Eigenschaften der UDP-A^Acetylglucosaminewo - ETH E

Diss.ETH
äxJ3
Diss.ETHNr. 12889
Strukturelle und kinetische
Eigenschaften der UDP-A^Acetylglucosaminewo/pjruvyltransferase
aus
Enterobacter cloacae
ABHANDLUNG
zur
Erlangung des Titels
DOKTOR DER NATURWISSENSCHAFTEN
der
EIDGENÖSSISCHEN TECHNISCHEN HOCHSCHULE
ZÜRICH
vorgelegt
von
Florian Krekel
Diplombiologe
Universität
Bayreuth, Deutschland
1.
1966
Angenommen auf Antrag
von
geboren
September
in Regensburg
am
Prof. Dr. N.
Prof. Dr. R.
Amrhein, Referent
Glockshuber, Korreferent
Zürich, 1998
ZUSAMMENFASSUNG/SUMMARY
III
Zusammenfassung
Nur zwei Enzyme sind bekannt, die den Transfer der intakten
Phosphoewo/pyruvat
Die
auf die
Hydroxylgruppe
isno/pyruvylgruppe
eines zweiten Substrates
5-£no/pyruvyl-Shikimat-3-Phosphat (EPSP) Synthase (AroA),
des
Shikimatwegs,
Transferase
und
die
katalysieren:
das sechste
UDP-N-Acetylglucosamin (UDPNAG)
(EPT=MurA), die den
Schritt der Biosynthese
ersten
Enzym
£«o/pyruvyl
des bakteriellen
Zellwand-Peptidoglykans (Murein) katalysiert. Dieser besteht in der Bildung
^wo/pyruvyl-UDP-N-Acetylglucosamin (£P-UDPNAG)
Reaktion der EPSP Synthase
ist
auf Pflanzen
diejenige der EPT kommt ausschliesslich
Angriffsziele von
In
von
Enterobacter cloacae ermittelt. Um die kinetische
UDPNAG-Reduktase
Reduktion der
zum
konnte mit seiner Hilfe ein
wurden
pH 7.4, Km
PEP
folgende
der
erhöhter Resistenz gegen
Proteolyse
=
5
Konformationsänderungen
grosse
veröffentlichten
Lactylether
=
60 uM.
auf
erleichtern, wurde die EP-
Da dieses
Verbrauch
unter
Enzym die
von
kcat=
2.5
s'1
bei 37 °C und
Konformationsänderungen
Ligandenbindung erfährt,
röntgenkristallographisch
NADPH
etabliert werden. Für das
Substratbindung hin gefolgert.
nach
aus
Peptidoglykanbiosynthese,
kinetische Parameter bestimmt:
UDPNAG
kürzlich
zu
gekoppelter Enzymtest
\iM, Km
EPT
Analyse
(MurB), das zweite Enzym
£«o/pyruvylgruppe
WT-Enzym
aus
sind daher als
Enzyme
Interesse.
GST-Fusionsprotein überexprimiert und gereinigt.
als
katalysiert,
Mikroorganismen beschränkt,
in Bakterien vor, beide
Herbiziden bzw. Antibiotika
von
UDPNAG und PEP. Die
Arbeit wurden kinetische und strukturelle Parameter der EPT
vorliegender
kloniert,
und
aus
von
ermittelten
ist
Strukturen
wurden
Dass die
in
zwei
gezeigt
worden.
Es besteht
ein
weitgehender
einziges,
nicht kovalent
gebundenes
weist offenbar darüberhinaus
Phospho-Thioketal
Rahmen
dieser
kollaborierende
Verlauf der
von
Arbeit
darüber, dass die Reaktion der EPSP Synthase über
Konsens
einen
Intermediat verläuft. Die Reaktion der EPT
kovalenten Zwischenzustand
Pyruvat, gebunden
konnte
diese
Cl 15 der EPT
Hypothese
Arbeitsgruppe durchführte,
Entstehung
an
mittels
untermauert
auf, der als O-
postuliert
wurde. Im
NMR-Studien,
die
eine
werden, und der zeitliche
und des Zerfalls dieses Intermediats wurde
verfolgt.
Im Unklaren
blieb, welche Rolle dieses kovalente Intermediat für die Katalyse spielt, und welche
Position
es
im Reaktionsverlauf einnimmt.
Um die Rolle
von
Cl 15 besser
Selenocystein ausgetauscht
und azideren
zeitliches
der Reaktion
Erscheinen
verstehen, sollte dieser Rest spezifisch gegen
werden. Der Ersatz dieses Restes durch den
Selenocystein-Rest
Gleichgewicht
zu
sollte kinetische Parameter der Reaktion verändern, das
zum
besser
nucleophileren
kovalenten Intermediat hin verschieben und sein
erfassbar
durch
NMR-Methoden
machen.
Als
ZUSAMMENFASSUNG/SUMMARY
rv
Voraussetzung für die Anwendung dieser
der EPT durch Serine ersetzt werden.
Methode sollten die drei anderen
Vorausgehende Mutagenesestudien
Beeinflussung
dass sich die drei Reste C251, C354 und C381 ohne
Parameter gegen Serin-Reste austauschen Hessen.
Kombination
Austausche
solcher
das
nur
Aktivität
enzymatischen Aktivität der exprimierten Proteine.
gingen mit
erhöhter
Hydrophobizität einher,
Diese
war
aber bei
Protein
teilweise
zu
gezeigt,
katalytischen
der
punktmutierte
C354S/C381S aktiv. Die anderen Kombinationen führten
Verlust der
hatten
Überraschenderweise
doppelt
Cys-Reste
EPT
vollständigem
Veränderungen der
der auf verminderte Stabilität
aus
geschlossen wurde.
Selenocystein-Einbau-Versuch mit
Daher wurde der
der WT-Form der EPT und der
Form EPT C354S/C381S unternommen. In beiden Fällen wurden
niedrige Selenocystein-Einbauraten
das
angewandte System
Selenocystein,
Erfolg führte,
zu
der
Fehlschlag
der
beobachtet. Der
Anwendung
Unterschieden zwischen diesen beiden Proteinen
Die
der
Röntgenstrukturanalyse
ausgeführt wurde, zeigte,
dass die
innerhalb der 12 bekannten
Positionen
Die strukturellen
Hydroxylgruppen
der
Aminosäuren oder der
Die strukturelle
sehr ähnlich und
und EPSP
EPT ist. Diese
einer
die das
Reste wie
Enzym
EPT
Serin-Reste
Thioredoxin mit
könnte
Vergleich
dass in den
fraglichen
von
Cystein-
gegen Serin-
durch Interaktionen der
Seitengruppen
Synthase
benachbarter
sein.
und EPT strukturell
sind. Auch in evolutiver Hinsicht sind EPT
miteinander verwandt, wobei die EPSP
betonen
Inneren
Leu, Ile oder Val dominieren.
bei Ersatz
dass EPSP
in
Ein
Beeinflussung hydrophober Wechselwirkungen bedingt
Beobachtungen
damit
in Zusammenarbeit
Gruppe
hydrophoben
mit
in dem
sein.
ergaben molecular modeling-SXudien,
völlig einzigartig aufgebaut
zwischen diesen zwei
von
Enzyms positioniert sind.
Analyse ergab darüberhinaus,
Synthase
die
EPT-Sequenzen zeigte darüberhinaus,
Veränderungen,
Reste erfährt, könnten, das
auf
begründet
von
Cystein-Resten hydrophobe
ausser
Markierung
fraglichen drei Cystein-Reste im hydrophoben
Domänen des
globulären
einer der zwei
EPT, die
vemachlässigbar
einzige bislang bekannte Fall,
die
war
nur
Synthase
der "Vorläufer" der
Fragen hinsichtlich mechanistischer Unterschiede
Enzymen sowie ihrer Gemeinsamkeiten.
SUMMARY
Only
from
two enzymes are
known
phosphoeno/pyruvate
to
to
catalyze
the
the transfer of the intact
hydroxyl
group
of
a
e«o/pyruvyl-shikimate-3-phosphate (EPSP) synthase (AroA),
shikimate
pathway,
transferase
(EPT=MurA).
the bacterial cell wall
and
UDP-iV-acetylglucosamine
EPT
catalyzes
e«o/pyruvyl moiety
second
Substrate:
the sixth enzyme of the
(UDPNAG)
the first committed step in the
peptidoglycan (murein):
5-
eno/pyruvyl
synthesis
of
the condensation of UDPNAG and PEP
ZUSAMMENFASSUNG/SUMMARY
ßHo/pyruvyl-UDPNAG
to
restricted to
V
(£P-UDPNAG).
of considerable interest
are
enzymes
EPSP
synthase reaction is
and the EPT reaction
plants and microorganisms,
bacteria, both
the
As
exclusively
occurs
in
targets for herbicides and
as
antibiotics, respectively.
In this
work, kinetic and structural parameters for the EPT from Enterobacter cloacae
obtained. In order to facilitate kinetic studies, the second enzyme of peptidoglycan
were
synthesis, isP-UDPNAG-reductase (MurB)
a
GST fusion
lactyl-ether
protein.
under the
catalyzes
MurB
was
the reduction of the
consumption of NADPH,
assay. The kinetic parameters of WT-EPT
PEP
=
5
jxM, Km UDPNAG
increased resistance to
publications
=
cloned, overexpressed and purified
which allowed
&cat
are:
=
s'1
2.5
60 uM. Conformational
proteolysis
it has been shown that
adopts
EPT
group to the
application
of a
and
at 37 °C
changes
binding of
upon
e«o/pyruvyl
coupled
pH 7.4, Km
deduced from
were
Substrates.
as
In
two
recent
different conformation when
a
interacting with ligands.
synthase
EPSP
The
intermediate, that is
obviously
an
structure of this
As
performed by
a
pathway
strategy towards
replace
collaborating
a
intermediate. Furthermore, the time
determined. However, the
the reaction
occurs, which
this residue
are
a
precise
a
for serines.
or
This
manipulation
without
approach,
this
affecting
feasibility
genes,
only
or
triple
one
solid
decay
position
decided to
to result in
an
detect, by the aid of
precedes
the tetrahedral
cys-residues
should be
of
mutant
protein,
proteins
increased
the
enzyme.
obtained from
EPT C354S/C381S
with diminished
or
even
hydrophobicity which
was
by impaired stability.
C354S/C381S. In both cases, almost
case, in which the
exchange
to
mutant constructs were
double
Thus, the selenocysteine-labelling approach
only
was
expected
was
catalytic parameters
the
activity. These proteins exhibited
assumed to be caused
of its formation and
the other three
active. All other combinations resulted in
abolished
study,
each of the residues C251, C354 and C381 could be
Unexpectedly, however, when double
was
course
covalent intermediate
not the
Individually,
single-point-mutated
be the O-
group, confirmed the chemical
of the role of C115, it
understanding
better
prerequisite for
replaced by serine
the
suggested to
was
still unclear.
by selenocysteine.
NMR-methods, whether
exchanged
mechanism of EPT
role of the thioketal intermediate and its
altered kinetic behaviour of the enzyme, and in the
intermediate. As
Single reaction
a
of pyruvate, bound to Cl 15 of EPT. As apart of this
State NMR measurements,
on
to the enzyme. In the
covalently attached
not
proceed through
to
additional, covalent intermediate
phosphothioketal
was
thought
is
reaction
was
done
with
neglectable incorporation
labelling System
so
far has been
of the cy steine residues in thioredoxin for
WT-EPT
rates were
and
found. The
successfully used,
selenocy stein,
EPT
was
and the failure
the
using
ZUSAMMENFASSUNG/SUMMARY
this
VI
labelling approach for EPT might be based
on
the differences between the two
proteins.
X-ray crystallographic analysis of EPT,
that the three
one
of the
cys-residues C251,
protein's
two
decreased
residues val, leu
stability
interactions
of the
of the
hydrophobic side
The structural
are
chains
or
ile
multiple
or
further
synthase
the
are
mutated
groups
group, revealed
hydrophobic
core
published
now
proteins might
of the
serine
modeling suggested
of
EPT
the
that the
be the result of unfavourable
residues
with
surrounding
weakening of hydrophobic interactions, respectively.
synthase
and EPT share
a
unique
three-
by evolutionary analysis,
relatives, EPSP synthase being the
emphasizes questions regarding
the two enzymes.
12 up to
present. Molecular
revealed that EPSP
are
coUaborating
located in the
dimensional structure, furthermore it could be shown
EPT and EPSP
a
respective positions, apart from cys-residues, mainly
hydroxyl
analysis
C354 and C381
by
globular domains. Comparison of
sequences showed that in the
hydrophobic
carried out
ancestor
that
of EPT, which
mechanistic similiarities and differences between