Auf Proteinjagd in der T-Zelle - Wiley-VCH

Einzelmolekül-Mikroskopie
Auf Proteinjagd in der T-Zelle
M ARIO B RAMESHUBER | M ANUEL M ÖRTELMAIER
Physik muss sich nicht nur mit toter Materie beschäftigen.
Die Biophysik eröffnet zum Beispiel seit kurzem neue Einblicke
in Lebensvorgänge auf der Nanometerskala.
as menschliche Immunsystem besitzt die Fähigkeit, eine Vielzahl potenzieller Krankheitserreger zu detektieren und zielgerichtet zu zerstören. Die Stärke dieser Immunantwort richtet sich dabei in intelligenter Weise nach
der Gefährlichkeit des jeweiligen Eindringlings.
Wie die verschiedenen Zellen des Immunsystems diese
erstaunliche Erkennungs- und Neutralisierungsleistung im
Detail vollbringen, kann man nur verstehen, wenn man ihre biomolekulare Maschinerie genau erforscht. Genau dies
machen jetzt die Methoden der ultrasensitiven Einzelmolekül-Mikroskopie möglich: Mit ihr können Forscher biologische Strukturen – und das ist das Novum – in lebenden,
aktiven Zellen mit einer Auflösung von weniger als fünfzig
Nanometern lokalisieren und verfolgen. Das ermöglicht somit auch neue Einsichten in die Funktionsweise einer besonderen Gruppe von Zellen bei Menschen und Tieren. Es
sind die T-Zellen, die bei der Auslösung immunologischer
Reaktionen eine Schlüsselrolle spielen. An diesen Zellen
forscht unsere Arbeitsgruppe am Institut für Biophysik der
Universität Linz.
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„Immunologische
Synapse“
T Zelle
Lebende Nanorechner
T Zelle
Antigen präsentierende Zelle
Antigen präsentierende Zelle
Zellmaterial aus der Umgebung
Eine T-Zelle begegnet einer Antigen präsentierenden Zelle (APC). Die APC trägt auf
ihrer Oberfläche Zellmaterial von körpereigenem Gewebe und gelegentlich solches
von Krankheitserregern. Auf dieses reagiert die T-Zelle mit der Formierung eines
Saugnapf artigen Kontaktes, der Immunologischen Synapse.
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T-Zellen schützen unseren Körper
T-Zellen – ihr Name leitet sich von „Thymusdrüse“, dem
Ort ihrer Reifung im Körper ab – sind so etwas wie die Manager des Immunsystems. Diese kleinen, runden Zellen haben einen Durchmesser von etwa fünf Mikrometern, also
etwa ein Zehntel des Durchmessers eines menschlichen
Haares. Sie durchwandern den Organismus und kommen
dabei – zum Beispiel in der Haut – mit so genannten Antigen präsentierenden Zellen (englisch abgekürzt APC) in
Kontakt. Die T-Zellen finden an der Oberfläche dieser APCs Fragmente von Zellmaterial, das diese aus der Umgebung
aufgesammelt haben und nun dem Immunsystem präsentieren. Die APCs tun dies allerdings wahllos, sind also in
einem gewissen Sinne „blind“, und zeigen folglich auf ihrer
Oberfläche sowohl gefährliches als auch ungefährliches
Material.
Hier bringt nun die T-Zelle eine entscheidende Eigenschaft ins Spiel. Dazu schmiegt sie sich eng an die APC und
formt eine flache, an einen Saugnapf erinnernde Grenzfläche, die so genannte Immunologische Synapse (Abbildung 1). In dieser Position verharrt die T-Zelle für wenige
Minuten bis hin zu einigen Stunden. Über molekulare
Mechanismen, die wir erst ansatzweise verstehen, kann sie
nun das Ausmaß der Bedrohung durch das präsentierte
Material „abschätzen“. Falls die Bedrohung ausreichend
hoch ist, beginnt die T-Zelle unverzüglich damit, andere
Zellen des Immunsystems über chemische Botenstoffe zu
alarmieren, etwa Antikörper produzierende B-Zellen oder
Fresszellen. Um die Schlagkraft dieses Signals zu vergrößern,
teilt sich die T-Zelle in tausende Kopien ihrer selbst; diese
neuen Zellen wachsen dabei auch noch auf das vielfache
Volumen der ursprünglichen T-Zelle an.
DOI:10.1002/piuz.200401045
T-Zellen kann man sich also gewissermaßen als CPUs des
Immunsystems vorstellen. Sie bekämpfen eingedrungene
Krankheitserreger nicht direkt, sondern steuern und koordinieren vielmehr andere Zelltypen des Immunsystems. Die
verteilte Rechenleistung des so entstehenden Regelsystems
ist nicht zu unterschätzen: Einerseits muss das Immunsystem gefährliche Krankheitserreger früh und zuverlässig
identifizieren, andererseits muss es aber unbedingt tolerant
gegenüber jedem Einzelnen der über 100 000 körpereigenen Proteinen bleiben. Sonst drohen Autoimmunerkrankungen wie Diabetes oder Multiple Sklerose, bei denen das
Immunsystem Körpergewebe angreift und abbaut.
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Schließlich muss das Immunsystem auch noch angemessen Nachsicht gegenüber den zahlreichen unschädlichen Bakterien, Amöben und Pilzen üben, die wir auf der
Haut, an den Schleimhäuten und im Darm mit uns tragen.
Diese „Hausgenossen“, beim gesunden Menschen sind es
etwa 1014 Stück, sind nämlich nicht zuletzt deswegen für
uns von Nutzen, weil ihre Anwesenheit keinen Platz mehr
frei lässt für andere, mutmaßlich gefährlichere Einzeller –
unser Körper ist sozusagen ständig „voll belegt“. T-Zellen
leisten den Hauptteil dieser Klassifizierungsarbeit zwischen
Gut und Böse. Doch wie schaffen sie es nun genau, zwischen Freund und Feind zu unterscheiden?
Das Geheimnis liegt im koordinierten Zusammenspiel
hunderter Proteine im Inneren der Immunologischen Synapse. Diese Proteine sind regelrechte biologische Nanomaschinen: Unter ihnen finden sich zum Beispiel molekulare Äquivalente zu chemischen Sensoren (Rezeptorproteine), Motoren (Motorproteine) und schaltbaren Widerständen (Ionenkanäle).
Einblick in die Mikrowelt
Verständlicherweise träumen Biologen davon, diese Bausteine bei ihrer Arbeit im lebenden System direkt beobachten zu können. Hier tun sich aber enorme technische
Hindernisse auf, weil Proteine nur wenige Nanometer klein
sind – ihre Abmessungen liegen also etwa drei Größenordnungen unter der von Zellen. Typische Lichtmikroskope haben dagegen nur ein Auflösungsvermögen, das in etwa der
halben Wellenlänge des sichtbaren Lichts entspricht. Das
sind nur rund 300 Nanometer und damit viel zu wenig, um
einzelne Proteine in der Zelle sichtbar zu machen (Abbildung 2 links oben).
Alternative Methoden wie die Elektronen-, Röntgenoder Rastersonden-Mikroskopie können zwar in den Nanometerbereich vordringen, schaffen dies jedoch zumeist nur
an speziell vorbehandeltem – und damit totem – Zellmaterial. Bei lebenden Zellen mussten sich Wissenschafter also
darauf beschränken, ihre mikroskopischen oder biochemischen Untersuchungen an einer sehr großen Zahl von Proteinen gleichzeitig durchzuführen. Das erhöht zwar die Stärke des messbaren Signals; doch das individuelle Verhalten
des einzelnen Proteins geht dabei in der Menge unter
(siehe auch „Der Lohn der Mühe“, S. 189).
Nun verfügen jedoch seit kurzem eine Hand voll Laboratorien weltweit über eine Technik, einzelne Proteine in lebenden Zellen zu verfolgen: Mit der Methode der optischen
Einzelmolekül-Mikroskopie gelingt dies sogar mit einem vergleichsweise moderaten technischen Aufwand [1]. Die Entwickler dieser neuen Technik mussten es allerdings zuerst
einmal schaffen, die Proteine überhaupt optisch sichtbar zu
machen, denn wegen ihrer geringen Größe treten diese mit
Licht nicht sonderlich in Wechselwirkung. Selbst eine komplette Zelle erscheint ja im Lichtmikroskop als praktisch
transparentes Stück Gallert, und erst viele Zellschichten
übereinander bilden ein undurchsichtiges Gewebe.
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PROT E I N E S I C H T BA R G E M AC H T
Links Oben: Eine T-Zelle in einer konventionellen lichtmikroskopischen Aufnahme. Sie hat einen Durchmesser von etwa
5 µm, das entspricht etwa einem Zehntel des Durchmessers
eines menschlichen Haares. Farbige Bilder: Markiert man
bestimmte Moleküle in der Zelle mit Leuchtfarbstoff, so erzeugt eine Bestrahlung mit Laserlicht leuchtende Fluoreszenzmuster. Sie zeigen die Verteilung des markierten Stoffes
an. Hier wurden verschiedene Proteine in der Immunologischen Synapse von T-Zellen mit rotem und grünem Farbstoff
markiert. Die Synapsen sind dabei jeweils aus der Sicht der
APC gesehen, also nach Abbildung 1 „von unten“.
Hier bot die Fluoreszenzmikroskopie einen Ausweg. Bei
ihr markiert man das jeweils interessante biologische Molekül gezielt mit einem Leuchtfarbstoff (Fluorophor), wie er
zum Beispiel in Textmarkern Verwendung findet. Diese
Leuchtstoffe besitzen die Eigenschaft, bei Bestrahlung mit
Licht einer bestimmten Farbe selbst Licht einer anderen
Farbe auszustrahlen. Die Wellenlänge der emittierten Photonen ist dabei immer größer als die der absorbierten Photonen, da ein Teil der Energie im Umwandlungsprozess verloren geht. Bestrahlt man nun im Dunkeln eine derart markierte Zelle mit intensivem Anregungslicht, so zeigen sich
leuchtende Flecken einer charakteristischen Farbe, welche
die Anwesenheit und die Position des jeweiligen Proteins
verraten (Abbildung 2).
Das Immunsystem hilft den Forschern
Um auf diese Weise Proteine und andere Zellbausteine selektiv zu markieren, nutzt die Wissenschaft wiederum die
hohe Leistungsfähigkeit des Immunsystems: Werden nämlich geringe Mengen einer chemisch aufgereinigten Zielsubstanz einem Labortier injiziert, zum Beispiel einem
Kaninchen, dann erkennt dessen Körper
diese Substanz als
INTERNET
„fremd“ und beginnt, gegengerichtete Antikörper zu erVideo zur Abbildung 6
zeugen. Diese Antiwww.biophysics.jku.at/bioph/proteinjagd.html
körper sind spezielle
www.phiuz.de („Zusatzmaterial zu den Heften“)
Y-förmige Proteine,
die als „intelligenter
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Rotes Licht aus einem starken Farbstofflaser (Dye Laser) und
grünes Licht aus einem starken Argon-Ionen-Laser (Ar+Laser) mit jeweils mehr als 100 mW Leistung wird auf die
Probe in einem Mikroskop mit großer Numerischer Apertur
gelenkt. Die mit Leuchtstoffen markierte Probe strahlt
daraufhin Fluoreszenzlicht aus. Dieses weist eine hoch
empfindliche CCD-Kamera nach.
Klebstoff“ nur an dem eingedrungenen Protein haften bleiben – an keinem anderen.
Entnimmt man nun diese Antikörper einer Blutprobe
des Tieres und färbt sie im Reagenzglas mit dem passenden
Leuchtfarbstoff, so erhält man den gewünschten selektiven
Marker, der im Experiment selbstständig an die jeweils gesuchten Strukturen der Zelle binden wird. Übrigens haben
gentechnische Methoden es mittlerweile ermöglicht, eine
Antikörper-produzierende Zelle des Immunsystems beliebig zu vervielfältigen. Damit kann auf den Einsatz von Labortieren zu diesem Zweck weitgehend verzichtet werden.
Nun sollte es im Prinzip möglich sein, durch sparsames
Markieren der Zelle nur einige wenige Proteine anzufärben:
Diese würden sich dann in der mikroskopischen Aufnahme
als leuchtende Pünktchen verraten. In der Tat verfolgt die
optische Einzelmolekül-Mikroskopie diesen im Prinzip simplen Ansatz. Dazu muss sie aber die enorme Schwierigkeit
überwinden, die extrem schwachen Signale einzelner
Leuchtstoffmoleküle vor dem optischen Hintergrundrauschen der Zelle nachzuweisen.
Die Hardware muss optimiert werden
Um in den Extrembereich des Einzelmolekül-Nachweises
zu gelangen, mussten die Entwickler die konventionelle Fluoreszenzmikroskopie ans technische Limit treiben. Dabei
bot sich ihnen an, drei Komponenten der Messapparatur zu
optimieren:
1. die Lichtquelle zur Beleuchtung der Probe,
2. das Mikroskop, welches das Licht der Beleuchtung auf
die Zelle fokussiert und das von ihr emittierte Fluoreszenzlicht einfängt und
3. die Kamera, die das Bild der Probe generiert.
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Wollten wir also ein Fluoreszenzmikroskop zu einem Einzelmolekül-Mikroskop umbauen, wie es Abbildung 3 zeigt,
so müssen wir als Erstes die konventionelle Lichtquelle
durch einen leistungsstarken Laser ersetzen. Dieser sollte
auf der Probe eine Lichtintensität von einigen Kilowatt pro
Quadratzentimeter bereitstellen können – und das über eine Fläche von etwa zwanzig Mikrometern im Durchmesser.
So groß sind nämlich die meisten interessanten Zellen. Hier
hilft, dass die Zellen praktisch transparent sind: So können
sie diese intensive Bestrahlung, die etwa dem Hunderttausendfachen der Sonnenhelligkeit entspricht, gut überstehen.
Um trotz der Verluste durch Spiegel und Filter eine solche Intensität zu erreichen, ist eine Laserleistung von einigen hundert Milliwatt nötig. Leider macht das heute noch
den Griff zu einem kostspieligen und stromfressenden Argon- oder Krypton-Ionen-Laser nötig. Die dramatischen Fortschritte der Halbleiterlaser-Technologie werden jedoch vielleicht schon bald zu einer billigeren und einfacher handhabbaren Alternative führen.
Als Nächstes wenden wir uns dem Mikroskop zu. Obwohl es das Herzstück der Apparatur darstellt, bleibt hier
gegenüber dem Seriengerät wenig zu verändern, denn die
jahrhundertelange Verfeinerung hat diese Geräte schon bis
an die physikalische Grenze optimiert. Wir begnügen uns
damit, ein Objektiv mit höchstmöglicher Numerischer Apertur zu wählen: Mit seinem großen Öffnungswinkel kann es
so ein Maximum des kostbaren Fluoreszenzlichts aus der
Probe einsammeln.
Kameratechnik aus der Astronomie
Das Schlüsselelement unserer Modifikationen ist die Kamera. Bei ihr profitiert die Einzelmolekülforschung von leistungsfähigen CCD-Chips, die ursprünglich für die Astronomie entwickelt wurden. Diese Chips werden mit flüssigem Stickstoff auf –196 °C gekühlt und erreichen einen
Wirkungsgrad von bis zu 90 %. Sie können also 90 von 100
einzelnen Photonen nachweisen, und wegen der niedrigen
Temperatur produzieren sie dabei ein geringes Hintergrundrauschen von nur drei Photonen pro Pixel.
Als Lohn für diese Verbesserungen winkt nun ein Signal wie in Abbildung 4. Das Signal der einzelnen Fluorophore ist hier deutlich vor dem Hintergrund auszumachen,
obwohl wir pro Molekül in Summe nur etwa hundert Photonen empfangen konnten – und das bei etwa 1014 eingestrahlten Photonen! Die Stärke dieses Signals ließe sich im
Prinzip durch eine Verlängerung der Belichtungs- und Aufnahmezeit steigern. In der Praxis versucht man jedoch, die
Bestrahlungszeiten möglichst gering zu halten, also im Millisekunden-Bereich oder darunter: Leuchtfarbstoffe neigen
nämlich zum Ausbleichen, weil photophysikalische Prozesse sie zerstören.
Bei der Einzelmolekül-Mikroskopie stellt das starke Laserlicht eine extreme Belastung dar, weshalb dieser Bleichprozess bereits in Sekundenbruchteilen abläuft. Beschränkt
man sich nun pro Aufnahme auf eine geringe Zahl von Pho© 2004 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim
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tonen, die man dem Fluorophor „abverlangt“, so erhält man
die Chance, mehrere Aufnahmen desselben Moleküls hintereinander machen zu können, bevor es ausbleicht: Damit
wird es möglich, die Bewegung individueller Moleküle zu
verfolgen. Der Pionier dieser Technik, Hans Georg Schindler, verlieh ihr also zu Recht den Namen Single Dye Tracing,
SDT (Einzel-Farbstoff-Verfolgung). Schindler war übrigens
der Leiter unseres Institutes in Linz und ist 2001 tödlich
verunglückt.
Die Zeitauflösung, die das Verfahren rein technisch erreichen kann, ist mit über 1000 Bildern pro Sekunde bedeutend höher als etwa die herkömmlicher Videoaufnahmen. Allerdings begrenzt der Zerfall des Fluorophors eine
„Filmaufnahme“ auch bei optimaler Parameterwahl auf insgesamt nur etwa 50 Bilder.
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EINZELMOLEKÜLBILD
Auflösung im Nanometerbereich
Abbildung 4 zeigt, dass ein so aufgenommenes Fluoreszenzsignal eines markierten Proteins ziemlich verrauscht
und unscharf wirkt. Trotzdem birgt es doch erstaunlich detaillierte Informationen über den Aufenthaltsort des strahlenden Fluorophors. In der Tat können wir daraus die ursprüngliche Position des Zielmoleküls mit einer Genauigkeit
von wenigen Nanometern rekonstruieren. Das ist bedeutend kleiner als die Wellenlänge des ausgestrahlten Lichts –
und auch kleiner als das Auflösungsvermögen des verwendeten Mikroskops. Wie funktioniert das?
Die optische Theorie besagt, dass das Signal einer punktförmigen Lichtquelle beim Durchgang durch ein optisches
Gerät zu einer so genannten Point Spread Function (Impulsantwort) verbreitert wird. Deren Breite und Form hängt
vom genauen Aufbau des Gerätes ab, in unserem Fall ist sie
näherungsweise durch eine Airy-Funktion mit einer Halbwertsbreite von etwa λ/2 beschreibbar. Ein einzelnes Farbstoffmolekül, das wegen seiner im Vergleich zur Wellenlänge des Lichts viel geringeren Größe als Punktlichtquelle betrachtet werden kann, erscheint in mikroskopischen
Aufnahmen daher als „Signalberg“ einer Breite von etwa
250 nm.
Entscheidend ist nun, dass wir die Point Spread Function unseres Gerätes genau kennen. Damit können wir nun
rückrechnen, welche Position der Fluorophor einnahm, um
das gemessene Signal zu erzeugen. Die dabei erzielte Genauigkeit hängt nun im Prinzip nur noch vom Signal-RauschVerhältnis im Bild ab. Die Breite des Signals, also das Auflösungsvermögen des verwendeten Gerätes, spielt keine
Rolle mehr (siehe auch „Nanometerauflösung mit Licht?“
auf dieser Seite).
Die Technik des SDT versetzt uns somit in der Praxis in
die Lage, die Position von Proteinen in der lebenden Zelle
innerhalb von wenigen Millisekunden mit einer Genauigkeit
von etwa 30 bis 50 nm zu bestimmen, und dies etwa zehnbis fünfzigmal hintereinander. Wir haben uns mit Methoden
der optischen Mikroskopie also Zugriff auf die Längen- und
Zeitskala verschafft, auf der sich die meisten biologischen
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Falschfarbendarstellung eines typischen Einzelmolekülbildes (links). Obwohl die
Signale der einzelnen Moleküle sehr schwach sind, lässt sich aus den Rohdaten
(rechts oben) die ursprüngliche Position der Signalquelle recht genau bestimmen
(rechts unten).
N A N O M E T E R AU F L Ö S U N G M I T L I C H T ?
Es mutet zunächst wie ein Widerspruch
an, dass mit lichtmikroskopischen
Techniken die Position eines Proteins
mit einer Genauigkeit von wenigen
Nanometern bestimmt werden kann.
Zum Verständnis dieses Phänomens
muss man genau zwischen dem Auflösungsvermögen des Gerätes und der
Positionsgenauigkeit der errechneten
Position der Signalquelle unterscheiden. Letztere hängt interessanterweise
nicht von der charakteristischen
Unschärfe des Mikroskops ab, sondern
in der erster Linie von der Stärke des
erhaltenen Signals.
Eine hilfreiche Analogie bietet die
Vorstellung, dass jedes Photon eine
Information über den Ort der Signalquelle beinhaltet. Diese Positionsinformation wird aber durch das endliche
Auflösungsvermögen des Mikroskops
um einen zufälligen Wert gestört. Der
Einfluss dieser zufälligen Schwankungen mittelt sich aber bei mehrfachen
Messungen zunehmend aus. Zieht man,
wie wir es tun, etwa 100 bis 1000
Photonen zur Positionsbestimmung
heran, so sinkt dadurch die Ungenauigkeit auf etwa 40 nm. Jüngst durchgeführte Messungen einer amerikanischen Gruppe mit 100 000 Photonen
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konnten diesen Wert sogar auf 1 bis
2 nm senken.
Wie aber können wir uns sicher sein,
dass wir die Positionen der Moleküle so
präzise rückrechnen können, wie wir
das behaupten? Eine Möglichkeit liefert
der Test der Apparatur mit einem
Molekül, das in einer genau bekannten
Position fixiert ist und dessen Position
wiederholt bestimmt wird: Die Schwankung der dabei erhaltenen Ergebnisse
entspricht dann dem Messfehler
unseres Verfahrens, und ist tatsächlich
so gering wie theoretisch vorhergesagt.
Die Genauigkeit in der Positionsbestimmung eines Moleküls (rechts) liegt weit
unter dem Auflösungsvermögen des
Lichtmikroskops (links).
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Prozesse abspielen. Wir können sogar für kurze Zeit einzelne Proteine auf ihrem Weg verfolgen.
Nun hindert uns nichts mehr daran, mit dieser Technik
verschiedene Fragen aus der Mikrobiologie anzugehen. Wie
eingangs beschrieben, konzentriert sich unsere Arbeitsgruppe rund um Gerhard Schütz an der Universität Linz dabei auf die Untersuchung der so faszinierenden und wichtigen T-Zellen. Trotz der schlagkräftigen neuen Methode
dürfen wir allerdings nicht hoffen, die komplexen Funktionsprinzipien der T-Zelle umfassend zu entschlüsseln –
dieses Ziel würde die Leistungsfähigkeit eines einzelnen Institutes bei Weitem übersteigen. Vielmehr müssen wir uns
auf ein Detail konzentrieren, bei dem die Anwendung einzelmolekularer Mikroskopie besonders viel versprechend
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B E W EG L I C H E U N D U N B E W EG L I C H E M O L E K Ü L E
Einzelne, rot und grün markierte Exemplare von zwei Proteinsorten in der Immunologischen Synapse. Beide Sorten können sich in der Synapse unterschiedlich gut
bewegen, wie das Video zeigt (siehe „Internet“). Die rot markierte Spezies ist
größtenteils unbeweglich, vor allem die grün markierte bewegt sich. Die dünnen
Pfeile erleichtern es hier, die Bewegung einiger Proteinmoleküle über die Bildsequenzen hinweg zu verfolgen. In beiden Gruppen gibt es allerdings auch einzelne
„Ausreißer“, die das Verhalten der jeweils anderen Gruppe zeigen (dicke Pfeile).
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erscheint: Das sind Prozesse, die sich in den ersten Stufen
des Kontaktes zwischen einer T-Zelle und einer AntigenPräsentierenden Zelle (APC) abspielen. Dabei treffen wir auf
eine zentrale Fragestellung aus der molekularen Immunologie. Sie lautet: Welche Rolle spielen die so genannten Lipid
Rafts beim Verhalten der Moleküle in der Synapse?
Mysteriöse Plattformen in der Zelle
Lipid Rafts sind winzige Inhomogenitäten in der Zellmembran, der „Haut“ der Zelle. Sie unterscheiden sich in ihrer
Zusammensetzung von der Umgebung in der Membran, und
nach der heutigen Modellvorstellung der Forschung sollten
sich in ihnen bestimmte Proteine bevorzugt aufhalten [2].
Obwohl fast alle Biologen annehmen, dass diese kleinen
Plattformen für zahlreiche Prozesse – unter anderem auch
in der T-Zelle – essenziell wichtig sind, beruht die Annahme ihrer Existenz nur auf indirekten Indizien. Diese immerhin starken Hinweise liefern biochemische Analysen der
Proteine in der Zellmembran.
Bislang gelang es noch nicht, Lipid Rafts mit mikroskopischen Methoden direkt abzubilden, um ihr Vorhandensein endgültig zu beweisen. Falls sie tatsächlich existieren,
muss ihre Größe also deutlich unterhalb des optischen Auflösungslimits von etwa 200 nm liegen. Solche Objekte, die
sich einer direkten Beobachtung hartnäckig entziehen, geben natürlich immer Anlass zu heftigen Diskussionen, und
in letzter Zeit häufen sich wieder vermehrt Stimmen, Lipid
Rafts seien in Wirklichkeit nur Messartefakte durch Störungen der Zellmembran während der biochemischen
Analyse.
Wir hoffen nun, mit unseren ultrasensitiven Methoden
Licht auf dieses interessante Phänomen werfen zu können.
Denn zum einen haben wir die technische Möglichkeit, zu
der vorhergesagten Längenskala von Lipid Rafts vorzudringen, zum anderen können wir damit erstmals Messungen an
lebenden, weitgehend ungestörten Zellen durchführen. Wir
markieren dabei diejenigen Proteine der T-Zelle, denen eine Interaktion mit den Lipid Rafts zugeschrieben wird, mit
Leuchtstoffmolekülen. Dann verfolgen wir ihr Verhalten
während der Ausbildung einer Immunologischen Synapse.
Da diese Proteine sich in den Lipid Rafts aufhalten sollten
– falls jene existieren – verrät ihr Aufenthaltsort die Position des gesuchten Rafts. Auf diese Weise sollte es so möglich werden, etwas über die Dynamik dieser Strukturen zu
lernen.
Unsere ersten Untersuchungen an T-Zellen führten wir
mit zwei markierten Typen von Proteinmolekülen durch,
die sich nach der bisherigen Modellvorstellung in der Synapse an Lipid Rafts binden. Da diese Proteinsorten in biochemischen Tests zur Raft-Bindung recht ähnlich abgeschnitten hatten, erwarteten wir eigentlich, dass der Blick
durch unser Mikroskop diese Ähnlichkeit weiter bestätigen
würde. Zu unserer Überraschung beobachteten wir jedoch
in der Synapse ein sehr unterschiedliches Verhalten (Abbildung 5 und „Internet“ Seite 185): Das eine Protein war
außerhalb der Synapse noch weitgehend mobil, fixiert sich
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nun aber in der Membran, das andere behält dagegen seine
Beweglichkeit bei.
Falls das bisherige Modell richtig ist und beide Moleküle
in Lipid Rafts gebunden sind, würde dies implizieren, dass
es mindestens zwei Subtypen von Rafts gibt, die sich wenigstens in ihrer Beweglichkeit unterscheiden. Das könnte
ein Hinweis darauf sein, dass die verschiedenen Subtypen
unterschiedlich stark mit dem Cytoskelett wechselwirken,
dem relativ starren Stützgerüst der Zelle. Da vor allem Proteine solche Wechselwirkungen erzeugen, legt das – beim
momentanen Stand unserer Untersuchungen – auch den
weitergehenden Schluss nahe, dass die einzelnen Rafts sich
auch in ihrer Proteinfracht unterscheiden.
Allerdings lassen sich unsere Messergebnisse derzeit
auch anders interpretieren. Danach wären die Rafts so winzig, dass sie wie ein Schwimmreifen eng an ein einzelnes
Protein gebunden sind. In diesem Fall wären sie weitgehend dem Verhalten des jeweiligen „Trägerproteins“ ausgeliefert. Wir arbeiten daher an unserem Institut derzeit an
einer Methode, die Rafts direkt auf der Zelle mit Leuchtfarbstoff zu markieren. Gelingt dies, so beweist das Erstens
die Existenz der Lipid Rafts direkt und liefert Zweitens eine genauere Information über deren Größe.
Quantenpunkt statt Farbstoff
Wie sich die Einzelmolekül-Mikroskopie in den nächsten
Jahren weiterentwickeln wird, lässt sich heute schwer vorhersagen: Sie ist ja noch ein junges Forschungsfeld, und die
ersten erfolgreichen Messungen an lebenden Zellen liegen
erst wenige Jahre zurück [3]. Die große Resonanz, auf die
dieses Gebiet in der wissenschaftlichen Community stößt,
gibt aber Grund zu großen Hoffnungen: Das Wissenschaftsmagazin Science ordnete die Single Molecule Sciences immerhin unter die zehn „heißesten“ Forschungsgebiete des Jahres 2003 ein [4].
Bei dem hier vorgestellten Verfahren der EinzelmolekülMikroskopie müssen allerdings noch zwei grundlegende
Probleme überwunden werden, bevor es breit eingesetzt
werden kann: das schnelle Ausbleichen der Fluorophore
und die komplizierte Handhabung der technischen Geräte.
Das Problem der Instabilität der Leuchtfarbstoffe kann man
im Prinzip umgehen, indem man sie durch Quantenpunkte
aus Halbleitermaterial ersetzt – deshalb wird dieser Ansatz
zurzeit intensiv verfolgt. Diese winzigen „künstlichen Atome“ können für unbegrenzt lange Zeit Licht ausstrahlen
(Physik in unserer Zeit 2002, 33(5), 206) und bieten daher
das Potenzial, Proteine über einen viel längeren Zeitraum
verfolgen zu können.
Da die viel versprechenden Q-Dots nun dem Laborstadium entwachsen und seit kurzem für die Biowissenschaft
erhältlich sind, wird ihr breiter Einsatz in der biologischen
Forschung wohl nicht lange auf sich warten lassen.
Bei unserer Technik würde dann die winzige Halbleiterstruktur mit der gleichen Methode wie das Farbstoffmolekül an das Proteinmolekül gebunden werden – via
Antikörper.
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Welche Vorteile bieten Messungen an einzelnen Molekülen gegenüber EnsembleMessungen, die die Signale von vielen Molekülen gleichzeitig zusammenfassen?
Wir wollen hier drei Vorteile anführen, die uns für biologische Messungen besonders relevant erscheinen.
1. Keine Mittelwertbildung
Während sich bei einer Ensemble-Messung die intermolekularen Variationen eines
bestimmten Messparameters ausmitteln, wird bei einer Einzelmolekül-Messung die
gesamte zugrunde liegende Verteilung sichtbar. Dies ist speziell in Situationen wie
in der Abbildung rechts skizziert wesentlich, da dort eine Bestimmung alleine des
Mittelwertes irreführende Ergebnisse liefern würde.
2. Variation einzelner Parameter wird sichtbar
Misst man am selben Molekül mehrere Parameter gleichzeitig, zum Beispiel Beweglichkeit und Größe, so kann die Einzelmolekül-Messung etwaige Beziehungen
zwischen Variationen dieser Parameter aufdecken (Abbildung links).
3. Keine Synchronisation nötig
Biologische Prozesse sind inhärent dynamisch. So kann sich zum Beispiel eine
Molekülspezies A in eine Spezies B umwandeln – und diese nach einiger Zeit wieder
in A zurück. Da solche Prozesse in lebenden Systemen jedoch zumeist nicht synchron ablaufen, befinden sich immer viele Moleküle in jedem der beiden Zustände.
Um die Dynamik des Umwandlungsprozesses beobachten zu können, muss man
also einzelne Moleküle herauspicken und verfolgen. Das entspricht dem Bild eines
Wettrennens, bei dem alle Läufer zu unterschiedlichen, zufälligen Zeiten starten:
Eine individuelle Verfolgung mit individueller Zeitmessung erlaubt dann trotzdem
eine Ermittlung des Siegers.
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Jenseits des Proof of Principle
Die derzeit größte Hürde, die der Verbreitung von Einzelmolekül-Techniken in der biomedizinischen Forschung entgegensteht, ist aber ihre komplexe Handhabung im Labor.
In der Vergangenheit verfolgten die Forscher zunächst das
Hauptziel, Messungen an lebenden Systemen überhaupt erst
technisch möglich zu machen. Deshalb ist heute praktisch
jedes neu entwickelte Gerät noch ein individueller Prototyp, in dem Hochleistungshardware friedlich mit Klebeband
und Pappe koexistiert.
Die zuverlässige Bedienung solcher Maschinen stellt derzeit mitunter eine eigene Wissenschaft dar, weshalb sie für
eine routinemäßige biologische Forschung noch ungeeignet
sind. Schließlich möchten Biologen oder Immunologen ihre Aufmerksamkeit auf die aktuelle Fragestellung konzentrieren, und nicht auf die Handhabung eines Messapparates,
welcher letztendlich nur Mittel zum Zweck sein darf.
Daher gilt es nun Mikroskope zu entwickeln, die eine
weitgehend serienmäßige Hardware enthalten und damit
für Biolabore erschwinglich sind. Zudem müssen sie robust
und zuverlässig sein, und ihre Bedienung darf kein Spezialwissen erfordern. Solche kommerziellen Geräte stehen
tatsächlich schon in der Entwicklung, auch unsere Arbeitsgruppe beteiligt sich daran.
Die Autoren
Mario Brameshuber studiert seit 1999 an der
Universität Linz Biophysik. Für seine Diplomarbeit
forscht er zurzeit an Lipid Rafts.
Manuel Mörtelmaier studierte Physik an den
Universitäten Linz und Salzburg. Seit 2001 arbeitet
er in Linz auf dem Gebiet der EinzelmolekülMikroskopie. Für seine Diplomarbeit „Wenn
Moleküle raften gehen“ erhielt er 2003 den Linzer
Physik-Oscar.
Anschrift
Manuel Mörtelmaier, Institut für Biophysik,
Johannes-Kepler-Universität Linz,
Altenbergstr. 69, A-4040 Linz.
[email protected]
Zusammenfassung
Einzelne Moleküle in lebenden Zellen mit Fluoreszenzmikroskopen zu beobachten, ist derzeit noch eine technische
Herausforderung. Sie lohnt sich aber: So können erstmals die
molekularen Bausteine des Lebens, etwa Proteine, bei ihren
Aktivitäten direkt verfolgt werden. Das erlaubt völlig neue
Einblicke in die Funktionsmechanismen biologischer Zellen.
Ein interessantes Forschungsobjekt sind die T-Zellen, die das
Immunsystem steuern. Die Beobachtung einzelner Proteine
kann das Rätsel lösen helfen, wie T-Zellen gefährliche von ungefährlichen Erregern unterscheiden können. Damit Einzelmolekül-Mikroskope routinemäßig in Biolabors eingesetzt
werden können, müssen sie noch robuster, billiger und einfacher handhabbar werden.
Stichworte
Einzelmolekül-Mikroskopie, Fluoreszenz, Farbstoff, Single
Dye Tracing, SDT, Laser, CCD-Kamera, Quantenpunkt, Immunsystem, T-Zelle, Immunologische Synapse, Protein, Lipid Raft.
Danksagung
Die Autoren danken Markus Axmann, Nina Kieberger und
Gerhard Schütz für ihre Unterstützung.
Literatur
[1] J. Uppenbrink und D. Clery, Science 1999, 283, 1667; Spezialausgabe
zur Einzelmolekül-Mikroskopie.
[2] K. Simons, Nature 1997, 387, 569.
[3] G. J. Schütz, EMBO J. 2000, 19, 892.
[4] www.sciencemag.org/cgi/content/full/302/5653/2039#molecule
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Phys. Unserer Zeit
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35. Jahrgang 2004 Nr. 4
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