Erreger-Wirt-Interaktionen intestinaler und respiratorischer RNA

Aus dem Institut für Virologie
der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Erreger-Wirt-Interaktionen
intestinaler und respiratorischer RNA-Viren
Habilitationsschrift
zur Erlangung der Venia legendi
an der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von
Dr. med. vet. Christel Schwegmann-Weßels, geb. Schwegmann
Hannover 2013
Tag der nichtöffentlichen wissenschaftlichen Aussprache:
19. Juni 2014
Für Peter, Hannah und Florian
Inhaltsverzeichnis
Liste der verwendeten Publikationen ..................................................................................................... 7
1.
Einleitung ......................................................................................................................................... 9
1.1.
1.1.1.
TGEV ................................................................................................................................ 9
1.1.2.
SARS-CoV ....................................................................................................................... 10
1.1.3.
IBV.................................................................................................................................. 11
1.1.4.
Sialinsäurebindungseigenschaften von Coronaviren .................................................... 11
1.2.
2.
Coronaviren ............................................................................................................................. 9
Weitere respiratorische Viren ............................................................................................... 12
1.2.1.
Influenza-Viren .............................................................................................................. 12
1.2.2.
Respiratorisches Synzytialvirus und Parainfluenzavirus 3 ............................................. 12
1.3.
Detergenz-resistente Membranen – lipid rafts ..................................................................... 13
1.4.
Transportsignale in Glykoproteinen ...................................................................................... 14
Eigene Untersuchungen ................................................................................................................ 16
2.1.
Fragestellung ......................................................................................................................... 16
2.2. Nutzung differenzierter Epithelzellen des Respirationstrakts und viraler Pseudotypen zur
Analyse von Virusinfektionen ............................................................................................................ 17
2.3.
Die Funktion von Sialinsäuren und Cholesterin beim Viruseintritt ....................................... 22
2.4.
Transport viraler Glykoproteine in der Zelle ......................................................................... 27
2.5.
Identifikation coronaviraler Inhibitoren ................................................................................ 29
3.
Übergreifende Diskussion ............................................................................................................. 31
4.
Zusammenfassung ......................................................................................................................... 35
5.
Summary........................................................................................................................................ 36
6.
Literaturverzeichnis ....................................................................................................................... 37
Erklärung über den eigenen Anteil an den Publikationen .................................................................... 44
Danksagung ........................................................................................................................................... 49
Liste der verwendeten Publikationen
Schwegmann-Wessels, C. and G. Herrler. 2006. Transmissible gastroenteritis virus infection:
a vanishing specter. Dtsch. Tierärztl. Wochenschr. 113:157-159. (Review)
Schwegmann-Wessels, C. and G. Herrler. 2006. Sialic acids as receptor determinants for
coronaviruses. Minireview. Glycoconj. J. 23:51-58. (Review)
Goris, K., S. Uhlenbruck, C. Schwegmann-Weßels, W. Köhl, F. Niedorf, M. Stern, M. HewickerTrautwein, R. Bals, G. Taylor, A. Braun, G. Bicker, M. Kietzmann, and G. Herrler. 2009. Differential sensitivity of differentiated epithelial cells to respiratory viruses reveals different viral
strategies of host infection. J. Virol. 83:1962-1968.
Punyadarsaniya, D., C.H. Liang, C. Winter, H. Petersen, S. Rautenschlein, I. Hennig-Pauka, C.
Schwegmann-Wessels, C.Y. Wu, C.H. Wong, and G. Herrler. 2011. Infection of differentiated
porcine airway epithelial cells by influenza virus: differential susceptibility to infection by
porcine and avian viruses. PLoS One. 6(12):e28429.
Hanika, A., B. Larisch, E. Steinmann, C. Schwegmann-Wessels, G. Herrler, and G. Zimmer.
2005. Use of influenza C virus glycoprotein HEF for generation of vesicular stomatitis virus
pseudotypes. J. Gen. Virol. 86:1455-1465.
Schwegmann-Weßels, C., J. Glende, X. Ren, X. Qu, H. Deng, L. Enjuanes, and G. Herrler. 2009.
Comparison of vesicular stomatitis virus pseudotyped with the S proteins from a porcine and
a human coronavirus. J. Gen. Virol. 90:1724-1729.
Winter, C., C. Schwegmann-Wessels, D. Cavanagh, U. Neumann, and G. Herrler. 2006. Sialic
acid is a receptor determinant for infection of cells by avian Infectious bronchitis virus. J.
Gen. Virol. 87:1209-1216.
Schwegmann-Wessels, C., S. Bauer, C. Winter, L. Enjuanes, H. Laude, and G. Herrler. 2011.
The sialic acid binding activity of the S protein facilitates infection by porcine transmissible
gastroenteritis coronavirus. Virol J. Sep 12; 8(1):435.
Ren, X., J. Glende, J. Yin, C. Schwegmann-Weßels, and G. Herrler. 2008. Importance of cholesterol for infection of cells by transmissible gastroenteritis virus. Virus Res. 137(2):220-224.
Yin, J., J. Glende, C. Schwegmann-Wessels, L. Enjuanes, G. Herrler, and X. Ren. 2010. Cholesterol is important for a post-adsorption step in the entry process of transmissible gastroenteritis virus. Antiviral Res. 88(3):311-6.
Ren, X., J. Glende, M. Al Falah, V. de Vries, C. Schwegmann-Wessels, X. Qu, L. Tan, T. Tschernig, H. Deng, H. Y. Naim, and G. Herrler. 2006. Analysis of ACE2 in polarized epithelial cells:
7
surface expression and function as receptor for severe acute respiratory syndromeassociated coronavirus. J. Gen. Virol. 87:1691-1695.
Glende, J., C. Schwegmann-Weßels, M. Al-Falah, S. Pfefferle, X. Qu, H. Deng, C. Drosten, H. Y.
Naim, and G. Herrler. 2008. Importance of cholesterol-rich membrane microdomains in the
interaction of the S protein of SARS coronavirus with the cellular receptor angiotensinconverting enzyme 2. Virology. 381(2):215-221.
Schwegmann-Wessels, C., M. Al Falah, D. Escors, Z. Wang, G. Zimmer, H. Deng, L. Enjuanes,
H. Y. Naim, and G. Herrler. 2004. A novel sorting signal for intracellular localization is present
in the S protein of a porcine coronavirus but absent from severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus. J. Biol. Chem. 279:43661-43666.
Winter, C., C. Schwegmann-Wessels, U. Neumann, and G. Herrler. 2008. The Spike Protein of
Infectious Bronchitis Virus Is Retained Intracellularly by a Tyrosine Motif. J. Virol. 82:27652771.
Paul, A., A. Trincone, S. Siewert, G. Herrler, and C. Schwegmann-Weßels. 2014. A lysinemethionine exchange in a coronavirus surface protein transforms a retention motif into an
endocytosis signal. Biol Chem. 395(6):657-665.
Pfefferle, S., J. Schöpf, M. Kögl, C.C. Friedel, M.A. Müller, J. Carbajo-Lozoya, T. Stellberger, E.
von Dall'armi, P. Herzog, S. Kallies, D. Niemeyer, V. Ditt, T. Kuri, R. Züst, K. Pumpor, R. Hilgenfeld, F. Schwarz, R. Zimmer, I. Steffen, F. Weber, V. Thiel, G. Herrler, H.J. Thiel, C.
Schwegmann-Weßels, S. Pöhlmann, J. Haas, C. Drosten, and A. von Brunn. 2011. The SARSCoronavirus-Host Interactome: Identification of Cyclophilins as Target for Pan-Coronavirus
Inhibitors. PLoS Pathog. Oct 7(10):e1002331.
8
1. Einleitung
1.1.Coronaviren
1.1.1. TGEV
Schwegmann-Wessels, C. and G. Herrler (2006): Transmissible gastroenteritis virus infection: a
vanishing specter. Dtsch. Tierärztl. Wochenschr. 113:157-159.
Das Virus der übertragbaren Gastroenteritis (TGEV) gehört zur Familie der Coronaviridae, Genus Alphacoronavirus. Die Coronaviren sind einzelsträngige (+)RNA-Viren, die
von einer Lipidhülle umgeben sind. Diese Membran wird während des Knospungsvorgangs der Viruspartikel in der Wirtszelle im intermediären Kompartiment zwischen ER
und Golgi (ERGIC) erworben (Krijnse-Locker et al., 1994; Stertz et al., 2007). In der Lipidhülle von TGEV befinden sich das Membranprotein M, das kleine Envelopeprotein E und
das rezeptorbindende Spike-Protein S. Das S-Protein ist essentiell für die ersten Schritte
einer Virusinfektion – Rezeptorbindung und Fusion – und Hauptziel der spezifischen
Immunantwort.
TGEV ist das ätiologische Agens der in Schweinebeständen vorkommenden übertragbaren Gastroenteritis (Doyle and Hutchings, 1946). Bis in die 80er Jahre hinein handelte es
sich um eine häufig vorkommende meist akut epizootisch verlaufende Durchfallerkrankung, die vor allem in Ferkelzuchtbetrieben zu hohen Verlusten führte. Die Mortalitätsrate bei Ferkeln bis zum Alter von zwei Wochen liegt bei 100 %, wenn kein entsprechender Immunschutz besteht. Ältere Tiere erholen sich meist wieder von der Gastroenteritis. Es kann allerdings zu Wachstumsverzörgerungen kommen. Die Viren werden oral
aufgenommen und gelangen in den Magen-Darm-Trakt. TGEV infiziert die Epithelzellen
auf den Spitzen der Darmzotten von Jejunum und Ileum. Die Virusinfektion breitet sich
über die Zotten aus, und es kommt zur Ablösung der Epithelzellen und zur Zottenatrophie (Hooper and Haelterman, 1969). Diese Vorgänge führen zu einem Malabsorptionssyndrom und die daraus resultierende Dehydrierung kann von jungen Ferkeln nicht
kompensiert werden. Die Epithelzellen werden von den Krypten aus ersetzt. Dieser regenerative Prozess dauert 5 bis 7 Tage.
Durch das Auftreten einer respiratorischen Virusvariante, dem porzinen respiratorischen
Coronavirus (PRCoV), in den 80er Jahren in Europa kam es auf diesem Kontinent zu einem starken Rückgang der akut verlaufenden übertragbaren Gastroenteritis (Pensaert
et al., 1986). Die Infektion mit PRCoV erfolgt oronasal oder über Aerosole (Bourgueil et
al., 1992). Die Infektion mit diesem respiratorischen Coronavirus führt nur zu milden
Krankheitssymptomen; häufig gibt es keinerlei Krankheitszeichen. Die Genome von
TGEV und PRCoV zeigen eine Sequenzhomologie von 96 %. Die für die Bildung neutralisierender Antikörper entscheidenden antigenen Epitope auf dem S-Protein stimmen bei
9
den beiden Viren überein. Somit können im Rahmen einer unauffällig verlaufenden
PRCoV-Infektion neutralisierende Antikörper gebildet werden, die ebenfalls einen
Schutz vor einer TGEV-Infektion vermitteln können (Cox et al., 1993).
Der zelluläre Rezeptor von TGEV und PRCoV ist die porzine Aminopeptidase N (pAPN),
die sowohl auf den Bürstensaummembranen der Darmepithelzellen als auch auf der
apikalen Seite von Lungen- und Nierenzellen, sowie in Granulozyten und Monozyten
vorkommt (Delmas et al., 1992; Look et al., 1989). Die Bindungsstelle für pAPN auf dem
S-Protein von TGEV liegt zwischen Aminosäure 522 und 744 (Godet et al., 1994). Im Nterminalen Bereich des TGEV S-Proteins gibt es eine zusätzliche Domäne, die eine Bindung an Sialinsäuren vermittelt (Schultze et al., 1996). Dieser Bereich ist bei PRCoV deletiert, somit besitzt diese Virusvariante keine Sialinsäurebindungseigenschaft. Durch diese zusätzliche Bindungeigenschaft bindet TGEV in Bürstensaummembranpräparationen
des Dünndarms neben pAPN ein hochmolekulares muzinartiges Glykoprotein
(Schwegmann-Wessels et al., 2003). Vermutlich hilft diese Sialinsäurebindungseigenschaft dem Virus trotz der Darmperistaltik über die Bindung an Muzine die Muzinschicht
im Darm zu durchdringen und den zellulären Rezeptor pAPN auf der Oberfläche der
Darmepithelzellen zu erreichen. Diese bei PRCoV nicht vorkommende Sialinsäurebindung stellt somit einen wichtigen Faktor für die Enteropathogenität von TGEV dar.
1.1.2. SARS-CoV
Im Winter 2002/2003 trat ein neuartiges humanes Coronavirus auf, welches zu einem
schweren akuten Atemwegssydrom führte. Dieses Virus erhielt die Bezeichnung „severe
acute respiratory syndrome coronavirus“ (SARS-CoV) und wurde dem Genus Betacoronavirus zugeordnet. Die Infektion mit SARS-CoV nahm ihren Ursprung in Südostasien und breitete sich als Pandemie über mehrere Länder weltweit aus bis z.B. nach
Kanada. Als Virusreservoir gelten Fledermäuse wie z.B. die Hufeisennasenfledermaus –
Rhinolophus sinicus (Li et al., 2005a). Bis zum Eindämmen der Pandemie im Juli 2003
kam es zu über 8000 Erkrankungsfällen mit einer Mortalitätsrate von 10 %. Die Infektion
mit SARS-CoV führt zur Pneumonie begleitet von Fieber, Atemnot, Lymphopenie und
akuten Atemwegsbeschwerden (Peiris et al., 2003).
Der zelluläre Rezeptor, durch den der Viruseintritt über das SARS-CoV S-Protein vermittelt wird, ist ACE2 – das Angiotensin-konvertierende Enzym 2 (Li et al., 2003; Wang et
al., 2004). Die Bindungsstelle für ACE2 liegt im N-terminalen Bereich des SARS-CoV SProteins zwischen Aminosäure 270 und 510 (Babcock et al., 2004). Die Aminosäuren 479
(N) und 487 (T) in der rezeptorbindenden Domäne des S-Proteins sind entscheidend für
die Interaktion mit dem humanen ACE2 und somit also für die Speziesspezifität (Li et al.,
2005b; Qu et al., 2005). Das SARS-CoV S-Protein liegt als Trimer in der Zelle und im Viruspartikel vor (Song et al., 2004). Es ist ein typisches Fusionsprotein vom Typ 1
(Ingallinella et al., 2004).
10
1.1.3. IBV
Das aviäre Coronavirus IBV (Virus der infektiösen Bronchitis der Hühner) gehört zum
Genus Gammacoronavirus. Es treten viele IBV Serotypen und Varianten im Feld auf, die
zu unterschiedlichen Krankheitsbildern führen. Die klassische infektiöse Bronchitis mit
Atemnot zeigt sich vor allem bei Küken. Neben den Schleimhäuten des Respirationstraktes können auch die Schleimhäute des Eileiters infiziert werden. Zudem gibt es einige
nephrotrope Stämme. Ei-adaptierte Stämme infizieren lokal den Respirationstrakt. Bei
Legehennen überwiegen die Schädigungen des Legeapparates durch eine IBV-Infektion.
Der Legerückgang kann bis zu 92 % betragen (Broadfoot et al., 1954).
Das S-Protein von IBV vermittelt wie bei allen anderen Coronaviren den Viruseintritt. Ein
Rezeptormolekül auf der Zelle wurde bisher nicht identifiziert, jedoch besitzt das IBV SProtein die Fähigkeit an Sialinsäure zu binden (Bingham et al., 1975; Schultze et al.,
1992; Winter et al., 2006). Das S-Protein liegt als Homotrimer vor und wird in eine S1
und S2 Untereinheit gespalten (Stern and Sefton, 1982). Die S1 Untereinheit enthält die
meisten der antigenen Epitope. Aufgrund der großen Variabilität in der Sequenz dieser
S1 Untereinheit kommt es zum Auftreten der zahlreichen IBV Serotypen.
1.1.4. Sialinsäurebindungseigenschaften von Coronaviren
Schwegmann-Wessels, C. and G. Herrler (2006): Sialic acids as receptor determinants for coronaviruses. Minireview. Glycoconj. J. 23:51-58.
Sialinsäuren werden von einigen Coronaviren als Rezeptordeterminante erkannt
(Schwegmann-Wessels and Herrler, 2006). Das bovine Coronavirus (BCoV) gehört zum
Genus Betacoronavirus und bindet mit seinem S-Protein an N-Acetyl-9-OAcetylneuraminsäure (Schultze et al., 1991a; Schultze and Herrler, 1992). Zusätzlich besitzt es ein rezeptorzerstörendes Enzym – die Hämagglutinin-Esterase (HE-Protein)
(Schultze et al., 1991b). Hier besteht somit eine Ähnlichkeit zu den Influenza-Viren, die
ebenfalls ein rezeptorzerstörendes Enzym in ihrer Virushülle tragen. Das HE-Protein von
BCoV verbessert vermutlich die Ausbreitung einer Virusinfektion, indem es die N-Acetyl9-O-Acetylneuraminsäure von bereits infizierten Zellen abspaltet und die Bildung von Virusaggregaten verhindert.
Das S-Protein von TGEV besitzt neben seiner Bindungsaktivität an den zellulären Rezeptor pAPN eine Sialinsäurebindungseigenschaft. Diese zusätzliche Bindung an Sialinsäuren
ist bei der respiratorischen Virusvariante PRCoV (siehe oben) verloren gegangen. Das
TGEV S-Protein bindet bevorzugt an N-Glykolylneuraminsäure – eine beim Schwein häufig, beim gesunden Menschen nicht vorkommende Sialinsäure (Schultze et al., 1996;
Varki, 2001). TGEV besitzt kein zusätzliches rezeptorzerstörendes Enzym wie BCoV. Dies
läßt vermuten, dass die Bindung zwischen S-Protein und Sialinsäuren reversibel ist und
keiner enzymatischen Spaltung bedarf. Die Untersuchung unterschiedlicher Virusmutan11
ten ergab, dass die Sialinsäurebindungseigenschaft einen wichtigen Faktor für die
Enteropathogenität dieses Virus darstellt (Krempl et al., 1997). Durch die Bindung an sialinsäurereiche Muzine im Darm kann das Virus seinen zellulären Rezeptor pAPN auf den
Enterozyten besser erreichen und somit die Epithelzellen infizieren.
Auch das S-Protein von IBV besitzt eine Sialinsäurebindungseigenschaft und erkennt bevorzugt -2,3-gebundene Sialinsäuren (Schultze et al., 1992). Für die Einleitung einer Infektion ist die Bindung an Sialinsäuren durch das IBV S-Protein essentiell.
1.2.Weitere respiratorische Viren
1.2.1. Influenza-Viren
Die Influenzaviren gehören zur Familie der Orthomyxoviridae und werden in die drei
Genera Influenza-A-Virus, Influenza-B-Virus und Influenza-C-Virus unterteilt. Es handelt
sich um behüllte einzelsträngige RNA-Viren, deren segmentiertes Genom in negativer
Polarität vorliegt. Die bekanntesten Vertreter sind die verschiedenen Subtypen der Influenza-A-Viren, die die klassische Virusgrippe verursachen. Die Nomenklatur der Subtypen der verschiedenen human- und tierpathogenen Influenza-Viren wird nach einem
bestimmten Schema erstellt. Neben dem Virustyp (Influenzavirus A, B oder C) wird der
Wirt angegeben aus dem der Erreger isoliert wurde (beim Menschen nicht), der geographische Ort der Isolierung, die Nummerierung des Isolats, das Jahr und die Subtypen der
HA- und NA-Proteine. Die Subtypenbezeichnung wird nur bei Influenza-A-Viren verwendet.
Schweine stellen einen bedeutsamen Wirt für Influenza-A-Viren dar. Weltweit enzootisch in Schweinen vorkommende Influenza-A-Viren gehören zu den Subtypen H1N1,
H3N2 oder H1N2. Schweine können ebenfalls von humanen oder aviären Influenza-AViren infiziert werden. Durch die Infektion mit Viren unterschiedlichen Ursprungs können in Schweinen Reassortanten entstehen, die eine Kombination von Gensegmenten
unterschiedlicher Wirtsspezies enthalten.
Für die aviären Influenza-A-Viren vom Subtyp H7N7, H9N2 und H7N9 sind Infektionen
im Menschen beschrieben, für H9N2 auch im Schwein (Cameron et al., 2000; Fouchier et
al., 2004; Gao et al., 2013; Koopmans et al., 2004; Lin et al., 2000; Peiris et al., 2001).
1.2.2. Respiratorisches Synzytialvirus und Parainfluenzavirus 3
Das Respiratorische Synzytialvirus (RSV) und das Parainfluenzavirus 3 (PIV3) gehören zur
Familie der Paramyxoviridae. RSV wird in das Genus Pneumovirus der Subfamilie
Pneumovirinae und PIV3 in das Genus Respirovirus der Subfamilie Paramyxovirinae ein12
geordnet. Die Paramyxoviren sind behüllte Viren mit einzelsträngiger RNA von negativer
Polarität. In schweren Fällen führt die Infektion mit humanem RSV und PIV3 bei Kindern
unter 2 Jahren zur Bronchiolitis und Pneumonie. Ähnliche Krankheitserscheinungen treten bei Kälbern auf, die mit bovinem RSV (BRSV) bzw. bovinem PIV3 (BPIV3) infiziert sind
(Stott and Taylor, 1985; Valarcher and Taylor, 2007). Neben bovinem Herpesvirus 1 sind
auch BRSV und BPIV3 primäre Pathogene des Bovine Respiratory Disease Complex
(BRDC) (Sacco et al., 2013; Thonur et al., 2012).
1.3.Detergenz-resistente Membranen – lipid rafts
Das Flüssig-Mosaik-Modell von Singer und Nicolson beschreibt die Lipiddoppelschicht
von Membranen als zweidimensionale Lösung gerichteter Lipide und globulärer Proteine. Lipide und Membranproteine können ungehindert in dieser Matrix diffundieren und
sind homogen über sie verteilt (Singer and Nicolson, 1972).
Im lipid raft-Modell wird davon ausgegangen, dass es in der Plasmamembran bestimmte
Bereiche gibt, die sich in ihrer Lipid- und Proteinzusammensetzung von den anderen
Membranbereichen unterscheiden. Diese Lipid-Domänen, auch lipid rafts genannt, enthalten im exoplasmatischen Teil der Lipid-Doppelschicht einen erhöhten Anteil an Cholesterin und Sphingolipiden und im zytoplasmatischen Bereich der Membran überwiegend Phospholipide mit gesättigten Fettsäureketten und Cholesterin (Brown and
London, 1998; Simons and Ikonen, 1997). Die Bezeichnung raft (engl. raft = Floß) wurde
gewählt, da sich diese Domänen in dem Flüssig-Mosaik-Modell frei sozusagen schwimmend bewegen können. Mehrere rafts können sich zu Clustern zusammenlagern und
auch wieder separiert werden (Pralle et al., 2000). Bestimmte Proteine werden ebenfalls
in solchen rafts konzentriert. Hierzu gehören Proteine mit einem Glykosylphosphatidylinositol (GPI)-Anker, doppelt-acylierte Proteine und palmitylierte und myristylierte Proteine wie z.B. Flotilline (Andre et al., 2011; Arni et al., 1998; Rajendran et al., 2003).
Es wird vermutet, dass Cholesterin die Sphingolipid-Interaktion in diesen Domänen stabilisiert, indem es sich in den Raum zwischen den gesättigten Fettsäureketten der
Sphingolipide einlagert. Das Entfernen von Cholesterin aus lipid rafts mittels z.B. Methyl-Cyclodextrin (M CD) führt zur Dissoziation von rafts-assoziierten Proteinen und Lipiden und zur Blockierung raft-abhängiger biologischer Funktionen. Lipid rafts werden u.a.
auch als Detergenz-resistente Membranen (DRMs) bezeichnet. Diese Bezeichnung basiert auf der Eigenschaft, dass diese Membranen bei niedrigen Temperaturen relativ unlöslich in nicht-ionischen Detergenzien wie Triton-X-100 sind.
Lipid rafts spielen eine wichtige Rolle bei der Sortierung von Proteinen und bei der Regulation von Signaltransduktions-Kaskaden (Simons and Toomre, 2000). Von einigen Viren
wie HIV und Influenzaviren ist bekannt, dass lipid rafts eine wichtige Rolle beim Viruseintritt spielen (Chazal and Gerlier, 2003). Für die Influenzaviren konnte gezeigt werden,
dass cholesterinhaltige Domänen in der Virusmembran mehrere HA-Trimere konzentrie13
ren und somit eine effiziente Membranfusion ermöglichen (Scheiffele et al., 1997;
Takeda et al., 2003). Das HI-Virus benötigt Cholesterin sowohl in der Virusmembran als
auch in der zellulären Membran für eine Infektion (Graham et al., 2003; Liao et al., 2001;
Liao et al., 2003). Das Vesikuläre Stomatitis Virus (VSV) hingegen ist in seiner Infektion
unabhängig von Cholesterin (Popik et al., 2002; Thorp and Gallagher, 2004).
1.4.Transportsignale in Glykoproteinen
Sowohl zelluläre als auch virale Proteine unterliegen in der eukaryotischen Zelle einem
gerichteten Transport. Dieser Transport erfolgt i.d.R. auf vesikulärem Wege (Rothman,
1996; Rothman and Wieland, 1996). Man unterscheidet z.B. den retrograden COPI (coat
protein complex I)-vermittelten Transport vom Golgi-Apparat zum ER, den anterograden
COPII-vermittelten Vesikeltransport vom ER zum Golgi-Apparat und den Clathrinvermittelten Vesikeltransport zwischen Golgi-Apparat und Plasmamembran (Kanaseki
and Kadota, 1969; Lee et al., 2004; Salisbury et al., 1983). Kompartiment-spezifische Sortierungsfaktoren wie der ADP-Ribosylierungsfaktor (ARF), vSNARE und tSNARE ermöglichen eine geordnete Sortierung dieser Vesikel (Pelham, 1999a, b). Um in den „richtigen“
Sortierungsweg zu gelangen, enthalten die Proteine entsprechende Sortierungssignale,
die z.B. von den coat Proteinen oder den Adapter-Proteinen (AP) erkannt und gebunden
werden. So werden z.B. Di-Lysin-Signale (KKXX) von COPI erkannt und Di-azide Signale
(DXE) von COPII (Barlowe, 2003; Letourneur et al., 1994; Sieben et al., 2008; Teasdale
and Jackson, 1996). Tyrosin-basierte Sortierungssignale (YXX ) können von verschiedenen Adapter-Proteinen (AP1, AP2) erkannt werden (Bonifacino and Traub, 2003; Ohno
et al., 1995).
Die tyrosin-basierten Sortierungssignale von Proteinen führen jedoch zu sehr unterschiedlichen Sortierungen/Lokalisationen in der Zelle. So weiß man, dass die Clathrinvermittelte Endozytose an der Plasmamembran durch die Interaktion zwischen einem
Tyrosin-Signal und AP2 induziert wird (Honing et al., 1996; Hunziker et al., 1991). Aber
auch der Transport zu Lysosomen, eine Lokalisation im Trans-Golgi-Netzwerk (TGN), die
Retention im ER oder der basolaterale Transport in polarisierten Epithelzellen kann
durch Tyrosin-basierte Sortierungssignale determiniert werden (Hunziker et al., 1991;
Thomas and Roth, 1994). Bei der Frage, welcher konkrete Sortierungsweg durch dieses
Signal jeweils eingeschlagen wird, spielen vermutlich weitere Aminosäuren in den Proteinen eine Rolle, die z.B. die Konformation des Proteins und somit seine Interaktionsmöglichkeit mit bestimmten Sortierungsproteinen beeinflussen.
Die Sortierung von viralen Proteinen in der Zelle ist vor allem für eine erfolgreiche Viruspartikelbildung von Bedeutung. Bei behüllten Viren müssen sich alle viralen Proteine,
in dem für die jeweilige Virusart spezifischen Knospungskompartiment sammeln. Die Viruspartikel von VSV entstehen z.B. an der Plasmamembran. Das VSV G-Protein enthält
14
neben dem sauren DXE-Signal ein YXXI Motiv in seinem zytoplasmatischen Abschnitt.
Für beide Signale ist beschrieben, dass sie zu einem effizienten Export des Proteins aus
dem ER führen (Nishimura and Balch, 1997; Nishimura et al., 1999; Sevier et al., 2000).
Zusätzlich wurde beschrieben, dass das DXE-Signal den Transport von VSV-G vom TGN
zur Plasmamembran in einem AP3-abhängigen Mechanismus unterstützt (Nishimura et
al., 2002). Das G1-Protein der Bunyaviren wird z.B. aufgrund eines Sortierungssignals im
Golgi-Apparat zurückgehalten (Andersson et al., 1997). Dieses Kompartiment ist auch
der Ort der Knospung neuer Bunyaviren.
15
2. Eigene Untersuchungen
2.1.Fragestellung
Der Eintritt von Viren in die Zielzelle sowie die Bildung neuer Viruspartikel in der Wirtszelle stellen wichtige Schritte im Vermehrungszyklus von Viren dar. Behüllte Viren interagieren beim Eintritt und auch bei der Virusknospung und dem Virusaustritt nicht nur
mit zellulären Proteinen und Zuckerstrukturen, sondern auch mit den lipidhaltigen
Membranen der Zelle. Die Identifizierung und das Verständnis von Interaktionen der Viren mit Komponenten der Wirtszelle können helfen, neue Ansätze in der Therapie von
Viruserkrankungen zu finden.
In dieser Arbeit werden Viren vorgestellt, bei denen es entweder verwandte Erreger im
humanmedizinischen Bereich gibt wie bei RSV und PIV-3 oder die zu den zoonotischen
Krankheitserregern gehören wie SARS-CoV oder Influenzaviren.
1.
Um zusätzlich zur Zellkultur auch mit primären Zellkultursystemen arbeiten zu
können und somit näher an die Situation im Wirt heranzureichen, wurden in
den hier vorgestellten Arbeiten bovine und porzine Lungenpräzisionsschnitte
und bovine Air-Liquid-Interface-Kulturen entwickelt. Folgende Fragestellungen
sollten mit diesen Systemen untersucht werden: Welche ausdifferenzierten Zellen von BRSV und BPIV-3 im Rind bzw. von porzinen (H3N2) bzw. aviären
(H7N7, H9N2) Influenza-A-Viren im Schwein werden bevorzugt infiziert? Sind
die aviären Influenzaviren in der Lage, porzines Lungengewebe effizient zu infizieren? Haben diese Viren das Potential sich an das Schwein als neuen Wirt zu
adaptieren?
2.
Um den Viruseintritt von auf Sicherheitsstufe 3 angesiedelten Viren wie SARSCoV unter S2-Bedingungen studieren zu können, wurde folgender Frage nachgegangen: Ist es möglich den Viruseintritt von Fremdviren mit Hilfe eines auf
dem Vesikulären Stomatitis Virus basierten replikationsdefiezienten Pseudotypensystems zu untersuchen? Kann der über das S-Protein von Coronaviren
vermittelte Viruseintritt mit einem VSV-basierten Pseudotypensystem untersucht werden?
Der Schwerpunkt in den hier vorgestellten Arbeiten liegt auf der Coronavirusforschung.
Folgende Fragestellungen wurden in diesem Zusammenhang bearbeitet:
1.
Welche Bedeutung haben Sialinsäuren für den Eintritt des porzinen Coronavirus
TGEV und des aviären Coronavirus IBV in Zellkultur?
16
2.
Spielt Cholesterin in der Zell- bzw. Virusmembran eine Rolle für die Infektion
mit TGEV und SARS-CoV? Welcher Schritt beim Viruseintritt wird durch lipid
rafts beeinflusst?
3.
Die Bildung neuer behüllter Viruspartikel in der Wirtszelle setzt voraus, dass
sich alle Viruskomponenten am Ort der Viruskospung zusammenfinden. Das Assembly infektiöser Virusnachkommen erfordert den Transport der viralen
Strukturproteine und des Genoms an den Ort der Virusknospung – im Falle von
Coronaviren also zum ERGIC. Wir haben in den hier vorgestellten Arbeiten neben der Rolle des S-Proteins beim Viruseintritt auch den intrazellulären Transport des S-Proteins untersucht und sind folgenden Fragen nachgegangen:
Liegen spezifische Transportsignale in den S-Proteinen von Coronaviren unterschiedlicher Genera vor? Wie beeinflussen diese Signale den Transport zum Ort
der Viruspartikelbildung?
4.
Ein genomweiter Yeast-2-Hybrid-Screen wurde angewendet, um coronavirale
Inhibitoren identifizieren zu können. Ein identifizierter Inhibitor war Cyclosporin
A. Es wurde folgenden Fragen nachgegangen: Welche Signalwege werden
durch Cyclosporin A gehemmt? Können auch Infektionen mit anderen Coronavirusspezies durch diesen Inhibitor beeinflusst werden?
2.2.Nutzung differenzierter Epithelzellen des Respirationstrakts und viraler
Pseudotypen zur Analyse von Virusinfektionen
Goris, K., S. Uhlenbruck, C. Schwegmann-Weßels, W. Köhl, F. Niedorf, M. Stern, M. HewickerTrautwein, R. Bals, G. Taylor, A. Braun, G. Bicker, M. Kietzmann, and G. Herrler (2009): Differential sensitivity of differentiated epithelial cells to respiratory viruses reveals different viral strategies of host infection. J. Virol. 83:1962-1968.
Es wurden zwei Kultursysteme differenzierter boviner respiratorischer Epithelzellen
etabliert: auf Filtern gewachsene ALI-Kulturen (ALI = „air-liquid-interface“) und Lungenpräzisionsschnitte (PCLS). Auf den Kulturen ließen sich nach zweiwöchigem Wachstum
unter ALI-Konditionen, d.h. Medium auf der basolateralen Seite und Luft auf der apikalen Seite, zilientragende Zellen und Mukus produzierende Zellen selektiv anfärben. Die
zilientragenden Zellen konnten mit BPIV3 in einer m.o.i. von 0,1 infiziert werden. Mit
BRSV konnten bei einer m.o.i. von 0,1 keine ausdifferenzierten Zellen infiziert werden.
Nach einer Erhöhung der initialen Virusmenge auf eine m.o.i. von 3,5 konnten auch mit
BRSV zilientragende Zellen infiziert werden.
Die Vitalität von Lungenpräzisionsschnitten kann anhand des Zilienschlags mikroskopisch überprüft werden. Zusätzlich wurde in dieser Arbeit die Vitalität mittels Broncho17
konstriktion nach Metacholinzugabe und durch eine Lebend-Tot-Färbung überprüft. Die
PCLS der bovinen Atemwege konnten auch 6 Tage nach der Präparation noch für Infektionsexperimente verwendet werden, da die Vitalität nur sehr langsam abnahm. Die
BPIV3-Infektion der PCLS verursachte einen zytopathischen Effekt der respiratorischen
Epithelzellen. Durch eine gleichzeitige Färbung von Virusantigen und -Tubulin als Marker für zilientragende Epithelzellen konnte hier das respiratorische Epithel der Bronchioli
als primärer Ort der BPIV3-Infektion identifiziert werden. Selbst mit sehr hohen initialen
Virusdosen (bis zu 107 PFU/ml) und langen Infektionszeiträumen von bis zu 10 dpi konnte BRSV die Epithelzellen der Bronchioli nicht infizieren. Stattdessen konnte Virusantigen
in tieferen Gewebsschichten nachgewiesen werden. BRSV gehört wie BPIV3 zu den primären Pathogenen des „bovine respiratory disease complex“. Zu diesem Krankheitsbild
tragen neben bovinem Herpesvirus 1 auch bakterielle Co-Infektionen und Umweltfaktoren wie Transportstress und Stallklima bei. Somit ist nicht ausgeschlossen, dass entsprechende zusätzliche Faktoren erst eine Infektion des bovinen respiratorischen Epithels
mit BRSV ermöglichen. Die erfolgreiche Etablierung der beiden bovinen Kultursysteme
ermöglicht die intialen Schritte einer Virusinfektion und auch Co-Infektionen künftig genauer zu studieren.
Punyadarsaniya, D., C.H. Liang, C. Winter, H. Petersen, S. Rautenschlein, I. Hennig-Pauka, C.
Schwegmann-Wessels, C.Y. Wu, C.H. Wong, and G. Herrler. 2011. Infection of differentiated porcine airway epithelial cells by influenza virus: differential susceptibility to infection by porcine
and avian viruses. PLoS One. 6(12):e28429.
Das oben beschriebene Kultursystem der Lungenpräzisionsschnitte (PCLS) wurde in dieser Arbeit für respiratorische Epithelzellen des Schweines etabliert, um die Infektion mit
unterschiedlichen Influenzavirusstämmen zu untersuchen. Die Zilienaktivität der Bronchioli wurde täglich überprüft und blieb bis 9 Tage nach der Präparation stabil bei täglichem Mediumwechsel. Des Weiteren wurde die Vitalität der Schnitte mit einer LebendTot-Färbung und der Messung der Bronchokonstriktion mittels Metacholinzugabe bestätigt. Da je nach Influenzavirusstamm -2,3-gebundene oder -2,6-gebundene Sialinsäure als Rezeptordeterminante erkannt werden, wurde die Expression der Sialinsäuren in
den PCLS mittels Lektinfärbung mit MAA (Maackia amurensis Agglutinin) Typ 2 für 2,3- bzw. SNA (Sambucus nigra Agglutinin) für -2,6-gebundene Sialinsäure nachgewiesen. Es zeigte sich, dass MAA vor allem die luminale Seite der Epithelzellen und vorwiegend zilientragende Epithelzellen anfärbte. Die SNA-Färbung war sowohl für zilientragende als auch für Muzin-produzierende Zellen nachweisbar und erstreckte sich auch
auf die laterale Seite der Epithelzellen.
Eine Infektion der porzinen PCLS war mit allen verwendeten Influenzastämmen möglich:
porzinem H3N2, aviärem H9N2 und aviärem H7N7. Jedoch unterschieden sich die Viren
stark in ihrer Replikationseffizienz. Das ins Medium freigesetzte porzine Influenzvirus erreichte 24 h nach der Infektion der PCLS eine Infektiösität von 10 7 PFU/ml, die niedrig18
pathogenen aviären Influenzavirusstämme zeigten eine niedrigere Infektiösität, deren
Maximum erst nach einem längeren Zeitraum erreicht wurde. H9N2 erreichte einen Titer von 106 PFU/ml 72 Stunden nach Infektion, H7N7 erreichte nur einen Titer von 10 4
PFU/ml ebenfalls nach 72 Stunden. Nach Doppelfärbung der PCLS zeigte sich, dass das
Nukleoprotein von H3N2, H7N7 und H9N2 in zilientragenden Epithelzellen vorlag. H3N2
und H7N7 Virusantigen war zusätzlich in Muzin-produzierenden Zellen nachweisbar.
Neben den bronchiolären Epithelzellen konnte H7N7-Nukleoprotein auch in submukosalen Zellschichten nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass ein breites Spektrum empfänglicher Zellen, wie für H7N7 nachgewiesen, nicht mit einer effizienten Virusreplikation korreliert, da der Virustiter bei diesem untersuchten Virus am niedrigsten
war. Um genauere Angaben über die Bindungsspezifitäten der getesteten aviären Influenzaviren zu erhalten, wurde die Rezeptorbindungsaktivität mittels „glycan array“
analysiert. Das H7N7 Influenzavirus erkannte ausschließlich Glykane, die -2,3gebundene Sialinsäuren enthielten, und dies mit höherer Affinität als H9N2. Hingegen
erkannte Letzteres sowohl -2,3-gebundene als auch -2,6-gebundene Sialinsäuren.
H9N2 Stämme, die an Aminosäureposition 226 des Hämagglutinins ein Leucin statt eines
Glutamins enthalten, binden bevorzugt an -2,6-gebundene Sialinsäuren. Das hier verwendete H9N2 Virus erkannte -2,6-gebundene Sialinsäure mit niedrigerer Affinität als
-2,3-gebundene Sialinsäure aufgrund eines Glutamins an Aminosäureposition 226 des
Hämagglutinins. Die hohen Titer von H9N2 auf den porzinen PCLS scheinen charakteristisch für dieses aviäre Influenzavirus zu sein. Somit besitzt dieses Virus im Vergleich zu
anderen niedrig-pathogenen aviären Influenzaviren vermutlich ein höheres Potential in
einem Adaptationsprozess die Speziesbarriere zum Säugetier und somit auch zum Menschen zu überschreiten.
--------------------------------------------------------Hanika, A., B. Larisch, E. Steinmann, C. Schwegmann-Wessels, G. Herrler,and G. Zimmer (2005):
Use of influenza C virus glycoprotein HEF for generation of vesicular stomatitis virus pseudotypes. J. Gen. Virol. 86:1455-1465.
In dieser Arbeit wurden replikationsdefekte VSV-Pseudotypen generiert, die das HEFGlykoprotein des Influenza C-Virus enthielten. Im Genom dieser rekombinanten Viren
wurde das für das VSV G-Protein kodierende Gen mit dem Gen für das grünfluoreszierende Protein (eGFP) ersetzt. Auf diese Weise war ein Monitoring der Virusinfektion mit
Hilfe der GFP-Expression möglich. Gleichzeitig konnten die Viren nur einen Replikationszyklus durchführen, da das VSV G-Protein in trans zur Verfügung gestellt wurde und neu
produzierte Viren aufgrund des fehlenden G-Proteins keine weiteren Zellen infizieren
konnten. Wurde das HEF-Glykoprotein anstelle des VSV G-Proteins komplementär exprimiert, konnte es in neu gebildete Pseudotypen eingebaut werden. Das verwendete
HEF-Glykoprotein wurde wie VSV G-Protein in Einzelexpression zur Plasmamembran
transportiert, dem Ort der Knospung neu generierter VSV-Partikel. Aufgrund seines ver19
gleichsweise kurzen zytoplasmatischen Abschnitts wurden vergleichend chimäre Proteine konstruiert, die unterschiedliche Anteile des VSV G-Proteins im Bereich des Membranankers und der zytoplasmatischen Domäne enthielten bei unveränderter HEFEktodomäne. Alle getesteten chimären Proteine konnten ebenfalls in generierte VSVPseudotypen eingebaut werden. Eine HEF-CD4 Chimäre wurde mit in die Untersuchungen aufgenommen, um die Relevanz des zytoplasmatischen Abschnitts für den Einbau in
VSV Partikel beurteilen zu können. Tatsächlich konnte diese Chimäre ebenfalls in VSVPseudotypen eingebaut werden, jedoch mit wesentlich geringerer Effizienz als authentisches HEF-Protein bzw. HEF-G chimäre Proteine. Um die Funktionalität der verwendeten
HEF-Proteine (authentisch, Punktmutanten, Chimären) zu überprüfen, wurden diese in
Einzelexpression auf ihre Esteraseaktivität und ihre Sialinsäurebindung getestet. Alle getesten Proteine waren in der Lage ein Esterasesubstrat umzusetzen und im Hämadsorptionstest Hühnererythrozyten zu binden. Neben dem Einbau der HEF-Proteine in die
VSV-Partikel wurde die proteolytische Spaltung des Proteins untersucht. Ohne externe
Trypsinzugabe lag das HEF-Glykoprotein überwiegend in ungespaltener Form in den VSV
Partikeln vor. Nach Trypsinbehandlung und Pelletierung des virushaltigen Zellkulturüberstands ließ sich vermehrt gespaltenes HEF-Protein nachweisen. Die getesteten
HEF-Glykoproteine sowie die HEF-G Chimäre, die den zytoplasmatischen Abschnitt des
VSV G-Proteins enthielt, konnten eine Infektion von MDCK-I Zellen vermitteln. Diese Zellen sind reich an 9-O-acetylierten Sialinsäuren, welche die Rezeptordeterminante für Influenza C-Viren darstellen. Die VSV-Pseudotypen, die HEF-G Chimären mit größerem VSV
G-Protein Anteil enthielten, waren nicht in der Lage, diese Zelllinie zu infizieren. Die Charakteristika der Infektion mit VSV-Pseudotypen, die das authentische HEF-Glykoprotein
enthielten, wurden im Vergleich zu VSV G-Protein enthaltene Pseudotypen determiniert. Die VSV-HEF Pseudotypen waren in der Lage, MDCK-I, U373 und HBE Zellen sialinsäureabhängig zu infizieren. Die Infektion der Zellen war nur durch vorherige Trypsinaktivierung der Viruspartikel möglich und spezifisch mit Antiserum neutralisierbar. Ebenfalls konnten auf Filtern polar gewachsene MDCK-I Zellen mit diesen generierten Pseudotypen nur von der apikalen Seite infiziert werden. Somit zeigten die gebildeten HEFPseudotypen einen Influenza-C Virus ähnlichen Phänotyp im bezug auf den durch das
HEF-Protein vermittelten Viruseintritt.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das authentische HEF-Glykoprotein effizient in VSV-Pseudotypen eingebaut werden kann und seine volle Funktionalität als infektionsvermittelndes Virusprotein beibehält. Mit diesem System ist es möglich, die isolierte Funktion dieses Virusproteins in puncto Esteraseaktivität, Rezeptoraffinität und
Zelltropismus unabhängig von anderen Influenza C Virus-Proteinen zu studieren. Des
Weiteren könnte man die Eigenschaft des HEF-Glykoproteins, effizient über die apikale
Seite polarer Epithelzellen bei Anwesenheit 9-O-acetylierter Sialinsäuren Infektion zu
vermitteln, für die Herstellung viraler Vektoren für die Gentherapie nutzen.
20
Schwegmann-Weßels, C., J. Glende, X. Ren, X. Qu, H. Deng, L. Enjuanes, and G. Herrler (2009):
Comparison of vesicular stomatitis virus pseudotyped with the S proteins from a porcine and a
human coronavirus. J. Gen. Virol. 90:1724-1729.
In dieser Arbeit wurde das oben beschriebene System der replikationsinkompetenten
VSV-Pseudotypen verwendet, um zwei coronavirale S-Proteine vergleichend zu studieren: das S-Protein des porzinen Coronavirus TGEV und das S-Protein des SARSassozierten Coronavirus SARS-CoV. Hier zeigt sich ein weiterer Vorteil der Arbeit mit replikationsinkompetenten Pseudoviren: Es können rezeptorbindende Membranproteine
von S3 oder S4 eingestuften Viren unter S2-Bedingungen analysiert werden. Das SProtein von TGEV wird im Gegensatz zum S-Protein von SARS-CoV aufgrund eines Retentionssignals im zytoplasmatischen Abschnitt intrazellulär zurückgehalten. Da die
Knospung der viralen Pseudotypen an der Plasmamembran stattfindet, wurde eine
TGEV-S Mutante mit zerstörtem Retentionssignal TGEV-S(YI/AA) mit in die Untersuchungen aufgenommen. Des Weiteren wurden wie für die oben beschriebene Arbeit
Chimären zwischen S- und G-Protein und für beide S-Proteine Deletionsmutanten mit
verkürztem C-Terminus unter Beibehaltung der cystein-reichen Domäne hergestellt. Es
zeigte sich, dass mit den C-terminal deletierten S-Proteinen (Deletion von 14 Aminosäuren beim TGEV-S, von 18 Aminosäuren beim SARS-CoV-S) die höchsten Virustiter zu erreichen waren. Für das VSV-SARS-Sdel18 lag der Titer auf VeroE6 Zellen im Mittel bei 4,8
x 105 infektiösen Einheiten/ml, für das VSV-TGEV-Sdel14 auf LLC-PK1 Zellen bei 2,5 x 104
infektiösen Einheiten/ml. Die eingebauten S-Proteine vermittelten spezifisch die Infektion von für die Ursprungsviren empfänglichen Zellen. Interessanterweise konnten die
Chimären zwischen SARS-CoV S-Protein und VSV G-Protein wie das authentische SARSCoV S-Protein nur schlecht eine Infektion vermitteln. Hingegen waren beim TGEV-S Protein neben der Deletionsmutante auch die Chimäre mit dem zytoplasmatischen Abschnitt des VSV G-Proteins und die TGEV-S(YI/AA) Mutante in der Lage eine Infektion zu
vermitteln. Die Effizienz betrug hier 53% bzw. 37% der Infektiösität, die mit der Deletionsmutante erreicht wurde. Generell scheint für die Funktionalität beider S-Proteine die
Anwesenheit des homologen Membranankers essentiell zu sein. Das TGEV S-Protein
konnte im Gegensatz zum SARS-CoV S-Protein auch bei ungekürztem zytoplasmatischen
Abschnitt eine Infektion vermitteln. Jedoch war der Titer der VSV-Pseudotypen mit porzinem S-Protein per se um mehr als das 10-fache niedriger als mit dem humanen SProtein. Somit eignet sich dieses System vor allem für Studien zur Funktionalität des
SARS-CoV S-Proteins, welches auf diese Weise isoliert von anderen coronaviralen Proteinen unter S2-Bedingungen betrachtet werden kann.
21
2.3. Die Funktion von Sialinsäuren und Cholesterin beim Viruseintritt
Winter, C., C. Schwegmann-Wessels, D. Cavanagh, U. Neumann, and G. Herrler (2006): Sialic acid
is a receptor determinant for infection of cells by avian Infectious bronchitis virus. J. Gen. Virol.
87:1209-1216.
In dieser Arbeit wurde die Bedeutung von Sialinsäuren als Rezeptordeterminante für das
aviäre Coronavirus IBV analysiert. Eine Neuraminidasebehandlung von für den IBVBeaudette Stamm empfänglichen Vero Zellen führte konzentrationsabhängig zu einer
Verringerung des Virustiters freigesetzter Virionen. Auch eine IBV-Beaudette Infektion
von BHK21 und primären Kükennierenzellen (CEK) konnte durch Neuraminidasebehandlung verhindert werden. Der IBV-Stamm M41 vermittelte ebenfalls eine sialinsäureabhängige Infektion von CEK Zellen. Der Effekt der Neuraminidasebehandlung empfänglicher Zellen auf die Virusinfektion mit IBV-Beaudette wurde mit anderen Viren, die Sialinsäure als Rezeptordeterminante nutzen, wie Influenza A-Virus und Sendai Virus verglichen. Hier zeigte sich, dass die IBV-Beaudette-Infektion im Gegensatz zu den anderen
Viren schon bei sehr niedrigen Neuraminidaseaktivitäten zurückgeht. Somit scheint IBV
für die Einleitung einer Virusinfektion relativ große Mengen an Sialinsäure auf der Zelloberfläche zu benötigen. Mit Hilfe des Lektins Maackia amurensis Agglutinin (MAA),
welches bevorzugt an -2,3-gebundene Sialinsäure bindet, konnte gezeigt werden, dass
IBV diesen Sialinsäuretyp für die Infektion nutzt. Die Bindung an -2,3-gebundene Sialinsäuren scheint somit essentiell für die Einleitung einer Virusinfektion für IBV zu sein.
Dies schließt die Erfordernis eines zweiten bisher unbekannten Proteinrezeptors, der für
weitere Schritte des Viruseintritts erforderlich ist, nicht aus. Die Ergebnisse zum M41Stamm in dieser Arbeit zeigen, dass dieser Virusstamm auch sialinsäureabhängig infiziert, aber im Gegensatz zum Beaudette-Stamm nur primäre Zellen, die CEK Zellen, eine
Virusreplikation ermöglichen. Somit erscheint ein zusätzlicher Proteinrezeptor wahrscheinlich, der im Falle der hier getesteten Virusstämme für M41 ein anderer ist als für
Beaudette. Die Unterschiede im Wirtstropismus der verschiedenen IBV-Stämme könnten mit der Nutzung unterschiedlicher Proteinrezeptoren zusammenhängen.
Schwegmann-Wessels, C., S. Bauer, C. Winter, L. Enjuanes, H. Laude, and G. Herrler. 2011. The
sialic acid binding activity of the S protein facilitates infection by porcine transmissible gastroenteritis coronavirus. Virol J. Sep 12; 8(1):435.
Das Virus der übertragbaren Gastroenteritis der Schweine (TGEV) besitzt ebenso wie IBV
eine Sialinsäurebindungseigenschaft, die im N-terminalen Bereich der Ektodomäne des
S-Proteins lokalisiert ist. In früheren Untersuchungen wurde gezeigt, dass diese Sialinsäurebindungseigenschaft mit der Enteropathogenität des Virus korreliert. Für die Effizienz einer Virusinfektion in Zellkultur schien diese Sialinsäurebindungeigenschaft irrelevant zu sein. In dieser Arbeit haben wir die Bedingungen einer Virusinfektion in Zellkul22
tur variiert, um zu sehen, inwieweit die Sialinsäurebindungseigenschaft des Virus bei
verkürzten Adsorptionszeiten für eine effiziente Virusinfektion von Bedeutung sein
kann. Bei einer regulären Adsorptionszeit von 60 min hatte eine Reduzierung der Sialinsäuren auf der Zelloberfläche mittels Neuraminidasebehandlung keinen signifikanten Effekt auf die Infektion mit dem TGEV-Stamm PUR46. Wurde die Adsorptionszeit jedoch
auf 5 min verringert, sank die Infektiösität der Viren auf desialylierten Zellen um mehr
als 60%. Eine Vorinkubation der Viren mit porzinen Muzinen, die reich an Sialinsäuren
sind, führte zu reduzierter Infektiösität, da die Sialinsäurebindungsstellen des S-Proteins
auf diese Weise blockiert waren und nicht mehr mit zellulären Sialinsäuren interagieren
konnten. Vergleichend wurden Virusmutanten getestet, die keine Sialinsäurebindungsaktivität mehr besitzen. In diesen Mutanten war die Infektiösität durch die Neuraminidasebehandlung der Zellen unabhängig von der Adsorptionszeit unverändert oder sogar leicht erhöht. Vermutlich ist der zelluläre Rezeptor porzine Aminopeptidase N für
diese Viren nach Beseitigung von Sialinsäuren von der Zelloberfläche leichter zu erreichen. Der erreichte Virustiter z.B. der HAD3 Mutante war jedoch nach 5 min um 77%
niedriger als der von TGEV PUR46 erreichte Titer, da die Virusmutanten nicht die Sialinsäurebindungseigenschaft für eine schnelle effiziente Anheftung an die Zelle nutzen
können. Für TGEV PUR46 scheint die Sialinsäurebindung unter ungünstigen Umweltbedingungen wie hier einer stark verkürzten Adsorptionszeit eine effiziente Anheftung an
die Zellen zu ermöglichen, um somit in einem zweiten Schritt die Interaktion mit porziner Aminopeptidase N zu vollziehen. Ein weiterer getesteter TGEV-Stamm (TGEV Miller)
und das aviäre Coronavirus IBV-Beaudette zeigten unabhängig von der Adsorptionszeit
eine Verringerung des Virustiters nach Neuraminidasebehandlung. Somit hat die Sialinsäurebindungseigenschaft der hier analysierten TGEV-Stämme (PUR46 und Miller) einen
Einfluss auf die Effizienz der Virusinfektion – jedoch in unterschiedlichem Maße.
--------------------------------------------------------Ren, X., J. Glende, J. Yin, C. Schwegmann-Weßels, and G. Herrler (2008): Importance of cholesterol for infection of cells by transmissible gastroenteritis virus. Virus Res. 137(2):220-224.
In dieser Arbeit wurde der Frage nachgegangen, ob in der Zellmembran enthaltenes
Cholesterin eine Rolle für die Initiierung einer TGEV-Infektion spielt. Der Cholesteringehalt der Plasmamembran wurde durch eine Behandlung mit Methyl- -Cyclodextrin
(M CD, bis 15 mM) erniedrigt. Mit sinkender Cholesterinkonzentration sank ebenfalls
die Infektiösität des porzinen Coronavirus. Vergleichend wurde als Kontrolle das Vesikuläre Stomatitis Virus (VSV) getestet, dessen Replikation vom Cholesteringehalt der Zellmembran unabhängig ist. Die Infektiösität von VSV blieb stetig auf einem Level unabhängig von der verwendeten M CD-Konzentration. Durch Zugabe von exogenem Cholesterin (bis 500 µM) konnte der Cholesteringehalt der Zellmembran wiederhergestellt
werden. Auch die Infektiösität von TGEV stieg mit steigender Cholesterinkonzentration
wieder an und erreichte fast ihren Ursprungswert. Durch Behandlung der Viruspartikel
23
mit M CD in steigenden Konzentrationen (bis 4 mM) wurde der Cholesteringehalt der
Virionen verringert. Auch dies hatte eine konzentrationsabhängige reduzierte Infektiösität der Viren zur Folge. Eine Zugabe von exogenem Cholesterin in steigenden Konzentrationen (bis 500 µM) führte zu einer fast vollständigen Wiederherstellung des ursprünglichen Virustiters. Die hier erzielten Daten weisen darauf hin, dass die Anwesenheit von
Cholesterin sowohl in der Plasmamembran als auch in der Virushülle für eine effiziente
TGEV-Infektion erforderlich ist. Die Virushülle der Coronaviren wird im intermediären
Kompartiment (ERGIC) zwischen ER und Golgi-Apparat erworben. Dieses Kompartiment
unterscheidet sich in seiner Lipidzusammensetzung von der Plasmamembran und enthält z.B. weniger Cholesterin. Somit ist die Cholesterinkonzentration in der Virushülle
von Coronaviren niedriger als bei Viren, die an der Plasmamembran knospen wie HIV.
Dennoch zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass TGEV cholesterinhaltige Mikrodomänen in seiner Virusmembran enthält und dass diese für den Viruseintritt ebenso von Bedeutung sind wie die Mikrodomänen in der Plasmamembran der Zelle.
Yin, J., J. Glende, C. Schwegmann-Wessels, L. Enjuanes, G. Herrler, and X. Ren. 2010. Cholesterol
is important for a post-adsorption step in the entry process of transmissible gastroenteritis virus.
Antiviral Res. 88(3):311-6.
Aufbauend auf der vorherigen Arbeit wurde hier untersucht, ob das S-Protein von TGEV
in so genannten DRMs (detergent resistant membrane microdomains) im Viruspartikel
vorliegt. Das S-Protein konnte nicht mit Hilfe von nicht-ionischen Detergenzien wie Triton X-100 solubilisiert werden. Das als Kontrolle mitgeführte VSV G-Protein hingegen
ließ sich mit Triton X-100 solubilisieren, war also in nicht-DRMs lokalisiert. Ob dieses Experiment tatsächlich auf das Vorliegen von S-Protein in DRMs schließen läßt, sollte eine
Verringerung des Cholesteringehalts in den Virionen durch M CD-Behandlung (10 mM)
zeigen. Die anschließende Behandlung mit Triton X-100 führte nicht zur Solubilisierung
des S-Proteins, obwohl die M CD-Behandlung die Integrität der DRMs zerstört haben
sollte. Tatsächlich war die Infektiösität der TGE-Virionen nach 10 mM M CD-Behandlung
reduziert und konnte durch exogene Cholesterinzugabe wiederhergestellt werden. Dies
weist darauf hin, dass das S-Protein in einer Detergenz-resistenten Weise in der Virusmembran vorliegt, die nicht durch Cholesterindepletion beeinflusst wird. Eine Flotationsanalyse des S-Proteins zeigte ebenfalls, dass das S-Protein nicht in typischen DRMs
vorlag, da es mit hoher Dichte im unteren Bereich des Gradienten verblieb unabhängig
von einer Cholesterindepletion. Möglicherweise hat die Unlöslichkeit des S-Proteins
durch nicht-ionische Detergenzien andere Gründe als die Lokalisierung in klassischen
DRMs. Eine Interaktion mit den viralen M-Proteinen, welche wiederum auch untereinander interagieren, könnte die Solubilisierbarkeit des S-Proteins verhindert haben.
Die Abhängigkeit der Bindungsaktivitäten des TGEV S-Proteins, der Sialinsäurebindung
und der Bindung an porziner Aminopeptidase N (pAPN), wurden im Bezug auf eine Cho24
lesterindepletion untersucht. Die Sialinsäurebindungsaktivität des Virus wurde im Hämagglutinationsstest gemessen. Der HA-Titer zeigte keine Reduktion bei einer 10 mM
M CD-Behandlung, obwohl die Infektiösität des Virus bei dieser Konzentration um ca.
60% erniedrigt war. Im ELISA wurde der Einfluss von Cholesterin auf die Bindung an
pAPN untersucht. Auch hier war kein Effekt auf die Rezeptorbindung nachweisbar, obwohl die Virusinfektiösität mit steigender M CD-Konzentration absank. Da die Virusbindung an die Zelle unabhängig von Cholesterin zu sein schien, wurde ein Test durchgeführt, um die Relevanz von postadsorptiven Schritten untersuchen zu können. Hierzu
wurden M CD-behandelte bzw. unbehandelte Viren bei 4°C oder bei 37°C auf Zellen für
1 h inkubiert. Nur bei 37°C war ein negativer Effekt auf die Virusinfektion zu sehen. Dies
spricht für eine Rolle des Cholesterins in einem post-adsorptiven Schritt des Viruseintritts, der möglicherweise zu einer Umsortierung der Virus- und Zellmembranen führt
und somit den Viruseintritt erleichtert.
--------------------------------------------------------Ren, X., J. Glende, M. Al Falah, V. de Vries, C. Schwegmann-Wessels, X. Qu, L. Tan, T. Tschernig,
H. Deng, H. Y. Naim, and G. Herrler (2006): Analysis of ACE2 in polarized epithelial cells: surface
expression and function as receptor for severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus. J. Gen. Virol. 87:1691-1695.
In dieser Arbeit wurde das Angiotensin-converting enzyme (ACE2) in seiner Lokalisation
in polaren Zellen und in seiner Funktion als zellulärer Rezeptor für das SARS-assozierte
Coronavirus (SARS-CoV) untersucht. Die Colonkarzinomazelllinie CaCo-2, die Lungenkarzinomazelllinie Calu-3 und die Affennierenzelllinie Vero E6 wurden auf Filtern ausgesät
und bei entsprechender Polarität 5 Tage nach der Aussaat auf die Lokalisation von ACE2
in der konfokalen Mikroskopie untersucht. Alle drei Zellinien zeigten eine endogene apikale Expression von ACE2. Die höchste ACE2-Menge wurde von den Vero E6 Zellen exprimiert. Calu-3 Zellen zeigten eine wesentlich geringere Menge an ACE2-Expression.
Die in obiger Arbeit (Schwegmann-Weßels et al., 2009) beschriebenen VSV-Pseudotypen
wurden mit einer Dosis von 1 x 105 infektiösen Einheiten für Infektionsstudien an den
polaren Zellen verwendet. Enthielten die Pseudotypen das SARS-S Protein (mit einer Cterminalen Deletion von 18 Aminosäuren) konnten Vero E6, Caco-2 und Calu-3 Zellen
von der apikalen Seite infiziert werden. Zur Kontrolle wurden VSV-Pseudotypen verwendet, die das VSV G-Protein enthielten. Für diese Viren konnte eine basolaterale Infektion der Calu-3 Zellen nachgewiesen werden. Der Grad der apikalen Infektion durch
VSV-SARS-Sdel18 korrelierte mit dem Expressionslevel des zellulären Rezeptors ACE2.
Um die Pathogenese einer SARS-CoV Infektion genauer zu verstehen, wurden Gewebe
aus dem humanen Respirationstrakt auf ihre ACE2-Expression hin untersucht. Die angefertigten Kryoschnitte wurden mit Hematoxylin angefärbt und ACE2 mittels Antikörpern
nachgewiesen. Eine schwache apikale ACE2-Expression wurde in den Epithelzellen der
Trachea, des Hauptbronchus und der Lungenalveolen nachgewiesen. Eine starke ACE225
Expression konnte auf den Epithelien trachealer Drüsen detektiert werden. In postmortem Gewebe konnte kein ACE2 in den Bronchen angefärbt werden, jedoch zeigte
sich eine fast kontinuierliche Färbung einiger Bronchen, wenn Resektionsmaterial für die
Untersuchung verwendet wurde. Auch einige nicht-epitheliale Zellen wie z.B. Alveolarmakrophagen exprimierten ACE2. Zusammenfassend lässt sich somit sagen, dass ACE2
in verschiedenen Bereichen des Respirationstrakts auf epithelialen Zellen vorhanden ist
und somit diese Epithelien empfänglich für eine SARS-CoV Infektion sein können. Die
Expressionsstärke von ACE2 ist variabel und könnte durch unterschiedliche Stimuli wie
Infektionen und Entzündung beeinflusst werden.
Glende, J., C. Schwegmann-Weßels, M. Al-Falah, S. Pfefferle, X. Qu, H. Deng, C. Drosten, H. Y.
Naim, and G. Herrler (2008): Importance of cholesterol-rich membrane microdomains in the interaction of the S protein of SARS coronavirus with the cellular receptor angiotensin-converting
enzyme 2. Virology. 381(2):215-221.
In dieser Arbeit wurde die Bedeutung von Cholesterin-haltigen Mikrodomänen für die
Interaktion des S-Proteins des SARS-CoV mit dem zellulären Rezeptor ACE2 untersucht.
Durch eine Cholesterindepletion der Zellen mit M CD wurde sowohl die Infektiösität
von SARS-CoV als auch die Infektiösität von VSV-Pseudotypen, die das SARS S-Protein
(SARS-Sdel18) enthielten, verringert. Dies zeigte, dass das Cholesterin für die Funktion
des S-Proteins bei der Infektion eine Rolle spielt und andere coronavirale Proteine davon unbeeinflusst sind. Da es unterschiedliche Berichte zum Vorliegen von ACE2 in
DRMs gab, wurden in dieser Arbeit DRMs aus VeroE6 und CaCo-2 Zellen präpariert und
auf einem Iodixanol-Stufengradienten untersucht. Flotillin-2 (Raft-Marker) und LAMP-2
(Nicht-Raft-Marker) dienten als Kontrollen. Die Präparation wurde mit und ohne vorherige Cholesterindepletion der Zellen durchgeführt. Der zelluläre SARS-CoV Rezeptor
ACE2 verhielt sich in den Experimenten wie der Raft-Marker Flotillin-2, d.h. er flotierte
bis zu dem oberen Bereich des Gradienten und verblieb nach Cholesterindepletion im
unteren Bereich. Dies weist darauf hin, dass ACE2 in den untersuchten Zellen in DRMs
vorliegt. Um die Bedeutung des Cholesterins in den ersten Schritten der Virusinfektion –
bei der Interaktion zwischen zellulärem Rezeptor ACE2 und SARS-CoV S-Protein – zu verstehen, wurde ein zellgebundener Bindungstest etabliert. VeroE6 Zellen, die endogen
ACE2 exprimieren, wurden mit BHK21 Zellen, die stabil das SARS-CoV S-Protein (BHKS 18) exprimieren, inkubiert. Die BHK21 Zellen wurden vor der Zugabe zu VeroE6 Zellen
mit dem fluoreszierenden BODIPY FL C12 markiert. Die Zell-Zell-Interaktion konnte somit
im Fluoreszenzmikroskop überprüft werden. Die Negativkontrollen (PBS, gelabelte
BHK21 Zellen) zeigten keinerlei Bindung. Die eindeutige Interaktion zwischen BHK-S 18
und VeroE6 Zellen konnte durch ein spezifisches anti-SARS Antiserum gehemmt werden.
Der Einfluss einer Cholesterindepletion auf diese Bindung wurde im Zytometer quantitativ bestimmt. Eine Behandlung mit 10 mM M CD führte zu einer 50 %igen Reduktion
der Zell-Zell-Interaktion. Eine exogene Cholesterinzugabe verbesserte die Zell-Zell26
Interaktion sogar auf das Doppelte. Um den Einfluss einer Cholesterindepletion auf die
Rezeptorbindung in einem alternativen Ansatz zu analysieren, wurde ein lösliches SProtein (S1-Fc) verwendet, welches nur die rezeptorbindende Domäne des SARS SProteins enthält. Dieses ankonzentrierte lösliche Protein wurde mit cholesterindepletierten und re-depletierten VeroE6 Zellen für 1 h auf Eis inkubiert. Gebundenes SProtein wurde mittels Fluoreszenz im Zytometer quantifiziert. Die Bindung des löslichen
S-Proteins an die VeroE6 Zellen wurde nicht durch eine Cholesterindepletion oder –
zugabe beeinflusst. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass multivalente Interaktionen
zwischen den S-Proteinen und dem auf der Zelle vorhandenem ACE2 für eine optimale
Infektion erforderlich sind. Dies wird gefördert durch die Ankonzentrierung von ACE2 in
Mikrodomänen und die im zellbasierten Bindungstest nachgestellte Multivalenz der SProteine wie sie auch auf dem Viruspartikel präsent sind. Somit wird die Effizienz der Virusbindung erhöht, was auf lange Sicht einen Replikationsvorteil für die Viren bedeutet.
2.4. Transport viraler Glykoproteine in der Zelle
Schwegmann-Wessels, C., M. Al Falah, D. Escors, Z. Wang, G. Zimmer, H. Deng, L. Enjuanes, H. Y.
Naim, and G. Herrler (2004): A novel sorting signal for intracellular localization is present in the S
protein of a porcine coronavirus but absent from severe acute respiratory syndrome-associated
coronavirus. J. Biol. Chem. 279:43661-43666.
In dieser Arbeit wurde der Transport der coronaviralen S-Proteine von TGEV und SARSCoV mit Hilfe der Immunfluoreszenzanalyse und der Oberflächenbiotinylierung untersucht. Beide Proteine unterschieden sich in ihrer zellulären Lokalisation. Das TGEV SProtein wurde in Einzelexpression in einem intrazellulären Kompartiment zurückgehalten. Das SARS-CoV S-Protein hingegen wurde effizient zur Plasmamembran transportiert. Mit Hilfe von chimären Proteinen konnte der hintere zytoplasmatische Abschnitt
des TGEV S-Proteins als Ort eines für die intrazelluläre Retention verantwortlichen Signals bestimmt werden. Durch gerichtete Mutationen wurde ein klassisches tyrosinbasiertes Sortierungssignal (YXXI) im TGEV S-Protein identifiziert, welches zur intrazellulären Retention des S-Proteins führt. Wurde ein ähnliches Signal per Mutation an ähnlicher Position in das SARS-CoV S-Protein eingeführt, wurde auch dieses Protein intrazellulär zurückgehalten. Eine Behandlung mit Endoglykosidase H zeigte, dass das TGEV SProtein mannose-reich glykosyliert ist, somit also nicht den Bereich des Golgi-Apparates
erreicht, in dem die komplexe Glykosylierung der N-Glykane erfolgt. Bei zerstörtem Retentionssignal wurde das Protein, welches dann auch zur Plasmamembran transportiert
wurde, zu einem großen Teil komplex glykosyliert.
Die Bildung neuer Viruspartikel erfolgt im Falle der Coronaviren in einem intrazellulären
Kompartiment – dem ER-Golgi-intermediärem Kompartiment, kurz ERGIC. Eine intrazelluläre Retention des S-Proteins in diesem Bereich scheint somit für das Assembly neuer
27
Viruspartikel von Vorteil sein. Auch die SARS Coronaviren werden im ERGIC gebildet.
Möglicherweise wird das SARS S-Protein jedoch durch die Interaktion mit anderen
coronaviralen Proteinen in diesem Kompartiment zurückgehalten. Das TGEV S-Protein
wird auch ohne diese Interaktion mit anderen viralen Proteinen zurückgehalten. Die
Abwesenheit von S-Protein auf der Plasmamembran infizierter Zellen (in einem frühen
Infektionsstadium) könnte einen Vorteil für die Virusproduktion haben, indem z.B. körpereigene Abwehrmechanismen wie Komplementaktivierung vermieden werden.
Winter, C., C. Schwegmann-Wessels, U. Neumann, and G. Herrler (2008): The Spike Protein of Infectious Bronchitis Virus Is Retained Intracellularly by a Tyrosine Motif. J. Virol. 82:2765-2771.
Analog zu der vorangegangenen Arbeit wurde der Transport des S-Proteins des aviären
Coronavirus IBV-Beaudette studiert. Zusätzlich zur Immunfluoreszenz und Oberflächenbiotinylierung wurde die Bildung von Synzytien in IBV-S exprimierenden Zellen analysiert. Das IBV S-Protein wurde wie das oben beschriebene TGEV S-Protein intrazellulär
zurückgehalten. Mit Hilfe von Mutanten wurde auch hier ein tyrosinbasiertes Retentionssignal im zytoplasmatischen Abschnitt (YXXF) des S-Proteins identifiziert. Da tyrosinbasierte Sortierungssignale auch als Endozytosesignale bekannt sind, wurde mit Hilfe eines „antibody uptake assays“ eine Endozytose des IBV S-Proteins ausgeschlossen. Das
IBV S-Protein kolokalisierte mit einem Golgi-Marker und zeigte im Endoglykosidase HVerdau die Anwesenheit komplexer N-Glykane. Für das IBV S-Protein ist eine proteolytische Spaltung durch Furin im späten Golgi in eine S1 und eine S2 Untereinheit beschrieben. Diese Spaltung konnte für die getesteten Mutanten und auch für das authentische
IBV S-Protein im Western Blot gezeigt werden. Somit wird das IBV S-Protein im Gegensatz zum TGEV S-Protein in Einzelexpression bis in den Golgi-Apparat (trans-Golgi) transportiert. Auch hier ist eine intrazelluläre Retention des S-Proteins wie für das TGEV SProtein oben beschrieben möglicherweise von Vorteil für eine effiziente Virusinfektion,
da die Bildung von Antikörpern gegen das S-Protein verzögert wird. Die zur Plasmamembran transportierten IBV S-Proteinmutanten führten zusätzlich zur Bildung großer
Synzytien. Aufgrund dieses starken zytopathischen Effektes könnte die Virusproduktion
bei nicht zurückgehaltenem S-Protein in einem frühen Stadium der Infektion gestört
werden. Eine Retention des IBV S-Proteins hätte somit eine effizientere Virusproduktion
zur Folge.
Paul, A., A. Trincone, S. Siewert, G. Herrler, and C. Schwegmann-Weßels (2014): A lysinemethionine exchange in a coronavirus surface protein transforms a retention motif into an endocytosis signal. Biol Chem. 395(6):657-665.
In dieser Arbeit wurde die Bedeutung von weiteren Aminosäuren in der zytoplasmatischen Domäne des TGEV S-Proteins für das tyrosin-basierte Retentionssignal untersucht.
Die Untersuchungen basierten auf der Beobachtung, dass das VSV G-Protein in seinem
28
zytoplasmatischen Abschnitt ein sehr ähnliches Tyrosin-basiertes Sortierungssignal enthält. Für das VSV G-Protein ist in der Literatur beschrieben, dass dieses Signal für die
basolaterale Sortierung des Proteins in polaren Zellen verantwortlich ist. Im Gegensatz
zum TGEV S-Protein wird das VSV G-Protein in Einzelexpression zur Plasmamembran
transportiert. Die Herstellung und Untersuchung (Immunfluoreszenz, Western Blot,
Oberflächenbiotinylierung) von chimären Proteinen, die in der zytoplasmatischen Domäne unterschiedliche Anteile des VSV G-Proteins enthielten, führte zu dem Ergebnis,
dass ein einzelnes Methionin an Position +2 (YXXIXM) das Transportverhalten des TGEV
S-Proteins veränderte. Das ursprünglich an dieser Position vorhandene Lysin schien
durch sein Fehlen nicht für dieses veränderte Transportverhalten verantwortlich zu sein,
da Mutationen zu Alanin, Arginin oder Asparaginsäure keinen offensichtlichen Effekt auf
die S-Protein Retention hatten. Durch das Einfügen des Methionins jedoch entstand eine
Proteinmutante (K/M) die trotz weiterhin vorhandenem Tyrosinsignal zur Plasmamembran transportiert wurde. Die Durchführung von Assays zum Endozytosenachweis zeigte,
dass diese Mutante anschließend endozytiert wurde. Diese Endozytose war abhängig
von der Anwesenheit eines intakten Tyrosinsignals (YXX ). In der konfokalen Mikroskopie zeigte sich, dass die K/M-Mutante in Vesikeln über das Zytoplasma verteilt vorlag,
das authentische TGEV S-Protein kolokalisierte hingegen zu einem großen Teil mit einem
ERGIC-Marker. Um zu sehen, ob das Methionin in seinem natürlichen Kontext im VSV GProtein funtionell von Bedeutung ist, wurden VSV G-Mutanten erstellt, die an dieser
Stelle ein Lysin (M/K) bzw. zusätzlich noch anstelle des Tyrosins ein Alanin (YM/AK) enthielten. Alle drei VSV G-Proteine wurden zur Plasmamembran transportiert. Der Anteil
an oberflächenexprimiertem VSV G war jedoch bei den Mutanten wesentlich niedriger.
Es ist möglich, dass das Methionin im VSV G-Protein zu einem effizienteren ER-Export
und einem effizienteren Transport zur Plasmamembran führt.
Die im TGEV S-Protein erstellte K/M-Mutante sollte ergänzend mit in die Untersuchungen zum TGEV S-Protein Retentionssignal aufgenommen werden, da sie trotz vorhandenem Tyrosinsignal einen komplett anderen Phänotyp zeigt. Die Relevanz dieser Signale
im Viruskontext kann somit noch genauer untersucht werden.
2.5. Identifikation coronaviraler Inhibitoren
Pfefferle, S., J. Schöpf, M. Kögl, C.C. Friedel, M.A. Müller, J. Carbajo-Lozoya, T. Stellberger, E. von
Dall'armi, P. Herzog, S. Kallies, D. Niemeyer, V. Ditt, T. Kuri, R. Züst, K. Pumpor, R. Hilgenfeld, F.
Schwarz, R. Zimmer, I. Steffen, F. Weber, V. Thiel, G. Herrler, H.J. Thiel, C. Schwegmann-Weßels,
S. Pöhlmann, J. Haas, C. Drosten, and A. von Brunn. 2011. The SARS-Coronavirus-Host Interactome: Identification of Cyclophilins as Target for Pan-Coronavirus Inhibitors. PLoS Pathog. Oct
7(10):e1002331.
29
Zur Indentifizierung coronaviraler Inhibitoren wurde ein Genom-weiter Yeast-2-Hybrid
Screen durchgeführt. Immunophiline wurden als Interaktionspartner des coronaviralen
Nichtstrukturproteins 1 (NSP1) identifiziert und zur weiteren Analyse ausgewählt. Diese
Moleküle modulieren den Calcineurin/NFAT (nuclear factor of activated T-cells) Signalweg, der eine wichtige Rolle in der Immunzellaktivierung spielt. Die Überexpression von
NSP1 bzw. die Infektion mit SARS-CoV verstärkte die Signaltransduktion über den Calcineurin/NFAT Signalweg und die Induktion von Interleukin 2. Dies ist kompatibel mit der
Immunopathogenität im späten Infektionsstadium einer SARS-CoV Infektion und einer
langanhaltenen Zytokindysregulation wie sie in schweren SARS Fällen auftritt.
Der Calcineurin/NFAT Signalweg konnte indirekt durch Cyclosporin A inhibiert werden.
Cyclosporin A bildet Komplexe mit Cyclophilinen, die wiederum an Calcineurin A binden.
Die Dephosphorylierung und somit Aktivierung von NFAT durch die Phosphatase Calcineurin A ist somit nicht mehr möglich. Die Inhibierung von Cyclophilinen durch Cyclosporin A blockierte die Replikation von Coronaviren aller Genera wie z.B. humanes CoV229E und-NL63, felines CoV, porzines CoV, SARS-CoV und aviäres IBV. Nichtimmunsuppressive Derivative von Cyclosporin A könnten somit als BreitbandCoronavirus-Inhibitor eingesetzt werden gegen neuauftretende Coronaviren sowie gegen Infektionen mit vorkommenden bekannten Coronaviren.
30
3. Übergreifende Diskussion
Der Respirations- und der Intestinaltrakt stellen Haupteintrittspforten für Erreger von Infektionskrankheiten dar. Um die ersten Schritte einer Virusinfektion in einem wirtsnahen
System ex vivo untersuchen zu können, haben wir die Verwendung von bovinen und porzinen Lungenpräzisionsschnitten und von bovinen Air-Liquid-Interface Kulturen in Infektionsstudien etabliert. Auf diese Weise war es möglich, die für die Virusvermehrung genutzten Zielzellen zu identifizieren. Für die Infektion mit BRSV war auffällig, dass in Einzelinfektion die Epithelzellen der Bronchioli nicht infiziert werden konnten. Auch bei der
Nutzung der bovinen ALI-Kulturen konnte eine Infektion der zilientragenden Zellen nur
mit hohen initialen Virusdosen erreicht werden (Goris et al., 2009). Ein Grund für diese
Ergebnisse könnte sein, dass weitere Erreger oder Faktoren nötig sind, um eine effiziente
Infektion der Epithelzellen zu erreichen. Es wäre aber auch möglich, dass der Zelltropismus und die Effizienz der Infektion in diesen Zellkulturmodellen vom Virusstamm abhängen. Ein Feldisolat mit entsprechender Virulenz im Tier könnte durchaus andere Resultate im Rahmen dieser Untersuchung liefern.
Mit Hilfe der porzinen Lungenpräzisionsschnitte war es uns möglich zu zeigen, dass auch
aviäre Influenzaviren wie H7N7 und H9N2 im Schweinegewebe replizieren können. Die
relativ hohen Titer von H9N2 lassen vermuten, dass dieses aviäre Virus das Potential besitzt, in einem Adaptationsprozess die Speziesbarriere zum Schwein zu überwinden
(Punyadarsaniya et al., 2011). Peiris et al. beschreiben die Übertragung von aviären H9N2
auf Schweine in Hongkong in dem Zeitraum einer virologischen Überwachung zwischen
1998 und 2000. Eine parallele Cozirkulation von humanem H3N2 wurde ebenfalls nachgewiesen und könnte zu einer genetischen Reassortierung und zum Auftreten neuer Influenzaviren mit pandemischen Potential führen (Peiris et al., 2001). Die porzinen Lungenpräzisionsschnitte eignen sich, solche Fragestellungen zu untersuchen. Somit kann im
Rahmen solcher Studien auch auf den Einsatz von Tierversuchen verzichtet werden.
Die hier vorgestellten Arbeiten mit replikationsdefizienten VSV-Pseudotypen zeigen, dass
es möglich ist, den Zelleintritt von Viren wie dem SARS-CoV mit Hilfe dieses Systems untersuchen zu können. Dies bietet den Vorteil, dass unter S2-Bedingungen im Labor gearbeitet werden kann. Die Verwendung des HEF-Glykoproteins des Influenza-C-Virus zeigte, dass dieses Protein in die VSV-Partikel eingebaut wurde und eine apikale Infektion
polarer MDCK-I Zellen über die Bindung an 9-O-acetylierte Sialinsäure vermitteln konnte
(Hanika et al., 2005). Die Untersuchungen mit den S-Proteinen von TGEV und SARS-CoV
zeigten, dass auch diese Proteine eine Infektion im VSV-Pseudoviren-System vermitteln
können. Jedoch ist hierfür eine C-terminale Deletion von 14-18 Aminosäuren der SProteine notwendig. Die mit dem SARS-S Protein komplementierten VSV-Pseudotypen
zeigten einen 10fach höheren Titer (4,8 x 105 infektiöse Einheiten/ml) als die TGEV-SVSV-Pseudotypen (Schwegmann-Wessels et al., 2009). Die Infektiösität von chimären
Proteinen, die Membrananker und zytoplasmatischen Abschnitt des VSV-G Proteins ent31
hielten, ging gegen Null. Vermutlich sind die Transmembrandomäne sowie die cysteinreiche Region der coronaviralen S-Proteine wichtig für die Infektiösität, indem sie z.B. die
Trimere stabilisieren wie von Broer et al. in pseudotypisierten Retroviren beschrieben
(Broer et al., 2006). Das VSV-Pseudoviren-System wurde von uns erfolgreich für Untersuchungen zum SARS-CoV S-Protein vermittelten Eintritt in Wirtszellen verwendet (Glende
et al., 2008; Hoffmann et al., 2013; Ren et al., 2006).
Sialinsäuren werden in unterschiedlichem Ausmaß von verschiedenen Coronaviren zur
Bindung an die Zielzelle genutzt (Schwegmann-Wessels and Herrler, 2006). Die hier vorgestellten Arbeiten zur sialinsäurevermittelten Bindung von IBV und TGEV an Zellkulturen zeigen, dass sich diese beiden Coronaviren in ihrem Bindungsverhalten voneinander
unterscheiden (Schwegmann-Wessels et al., 2011; Winter et al., 2006). Die IBV-Stämme
Beaudette und M41 können Zielzellen nur bei einer ausreichenden Menge an auf der
Zelloberfläche vorhandenen -2,3-gebundenen Sialinsäuren infizieren. Von M41 konnten
nur die primären CEK-Zellen infiziert werden. Dies weist auf das Vorhandensein eines
weiteren Rezepors – möglicherweise eines Proteinrezeptors – hin, der bei M41 ein anderer ist als bei dem Beaudette-Stamm. Der Wirts- und Zelltropismus verschiedener IBVStämme ließe sich durch die unterschiedliche Nutzung weiterer Rezeptoren erklären.
Versuche mit rekombinantem IBV bestätigen diese Vermutung (Casais et al., 2003). Ein
Austausch des S-Proteins von IBV-Beaudette mit dem S-Protein von IBV-M41 im rekombinanten IBV-Beaudette verhinderte die Infektion von Vero Zellen, die vom IBVBeaudette Stamm effizient infiziert werden konnten.
TGEV PUR46 hingegen kann empfängliche Zellen in Zellkultur auch sialinsäureunabhängig
durch Bindung an den zellulären Rezeptor pAPN infizieren. Die Bindung an pAPN scheint
sogar effizienter zu sein, wenn die Zellen mit Neuraminidase vorbehandelt werden
(Schwegmann-Wessels et al., 2002). Erst eine Herabsetzung der Virusadsorptionszeit von
60 min auf 5 min zeigt, dass unter diesen ungünstigen Bedingungen die Sialinsäurebindungseigenschaft des TGEV S-Proteins einen Replikationsvorteil darstellt (SchwegmannWessels et al., 2011). Der getestete TGEV Miller-Stamm hingegen ähnelte eher IBV in
seiner Abhängigkeit von Sialinsäuren. Hier führte wie bei IBV-Beaudette eine Neuraminidasebehandlung der Zellen auch schon bei 60 min Adsorptionszeit zu signifikant niedrigeren Virustitern. Diese Ergebnisse bestätigen unsere Hypothese, dass die Sialinsäurebindungseigenschaft von TGEV dazu dient, die Bindung an das Darmepithel im Schwein
effizienter zu gestalten. Auf diese Weise können eingedrungene Viren nicht oder weniger
effektiv durch die Darmperistaltik aus dem Dünndarm geschleust werden und durch die
längere Verweildauer im Darm besteht eine höhere Wahrscheinlichkeit zur auf den
Enterozyten vorhandenen porzinen Aminopeptidase N vorzudringen.
Neben der Rolle von Sialinsäuren für den Viruseintritt haben wir die Bedeutung von Cholesterin für eine Virusinfektion mit TGEV und SARS-CoV untersucht (Glende et al., 2008;
Ren et al., 2008; Yin et al., 2010). Eine zelluläre Cholesterindepletion zeigte, dass sowohl
TGEV als auch SARS-CoV sowie VSV-Pseudotypen, die das SARS-CoV S-Protein enthalten,
32
in ihrer Infektiösität abhängig von Cholesterin sind. Eine Cholesterindepletion der Viruspartikel führte bei TGEV ebenfalls zu einer erniedrigten Infektiösität (Ren et al., 2008).
Cholesterin hatte jedoch keinen Einfluss auf die Bindungsaktivitäten des TGEV S-Proteins,
vielmehr schien ein postadsorptiver Schritt beim Viruseintritt wesentlich effizienter bei
ausreichend vorhandenem Cholesterin zu sein (Yin et al., 2010). Möglicherweise hilft
ausreichend Cholesterin an dieser Stelle eine gewisse Membranfluidität aufrecht zu erhalten, die den Viruseintritt erleichtert. Für einige Viren wurde in den vergangenen Jahren eine Abhängigkeit der Infektiösität von Cholesterin in der Virusmembran beschrieben
(Funk et al., 2008; Imhoff et al., 2007; Ren et al., 2011; Sun and Whittaker, 2003). Somit
scheint Cholesterin in der Virusmembran einen eher generellen Replikationsvorteil für
behüllte Viren darzustellen. Unsere Untersuchungen zum SARS-CoV S-Protein haben gezeigt, dass (i) die vom S-Protein vermittelte Infektion cholesterinabhängig ist, dass (ii) der
Rezeptor ACE2 in Vero E6 Zellen und in Caco-2 Zellen in Cholesterin-reichen Mikrodomänen vorliegt und dass (iii) Cholesterin wichtig ist für eine effiziente durch das S-Protein
vermittelte Bindung an ACE2 exprimierenden Zellen (Glende et al., 2008). Wir vermuten,
dass ein Clustering von ACE2 in lipid rafts eine multivalente Bindung von Viruspartikeln
an die Zelloberfläche ermöglicht und dadurch zu einer effizienteren Infektion mit SARSCoV führt.
Neben dem Viruseintritt stellt auch der Zusammenbau neuer Viruspartikel einen wichtigen Schritt im Lebenszyklus von Viren dar. In beiden Fällen kann eine Speziesspezifität
oder auch der Übertritt zu neuen Spezies von der Interaktion mit zellulären Komponenten abhängen. Wir haben den Transport des S-Proteins in der Zelle an drei Vertretern aus
verschiedenen Genera ( -, -, -Coronaviren) der Familie Coronaviridae studiert
(Schwegmann-Wessels et al., 2004; Winter et al., 2008). Das TGEV und das IBV S-Protein
wurden aufgrund eines tyrosin-basierten Sortierungssignals im C-Terminus der zytoplasmatischen Domäne intrazellulär zurückgehalten. Das SARS-CoV S Protein hingegen enthielt kein tyrosin-basiertes Sortierungssignal und wurde in Einzelexpression zur Plasmamembran transportiert. Eine Übertragung des TGEV-S Retentionssignals auf das SARSCoV S Protein führte zu einer intrazellulären Retention dieser Mutante. Das TGEV S Protein wurde im ERGIC – dem Ort der Virusknospung – zurückgehalten (Paul et al., 2014).
Das IBV S Protein hingegen war im Golgi-Apparat lokalisiert (Winter et al., 2008). Dies belegt auch das unterschiedliche Glykosylierungsmuster dieser coronaviralen S-Proteine.
Während das IBV S-Protein auch bei Einzelexpression in komplex-gykosylierter Form in
der Zelle vorliegt, konnte beim authentischen TGEV S Protein nur eine Endoglykosidase
H-sensitive mannosereiche Glykosylierung nachgewiesen werden (Schwegmann-Wessels
et al., 2004; Winter et al., 2008). Das durch Mutation eines Lysins an Position +2 in Relation zum YXX Signal zu einem Methionin veränderte Transportverhalten des TGEV S
Proteins zeigt, dass auch Aminosäuren außerhalb des tyrosin-basierten Sortierungssignals einen Einfluss auf den Proteintransport ausüben. Diese Methioninmutante wurde
zur Plasmamembran transportiert und anschließend aufgrund des tyrosin-basierten Motivs endozytiert (Paul et al., 2014). Somit kann der Kontext, in dem sich ein tyrosin33
basiertes Sortierungsmotiv befindet, determinieren, welcher Transportweg letztendlich
eingeschlagen wird (Mallabiabarrena et al., 1995). Die Retention der S-Proteine im ERGIC
oder in dessen Nähe scheint sinnvoll zu sein, da die Virusknospung in diesem Kompartiment stattfindet. McBride et al. haben für das SARS-CoV S Protein gezeigt, dass ein DiLysin-ähnliches Signal (KXHXX) am C-Terminus eine Rückführung von S-Protein ins ER
bewirken kann (McBride et al., 2007). Zu berücksichtigen ist, dass bei einer Virusinfektion
auch die viralen Proteine miteinander interagieren und somit eine Interaktion von SProtein mit dem coronaviralen M-Protein zur Anhäufung von Virusproteinen im
Knospungskompartiment führen kann. Für das SARS-CoV S-Protein wurde gezeigt, dass
die Interaktion mit dem M-Protein zu einer Retention des S-Proteins führt (McBride and
Machamer, 2010). Für das TGEV S-Protein wird die Bedeutung des tyrosin-basierten Retentionssignals in der Interaktion mit anderen viralen Strukturproteinen und im Viruskontext von uns untersucht. Die Methionin-Mutante wird aufgrund ihres abweichenden Phänotyps mit in diese Untersuchungen aufgenommen. Über die Interaktion mit zellulären Proteinen während der Entstehung neuer Viruspartikel am ERGIC ist für Coronaviren kaum etwas bekannt. Diese von der Wirtsseite aus gesehenen bedeutsamen Interaktionen werden wir unter Berücksichtigung der hier dargestellten Erkenntnisse studieren.
Eine Möglichkeit Virus-Wirts-Interaktionen zu identifizieren, ist die Nutzung von Yeast-2Hybrid-Screens. Auf diese Weise konnte Cyclosporin A als pan-coronaviraler Inhibitor detektiert werden (Pfefferle et al., 2011). In Zellkulturversuchen konnte die Replikation von
Coronaviren aller Genera durch Cyclosporin A inhibiert werden. Versuche an Tiermodellen oder ex vivo-Systemen müssen zeigen, ob nicht-immunsuppressive Derivative von
Cyclosporin A geeignet sind, als Breitband-Coronavirus-Inhibitor eingesetzt zu werden. In
Anbetracht des im Herbst 2012 neu aufgetretenen Middle East Respiratory Coronavirus
(MERS-CoV), welches in Saudi-Arabien beim Menschen Mortalitätsraten von ca. 45 %
hervorruft, gibt es einen Bedarf für Breitbandtherapeutika gegen Coronavirusinfektionen
(The Who Mers-Cov Research, 2013). Das Auftreten dieses neuartigen Coronavirus im
Menschen (10 Jahre nach dem Auftreten von SARS-CoV) und der wahrscheinliche tierische Ursprung dieses Virus zeigen, dass Coronaviren sowohl beim Tier selbst, aber auch
als Zoonoseerreger in der Übertragung vom Tier zum Menschen, in der veterinärmedizinischen Virologie von Bedeutung sind.
34
4. Zusammenfassung
Viren interagieren in jeder Phase ihres Replikationszyklus mit dem Wirtsorganismus. Bei pathogenen Erregern führt dies in der Regel zu Krankheitserscheinungen im jeweiligen Wirt.
Die Erforschung der molekularen Mechanismen der Virus-Wirt-Interaktion kann helfen, die
Pathogenese von Viruserkrankungen aufzuklären und Therapeutika zur Behandlung von Virusinfektionen zu entwickeln. Die vorliegenden Arbeiten beschäftigen sich mit der VirusWirt-Interaktion von RNA-Viren, die den Respirationstrakt und/oder den Intestinaltrakt als
Eintrittspforte für eine Infektion nutzen.
Für die bovinen Paramyxoviren BRSV und BPIV-3 sowie für aviäre und porzine Influenzaviren
wurde der Viruseintritt mit Präzisionslungenschnitten (PCLS) vom Rind bzw. Schwein und
bovinen Air-Liquid-Interface-Kulturen untersucht. BPIV-3 und die Influenzaviren infizierten
bevorzugt zilientragende Epithelzellen. BRSV konnte nur in tieferen Gewebsschichten der
Bronchioli nachgewiesen werden. Das aviäre Influenzavirus H7N7 infizierte zusätzlich zu den
Epithelzellen submukosale Zellen. Das aviäre H9N2 Influenzavirus konnte sich in porzinen
PCLS zu Titern replizieren, die nur ein Zehntel unter denen des porzinen H3N2 lagen. Dies
weist auf ein hohes Potential zur Adaptation an das Schwein als neuen Wirt hin.
Die Coronaviren TGEV und IBV interagieren mit Sialinsäuren auf der Zelloberfläche. Die Sialinsäurebindungseigenschaft des porzinen Coronavirus bewirkte eine effiziente Virusanheftung an die Zelle. Dies stellt unter ungünstigen Vermehrungsbedingungen einen Replikationsvorteil dar. Im Gegensatz zu TGEV war die Infektiösität von IBV grundsätzlich sialinsäureabhängig. Hier scheinen Sialinsäuren als genereller Faktor für die primäre Anheftung an die
Zielzelle von Bedeutung zu sein. Die Effizienz einer TGEV-Infektion war ebenfalls vom Cholesteringehalt der Zell- und der Virusmembran abhängig. Hier spielt das Cholesterin in einem
post-adsorptiven Schritt eine Rolle, indem vermutlich durch eine Umsortierung der Virusund Zellmembranen der Viruseintritt erleichtert wird. Die Entwicklung eines VSV-basierten
Pseudotypensystems ermöglichte es, den Viruseintritt des SARS-CoV und seine Cholesterinabhängigkeit zu untersuchen. Der zelluläre Rezeptor ACE2 lag in cholesterinhaltigen Mikrodomänen in der Zellmembran vor. Dies fördert möglicherweise eine multivalente Interaktion
von ACE2 mit den SARS-CoV S-Proteinen, welche einen Replikationsvorteil für das Virus darstellt. Neben der Abhängigkeit des coronaviralen Viruseintritts von Sialinsäuren und Cholesterin wurde in den vorliegenden Arbeiten der Transport und die Lokalisation coronaviraler SProteine untersucht. Das TGEV S-Protein und das IBV S-Protein wurden aufgrund eines tyrosin-basierten Sortierungssignals in der Nähe des ERGIC, dem Knospungskompartiment der
Coronaviren, zurückgehalten. Das SARS-CoV S-Protein wurde zur Plasmamembran transportiert. Mutationen im TGEV S-Protein stromabwärts des tyrosin-basierten Sortierungssignals
zeigten, dass auch Aminosäuren außerhalb dieses Motivs den Proteintransport beeinflussen
können. Mit Hilfe eines genomweiten Yeast-2-Hybrid-Screens wurde Cyclosporin A als
coronaviraler Inhibitor identifiziert. Der Calcineurin/NFAT Signalweg wurde indirekt durch
eine Komplexbildung von Cyclosporin A mit Cyclophilinen gehemmt. Durch diese Cyclophilininhibierung kam es zu einer genusübergreifenden Blockade der Coronavirusreplikation.
35
5. Summary
Viruses interact with their hosts during replication. By studying the molecular mechanisms of
virus-host interactions the pathogenesis of viral diseases can be elucidated and new therapeutic agents can be developed. This work analyzed the virus-host interaction of RNA viruses
that infect the host via the respiratory and/or the gastrointestinal route.
For the bovine paramyxoviruses BRSV and BPIV-3 as well as for avian and porcine influenza
viruses virus entry was analyzed by using precision cut lung slices (PCLS) of the bovine and
porcine lung and bovine air-liquid-interface cultures. BPIV-3 and influenza viruses infected
preferentially ciliated cells. Infection by BRSV was observed in cells located in lower cell layers of PCLS. H7N7-infected cells were not only detected in the epithelium but also in submucosal cell layers. H9N2 grew to titers that were only tenfold lower than that of the tested
porcine H3N2 virus. This avian virus seems to be an interesting candidate for interspecies
transmission.
The coronaviruses TGEV and IBV interact with sialic acids on the cell surface. The sialic acid
binding activity of the porcine coronavirus led to an efficient virus attachment. In this way,
infection by TGEV is facilitated under unfavorable environmental conditions. Infection by IBV
was strictly sialic acid dependent. Binding to sialic acids is used by IBV for primary attachment to the cell surface. In addition, efficient infection by TGEV was dependent on the cholesterol content of the viral and the cellular membrane. Cholesterol was shown to be important for a post-adsorption step, allowing membrane rearrangements that facilitate virus
entry.
Vesicular stomatitis virus was pseudotyped with the SARS-CoV S protein and used for the
analysis of SARS-CoV entry and its dependance on cholesterol. The cellular receptor ACE2
was present in cholesterol-rich membrane microdomains. This clustering of ACE2 may allow
multivalent binding of virus particles to the cell surface which leads to an increase in infection efficiency. In addition to coronavirus entry and its dependance on sialic acids and cholesterol, the transport and localization of coronavirus S proteins was analyzed. The TGEV S
and the IBV S protein were retained near the ERGIC – the budding compartment of coronaviruses – due to a tyrosine-based sorting signal. The SARS-CoV S protein was transported to
the plasma membrane. Site-directed mutagenesis in the TGEV S protein showed that amino
acids downstream of the tyrosine-based sorting signal may influence the protein transport. A
genome-wide yeast-two hybrid interaction screen was used to identify cyclosporin A as
coronaviral inhibitor. The Calcineurin/NFAT pathway was inhibited due to complex formation of cyclosporin A with cyclophilins. Due to this inhibition of cyclophilins the replication
of coronaviruses of all genera was blocked.
36
6. Literaturverzeichnis
Andersson, A.M., Melin, L., Bean, A., and Pettersson, R.F. (1997). A retention signal necessary and
sufficient for Golgi localization maps to the cytoplasmic tail of a Bunyaviridae (Uukuniemi
virus) membrane glycoprotein. J Virol 71, 4717-4727.
Andre, B., Duterme, C., Van Moer, K., Mertens-Strijthagen, J., Jadot, M., and Flamion, B. (2011). Hyal2
is a glycosylphosphatidylinositol-anchored, lipid raft-associated hyaluronidase. Biochem
Biophys Res Commun 411, 175-179.
Arni, S., Keilbaugh, S.A., Ostermeyer, A.G., and Brown, D.A. (1998). Association of GAP-43 with
detergent-resistant membranes requires two palmitoylated cysteine residues. J Biol Chem
273, 28478-28485.
Babcock, G.J., Esshaki, D.J., Thomas, W.D., Jr., and Ambrosino, D.M. (2004). Amino acids 270 to 510
of the severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein are required for
interaction with receptor. J Virol 78, 4552-4560.
Barlowe, C. (2003). Signals for COPII-dependent export from the ER: what's the ticket out? Trends
Cell Biol 13, 295-300.
Bingham, R.W., Madge, M.H., and Tyrrell, D.A. (1975). Haemagglutination by avian infectious
bronchitis virus-a coronavirus. J Gen Virol 28, 381-390.
Bonifacino, J.S., and Traub, L.M. (2003). Signals for sorting of transmembrane proteins to endosomes
and lysosomes. Annu Rev Biochem 72, 395-447.
Bourgueil, E., Hutet, E., Cariolet, R., and Vannier, P. (1992). Experimental infection of pigs with the
porcine respiratory coronavirus (PRCV): measure of viral excretion. Vet Microbiol 31, 11-18.
Broadfoot, D.I., Pomeroy, B.S., and Smith, W.M., Jr. (1954). Effect of infectious bronchitis on egg
production. J Am Vet Med Assoc 124, 128-130.
Broer, R., Boson, B., Spaan, W., Cosset, F.L., and Corver, J. (2006). Important role for the
transmembrane domain of severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein
during entry. J Virol 80, 1302-1310.
Brown, D.A., and London, E. (1998). Functions of lipid rafts in biological membranes. Annu Rev Cell
Dev Biol 14, 111-136.
Cameron, K.R., Gregory, V., Banks, J., Brown, I.H., Alexander, D.J., Hay, A.J., and Lin, Y.P. (2000). H9N2
subtype influenza A viruses in poultry in pakistan are closely related to the H9N2 viruses
responsible for human infection in Hong Kong. Virology 278, 36-41.
Casais, R., Dove, B., Cavanagh, D., and Britton, P. (2003). Recombinant avian infectious bronchitis
virus expressing a heterologous spike gene demonstrates that the spike protein is a
determinant of cell tropism. J Virol 77, 9084-9089.
Chazal, N., and Gerlier, D. (2003). Virus entry, assembly, budding, and membrane rafts. Microbiol Mol
Biol Rev 67, 226-237, table of contents.
Cox, E., Pensaert, M.B., and Callebaut, P. (1993). Intestinal protection against challenge with
transmissible gastroenteritis virus of pigs immune after infection with the porcine respiratory
coronavirus. Vaccine 11, 267-272.
Delmas, B., Gelfi, J., L'Haridon, R., Vogel, L.K., Sjostrom, H., Noren, O., and Laude, H. (1992).
Aminopeptidase N is a major receptor for the entero-pathogenic coronavirus TGEV. Nature
357, 417-420.
Doyle, L.P., and Hutchings, L.M. (1946). A transmissible gastroenteritis in pigs. J Am Vet Med Assoc
108, 257-259.
37
Fouchier, R.A., Schneeberger, P.M., Rozendaal, F.W., Broekman, J.M., Kemink, S.A., Munster, V.,
Kuiken, T., Rimmelzwaan, G.F., Schutten, M., Van Doornum, G.J., et al. (2004). Avian influenza
A virus (H7N7) associated with human conjunctivitis and a fatal case of acute respiratory
distress syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 1356-1361.
Funk, A., Mhamdi, M., Hohenberg, H., Heeren, J., Reimer, R., Lambert, C., Prange, R., and Sirma, H.
(2008). Duck hepatitis B virus requires cholesterol for endosomal escape during virus entry. J
Virol 82, 10532-10542.
Gao, R., Cao, B., Hu, Y., Feng, Z., Wang, D., Hu, W., Chen, J., Jie, Z., Qiu, H., Xu, K., et al. (2013). Human
infection with a novel avian-origin influenza A (H7N9) virus. N Engl J Med 368, 1888-1897.
Glende, J., Schwegmann-Wessels, C., Al-Falah, M., Pfefferle, S., Qu, X., Deng, H., Drosten, C., Naim,
H.Y., and Herrler, G. (2008). Importance of cholesterol-rich membrane microdomains in the
interaction of the S protein of SARS-coronavirus with the cellular receptor angiotensinconverting enzyme 2. Virology 381, 215-221.
Godet, M., Grosclaude, J., Delmas, B., and Laude, H. (1994). Major receptor-binding and
neutralization determinants are located within the same domain of the transmissible
gastroenteritis virus (coronavirus) spike protein. J Virol 68, 8008-8016.
Goris, K., Uhlenbruck, S., Schwegmann-Wessels, C., Kohl, W., Niedorf, F., Stern, M., HewickerTrautwein, M., Bals, R., Taylor, G., Braun, A., et al. (2009). Differential sensitivity of
differentiated epithelial cells to respiratory viruses reveals different viral strategies of host
infection. J Virol 83, 1962-1968.
Graham, D.R., Chertova, E., Hilburn, J.M., Arthur, L.O., and Hildreth, J.E. (2003). Cholesterol depletion
of human immunodeficiency virus type 1 and simian immunodeficiency virus with betacyclodextrin inactivates and permeabilizes the virions: evidence for virion-associated lipid
rafts. J Virol 77, 8237-8248.
Hanika, A., Larisch, B., Steinmann, E., Schwegmann-Wessels, C., Herrler, G., and Zimmer, G. (2005).
Use of influenza C virus glycoprotein HEF for generation of vesicular stomatitis virus
pseudotypes. J Gen Virol 86, 1455-1465.
Hoffmann, M., Muller, M.A., Drexler, J.F., Glende, J., Erdt, M., Gutzkow, T., Losemann, C., Binger, T.,
Deng, H., Schwegmann-Wessels, C., et al. (2013). Differential sensitivity of bat cells to
infection by enveloped RNA viruses: coronaviruses, paramyxoviruses, filoviruses, and
influenza viruses. PLoS One 8, e72942.
Honing, S., Griffith, J., Geuze, H.J., and Hunziker, W. (1996). The tyrosine-based lysosomal targeting
signal in lamp-1 mediates sorting into Golgi-derived clathrin-coated vesicles. EMBO J 15,
5230-5239.
Hooper, B.E., and Haelterman, E.O. (1969). Lesions of the gastrointestinal tract of pigs infected with
transmissible gastroenteritis. Can J Comp Med 33, 29-36.
Hunziker, W., Harter, C., Matter, K., and Mellman, I. (1991). Basolateral sorting in MDCK cells requires
a distinct cytoplasmic domain determinant. Cell 66, 907-920.
Imhoff, H., von Messling, V., Herrler, G., and Haas, L. (2007). Canine distemper virus infection
requires cholesterol in the viral envelope. J Virol 81, 4158-4165.
Ingallinella, P., Bianchi, E., Finotto, M., Cantoni, G., Eckert, D.M., Supekar, V.M., Bruckmann, C., Carfi,
A., and Pessi, A. (2004). Structural characterization of the fusion-active complex of severe
acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 8709-8714.
Kanaseki, T., and Kadota, K. (1969). The "vesicle in a basket". A morphological study of the coated
vesicle isolated from the nerve endings of the guinea pig brain, with special reference to the
mechanism of membrane movements. J Cell Biol 42, 202-220.
38
Koopmans, M., Wilbrink, B., Conyn, M., Natrop, G., van der Nat, H., Vennema, H., Meijer, A., van
Steenbergen, J., Fouchier, R., Osterhaus, A., et al. (2004). Transmission of H7N7 avian
influenza A virus to human beings during a large outbreak in commercial poultry farms in the
Netherlands. Lancet 363, 587-593.
Krempl, C., Schultze, B., Laude, H., and Herrler, G. (1997). Point mutations in the S protein connect
the sialic acid binding activity with the enteropathogenicity of transmissible gastroenteritis
coronavirus. J Virol 71, 3285-3287.
Krijnse-Locker, J., Ericsson, M., Rottier, P.J., and Griffiths, G. (1994). Characterization of the budding
compartment of mouse hepatitis virus: evidence that transport from the RER to the Golgi
complex requires only one vesicular transport step. J Cell Biol 124, 55-70.
Lee, M.C., Miller, E.A., Goldberg, J., Orci, L., and Schekman, R. (2004). Bi-directional protein transport
between the ER and Golgi. Annu Rev Cell Dev Biol 20, 87-123.
Letourneur, F., Gaynor, E.C., Hennecke, S., Demolliere, C., Duden, R., Emr, S.D., Riezman, H., and
Cosson, P. (1994). Coatomer is essential for retrieval of dilysine-tagged proteins to the
endoplasmic reticulum. Cell 79, 1199-1207.
Li, W., Moore, M.J., Vasilieva, N., Sui, J., Wong, S.K., Berne, M.A., Somasundaran, M., Sullivan, J.L.,
Luzuriaga, K., Greenough, T.C., et al. (2003). Angiotensin-converting enzyme 2 is a functional
receptor for the SARS coronavirus. Nature 426, 450-454.
Li, W., Shi, Z., Yu, M., Ren, W., Smith, C., Epstein, J.H., Wang, H., Crameri, G., Hu, Z., Zhang, H., et al.
(2005a). Bats are natural reservoirs of SARS-like coronaviruses. Science 310, 676-679.
Li, W., Zhang, C., Sui, J., Kuhn, J.H., Moore, M.J., Luo, S., Wong, S.K., Huang, I.C., Xu, K., Vasilieva, N.,
et al. (2005b). Receptor and viral determinants of SARS-coronavirus adaptation to human
ACE2. EMBO J 24, 1634-1643.
Liao, Z., Cimakasky, L.M., Hampton, R., Nguyen, D.H., and Hildreth, J.E. (2001). Lipid rafts and HIV
pathogenesis: host membrane cholesterol is required for infection by HIV type 1. AIDS Res
Hum Retroviruses 17, 1009-1019.
Liao, Z., Graham, D.R., and Hildreth, J.E. (2003). Lipid rafts and HIV pathogenesis: virion-associated
cholesterol is required for fusion and infection of susceptible cells. AIDS Res Hum
Retroviruses 19, 675-687.
Lin, Y.P., Shaw, M., Gregory, V., Cameron, K., Lim, W., Klimov, A., Subbarao, K., Guan, Y., Krauss, S.,
Shortridge, K., et al. (2000). Avian-to-human transmission of H9N2 subtype influenza A
viruses: relationship between H9N2 and H5N1 human isolates. Proc Natl Acad Sci U S A 97,
9654-9658.
Look, A.T., Ashmun, R.A., Shapiro, L.H., and Peiper, S.C. (1989). Human myeloid plasma membrane
glycoprotein CD13 (gp150) is identical to aminopeptidase N. J Clin Invest 83, 1299-1307.
Mallabiabarrena, A., Jimenez, M.A., Rico, M., and Alarcon, B. (1995). A tyrosine-containing motif
mediates ER retention of CD3-epsilon and adopts a helix-turn structure. EMBO J 14, 22572268.
McBride, C.E., Li, J., and Machamer, C.E. (2007). The cytoplasmic tail of the severe acute respiratory
syndrome coronavirus spike protein contains a novel endoplasmic reticulum retrieval signal
that binds COPI and promotes interaction with membrane protein. J Virol 81, 2418-2428.
McBride, C.E., and Machamer, C.E. (2010). A single tyrosine in the severe acute respiratory syndrome
coronavirus membrane protein cytoplasmic tail is important for efficient interaction with
spike protein. J Virol 84, 1891-1901.
Nishimura, N., and Balch, W.E. (1997). A di-acidic signal required for selective export from the
endoplasmic reticulum. Science 277, 556-558.
39
Nishimura, N., Bannykh, S., Slabough, S., Matteson, J., Altschuler, Y., Hahn, K., and Balch, W.E. (1999).
A di-acidic (DXE) code directs concentration of cargo during export from the endoplasmic
reticulum. J Biol Chem 274, 15937-15946.
Nishimura, N., Plutner, H., Hahn, K., and Balch, W.E. (2002). The delta subunit of AP-3 is required for
efficient transport of VSV-G from the trans-Golgi network to the cell surface. Proc Natl Acad
Sci U S A 99, 6755-6760.
Ohno, H., Stewart, J., Fournier, M.C., Bosshart, H., Rhee, I., Miyatake, S., Saito, T., Gallusser, A.,
Kirchhausen, T., and Bonifacino, J.S. (1995). Interaction of tyrosine-based sorting signals with
clathrin-associated proteins. Science 269, 1872-1875.
Paul, A., Trincone, A., Siewert, S., Herrler, G., and Schwegmann-Wessels, C. (2014). A lysinemethionine exchange in a coronavirus surface protein transforms a retention motif into an
endocytosis signal. Biol Chem 395, 657-665.
Peiris, J.S., Chu, C.M., Cheng, V.C., Chan, K.S., Hung, I.F., Poon, L.L., Law, K.I., Tang, B.S., Hon, T.Y.,
Chan, C.S., et al. (2003). Clinical progression and viral load in a community outbreak of
coronavirus-associated SARS pneumonia: a prospective study. Lancet 361, 1767-1772.
Peiris, J.S., Guan, Y., Markwell, D., Ghose, P., Webster, R.G., and Shortridge, K.F. (2001). Cocirculation
of avian H9N2 and contemporary "human" H3N2 influenza A viruses in pigs in southeastern
China: potential for genetic reassortment? J Virol 75, 9679-9686.
Pelham, H.R. (1999a). The Croonian Lecture 1999. Intracellular membrane traffic: getting proteins
sorted. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 354, 1471-1478.
Pelham, H.R. (1999b). SNAREs and the secretory pathway-lessons from yeast. Exp Cell Res 247, 1-8.
Pensaert, M., Callebaut, P., and Vergote, J. (1986). Isolation of a porcine respiratory, non-enteric
coronavirus related to transmissible gastroenteritis. Vet Q 8, 257-261.
Pfefferle, S., Schopf, J., Kogl, M., Friedel, C.C., Muller, M.A., Carbajo-Lozoya, J., Stellberger, T., von
Dall'Armi, E., Herzog, P., Kallies, S., et al. (2011). The SARS-coronavirus-host interactome:
identification of cyclophilins as target for pan-coronavirus inhibitors. PLoS Pathog 7,
e1002331.
Popik, W., Alce, T.M., and Au, W.C. (2002). Human immunodeficiency virus type 1 uses lipid raftcolocalized CD4 and chemokine receptors for productive entry into CD4(+) T cells. J Virol 76,
4709-4722.
Pralle, A., Keller, P., Florin, E.L., Simons, K., and Horber, J.K. (2000). Sphingolipid-cholesterol rafts
diffuse as small entities in the plasma membrane of mammalian cells. J Cell Biol 148, 9971008.
Punyadarsaniya, D., Liang, C.H., Winter, C., Petersen, H., Rautenschlein, S., Hennig-Pauka, I.,
Schwegmann-Wessels, C., Wu, C.Y., Wong, C.H., and Herrler, G. (2011). Infection of
differentiated porcine airway epithelial cells by influenza virus: differential susceptibility to
infection by porcine and avian viruses. PLoS One 6, e28429.
Qu, X.X., Hao, P., Song, X.J., Jiang, S.M., Liu, Y.X., Wang, P.G., Rao, X., Song, H.D., Wang, S.Y., Zuo, Y.,
et al. (2005). Identification of two critical amino acid residues of the severe acute respiratory
syndrome coronavirus spike protein for its variation in zoonotic tropism transition via a
double substitution strategy. J Biol Chem 280, 29588-29595.
Rajendran, L., Masilamani, M., Solomon, S., Tikkanen, R., Stuermer, C.A., Plattner, H., and Illges, H.
(2003). Asymmetric localization of flotillins/reggies in preassembled platforms confers
inherent polarity to hematopoietic cells. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 8241-8246.
Ren, X., Glende, J., Al-Falah, M., de Vries, V., Schwegmann-Wessels, C., Qu, X., Tan, L., Tschernig, T.,
Deng, H., Naim, H.Y., et al. (2006). Analysis of ACE2 in polarized epithelial cells: surface
40
expression and function as receptor for severe acute respiratory syndrome-associated
coronavirus. J Gen Virol 87, 1691-1695.
Ren, X., Glende, J., Yin, J., Schwegmann-Wessels, C., and Herrler, G. (2008). Importance of cholesterol
for infection of cells by transmissible gastroenteritis virus. Virus Res 137, 220-224.
Ren, X., Yin, J., Li, G., and Herrler, G. (2011). Cholesterol dependence of pseudorabies herpesvirus
entry. Curr Microbiol 62, 261-266.
Rothman, J.E. (1996). The protein machinery of vesicle budding and fusion. Protein Sci 5, 185-194.
Rothman, J.E., and Wieland, F.T. (1996). Protein sorting by transport vesicles. Science 272, 227-234.
Sacco, R.E., McGill, J.L., Pillatzki, A.E., Palmer, M.V., and Ackermann, M.R. (2013). Respiratory
Syncytial Virus Infection in Cattle. Vet Pathol.
Salisbury, J.L., Condeelis, J.S., and Satir, P. (1983). Receptor-mediated endocytosis: machinery and
regulation of the clathrin-coated vesicle pathway. Int Rev Exp Pathol 24, 1-62.
Scheiffele, P., Roth, M.G., and Simons, K. (1997). Interaction of influenza virus haemagglutinin with
sphingolipid-cholesterol membrane domains via its transmembrane domain. EMBO J 16,
5501-5508.
Schultze, B., Cavanagh, D., and Herrler, G. (1992). Neuraminidase treatment of avian infectious
bronchitis coronavirus reveals a hemagglutinating activity that is dependent on sialic acidcontaining receptors on erythrocytes. Virology 189, 792-794.
Schultze, B., Gross, H.J., Brossmer, R., and Herrler, G. (1991a). The S protein of bovine coronavirus is
a hemagglutinin recognizing 9-O-acetylated sialic acid as a receptor determinant. J Virol 65,
6232-6237.
Schultze, B., and Herrler, G. (1992). Bovine coronavirus uses N-acetyl-9-O-acetylneuraminic acid as a
receptor determinant to initiate the infection of cultured cells. J Gen Virol 73 ( Pt 4), 901-906.
Schultze, B., Krempl, C., Ballesteros, M.L., Shaw, L., Schauer, R., Enjuanes, L., and Herrler, G. (1996).
Transmissible gastroenteritis coronavirus, but not the related porcine respiratory
coronavirus, has a sialic acid (N-glycolylneuraminic acid) binding activity. J Virol 70, 56345637.
Schultze, B., Wahn, K., Klenk, H.D., and Herrler, G. (1991b). Isolated HE-protein from
hemagglutinating encephalomyelitis virus and bovine coronavirus has receptor-destroying
and receptor-binding activity. Virology 180, 221-228.
Schwegmann-Wessels, C., Al-Falah, M., Escors, D., Wang, Z., Zimmer, G., Deng, H., Enjuanes, L., Naim,
H.Y., and Herrler, G. (2004). A novel sorting signal for intracellular localization is present in
the S protein of a porcine coronavirus but absent from severe acute respiratory syndromeassociated coronavirus. J Biol Chem 279, 43661-43666.
Schwegmann-Wessels, C., Bauer, S., Winter, C., Enjuanes, L., Laude, H., and Herrler, G. (2011). The
sialic acid binding activity of the S protein facilitates infection by porcine transmissible
gastroenteritis coronavirus. Virol J 8, 435.
Schwegmann-Wessels, C., Glende, J., Ren, X., Qu, X., Deng, H., Enjuanes, L., and Herrler, G. (2009).
Comparison of vesicular stomatitis virus pseudotyped with the S proteins from a porcine and
a human coronavirus. J Gen Virol 90, 1724-1729.
Schwegmann-Wessels, C., and Herrler, G. (2006). Sialic acids as receptor determinants for
coronaviruses. Glycoconj J 23, 51-58.
Schwegmann-Wessels, C., Zimmer, G., Laude, H., Enjuanes, L., and Herrler, G. (2002). Binding of
transmissible gastroenteritis coronavirus to cell surface sialoglycoproteins. J Virol 76, 60376043.
41
Schwegmann-Wessels, C., Zimmer, G., Schroder, B., Breves, G., and Herrler, G. (2003). Binding of
transmissible gastroenteritis coronavirus to brush border membrane sialoglycoproteins. J
Virol 77, 11846-11848.
Sevier, C.S., Weisz, O.A., Davis, M., and Machamer, C.E. (2000). Efficient export of the vesicular
stomatitis virus G protein from the endoplasmic reticulum requires a signal in the
cytoplasmic tail that includes both tyrosine-based and di-acidic motifs. Mol Biol Cell 11, 1322.
Sieben, C., Mikosch, M., Brandizzi, F., and Homann, U. (2008). Interaction of the K(+)-channel KAT1
with the coat protein complex II coat component Sec24 depends on a di-acidic endoplasmic
reticulum export motif. Plant J 56, 997-1006.
Simons, K., and Ikonen, E. (1997). Functional rafts in cell membranes. Nature 387, 569-572.
Simons, K., and Toomre, D. (2000). Lipid rafts and signal transduction. Nat Rev Mol Cell Biol 1, 31-39.
Singer, S.J., and Nicolson, G.L. (1972). The fluid mosaic model of the structure of cell membranes.
Science 175, 720-731.
Song, H.C., Seo, M.Y., Stadler, K., Yoo, B.J., Choo, Q.L., Coates, S.R., Uematsu, Y., Harada, T., Greer,
C.E., Polo, J.M., et al. (2004). Synthesis and characterization of a native, oligomeric form of
recombinant severe acute respiratory syndrome coronavirus spike glycoprotein. J Virol 78,
10328-10335.
Stern, D.F., and Sefton, B.M. (1982). Coronavirus proteins: biogenesis of avian infectious bronchitis
virus virion proteins. J Virol 44, 794-803.
Stertz, S., Reichelt, M., Spiegel, M., Kuri, T., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Weber, F., and
Kochs, G. (2007). The intracellular sites of early replication and budding of SARS-coronavirus.
Virology 361, 304-315.
Stott, E.J., and Taylor, G. (1985). Respiratory syncytial virus. Brief review. Arch Virol 84, 1-52.
Sun, X., and Whittaker, G.R. (2003). Role for influenza virus envelope cholesterol in virus entry and
infection. J Virol 77, 12543-12551.
Takeda, M., Leser, G.P., Russell, C.J., and Lamb, R.A. (2003). Influenza virus hemagglutinin
concentrates in lipid raft microdomains for efficient viral fusion. Proc Natl Acad Sci U S A 100,
14610-14617.
Teasdale, R.D., and Jackson, M.R. (1996). Signal-mediated sorting of membrane proteins between the
endoplasmic reticulum and the golgi apparatus. Annu Rev Cell Dev Biol 12, 27-54.
The Who Mers-Cov Research, G. (2013). State of Knowledge and Data Gaps of Middle East
Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) in Humans. PLoS Curr 5.
Thomas, D.C., and Roth, M.G. (1994). The basolateral targeting signal in the cytoplasmic domain of
glycoprotein G from vesicular stomatitis virus resembles a variety of intracellular targeting
motifs related by primary sequence but having diverse targeting activities. J Biol Chem 269,
15732-15739.
Thonur, L., Maley, M., Gilray, J., Crook, T., Laming, E., Turnbull, D., Nath, M., and Willoughby, K.
(2012). One-step multiplex real time RT-PCR for the detection of bovine respiratory syncytial
virus, bovine herpesvirus 1 and bovine parainfluenza virus 3. BMC Vet Res 8, 37.
Thorp, E.B., and Gallagher, T.M. (2004). Requirements for CEACAMs and cholesterol during murine
coronavirus cell entry. J Virol 78, 2682-2692.
Valarcher, J.F., and Taylor, G. (2007). Bovine respiratory syncytial virus infection. Vet Res 38, 153-180.
Varki, A. (2001). N-glycolylneuraminic acid deficiency in humans. Biochimie 83, 615-622.
42
Wang, P., Chen, J., Zheng, A., Nie, Y., Shi, X., Wang, W., Wang, G., Luo, M., Liu, H., Tan, L., et al.
(2004). Expression cloning of functional receptor used by SARS coronavirus. Biochem Biophys
Res Commun 315, 439-444.
Winter, C., Schwegmann-Wessels, C., Cavanagh, D., Neumann, U., and Herrler, G. (2006). Sialic acid is
a receptor determinant for infection of cells by avian Infectious bronchitis virus. J Gen Virol
87, 1209-1216.
Winter, C., Schwegmann-Wessels, C., Neumann, U., and Herrler, G. (2008). The spike protein of
infectious bronchitis virus is retained intracellularly by a tyrosine motif. J Virol 82, 2765-2771.
Yin, J., Glende, J., Schwegmann-Wessels, C., Enjuanes, L., Herrler, G., and Ren, X. (2010). Cholesterol
is important for a post-adsorption step in the entry process of transmissible gastroenteritis
virus. Antiviral Res 88, 311-316.
43
Erklärung über den eigenen Anteil an den Publikationen
Schwegmann-Wessels, C. and G. Herrler. 2006. Transmissible gastroenteritis virus infection: a vanishing specter. Dtsch. Tierärztl. Wochenschr. 113:157-159. (Review)
Konzept:
Schwegmann-Weßels, Herrler
Diskussion, Beratung:
Schwegmann-Weßels, Herrler
Manuskript:
Schwegmann-Weßels, Herrler
Schwegmann-Wessels, C. and G. Herrler. 2006. Sialic acids as receptor determinants for
coronaviruses. Minireview. Glycoconj. J. 23:51-58. (Review)
Konzept:
Schwegmann-Weßels, Herrler
Diskussion, Beratung:
Schwegmann-Weßels, Herrler
Manuskript:
Schwegmann-Weßels, Herrler
Goris, K., S. Uhlenbruck, C. Schwegmann-Weßels, W. Köhl, F. Niedorf, M. Stern, M. Hewicker-Trautwein, R. Bals, G. Taylor, A. Braun, G. Bicker, M. Kietzmann, and G. Herrler. 2009.
Differential sensitivity of differentiated epithelial cells to respiratory viruses reveals different viral strategies of host infection. J. Virol. 83:1962-1968.
Konzept, Versuchsplanung:
Herrler, Schwegmann-Weßels
Experimentelle Durchführung, Auswertung:
Goris, Uhlenbruck, Schwegmann-Weßels,
Köhl
Diskussion, Beratung:
Schwegmann-Weßels, Herrler, HewickerTrautwein, Braun, Niedorf, Bals, Taylor,
Stern, Bicker, Kietzmann
Manuskript:
Herrler, Goris, Schwegmann-Weßels
Punyadarsaniya, D., C.H. Liang, C. Winter, H. Petersen, S. Rautenschlein, I. Hennig-Pauka,
C. Schwegmann-Wessels, C.Y. Wu, C.H. Wong, and G. Herrler. 2011. Infection of differentiated porcine airway epithelial cells by influenza virus: differential susceptibility to infection by porcine and avian viruses. PLoS One. 6(12):e28429.
Konzept, Versuchsplanung:
Herrler, Schwegmann-Weßels, Punyadarsaniya
Experimentelle Durchführung, Auswertung:
Punyadarsaniya, Liang, Winter, Schwegmann-Weßels, Petersen
44
Diskussion, Beratung:
Herrler, Winter, Schwegmann-Weßels,
Hennig-Pauka, Rautenschlein, Wu, Wong
Manuskript:
Herrler, Punyadarsaniya, SchwegmannWeßels, Winter, Liang
Hanika, A., B. Larisch, E. Steinmann, C. Schwegmann-Wessels, G. Herrler, and G. Zimmer.
2005. Use of influenza C virus glycoprotein HEF for generation of vesicular stomatitis virus
pseudotypes. J. Gen. Virol. 86:1455-1465.
Konzept, Versuchsplanung:
Zimmer
Experimentelle Durchführung, Auswertung:
Hanika, Larisch, Steinmann, SchwegmannWeßels, Zimmer
Diskussion, Beratung:
Zimmer, Herrler, Schwegmann-Weßels
Manuskript:
Zimmer
Schwegmann-Weßels, C., J. Glende, X. Ren, X. Qu, H. Deng, L. Enjuanes, and G. Herrler.
2009. Comparison of vesicular stomatitis virus pseudotyped with the S proteins from a
porcine and a human coronavirus. J. Gen. Virol. 90:1724-1729.
Konzept, Versuchsplanung:
Schwegmann-Weßels, Herrler
Experimentelle Durchführung, Auswertung:
Glende, Schwegmann-Weßels, Ren, Qu
Diskussion, Beratung:
Schwegmann-Weßels, Herrler, Deng, Enjuanes
Manuskript:
Schwegmann-Weßels
Winter, C., C. Schwegmann-Wessels, D. Cavanagh, U. Neumann, and G. Herrler. 2006. Sialic
acid is a receptor determinant for infection of cells by avian Infectious bronchitis virus. J.
Gen. Virol. 87:1209-1216.
Konzept, Versuchsplanung:
Herrler, Schwegmann-Weßels, Winter
Experimentelle Durchführung, Auswertung:
Winter
Diskussion, Beratung:
Herrler, Schwegmann-Weßels, Neumann,
Cavanagh
Manuskript:
Herrler, Winter, Schwegmann-Weßels
Schwegmann-Wessels, C., S. Bauer, C. Winter, L. Enjuanes, H. Laude, and G. Herrler. 2011.
The sialic acid binding activity of the S protein facilitates infection by porcine transmissible
gastroenteritis coronavirus. Virol J. Sep 12; 8(1):435.
45
Konzept, Versuchsplanung:
Schwegmann-Weßels, Herrler
Experimentelle Durchführung, Auswertung:
Bauer, Schwegmann-Weßels
Diskussion, Beratung:
Schwegmann-Weßels, Herrler, Winter,
Enjuanes, Laude
Manuskript:
Schwegmann-Weßels
Ren, X., J. Glende, J. Yin, C. Schwegmann-Weßels, and G. Herrler. 2008. Importance of cholesterol for infection of cells by transmissible gastroenteritis virus. Virus Res. 137(2):220224.
Konzept, Versuchsplanung:
Ren, Herrler,
Weßels
Glende,
Schwegmann-
Experimentelle Durchführung, Auswertung:
Ren, Yin
Diskussion, Beratung:
Glende, Herrler, Schwegmann-Weßels
Manuskript:
Herrler, Ren
Yin, J., J. Glende, C. Schwegmann-Wessels, L. Enjuanes, G. Herrler, and X. Ren. 2010. Cholesterol is important for a post-adsorption step in the entry process of transmissible gastroenteritis virus. Antiviral Res. 88(3):311-6.
Konzept, Versuchsplanung:
Ren, Herrler, Schwegmann-Weßels
Experimentelle Durchführung, Auswertung:
Yin, Ren
Diskussion, Beratung:
Ren, Herrler, Schwegmann-Weßels, Glende, Enjuanes
Manuskript:
Ren, Herrler
Ren, X., J. Glende, M. Al Falah, V. de Vries, C. Schwegmann-Wessels, X. Qu, L. Tan, T.
Tschernig, H. Deng, H. Y. Naim, and G. Herrler. 2006. Analysis of ACE2 in polarized epithelial cells: surface expression and function as receptor for severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus. J. Gen. Virol. 87:1691-1695.
Konzept, Versuchsplanung:
Herrler, Schwegmann-Weßels, Tschernig
Experimentelle Durchführung, Auswertung:
Ren, Glende, Schwegmann-Weßels, Al
Falah, de Vries
Diskussion, Beratung:
Herrler, Schwegmann-Weßels, Tschernig,
Naim, Deng, Glende
Manuskript:
Herrler, Tschernig
46
Glende, J., C. Schwegmann-Weßels, M. Al-Falah, S. Pfefferle, X. Qu, H. Deng, C. Drosten, H.
Y. Naim, and G. Herrler. 2008. Importance of cholesterol-rich membrane microdomains in
the interaction of the S protein of SARS coronavirus with the cellular receptor angiotensinconverting enzyme 2. Virology. 381(2):215-221.
Konzept, Versuchsplanung:
Herrler, Glende, Schwegmann-Weßels
Experimentelle Durchführung, Auswertung:
Glende, Pfefferle
Diskussion, Beratung:
Schwegmann-Weßels, Herrler, Al-Falah,
Naim, Drosten
Manuskript:
Herrler, Glende
Schwegmann-Wessels, C., M. Al Falah, D. Escors, Z. Wang, G. Zimmer, H. Deng, L. Enjuanes,
H. Y. Naim, and G. Herrler. 2004. A novel sorting signal for intracellular localization is present in the S protein of a porcine coronavirus but absent from severe acute respiratory
syndrome-associated coronavirus. J. Biol. Chem. 279:43661-43666.
Konzept, Versuchsplanung:
Schwegmann-Weßels, Herrler
Experimentelle Durchführung, Auswertung:
Schwegmann-Weßels
Diskussion, Beratung:
Schwegmann-Weßels, Herrler, Al Falah,
Escors, Zimmer, Enjuanes, Naim
Manuskript:
Schwegmann-Weßels, Herrler
Winter, C., C. Schwegmann-Wessels, U. Neumann, and G. Herrler. 2008. The Spike Protein
of Infectious Bronchitis Virus Is Retained Intracellularly by a Tyrosine Motif. J. Virol.
82:2765-2771.
Konzept, Versuchsplanung:
Herrler, Schwegmann-Weßels, Winter
Experimentelle Durchführung, Auswertung:
Winter
Diskussion, Beratung:
Schwegmann-Weßels, Herrler
Manuskript:
Herrler, Winter, Schwegmann-Weßels
Paul, A., A. Trincone, S. Siewert, G. Herrler, and C. Schwegmann-Weßels. 2014. A lysinemethionine exchange in a coronavirus surface protein transforms a retention motif into an
endocytosis signal. Biol Chem. 395(6):657-665.
Konzept, Versuchsplanung:
Schwegmann-Weßels
Experimentelle Durchführung, Auswertung:
Paul, Trincone, Siewert, SchwegmannWeßels
47
Diskussion, Beratung:
Schwegmann-Weßels, Herrler
Manuskript:
Schwegmann-Weßels
Pfefferle, S., J. Schöpf, M. Kögl, C.C. Friedel, M.A. Müller, J. Carbajo-Lozoya, T. Stellberger,
E. von Dall'armi, P. Herzog, S. Kallies, D. Niemeyer, V. Ditt, T. Kuri, R. Züst, K. Pumpor, R.
Hilgenfeld, F. Schwarz, R. Zimmer, I. Steffen, F. Weber, V. Thiel, G. Herrler, H.J. Thiel, C.
Schwegmann-Weßels, S. Pöhlmann, J. Haas, C. Drosten, and A. von Brunn. 2011. The SARSCoronavirus-Host Interactome: Identification of Cyclophilins as Target for Pan-Coronavirus
Inhibitors. PLoS Pathog. Oct 7(10):e1002331.
Konzept, Versuchsplanung:
von Brunn, Teilkonzept IBV/TGEV Versuche: Schwegmann-Weßels, etc.
Experimentelle Durchführung, Auswertung:
Pefferle, Schöpf, Kögl, Friedel, Müller,
Carbajo-Lozoya,
Schwegmann-Weßels
(IBV/TGEV), etc.
Diskussion, Beratung:
von Brunn, Drosten, Weber, Schwegmann-Weßels (IBV/TGEV), Thiel, etc.
Manuskript:
von Brunn, Drosten, IBV/TGEV Versuche:
Schwegmann-Weßels, etc.
48
Danksagung
Ich danke Herrn Prof. Dr. Georg Herrler für die uneingeschränkte Unterstützung meiner Arbeit. Sein Rat und seine Diskussionsbereitschaft sind und waren mir immer wertvolle Hilfe.
An meiner Arbeit waren viele Kollegen und Mitarbeiter beteiligt, denen ich allen sehr herzlich danken möchte. Mein besonderer Dank gilt:
Prof. Dr. Luis Enjuanes, Spanien
Dr. Jörg Glende, Hannover
Dr. Katherina Goris, Hannover
Prof. Dr. Hassan Naim, Hannover
Dr. André Paul, Hannover
Dr. Darsaniya Punyadarsaniya, Thailand
Prof. Dr. Xiaofeng Ren, China
PD Dr. Albrecht von Brunn, München
Christine Winter, PhD, Hannover
PD Dr. Gert Zimmer, Schweiz
Mein besonderer Dank gilt auch Sandra Bauer, die mich als technische Assistentin unterstützt und zum Gelingen vieler Experimente beiträgt.
Der Deutschen Forschungsgemeinschaft möchte ich für die Aufnahme in das Emmy NoetherProgramm und die Förderung meiner Emmy Noether-Nachwuchsgruppe danken.
Besonders bedanken möchte ich mich auch bei meiner Familie für ihre Hilfe und Unterstützung.
49