Genes and mechanisms regulating - ETH E-Collection

Diss. ETHNo. 17108
Genes and mechanisms regulating angiogenesis and
kidney organogenesis Studies on ephrin-B and WT1
gene functions
-
A dissertation submittedto the
Swiss Federal Institute of Technology
(ETH) Zürich
for the degree of
Doctor of Natural Sciences
Presented by
Vasilios Dabouras
Diploma of Biology
Darmstadt University of Technology
Born September 15, 1973
Citizen of Greece
acccpted on the recommendationof
Prof. Dr. Andre Brändli, examiner
Prof. Dr. Dario Neri, co-examiner
Prof. Dr. Andreas Schedl, co-examiner
2007
Summary
Summary
is a convenientmodel System for studying molecularand cellular aspects of
renal and vascular development.Two days after fertilisation it's excretory and circulatorySystems
statt to function. The molecules and cellular processes Controllingdevelopment of these organs
are similar to the ones utilised in higher vertebrates. The aim of this thesis was to investigate
Xenopus laevis
the function of the zinc finger transcription factor WT1 during pronephric development, as
well as analysing the role ofthe Eph-ephrinsignalling pathwayduring angiogenesis in the frog
Xenopus laevis.
In a first study, Xenopus laevis cDNAs were identified encoding orthologues of mammalian
markers of the glomerulus, including the angiotensin 11 receptor type I, nephrin and two
members of the nephrin like gene family. The deduced protein structure of these genes is
largely conserved to its mammalian counterparts.Expression for all of them was found in the
Xenopus glomus. I could show that the Xenopus glomus is structural similar to the mammalian
glomerulus, consisting of fenestrated endothelial cells, a glomemlar basement membrane
(GBM), and visceral epithelial cells (podocytes), which form podocyte foot processes and a
slit diphragm. These findings establishednovelmarkers of glomemlardevelopment and will be
valuable to
study the genetic basis of glomemlardevelopment in vertebrates.
I studied the function of WT1 during pronephric development. I performed loss-of
function and gain of function studies. Knockdownof WT1 by means of morpholino antisense
oligonucleotides injeetions in Xenopus embryos resulted in reduced expression of glomemlar
marker genes, abseilt glomerulusand formationof edema at larval stages. Tubulär development
was largely unaffected. Interestingly, knockdown of WT1 lead to an increase expression of
WT1, indicating a complex mode of action of WT1 during glomemlar development. These
results suggest, that WT1 function is dispensable for nephrogenesis, but essential of glomemlar
Next,
development.
In my second projeet, I studied the role of ephrin-B genes during vascular development.
Ephrin-B2 is the ligand for the receptor tyrosine kinase EphB4, whichcontrols angiogenicgrowth
of intersomiticvcssels in the Xenopus embryo. Ephrin-B2 is expressed, together with ephrin-B1
in the somites adjacent to the growth path taken by extendingintersomiticvessels, implying that
both genes are involvedin intersomiticvessels outgrowth. 1 performed loss-of-funetion studies
in Xenopus, which indicate that both ephrin Bl and B2 are necessary to regulate outgrowth of
intersomitic vessels, presumably via EphB4. To understand the mechanism, by which ephrin-B
proteins guide endothelial cells, 1 utilised stripe assays to characterisethe interactionof ephrinB proteins with primary human endothelial cells in vitro. Human umbilical vein and arterial
endothelial cells were exposed to ephrin-B coated surfaces and their response was monitored.
5
Summary
and arterial endothelialcells avoid ephrin-B coated surfaces in a
dose-dependent manner, which indicatesthat ephrin-B ligands mediate repulsive signaling to
endothelial cells.
The results show that
venous
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Der afrikanische Krallenfrosch Xenopus laevis dient als Referenzmodell um zelluläre und
molekulare Aspekte der Nieren- und Blutgefässentwicklungzu studieren. Zwei Tage nach
der Befruchtung sind das Nieren-und das Kreislaufsytemvoll funktionsfähig. Die Moleküle,
welche die Entwicklung dieser Organe steuern, ähneln sich in niedern und höheren Vertebraten.
Ziel dieser Arbeit war sowohl die Analyse der Funktion des Zinkfmger-Transkriptionfaktors
Wilms-Tumor Gen 1 (WT1) währendder Vornierenentwicklungin Xenopus, als auch die Rolle
des
Eph-cphrin-Signalwegeswährendder Blutgefässsprossung (Angiogenese).
Im ersten Projekt dieser Dissertation wurden Xenopus cDNA identifiziert,die für orthologe
glomeruläreMarkergenehöhererWirbeltiere kodieren. DieseschliessenAngiotensinIT Rezeptor
Typ I, Nephrin, Nephl und Neph4 ein. Die abgeleiteten Proteinsequenzensind weitesgehend
konserviert zu den entsprechenden Säugetierproteinen. Expression im Xenopus Kapillametz
(Glomerulus) konnte für alle diese Gene nachgewiesen werden. Ich konnte zeigen, dass der
Xenopus Glomerulus aus einem gefensterten Kapillarendothel, einer Basalmembran und
Podozyten besteht. Die Podozyten bilden Podozytenfortsätze und Filtrationsschlitze. Somit ist
der Filtrationsapparatin Xenopus ähnlich dem der Säugetiere aufgebaut. Unsere Ergebnisse
etablieren neue Markergene für die Entwicklung und Funktion des Glomerulus die nun als
nützliche Werkzeuge für weitere Untersuchungen zur molekularen Regulationder glomerulären
Entwicklung in Wirbeltieren dienen.
Mittels der glomerulären Markergene untersuchte ich die Funktion des Wilms Tumorgens
WT1 während der Vornierenentwicklungbei Xenopus. Hierzu führte ich Funktionsverlustund Überexpressions-studien durch. Hemmung der WT1-Genfunktion mittels MorpholinoOligonukleotide führte zu reduzierten Expression von glomerulären Markergenen,
fehlendem Glomerulus und Bildung von Oedemen im Larvenstadium. Die Entwicklung der
Nierenkanälchen (Tubuli) war weitesgehend normal. Interessanterweise führte die Inhibition
von WT1 zu einer Erhöhung der WT1-Expression. Dies deutet auf eine komplexeRegulation
der Funktionsweise von WT1 während der glomerulärenEntwicklung hin. Unsere Ergebnisse
lassen darauf schliessen,dass WTlwesentlichfür die Entwicklung des Glomerulus, aber nicht
der Nierenkanälchenist.
Projekt diente der Analyse der Funktion von ephrinB Genen während der
Blutgefässentwicklung. EphrinB2 ist der Ligand für den EphB4-Rezeptor, welcher das
Wachstum intersomitischerGefässe in Xenopus reguliert. Ephrin-B2 ist zusammenmit ephrinBl in den Somiten exprimiert, angrenzend am Wachstumspfad intersomitischer Gefässe.
Dies lässt vermuten, dass ephrin-B1 und ephrin-B2 das Auswachsen intersomitischerGefässe
Mein zweites
Zusammenfassung
regulieren. Hemmung der ephrin-B1 und ephrin-B2 Genfunktion in Xenopus Embryos zeigt,
dass ephrin-B1 und ephrin-B2 notwendig zur Regulation des Auswachsens intersomitischer
Gefässe sind, vermutlich mittels EphB4. Um den Mechansimus zu verstehen, mit dem ephrin-B
Proteine Endothelzellen zu ihrem Ziel leiten, untersuchte ich mit Hilfe eines Streifen-Assays wie
primäre humaneEndothelzellen in vitro auf ephrinB Proteine reagieren. Humane arterielle und
venöse Nabelschnur-Endothelzellenwurden auf ephrin-B beschichtete Oberflächen kultiviert
anschliessend ihr Verhalten zu beobachten. Die Ergebnissezeigen, dass sowohl arterielle
als auch venöse Endothelzellen konzentrationsabhängigephrin-B beschichtete Oberflächen
vermeiden, welches nahe legt, dass ephrin-B Liganden abstossende Signale in Endothelzellen
induzieren.
um