Aus dem Institut für Parasitologie der Tierärztlichen Hochschule
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Aus dem Institut für Parasitologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover Studien zur Vitalitätsabschätzung von Cryptosporidium parvum INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Ellen Eckert aus Wittingen Hannover 2001 Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. A. Daugschies 1. Gutachter : Univ.-Prof. Dr. A. Daugschies 2. Gutachter : Univ.-Prof. Dr. J. Pohlenz Tag der mündlichen Prüfung : 1.06.2001 Meinen Eltern Was wir wissen ist ein Tropfen, was wir nicht wissen ist ein Ozean. Sir Isaac Newton INHALTSVERZEICHNIS 1. 2. 2.1 EINLEITUNG Seite 13 LITERATURÜBERSICHT 14 Cryptosporidium parvum 14 2.1.1 Taxonomie 14 2.1.2 Biologie und Morphologie 17 2.1.2.1 Der Entwicklungszyklus 17 2.1.2.2 Wirtsspektrum 18 2.1.3 Epidemiologie 19 2.1.4 Kryptosporidiose als Zoonose 22 2.1.5 Pathogenese und Pathologie 24 2.1.6 Bekämpfung 26 2.1.6.1 Rehydratation 26 2.1.6.2 Therapie 27 2.1.6.2.1 Halofuginon 27 2.1.6.2.2 Weitere Medikamente 28 2.1.6.3 Antivirale Therapie 29 2.1.6.4 Immunisierung durch Kolostrum und die Wirkung darmaktiver Substanzen 30 2.1.6.5 Prophylaxe 31 2.1.6.6 Desinfektion 31 2.1.6.6.1 Desinfektionsarten 32 2.1.6.6.2 Chemische Desinfektion 33 2.1.6.6.3 35 Desinfektionsmittelprüfung 2.1.7 Diagnostik 2.1.7.1 Nachweis von C.-parvum-Oozysten in Kotproben 35 35 2.1.7.2 Direkter C.-parvum-Nachweis 36 2.1.7.3 Indirekter C.-parvum-Nachweis 37 2.1.8 C. parvum in der Zellkultur 42 2.1.8.1 Vorbehandlung der Oozysten 42 2.1.8.2 Kultivierung in verschiedenen Zelllinien 42 2.1.8.3 C. parvum in der HCT-8-Zellkultur 45 2.1.9 2.1.8.3.1 C.-parvum-Vitalitätsnachweis in vitro 45 2.1.8.3.2 47 Inhibition von C. parvum in vitro C. parvum im Tiermodell 48 3. EIGENE UNTERSUCHUNGEN 52 3.1 Material und Methoden 52 3.1.1 C.-parvum-Gewinnung 52 3.1.1.1 Parasitenmaterial 52 3.1.1.2 Passagierung im Kalb 53 3.1.1.3 Anreicherung der C.-parvum-Oozysten 56 3.1.1.4 Reinigung der C.-parvum-Oozysten 57 3.1.1.5 Mikroskopischer Nachweis von C.-parvum-Oozysten 61 3.1.2 Desinfektion der C.-parvum-Oozysten 63 3.1.3 C. parvum in der Zellkultur 64 3.1.3.1 Anlage einer HCT-8-Zellkultur 64 3.1.3.2 Lagerung der HCT-8-Zellkultur 67 3.1.3.3 Vitalitätsprüfung der HCT-8-Zellkultur 68 3.1.3.4 Infektion der HCT-8-Zellkultur mit C. parvum 69 3.1.3.5 Inhibition von C. parvum in vitro mit Paromomycin 70 3.1.3.6 Ernte der Zellkultur zur mikroskopischen Untersuchung 71 3.1.4 PCR von C. parvum 72 3.1.4.1 Ernte der Zellkultur für die PCR 72 3.1.4.2 Extraktion genomischer C.-parvum-DNA 72 3.1.4.2.1 Ethanolfällung 72 3.1.4.2.2 Extraktion mit Phenol und Chloroform 73 3.1.4.3 Auswahl der Primer 74 3.1.4.4 Herstellung der Mastermixe für die PCR 75 3.1.4.5 Ansetzen der Reaktion 77 3.1.4.6 Nachweis der PCR-Produkte im Agarosegel 78 3.1.4.6.1 Ladung der Elektrophoresekammer 78 3.1.4.6.2 80 Färbung des Gels 3.1.4.6.3 Ablichten des Gels 81 3.1.5 C.-parvum-Nachweis mit monoklonalen fluoreszierenden Antikörpern 81 3.1.6 C. parvum-Infektion von BALB/c-Mäusen 83 3.1.6.1 Haltung der BALB/c-Mäuse 83 3.1.6.2 Infektion der Mäuse mit unbehandelten und behandelten Oozysten 3.1.6.3 Gewinnung von Untersuchungsmaterial 3.1.7 Statistik 83 85 86 4. ERGEBNISSE 87 4.1 C.-parvum-Oozysten-Gewinnung 87 4.1.1 Passagierung im Kalb 87 4.1.2 Anreicherung der C.-parvum-Oozysten 87 4.1.3 Reinigung der C.-parvum-Oozysten 88 4.2 Desinfektion der C.-parvum-Oozysten 88 4.3 Zellkultur 89 4.3.1 MTT-Test 89 4.3.2 Zellkulturmedium 91 4.4 4.3.2.1 DMEM oder RPMI-1640 91 4.3.2.2 Mediumzusätze 92 PCR von C. parvum 92 4.4.1 92 Extraktion genomischer C. parvum-DNA 4.5 Infektion von HCT-8-Zellkulturen mit C.-parvum-Oozysten 4.5.1 Vergleich der Vitalität von C. parvum in 48- und 96-Kalotten-Zellkulturtestplatten 4.5.2 lässigung des Plattentyps 97 4.5.3 Inhibition mit Paromomycin 99 4.5.4 Einfluß der Inkubationsdauer auf die In-vitro-Vitalität von C. parvum 101 4.5.5 Auswirkung der Desinfektion auf die Vitalität von C. parvum- 4.5.6 103 Auswirkung der Desinfektionsdauer auf die Vitalität von C.-parvum-Oozysten 106 Vitalitätsnachweis durch Focuszählung 107 4.6.1 4.6.2 4.7 94 PCR-Ergebnisse C.-parvum-infizierter Zellkulturen bei Vernach- Oozysten in der Zellkultur 4.6 94 Infektion von HCT-8-Zellkulturen mit unterschiedlichen Oozystendosen 107 Focuszählung nach Einsaat desinfizierter Oozysten 109 Infektion von Babymäusen 111 5. DISKUSSION 118 5.1 Gewinnung von C. parvum 118 5.1.1 Passagierung im Kalb 118 5.1.2 Anreicherung von C. parvum 119 5.1.3 Reinigung von C. parvum 119 5.2 Desinfektion der C.-parvum-Oozysten 121 5.3 PCR 122 5.3.1 5.4 Extraktion genomischer DNA 122 Zellkultur 123 5.4.1 HCT-8-Zellkultur 123 5.4.2 MTT-Test 123 5.4.3 Zellkulturmedium 124 5.5 5.4.4 Vitalität von unbehandelten C. parvum-Oozysten 125 5.4.5 Inhibition mit Paromomycin 127 5.4.6 Vitalität desinfizierter Oozysten 129 5.4.6.1 Auswirkung der Neopredisankonzentrationen 129 5.4.6.2 Auswirkung der Inkubationszeiten 131 Vitalitätsnachweis durch Focuszählung 131 5.5.1 Vitalität von unbehandelten C.-parvum-Oozysten 131 5.5.2 Vitalität desinfizierter C.-parvum-Oozysten 133 5.6 Infektion von Babymäusen 134 5.7 Schlußfolgerung 137 6. ZUSAMMENFASSUNG 138 7. SUMMARY 140 8. LITERATURVERZEICHNIS 142 9. ANHANG 170 Abkürzungsverzeichnis Abb. A. dest. bp BSA bzw. °C C. ca. Caco-2 Cl cm cm2 CO2 DAPI DABCO dATP dCTP dGTP DMSO DNA dNTP dTTP DVG EDTA EIA FDM FKS g h HCO3 H2O IgA IgG IgM Kap. KCl kg l M MDBK MDCK min mg Abbildung Aqua destillata Basenpaare bovine serum albumin (Rinderserumalbumin) beziehungsweise Grad Celsius Cryptosporidium circa humane Kolon-Adenomakarzinomzellen Chlor Zentimeter Quadratzentimeter Kohlenstoffdioxid 4´,6-diamidino-2-phenylinole 1,4-Diazabicyclo(2.2.2)octane desoxy-Adenosintriphosphat desoxy-Cytosintriphsphat desoxy-Guanosintriphophat Dimethylsulfoxid Desoxyribonukleinsäure desoxy-Nukleotidtriphosphat desoxy-Thymidintriphosphat Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Äthylendiamintetraessigsäure Enzym-Immun-Assay foci-detection-method fetales Kälberserum Gramm Stunde(n) Hydrogencarbonat Wasser Immunglobulin A Immunglobulin G Immunglobulin M Kapitel Kaliumchlorid Kilogramm Liter molar Mardin-Darby-Rindernierenzellen Mardin-Darby-Hundenierenzellen Minuten Milligramm Mg MgCl2 ml mm mM MPN MTT n Na NaCl NaHCO3 ng NGA µg µl µm OD600 p PBS PCR Pen. pg PI p.i. pmol p.o. RL95-2 ±s s.c. sek spp. Strept. Tab. TBE TPP x xg Magnesium Magnesiumchlorid Milliliter Millimeter millimolar most-probable-number assay Methyl-Thiazolblau Stichprobenumfang Natrium Natriumchlorid Natriumhydrogencarbonat Nanogramm normal goat serum (Ziegenserum) Mikrogramm Mikroliter Mikrometer Optische Dichte 600 nm Statistische Irrtumswahrscheinlichkeit Phosphate buffered saline (phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung) Polymerasekettenreaktion Penicillin Pikogramm Propidium-Jodid post infectionem Pikomol per os endometriale Karzinomzellen Standardabweichung subcutan Sekunde Spezies Streptomycin Tabelle Tris/Borat/EDTA Techno Plastic Products arithmetrischer Mittelwert relative Zentrifugalbeschleunigung 13 1 EINLEITUNG Die Kryptosporidiose ist eine Kokzidiose, die durch parasitäre Protozoen der Gattung Cryptosporidium verursacht wird. Mittlerweile gilt C. parvum beim Menschen als dritthäufigster Diarrhoeerreger weltweit (GRIFFITH 1998). Die im Darm lebenden Protozoen kommen vorwiegend bei Kälbern in den ersten Lebenswochen vor. Bei erwachsenen Tieren verläuft die Infektion in der Regel symptomlos. Die infizierten Kälber erkranken klinisch an starker, wäßriger Diarrhoe und können an den Folgen eines Flüssigkeitsdefizites sterben (FAYER et al. 1997). Bis vor kurzem gab es in Deutschland noch keine spezifischen Therapiemöglichkeiten, um ein an C. parvum erkranktes Kalb zu behandeln. Die symptomatische Therapie beschränkt sich auf eine ausreichende Flüssigkeitszufuhr per os oder Elektrolyt- und Glukoseinfusionen intravenös oder subkutan. Da Kryptosporidien nicht wirtsspezifisch sind, können sie auch andere Tiere und den Menschen befallen. Kryptosporidien nehmen eine bedeutende Rolle als humanpathogene Erreger bei Menschen mit einem schwachen Immunsystem ein (CASEMORE et al. 1997) Zahlreiche Autoren beschäftigen sich mit der Wirkung von Medikamenten und Desinfektion auf Kryptosporidien. Die Testung antikryptospordienwirksamer Mittel direkt am Tier oder im Stall bringt viele Nachteile mit sich. Hierbei handelt es sich um Aspekte des Tierschutzes, des ökonomischen Aufwandes sowie der unzureichenden Standardisierungsmöglichkeiten. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Fähigkeit von Kryptosporidien, vor und nach einer Desinfektion Zellkulturen zu infizieren, getestet. Das Desinfektionsmittel sollte hierbei eine messbare Vitalitätsminderung hervorrufen. Die Vitalität unbehandelter und behandelter Oozysten wurde mittels PCR der infizierten Zellkulturen beurteilt. In weitergehenden Untersuchungen wurden zum Vergleich mikroskopische Nachweisverfahren, monoklonale Antikörper und ein Mausmodell herangezogen. 14 2. LITERATURÜBERSICHT 2.1 Cryptosporidium parvum 2.1.1 Taxonomie Stamm APICOMPLEXA apikaler Komplex mit Polring, Conoid, Mikronemen und Rhoptrien; subpellikuläre Tubuli mit Mikroporen Klasse SPOROZOA geschlechtliche und ungeschlechtliche Vermehrung, Oozystenbildung Unterklasse COCCIDIA Trophozoiten und sexuelle Stadien intrazellulär Ordnung EUCOCCIDIIDA Merogonie in Vertebraten Unterordnung EIMERIIDA Makro- und Mikrogamonten entwickeln sich getrennt Familie CRYPTOSPORIDIIDAE Gattung CRYPTOSPORIDIUM Art CRYPTOSPORIDIUM PARVUM Die Familie der monoxenen Cryptosporidiidae zeichnet sich durch Merogonie, Gamogonie und Sporogonie im Wirt aus. Kryptosporidien sind einwirtig, die Oozyste enthält eine Sporozyste mit vier Sporozoiten. Die Entwicklung erfolgt intrazellulär und extraplasmatisch. TYZZER (1907) beschrieb als erster den Entwicklungszyklus von Kryptosporidien in den Magendrüsen und dem Dünndarm einer Labormaus (TYZZER 1907, 1910, 1912). TYZZER benannte die Spezies im Magen Cryptosporidium muris und die im Dünndarm Cryptosporidium parvum. Es wurden noch weitere acht Kryptosporidienarten benannt. Bei einigen dieser Arten hat sich herausgestellt, daß es sich um Fehlklassifizierungen von 15 Sarcocystis spp. handelte (MORGAN et al. 1999). Die verbliebenen acht Arten, die zur Familie der Cryptosporidiidae gehören, sind in Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1: Derzeit anerkannte Arten der Gattung Cryptosporidium WIRT ART Erstmals beschrieben in AUTOR C. meleagridis Truthühner SALVIN (1955) C. wrairi Meerschweinchen VETTERLING et al. (1971) C. baileyi Hühnervögel CURRENT et al. (1986) C. felis Katze ISEKI (1979) C. nasorum Fisch HOOVER et al. (1981) C. serpentis Reptilien LEVINE (1980) C. muris Maus TYZZER (1910) C. parvum Maus TYZZER (1912) C. parvum ist für 79 Säugetierspezies einschließlich des Menschen infektiös (O´DONOGHUE 1995). Die allgemeine Einteilung in verschiedene Spezies basiert auf der Wirtsspezifität, der Oozystenmorphologie und dem Infektionsort. C. parvum ist am häufigsten unter den Säugetieren verbreitet und C. muris wurde bei chronisch infizierten Tieren gefunden (FAYER et al. 1997). Eine Kryptosporidiose bei einem Kalb mit chronischer Diarrhoe wurde erstmals von PANCIERA et al. (1971) beschrieben. MEUTIN (1974) und MORIN (1976) beschäftigten sich in den Jahren darauf mit der Kryptosporidiose des neonatalen Kalbes. Mit Hilfe der Molekularbiologie und der damit verbundenen neuen Techniken, wie zum Beispiel Westernblot, Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR), Random amplified polymorphic DNA (RAPD), etc. sammelten sich immer mehr Daten an, so daß man heute auch noch weitere Differenzierungen vorgenommen hat. C. parvum läßt sich in 16 verschiedene Subtypen unterteilen, da es Unterschiede in Virulenz, Infektiösität und Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten gibt (MORGAN et al. 1999). Antigene Unterschiede werden im Westernblot von verschiedenen Autoren aufgezeigt, die MORGAN et al. (1999) in ihrer Veröffentlichung zusammengefaßt haben. MORGAN et al. (1999) weisen darauf hin, dass es einen ”Mensch"- und einen ”Rind"- Genotyp von C. parvum gibt, die sich mit Isoenzym-Analyse und RAPD-Analyse unterscheiden lassen. Der Genotyp ”Rind” kann Kälber, Mäuse und auch Menschen infizieren. Der Genotyp ”Mensch” hingegen löst nur eine Infektion beim Menschen aus (PENG 1997, WIDMER 1998). Mit der Methode der Arbitrary Primed-PCR (AP-PCR) konnten FAITH et al. (1998) diese genotypischen Unterschiede der beiden Isolate bestätigen. Im Gegensatz dazu haben TZIPORI und GRIFFITH (1998) die humanen Isolate von C. parvum eingeteilt in diejenigen, die Mäuse, Kälber und Ferkel infizieren können und diejenigen, die im Tiermodell nur bei Ferkeln Durchfall auslösen. Weiterhin wurde diskutiert, ob es spezifische C.-parvum-Genotypen der Maus, des Schweines oder des Beuteltieres gibt. Auch Genotypen, die spezifisch für Hunde und Frettchen sind, könnte es möglicherweise geben (MORGAN et al. 1999). Phenotypische und genotypische Unterschiede wurden eingesetzt, um das "Mensch"- vom "Rind"- Isolat zu unterscheiden. Manche Isolate bevorzugten deutlich einen Wirt, um sich zu reproduzieren (TZIPORI u. GRIFFITH 1998). Bei Untersuchungen an bestimmten DNA-Sequenzen von C.-parvumIsolaten waren die Interspezies-Beziehungen signifikant enger als die IntraspeziesBeziehungen (XIAO et al. 1999 a u. b). XIAO et al. (1999 b) stellten dazu einen Stammbaum mit den verschiedenen Verwandtschaftsgraden der einzelnen Isolate auf. Im Stammbaum von TZIPORI und GRIFFITHS (1998) wird bestätigt, dass verschiedene Kryptosporidienarten zum Teil näher miteinander verwandt waren als verschiedene Subtypen. Damit besteht noch erheblicher Klärungsbedarf, um eine allgemeine Taxonomie der Kryptosporidien aufstellen zu können. 17 2.1.2 Biologie und Morphologie 2.1.2.1 Der Entwicklungszyklus TYZZER (1910, 1912) beschrieb sehr detailliert den Entwicklungszyklus von C. parvum in der Maus. Die zu den Apicomplexa gehörenden Parasiten haben einen Generationswechsel, den man in drei verschiedene Abschnitte unterteilen kann: 1. Sporogonie: eine Reduktionsteilung, die der Gamogonie folgt 2. Schizogonie: eine ungeschlechtliche Vielteilung 3. Gamogonie: die geschlechtliche Generation Die Sporogonie erfolgt schon im Gastrointestinaltrakt des Wirtes, der damit voll infektiöse Oozysten mit dem Kot ausscheidet. Werden die Oozysten von einem empfänglichen Wirt aufgenommen, kommt es durch das Zusammenwirken der Körpertemperatur, der Enzyme des Pankreas und der Gallensalze zur Exzystierung der Sporozoiten. Nach der Exzystierung werden von den 5,5 µm großen Oozysten je vier Sporozoiten freigesetzt. Das Vorderende der Sporozoiten heftet sich vorwiegend im hinteren Teil des Jejunums und Ileums an eine Darmepithelzelle in der luminalen Darmschleimhaut und wird von einer von Mikrovilli des Darmepithels gebildeten parasitophoren Vakuole umgeben. Damit liegen die Entwicklungsstadien von C. parvum intrazellulär und extrazytoplasmatisch. Es bildet sich eine Haftzone und eine Stoffwechsellamelle, die aus der Verschmelzung von Mikrovilli und Parasitenpellikula resultieren (ROMMEL 2000). Die Sporozoiten runden sich ab zu kugelförmigen Trophozoiten. Es erfolgt nun die asexuelle Vermehrung, die Schizogonie, bei der sich die Trophozoiten teilen. C. parvum hat zwei verschiedene Typen von Schizonten, die auch Meronten genannt werden. Der Typ-I-Schizont entwickelt 48 Stunden post infectionem (p.i.) sechs oder acht Kerne, dabei liegt jeder in einem bananenförmigen Tochterindividuum, dem Merozoiten, der strukturell dem Sporozoiten entspricht. Diese Schizogoniestadien treten bis zum 7. Tag p.i. auf. Jeder reife Merozoit kann nach Verlassen des Schizonten eine weitere Epithelzelle infizieren und sich dann zu einem 18 Typ-I-oder Typ-II-Schizonten entwickeln. Der Typ-II-Schizont bildet vier Merozoiten. Diese können sich weiter differenzieren in männliche Mikrogamonten und weibliche Makrogamonten. Die geschlechtlichen Stadien der Gamogonie treten bereits 72 Stunden p.i. auf. Jeder Mikrogamont teilt sich mehrfach, so dass bis zu 16 geißellose Mikrogameten entstehen, die funktionell dem Spermium äquivalent sind. Die Makrogamonten teilen sich nicht weiter und stellen das Eizellenäquivalent dar. Werden die Mikrogameten freigesetzt, kann ein Mikrogamet in einen Makrogamonten eindringen und es kommt zur Fusion von Makro- und Mikronuklei, der Syngamie. Nur befruchtete Makrogamonten können sich in eine Oozyste wandeln, die in situ sporuliert und dann wieder vier Sporozoiten enthält. Die Oozysten gelangen in das Darmlumen und werden mit dem Kot ausgeschieden. Nach einer durchstandenen Infektion bildet sich bei einem immunkompetenten Tier eine ausreichende Resistenz gegenüber C. parvum aus, so dass das Tier nicht noch einmal erkrankt (THEODOS 1998). 2.1.2.2 Wirtsspektrum Kryptosporidien sind bei sehr unterschiedlichen Tierarten zu finden. Wie schon in dem Kapitel zur Taxonomie (Kap. 2.1) erwähnt, sind für eine C.-parvum-Infektion 79 Säugetierspezies, wie zum Beispiel Schweine, Pferde, Frettchen, Katzen, Hunde und Hamster, empfänglich (O´DONOGHUE 1995). Potenziell stellt C. parvum also für fast alle Säugetiere ein Gesundheitsrisiko dar, die Kontakt zu C.-parvum-Oozysten haben. Dies stellt ein erhebliches epidemiologisches Problem dar, da sich C. parvum über ein weites Wirtsspektrum vermehren und ausbreiten kann (O´DONOGHUE 1995). Aus veterinärmedizinischer Sicht ist das Rind der wichtigste Wirt von C. parvum; insbesondere Kälber erkranken in den ersten Lebenswochen. C. parvum kommt auch in der Ziege (MAJEWSKA et al. 2000) oder dem Schaf vor (ANGUS et al. 1981, TZIPORI et al. 1981, NAGY et al. 1984, TZIPORI 1988), aber die Bedeutung des Parasiten bei diesen Wirten ist nicht genau dokumentiert. Serologische Untersuchungen deuten auf eine weite Verbreitung von C. parvum bei Schweinen hin (TZIPORI u. CAMPBELL 1981, QUILEZ et al. 1996). 19 Ferkel haben oft noch zusätzliche enteropathogene Erreger, die ebenfalls Durchfälle verursachen, und meist erkranken die Ferkel an C. parvum nur asymptomatisch (SANFORD 1987). Weiterhin werden Infektionen bei Katzen, Hunden und Pferden beschrieben, die eine potenzielle Quelle für Infektionen des Menschen sein können (TZIPORI und GRIFFITH 1998), doch kryptosporidienbedingte Durchfälle werden bei diesen Tierarten nach TZIPORI (1985) nicht gesehen. Bei diesen drei Spezies stellten TZIPORI und CAMPBELL (1981) allerdings mit serologischen Untersuchungen eine hohe Prävalenz fest. Die Infektion beim Pferd verläuft ebenfalls meist subklinisch (XIAO und HERD 1994). Bei Katzen gibt es nur wenige Dokumentationen über patente Infektionen mit C. parvum (FAYER et al. 1997). Die diversen Genotypen von C. parvum sind nicht beliebig auf verschiedene Wirtsarten übertragbar (siehe Taxonomie, Kap. 2.1.). Derzeit gelten die domestizierten und wildlebenden Wiederkäuer, besonders die neugeborenen Tiere, als die wichtigste Infektionsquelle für Tier und Mensch (CASEMORE et al. 1997). Bei der Übertragung von Mensch auf Mensch sind besonders immunsupressive Menschen und Kinder betroffen (CASEMORE 1990, UNGAR 1990, CURRENT 1994). Ein zusammenfassender Rückblick zeigt, dass die Kryptosporidiose in Kindertagesstätten weit verbreitet ist (CORDELL und ADISS 1994). Ferner kommt es in Krankenhäusern zu C.parvum-Infektionen durch die Übertragung von Patient zu Patient und von Patient zu Personal (KOCH 1985, NAVARRETTE 1991). 2.1.3 Epidemiologie Die meisten veterinär-epidemiologischen Daten liegen für Rinder vor. Klinische Erkrankungen treten vorwiegend bei jungen Tieren auf, und es werden altersbezogene Empfindlichkeiten gegenüber C. parvum beim Kalb von HARP et al. (1990 a u.1990 b) beschrieben. 20 In einer in den USA durchgeführten Studie waren 22 % der 7369 untersuchten Kälber mit Kryptosporidien infiziert und insgesamt 59 % der 1103 untersuchten Bestände von C. parvum betroffen. Hierbei waren fast die Hälfte der 7-12 Tage alten Kälber infiziert (GARBER et al. 1994). LORENZO-LORENZO et al. (1993) konnten eine hohe Prävalenz von C. parvum Antikörpern bei erwachsenen Rindern, die asymptomatisch erkrankt waren, feststellen. Im Rahmen von Untersuchungen des Veterinäruntersuchungsamtes Oldenburg wurden in 44 % von 284 untersuchten Kälber bzw. in 42,5 % der untersuchten Betriebe Kryptosporidien nachgewiesen. In den Winter- und Frühjahrsmonaten erfolgte ein Anstieg der positiven Befunde (FIEDLER 1985). In Dänemark konnten HENRICKSEN und KROGH (1985) nur eine leichte Tendenz zu höheren Infektionsraten im zweiten Quartal des Jahres feststellen und ermittelten die niedrigste Infektionsrate im vierten Quartal des Jahres, was im Gegensatz zu den Untersuchungen des Veterinäramtes Oldenburg steht. In Großbritannien stellt die Kryptosporidiose ein zunehmendes Problem dar. Der ”U.K. Veterinary Investigation Service” stellte 1994 2177 C.-parvum-Infektionen fest, im Jahr 1984 waren es nur 216 Fälle. Dabei konnten nicht alle erkrankten Tiere erfaßt werden, da durch die Unterschätzung der C.-parvum-Infektionen nicht alle Rinder auf C. parvum untersucht wurden, obwohl sie möglicherweise infiziert waren. Unveröffentlichte C.-parvum-Infektionen konnten ebenfalls nicht mit erfaßt werden (CASEMORE et al. 1997). In einer an der Universität Gießen durchgeführten Studie konnten bei 40 % der mit Durchfall eingelieferten Kälber C.-parvum-Oozysten nachgewiesen werden. Der höchste Anteil an Ausscheidern befand sich in der Altersgruppe bis zu 4 Wochen. Bei 45,5 % dieser Kälber konnten keine weiteren enteropathogenen Erreger festgestellt werden. 37 % der Kälber, die keine Durchfallerscheinungen hatten, schieden ebenfalls C. parvum aus (SIEBERT u. GRÜNDER 1991). 21 KRULL (2000) wertete die Ergebnisse der Routinediagnostik von fünf staatlichen Untersuchungsämtern in der Bundesrepublik Deutschland aus und stellte einen durchschnittlichen C.-parvum-Befall von 20 –30 % der untersuchten Kälberkotproben und histologisch untersuchten Därme fest. Bei Kälbern in Schweizer Mutterkuhbetrieben beträgt die durchschnittliche Prävalenz in den ersten drei Lebensmonaten 16,8 %. In Tiefstreulaufställen bestand für C. parvum ein signifikant höheres Infektionsrisiko als in Boxenlaufställen. Dies kann an dem engeren Kontakt zu den Ausscheidungen älterer Tiere liegen. Wenn die Futterration der Mütter zu mehr als 50 % aus Heu bestand, sank das Risiko für eine Ausscheidung von C. parvum (LENTZE et al. 1999). Subklinisch erkrankte Rinder können bis zu 7 Millionen Oozysten täglich ausscheiden (SCOTT et al. 1994). CASEMORE et al. (1997) stellten die Besonderheiten, die die Epidemiologie von C. parvum ausmachen, zusammen. Dazu zählten die geringe Größe der Oozysten von nur 4-6 µm, die Resistenz gegen Umwelteinflüsse und Desinfektionsmittel und die Ausscheidung sporulierter und damit voll infektiöser Oozysten. C. parvum hat ein großes Reservoir an Wirtstieren einschließlich des Menschen. KLESIUS et al. (1986) haben C. parvum aus wilden Mäusen isoliert und konnten sie dann erfolgreich auf das Kalb und LaborMäuse übertragen. Der Erreger kommt ubiquitär vor und es ist nur eine geringe Infektionsdosis von 10 -100 Oozysten notwendig, um eine Erkrankung auszulösen. Die Reproduktionsrate von C. parvum im erkrankten Wirt ist sehr hoch (>1010). Bekämpfungsprobleme liegen in der hohen Resistenz gegenüber Desinfektionsmitteln und unzureichenden spezifischen Therapiemöglichkeiten begründet (CASEMORE et al. 1997). Wegen der Schwere der C.-parvum-Infektionen bei AIDS-Patienten wurden weltweit Daten über Kryptosporidiose in diesem Personenkreis gesammelt. So konnten bei AIDS-Patienten in Mittel- und Südamerika (Brasilien, Kuba, Mexiko und Venezuela), Europa (Frankreich, Dänemark, Italien, etc.) Afrika (Äthiopien) und Asien (Taiwan, Thailand etc.) gehäuft C.parvum-Infektionen als Durchfallerreger gefunden werden (GRIFFITH 1998). Auch wenn C. parvum-Infektionen weltweit vorkommen, ist die globale Verteilung von C.-parvum- 22 Infektionen bei Menschen nicht einheitlich und reicht von einigen Prozent in den entwickelten Ländern der nördlichen Hemisphäre bis hin zu 10 % in wärmeren, weniger entwickelten Ländern (CASEMORE 1990). 2.1.4 Kryptosporidiose als Zoonose Grundsätzlich ist jedes Tier und jeder Mensch einem Risiko ausgesetzt, eine Kryptosporidiose zu bekommen (KEUSCH et al. 1995). Die enge ökologische Beziehung zwischen Mensch und Rind läßt vermuten, dass viele C.-parvum-Infektionen des Menschen Zoonosen sind. Die Infektion von Mensch zu Mensch ist besonders in überfüllten Wohnvierteln verbreitet. Die zur Infektion erforderliche Menge an Oozysten ist sehr gering und aufgrund der Größe des Parasiten ist es sehr schwer, das Trinkwasser durch Filtration kryptosporidienfrei zu bekommen (FRICKER und CRABB 1998, GRIFFITH 1998). Weiterhin ist es schwierig, einen schnellen C. parvum Nachweis zu führen, da die zu untersuchende Fäzesprobe spezielle Färbungen erfordert. Es wird befürchtet, dass die Häufigkeit humaner Kryptosporidiose in Zukunft zunehmen wird (GRIFFITH 1998). PALMER und BIFFIN (1990) untersuchten die klinischen und epidemiologischen Aspekte der Kryptosporidiose bei Kindern in England und Wales und ermittelten, dass C. parvum neben Campylobacter der am häufigsten vorkommende Verursacher von gastrointestinalen Erkrankungen bei ein bis fünf Jahre alten Kindern ist und zweimal häufiger auftritt als Salmonellen. Sehr selten kommt es zu einer Übertragung der C.-parvum-Oozysten von Haustieren wie Hunden und Katzen auf den Menschen (CASEMORE et al. 1997). CASEMORE et al. (1997) listen die prädisponierenden Faktoren für eine Kryptosporidieninfektion wie folgt auf: Immundefizienz: AIDS oder andere Immundepression hervorrufende Krankheiten, Unterernährung Zoonotischer Kontakt: Camping, Rucksacktourismus, Bauernhofbesuch 23 direkter Kontakt mit infizierten Tieren oder Menschen: Tierärzte, Bauern, Krankenschwestern, Mediziner, Laborangestellte, Erzieherinnen Kontakt zu kontaminierten Flächen/Material/Wasser Rohmilch oder nicht pasteurisierte Milch, rohes Fleisch, etc. Menschen können sich über Tiere an C. parvum infizieren. Über Ausbrüche von C. parvum in der Bevölkerung wird seit den frühen 80er Jahren vermehrt berichtet. Meist wurden nur bestimmte Personengruppen untersucht, wie zum Beispiel Kinder (CRAWFORD u. VEERMUND 1988; CASEMORE 1990). FAYER u. UNGER (1986) und CURRENT (1986) weisen auf die Gefahr der Übertragung von C. parvum auf den Menschen hin, die unmittelbaren Kontakt mit infizierten Kälbern hatten. Zahlreiche Infektionen am Menschen leiten sich von jungen infizierten Kälbern und Lämmern direkt oder indirekt ab (CURRENT 1986, CASEMORE 1990, DAWSON et al. 1995). DAWSON et al. (1995) zeigten einen unmittelbaren Zusammenhang zwischen Schulbesuchen auf Bauernhöfen und dem Auftreten von Zoonosen einschließlich der Kryptosporidiose. CASEMORE (1990) berichtete Fälle, bei denen erkrankte Personen Kontakt zu Reitställen oder Gartendünger hatten, obwohl in letzterem nur eine geringe Anzahl an Oozysten gefunden werden konnte. In einer Studie an Freiwilligen konnten DUPONT et al. (1995) zeigen, dass schon eine Dosis von 30 Oozysten ausreichend für eine Infektion ist. In der Epidemiologie von C. parvum ist durch Rinder oder andere Tiere kontaminiertes Wasser ein wichtiger Faktor für eine zoonotische Übertragung. Entwässerungsgräben können Rinderfäzes enthalten und so durch Ablauf andere Gewässer kontaminieren (BRIDGMAN et al. 1995). Zu einem massiven Ausbruch in der Bevölkerung kam es 1993 in Milwaukee (USA). In diesem Zusammenhang konnte eine Zoonose nicht direkt nachgewiesen werden, doch ist das Gebiet um Milwaukee bekannt für seine ausgedehnte Milchviehhaltung. Für eine Übertragung über kontaminiertes Trinkwasser sprechen auch die heftigen Regenfälle, die es vor dem Ausbruch gab und die zu einem vermehrten Eintrag von Oozysten von Weideflächen in Gewässer geführt haben könnten (MACKENZIE et al. 1994). 24 Kontaminierte Nahrung kann ebenfalls eine Infektionsquelle sein. So erkrankten nach einem Verzehr von handgepresstem Cider auf einer landwirtschaftlichen Ausstellung 54 % von 284 Personen an einer Kryptosporidiose. Nach einer Untersuchung konnte festgestellt werden, dass sowohl der Cider als auch die Kälberfäzes der Bauernhöfe, von denen der Cider stammte, C. parvum enthielten (MILLARD et al. 1994). 2.1.5 Pathogenese und Pathologie Gewöhnlich kann eine ausgeprägte Kryptosporidiose nur entstehen, wenn die Resistenzlage des Wirtes ungünstig ist. Dies kann bedingt sein durch das Alter, eine fehlende Immunantwort bei einer Erstinfektion, die Ernährung und/oder durch ein geschwächtes Immunsystem (CASEMORE et al. 1997). Nach GREGORY (1990) infiziert ein erfolgreicher Parasit jeden möglichen Wirt und richtet nur minimalen Schaden an, so dass unter natürlichen Bedingungen keine Erkrankungserscheinungen auftreten. Diese Balance zwischen Wirt und Parasit kann durch verschiedene prädisponierende Faktoren (siehe Kap. 2.1.4) gestört sein und es kommt zu einer klinischen Erkrankung. Die Erreger können sich stark vermehren und der Wirt kann der Replikation des Eindringlings nichts entgegensetzen. Schädigungen können von zwei Seiten her entstehen: durch den Parasiten selbst und durch die Wirtsreaktion auf den Parasiten. C. parvum schädigt direkt durch Nährstoffentzug, mechanische Alterationen und toxische oder allergene Ausscheidungs- und Stoffwechselprodukte des Parasiten (GREGORY 1990). Die Kryptosporidien verdrängen den Mikrovillisaum der Epithelzellen und stören somit indirekt die Funktion der Darmmukosa. Durch die kleinere Resorptionsoberfläche kommt es zur Malabsorption. Es tritt ein Verlust von Enzymaktivitäten auf, der wahrscheinlich zu einer unzureichenden Spaltung von Zucker und Eiweiß führt (ROMMEL 2000). Entzündungsreaktionen können unspezifisch das betroffene Wirtsgewebe alterieren (GREGORY 1990). Klinisch zeigt sich die Kryptosporidiose durch Diarrhoe meist ohne Blutbeimengungen. Läsionen am Darm entstehen durch primäre Entzündungsprozesse am Darm, epitheliale Hyperplasie und Epithelzellverlust. Histologisch stehen vaskuläre Veränderungen, Zellinfiltrationen und epitheliale Hyperplasien im Vordergrund (GREGORY 1990). 25 Vaskuläre Veränderungen: Die generelle Entzündungsreaktion bei einer Kryptosporidiose beruht auf Hyperämie und Ödemen, die aber auch gleichzeitig eine Reaktion auf opportunistische Bakterien oder Rotaund Coronaviren sein können. Mukosale Mastzellprodukte erhöhen die Permeabilität des Endothels und Epithels mit der Folge von Ödemen und Flüssigkeitsverlusten (GREGORY 1990). Zellinfiltrationen: In das geschädigte Gewebe treten neutrophile und eosinophile Granulozyten, Lymphozyten und Makrophagen ein. Neutrophile Granulozyten treten vor allem auf, wenn der epitheliale Deckmantel zerstört ist und Sekundärerreger eingedrungen sind (GREGORY 1990). Epitheliale Hyperplasie: Die Zerstörung der Epithelzellen hat eine Epithelzellproliferation zur Folge. Intestinale Zellen entstehen vermehrt aus den Stammzellen an der Basis der Lieberkühnschen Krypten. Die erhöhte Proliferation führt zu einer Verlängerung der Krypten, und die Epithelzellzerstörung im Dünndarm führt zu einer Bürstensaumatrophie (GREGORY 1990). Bei einer Monoinfektion mit C. parvum, die HEINE et al. (1984) an keimfrei aufgezogenen Kälbern durchgeführt haben, sind Malabsorption im gesamten Darm und gestörte Verdauung im Dünndarm die Hauptursachen der Diarrhoe. Dies kann zu einem Überwuchern der intestinalen Mikroflora führen, zur Veränderung des osmotischen Druckes entlang der Darmwand und infolge dessen zu einem Verlust von Flüssigkeit in das Darmlumen. Bei AIDS-Patienten ist eine durch C. parvum verursachte sekretorische Diarrhoe auf eine toxinvermittelte Hypersekretion zurückzuführen (CURRENT und BLAGBURN 1990). VITOVEC und KOUDELA (1988) führten eine experimentelle Studie an Mäusen durch, um die Lokalisation und Pathogenität von C. parvum zu untersuchen. Der Parasit konnte hauptsächlich im hinteren Jejunum und Ileum, Zäkum und vorderen Kolon lokalisiert werden. 26 Im mittleren Jejunum und hinteren Kolon fand man nur sporadisch Kryptosporidien. Die Mäuse zeigten keine klinische Erkrankung. Histologisch konnten die typischen Merkmale einer Kokzidiose festgestellt werden. TZIPORI et al. (1983) infizierten 21 Kälber mit C. parvum und untersuchten sie klinisch und pathologisch. Äußerlich zeigten die erkrankten Tiere zunächst Depression und Anorexie, dann Durchfall, der eine weiße oder gelbe Farbe hatte und von pastöser bis wässriger Konsistenz war. Zum Teil befanden sich im Kot Blutbeimengungen, Galle, Mukus und unverdaute Milch. In der Sektion zeigten sich zum Teil gasgefüllte Darmabschnitte mit gelbem Kot, die intestinalen Lymphknoten waren vergrößert und ödematös. Die meisten Oozysten fanden sich im distalen Dünndarmabschnitt. Zäkum, Kolon und Duodenum waren aber auch teilweise mit Kryptosporidien infiltriert. Im Allgemeinen bildet sich eine Immunität aus, bei der IgA-Antikörpern eine besondere Bedeutung zukommt (ROMMEL 2000). 2.1.6 Bekämpfung 2.1.6.1 Rehydratation Eine symptomatische Behandlung des Flüssigkeitsverlustes und der Gewichtsabnahme durch Rehydratationsmaßnahmen und Glukoseinfusionen unterstützen den Genesungsprozeß (GRIFFITH 1998). Die orale und parenterale Rehydratation mit Flüssigkeiten und Elektrolyten und chemotherapeutischen Zusätzen (siehe Kap.2.1.6.2.1 Halofuginon), die antikryptosporidielle Wirkung besitzen, werden bei erkrankten Kälbern eingesetzt. Die Rehydratation ist vor allem wichtig bei jungen Tieren und bei Tieren mit einer Sekundärinfektion. Mit einer antibiotischen Therapie können pathogene Bakterien, die eine zusätzliche Belastung darstellen, behandelt werden (BLAGBURN u. SOAVE 1997). 27 2.1.6.2 Therapie 2.1.6.2.1 Halofuginon In der Europäischen Union (EU) ist Halofuginon als Medikament beim Kalb zugelassen (ROMMEL 2000). VILLACORTA et al. (1991) untersuchten die Effizienz und Wirksamkeit von Halofuginon bei Kälbern. In der nicht behandelten Kontrollgruppe schieden 93 % der Kälber bis zu 10 Tage C. parvum aus, 62 % von ihnen zeigten Durchfallerscheinungen. Unmittelbar nach Beginn der Behandlung mit Halofuginon konnte kein kryptosporidienbedingter Durchfall mehr festgestellt werden. Diese Tiere blieben sieben Tage nach Absetzen von Halofuginon C. parvum negativ (VILLACORTA et al. 1991). Die Oozystenausscheidung wurde durch die tägliche Verabreichung von 60 oder 120 µg/kg Lebendgewicht vollständig gehemmt (PEETERS et al. 1993). Geringe Dosen von Halofuginon können eine Infektion nicht komplett unterbrechen. Eine Dosis von 60-125 µg/kg Lebendmasse Halofuginon über einen Zeitraum von 7 Tagen verabreicht ist hingegen zur Behandlung von Kälbern geeignet (VILLACORTA et al. 1991). In einem Feldversuch führte KRULL (2000) an 152 Saugkälbern aus verschiedenen deutschen Betrieben, die Durchfallprobleme mit gleichzeitigem Nachweis von C. parvum hatten, Therapieversuche mit unterschiedlichen Konzentrationen von Halofuginon und Sulfadimidin durch. Behandlungsschema nach KRULL (2000): Die Kälber werden gewichtsabhängig (2 ml pro 10 kg Körpergewicht ) mit je 7 – 9 ml/Tag Halofuginon (0,05 g Halofuginon-Base/100 ml) behandelt (100 µg/kg/Tag). In der Placebo-Gruppe und der Sufadimidin-Gruppe trat Durchfall signifikant häufiger und schwerer auf und diese Kälber wiesen einen schlechteren Allgemeinzustand auf als die der Halofuginon-Gruppe. Das von KRULL (2000) durchgeführte Behandlungsschema ist geeignet zur Behandlung in Problembeständen. 28 2.1.6.2.2 Weitere Medikamente Die meisten Studien, die sich mit gegen C. parvum wirksamen Medikamenten beschäftigten, wurden mit Nagetieren, wie Inzucht- und Auszuchtmäusen (siehe Kapitel 2.7) und Ratten, (REHG 1991 a u. b) gemacht. Die Behandlung natürlicher Infektionen sowie die Behandlung von experimentell infizierten Tieren steht dabei im Vordergrund (REHG 1991 a u. b, FAYER u. ELLIS 1993 a u. b, PEETERS et al. 1993, LUGINBÜHL et al. 1996, LINDSAY et al. 2000). Wirksamkeit von Medikamenten am Kalb Die getesteten Wirkstoffe Paromomycin, Lasalocid und Halofuginon (siehe oben) sind mehr oder weniger gegen C.-parvum Infektion bei Wiederkäuern wirksam (BLAGBURN u. SOAVE 1997). Paromomycin konnte in einer Dosis von 100 mg/kg Lebendgewicht (zweimal täglich für elf Tage) die Oozystenausscheidung und die Häufigkeit des Durchfalls signifikant verringern. Bei einer Dosis von 100 mg/kg Lebendgewicht konnten keine Oozysten in den Fäzes nachgewiesen werden, jedoch schieden die Kälber bei geringeren Dosierungen von 25 bzw. 50 mg/kg Paromomycin nach der ersten Woche der Behandlung wieder Oozysten aus (FAYER u. ELLIS 1993 a). LUGINBÜHL und PFISTER (1996) empfehlen bei einer klinisch manifesten Kryptosporidiose zweimal täglich 6 mg/kg Lasalocid zu verabreichen. Nach drei Tagen konnte die klinische Abheilung und Hemmung der Oozystenausscheidung festgestellt werden, ohne das Nebenwirkungen (Apathie, Schwäche, Festliegen, Zittern der Kaumuskulatur) festgestellt werden konnten. Eine einmalige Verabreichung von 10 mg/kg zeigte keine Wirkung (LUGINBÜHL und PFISTER 1996). Höhere Dosen (15 mg/kg) zeigten toxische Wirkungen (LUGINBÜHL und PFISTER 1996). GÖBEL (1987) konnte bei der Dosierung von 15 mg/kg/Tag keine Nebenwirkung feststellen. 29 Wirksamkeit von Medikamenten an Nagetieren Bei Nagetieren wurden ebenfalls eine Reihe verschiedener Chemotherapeutika auf ihre Wirksamkeit gegen C. parvum überprüft. Hierzu gehören Sulfonamide oder Makrolidantibiotika sowie Antiparasitika wie Decoquinat. Die Sulfonamide Sulfadimethoxin (120 mg/kg/Tag) und Sulfamethazin (175 mg/kg/Tag) waren prophylaktisch und therapeutisch wirksam, wenn der Behandlungsbeginn am Tag 0 p.i. oder am Tag 10 p.i. war. Es konnte eine Wirksamkeit von 76 % (Sufamethoxin) bis zu 83 % (Sufamathazin) erreicht werden. Die Bewertung erfolgte anhand der Zählung der C.-parvum-Entwicklungsstadien im Ileum (REGH 1991 a). Die Makrolidantibiotika Erythromycin (200 mg/kg/Tag) und Azithromycin (200 mg/kg/Tag) zeigten in einer 11tägigen Behandlung im Vergleich zur Kontrollgruppe (17 Kryptosporidien/Ileumzotte, 1,7 Kryptosporidien/100 µm) bei REGH (1991 b) eine Reduzierung der Parasitenstadien im Ileum (0/0,2 Kryptosporidien/Ileumzotte) und im Zäkum (0,5 Kryptosporidien /100 µm Zäkum) der Ratten. Die Behandlung von Mäusen mit Decoquinat (2,5 und 5 mg/kg) bewirkte keine signifikanten Unterschiede in der Anzahl vorhandener C.-parvum-Oozysten. Die Oozystenanzahl betrug durchschnittlich ca. 136,5 x 104 bei unbehandelten Mäusen, ca. 144,6 x 104 bei Mäusen, die mit 2,5 mg/kg Decoquinat behandelt wurden und 190,5 x 104 Oozysten bei Mäusen, die mit 5 mg/kg behandelt wurden (LINDSAY et al. 2000). 2.1.6.3 Antivirale Therapie Die Wirkung von 13 antiviralen Substanzen auf C.-parvum-Entwicklungsstadien in einer HCT-8-Zellkultur wurde mit einem ELISA überprüft und kann möglicherweise zu einer neuen Strategie der Kryptosporidiose-Therapie führen. Sechs Präparate sind Nucleosid-Analoge und weisen eine geringe Wirksamkeit gegen C. parvum auf (GRIFFITH 1998). 30 Ein intaktes Immunsystem ist auch heute noch der wichtigste Faktor zur Bekämpfung der Erkrankung. Eine symptomatische Behandlung des Flüssigkeitsverlustes und der Gewichtsabnahme durch Rehydratationsmaßnahmen und künstliche Ernährung unterstützen den Genesungsprozeß beim Menschen (GRIFFITH 1998) und beim Tier (BLAGBURN u. SOAVE 1997). 2.1.6.4 Immunisierung durch Kolostrum und die Wirkung darmaktiver Substanzen Häufig erkranken Tiere in den ersten Lebenstagen an einer Kryptosporidiose, bevor ihr Immunsystem ausgereift und fähig ist, spezifische Immunantworten zu geben. Eine passive Immunisierung durch maternales Kolostrum könnte möglicherweise einen Schutz gegen C. parvum aufbauen. Die dreimalige Immunisierung von Schwarzbunten-Kühen mit jeweils 300 µg gereinigtem rekombinanten Protein (rC7) von C. parvum verhindert bei Fütterung des Kolostrums an Kälber und nachfolgender oraler Infektion mit 107 Oozysten Diarrhoe und reduziert signifikant die Oozystenausscheidung (PERRYMAN et al. 1999). Die Verabreichung von hyperimmunem Rinderkolostrum ab der vierten Lebensstunde, das mit Antikörpern gegen C.-parvum-Oozysten versetzt worden ist, führt bei einer C.-parvumInfektion der Kälber am 4. Lebenstag zu einer verkürzten Patenz, verminderter Oozystenausscheidung und abgeschwächter Diarrhoe im Vergleich zu Kälbern, denen normales Kolostrum verabreicht worden ist (FAYER et al. 1989). Im Gegensatz dazu erwies sich bei HARP et al. (1990a) die Fütterung von Rinderkolostrum, das spezifische C.-parvumAntikörper enthält, die mit einem ELISA nachgewiesen werden konnten, als wirkungslos gegen eine C.-parvum-Infektion. In dieser Untersuchung wurden die Kühe mit Oozysten immunisiert, waren aber nicht hyperimmun (HARP et al. 1990 a). Enterocin-C, ein Milchaustauscher mit Allicin, Fruktooligosacchariden und darmaktiven Bakterien, hat keine signifikanten Auswirkungen auf das Ausmaß der Diarrhoe oder die Gewichtszunahmen bei C. parvum infizierten Kälbern (OLSON et al. 1998). Ein Vergleich dreier Versuchsgruppen, die entweder oral mit einer C.-parvum-Vakzine oder mit Laktat- 31 produzierenden Bakterien behandelt wurden oder unbehandelt blieben, zeigten nach experimenteller Infektion keine Unterschiede im Infektionsverlauf (HARP et al. 1996). 2.1.6.5 Prophylaxe Ziel der Prophylaxe sollte es sein, durch die Kombination von hygienischen Maßnahmen und gezielter symptomatischer Behandlung erkrankter Tiere, eine Ansteckung anderer Tiere zu verhindern und somit die Ausbreitung der Kryptosporidien einzudämmen (BLAGBURN u. SOAVE 1997). Um eine Ausbreitung von C. parvum zu verhindern, sollten die epidemiologischen Aspekte berücksichtigt werden (siehe Kap. 2.1.3 und 2.1.4). Der Kontakt mit C.-parvum-Oozysten sollte gemieden werden. Infizierte Tiere sollten abgesondert in Quarantäne gestellt werden und der Zutritt zu ihnen nur durch ein Desinfektionsbad des Schuhwerks möglich sein. Ställe, die leicht zu reinigen und desinfizieren sind, und regelmäßig gesäubert und desinfiziert werden, beugen ebenfalls einer Ausbreitung der Infektion vor. Die Übertragung über verunreinigtes Futter und Wasser sollte unterbunden werden. Nagetiere und Wildtiere sollten von dem Viehbestand ferngehalten werden. Das Personal sollte Kleidung tragen, die regelmäßig gereinigt wird (BLAGBURN u. SOAVE 1997). Zahlreiche Medikamente wiesen auch eine prophylaktische Wirkung gegen C. parvum auf (siehe Kap. 2.1.6.2), jedoch ist nur Halofuginon als wirksames Medikament bei lebensmittelliefernden Tieren zugelassen. 2.1.6.6 Desinfektion Die C.-parvum-Oozysten sind sowohl gegenüber Umwelteinflüssen (siehe Kap. 2.1.4) als auch gegenüber Desinfektionsmitteln sehr widerstandsfähig (EXNER u. GORNIK 1990, FAYER et al. 1997). 32 2.1.6.6.1 Desinfektionsarten Eine Desinfektion kann durch physikalische oder chemische Methoden erreicht werden (PETZOLDT u. KIRCHHOFF 1986). Ziel einer Desinfektion ist die Abtötung bzw. irreversible Inaktivierung von krankheitserregendem Material an oder in kontaminierten Objekten (STEUER et al. 1998). GUNDERMANN et al. (1991) sahen die Aufgabe der Desinfektion in der Reduzierung der Zahl an Infektionserregern auf einer Fläche oder einem Gegenstand, so daß eine Übertragung von Infektionserregern nicht mehr möglich ist. Es sollte sowohl eine laufende Desinfektion (z.B. regelmäßige Reinigung der Gegenstände, bei denen mit Kontamination zu rechnen ist, Nutzung von Desinfektionswannen für Schuhwerk), die während der Zeit der Erkrankung stattfindet, als auch eine Schlußdesinfektion des Raumes bzw. Stalles vorgenommen werden. Die Desinfektion eines Stalles kann in vier Schritten ablaufen (STEUER et al. 1998): 1. Entfernen des Mistes und Verbrennen 2. Gründliche Reinigung mit viel Wasser 3. Reinigung mit einem eiweißlösenden Mittel 4. Anwendung des Desinfektionsmittels 5. Abwaschen des Desinfektionsmittels, Flächen mit Kalkmilch bestreichen Vor einer Raumdesinfektion sind alle zu desinfizierenden Einrichtungsgegenstände so aufzustellen, daß das Aerosol (z.B. 5 g Formaldehyd, bzw. 15 g Formalin/1 m3) gut eindringen kann. Die starke Reaktionsfähigkeit vieler Desinfektionsmittel mit Eiweiß erfordert eine gründliche Reinigung der Flächen vor Desinfektionsbeginn (STEUER et al. 1998). Die Desinfektion wird bestimmt durch die Konzentration des Desinfektionsmittels, die Einwirkzeit und die Temperatur (PETZOLDT u. KIRCHHOFF 1986). 33 2.1.6.6.2 Chemische Desinfektion Zur chemischen Raum- und Flächendesinfektion können Präparate auf Aldehydbasis (z.B. Formalin) verwendet werden (STEUER et al. 1998). Weitere Desinfektionsmittelgruppen sind Laugen (Natronlauge, Kalkmilch), Halogene (Chlor und Chlorverbindungen, Jod), Phenole, Phenolderivate (Kresole), Alkohole (Ethanol, Isopropanol) und oberflächenaktive Verbindungen (Amphotenside, quaternäre Ammoniumverbindungen) (PETZOLDT u. KIRCHHOFF 1986). Chemische Desinfektionsmittel gegen Bakterien und Viren wurden auf ihre Effektivität gegen C. parvum getestet. Viele Desinfektionsmittel sind auf C. parvum ungenügend wirksam (FAYER et al. 1997) (siehe Tab. 2). BLEWETT (1989) führte Desinfektionsversuche mit anschließender Bestimmung der Exzystierung von C.-parvum-Oozysten durch. Die Reduktion der Vitalität wurde über die Verminderung der Exzystierungsrate ermittelt. Die Vitalität der Oozysten konnte in Tiermodellen (QUINN u. BETTS 1993, FAYER et al. 1996) oder in vitro in Zellkulturen (siehe Kap. 2.1.8.3.2) untersucht werden (siehe Tab. 2). Mit Desinfektionsmitteln (siehe Tab.2) wurden Reduktionsraten von C. parvum von 19 % bis 99 % erreicht. Die Untersuchung der C.-parvum-Desinfektion mit Gasen (Formaldehyd, Ammoniak, Ethylenoxid, Methylbromid, Kohlenmonoxid) und anschließender Überprüfung an BALB/c Mäusen ergab eine desinfizierende Wirkung von Gasen mit niedrigem Molekulargewicht. Ethylenoxid und Methylbromid haben die größte Effektivität und sind am besten als Desinfektionswirkstoff geeignet. Kohlenmonoxid hingegen zeigt keine Wirkung auf C. parvum (FAYER et al. 1996). STEIN et al. (1983) testeten vier im Handel befindliche Desinfektionsmittel (Wirkstoffe: Schwefelkohlenstoff, Phenol, Chloroform, Perchloräthylen und Alkohol). Kryptosporidienhaltiger Kälberkot, der mit der empfohlenen und der 1,5fachen Konzentration dieser Desinfektionsmittel behandelt wurde, verursacht nach zweistündiger Inkubation eine Infektion von Babymäusen. 34 Tabelle 2: Wirksamkeit von Desinfektionsmitteln gegen C. parvum Desinfektionsmittel Inkubationsbedingungen 5 mg/l, 2 Std. Chlor 80 mg/l, 2 Std. Hypochlorit Jod Ethanol Ergebnis Oozysten exzystieren 99 % Reduktion* in QUINN u. BETTS 1993 vivo 1 %, 30 min., 22 °C 55 % Reduktion** 1 %, 30 min. 37 °C 59 % Reduktion** 10 %, 30 min., 22 °C 19 % Reduktion** 10 %, 30 min., 37 °C 53 % Reduktion** 90 %, 30 min., 22 u. Autor BLEWETT 1989 BLEWETT 1989 keine Reduktion** BLEWETT 1989 keine Reduktion** BLEWETT 1989 keine Reduktion** BLEWETT 1989 1 %, 30 min., 22 °C 36 % Reduktion** BLEWETT 1989 1 %, 30 min., 37 °C 67 % Reduktion** BLEWETT 1989 100 % Gas, 24 Std. infektiös in vivo FAYER et al. 1996 Ammoniak 100 % Gas, 24 Std. nicht infektiös in vivo FAYER et al. 1996 Kohlenmonoxid 100 % Gas, 24 Std. infektiös in vivo Ethylenoxid 100 % Gas, 24 Std. nicht infektiös in vivo FAYER et al. 1996 Methylbromid 100 % Gas, 24 Std. nicht infektiös in vivo FAYER et al. 1996 Propanol Isopropanol Formaldehyd 37 °C 90 %, 30 min., 22 u. 37 °C 90 %, 30 min., 22 u. 37 °C * Reduktion der Infektiösität im Tiermodell ** Reduktion entspricht der Abnahme der Exzystierungsrate in vitro FAYER et al. 1996 35 2.1.6.6.3 Desinfektionsmittelprüfung In den Richtlinien der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft (DVG) zur Prüfung von Desinfektionsmitteln an Kokzidienoozysten ist ein Lysistest an sporulierten und unsporulierten Oozysten von Eimeria tenella sowie ein Sporulationshemmtest an unsporulierten Oozysten in vitro vorgesehen. Das Desinfektionsmittel wird dazu vor jedem Versuch in doppelter Anwendungskonzentration mit destilliertem Wasser angesetzt. Die Einwirkzeiten betragen 30, 60, 90, 120 und 180 min. Unter einem Mikroskop wird die Anzahl intakter Oozysten und der Anteil unsporulierter und sporulierter Oozysten bestimmt. Entscheidend für die Bewertung des Desinfektionserfolges ist aber der Infektivitätsverlust der Oozysten im Infektionstest mit Hühnerküken. Als Testobjekte für die Prüfung von Desinfektionsmitteln an Kokidienoozysten dienen ausschließlich Eimeria-tenella-Oozysten. Die Aussagekraft zur Wirkung auf C. parvum bleibt durch die höherer Resistenz von C. parvum (siehe oben u. Kap. 2.1.3 ) eingeschränkt. Es ist kein entsprechendes Verfahren für C. parvum vorhanden. 2.1.7 Diagnostik Eine korrekte Diagnose ist die Grundlage einer sinnvollen Bekämpfung der Kryptosporidiose. So ist es beispielsweise wichtig Eltern, deren Kinder erkrankt sind, vor einem Infektionsrisiko zu warnen um so eine Ansteckung anderer Personen zu verhindern. Zum anderen dient eine Untersuchung des Trinkwasser auf Kontamination mit C.-parvum-Oozysten dem Schutz der öffentlichen Gesundheit (GRIFFITH 1998). 2.1.7.1 Nachweis von C.-parvum-Oozysten in Kotproben Zur Diagnostik kann es von Vorteil sein, die Oozysten in den Fäzesproben vorher anzureichern, um den Nachweis auch geringer Mengen Oozysten zu ermöglichen. 36 Eine einfache Sedimentation ohne Zentrifugation ist hierzu oft nicht ausreichend. In einer Untersuchung der Sedimentationsgeschwindigkeit von C. parvum, C. muris und C. baileyi in Abhängigkeit von der Temperatur und dem umgebenen Medium zeigte C. parvum deutlich die geringsten Sedimentationsgeschwindigkeiten, was SRETER und SZELL (1998) auf die geringe Größe (C. parvum: 4,5 µm, C. muris: 6,5 µm, C. baileyi: 7,5 µm) und Dichte der Oozysten zurückgeführt haben. Daher ist für die Anreicherung die Verwendung von Zentrifugen erforderlich (SRETER u. SZELL 1998). Eine vorteilhafte Alternative zur Sedimentation ist die Flotation. Hierzu benötigt man Lösungen (gesättigte Salz- oder Zuckerlösungen) mit einem spezifischen Gewicht über 1,2. Das originale Sheather´s Flotationsmedium stellt ein Zucker-Wasser-Gemisch mit einem spezifischen Gewicht von 1,2 dar (SHEATHER 1923). Es gibt noch Variationsmöglichkeiten mit unterschiedlichen spezifischen Gewichten und Zusätzen wie Formaldehyd oder Phenol, um das Wachstum von Bakterien und Pilzen zu verhindern (UPTON 1997). CURRENT (1990) benutzte die Zucker-Flotationstechnik zur Gewinnung von Oozysten. Diese Technik hat gegenüber anderen Flotationsverfahren den Vorteil, daß die Oozysten reiner sind und eine größere Anzahl Oozysten gewonnen werden kann. 2.1.7.2. Direkter C.-parvum-Nachweis Post mortem lassen sich C.-parvum-Entwicklungsstadien am sichersten in Tupfpräparaten der Ileumschleimhaut auf Objektträgern nachweisen. Die Präparate werden mit Methanol fixiert und nach Giemsa gefärbt. Als Untersuchungsmaterial eignen sich ebenfalls histologische Schnitte des Darmes und Kotausstriche vom lebenden Tier. Eine schnell anzuwendende Färbung kann die Untersuchung von Kotproben erleichtern. Hierbei werden ein Tropfen Kot mit einem Tropfen Karbolfuchsin auf einem entfetteten Objekträger vermischt und dünn ausgestrichen. Nach der Trocknung wird das Präparat mit Immersionsöl bedeckt und unter maximal möglicher Vergrößerung unter einem Lichtmikroskop untersucht. Die Oozysten stellen sich im Hellfeldmikroskop als 4 - 4,5 µm große lichtbrechende runde Gebilde dar. Mit 37 Hilfe des Interferenzmikroskopes lassen sich die Oozysten leicht anhand ihrer Morphologie identifizieren (HEINE 1982, ROMMEL 2000). In einer modifizierten Ziehl-Neelsen-Färbetechnik von HENRIKSEN und POHLENZ (1981) kommt zur Karbolfuchsinfärbung noch eine Gegenfärbung mit Methanolblau hinzu. Dies ist ebenfalls eine schnelle und einfache Färbetechnik, bei der sich die hellroten Oozysten gegenüber einem blaugrünen Hintergrund aus Fäzespartikeln abheben. Weitere Modifikationen der Ziehl-Neelsen-Technik beschrieben BRONSDON (1984) und POHJOLA et al. (1985) indem sie zusätzlich Dimethylsulfoxid (DMSO) verwendeten. Bei dieser Technik können andere Parasiten, die bei spezifischen Immunfluoreszenztechniken oder Enzymassays übersehen werden, ebenfalls ermittelt werden (siehe Kap. 2.1.7.3). Die Fluoreszenz-Färbemethode ist sensitiver, aber es kann genau wie bei Hellfeldfärbungen zu falsch positiven Ergebnissen kommen, und Oozysten anderer Kokzidienarten bleiben zum Teil unerkannt (ARROWOOD 1997). Zu den direkten Nachweismöglichkeiten gehören ebenfalls die unter Kap. 2.1.7.1 erläuterten Flotations- und Sedimentationtechniken. 2.1.7.3 Indirekter C.-parvum-Nachweis Bei dem indirektem Nachweis von C. parvum werden Antikörper, Antigene, genomische DNA oder messengerRNA nachgewiesen. C.-parvum-Nachweis mit Antikörpern Serologische Techniken zum Nachweis von Oozysten mit Hilfe von Kaninchenimmunserum beschrieben STRIBBS und ONGERTH (1986). Um die Technik der Immunfloureszenz noch weiter zu spezifizieren, benutzten ARROWOOD und STERLING (1989) monoklonale Antikörper. Mit der Immunfloureszenz-Technik konnten signifikante Erhöhungen in der Sensitivität und der Spezifität gegenüber konventionellen Nachweismethoden, wie z.B. der 38 Färbetechnik nach HEINE (1982) erzielt werden und so Kryptosporidien-Entwicklungsstadien im infizierten Gewebe gezeigt werden (ARROWOOD und STERLING 1989). Zuvor mit Natriumhypochlorit oder Natriummetaperiodat behandelte Oozysten büßen zum Teil ihre Fähigkeit ein, von bestimmten Antikörpern erkannt zu werden. Durch die chemische Behandlung sind die Oozysten zwar noch vital, aber die Epitope an der Oberfläche der Oozysten werden zerstört. Somit kann die Wiederfindungsrate aus Wasserproben erniedrigt sein und zu falsch negativen Ergebnissen führen. Dieses Problem kann möglicherweise durch die Verwendung von Antikörpern, die an nicht labile Antigene binden, umgangen werden (MOORE et al. 1998). WOODS et al. (1995) entwickelten mit einen ELISA zum Nachweis von vitalen Oozysten eine in-vitro-Nachweismethode von C. parvum. Eine C.-parvum-Infektion kann auch durch serologischen Antikörpernachweis diagnostiziert werden. Im Serum treten IgG-Antikörper 6 Tage nach einer Infektion auf. In den Fäzes sind IgG, IgA und IgM 5-6 Tage nach Infektionsbeginn nachweisbar (ROMMEL 2000). Humorale Antworten auf Kryptosporidieninfektionen wurden zuerst mit der indirekten Immunfloureszenz im infiziertem Gewebe dargestellt. Antikryptosporidien-Immunglobuline wurden in 10 Säugetierspezies demonstriert (TZIPORI und CAMPBELL 1981). C.-parvum-Nachweis mit Vitalfarbstoffen CAMPBELL et al. (1992) untersuchten die Vitalität von Oozysten anhand einer in vitro Exzystierung mit Ein- oder Ausschluß von fluoreszierenden Vitalfarbstoffen (4´,6-diamidino2-phenylinole (DAPI), Propidium-Jodid (PI)). Cervine-ovine Oozystenisolate konnten deutlich mehr DAPI aufnehmen als humane oder bovine Oozystenisolate und waren gegenüber PI negativ. Oozysten mit einer Oozystenwand, die permeabel gegenüber DAPI und nicht permeabel gegenüber PI ist, exzystieren nach zwei Stunden Inkubation. Solche Oozysten werden als vital angesehen. Die hohe Vitalität der cervinen-ovinen Oozysten erklären die Autoren durch eine andere Reinigungsmethode. Die Fäzes wurden für diese Reinigungsmethode mit 1 %igem Natriumdodecylsulfat inkubiert und anschließend sedimentiert. 39 C.-parvum-Nachweis mit Kits Die kommerziell erhältlichen Enzym-Immun-Assays (EIA) ”ProSpecT Cryptosporidium Microtiter assay” (Alexon, Inc., Kalifornien, USA) und ”ColorView Cryptosporidium assay” (Seradyn, Indianapolis, Indiana, USA) haben eine Sensitivität von 94,5 %. Der direkte Immunfluoreszenzassay ”Merifluor Cryptosporidium Kit” (Meridian, Diagnostics, Cincinnati, Ohio, USA) und die ”Acid-fast Kinyounfärbung” Methode weisen eine Sensitivität von 96,4 % auf. Somit ist bei allen Tests mit falsch negativen Ergebnisse zu rechnen. Der Colorview Test und die ProSpect Methode erfordern einen erheblichen technischen Aufwand, insgesamt waren der ProSpect-Test und der Merifluor-Test am leichtesten zu handhaben (KEHL et al. 1994). C.-parvum-Nachweis mit der Polymerasekettenreaktion (Polymerase chain reaction: PCR) Die PCR ist eine molekularbiologische Methode, mit der gezielt spezifische DNA-Sequenzen schnell vervielfältigt und nachgewiesen werden können (SAKI et al. 1985, MULLIS u. FALOONA 1987). Als Starthilfe wird ein Oligonukleotidprimer verwendet, der aus kurzkettigen einzelsträngigen DNA-Molekülen besteht und sich an den Enden einer definierten Sequenz der DNA-Matrize anheftet. Die DNA-Polymerase verlängert in Gegenwart von Desoxynukleotidtriphosphaten (dNTP) die Primer und synthetisiert somit neue DNA-Stränge. In einem Zyklus werden zunächst bei ca. 95-100 °C die doppelsträngige DNA geschmolzen (Denaturierung), dann erfolgt die Primeranlagerung bei 37-65 °C und eine Primerverlängerung (Extension) schließt sich bei 72 °C an. Im Verlauf einer PCR wird ein Zyklus mehrmals wiederholt, wobei auch die neu synthetisierten DNA-Stränge als Matrize dienen und es so zu einer exponentiellen Vermehrung des gesuchten DNA-Abschnittes kommt (NEWTON u. GRAHAM 1994). Die PCR-Produkte (Amplifikate) können mit der Elektrophorese in einem Agarosegel und nachfolgender Färbung mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht werden. Andere Nachweistechniken für PCR-Amplifikate sind Southern-Blot-, Dot-Blot-Hybridisierung oder Elektrochemolumineszenz (NEWTON u. GRAHAM 1994). 40 Eine PCR kann mit verschiedenen Ausgangangsmaterialien von C. parvum durchgeführt werden: PCR direkt aus Oozysten LAXER et al. (1991) konstruierten ein spezifisches und sensitives PCR Verfahren, das sich für Diagnostik, Gewebeuntersuchungen sowie für epidemiologische Untersuchungen eignet. Als Amplifikationsziel wurde eine 400-Basenpaar (bp)-Region des C.-parvum-Genoms gewählt. WEBSTER et al. (1993) bestätigen die Sensitivität und Spezifität der PCR, verwendeten aber eine Sequenz von 329 bp als Replikationsziel. Ihrer Meinung nach ist diese PCR geeignet für diagnostische Proben und epidemiologische Studien. WAGNER-WIENING et al. (1995) fanden weitere C.-parvum-spezifische DNA-Regionen von 873 bp und 604 bp. Die Spezifität und Sensitivität der Primer war ausreichend, um eine geringe Anzahl an Sporozoiten (Nachweisgrenze 873-bp-Primer: 100 Sporozoiten, 604-bp-Primer: 10 Sporozoiten) nachzuweisen. Zur Überprüfung ihrer Ergebnisse benutzten sie ein Exzystierungsprotokoll, um tote und lebende Oozysten zu unterscheiden. PCR aus organischem Gewebe Geringste Mengen (0,8 pg) reiner Parasiten-DNA und weniger als 0,1 ng Parasiten-DNA in der Ileummukosa können durch die PCR nachgewiesen werden. Bei nicht immunsupprimierten Mäusen, in deren Fäzes keine Oozysten nachgewiesen werden können, sind mindestens 25 ng Mukosa-DNA notwendig, um eine stattgefundene Infektion mit der PCR nachzuweisen zu können (PETRY et al. 1998). PCR aus Zellkulturmaterial LAXER et al. (1992) konnten den Nachweis von C. parvum in fixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten mit der PCR führen. Auch in diesem Fall wurde die Methode als sensitiv und spezifisch für C. parvum angesehen. DENG und CLIVER (1998) wiesen durch die PCR C.-parvum-DNA im Überstand einer mit C. parvum infizierten Zellkultur nach. Die hierbei verwendeten Primer lieferten eine spezifische Bande von 452 bp und amplifizierten keine PCR-Produkte mit DNA von C. muris, Giardia lamblia, E. coli oder den 41 Zellen der Zellkultur. Ein 280-bp-Fragment, das nicht von den Oozysten oder Sporozoiten stammen kann, war möglicherweise Meronten, Mikrogamonten oder Makrogamonten zuzuweisen (DENG u. CLIVER 1998). PCR-Nachweis in Wasserproben Eine sehr sensitive Nachweismethode ist notwendig, um auch geringe Oozystenmengen in der Umwelt, vor allem im Trinkwassersediment, nachzuweisen. FILKORN et al. (1994) optimieren den C.-parvum-Nachweis mittels PCR durch Kombination mit weiteren Arbeitsschritten. Die Zerstörung aller freien DNA im Untersuchungsmaterial, anschließende Exzystierung der vorhandenen Oozysten und die nachfolgende PCR der Sporozoiten-DNA erhöht die Nachweisbarkeit von C. parvum. Es wurde der Vitalitätsnachweis von C. parvum erbracht, da nur die lebensfähigen Sporozoiten mittels einer PCR nachgewiesen werden konnten. JOHNSON et al. (1995) erhöhten die Sensitivität durch eine magnetische Antikörper-Bindung, die der Sensitivität einer Immunfluoreszenz zum Nachweis von C.parvum-Oozysten im konzentrierten Abwasser entspricht. Dieses Verfahren wurde bei dem großem C.-parvum-Ausbruch in Milwaukee verwendet (siehe Kap. 2.1.3). PCR und Random Amplified Polymorphic (RAPD) DNA-Methode Der von ZHILIANG et al. (1995) entwickelte Primer SB50 wurde mit der RAPD-DNAMethode hergestellt. Er liefert PCR-Signale sowohl von den Fäzes C.-parvum-infizierter Patienten, als auch von natürlich infizierten Kälbern und experimentell infizierten Mäusen. WU et al. (2000) konnten durch die mit der RAPD-DNA-Methode hergestellten Primer eine Sensitivität erreichen, mit der man eine einzelne C.-parvum-Oozyste (bzw. 0,156 pg Oozystenmaterial) nachweisen kann. 42 2.1.8 C. parvum in der Zellkultur Um Vorgänge wie zum Beispiel den Entwicklungszyklus, die Entwicklungsstadien, Reaktion auf chemische oder physikalische Behandlung von C. parvum besser beobachten zu können, ist eine C.-parvum-Infektion in der Zellkultur hilfreich. 2.1.8.1 Vorbehandlung der Oozysten Bevor C.-parvum-Oozysten in die Zellkultur gebracht werden, wird die Exzystierungsrate bestimmt (WOODMANSEE 1987, FILKORN et al. 1994, MAILLOT et al. 1997, SLIFKO et al. 1998). Die Exzystierungsrate kann dabei von verschiedenen Faktoren abhängen. Hierzu zählen der pH-Wert (FAYER u. LEEK 1984, WOODMANSEE 1987), der Zusatz von Taurogallensäure oder Trypsin (FAYER et al. 1984, WOODMANSEE 1987, UPTON et al. 1994 b) und der CO2-Gehalt sowie die Temperatur während der Exzystierung (FAYER et al. 1984). Aber auch ohne ein spezielles Exzystierungsmedium mit bestimmten Zusätzen können Exzystierungsraten von bis zu 90 % in der Zellkultur beobachtet werden (UPTON et al. 1994 b). Der wichtigste Schritt hierbei ist die Behandlung der Oozysten mit Natriumhypochlorit und die anschließende Inkubation der Oozysten bei 37 °C. Nicht vorbehandelte Oozysten exzystierten sehr schlecht. Werden ausreichende Exzystierungsraten mit dieser Methode erzeugt, können aufwendige Behandlungen der Oozysten, wie die Reinigung der Sporozoiten mit einem Anionen-Austausch-Chromatographen, über Cäsiumchlorid- oder Percoll®Gradienten wegfallen (TAGHI-KILANI u. SEKLA 1987, UPTON et al. 1994 b). 2.1.8.2 Kultivierung in verschiedenen Zelllinien C. parvum läßt sich in verschiedenen Zelllinien kultivieren (Tab. 3). Am besten geeignet sind epitheliale endometriale Zelllinien, wie humane Karzinomazellen Kolon-Adenomakarzinomzellen (RL95-2). Galaktose-adaptierte (Caco-2) humane oder Kolon- Adenomakarzinomzellen (HT-29), humane ileozäkale Adenomakarzinomzellen (HCT-8) und 43 Mardin-Darby-Hundenierenzellen (MDCK) können ebenfalls verwendet werden (UPTON 1997). Vergleichende Untersuchungen zwischen der Infektiösität für humane EnterozytenZelllinien führten MAILLOT et al. (1997) an Caco-2, HT-29, HCT-8 und den TC7 und PF11 Klonen von Caco-2 Zellen durch und bestätigen, dass alle drei Zelllinien zur in vitro Kultivierung von C. parvum genutzt werden können. Ein Vergleich zwischen HT-29 (originaler Herkunft von humanen Kolonkarzinomzellen) und differenzierten HT-29 (Ähnlichkeit mit epithelialen Stammzellen, gleiche morphologische und funktionelle Charakteristika) zeigte eine fünffach höhere Infektiösität von C. parvum in den differenzierten HT-29-Zellen (FLANIGAN et al. 1991). Die Infektionssraten schwankten von 3 % bis 50 % in Caco-2-Zellen (BURAUD et al. 1991, GRIFFITH et al. 1994). UPTON et al. (1994 a) konnten klare Unterschiede zwischen der Infektiösität von C. parvum in verschiedenen Zelllinien beobachten. Die Entwicklungsrate von C. parvum in BALB/3T3, HT-29 und RL- Zellen lag 20 % unter der Entwicklung in MDBK-Zellen. Die HCT-8 Zelllinie hatte die höchste Infektionsrate und somit die besten Entwicklungsergebnisse für C. parvum ergeben. Es war unklar, warum diese Zelllinie den anderen Zelllinien überlegen war. Es wurde angenommen, daß unter anderen Umgebungsverhältnissen mit anderen Medien oder Zusätzen eine andere Zelllinie der HCT-8 Zelllinie überlegen sein könnte (UPTON et al. 1994 a). Teilweise entwickelten sich zwei oder mehr C.-parvum-Stadien in einer Zelle (ROSALES et al. 1983). In einer elektronenmikroskopischen Untersuchung der ultrastrukturellen Entwicklungsvorgänge einer mit C. parvum infizierten HT-29 Zellkultur konnten sechs Stunden nach Inokulation Trophozoiten nachgewiesen werden. Die Entwicklung vom Trophozoiten zum Schizonten vollzog sich innerhalb von 24 Stunden (AJI et al. 1991). Aufeinanderfolgende Entwicklungsstadien, wie Trophozoiten, Meronten, Mikrogametozyten und Makrogametozyten konnten beobachtet werden (GUT et al. 1991, AJI et al. 1991, SLIFKO et al. 1997 a). In einigen Fällen konnten die Stadien nicht definiert zugeordnet werden (ROSALES et al. 1983). 44 Tabelle 3: C.-parvum-Infektionen in verschiedenen Zelllinien Zelllinie Kurzbezeichnung Autor ROSALES et al. 1983 Mardin-Darby-canine kidney MDCK GUT et al. 1991 MITSCHLER et al. 1994 Human fetal lung HFL CURRENT u. HAYNES 1984 Primary chicken kidney PCK CURRENT u. HAYNES 1984 Porcine kidney PK CURRENT u. HAYNES 1984 Human colonic adenocarcinoma Human endometrial carcinoma Human colonic carcinoma Human ileocaecal adenocarcinoma BURAUD et al. 1991 CACO-2 GRIFFITH et al. 1994 RL-95-2 RASMUSSEN et al. 1993 FLANIGAN et al. 1991 HT-29 AJI et al. 1991 UPTON et al. 1994 a u. b HCT-8 SLIFKO et al. 1997 a u. b SLIFKO et al. 1998 Mardin-Darby-bovine-kidney MDBK UPTON et al. 1994 a BALB/c mouse embryo UPTON et al. 1994 a Die direkten Auswirkungen BALB/3T3 von C. parvum auf infizierte Zellkulturen waren Monolayerdefekte, vor allem eine Erhöhung der Permeabilität der Zellmembran und als dessen Folge der epitheliale Zelltod (GRIFFITH et al. 1994). Neben der Wahl einer bestimmten Zelllinie konnte eine Variation der Infektionsdosis und der Inkubationszeit helfen, die Parasitenentwicklung in vitro zu optimieren (RASMUSSEN et al. 1993, GRIFFITH et al. 1994). Der Erfolg einer C.-parvum-Kultivierung hängt wesentlich von der Zusammensetzung des Kultivierungsmediums ab (UPTON et al. 1995). Ein Vergleich der 45 Membranlipidzusammensetzung von C.-parvum-Oozysten und den Wirtszellen könnte zu einem besseren Verständnis des Kokzidienwachstums in der Zellkultur beitragen, so daß die Kulturbedingungen und die Entwicklung der Parasiten in der Zellkultur verbessert werden könnte (MITSCHLER et al. 1994). 2.1.8.3 C. parvum in der HCT-8- Zellkultur Die meisten in vitro Untersuchungen von C. parvum finden in HCT-8 Zellkulturen statt. Die Inhibition von C. parvum und anschließende Überprüfung der Oozystenvitalität in vitro wurden für die Suche nach einem wirksamen Mittel gegen C. parvum eingesetzt (FAYER et al. 1997). 2.1.8.3.1 C.-parvum-Vitalitätsnachweis in vitro SLIFKO et al. (1997a) haben sich mit der in vitro Technik zur Ermittlung der Infektiösität von C-parvum-Oozysten in der Zelllinie HCT-8 befaßt. Mit der ”foci-detection-method” (FDM) (eine primäre Antikörper-Kopplung an parasitäre Stadien mit Bindung eines sekundären fluoreszierenden Antikörpers) wurden nach 48 Stunden wesentlich mehr Foci gefunden, als ursprünglich Parasiten inokuliert wurden. Dies war vermutlich durch die Vermehrung der Parasiten in der Kultur zu begründen. Theoretisch müßte, wenn alle für die Infektion vorgesehenen Oozysten vital waren, ein Foci/Oozystenverhältnis von 4:1 vorliegen, tatsächlich stieg das Foci/Oozystenverhältnis innerhalb von 48 Stunden auf 9,3:1 bis zu 29,6:1 an (SLIFKO et al. 1997 a). SLIFKO et al. (1998) verglichen vier C.-parvum-Vitalitätsassays miteinander: die Vitalfarbstoffmethode mit DAPI/PI (siehe Kapitel 2.1.7.3.2) die Exzystierungsmethode 46 die Zellkulturinfektion und anschließende Markierung der Entwicklungsstadien mit den von SLIFKO et al. (1997 a) benutzten Antikörpern und Auswertung mit Hilfe der FDM die Infektiösität am Mausmodell Sämtliche Daten wurden über den ”most-probable number assay” (MPN) ausgewertet. Der FDM-MPN-Nachweis im Anschluß an eine Infektion einer HCT-8 Zellkultur war sensitiv genug, um Oozystenkonzentrationen in Lösungen nachzuweisen, die weniger als eine Oozyste pro Milliliter enthielten. Diese Methode war auch anwendbar, wo andere Vitalitätsassays, wie zum Beispiel die PCR und die in situ Hybridisation noch problematisch in der Anwendung sind (z.B. Turbinenwasserproben). Die FDM-MPN-Methode war sensitiver im Nachweis vitaler Oozysten als die Vitalfärbemethode oder die Exzystierungsmethode, die die aktuelle Oozysteninfektiösität zum Teil überschätzten. Im Vergleich der FDM-MPN-Methode mit einem Tiermodell erfolgte hier eine vergleichbare Bewertung der Inaktivierung, so dass dieses In-vitro-Verfahren möglicherweise eine brauchbare Alternative zum Tierversuch sein könnte (SLIFKO et al. 1998). Zur Optimierung von Vitaitätsassays zeigte ein Vergleich beim Gebrauch von konventionellen Glasobjektträgern mit sogenannten ”well chamber slides”, dass beide sich gleichermaßen eignen, um Monolayer-Kulturen mit Oozysten zu infizieren und anschließend auszuwerten. Es ergaben sich keine Unterschiede der Infektiösität in der qualitativen Auswertung. Die ”well chamber slides” haben den Vorteil, dass man eine begrenzte infizierte Oberfläche vollständig betrachten kann. Um eine Auswertung auch bei höheren Oozysteninfektionsdosen zu ermöglichen, sollte die Inkubationszeit auf 24 Stunden beschränkt werden, da schon nach 48 Stunden 380 % mehr Infektionsfoci zählbar waren als nach 24 Stunden (SLIFKO et al. 1997 b). 47 2.1.8.3.2 Inhibition von C. parvum in vitro Die Wirksamkeit von 101 antimikrobiellen und anderen Substanzen auf C. parvum wurde an infizierten Zellkulturen mit Hilfe von Antikörpern von WOODS et al. (1996) getestet. Die Mehrheit der Substanzen hatte eine erkennbare Wirksamkeit erst in hohen Konzentrationen. Zu den getesteten antimikrobiellen Substanzen gehören z.B. Antibiotika (Ionophore, Sulfonamide, Aminoglykoside, Makrolidantibiotika und Tetrazykline), Malonat, Sinefungin und Ozon. Die höchste Inhibitionswirkung hatte die Stoffgruppe der Ionophoren. Alborixin hemmte C. parvum schon bei einer Konzentration von 12,5 ng/ml zu 97 %. Allerdings können Ionophore in dieser Dosis in vivo wegen ihrer hohen Toxizität nicht eingesetzt werden. Ca. 30 % der getesteten Sulfonamide waren bei hohen Anwendungskonzentrationen wirksam (WOODS et al. 1996). Eine weitere Studie bestätigte, dass die Sulfonamide Sulphadimethoxin und Sulphamethazine gegen C. parvum wirksam waren (REHG 1991 b). WOODS et al. (1996) zeigten, dass Sulphanitran und Trimethoprim effizienter waren als Sulphadimethoxin und Sulphamethazine. Von den Aminoglykosiden war nur Paromomycin im Mikrogrammbereich (100 µg/ml) mit einer Inhibition von 69 % wirksam (WOODS et al. 1996). Eine andere Studie des Wirkstoffes Paromomycin in Zellkultur belegt ebenfalls die inhibitorische Wirkung gegen C. parvum. Die Wirksamkeit einer Paromomycin-Konzentration von 100 µg/ml lag bei 62 %, von 1 mg/ml bei 95 %. Höhere Konzentrationen (5 mg/ml) erwiesen sich jedoch als weniger inhibitorisch und erreichten eine Wirksamkeit von 86 % (MARSHALL u. FLANIGAN 1992). Makrolidantibiotika zeigten sowohl in vitro (WOODS et al. 1996) als auch in vivo (REHG 1991 a) eine Antikryptosporidienaktivität. Die stärkste Wirkung der Makrolidantibiotika wiesen Azithromycin und Clindamycin auf. Makrolidantibiotika konnten nicht alle Kryptosporidien vollständig eliminieren, so dass es zu Superinfektionen des Wirtsgewebes kam (WOODS et al. 1996). 48 Tetracycline, vor allem Doxycyclin, waren in vitro gegen C. parvum aktiv (WOODS et al. 1996) und führten auch in vivo allein oder in Kombination mit Paromomycin zu einer Hemmung von C. parvum (FAYER u. ELLIS 1993 a). Mikrotubuli-Inhibitoren wie der Wirkstoff Colchicin bewirken in C.-parvum-infizierten HT-29-Zellkulturen eine Reduktion der intrazellulären Parasitenstadien um 77 %. Vinblastine, ein weiterer Mikrotubuli-Inhibitor, reduzierte ebenfalls den Parasitenbefall der Wirtszellen (WIEST et al. 1993). Der Wirkstoff Malonat wies dagegen bei einer niedrigen Konzentration von 0,04 µg/ml eine höhere Inhibition von C. parvum auf als bei höheren Konzentrationen (0,1, 0,3 oder 1,0 mg/ml). Dies wurde über Ausfällungen bei höheren Konzentrationen erklärt, die zur Bildung von Micellen geführt haben können. Sinefungin zeigte in der Zellkultur eine Inhibitionsrate auf C. parvum von ca. 80 %, wenn man den Wirkstoff zwei Stunden nach Zugabe der Sporozoiten zur Zellkultur dem Nährmedium zusetzte. Gab man Sinefungin und Sporozoiten simultan zur Zellkultur, wurden nur Inhibitionsraten von maximal 50 % erreicht (GARGALA et al. 1999). Im Vergleich zu Giardia wies C. parvum gegenüber Ozon eine 30mal stärkere Resistenz, und gegenüber Chlordioxin eine 14mal höhere Resistenz auf (KORICH et al. 1990). 2.1.9 C. parvum im Tiermodell Das meistverwendete Tiermodell für experimentelle Studien an C.-parvum-Infektionen ist die Maus. Die Empfänglichkeit der Mäuse für C. parvum kann von unterschiedlichen Faktoren abhängen: a. Infektionsmaterial b. Infektionsdosis c. Vorbehandlung der Mäuse d. Rasse der Mäuse e. Alter der Mäuse f. Applikationsweg der Oozysten 49 Zu a. Die Eingabe von Sporozoiten (RIGGS u. PERRYMAN 1987) und Oozysten (SHERWOOD et al. 1982, ERNEST et al. 1986, CURRENT u. REESE 1986, RIGGS u. PERRYMAN 1987, VITOVEC u. KOUDELA 1988, FINCH et al. 1993) führte ebenso zu einer C.-parvum-Infektion in der Maus, wie auch die Eingabe von oozystenhaltiger Fäzessuspension oder Darmhomogenat (TZIPORI et al. 1980, SHERWOOD et al. 1982). Bei verlängerter Aufbewahrungszeit verlieren die Oozysten an Vitalität (DORAN u. VETTERLING 1969, LEEK u. FAYER 1979). Ein signifikanter Abfall der Vitalität wurde bereits nach 2 Monaten festgestellt (SHERWOOD et al. 1982). Bei Aufbewahrungstemperaturen von 4 bis 8° C ließen sich Infektionen auch mit 12 Monate alten Oozysten durchführen (CURRENT 1990). Zu b. Ein Vergleich der Infektionsdosen, bei der 50 % der Mäuse erkranken (ID 50) zeigt, dass bei ERNEST et al. (1986) und RIGGS u. PERRYMAN (1987) 500-1000 Oozysten zur Infektion notwendig waren, während FINCH et al. (1993) nur 79 Oozysten benötigten. LINDSAY (1987) verwendete zwischen 1 x 105-1 x 107 Oozysten für experimentelle Infektionen. Die benötigte Infektionsdosis hängt vom Alter der zu infizierenden Mäuse ab. Je jünger die Mäuse bei der Infektion waren, desto geringer war die Anzahl der Oozysten, die notwendig war, um eine Infektion auszulösen (LINDSAY 1987). Zu c. Die Behandlung Methylprednisolon), erwachsener die eine Mäuse mit Medikamenten Immunsuppression (Dexamethason, hervorrufen, förderte bei Applikation von C.-parvum-Oozysten die Infektion (SHERWOOD et al. 1982, KIMATA et al. 1991, RASMUSSEN u. HEALEY 1992, PETRY et al. 1995) mit Ausscheidungsraten, die zur Gewinnung von größeren Mengen an Oozysten genutzt werden konnten und somit eine Alternative zur Parasitenpassagierung im Lamm oder Kalb sein könnte (PETRY et al. 1995). Zu d. C.-parvum-Infektionen konnten in vielen Mäuserassen experimentell erzeugt werden (Tab.4). SHERWOOD et al. (1982) untersuchten die Empfänglichkeit für C. parvum in verschiedenen Mäuserassen. Die ”Schneider Swiss White”-Maus, die ”Porton”- 50 Maus, fünf Inzuchtstämme (CBA, CBA Nude, C57 Black, BALB/c) und ein haarloser Mäusestamm (HR/HR-ADR) waren empfänglich für C.-parvumInfektionen, erkrankten aber lediglich subklinisch. Zu e. Wenn die Mäuse älter wurden, verloren sie die Empfänglichkeit für C.-parvumInfektionen. Ab einem Alter von 21 Tagen konnten keine experimentellen Infektionen hervorgerufen werden (SHERWOOD et al. 1982). Neonatale Mäuse waren dagegen empfänglich für C. parvum (Tab.4). Das optimale Alter zur Infektion in ICR-Auszucht-Mäusen lag bei 8 bis 9 Tagen (UPTON u. GILLOCK 1986). Die Empfänglichkeit für C.-parvum-Infektionen blieb bis zum Alter von 14 Tagen erhalten (NOVAK u. STERLING 1991). Zu f. In den meisten Untersuchungen wurden die C.-parvum-Oozysten oral direkt in den Magen appliziert (SHERWOOD et al. 1982, ERNEST et al. 1986, RIGGS u. PERRYMAN 1987, VITOVEC u. KOUDELA 1988, FINCH et al. 1993, LINDSAY et al. 2000), aber auch eine Applikation in das Rektum (RIGGS u. PERRYMAN 1987), in den Uterus (LIEBLER et al. 1986) oder in die Trachea (MEULBROECK et al. 1991) ist möglich und führt dort zu lokalen C.-parvum-Infektionen. Unabhängig von der Infektionsroute zeigten die Mäuse keine klinischen Krankheitsmerkmale und makroskopische Läsionen waren ebenfalls nicht erkennbar. Lichtmikroskopisch konnten Läsionen vor allem im hinteren Jejunum, Ileum, Caecum und vorderen Colon erkannt werden. Die Mikrovilli der Enterozyten waren ab dem 2. Tag p.i. atrophiert und Mikrovilliläsionen waren ab dem 3. Tag p.i. feststellbar. Die Propria wies eine Entzündungsinfiltration auf. Die pathologischen Veränderungen korrelierten mit dem Grad des Befalls (VITOVEC u. KOUDELA 1988). Die Parasitenausscheidung begann ab dem sechsten Tag p.i. (REESE et al. 1982) und hielt für durchschnittlich 9,5 Tage an (ERNEST et al. 1986). Im wesentlichen ergab das Mäuse-Tiermodell die gleichen Ergebnisse wie Studien an Zellkulturen (CURRENT u. HAYNES 1984, LINDSAY et al. 2000). 51 Tabelle 4: Infektion von verschiedenen Mäuserassen und deren Infektionstermin Alter der Mäuse zu Mäuserassen Infektionsbeginn BALB/c CD-1 Autor 8. Tag RIGGS u. PERRYMAN 1987 bis 3. Tag FAYER 1995 1 u. 7. Tag VITOVEC u. KOUDELA 1988 8. Woche LIEBLER et al. 1986 4. Tag FINCH et al. 1993 1. – 6. Tag SHERWOOD et al. 1982 5. Tag ERNEST et al. 1986 3. – 5. Tag CURRENT u. REESE 1986 4. – 12. Tag UPTON u. GILLOCK 1986 2. Tag LINDSAY et al. 2000 8. – 12. Woche / PETRY et al. 1998 mit Vorbehandlung PETRY et al. 1995 CBA, CBA Nude, C57 Black, BALB/c, Porton, HR, HRADR Swiss-Webster ICR C57/6 Adulte Ratten können ebenfalls als Tiermodell für C.-parvum-Infektionen dienen. Die Ratten wurden vor der Infektion durch s.c. Injektionen mit Methylprednisolonazetat (MEULBROECK et al. 1991), Hydrokortison (BRASSEUR et al. 1988) oder Dexamethason (REGH 1991a u. b) immunsupprimiert oder es wurden Tiere ohne Thymus verwendet (LINDSAY 1997). Ratten sind durch intratracheale Inokulation von C.-parvum-Oozysten infizierbar und entwickelten Husten, Lethargie und Gewichtsverlust (MEULBROECK et al. 1991). Sie schieden nach Verabreichung von 1 x 105 Oozysten im Trinkwasser vom 7. bis 23. Tag p.i. Oozysten aus (BRASSEUR et al. 1988). 52 3. EIGENE UNTERSUCHUNGEN 3.1 Material und Methoden Verwendete Geräte: Zentrifuge (Megafuge 1.0 R, Heraeus, Hanau) Zentrifuge (neoLab 16/18 Mikrozentrifuge für Reaktionsgefäße) Zentrifugen (Minifuge T, Heraeus Sepatech; Cryofuge 6-6, Heraeus Christ GmbH, Osterode/Harz) Waage (Sartorius 1204 MP, Göttingen) Reagenzglasschüttler (Reax 2000, Omnilab, Hannover) Wasserstrahlpumpe Sterilbank (CEAG-Schirp-Reinraumtechnik, Dortmund) Brutschrank (Biocenter 2001, Salvis) Mikroskop (Zeiss, Oberkochen u. Leica DMLB, Wetzlar) Neubauer-Zählkammer (Brand) 3.1.1. C.-parvum-Gewinnung 3.1.1.1. Parasitenmaterial Die in den Versuchen verwendeten C.-parvum-Oozysten stammen von Dr. Franz Petry aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene der Johannes GutenbergUniversität Mainz. Es handelt sich hier um C. parvum “IOWA”, da die ursprüngliche Isolierung der Parasiten im Staat Iowa der USA stattgefunden hat. Um eine ausreichende Anzahl Parasiten zur Verfügung zu haben und ein Alter des Infektionsmaterials von weniger als 3 Monaten zu gewähren, war es erforderlich, C. parvum dreimal im Laufe der Versuche zu passagieren. 53 3.1.1.2 Passagierung im Kalb Material: Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3, Roth, Karlsruhe) Natriumchlorid (NaCl, Roth, Karlsruhe) Kaliumchlorid (KCl, Merck, Darmstadt) Glukose (α-D(+)-Glukose Monohydrat, Roth, Karlsruhe) Leitungswasser Schutzkleidung (Overall, Stiefel, Handschuhe) Kälberstand für die Einzelhaltung mit Möglichkeit der separaten Kotgewinnung Wasserkocher Meßbecher Eimer zum Auffangen des Kotes Fieberthermometer Zucker-Elektrolytlösung (UNGEMACH 1998): 111 mmol/l Glukose 90 mmol/l Na 80 mmol/l Cl 30 mol HCO3 dies entspricht bei Zubereitung einer 10fach konzentrierten Elektrolytlösung: 25,2 g NaHCO3 14.9 g KCl 35,1 g NaCl ad 1 Liter H2O 54 Zubereitung zur Verwendung: 10 x Salzlösung Fütterung : 0,5 l Glukose 100 g Leitungswasser ad 5 l 2-3 x täglich, 37 °C Durchführung: Für die Passagierung von C. parvum wurden zwei bis vier Tage alte Bullenkälber der Rasse “Schwarzbunte” verwendet. Am Tag der Geburt wurden die Kälber mit Kolostrum versorgt und anschließend mit Milchaustauscher gefüttert. Während der Passagierung wurden die Kälber in Einzelhaltung gehalten (Abb.1). Am fünften Lebenstag wurden die Kälber mit 1 x 107 C.-parvum-Oozysten oral infiziert. Der Kot der Kälber wurde nun täglich auf das Vorhandensein von C.-parvum-Oozysten untersucht (siehe Kap. 3.1.1.5 u. Abb. 2). Sobald die Oozystenausscheidung begann, wurde die Fütterung des Kalbes von Milchaustauscher auf Elektrolytlösung umgestellt, um durch die Reduzierung des Fettanteils im Kot die Kotaufbereitung zu erleichtern. Während der gesamten Passagierung hatten die Kälber Wasser zur freien Verfügung. Die Kälber wurden in dieser Zeit täglich allgemein untersucht und ihre Körpertemperatur gemessen. Kot und Harn wurden zusammen in einer Wanne unterhalb der Kälberbox aufgefangen, in Eimern gesammelt und bis zur weiteren Verarbeitung in einem Kühlraum gelagert. Wenn genügend Oozysten gewonnen waren oder die Ausscheidungsrate stark abnahm, wurde die Fütterung wieder auf Milchaustauscher umgestellt. Die Kälber wurden weiterhin auf C. parvum untersucht und nach ihrer Genesung zurück in die Gruppenhaltung gebracht. 55 Abb.1: Kalb während der Passagierung in einer Kälberbox mit Auffangbehälter Abb.2: C.-parvum-Oozysten im Hämatozytometer zur Ermittlung der Oozystenzahl (Phasenkontrastmikroskop, 400fache Vergrößerung) 56 3.1.1.3 Anreicherung der C.-parvum-Oozysten Material: Leitungswasser Plastikeimer (5 Liter) Holzspatel Plastikspritzflasche Plastikmeßbecher Metallsiebe (Maschengröße: 2000 µm, 250 µm, 125 µm, 60 µm, 20 µm, Durchmesser: 22 cm) Zentrifugenbecher Durchführung: Das Kot-Harngemisch wurde mit Hilfe von Holzspatel und Wasserspritzflasche durch die Metallsiebe von der größten bis zur feinsten Maschenweite gefiltert. Die ablaufende Flüssigkeit wurde in Zentrifugenbecher gefüllt und bei 2500 x g für 10 min zentrifugiert. Mit der Wasserstrahlpumpe wurde vorsichtig die Flüssigkeit bis ca. 1 cm über dem entstandenen Bodensatz abgesaugt. Mit Hilfe der Spritzflasche oder durch Aufschütteln wurde das Pellet vom Boden des Zentrifugenbechers gelöst und in einen Plastikmeßbecher überführt. Während der Anreicherungsschritte wurde laufend die Sedimentation der Oozysten überprüft (siehe Kap. 3.1.1.8). Im Anschluß an den Zentrifugationsschritt befanden sich in dem gewonnenen Oozystenkonzentrat noch Verunreinigungen, die mit weiteren Reinigungsschritten entfernt wurden. 57 3.1.1.4 Reinigung der C.-parvum-Oozysten Reinigung mit Diethylether Material: Diethylether (Roth, Karlsruhe) Leitungswasser Holzspatel Plastikzentrifugenröhrchen (50 ml/15 ml, Techno Plastic Products (TPP) AG, Trasadingen, Schweiz) Zentrifugenröhrchenständer Bechergläser (250 ml) Durchführung: In ein 50 ml Zentrifugenröhrchen wurden ca. 35 ml der Oozystensuspension gefüllt. Die Oozystensuspension wurde so weit mit Wasser verdünnt, bis eine homogene Suspension entstand. Das Zentrifugenröhrchen wurde mit ca. 10 ml Ether aufgefüllt und 5 Sekunden auf dem Reagenzglasschüttler gemischt, bis sich die Etherphase in der wässrigen Phase gleichmäßig verteilte. Die Zentrifugenröhrchen wurden bei 2500 x g für 10 min zentrifugiert. Anschließend wurde die obere Etherphase mit dem Schmutzkuchen in der Interphase entfernt und die verbleibende Flüssigkeit mit dem Sediment mit Wasser aufgefüllt, auf dem Reagenzglasschüttler vermischt, bei 2500 x g für 10 min zentrifugiert und erneut das Pellet gewonnen. Anschließend wurde mit einer Pipette die Flüssigkeit bis zu einem Zentimeter über dem Pellet abgesaugt und erneut mit Wasser auf 50 ml aufgefüllt. Dieser Vorgang wurde mindestens dreimal wiederholt. Bis zur weiteren Verarbeitung wurde der Bodensatz in etwa 5 ml Wasser aufgenommen und bei 4 °C im Kühlschrank aufbewahrt. 58 Während der Aufarbeitung mit Ether wurde kontrolliert, wo sich die Oozysten nach den einzelnen Bearbeitungsschritten befanden (siehe Kap. 3.1.1.5). Wenn viele Oozysten in der Interphase zu finden waren, wurde diese nochmals aufgereinigt. Reinigung mit Natriumhypochlorit Material: Natriumhypochlorit (12 % freies Chlor, Roth, Karlsruhe) eisgekühltes Leitungswasser Eis Plastikzentrifugenröhrchen (50/15 ml, TPP, Trasadingen, Schweiz) Plastikpasteurpipetten (152 mm, 0,5 ml, TPP) Durchführung: Nach der Etheraufbereitung wurde das letzte Sediment mit Wasser aufgeschwemmt, mit einer Natriumhypochloritlösung mit 3,8 % Chlor im Verhältnis 1:20, bei starker Verunreinigung bis zu einem Verhältnis von 1:10 gemischt und für 5 min auf Eis inkubiert. Im Anschluß erfolgte eine Zentrifugation bei 2500 x g für 10 min. Das verbliebene Sediment wurde noch mindestens dreimal mit gekühltem Wasser aufgeschwemmt und erneut zentrifugiert, bis der Geruch von Chlor nur noch geringfügig vorhanden war. Das Pellet wurde gleich weiter bearbeitet oder mit ca. 5 ml Wasser aufgeschwemmt und im Kühlschrank bei 4 °C gelagert. 59 Reinigung mit gesättigter Salzlösung Material: gesättigte Kochsalzlösung eisgekühltes destilliertes Wasser Leitungswasser Plastikzentrifugenröhrchen (15 ml, TPP-AG, Trasadingen, Schweiz) Reaktionsgefäß (0,5 ml, Eppendorf, Hamburg) Glaspasteurpipetten (230 mm, Roth) Plastikpasteurpipetten (152 mm, 0,5 ml, TPP-AG, Trasadingen, Schweiz) Plastikpipetten (25 ml, gestopft, steril, Nunc, Wiesbaden) Plastikpipetten (10 ml, gestopft, steril, Roth, Karlsruhe) Pipettierhilfe (Powerpette, Jencons, Bedfordshire, England) Durchführung: Im Anschluß an die letzte Zentrifugation zur Auswaschung des Natriumhypochlorits wurde die Flüssigkeit bis auf wenige Millimeter über dem Pellet abgesaugt und das Pellet mit gesättigter Salzlösung in einem 15 ml Plastikzentrifugenröhrchen resuspendiert. Das Röhrchen wurde mit gesättigter Salzlösung bis auf 10 ml Volumen aufgefüllt, durchmischt und vorsichtig mit 1-2 ml destilliertem Wasser überschichtet. Die Röhrchen wurden für 10 min bei 2300 x g ungebremst zentrifugiert. Mit einer Glaspasteurpipette wurden vorsichtig die obere wässrige Phase und die Interphase, in der sich die gereinigten Oozysten befanden, aufgenommen. Diese Suspension wurde mit Leitungswasser aufgefüllt und erneut zentrifugiert. Die gewonnenen Pellets wurden in ca. 100 - 200 µl destilliertem Wasser aufgenommen und in einem 0,5-ml-Reaktionsgefäß gesammelt. Mit einer NeubauerZählkammer wurde die gewonnene Anzahl an Oozysten unter dem Mikroskop ermittelt (siehe Kap. 3.1.1.5 und Abb. 2) 60 Reinigung mit Percoll® Material: Percoll® (Amersham Pharmacia Biotech AG, Uppsala, Schweden) 10fach phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS: 400,0 g NaCl, 10,0 g KH2PO4, 57,5 g Na2HPO4, 10,0 g KCl ad 5000 ml Aqua destillata, pH 7,2) Plastikzentrifugenröhrchen (15 ml, TPP-AG, Trasadingen, Schweiz) Plastikpipetten (25 ml, gestopft, steril, Nunc, Wiesbaden) Plastikpipetten (5/10 ml, gestopft, steril, Roth, Karlsruhe) Pipettierhilfe (Powerpette, Jencons, Bedfordshire, England) Glaspasteurpipette (230 mm, Brand) Pipette (Gilson Pipetman, Gilson Medical Eletronics, Frankreich) Pipettenspitzen (5-200 µl, Wörl Kunststofftechnik, München) Durchführung: Percoll®-Verdünnungen in Konzentrationen von 100 %, 75 %, 35 % und 5 % in PBS wurden nach Herstellerangaben angesetzt und in Zentrifugenröhrchen vorsichtig geschichtet. Zuunterst wurden 2 ml Iso-Percoll® vorgelegt und aufsteigend mit 2,5 ml 75 % igem, 2,5 ml 35 % igem und 2,5 ml 5 % igem Percoll® überschichtet. Zum Schluß wurden ein bis zwei Milliliter der Oozystensuspension, die nach der Etherreinigung gewonnen wurde, als oberste Schicht auf den Percollgradienten pipettiert. Es folgte eine ungebremste Zentrifugation bei 1900 x g für 15 min. Anschließend wurden die Schichten zwischen den unterschiedlichen Percollkonzentrationen vorsichtig herauspipettiert und unter dem Mikroskop untersucht. 61 3.1.1.5 Mikroskopischer Nachweis von C.-parvum-Oozysten (HEINE 1982) Material: Glaspasteurpipetten (230 mm, Brand) Plastikpasteurpipetten (152 mm, 0,5 ml, Elkay) Deckgläser (18 x 18 mm, IDL, Nidderau) Objektträger (76 x 26 mm, IDL, Nidderau) Karbolfuchsin Immersionsöl Durchführung: Mit einer Pasteurpipette wurden Proben aus Eimern, Sieben und Zentrifugenbechern entnommen, jeweils ein Tropfen der Probe mit einem Tropfen Karbolfuchsin auf einem Objektträger gemischt, dünn ausgestrichen und luftgetrocknet. Anschließend wurde der Objektträger mit einem Tropfen Immersionsöl und einem Deckgläschen bedeckt und bei 400facher Vergrößerung mikroskopiert. Die Oozysten stellten sich als nicht anfärbbare lichtbrechende Gebilde mit einem Durchmesser von 5 – 6 µm dar (Abb. 2 u.3). Während der einzelnen Aufarbeitungsschritte wurde laufend kontrolliert, wo sich die Oozysten befanden. 62 Abb. 3: C.-parvum-Oozysten im Hämotozytometer nach Anreicherung in gesättigter Kochsalzlösung (Phasenkontrastmikroskop, 400fache Vergrößerung) Abb. 4: C.-parvum-Oozysten im Hämatozytometer nach 120 min Einwirkzeit in 4 % Neopredisan®. Die Oozysten weisen morphologische Veränderungen in Form von Einziehungen Vergrößerung) der Oberflächen auf (Phasenkontrastmikroskop, 400fache 63 3.1.2. Desinfektion der C.-parvum-Oozysten Material: Neopredisan® (Chlorokresol 25 % ig, Menno-Chemie-Vertrieb, Norderstedt) Isopropanol (Roth, Karlsruhe) Leitungswasser Pipette (Gilson Pipetman, Gilson Medical Eletronics, Frankreich) Pipettenspitzen (5-200 µl, 101-1000 µl, Wörl Kunststofftechnik, München) Pipettenspitzen (0,5-10 µl, Sorenson Bio Science, USA) Plastikzentrifugenröhrchen (15 ml, TPP-AG, Trasadingen, Schweiz) Durchführung: Neopredisankonzentrationen im 1,1fachen Ansatz (0,069 - 4,44%) der gewünschten Endkonzentration wurden hergestellt. Die zuvor mit Diethylether und Natriumhypochlorit gereinigten Oozysten (9 x 105 bis 1,5 x 106 je Ansatz) wurden im Verhältnis von 1:10 mit den zuvor angesetzten Neopredisanverdünnungen mittels Reagenzglasschüttler vermischt, so dass Neopredisan®-Endkonzentrationen von 0,0625 % bis 4 % erreicht wurden. Es erfolgte eine Inkubation der Oozysten bei Zimmertemperatur für mindestens 30 bis maximal 180 min in 15 ml Plastikzentrifugenröhrchen. Parallel dazu wurden Oozysten in der gleichen Anzahl in Leitungswasser den gleichen Temperaturen und Zeiten ausgesetzt. Im Anschluß an die Inkubation wurde den Suspensionen mit hohen Neopredisankonzentrationen (1% und mehr) so viel Isopropanol zugesetzt, bis sich ausgefälltes Neopredisan® löste und die Lösungen wieder klar wurden. Außerdem wurden alle Ansätze mit Leitungswasser auf 15 ml aufgefüllt und für 10 min bei 2500 x g zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde die Flüssigkeit bis auf ca. 0,5 ml abgesaugt, erneut aufgefüllt und zentrifugiert. Dieser Arbeitsschritt wurde viermal wiederholt und beim letzten Schritt wurden die Oozysten mit einer Glaspasteurpipette in ca. 500 µl A. dest. resuspendiert. Ein Aliquot wurde unter dem Mikroskop untersucht und gezählt (siehe Kap. 3.1.1.5 und Abb.4). 64 3.1.3 C. parvum in der Zellkultur 3.1.3.1 Anlage einer HCT-8 Zellkultur Zelllinie: HCT-8-Zellen (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA) Verbrauchsmaterial: Spritzenvorsatzfilter (0,2 µm, Renner GmbH, Dannstadt) Pipette (Gilson Pipetman, Gilson Medical Eletronics, Frankreich) Pipettenspitzen (5-200 µl, 101-1000 µl, Wörl Kunststofftechnik, München) Pipettenspitzen (0,5-10 µl, SØrenson Bio Science, USA) Plastikzentrifugenröhrchen (15 ml, TPP-AG, Trasadingen, Schweiz) Plastikpipetten (Volumen: 25 ml, gestopft, steril, Nunc, Wiesbaden) Plastikpipetten (Volumen: 5/10 ml, gestopft, steril, Roth, Karlsruhe) Pipettierhilfe (Powerpette, Jencons, Bedfordshire, England) Zellkulturflasche (Filtertopflaschen, Schräghals, Oberfläche: 75 cm2, Volumen: 250 ml, Greiner) Zellkulturtestplatten (48 Kalotten, 0,5 ml, 1,1 cm2, Nunc, Wiesbaden) Handschuhe (nicht steril, Unigloves GmbH, Troisdorf) Chemikalien und Lösungen: RPMI-1640 ohne Glutamin (GIBCO, BRL, Eggenstein) DMEM ohne Natriumpyruvat (GIBCO, BRL, Eggenstein) Penicillin ( 100 U/ml, GIBCO, BRL, Eggenstein) Streptomycin (100 µg/ml, Verviers, Belgien) EDTA-Trypsin 10x (SIGMA, Steinheim) 65 Fetales Kälberserum (FKS: GIBCO, BRL, Eggenstein) 10fach phosphatgepufferte Kochsalzlösung (siehe Kap. 3.1.1.7) Desinfektionsmittel für den Brutschrank (Barricidal, Schröder, Stuttgart) Mediumzusätze: 1 % L-Glutamin (FLUKA, Buchs, Schweiz) 10 % FKS (GIBCO, BRL, Eggenstein) 15 mM HEPES von einer 1 M Stammlösung (SIGMA, Steinheim) 50 mM Glukose (α-D(+)-Glukose Monohydrat, Roth, Karlsruhe) 35 µg Ascorbinsäure (Merck, Darmstadt) 1 µg Folsäure (SIGMA, Steinheim) µg 4-Aminobenzoesäure (SIGMA, Steinheim) 2 µg Kalziumpanthotenat (FLUKA, Buchs, Schweiz) 0,1 U Insulin (SIGMA, Steinheim) 100 U Penicillin (Biowhittaker) 100 µg Streptomycin (Verviers, Belgien) 0,25 µg Fungizone® (SIGMA, Steinheim) auf 100 ml Mediumansatz. Durchführung: Die Zellkulturarbeiten fanden unter sterilen Bedingungen an einer Sterilbank statt. Es wurden Handschuhe getragen und sämtliche Materialien waren steril beim Gebrauch. Die Öffnungen und Verschlüsse der Glasgefäße und Zellkulturflaschen wurden vor dem Öffnen und vor dem Verschließen über eine Gasflamme gehalten, um so die Sterilität zu bewahren. Medien wurden nach Zusammenstellung der einzelnen Komponenten sterilfiltriert. 66 HCT-8 Zellen, die in flüssigem Stickstoff eingefroren waren, wurden bei Zimmertemperatur aufgetaut und in Zellkulturflaschen, die bereits ca. 25 ml Wachstumsmedium (RPMI 1640 mit 10 % FKS und 1 ml Penicillin/Streptomycin (1 ml = 100 Einheiten Penicillin und 100 µg Streptomycin) enthalten, pipettiert. Die Zellen wurden im Brutschrank bei 37 °C, 5 % CO2 und 70 % Luftfeuchtigkeit inkubiert. Täglich wurde das Wachstum unter dem Mikroskop kontrolliert und bei ca. 75 %iger Konfluenz (bzw. im Abstand von 3 Tage) wurden die Kulturen zur Teilung der Zellanzahl trypsiniert. Hierzu wurde das Zellmedium abpipettiert, die HCT-8-Zellen mit ca. 5 ml PBS-Lösung bedeckt, einige Sekunden die Zellkulturflasche geschwenkt und die Pufferlösung wieder abpipettiert. Anschließend wurde ca. 3 ml 0,5 %iges Trypsin auf die Zellen pipettiert, 10 min im Brutschrank bei 37 °C, 5 % CO2 inkubiert und dann unter dem Mikroskop das Ablösen der Zellen kontrolliert. Das Trypsin mit den Zellen wurde in ein Zentrifugenröhrchen pipettiert und bei 500 x g für 5 min zentrifugiert. Anschließend wurde die Flüssigkeit abgegossen und die Zellen mit einer Pipette wieder in neuem Wachstumsmedium aufgenommen. Zur Teilung der Zellen wurden 1/5 bis 1/6 der Zellen wieder neuem Medium in einer neuen Zellkulturflasche zugesetzt. In einem Vorversuch wurde nach einem optimalen Zellkulturmedium gesucht und unter Verwendung von Mediumzusätzen, wie sie auch von UPTON et al. (1994) verwendet wurden, das Zellwachstum unter dem Mikroskop beobachtet. Die einzelnen Mediumzusätze wurden zuvor in bestimmten Konzentrationen steril angesetzt, portioniert und zur Lagerung eingefroren. Weiterhin wurden 100 ml DMEM und RPMI 1640 Zellmedium mit jeweils 10 % FKS und 1 ml Penicillin/Streptomycin (1 ml = 100 Einheiten Pen. und 100 µg Strept.) verwendet. Um das Wachstum unter verschiedenen Bedingungen vergleichen zu können, wurden in Zellkulturtestplatten 102 –105 HCT-8-Zellen mit jeweils 500 µl Medium je Vertiefung eingesät. 67 3.1.3.2 Lagerung der HCT-8-Zellkultur Material: Materialien wie in Kap. 3.1.3.1 beschrieben Dimethylsulfoxid (DMSO, Serva, Feinbiochemika, Heidelberg) FKS (GIBCO, BRL, Eggenstein) Cryo-Gefäße (1,5 ml, Roth, Karlsruhe) Flüssiger Stickstoff Stickstoff-Behälter Tiefgefrierschrank -80 °C Durchführung: Die HCT-8-Zellen wurden wie bei der in Kap. 3.1.3.1 beschriebenen Trypsinierung gewonnen und nach der Zentrifugation in FKS aufgenommen. Mit einer Neubauer-Zählkammer wurde die Anzahl HCT-8-Zellen festgestellt und durch entsprechende Verdünnung mit FKS wurden Zelldichten von 3-5 x 106/ml eingestellt. In Cryoröhrchen wurden jeweils 900 µl HCT-8Zellen in FKS und 100 µl DMSO pipettiert, die Gefäße verschlossen und vorsichtig geschwenkt. Die Gefäße wurden in einen Styroporkarton, der mit losem Zellstoff oder Papier gefüllt war, gestellt und dieser wiederum in einem Tiefgefrierschrank mit einer Temperatur von -80 °C für 24 Stunden gelagert. Anschließend konnten die Gefäße mit den gefrorenen HCT-8-Zellen in einen Behälter mit flüssigem Stickstoff überführt werden. 68 3.1.3.3 Vitalitätsüberprüfung der HCT-8-Zellkultur Material: Materialien wie in Kap. 3.1.3.1 beschrieben RPMI-Medium mit und ohne FKS Neopredisan® (Chlorokresol 25 %ig, Menno-Chemie-Vertrieb, Norderstedt) Isopropanol (Roth, Karlsruhe) Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (siehe Kap. 3.1.1.4) Methyl-Thiazolblau (MTT, 2 mg/ml, Roth, Karlsruhe) Zellstoff (Roth, Karlsruhe) Photometer (Intermed-Immuno-Reader, NJ 2000, Japan) Schwenker (Rocky Typ RT-1S, Wasserburg, Fröbel Labortechnik) Zellkulturtestplatte (96 well, Arbeitsvolumen: 0,34 ml/well, 0,31 cm2, Nunc, Wiesbaden) Testplattenrüttler Durchführung: Die Vitalität von Zellen wurde anhand der mitochondrialen Enzymaktivitäten in den Mitochondrien überprüft. MTT wird von den Mitochondrien-Enzymen um so stärker umgesetzt, je aktiver die Zellen sind, bzw. je stärker die Zellen wachsen. Hierbei entsteht durch den Enzymabbau ein blauer Niederschlag, der in Alkohol löslich ist und im Photometer gemessen werden kann. In die Zellkulturtestplatte wurden HCT-8-Zellen in den Konzentrationen von 0, 5 x 104 , 2,8 x 104, 1,4 x 104 und 5 x 103 HCT-8-Zellen/Kalotte eingesät und für 48 Stunden wie in Kap.3.1.3.1 beschrieben inkubiert. Anschließend wurde das Wachstumsmedium abpipettiert und durch Medium mit Neopredisan® in unterschiedlichen Konzentrationen (0 %, 0,2 %, 0,002 %, 0,0002 %, 0,00002 %) ersetzt. Nach Inkubation der HCT-8-Zellen für weitere 24 h 69 wurde das Medium abpipettiert, neues Medium ohne FKS hinzugegeben und für weitere 3 Stunden inkubiert. Dann wurde das Medium erneut abgesaugt und die Platte auf Zellstoff ausgeschlagen. Es wurden bis auf eine Kontrollreihe ohne Neopredisan® in jede Vertiefung 100 µl MTT-Lösung pipettiert. In die Kontrollreihe wurde PBS pipettiert. Die Zellkulturtestplatte wurde für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde zunächst das PBS und anschließend die MTT-Lösung abpipettiert, die Platte ausgeschlagen, in jede Vertiefung 100 µl Isopropanol gegeben und die Platte für 10 min gerüttelt und anschließend bei 600 nm mit einem Photometer ausgewertet. 3.1.3.4 Infektion der HCT-8-Zellkultur mit C. parvum Material: Materialien wie in Kap. 3.1.3.1 beschreiben Materialien wie in Kap. 3.1.1.3 beschrieben C. parvum-Oozysten behandelt/unbehandelt Zellkulturtestplatten (48 Kalotten, Nunc, Wiesbaden) Zellkulturtestplatte (96 well, Arbeitsvolumen: 0,34 ml/well, 0,31 cm2, Nunc, Wiesbaden) Lab-tek-chamber-slides (8 Kammern, Glas, 0,5-0,6 ml, 0,7 cm2 , Nunc, Wiesbaden) Durchführung: In die 48-Kalotten-Zellkulturtestplatten, bzw. in die Lab-tek-chamber-slides, wurden zunächst in jede Vertiefung 450 µl Wachstumsmedium (siehe Kap. 3.1.3.1) vorgelegt und dann je Vertiefung 1 x 105 HCT-8-Zellen eingesät. Entsprechend wurden in 96-KalottenZellkulturtestplatten 100 µl Wachstumsmedium und 3-4 x 104 HCT-8-Zellen eingesät. Die Zellen wurden 24 bis 48 h, bzw. bis eine 70 %ige Konfluenz der Zellen erreicht war, im Brutschrank (37 °C, 5 % CO2) inkubiert. Das Medium wurde gegen neues Medium 70 ausgetauscht und die zuvor gezählten behandelten und unbehandelten Oozysten wurden in Konzentrationen von 1 x 100 bis 1 x 105 jeweils zu einer Vertiefung bewachsener HCT-8Zellkultur pipettiert. Nach 24 Stunden wurde das alte Medium mit den Oozystenhüllen und den Oozysten, die keine HCT-8-Zellen infizierten, entfernt. Durch dreimaliges Waschen der HCT-8-Zellen mit je 500 µl PBS (48-Kalotten), bzw. 100 µl PBS (96-Kalotten) wurden weitere Reste entfernt. Es erfolgte anschließend das Hinzufügen von neuem Wachstumsmedium (500/100 µl) und eine weitere Inkubation für 24 h im Brutschrank. 3.1.3.5 Inhibition von C. parvum in vitro mit Paromomycin Material: Materialien wie in Kap. 3.1.3.1 beschrieben C.-parvum-Oozysten unbehandelt Paromomycin (SIGMA, Steinheim) Durchführung: Dieser Verscuh orientierte sich an der in vitro Studie von MARSHALL u. FLANIGAN (1992). HCT-8-Zellkulturen wurden in 48-Kalotten-Zellkulturtestplatten und Lab-tekchamber-slides angelegt (siehe Kap. 3.1.3.4). Nach einer 24-stündigen Inkubation wurde das alte Wachstumsmedium (siehe Kap. 3.1.3.1) entfernt und je Vertiefung im Lab-tek-chamberslide, bzw. Testplatte wurden 1 x 105 C.-parvum-Oozysten, die in verschiedenen Paromomycinkonzentrationen (0 %, 0,005 %, 0,05 %, 0,5 % und 5% Paromomycin in PBS) suspendiert waren, in die jeweiligen Ansätze pipettiert. Die Kulturen wurden für zwei Stunden im Brutschrank inkubiert. Anschließend wurde die Oozystensuspension entfernt und die Zellkulturoberfläche dreimal mit PBS-Lösung gespült (siehe Kap. 3.1.3.4). Es erfolgten weitere Inkubationen für 6, 24 und 48 Stunden p.i. von Zellkulturen, die mit unbehandelten Oozysten infiziert worden waren. Die Lab-tek-chamber-slides wurden nach Giemsa gefärbt 71 (siehe Kap. 3.1.3.6) und mikroskopisch untersucht. Aus den infizierten HCT-8-Zellkulturen in der Multischale wurde DNA für die PCR extrahiert (siehe Kap 3.1.4.1). 3.1.3.6 Ernte der Zellkultur zur mikroskopischen Untersuchung Material: Materialien wie in Kap. 3.1.3.1 beschrieben Methanol (70 %, Roth, Karlsruhe) Giemsa-Lösung Durchführung: Das Medium wurde abgesogen und die Zellkultur erneut mit PBS gewaschen. Die Kammeraufteilung wurde entfernt, die Objektträgeroberfläche mit PBS gespült und an der Luft getrocknet. Es erfolgte eine Fixierung in Methanol für 10 min und die Färbung mit Giemsa-Gebrauchslösung auf einer Färbebrücke für weitere 20-30 min. Mit einem Wasserstrahl wurde von der Seite die Giemsa-Gebrauchslösung abgespült und der Objektträger luftgetrocknet. 72 3.1.4 PCR von C. parvum 3.1.4.1 Ernte der Zellkultur für die PCR Material: Materialien wie in Kap.3.1.3.1 beschrieben M-Guanidiniumchlorid-Lösung (SIGMA, Deisenhofen) Reaktionsgefäße (2,0 ml, Eppendorf, Hamburg) Durchführung: Für jede Probe, bzw. Vertiefung wurde eine neue Pipettenspitze verwendet, um Kontaminationen der Proben zu vermeiden. In jede Vertiefung einer Zellkulturtestplatte (48 Kalotten) wurde 350 µl Guanidiniumchlorid-Lösung zur Lysis der Zellkulturen gegeben und die Suspension in ein Reaktionsgefäß überführt. Bei einer Zellkulturtestplatte mit 96 Kalotten wurden je Vertiefung 100 µl Guanidiniumchlorid-Lösung verwendet. 3.1.4.2 Extraktion genomischer C.-parvum-DNA 3.1.4.2.1 Ethanolfällung Material: Untersuchungsmaterial (Kap.3.1.4.1) Steriles Aqua destillata (A. dest.) Ethanol (95 %, 70 %, unvergällt, Roth, Karlsruhe) Reaktionsgefäße (2,0 ml, Eppendorf, Hamburg) Proteinase K (10 mg/ml, PROMEGA, Mannheim) 20 % N-Lauroylsarkosin (FLUKA, Buchs, Schweiz) 7,5 M Ammoniumazetat (FLUKA, Buchs, Schweiz) 73 Thermoblock (Scientific Thermolyne Corp., USA) Zentrifuge (Z 160 M Brushless Microzentrifuge, Hermle) Wasserbad Handschuhe (nicht steril, Unigloves GmbH, Troisdorf) Durchführung: In jedes Reaktionsgefäß mit lysierten Zellen wurden 25 µl Ammoniumacetat, 25 µl NLauroylsarkosin und 3,75 µl Proteinase K/350 µl Guanidiniumchlorid-Lösung, bzw. 7,5 µl Ammoniumacetat, 7,5 µl N- Lauroylsarkosin und 2 µl Proteinase K/100 µl Guanidiniumchlorid-Lösung pipettiert. Die Proben wurden für 60 min in einem Thermoblock bei 60 °C inkubiert und anschließend bei Raumtemperatur abgekühlt. Zu jeder Probe wurden 875 µl Ethanol (90 %) pipettiert, das Reaktionsgefäß verschlossen und vorsichtig geschwenkt, bis ein DNA-Faden im Ethanol sichtbar war. Für 20 min wurden alle Proben bei 14000 x g zentrifugiert, dabei waren alle Röhrchen in der Zentrifuge zur gleichen Seite ausgerichtet, um die Pellets nach der Zentrifugation besser lokalisieren zu können. Der gesamte Überstand wurde vorsichtig bis auf das heftende Pellet dekantiert. Nach Zugabe von 350 µl Ethanol (70 %) wurde das Pellet nochmals und für 10 min bei 14000 x g zentrifugiert, der Überstand wurde wieder dekantiert, die Reaktionsgefäße locker auf Zellstoff abgeklopft und die Pellets an der Luft getrocknet. Die Pellets wurden dann in je 50 µl A. dest. gelöst und bis zur weiteren Verwendung im Kühlschrank aufbewahrt. 3.1.4.2.2 Extraktion mit Phenol und Chloroform Material: Materialien aus Kap. 3.1.4.1.1. Phenol (pH 8.0, gepuffert mit Tris-HCl, Roth, Karlsruhe) Chloroform (Roth, Karlsruhe) 74 Durchführung: Durch die Extraktion mit Phenol wurden die Proben vor der weiteren Verarbeitung von Proteinen gereinigt. Vor der Fällung mit Ethanol wurde zu den Proben 1 Volumen-Äquivalent an Phenol gegeben und durch Schwenken gut vermischt. Nach Zentrifugation für 5 min bei 14000 x g wurde die entstandene obere Phase verworfen. Es wurde 1 Volumen-Äquivalent Chloroform hinzupipettiert und wieder für 5 min bei 14000 x g zentrifugiert. Das Chloroform wurde verworfen und der Schritt der Chloroformreinigung nochmals wiederholt. Anschließend wurde wie in Kap. 3.1.4.2.1 eine Ethanolfällung durchgeführt. 3.1.4.3 Auswahl der Primer Material: -Primer 1, CP 3.4 5´ (Reinigungsgrad: Standard, GIBCO, BRL, Eggenstein, siehe Tab.5) -Primer 2, CP 3.4 3´ (Reinigungsgrad: Standard, GIBCO, BRL, Eggenstein, siehe Tab. 5) -Wasser, steril Durchführung: Es wurden Oligonukleotid-Primer verwendet, die PETRY et al. (1998) von der Sequenz des Gens CP 3.4 ableiteten. Der Vorwärtsprimer umfaßt die Sequenzen in den Positionen 7 bis 26 und der Rückwärtsprimer ist komplementär zu den Positionen 637 bis 656. Die Sequenzen der Primer sind in Tabelle 5 dargestellt. Die lyophylisierten Primer wurden mit sterilem Wasser verdünnt zu einer Endkonzentration von 20 pmol/µl aufgenommen. 75 Tabelle 5: Primerkombination zur Amplifikation von C.-parvum-DNA aus infizierten Zellkulturen Primer Orientierung Sequenz (5´-3´) CP 3.4-5´ vorwärts 5´-GAT GGA TTA ATT GTT CCA CC-3´ CP 3.4-3´ rückwärts 5´-CCT CCA TTT TCA CCT TGT GG-3´ 3.1.4.4 Herstellung der Mastermixe für die PCR Material: Primer (siehe Kap. 3.1.4.3) A. dest. (steril) 25 mM Magnesiumchlorid (MgCl2, Promega, Wisconsin, USA) 10 x Puffer (Promega, Wisconsin, USA) Desoxyribonukleosidtriphosphate (je 100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP, Boeringer Mannheim) Taq-Polymerase (Promega, Wisconsin, USA) Mineralöl für die PCR (SIGMA, Deisenhofen) Reaktionsgefäße (1,5 ml, 2,0 ml, 0,5 ml, Safe-Lock, Eppendorf, Hamburg) Reaktionsgefäßeständer (TPP, Trasadingen Schweiz) Pipettenspitzen (gestopft, steril, Multi-Guard Tips, 0,5-10 µl, 1-200 µl, 100-1000 µl, SØrenson Bioscience, USA) Pipette (Gilson Pipetman, Gilson Medical Eletronics, Frankreich) Handschuhe (nicht steril, Unigloves GmbH, Troisdorf) 76 Durchführung: Alle Reagenzien und Materialien für die PCR, die direkten Kontakt zu den Proben hatten, waren steril und es wurde mit Handschuhen gearbeitet. Tabelle 6: Mastermix für die C. parvum-PCR einer Probe (50 µl) Material Stammlösung Endkonzentration Volumen (µl) A. dest. - - 32 Puffer 10 x 1x 5 Mg 25 mM 1,5 mM 3 100 mM dATP 100 mM dCTP dNTP´s 100 mM dGTP 0,5 mM 1 100 mM dTTP Primer1, CP 3.4-5` 20 pmol/µl 0,4 pmol/µl 1 Primer 2, CP 3.4-3` 20 pmol/µl 0,4 pmol/µl 1 Taq-Polymerase 5 U/µl 2,5 U/50 µl 0,5 Die dNTP´s hatten jeweils eine Ausgangskonzentration von 100 mM, wurden im Verhältnis 1 : 5 mit sterilem Wasser verdünnt, so dass die Endkonzentration jedes Probensatzes 0,5 mM betrug. Entsprechend zusammengestellt. der Proben wurde ein vielfacher Ansatz im Mastermix 77 3.1.4.5 Ansetzen der Reaktion Material: Materialien wie in Kap. 3.1.4.2 beschrieben Endprodukte aus der Bearbeitung nach Kap. 3.1.4.1.1. DNA-Proben (Kap. 3.1.4.1.1) Thermocycler (Hybaid, Omnigene LTD Teddington, USA) Zentrifuge (Biofuge A, Heraeus Sepatech) Durchführung: Vom Mastermix (Tab. 5) wurden in jedes steriles Reaktionsgefäß (0,5 ml) 45 µl vorgelegt. Zur Vermeidung der Verdunstung wurde jeder Ansatz mit einem Tropfen Mineralöl überschichtet. 5 µl von jeder DNA-Probe (siehe Kap. 3.1.4.4) wurden durch das Mineralöl in den Mastermix pipettiert und 2-3 sek in einer Minizentrifuge zentrifugiert, so dass sichergestellt war, dass sich die DNA in der wässrigen Phase befand. Die Reaktionsgefäße wurden in den Thermocycler gestellt und das PCR-Programm (siehe Tab. 7) (PETRY et al. 1998) gestartet. Nach Beendigung der Zyklen wurden die Proben auf 4 °C heruntergekühlt und bis zur weiteren Verwendung im Kühlschrank gelagert. Das PCR-Programm dauerte ca. zwei Stunden. 78 Tabelle 7: PCR-Programm zur Amplifikation C.-parvum-spezifischer DNA Zyklus 1. 2.-33. 34. Temperatur Inkubationsdauer Vorgang 94 °C 3 min Denaturierung 84 °C 45 sek Denaturierung 57 °C 45 sek Annealing 72 °C 1 min Extension 84 °C 45 sek Denaturierung 57 °C 45 sek Annealing 72 °C 1 min Extension 84 °C 45 sek Denaturierung 57 °C 45 sek Annealing 72 °C 11 min Extension 3.1.4.6 Nachweis der PCR-Produkte im Agarosegel 3.1.4.6.1 Ladung der Elektrophoresekammer Material: PCR-Produkte 100 bp-DNA-Marker (Promega, Wisconsin, USA) Ladungspuffer (6 ml: 3,4 ml TBE-Puffer, 2,0 ml Glycerol, 0,6 ml Bromphenol-Blau (0,1 %) 70 % Ethanol, vergällt (Roth) A. dest. Agarose für DNA-Elektrophorese (Roth, Karlsruhe) Erlenmeyerkolben (100 ml) 10 x TBE-Puffer (0,89 M Tris, 0,89 M Borsäure, 0,02 M EDTA, pH 8,0) 79 Reaktionsgefäße (0,5 ml, Eppendorf, Hamburg) Elektrophorese-Kammer mit Gelträger und Gelkämmen (Biorad Mini SUBTM DNA Cell, Biorad München) Klebeband Handschuhe (nicht steril, Unigloves GmbH, Troisdorf) Mikrowelle (Typ 6155.13, 1400 Watt, NEFF GmbH, Bretten) Mikrowellenfolie (Melitta Topits) Stromquelle (Biorad Power Pac 300, Biorad Model 1000/500 Power Supply) Durchführung: Zur Darstellung der PCR-Produkte wurden 1,5 %ige Agarosegele hergestellt. Zur Darstellung von genomischer DNA wurden 1 %ige Gele verwendet. 10 x TBE-Lösung wurde durch Zugabe von A. dest. im Verhältnis 1:10 zur Gebrauchslösung verdünnt. Die Gelkammer wurde vorher mit 70 %igem Ethanol gereinigt und die offenen Seitenränder mit Klebeband verschlossen. Die Gelträgerform wurde waagerecht ausgerichtet und der Gelkamm zur Herstellung der passenden Geltaschen für die Proben wurde in dem Gelträger aufgestellt. Zur Herstellung eines 1,5 %igen Agarosegels wurden 0,675 g Agarose in einen Erlenmeyerkolben abgewogen und 45 ml TBE-Puffer hinzugefügt, mit Mikrowellenfolie abgedeckt und der Kolben wurde vorsichtig geschwenkt. In der Mikrowelle wurde das ganze bis zum Kochen erhitzt, bis sich alle Flocken gelöst hatten. Anschließend wurde der Erlenmeyerkolben schwenkend unter fließendem Leitungswasser auf Handwärme abgekühlt und langsam, unter Vermeidung von Blasenbildung, in die vorbereitete Gelkammer gegossen. Nach ca. 30 min war das Gel erhärtet, die Kleberänder und der Kamm wurden entfernt und der Gelträger mit dem Gel wurde in die Elektrophoresekammer gelegt. Die Elektrophoresekammer wurde bis zur Bedeckung des Gels mit TBE-Lösung gefüllt. Die Proben wurden unmittelbar vor der Ladung des Gels mit Ladungspuffer in einem Reaktionsgefäß gemischt (5 µl DNA mit 2 µl Ladungspuffer oder 7,5 µl PCR-Produkt mit 2,5 µl Ladungspuffer). Die vorbereiteten Proben wurden nun durch die TBE-Lösung vorsichtig in 80 die Geltaschen pipettiert, wobei in die erste Geltasche stets der 100 bp-DNA-Marker (10 µl) pipettiert wurde. Der Marker trennt sich während der Elektrophorese in 11 Fragmente definierter Größe auf, die der Größenzuordnung der PCR-Produkte dienen. Die Elektrophoresekammer wurde geschlossen und die elektrischen Verbindungen zur Stromquelle hergestellt. Die DNA-Proben wurden bei 70 Volt, PCR-Produkte bei 90 Volt aufgetrennt bis die Farbstofffront ca. 1 cm vom gegenüberliegenden Rand des Gels entfernt war. 3.1.4.6.2 Färbung des Gels Material: Gele nach der Elektrophorese Ethidiumbromid (10 mg/ml) Plastikschale A. dest. Meßbecher Handschuhe (nicht steril, Nitril, Touch N Tuff®, Rot, Karlsruhe) Schwenker (Rocky Typ RT-1S, Fröbel Labortechnik, Wasserburg) Durchführung: Im Anschluß an die Elektrophorese wurden die Gele in einer Plastikschale mit 100 ml A. dest. und 20 µl Ethidiumbromid für 15 min auf dem Schwenker gefärbt. Dann wurden die Gele in A. dest. für weitere 15 min entfärbt. 81 3.1.4.6.3 Ablichten des Gels Material: Gele nach der Färbung Handschuhe (nicht steril, Nitril) Zellstoff UV-Transilluminater (Intas, Göttingen) Video-Print-Anlage (Intas, Göttingen) Durchführung: Das Ethidiumbromid interkaliert mit dem DNA-Doppelstrang der PCR-Produkte und wird durch UV-Licht mit 312 nm Wellenlänge angeregt und dadurch sichtbar gemacht. Die Gele wurden auf den UV-Transilluminater gelegt und mit einer Video-Print-Anlage dokumentiert. 3.1.5 C. parvum-Nachweis mit monoklonalen fluoreszierenden Antikörpern Material: Lab-tek-chamber-slides mit C.-parvum-infizierten HCT-8 Zellkulturen Methanol (70 %, Roth, Karlsruhe) Sporo-Glo® (20fach, Waterborne, Inc., New Orleans, USA) PBS-Lösung (Kap. 3.1.1.4) DABCO (1,4-Diazabicyclo(2.2.2)octane, in 90 % Glycerol/10 % PBS) Rinderserumalbumin (bovine serum albumine, BSA, Sigma) Ziegenserum (normal goat serum, NGS, gewonnen durch Blutabnahme und anschließende Zentrifugation) Deckgläser (18 x 18 mm, IDL, Nidderau) 82 Immersionsöl Mikroskop (Zeiss, Oberkochen u. Leica DMLB) Durchführung: Zum Nachweis mit Sporo-Glo® wurden infizierte HCT-8-Zellkulturen auf Lab-tek-chamberslides verwendet. Der Objektträger wurde wie in Kap. 3.1.3.6 beschrieben geerntet, mit Methanol für 10 min fixiert und anschließend luftgetrocknet. Es wurden 3 ml Verdünnungspuffer aus 2670 µl PBS-Lösung, 30 µl BSA (Endkonzentration: 1 %) und 300 µl NGS (Endkonzentration: 10 %) hergestellt. Der Überschichtungspuffer bestand aus 90 % Glycerol und 10 % PBS-Lösung, von denen 9800 mg mit 200 mg DABCO gemischt wurden (DABCO-Endkonzentration: 2 %). Um Sporo-Glo® in der Arbeitskonzentration zu erhalten wurden 50 µl des Sporo-Glo®-Konzentrates mit 950 µl Verdünnungspuffer versetzt. Der Objektträger wurde vorsichtig mit unverdünnten Sporo-Glo® überschichtet und abgedunkelt für mindestens 30 min bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Dann wurde für eine Minute der Objektträger mit PBS-Lösung gespült und die PBS-Lösung abgeschüttet. Vor dem Mikroskopieren wurden ein bis drei Tropfen des Überschichtungspuffers auf den Objektträger gegeben und mit einem Deckgläschen abgedeckt. 83 3.1.6 C. parvum-Infektion von BALB/c-Mäusen 3.1.6.1 Haltung der BALB/c-Mäuse Material: Einstreu (Sägespäne, Altromin animal bedding granular, Altromin, Lage) Mäusefutter (Altromin Alleinfutter Standard Diät-Ratten-Mäuse, Altromin, Lage) Makrolon-Käfige Leitungswasser Durchführung: Jede tragende Maus (weiblich, 01aHsd, sichtbar tragend, Harlan Winkelmann, Borchen) wurde einzeln in einem Käfig mit Sägespänen gehalten. Wasser und Futter standen ad libitum zur Verfügung. 3.1.6.2 Infektion der Mäuse mit unbehandelten und behandelten Oozysten Material: Unbehandelte und mit Neopredisan® behandelte Oozysten (siehe Kap. 3.1.2) Ethanol (90 %, unvergällt, Roth, Karlsruhe) Plastikkatheter (Durchmesser: 2-3 mm) Pikrinsäure Insulinspritze (steril, 1 ml, Braun, Melsungen) Pipette (Gilson Pipetman, Gilson Medical Eletronics, Frankreich) Pipettenspitzen (5-200 µl, 101-1000 µl, Wörl Kunststofftechnik, München) Pipettenspitzen (0,5-10 µl, SØrenson Bio Science, USA) 84 Durchführung: Die behandelten und unbehandelten C. parvum-Oozysten wurden gezählt und dann 1 x 105 Oozysten/Maus in einem Volumen von 20-100 µl oral eingegeben. Dieser Versuch orientierte sich an der von PEETERS und VILLACORTA (1995) beschriebenen intragastralen Eingabe von C.-parvum-Oozysten. Der Katheter wurde auf die Kanülenspitze der Insulinspritze gezogen, die erforderliche Menge in die Spritze aufgesogen und den Babymäusen am 3. Lebenstag oral eingegeben, so dass der Katheterschlauch mindestens bis in die Speiseröhre bzw. Magen reichte. Die erste Versuchsgruppe (17 Babymäuse aus zwei Würfen) wurde mit Pikrinsäure äußerlich am Rücken markiert. Die Mäuse wurden mit unbehandelten C.-parvum-Oozysten, Oozysten nach 120 min Inkubation mit 0,25 %, 1 % und 4 % Neopredisan® und mit Wasser ohne Oozysten behandelt (siehe Tab. 8). Die unbehandelten Oozysten wurden vor dem Infektionstermin zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Dieser Tierversuch wurde genehmigt und registriert unter der Nr. 509i-42502-99/247. Tabelle 8: C.-parvum-Inokulation von Babymäusen (Versuch 1) Inkubationszeit der Versuchs- Anzahl der Oozystenanzahl/ Neopredisankonzentration gruppe Mäuse infizierte Maus der behandelten Oozysten 1 7 1 x 105 unbehandelt - 2 2 1 x 105 4% 120 3 3 1 x 105 1% 120 4 5 0 unbehandelt - Oozysten in Neopredisan (min) 85 Die Mäuse der zweiten Versuchsgruppe stammten aus 5 Würfen, wobei jeder Wurf eine Versuchsgruppe bildete. Am dritten Lebenstag wurden die Mäuse mit unterschiedlichem Probenmaterial infiziert (siehe Tab. 9). Tabelle 9: C.-parvum-Inokulation von Babymäusen (Versuch 2) Inkubationszeit der Versuchs- Anzahl der Oozystenanzahl/ Neopredisankonzentration gruppe Mäuse infizierte Maus der behandelten Oozysten 1 5 0 unbehandelt - 2 5 1 x 105 4% 120 3 7 1 x 105 1% 120 4 7 1 x 105 0,25 % 120 5 7 1 x 105 unbehandelt - 3.1.6.3 Gewinnung von Untersuchungsmaterial Material: Materialien wie in Kap. 3.1.6.2 beschrieben Materialien wie in Kap. 3.1.1.3 beschrieben Skalpellklingen (O.R., Solingen) Ethanol (70 %, Roth, Karlsruhe) Pinzette Schere Reaktionsgefäße (1,5 ml, Safe-Lock, Eppendorf, Hamburg) Formalin-Lösung (Formaldehydlösung, 37 %, Merck, Darmstadt) Plastikfolie Oozysten in Neopredisan (min) 86 Durchführung: Die Mäuse wurden sieben Tage p.i. durch zervikale Dislokation getötet und die Bauchhöhle mit einer Schere eröffnet. Vorsichtig wurde der Dünndarm vor dem Magen und der Kolon ca. 1 cm vor dem After (harte Kotbestandteile sollten im Tier bleiben) getrennt und das Darmkonvolut aus der Bauchhöhle entfernt. In der ersten Versuchsgruppe wurde der Darm vorsichtig ausgebreitet und dreimal mit einem Milliliter sterilem Wasser gespült und die Spülflüssigkeit in einem Reaktionsgefäß aufgefangen. Anschließend wurde der Blinddarm eröffnet, ein Darmabstrich genommen, auf einen Objektträger gestrichen, mit einem Deckglas versehen und sofort unter dem Mikroskop untersucht. In der zweiten Versuchsgruppe wurde ebenfalls ein Darmabstrich vom Blinddarm genommen und mikroskopisch untersucht. Der Hüftdarm und der Blinddarm wurden herausgetrennt und für 15 h in 30 %iger wässriger Formalinlösung aufbewahrt. Dann wurden die Proben in 10 %ige Formalinlösung und anschließend in 4 %ige Formalinlösung gelegt. Von diesen Proben wurden im Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule histologische Schnitte angefertigt, die mikroskopisch untersucht wurden. 3.1.7 Statistik Die statistischen Auswertungen erfolgten mittels SPSS (SPSS® Inc., Chicago) und EXEL 95 (Microsoft® GmbH). Der X2-Test wurde nach PEARSON und die Beurteilung der PCRErgebnisse und der Focuszählmethode wurde mit dem MANN-WHITNEY-U-Test durchgeführt. Eine Irrtumswahrscheinlichkeit von p < 0,05 wurde als signifikant und p < 0,001 als hoch signifikant eingestuft. 87 4. ERGEBNISSE 4.1 C.-parvum-Oozysten-Gewinnung 4.1.1 Passagierung im Kalb Nachdem die Kälber mit 1 x 107 C.-parvum-Oozysten oral infiziert wurden, begann die Ausscheidung der Oozysten am 3. Tag p.i. Die Anzahl ausgeschiedener Oozysten erhöhte sich bis zum 8. Tag p.i. auf ca. 1 x 108 Oozysten täglich und nahm dann wieder ab, so dass am Tag 11 p.i. nur vereinzelt Oozysten im Kot gefunden wurden. Im Kot waren teilweise kleine Schleimhautbestandteile des Darmes, sowie vereinzelt frische Blutbeimengungen zu finden. Durch die Futterumstellung von Milchaustauscher auf Elektrolytlösung konnte der Fettanteil im Kot deutlich reduziert werden. Die Elektrolytlösung wurde von den Kälbern als Alleinfuttermittel während der Passagierung akzeptiert. Die tägliche Allgemeinuntersuchung und Messung der Körpertemperatur entsprach den Werten eines gesunden Tieres. Das Kalb war stets aufmerksam und vital. Wenn die Ausscheidung stark abnahm oder genügend Oozysten gewonnen worden waren, wurde der Kälberkot nicht mehr gesammelt und die Kälberfütterung konnte wieder auf Milchaustauscher umgestellt werden. 4.1.2 Anreicherung der C.-parvum-Oozysten Während der Anreicherungsschritte waren die C.-parvum-Oozysten nach der Zentrifugation stets massenhaft im Pellet vorhanden und nur vereinzelt im Überstand des Zentrifugates zu finden. Die C.-parvum-Oozysten hafteten an den festen Bestandteilen des Kotes und konnten nicht vollständig durch Sieben isoliert werden. Durch die Anreicherung konnte die Gesamtmenge von ca. 60 Liter Kot-Harn-Gemisch auf ca. 2 Liter Oozystensuspension reduziert werden. 88 4.1.3 Reinigung der C.-parvum-Oozysten Die Reinigung des oozystenhaltigen Kot-Harn-Gemisches mit Diethylether (siehe Kap. 3.1.1.4) und anschließende Gewinnung der C.-parvum-Oozysten über einen Percoll®Gradienten erwies sich als nicht sinnvoll. Die Schichtung der Percoll®-Konzentrationen wäre bei der Reinigung des gesamten Harn-Kotsedimentes im Anschluß an die Diethyletherreingung (ca. 200 ml Endvolumen nach Diethyletherreinigung) sehr aufwendig gewesen, da zu jedem Percollröhrchen nur wenige Milliliter A. dest. hinzupipettiert werden können. Bei der mikroskopischen Untersuchung der Interphase waren zahlreiche Kotpartikel und massenhaft Bakterien vorhanden. Die Kryptosporidien hingegen waren in der Interphase zwischen dem 35 und 75 %igen Percoll® nur unzureichend angereichert. Bei dem Versuch, Percollreste durch Verdünnung der Oozystensuspension und anschließende Zentrifugation für 10 min bei 2300 x g zu entfernen, gingen im erheblichen Umfang C.-parvum-Oozysten verloren. Die Behandlung mit Natriumhypochlorit (siehe Kap. 3.1.1.4) bewirkt gleichzeitg eine Desinfektion anderer Mikroorganismen. Durch die Flotation der Kryptosporidien in gesättigter Kochsalzlösung (siehe Kap. 3.1.1.4) konnte eine hinreichende Trennung der Oozysten von Schmutzpartikeln erreicht werden. Die Kochsalzreste in der Oozystensuspension konnten leicht durch Verdünnung und anschließende Zentrifugation entfernt werden (Abb. 3). 4.2 Desinfektion der C.-parvum-Oozysten Die mit Neopredisan® desinfizierte Suspension der C.-parvum-Oozysten mußte bei hohen Konzentrationen (1 % und mehr) zur Entfernung des Desinfektionsmittels mit Isopropanol versetzt werden. Ohne Isopropanol kam es zu einer trüben, flockigen Ausfällung des Desinfektionsmittels, die sich nach einer Zentrifugation als klare visköse Flüssigkeit absetzte. Dadurch konnte das Desinfektionsmittel mittels Zentrifugation nicht vollständig entfernt werden, was zu einer erheblichen Beeinträchtigung des Wirtszellwachstums in der in vitro Kultur führte (siehe Kap. 4.3.1). Isopropanol bewirkte eine vollständige Lösung von 89 Neopredisan®, so dass sich das Präparat problemlos durch Verdünnung und Zentrifugation entfernen ließ. C.-parvum-Oozysten, die mit 4%igem Neopredisan® behandelt wurden, waren unregelmäßig statt rund geformt (Abb. 4). Die C.-parvum-Oozysten wurden vor und nach der Desinfektion mit einem Hämatozytometer (Neubauer-Zählkammer) gezählt (Abb. 3 u. 4) und anschließend zur Infektion von Zellkulturen oder Babymäusen verwendet. 4.3 Zellkultur Die HCT-8-Zellen ließen sich problemlos kultivieren und vermehren. Im Abstand von drei Tagen wurden die HCT-8-Zellen der Stammhaltung trypsiniert, geteilt und ein Viertel der ursprünglichen Zellen in neue Kulturflaschen eingesät. Die gelagerten HCT-8-Zellen ließen sich jederzeit aus dem Stickstoffbehälter bei Zimmertemperatur auftauen und erneut kultivieren. 4.3.1 MTT-Test Der MTT-Test wurde in vorbereitenden Studien zur Abschätzung der Proliferation der HCT8-Zellen unter Neopredisaneinfluß gemacht (siehe Kap. 3.1.3.3). Die höchsten Absorptionswerte (1,231) wurden erreicht bei Einsaat von 5 x 104 HCT-8-Zellen ohne Neopredisan, die niedrigsten (0,019) bei gleicher Anzahl von HCT-8-Zellen und einer Neopredisankonzentration von 0,02 %. Bei abnehmender Anzahl der HCT-8-Zellen verringerten sich im allgemeinen die Absorptionswerte. Die Einsaat von 5 x 104 HCT-8Zellen führte zu Absorptionswerten von bis zu 1,231, während 5 x 103 HCT-8-Zellen Absorptionswerte von bis zu 0,422 lieferten. Allerdings kam es zu erheblichen Schwankungen und demzufolge auch Überschreitungen der Meßwerte. Die Abnahme der Neopredisankonzentration von 0,2 bis 0 % führt zu einer Zunahme der Absorption. Die Absorptionswerte schwanken bei 0,2 % Neopredisan zwischen 0,021 und 0,044, während ohne Neopredisan Absorptionswerte zwischen 0,312 und 1,231 erreicht wurden (siehe Tab. 90 10 u. Abb. 5). Bei Verringerung von 0,02 % zu 0,002 % Neopredisan® kam es zu einem deutlichen Anstieg der Absorptionswerte von 0,019 auf 1,102 (5 x 104 HCT-8-Zellen) oder von 0,021 auf 0,813 (1,4 x 104 HCT-8-Zellen). Die Absorptionsunterschiede zwischen infizierten Kulturen (5 x 104 HCT-8-Zellen), die mit 0,02 % Neopredisan® oder nicht behandelt wurden, liegen im Bereich von 0,284 bis 1,212, während die Absorptionsunterschiede bei Anwendung von 0,002 % Neopredisan zu den unbehandelten Kontrollen im Bereich zwischen 0,079 und 0,129 lagen. Die Absorptionswerte bei Anwendung von 0,002 % Neopredisan® waren signifikant (p < 0,05) höher als bei einer Neopredisankonzentration von 0,02 %. Damit wirkte sich Neopredisan® in einer Konzentration von 0,002 % oder weniger nicht mehr proliferationshemmend auf die HCT-8Zellkultur aus. Tabelle 10: Absorptionsergebnisse im MTT-Test zu HCT-8-Zellkulturen unter Einfluß von Neopredisan® Neopredisankonzentration HCT-8-Zellen/Kalotte 5 x 104 5 x 104 2,8 x 104 1,4 x 104 5 x 103 5 x 103 0,2 0,044 0,041 0,021 0,022 0,025 0,026 0,02 0,019 0,027 0,021 0,025 0,022 0,021 0,02 0,019 0,027 0,021 0,021 0,021 0,028 0,002 1,102 1,083 1,021 0,813 0,392 0,422 0,002 1,138 1,111 1,062 0,693 0,520 0,222 0,0002 1,270 1,203 1,159 0,908 0,404 0,407 0,0002 1,145 1,253 1,102 0,850 0,333 0,317 0,00002 1,168 1,106 1,152 0,760 0,366 0,317 0,00002 1,184 1,160 0,983 1,101 0,367 0,397 0 1,231 1,214 1,146 0,734 0,359 0,312 (mg/ml) 91 OD600 1,4 5000 Zellen/Kalotte 14000 Zellen/Kalotte 28000 Zellen/Kalotte 50000 Zellen/Kalotte 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0,00001 Neopredisankonzentration (%) 0,00010 0,00100 0,01000 0,10000 1,00000 Abb. 5: Absorptionswerte von HCT-8-Zellen im MTT-Test (600 nm) 4.3.2 Zellkulturmedium 4.3.2.1 DMEM oder RPMI-1640 Um die Kultivierung von HCT-8-Zellen zu optimieren, wurden die Zellen mit DMEM- oder RPMI-1640-Medium kultiviert und das Zellwachstum mikroskopisch beurteilt (siehe Kap. 3.1.3.1). Die HCT-8-Kulturen, die in einer Dichte von 1 x 105 HCT-8-Zellen pro Kalotte mit RPMI eingesät wurden hatten schon 48 h nach der Einsaat eine Konfluenz von 70 – 90 % erreicht, während die gleiche Konfluenz der HCT-8-Zellen mit DMEM-Medium nach 72 h erreicht wurde. Betrug die Anzahl eingesäter Zellen 1 x 104, konnte unter dem Mikroskop nach 48 Stunden ein Bewuchs von ca. 50 % beobachtet werden, während mit DMEM der Bewuchs deutlich unter 50 % lag. Bei einer geringeren Anzahl von HCT-8-Zellen (1 x 102 oder 1 x 103) wurden keine Unterschiede im Wachstumsverhalten unter dem Mikroskop 92 beobachtet. Da das Wachstum von HCT-8-Zellen mit RPMI-1640 schneller verlief, wurde bei allen weiteren Versuchen RPMI-1640 verwendet. 4.3.2.2 Mediumzusätze Zur Optimierung der C.-parvum-Entwicklung in vitro wurde in Vorversuchen der Einsatz von Mediumzusätzen geprüft. Der Einsatz von Mediumzusätzen (siehe Kap. 3.1.3.1) verlangsamte das Wachstum der HCT-8-Zellen im Vergleich zu HCT-8-Kulturen, die nur RPMI-1640 mit 10 % FKS, Penicillin und Streptomycin erhielten. Zum Teil konnte beim Einsatz anderer Mediumzusätze beobachtet werden, dass sich die HCT-8-Zellen abrundeten und starben. Auf die Verwendung von weiteren Mediumzusätzen wurde aus diesen Gründen verzichtet. 4.4 PCR von C. parvum 4.4.1 Extraktion genomischer C.-parvum-DNA Die Extraktion genomischer DNA wurde in den vorliegenden Versuchen mit Ethanol durchgeführt. Um eine bessere Reproduzierbarkeit der PCR-Ergebnisse zu erzielen, wurde in Vorversuchen die DNA durch eine Phenolextraktion von Proteinen gereinigt und durch eine Chloroformfällung das Phenol wieder entfernt. Parallel dazu wurde die DNA nur mit Ethanol extrahiert. Mit der PCR konnten im Anschluß an eine Phenolextraktion mit 1 x 103 C.parvum-Oozysten infizierte HCT-8-Zellkulturen nach Einsaat keine parasitenspezifischen DNA-Fragmente dargestellt werden. Die Verwendung von 1 x104 Oozysten lieferte ein negatives und zwei positive Ergebnisse und 1 x 105 Oozysten ergaben zwei negative und drei positive Ergebnisse. Der Einsatz von Ethanol zur DNA-Extraktion ergab bei Einsaat von 1 x 103 Oozysten 26 (35 %) negative und 48 (65 %) positive Ergebnisse, bei 1 x 104 Oozysten 22 (37%) negative und 37 (63 %) positive Ergebnisse. Bei Einsaat von 1 x 105 Oozysten waren 26 (35 %) Proben negativ und 48 (65 %) positiv. Durch eine Phenolextraktion konnten nur bei Einsaat von 1 x 104 Oozysten/Kalotte etwas mehr positive PCR-Ergebnisse erzielt werden, insgesamt ergab 93 aber das Phenol als Extraktionsmedium dem Ethanol gegenüber keinen signifikanten Vorteil. Aufgrund der Giftigkeit des Phenols wurde für alle weiteren Versuche Ethanol zur Extraktion verwendet (siehe Tab. 11, Abb. 6 u. 7). Tabelle 11: PCR-Ergebnisse nach Phenol- oder Ethanol-Extraktion von DNA-Proben infizierter HCT-8-Zellkulturen (Anzahl und Prozente) Phenolextraktion Oozystenanzahl /Kalotte n (PCR-Versuche) PCR-positiv (Prozente) Ethanolextraktion n (PCR-Versuche) PCR-positiv (Prozente) 1 x 103 2 0 (0 %) 74 48 (65 %) 1 x 104 4 3 (75 %) 59 37 (63 %) 1x 105 5 3 (60 %) 74 48 (65 %) Oozystenanzahl (x100)/Kalotte negativ positiv 1000 100 10 0% Abb. 6: 20% 40% 60% 80% 100% Anteile negativer und positiver PCR-Ergebnisse nach Aufarbeitung infizierter Zellkulturen mittels Ethanolextration 94 Oozystenanzahl/Kalotte-Extraktionsmittel < 1 x 103-Phenol < 1 x 103-Phenol < 1 x 103-Ethanol < 1 x 103-Ethanol < 1 x 104-Phenol < 1 x 104-Phenol < 1 x 104-Ethanol < 1 x 104-Ethanol < 1 x 105-Phenol < 1 x 105-Phenol < 1 x 105-Ethanol < 1 x 105-Ethanol < Negativkontrolle < Negativkontrolle < 100-bp-Marker Abb. 7: PCR im Anschluß an die Phenol- und Ethanolextraktion der genomischen DNA von mit C.-parvum-Oozysten infizierten HCT-8-Zellkulturen. Die Anzahl der C. parvum-Oozysten/Kalotte variierte (1 x 103 –1 x 105). Nicht infizierte Zellkulturen waren bei der PCR die Negativkontrolle. 4.5 Infektion von HCT-8-Zellkulturen mit C.-parvum-Oozysten 4.5.1 Vergleich der Vitalität von C. parvum in 48- und 96-Kalotten- Zellkulturtestplatten Durch die Verwendung von 96-Kalotten-Zellkulturtestplatten sollte eine Verbesserung des Vitalitätstests von C.-parvum-Oozysten durch Verkleinerung der Volumina erreicht werden. Hierzu wurde ein Vergleich der Vitalität von C. parvum in 48- und 96-KalottenZellkulturtestplatten auf HCT-8-Zellen durchgeführt. Die PCR von infizierten HCT-8-Zellen, die in 48-Kalotten-Zellkulturplatten kultiviert waren, zeigte mit Ausnahme von 1 x 103 eingesäten Oozysten (14,3 %) eine Zunahme der positiven Ergebnisse von 33,3 % bei 1 x 102 95 Oozysten auf 61,3 % bei Einsaat von 1 x 105 Oozysten. Die Negativproben, bei denen keine Oozysten eingesät wurden, lieferten alle negative Ergebnisse, sowohl in den 48-, als auch in den 96-Kalotten-Zellkulturtestplatten. Die Zunahme der positiven Ergebnisse ist auch bei Einsaat in 96-Kalotten-Zellkulturtestplatten (von 16 % bei 1 x 102 Oozysten bis zu 67,5 % bei 1 x 105 Oozysten) zu beobachten. Die Einsaat von nur 10 Oozysten in 96-KalottenZellkulturtestplatten ergab ausschließlich negative Ergebnisse (siehe Tab. 12, Abb. 8 u. 9). Ein Vergleich der positiven PCR-Ergebnisse der zwei Plattentypen ergab nur bei Einsaat von 1 x 103 Oozysten/Kalotte signifikant (p < 0,05) mehr positive PCR-Ergebnisse bei Verwendung der 96-Kalotten-Zellkulturtestplatte. Die Einsaat von C.-parvum-Oozysten in 48und 96-Kalotten-Zellkulturtestplatten zeigte bei beiden Kalottengrößen einen höheren Anteil positiver PCR-Ergebnisse, wenn die Anzahl der Oozysten erhöht wurde. Tabelle 12: PCR-Ergebnisse nach Infektion von HCT-8-Zellkulturen mit unbehandelten C.parvum-Oozysten in 48- oder 96-Kalotten-Zellkulturtestplatten nach 48 h Inkubation (Anzahl und Prozente) 48 Kalotten Oozystenzahl/ Kalotte 96 Kalotten n (Anzahl PCR- PCR-positiv n (Anzahl PCR- PCR-positiv Auswertungen) (Prozente) Auswertungen) (Prozente) 0 22 0 (0 %) 20 0 (0 %) 1 x 101 - - 6 0 (0 %) 1 x 102 6 2 (33,3 %) 25 4 (16 %) 1 x 103 14 2 (14,3 %) 34 18 (52,9 %) 1 x 104 21 10 (47,6 %) 40 27 (67,5 %) 1 x 105 31 19 (61,3 %) 43 29 (67,4 %) 96 Oozystenanzahl (x100)/Kalotte negativ positiv 1000 100 10 1 0 0% 20% 40% 60% 80% 100% Abb. 8: Anteil negativer und positiver Testergebnisse in der PCR nach Infektion von HCT-8Zellkulturen mit C. parvum in 48 Kalotten-Zellkulturtestplatten Oozystenanzahl (x100)/Kalotte negativ positiv 1000 100 10 1 0,1 0 0% 20% 40% 60% 80% 100% Abb. 9: Anteile negativer und positiver Testergebnisse in der PCR nach Infektion einer HCT8-Zellkultur mit C. parvum in 96-Kalotten-Zellkulturtestplatten 97 4.5.2 PCR-Ergebnisse C. parvum infizierter Zellkulturen bei Vernachlässigung des Plattentyps Unabhängig vom benutzten Plattentyp lieferten die Negativproben und mit 1 x 101 C.parvum-Oozysten beimpfte Kulturen ausschließlich negative Ergebnisse. Insgesamt waren bei 1 x 102 C.-parvum-Oozysten 25 (80,6 %) Proben negativ und 6 Proben positiv. Der Anteil positiver Proben stieg weiter an von 41,7 % bei 1 x 103 auf 61,5 % bei Einsaat von 1 x 105 Oozysten (siehe Tab. 13 u. Abb. 10). Die PCR-Banden waren bei Einsaat von 1 x 105 Oozysten/Kalotte teilweise stärker ausgeprägt als PCR-Banden bei Einsaat von 1 x 104 Oozysten/Kalotte (siehe Abb. 11 u. 12). Es gab einen signifikanten (p < 0,05) Unterschied der positiven PCR-Ergebnisse zwischen der Verwendung von 1 x 105 Oozysten/Kalotte und der Einsaat von 1 x 103, 1 x 102 oder 1 x 101 Oozysten/Kalotte. Es ist deutlich erkennbar, dass mit zunehmender Oozystenzahl der Anteil positiver PCR-Ergebnisse anstieg und die Bandenstärke zunahm. Tabelle 13: PCR-Ergebnisse nach Infektion von HCT-8-Zellkulturen mit unbehandelten C.parvum-Oozysten in 48-und 96-Kalotten-Zellkulturtestplatten nach 48 h Inkubation Oozystenanzahl n (Anzahl PCRAuswertungen PCR positiv (Prozente) 0 42 0 (0 %) 1 x 101 6 0 (0 %) 1 x 102 31 6 (19,4 %) 1 x 103 48 20 (41,7 %) 1 x 104 61 37 (60,7 %) 1 x 105 78 48 (61,5 %) 98 negativ positiv Oozystenanzahl (x100)/Kalotte 1000 100 10 1 0,1 0 0% 20% 40% 60% 80% 100% Abb. 10: Anteil negativer und positiver Testergebnisse in der PCR nach Infektion von HCT-8Zellkulturen in 48- und 96-Kalotten-Zellkulturtestplatten Oozystenanzahl/Kalotte < 100-bp-Marker < 1 x 103 < 1 x 103 < 1 x 104 < 1 x 105 < Negativkontrolle-keine Oozysten < 1 x 104 < 1 x 105 < 1 x 103 < 1 x 104 < 1 x 105 Abb. 11: PCR-Banden infizierter HCT-8-Zellkulturen mit unbehandelten C.-parvumOozysten. Variable Oozystenzahl/Kalotte (1 x 103 – 1 x 105). 99 Oozystenanzahl/Kalotte < 1 x 105, 0,2 % Neopredisan < 1 x 105, 0,2 % Neopredisan < 1 x 105 < 1 x 105 < 1 x 105 < 1 x 103 < 1 x 104 < 1 x 105 < 1 x 103 < 1 x 104 < 1 x 105 < 1 x 103 < 1 x 104 < 1 x 105 < 100-bp-Marker Abb. 12: PCR-Ergebnisse im Anschluß einer Infektion von HCT-8-Zellkulturen mit behandelten (0,2 % Neopredisan®, 120 min Einwirkzeit) und unbehandelten C.parvum-Oozysten. 4.5.3 Inhibition mit Paromomycin In vorbereitenden Studien wurde die Inhibition von C.-parvum mit Paromomycin in Anlehnung an Versuche von MARSHALL und FLANIGAN (1992) getestet. Die Auswertung erfolgte mikroskopisch und über eine anschließende PCR der Zellkultur. Die erste PCR einer Zellkultur, die mit behandelten C.-parvum-Oozysten (1 x 105 Oozysten, 0,5 mg/ml Paromomycin) infiziert worden war, lieferte ein negatives Ergebnis (keine Bande bei 649 bp im Agarosegel sichtbar). Eine zweite PCR ergab dagegen ein positives Ergebnis. Bei Paromomycinkonzentrationen von 5, 0,05 und 0,005 mg/ml lieferten jeweils beide PCRParallelansätze ein Signal. Oozysten, die nicht behandelt wurden, ergaben bei Einsaat von 1 x 105 Oozysten/Kalotte ebenfalls eine spezifische Bande (siehe Tab. 14). Wurde nur Paromomycin (5 %, 0,5 %, 0,05 %, 0,005 %, 0,0005 %, 0 %) ohne Oozysten zu den Zellkulturen pipettiert, war das PCR-Ergebnis stets negativ (siehe Tab. 14). Die mikroskopische Auswertung der Lab-tek-chamber-slides ergab in allen angewendeten 100 Paromomycinkonzentrationen ein positives Vitalitätsergebnis für C. parvum. Es wurden mikroskopisch Entwicklungsstadien von C. parvum in der Zellkultur gefunden (siehe Abb. 13). Die Negativkontrolle ohne Oozysten war negativ und die Positivkontrolle ohne Paromomycin war positiv. Es konnte somit durch die PCR und die Histologie keine eindeutige Inhibition von C. parvum durch Paromomycin nachgewiesen werden. Tabelle 14: PCR-Ergebnisse nach Infektion von HCT-8-Zellkulturen mit Paromomycinbehandelten C.-parvum-Oozysten Ergebnis PCR 1 Ergebnis PCR 2 Oozystenanzahl/ Paromomycin- Kalotte konzentration (mg/ml) 1 x 105 5,000 1 x 105 0,500 1 x 105 0,005 + + 1 x 105 0,0005 + + 1 x 105 0 + + negativ positiv + - negativ positiv + + Abb. 13: Entwicklungsstadien von C. parvum nach Infektion einer HCT-8-Zellkultur mit Paromomycin (0,5 mg/ml)-behandelten Oozysten (Ölimmersion, 1000fache Vergrößerung). 101 4.5.4 Einfluß der Inkubationsdauer auf die In-vitro-Vitalität von C. parvum Die Auswirkung der Inkubationszeit der infizierten Zellkultur im Brutschrank auf die Vitalität der C.-parvum-Oozysten wurde untersucht. Unabhängig von der Inkubationsdauer und Oozystenzahl ergaben alle Kulturen positive PCR-Ergebnisse. Die Negativproben in einem ersten Versuchsansatz lieferten positive PCR-Ergebnisse. Die zweite PCR ergab die erwarteten negativen Ergebnisse bei den Negativproben (keine Oozysten) und negative Ergebnisse bei 6 Stunden Inkubation mit 1 x 101 oder 1 x 102 Oozysten, bei 24 Stunden Inkubation mit 1 x 102 Oozysten und nach 48 Stunden Inkubation mit 1 x 101 Oozysten. Bei den übrigen Ansätzen wurde die spezifische Bande erzeugt. Die Wiederholung der ersten mißlungenen PCR lieferte in der zweiten PCR bei zwei der drei Negativkontrollen, bei geringen Oozystenzahlen und geringen Inkubationszeiten keine spezifischen Banden (siehe Tab. 15). 102 Tabelle 15: PCR-Ergebnisse infizierter HCT-8-Zellkulturen nach unterschiedlichen Inkubationszeiten Oozystenanzahl/ Inkubationszeit der Kalotte infizierten Zellkultur (h) Ergebnis PCR 1 Ergebnis PCR 2 1 x 105 6 + + 1 x 104 6 + + 1 x 103 6 + - 1 x 102 6 + - 1 x 101 6 + - 0 6 + - 1 x 105 24 + + 1 x 104 24 + + 1 x 103 24 + + 1 x 102 24 + - 1 x 101 24 + + 0 24 + - 1 x 105 48 + + 1 x 104 48 + + 1 x 103 48 + + 1 x 102 48 + + 1 x 101 48 + - 0 48 + + 103 4.5.5 Beurteilung der Neopredisanwirkung auf C. parvum mittels PCR Insgesamt wurden 163 Zellkulturen mit C. parvum beimpft. Davon wurden 85 Zellkulturen mit Neopredisan® behandelten und 78 Zellkulturen mit unbehandelten C.-parvum-Oozysten infiziert. Die Einsaat von 1 x 104 C.-parvum-Oozysten führte bei Behandlung mit 1 % und mit 4 % des Desinfektionsmittels bei einer Einwirkdauer von 120 min zu ausnahmslos negativen PCR-Ergebnissen. Bei Einsaat von 1 x 105 C.-parvum-Oozysten konnten bei Verwendung von 4 % Neopredisan® bei 1 von 24 Kulturen positive Ergebnisse erzielt werden, während die Anwendung von 1 % Neopredisan® bei 4 von 22 Kulturen positive Ergebnisse lieferte. In einer folgenden Testreihe führte die Abnahme des Neopredisangehaltes zu einer Zunahme des Anteils positiver PCR-Ergebnisse von 15 % bei 0,25 % Neopredisan® über 28,6 % bei 0,0625 % Neopredisan® bis zu 61,5 % positiver PCR-Ergebnisse ohne Neopredisan®Anwendung (siehe Tab. 16, Abb. 14). Auch wenn trotz Desinfektion der Oozysten C.parvum-spezifische PCR-Banden auftraten (siehe Abb. 15), waren sie doch immer deutlich schwächer als in den Positivkontrollen (siehe Abb. 16). Die Positivkontrollen ohne Neopredisanbehandlung lieferten hoch signifikant (p < 0,001) mehr positive PCR-Ergebnisse als mit 4 %, 1 % und 0,25 % Neopredisan® behandelte Oozysten. Die Unterschiede der positiven PCR-Ergebnisse bei Verwendung von 4 % Neopredisan® und 0,25 % oder 0,0625 % Neopredisan® waren signifikant (p < 0,05). Die Anwendung von 0,0625 % Neopredisan® auf Oozysten ergab signifikant (p < 0,05) mehr positive Ergebnisse als die Anwendung von 1 % Neopredisan®. Die Zunahme des Neopredisangehaltes führte im allgemeinen zu einer Abnahme der Vitalität der Oozysten. Dennoch waren auch nach Einsaat unbehandelter Oozysten manche PCR-Ergebnisse negativ (siehe Abb. 16). 104 Tabelle 16: PCR-Ergebnisse von HCT-8-Zellkulturen, die mit Neopredisan®-behandelten C.parvum-Oozysten infiziert wurden 1 x 104 Oozysten/Kalotte 1 x 105 Oozysten/Kalotte Neopredisankonzentration (%) n (Anzahl PCR-positiv n (Anzahl PCR-positiv Kulturansätze) (Prozente) Kulturansätze) (Prozente) 4 6 0 (0 %) 24 1 (4,2 %) 1 6 0 (0 %) 22 4 (18,2 %) 0,25 - - 20 3 (15,0 %) 0,0625 - - 7 2 (28,6 %) 0 - - 78 48 (61,5 %) Neopredisankonzentration negativ positiv 0,00% 0,0625% 0,25% 1% 4% 0% 20% 40% 60% 80% 100% Abb. 14: Anteil negativer und positiver PCR-Testergebnisse nach Infektion von HCT-8Zellkulturen mit Neopredisan® -behandelten Oozysten (1 x 105) 105 Neopredisankonzentration, 120 min Inkubation < Negativkontrolle < 0,0625 % < 0,25 % <1% <4 % < 0,0625 % < 0,25 % <1% <4% < 100-bp-Marker Abb. 15: PCR-Banden von HCT-8-Zellkulturen, die mit Neopredisan®-behandelten C.parvum-Oozysten infiziert wurden. Die Infektionsdosis betrug bei jedem Ansatz 1 x 105 Oozysten/Kalotte, die Inkubationszeit 120 min bei variabler Neopredisankonzentration. < Negativkontrolle < 1 x 105, 0,0625 % Neopredisan < 1 x 105 ,0,25 % Neopredisan < 1 x 105, 1 % Neopredisan < 1 x 105 ,4 % Neopredisan < 1 x 104 < 1 x 105 < 1 x 102 < 1 x 103 < 1 x 104 < 1 x 105 < 100-bp-Marker Abb. 16: PCR-Banden von mit Neopredisan®-behandelten C.-parvum-Oozysten infizierten HCT-8-Zellkulturen. Als Positivkontrollen wurden mit unbehandelten C.-parvumOozysten infizierte Zellkulturen in unterschiedlichen Oozystenzahlen verwendet. 106 4.5.6 Auswirkung der Desinfektionsdauer auf die Vitalität von C.-parvum-Oozysten Oozysten wurden über unterschiedliche Einwirkzeiten dem Desinfektionsmittel ausgesetzt, gezählt und in die Zellkultur gebracht. Von vier Ansätzen mit je 1 x 105 C.-parvum-Oozysten, die 30 min mit 1 % Neopredisan® behandelt wurden, blieben drei in der PCR negativ und eine Probe ergab ein positives Ergebnis. Bei einer verlängerten Desinfektionszeit von 60 oder 90 min waren alle 9 Ansätze negativ. Bei 120 min und 180 min konnten ebenfalls nur negative Ergebnisse ermittelt werden (siehe Tab. 17). Auch wenn bei 1 % Neopredisan® über 30 min die Oozysten die Infektiösität weitestgehend verloren haben, waren längere Inkubationszeiten mit einer höheren Sicherheit wirksam. Tabelle 17: PCR-Ergebnisse von mit C. parvum (1 x 105 Oozysten/Kalotte) infizierten HCT-8-Zellkulturen. Die Oozysten wurden Neopredisan® unterschiedliche Einwirkzeiten ausgesetzt Inkubationszeit (min) der Oozysten im Desinfektionsmittel PCR-Ergebnis 30 60 90 120 180 negativ 3 5 4 5 4 positiv 1 0 0 0 0 über 107 4.6 Vitalitätsnachweis durch Focuszählung Insgesamt wurden 88 Zellkulturen durch Focuszählung ausgewertet. Davon wurden 12 Negativkontrollen ohne Oozysten geführt, 28 Zellkulturen mit unbehandelten und 48 Zellkulturen mit behandelten C.-parvum-Oozysten infiziert. Die Auswertung erfolgte durch Zählung der Foci innerhalb eines begrenzten Feldes (Länge einer Kalotte und Breite eines Mikroskopierfeldes) der Zellkultur. 4.6.1 Infektion von HCT-8-Zellkulturen mit unterschiedlichen Oozystendosen HCT-8-Zellkulturen wurden mit unbehandelten C.-parvum-Oozysten in Konzentrationen von 1 x 101 bis 1 x 105 Oozysten infiziert, 48 h inkubiert und anschließend mit Sporo-Glo® behandelt (siehe Kap.3.1.5). Parallel dazu wurden Zellkulturen angelegt, die mit der gleichen Anzahl Oozysten infiziert wurden und mittels PCR ausgewertet wurden. Durchschnittlich konnten nach Einsaat von 1 x 105 C.-parvum-Oozysten mittels Fluoreszein-markiertem monoklonalen Antikörper gegen C. parvum 100,45 ±33,63 Foci gefunden werden. Weniger eingesäte Oozysten führten zu einer geringeren Focianzahl. Bei Einsaat von 1 x 104 Oozysten konnten noch durchschnittlich 20,13 ±14,88 Foci gefunden werden, während bei Zellkulturen, die mit 1 x 101 Oozysten infiziert wurden, durchschnittlich nur 0,05 ±0,10 Foci gezählt wurden. Die Einsaat von 1 x 105 Oozysten/Kalotte ergab signifikant (p < 0,05) mehr Foci als die eingesetzten niedrigeren Oozystenzahlen/Kalotte. Teilweise war die Hintergrundlumineszenz sehr stark, so dass ein anderer Bereich zur Zählung der Foci gewählt wurde. Mittels PCR konnten bei 1 x 105 und 1 x 104 Oozysten/Kalotte positive Ergebnisse erzielt werden. In der zweiten Titrationsreihe konnten bei Einsaat von 1 x 105 bis 1 x 102 Oozysten/Kalotte positive Ergebnisse ermittelt werden. Die nicht infizierte Kontrollgruppe lieferte ein negatives Ergebnis (siehe Abb. 17). In der PCR konnten somit vitale Oozysten ab einer Einsaat von 1 x 102 Oozysten/Kalotte nachgewiesen werden. In der Focuszählung korrelierten (Korrelationskoeffizient = 0,92) die Zählergebnisse mit der Anzahl der eingesäten Oozysten (siehe Abb. 18 und Anlage 1). 108 Oozystenanzahl/Kalotte < Negativkontrolle < 1 x 102 < 1 x 103 < 1 x 104 < 1 x 105 < 1 x 103 < 1 x 104 < 1 x 105 < 100-bp-Marker Abb. 17: PCR-Banden mit C.-parvum-Oozysten infizierter HCT-8-Zellkulturen in einer Titrationsreihe. Parallelansatz zur Auswertung von infizierten Zellkulturen mit Floureszein-markierten Antikörpern. 109 Focusanzahl 100,45 100 80 60 40 20,13 20 4,97 2,10 0,05 0 1000 100 10 1 0,1 0,00 Anzahl eingesäter 0 Oozysten (x 100)/Kalotte Abb.18: Mittelwerte der Focuszählung in der Zellkultur nach Markierung mit monoklonalen Anti-C.-parvum-Antikörpern (Sporo-Glo®). 4.6.2 Focuszählung nach Einsaat desinfizierter Oozysten Es wurden jeweils 12 Zellkulturen mit 1 x 105 Oozysten/Kalotte infiziert, die mit der gleichen Neopredisankonzentration (0,0625 %, 0,25 %, 1 % oder 4 %) behandelt wurden. Die Einwirkzeit von Neopredisan® betrug 120 min, die Inkubationszeit der infizierten Zellkultur 48 h. Mit der Abnahme der Neopredisankonzentration von 4 % bis auf 0 % nimmt die Focuszahl zu. Bei Anwendung von 4 % Neopredisan® konnten durchschnittlich 0,42 ±1,02 Foci gefunden werden. Bei 1 % Prozent Neopredisan® wurden durchschnittlich 2,11 ±3,84 Foci, bei 0,25 %, 1,65 ±1,79 Foci und bei 0,0625 % 39,47 ±25,88 Foci gezählt. Die Einsaat von C.-parvum-Oozysten, die nicht mit Neopredisan® behandelt waren, ergab durchschnittlich 100,45 ±33,63 Foci. Mit der Focuszählung konnte eine Minderung der C.-parvum-Vitalität bei steigender Neopredisankonzentration ermittelt werden (siehe Abb. 19). Es wurden signifikant 110 (p < 0,05) mehr Foci in den Zellkulturen mit unbehandelten Oozysten gefunden als bei Verwendung von mit 4 %, 1 %, 0,25 % oder 0,0625 % Neopredisan® behandelten Oozysten. Die parallel dazu durchgeführte PCR ergab eine spezifische Bande mit 0,25 % und 2 Banden mit 0,0625 % Neopredisan® behandelten Oozysten, höhere Konzentrationen ergaben negative Ergebnisse (siehe Abb. 20). Focusanzahl 100,45 100 80 60 39,47 40 20 0,42 2,11 4 1 1,65 0 0,25 0,0625 0 Neopredisankonzentration (%) Abb. 19: Mittelwerte der Focuszählung in der Zellkultur nach Infektion mit Neopredisan® behandelten Oozysten 111 Neopredisankonzentration, 120 min Inkubation < 0,25 % < 0,25 % <1% <4% <4% < 0,625 % < 0,625 % < 100-bp-Marker Abb. 20: PCR-Banden mit 1 x 105 Neopredisan®-behandelten C.-parvum-Oozysten infizierter HCT-8-Zelllkulturen. Die Inkubationsdauer des Neopredisans betrug 120 min. Parallelansatz zur Auswertung der Zellkulturen mit Floureszein-markierten Antikörpern 4.7 Infektion von Babymäusen Zur Überprüfung der PCR-Ergebnisse und Focuszählungen aus der Zellkultur bezüglich der Vitalität von C. parvum wurde eine Infektion von Mäusen mit behandelten und unbehandelten C.-parvum-Oozysten vorgenommen (siehe Kap. 3.1.6.2). Versuch 1 Um die Infektion von Babymäusen und die Auswertung des Tiermodells zu optimieren, wurden 17 Mäuse aus zwei Würfen mit behandelten (1 % Neopredisan® für 120 min; 4 % Neopredisan® für 120 min) oder unbehandelten C.-parvum-Oozysten (1 x 105 Oozysten/Maus) infiziert. Von den 17 Mäusen dienten 5 Mäuse als Negativkontrolle. Ihnen wurde ein gleiches Volumen Leitungswasser p.o. eingegeben. Die Auswertung beruhte bei 112 allen Mäusen auf der Beurteilung eines Nativausstrichs der Darmmukosa. Die Babymäuse machten alle einen vitalen Eindruck. Eine Markierung mit Pikrinsäure war täglich notwendig, da sie sich auf der Haut schnell abschwächte. Bei 8 Mäusen wurde der Darm mit 1 ml Leitungswasser gespült und anschließend eine Zählung der Oozysten in der Spülflüssigkeit vorgenommen. Die Oozystenzählung in der Spülflüssigkeit war durch Kotbestandteile beeinträchtigt. Im Nativausstrich waren alle Mäuse C.-parvum- positiv. Es konnten 1500 bis 23000 Oozysten/ml Spülflüssigkeit ermittelt werden. Zwei Mäuse, die mit 4 % Neopredisan® behandelte Oozysten erhielten, hatten 4500 und 9000 Oozysten/ml Spülflüssigkeit. Die höchste Anzahl Oozysten in der Spülflüssigkeit hatte eine Maus, die mit 1 x 105 unbehandelten Oozysten infiziert wurde (23000 Oozysten/ml Spülflüssigkeit). Zwei Mäuse, die keine Oozysten erhielten, wiesen dennoch 1500 und 9500 Oozysten/ml Spülflüssigkeit auf (siehe Tab. 18). Die Verwendung von Spülflüssigkeit zur Ermittlung der Parasitenanzahl bewährte sich weder in der Handhabung noch in der Auswertung. Eine Desinfektionswirkung ließ sich durch Oozystenzählung im Darm nicht zeigen. Eine akzidentelle Infektion von Mäusen konnte in diesem Versuchsansatz nicht verhindert werden, so daß der Versuch insgesamt nicht aussagekräftig war. 113 Tabelle 18: Infektion von Babymäusen (Versuch 1) Neopredisan® (%), Oozystenanzahl/ml 120 min Spülflüssigkeit 1 x 105 4 4500 + 1 x 105 4 9000 + 1 x 105 1 - + 1 x 105 1 - + 1 x 105 1 - + 1 x 105 0 - + 1 x 105 0 - + 1 x 105 0 - + 0 0 - + 0 0 - + 0 0 - + 1 x 105 0 23000 + 1 x 105 0 10500 + 0 0 1500 + 0 0 9500 + 1 x 105 0 4500 + 1 x 105 0 6500 + Oozystenanzahl Nativausstrich Versuch 2 Auf die Spülung des Darmes wurde im zweiten Versuch verzichtet. Die Auswertung erfolgte durch mikroskopische Untersuchung eines Nativausstriches und durch die histologische Untersuchung des Darmes. Im Nativausstrich wiesen die vier Mäuse der Negativkontrolle, die keine C.-parvum-Oozysten erhielten, keine Oozysten auf. In der Positiv-Kontrollgruppe, die mit 1 x 105 unbehandelten C.-parvum-Oozysten infiziert wurden, wiesen alle sieben Mäuse 114 Oozysten im Darm auf. Von fünf Mäusen, die mit 4 % Neopredisan® behandelte C.-parvumOozysten erhielten, waren vier negativ. Bei Verwendung von 1 % Neopredisan® waren alle sieben Mäuse negativ, während bei 0,25 % Neopredisan® drei von sechs negativ waren (siehe Tab. 19). Eine Infektion der Negativkontrolltiere konnte verhindert werden (siehe Kap. 3.1.6.2). Tabelle 19: C.-parvum-Nachweis im Nativausstrich von Mäusedärmen (Versuch-2) Oozysten/ Kalotte Neopredisankonzentration (%) negative Mäuse (n=) positive Mäuse (n=) 0 0 4 0 1 x 105 4 4 1 1 x 105 1 7 0 1 x 105 0,25 3 3 1 x 105 0 0 7 Zur histologischen Untersuchung wurden Mäusedärme drei negativer und zwei positiver Nativausstriche ausgewählt. Die Histologie von Ileum und Zäkum bestätigte im wesentlichen die Ergebnisse der mikroskopischen Beurteilung von Nativausstrichen. Lediglich im Darm einer Maus, die mit desinfizierten Oozysten (0,25 %) inokuliert worden war, wurde im Ausstrich ein positiver Befund erhoben, während die histologische Untersuchung sowohl im Ileum als auch im Zäkum ein negatives Ergebnis aufwies (siehe Tab. 20, Abb. 21-24). 115 Tabelle 20: Ergebnisse der mikroskopischen Beurteilung von Nativausstrichen und histologischen Präparaten C.-parvum-infizierter-Mäuse (Versuch-2) Oozystenanzahl/ Neopredisan- Kalotte konzentration (%) Nativausstrich Histologie Histologie Ileum Zäkum 0 0 - - - 1 x 105 4 - - - 1 x 105 1 - - - 1 x 105 0,25 + - - 1 x 105 0 + + + 116 Abb. 21: Ileum einer BALB/c-Babymaus aus der Negativkontrollgruppe. Keine C.-parvumOozysten oder Entwicklungsstadien sichtbar (Ölimmersion, 100x) Abb. 22: Ileum einer BALB/c-Babymaus aus der Positivkontrollgruppe. Zahlreiche C.parvum-Entwicklungsstadien im Bürstensaum (Ölimmersionm, 100x) 117 Abb. 23: Zäkum einer BALB/c-Babymaus aus der Negativgruppe. Keine C.-parvum Oozysten oder Entwicklungsstadien sichtbar (Ölimmersion, 100x) Abb. 24: Zäkum einer BALB/c-Babymaus aus der positivgruppe. C.-parvum Entwicklungstadien im Bürstensaum (Ölimmersion, 100x) 118 5. DISKUSSION 5.1 Gewinnung von C. parvum 5.1.1 Passagierung im Kalb Neben einer Passagierung im Kalb gibt es die Möglichkeit C.-parvum-Oozysten durch Infektion von immunsupprimierten Ratten (REGH 1991 a u. b) und Mäusen (PETRY et al. 1995, PETRY 1998), Ziegen (MITSCHLER et al. 1994) oder Lämmern zu gewinnen (UPTON et al. 1990). Viele Studien werden mit C.-parvum-Ausgangsmaterial gemacht, das aus Kälbern gewonnen wurde (LUFT et al. 1987, KORICH et al. 1990, GUT et al. 1991, FINCH et al. 1993, RASMUSSEN et al. 1993, FILKORN et al. 1994, GRIFFITH et al. 1994, FAYER 1995, FAYER et al. 1996, GRACZYK et al. 1997, SLIFKO et al. 1997 a u. b, DENG u. CLIVER 1998, GARGALA et al. 1999, HARRIS u. PETRY 1999, FREIRE-SANTOS et al. 2000). Kälber sind insbesondere von Vorteil, wenn, wie in dieser Studie eine hohe Parasitenanzahl benötigt wird. Die Kälber schieden bis zu 1 x 108 Oozysten/Tag aus. UPTON (1997) erhielt durch die orale Infektion mit 1 x 106 bis 12,5 x 107 Oozysten vom 5. bis 9. Tag p.i. bis zu 1 x 1012 Oozysten. Eine Ursache für die geringere Oozystenausbeute in der vorliegenden Arbeit könnte das zuvor verabreichte Kolostrum sein. Kolostrum kann keine Infektion verhindern, aber sie dennoch abmildern (PERRYMAN et al. 1999). Durch das gemeinsame Auffangen von Kot und Harn sollte ein Abschwemmen der Oozysten mit Harn vermieden werden. Die Futterumstellung auf Elektrolytlösung wurde im Gegensatz zu CURRENT (1990) nicht an einem bestimmten Tag (Tag 4 p.i.), sondern mit dem Beginn der Oozystenausscheidung vorgenommen. Diese Praktik hat sich hier durch alle Passagierungen von C. parvum bewährt. Insgesamt verlief die Passagierung von C. parvum im Kalb problemlos und abgesehen von der vorübergehenden Enteritis ohne Beeinträchtigung der Gesundheit des Tieres. Somit ist diese Methode gut geeignet, um Oozysten in ausreichender Menge für weitere Versuche zu gewinnen. 119 5.1.2 Anreicherung von C. parvum Bei der Anreicherung der Oozysten wurden Schleimhautbestandteile und geringe Blutbeimengungen gefunden. Dies wurde wahrscheinlich durch die hohe Infektionsdosis (1 x 107 Oozysten) verursacht. Es kann hierbei zur Entzündung und Hyperämie der Mukosa kommen (ROMMEL et al. 2000), wobei sich Schleimhautbestandteile ablösen können. Durch das gemeinsame Auffangen von Harn und Kot waren große Volumina zur Oozystengewinnung zu verarbeiten. Hierdurch kam es zu Oozystenverluste beim Sieben. Durch ein separates Auffangen des Kotes könnten Arbeitsschritte durch die Verarbeitung kleinerer Volumina vermieden werden und Oozystenverluste verkleinert werden. 5.1.3 Reinigung von C. parvum Für die Reinigung der Oozysten wurde Diethylether verwendet (CURRENT 1990, HARRIS u. PETRY 1999, FREIRE-SANTOS et al. 2000, VERGARA-CASTELBLANCO et al. 2000). Damit wurde eine ausreichende Entfernung von unverdauten Fettbestandteilen aus dem Kälberkot erreicht. Etherbehandelte C.-parvum-Oozysten exzystieren, die Sporozoiten sind motil, vital und können in vivo und in vitro Infektionen hervorrufen (RIGGS u. PERRYMAN 1987, CAMPBELL et al. 1992), so dass diese Methode den weiteren Versuchsablauf nicht beeinträchtigte und daher standardmäßig verwendet wurde. Die unbefriedigende Reinigung des Oozystenmaterials mit Percoll® kann durch die zu hohe Schmutzkonzentration bedingt sein. Schmutz und Bakterien konnten über einen Percoll®Gradienten erfolgreich entfernt werden, wenn zuvor eine Zuckerflotation erfolgte (KORICH et al. 1990, MEAD et al. 1990, GRIFFITH et al. 1994). UPTON (1997) hält eine Anreicherung der Oozysten über die Zuckerflotation vor einem Percoll®-Gradienten ebenfalls für vorteilhaft, da sich sonst eine beträchtliche Menge an Schmutz nachteilig auf die Percoll®Reinigung auswirkt. TAGHI-KILANI und SEKLA (1987) erhielten durch eine Natriumhypochloritbehandlung und anschließende Reinigung über einen Percoll®-Gradienten saubere Oozysten ohne Bakterien. Ohne Natriumhypochloritbehandlung konnten auf diese Weise auch dann keine sauberen Oozysten gewonnen werden, wenn die Zentrifugationszeit 120 von 10 auf 60 min verlängert wurde. In den eigenen Versuchen fand die Zentrifugation des Gradienten bei 1900 x g für 15 min statt. Dies war möglicherweise nicht ausreichend. REGAN et al. (1991) zentrifugierten bei 22000 x g für 30 min und TAGHI-KILANI u. SEKLA (1987) bei 16000 x g über 10 min. UPTON hingegen betrieb die Percoll®-Reinigung mit nur 400 x g über 30 min. Bei der Reinigung über einen Cäsiumchloridgradienten wurden ebenfalls durch höhere Zentrifugationsgeschwindigkeiten (16000 x g) bakterien- und schmutzfreie Oozystensuspensionen gewonnen (TAGHI-KILANI u. SEKLA 1987). In den eigenen Versuchen konnte mit Percoll® keine ausreichende Reinigung erreicht werden, somit wurde von dieser Methode Abstand genommen. Die Verwendung von Natriumhypochlorit (Chlorbleiche) zur Abtötung vorhandener Bakterien im Kälberkot hat sich bei der weiteren Aufbereitung der Oozystensuspension in den eigenen Studien in Einklang mit der Literatur als sinnvoll erwiesen. Uneinigkeit besteht in der besten Anwendungskonzentration und der Inkubationsdauer. Natriumhypochlorit wurde in hohen Konzentrationen von 5,25 % während 5 min (LIEBLER et al. 1986, TAGHI-KILANI u. SEKLA 1987, WOODMANSEE 1987, WOODMANSEE et al. 1987), 2 % über 10 min (BURAUD et al. 1991, RASMUSSEN et al. 1993) und einer niedrigen Konzentration von 0,05 % während 5 min (MEAD et al. 1990, FLANIGAN et al. 1991) mit Erfolg verwendet. Natriumhypochlorit hat bei 3 %iger Anwendung keinen Einfluß auf die Vitalität der Oozysten. Etwa 95 % der C.-parvum-Oozysten exzystieren nach der Anwendung von Natriumhypochlorit. WOODMANSEE (1987) hielt die Anwendung einer Chlorbleiche bei Verwendung der Oozysten in der Zellkultur sogar für notwendig, wenn zur Exzystierung keine Gallensalze verwendet wurden. FLANIGAN et al. (1991) ließen vor Anwendung der Chlorbleiche (0,05 %, 10 min) die Oozysten in 30 %iger Kochsalzlösung flotieren, um Schmutz zu entfernen. Die Anwendung einer gesättigten Kochsalzlösung hat sich in der vorliegenden Studie wegen der einfachen Handhabung und der schnellen Bearbeitung bewährt, wohingegen die aufwendige Schichtung von mehreren Gradienten in einem Zentrifugenröhrchen keine wesentlich besseren Resultate ergab. 121 5.2 Desinfektion der C.-parvum-Oozysten Die Anwendung von Isopropanol im Anschluß an die Oozysteninkubation war der entscheidende Schritt, um die Oozysten vom Desinfektionsmittel zu befreien. Ohne ausreichende Entfernung des Neopredisans ist eine Einsaat in die Zellkultur nicht möglich. Durch den MTT Test wurde gezeigt, dass Neopredisankonzentrationen von 0,002 % und weniger von den HCT-8-Zellen toleriert wurden, während höhere Rest-Konzentrationen die Zellkultur beeinträchtigen. FAYER et al. (1996) und KORICH et al. (1990) entfernten das Desinfektionsmittel durch Verdünnung mit Wasser und anschließende Zentrifugation. LINDSAY et al. (2000) (Decoquinat, 10, 50, 100 µMol), MARSHALL u. FLANIGAN (1992) (Paromomycin, 100–1000 µg/ml) und WOODS et al. (1996) (101 Substanzen in verschiedenen Konzentrationen) gaben gegen Cryptosporidium wirksame Substanzen zusammen mit den Oozysten in die Zellkultur. Die Auswirkungen der Substanzen auf die Zellkultur wurden hier nicht untersucht. MARSHALL u. FLANIGAN (1992) verwendeten für die Zellkultur HT-29-Zellen. Die Inkubation von Oozysten mit Desinfektionsmittel betrug 24 Stunden, während bei WOODS et al. (1996), LINDSAY et al. (2000) und in den eigenen Versuchen eine Inkubation von 48 Stunden stattfand. Diese hohen Einwirkzeiten des Desinfektionsmittels sind unter Praxisbedingungen nicht praktikabel. Somit wurde in den meisten Versuchen dieser Studie in Anlehnung an die DVG-Richtlinien mit einer Desinfektionsdauer von 120 min gearbeitet. Die Durchführung eines MTT-Tests vor Verwendung einer neuen Substanz in der Zellkultur ist sinnvoll, da dadurch eventuelle Reaktionen der Wirtskultur auf die Substanz und damit eine Verfälschung der Infektionsergebnisse vermieden werden kann. Zwar kann es bei den Oozysten im Anschluß einer Einwirkzeit hoher Neopredisankonzentration zu morphologischen Veränderungen kommen, das erlaubt aber keine Aussagen über die Vitalität der Oozysten. Die Veränderungen in der Oozystenform könnten durch osmotische Einflüsse während der Desinfektion bedingt sein, wobei Flüssigkeit aus der Oozyste diffundiert. Die Oozystenhülle erlangt ihre Stabilität durch drei Lagen unterschiedlicher Dicke (zusammen 40 nm), die netzartig aufgebaut sind (HARRIS u. PETRY 1999). Die Wand verhält sich sehr resistent gegenüber Ultraschall und proteolytischen 122 Substanzen (HARRIS u. PETRY 1999). Trypsin-Gallensalze, die eine Exzystierung auslösen können, lassen eine vorhandene Naht an einem Ende der Oozyste rupturieren (FAYER et al. 1997). Möglicherweise könnte die Naht ein Angriffort des Desinfektionsmittels sein, um die Oozyste zu deaktivieren. In den vorliegenden Versuchen waren die Formveränderungen der Oozysten untergeordnet zu bewerten, da dies keinen Einfluß auf die Vitalitätsprüfung hatte. 5.3 PCR 5.3.1 Extraktion genomischer DNA Der Vergleich von Phenol- und Ethanolextraktion zeigte annähernd vergleichbare PCRErgebnissen von mit C. parvum infizierten HCT-8-Zellkulturen bei denen nur eine Ethanolextraktion vorgenommen worden ist. Signifikante (p < 0,05) Unterschiede zwischen den Extraktionsmethoden wurden nicht gefunden. Die Aussagekraft der Ergebnisse zum Vergleich der Extraktionsverfahren waren jedoch durch die geringe Anzahl an Versuchen eingeschränkt. Immerhin deutet das negative Ergebnis bei Verwendung von 1 x 103 Oozysten und Phenolanwendung im Gegensatz zu der positiven PCR nach Ethanolextraktion bei dieser Oozystenzahl auf die bessere Eignung des Ethanols hin. Die Extraktion mit Phenol/Chloroform bei der Aufarbeitung von C.-parvum-DNA-Material kommt häufig zur Anwendung (WAGNER-WIENING u. KIMMIG 1995, JENKINS u. PETERSEN 1997, PETRY et al. 1998). Bei den meisten Aufarbeitungen von DNA-Material handelt es sich um gereinigte C.-parvum-Oozysten oder exzystierte Sporozoiten, die zuvor mit Natriumdodekylsulfat und Proteinase K (0,05-2,0 mg/ml) bei 42-60 °C inkubiert worden sind. Im Anschluß an die Phenolextraktion folgte eine Ethanol- (JENKINS u. PETERSEN 1997) oder Isopropanolfällung (WAGNER-WIENING u. KIMMIG 1995). Nach den eigenen Erfahrungen war das Ethanol dem Phenol zumindest ebenbürtig und so wurde aufgrund der Giftigkeit des Phenols auf die Phenolextraktion in den weiteren Versuchen verzichtet. 123 5.4 Zellkultur 5.4.1 HCT-8-Zellkultur Es wurde die Zelllinie HCT-8 ausgewählt, weil sie nach Literaturangaben die höchsten C.parvum-Infektionraten aufweist (UPTON et al. 1994 a). Sie wurde in zahlreichen in vitro Untersuchungen (UPTON et al. 1994 u. 1995, MAILLOT et al. 1997, SLIFKO et al. 1997 a u. b, SLIFKO et al. 1998, GARGALA et al. 1999) verwendet und ließ sich in den eigenenVersuchen problemlos handhaben. 5.4.2 MTT-Test Die Proliferationsaktivität von Zellkulturen kann durch den MTT-Umsatz der MitochondrienEnzyme wachsender Zellen gemessen werden (siehe Kap. 3.1.3.3). Je höher die gemessene Absorption ist, desto höher ist der MTT-Umsatz und die Vitalität der Zellen. Durch diesen Test sollte ermittelt werden, bei welcher Restkonzentration Neopredisan® ein negativer Einfluß auf die Zellkultur besteht, was die Versuchsergebnisse wesentlich beeinträchtigen kann. Grundsätzlich steigen die Absorptionswerte mit der Anzahl an HCT-8-Zellen an (siehe Tab. 10). Die Wirkung von Neopredisan® auf verschiedene HCT-8-Zellzahlen zeigte deutlich bei hohen Neopredisankonzentrationen (0,2 % u. 0,02 %) eine starke Abnahme der Zellaktivität, dargestellt durch die geringeren Absorptionswerte zwischen 0,019 und 0,044. Ab einer Neopredisankonzentration von 0,002 % oder weniger kam es zu einem signifikanten (p < 0,05) Anstieg der MTT-Werte, so dass davon auszugehen ist, dass in diesem Konzentrationsbereich die HCT-8-Zellen nicht negativ beeinflusst wurden (siehe Tab. 10). Die Absorptionswerte bei Verwendung von 0,002 % Neopredisan® (1,4 x 104 Oozysten) waren sogar teilweise höher als in den unbehandelten Kontrollen. Der MTT-Test erwies sich als geeignet, den Störeffekt von Desinfektionsmittelresten zu erkennen und festzulegen, wie viele Waschungen der Oozysten mindestens notwendig sind, um Neopredisan® aus der Oozystensuspension zu entfernen. Durch die Ermittlung der von den 124 HCT-8-Zellen tolerierbarten Restkonzentration, konnte ein Bereich der Neopredisankonzentration festgelegt werden, der einen negativen Einfluß auf die Testmethode ausschließt. 5.4.3 Zellkulturmedium Zur Inkubation infizierter Kulturen verwendeten GRIFFITH et al. (1994) und MAILLOT et al. (1997) Dulbeccos-modified-Eagles-Medium (DMEM). DENG und CLIVER (1998) nutzten zur Kultivierung Eagles-minimal-essential-Medium, während Leibovitz-Medium von FLANIGAN et al. (1991), MARSHALL und FLANIGAN (1992) und WIEST et al. (1993) verwendet wurden. Das Medium RPMI 1640 fand bei vielen anderen Untersuchungen zum in vitro Verhalten von C. parvum Anwendung (FLANIGAN et al. 1991, UPTON et al. 1994 a, UPTON et al. 1995, SLIFKO et al. 1997 a u. b). Die Kultivierung von C. parvum fand in verschiedenen Zelllinien (siehe Kap. 2.1.8.2) mit unterschiedlichen Medien statt. Vergleiche, die die Auswirkung von unterschiedlichen Medien (DMEM, RPMI-1640) auf die Vermehrung des Parasiten zeigen, sind nicht bekannt. Die Verwendung von RPMI-Medium erwies sich in den vorliegenden Versuchen als vorteilhaft, da das Wachstum der HCT-8-Zellen besser als in DMEM war. Mediumzusätze für infizierte Zellkulturen wirkten sich bei UPTON et al. (1995) positiv auf die in vitro Vermehrung von C. parvum aus. Der Vergleich infizierter Kulturen, die mit 25 verschiedenen Mediumzusätzen versetzt wurden, zeigte in der histologischen Auszählung ein höheres Oozysten-Wachstum bei Verwendung von Vitaminen (Ascorbinsäure (40µg/ml), Kalziumpanthotenat (2,3 µg/ml), Folsäure (1 µg/ml), 4-Aminobenzoesäure (4µg/ml)), Glukose (50 mM), Galaktose (50 mM) und FKS (> 5 %). Die Infektionsversuche wurden mit 68stündiger Inkubation in RPMI-1640, 10 % FKS, 15 mM HEPES und Antibiotikazusätzen gemacht (UPTON et al. 1995). Insulin erhöhte ebenfalls die Anzahl der Parasitenstadien in vitro (GUT et al. 1991, UPTON et al. 1995). SLIFKO et al. (1997 a u. b) verwendeten RPMI 1640 mit 1 % L-Glutamin (200mM), 5 % FKS und 2 % HEPES (1 M) in C.-parvumInfektionsversuchen. In den eigenen Studien konnte kein Nutzeffekt beim Einsatz von 125 verschiedenen Mediumsupplemente festgestellt werden (siehe Kap. 3.1.3.1), so dass die Kultivierung ausschließlich in RPMI erfolgte. 5.4.4 Vitalität von unbehandelten C.-parvum-Oozysten Um einen Vitalitätsassay für C. parvum zu entwickeln, war es zunächst erforderlich, einen Vergleichswert durch die Ermittlung der Vitalität von unbehandelten Oozysten zu ermitteln. Hierzu wurden die Oozysten zunächst zur Infektion auf 48-Kalotten-Zellkulturtestplatten eingesetzt und dann zur Verkleinerung der Volumina, bzw. zur erleichterten Auswertung in 96-Kalotten-Zellkulturtestplatten eingesetzt. Nur bei Einsaat von 1 x 103 Oozysten/Kalotte wurden signifikant (p < 0,05) mehr positive PCR-Ergebnisse in den 96- als in den 48Kalotten-Zellkulturtestplatten ermittelt, so dass für die folgenden Versuche aus praktischen Erwägungen, die 96 –Kalotten- Zellkulturtestplatten verwendet wurden.. Ein direkter Vergleich zwischen verschiedenen Typen von Zellkulturplatten zur C.-parvumKultivierung konnte in der Literatur nicht gefunden werden. LINDSAY et al. (2000) führt die C. parvum Kultivierung ebenfalls wegen der leichteren Auswertung mittels eines Substratgekoppelten-Antikörpers in 96-Kalotten-Zellkulturtestplatten durch. Zur Kultivierung von C. parvum werden auch häufig Lab-tek-chamber-slides (1 cm2/Kalotte) verwendet (FLANIGAN et al. 1991, GUT et al. 1991, WIEST et al. 1993, SLIFKO et al. 1997 a u. b), um anschließend eine direkte mikroskopische Beurteilung der Zellkultur zu erleichtern. In der vorliegenden Studie erhöhten sich die Anteile positiver PCR-Ergebnisse, sowohl bei der 48- als auch bei der 96-Kalotten-Zellkulturtestplatte, wenn die Anzahl der Oozysten erhöht wurde. Es wurden signifikant (p < 0,05) mehr positive PCR-Ergebnisse bei Einsaat von 1 x 105 Oozysten/Kalotte als bei Einsaat von 1 x 103 oder weniger Oozysten/Kalotte ermittelt. SLIFKO et al. (1997 a u. b) konnten in vitro ebenfalls eine Zunahme der Entwicklungsstadien bei steigender Oozystenanzahl beobachten. Die Auswertung erfolgte durch Zählung der Foci nach Markierung der Entwicklungsstadien mit einem Fluoreszein-gekoppelten-Antikörper. Während bei 10 eingesäten Oozysten 93 Foci/Kalotte gezählt wurden, betrug die Focianzahl 126 bei 1000 Oozysten/Kalotte bereits 13839 Foci/Kalotte (SLIFKO et al. 1997 a). In einer weiteren Studie betrug die Focianzahl 9,4 x 104 bei Einsaat von 1 x 104 Oozysten/Kalotte und bei 1 x 106 Oozysten/Kalotte 1,5 x 106 Foci (SLIFKO et al. 1997 b). In der vorliegenden Studie wies die Ausprägung der PCR-Banden deutliche Unterschiede auf. Banden nach Einsaat von 1 x 105 Oozysten/Kalotte waren wesentlich deutlicher als Banden, bei denen 1 x 104 oder 1 x 103 Oozysten/Kalotte eingesät wurden. Dieser subjektiv beobachtete Effekt könnte eine (semi-) quantitative Auswertung ermöglichen. Hierzu sind aber weitere Untersuchungen, beispielsweise unter Einsatz von Gelscannern oder bildanalytischer Techniken, nötig. In den vorliegenden Versuchen konnte mittels PCR C. parvum ab einer Konzentration von 100 eingesäten Oozysten nachgewiesen werden. Allerdings wurde ein spezifisches Signal bei dieser geringen Dosis bei nur 19,4 % der Kulturen ermittelt. Auch bei der Einsaat von höheren Oozystenzahlen (1 x 103 - 1 x 105 Oozysten/Kalotte) wurden nicht alle Kulturen in der PCR positiv. Die Nachweisgrenze für C. parvum mittels PCR liegt bei PETRY et al. (1998) bei 140 Oozysten und bei WU et al. (2000) sogar bei einer einzelnen Oozyste, jedoch erfolgte bei diesen Versuchen keine in vitro Kultivierung von C. parvum. WAGNER-WIENING u. KIMMIG (1995) erklärten falsch negative Ergebnisse durch die Anwesenheit von Enzymen (DNAase), die die Parasiten-DNA zerstören. In ihrer Studie wurden DNAase behandelte exzystierte Sporozoiten benutzt, um einen C. parvum Nachweis mittels PCR durchzuführen. Dies hat den Nachteil, dass nur Sporozoiten beurteilt wurden und keine Aussage über nicht exzystierte Oozysten getroffen wurde. Ebenso kritisch ist ein Vitalitätsnachweis über die Exzystierungsrate der Oozysten zu betrachten. CAMPBELL et al. (1992) betrachten nur exzystierte Oozysten als vital. KORICH et al. (1990) stellten die Exzystierung unbehandelter der Exzystierungsrate mit Ozon behandelten Oozysten gegenüber. Auch hier wurden nicht exzystierte Oozysten als abgetötet betrachtet. NEUMANN et al. (2000) stellten allerdings durch die Inokulation von nicht exzystierten Oozysten in Mäuse fest, das diese noch infizieren können und somit vital sind. Um auch diese Oozysten zu erfassen, wurde in der vorliegenden Studie eine Infektion von HCT-8-Zellkulturen mit zuvor nicht exzystierten Oozysten vorgenommen. 127 Theoretisch wäre nur eine sehr geringe Anzahl an Oozysten notwendig, um ein positives PCR Ergebnis zu erlangen, da sich C. parvum in vitro vermehrt. SLIFKO et al. (1997 b) konnten bereits nach 48 h Inkubation der Zellkultur Entwicklungsstadien beobachten, die durch eine Autoinfektion entstanden sind. Weiterhin konnten SLIFKO et al. (1997 b) nach 48 h in der FDM (siehe Kap. 2.1.8.3.1) 380 % mehr Foci finden als nach 24 h Inkubation. Die in vitro Vermehrung von C. parvum hängt neben der Verwendung einer geeigneten epithelialen Zelllinie (UPTON et al. 1994) und dem Kulturmedium (siehe Kap. 2.1.8.2) (UPTON et al. 1995) auch vom Alter der Oozysten ab. In der vorliegenden Studie wurden Oozysten bis zu einem Alter von drei Monaten verwendet. LIEBLER et al. (1986), RIGGS u. PERRYMAN (1987) und ARGENZIO et al. (1990) verwendeten ebenfalls bis zu drei Monate alte Oozysten, FLANIGAN et al. (1991) nutzten Oozysten bis zu einem Alter von zweieinhalb Monaten. FAYER (1995) hingegen benutzte in seinen Studien die Oozysten nur bis zu einem Alter von einem Monat. UPTON (1997) hält sechs Wochen alte C.-parvum-Oozysten für am besten zur in vitro Kultivierung geeignet. Ansonsten sollte die Exzystierungsrate überprüft werden und diese nach 90 min über 70 % liegen. Eine Passagierung war in der vorliegenden Studie aus Zeit- und Kostengründen nicht alle 6 Wochen möglich. Auch die Bestimmung der Exzystierungsrate war zu aufwendig und störanfällig. Die Verwendung bis zu 3 Monate alter Oozysten erschien aber in Übereinstimmung mit den meisten Literaturangaben als vertretbar. Grundsätzlich stellt die PCR nach Zellkultur ein vielversprechendes Modell zur Vitalitätsüberprüfung dar. Allerdings muss die Sensitivität und Reproduzierbarkeit noch verbessert werden, und die Störanfälligkeit der Methode erfordert sehr sorgfältiges Arbeiten. Ein standardisiertes Infektionsmaterial ist unbedingt erforderlich, eine Objektivierung der Signalauswertung wäre in höchstem Maße wünschenswert. 5.4.5 Inhibition mit Paromomycin (Tab. 13 u. 14) Paromomycin ist laut Literatur ein vielversprechender Wirkstoff im Einsatz gegen C. parvum (MARSHALL u. FLANIGAN 1992, FAYER u. ELLIS 1993 a, THEODES et al. 1998). In Vorversuchen wurde in Anlehnung an die Studie von MARSHALL u. FLANIGAN (1992) 128 eine Inhibition von C. parvum mit Paromomycin untersucht. Die Infektion von HCT-8Zellkulturen mit Paromomycin behandelten C.-parvum-Oozysten ergab in der eigenen Studie nur bei der ersten PCR ein negatives Ergebnis (Paromomycinkonzentration: 0,5 mg/ml), bei den übrigen 4 Ansätzen wurde jeweils eine spezifische Bande dargestellt. Eine ausbleibende Inhibition wurde durch die histologische Präparation in der vorliegenden Studie bestätigt, bei der selbst bei hohen Paromomycinkonzentrationen (5 mg/ml) C. parvum-Entwicklungsstadien zu finden waren. Hier lieferten die Negativkontrollen positive PCR-Ergebnisse. Die positiven Ergebnisse bei Verwendung von 10 Oozysten nach 6 h und nach 48 h Inkubation sind zweifelhaft, da die korrekte Einsaat weniger Oozysten sehr schwierig ist und nicht auszuschliessen ist, dass evtl. keine Oozysten eingesät wurden. Im Gegensatz dazu stehen die Ergebnisse von MARSHALL u. FLANIGAN (1992). Sie führten die Inhibition von C. parvum an HT-29 Zellen durch und werteten die Versuche durch Zählung der Schizontenstadien aus. Die Inhibition betrug bei 5 mg/ml 86 %, bei 0,5 mg/ml 35 % und bei 0,005 mg/ml noch 31 %. Der Vergleich ist jedoch nur bedingt möglich, da bei einer C.parvum-Infektion von HCT-8-Zellen mit einer ca. zehn mal höheren Infektionsrate zu rechnen ist als bei einer Infektion von HT-29-Zellen (UPTON et al. 1994 a). THEODES et al. 1998 konnten in Zellkulturversuchen eine Inhibition von 80 % erreichen, wenn die C.-parvumOozysten mit 2 mg/ml Paromomycin behandelt wurden. FAYER u. ELLIS (1993 a) bestätigten ebenfalls die inhibitorische Wirkung von Paromomycin, indem sie Behandlungsversuche an Kälbern mit Paromomycin (25, 50, 100 mg/kg) durchführten und signifikant weniger Oozysten im Kot feststellten. Die zu dem Paromomycinansatz parallel durchgeführten Versuche, infizierte Zellkulturen unterschiedlichen Inkubationszeiten auszusetzen, zeigten, dass Fehler in der ersten PCR durch Anlegen der Titrationsreihe oder durch Kontamination der Zellkulturen oder der PCR- Gefäße erfolgt sein müssen, da alle Negativkontrollen ein positives PCR-Ergebnisse ergeben haben (siehe Tab. 14). Eine inhibitorische Wirkung von Paromomycin konnte durch die vorliegenden Versuche nicht gezeigt werden. 129 5.4.6 Vitalität desinfizierter Oozysten 5.4.6.1 Auswirkung der Neopredisankonzentrationen Durch die Anwendung von Neopredisan® auf C. parvum sollte die Vitalität der Oozysten vermindert werden, und mit den PCR-Ergebnissen sollte der Vitalitätsverlust der Oozysten abgeschätzt werden. Bei Einsaat von mit Neopredisan® (1 %, 4 %) behandelten Oozysten (1 x 104) konnten im Gegensatz zu unbehandelten Oozysten keine positiven PCR-Ergebnisse ermittelt werden. Damit kann von einer drastischen Vitalitätsminderung durch Desinfektion ausgegangen werden. Die signifikanten (p < 0,05) Unterschiede zwischen den behandelten und unbehandelten Oozysten bestätigen die Vitalitätsminderung der Oozysten durch das Desinfektionsmittel. Die folgenden Untersuchungen fanden bei Einsaat von 1 x 105 Oozysten/Kalotte statt. Tendenziell nahm der Anteil der positiven Ergebnisse bei Senkung der Neopredisankonzentration zu. Jedoch ergaben nicht alle unbehandelten Oozysten positive PCR-Ergebnisse (siehe Kap. 5.4.1) und selbst mt 4 % Neopredisan® behandelte Oozysten ergaben nicht ausschließlich negative Ergebnisse. Der Grund, warum es trotz 4 %iger Neopredisanbehandlung einige positive PCR-Ergebnisse gab, ist unklar. Bei Anwendung von 1 % Neopredisan® waren 4 von 22 Proben positiv und bei 0,25 % waren 3 von 20 Proben positiv. Abbildung 14 zeigt einen direkten Vergleich der Ergebnisse von HCT-8Zellkulturinfektionen mit behandelten und unbehandelten C.-parvum-Oozysten. Hier wurde bei Einsaat von 1 x 103 Oozysten/Kalotte oder weniger Oozysten kein PCR-Ergebnis mehr erzielt. In der Regel waren bei höheren Neopredisankonzentrationen keine C.-parvumspezifischen Banden erkennbar. Eine mögliche Aussage über die Vitalitätsminderung könnte ein Vergleich nach Kultivierung behandelter und unbehandelter Oozysten ergeben. Wenn bei der Anwendung von 0,0625 % Neopredisan® eine Bande festgestellt wurde, so müssten mindestens 1000 vitale Oozysten vorgelegen haben, wenn die Grenze für eine sichtbares Signal bei 1 x 103 Oozysten liegt. Es lag eine Minderung der Oozysten um etwa 99000 Oozysten vor, wenn die behandelten 130 Zellkulturen (1 x 105 Oozysten/Kalotte, Behandlung: 4 %, 1 %, 0,25 %) in der PCR kein Signal ergaben. Dies würde einer Inhibition von ca. 99 % entsprechen. Die offensichtliche Störanfälligkeit des Prüfmodells lässt aber keine präzise Aussage bezüglich der Wirkung von Neopredisan® auf C.-parvum-Oozysten zu. Die Aussagekraft ist auch durch die rein qualitative Bewertung der PCR eingeschränkt. Eine (semi-) quantitative Auswertung zwischen PCR-Banden könnte hilfreich sein (siehe Kap. 5.4.1). BLACK et al. (1996) verglichen verschiedene Vitalitätsassays im Anschluß an eine chemische Desinfektion von C.-parvum-Oozysten. Sie verwendeten Ozon und Chlor zur Desinfektion. Die Exzystierungsrate (siehe Kap. 2.1.8.1), die Vitalfarbstoffmethode (siehe Kap. 2.1.7.3) und das Mausmodell (siehe Kap. 2.1.9) dienten als Vitalitätsassays. Die Exzystierungsrate und der Vitalfarbstoffmethode überschätzten die Vitalität. BLACK et al. (1996) sind der Meinung, dass die Exzystierung nach Stimulation noch nicht bedeutet, dass der Parasit einen kompletten Lebenszyklus im Wirt durchlaufen kann. In den vorliegenden Versuchen mussten sich die Oozysten in der Zellkultur weiterentwickeln, um später durch die PCR nachgewiesen zu werden. SLIFKO et al. (1995, 1997 a u. b) infizierten ebenfalls Zellkulturen und entwickelten auf diese Basis die FDM (foci-detection-method). Sie führten parallel die Vitalfarbstoffmethode, Exzystierung und Infektionen an der Maus durch (siehe Kap. 2.1.8.3.1.). Die FDM erwies sich hierbei als die sensitivste Methode und lieferte dem Mausmodell vergleichbare Infektionsergebnisse. Gegenüber der Merontenauszählung (MARSHALL u. FLANIGAN 1992, WIEST et al. 1993) ist das in der vorliegenden Studie durchgeführte Verfahren weniger zeitaufwendig und kann technisch noch vereinfacht werden. Um die Zuverlässigkeit und Sensitivität der Methode zu erhöhen, sind noch mehr Versuche nötig. Im Gegensatz zur Bestimmung der Exzystierungsrate wird in der vorliegenden Studie das Reproduktionsvermögen als Vitalitätsmaß verwendet (siehe Kap. 5.5.1), bei der die Gefahr einer Überschätzung der Vitalität, wie sie bei der Exzystierungsrate und der DAPI/PI Auswertung (siehe Kap. 2.1.7.3) vorkommt, geringer ist (BLACK et al. 1996). Um einen direkten Vergleich zu vitalen Oozysten und einen Ausschluß von falsch positiven und falsch negativen Ergebnissen zu erzielen sollte stets parallel mit unbehandelten Oozysten in einer Titrationsreihe gearbeitet 131 werden (WAGNER-WIENING u. KIMMIG 1995). WAGNER-WIENING u. KIMMIG (1995) schlagen vor, zwei PCR-Verfahren mit unterschiedlichen Primern gleichzeitig durchzuführen, um zuverlässigere Ergebnisse zu erhalten. Eine quantitative Aussage zur Vitalitätsminderung der Oozysten ist derzeit nur eingeschränkt möglich, da auch bei Einsaat hoher Anzahlen unbehandelter Oozysten einige negative PCRErgebnisse erzielt wurden. 5.4.6.2 Auswirkung der Inkubationszeiten Die Vitalitätsminderung der Oozysten bei unterschiedlicher Desinfektionsdauer wurde in Analogie zu nach DVG-Richtlinien üblichen Verfahren beurteilt. Inkubationszeiten des Neopredisans (1%) von 180 min, 120 min und 60 min lieferten ausschließlich negative PCRErgebnisse. Die 30minütige Anwendung von Neopredisan® lieferte ein positives und 3 negative Ergebnisse. Die Auswertung der PCR konnte nur qualitativ erfolgen. Weitere Versuche mit unterschiedlichen Konzentrationen und Desinfektionsdauern stehen zwar noch aus, wenn man aber von den Eintragungswerten des Neopredisans in der Desinfektionsmittelliste der DVG von 4 % bei einer Einwirkzeit von 120 min ausgeht, ist doch unter diesen Bedingungen eine Wirksamkeit in der vorliegenden Studie verwendeten C.parvum-Zellkultur-Modell zu erwarten ist. 5.5 Vitalitätsnachweis durch Focuszählung 5.5.1 Vitalität von unbehandelten C.-parvum-Oozysten Zum Vitalitätsnachweis durch Focuszählung wurden wie auch für die PCR Zellkulturen angelegt, die mit unbehandelten C.-parvum-Oozysten in einer Titrationsreihe infiziert wurden. Eine erhöhte Oozystenanzahl führte zu einer signifikant (p < 0,05) höheren Focianzahl. Die 132 Fokuszählungen korrelieren positv (Korrelationskoeffizient=0,929) mit der Anzahl eingesäter Oozysten. Ein Vergleich mit den PCR-Ergebnissen, die parallel dazu erhoben wurden, ist nur eingeschränkt möglich, da in der PCR die Ergebnisse nicht quantitativ ausgewertet wurden. In der PCR (Abb. 17) lag die Nachweisgrenze bei 1 x 102 eingesäten Oozysten/Kalotte. Bei der Focuszählung wurden durchschnittlich 2,10 Foci bei Einsaat von 1 x 102 Oozysten/Kalotte, bei 10 Oozysten/Kalotte wurden durchschnittlich 0,05 Foci ermittelt. SLIFKO et al. (1997 a) zählten bei Einsaat von 1 x 103 Oozysten/Kalotte 512 Foci/Kalotte nach 24 h und 13839 Foci nach 48 h Inkubation. Die extreme Erhöhung der Focianzahl begründeten sie durch eine Autoinfektion, bzw. zweite Replikation der Oozysten, die hier bereits nach 12 h erfolgte. In den vorliegenden Versuchen betrug die Focianzahl bei Einsaat von 1 x 105 Oozysten/Kalotte 100,45 Foci und bei 1 x 104 Oozysten/Kalotte 20,13 Foci. Die geringere Focizahl könnte durch die Verwendung eines anderen monoklonalen Antikörpers oder durch die älteren Oozysten begründet sein. Außerdem wurde in den vorliegenden Versuchen nicht die ganze Kalotte ausgezählt. SLIFKO et al. (1997 a) verwendeten einen Antikörper, der an alle Entwicklungsstadien von C. parvum bindet und einen zweiten Fluoreszein-gekoppelten Sekundärantikörper. Die Oozysten waren in den Versuchen von SLIFKO et al. (1997) nicht älter als einen Monat. Die Standardabweichungen betrugen in diesen Versuchen bis zu ein Drittel (±33,63) des Mittelwertes (100,45). Die Standardabweichung (±3873) bei SLIFKO et al. (1997 a) überschreitet zum Teil den Mittelwert (2960,20), d.h. es lagen erhebliche Schwankungen zwischen den einzelnen Focuszählungen der Kalotten vor. Der Variationskoeffizient lag bei SLIFKO et al (1997) bei 130 %, während in der vorliegenden Studie der Variationskoeffizient 33 % betrug. In der vorliegenden Studie wurden somit einheitlichere Ergebnisse als bei SLIFKO et al (1997) erzielt. Durch die Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, der spezifisch an die Entwicklungsstadien von C. parvum bindet, kann die tatsächliche Vitalität der Oozysten ermittelt werden. Leere Oozysten oder nicht exzystierte Oozysten werden nicht erfaßt. Die teilweise starke Hintergrundlumineszenz wirkte sich störend bei der Zählung der Foci aus, und es musste teils auf andere Flächen in der Kalotte zur Zählung ausgewichen werden. 133 SLIFKO et al. (1997 b) konnten aufgrund des starken Hintergrundes viele Kalotten nicht auswerten. Da auch schon geringe Oozystenzahlen Ergebnisse in der Focuszählung liefern, ist dieser Test sehr sensitiv und damit anfällig für falsch positive Ergebnisse, die durch geringste Pipettierfehler entstehen können. Dennoch ist im Vergleich zu in vivo Versuchen die Focuszählung kostengünstiger, reproduzierbar, praktikabel und erlaubt eine quantitative Auswertung der Ergebnisse (SLIFKO et al. 1997 a). Die Fokuszählmethode war in der vorliegenden Studie sensitiv, quantitativ auswertbar und zeigte einen direkten Zusammenhang zwischen eingesäter Oozystenzahl und gezählten Foci. Trotz möglicherweise gelegentlich falsch positiver Ergebnisse erscheint eine Weiterentwicklung dieser Methode zur Etablierung eines Vitalitätsassays mit Floureszeinmarkierten Antikörpern möglich zu sein. Im Gegensatz zur Auswertung von infizierten Zellkulturen durch eine PCR war die Focuszählmethode (semi-) quantitativ auswertbar. Weiterhin war die PCR-Methode arbeitsaufwendiger und die PCR-Ergebnisse waren nicht immer reproduzierbar, so dass aufgrund der eigenen Studien derzeit die Focuszählmethode zur Desinfektionsmitteltestung geeigneter erscheint. Der grundsätzliche Vorteil der PCR ist die Objektivierbarkeit der Beurteilung, so dass weitere Untersuchungen in dieser Hinsicht dennoch vielversprechend sein könnten. 5.5.2 Vitalität desinfizierter C.-parvum-Oozysten Wie schon die Focuszählung mit unbehandelten Oozysten infizierter Zellkulturen ergab, kann auch in der Desinfektionsmitteltestung nur ein eingeschränkter Vergleich zu den PCRErgebnissen vorgenommen werden. In der PCR wurden positive Ergebnisse nach Einsatz von 0,0625 % Neopredisan® und 0,25 % Neopredisan® infizierten Zellkulturen ermittelt. Eine zweite Bande bei Anwendung von 0,0625 % des Präparates war nur sehr schwach ausgeprägt (Abb. 15), ob ihr eine Bedeutung zukommt ist nicht klar. Die Stärke der Banden könnte quantitative Rückschlüsse erlauben, die entsprechende Methodik ist aber noch nicht erarbeitet. Somit kann nur die Aussage getroffen werden, dass in den Proben, die keine Bande ergaben, in der Regel weniger als 1 x 102 vitale Oozysten vorlagen. Dies ergibt sich aus der 134 Titrationsreihe, bei der normalerweise erstmals ein DNA-Produkt bei 1 x 102 Oozysten/Kalotte dargestellt war. Allerdings wurden gelegentlich auch bei höheren Infektionsdosen keine PCR-Produkte gefunden, so dass die Reproduzierbarkeit eingeschränkt war. Bei der Focuszählung konnten unabhängig von der Desinfektion Foci gefunden werden. Die Focianzahl nahm aber bei steigender Neopredisankonzentration ab. Es wurden signifikant (p < 0,05) weniger Foci gefunden, wenn die Oozysten zuvor mit Neopredisan® (0,0625 %, 1 %, 0,25 %, 4 %) behandelt wurden. Bei Anwendung von 0,0625 % Neopredisan® und 1 x 105 Oozysten konnten 39 oder 47 Foci ermittelt werden. Dies entspricht der Fokuszahl nach Einsaat von 1 x 105 und 1 x 104 unbehandelten Oozysten. Eine hohe Neopredisankonzentration (4 %, 1 x 105 Oozysten) lieferte durchschnittlich 0,42 Foci. Die Einsaat von 10 Oozysten ergab durchschnittlich 0,05 und die Einsaat von 100 Oozysten ergab durchschnittlich 2,10 Foci. Somit kann davon ausgegangen werden, das sich von den mit 4 % Neopredisan® behandelten Oozysten zwischen 10 und 100 vitale Oozysten in der Zellkultur entwickeln konnten. Dies entspricht einer Vitalitätsminderung der Oozysten um 99 %. Nach den DVG-Richtlinien sollte die Anwendungskonzentration eines Desinfektionsmittels bei 120 min Einwirkzeit wenigstens 98 % der Parasitenstadien hemmen. Somit ist dieses Ergebnis vielversprechend, jedoch sind zur Weiterentwicklung eines Routineverfahrens weitere Untersuchungen nötig. In der Literatur konnten zur chemischen Desinfektion und anschließenden Anwendung einer Focuszählung keine Ergebnisse gefunden werden. Durch die mikroskopische Auszählung der Objektträger liefert die Focuszählmethode zwangsläufig ein subjektives Ergebnis. Sie eignet sich zur Beurteilung der Vitalitätsminderung von Oozysten, dennoch ist eine quantitative Aussage nur eingeschränkt möglich, da ein gezählter Fokus einen Parasiten oder mehrere Entwicklungsstadien darstellen kann. 5.6 Infektion von Babymäusen Die erfolgreiche Infektion der Babymäuse hängt von verschiedenen Faktoren ab (siehe Kap. 2.1.9.). Als Infektionsmaterial dienten gereinigte behandelte oder unbehandelte C.-parvum- 135 Oozysten. Eine Infektion mit Sporozoiten (RIGGS u. PERRYMAN 1987), Fäzessuspension oder Darmhomogenat (TZIPORI et al. 1980, SHERWOOD et al. 1982) bei Mäusen führt ebenfalls zu einer Replikation des Parasiten. In der vorliegenden Studie wurde die gleiche Infektionsdosis (1 x 105 Oozysten/Maus), wie in der Zellkultur angewendet. Eine wesentlich geringere Oozystenzahl (79 Oozysten/Maus) kann bereits eine Infektionen in der Maus auslösen (FINCH et al. 1993). Eine Vorbehandlung durch kortisonhaltige Präparate (PETRY et al. 1995) ist bei Verwendung von Babymäusen, die noch empfänglich für C.-parvumInfektionen sind (FAYER 1995), nicht notwendig. Die Behandlung von C. parvum erfolgte wie im Zellkultursystem durch vorherige Inkubation der Oozysten im Desinfektionsmittel. RIGGS u. PERRYMAN (1987), KORICH et al. (1990) und BLACK et al. (1996) behandelten die Oozysten ebenfalls vor der Inokulation der Mäuse. REGH et al. (1991 a u. b) hingegen infizierten zuerst die Mäuse und versuchten dann über eine Behandlung der Mäuse über Trinkwasser und Futter eine Inhibition von C. parvum zu erreichen. Die Auswertung der Spülflüssigkeit aus dem Darm war nicht praktikabel und wurde somit in Versuch 2 nicht angewendet. Die Beurteilung über einen Nativausstrich der Darmmukosa war schneller und einfacher durchzuführen. CURRENT u. REESE (1986) und LIEBLER et al. (1986) untersuchten über ein Geschabsel verschiedene Darmabschnitte unter einem Interferenzkontrastmikroskop nach Entwicklungsstadien von C. parvum. UPTON u. GILLOCK (1996) und LINDSAY et al. (2000) werteten die C.-parvum-Infektion von Mäusen nach Homogenisierung des Darmtraktes in 10 ml 2,5 %iger Kaliumchloridlösung durch Zählung der Oozysten im Hämatozytometer aus. Die Homogenisierung von Ileum, Zäkum und Kolon mit einem Mixer wurde von FINCH et al. (1993) um eine anschließende Konzentrierung über einen Zuckergradienten ergänzt. Die elektronenmikroskopische Auswertung (VITOVEC u. KOUDELA 1988) und die Anfertigung histologischer Schnitte vom Darm ermöglicht ebenfalls eine Beurteilung der C.-parvum-Infektion. LIEBLER et al. (1986), VITOVEC u. KOUDELA (1988) und FAYER (1995) fixierten den Darm zuvor in 10 % Formalin und führten dann eine HE-Färbung (FAYER 1995) oder Giemsa-Färbung (VITOVEC u. KOUDELA 1988) vor der mikroskopischen Auswertung durch. 136 Im zweiten eigenen Versuch wurde von einigen Mäusedärmen eine histologische Auswertung vorgenommen. FINCH et al. (2000) bewerteten die histologischen Untersuchungen ebenfalls durch Einteilung in positive und negative Ergebnisse. VITOVEC u. KOUDELA (1988) beurteilten die Mäuseinfektion nach verschiedenen Kategorien (moderate, mittlere, mehrere, massive Infektionen), während LINDSAY et al. (2000) eine Zählung der Oozysten und FAYER (1995) eine Zählung der infizierten epithelialen Zellen vornahmen und eine prozentuale Angabe der infizierten Zellen machten. Die Einteilung in positive und negative Ergebnisse ist einfach und schnell durchzuführen, gibt aber keine Auskunft über den Grad der Infektion. Andererseits ist der Infektionsverlauf in der Maus in hohem Maße variabel, so dass quantitatve Bewertungen nicht mit hinreichender Sicherheit möglich sind, bzw. einen sehr eingeschränkten Aussagewert haben. In Versuch 2 blieben alle nicht infizierten Mäuse negativ und alle Mäuse, die mit unbehandelten Oozysten infiziert worden waren, wurden sowohl im Nativausstrich als auch bei der histologischen Untersuchung positiv. Mit 4 % Neopredisan® (1 x 105 Oozysten/Kalotte) desinfizierte Oozysten ergaben ein positives und 4 negative Ergebnisse. Das positive Ergebnis steht im Widerspruch zur Beobachtung, dass im gleichen Versuch bei geringerer Neopredisankonzentration von 1 % alle 7 Mäuse negativ waren. Es könnte trotz Vorsichtsmaßnahmen zu einer akzidentellen Infektion gekommen sein. Schon eine geringe Oozystendosis von 79 Oozysten kann ausreichend für eine Infektion sein (FINCH et al. 1993). Bei Verwendung von 0,25 % Neopredisan® konnten 3 negative und 3 positive Nativausstriche ermittelt werden. In der Zellkultur hingegen waren 85 % der untersuchten Proben bei gleicher Neopredisankonzentration negativ. Die histologischen Ergebnisse entsprechen im allgemeinen den Ergebnissen der Nativausstriche. BLACK et al. (1996) hält eine Infektion im Tiermodell für aussagekräftiger als die Bestimmung der Exzystierungsrate oder die Verwendung der Vitalfarbstoffmethode. Durch die geringe Anzahl von Nativausstrichen ist die Aussagekraft der eigenen Ergebnisse eingeschränkt. Das Mausmodell ist jedoch aus ethischen und methodischen Gründen nicht als ideal zu betrachten, so dass auf eine Ausweitung der tierexperimentellen Studien verzichtet wurde. 137 Die Infektion von Mäusen wurde vergleichend zu den in vitro Untersuchungen durchgeführt. Mit der Vitalitätsabschätzung in vitro ergibt sich die Perspektive künftig auf Tierversuche verzichten zu können, allerdings sind noch grundlegende Verbesserungen hinsichtlich der Sensitivität und Reproduzierbarkeit erforderlich. 5.7 Schlußfolgerung Der in dieser Studie entwickelte Vitalitätsassay für C. parvum-Oozysten bedarf weiterer Untersuchungen. Zwar ist ein Vitalitätsnachweis von C. parvum in vitro durch PCRAuswertung von infizierten Zellkulturen im Prinzip möglich, aber es besteht nach wie vor Bedarf für erhebliche Verbesserungen, bevor dieses Verfahren z.B. für Desinfektionsmitteltestungen verwendet werden kann. Quantifizierung durch bildanalytische oder andere Verfahren könnte die Aussagekraft verbessern und hin zu einem routinemäßig anwendbaren Modell führen. Die Markierung infizierter Zellkulturen mit monoklonalen Antikörpern ist schneller durchzuführen als die PCR. Die Fokuszählmethode kann allerdings zu falsch positiven Ergebnissen führen. Das Mausmodell hatte den größten finanziellen Aufwand und ist mit ethischen Problemen belastet. Die Verwendung größerer Probenzahlen ist in vitro einfacher zu realisieren. Damit ist zwar noch kein in der Praxis anwendbares in vitro Modell als Vitalitätsassay verfügbar, die vorliegenden Studien lassen aber erwarten, dass eine Methode auf Basis der Focuszählmethode oder einer PCR etablierbar ist. 138 6. ZUSAMMENFASSUNG Zur Vitalitätsprüfung von Cryptosporidium parvum wurden Oozysten dem Desinfektionsmittel Neopredisan® in verschiedenen Konzentrationen (4 %, 1 %, 0,25 %, 0,0625 %, 0 %) und Inkubationszeiten (30, 60, 90, 120 min) ausgesetzt, anschließend vom Desinfektionsmittel befreit und zur Infektion von Zellkulturen und Mäusen verwendet. Die Unschädlichkeit von Desinfektionsmittelresten in Konzentrationen bis zu 0,002 % für HCT-8Zellen wurde im MTT-Test belegt. Zur Ermittlung der C.-parvum-Vitalität wurden insgesamt 339 Zellkulturen verwendet, die mit desinfizierten oder nicht desinfizierten C.-parvum-Oozysten infiziert wurden. Die Wirtszell-DNA und Parasiten-DNA wurde gewonnen und mit einem kryptosporidienspezifischen Primer wurde eine PCR durchgeführt. Im Agarosegel wurde eine spezifische Bande bei 649 bp dargestellt. Positive PCR-Ergebnisse wurden ab einer Einsaat von 1 x 102 Oozysten/Kalotte ermittelt. Die Zunahme der Oozystenzahl/Kalotte führte zu einer Zunahme der positiven PCR-Ergebnisse. Bei Einsaat von 1 x 102 Oozysten waren 16 % der Kulturen (n=25) in der PCR positiv, während bei Verwendung von 1 x 105 Oozysten 67,4 % der Kulturen (n=43) PCR-positiv waren. Die Infektion von HCT-8-Zellkulturen mit desinfizierten Oozysten führte in Abhängigkeit von der Desinfektionsmittelkonzentration zu einer Abnahme des Anteils positiver PCRErgebnisse. Bei Anwendung von 4 % Neopredisan® war nur eine von 24 Kulturen positiv, während bei einer geringeren Konzentration von 0,0625 % Neopredisan® 28,6 % der Kulturen positive PCR Ergebnisse lieferten. Von 78 Kontrollkulturen, die nicht desinfizierte Oozysten erhielten, waren 61,5 % positiv. Die PCR-Banden nach Einsaat von mit Neopredisan® behandelten Oozysten waren schwächer ausgeprägt. Bei Inkubationszeiten über 30 min nahm die Zahl positiver PCR-Ergebnisse ab. Die Anwendung eines Floureszein-gekoppelten monoklonalen Antikörpers bestätigte den Vitalitätsverlust der Oozysten bei Anwendung von 4 % Neopredisan® über 120 min. Es 139 wurden hierbei durchschnittlich nur 0,42 Foci/105 eingesäten Oozysten gezählt. Im Gegensatz dazu wurden bei Einsaat von 100 unbehandelten Oozysten 45 Foci gezählt. Die Zählung der Foci in der Zellkultur ist nur eingeschränkt quantitativ auswertbar, da ein Focus einen oder mehrere Parasitenstadien darstellen kann. Durch die Kombination der Infektion von Zellkulturen mit desinfizierten und unbehandelten C.-parvum-Oozysten und anschließende PCR konnte die Vitalität der Oozysten abgeschätzt werden. Allerdings mangelt es der Methode noch an Reproduzierbarkeit und einer (semi-) quantitativen Bewertbarkeit. 140 7. SUMMARY E. Eckert (2001) Studies on the viability assessment of Cryptosporidium parvum. In order to evaulate the viability of Cryptosporidium parvum, oocysts were treated with the disinfectant Neopredisan® in varying concentrations (4 %, 1 %, 0.25 %, 0.0625 %, 0 %) and incubation times (30, 60, 90, 120 min), after which the disinfectant was removed and cell cultures and mice were infected. The remaining disinfectant was demonstrated not to be noxious for cell cultures in concentrations of 0.002 % or less, as shown in an MTT-assay. For the determination of C. parvum viability a total of 339 cell cultures were used which were infected with disinfected or untreated oocysts of C. parvum. DNA from host cells and parasites was harvested and PCR was carried out using Cryptosporidium-specific primers. A specific band of 649 bp was demonstrated on an agarose gel. PCR was found to be positive from a concentration of 1 x 102 oocysts/well. Increasing numbers of oocysts/well also increased the numbers of positive PCR results. When 1 x 102 oocysts were seeded 16 % of the cultures (n=25) were positive, while 67.4 % of the cultures with 1 x 105 oocysts (n=43) were positive. Depending on the concentration of disinfectant the infection of HCT-8 cell cultures with disinfected oocysts lead to a decrease of positive PCR-results. After application of 4 % Neopredisan® only one out of 24 cultures was positive, while at lower concentrations of 0.0625 % Neopredisan® 28.6 % of the cultures were PCR-positive. Of the 78 control cultures seeded with untreated oocysts 61.5 % were positive. The PCR-bands were weaker after seeding of Neopredisan®-treated oocysts. After incubation for 30 min the number of positive PCR results decreased. 141 Application of a fluorescein-conjugated monoclonal antibody verified the loss of oocyst viability after application of 4 % Neopredisan® for120 min. Per average 0.42 foci/105 seeded oocysts were counted. In contrast, after seeding of 100 untreated oocysts 45 foci were counted. The quantitiative evaluation of foci counts in cell culture is limited since a single focus can represent one or more parasite stages. With the combination of infection of cell cultures with disinfected or untreated C. parvum oocysts followed by PCR the oocyst viability could be estimated. However, the method still lacks reproducibility and the possibility of (semi-) quantitative estimation. 142 8. LITERATURVERZEICHNIS AJI, T., T. FLANIGAN, R. MARSHALL, C. KAETZEL u. M. AIKAWA (1991): Ultrastructural study of asexual development of Cryptosporidium parvum in a human intestinal cell line. J. Protozool. 38, 82S-84S ANGUS, K. W., W. T. 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Res. 5, 149-156 170 Anlage 1: Ergebnisse der Versuche mit fluoreszierenden Antikörpern Oozysten- NeopreNr.: anzahl/ disan Zählung Zählung Zählung Zählung Zählung x 1 2 3 4 5 Focizahl ±s Kalotte (%) 1 1 x 105 0 128 131 198 117 180 150,8 35,83 2 1 x 105 0 78 73 76 96 81 80,8 8,98 3 1 x 104 0 50 47 40 14 23 34,8 15,64 4 1 x 104 0 43 47 57 44 21 42,4 13,18 5 1 x 103 0 11 7 3 12 8 8,2 3,56 6 1 x 103 0 26 4 2 11 4 8,6 9,89 7 1 x 102 0 5 2 1 4 1 2,6 1,82 8 1 x 102 0 7 5 1 2 0 3,0 2,92 9 1 x 105 4 0 0 0 0 0 0,0 0,00 10 1 x 105 4 0 0 0 0 0 0,0 0,00 11 1 x 105 1 0 0 3 0 0 0,6 1,34 12 1 x 105 1 0 0 0 0 0 0,0 0,00 13 1 x 105 0,25 0 0 0 0 0 0,0 0,00 14 1 x 105 0,25 0 0 0 0 0 0,0 0,00 15 1 x 105 0,0625 106 102 43 132 80 92,6 33,31 16 1 x 105 0,0625 114 38 48 58 59 63,4 29,54 17 1 x 105 4 9 5 2 0 0 3,2 3,83 18 1 x 105 4 3 0 0 5 1 1,8 2,17 19 1 x 105 1 4 6 4 0 0 2,8 2,68 20 1 x 105 1 19 13 7 17 4 12,0 6,40 21 1 x 105 0,25 7 0 0 0 0 1,4 3,13 22 1 x 105 0,25 0 4 1 4 6 3,0 2,45 23 1 x 105 0,0625 33 97 42 56 46 54,8 24,99 24 1 x 105 0,0625 43 35 25 26 42 34,2 8,53 171 Anlage 1: Ergebnisse der Versuche mit fluoreszierenden Antikörpern Oozysten- NeopreNr.: anzahl/ Kalotte disan (%) Zählung Zählung Zählung Zählung Zählung x 1 2 3 4 5 Focizahl ±s 25 1 x 105 0 80 48 97 132 68 85,0 31,76 26 1 x 105 0 57 62 83 134 90 85,2 30,59 27 1 x 104 0 53 25 20 12 16 25,2 16,27 28 1 x 104 0 15 26 25 20 37 24,6 8,20 29 1 x 103 0 6 0 16 2 8 6,4 6,23 30 1 x 103 0 8 15 8 0 2 6,6 5,90 31 1 x 102 0 4 4 10 2 0 4,0 3,74 32 1 x 102 0 5 0 7 3 0 3,0 3,08 33 1 x 101 0 0 0 1 0 0 0,2 0,45 34 1 x 101 0 0 0 0 0 0 0 0,00 35 0 0 0 0 0 0 0 0 0,00 36 0 0 0 0 0 0 0 0 0,00 39 0 0 0 0 0 0 0 0 0,00 40 0 0 0 0 0 0 0 0 0,00 41 1 x 104 0 5 40 31 20 7 20,6 15,11 42 1 x 104 0 9 2 23 7 12 10,6 7,83 43 1 x 104 0 1 0 0 0 3 0,8 1,30 44 1 x 104 0 2 8 0 0 0 2 3,46 45 1 x 103 0 0 0 0 0 0 0 0,00 46 1 x 103 0 0 0 0 0 0 0 0,00 47 1 x 102 0 0 0 0 0 0 0 0,00 48 1 x 102 0 0 0 0 0 0 0 0,00 49 1 x 101 0 0 0 0 0 0 0 0,00 50 1 x 105 0 0 0 0 0 0 0 0,00 172 Anlage 1: Ergebnisse der Versuche mit fluoreszierenden Antikörpern Oozysten- NeopreNr.: anzahl/ Kalotte disan (%) Zählung Zählung Zählung Zählung Zählung x 1 2 3 4 5 Focizahl ±s 51 0 0 0 0 0 0 0 0 0,00 52 0 0 0 0 0 0 0 0 0,00 53 0 0 0 0 0 0 0 0 0,00 54 0 0 0 0 0 0 0 0 0,00 55 0 0 0 0 0 0 0 0 0,00 56 0 0 0 0 0 0 0 0 0,00 57 1 x 105 4 0 0 0 0 0 0 0,00 58 1 x 105 4 0 0 0 0 0 0 0,00 59 1 x 105 1 0 0 0 0 0 0 0,00 59 0 0 0 0 0 0 0 0 0,00 60 1 x 105 1 0 0 0 0 0 0 0,00 60 0 0 0 0 0 0 0 0 0,00 61 1 x 105 0,25 0 5 4 3 3 3 1,87 62 1 x 105 0,25 0 0 6 7 3 3,2 3,27 63 1 x 105 0,0625 38 10 37 29 59 34,6 17,67 64 1 x 105 0,0625 76 40 27 26 21 38 22,37 65 1 x 105 4 0 0 0 0 0 0 0,00 66 1 x 105 4 0 0 0 0 0 0 0,00 67 1 x 105 1 12 0 0 1 0 2,6 5,27 68 1 x 105 1 1 2 0 0 2 1 1,00 69 1 x 105 0,25 16 8 1 3 1 5,8 6,38 70 1 x 105 0,25 0 0 0 0 0 0 0,00 71 1 x 105 0,0625 6 28 39 11 19 20,6 13,24 72 1 x 105 0,0625 59 55 81 15 44 50,8 24,11 73 1 x 105 4 0 0 0 0 0 0 0,00 173 Anlage 1: Ergebnisse der Versuche mit fluoreszierenden Antikörpern Oozysten- NeopreNr.: anzahl/ Kalotte disan (%) Zählung Zählung Zählung Zählung Zählung x 1 2 3 4 5 Focizahl ±s 74 1 x 105 4 0 0 0 0 0 0 0,00 77 1 x 105 0,25 0 0 3 2 0 1 1,41 78 1 x 105 0,25 5 0 2 1 0 1,6 2,07 79 1 x 105 0,0625 65 25 29 39 24 36,4 17,05 80 1 x 105 0,0625 69 42 38 63 29 48,2 17,05 81 1 x 105 4 0 0 0 0 0 0 0,00 82 1 x 105 4 0 0 0 0 0 0 0,00 83 1 x 105 1 0 0 0 0 0 0 0,00 85 1 x 105 0,25 0 0 1 0 0 0,2 0,45 86 1 x 105 0,25 3 0 0 0 0 0,6 1,34 87 1 x 105 0,0625 0 0 0 0 0 0 0,00 88 1 x 105 0,0625 0 0 0 0 0 0 0,00 174 175 DANKSAGUNG Herrn Univ.-Prof. Dr. A. Daugschies danke ich sehr herzlich für die Überlassung des interessanten Themas, die Breitstellung des Arbeitsplatzes und die jederzeit gewährte Unterstützung und Gesprächsbereitschaft bei dieser Arbeit. Den Mitarbeitern des Instituts für Parasitologie, insbesondere Frau B. Ruttkowski danke ich herzlich für die freundliche Aufnahme und immerwährende Hilfsbereitschaft. Besonders danke ich Frau Dr. A. Joachim für ihre Anregungen, stets entgegengebrachte Hilfe und die schnelle Durchsicht der Manuskripte. Herrn Dr. F. Petry und seinen Mitarbeitern vom Institut für Mikrobiologie und Hygiene, Johannes Gutenberg Universität, Mainz danke ich herzlich für die Bereitstellung der Parasiten, sowie besonders für die freundliche Unterstützung und Hilfestellung bei der Einführung in die Zellkulturtechnik und die PCR. Herrn Prof. Dr. Pohlenz und den Mitarbeitern des Institutes für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover danke ich für die Anfertigung der histologischen Schnitte. Bei meinen Freunden und Verwandten, die mich jederzeit aufgemuntert haben, möchte ich mich bedanken. Ein ganz besonderer Dank gilt meinen Eltern, die mir durch ihre unermüdliche Unterstützung den Weg bis hierher erst möglich gemacht haben. Nicht zuletzt danke ich meinem Mann Marc für sein Verständnis, seine aufmunternden Worte und stetige Unterstützung. 176 WISSENSCHAFTLICHE VERÖFFENTLICHUNGEN: PFLÜGER, E., F. PETRY, A. JOACHIM u. A. DAUGSCHIES: Development of an in vitro assay for the viability of Cryptosporidium oocysts. In: 19. Tagung der Deutschen Gesellschaft für Parasitologie e. V. 28.03-1.04.2000, Stuttgart-Hohenheim
