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Ouchterlony-Immundiffusion Western Blot ELISA (enzyme linked immuno sorbent assay) Immunpräzipitation A Antikörper sind wichtige diagnostische Marker HIV Infektion und HIV Nachweis Verbreitung von HIV in Deutschland Adults and children estimated to be living with HIV/AIDS as of end 2000 North America 920 000 Caribbean 390 000 Latin America 1.4 million Eastern Europe Western Europe & Central Asia 540 000 700 000 East Asia & Pacific North Africa 640 000 South & Middle East & South-East Asia 400 000 5.8 million Sub-Saharan Africa 25.3 million Total: 36.1 million Australia & New Zealand 15 000 Globale Verbreitung von HIV-1 Subtypen B AA/B B D B, F AA/G C B C B/C C E B’ M,O,N C B Unterschiede in Geographie und Übertragungsgruppen Nachweis von HIV-spezifischen Antikörpern durch ELISA A - B - C - D Virusproteine sind in der Kavität der ELISA-Platte adsorbiert Patientenserum wird in die Kavität gegeben, HIV-spezifische Antikörper binden an die Virusproteine. Mit Enzymen gekoppelte Anti-HumanAntikörper binden an die HIV-spezifischen Antikörper Ein farbloses Substrat wird duch das Enzym umgesetzt und es kommt zu einem Farbumschlag. HIV-spezifischer Antikörper HIV-ELISA zum Nachweis HIV-spezifischer Antikörper Nachweis von HIV-spezifischen Antikörpern durch Western Blot A Aufbau des humanen Immundefizienzvirus B C D Zerlegung des Virus in einzelne Proteine Proteingel Elektrophoretische Auftrennung der Proteine nach der Größe Membran Membran E Übertragung der Proteine auf eine Nitrozellulosemembran Inkubation der Membran mit Patientenserum F Nachweis der gebundenen Antikörper durch enzymatische Färbung + - 0 4 8 11 16 18 23 35 Kontrollen Wochen nach Infektion 0 2 4 6 8 10 12 13 Wochen nach Infektion HIV Serologie: • 2 Elisa als „Suchtests“ (unterschiedliche Funktionsprinzipien) • Bei positivem ELISA: Western Blot als Bestätigungstest • Bei unklarer Serologie: Verlaufskontrolle Unklares Ergebnis? Eine Möglichkeit: Virus-Nachweis durch Anzuchtversuche Wie weißt man postive Anzucht nach?? Durch: a)Antigen-Capture-Assay b)RT-Test c)Immunfärbung infizierter Zellen Immunfluoreszenz Fluorochrom-konjugierte spezifische Antikörper Fluorochrom-konjugierte sekundäre Antikörper (z.B. anti-Ig Antikörper) Unkonjugierte spezifische Antikörper direkte Immunfluoreszenz indirekte Immunfluoreszenz Immunfluoreszenz A431 cells labeled with probes for histones and the epidermal growth factor (EGF) receptor. Histones were detected with a mouse anti-histone antibody prelabeled using the Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG2a Labeling Kit (Z-25102). EGF receptors on the cell surface were detected with a mouse anti–EGF receptor monoclonal IgG2a antibody prelabeled using the Zenon Alexa Fluor 555 Mouse IgG2a Labeling Kit (Z-25105). Quelle: Molecular Probes Fixed and permeabilized bovine pulmonary artery endothelial cells stained with Alexa Fluor 350 phalloidin (A-22281), an anti–-tubulin antibody (A-11126) and the anti–cdc6 peptide antibody (A-21286). The anti–-tubulin antibody was labeled with the Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 Labeling Kit (Z-25006) and the anti–cdc6 peptide antibody was labeled with the Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Labeling Kit (Z-25002). The image was acquired using a CCD camera controlled by MetaMorph software (Universal Imaging Corporation). Quelle: Molecular Probes Microtubules of NIH 3T3 cells labeled with mouse anti–-tubulin monoclonal IgG1 antibody (A-11126) and visualized with blue-fluorescent AlexaFluor 405 goat anti–mouse IgG antibody (A-31553). Nuclei were stained with red-fluorescent propidium iodide (P-1304, P-3566, P-21493). Quelle: Molecular Probes Antikörper als „Medikament“ Murine monoklonale Antikörper als Medikamente Vorteile Nachteile Monoklonale Antikörper (mAbs) von definierter Spezifität und Affinität können unter reproduzierbaren Bedingungen in großen Mengen hergestellt werden Die Menge von benötigtem Protein ist bei Verwendung von mAbs geringer als bei Verwendung von polyklonalen Antikörpern MAbs sind besser geeignet für Standardisierung und Qualitätskontrolle Alle monoklonalen Antikörper sind murinen Ursprungs. Die Anwendung bei Menschen ruft eine Immunantwort hervor: Human anti-mouse immunglobulin (HAMA) Die Neutralisation von murinen mAbs durch HAMA kann zur Attenuierung des therapeutischen Effekts und zur Beschleunigten Clearance aus dem Blut führen. Production von humanem IgE kann zu hypersensitiven Reaktionen führen Kurze Halbwertszeit, erfordert wiederholte Gabe Murine Antikörper können humane Immun-EffektorFunktionen nicht so effizient auslösen, wie humane Antikörper Nach: Vaswani et al. 1998 Annals of Allergy, Asthma & Immunology Nach: Vaswani et al. 1998 Annals of Allergy, Asthma & Immunology Erkrankung Protein ? Transmissible Spongiforme Enzephalopathien (TSE) Oder die Suche nach den Prionen Die „protein only“ Hypothese Geschichte der Prionenforschung • • • • • • • • • • • • • • • 18. Jahrhundert: 1920/21 1921 1936 1957 1976 1981 1982 22.12.1984 11.02.1985 1986 1987 bis 1989 1992 1993 • • • • • Mai 1995 März 1996 Juli 1997 Dez. 1997 24.11.2000 Auftreten von Scrapie Beschreibung der“ Prionen-Erkrankung“ beim Menschen (Creutzfeld/ Jakob) Beschreibung einer vererbbaren Prionenkrankheit (Gerstmann) Nachweis der Infektiösität von Scrapie Entdeckung von Kuru-Kuru in Papua-Neuguinea Nobelpreis für Gajdusek für Nachweis von CJK-Übertragung auf Tiere neues Verfahren zur Tiermehlherstellung in England Publikation des Prionen-Modells (S. Prusiner) Untersuchung von „cow 133“ in Sussex „Cow 133“ stirbt, spätere Diagnose: spongiforme Enzephalitis (SE) Bezeichnung „BSE“ für „mad cow disease“ Übertragung von BSE auf Mäuse in GB 480 000 erkrankte Rinder geschlachtet und zu Wurst und Fleisch verarbeitet 373 000 BSE-erkrankte Rinder in Großbritannien BSE experimentell auf 19 Tierarten übertragen Rückgang der BSE-Fälle in Großbritannien CJK bei 19!-jährigem Engländer weltweites Exportverbot für britisches Rindfleisch Übertragung von BSE auf Menschen bewiesen (Nature) Nobelpreis für Stanley Prusiner erster originärer BSE-Fall in Deutschland nachgewiesen Tabelle nach Stülke Die bovine spongiforme Enzephalopathie BSE Abb. von G. Wellls & S. Hawkins Histologischer Hirngewebsschnitt mit schwammartiger (spongiformer) “Durchlöcherun vCJK: Ebenfalls eine spongiforme Enzephalopathie Histologischer Schnitt aus dem frontalen Cortex “Florider Plaque“ Abb. von J.W. Ironside Appearance of Cellular and Scrapie Isoforms of PrP in the Western Blot PrPC - PK + PK PrPSc - PK + PK 35 kDa 30 kDa PrP 27-30 (MW of diglycosylated band) PrPsen PrPres Proteinase K • Serin-Protease • Endopeptidase • bei ausreichend langer Inkubationszeit werden Proteine proteolytisch zu einzelnen Aminosäuren gespalten. Verteilung von PrPSc in Mäusehirn Inokkuliert mit Hirnextrakt von Patienten, die verstorben sind an: A) fataler familiärer Insomnie B) familiärer CJK NC Hp Hb Th Hy Am Neocortex Hippocampus Habenula Thalamus Hypothalamus Amygdala S. Prusiner Beispiel: BSE-Schnelltestung Vorbereitung einer Hirnstammprobe aus dem Schlachthaus für die Schnelltestung (Aktive BSE-Überwachung) BSE-Schnelltestung: Prinzip des „Prionics-Check“ Normales Rind PK: - + BSERind - + Offene Fragen in der Prion-Forschung • Was ist das infektiöse Agens? Ist PrPSc identisch mit dem Prion? Wie bewirkt das PrPSc die Umwandlung des PrPC in weiteres PrPSc ? Welche anderen Protein sind an diesem Prozess beteiligt? Kann die Prion-Erkrankung geheilt werden, wenn man den Konversionsprozess beeinflusst? Was sind Prion-Stämme auf molekularer Ebene und wie sind stamm-spezifische Eigenschaften kodiert? • Wie gelangen peripher verabreichte Prionen zum Gehirn? Welche Moleküle und Zellen sind an der Neuroinvasion beteiligt? Welche Inhibitor-Strategien haben realistische Erfolgsaussichten? • Welches sind die Mechanismen der spongiformen Neurodegeneration? Welche pathogenen Kaskaden werden aktiviert? Was sind die biochemischen Auswirkungen der Hirnschädigungen? • Was ist die physiologische Funktion des normalen Prion-Proteins PrPC? PrPC ist hochgradig konserviert, also ist es wahrscheinlich nützlich. Das Pmp Gen ist 1985 identifiziert, Pmp Knockout-Mäuse gibt es seit 1992, trotzdem ist die Funktion von PrPC immer noch unbekannt. Keiner der Phenotypen, die der Abwesenheit von PrPC zugeschrieben werden, konnte auf molekularer Ebene erklärt werden. Ist eine abnorme Funktion von PrPC an der Pathogenese der Prion-Erkrankung beteiligt?
