Wien_Kehle_November2011 [Kompatibilitätsmodus]
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Real time RT-PCR Verfahren zur Detektion, Quantifizierung und Genotypisierung von Hepatitis-C-Virus Seminar „Molekulare Diagnostik 2011“ 30. November 2011, Wien AnDiaTec Kernkompetenz Entwicklung und Produktion von breit-reaktiven, sensitiven und gleichzeitig robusten Nachweisverfahren für schwierig zu detektierende RNA-Viren Genomdiversität von RNA-Viren Punktmutationen generiert während Replikation des RNA-Genoms RNA-Polymerasen ohne Proofreading-Aktivität Unterscheidung im Genom der „Nachkommenviren“ im Vergleich zum „Elternvirus“ nach 1 Replikationszyklus um 1-30 Nukleotide Unterschiede zw. verschiedenen RNA-Virusfamilien je nach Replikationssystem und Genomstrukturierung Genetische Rekombination/ Gen. Re-Assortment Bei Infektion einer Wirtszelle durch zwei nahe verwandte Viren Auch Rekombination zwischen viraler und zellulärer Nukleinsäure Hervorragende Adaptation an den Wirt „Breite“ Detektion dieser Viren sehr schwierig Genomdiversität von RNA-Viren Porcines Reproduktives und Respiratorisches Syndrom Virus (PRRSV) Humanes Enterovirus 71 (EV71) Evolutionsrate: ~ 3.1 x 10-3 Austausche pro Nukleotid und Jahr Flaviviren (z.B. Classical Swine Fever Virus (CSFV)) Evolutionsrate: 4.0 x 10-3 Austausche pro Nukleotid und Jahr Caliciviren (u.a. best. Noroviren) Evolutionsrate: 4.5 x 10-3 Austausche pro Nukleotid und Jahr Humanes Immundefizienz-Virus I (HIV I) Evolutionsrate: 7.3 x 10-2 Austausche pro Nukleotid und Jahr Evolutionsrate: 2.0 x 10-3 Austausche pro Nukleotid und Jahr Hepatitis C Virus (HCV) Evolutionsrate: 1.1 x 10-3 Austausche pro Nukleotid und Jahr Sequenzanalyse Hepatitis-C-Virus Lösungsansätze AnDiaTec Primer ACGTAAGGCGATTGACTTAGCCGATGGCTAGCTAAGCCTAGCAT Primer mit „Spacer“ Affinität des Spacers zum DNA-backbone Hohe Sensitivität des Primers Keine unspezifische Bindung Lösungsansätze AnDiaTec Primer ACGTAAGGCGATTGACTTAGCCGATGGCTAGCTAAGCCTAGCAT Sehr kurzer Primer (11 – 16 Nukleotide) Erhöhung der Bindungsaffinität des Primers durch Modifikationen am 5´- und 3´-Ende Keine unspezifische Bindung Gute Sensitivität Lösungsansätze AnDiaTec Primer 1 Primer 2 Probe ACGTAAGGCGATTGACTT GCCGATGGCTAGCTAAGCCTAGCAT ACGTAAGGCGATTGACTT GCCGATGGCTAGCT AGCCTAGCAT Multiplex-System zur Detektion der unterschiedlichen Stämme Gezielte Auswahl von Primern, die parallel an das Template binden können keine Interferenz zwischen Primern/ Sonden Screening-Methode zur Identifizierung geeigneter Primer/ Sonden Hohe Sensitivität Breite Reaktivität und langzeitig „stabileres“ Verfahrens Zielsetzung HCV-Diagnostik Breit reaktives Screening-Verfahren Quantifizierender Nachweis von HCV Genotypisierendes Assay Screening-Verfahren/ Quantifizierung Relevanz Breit reaktives Verfahren für eine sichere Detektion aller Feldstämme Quantifizierung für Kontrolle des Therapie-Verlaufs Problematik Perfekte Abstimmung von Primern und Sonden Mögliche Beeinträchtigung der PCR-Effizienz (charakterisiert über die lineare Regressionslinie) Abbruch der Linearität nach einem bestimmten Zyklus der PCR Linearität nur in engem Amplifikationsbereich Quantifizierung wäre dadurch nur bedingt möglich Screening-Verfahren/ Quantifizierung Ergebnisse 40 Wettbewerber Kit 2 38 R = 0.9997 36 POS 461 2 NEG 3* AnDiaTec Kit R = 0.999 34 A ve rage C t V alu e POS 32 30 28 26 NEG 0 178 24 Stratagene Av Ct 7500 Fast Dx Av Ct 22 20 0 * 3 Proben als richtig-positiv identifiziert 1 2 3 Dilution 4 5 6 Genotypisierung Relevanz V.a. Unterscheidung zwischen Genotyp 1 (a/b) vs. Genotypen 2 - 6 Information relevant zur Therapie-Entscheidung (Dosierung PEGIFNα + Ribavirin – Therapie-Dauer) und Aussicht auf Erfolg Problematik Keine eindeutigen Genotyp-spezifischen Basenaustausche Auch hier muss mit mehr als einem Primer-/Sondenpaar gearbeitet werden Mögliche Kreuz-Reaktivitäten und dadurch falsche Differenzierungsergebnisse Falsche Therapie-Entscheidung Probleme mit Ringversuchszertifikaten und Akkreditierung des Labors für HCV-Diagnostik AnDiaTec Testformate Screening-Verfahren – CE-Markierung erteilt Quantifizierende Kitversion – CE-Markierung kurz vor Abschluss Differenzierendes Assay - Evaluierungsphase Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!
