Standartisierte Nomenklatur für transgene Tiere (ILAR News 34, No

Biologie, experimentelle Nutzung
u. Haltung von Krallenfröschen
Prof. Dr. Gero Hilken
Zentrales Tierlaboratorium
UK Essen
Gliederung
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Systematik und Biologie
Nutzung
Haltung
Krankheiten
(Zucht)
Revision of Appendix A of the
Convention
Table 1: Four habitats and examples of amphibian species of each habitat
frequently used
MEDLINE-Search
Number of publications
1995-2000
Key-word:
0
5000
10 000
201 482
Rats
157 419
Mice
Xenopus spp.
Rana
Rana catesbeiana
Ambystoma spp.
Bufo marinus
200 000
8 784
558
483
190
AMPHIBIANS
RHODENTS
Systematik und Biologie
Urodela (Schwanzlurche)
Die Schwanzlurche präsentieren ausgeprägt die plesiomorphen Züge der
Amphibia und Batrachia.
Artenarm, 450 Arten, weitgehend Nordhalbkugel, nur mit Vorkommen im
oberen Amazonas überschreiten sie den Äquator.
Plesiomorphien
• stark wassergebundene Lebensweise
• langer Rumpf mit Schwanz, gleichstarke, kurze Extremitäten
• wiederholte Evolution neotäner, zeitlebens aquatischer Arten
Ambystoma mexicanum (Axolotl)
Ambystoma tigrinum
24 Familien
339 Gattungen
ca. 4400 Arten
Pipidae
(Zungenlose)
• aquatisch, Schwimmer
• Keine Zunge und kein
Trommelfell
• Augenlider reduziert, Augen
klein
• Mündung der Eustachischen
Röhre unpaar
• Seitenlinienorgan zeitlebens
erhalten
• 6-8 präsakrale Wirbel,
• Larven auch mit Rippen
• Larven mit inneren Kiemen
• Amplexus inguinal
Pipa
Xenopus
Verbreitung
Xenopus laevis ist im südwestlichen Afrika verbreitet.
Die Unterart X. l. laevis in Namibia, Südafrika,
Lesotho, Swasiland,Botswana, Simbabwe und
Malawi. In Kalifornien eingebürgert.
Xenopus tropicalis kommt in den Tiefland-Regenwälder
Westafrikas vor (Senegal, Nigeria).
Vorteile von Krallenfröschen
• Tiere nicht geschützt
• lange Haltungserfahrungen
• relativ anspruchslos in der Haltung (rein
aquatisch)
• relativ leicht zu züchten; Ovulation kann
leicht durch HCG ausgelöst werden;
Verpaarung ganzjährig möglich
• Ontogenese sehr gut bekannt
• Weibchen können mehrfach zur OozytenSpenden herangezogen werden
Genetik
• Innerhalb der Gattung Xenopus sind alle
Formen polyploid (von 4n bis 12n). Ausnahme
X. tropicalis!
• Xenopus laevis und Xenopus tropicalis:
• 36/20 Chromosomen; 4n/2n
• Weibchen heterogametisch (ZW)
• Männchen homogametisch (ZZ)
• isogene und transgene Krallenfrösche
• hybridisieren mit anderen Krallenfrosch-Arten
Biologie von X. laevis
• euryöke Tierart (pH, Salzgehalt, Temperatur
etc.)
• leben in schlammigen, z. T. temporären
Gewässern
• können lange hungern und im feuchten
Schlamm überdauern
• überleben im Trockenen kaum 3 Stunden
Biologie von X. tropicalis
• Lebt in relativ flachen Weihern und
Urwaldtümpeln, die stark mit Wasserpflanzen
bewachsen sind.
• Wassertemperaturen liegen zwischen 27-32°C
• pH-Wert neutral bis leicht sauer
• Purzelbaumartige Paarungstänze (Höhe des
Beckens!)
Nutzung von Krallenfröschen
• externe Embryonalentwicklung
und transparente Larven
erlauben es, die Organogenese
zu verfolgen
• Größe der Larven erlaubt
mikrochirurg. Manipulationen
• transgene Tiermodelle
• Bioindikatoren
• Kreislauf- und
Pharmaforschung
• (in der Schwangerschaftsdiagnostik)
• (in der Studentenausbildung)
Journal of Biological Chemistry, You D et al. „The first gene-encoded
amphibian neurotoxin“ 2009, 1-12
 High level of biochemical diversity make amphibian
skins attractive subjects for chemical prospecting. Many
amphibian skin peptides, such as antimicrobial peptides
(10-13), tachykinins (14-16), dermorphins (17, 18),
cholecystokinin (19) and bradykinins (20-22) which play
defensive roles, have been extensively studied in recent
decades but a large amount of pharmacological
peptides with defensive functions may remain to be
identified (12).
Magainine
Magainins are peptide antibiotics with antibacterial and
antiparasitic activities, originally extracted from the skin of
Xenopus laevis.
These antimicrobial peptide shave broad-spectrum, nonspecific activity against a widerange of microorganisms,
including viruses, gram-positive and gram-negative bacteria,
protozoa, yeasts and fungi, and may also be hemolytic and
cytotoxic to cancercells.
Magainin 1 is a bactericide. Both Magainin 1 and 2 exhibitin
hibitory action towardHerpes simplex virus type 1(HSV-1)
and HSV-2.
Ref: Williams, RW. et al. Biophysical J. 53, 631A (1988);
Morvan, A. et al. Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 3, 327 (1994);
Matanic, A. et al. Int. J. Antimicrob Agents 23, 382 (2004);
Zasloff, M. Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 5449 (1987).
Nutzung von Xenopus-Oozyten
• Studium der Expression und
Charakterisierung exogener,
oozytenfremder Proteine
• Membraneigenschaften
(Rezeptoren, Ionenpumpen,
Ionenkanäle etc.)
• intrazelluläre Messungen der
Aktionen von primären und
sekundären Botenstoffen
• elektro- u.
transportphysiologische,
biochemische und
morphologische
Untersuchungen der
Entwicklungsstadien im
Verlauf der Oogenese
Xenopus laevis u. X. tropicalis
Xenopus tropicalis vs X. laevis
• Größe der Weibchen: 4-5cm/12cm
• Eizahl: 1000-3000/300-1000
• diploid/polyploid(4n), genetische Studien bei X.
laevis problematischer (Genduplikation)
• 20/36 Chromosomenpaare
• X. tropicalis hat eines der kleinsten Genome
innerhalb der Amphibien. Es ist nur etwa halb so
groß wie das von X. laevis
• Generationszeit:4-6/12Monate
• Larven: 0,7-0,8/1,0-1,3 cm
Vorteile von Xenopus tropicalis
• Entwicklung verläuft weniger variabel
• sehr effektive Generierung von transgenen
Nachkommen über Transferierung von
genmanipulierten Spermien-Nuklei in
unbefruchtete Eizellen.
• Multi-Generationen Experimente sind mit X.
tropicalis möglich.
• Unterbringung von mehr Fröschen/Becken
möglich
Haltung
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Fütterung
Wassertemperatur
Wasseraufbereitung
Wasserstand
Beckenfarbe, Deckung, Beleuchtung
Besatzdichte
Haltung adulter Xenopus laevis
Wassertemperatur:
Wasserstand:
Besatzdichte:
Untergrundhelligkeit:
Beleuchtung:
Deckung:
Wasseraufbereitung:
Fütterung:
20-22°C
20-50cm
(600cm2/Frosch in Gruppenhaltung;
2400 cm2/ Frosch in Einzelhaltung)
dunkle Beckenfarbe
 200 Lux,12stündige L/D-Phasen
wenige dunkle Tonröhren
Filterreinigung
täglich alternierend mit standardisiertem
Lebendfutter (Drosophila-Larven,
Xenopus-Kaulquappen), pelletiertem
Xenopus-Futter, zerkleinertes Herz.
Haltung adulter Xenopus tropicalis
Wassertemperatur: 24-26°C
Wasserstand:
15-30cm
Besatzdichte:
150cm2/Frosch in Gruppenhaltung;
800cm2/ Frosch in Einzelhaltung
Untergrundhelligkeit:dunkle Beckenfarbe
Beleuchtung:
 200 Lux, 12stündige Licht/Dunkelphasen
Deckung:
wenige dunkle Tonröhren
Wasseraufbereitung: Wasserspülung 1xtäglich für 15 min
Fütterung:
täglich alternierend mit Lebendfutter (Tubifex
sp.),pelletiertem Xenopus-Futter, zerkleinertes
Herz.
Hygienemaßnahmen
• Für jedes Becken ist ein separates Netz zu
verwenden
• Futterreste regelmäßig entfernen
• Kranke Tiere sofort separieren
• Handling
Zucht
• Verhalten
• Induktion der Paarung und Eiablage
Induktion der Paarung bei X. laevis
• Elterntiere 3 Tage vor Hormonbehandlung nach
Geschlechter trennen; nüchtern lassen.
• Am Morgen des 4. Tages werden den
Männchen 200 I.E. HCG in den dorsalen
Lymphsack appliziert.
• Am Morgen des 5. Tages erhalten die Weibchen
die 1. HCG-Injektion (200 I.E.), 6 Stunden
später die zweite (600 I.E.).
• Zeitgleich mit der 2. Injektion der Weibchen
erhalten die Männchen ein 2. Mal 200 I.E. HCG.
Induktion der Paarung bei X. tropicalis
• Elterntiere vor Hormonbehandlung nach
Geschlechter trennen; nüchtern lassen.
• 15 I.E. in den dorsalen Lymphsack, danach
ins Becken zurücksetzen
• Nach 12-72 Stunden erneut 100 I.E.
applizieren, danach Paare
zusammensetzen.
• Amplexus beginnt nach 3-4 Stunden und
endet nach bis zu 6 Stunden.
Haltung von Xenopus-Kaulquappen I
Wassertemperatur: 22°C
Wasserstand:
10-20cm
Besatzdichte:
0,5lWasser/Kaulquappe,
bei Grundfläche von 1m2
400 Kaulquappen
Untergrundhelligkeit: dunkle Beckenfarbe
Haltung von Xenopus-Kaulquappen II
• Beleuchtung: ? Lux, 12stündige L/D
• Wasseraufbereitung: Wasser belüften,
manuelle Reinigung, nicht gefressenes Futter
absaugen, Becken nur mit abgestandenem
Wasser auffüllen.
• Fütterung: 2x täglich mit einer AlgenpulverSuspension (Mikrozell®, max. 150-200mg/l
Wasser/Tag)