Zell - BIOspektrum

Special
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Zell- und Molekularbiologische Mechanismen der
Körperachsenbildung im Amphibienembryo
Herbert Steinbeisser, Max-Planck-Institut für Entwicklungsbiologie, Abteilung Zellbiologie, Tübingen
Der Amphibienembryo ist ein klassisches Objekt der entwicklungsbiologischen Forschung und der konzeptionelle Einfluß dieses Systems besteht noch heute. Der Hauptgrund hierfür ist, daß im Amphibienkeim experimentelle embryologische Techniken und molekularbiologisch-biochemische Methoden in hervorragender Weise kombiniert werden können. Während in der ersten Hälfte des vergangenen Jahrhunderts vorwiegend Embryonen von Triturus und Rana untersucht wurden ist heute der Südafrikanische Krallenfrosch Xenopus laevis
das embryologische Standard-Amphibium [1]. Dennoch sind die Hauptfragestellungen gleichgeblieben, nämlich wie aus einem befruchteten Ei in wenigen Stunden ein Embryo mit dorsoventaler (D/V) und anteroposteriorer (A/P) Polarität entsteht. Trotz beachtlicher Forschritte bei der Entschlüsselung dieser Phänomene sind
die genetischen und zellbiologischen Grundlagen der Achsenbildung nicht umfassend verstanden. In diesem
Artikel möchte ich auf folgende Aspekte der Xenopus-Embryogenese eingehen: 1. Wann und wie wird die dorsoventale Polarität in das radiärsymmetrische Ei eingeführt? 2. Wie steuern diese Signale die zeitlich und
räumlich kontrollierte Expression von Genen? 3. Wie werden die Keimblätter spezifiziert und die anteroposteriore Achse gebildet? Dazu sollen in exemplarischer Form molekulare Komponenten und Mechanismen vorgestellt werden, welche die Entwicklung vom Ei zur Kaulquappe steuern.
Definition der Dorsalseite im
befruchteten Ei
쑺 Die Etablierung der D/VPolarität im Xenopus-Embryo
beginnt mit dem Eintritt des
Spermiums in die animale Hälfte des Eis. Die Dorsalseite entsteht dann in der Eihälfte, die
der Spermieneintrittsstelle ge-
genüberliegt. Der Spermieneintritt initiiert eine Vielzahl von
zellulären Reaktionen im Ei,
wie die Vorkernbildung und die
Exozytose von kortikalen Granula. Der mit dieser verbundene Wassereinstrom in den Raum
zwischen Vitellin- und Eimembran führt dazu, daß sich das Ei
im Schwerefeld so ausrichtet,
Abb. 1: Symmetriebruch im befruchteten Ei .
(A) Die ausgewachsene Xenopus-Oocyte reift unter Hormoneinfluß zum
befruchtungsfähigen Ei, wobei sich der Oocytenkern auflöst. (B) Das Ei ist
befruchtet, die Vorkerne wandern aufeinander zu und verschmelzen. (A’, B’)
In der ersten Stunde nach der Besamung rotiert der Eikortex zu der Seite,
die der Spermieneintrittsstelle gegenüber liegt. Das innere Zytoplasma
bleibt in seiner Lage unverändert. (A, B verändert nach Hausen und
Riebesell, 1990 [1]
daß die vegetale Hälfte, welche
schwere Dotterschollen enthält,
nach unten zeigt. Gleichzeitig
beginnt der Eikortex gegenüber
dem inneren Eiplasma um ca.
30° zu rotieren, so daß Material
aus dem vegetalen Polbereich
auf die dem Spermieneintrittspunkt gegenüberliegende Seite
bewegt wird (Abb. 1). Dieser
Prozeß der kortikalen Rotation,
welcher in den ersten 45 Minuten nach der Besamung stattfindet, ist der entscheidende, die
Symmetrie brechende Schritt im
Ei, welcher für die Etablierung
der D/V-Achse unabdingbar ist.
Wird ein früher Embryo vom
vegetalen Pol her mit UV bestrahlt, wodurch die Kortikalrotation verhindert wird, kann er
keine dorsalen und anterioren
Strukturen bilden. Solche „ventralisierten“ Embryonen haben
weder Köpfe noch Achsenstrukturen wie Chorda dorsalis
oder Somiten und werden als
„Bauchstücke“ bezeichnet. Interessanterweise können in solchen experimentell ventralisierten Embryonen die Achsenstrukturen vollständig gerettet
werden, indem man die befruchteten Eier kurz nach der UVBehandlung um 90° rotiert [2, 3]
(Abb. 2). Dieses Experiment
zeigt, daß die kortexassoziierte
dorsalisierende Aktivität (KADA)
durch die UV-Behandlung nicht
zerstört wird, sondern daß ihre
korrekte Positionierung durch
die Inhibition der Kortikalrota-
tion verhindert wird. Die molekulare Basis der KADA ist noch
nicht vollständig aufgeklärt, aber
es konnten schon einige Komponenten identifiziert werden.
Da die Kortikalrotation sehr früh
in der Embryogenese abläuft,
die zygotische Expression von
Genen aber erst Stunden später
in der Blastula beginnt, ist anzunehmen, daß sich maternale
dorsalisierende Aktivitäten im
Ei befinden müssen. In den letzten Jahren hat es sich gezeigt,
daß die Wnt-Signaltransduktionskaskade eine wichtige Rolle
bei der D/V-Spezifizierung spielt
[4] (Abb. 2). Ein Indikator für einen aktiven Wnt-1-Signaltranduktionsweg ist die Stabilisierung von zytoplasmatischem
β-Catenin und die Akkumulation dieses Proteins in den Zellkernen [4, 5]. Dort ist β-Catenin
in Verbindung mit Transkriptionsfaktoren der TCF-Klasse in
der Lage, Zielgene transkriptionell zu regulieren. Es gibt experimentelle Hinweise, daß im
Laufe der Kortikalrotation intrazelluläre Komponenten des
Wnt-Signalwegs wie β-Catenin
oder Dishevelled auf der Dorsalseite angereichert werden und
auf diese Weise die Wnt-Kaskade aktiviert wird [3, 4, 6]. Neuere Daten weisen aber auch auf
die Beteiligung von maternalen
Wnt-Liganden und Rezeptoren
der Frizzled-Familie bei der
Aktivierung des Wnt-Signalwegen auf der Dorsalseite hin [7].
Auch die Rolle des APC-Proteins, welches ein Teil der KADA
zu sein scheint, welches nicht
ausschließlich durch Wnt-Signale reguliert werden kann, ist
noch nicht verstanden [4, 8]. Unabhängig davon wie die Stabilisierung und Kernwanderung
von β-Catenin bewerkstelligt
wird, kann sie als frühester molekularer Marker für die Dorsalseite genutzt werden.
Bildung des Spemannschen
Organisators und die
Spezifizierung des Mesoderms
쑺 Ein weiterer, wichtiger
Schritt in der Frühembryogenese ist die Definition der Keimblätter. Der animale Bereich des
Embryos wird zum Ektoderm,
während der vegetale Bereich
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Abb. 2: Kortexassoziierte dorsalisierende Aktivität und Wnt-Signalweg.
(A) Die kortikale Rotation bewegt die kortexassoziierte dorsalisiernde Aktivität (KADA) in Richtung animaler Pol, so daß sie mit dem prospektiven Mesoderm
überlappt. Im durch UV ventralisierten Embryo bleibt die KADA am vegetalen Pol liegen, und der Keim bildet keine dorsalen Achsenstrukturen aus. Durch
Drehung des UV-Embryos um 90° werden KADA und Mesoderm wieder zur Deckung gebracht, und die embryonale Achse wird gerettet. Die KADA führt zur
Akkumulation von b-Catenin-Protein in den Zellkernen, was ein Indikator für einen aktiven Wnt-1 Signalweg ist.
(B) Die Wnt-Signaltransduktioskaskade.
Die Bindung eines sekretierten Wnt-Liganden an einen Frizzled-Rezeptor führt zu einer Aktivierung des Dishevelled-Proteins, was die Hemmung der
Glykogen-Synthase-Kinase3 (GSK3) zur Folge hat. b-Catenin wird durch GSK3 phosphoryliert und danach schnell abgebaut. Die Hemmung von GSK3 führt
zur Stabilisierung von zytoplasmatischem b-Catenin, welches dann in den Kern wandert und mit Transkriptionsfaktoren der TCF-Klasse Zielgene wie
siamois, twin und nodal related 3(Xnr3) aktivieren kann. Axin ist ein negativer Regulator des Wnt-Signalweges, während für das Adenomatous Polyposis
Coli (APC)-Protein sowohl aktivierende als auch hemmende Aktivitäten beschrieben sind.
zum Entoderm wird. Die zwischen Ekto- und Entoderm liegende marginale Zone differenziert zum Mesoderm. Dazu muß
dieses Gewebe induziert werden, das heißt, Zellen aus der
animalen und vegetalen Hälfte
müssen interagieren, damit sich
das Mesoderm bilden kann. Der
Prozeß der Mesoderminduktion
erstreckt sich über mehrere
Stunden, vom 32-Zell-Stadium
bis zur frühen Gastrula und sowohl maternale als auch zygotische Aktivitäten sind daran beteiligt. Dazu zählen vor allem
Wachtumsfaktoren der TGF-β−
und FGF-Klassen, aber auch
maternale Transkritionsfaktoren
wie das T-Box-Protein Veg-T
(Abb. 3). Werden im Embryo experimentell die FGF und TGFβ-Signalwege unterbrochen, z.B.
durch Expression von dominant
negativ wirkenden Rezeptormutanten, kann das Mesoderm
nicht oder nur unvollständig gebildet werden [6]. Das Mesoderm kommt im Zuge der Gastrulation durch Invagination
zwischen Ecto- und Entoderm
zu liegen. Die morphogenetischen Bewegungen während der
Gastrulation beinhalten die vegetale Rotation des Entoderms
und die konvergente Extension
des Mesoderms, welche zur Ausbildung der A/P-Achse im Embryo führt [6, 9]. Die Stelle an
der die Gastrulation beginnt,
liegt auf der Dorsalseite und
wird als obere Urmundlippe
oder Spemannscher Organisator
bezeichnet (Abb. 3). In ihren
Transplantationsexperimenten
konnten Hans Spemann und
Hilde Mangold in den 20er Jahren des vergangenen Jahrhunderts zeigen, daß die obere Urmundlippe in der Lage ist, eine
komplette Körperachse auf der
Ventralseite zu induzieren. Dazu
muß das implantierte Gewebe
ventrales Mesoderm, welches zu
Blut differenziert, in dorsales
umprogrammieren, welches unter anderem Somiten bildet. Mit
der Identifizierung von Organisator-spezifisch exprimierten
Genen Anfang der 90er Jahre
konnte die molekulargenetische
Analyse dieser Sturuktur beginnen. Im Laufe der letzten 10
Jahre wurden ca. 20 Organisatorspezifische Proteinfaktoren beschrieben, von denen einige
Achsen-induzierende Aktivität,
ähnlich der oberen Urmundlippe besitzen [6] (Abb. 5). Entscheidende Fragen sind nun,
wie diese Gene im Organisator
aktiviert und reguliert werden
und welche Genprodukte den
Keimblättern ihre jeweilige
Identität verleihen. Als frühe
molekulare Marker für das gesamte Mesoderm dienen hauptsächlich Transkriptionsfaktoren
der T-Box-Klasse wie Brachyury (Xbra) und Veg-T sowie
TGF-β-Wachstumsfaktoren der
Nodal-Familie.
Die Gene, welche ausschließlich im dorsalen Mesoderm aktiviert werden, unterliegen verschiedenen Regulationsmechanismen. Eine Gruppe von
dorsal-spezifisch exprimierten
Genen wird durch die Kortikalrotation, das heißt durch die
Aktivierung des Wnt-1-Signalwegs induziert. Dazu zählen die
Homöoboxgene siamois und twin
sowie dem TGF-Protein Nodal
related 3(Xnr3), deren Aktivierung auf der Dorsalseite unabhängig von Mesoderm-induzierenden Faktoren ist. Im Gegensatz dazu benötigen andere Spemann-Organisator-spezifisch exprimierte Gene wie das Homöoboxgen goosecoid den mesodermalen Kontext um stabil aktiviert zu werden [3, 6, 10, 11].
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Abb. 3: Dorsoventrale Spezifizierung des Mesoderms.
Das Überlappen von Kortexassoziierter dorsalisierender
Aktivität und des Mesoderms führt
in der marginalen Zone zur
Ausbildung des Spemannschen
Organisators. Das Mesoderm
exprimiert T-Box-Proteine wie
Brachyury(Xbra) und Veg-T und
benötigt aktive TGF-b- und FGFSignalwege. Proteine aus dem
Organisator, wie z.B. der sekretierte
Faktor Chordin und das Homöoboxprotein Goosecoid, dorsalisieren
das Mesoderm. Im Gegensatz dazu
haben Proteine wie BMP-4 oder
Homöoboxproteine der VentFamilie einen ventralisierenden
Einfluß. Die Aktivität von zygotischem Xwnt-8 wird dorsal durch
sekretierte Inhibitoren wie Frzb und
ventral durch Sizzled unterdrückt.
Dies beschränkt die Wnt-Aktivität
auf das somitogene Mesoderm.
Markergenexpression in Xenopus
Gastrulae: Ventrales Mesoderm
exprimiert sizzled(B), somitogenes
Mesoderm myf-5(C), Organisator
goosecoid (D). Die Pfeile geben die
Position der dorsalen Urmundlippe
Dies zeigt, daß zur Ausbildung
eines „kompletten“ Organisators
die Kortikaltrotation und die
Mesoderminduktion notwendig
sind. An der Stelle, an der das
Mesoderm mit der KADA überlappt, bildet sich der Organisator
aus. Eine solche Synergie der
verschiedenen Aktivitäten (Mesoderm + KADA) als Voraussetzung für das Entstehen dorsaler
Strukturen im Embryo wurde
bereits 1937 von Dalcq und Pasteels in ihrer KortikalgradientenTheorie postuliert [12]. Die Ergebnisse neuerer Forschun-
Abb. 4: Negative Autoregulation von Organisator und Antiorganisator BMP4 induziert die Expression des Pseudorezeptors BAMBI (BMP Activin Membrane Bound Inhibitor), welcher das BMP-Signal antagonisiert. Dorsalisierende Faktoren induzieren im Organisator ADMP (Anti Dorsalizing Morphogenetic Protein), das zur BMP-Klasse gehört und ventralisierende Aktivität
besitzt.
gen stützen diese vor mehr als 60
Jahren formulierte Hypothese.
Die D/V-Spezifizierung des Mesoderms wurde lange Zeit damit
erklärt, daß die Aktivitäten des
Organisators das Mesoderm dorsalisieren und das ventrale Mesoderm sich in Abwesenheit dieser Faktoren bildet, also den „default state“ darstellt. Die Forschung der letzten Jahre zeigte
aber, daß auf der Ventralseite des
Embryos ein sogenannter „Antiorganisator“ aktiv ist, der das
Mesoderm ventralisiert und die
dorsalisierenden Faktoren antagonisiert (Abb. 3). Eine zentrale Rolle kommt hierbei dem
BMP-4 (Bone Morphogentic
Protein 4) zu, ein sekretiertes
TGF-b-Protein, welches das
ventrale Morphogen darstellt.
BMP-4 steht in antagonistischer
Wechselwirkung mit sekretierten Proteinen des Organisators
wie Chordin, Noggin und Follistatin und verhindert so die Ausbreitung der dorsalisierenden
Aktivitäten [3, 6]. Ein weiteres
sekretiertes Protein, Xwnt-8,
welches im ventrolateralen Mesoderm exprimiert wird, ist entscheidend für die Definition des
somitogenen Mesoderms. BMP4 und Xwnt-8 müssen auf der
Dorsalseite inhibiert werden,
damit der Kopf als anteriorste
Struktur des Embryos entstehen
kann [6, 13]. Dies wird durch die
Aktivitäten von Kopf induzierenden Faktoren wie Cerberus und
Dickkopf erreicht [4, 14]. Die
Ausdehnung des somitogenen
Mesoderms wird auf der Ventralseite durch die Hemmung von
Xwnt-8 erreicht wobei das sekretierte Protein Sizzled eine wichtige Rolle spielt [15]. Obwohl einige wichtige Komponenten der
D/V-Spezifizierung des Mesoderms identifiziert und charakterisiert sind, bleiben doch Fragezeichen. Unverstanden ist noch
immer die Beteiligung der RelProteine bzw. von Spätzle/Toll/
Dorsal-artigen Signaltransduktionswegen sowie die Rolle G-Protein-abhängiger Signalkaskaden.
Die Aktivierung eines Spätzle/
Toll/Dorsal-artigen Signalweges
oder die Inhibition von Inositoltriphosphat (IP3) oder cyclischem Adenosintriphosphat
(cAMP) dorsalisieren das Mesoderm, was dazu führt, daß Achsenstrukturen im UV-ventraliserten Embryo gerettet werden [6,
17, 18] (Abb. 5).
Eine der interessantesten
Beobachtungen bezüglich der
Regulation von Genen, die das
Mesoderm spezifizieren, ist das
Vorhandensein von negativen
autoregulatorischen Schleifen.
Das heißt, Genprodukte induzieren die Expression ihrer eigenen Repressoren. So induzieren
z.B. dorsalisierende Organisatorfaktoren dorsal die Expression
von ADMP (Anti Dorsalizing
Morphogentic Protein), einem
sekretierten Faktor mit ventralisierender Aktivität [ 19]. BMP4 dagegen induziert im ventrolateralen Mesoderm die Expression eines Pseudorezeptors
BAMBI (BMP and Activin Membrane Bound Inhibitor), welcher
das BMP-Signal durch Interaktion mit dem BMP-Rezeptor inhibiert [20] (Abb. 4). Durch solche Rückkopplungsmechanismen stellt der Embryo sicher,
daß es zu keiner unkontrollierten Ausbreitung von dorsalisie-
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Abb. 5: Rettung von
Achsenstrukturen im UVEmbryo durch ectopische
Expression von dorsalisierenden Faktoren.
Der ventrale Charakter
des gesamten Mesoderms im UV- behandelten Embryo kann durch
Mikroinjektion von
synthetischer mRNAs, die
für Proteine verschiedenster Klassen kodieren,
dorsalisiert werden.
Durch die ectopische
Aktivität der dorsalisierenden Faktoren entsteht
ein Organisator, und die
Achsenstrukturen im
Embryo werden wiederhergestellt. Die
Achsenrettung kann
komplett sein, das heißt
den Kopf beinhalten oder
auf den Rumpf und
Schwanz beschränkt
bleiben.
renden oder ventralisierenden Aktivitäten
kommen kann, was fatale Konsequenzen auf
die Ausbildung der Achsensysteme hätte.
rekt zitiert werden konnten, um Verständnis und Nachsicht. Ulrike Gossweiler danke ich für die Hilfe beim Anfertigen der Abbildungen.
Schlußbemerkung und Ausblick
Literatur
Der konzeptionelle Einfluß, den die
Analyse der Xenopus- Frühembryogenese auf
andere Vertebratensysteme ausübte und
weiterhin ausüben wird, ist beachtlich. Die
Analyse von Zebrafischmutanten mit defekten in der frühen Embryonalentwicklung
zeigten mit genetischen Ansätzen, daß hier
die gleichen Spezifizierungsmechanismen
verwirklicht sind, wie bei Xenopus. Auch die
molekularen Komponenten, die dabei Verwendung finden, sind weitgehend identisch.
Vertebraten-Systeme wie Zebrafisch oder
Maus bieten die Möglichkeit, Genfunktionen durch genetische Methoden zu analysieren, was bei Xenopus bisher nicht machbar war. In den letzten Jahren wurden aber
auch bei Xenopus auf diesem Gebiet Fortschritte erzielt. Die Herstellung transgener
Frösche ist mittlerweile soweit perfektioniert, daß sie in vielen Labors weltweit genutzt werden kann. Durch die Verwendung
von Xenopus tropicalis, einer schnellwachsenden Xenopus-Art, rücken auch genetische Analysen in den Bereich des Möglichen [21].
Danksagung
Ich bitte alle Kollegen, deren wichtige
Originalarbeiten aus Platzgründen nicht di-
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Korrespondenzadresse
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