Aminosäuren, Proteine, Enzyme, Enzymkinetik & Energetische

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Aminosäuren, Proteine, Enzyme,
Enzymkinetik & Energetische Kopplung
• Gegenstandskatalog:
4.1
4.1.1
4.1.2
4.1.3
Enzyme
Einteilung, Wirkweise und Bedeutung von
Enzymen für den Stoffwechsel; Coenzyme,
Beziehung zu den Vitaminen
Beeinflussung der Enzymaktivität
Ribozyme
4.3
4.3.1
Grundzüge des Stickstoffwechsels
Aminosäuren und Proteine
4.5.1
Energetische Kopplung, Prinzip und Bedeutung
Aminosäuren
• Alle Aminosäuren besitzen
ein a-C-Atom, das als
funktionelle Gruppe eine
Carboxyl- und eine
Aminogruppe, sowie eine
variable Seitenkette trägt.
• Bis auf Glycin (R = H) sind alle
proteinogenen AS chiral und
gehören zur L-Reihe nach
Fischer bzw. 2S-Reihe nach
C.I.P. (Ausnahme: Cystein
L/2R)
• AS sind Ampholyte, da sie sowohl ein Proton
auf-, als auch abgeben können
• Beim physiologischen pH-Wert liegt die
– Aminogruppe protoniert als –NH3+
– Caroboxylgruppe deprotoniert als –COOvor.
• Der isoelektrische Punkt ist der pH-Wert, an
dem die AS neutral vorliegt.
• AS können nach folgenden Kriterien unterteilt
werden:
– Chemische Eigenschaften (Seitenkette)
– Verwendung in der Proteinbiosynthese
(proteinogen (20)/nichtproteinogen(>100))
– Fähigkeit des Organismus zur Biosynthese
• Essentiell: Valin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin,
Tryptophan, Lysin, Methionin, Threonin
• Semi-essentiell: Histidin (nur für Säuglinge)
Peptide und Proteine
• Peptide und Proteine sind kettenförimge
Makromoleküle, in denen die 20 (bzw. 21)
proteinogenen Aminosäuren sequenzspezifisch
kovalent miteinander verknüft sind.
• Die AS-Sequenz ist dabei genetisch vorgeschrieben
• 2-10 AS: Oligopeptide (Dipeptid/Tripeptid/…)
• 10-100 AS: Polypeptid
• >100 AS: Protein
• Ort der Proteinbiosynthese: Ribosomen
– Freie Ribosomen: lösliche und für die Zelle selbst
bestimmte Proteine
– Raues ER: Exportproteine und Membranproteine
• Die einzelnen AS sind durch die sog. Peptidbindung
verknüpft.
• Die Peptidbindung enteht formal durch
Wasserabspaltung zwischen der Carboxylgruppe der
einen und der Aminogruppe der nächstfolgenden AS. 
Peptidbindung entspricht einer Säureamidbindung.
• Aufgrund ihres partiellen Doppelbindungscharacters ist
die Peptidbindung planar.
• An einem Ende der AS-Kette befindet sich die
freie a-Aminogruppe  N-Terminus
• Am anderen Ende befindet sich die freie
Carbxylgruppe  C-Terminus
• Nach Konvention wird die AS-Sequenz eines
Proteins immer vom N-Terminus aus
begonnen.
• Bei Polypeptiden und Proteinen unterscheidet
man folgende Strukturen:
– Primärstruktur
– Sekundärstruktur
– Tertiärstruktur
– Quartärstruktur
Primärstruktur
• Die AS-Sequenz wird als Primärstruktur
bezeichnet, sie gibt keinerlei Auskunft über
die Raumstruktur des Proteins.
Sekundärstruktur
• Räumliche Anordnung der AS-Kette aufgrund
von H-Brückenbildung zwischen C=O- und NHGruppen.
• Wichtige Sekundärstrukturen sind:
– a-Helix
– b-Faltblatt
– b-Schleifen
a-Helix
• Polypeptidkette liegt in Form
einer rechtsgewundenen
Schraube vor
• Pro Windung 3,6 AS
• Ganghöhe beträgt 0,54nm
• Prolin kann aufgrund seiner
Struktur zu einer Unterbrechung
der Helix führen  Knick
• Beispiele: a-Keratine
b-Faltblatt
• Aufbau aus mehreren
benachbarten b-Strängen
aufgebaut, bei denen die
Seitenketten der AS
abwechselnd ober- und
unterhalb der
Faltblattebene liegen
• Beispiel: b-Keratin der
Haut/Nägel
Tertiärstruktur
• Die TS beschreibt die
Ausbildung der stabilen
Raumstruktur
monomerer Proteine.
• Sie beruht auf kovalenten
(Disulfidbrücken) und
nichtkovalenten
Wechselwirkungen (HBrücken, hydrophope
WW, Ionenbindungen)
der
Aminosäureseitenketten.
Quartärstruktur
• Bei der Assoziation mehrerer
identischer oder
nichtidentischer
Polypeptidketten
(Untereinheiten) mit jeweils
eigener Primär-, Sekundär- und
Tertiärstruktur zu einer
funktionellen Gruppe spricht
man von der Quartärstruktur
eines Proteins.
• Erst durch Raumstruktur wird
die biologische Aktivität eines
Proteins ermöglicht.
• Bsp.: Keratinkinase (dimer),
Hämoglobin (tetramer)
• Unterteilung von Proteinen:
– Sphäroproteine: Wasserlösliche, reaktionsfähige
Proteine (Bsp.: Enzyme)
– Skleroproteine: Wasserunlösliche, reaktionsarme
Proteine (Bsp.: Strukturproteine wie Kollagen)
– Proteine können prinzipiell auch andere Gruppen als
AS tragen:
•
•
•
•
Lipide  Lipoproteine
Kohlenhydrate  Glykoproteine
Phosphoratome  Phosphoprotein
Metalle  Metallprotein
Abbau von Proteinen
• Proteinasen: neben Amylasen wichtigste hydrolytische Enzyme; C-NHydrolasen
• → Spaltung der Peptidbindung
• Proteinasen:
– Endopeptidasen: spalten Peptidbindungen innerhalb des Proteinmoleküls →
Zerlegung in kleinere Peptide
– Exopeptidasen: spalten fortschreitend vom Ende eines Proteinmoleküls her
Aminosäuren ab → Carboxypeptidasen, Aminopeptidasen
• Proteinasen wirken nicht spezifisch auf bestimmte Substrate (Proteine)
– Hemmung durch Inhibitorproteine
– Proteinasen, die sich extrazellulär im Blut und in den extrazellulären
Flüssigkeiten befinden, üben dort spezifische regulatorische Funktionen aus
(→ Blutgerinnung, Fibrinolyse, Aktivierung von Komplementfaktoren)
– innerhalb der Zellen finden sich Proteinasen v. a. in Lysosomen
Abbau von Aminosäuren
• Kohlenstoffskelett wird i. A. über den
Citronensäurezyklus weiterverarbeitet
• Stickstoffanteil gesonderter Weg:
Abspaltung der Aminogruppe vom
Kohlenstoffgerüst.
• Aminogruppen werden auf α-Ketosäure
übertragen (Transaminierung), meist auf
α-Ketoglutarsäure. Dabei entsteht
Glutaminsäure und die jeweilige αKetosäure, die als Substrat in den
Citratzyklus eingeht.
Auf diesem Weg können die
verschiedenen Aminosäuren je nach
Bedarf auch ineinander umgewandelt
werden.
Abbau von Aminosäuren
• Der endgültige Abbau der AS erfolgt in
der Leber. Über das Blut gelangen
überschüssige AS in der Transportform
Alanin zur Leber.
• Dort wird die Aminogruppe in Form
von Glutamat fixiert.
• Anschließend wird Glutamat oxidativ
desanimiert und liefert NH3 in den
Harnstoffzyklus.
• Über die Nieren wird der Stickstoff
letztlich in Form von Harnstoff
ausgeschieden.
Enzyme - Biokatalysatoren
•
Als reaktionsspezifische Katalysatoren sind in
lebenden Systemen zwei unterschiedliche
Makromoleküle vorhanden:
– Katalytisch aktive Proteine (Enzyme)
– Katalytisch aktive Ribonukleinsäuren (Ribozyme)
•
•
•
•
Die weithäufigsten Biokatalysatoren sind
Enzyme.
Ribozyme kommen in Spleißosomen und
Ribosomen vor. Sie trennen Introns aus
Primärtranskripten heraus und verknüpfen die
Exons oder katalysieren die Peptidverknüpfung
in den Ribosomen
Wie alle Katalysatoren beschleunigen sie die
Einstellung der Gleichgewichtslage einer
Reaktion, ohne das Gleichgewicht zu ändern.
Sie katalysieren sowohl Hin- als auch
Rückreaktion
E+S → ES → EP → E+P
• Die Reaktion verläuft i.A. nach folgendem
Schema:
1. Substrat bindet kovalent/nichtkovalent an das
Enzym  Enzym-Substrat-Komplex
2. Katalysierte Reaktion führt zum Enzym-ProduktKomplex
3. Enzym-Produkt-Komplex zerfällt in Produkt und
Enzym (unverändert)
• Die Bindung des Substrats an das Enzym findet
dabei am katalytischen Zentrum des Enzyms
statt.
Enzyme katalysieren immer nur eine einzige bzw. nur sehr wenige
Reaktionen. Sie sind reaktionsspezifisch bzw. wirkungsspezifisch. Dabei
setzen sie immer nur bestimmte Substrate um.
Die Substratspezifizität beruht auf folgenden Modellen
Schlüssel-Schloss-Prinzip:
Modell des „induced fit“:
Aktives Zentrum des ungebundenen Enzym verändert seine Form
Enzyms hat eine zum Substrat
(Konformation) bei der
komplementäre Gestalt
Substratbindung, aktives Zentrum hat
die zum Substrat komplementäre
Gestalt erst nach dessen Bindung
Enzymklassifikation
•
Enzyme werden nach ihrer Wirkspezifität in sechs Gruppen unterteilt:
Hauptklasse
Katalysierte Reaktion
Oxidoreduktasen Redoxreaktionen
Beispiele
Lactatdehydrogenase
Glutamatdehydrogenase
Succinatdehydrogenase
Pyruvatdehydrogenase
Transferasen
Gruppenübertragungen
Hexokinase
Glycogenphosphorylase
Hydrolasen
Hydrolytische Abspaltung von Gruppen
Proteasen, Petidasen
Esterasen
Glycosidasen
Lyasen
Nichthydrolytische Abspaltung von Gruppen
Aldolase
Transketolase
Fumarase
Isomerasen
Umwandlungen isomerer Verbindungen
Retinalisomerase
Triosephopsphat-Isomerase
UDP-Galaktose-4-Epimerase
Ligasen
Energieabhängige Verknüpfung von Bindungen Pyruvatcarboxylase
Acyl-CoA-Synthetase
Glutaminsynthetase
•
•
Enzyme, die verschiedene Primär- und Raumstrukturen besitzen, aber die gleiche Reaktion mit dem gleichen Substrat
und dem gleichen Produkt katalysieren, werden Isoenzyme genannt.
Enzyme, die mehrere katalytische Zentren besitzen, werden Multienzymkomplexe gennant (Bsp.: Pyruvatdehydrogenase,
DANN-Replikase)
• Viele Enzyme benötigen Cofaktoren für ihre Aktivität. Diese gehen nicht
unverändert aus der Reaktion hervor und müssen regeneriert werden.
• Das vollständig funktionelle Enzym mit der niedermolekularen Gruppe
wird als Holoenzym bezeichnet
• Das Enzym ohne die niedermolekulare Gruppe wird Apoenzym genannt
• Die niedermolekulare Gruppe wird als Coenzym (= Cosubstrat), und wenn
sie fest mit dem Enzym verbunden ist prosthetische Gruppe genannt.
• Da Cosubstrate regeneriert werden, werden sie nur in geringen Mengen
benötigt. Menschen können Cosubstrate häufig nur teilweise
synthetisieren, sie müssen bestimmte Vorstufen der Cosubstrate mit der
Nahrung aufnehmen. Diese Vorstufen werden Vitamine genannt.
• Es werden fettlösliche Vitamine (E, D, K, A) und wasserlösliche Vitamine
(C, H, Vitamine des B-Komplexes) unterschieden.
Herkunft und Funktion der Coenzyme
Coenzym
Funktion
Vitamin
Ascorbat
Hydroxylierungen
Ascorbat
Redoxsystem
Vitamin C
Decarboxylierungen
Thiamin
Aldehydgruppentransfer
Vitamin B1
Wasserstoffübertragung
Riboflavin
Thiaminpyrophosphat
Flavinmononukleotid (FMN);
Flavinadenindinucleotid (FAD)
Vitamin B2
+
Nicotinamidadenindinucleotid(-phosphat) NAD ; NADP
Pyridoxalphosphat
+
Wasserstoffübertragung
Nicotinsäure
Transaminierungen
Pyridoxin
Decarboxylierungen
Vitamin B6
a,b-Elimination
Coenzym A
Acylübertragung
Pantothensäure
Biotinyl-Lysyl-Enzym
Carboxylierung
Biotin
Lipoyl-Lysyl-Enzym
Wasserstoffübertragung
Lionsäure
Acylgrupenübertragung
Tetrahydrofolat
C1-Gruppenübertragung
Folsäure
5'-Adenosylcobalamin
1,2 Verschiebungen von Alklgruppen
Cobalamin
Difarnesylnaphthochinon
Carboxylierungen von Glutamylresten
Vitamin B12
Ubichinon
Wasserstoffübertragung
Naphthochinon
Cytochrome
Elektronenübertragung
Vitamin K
Adenosintriphosphat
Phosphatübertragungen
-
Adenylübertragungen
Cytidindiphosphat
Phospholipidübertragungen
-
Uridindiphosphat
Saccharidübertragungen
-
S-Adenosylmethionin
Methylgruppenübertragungen
-
Phoshoadenosyl-Phosphosulfat (PAPS)
Sulfatübertragungen
-
Beeinflussung der Enzymaktivität
• Die Aktivität der Enzyme wird beeinflusst von
verschiedenen Faktoren:
– pH-Wert (meist Optimum beim pH = 7,4)
– Temperatur (meist Körpertemperatur)
– Affinität zum Substrat
– Effektoren:
• Aktivatoren
• Inhibitoren
Enzymkinetik
• Die Geschwindigkeit der Enzymkatalyse
hängt von der Substratkonzentration ab.
• Die Michaelis-Menten-Gleichung
beschreibt die Abhängigkeit der
Reaktionsgeschwindigkeit von der
Substratkonzentration. Die
Michaeliskonstante KM gibt die
Substratkonzentration an, bei der ein
Enzym mit halbmaximaler
Geschwindigkeit arbeitet. Sie ist ein Maß
für die Affinität eines Enzyms zu einem
Substrat.
• Je steiler die Kurve, desto höher ist die
Affinität zum Substrat
• KM ist unabhängig von der
Enzymkonzentration
• Um den KM-Wert exerimentell zu bestimmen
bedient man sich einer doppelt reziproken
Auftragungsart der Michaelis-Menten-Gleichung
im Lineweaver-Burk-Diagramm.
• Aus diesem kann KM direkt ablesen
Enzymeffektoren
Effektoren
Aktivatoren
Inhibitoren
Irreversible
Inhibitoren
Suizidinhibitoren
Reversible
Inhibitoren
Kompetitive
Inhibitoren
Nichtkompetitive
Inhibitoren
Unkompetitve
Inhibitoren
Irreversible Inhibition
• Inhibitor bindet kovalent an das Enzym und
beeinträchtigt dadurch dessen
Funktionsfähigkeit.
• Ein besonderer Fall sind die Suizidinhibitoren.
Dabei wandelt das Enzym den potentiellen
Inhibitor enzymatisch in den eigentlichen
Inhibitor um, der die kovalente Bindung mit
dem Enzym eingeht.
• Bsp.: Cyanid
Kompetetive Inhibition
• Substrat und Inhibitor strukturell ähnlich, beide
haben Affinität zum aktiven Zentrum desselben
Enzyms, beide konkurrieren um reversible Bindung an
aktives Zentrum des Enzyms
• Verdrängung des Inhibitors durch hohe
Substratkonzentrationen möglich
• Vmax unverändert
• KM-Wert höher → es muss eine höhere
Substratkonzentration vorhanden sein, um die
halbmaximale Geschwindigkeit zu erreichen
Nichtkompetetive Inhibition
•
•
•
•
•
i.d.R. keine strukturelle Ähnlichkeit von Substrat und
Inhibitor
Inhibitor bindet an Enzym oder ES-Komplex → Komplex
aus Enzym, Substrat und Inhibitor; Inhibitor bindet nicht
am aktiven Zentrum, sondern an eine eigene Stelle
keine Verdrängung des Inhibitors möglich (daher sind z.
B. Schwermetallionen giftig)
Vmax erniedrigt → mit Inhibitor besetzte EnzymMoleküle sind weniger oder gar nicht aktiv
KM-Wert unverändert
Unkompetetive Inhibition
• Inhibitoren binden ausschließlich an ESKomplex
• KM und Vmax erniedrigt
• Bsp.: Hemmung der Cytochromoxidase durch
Azid
Regulation der Enzymaktivität
• Eine weitere Unterscheidung von
Inhibitionstypen bieten die Bindungsstellen der
Inhibitoren:
– Isosterische Inhibition
• Inhibitor und Substrat binden an das katalytische Zentrum.
• Meist kompetetive Hemmung
– Allosterische Inhibition
• Substrat und Inhibitor binden an unterschiedlichen Stellen
• Bestehen häufig aus einer katalytisch wirksamen
Untereinheit (Substratbindungsstelle) und einer weiteren,
assoziierten Regulationsuntereinheit
(Inhibitorbindungsstelle)
Regulation der Enzymaktivität
• Neben der Enzymsynthese und dem Enzymabbau wird die
Stoffwechselleistung einer Zelle durch die Enzymaktivität der
vorhandenen Enzymmoleküle reguliert.
• Produkthemmung
– Enzym wird durch das Produkt der Reaktion, die es katalysiert,
gehemmt
– überwiegend Typ der kompetitiven Hemmung
– Bei komplexen Stoffwechselvorgängen werden Schlüsselenzyme
reguliert (Bsp.: Glykolyse/Gluconeogenese)
• Substrathemmung
– Substrat hemmt bei erhöhten Konzentrationen seinen eigenen Umsatz
– typisch bei Enzymen, bei denen das Substrat zunächst an periphere
Stellen gebunden und dann an die Bindungsstelle im aktiven Zentrum
„geleitet“ wird
Energetische Kopplung
• Energie kommt in verschiedenen Formen vor:
–
–
–
–
–
Mechanische (kinetische, potentielle) Energie
Elektrische Energie
Wärme
Strahlungsenergie
Energie einer chemischen Bindung
• Die beiden letztgenannten sind für den lebenden
Organismus von essentieller Bedeutung
• Strahlungsenergie ist die Aufnahmeform der Energie
während der Photosynthese
• Chemische Energie ist die Speicherform der
Organismen
• Um energiearme Substrate im Rahmen eines
Stoffwechselprozesses umzuwandeln, bedarf es
eines zweiten Energie liefernden Prozesses,
derart, dass die Energie verbrauchende
(endergonische) Reaktion an eine Energie
liefernde (exergonische) Reaktion gekoppelt wird.
• Die Energie liefernde Verbindung fällt dabei auf
einen energieärmeren Zustand und muss
anschließend regeneriert werden. (
Photosynthese)
Energiereiche Verbindungen
• Nukleotide
– Adenosintriphosphat (ATP)
– Guanosintriphosphat (GTP)
– Uridintriphosphat (UTP)
• Acylphosphate
• Enolphosphate
• Thiocarbonsäuren/-ester
ATP
•
•
•
•
•
•
2 Phosphorsäureanhydrid-Bindungen des ATP energiereich
Anhydrid-Bindungen leicht hydrolysierbar, da partielle Ladungen der benachbarten
Phosphor- bzw. Sauerstoffatome sich gegenseitig abstoßen
Aktivierung energiearmer Substrate: endständiger Phosphat-Rest oder ADP-Rest
bzw. Diphosphat-Rest oder AMP-Rest wird übertragen
auch GTP oder UTP, allerdings seltener
„Gruppenübertragungspotential des ATP“
• Acylphosphate energiereich: Carboxy-Gruppe und
Phosphorsäure-Rest über Anhydrid-Bindung
verbunden
• Enolphosphate: höherer Energiegehalt als
Anhydrid-Bindung, z. B. des Phosphoenolpyruvats
(PEP); Oxo-Enol-Tautomerie und
Phosphorsäureester-Bindung
• Thiocarbonsäureester / Thioester: keine
Resonanzstabilisierung wie in Sauerstoffestern,
daher energiereich
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