angiogenesis - ETH E-Collection
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Diss.ETH No. 13086 EPH RECEPTORSIN CRANIAL NEURALCREST CELL MIGRATIONAND ANGIOGENESIS A dissertation submitted to the EIDGENOESSISCHE TECHNISCHEHOCHSCHULE(ETH) ZÜRICH for the degree of Doctor of Natural Sciences presentedby PAULM. HELBLING Diplomzoologe UniversitätZürich Born May 12, 1968 in Luzern Acceptedon the recommendationof Prof. Dr. Hans Eppenberger, examiner Prof. Dr. Konrad Basler, co-examiner Dr. Andre Brändli, co-examiner March 1999 Zusammenfassung 1. Zusammenfassung Familie der Rezeptor Tyrosin Kinasen. Aufgrund von Sequenzhomologien und Bindungsspezifitäten lassen sie sich in EphA- und EphB-Klassen einteilen. Die Liganden der EphRezeptoren, die Ephrine, bilden ebenfalls zwei Klassen, die Ephrin-A und Ephrin-B genannt werden. Ephrin-A Proteine sind mittels eines Glykosylphosphatidylinositol-Ankers an der Zellmembranbefestigt. EphrinB Liganden sind hingegen Transmembranproteine. Eph-Rezeptoren zeichnen sich darin aus, dass sie mehrere Liganden binden können. Die EphA-Rezeptoren können durch alle Mitglieder der Ephrin-A Familie aktiviert werden, während die EphB-Rezeptoren mit allen Mitgliedern der Ephrin-B Gruppe wechselwirken können. Es gibt Hinweise, dass EphRezeptoren den Axonen als auch den auswandernden Neuralleistenzellen Signale vermitteln, die der räumlichen Orientierung dienen. Darüber hinaus nehmen Eph-Rezeptoren eine zentrale Rolle bei der Bündelung von Axonen zu Nervensträngen, der Verknüpfung von Sehzellen mit dem Tectum und der Ausbildung des Blutgefässystems ein. Eph-Rezeptoren bilden die vorliegenden grösste Bedeutung von Eph-Rezeptoren für die Embryonalentwicklung von Xenopus laevis untersucht. Dazu wurden cDNAs, die für Xenopus EphA2 und EphB4 kodieren, isoliert. Ausserdem wurden cDNAs, die für Xenopus Ephrin-B3 und für zwei Xenopus Ephrin-A Liganden kodieren, kloniert. Das Expressionsmustervon EphA2, EphB4 und Ephrin-B3 wurde mittels in situ Hybridisierung und Northern Blot Analyse untersucht. EphA2 Transkripte wurden in auswanderndenNeuralleistenzellen des Kopfes nachgewiesen. In den sich entwickelnden Kiemenbögen, zeigten EphA2-Rezeptoren und ihre Liganden ein überlappendes Expressionsmuster. Durch die Blockierung der Signalleitung von EphARezeptoren in Xenopus Embryonen konnte gezeigt werden, dass diese für die Orientierung von auswandernden Neuralleistenzellen von grösster Bedeutung sind. In den manipulierten Embryonen konnte keine Auftrennung der normalerweise in den dritten und vierten Kiemenbögen In der Arbeit wurde die auswandernden Neuralleistenzellen beobachtet werden. Diese Befunde weisen darauf hin, dass durch die Signalvermittlung der EphA-Rezeptoren Zusammenfassung der Zusammenhalt der Neuralleistenzellen verstärkt wird und diese somit als geschlossener Zellverbund in die Kiemenbögen einwandern können. Xenopus Embryo konnten EphB4-Rezeptoren in den Intersegmentalvenen nachgewiesen werden, während die Expression der Liganden in den benachbarten Somiten erfolgte. Die Blockierung der Signalleitung der EphB4-Rezeptoren in Xenopus Embryonen verhinderte das korrekte Auswachsen der Intersegmentalvenen. Ein ähnlicher Befund lieferte die Überexpression von Ephrin-B3. Da EphB4 und Ephrin-B komplementäre Expressionsmuster aufweisen, wird das Wachstum der Intersegmentalvenen möglicherweise durch EphB4 vermittelte Abstossungssignale kontrolliert. Zusammenfassend lässt sich aus der vorliegenden Arbeit schliessen, dass Eph-Rezeptoren in Neuralleistenzellen vermutlich anziehende, während sie in Endothelzellen abstossende Signale vermitteln. In beiden Fällen gewährleisten sie das korrekte Auswandern embryonaler Zellen. Am Summary 2. Summary objective of this thesis was to investigate the role of Eph reeeptor signaling during Xenopus embryogenesis. Eph reeeptors are the largest family of reeeptor tyrosine kinases. They can be divided into the EphA and EphB subfamilies aecording to sequence homologies and ligand binding properties. Eph reeeptor ligands, the ephrins, are comprised of two distinct families, the ephrin-As and the ephrin-Bs. Ephrin-A proteins are attached to the cell membranes via a glycosylphosphatidylinositol anchor, while ephrin-B ligands are transmembrane proteins. Binding of ephrins to Eph reeeptors oecurs promiscuously, with ephrin-A proteins interacting with EphA and ephrin-B with EphB reeeptors. Recent studies indicate that Eph reeeptor signaling provides cells with spatial information during axonal pathfinding and neural crest migration. Furthermore, axon fasciculation, The establishment of the retinotectal projeetion, and dependent on Eph reeeptor activity. angiogenesis appear to be thesis, the isolation of cDNAs encoding Xenopus orthologues of the Eph reeeptors EphA2 and EphB4 is described. In a screen for cDNAs In this encoding ephrins, a full-length cDNA for ephrin-B3 and partial cDNAs for ephrin-A ligands were isolated. The expression patterns of EphA2, EphB4, and ephrin-B3 were analyzed using in situ hybridization and Northern blots. EphA2 was expressed in migrating cranial neural crest cells. Interestingly, the ligands for EphA2 were found to be expressed in a pattern overlapping with EphA2 in the mesenehyme of the visceral arches. Loss-offunetion experiments in Xenopus embryos revealed that EphA signaling is required to segregate migrating cranial neural crest cells to the third and fourth visceral arches. Since reeeptor and ligands share overlapping expression patterns, EphA reeeptors and their ligands probably mediate cell adhesive or attractive signals to migrating cranial neural crest cells. Expression of EphB4 was detected in intersegmental veins, while the ligands of the ephrin-B class were expressed complementary in the adjacent somites. In vivo data provided evidence for ephrin-B3 acting as a ligand of EphB4. Loss- and gain-of-funetion experiments in Xenopus embryos resulted in abnormal pathfinding of intersegmental veins during angiogenic growth. Summary We propose that EphB4 endothelial cells of the signaling mediates repellent guidance cues to intersegmental veins, and thus prevents the vascularization of inappropriate tissues. Together, the findings described here suggest that Eph reeeptors are able to provide either attractive or repellent Signals during the migration phases of embryonic neural crest and endothelial cells, respectively.
