Keimbahnmutationen im KRAS Gen verursachen das Noonan
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Aus dem Zentrum für Kinderheilkunde und Jugendmedizin Klinik IV: Pädiatrische Hämatologie und Onkologie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Keimbahnmutationen im KRAS Gen verursachen das Noonan-Syndrom INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität in Freiburg im Breisgau vorgelegt 2006 von cand. med. Silke Böll geboren in Sigmaringen 2 ___________________________________________________________________ Dekan: Universitätsprofessor Dr. med. C. Peters 1. Gutachter: Privatdozent Dr. med. C.P. Kratz 2. Gutachter: Privatdozent Dr. med. J. Scheele Jahr der Promotion: 2008 ___________________________________________________________________ 3 Mariapia und meiner Familie ___________________________________________________________________ Die vorliegende Arbeit wurde am Zentrum für Kinderheilkunde und Jugendmedizin, Klink IV Pädiatrische Hämatologie und Onkologie der Universitätsklinik der AlbertLudwigs-Universität Freiburg in der Zeit von April 2004 bis Juli 2006 angefertigt. ___________________________________________________________________ 4 Danksagung Allen, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben, möchte ich hiermit herzlich danken: Frau Universitätsprofessorin Dr. med. Charlotte Niemeyer für die Möglichkeit in Ihrem Labor zu arbeiten, Herrn Privatdozent Dr. med. Christian Kratz für Projektidee und für die Überlassung des Themas, die gute Betreuung, sowie die Hilfe beim Verfassen dieser Arbeit, Herrn Privatdozent Dr. Scheele für die Übernahme der Zweitkorrektur, Herrn Privatdozent Dr. med. Martin Zenker für die DNA Proben von Patienten mit Noonan-Syndrom und die Bestätigungssequenzierung und Frau Cornelia Klein sowie dem übrigen Laborteam für die technische Hilfe. 5 Inhaltsverzeichnis Seite 1. Einleitung 7 1.1. Noonan-Syndrom 7 1.2. Ras Proteine 9 1.3. Ras abhängige Signalwege 10 2. Hypothese zur Identifizierung neuer Gene für das Noonan-Syndrom 12 3. Patienten und Methoden 13 4. Ergebnisse 15 5. Diskussion 17 5.1. Noonan-Syndrom verwandte Syndrome 17 5.2. Genetische Grundlagen des Noonan-Syndroms und verwandter Syndrome 18 5.3. Somatische Mutationen im Noonan-Gen PTPN11 19 5.4. JMML, Neurofibromatose Typ 1 und das Neurofibromatose Noonan-Syndrom 20 5.5. Identifizierung weiterer Noonan-Gene 21 5.6. KRAS als Onko- und Entwicklungsgen: Funktionelle Studien zur Belegung dieser 21 Hypothese 5.7. Neue Mechanismen der Ras Aktivierung 23 5.8. Ras-Signalwegmutationen beim Kardio-fazio-kutanen Syndrom 24 5.9. Keimbahn HRAS Mutationen verursachen das Costello Syndrom 25 5.10. Das Neuro-Kardio-Fazio-kutane Syndrom 25 5.11. Keimbahnmutation in weiteren Neoplasie-assoziierten Genen 28 6. Ausblick 28 7. Literaturverzeichnis 29 8. Zusammenfassung 38 6 Verzeichnis häufig verwendeter Abkürzungen CFC, kardio-fazio-kutanes Syndrom CS, Costello-Syndrom GAP, GTPase aktivierendes Protein GDP, Guanosindiphosphat G-Protein, Guaninnukleotid-bindendes Protein GTP, Guanosintriphosphat JMML, Juvenile myelomonozytäre Leukämie LS, LEOPARD-Syndrom MPD, myeloproliferative Erkrankung NCFC, Neuro-kardio-fazio-kutanes Syndrom NF1, Neurofibromatose Typ1 NFNS, Neurofibromatose Noonan-Syndrom NS, Noonan-Syndrom NS/JMML, JMML-artige Erkrankung bei Säuglingen mit Noonan-Syndrom 7 1. Einleitung 1.1. Noonan-Syndrom Das Noonan-Syndrom (NS; OMIM 163950) ist eine meist autosomal dominant, selten auch autosomal rezessiv vererbte Erkrankung, die durch proportionierten Kleinwuchs, typische Gesichtszüge und variable kongenitale Herzfehler charakterisiert ist (Tab. 1). Die Inzidenz wird auf 1:2000 Lebendgeburten geschätzt (1, 44, 64). Das Malformationssyndrom wird in ~50% der Fälle durch heterozygote aktivierende Keimbahnmutationen im PTPN11 Gen, das für das Protein SHP-2 kodiert, verursacht (61). SHP-2 fungiert als Signal steigernde Komponente bei der Aktivierung des Ras/ERK Signalwegs und ist damit an multiplen fundamentalen Prozessen wie Zellproliferation, -differenzierung und Zellmigration beteiligt (41). Es wird vermutet, dass die vielfältigen phänotypischen Veränderungen, die bei Individuen mit NS beobachtet werden, durch eine konstitutive Fehlregulation des Ras-Signalwegs vermittelt werden. Die Annahme wird weiter dadurch gestützt, dass Patienten mit Neurofibromatose Typ 1 (NF1) ebenfalls Symptome aus dem Noonan-Spektrum haben können (7). Die NF1 wird durch inaktivierende Mutationen im Tumorsuppressor Gen NF1, welches das GTPase aktivierende Protein (GAP) Neurofibromin kodiert, verursacht. Diese Daten unterstützen die Hypothese, dass die gemeinsame Grundlage der Erkrankungen des NS-Spektrums eine Dysregulation des Ras-Signalwegs ist. Trotz der enormen Fortschritte der Forschung auf diesem Gebiet blieben bis vor Beginn dieser Arbeit weitere NS-Gene unbekannt. 8 Tabelle 1: Klinische Auffälligkeiten bei Patienten mit Noonan-Syndrom Dysmorphie Epikanthus Ptosis Nach außen abfallende Lieder Dreieckige Gesichtsform Tiefsitzende, kräftige Ohren Mild pigmentierte Iris Lockiges, grobes Haar Kardiovaskuläres System Angeborene Herzfehler (Pulmonalstenose > atrioventrikuläre Septumdefekte > Aortenstenose > Vorhofseptumdefekt vom Sekundumtyp > Mitralklappendefekte > Fallot Tetralogie > Ventrikelseptumdefekte > persistierender Ductus arteriosus Botalli Kleinwuchs Pterygium colli mit tiefem hinterem Haaransatz Skelett Trichter- oder Kielbrust Cubitus valgus Skoliose Wirbelfehlbildungen Kryptorchismus Fütterungsschwierigkeiten Entwicklung Verzögerung Aufmerksamkeitsdefizit und Hyperaktivität Hämatologie Blutungsneigung (von Willebrand Syndrom, Faktor XI und XII Mangel) Thrombozytopenie Postnatale Myeloproliferation Augen Strabismus Myopie Schwerhörigkeit Mund/Zähne Hoher Gaumen Malocclusion Lymphatisches System Lymphödeme Lymphangiektasie 9 1.2. Ras Proteine Ras Proteine sind Signalschaltmoleküle, die fundamentale zelluläre Prozesse regulieren indem sie zwischen einer aktiven Guanosintriphosphat (GTP)-gebundenen Form (RasGTP) und einer inaktiven Guanosindiphosphat (GDP)-gebundenen Form (Ras-GDP) wechseln können (Abb. 1). Ras-GTP Konzentrationen werden durch das kompetitive Wirken von Guanosinnukleotid Austauschfaktoren (GNEFs) einerseits und GTPaseaktivierenden Proteinen (GAPs, z.B. p120GAP, Neurofibromin) andererseits reguliert. Extrazelluläre Stimuli, wie Wachstumsfaktorrezeptoren, die Bindung kreieren von Liganden Bindungsstellen für an verschiedenen Adaptermoleküle und Signalfortleitungsmoleküle (GRP2, SHC, GAB2). Diese Moleküle rekrutieren und aktivieren GNEFs wie das Protein SOS. GNEFs verdrängen an Ras gebundenes GDP. Hierdurch kann Ras passiv an GTP, welches im Überfluss im Zytosol vorliegt, binden. Ras-GTP bindet und aktiviert Raf1, Phosphoinositid-3-OH (PI3) Kinase, RalGDS und andere Effektoren. Diese Signalweiterleitung wird durch die intrinsische GTPase-Aktivität von Ras beendet, indem Ras-GTP zu Ras-GDP hydrolysiert wird. Diese langsame ’Ausschalt’-Reaktion wird um ein Vielfaches durch GAPs beschleunigt. GAPs binden an die Effektordomäne von Ras-GTP und katalysieren die Abspaltung einer Phosphatgruppe und damit die Bildung von Ras-GDP (10, 11, 19, 25, 45, 50, 52). 10 Abbildung 1. Ras Proteine fungieren als binäre GDPGTP Schalter. Extrazelluläre Stimuli werden durch Rezeptoren wie Rezeptortyrosinkinasen (RTKs) empfangen. Diese Rezeptoren stimulieren Signal- und Adaptermoleküle SHP-2, SHC, GRP2 und GAB2. Hierdurch werden Guanosinnukleotidaustauschfaktoren (GNEFs) aktiviert. Dies führt zur transienten Ras Aktivierung. Aktiviertes Ras nimmt eine Konformation ein, die die Bindung und Stimulation von Effektormolekülen ermöglicht. Die Ras Signalfortleitung wird durch die GAP (Ras-GTPase aktivierende Protein) -vermittelte Hydrolyse von gebundenem GTP zu GDP und Loslösung von Effektormolekülen beendet [modifiziert nach (45)]. Grb2 Shc Gab2 SHP-2 GDP GNEF GTP RTK Ras Ras GDP Pi GAP GTP H20 Effektor 1.3. Ras abhängige Signalwege In der aktiven, GTP-gebundenen Form bindet und aktiviert Ras verschiedene Effektorproteine (Abb. 2). Hierdurch steuert Ras vielfältige Signalwege, welche fundamentale zelluläre Prozesse wie Proliferation und Zellüberleben regulieren. Vier wichtige Ras Effektoren bzw. Effektorsignalwege sind: (a) Ras-Raf-MEK-ERK Signalweg. Durch Ras aktivierte Raf Kinasen phosphorylieren MEK1 und MEK2 (Mitogen aktivierte Protein Kinase Kinase 1 und 2). Diese Kinasen aktivieren ERK1 und ERK2 (extracellular signal-regulated kinases 1 and 2). ERK stimuliert Proteine, die die Zellzyklusprogression steuern. (b) Ras-PI3K-Akt Signalweg. Ras interagiert mit der katalytischen Lipidkinasen Untereinheit konvertieren von Typ I Phosphoinosid Phosphatidylinositol 3-Kinasen (PI3Ks). (4,5)-Diphosphat (PIP2) Diese in Phosphatidylinositol (3,4,5)-Triphosphat (PIP3). PIP3 ist ein Botenmolekül, das an eine Reihe weiterer Proteine bindet. Ein wichtiges Zielprotein mit antiapoptotischer Funktion ist AKT/PKB. Ferner aktiviert PI3K das Protein Rac, ein Protein, welches das AktinZytoskelett und Transkriptionsfaktor-Signalwege reguliert; (c) Ras-RalGEF-Ral 11 Signalweg. Die vier RalGEFs (RalGDS, RGL, RGL2, RGL3) sind Ras Effektoren, die als GNEFs für die mit Ras verwandten Ral Proteine fungieren. Dieser Signalweg steuert Zellzyklus und Apoptose. (d) Ras-PLCεε (Phospholipase Cεε) Signalweg. PLCε hydrolysiert PIP2 in die zwei Botenstoffe Diazylglyzerol (DAG) und Inositol (1,4,5)Triphosphat (IP3). Über diesen Signalweg steuert Ras die Aktivierung von PKC (Proteinkinase C) und moblilisiert Ca2+ von intrazellulären Speichern (20, 45, 52). Interessanterweise entwickeln PLCε defiziente Mäuse kongenitale Herzfehler mit verdickten Semilunarklappen (56). Ras IMP Raf PI3K Tiam1 MEK1/2 PIP2 PIP3 Rac GTP PLCε PIP2 DAG+ IP3 RIN RalGEF Rab5 Ral KSR ERK1/2 PTEN Genexpression, Zellzyklusprogession Akt Zellüberleben Transkription Zytoskelett Translation PKC Ca2+ Ca2+ Signal Transkription Vesikel Transport Zellzyklusprogession Abbildung 2. Aktiviertes Ras interagiert mit verschiedenen Familien von Effektorproteinen. IMP (impedes mitogenic signal propagation) ist ein negativer Wachstumsregulator, da IMP das Protein KSR (kinase suppressor of Raf) daran hindert als Stützprotein für die Aktivierung von MEK und ERK durch Raf zu dienen. Der Tumorsuppressor PTEN ist eine Lipidkinase und konvertiert Phosphatidylinositol (3,4,5)-Triphosphat (PIP3) in Phosphatidylinositol (4,5)-Diphosphat (PIP2). Verschiedene Ras Effektoren wie Tiam1, Phospholipase Cε (PLCε) und RIN (Ras-interaction/interference) und RalGEFs dienen als Guaninnukleotid Austauschfaktoren (GNEFs) für andere Proteine der Ras Superfamilie. Die einzelnen Signalwege sind untereinander vernetzt. Abkürzungen: DAG, Diazylglyzerol; IP3, Inositol (1,4,5)-Triphosphat [modifiziert nach (45)]. Seit mehreren Dekaden ist bekannt, dass RAS Gene häufig in Malignomen mutiert sind [zusammengefasst in (9)]. Diese Mutationen führen meist zu Substitutionen an Aminosäuren G12, G13 oder Q61 und blockieren Ras in der aktiven GTP gebundenen 12 Form, indem sie die intrinsische Ras-GTPase Aktivität reduzieren und zu einer GAP Resistenz führen (19, 20, 45, 52). Lange Zeit ging man davon aus, dass diese Mutationen nur als somatische Ereignisse vorkommen. In einem Mausmodell führte die ubiquitäre Expression von endogenem K-rasG12D zum embryonalen Tod (63). Die höchste Inzidenz von RAS Mutationen wird bei Adenokarzinomen des Pankreas (90%), des Kolon (50%) und der Lunge (30%), in Schilddrüsenkarzinomen (50%) sowie in myeloischen Leukämien (30%) angegeben (9). Zu den myeloischen Neoplasien mit Aktivierung des RasSignalwegs gehört insbesondere die juvenile myelomonozytäre Leukämie (JMML). Bei dieser myeloproliferativen Erkrankung (MPD) der frühen Kindheit (42) werden Mutationen in NRAS oder KRAS (∼25%) oder in anderen Genen des Ras-Signalwegs einschließlich PTPN11 (∼35%) oder NF1 (klinische Diagnose einer NF1 bei ∼11%) in mehr als zweidrittel der Fälle identifiziert (22, 29, 36). In einem Mausmodell führt die somatische Aktivierung von Kras in hämatopoetischen Zellen zu einer aggressiven letalen MPD, welche der JMML ähnelt (12). Trotz der niedrigen jährlichen Inzidenz von etwa 1-2 pro Millionen steht die JMML im Mittelpunkt des Interesses verschiedener renommierter Arbeitsgruppen, die im klinischen Bereich sowie im Bereich der Grundlagenforschung tätig sind - wahrscheinlich aufgrund des oft letalen klinischen Verlaufs der JMML und der Assoziation mit dem NS (4) und der NF1 [zusammengefasst in (36)]. 2. Hypothese zur Identifizierung neuer Gene für das Noonan-Syndrom Keimbahnmutationen in PTPN11 aktivieren den Ras-Signalweg und verursachen das NS in etwa 50% der Fälle. Die vorliegende Arbeit untersucht die Hypothese, dass Patienten mit NS und bislang unklarem Gendefekt Keimbahnmutationen in anderen Genen tragen, die ebenfalls den Ras-Signalweg aktivieren. Nachdem im Labor bei einem Indexpatienten mit NS eine KRAS Mutation identifiziert wurde, wird in dieser Arbeit die Hypothese 13 verfolgt, dass die RAS Gene KRAS, NRAS und HRAS nicht nur als somatisch mutierte Onkogene, sondern auch als in der Keimbahn mutierte NS Gene fungieren können. 3. Patienten und Methoden Patienten. Vom Kooperationspartner PD Dr. Martin Zenker erhielt ich DNA Proben von 174 Patienten mit an drei großen Kliniken diagnostiziertem NS. Die Diagnose wurde durch erfahrene klinische Genetiker oder Pädiater gestellt. Einverständnisse wurden von allen Patienten bzw. deren Eltern eingeholt. Das Projekt wurde durch Ethik-Kommissionen der Universitäten Erlangen und Freiburg bewilligt. Als Kontrollen dienten DNA Proben von 200 Personen. Mutationsanalyse. Genomische DNA von Blut Lymphozyten wurde mit Standard Techniken isoliert. Die Mutationsanalyse des PTPN11 Genes wurde in Erlangen mit publizierten Techniken durchgeführt (58, 65) und war bei allen Patienten negativ. Die Mutationsanalyse von KRAS (Isoformen A und B), NRAS und HRAS wurde durch direkte bidirektionale Sequenzierung aufgereinigter Polymerase Kettenreaktions-(PCR) Produkte unter Verwendung eines ABI BigDye Termintor Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, California) und eines ABI3100 Capillary Array Sequencer (Applied Biosystems) oder mittels denaturierender Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (DHPLC) unter Verwendung des Wave DNA Fragment Analyse Systems (Transgenomic) durchgeführt. PCR Produkte mit abnormalem DHPLC Profil wurden re-amplifiziert, zur Bestätigung erneut mit der DHPLC untersucht und anschließend sequenziert. 14 Tabelle 2. Primer für die Mutationsanalyse mittels DHPLC GEN/ GENBANK/ PRIMER SEQUENZ (5’-3’) EINGSCHLOSSENE ANNEALING PRODUKTLÄNGE EXON NUKLEOTID FORWARD/REVERSE CODONS TEMP (BP) (°C) KRAS NM_004985 1 1 – 111 GGCCTGCTGAAAATGACTGA/ 2 112 – 290 TGTGTTTCTCCCTTCTCAGGATTC/ 1 – 37 55 162 40 – 76 55 158 97 – 149 50 387 150 – 188 53 367 1 – 37 55 191 51 – 97 55 201 98 – 150 55 320 151 – 189 51 320 1 – 37 61 312 38 – 96 63 375 97 – 150 67 302 151 – 189 63 333 GTCCTGCACCAGTAATATGC TGG CAA ATA CAC AAA GAA AGC C 3 291 – 450 TTGGTGTAGTGGAAACTAGGA/ CCTAGTATAGCATAATTGAGAG 4 451 – 564 TCAGTTGCCTGAAGAAAAACA/ AGCTAACAGTCTGCATGGAG NRAS NM_002524 1 1 – 111 GGTTTCCAACAGGTTCTTGC/ 2 112 – 290 CAAGTGGTTATAGATGGTGAAACC/ 3 291 – 450 TCCGACAAGTGAGAGACAGG AAGATCATCCTTTCAGAGAAAATAAT GCTGAGATTGCAGGCATGA/ ATATGAATATGGATCACATCTC 4 451 – 567 ATTGGAATCTTATGTCCACA/ CATATAGACAATAACACCAG HRAS NM_005343 1 1 – 111 GAGACCCTGTAGGAGGACCC/ 2 112 – 290 GCATGAGAGGTACCAGGGAGA/ 3 291 – 450 GCATGTCCTGGATGCCGCTG/ GGGTGCTGAGACGAGGGACT AGCGGCATCCAGGACATGCG GGGTCAGTGAGTGCTGCTCC 4 451 – 567 GGCAAGGCTTGATCCCACAG/ CCTGAGCTTGTGCTGGGCG Tabelle 3. Primer für die Mutationsanalyse durch Sequenzierung GEN/ GENBANK/ PRIMER SEQUENZ (5’-3’) EINGSCHLOSSENE ANNEALING PRODUKTLÄNGE EXON NUKLEOTID FORWARD/REVERSE CODONS TEMP (BP) (°C) KRAS NM_004985 1 1 – 111 NRAS NM_002524 1 1 – 111 AAAAGGTACTGGTGGAGTATTTGA/ 1 – 37 60 265 1 – 37 55 183 51 – 95 55 180 CTGTATCAAAGAATGGTCCTGC GATGTGGCTCGCCAATTAACC CACTGGGCCTCACCTCTATG 2 112 – 290 TCC CAC CAT AGA GGA TTC TTA C ATA TCC GCA AAT GAC TTG CTA TT Primersequenzen für die jeweiligen Gene und ihre Exone zur Mutationsanalyse durch Sequenzierung durch die Core Facility in Freiburg; die nicht aufgeführten Primer entsprechen für die Sequenzierung den Primern in Tabelle 2. 15 4. Ergebnisse Ich identifizierte Keimbahnmutationen in KRAS als neue Ursache des NS. Diese Arbeit zeigte, dass KRAS nicht nur als Onkogen fungiert, sondern fundamentale Prozesse bei der embryonalen Entwicklung reguliert (49). Charakteristika von Patienten mit Keimbahn KRAS Mutationen. Ein drei Monate alter weiblicher Säugling mit typischen klinischen Zeichen eines NS entwickelte eine MPD. Die Analyse von aus Leukozyten extrahierter DNA zeigte keine Mutation in PTPN11. Stattdessen wurde eine neue, heterozygote C→T Transition an Position 173 von KRAS, welche im K-Ras Protein zur Substitution T58I führt, entdeckt (Abb. 3). Diese Mutation fand sich auch in Mundschleimhautzellen der Patientin, jedoch nicht in der DNA der Eltern. Um die Prävalenz von KRAS, NRAS und HRAS Mutationen zu ermitteln, untersuchte ich anschließend Leukozyten DNA von 174 Individuen mit NS ohne PTPN11 Mutation. Mit diesen Analysen entdeckte ich weitere Keimbahn KRAS Mutationen bei vier Patienten mit NS (Patienten 2-5, Tab. 4). Die rekurrente Mutation V14I war mit einem vergleichsweise milderen Phänotyp assoziiert. Bei allen Eltern der NS-Patienten mit KRAS Mutation konnte eine Mutation durch die Analyse von DNA aus Leukozyten ausgeschlossen werden. 16 Abbildung 3. Klinischer Phänotyp und KRAS Mutationen bei Patienten mit NS. (a, b) Klinische Aspekte der Patienten 1 und 3 (s. Tab.4). (c) Exon-Intron Stuktur des humanen KRAS Gens (Isoform b). Die nicht kodierenden Exone sind blau, die Protein kodierenden Exone sind schwarz dargestellt. (d) Struktur des KRas Proteins. Dargestellt sind die Phosphat-Schleife (P-L), Switch I (Sw-I) und Switch II (Sw-II) Domänen. (e) Aminosäuresubstitutionen bei Patienten mit Sequenzvergleichen zwischen Wildtyp-H-, N- und K-Ras Proteinen. V14 befindet sich in der P-Schleife, T58 nahe des NH2 Randes von Switch II und D153 innerhalb der α5 Helix. Die drei Aminosäuren G12, G13 und Q61, die durch Neoplasie-assoziierte somatische RAS Mutationen verändert werden, sind durch Sterne markiert. 17 Tabelle 4. Patienten mit Noonan-Syndrom und Keimbahnmutation in KRAS Patient Nummer K-Ras Mutation Alter bei letzter Untersuchung Geschlecht Kongenitaler Herzfehler Noonan-typische Gesichtszüge Kleinwuchs Pterygium colli Thoraxdeformität Blutungsneigung Lymphödem Kryptorchismus Ophthalmologische Probleme Entwicklungsverzögerung Lentigines /Café-aulait Flecken MPD Sonstiges 1 c.173C>T p.T58I 24 Monate 2 c.40G>A p.V14I 13 Jahre 3 c.40G>A p.V14I 15 Jahre 4 c.40G>A p.V14I 14 Jahre 5 c.458A>T p.D153V 18 Jahre Weiblich ASD, VSD, valvuläre PS Männlich Nein Weiblich Gespaltene Mitralklappe Ja Männlich HOCM, Mitralund Trikuspidalklappenprolaps Ja Ja Ja Männlich HCM, Mitralklappenprolaps Ja <1. Perz. Ja Mild 3. Perz. Nein Nein <1. Perz. Nein Mild Nein Nein Nein Nein Nein Nein Strabismus Schwer Nein Nein Ja Strabismus, Ptosis Mild 3. Perz. Nein Breiter Thorax Ja Nein Nein Nein Nein Nein Nein Mild (IQ 82) Nein 2. Perz. Nein Milde Kielbrust Nein Nein Unilateral Strabismus, Nystagmus Mild Nein JMML Nein Nein Nein Nein SagittalnahtLaryngoGrand-mal synostose, tracheoAnfälle Makrozephalus malazie Diagnose NS/JMML NS NS NS NS Legende: HOCM: hypertrophe obstruktive Kardiomyopathie; HCM: hypertrophe Kardiomyopathie; ASD: Vorhofseptumdefekt; VSD: Ventrikelseptumdefekt; PS: Pulmonastenose; NS: Noonan-Syndrom; MPD: Myeloproliferative Erkrankung 5. Diskussion 5.1. Noonan-Syndrom verwandte Syndrome Das NS teilt verschiedene klinische Charakteristika mit deutlich selteneren Syndromen wie dem Costello Syndrom (CS), dem kardio-fazio-kutanen Syndrom (CFC) und dem LEOPARD Syndrom (LS) (57). Als gemeinsame klinische Merkmale zeigen Patienten mit diesen Syndromen Noonan-ähnliche Gesichtszüge (Abb. 4), ein ähnliches Spektrum von Herzfehlern, Kleinwuchs, und eine variable Entwicklungsverzögerung. Zusätzlich haben alle diese Syndrome charakteristische phänotypische Merkmale: (1) CS Patienten haben nasale Papillomata, lose Haut, eine starke Prädisposition für Tumore (insbesondere 18 Rhabdomyosarkome) (24); (2) CFC Patienten haben ektodermale Veränderungen mit dünnem lockigem Haar, dünnen oder fehlenden Augenwimpern (30); und (3) LS Patienten haben multiple Lentigines, die typischerweise im Jugendalter entstehen (57). Abbildung 4. kraniofazialer Phänotyp eines 10-Monate alten weiblichen Säuglings mit Noonan-Syndrom mit typischen Gesichtszügen einschließlich Hypertelorismus, breite Stirn und tief sitzenden Ohren. 5.2. Genetische Grundlagen des Noonan-Syndroms und verwandter Syndrome Das NS und das LS kann familiär mit einem dominanten Vererbungsmuster auftreten [abgesehen von seltenen NS Fällen, bei denen eine rezessive Vererbung vermutet wird (64)]. Jedoch sind die meisten Fälle und soweit bekannt alle Fälle der schwereren Syndrome CFC und CS sporadisch, so dass hier vermutlich dominante neue Mutationen vorliegen. Bis vor kurzem war die genetische Grundlage dieser Störungen unklar. Es war unbekannt, ob es sich um genetisch distinkte Entitäten oder um Syndrome mit einer gemeinsamen genetischen Grundlage handelt. Mit Kopplungsanalysen bei Familien mit NS konnte die Erkrankung auf Chromosom 12 Bande q24 lokalisiert werden (27). Anschließend wurde gezeigt, dass etwa 50% aller Patienten mit NS Keimbahnmutationen in PTPN11 tragen (61). Das PTPN11 Gen kodiert für SHP-2, eine Phosphatase, die Wachstumssignale von aktivierten Wachstumsfaktorrezeptoren an andere Signalmoleküle fortleitet, einschließlich Ras [zusammengefasst in (41)]. Die meisten PTPN11 Mutationen zerstören die Auto-Inhibition der katalytischen Phosphatase (PTPase)-Domäne durch die 19 N-terminale src-homology 2 (N-SH2)-Domäne. Hierdurch wird die aktive Form des Proteins bevorzugt eingenommen (41). Bei Patienten mit CS oder CFC wurden keine PTPN11 Mutationen identifiziert [zusammengefasst in (57)], jedoch spezifische Mutationen bei Patienten mit LS (18). Im Gegensatz zu den aktivierenden Mutationen beim NS sind die LS-assoziierten Mutationen inaktivierend und haben einen dominant negativen Mechanismus (33, 60). 5.3. Somatische Mutationen im Noonan-Gen PTPN11 Kurz nach der Entdeckung von PTPN11 Mutationen bei Individuen mit NS wurden spezifische Keimbahn PTPN11 Mutation bei Säuglingen mit NS und einer JMMLähnlichen MPD (NS/JMML) identifiziert (39, 62). Daraufhin konnten somatische PTPN11 Mutationen in JMML Zellen von 35% aller untersuchten Patienten mit nicht-syndromaler JMML identifiziert werden (34, 39, 62). Folgestudien haben gezeigt, dass somatische PTPN11 Mutationen auch bei der B-Zell Vorläufer akuten lymphoblastischen Leukämie (59) und selten auch bei anderen Neoplasien auftreten (6). Somatische Mutationen bei Patienten mit JMML unterscheiden sich von Mutationen bei Patienten mit NS/JMML und von Mutationen bei Patienten mit NS ohne JMML. Bei der sporadischen JMML führt die häufigste Mutation zu einer E76K Substitution. Diese Mutation wurde bisher nicht bei Patienten mit NS (N308D ist beim NS die häufigste Mutation) oder NS/JMML (T73I am häufigsten) entdeckt (34, 57). In eleganten funktionellen Experimenten haben verschiedene Arbeitsgruppen gezeigt, dass somatische JMML-assoziierte PTPN11 Mutationen stärkere biochemische und biologische Effekte ausüben als NS-assoziierte Keimbahnmutationen in PTPN11. Dies führte zu dem Konzept, dass nur die milde Aktivierung von SHP-2 während der Embryonalentwicklung toleriert wird (14, 40, 48). Mittlerweile ist jedoch klar, dass dieses simple Modell den komplexen Sachverhalt nicht ausreichend erklärt. Enzymatische, strukturelle und mathematische Analysen zeigen, 20 dass die Mutanten in unterschiedlicher Weise die basale Aktivierung, die SH2-DomänePhosphopeptid-Affinität und/oder Substratspezifität beeinflussen und es besteht keine absolute Korrelation zwischen dem Ausmaß der basalen SHP-2 Aktivierung und dem Ausmaß der induzierten Erkrankung (31). Ein murines knock-in Ptpn11D61G/+ NS-Modell wurde konstruiert. Dieses Modell zeigte, dass in den Endokardkissen dieser Mäuse eine vermehrte Aktivierung von ERK nachweisbar ist (3). Diese Beobachtung legt nahe, dass der durch PTPN11 Mutationen ausgelöste Phänotyp durch einen hyperaktiven RasSignalweg ausgelöst wird. 5.4. JMML, Neurofibromatose Typ 1 und das Neurofibromatose Noonan-Syndrom Die JMML ist zudem mit der NF1, einem autosomal dominant vererbten Syndrom, welches bei 1 von 4000 Geburten auftritt und durch Pigmentstörungen (café-au-lait Flecken), Prädisposition zu benignen und malignen Tumoren insbesondere neurogenen Ursprungs charakterisiert ist, assoziiert. Das Syndrom wird durch Mutationen im NF1Tumorsuppressor Gen verursacht, welches das Ras-GAP Neurofibromin kodiert. Bei Kindern mit NF1 ist die JMML-Inzidenz etwa 200-fach erhöht [zusammengefasst in (53)]. Der Verlust des normalen NF1 Allels (loss of heterozygosity, LOH) ist ein häufiges Ereignis in JMML Zellen von Kindern mit NF1 (51, 54). Dies resultiert in einem deregulierten Ras-Signal und verursacht ein gesteigertes Wachstum hämatopoetischer Progenitor Kolonien in vitro (8). Der adoptive Transfer von homozygot Nf1 mutanten fetalen Leberzellen oder die somatische Inaktivierung eines konditional mutierten Nf1 Allels in hämatopoetischen Zellen induziert eine JMML-ähnliche MPD bei Mäusen (35, 37). Bemerkenswerterweise haben viele NF1 Patienten milde NS-ähnliche Züge (15). Einige Patienten entwickeln sogar einen gemischten Phänotyp, der als separate Entität behandelt wird und mit dem Begriff Neurofibromatose Noonan-Syndrom (OMIM 601321; 21 NFNS) bezeichnet wird. Die meisten Patienten mit NFNS tragen NF1 Mutationen ohne eine augenscheinliche Genotyp-Phänotyp Korrelation (17). 5.5 Identifizierung weiterer Noonan-Gene Die Identifizierung weiterer NS-Gene wurde bis heute durch den Umstand erschwert, dass PTPN11-Mutation-negative NS-Patienten sporadische Fälle repräsentieren (65), wodurch eine Kopplungsanalyse unmöglich ist. Meine Arbeit und die Forschungsarbeit anderer Gruppen identifizierten Keimbahnmutationen in Komponenten des Ras-Signalwegs bei Patienten mit NS und verwandten Syndromen (2, 13, 43, 47, 49). Nachdem im Labor bei einer Indexpatientin mit NS/JMML eine de novo Keimbahn KRAS Mutation identifiziert wurde, suchte ich systematisch RAS Mutationen bei Patienten mit NS (49). Die Mutation c.173C>T (p.T58I), die bei der Indexpatientin identifiziert wurde, betrifft eine hoch konservierte Aminosäure von K-Ras und flankiert die Switch II Region (Aminosäuren 5967) des K-Ras Proteins. De novo KRAS Mutationen wurden bei 4 von 174 sporadischen Fällen mit NS, bei denen zuvor eine PTPN11 Mutation ausgeschlossen wurde, identifiziert. Anschließend wurde auch bei einem von 12 Patienten mit CFC eine KRAS Keimbahnmutation entdeckt (49). Alle Keimbahn KRAS Mutationen waren neu und nicht als Neoplasie-assoziierte Mutationen bekannt. NS-assoziierte KRAS Allele beinhalteten die rekurrente Mutation V14I und D153V. Letztere Mutation wurde später auch bei schwerer betroffenen Patienten identifiziert (13, 43). Die Punktmutation, die bei dem CFC Patient identifiziert wurde, sagt den Aminosäureaustausch P34R voraus. 5.6. KRAS als Onko- und Entwicklungsgen: Funktionelle Studien zur Belegung dieser Hypothese Analog zu der Doppelrolle von PTPN11 als Onko- und Entwicklungsgen, führte diese Beobachtung zur Hypothese, dass KRAS nicht nur als Onkogen agiert, sondern dass 22 mild-aktivierende K-Ras Keimbahnmutationen zu einer embryonalen Entwicklungsstörung führen. Um diese Hypothese zu beweisen, wurden im Labor des Kooperationspartners Kevin Shannon funktionelle Analysen durchgeführt. Es wurden rekombinante V14I und T58I K-Ras Proteine produziert, um die Moleküle in vitro zu analysieren. Beide Mutationen hatten eine gestörte intrinsische GTPase Aktivität. In Übereinstimmung mit der Hypothese, dass Keimbahn KRAS Mutationen milde Effekte ausüben, war die intrinsische GTPase Aktivität von NS-assoziierten Mutanten V14I und T58I deutlich stärker als die GTPase Aktivität von G12D K-Ras, eine Neoplasie-assoziierte Mutation. Diese Analysen wurden unter Zugaben von rekombinantem Neurofibromin oder p120 GAP wiederholt. Auch hierbei zeigten V14I und T58I K-Ras milde Effekte im Vergleich zur onkogenen Mutation K-Ras G12D. V14I K-Ras und T58I K-Ras hatten eine intermediäre GTPase Aktivität in diesen Experimenten. Interessanterweise wurden auch bei weiteren Untersuchungen intermediäre Phänotypen der NS-assoziierten Mutanten V14I und T58I K-Ras im Vergleich zu G12D K-Ras beobachtet. Bei ansteigenden Konzentrationen von Granulozyten/Makrophagen Kolonie stimulierendem Faktor (GM-CSF) oder Erythropoetin wuchsen murine fetale Leberzellen, die K-Ras G12D exprimierten, deutlich schneller als Wildtyp K-Ras exprimierende Zellen. Zellen, die NS-assoziierte K-Ras Proteine V14I oder T58I exprimierten, zeigten ein intermediäres Koloniewachstum in diesen Experimenten. Interessanterweise hatte T58I einen stärkeren Effekt als V14I K-Ras in diesem Assay. Dies könnte bedeuten, dass das Auftreten der JMML bei der Patientin mit dieser Mutation durch spezifische Eigenschaften dieser Mutation verursacht wurde (49). Makrophagen Progenitor Kulturen, die G12D oder T58I K-Ras exprimierten, zeigten eine stärkere Aktivierung von Ras und Ras Effektoren als Zellen, die Wildtyp K-Ras oder V14I K-Ras exprimierten. Hingegen führte in COS-7 Zellen die Expression V14I K-Ras zu einer stärkeren Aktivierung von Ras und Effektorproteinen als die Expression von T58I. In murinen embryonalen Fibroblasten (MEFs), führte Wildtyp K-Ras nicht zu einer 23 Fokusbildung und G12D K-Ras Expression resultierte in Seneszenz. Die Expression von V14I und T58I K-Ras induzierte jedoch eine Fokusbildung, wobei das kräftigste Wachstum durch die Expression von V14I K-Ras erzielt wurde (49). Die Beobachtungen weisen darauf hin, dass der Zellkontext einen Einfluss darauf hat wie hyperaktives Ras das RasSignal alteriert (49). Zusammenfassend zeigen diese Analysen, dass die beiden NSassozierten Mutanten, V14I und T58I, im Vergleich zu der onkogenen Mutation G12D und zu Wildtyp K-Ras intermediäre biochemische und biologische Eigenschaften haben. Interessanterweise wurden in bestimmten Experimenten mutationsspezifische Effekte gefunden. So führte die Expression von T58I K-Ras zu stärkeren Effekten in hämatopoetischen Zellen als V14I K-Ras, welches wiederum stärkere Effekte in COS-7 Zellen oder MEFs ausübte. 5.7. Neue Mechanismen der Ras-Aktivierung Die zwei oben diskutierten Mutationen, K-Ras V14I und K-Ras T58I, betreffen Aminosäuren, die in unmittelbarer Nähe von in Neoplasien mutierten Aminosäuren (G12, G13 oder Q61) liegen. Diese Regionen sind an der GTP Bindung beteiligt. Demgegenüber liegt die Mutation K-Ras D153V, die bei einem weiteren Patienten mit NS identifiziert wurde, in einer nicht unmittelbar an der GTP Bindung beteiligten Region. Dies deutet darauf hin, dass andere Ras Aktivierungsmechanismen existieren. Nach Publikation der in dieser Arbeit identifizierten Mutationen veröffentlichten Carta et al. Strukturanalysen an zwei Mutationen, V152G und D153V K-Ras, die diese Forscher bei zwei Patienten mit schwerem NS identifiziert hatten. Ihre Computer-unterstützte Analyse deutete darauf hin, dass beide Mutationen die Form der Guanin-Bindungstasche verändern. Hierdurch wird möglicherweise die Guaninnukleotid Dissoziationsrate erhöht und die aktive Ras Form bevorzugt (13). 24 5.8. Ras-Signalwegmutationen beim Kardio-fazio-kutanen Syndrom Die Mutation K-Ras P34R wurde bei einem Patienten mit CFC identifiziert (49). Mittlerweile ist bekannt, dass die Aminosäure P34 eine weitere häufig mutierte Region bei Patienten mit NS oder CFC darstellt (Martin Zenker, Kerstin Kutsche, unveröffentlichte Daten). Eine P34R H-Ras Mutation wurde vor einiger Zeit von Stone und Mitarbeitern charakterisiert (55). Diese Gruppe führte ein Mutageneseexperiment durch, bei dem sie entdeckte, dass H-Ras P34R in vivo an GTP bindet. In vitro konnte H-Ras P34R nicht durch GAP stimuliert werden (55). In Anbetracht der hoch konservierten G-Domäne Struktur von Ras Proteinen ist davon auszugehen, dass P34R K-Ras Mutationen vermutlich ähnliche (oder identische) biochemische Eigenschaften besitzen. Die Beobachtung von K-Ras Mutationen bei Individuen mit CFC wurde inzwischen von Niihori und Mitarbeitern bestätigt (43). Diese Gruppe analysierte DNA Proben von 43 Individuen mit CFC und fand zwei KRAS Keimbahnmutationen (G60R und D153V) bei drei und acht, BRAF Keimbahnmutationen bei 16 Patienten (43). Gleichzeitig fand eine andere Gruppe BRAF Keimbahnmutationen bei 18 von 23 Patienten mit CFC und MEK1 oder MEK2 Keimbahnmutationen bei drei der verbleibenden fünf untersuchten Patienten mit CFC (47). Wie PTPN11 und RAS ist auch BRAF ein bekanntes Onkogen und somatische Mutationen finden sich häufig in verschiedenen Neoplasien (16). Bis heute wurden eine Reihe weiterer neuer Keimbahn KRAS Mutationen bei Patienten mit mildem bis schwerem NS, CFC und in zwei Fällen mit CS identifiziert. Diese Keimbahnmutationen betreffen die Aminosäuren K5, Q22, P34, I36, F156 und G179 von K-Ras; Strukturanalysen dieser neuen Mutationen lassen darauf schließen, dass der Ras Deregulation verschiedene Mechanismen zugrunde liegen (Martin Zenker, Kerstin Kutsche, Mohammad Reza Ahmadian, unveröffentlichte Daten). Die biochemische Analyse dieser Mutationen werden bereits durchgeführt. 25 5.9. Keimbahn HRAS Mutationen verursachen das Costello-Syndrom Kurz bevor Keimbahn KRAS Mutationen bei Patienten mit NS und CFC beschrieben wurden und nachdem ich meine Analysen abgeschlossen hatte, berichtete eine Gruppe aus Japan über HRAS Keimbahnmutationen bei Individuen mit CS (2). Diese Beobachtung wurde mittlerweile von anderen Arbeiten bestätigt, die diese Mutationen bei ~90% aller CS Patienten identifizierten (21, 23, 32). Überraschenderweise betreffen CSassoziierte HRAS Keimbahnmutationen dieselben Aminosäuren von H-Ras, die auch in Neoplasien mutiert sind. Die Beobachtung, dass aktivierende onkogene H-Ras Mutationen an Aminosäuren G12 oder G13 in der Keimbahn toleriert werden, während dies nicht bei onkogenen K-Ras Mutationen an diesen Aminosäuren der Fall ist, unterstreicht die Idee, dass H-Ras und K-Ras trotz Ihrer hohen strukturellen Ähnlichkeit eine unterschiedliche Rolle bei der Embryonalentwicklung spielen. Dies ist vereinbar mit der Beobachtung, dass bei Mäusen die ubiquitäre Expression von onkogenem Ras zum embryonalen Tod führt (63). Knockout Studien haben gezeigt, dass nur K-Ras für die Embryonalentwicklung notwendig ist, während dies nicht für H-Ras der Fall ist (28). Die unterschiedlichen Phänotypen, die durch Keimbahnmutationen in unterschiedlichen Ras Isoformen ausgelöst werden, sind möglicherweise durch verschiedene Expressionsmuster dieser Proteine bedingt. Ferner unterliegen verschiedene Ras Isoformen einer unterschiedlichen Aufbereitung, z.B. einer unterschiedlichen De/Repalmitoylierungskinetik, welche die subzelluläre Lokalisierung und Aktivität von Ras Isoformen steuert (46). 5.10. Das Neuro-Kardio-Fazio-kutane Syndrom Der molekulare Mechanismus, durch den Keimbahn K-Ras oder H-Ras Mutationen ein unterschiedliches Spektrum unterschiedlicher Phänotypen verursachen, ist weitgehend unklar. Aktivierende Keimbahn K-Ras Mutationen sind vermutlich mit dem breitesten 26 Spektrum klinischer Manifestationen assoziiert (vom milden NS zum schweren CFC oder CS [(13, 43, 49) und unveröffentlichte Beobachtungen]. Jedoch stellen diese Phänotypen nicht nur eine schwächere und stärkere Ausprägung ein und desselben Syndroms dar. Daher ist anzunehmen, dass unterschiedliche RAS Mutationen, die mit unterschiedlichen Phänotypen einhergehen, nicht nur in ihrem Ausmaß der konstitutiven Aktivierung variieren. Spezifische Mutationen haben vermutlich verschiedene qualitative Effekte auf Ras abhängige Signalwege. Kürzlich wurde der Begriff ‘Neuro-Kardio-Fazio-kutanes’ Syndrom (NCFC) (5) geprägt um zu illustrieren, dass die klinisch überlappenden Syndrome des NS Spektrums einschließlich NF1, NS, CS, LS und CFC durch Mutationen in Komponenten des Ras-Signalwegs verursacht werden (Abb. 5). Möglicherweise beruht die phänotypische Variabilität zwischen diesen Syndromen auf (1) unterschiedlichen Expressionsmustern der betroffenen Gene/Isoformen; (2) variablen Mechanismen, über die bestimmte Mutationen mit Effektoren und Regulatoren interagieren. Diese Mutanten dysregulieren den Ras-Signalweg auf unterschiedliche Weise. Weitere Forschungsbemühungen sind erforderlich, um die Basis der Genotyp/Phänotyp Korrelationen des NCFC zu ergründen. Der Umstand, dass der Ras-Signalweg bei allen Formen des NCFC betroffen ist, lässt vermuten, dass Noonan-ähnliche Merkmale das klinische Korrelat einer Keimbahnderegulation des Ras-Signalwegs bei der Embryonalentwicklung darstellen. Dies mag auch die klinische Ähnlichkeit zwischen Patienten mit NF1 und NS erklären. Zusätzlich zu den gut beschriebenen Symptomen, die die NF1 definieren (café-au-lait Flecken und kutane Neurofibrome), haben viele NF1 Patienten NS ähnliche Merkmale wie Kleinwuchs, relative Makrozephalie, milde Gesichtsanomalie, Thoraxdeformitäten und Lernschwierigkeiten. Das NFNS repräsentiert wahrscheinlich ein Extrem der hochvariablen Expression dieser Merkmale. Obwohl die Assoziation zwischen NF1 und NS in einer Familie mit unabhängig segregierenden Mutationen in NF1 und PTPN11 beschrieben wurde (7), ist dieses Doppelereignis nicht 27 der typische grundlegende Mechanismus bei vielen weiteren Individuen mit NF1 und NSähnlichen Merkmalen. Bei der Mehrheit der untersuchten Personen mit NFNS liegen NF1 Mutationen vor. Einige dieser Mutationen wurden auch bei Patienten mit reiner NF1 identifiziert. Möglicherweise sind die NS-ähnlichen Merkmale, die oft bei Patienten mit NF1 gezeigt werden, durch NF1 Haploinsuffizienz bedingt, die zu einer verminderten Inaktivierung von Ras-GTP führt. Dies könnte zu einer milden konstitutionellen Deregulation des Ras Signals führen und in einigen Fällen so stark sein, dass ein NFNS Phänotyp resultiert. Die oft beobachteten milden phänotypischen Ähnlichkeiten zwischen Patienten mit NF1 und NS könnten durch eine vergleichsweise milde Ras Aktivierung bedingt sein. Unbekannte modifizierende Genveränderungen könnten ebenfalls eine Rolle spielen. Neoplasien, die bei Patienten mit NF1 entstehen, verlieren häufig das Wildtyp NF1 Allel. Dieses zweite somatische Ereignis führt zur kompletten Depletion der GAPAktivität von Neurofibromin, was zur weiteren Aktivierung von Ras führt. Wachstumsfaktor aktiv Ras Grb2 Sos Shc Gab2 SHP-2 RTK GNEF NS und LS Ras NF1 Zellmembran NS CFC CS Raf GNEF NF1 CFC NFNS MEK ERK Nukleus pERK Abbildung 5. Der Ras-Signalweg vermittelt Wachstumssignale von aktivierten Rezeptoren zum Zellkern. Somatische Mutationen in einigen Komponenten dieses Signalwegs wurden bei Neoplasien beschrieben. Meine Arbeit sowie Arbeiten anderer Gruppen zeigte, dass Keimbahnmutationen in diesen Molekülen bei Patienten mit Noonan-Syndrom und verwandten Syndromen auftreten. 28 5.11. Keimbahnmutation in weiteren Neoplasie-assoziierten Genen Die Beobachtung von Keimbahnmutationen im Ras-Signalweg verdeutlicht, dass Neoplasie-assoziierte Onko- oder Tumorsuppressor Gene als essentielle Regulatoren von Differenzierung, Morphogenese und Entwicklung fungieren. Systemische klinische Merkmale einer gestörten Entwicklung wurden auch bei Patienten mit Keimbahnmutationen in anderen bekannten Tumorsuppressor Genen wie PTEN Mutationen bei Individuen mit Cowden Syndrom (38) und TSC1 oder TSC2 Mutationen bei Individuen mit tuberöser Sklerose beobachtet [zusammengefasst in (26)]. 6. Ausblick Während die Mehrheit der Fälle mit CFC und CS durch Mutationen in KRAS, BRAF, MEK1, MEK2 und HRAS erklärt ist, ist in ca. 50% aller NS Fälle der zugrunde liegende Gendefekt unklar. Basierend auf der Annahme, dass der NS-Phänotyp durch ein hyperaktives Ras-Signal verursacht wird, werden aktuell durch verschiedene Gruppen DNA Proben von NS-Patienten auf das Vorliegen von Mutationen in anderen Genen des Signalwegs, einschließlich negativer Regulatoren, untersucht. Analog zu PTPN11 und KRAS spielen die aktuell noch unbekannten NS Gene des Ras-Signalwegs vermutlich ebenfalls Doppelrollen als Entwicklungs- und Onkogene. Mutationen in BRAF und MEK1/2 wurden inzwischen als NS Gene ausgeschlossen (Martin Zenker, unveröffentlichte Daten). Es wird von besonderem Interesse sein zu eruieren wie verschieden Expressionsmuster der verschiedenen RAS Gene und Isoformen klinische Phänotypen beeinflussen, wenn diese Gene/Isoformen in der Keimbahn mutiert sind. Besonders wichtig wird es sein die strukturellen Mechanismen zu erarbeiten um zu verstehen wie diese neuen Mutationen das Ras-Signal molekular beeinflussen. Die Charakterisierung der biologischen 29 Konsequenzen dieser Mutationen wird besonders von der Konstruktion von murinen Knock-in Modellen profitieren. 7. Literaturverzeichnis 1. Allanson, J.E. (1987) Noonan syndrome. J Med Genet, 24, 9-13. 2. Aoki, Y., Niihori, T., Kawame, H., Kurosawa, K., Ohashi, H., Tanaka, Y., Filocamo, M., Kato, K., Suzuki, Y., Kure, S., et al. (2005) Germline mutations in HRAS protooncogene cause Costello syndrome. Nat Genet, 37, 1038-1040. 3. 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Zusammenfassung Das Noonan-Syndrom (NS) ist eine genetische Erkrankung und durch Kleinwuchs, typische Gesichtszüge, Herzfehler und Prädisposition zur juvenilen myelomonozytären Leukämie (JMML) gekennzeichnet. Als Ursache des NS wurden Mutationen im Gen PTPN11, welches für das Signalprotein SHP-2 kodiert, bei ∼50% der Betroffenen beschrieben. SHP-2 ist eine Phosphatase, die Wachstumssignale von aktivierten Wachstumsfaktorrezeptoren an andere Signalmoleküle weiterleitet, insbesondere an Ras. Ras-Proteine regulieren fundamentale zelluläre Prozesse; somatische Ras-Mutationen werden häufig bei bösartigen Erkrankungen gefunden. Die vorliegende Arbeit untersucht mit einem Kandidatengen-Ansatz, ob einige PTPN11-Mutation-negative NS Patienten Mutationen in RAS Genen tragen. Die Mutationsanalyse der Gene HRAS, NRAS und KRAS an 174 Patienten mit PTPN11 Mutation negativem NS zeigte, dass ein kleiner Prozentsatz der Patienten Keimbahnmutationen im KRAS-Gen hat. Diese neuen Mutationen, K-Ras V14I, T58I und D153V unterscheiden sich von den Neoplasieassoziierten Mutationen an Positionen G12, G13 und Q61 und üben wahrscheinlich mildere Effekte aus, damit sie in der Keimbahn toleriert werden. Bei etwa 50% der Patienten mit NS ist der zugrunde liegende Gendefekt noch ungeklärt. Da aber offenbar der Noonan-Phänotyp durch verschiedene Gendefekte hervorgerufen werden kann, deren gemeinsamer Mechanismus eine konstitutive Deregulation des Ras-Signalwegs ist, wird vermutet, dass Patienten mit bislang unklarem Gendefekt Mutationen in anderen Proteinen desselben Signalwegs tragen.
