Phänotypisierung von Liquorzellen im Verlauf von entzündlichen

Aus der Neurologischen Klinik
der Berufsgenossenschaftlichen Kliniken Bergmannsheil - Universitätsklinik der Ruhr-Universität Bochum
Direktor: Prof. Dr. med. J. P. Malin
__________________________________
Phänotypisierung von Liquorzellen
im Verlauf von entzündlichen
Erkrankungen des Nervensystems
Immunzytochemische Untersuchung mit der APAAP-Methode
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Ronald Plennis
aus Ulm/ Donau
1999
Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr
1. Referent: PD Dr. med. E. Sindern
2. Referent: PD Dr. med. M. Haupts
Tag der mündlichen Prüfung: 16. Januar 2001
Inhaltsverzeichnis
1
Einleitung ...................................................................................................................... 1
1.1
Kurze historische Entwicklung der Liquorzytologie.......................................... 1
1.2
Darstellung der untersuchten Krankheitsbilder .................................................. 2
1.2.1
Zoster ............................................................................................................ 2
1.2.2
Aseptische Meningitis.................................................................................. 2
1.2.3
Septische Meningitis .................................................................................... 3
1.2.4
Neuroborreliose (Meningoneuritis Bannwarth) ......................................... 3
1.2.5
Akutes Guillain-Barré-Syndrom ................................................................. 4
1.3
2
Seite
Fragestellung......................................................................................................... 4
Material und Methode .................................................................................................. 6
2.1
Patienten................................................................................................................ 6
2.1.1
Kontrollgruppe ............................................................................................. 6
2.1.2
Zoster ............................................................................................................ 6
2.1.3
Aseptische Meningitis.................................................................................. 7
2.1.4
Septische Meningitis .................................................................................... 8
2.1.5
Neuroborreliose (Bannwarth-Syndrom) ..................................................... 8
2.1.6
Akutes Guillain-Barré-Syndrom ................................................................. 9
2.2
Materialien .......................................................................................................... 10
2.2.1
Geräte.......................................................................................................... 10
2.2.1.1
Geräte für die Bestimmung der Zellzahl .......................................... 10
2.2.1.2
Geräte für die Bestimmung der Differentialzytologie..................... 10
2.2.1.3
Geräte für die Bestimmung der Immunzytochemie......................... 10
2.2.2
Chemikalien................................................................................................ 10
2.2.2.1
Reagenzien für die Bestimmung der Zellzahl.................................. 10
2.2.2.2
Reagenzien für die Bestimmung der Differentialzytologie............. 11
2.2.2.3
Reagenzien für die APAAP-Färbetechnik ....................................... 11
2.3
Methodik ............................................................................................................. 13
2.3.1
Zellzahl ....................................................................................................... 13
2.3.2
Herstellung der Zellpräparate und Differentialzytologie......................... 13
2.3.3
Immunhistochemische Untersuchung....................................................... 14
2.3.3.1
APAAP-Technik ................................................................................ 14
2.3.3.1.1
APAAP-Testprinzip ....................................................................... 15
2.3.3.1.2
Färbevorgang .................................................................................. 18
2.3.3.2
2.3.3.2.1
Antikörper - Beschreibung ................................................................ 19
Cluster of Differentiation (CD) 4 .................................................. 19
III
2.4
3
Cluster of Differentiation (CD) 8 .................................................. 20
2.3.3.2.3
Human Leucocyte antigen (HLA) DR .......................................... 20
2.3.3.2.4
Immunglobulin M (IgM)................................................................ 21
Statistik................................................................................................................ 21
Ergebnisse ................................................................................................................... 22
3.1
Färbeverhalten der Liquorzellen........................................................................ 22
3.2
Kontrollgruppe.................................................................................................... 25
3.2.1
Zellzahl und Differentialzytologie ............................................................ 25
3.2.2
Immunzytologie ......................................................................................... 26
3.2.3
CD4/CD8-Ratio.......................................................................................... 28
3.3
Zoster................................................................................................................... 28
3.3.1
Zellzahl und Differentialzytologie ............................................................ 28
3.3.2
Immunzytologie ......................................................................................... 30
3.3.3
CD4/CD8-Ratio.......................................................................................... 31
3.4
Aseptische Meningitis ........................................................................................ 32
3.4.1
Zellzahl und Differentialzytologie ............................................................ 32
3.4.2
Immunzytologie ......................................................................................... 34
3.4.3
CD4/CD8-Ratio.......................................................................................... 37
3.5
Septische Meningitis .......................................................................................... 38
3.5.1
Zellzahl und Differentialzytologie ............................................................ 38
3.5.2
Immunzytologie ......................................................................................... 40
3.5.3
CD4/CD8-Ratio.......................................................................................... 43
3.6
Neuroborreliose .................................................................................................. 44
3.6.1
Zellzahl und Differentialzytologie ............................................................ 44
3.6.2
Immunzytologie ......................................................................................... 46
3.6.3
CD4/CD8-Ratio.......................................................................................... 48
3.7
Akutes Guillain-Barré-Syndrom........................................................................ 49
3.7.1
Zellzahl und Differentialzytologie ............................................................ 49
3.7.2
Immunzytologie ......................................................................................... 51
3.7.3
CD4/CD8-Ratio.......................................................................................... 53
3.8
3.8.1
4
2.3.3.2.2
Vergleich der Krankheitsgruppen untereinander.............................................. 55
Immunzytologie ......................................................................................... 55
Diskussion ................................................................................................................... 57
4.1
Wertigkeit der APAAP-Technik zur immunzytochemischen Differenzierung
von Liquorzellen ............................................................................................................. 57
4.2
Lymphozytensubtypisierung im Liquor bei:..................................................... 60
IV
4.2.1
Nichtentzündlichen neurologischen Erkrankungen ................................. 60
4.2.2
Zoster Meningoradikulitis ......................................................................... 62
4.2.3
Aseptische Meningitis................................................................................ 63
4.2.4
Septische Meningitis .................................................................................. 67
4.2.5
Borrelienradikulitis .................................................................................... 69
4.2.6
Guillain-Barré-Syndrom ............................................................................ 70
4.3
Vergleich zwischen den Krankheitsgruppen .................................................... 73
5
Zusammenfassung ...................................................................................................... 79
6
Literaturverzeichnis .................................................................................................... 82
V
Abkürzungsverzeichnis
AP
alkalische Phosphatase
APAAP
alkalische Phosphatase-Anti-alkalische Phosphatase
ASI
Antikörper-Spezifitäts-Index
BSA
Bovine Serum Albumin
CD
Cluster of Differentiation
DMF
N,N-dimethylformamide
HLA
Human Leucocyte antigen
Ig (A/M/G)
Immunglobulin A, M, G
MHC-Klasse
major histocompatibility complex
NK-Zellen
Natürliche Killerzellen
PAP
Peroxidase-Anti-Peroxidase
TBS
Tris buffered saline
TCR
T-Cell-Receptor
Tris
Trishydroxymethylaminomethane
VZV
Varizella Zoster Virus
ZNS
Zentralnervensystem
x
Mittelwert
sx
Standardabweichung
VI
1 Einleitung
1.1 Kurze historische Entwicklung der Liquorzytologie
Durch die Einführung der Lumbalpunktion als Technik der Liquorentnahme, wurden
1891 durch Wynter und Quincke die Voraussetzungen geschaffen, diese
Körperflüssigkeit zytologisch zu untersuchen. Die frühesten Analysen wurden bereits
von Morton im Oktober 1891 über die Liquorveränderungen bei der tuberkulösen
Meningitis veröffentlicht (Sakula 1991). Seit dieser Zeit wird die Gesamtzellzahl im
Liquor bestimmt. Durch die 1903 von Babinski und Nageotte eingeleitete Entwicklung
geeigneter Zellanreicherungsverfahren, entwickelte sich die Liquorzelldiagnostik weiter
und das Differentialzellbild erlangte seine bis heute andauernde Bedeutung
(Dufresne 1973).
Mit der Entwicklung der Technologie zur Herstellung monoklonaler Antikörper wurde
ein weiterer Meilenstein der medizinischen Diagnostik erreicht (Köhler und Milstein
1975). Bedeutsam wurde vor allem die Unterscheidung der Lymphozyten in „Thymus
geprägte“ T-Lymphozyten, als Träger der zellulären Immunität und in die für die
Antikörperproduktion wesentlichen „Bursa abhängigen“ B-Lymphozyten.
Die zunehmende Bedeutung der monoklonalen Antikörper in der medizinische
Diagnostik, führte zur Weiterentwicklung der immunenzymatischen Färbemethoden.
Mit der Einführung löslicher Enzym-Immunkomplexe gelang es, eine der sensitivsten
immunologischen Färbetechniken zu entwickeln (Sternberger und Cuculis 1969, Mason
und Sammons 1978). Zu ihnen zählt die APAAP- (alkalische Phosphatase-Antialkalische Phosphatase) Methode. Mit der Weiterentwicklung der APAAP-Technik
gelang es die Sensitivität bis zu dem Maß zu steigern, daß einzelne Immunglobulin
produzierende Zellen spezifisch gefärbt werden konnten (Mason 1985).
Die Einführung dieser immunchemischen Methoden brachte auch in der
Liquorzytologie entscheidende Fortschritte. Diagnostisch bedeutsam ist hier vor allem
der Nachweis von Immunglobulin (IgG, IgA, IgM) synthetisierenden B-Lymphozyten.
1
1.2 Darstellung der untersuchten Krankheitsbilder
1.2.1 Zoster
Der Zoster, ist eine durch das VZV (Varicella-Zoster-Virus) hervorgerufene
Infektionskrankheit. Das VZV persistiert nach der Primärinfektion (Windpocken) in den
sensorischen Spinalganglien des Rückenmarkes. Bei der Reaktivierung der Infektion ist
oft das ganze Spinalganglion entzündet. Das typische Krankheitsbild zeigt sich als
vesikuläre Effloreszenz. Diese breitet sich gürtelförmig im Verlauf eines sensorischen
Dermatoms aus. Aus einem initial gruppenförmig angeordneten makulo-papulösen
Exanthem, entwickelt sich später ein vesikulär-pustulöses Exanthem. Dieses beginnt
nach 5 - 10 Tagen bereits zu verkrusten und kann auch narbig abheilen. Schmerzen oder
Parästhesien können dem Exanthem bis zu drei Wochen vorausgehen, es begleiten oder
auch nach der Abheilungsphase als postherpetische Neuralgie bei ca. 10 - 20% der
Patienten bestehen bleiben.
Bei der Zoster-Ganglionitis findet sich im transparenten Liquor häufig eine deutliche
mononukleäre Pleozytose (bis zu 150 Zellen pro µl), eine leichte Schrankenstörung und
ein normaler Laktatwert. Die humorale Immunreaktion ist verhältnismäßig schwach,
jedoch steigt der ASI (Antikörper-Spezifitäts-Index) auf über 1,5 an (Felgenhauer, 1992,
Enders 1992).
1.2.2 Aseptische Meningitis
Die aseptische lymphozytäre Meningitis ist eine häufige, meist viral bedingte
Infektionskrankheit der Leptomeninx. Das Krankheitsbild zeigt überwiegend ein
meningeales
Syndrom,
welches
durch
Kopfschmerz
und
eventuelle
Bewußtseinsstörungen charakterisiert sein kann. Im Gegensatz zur akuten bakteriellen
Meningitis kann es bei der aseptische Meningitis zu einer deutlich leichteren
Ausprägung des meningealen Syndroms kommen.
Im Liquor der akuten viralen Meningitis ist eine überwiegend mononukleäre Pleozytose
(bis zu mehreren hundert Zellen pro µl) mit aktivierten B-Lymphozyten zu finden
(Kölmel 1976). Ebenso zeigen sich eine leichte bis mittelgradige Schrankenstörung und
normwertige Glucose- und Laktatwerte (Felgenhauer 1992).
2
1.2.3 Septische Meningitis
Die bakterielle Meningitis ist ein hochakutes meningeales Krankheitsbild. Es entsteht
durch den Einbruch von Bakterien in den Subarachnoidalraum mit Eiteransammlungen
vor allem über den Großhirnhemisphären (Haubenmeningitis). Häufigste Erreger sind
Meningokokken, Pneumokokken, Haemophilus influenzae und gramnegative
Enterobacteriaceae. Das Krankheitsbild zeigt ein hochakutes meningeales Syndrom,
welches durch Kopfschmerz, Lichtempfindlichkeit, Opisthotonus, vegetative Störungen
und eventuell psychische Veränderungen charakterisiert sein kann. Innerhalb von
Stunden ist eine Bewußtseinseintrübung möglich.
Im Liquor der bakteriellen Meningitis zeigt sich eine polynukleäre Pleozytose, eine
Schrankenstörung und ein erhöhter Laktatwert. Außerdem gelingt der Nachweis von
Bakterien oder bakteriellen Antigenen. Makroskopisch erscheint der Liquor trübe bis
eitrig. Im weiteren Verlauf läßt sich, auch bei erfolgreich behandelten eitrigen
Meningitiden, eine mononukleäre Phase feststellen.
1.2.4 Neuroborreliose (Meningoneuritis Bannwarth)
Die Neuroborreliose wird durch Borrelia burgdorferi hervorgerufen. Hauptvektor im
mitteleuropäischen Raum ist die Schildzecke Ixodes ricinus.
Die durch diesen Erreger hervorgerufene Infektionskrankheit ist eine
Multisystemerkrankung. Sie kann in drei klinischen Stadien mit den verschiedensten
Organmanifestationen verlaufen. Jede Manifestation kann einzeln oder kombiniert
auftreten (Pfister und Weber 1990).
Die Meningoneuritis Bannwarth (= klinisches Stadium II) wird erst nach Wochen bis
Monaten symptomatisch. Die Symptomatik bezieht sich auf Reizerscheinungen und/
oder Ausfälle von peripheren Nerven, Nervenwurzeln und auch Meningen. Dabei stehen
brennende, radikuläre Schmerzen ohne oder mit motorischen Ausfällen im
Vordergrund. Eine häufige Beteiligung der Hirnnerven äußert sich überwiegend in einer
akuten peripheren Fazialislähmung (Kunze 1992).
Im Liquor der Neuroborreliose ist eine überwiegend mononukleäre Pleozytose mit bis
zu 25% aktivierten B-Lymphozyten, eine schwere Schrankenstörung und eine breite
humorale Immunreaktion mit besonders starker Beteiligung des IgM nachweisbar
(Felgenhauer 1992).
3
1.2.5 Akutes Guillain-Barré-Syndrom
Das Guillain-Barré-Syndrom (akute idiopathische Polyradikuloneuritis) ist eine
immunologisch bedingte, akut oder subakut auftretende Entzündung peripherer Nerven
und Nervenwurzeln. Die genaue Ursache ist aber bisher letztlich nicht geklärt.
Das typische Krankheitsbild zeigt eine progrediente, vorwiegend motorische
Polyneuritis. Die überwiegend symmetrisch angeordnete schlaffe Lähmung kann initial
mit Parästhesien einhergehen und beginnt vor allem an den unteren Extremitäten mit
Reflexabschwächung oder Areflexie. Im Verlauf der Ausbreitung der motorischen
Ausfälle kommt es häufig zu Atemfunktionsstörungen. Hirnnerven, besonders der
Nervus facialis, können mit einbezogen sein. Vegetative Komplikationen sind durch
neuropathische Beteiligung des Nervus vagus, der Chemo- und Barorezeptoren bedingt.
Sensible Störungen können vorhanden sein, treten aber deutlich zurück.
Im Liquor des Guillain-Barré-Syndroms finden sich charakteristischerweise eine
schwere Schrankenstörung und gelegentlich eine leichte mononukleäre Pleozytose
(albumino-zytologische Dissoziation). Diese können sich allerdings auch erst im
Verlauf der Krankheit entwickeln (Kunze, 1992).
1.3 Fragestellung
Unter normalen Bedingungen ist das ZNS (Zentralnervensystem) durch die Blut-HirnSchranke geschützt und selten betroffen von immunologischen Interaktionen, die in
anderen Körperkompartimenten ablaufen.
Bei entzündlichen Erkrankungen des ZNS überwinden Serumproteine und Leukozyten
diese Barriere und zeigen ihre immunregulatorische Aktivität und Effektorfunktion
innerhalb des Subarachnoidalraumes. Dabei ist die Differenzierung der mononukleären
Liquorzellen sowohl für die Zuordnung und Klassifizierung der Zellen, als auch für
diagnostische und pathogenetische Schlußfolgerungen zu verschiedenen Erkrankungen
von Bedeutung.
Bis zur Entwicklung monoklonaler Antikörper spielte die Immunzytologie in der
Hämatologie nur eine untergeordnete Rolle und beschränkte sich auf den Nachweis von
Immunglobulinen. Durch den breiten Einsatz mononukleärer Antikörper führte die
Anwendung immunologischer Färbetechniken zu einem besseren Verständnis der
physiologischen Hämatopoese und ermöglichte bei der Diagnostik von Neoplasien eine
genauere Charakterisierung der Zellart und ihres Differenzierungsgrades.
4
Viele der Oberflächenantigene wurden inzwischen im Rahmen von mehreren
„International Workshop on Human Leucocyte Differentiation Antigens“ (Paris 1982,
Boston 1984, Oxford 1986, Wien 1989, Boston 1993) genau definiert und in der
sogenannten CD-Klassifikation der Leukozytenantigene in verschiedene Klassen
eingeteilt. Durch die Anwendung der monoklonalen Antikörper auch bei der
immunzytologischen Differenzierung von Liquorzellen, konnte schließlich mit der
Sammlung qualitativer und quantitativer Angaben über die Zusammensetzung des
Liquors begonnen werden.
Durch die Immunfärbung mit dem APAAP-Komplex entsteht eine sehr kontrastreiche
Markierung, da das Reaktionsprodukt der alkalischen Phosphatase bei der Verwendung
von Neu Fuchsin intensiv rot ist und sich sehr deutlich von der blauen Gegenfärbung
(Hämalaun) abhebt.
Bei der Durchführung dieser Methode ist es möglich, innerhalb eines
Untersuchungsganges, sowohl die immunologische, als auch die morphologische
Differentialzytologie der Liquorzellen lichtmikroskopisch zu beurteilen.
Ziel dieser Arbeit ist es, die an den entzündlichen Erkrankung des Nervensystems
beteiligten Liquorzellen in ihre Subpopulationen zu differenzieren. Dabei soll versucht
werden, zusätzliche Informationen über die immunzytologischen Unterschiede
zwischen den untersuchten Erkrankungen zu erhalten und bei den einzelnen
Erkrankungen die Verlaufsdynamik zu berücksichtigen.
5
2 Material und Methode
2.1 Patienten
Das Liquorlabor der Neurologischen Klinik im Bergmannsheil Bochum erstellt aus dem
Material der diagnostischen Liquorpunktionen Cytospin-Zell-Präparate für die
zytologische Routineuntersuchung. Seit dem Januar 1992 wurden zur
immunzytochemischen Untersuchung weitere Cytospin-Präparate erstellt und
gesammelt.
Für diese Studie wurden die gesammelten Präparate aus dem Zeitraum von Januar 1992
bis Dezember 1994 auf die nachfolgenden Krankheitsbilder hin ausgewählt und
immunzytochemisch untersucht. Präparate von Patienten mit artifizieller
Blutbeimengung wurden bei der Auswahl nicht berücksichtigt.
2.1.1 Kontrollgruppe
In die Kontrollgruppe wurden 13 Patienten mit Erkrankungen ohne entzündliche
Liquorveränderungen aufgenommen; davon waren 8 Frauen und 5 Männer im Alter
zwischen 34 und 76 Jahren (54,2 ± 13,6).
Die Patientengruppe setzt sich aus drei Patienten mit Migräne, zwei mit motorischer
Systemdegeneration (amyotrophische Lateralsklerose), drei mit ischämischem
Hirninfarkt und fünf mit degenerativem Wirbelsäulenleiden zusammen.
Alle Patienten wurden innerhalb der ersten Woche, nach Auftreten der Symptome,
einmal diagnostisch punktiert. Eine Kontrollpunktion war klinisch nicht notwendig und
wurde bei keinem Patienten aus der Gruppe durchgeführt.
Aus ethischen Gründen wurden keine gesunden Probanden in die Kontrollgruppe
aufgenommen.
2.1.2 Zoster
In die Zoster Gruppe wurden 50 Patienten aufgenommen; davon waren 27 Frauen und
23 Männer im Alter zwischen 14 und 92 Jahren (53,7 ± 21,2).
Die diagnostische Erstpunktion erfolgte bei 29 Patienten in der ersten Woche nach
Auftreten der Symptome (Schmerzen, Brennen, Rötung, Effloreszenz), bei 11 Patienten
in der zweiten Woche und bei 10 Patienten nach der zweiten Woche. Dabei zeigten
44 Patienten frische oder in Abheilung befindliche typische Effloreszenzen; sechs
Patienten beschrieben bei der Punktion bereits postzosterischer Neuralgien.
6
In dieser Studiengruppe wurde bei 13 Patienten eine zweite, bei einem Patienten eine
dritte Punktion durchgeführt.
Die zweite Punktion wurde bei einem Patienten in der ersten Woche, bei sechs Patienten
in der zweiten und bei sechs weiteren Patienten in der dritten Woche nach der ersten
Punktion durchgeführt.
Die dritte Punktion erfolgte in der achten Woche nach der ersten Punktion, der
6. Woche nach der zweiten Punktion.
2.1.3 Aseptische Meningitis
In die Patientengruppe mit aseptischer lymphozytärer Meningitis wurden 19 Personen
aufgenommen; davon waren 8 Frauen und 11 Männern im Alter zwischen 18 und
72 Jahren (39,8 ± 16,3).
Die diagnostische Erstpunktion erfolgte bei 10 Patienten in der ersten Woche nach
Auftreten des meningealen Syndroms, bei sechs Patienten in der zweiten Woche und bei
drei Patienten nach der zweiten Woche. Zum Zeitpunkt der ersten Punktion klagten alle
19 Patienten über erhöhte Temperaturen (> 38°C), Kopfschmerzen und Übelkeit
(meningeales Syndrom).
In dieser Studiengruppe wurde bei zehn Patienten eine zweite und bei zwei Patienten
eine dritte Punktion durchgeführt.
Die zweite Punktion wurde im zeitlichen Abstand zur ersten Punktion bei zwei
Patienten in der zweiten Woche, bei drei Patienten in der dritten Woche und bei fünf
Patienten nach der dritten Woche durchgeführt.
Die dritte Punktion wurde beim ersten Patienten in der 13. Woche nach der ersten
Punktion, der dritten Woche nach der zweiten Punktion durchgeführt. Beim zweiten
Patienten wurde sie in der vierten Woche nach der ersten Punktion, der zweiten Woche
nach der zweiten Punktion durchgeführt.
7
2.1.4 Septische Meningitis
Der Patientengruppe mit septischer Meningitis wurden insgesamt 17 Personen
zugeordnet; davon waren 9 Frauen und 8 Männern im Alter zwischen 20 und 70 Jahren
(49,1 ± 16,1).
Die diagnostische Erstpunktion erfolgte nach dem Auftreten des meningealen Syndroms
bei 15 Patienten in der ersten Woche, bei einem Patienten in der zweiten Woche und bei
einem Patienten nach der zweiten Woche.
Zum Zeitpunkt der ersten Punktion zeigten alle 17 Patienten ein meningeales Syndrom
mit Fieber (> 39,0°C), Kopfschmerz, Doppeltsehen, starke Somnolenz, Nackensteife
und Kernig-Zeichen.
In dieser Studiengruppe wurde bei zehn Patienten eine zweite und bei drei Patienten
eine dritte Punktion durchgeführt.
Die zweite Punktion wurde im zeitlichen Abstand zur ersten Punktion bei drei Patienten
in der ersten Woche, bei vier Patienten in der zweiten Woche, bei zwei Patienten in der
dritten Woche und bei einem Patienten nach der dritten Woche durchgeführt.
Die dritte Punktion wurde bei zwei Patienten in der dritten und bei einem in der vierten
Woche nach der ersten Punktion durchgeführt.
2.1.5 Neuroborreliose (Bannwarth-Syndrom)
In die Borreliose Gruppe wurden neun Patienten aufgenommen; davon waren drei
Frauen und sechs Männern im Alter zwischen 24 und 68 Jahren (51,9 ± 16,2).
Die diagnostische Erstpunktion erfolgte nach dem Auftreten der Beschwerden bei vier
Patienten in der ersten Woche, bei drei Patienten in der zweiten Woche und bei zwei
Patienten nach der zweiten Woche.
Zum Zeitpunkt der ersten Punktion zeigten sich bei allen 9 Patienten Reizerscheinungen
der peripheren Nerven, Nervenwurzeln oder auch der Meningen.
Dabei beschrieben drei Patienten Reizerscheinungen im lumbosakralen
Innervationsgebiet; ein Patient eine kombinierte lumbale und meningeale
Reizsymptomatik; ein Patient eine bilaterale Parese des Nervus facialis; zwei Patienten
die kombinierte Symptomatik einer meningealen Reizung mit unilateraler und
bilateraler Parese des Nervus facialis; zwei Patienten eine reine Reizung der Meningen.
In dieser Studiengruppe wurde bei allen 9 Patienten eine zweite Punktion und bei vier
Patienten eine dritte Punktion durchgeführt.
8
Die zweite Punktion wurde im zeitlichen Abstand zur ersten Punktion bei fünf Patienten
in der zweiten Woche, bei einem Patienten in der dritten Woche und bei drei Patienten
nach der dritten Woche durchgeführt.
Die zweite Kontrollpunktion wurde bei drei Patienten in der 14. Woche und bei einem
Patienten in der 17. Woche nach der Erstpunktion durchgeführt.
2.1.6 Akutes Guillain-Barré-Syndrom
Der Patientengruppe mit akutem Guillain-Barré-Syndrom wurden 19 Personen
zugeordnet; davon waren 7 Frauen und 12 Männern im Alter zwischen 29 und 81 Jahren
(56,2 ± 14,9).
Die diagnostische Erstpunktion erfolgte nach dem Auftreten der klinischen Symptome
(Paresen oder Sensibilitätsstörungen) bei 11 Patienten in der ersten Woche, bei fünf
Patienten in der zweiten Woche und bei drei Patienten nach der zweiten Woche.
Zum Zeitpunkt der Erstpunktion zeigten 18 Patienten klinisch das Bild eines akuten
Guillain-Barré-Syndroms mit symmetrisch schlaffen Paresen; ein Patient zeigte die
Symptomentrias eines Miller-Fisher-Syndroms (zerebellare Ataxie, Areflexie,
Ophthalmoplegie).
In der Patientengruppe wurde bei fünf Patienten eine zweite Punktion durchgeführt.
Eine dritte Punktion war im klinischen Verlauf nicht notwendig und wurde nicht
durchgeführt.
Die zweite Punktion wurde im zeitlichen Abstand zur ersten Punktion bei drei Patienten
in der dritten Woche und bei zwei Patienten nach der dritten Woche durchgeführt.
9
2.2 Materialien
2.2.1 Geräte
2.2.1.1 Geräte für die Bestimmung der Zellzahl
Fa. Brand
Fuchs-Rosenthal-Kammer
Fa. Assistent
Leukozytenmischpipette; Vibrator 340
2.2.1.2 Geräte für die Bestimmung der Differentialzytologie
Hettich Universal 16 A
Zytozentrifuge
Pharmacia GmbH
Ficoll-Paque
Shandon, Runcorn
Cytospin-Zentrifuge: Cytospin 2 Shandon
England
Objektträger: Cytoträger 76x26x1 mm
Fa. Schott
Färbekästen
Fa. Mettler
elektronische Waage J-Serie (0,5 - 310 g)
IKA-Labortechnik
Magnetrührer RCT basic
Fa. Sarsted
Objektträger-Versandgefäße 85x 30 mm
Fa. Brand
Pipettierball
Fa. Zeiss
Mikroskop: Axioskop
Vergr, 10x 10; 40x 10; 100x 10 (Ölimmersion)
2.2.1.3 Geräte für die Bestimmung der Immunzytochemie
Fa. Assistent
Feuchte Kammer
Fa. Eppendorf
Pipetten (10 - 1000 µl); Tubes 1,5 ml
Fa. Köttermann
Schüttelwasserbad/ -Inkubator
2.2.2 Chemikalien
2.2.2.1 Reagenzien für die Bestimmung der Zellzahl
Merck
Essigsäure 3%
10
2.2.2.2 Reagenzien für die Bestimmung der Differentialzytologie
Kulturmedium
Medium 199 (Flow Laboratories No. 14-230-49)
fetales Kälberserum (Sigma No. A-4503)
Penicillin/Streptomycin 10.000 mcg/ml
(Difco No. 5454-59)
Aqua dest. (Fresenius)
Essigsäure (Merck)
Panoptische
Natrium-Bicarbonat-Lösung
Kontrastfärbung nach
(Flow Laboratories No. 16-883-49)
Pappenheim
0,5 ml May-Grünwald Lösung (Merck No. 1424)
Aqua dest.
Giemsa-Lösung (Merck No. 9204)
2.2.2.3 Reagenzien für die APAAP-Färbetechnik
Fixierungsmedium
• Aceton : Methanol im Verhältnis 1:2
Haftimprägnierung für
• Poly-L-lysine (Fa. Sigma No. P1399)
Objektträger
Spülpuffer
50 µg/ml Aqua dest.;
• 0,05 M Tris buffered saline (TBS), pH 7,6;
• 6,1 g Trishydroxymethylaminomethane/ l
(Merck No 8382),
• 8,8 g NaCl/ l, pH-Wert titrieren mit 1 N HCl
(Titrisol Merck No. 9970)
Spül- und
Blockierungspuffer
Propandiolstammpuffer
• 1 g Bovine Serum Albumin (BSA) (Sigma No. A-4503)
auf 100 ml TBS (>> 1% BSA-Lsg.)
• 21,028 g 2-Amino-2,2-methyl-propan-1,3-diol/ l
(Merck No 801464),
• Aqua dest.
Primärantikörper
• CD4, monoklonal Maus, IgG, (DAKO No. M-0716);
verdünnt 1:20 in TBS/ 1 % BSA,
• CD8, monoklonal Maus, IgG, (DAKO No. M-0707);
verdünnt 1:100 in TBS/ 1 % BSA,
• IgM, monoklonal Maus, IgG, (DAKO No. M-0702);
verdünnt 1:80 in TBS/ 1 % BSA,
• HLADR, monoklonal Maus, IgG (Dianova No. 0108);
11
verdünnt 1:50 in TBS/ 1 % BSA;
Brückenantikörper
• Kaninchen Anti-Maus IgG, (DAKO No. Z-259);
verdünnt 1: 25 in TBS/ 1 % BSA;
APAAP-Komplex
• APAAP Maus monoklonal IgG (DAKO No. D-651);
verdünnt 1:50 in TBS/ 1 % BSA
Substrat
• Naphthol AS-BI-phosphat (Sigma No. N-2125),
• Neufuchsin (Serva No. 30293),
• Levamisole (Sigma No. L-9756),
• N,N-dimethylformamide (DMF) (Merck No. 3053),
• Natriumnitrit (Sigma No. S-2252),
• 2-Amino-2,2-methyl-propan-1,3-diol
(Merck No. 801464),
• NaCl (Merck No. 6400),
• Tris-Puffer pH 7,6
Substrat-Lösung
I. 62,5 mg Naphtol-AS-BI-phosphat in 0,75 ml DMF
II. 0,25 ml 5 % Neufuchsin (5 g in 100 ml 2 N HCl) in
0,625 ml 4 % Natriumnitrit
(25 mg in 0,625 ml Aqua dest.)
III.
50 mg Levamisole
in 31,25 ml Propandiolstammpuffer in
87,5 ml Aqua dest.
Lösung II. und III. mischen, dann Lösung I. hinzufüllen;
pH-Wert mit 1 N HCl auf pH 8,7 einstellen, danach
filtrieren.
Hämalaun-Lösung
• Meyers Hämalaun (Merck No. 9249)
Eindeck-Lösung
• Kaiser´s Glyceringelantine (Merck No. 9242)
Alle übrigen Chemikalien stammten von Merck, Darmstadt.
12
2.3 Methodik
2.3.1 Zellzahl
Die Bestimmung der Liquorzellzahl wurde mit der Fuchs-Rosenthal-Kammer
durchgeführt.
In einer Leukozytenmischpipette ist 3 % Essigsäure mit dem frisch gewonnenen Liquor
im Verhältnis 10:1 aufgezogen und 90 Sekunden gemischt worden. Um die im
Kapillarteil befindliche unvermischte Flüssigkeit vor der Kammerbeschickung zu
entfernen, sind die ersten 3 bis 5 Tropfen verworfen worden, bevor das Gemisch
vorsichtig in die vorbereitete Zählkammer gefüllt wurde. Die gesamte Fuchs-RosenthalKammer wurde unter 400x-facher Vergrößerung ausgezählt und die Zellzahl in Dritteln
angegeben. Für die Angabe in Mikroliter [µl] wurde die Gesamtzahl der Liquorzellen
durch 3 dividiert (Volumen der Kammer 3 µl).
Der Normalwert der Zellzahl im Liquor beträgt ≤ 4 Rundzellen pro Mikroliter.
2.3.2 Herstellung der Zellpräparate und Differentialzytologie
Die Präparation der Zellen aus ca. 10 ml Liquor/Probe erfolgte nach dem Verfahren der
kombinierten Zentrifugation und Zytozentrifugation (Wurster et al. 1984). Der Liquor
wurde 20 min in der Zentrifuge mit 1500 U/min behandelt. Nach der Trennung vom
Überstand wurde das Sediment mit Kulturmedium (pro Präparat 200 µl; 1:1) versetzt
und zum Zellfang in der Cytospin-Zentrifuge verwendet. Die mit den Liquorzellen
beschichteten Objektträger wurden 10 min luftgetrocknet und für die
Differentialzytologie nach Pappenheims panoptischer Kontrastfärbung gefärbt
(0,5 min May-Grünwald; 4,5 min Giemsa).
Das Kulturmedium zur Resuspension des Zellsediments wurde aus fetalem Kälberserum
und modifiziertem Medium 199 hergestellt. Das Medium 199 ist als 10-fach
konzentrierte Vorratslösung im Handel (Flow Laboratories). 5 ml dieses Konzentrats
wurden mit 500 µl Penicillin/ Streptomycin (10.000 mcg/ml) und 44,5 ml Aqua dest.
gemischt. Danach wurde mit 7,5 % Natrium-Bicarbonat-Lösung ein pH von 7,2 bis 7,3
eingestellt. Fetales Kälberserum wurde bei 56°C im Brutschrank für 2 h inkubiert. Um
gebrauchsfertiges Kulturmedium für Liquorzellen zu erhalten, sind 9 ml Medium mit
1 ml fetalem Kälberserum vermischt worden.
13
2.3.3 Immunhistochemische Untersuchung
Die Untersuchung erfolgte nach der APAAP-Methode und wurde an
Zytozentrifugenpräparaten mit Liquorzellen durchgeführt.
Die Präparate wurden 24 h bei Raumtemperatur luftgetrocknet und danach bei 4oC mit
einem Gemisch aus Methanol und Aceton im Verhältnis 2:1 für einen Zeitraum von
90 Sekunden lang fixiert. Die fixierten Präparate wurden bei einer Temperatur von
-70oC luftdicht gelagert (Moir et al. 1983).
Vor dem sich anschließenden Färbevorgang wurde das Präparat 1 Stunde in seinem
Behälter bei Raumtemperatur aufgetaut und danach in der APAAP-Technik mit
monoklonalen Antikörpern beschichtet.
2.3.3.1 APAAP-Technik
Bei dieser Methode werden lösliche Enzym-Immunkomplexe als Färbesystem
verwandt, die sich aus jeweils 2 Molekülen der alkalischen Phosphatase des
Kälberdarms und einem dagegen gerichteten Mausantikörper aufbauen (APAAPKomplex DAKO). Durch die natürliche Affinität von Antikörpern gegenüber ihrem
Antigen entstehen stabile Immunkomplexe.
Das Verfahren erreicht durch eine größere Anzahl von Enzymmolekülen, die pro
Antigen zur Verfügung stehen, eine bessere Sensitivität, als andere
immunzytochemische Verfahren. Das nachzuweisende, zellgebundene Antigen wird mit
einem primären Antikörper markiert und danach über einen Brückenantikörper mit dem
APAAP-Komplex verbunden. Die alkalische Phosphatase hydrolysiert das zugefügte
Substrat Naphtholphosphat-Ester in seine Phenol- und Phosphatkomponenten. Naphthol
bildet zusammen mit dem farblosen Diazoniumsalz Neufuchsin einen roten unlösliche
Azofarbstoff.
Wenn die Färbung mit dem Standard APAAP-Schema zu schwach ausfällt, kann die
Farbintensität durch wiederholte Applikation des Brückenantikörpers mit APAAPKomplex gesteigert werden. Die Zunahme der unspezifischen Färbung fällt bei der
Beurteilung des Präparates nicht ins Gewicht (Beuche et al. 1989, Beuche et al. 1992).
Die APAAP-Färbung kann nicht angewandt werden bei Zellen, die selbst intestinale
alkalische Phosphatase beinhalten, z.B. Zellen des intestinalen Epithels. Isoenzyme der
alkalischen Phosphatase, die in Endothelzellen und Granulozyten vorkommen, können
zur Kontrastierung durch Levamisole gehemmt werden (Janckila et al. 1985).
14
2.3.3.1.1 APAAP-Testprinzip
unspezifische Struktur
alkalische Phosphatase
(endogen)
Abbildung 1
Antigen
(hydrophob./elektrostat.
Interaktion)
Liquorzelloberfläche mit spezifischen und unspezifischen Strukturen
Levamisole
Abbildung 2
Blockierung der endogenen alkalischen Phosphatase durch Levamisole, zur Reduktion der
unspezifischen Hintergrundfärbung
Normalserum
Abbildung 3
Blockierung unspezifischer Strukturen durch Normalserum, zur Reduktion der
unspezifischen Hintergrundfärbung
15
Primärantikörper
Abbildung 4
Anlagerung des Primärantikörpers an das Antigen
Brückenantikörper
Abbildung 5
Anlagerung des Brückenantikörpers als Bindeglied zwischen Primär- und
Markierungsantikörper
16
Abbildung 6
E
Enzym-Anti-EnzymKomplex
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
Anlagerung der Markierungsantikörper
(alkalische Phosphatase-Anti-alkalische
Phosphatase-Komplex).
Farbentwicklung durch Substratlösung:
Naphtolphosphat und NEUFUCHSIN
(rotes Reaktionsprodukt)
E
Brückenantikörper
Primärantikörper
17
2.3.3.1.2 Färbevorgang
Die immunzytochemische Färbung erfolgte nach der von Sindern 1995 modifizierten
APAAP-Methode. Zur Verdeutlichung der einzelnen Färbeschritte wird die Methode in
die einzelnen Inkubationsvorgänge gegliedert.
A. 1. Die gefrorenen Präparate bei Raumtemperatur in ihren Schutzhüllen auftauen
- 60 min.
2. Inkubation mit 1% Rinderalbumin (BSA) in Tris-Puffer-Gebrauchslösung (TBS)
- 20 min
3. Präparate auf Zellstoff abtropfen lassen.
B. 1. Inkubation mit Primärantikörper (monoklonal) in feuchter Kammer - 30 min
2. Waschen in TBS/ 1 % BSA - 3 min
3. Präparate auf Zellstoff abtropfen lassen.
C. 1. Inkubation mit Brückenantikörper in feuchter Kammer - 30 min
2. Waschen in TBS/ 1 % BSA - 3 min
3. Präparate auf Zellstoff abtropfen lassen.
D. 1. Inkubation mit APAAP-Komplex in feuchter Kammer - 30 min
2. Waschen in TBS/ 1 % BSA - 3 min
3. Präparate auf Zellstoff abtropfen lassen.
Zur Intensivierung des Färbeergebnisses wird die Inkubation mit dem
Brückenantikörper und dem APAAP-Komplex wiederholt:
E. 1. Inkubation mit dem Brückenantikörper in feuchter Kammer - 10 min
2. Waschen in TBS/ 1 % BSA - 3 min
3. Präparate auf Zellstoff abtropfen lassen.
F. 1. Inkubation mit APAAP-Komplex in feuchter Kammer - 10 min
2. Waschen in TBS/ 1 % BSA - 3 min
3. Präparate auf Zellstoff abtropfen lassen.
18
G. 1. Inkubation (unter Schütteln) in dem frisch angesetzten Substrat - 30 min
2. Spülen in Aqua destillata; beendet die Umsetzung des Substrats
3. Gegenfärbung mit Hämalaun und feucht eindecken.
Für die Beurteilung der immunzytochemisch behandelten Präparate wurden nur gut
erhaltene Zellen berücksichtigt. Extrazelluläre Anfärbungen und Anfärbungen
nekrotischer oder lytischer Zellen wurden als unspezifisch betrachtet. Eine intensive
rote Färbung (Neufuchsin) zytoplasmatischer oder zytomembranöser Anteile, wurde als
positives Reaktionsprodukt gewertet. Die in vorausgegangenen Untersuchungen in
unserem Liquorlabor mit der gleichen Methodik erreichten Reaktionen in anderen
Liquorproben wurden als positive Kontrolle herangezogen. In jedem Präparat wurden
100 bis 400 Zellen gezählt und von diesen der Prozentsatz an positiven Zellen
berechnet. Sämtliche Präparate wurden von derselben Person ausgezählt.
2.3.3.2 Antikörper - Beschreibung
2.3.3.2.1 Cluster of Differentiation (CD) 4
DAKO-CD4 ist ein monoklonaler Antikörper (IgG1) der Maus und reagiert mit einem
Glykoprotein, welches als CD4-Antigen im System zur Klassifizierung der
menschlichen Leukozytenantigene beschrieben wird. CD4 charakterisiert eine
T-Lymphozyten-Subpopulation, mit einer die Immunantwort induzierenden Aktivität.
Für den Helfer-/Inducer-T-Lymphozyten ist CD4 ein notwendiges Molekül, um den
MHC-Klasse II-Rezeptor der antigenpräsentierenden Zelle zu erkennen. Die
CD4-positiven T-Lymphozyten repräsentieren zirka 45 % der im peripheren Blut
vorkommenden Lymphozyten. Das durch den CD4-Antikörper gefundene Antigen wird
nicht ausschließlich auf T-Zellen gefunden, sondern ebenso auf Abkömmlingen der
Monozyten und Makrophagen. Bei ihnen ist jedoch, gegenüber den T-Lymphozyten, die
Anzahl der CD4-Moleküle auf der Zelloberfläche signifikant geringer ausgebildet, so
daß dieser Antikörper als nützlich zur Bewertung der T-Zellsubpopulation angesehen
werden kann (Chan und Hui 1988).
19
2.3.3.2.2 Cluster of Differentiation (CD) 8
DAKO-CD8 ist ein monoklonaler Antikörper (IgG1) der Maus und reagiert mit einem
Glykoprotein, welches den Differenzierungsantigenen des CD8 zugeordnet wird.
CD8 definiert eine T-Zellsubpopulation, die überwiegend für Suppressor sowie
zytotoxische Mechanismen verantwortlich ist. Die CD8-positiven T-Lymphozyten
machen etwa 20 % der im peripheren Blut vorkommenden menschlichen Lymphozyten
aus. Das CD8-Molekül bildet zusammen mit dem T-Cell-Receptor (TCR), einem
spezifischen Antigenrezeptor der T-Zellen, einen Co-Rezeptor für (major
histocompatibility complex) MHC-Klasse I-Moleküle bei der Antigenerkennung. Mit
einer geringen bis mittleren Dichte wird das CD8 Antigen auch von Natürlichen
Killerzellen (NK-Zellen), einer heterogenen Subklasse der Lymphozyten, ausgebildet.
Bei ihnen ist jedoch die Anzahl der CD8-Moleküle auf der Zelloberfläche signifikant
geringer ausgebildet, so daß dieser Antikörper als nützlich zur Bewertung der
Suppressor/ zytotoxischen T-Lymphozyten angesehen werden kann.
2.3.3.2.3 Human Leucocyte antigen (HLA) DR
Dianova-HLADR ist ein monoklonaler Antikörper (IgG2a) der Maus und reagiert mit
einem monomorphem HLA-Klasse-II-Epitop, das an der zellulären Interaktion
zwischen immunkompetenten Zellen beteiligt ist.
Das HLADR-Antigen wird von einer Reihe von Zellen, einschließlich B-Lymphozyten
ausgebildet. Die ruhenden T-Zellen zeigen keine Ausprägung des DR-Antigens, außer
sie werden aktiviert. Winchester und Kunkel (1979) konnten die Ausprägung des
DR-Antigens bei ruhenden T-Lymphozyten nach in vitro Aktivierung durch Mitogene
oder Antigene steigern. Deshalb ist HLADR ein anerkannter Marker für die
T-Zellaktivierung. Eine beträchtliche Anzahl von HLA-Klasse-II-positiven
T-Lymphozyten wird bei Erkrankungen mit starker Stimulation des Immunsytems
gefunden. Granulozyten und Thrombozyten bilden dieses Antigen nicht.
Die Ausbildung von HLADR und CD8 läßt auf eine Aktivierung der zytotoxischen
T-Zellen, zum Beispiel bei viralen Infektionen, schließen.
Dieser Antikörper ist nützlich für die Bewertung der HLA Klasse II bei der zellulären
Interaktionen und antigener Stimulation.
20
2.3.3.2.4 Immunglobulin M (IgM)
DAKO-IgM ist ein monoklonaler Antikörper (IgG1) der Maus und reagiert mit der
schweren Kette (µ-Kette), des in allen Variationen vorkommenden menschlichen IgM.
Die Hauptmasse der antigenreaktiven B-Zellen exprimiert IgM und IgD. Die IgM und
IgD positiven B-Lymphozyten finden sich im Blut, in den Lymphknoten, den
Peyerschen Plaques und jedem anderen extranodalen lymphatischen Gewebe. Dieser
Antikörper ist nützlich zur Beschreibung der IgM produzierenden B-Lymphozyten.
2.4 Statistik
Eine statistische Beratung erfolgte im Institut für Medizinische Informatik, Biometrie
und Epidemiologie der Ruhr-Universität (Direktor: Prof. Dr. rer. nat. Trampisch). Die
Analysen wurden mit der Software StatView 5.0 (Eigenlizenz Studentenversion) auf
einem Macintosh-Computer durchgeführt.
Die folgenden statistischen Methoden kamen zur Anwendung:
Kolmogorov-Smirnov Test und Normalverteilungsplots zur Prüfung der
Normalverteilung der Werte einer Stichprobe:
Obwohl der Test auf Normalverteilung in den Datengruppen keine signifikante
Abweichung von der Normalitätsannahme findet, ist die qualitative Beurteilung der
Normalverteilungsplots und die Güte des Normalitätstest (sensitiv für Ausreißer) von
kleinen Stichproben unbefriedigend (Hüsler et Zimmermann 1996).
Daher kamen folgende nichtparametrische Testverfahren zur Anwendung:
Mann-Whitney U-Test für zwei unabhängige Stichproben.
Kruskal-Wallis-Test zum Vergleich von drei oder mehr unabhängigen Stichproben.
Wilcoxon-Vorzeichen-Rangsummentest für gepaarte Daten.
Die statistische Signifikanz wird durch den p-Wert ausgedrückt. Es wurde auf einem
Signifikanzniveau von mindestens p ≤ 0,05 gearbeitet. Die Irrtumswahrscheinlichkeiten
werden im Zusammenhang mit den jeweiligen Testergebnissen angegeben. Bei
Ausdrücken der Form
( x ± sx )
ist unter x der Mittelwert und unter sx die
Standardabweichung der Daten zu verstehen. Balkendiagramme stellen die Werte in
einer Stichprobe dar.
21
3 Ergebnisse
3.1 Färbeverhalten der Liquorzellen
Für die Beurteilung der immunzytochemisch behandelten Zellpräparate sind nur
morphologisch gut erhaltene Zellen berücksichtigt worden. Anfärbungen beschädigter
Zellen wurden als unspezifisch betrachtet. Als positive Färbereaktion galt die
Anwesenheit von intensiv rotem Reaktionsprodukt.
Die aus der Literatur bekannten und im Liquorlabor der Neurologischen Klinik mit der
gleichen Methodik erreichten Reaktionen wurden als positive Kontrollen herangezogen.
Insgesamt ergaben die von uns eingesetzten monoklonalen Antikörper kontrastreiche
Färbungen und waren gut auswertbar (Abbildung 7 - 10).
Abbildung 7:
Immunalkalische Phosphatase Färbung der Liquorzellen in einem Fall von Zoster, mit
dem monoklonalen CD4-Antikörper von DAKO. Vergrößerung 10x 10; 1. Pkt (Tag 7)
22
Abbildung 8:
Immunalkalische Phosphatase Färbung der Liquorzellen in einem Fall von
Neuroborreliose, mit dem monoklonalen CD8-Antikörper von DAKO.
Vergrößerung 10x 100 Ölimmersion; 1. Pkt (Tag 1)
Abbildung 9:
Immunalkalische Phosphatase Färbung der Liquorzellen in einem Fall von
Neuroborreliose, mit dem monoklonalen IgM-Antikörper von DAKO.
Vergrößerung 10x 40; 2. Pkt. (Tag 13); Akt. B.-L.
23
Abbildung 10:
Immunalkalische Phosphatase Färbung der Liquorzellen in einem Fall von septischer
Meningitis, mit dem monoklonalen HLADR-Antikörper von Dianova
Vergrößerung 10x 10; 1. Pkt. (Tag 1)
24
3.2 Kontrollgruppe
3.2.1 Zellzahl und Differentialzytologie
Die Gesamtzellzahl in den Liquorproben der Kontrollgruppe (Tabelle 1) lag zwischen
zwei und sechs Zellen pro Mikroliter. Bei zwei Patienten der Kontrollgruppe wurde eine
diskret erhöhte Zellzahl (über vier Zellen /µl) ermittelt.
Tabelle 1:
Leukozytenzahl und morphologische Differenzierung der Liquorzellen in der Kontrollgruppe.
n = Anzahl der Präparate
Kontrollgruppe
1. Punktion
( x ± sx )
3,4 ± 1,3
Leukozyten/µl
(n = 13)
89,7 ± 5,1
Lymphozyten (%)
(n = 13)
10,2 ± 5,1
Monozyten (%)
(n = 13)
0,2 ± 0,4
Granulozyten (%)
(n = 13)
0±0
Plasmozyten (%)
(n = 13)
Das morphologische Differentialzellbild im Liquor der Kontrollgruppe entsprach den in
der Literatur angegebenen Referenzwerten für den normalen Liquor. Bei zwei Patienten
zeigte das Differentialzellbild eine Abweichung im Granulozytenanteil von jeweils 1%.
25
Für die berechneten Mittelwerte des morphologischen Differentialzellbildes im Liquor
der Kontrollgruppe (Tabelle 1) wurde die Darstellung im Balkendiagramm gewählt.
Kontrollgruppe
(13)
100
90
80
70
60
50
40
30
(13)
20
(13)
(13)
Granulozyten
Plasmozyten
10
0
Lymphozyten
Abbildung 11:
Monozyten
Differentialzytologie im Liquor der Kontrollgruppe.
Die vertikale Markierung in den Balken kennzeichnet die Standardabweichung einer
durch ihre Morphologie definierten Zellgruppe.
(n) = Anzahl der zur Verfügung stehenden Präparate.
3.2.2 Immunzytologie
In der immunzytologischen Differenzierung der mononukleären Zellen (Tabelle 2)
bildeten die CD4 positiven T-Lymphozyten die größte Gruppe unter den Liquorzellen.
CD8 positive T-Lymphozyten waren weniger häufig.
Tabelle 2:
Immunologische Differenzierung der Liquorzellen der Kontrollgruppe.
Monoklonale Antikörper: CD4, CD8, IgM und HLADR; n = Anzahl der Präparate.
Kontrollgruppe
1. Punktion
( x ± sx )
61,1 ± 2,5
CD4 (%)
(n = 13)
28,6 ± 3,3
CD8 (%)
(n = 13)
0,1 ± 0,4
IgM (%)
(n = 7)
0,5 ± 0,5
HLADR (%)
(n = 6)
26
Bei einem Patienten fiel bei einem Anteil von 1% der Liquorzellen eine Positivität
gegenüber dem IgM-Zellmarker auf. Dieser Anteil der IgM positiven B-Zellen an den
mononukleären Zellen war sehr niedrig.
Bei drei Patienten wiesen 1% der Zellen eine Positivität gegenüber dem HLADRZellmarker auf. Der Anteil der HLADR positiven Zellen an den mononukleären Zellen
fiel ebenfalls sehr niedrig aus.
Für die berechneten Mittelwerte des immunologischen Differentialzellbildes im Liquor
der Kontrollgruppe (Tabelle 2) ist die Darstellung im Balkendiagramm gewählt worden.
Kontrollgruppe
70
(13)
60
50
40
(13)
30
20
10
(7)
(6)
IgM
HLADR
0
CD4
Abbildung 12:
CD8
Immunologische Differenzierung der Leukozyten im Liquor der Kontrollgruppe.
Die vertikale Markierung in den Balken kennzeichnet die Standardabweichung einer
durch monoklonale Antikörper definierten Zellgruppe.
(n) = Anzahl der zur Verfügung stehenden Präparate.
27
3.2.3 CD4/CD8-Ratio
Der Berechnung der Ratio aus CD4, sowie CD8 positiven T-Lymphozyten lagen die
Einzelergebnisse aus den Liquorpräparaten der Kontrollgruppe zu Grunde.
Tabelle 3:
CD4/CD8-Ratio im Liquor der Kontrollgruppe. n = Anzahl der Präparate
Kontrollgruppe
1. Punktion
( x ± sx )
61,1 ± 2,5
CD4 (%)
(n = 13)
28,6 ± 3,3
CD8 (%)
(n = 13)
2,2 ± 0,3
CD4/CD8-Ratio
(n = 13)
3.3 Zoster
3.3.1 Zellzahl und Differentialzytologie
Die Liquorproben der ersten und zweiten Punktion (Tabelle 4) zeigten in der
morphologischen Differentialzytologie eine mononukleäre Pleozytose, welche
hauptsächlich aus Lymphozyten und Monozyten und zu einem geringeren Umfang aus
Plasmozyten zusammengesetzt war. Die dritte Punktion wies eine nur noch diskrete
lympho-/ monozytäre Pleozytose auf.
Der Anteil der Plasmozyten an der Pleozytose lag unter 1%. Bei sieben Patienten
wurden zwischen 1 - 8% Granulozyten innerhalb der ersten zwei Wochen gefunden.
Tabelle 4:
Leukozytenzahl und morphologische Differenzierung der Liquorzellen bei Zoster.
n = Anzahl der Präparate.
28
Zoster
Leukozyten/µl
Lymphozyten (%)
Monozyten (%)
Granulozyten (%)
Plasmozyten (%)
1. Punktion
2. Punktion
3. Punktion
( x ± sx )
( x ± sx )
( x ± sx )
61,3 ± 106,9
61,1 ± 69,2
8,7
(n = 50)
(n = 13)
(n = 1)
74,3 ± 20,9
81,0 ± 19,5
83,0
(n = 50)
(n = 13)
(n = 1)
23,9 ± 19,1
18,5 ± 19,3
17,0
(n = 50)
(n = 13)
(n = 1)
0,3 ± 1,2
0±0
0
(n = 50)
(n = 13)
(n = 1)
0,6 ± 1,6
0,5 ± 0,7
0
(n = 50)
(n = 13)
(n = 1)
Für die berechneten Mittelwerte des morphologischen Differentialzellbildes bei Zoster
(Tabelle 4) wurde die Darstellung im Balkendiagramm gewählt.
Zoster
120
(50/13/1)
100
80
1. Punktion
2. Punktion
3. Punktion
60
(50/13/1)
40
20
(50/13/1)
(50/13/1)
Granulozyten
Plasmozyten
0
Lymphozyten
Abbildung 13:
Monozyten
Differentialzytologie der Liquorleukozyten bei Zoster.
Gegenüberstellung der einzelnen Punktionen im Verlauf der Erkrankung. Die Säule
stellt den Mittelwert dar. Die vertikale Markierung kennzeichnet die
Standardabweichung. (n) = Anzahl der zur Verfügung stehenden Präparate.
29
3.3.2 Immunzytologie
In der immunzytologischen Differenzierung der mononukleären Zellen (Tabelle 5)
bildeten die CD4 positiven T-Lymphozyten die größte Gruppe unter den Liquorzellen.
Die CD8 positiven T-Lymphozyten bildeten eine deutlich kleinere Gruppe.
Im Verlauf der Erkrankung ist die Entwicklung der T-Zellsubpopulationen deutlich
gegenläufig. Der CD4-Anteil sank von der ersten zur zweiten Punktion ab, wohingegen
der CD8-Anteil zunahm.
Zur dritten Punktion veränderte sich der Anteil der CD4 und CD8 positiven TLymphozyten gegenüber der zweiten Punktion nicht.
Keine Unterschiede zeigten sich im Verlauf der IgM positiven B-Zellen von der ersten
zur zweiten Punktion. In der dritten Punktion konnten keine IgM positiven BLymphozyten nachgewiesen werden.
Der Verlauf der HLADR positiven Zellen nahm stetig ab.
Tabelle 5:
Immunologische Differenzierung der Liquorzellen bei Zoster.
Die Werte beschreiben den Mittelwert ± Standardabweichung der monoklonalen Antikörper:
CD4, CD8, IgM und HLADR im Krankheitsverlauf; n = Anzahl der Präparate.
Zoster
CD4 (%)
CD8 (%)
IgM (%)
HLADR (%)
1. Punktion
2. Punktion
3. Punktion
( x ± sx )
( x ± sx )
( x ± sx )
73,2 ± 10,1
66,4 ± 6,3
67,0
(n = 43)
(n = 11)
(n = 1)
26,9 ± 8,8
34,1 ± 7,8
33,0
(n = 43)
(n = 11)
(n = 1)
1,5 ± 2,9
0,9 ± 0,8
0
(n = 38)
(n = 11)
(n = 1)
8,4 ± 7,0
6,5 ± 3,1
6,0
(n = 28)
(n = 6)
(n = 1)
Für die berechneten Mittelwerte des immunologischen Differentialzellbildes im Liquor
bei Zoster (Tabelle 5) wurde die Darstellung im Balkendiagramm gewählt.
30
Zoster
90
80
(43/11/1)
70
60
50
1. Punktion
2. Punktion
3. Punktion
(43/11/1)
40
30
20
10
(28/6/1)
(38/11/1)
0
CD4
Abbildung 14:
CD8
IgM
HLADR
Immunologische Differenzierung der Leukozyten im Liquor bei Zoster.
Gegenüberstellung der Ergebnisse im Krankheitsverlauf. Die vertikale Markierung in den
Balken kennzeichnet die Standardabweichung einer durch monoklonalen Antikörper
definierten Zellgruppe; (n) = Anzahl der zur Verfügung stehenden Präparate.
3.3.3 CD4/CD8-Ratio
Der aus CD4 und CD8 positiven T-Lymphozyten errechnete CD4/CD8-Quotient war
zum Zeitpunkt der ersten Punktion deutlich erhöht. Von der ersten zur zweiten Punktion
fiel der CD4/CD8-Quotient signifikant (Wilcoxon-Vorzeichen-Rangsummentest;
p ≤ 0,01) ab und zeigte im weiteren Verlauf zur dritten Punktion keine relevanten
Unterschiede.
Tabelle 6:
CD4/CD8-Ratio im Liquor der Punktionsintervalle bei Zoster.
N = Anzahl der Präparate.
Zoster
CD4 (%)
CD8 (%)
CD4/CD8-Ratio
1. Punktion
2. Punktion
3. Punktion
( x ± sx )
( x ± sx )
( x ± sx )
73,2 ± 10,1
66,4 ± 6,3
67,0
(n = 43)
(n = 11)
(n = 1)
26,9 ± 8,8
34,1 ± 7,8
33,0
(n = 43)
(n = 11)
(n = 1)
3,1 ± 1,3
2,1 ± 0,8
2,0
(n = 43)
(n = 11)
(n = 1)
Für die errechneten Mittelwerte der CD4/CD8-Ratio bei Zoster (Tabelle 6) wurde die
Darstellung im Balkendiagramm gewählt.
31
Zoster
5
4,5
(43)
4
3,5
(11)
3
2,5
(1)
2
1,5
1
0,5
0
1. Punktion
Abbildung 15:
2. Punktion
3. Punktion
CD4/CD8-Ratio im Liquor bei Zoster.
Gegenüberstellung der Ergebnisse im Krankheitsverlauf. Die vertikale Markierung in den
Balken kennzeichnet die Standardabweichung.
(n) = Anzahl der zur Verfügung stehenden Präparate.
3.4 Aseptische Meningitis
3.4.1 Zellzahl und Differentialzytologie
Bei der aseptischen Meningitis wurden in den Liquorproben der ersten Punktion erhöhte
Gesamtzellzahlen (Tabelle 7) gezählt. Die Leukozytenzahlen der zweiten Punktion
nahmen im Vergleich zur ersten Punktion deutlich ab und zeigten zum Zeitpunkt der
dritten Punktion eine nur diskret erhöhte Leukozytenzahl.
Die durch Erstpunktion gewonnenen Liquorproben zeigten in der morphologischen
Differentialzytologie eine überwiegend mononukleäre Pleozytose, welche sich
hauptsächlich aus Lymphozyten und zu einem geringeren Umfang aus Monozyten,
Granulozyten und Plasmozyten zusammensetzte,.
Das morphologische Differentialzellbild der zweiten Punktion zeigte eine mononukleäre
Pleozytose mit fast ausschließlicher Beteiligung von Lymphozyten und Monozyten,
sowie einem geringen Anteil an Plasmozyten. Granulozyten traten im Vergleich zur
ersten Punktion nicht mehr auf. Die dritte Punktion bestand aus einem rein lymphomonozytären Zellbild.
Tabelle 7:
Leukozytenzahl und morphologische Differenzierung der Liquorzellen bei aseptischer
Meningitis.
32
Mittelwert ± Standardabweichung im Krankheitsverlauf. n = Anzahl der Präparate.
Aseptische Meningitis
Leukozyten/µl
Lymphozyten (%)
Monozyten (%)
Granulozyten (%)
Plasmozyten (%)
1. Punktion
2. Punktion
3. Punktion
( x ± sx )
( x ± sx )
( x ± sx )
180,6 ± 286,7
41,8 ± 35,5
11,5 ± 4,5
(n = 19)
(n = 10)
(n = 2)
82,1 ± 22,9
86,4 ± 6,8
89,0
(n = 19)
(n = 10)
(n = 1)
8,9 ± 3,7
13,4 ± 6,8
11,0
(n = 19)
(n = 10)
(n = 1)
7,8 ± 21,7
0±0
0
(n = 19)
(n = 10)
(n = 1)
1,1 ± 2,8
0,2 ± 0,4
0
(n = 19)
(n = 10)
(n = 1)
Für die berechneten Mittelwerte des morphologischen Differentialzellbildes im Liquor
der aseptischer Meningitis (Tabelle 7) wurde die Darstellung im Balkendiagramm
gewählt.
33
Aseptische Meningitis
120
(19/10/1)
100
80
1. Punktion
2. Punktion
3. Punktion
60
40
(19/10/1)
(19/10/1)
20
(19/10/1)
0
Lymphozyten
Abbildung 16:
Monozyten
Granulozyten Plasmozyten
Differentialzytologie der Leukozyten im Liquor bei aseptischer Meningitis.
Gegenüberstellung der Ergebnisse im Krankheitsverlauf. Die vertikale Markierung in den
Balken kennzeichnet die Standardabweichung einer durch ihre Morphologie definierten
Zellgruppe. (n) = Anzahl der zur Verfügung stehenden Präparate.
3.4.2 Immunzytologie
Immunzytologisch bildeten die CD4 positiven T-Lymphozyten die größte Gruppe der
mononukleären Zellen (Tabelle 8). Die CD8 positiven T-Lymphozyten bildeten eine
deutlich kleinere Gruppe. Der daraus zu errechnende CD4/CD8-Quotient war zum
Zeitpunkt der Erstpunktion deutlich erhöht.
Die Entwicklung der T-Lymphozyten Subpopulation verlief gegenläufig. Der CD4Anteil nahm im Verlauf von der ersten zur dritten Punktion ab. Der CD8-Anteil
hingegen nahm im Verlauf von der ersten zur dritten Punktion zu.
Die Entwicklung im Verlauf der IgM positiven B-Zellen zeigte zwischen der ersten und
zweiten Punktion keinen relevanten Unterschied. In der dritten Punktion standen keine
Präparate für die Markierung mit IgM-Antikörper und HLADR-Antikörper zur
Verfügung.
Der Verlauf der HLADR positiven Zellen nahm von der ersten zur zweiten Punktion
deutlich ab.
34
Tabelle 8:
Immunologische Differenzierung der Liquorzellen bei aseptischer Meningitis.
Die Werte beschreiben den Mittelwert ± Standardabweichung der monoklonalen
Antikörper: CD4, CD8, IgM, HLADR im Krankheitsverlauf; n = Anzahl der Präparate.
Aseptische Meningitis
CD4 (%)
CD8 (%)
IgM (%)
HLADR (%)
1. Punktion
2. Punktion
3. Punktion
( x ± sx )
( x ± sx )
( x ± sx )
78,5 ± 7,9
74,8 ± 5,4
65,0 ± 5,7
(n = 12)
(n = 5)
(n = 2)
20,0 ± 9,4
26,8 ± 10,2
28,0 ± 1,4
(n = 12)
(n = 6)
(n = 2)
2,3 ± 2,4
2,0 ± 2,8
--------
(n = 5)
(n = 5)
(n = 0)
7,9 ± 7,1
4,5 ± 2,8
--------
(n = 10)
(n = 6)
(n = 0)
Für die berechneten Mittelwerte des immunologischen Differentialzellbildes im Liquor
der aseptischen Meningitis (Tabelle 8) wurde die Darstellung im Balkendiagramm
gewählt.
Aseptische Meningitis
100
90
(12/5/2)
80
70
60
1. Punktion
2. Punktion
3. Punktion
50
(12/6/2)
40
30
20
(10/6/0)
(5/5/0)
10
0
CD4
Abbildung 17:
CD8
IgM
HLADR
Immunologische Differenzierung der Leukozyten im Liquor bei aseptischer Meningitis.
Gegenüberstellung der Ergebnisse im Krankheitsverlauf. Die vertikale Markierung in den
Balken kennzeichnet die Standardabweichung einer durch monoklonalen Antikörper
definierten Zellgruppe. (n) = Anzahl der zur Verfügung stehenden Präparate.
35
3.4.3 CD4/CD8-Ratio
Der aus CD4 und CD8 positiven T-Lymphozyten errechnete CD4/CD8-Quotient war
zum Zeitpunkt der ersten Punktion deutlich erhöht (Tabelle 9).
Im weiteren Verlauf nahm der CD4/CD8-Quotient von der ersten zur zweiten Punktion
nicht signifikant ab (Wilcoxon-Vorzeichen-Rangsummentest; p > 0,05) und erreichte
bei der dritten Punktion den in der Literatur als normal beschriebenen Mittelwert.
Tabelle 9:
CD4/CD8-Ratio im Liquor der Punktionsintervalle bei aseptischer Meningitis.
Mittelwert ± Standardabweichung im Krankheitsverlauf. n = Anzahl der Präparate.
Aseptische Meningitis
CD4 (%)
CD8 (%)
CD4/CD8-Ratio
1. Punktion
2. Punktion
3. Punktion
( x ± sx )
( x ± sx )
( x ± sx )
78,5 ± 7,9
74,8 ± 5,4
65,0 ± 5,7
(n = 12)
(n = 5)
(n = 2)
20,0 ± 9,4
26,8 ± 10,2
28,0 ± 1,4
(n = 12)
(n = 6)
(n = 2)
4,9 ± 2,6
3,0 ± 1,4
2,4 ± 0,4
(n = 12)
(n = 5)
(n = 2)
Für die berechneten Mittelwerte der CD4/CD8-Ratio bei aseptischer Meningitis
(Tabelle 9) wurde die Darstellung im Balkendiagramm gewählt.
36
Aseptische Meningitis
8
(12)
7
6
5
(5)
4
(2)
3
2
1
0
1. Punktion
Abbildung 18:
2. Punktion
3. Punktion
CD4/CD8-Ratio im Liquor bei aseptischer Meningitis.
Gegenüberstellung der Ergebnisse im Krankheitsverlauf. Die vertikale Markierung in den
Balken kennzeichnet die Standardabweichung.
(n) = Anzahl der zur Verfügung stehenden Präparate.
3.5 Septische Meningitis
3.5.1 Zellzahl und Differentialzytologie
Bei der septischen Meningitis (Tabelle 10) lag die Zellzahl im Liquor der ersten
Punktion bei mehreren tausend Zellen pro Mikroliter. Im weiteren Krankheitsverlauf
nahm die Zahl der Leukozyten im Vergleich zwischen der ersten und zweiten Punktion
auf mehrere hundert Zellen pro Mikroliter ab. Bei der dritten Punktion fand sich nur
noch eine leichte Pleozytose.
Die in der ersten Punktion gewonnenen Liquorproben zeigten in der morphologischen
Differentialzytologie eine deutliche polynukleäre Pleozytose, die auch mit einer
geringen Erhöhung der mononukleären Zellen einherging. Unter den mononukleären
Zellen dominierten die Monozyten gegenüber den Lymphozyten und Plasmozyten.
Tabelle 10:
Leukozytenzahl und Morphologische Differenzierung der Liquorzellen bei septischer
37
Meningitis.
Mittelwert ± Standardabweichung im Krankheitsverlauf. n = Anzahl der Präparate.
Septische Meningitis
Leukozyten/µl
Lymphozyten (%)
Monozyten (%)
Granulozyten (%)
Plasmozyten (%)
1. Punktion
2. Punktion
3. Punktion
( x ± sx )
( x ± sx )
( x ± sx )
5833,5 ± 8095,3
286,8 ± 510,5
27,1 ± 14,6
(n = 17)
(n = 10)
(n = 3)
4,8 ± 11,4
54,8 ± 39,5
85,7 ± 11,1
(n = 17)
(n = 10)
(n = 3)
8,9 ± 13,6
14,2 ± 5,7
13,0 ± 11,1
(n = 17)
(n = 10)
(n = 3)
86,1 ± 23,8
29,4 ± 37,0
0,3 ± 0,6
(n = 17)
(n = 10)
(n = 3)
0,2 ± 0,8
1,2 ± 1,0
1,0 ± 0,0
(n = 17)
(n = 10)
(n = 3)
Im Verlauf der Erkrankung kam es in der Differentialzytologie im Liquor zu einem
deutlichen Anstieg des Lymphozytenanteils von der ersten bis zur dritten Punktion.
Ebenso kam es zu einem prozentualen Anstieg der Monozyten und Plasmozyten von der
ersten zur zweiten Punktion, der im Verlauf zur dritten Punktion stagnierte. Der
Granulozytenanteil nahm hingegen von der ersten bis zur dritten Punktion steil ab.
Für die berechneten Mittelwerte der morphologischen Differentialzytologie bei
septischer Meningitis (Tabelle 10) wurde die Darstellung im Balkendiagramm gewählt.
38
Septische Meningitis
120
100
(17/10/3)
(17/10/3)
80
1. Punktion
2. Punktion
3. Punktion
60
40
(17/10/3)
20
(17/10/3)
0
Lymphozyten
Abbildung 19:
Monozyten
Granulozyten Plasmozyten
Differentialzytologie der Leukozyten im Liquor bei septischer Meningitis.
Gegenüberstellung der Ergebnisse im Krankheitsverlauf. Die vertikale Markierung in den
Balken kennzeichnet die Standardabweichung einer durch ihre Morphologie definierten
Zellgruppe. (n) = Anzahl der zur Verfügung stehenden Präparate.
3.5.2 Immunzytologie
Bei der immunzytologischen Markierung (Tabelle 11) bildeten die CD4 positiven
Lymphozyten die größte Gruppe positiv markierter Zellen zum Zeitpunkt der ersten
Punktion. Einen vergleichbaren hohen Anteil zeigten die HLADR positiven Zellen.
Die CD8 positiven T-Lymphozyten bildeten eine deutlich kleinere Gruppe.
Der Mittelwert der CD4 positiven Zellen nahm von der ersten zur zweiten und dritten
Punktion deutlich zu. Der Anteil der CD8 positiven Zellen stieg ebenfalls zur zweiten
und dritten Punktion stetig an.
Kein markanter Unterschied zeigte sich in der Zunahme der HLADR positiven Zellen
von der ersten zur zweiten Punktion und deren Abnahme auf das Ausgangsniveau zur
dritten Punktion.
39
Tabelle 11:
Immunologische Differenzierung der Liquorzellen bei septischer Meningitis. Die Werte
beschreiben den Mittelwert und die Standardabweichung der monoklonalen Antikörper:
CD4, CD8, IgM und HLADR im Krankheitsverlauf. n = Anzahl der Präparate.
Septische Meningitis
CD4 (%)
1. Punktion
2. Punktion
3. Punktion
( x ± sx )
( x ± sx )
( x ± sx )
9,7 ± 12,4
43,9 ± 29,1
42,7 ± 37,4
(n = 11)
(n = 7)
(n = 3)
4,2 ± 6,7
18,3 ± 12,4
32,5 ± 3,5
(n = 11)
(n = 7)
(n = 2)
0,4 ± 0,9
3,7 ± 4,5
3,0
(n = 11)
(n = 4)
(n = 1)
7,7 ± 8,8
13,5 ± 1,9
9,3 ± 5,1
(n = 10)
(n = 4)
(n = 3)
CD8 (%)
IgM (%)
HLADR (%)
Für die berechneten Mittelwerte des immunologischen Differentialzellbildes bei
septischer Meningitis (Tabelle 11) wurde die Darstellung im Balkendiagramm gewählt.
Septische Meningitis
90
80
(11/7/3)
70
60
1. Punktion
2. Punktion
3. Punktion
50
(11/7/2)
40
30
(10/4/3)
20
(11/4/3)
10
0
CD4
Abbildung 20:
CD8
IgM
HLADR
Immunologische Differenzierung der Leukozyten im Liquor bei septischer Meningitis.
Gegenüberstellung der Ergebnisse im Krankheitsverlauf. Die vertikale Markierung in den
Balken kennzeichnet die Standardabweichung einer durch monoklonalen Antikörper
definierten Zellgruppe. (n) = Anzahl der zur Verfügung stehenden Präparate.
40
3.5.3 CD4/CD8-Ratio
Der errechnete CD4/CD8-Quotient (Tabelle 12) war zum Zeitpunkt der ersten Punktion
deutlich erhöht. Im weiteren Verlauf nahm der CD4/CD8-Quotient zur zweiten
Punktion nicht signifikant ab (Wilcoxon-Vorzeichen-Rangsummentest; p > 0,05) und
erreichte bei der dritten Punktion seinen niedrigsten Wert.
Tabelle 12:
CD4/CD8-Ratio im Liquor der Punktionsintervalle bei septischer Meningitis.
Mittelwert ± Standardabweichung im Krankheitsverlauf. n = Anzahl der Präparate.
Septische Meningitis
CD4 (%)
CD8 (%)
CD4/CD8-Ratio
1. Punktion
2. Punktion
3. Punktion
( x ± sx )
( x ± sx )
( x ± sx )
9,7 ± 12,4
43,9 ± 29,1
42,7 ± 37,4
(n = 11)
(n = 7)
(n = 3)
4,2 ± 6,7
18,3 ± 12,4
32,5 ± 3,5
(n = 11)
(n = 7)
(n = 2)
3,5 ± 5,1
2,5 ± 0,8
2,0 ± 0,1
(n = 11)
(n = 7)
(n = 2)
Für die berechneten Mittelwerte der CD4/CD8-Ratio bei septischer Meningitis
(Tabelle 12) wurde die Darstellung im Balkendiagramm gewählt.
41
Septische Meningitis
10
9
(11)
8
7
6
5
4
(7)
3
(2)
2
1
0
1. Punktion
Abbildung 21:
2. Punktion
3. Punktion
CD4/CD8-Ratio im Liquor bei septischer Meningitis.
Gegenüberstellung der Ergebnisse im Krankheitsverlauf. Die vertikale Markierung in den
Balken kennzeichnet die Standardabweichung.
(n) = Anzahl der zur Verfügung stehenden Präparate.
3.6 Neuroborreliose
3.6.1 Zellzahl und Differentialzytologie
Im Zeitraum der ersten Punktion wurden in den Liquorproben der Borreliosegruppe
(Tabelle 13) einige Hundert Zellen pro Mikroliter gezählt. Im weiteren
Krankheitsverlauf nahm der Mittelwert der Leukozyten bis zur dritten Punktion deutlich
ab.
Die Liquorproben der ersten Punktion zeigten in der morphologischen
Differentialzytologie (Tabelle 13) eine mononukleäre Pleozytose, die durch einen
großen Lymphozytenanteil und einen prozentual gleich großen Anteil an Monozyten
und Plasmozyten geprägt war. Der Anteil der Granulozyten lag um 1%. Im weiteren
Verlauf nahm der Anteil der Lymphozyten zu und erreichte zur dritten Punktion einen
Mittelwert von mehr als 90%. Die Entwicklung der Zellzahlen bei Monozyten und
Plasmozyten verlief abnehmend. Auffallend war der im Verlauf bis zur dritten Punktion
positive Nachweis der Plasmozyten, deren Anteil nur langsam abnahm.
42
Der Anteil der Granulozyten an der morphologischen Differentialzytologie war von der
ersten zur zweiten Punktion nicht mehr nachweisbar.
Tabelle 13:
Leukozytenzahl und morphologische Differenzierung der Liquorzellen bei
Neuroborreliose.
Mittelwert ± Standardabweichung im Krankheitsverlauf. n = Anzahl der Präparate..
Neuroborreliose
Leukozyten/µl
Lymphozyten (%)
Monozyten (%)
Granulozyten (%)
Plasmozyten (%)
1. Punktion
2. Punktion
3. Punktion
( x ± sx )
( x ± sx )
( x ± sx )
298,3 ± 204,7
55,9 ± 53,2
6,3 ± 6,7
(n = 9)
(n = 9)
(n = 4)
78,2 ± 13,5
87,8 ± 9,2
92,3 ± 2,9
(n = 9)
(n = 9)
(n = 4)
11,3 ± 13,4
8,6 ± 10,8
6,3 ± 3,4
(n = 9)
(n = 9)
(n = 4)
0,9 ± 0,8
0±0
0±0
(n = 9)
(n = 9)
(n = 4)
9,7 ± 5,7
4,2 ± 2,9
1,5 ± 1,3
(n = 9)
(n = 9)
(n = 4)
Für die berechneten Mittelwerte des morphologischen Differentialzellbildes bei
Borreliose (Tabelle 13) wurde die Darstellung im Balkendiagramm gewählt.
43
Neuroborreliose
120
100
(9/9/4)
80
1. Punktion
2. Punktion
3. Punktion
60
40
(9/9/4)
(9/9/4)
20
(9/9/4)
0
Lymphozyten
Abbildung 22:
Monozyten
Granulozyten Plasmozyten
Differentialzytologie der Leukozyten im Liquor bei Neuroborreliose.
Gegenüberstellung der Ergebnisse im Krankheitsverlauf. Die vertikale Markierung in den
Balken kennzeichnet die Standardabweichung einer durch ihre Morphologie definierten
Zellgruppe. (n) = Anzahl der zur Verfügung stehenden Präparate.
3.6.2 Immunzytologie
In der immunzytologischen Färbung bildeten die CD4 positiven Zellen bei der
Erstpunktion einen deutlich größeren Anteil an den T-Lymphozyten, als die CD8
positiven Zellen (Tabelle 14). Die IgM positiven Zellen stellten in der
immunzytologischen Färbung eine ebenfalls verhältnismäßig große Gruppe dar. Der
HLADR-Antikörper wurde wegen fehlender Präparate nicht genutzt.
Im weiteren Verlauf fiel bei den CD4 positiven Zellen der zweiten Punktion eine
Abnahme des Mittelwertes auf, der zur dritten Punktion wieder dem der ersten Punktion
entsprach. Die Entwicklung der CD8 positiven Zellen nahm hingegen von der ersten zur
zweiten Punktion zu und stieg bis zur dritten Punktion weiter an.
Der IgM-Antikörper zeigte im Verlauf von der ersten zur zweiten Punktion keine
deutliche Veränderung. Nur von der ersten zur dritten Punktion kam es zu einer
deutlichen Abnahme der IgM positiven Zellen.
44
Tabelle 14:
Immunologische Differenzierung der Liquorzellen bei Neuroborreliose. Die Werte
beschreiben den Mittelwert und die Standardabweichung der monoklonalen Antikörper:
CD4, CD8, IgM, HLADR im Krankheitsverlauf. n = Anzahl der Präparate.
Neuroborreliose
CD4 (%)
CD8 (%)
IgM (%)
1. Punktion
2. Punktion
3. Punktion
( x ± sx )
( x ± sx )
( x ± sx )
66,9 ± 8,3
58,8 ± 7,4
65,5 ± 9,3
(n = 8)
(n = 8)
(n = 4)
21,8 ± 11,5
31,4 ± 6,8
36,3 ± 11,0
(n = 8)
(n = 8)
(n = 4)
15,6 ± 7,1
10,4 ± 6,0
4,0 ± 3,9
(n = 8)
(n = 8)
(n = 4)
--------
--------
--------
(n = 0)
(n = 0)
(n = 0)
HLADR (%)
Für die berechneten Mittelwerte der immunologischen Differentialzytologie bei
Borreliose (Tabelle 14) wurde die Darstellung im Balkendiagramm gewählt.
Neuroborreliose
80
(8/8/4)
70
60
(8/8/4)
50
1. Punktion
2. Punktion
3. Punktion
40
30
(8/8/4
20
10
(0/0/0)
0
CD4
Abbildung 23:
CD8
IgM
HLADR
Immunologische Differenzierung der Leukozyten im Liquor bei Neuroborreliose.
Gegenüberstellung der Ergebnisse im Krankheitsverlauf. Die vertikale Markierung in den
Balken kennzeichnet die Standardabweichung einer durch monoklonalen Antikörper
definierten Zellgruppe. (n) = Anzahl der zur Verfügung stehenden Präparate.
45
3.6.3 CD4/CD8-Ratio
Der aus dem Anteil der CD4 und CD8 positiven Zellen zu errechnende CD4/CD8Quotient (Tabelle 15) war zum Zeitpunkt der ersten Punktion deutlich erhöht. Im
weiteren Krankheitsverlauf nahm er von der ersten zur zweiten Punktion signifikant
deutlich ab (Wilcoxon-Vorzeichen-Rangsummentest; p ≤ 0,05) und blieb zur dritten
Punktion unverändert.
Tabelle 15:
CD4/CD8-Ratio im Liquor der Punktionsintervalle bei Neuroborreliose.
Mittelwert ± Standardabweichung im Krankheitsverlauf. n = Anzahl der Präparate.
Neuroborreliose
CD4 (%)
CD8 (%)
CD4/CD8-Ratio
1. Punktion
2. Punktion
3. Punktion
( x ± sx )
( x ± sx )
( x ± sx )
66,9 ± 8,3
58,8 ± 7,4
65,5 ± 9,3
(n = 8)
(n = 8)
(n = 4)
21,8 ± 11,5
31,4 ± 6,8
36,3 ± 11,0
(n = 8)
(n = 8)
(n = 4)
3,2 ± 0,9
1,9 ± 0,4
1,9 ± 0,5
(n = 8)
(n = 8)
(n = 4)
Für die berechneten Mittelwerte des CD4/CD8-Quotienten bei Neuroborreliose
(Tabelle 15) wurde die Darstellung im Balkendiagramm gewählt.
46
Neuroborreliose
4,5
(8)
4
3,5
3
2,5
(8)
(4)
2
1,5
1
0,5
0
1. Punktion
Abbildung 24:
2. Punktion
3. Punktion
CD4/CD8-Ratio im Liquor bei Neuroborreliose.
Gegenüberstellung der Ergebnisse im Krankheitsverlauf. Die vertikale Markierung in
den Balken kennzeichnet die Standardabweichung.
(n) = Anzahl der zur Verfügung stehenden Präparate.
3.7 Akutes Guillain-Barré-Syndrom
3.7.1 Zellzahl und Differentialzytologie
In den Liquorproben der ersten Punktion der Guillain-Barré-Syndrom Gruppe, fanden
sich einige wenige Zellen pro Mikroliter (Tabelle 16). Die Leukozytenzahl nahm von
der ersten zur zweiten Punktion ab.
Die in der ersten Punktion gewonnenen Liquorproben zeigten in der morphologischen
Differentialzytologie eine leichte mononukleäre Pleozytose (Tabelle 16). Sie setzte sich
fast ausschließlich aus Lymphozyten und einem geringeren Anteil Monozyten
zusammen. Der Anteil der Plasmozyten und der polynukleären Granulozyten lag unter
1%.
Im weiteren Verlauf zur zweiten Punktion nahm der Mittelwert der Lymphozyten
deutlich ab, der Anteil der Monozyten veränderte sich nicht und der Anteil der
Granulozyten stieg zur zweiten Punktion an. Plasmozyten konnten in der zweiten
Punktion nicht nachgewiesen werden.
47
Tabelle 16:
Leukozytenzahl und morphologische Differenzierung der Liquorzellen bei Guillain-BarréSyndrom.
Mittelwert ± Standardabweichung im Krankheitsverlauf. n = Anzahl der Präparate.
Guillain-Barré-Syndrom
Leukozyten/µl
Lymphozyten (%)
Monozyten (%)
Granulozyten (%)
Plasmozyten (%)
1. Punktion
2. Punktion
( x ± sx )
( x ± sx )
5,4 ± 7,4
3,7 ± 3,2
(n = 19)
(n = 5)
88,7 ± 16,0
77,6 ± 24,4
(n = 19)
(n = 5)
11,2 ± 16,0
10,0 ± 3,7
(n = 19)
(n = 5)
0,1 ± 0,3
12,4 ± 27,7
(n = 19)
(n = 5)
0,1 ± 0,2
0±0
(n = 19)
(n = 5)
Für die berechneten Mittelwerte des morphologischen Differentialzellbildes bei
Guillain-Barré-Syndrom (Tabelle 16) wurde die Darstellung im Balkendiagramm
gewählt.
48
Guillain-Barré-Syndrom
120
(19/5)
100
80
1. Punktion
2. Punktion
60
(19/5)
40
(19/5)
20
(19/5)
0
Lymphozyten
Abbildung 25:
Monozyten
Granulozyten Plasmozyten
Differentialzytologie der Leukozyten im Liquor bei Guillain-Barré-Syndrom.
Gegenüberstellung der Ergebnisse im Krankheitsverlauf. Die vertikale Markierung in
den Balken kennzeichnet die Standardabweichung einer durch ihre Morphologie
definierten Zellgruppe. (n) = Anzahl der zur Verfügung stehenden Präparate.
3.7.2 Immunzytologie
In der immunzytologischen Markierung der ersten Punktion bildeten die CD4 positiven
Zellen, im Gegensatz zu den CD8 positiven Zellen, den deutlich größeren Anteil an den
T-Lymphozyten (Tabelle 17).
HLADR-positiv war nur ein geringer Anteil der Zellen zum Zeitpunkt der ersten
Punktion.
Im weiteren Verlauf der CD4 und CD8 positiven T-Lymphozyten ließen sich von der
ersten zur zweiten Punktion keine Unterschiede feststellen.
Die Zahl der HLADR positiven Zellen nahm zur zweiten Punktion deutlich zu.
49
Tabelle 17:
Immunologische Differenzierung der Liquorzellen bei Guillain-Barré-Syndrom. Die Werte
beschreiben den Mittelwert und die Standardabweichung der monoklonalen Antikörper:
CD4, CD8, IgM, HLADR. n = Anzahl der Präparate.
Guillain-Barré-Syndrom
CD4 (%)
CD8 (%)
IgM (%)
HLADR (%)
1. Punktion
2. Punktion
( x ± sx )
( x ± sx )
65,7 ± 9,2
63,3 ± 8,3
(n = 10)
(n = 3)
33,0 ± 6,3
31,3 ± 7,5
(n = 10)
(n = 3)
0,5 ± 0,7
0
(n = 2)
(n = 1)
2,0 ± 2,0
5,5 ± 2,1
(n = 6)
(n = 2)
Für die berechneten Mittelwerte des immunologischen Differentialzellbildes bei
Guillain-Barré-Syndrom (Tabelle 17) wurde die Darstellung im Balkendiagramm
gewählt.
Guillain-Barré-Syndrom
80
(10/3)
70
60
50
(10/3)
40
1. Punktion
2. Punktion
30
20
(6/2)
10
(2/1)
0
CD4
Abbildung 26:
CD8
IgM
HLADR
Immunologische Differenzierung der Leukozyten im Liquor bei Guillain-Barré-Syndrom.
Gegenüberstellung der Ergebnisse im Krankheitsverlauf. Die vertikale Markierung in
den Balken kennzeichnet die Standardabweichung einer durch monoklonalen
Antikörper definierten Zellgruppe.
(n) = Anzahl der zur Verfügung stehenden Präparate.
50
3.7.3 CD4/CD8-Ratio
Der aus dem Anteil der CD4 und CD8 positiven Zellen zu errechnende CD4/CD8Quotient blieb im Krankheitsverlauf unverändert (Tabelle 18). Die Durchführung des
Wilcoxon-Vorzeichen-Rangsummentest war nicht möglich, da bei der zweiten Punktion
nicht genügend Beobachtungen vorlagen.
CD4/CD8-Ratio im Liquor der Punktionsintervalle bei Guillain-Barré-Syndrom.
Mittelwert ± Standardabweichung im Krankheitsverlauf. n = Anzahl der Präparate.
Tabelle 18:
Guillain-Barré-Syndrom
CD4 (%)
CD8 (%)
CD4/CD8-Ratio
1. Punktion
2. Punktion
( x ± sx )
( x ± sx )
65,7 ± 9,2
63,3 ± 8,3
(n = 10)
(n = 3)
33,0 ± 6,3
31,3 ± 7,5
(n = 10)
(n = 3)
2,2 ± 1,1
2,1 ± 0,8
(n = 10)
(n = 3)
Für die berechneten Mittelwerte des CD4/CD8-Quotienten bei Guillain-Barré-Syndrom
(Tabelle 18) wurde die Darstellung im Balkendiagramm gewählt.
Guillain-Barré-Syndrom
3,5
(10)
(3)
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
1. Punktion
Abbildung 27:
2. Punktion
CD4/CD8-Ratio im Liquor bei Guillain-Barré-Syndrom.
Gegenüberstellung der Ergebnisse im Krankheitsverlauf. Die vertikale Markierung in
den Balken kennzeichnet die Standardabweichung.
(n) = Anzahl der zur Verfügung stehenden Präparate.
51
3.8 Vergleich der Krankheitsgruppen untereinander
3.8.1 Immunzytologie
Die immunzytologischen Untersuchungsergebnisse der diagnostischen Erstpunktionen
bei den Patientengruppen sind in der Tabelle 19 zusammengefaßt. Bei nahezu allen
Parametern bestehen signifikante Unterschiede zwischen den einzelnen Erkrankungen.
Tabelle 19:
Gegenüberstellung der Studiengruppen bei der diagnostischen Erstpunktion.
Mittelwert ± Standardabweichung (%) der immunologischen Liquorzelldifferenzierung.
Der p-Wert zeigt das Signifikanzniveau im Gruppenvergleich (Kruskal-Wallis-Test) an.
n. s.: nicht signifikant
1. Punktion (%)
CD4
CD8
CD4/CD8-Ratio
IgM
HLADR
( x ± sx)
( x ± sx)
( x ± sx)
( x ± sx)
( x ± sx)
61,1 ± 2,5
28,6 ± 3,3
2,2 ± 0,3
0,1 ± 0,4
0,5 ± 0,5
(n = 13)
(n = 13)
(n = 13)
(n = 7)
(n = 6)
73,2 ± 10,1
26,9 ± 8,8
3,1 ± 1,3
1,5 ± 2,9
8,4 ± 7,0
(n = 43)
(n = 43)
(n = 43)
(n = 38)
(n = 28)
Aseptische
78,5 ± 7,9
20,0 ± 9,4
4,9 ± 2,6
2,3 ± 2,4
7,9 ± 7,1
Meningitis
(n = 12)
(n = 12)
(n = 12)
(n = 5)
(n = 10)
Septische
9,7 ± 12,4
4,2 ± 6,7
3,5 ± 5,1
0,4 ± 0,9
7,7 ± 8,8
Meningitis
(n = 11)
(n = 11)
(n = 11)
(n = 11)
(n = 10)
Neuroborreliose
66,9 ± 8,3
21,8 ± 11,5
3,2 ± 0,9
15,6 ± 7,1
--------
(n = 8)
(n = 8)
(n = 8)
(n = 8)
(n = 0)
Guillain-Barré-
65,7 ± 9,2
33,0 ± 6,3
2,2 ± 1,1
0,5 ± 0,7
2,0 ± 2,0
Syndrom
(n = 10)
(n = 10)
(n = 10)
(n = 2)
(n = 6)
p < 0,0001
p < 0,0001
p < 0,001
p < 0,0001
n. s.
Kontrolle
Zoster
Von besonderer Bedeutung sind die Unterschiede bei der CD4/CD8-Ratio. Diese ist bei
der aseptischen Meningitis signifikant höher als bei allen anderen Patientengruppen. Zur
Kontrollgruppe liegt das Signifikanzniveau bei p ≤ 0,001 (Mann-Whitney U-Test für
zwei unabhängige Stichproben). Mit unterschiedlichem Signifikanzniveau wiesen die
Patientengruppen mit Neuroborreliose (p ≤ 0,005, Mann-Whitney U-Test für zwei
unabhängige Stichproben) und Zoster (p ≤ 0,05, Mann-Whitney U-Test für zwei
unabhängige Stichproben) ebenfalls signifikante Unterschiede zur Kontrollgruppe auf.
Der Anteil der B-Lymphozyten war bei der Neuroborreliose signifikant höher als bei
sämtlichen anderen Patientengruppen. Im Vergleich zur Kontrollgruppe liegt das
Signifikanzniveau bei p ≤ 0,001 (Mann-Whitney U-Test für zwei unabhängige
Stichproben). Im weiteren Vergleich ließ sich nur bei der aseptischen Meningitis
52
(p ≤ 0,05, Mann-Whitney U-Test für zwei unabhängige Stichproben) ein weiterer
signifikanter Unterschied zur Kontrollgruppe feststellen.
Bei den HLADR positiven Zellen wurden im Kruskal Wallis-Test keine signifikanten
Unterschiede beobachtet.
53
4 Diskussion
4.1 Wertigkeit der APAAP-Technik zur immunzytochemischen
Differenzierung von Liquorzellen
Die Basis der immunzytologischen Diagnostik von Liquorzellen ist die konventionelle
Zytologie und damit das Pappenheim-Präparat. Die Immunzytologie ist lediglich eine
ergänzende Untersuchung, die jedoch die Möglichkeiten und die Aussagekraft der
zytologischen Diagnostik erweitert.
Mit Hilfe monoklonale Antikörper ist es heute möglich, eine Vielzahl von Antigenen
sowohl an der Zelloberfläche, als auch im Zellkern oder Zytoplasma spezifisch zu
erkennen und damit die Zellart und deren Differenzierungsgrad genau zu
charakterisieren.
Die eingesetzten Antikörper müssen mit Substanzen markiert werden, die entweder
selbst farbig sind oder eine Anfärbung der Antigen-Antikörper-Bindungsstelle
vermitteln. Am häufigsten werden Fluorochrome, Enzyme und kolloidales Gold
angewandt.
Für die verschiedenen Anwendungsgebiete sind sowohl unterschiedliche
Antikörpermarkierungen, als auch Färbetechniken zum Standard geworden.
In der Histologie und der Histopathologie werden meist Enzyme in Form des
Peroxidase-Anti-Peroxidase Komplexes zum Markierungsnachweis genutzt.
Enzyme wie Peroxidase, alkalische Phosphatase, u.a. werden an Immunglobuline
gekoppelt und katalysieren nach Zugabe eines geeigneten Substrats am Ort der AntigenAntikörperbindung eine Farbreaktion. Die Anfärbung ist praktisch unbegrenzt haltbar,
kann durch Verwendung unterschiedlicher Substrate variiert werden und ist
lichtmikroskopisch sichtbar. Im Gegensatz zur Immunfluoreszenz können die Präparate
gegengefärbt werden, so daß das ganze Präparat in seiner Morphologie beurteilt werden
kann. Bei der Immunfluoreszenz sind nur die in der immunologischen Färbung
dargestellten Anteile sichtbar.
Der wichtigste Vorteil der enzymatischen Methoden gegenüber der Goldmethode und
der Immunfluoreszenz liegt jedoch in ihrer großen Empfindlichkeit - sie sind um mehr
als das 1000fache sensitiver.
Im Unterschied zur Fluoreszenz, für die keine befriedigende Lösung zur Reduzierung
der Autofluoreszenz gefunden wurde und bei der der Background damit sehr hoch ist,
ist die Hintergrundfärbung bei den enzymatischen Methoden minimal. Die endogene
54
Enzymaktivität wird entweder chemisch blockiert oder es werden Enzyme angewandt,
die in dem untersuchten Material nicht vorkommen.
In der immunzytochemischen Differenzierung von Liquorzellen hat sich ebenfalls die
Markierung mit Enzymen für die Untersuchung von Objektträgerpräparaten bewährt.
Dabei ist anzumerken, daß beide Techniken (APAAP/PAP) in Ihren Ergebnissen eine
gute Übereinstimmung aufweisen (Stark und Wurster 1987, Stark 1988).
Als Bestandteil der unspezifischen Körperabwehr sind hohe Peroxidasekonzentrationen
in den Granulozyten, Monozyten und den Eosinophilen vorhanden, die in einer
immunzytochemischen Färbung nicht von der exogenen Peroxidase des markierten
Antiserums getrennt werden kann. Die Blockierung der endogenen Peroxidase bei
Leukozyten, besonders durch Wasserstoffperoxid in Methanol, führt häufig zur
Denaturierung der empfindlichen Leukozytenantigene (Streefkerk 1972).
Für die immunzytochemische Differenzierung von Liquorzellen im Verlauf
entzündlicher Erkrankungen des Nervensystems besteht jedoch für die
Immunglobulinmarkierung mit (intestinaler) alkalischer Phosphatase ein eindeutiger
Vorteil gegenüber der PAP-Technik (Cordel et al. 1984).
Alkalische Phosphatasen sind Enzyme, die im alkalischen pH-Bereich die Hydrolyse
von Phosphatestern in Anwesenheit von Magnesiumionen katalysieren. Für
immunzytochemische Zwecke wird praktisch ausschließlich die intestinale alkalische
Phosphatase vom Kalb angewandt, die Koppelung an Immunglobuline erfolgt meist
nach der Methode von Avrameas (1969). Die Farbreaktion entsteht durch Kopplung des
hydrolysierten Phosphatasesubstrates an ein Diazoniumsalz.
Von den zahlreichen Diazoverbindungen findet in der Zytologie das Fast Red TR Salz
am meisten Verwendung. Die entstehende rote Farbe bildet, anders als die Farbprodukte
der PAP-Technik, einen guten Kontrast zum blauen Zellkern der HämalaunGegenfärbung. Dadurch ist eine auch bei geringer positiver Zellzahl optisch einfachere
Identifizierung möglich. Neufuchsin, weit verbreitet in der Histologie, liefert ebenfalls
ein rotes Reaktionsprodukt. Im Gegensatz zu Fast Red TR weist die durch Neufuchsin
entstehende Farbe eine deutlich stärkere Farbintensität auf und ist nicht in Alkohol oder
anderen organischen Lösungsmitteln löslich. Dies ist für die Qualität der Gegenfärbung
und Eindeckung von Interesse.
55
Im Rahmen der Erforschung der biochemischen Effekte des Tetramisol - einer
antihelminthisch wirkenden Substanz - wurde festgestellt, daß dieser Wirkstoff ein
potenter Inhibitor der alkalischen Phosphatase ist, ohne Veränderung an den antigenen
Strukturen hervorzurufen (Ponder und Wilkinson 1981, Gown und DeLellis 1988). Aus
der Sicht der Immunzytologie ist es besonders wichtig, daß die Inhibierung nur die
alkalische Phosphatasen eines anderen als intestinalen oder plazentaren Ursprungs
betrifft, während die zur Markierung verwendete intestinale AP in ihrer Aktivität nicht
beeinträchtigt wird. Diese Eigenschaft ist nicht nur auf das Tetramisol (Belle 1972)
beschränkt, sie wird auch bei dessen Abkömmlingen wie dem Levamisol
(Borgers 1973; Ponder 1981) und dem 1p-Bromtetramisol (Borgers et al. 1975)
beobachtet. Dank dieser Inhibitoren ist die AP insbesondere bei Präparaten, die keine
intestinale alkalische Phosphatase enthalten, interessant.
Die APAAP-(alkalische Phosphatase-Anti-alkalische Phosphatase) Technik wurde 1978
von Mason und Sammons entwickelt und stellt eine Modifizierung der von
(Sternberger et al. 1970) entwickelten PAP-(Peroxidase-Anti-Peroxidase) Technik dar.
Dieses Färbesystem nutzt durch den Einsatz stabiler Immunkomplexe (lösliche Enzymanti-Enzymimmunkomplexe aus Antigen (= Enzym) und den dagegen gerichteten
Antikörper) die natürliche Affinität von Antikörpern gegenüber ihrem Antigen.
Das Immunkomplexverfahren stellt eine Modifikation der Immunglobulin-EnzymBrücke-Technik dar, bei welcher der Enzymantikörper und das Enzym getrennt
nacheinander appliziert werden. Bei der von Mason und Sammons (1978) entwickelten
Färbetechnik, wird im dritten Schritt ein vorgebildeter Komplex aus dem Enzym und
Antikörper zugegeben und damit ein Arbeitsschritt gespart. Gegenüber der indirekten
Methode ist die Empfindlichkeit dieses Verfahrens ca. um den Faktor 50 größer. Sie ist
vor allem auf die große Zahl von Enzymmolekülen, die pro Gewebeantigen zur
Verfügung stehen, zurückzuführen und kann durch die Wiederholung des zweiten und
dritten Inkubationsschrittes verstärkt werden.
Die notwendige Konzentration des primären Antikörpers muß bei dieser Methode für
jedes Antigen extrem genau bestimmt werden.
Die Qualität einer immunenzymatischen Färbetechnik ist von vielen Faktoren abhängig.
Dabei muß berücksichtigt werden, daß die Ergebnisse immunzytochemischer Studien
nur bedingt vergleichbar sind, da sie letztlich eine subjektive Aussage des sie
erstellenden Labors bedeuten. Dies ist bedingt durch das von der jeweiligen
Arbeitsgruppe für sich standardisierte immunologische Färbeverfahren hinsichtlich der
folgenden Parameter:
56
- gleiche Fixierungsmodalitäten (Azeton, Ethanol,...)
- gleiche Zellpräparation (Zytozentrifugation, Sedimentationskammer,..)
- gleiche immunzytochemische Methode (APAAP, PAP, Immunfluoreszenz,...)
- vergleichbare Primärantikörper (mono-, polyklonal)
- hochspezifische Primärantikörper (Herkunft und Art, Cluster of differentiation
(Bernard et al. 1984, Reinherz et al. 1986, McMichael 1987)...)
- Kontrolle der interindividuellen Variabilität bei demselben Material und
derselben Methode
Diese Parameter sind von den zitierten Arbeitsgruppen zum Teil sehr deutlich
modifiziert worden.
Die Untersuchungen unserer Studie wurden in allen Fällen an fixierten
Zytozentrifugenpräparaten durchgeführt, die bei -70°C längere Zeit (1-3 Jahre)
aufbewahrt wurden. Dabei kann sowohl die Fixation, als auch die lange Lagerung, die
Antigenität von Molekülen verändern und zu einem Verlust an Reaktivität führen. Die
ebenfalls für diese Studie gesammelten Proben aus dem Zeitraum Januar bis Juni 1995
haben durch die Besonderheit bei der Lagerung einen deutlichen Reaktivitätsverlust
erlitten, so daß sie nicht mehr verwendet werden konnten. Die Proben waren durch
unsachgemäße „Bewegungen in der Tiefkühltruhe“ starken Temperaturschwankungen
ausgesetzt. Diese führten zu einer Veränderung der antigenen Struktur, was zu einem
vollständigen Reaktivitätsverlust führte.
Die für die Studie verwandten Präparate wiesen eine einheitliche Qualität der
Reaktivität auf. Während der Markierung gingen keine Präparate verloren.
4.2 Lymphozytensubtypisierung im Liquor bei:
4.2.1 Nichtentzündlichen neurologischen Erkrankungen
Bedingt durch die geringe Zellzahl im normalen Liquor, aber auch durch die
Schwierigkeit, gesunde Probanden zur Lumbalpunktion zu gewinnen, gibt es nur
wenige Studien, die über die immunzytochemische Differentialzytologie des normalen
Liquors berichten.
Bei Studien über neuroimmunologische Erkrankungen wie der multiplen Sklerose,
bestehen die Kontrollgruppen bezeichnenderweise aus Patienten mit anderen
entzündlichen
oder
nicht
entzündlichen
neurologischen
Erkrankungen
(Matsui et al. 1988; Salonen et al. 1989; Scolozzi et al. 1992) oder auch aus Patienten
57
mit Spannungskopfschmerz (Correale et al. 1991; Mix et al. 1990). Gesunde Probanden
wurden
hingegen
sehr
selten
mit
untersucht
(Hedlund et al. 1989;
Svenningsson et al. 1993).
Trotz dieser Ungenauigkeiten gibt es einige gemeinsame Charakteristika der
Liquorlymphozyten, die man schon früh festgestellt hat und die von nachfolgenden
Studien bestätigt worden sind:
- Die T-Lymphozyten im Liquor überwiegen im Verhältnis zu den B-Lymphozyten
(Manconi et al. 1976; Moser et al. 1976; Gangji et al. 1976).
- Die CD4/CD8-Ratio im normalen Liquor ist gegenüber dem Normalwert im Blut
(Brinkmann et al. 1983) erhöht.
In den Liquorproben der Patienten mit nicht entzündlichen neurologischen
Erkrankungen wird der Prozentsatz der Pan T-Zellen mit 78-98% angegeben, die
CD4/CD8-Ratio wird mit 2,0 bis 2,7 beschrieben (Margolick et al. 1988;
Scolozzi et al. 1992; Frequin et al. 1993; Svenningsson et al. 1993; Rolfs et al. 1994).
Bisher ist nur eine neuere Studie bekannt (Svenningsson et al. 1995), in welcher die
immunzytologischen Normalwerte für den Liquor im Vergleich mit der Situation im
Blut erarbeitet wurde. Bei der Differenzierung der Lymphozyten im Liquor gesunder
Probanden mittels Immunfluoreszenz und Flowzytometrie (FACS), fanden sie:
- Ein Überwiegen der T-Lymphozyten gegenüber den B-Zellen und NK-Zellen im
Liquor, sowie eine erhöhte CD4/CD8-Ratio.
- Keine generelle Steigerung der Marker (HLADR und CD25), die für eine kürzlich
stattgefundene Aktivierung hinweisend wären, außer einer ansteigenden
Exprimierung von HLADR bei der kleinen CD3+CD16-/56+ Untergruppe
(natürliche Killerzellen).
Die Ergebnisse der Kontrollgruppe unserer Studie stimmen mit den bisher
veröffentlichten Daten überein.
Die CD4/CD8-Ratio der Kontrollgruppe liegt im Mittel bei 2,15. Eine Abweichung in
der Verteilung der CD4 und CD8 positiven Zellen zu anderen Studien ergibt sich aus
der zugrunde liegenden Gesamtzellzahl (Leukozyten oder Lymphozyten) und deren
Angabe als Absolut- oder Prozentzahl.
58
4.2.2 Zoster Meningoradikulitis
Immunzytologische Arbeiten über die Zoster Meningoradikulitis befassen sich zum
überwiegenden Teil mit der Untersuchung von Blutproben (Kazugo et al. 1992). Die
bislang mitgeteilten Daten über immunologische Liquorzellbefunde bei Zoster
Meningoradikulitiden sind hingegen nicht sehr umfassend.
Merelli et al. (1991) untersuchten Liquor- und Blutproben bei einer Gruppe von
15 Patienten mit akuter aseptischer/viraler Meningitis. Bei fünf der 15 Patienten konnte
eine Infektion mit dem Zoster Virus nachgewiesen werden. Im Liquor fanden sie bei der
Untersuchung der Lymphozytensubpopulationen einen Anteil von 62% CD4 und
19% CD8 positiver Lymphozyten. Der Anteil der HLADR positiven T-Lymphozyten
(CD3+) belief sich auf 8%, der Mittelwert der HLADR+CD3- Lymphozyten (B-Zellen)
auf 3%. Eine CD4/CD8-Ratio wurde nicht angegeben.
Weber et al. (1988) fanden bei der Untersuchung von B-Lymphozyten im Liquor mit
polyklonalen Antikörpern einen Anteil von 0,4% IgM positiver Zellen bei Patienten mit
Zoster ganglionitis (n = 6).
Bisher ist in der Literatur nur eine vergleichende Studie über den phasentypischen
Verlauf der Leukozytensubpopulationen im Liquor bekannt:
Stark (1988) definierte bei Fällen mit Zoster Meningoradikulitis jeweils eine frühe
(< 14 d) und eine späte Phase (> 14 d) der Erkrankung. Im Krankheitsverlauf verglich er
die CD4/CD8-Ratio und den Anteil der B-Zellen. Dabei zeigte sich, statistisch nicht
signifikant, daß initial das CD4/CD8-Verhältnis höher war als zur Spätphase und die
B-Zellreaktion in der Spätphase höher lag als zu Beginn.
Sindern et al. (1994) stellten in ihrer Arbeit eine signifikante Abnahme der CD4/CD8Ratio und der HLADR positiven Zellen bei 24 Patienten mit Zoster fest.
Bei den Patienten unserer Studie, die an Zoster Meningoradikulitis erkrankt waren, ist
die CD4/CD8-Ratio in der Akutphase im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant
erhöht. Verglichen mit den Werten der oben genannten Autoren, stimmt der erhöhte
Anteil der CD4 gegenüber den CD8 positiven Zellen mit dem Ergebnis der Akutphase
in unserer Arbeit überein. Die in der Genesungsphase einsetzende gegenläufige
Entwicklung der CD4 und CD8 positiven Zellen führt hier, ähnlich wie bei Stark (1988)
beschrieben, zu einem signifikanten Absinken der CD4/CD8-Ratio. In dieser
Entwicklung spiegelt sich die klinische Aktivität der Erkrankung wider.
Der in unserer Studie bei der Erstpunktion gefundene geringe B-Zellanteil bei Zoster
entspricht den Ergebnissen der oben zitierten Autoren, jedoch weicht er in seiner
Entwicklung von dem von Stark (1988) beschriebenen Ergebnis ab und sinkt bereits zur
zweiten Punktion leicht ab.
59
In der Frühphase zur Kontrollgruppe unserer Studie wurde der deutlich hohe Anteil der
HLADR positiven Zellen von Merelli et al. (1991) ebenfalls als erhöht beschrieben.
Eine weitere Untersuchung der Entwicklung HLADR positiver Zellen bei Zoster in der
Spätphase durch andere Studiengruppen ist nicht bekannt. In unserer Studie nahm der
Anteil der HLADR positiven Zellen zur Spätphase leicht ab, jedoch blieb er auch in der
Spätphase zur Kontrollgruppe deutlich erhöht.
4.2.3 Aseptische Meningitis
Die aseptischen Meningitis war häufig Gegenstand von Untersuchungen über die
Phänotypisierung von Liquorzellen mit monoklonalen Antikörpern. Die umfangreichen
Ergebnisse sind jedoch teilweise widersprüchlich.
In einigen klinisch nicht näher definierten Fällen von akuter aseptischer
Meningoenzephalitis (Kuroda et al. 1987) wurden die folgenden Liquorzellsubgruppen
gefunden: OKT3-positiv: 53-83%, OKT4-positiv: 33-65%, OKT8-positiv: 13-45%.
Lucht et al. (1992) untersuchten Blut und Liquorproben von Patienten (n = 11) mit
Echovirus Meningitis. Im Liquor fanden sie Mittelwerte für Pan T (93%), CD4 (68,7%),
CD8 (17,7%) und B-Zellen (3,8%). Die Zellmarker für T-Zellaktivierung konnten im
Liquor nur in geringen Mengen nachgewiesen werden: IL2 (CD25) (3,0 ± 1,9) und
HLADR (4,8% ± 2,6).
Merelli et al. (1991) untersuchten Liquor- und Blutproben bei einer Gruppe von
15 Patienten mit unterschiedlichen aseptischen/viralen ZNS-Erkrankungen. Im Liquor
fanden sie bei der Untersuchung der Lymphozytensubpopulationen einen Anteil von
62% CD4 und 19% CD8 positiven Lymphozyten. Der Anteil der HLADR positiven
T-Lymphozyten (CD3+) betrug 8%, der Anteil der HLADR+CD3--Lymphozyten
(B-Zellen) betrug 3%.
Schädlich et al. (1983) untersuchten bei einer Gruppe mit aseptischer Meningitis den
Gehalt an CD8 positiven Zellen im Liquor der Akutphase (1 - 10 d) und fanden einen
Anteil von < 19%.
Bamborschke et al. (1987) fanden bei 10 Fällen mit akuter aseptischer Meningitis:
OKT3 59%, OKT4 34%, OKT8 25%, Leu12 (PanB) 41%. Der deutlich verminderte
Anteil an OKT4 positiven T-Lymphozyten führte zu einer reduzierten
OKT4/OKT8-Ratio von 1,46 ± 0,47. Die Werte werden von dieser Arbeitsgruppe als
Prozent von Lymphozyten angegeben.
Ernerudh et al. (1989) fanden bei ihrer Patientengruppe mit aseptischer Meningitis
(n = 14) im Mittel einen T-Zellanteil von 86%. Die Verteilung der T-Zellsubpopulation
lag für den CD4-Marker bei 61% und für CD8 bei 19%. Der in der Akutphase erhöhte
60
T-Lymphozytenanteil war eine Folge des erhöhten CD4-Anteils. Im zeitlichen Verlauf
stieg die CD8-Population an wodurch die CD4/CD8-Ratio abnahm. Ein Mittelwert für
die CD4/CD8-Ratio wurde nicht mitgeteilt. Der Anteil an HLADR positiven Zellen lag
bei 20%. Der B-Zellanteil (OK B2) betrugt im Mittelwert 8%.
Nobutada et al. (1994) untersuchten den Verlauf der aseptischer Meningitis (n = 35) mit
monokonalen Antikörpern. Die CD4 positiven Zellen waren in der Akutphase (52,31%)
gegenüber der Spätphase (41,02%) signifikant erhöht. Andererseits war der Anteil der
CD8 positiven Zellen in der Akutphase (24,85%) gegenüber der Spätphase (34,63%)
signifikant niedrig. Die in der Akutphase (2,37) gegenüber der Spätphase (1,25)
signifikant erhöhte CD4/CD8-Ratio lag in der unterschiedlichen Verteilung der CD4
und CD8 positiven T-Lymphozyten begründet. In der Spätphase (33,99%) nahmen die
aktivierten T-Zellen (HLADR+/CD3+) zur Akutphase (27,2%) signifikant zu.
Stark (1988) definierte bei Fällen mit aseptischer Meningitis jeweils eine frühe (< 14 d)
und eine späte Phase (> 14 d) der Erkrankung. Im Krankheitsverlauf verglich er die
CD4/CD8-Ratio und den Anteil der B-Zellen. Dabei zeigte es sich, daß initial das
CD4/CD8-Verhältnis (MW 3,54) statistisch signifikant höher war als zur Spätphase
(MW 2,79), die B-Zellreaktion in der Spätphase (3,53) lag höher als zu Beginn (2,16).
Ross et al. (1991) fanden bei fünf Fällen mit aseptischer Meningitis einen
T-Lymphozyten
Anteil
im
Liquor
von
100%.
Eine
Aufteilung
der
T-Lymphozytensubpopulationen gelang bei vier der fünf Patienten. In Fällen mit viraler
Meningitis und infektiöser Mononucleose lag die CD4/CD8-Ratio bei 3:1. Ein Patienten
mit aktiver HIV-Infektion wies eine Ratio von 1:>10 auf. Hier war der CD4 positive
T-Zelltyp nahezu vollständig abwesend.
In unserer Studie ist die CD4/CD8-Ratio in der Akutphase der Patientengruppe mit
aseptischer Meningitis, im Vergleich zur Kontrollgruppe, signifikant erhöht.
Übereinstimmend mit den Arbeiten von Bamborschke und Heiss (1987),
Nobutada et al. (1994), Lucht et al. (1992), Merelli et al. (1991), Ernerudh et al. (1989),
Kuroda und Shibasaki (1987), Stark (1988) und Ross et al. (1991) überwiegt der Anteil
der CD4 gegenüber den CD8 positiven Zellen. Besonders hervorzuheben ist jedoch der
zur Kontrollgruppe deutlich verminderte Anteil an CD8 positiven Zellen; eine
Beobachtung, die bisher nicht beschrieben wurde.
Im weiteren Krankheitsverlauf resultiert aus der gegenläufigen Entwicklung der CD4
und CD8 positiven Zellen eine zur Kontrollgruppe leicht verminderte, jedoch weiterhin
deutlich erhöhte CD4/CD8-Ratio. Innerhalb der Krankheitsgruppe nimmt der Verlauf
der CD4/CD8-Ratio nicht signifikant ab und erreicht zur dritten Punktion den Wert der
Kontrollgruppe.
61
Weber et al. (1988) fanden bei der Untersuchung von B-Lymphozyten im Liquor mit
polyklonalen Antikörpern einen Anteil von 3,6% IgM positiver Zellen bei Patienten mit
lymphozytärer Meningoradikulitis (n = 6).
Die alternative Aussage über die Verteilung der B-Zellen divergiert innerhalb der
Literatur je nach Autor mit Anteilen von 2,16% (Stark 1988) bis 41% (Bamborschke et
al. 1987) weit auseinander. Der überwiegende Teil der Autoren beschreibt den Anteil
der B-Zellen im Liquor aseptischer Meningitiden mit einem Mittelwert von 5%. In
unserer Arbeit liegt der Anteil der IgM positiven Zellen im Liquor bei aseptischer
Meningitis bei einem Mittelwert von 2%, was den vorhergehenden Studien entspricht.
Die Maximalangabe in der Arbeit von Bamborschke et al. (1987) kann in der
zugrundeliegenden Beschreibung der B-Zellen als Anteil an den gesamten
Lymphozyten - nicht Leukozyten! - begründet sein, was den Vergleich zwischen den
einzelnen Studien erschwert.
Schädlich et al. (1985) konnten zeigen, daß der Nachweis von aktivierten
B-Lymphozyten (monoklonaler IgG-Marker), ohne den Nachweis von lokal
synthetisiertem Immunglobulin G (IgG) ein zuverlässiger differentialdiagnostischer
Parameter zur Unterscheidung zwischen entzündlicher und nicht entzündlicher
Pleozytose ist.
62
Rieckmann et al. (1990) differenzierten diese Aussage sogar dahingehend, daß der
Nachweis von intrazellulärem Immunglobulin (IgG, IgA und IgM) (Plasmazellen) ein
Indikator für einen entzündlichen Prozeß im ZNS ist. Bei B-Zell-Neoplasien kommt in
erster Linie nur eine der Immunglobulinklassen vor.
Im Gegensatz zu unserem Ergebnis wird in der Literatur aber auch über aseptische
Meningitiden mit inverser CD4/CD8-Ratio berichtet. Besonders durch die Infektion mit
Mumps-Viren (Kreth et al. 1982, Nagai et al. 1983, Fleischer und Kreth 1983,
Taniguchi et al. 1983, Bertotto et al. 1984), aber auch durch HIV-Infektionen
(Ross et al. 1991, McArthur et al. 1989, Margolick et al. 1988) wird ein Anstieg der
CD8 positiven Zellpopulation im Liquor hervorgerufen.
Fleischer et al. (1983) berichten über einen Fall von kindlicher Mumpsmeningitis. Bei
der Liquorpunktion in der Akutphase (5. d) reagierten 90% der Zellen positiv mit dem
CD3 Antikörper, 48% mit dem CD4 und 62% mit dem CD8-Marker. Die CD4/CD8Ratio war 0,77.
Taniguchi et al. (1983) untersuchten Liquorproben von 6 Kindern mit Mumpsmeningitis
und fanden einen Anteil von 35% CD4 und 48% CD8 positiver Zellen. Der genaue
Punktionszeitpunkt wurde jedoch nicht mitgeteilt.
Bertotto et al. (1984) wiesen bei 6 Kindern mit aseptischer Meningitis 82% CD3
positiver Zellen im Liquor nach. Die T-Zellsubpopulation betrug im Mittel 26% CD4
und 59% CD8 positiver Zellen. Daraus ergab sich eine CD4/CD8-Ratio von 0,46.
Unter chronischen Erkrankungen wie bei AIDS (aquired immuno deficiency syndrom)
und der subakuten sklerosierenden Panenzephalitis (Czlonkowska et al. 1986) dominiert
ebenfalls der CD8 positive Phänotyp im Liquor.
Eine Erklärung für diese offensichtliche Diskrepanz könnte sein, daß die Population von
T-Lymphozyten, die in das ZNS infiltrieren, von den biologischen Charakteristika des
infizierenden Virus abhängig sind. Das AIDS-Virus zeigt eine besondere Affinität zur
CD4-Struktur der Zelle als Rezeptormolekül; darüber hinaus ist auch die Wahl des
geeigneten Zeitpunktes zur Probengewinnung für die Verteilung der Zellpopulationen
von Bedeutung (Bannwarth 1933, Oehmichen 1976).
Longitudinalstudien, die die Entwicklung der inversen Ratio untersuchen, sind bisher
nicht veröffentlicht worden. Diese könnten hinsichtlich möglicher prognostischer
Aussagen von Bedeutung sein, wie sie sich im Verlauf der CD4/CD8-Ratio bei den
Krankheitsgruppen unserer Studie abzeichnen.
63
In der vorliegenden Arbeit konnten, in Folge der beschränkten Anzahl an Liquorzellen,
keine funktionellen Analysen der im Liquor angesammelten CD4 und CD8 positiven
T-Lymphozyten durchgeführt werden.
In früheren Arbeiten mit funktioneller Fragestellung wurde berichtet, daß meningeale
T-Lymphozyten, die bei Mäusen mit Impfmeningitis gefunden wurden, zytotoxische
Aktivitäten gegen virusinfizierte Zellen aufweisen und die Plaqueformation des
Impfvirus hemmen (Morishima und Hayashi 1978). Außerdem waren T-Zellklone, die
direkt aus dem Liquor eines Patienten mit Mumpsmeningitis gewonnen werden
konnten, hoch zytotoxisch und zeigten eine spezifische Killeraktivität gegen die autolog
mit Mumps-Viren infizierten Zielzellen (Fleischer und Kreth 1983). Diese Ergebnisse
lassen vermuten, daß die CD8 positiven Zellen, die bei viraler Meningitis aus dem Blut
in den Liquor rekrutiert werden, HLA- beschränkte Virus-spezifische T-Lymphozyten
sind. Neuere qualitative Analysen durch zweifarbige Flowzytometrie ergaben, daß die
CD11b-Untergruppe der CD8 positiven Zellen (zytotox. T-Zellen) in der akuten Phase
der aseptischen Meningitis erhöht war, obwohl der Anteil der gesamten CD8 positiven
Zellen im Liquor geringer war (Uchihara et al. 1990). Wenn Suppressor
T-Lymphozyten sich hauptsächlich im Liquor ansammeln, könnten diese Zellen eine
wichtige Rolle in der Immunregulation im ZNS-Kompartiment spielen. Funktionelle
Studien über die Bedeutung der T-Lymphozyten im Liquor und deren prognostische
Aussage sollten daher fortgeführt werden.
4.2.4 Septische Meningitis
Die Phänotypisierung der Lymphozyten durch monoklonale Studien bei septischen
Meningitiden ist bis heute selten. Dies mag in der massiven polymorphkernigen, fast
ausschließlich aus neutrophilen Granulozyten bestehenden Pleozytose begründet sein,
die eine relativ einfache Differentialdiagnose gegenüber mononukleären Zellbildern im
Liquor zuläßt. Andererseits kann die immunologische Differentialzytologie bei Fällen
apurulenter bakterieller Meningitis (Felgenhauer und Kober 1985), anbehandelten
septischen Meningitiden, Meningitiden mit fulminant beginnendem Verlauf, ohne
polynukleäre Pleozytose, oder bei chronischen septischen Meningitiden eine mögliche
differentialdiagnostische Bedeutung für die Akuität der Erkrankung haben. Die
Notwendigkeit einer weiterführenden immunologischen Lymphozytendifferenzierung,
z. B. zur Unterscheidung zwischen einer atypischen lymphoiden Pleozytose und eines
malignen Lymphoms (Ross et al. 1991), ist bei den septischen Meningitiden eher
seltener zu erwarten.
64
Bamborschke et al. (1987) fanden bei 8 Fällen mit akuter septischer Meningitis
(% Lymphozyten): 24% Leu12- (PanB), 77% OKT3-, 48% OKT4- und 29% OKT8Antikörper positive Zellen. Der geringe Anteil an OKT4 positiven T-Lymphozyten
führt zu einer OKT4/OKT8-Ratio von 1,72 ± 0,66. Die Werte werden von dieser
Arbeitsgruppe als Prozent von Lymphozyten angegeben.
In einer Folgearbeit über den klinischen Verlauf bei septischen und aseptischen
Meningitiden fanden Bamborschke et al. (1990) bei Patienten mit bakterieller
Meningitis große Unterschiede zwischen den CD4 und CD8 positiven Zellen. Im
zeitlichen Verlauf nahm der Anteil der CD4 positiven Zellen ab und der Anteil der CD8
positiven Zellen zu. Daraus resultierte eine signifikant abnehmende Ratio im Liquor bei
bakterieller Meningitis. Die Veränderung der Ratio während des klinischen Verlaufs
stand in Relation zur Aktivität der Entzündung. Die Veränderung in der CD4/CD8Ratio wurde hier nur graphisch dargestellt - Zahlenwerte wurden nicht veröffentlicht.
Stark (1988) definierte bei Fällen mit septischer Meningitis eine frühe Phase (< 14 d)
und eine späte Phase (> 14 d) der Erkrankung. Im Krankheitsverlauf verglich er die
CD4/CD8-Ratio und den Anteil der B-Zellen. Dabei zeigte sich, daß das Verhältnis der
Helferzellen zu den Suppressorzellen zu Beginn dieser Erkrankung signifikant höher ist,
als zum späteren Zeitpunkt. Der B-Zellanteil war in der Akutphase signifikant niedriger,
als zum späteren Zeitpunkt.
Weber et al. (1988) fanden bei der Untersuchung der Liquorlymphozyten mit
polyklonalen Antikörpern einen Anteil von 1,3% IgM positiver Zellen bei Patienten mit
bakterieller Meningitis (n = 12).
Bei Patienten mit septischer Meningitis der vorliegenden Studie ist die CD4/CD8-Ratio
in der Akutphase, im Vergleich zur Kontrollgruppe, nicht signifikant erhöht.
Im weiteren Krankheitsverlauf sinkt die CD4/CD8-Ratio von der ersten zur zweiten
Punktion nicht signifikant ab und erreicht von der zweiten zur dritten Punktion den
Wert der Kontrollgruppe.
Diese
Entwicklung
der
CD4/CD8-Ratio
ähnelt
den
Ergebnissen
von
Bamborschke et al. (1990) und Stark (1988).
Wegen der massiven Verschiebung des Granulozytenanteils im morphologischen
Differentialzellbild, stellt sich die Verlaufsbeschreibung der einzelnen monoklonalen
Antikörper in unserer Arbeit sehr verzerrt dar. Besonders deutlich wird dies in der
Beschreibung der CD4 und CD8 positiven Zellen, deren Anteil zur Gesamtzellzahl
angegeben wird. Trotz hoher Ratio in der Akutphase, fallen die einzeln betrachteten
Zellanteile an der Gesamtzellzahl, im Vergleich mit der Kontrollgruppe, deutlich
geringer aus.
65
4.2.5 Borrelienradikulitis
Die Verteilung der Lymphozytenpopulationen im Verlauf dieser Erkrankung wurde
bisher nur von wenigen Autoren untersucht. Die meisten der veröffentlichten Studien
beschränken sich häufig auf die Akutphase im Liquor der Borrelienradikulitiden und
vergleichen diese mit der Situation im Blut. Die immunologische Zellverhältnisse im
Liquor werden von den verschiedenen Autoren im Ergebnis aber ähnliche beschrieben.
Bamborschke et al. (1987) fanden bei einem Einzelfall mit Bannwarth-Syndrom im
Liquor 46% CD19 positiver B-Zellen (Leu12-Pan-B-Zellen) und 54% CD3 positiver TZellen (OKT3-Pan-T-Zellen). Die Untersuchung der T-Zellsubpopulationen ergaben
einen Anteil von 37% CD4 (OKT4) und 17% CD8 positiver (OKT8) T-Lymphozyten.
Die CD4/CD8-Ratio ist 2,2. Die Werte werden von dieser Arbeitsgruppe als Prozent
von Lymphozyten angegeben.
Sindern et al. (1994) beschrieben in ihrer Arbeit eine signifikante Abnahme der
HLADR positiven Zellen und der CD4/CD8-Ratio bei 24 Patienten mit Zoster und
12 Patienten mit Meningoradikulitis Bannwarth. Dabei stellten sie eine
Differenzierungsmöglichkeit zwischen der bakteriellen und viralen Genese im
Nachweis des IgM-Markers fest, der bei der Patientengruppe mit Meningoradikulitis
Bannwarth signifikant erhöht war.
Sindern et al. (1995) kamen in ihrer Studie zu dem Ergebnis, daß die B-Zellzahl (IgM
positiv) kein sinnvoller Verlaufsparameter der Lyme-Meningoradikulitis sei, da die
verlängerte B-Zellreaktion ohne klinische Symptome einhergeht. Im Gegensatz dazu
reagierte der CD4/CD8-Quotient empfindlicher auf eine erfolgreiche Therapie im
Verlauf der Krankheit. In der Akutphase konnten sie eine deutlich erhöhte CD4/CD8Ratio (3,5) nachweisen, die zur zweiten (2,2) und dritten Punktion (1,85) abnahm. Der
Anteil an IgM positiven Zellen veränderte sich von der ersten (17,5) zur zweiten
Punktion (15,25) nicht und zeigte erst bei der dritten Punktion (4,5) eine Reduzierung
des Zellanteils. Diese unterschiedliche Reaktionsform zwischen dem Verlauf der IgM
positiven Zellen und der CD4/CD8-Ratio, ließ die Vermutung zu, daß die Ratio ein
nützlicher Verlaufsparameter für die Aktivität der Erkrankung sein könnte.
66
Stark (1988) fand in der Akutphase bei Borrelienradikulitis eine CD4/CD8-Ratio von
2,77 und ein B-Zellanteil von 10,31 %. Bei der näheren Einzelfalluntersuchung zeigte
sich bei mehrfach untersuchten Fällen ein deutlicher Abfall des CD4/CD8-Quotienten
nach erfolgreicher Therapie.
Rieckmann et al. (1990) fanden bei Patienten mit Bannwarth-Syndrom einen hoch
signifikanten Anteil an IgM positiven Zellen in der lymphozytären Phase. Dieses
Ergebnis steht in Übereinstimmung mit der starken intrathekalen IgM-Antwort, die von
Felgenhauer (1982) und Henriksson (1985) beschrieben wurde.
Schädlich et al. (1985) fanden bei Patienten mit Bannwarth-Syndrom die deutlichste BZellreaktion und den höchsten Anteil an aktivierten (IgG positiven) B-Zellen im
Vergleich mit anderen akut entzündlichen Erkrankungen des zentralen Nervensystems.
Bei der Untersuchung der Borrelienradikulitis in unserer Studie zeigte es sich, daß die
CD4/CD8-Ratio in der Akutphase gegenüber der Kontrollgruppe signifikant erhöht ist.
In der Genesungsphase nimmt der gegenüber der Kontrollgruppe deutlich erhöhte CD4Anteil weiter ab. Dieser Entwicklung gegenläufig steigt der Anteil der CD8 positiven TLymphozyten an, so daß die CD4/CD8-Ratio im weiteren Verlauf signifikant abnimmt
und schon zur zweiten Punktion keinen Unterschied zur Kontrollgruppe aufweist.
Dieser Verlauf der Ratio unterstützt die Ergebnisse von Sindern et al. (1995), jedoch
fehlt eine Gegenüberstellung zu Patienten mit therapieresistentem Krankheitsverlauf.
In unserer Studie liegt der Anteil der IgM positiven Zellen zu Beginn der Erkrankung
bei einem Mittelwert von 15%, der sich im weiteren Verlauf nicht wesentlich ändert und
erst in der Spätphase zur dritten Punktion langsam abnimmt. Dies entspricht dem
B-Zellverlauf bei Sindern et al. (1995), Schädlich und Felgenhauer (1985), u.a.
Der Verlauf der HLADR positiven Zellen wurde bei dieser Erkrankung nicht
untersucht.
4.2.6 Guillain-Barré-Syndrom
Auch beim Guillain-Barré-Syndrom sind bisher nur wenige Studien über
Lymphozytenphänotypisierungen im Liquor mit monoklonalen Antikörpern bekannt
und die Ergebnisse sind sehr uneinheitlich. Dies liegt zum Teil darin begründet, daß die
Autoren keine einheitliche Gruppe mit Guillain-Barré-Syndrom gebildet haben, sondern
mehrere ähnliche Krankheiten zu einer Gruppe zusammengefaßt haben.
Polman et al. (1987) faßte Patienten mit Guillain-Barré-Syndrom, chronisch
entzündlicher demyelinisierender Polyneuropathie (CIDP) und zerebraler Vaskulitis
Lupus erythematodes als Gruppe mit „anderen neuroimmunologischen Erkrankungen“
67
(n = 7) zusammen. Die CD4/CD8-Ratio dieser Patientengruppe lag bei 4,4. Der Anteil
der Helferzellen bei 63%, für die Suppressorzellen bei 20% und OKIa+ bei 15%.
Betrachtet man die Patienten mit Guillain-Barré-Syndrom (n = 3), so lag die CD4/CD8Ratio bei 4,7. Die Helferzellpopulation (OKT4) betrug im Mittel 59%, die
Suppressorzellpopulation (WT 82+) 18%. Der OKIa-Antikörper (anti macrophages,
B-cells, activated T-cells) markierte 17% der mononukleären Zellen im Liquor.
Ernerudh et al. (1989) fanden bei ihrer Patientengruppe mit Guillain-Barré-Syndrom
(n = 9) im Mittel einen T-Zellanteil von 70%. Die Verteilung der T-Zellsubpopulation
lag für CD4 positive Zellen bei 60% und für CD8 bei 20%. Eine CD4/CD8-Ratio wurde
nicht mitgeteilt. Der Anteil an (HLADR+-Zellen lag bei 27%. Der B-Zellanteil (OK B2)
betrugt 2%. Der Vergleich der aufeinanderfolgenden Liquorproben einzelner Patienten
ergab im Krankheitsverlauf des Guillain-Barré-Syndrom keine beständigen
Verteilungsmuster. Weder die T-Zellsubpopulationen noch die Werte der anderen
Marker korrelierten mit der Schwere der Erkrankung bei Guillain-Barré-Syndrom.
Rolfs et al. (1994) fanden bei einer schwangeren Patientin (36. SSW) mit GuillainBarré-Syndrom bei den Liquorleukozyten eine extreme Reduktion der Suppressorzellen
(CD8) 4% [22%] und einen Anstieg der Helferzellen (CD4) auf 58% [44%] gegenüber
ihren Normalwerten [NW]. Die CD4/CD8-Ratio wurde mit 14,5 angegeben. Der Anteil
der HLADR positiven Zellen erreichte 42% [26%].
Stark (1988) fand bei seiner Gruppe (n = 9) mit akuter (Guillain-Barré-Syndrom) und
chronischer (CDIP) idiopathischer Polyneuropathie 78,14% T-Zellen und 0,75%
B-Zellen. Die T-Zellsubpopulation mit 53,17% Helferzellen und 23,50%
Suppressorzellen ergaben eine CD4/CD8-Ratio von 2,33. Diese Gruppe war jedoch
nicht nur in ihrer Zusammensetzung aus akuten und chronischen Fällen, sondern auch
hinsichtlich der Akuität inhomogen, da sich einige Patienten bereits in Remission
befanden. In der Verlaufsbeobachtung der unterschiedlichen Patienten vermutete er
jedoch einen Trend hinsichtlich der CD4/CD8-Ratio, der die Aktivität der Erkrankung
widerspiegeln könnte: Bei der akuten Form der idiopathischen Polyneuritis (n = 4) fand
sich bei einem Patienten mit rückläufiger Symptomatik eine Ratio von 1,09; bei zwei
Patienten zum Ende der progredienten Phase (noch ein/ drei Tage) eine Ratio von
1,44/ 1,55; beim vierten Patienten eine Ratio von 5,55 - hier schritten die Paresen noch
neun Tage fort. Bei der chronischen Form (n = 5) befand sich ein Patient klinisch in
sicherer Remission, dabei wies er eine Ratio von 1,3 auf; bei den verbliebenen vier
Patienten bestand eine fragliche bis sichere Progredienz der Erkrankung mit einer Ratio
von 1,6 bis 3,5.
68
Sindern et al. (1994) beschrieben in ihrer Arbeit eine signifikante Abnahme der
HLADR positiven Zellen und der CD4/CD8-Ratio bei 24 Patienten mit Zoster und
12 Patienten mit Meningoradikulitis Bannwarth. Bei der Meningoradikulitis Bannwarth
konnte zusätzlich ein signifikant erhöhter Anteil an B-Zellen festgestellt werden.
Gegenüber diesen beiden Patientengruppen konnten sie bei 15 Guillain-Barré-Syndrom
Patienten keinen Anteil an B-Zellen, keine HLADR positive Zellen und keinen Wechsel
in der CD4/CD8-Ratio feststellen.
Ähnlich, wie auch bei Ernerudh et al. (1989) beschrieben, gab es in unserer Studie, im
Vergleich der aufeinanderfolgenden Liquorproben einzelner Patienten im
Krankheitsverlauf des Guillain-Barré-Syndrom, keine beständigen Verteilungsmuster.
Die Anwendung des Wilcoxon-Vorzeichen Rangsummentestes kam bei der CD4/CD8Ratio dieser Patientengruppe nicht in Frage, da es nur 3 Beobachtungen von der ersten
zur zweiten Punktion gab. Im Vergleich mit den Werten der Kontrollgruppe gab es
jedoch in der Akutphase eine Verschiebung der Zellverteilung zu den CD8 positiven
Zellen. Entgegen dem Ergebnis von Rolfs et al. (1994) und Kunze (1992), die einen
deutlich reduzierten Anteil CD8 positiver Zellen feststellten, waren hier die CD8
positiven Zellen deutlich erhöht und glichen sich dem Wert der Kontrollgruppe in der
Genesungsphase zur zweiten Punktion wieder an. Die CD4/CD8-Ratio zeigte jedoch
keine signifikante Veränderung im Vergleich zur Kontrollgruppe. Der Anteil der
HLADR positiven Zellen zur zweiten Punktion war gegenüber der Kontrollgruppe
deutlich erhöht, eine ähnliche Erhöhung gab es bei Rolfs et al. (1994) bereits in der
Akutphase (7. d). Der Verlauf der IgM positiven Zellen wurde bei dieser Erkrankung
nicht untersucht.
In den Einzellfallbetrachtungen der Guillain-Barré-Gruppe fällt ein Patient auf, der in
der Akutphase der Ratio bei Rolfs et al. (1994) ähnelt und zur Kontrollgruppe einen
ähnlichen Verlauf der CD4/CD8-Ratio aufweist, wie sie bei den übrigen untersuchten
infektiösen Krankheitsgruppen beschrieben wird. Die immunologische
Differentialzytologie der Akutphase zeigte eine CD4/CD8-Ratio von 5,1. Dabei fehlte
in der Routinediagnostik des Liquors jedoch die charakteristische zytoalbuminäre
Dissoziation, bei einer sonst dem Guillain-Barré-Syndrom entsprechenden
morphologischen Differentialzytologie (Ashbury et al. 1978). Der klinische Verlauf des
Patienten, mit aufsteigenden, symmetrischen Paraparesen und sensiblen Defiziten, weist
dabei deutliche Kennzeichen eines Guillain-Barré-Syndroms auf. Ein möglicher Erreger
konnte im Liquor nicht nachgewiesen werden, so daß dieser Befund, verglichen mit
anderen Ergebnissen, im Rahmen notwendiger Folgestudien, später einmal als mögliche
Normvariante gewertet werden kann.
69
4.3 Vergleich zwischen den Krankheitsgruppen
Die wenigen aus der Literatur bekannten Studien, in denen die CD4/CD8-Ratio im
Liquor bei Patienten mit verschiedenen Erkrankungen untersucht wird, vergleichen die
Situation im Liquor mit der im Blut. Ein Vergleich zwischen den untersuchten
Krankheitsgruppen findet dagegen nur hinsichtlich der Unterschiede zwischen dem
Blut-Liquor-Verhältnis der einzelnen Erkrankungen statt.
Ein direkter Vergleich der Liquorzellsituation bei unterschiedlichen neurologischen
Erkrankungen ist bisher nur von wenigen durchgeführt worden und geht meist von der
Betrachtung der multiplen Sklerose aus. Eine Gegenüberstellung der Liquor CD4/CD8Ratio im Verlauf verschiedener neurologischer Erkrankungen ist bisher nur von
Stark (1988) beschrieben worden. Diese Studie ist hinsichtlich der untersuchten
Krankheitsbilder die bisher umfangreichste, jedoch wurden nur relativ kleine
Patientenzahlen untersucht. Es wurden Liquorproben von Patienten mit multipler
Sklerose, aseptischer Meningitis, Zoster-Meningoganglionitis, Borrelienradikulitis,
Guillain-Barré-Syndrom, Kollagenosen mit ZNS-Befall und septischer Meningitis
verglichen. Dabei waren die Unterschiede im Helfer-Suppressor-Verhältnis von
besonderer Bedeutung. Dieser Wert war bei der multiplen Sklerose signifikant höher als
bei allen anderen entzündlichen Erkrankungen mit Ausnahme der Zoster
ganglioradikulitis und der Gruppe der Kollagenosen mit ZNS Beteiligung. Vergleicht
man die Mittelwerte, so erhält man die folgende Reihenfolge: multiple Sklerose >
Zoster > Kollagenosen > aseptische Meningitis > Borreliose > septische Meningitis >
Lues/Tbc > Herdenzephalitis.
Bamborschke et al. (1987) verglichen in ihrer Studie Blut und Liquorproben von
Patienten mit aseptischer Meningitis gegenüber einer Gruppe mit septischer Meningitis.
Die OKT4/OKT8-Ratio im Liquor der Patienten mit aseptischer Meningitis weist, im
Vergleich zu denen mit septischer Meningitis keinen signifikanten Unterschied auf.
Ernerudh et al. (1989) verglichen in ihrer Studie Blut- und Liquorproben bei Patienten
mit aseptischer Meningitis und Guillain-Barré-Syndrom. Dabei zeigt das Verhältnis der
T-Zellsubpopulationen (CD4 und CD8) keine wesentlichen Unterschiede zwischen den
beiden Gruppen.
Bamborschke et al. (1990) stellten in ihrer Studie einer Gruppe mit septischer
Meningitis eine Gruppe mit aseptischer Meningitis gegenüber und verglichen deren Blut
und Liquorproben. Die Patienten wurden im Krankheitsverlauf dreimal punktiert.
Zwischen den CD4/CD8-Rationes konnte im Verlauf der Erkrankungen kein
signifikanter Unterschied festgestellt werden.
70
Polman et al. (1987) verglichen in Ihrer Studie Liquorproben von multipler Sklerose mit
neuroimmunologischen Erkrankungen (Guillain-Barré-Syndrom, CDIAP und zerebraler
Vaskulitis (Lupus)), sowie infektiösen entzündlichen Erkrankungen des ZNS
(Neurosyphilis, virale Enzephalitis) gegen eine Kontrollgruppe mit nicht entzündlichen
neurologischen Erkrankungen (Diskusprolaps, Kopfschmerz, Epilepsie).
Während bei den Patienten mit neuroimmunologischen Erkrankungen gegenüber den
anderen Patientengruppen eine statistisch signifikant erhöhte CD4/CD8-Ratio im Liquor
festgestellt werden konnte, fanden sich sonst keine signifikanten Unterschiede zwischen
den Patientengruppen.
Merelli et al. (1991) verglichen in ihrer Studie Blut- und Liquorproben bei multipler
Sklerose mit akuten viralen Entzündungen des ZNS. Dabei zeigte es sich, daß die
Lymphozytensubpopulationen bei beiden Patientengruppen eine identische Verteilung
hatten.
Alle Patientengruppen der vorliegenden Studie erreichen in der Akutphase, bis auf die
Guillain-Barré-Gruppe, unabhängig von der statistischen Signifikanz, ihre größte
CD4/CD8-Ratio. Durch die in der Genesungsphase einsetzende gegenläufige
Entwicklung der CD4 und CD8 positiven Zellen, nähern sich die Patientengruppen
bereits zur zweiten Punktion wieder dem Mittelwert der Kontrollgruppe an. Einzige
Ausnahme bildet hierbei die aseptische Meningitis, die erst zur dritten Punktion den
Mittelwert der Kontrollgruppe erreicht.
Vergleicht man die Mittelwerte der CD4/CD8-Ratio zwischen den Patientengruppen der
ersten Punktion einschließlich der Kontrollgruppe, so fällt die aseptische Meningitis mit
der höchsten Ratio auf.
Nach der Größe ihrer Mittelwerte gegliedert, folgen der aseptischen Meningitis die
septische Meningitis, die Neuroborreliose, Zoster und das Guillain-Barré-Syndrom.
Die Verteilung der Patientengruppen nach ihrem statistischen Signifikanzniveau zur
Kontrollgruppe folgt jedoch nicht der Höhe der Mittelwerte. Septische Meningitis und
Guillain-Barré-Syndrom fallen aus der Gliederung heraus, weil sie, bewertet nach dem
eingangs definierten Signifikanzniveau, keinen statistisch signifikanten Unterschied zur
Kontrollgruppe aufweisen. Unter den verbleibenden drei Patientengruppen liegt die
statistische Signifikanz bei der aseptischen Meningitis p < 0,0005 vor den Borrelien
p < 0,005 und Zoster p < 0,05. Eine ähnliche Verteilung ergibt sich bei diesen
Krankheitsgruppen hinsichtlich der signifikant deutlich erhöhten Ratio gegenüber der
Guillain-Barré-Gruppe.
71
Im weiteren Vergleich der Patientengruppen fällt bei der aseptischen Meningitis eine
deutlich erhöhte Ratio gegenüber den Gruppen mit Zoster und septischer Meningitis
auf.
Trotz der Unterschiede zwischen den Mittelwerten der Liquorzellpopulationen lassen
sich für die einzelnen Krankheitsgruppen keine typischen Zellmuster im Verlauf der
CD4/CD8-Ratio beschreiben. Eine statistische Auswertung war wegen der nicht
ausreichenden Anzahl an Punktionen/-spräparaten in der zweiten und dritten Punktion
nicht möglich. Eine genaue Zuordnung zu einer bestimmten Krankheitsgruppe ist
demnach nicht möglich.
Unter Berücksichtigung der in der Literatur beschrieben methodischen Unterschiede
und der in unserer Studie nur begrenzt zur Verfügung stehenden Anzahl an Liquorzellen
kann man jedoch feststellen, daß die CD4/CD8-Ratio im Liquor im zeitlichen Verlauf,
das heißt im Laufe der Heilung, abnimmt. Bei allen Patientengruppen war der
Krankheitsverlauf unter der entsprechenden Therapie komplikationslos. Es ergab sich
zwischen den untersuchten Krankheitsgruppen, mit Ausnahme des Guillain-BarréSyndroms, kein Hinweis auf einen abweichenden Verlauf der CD4/CD8-Ratio im
Verhältnis zur Kontrollgruppe. Anders als bei den mit untersuchten Krankheitsgruppen
bestehen hier zur Kontrollgruppe ähnliche Mittelwerte im Krankheitsverlauf.
Während in der Akutphase einer Meningoradikulitis das Geschehen durch eine hohe
CD4/CD8-Ratio beschrieben werden kann, bedingt durch den erhöhten Anteil der CD4
positiven T-Effektorzellen und den der Situation angemessen reduzierten CD8 positiven
T-Suppressorzellen, spiegelt sich der unkomplizierte Heilungsverlauf durch eine
abnehmende, der Kontrollgruppe sich angleichenden Ratio, wider. Diese Veränderung
kann als suppressorische Regulation im unkomplizierten Heilungsverlauf einer
Entzündungsreaktion im Liquor interpretiert werden.
Diesem Interpretationsansatz entgegen stehen die deutlich verminderten Werte der
CD4/CD8-Ratio in der Akutphase bei anderen infektiösen ZNS-Erkrankungen. Bei der
HIV-Infektion (Ross et al. 1991, McArthur et al. 1989, Margolick et al. 1988) kommt es
zum Beispiel zu einer selektiven Eliminierung von CD4 positiven Zellen und dadurch
zu einem überwiegen der CD8 positiven T-Lymphozyten. Ähnlich dominiert der CD8
positive Phänotyp im Liquor bei chronischen Erkrankungen, wie der subakuten
sklerosierenden Panenzephalitis (Marrosu et al. 1986). Bei der Infektion durch den
lymphozytären Choriomeningitis Virus (Allan und Doherty 1986) kommen im Liquor
beträchtliche Anteile an CD8 positiven zytotoxischen T-Zellen und „Natürlichen
Killerzellen“ vor, wohingegen bei der japanischen Enzephalitis (Johnson et al. 1985) die
T-Helferzellen in den perivaskulären Hüllen (Cuffs) vorkommen. Eine bedeutende
72
Erklärung für die Diskrepanz zu den Ergebnissen dieser Studie kann es sein, daß
verschiedene Viren unterschiedliche T-Zellsubpopulationen werben.
Das bereits vielfach in der Literatur zitierte Vorkommen einer stark reduzierten
CD4/CD8-Ratio in der Akutphase, bei aseptischen Meningitiden durch Mumps(Kreth et al. 1982, Nagai et al. 1983, Fleischer und Kreth 1983, Taniguchi et al. 1983)
und HIV-Infektionen (Ross et al. 1991, McArthur et al. 1989, Margolick et al. 1988),
trat bei den Patientengruppen unserer Studie nicht auf.
Nach den vorliegenden und den in der Literatur veröffentlichten Ergebnissen (längerer
Verlauf der CD4/CD8-Ratio bei aseptischer Meningitis, jedoch nicht bei Borrelien) ist
zu erwarten, daß sich die CD4/CD8-Ratio bei chronischen Erkrankungen nicht der
Kontrollgruppe angleichen wird, sondern auf einem erhöhten Wert bestehen bleibt.
Diese Erwartung wird unterstützt durch die Studien von Cashman et al. (1982),
Hommes und Brinkmann (1984) und Zaffaroni et al. (1985), welche bei Patienten mit
multipler Sklerose im akuten Schub eine niedrige Suppressorzellzahl fanden und zu
Oger et al. (1982), der berichtete, daß Helfer-T-Zellen bei Patienten mit progressivem
Verlauf der multiplen Sklerose erhöht sind.
Anders stellt sich die Situation bei der Studiengruppe mit Guillain-Barré-Syndrom dar:
In der Arbeit von Ernerudh et al. (1989) und in unserer Studie kam es bei der
diagnostischen Erstpunktion zu keiner signifikanten Veränderung der CD4/CD8-Ratio
gegenüber der Kontrollgruppe. Auch im weiteren Verlauf lag die Ratio der Gruppe mit
Guillain-Barré-Syndrom auf dem Niveau der Kontrollgruppe. Bei der Betrachtung der
individuellen Zellverläufe von Patienten mit Guillain-Barré-Syndrom kann man
ebenfalls kein beständiges Verlaufsmuster der CD4/CD8-Ratio erkennen.
Die eigentliche Ursache für die ähnliche Zellsituation im Liquor der diagnostischen
Erstpunktion beim Guillain-Barré-Syndrom und der Kontrollgruppe muß im
Zusammenhang mit der Pathogenese des Guillain-Barré-Syndrom stehen.
Mit Hilfe des Modells der experimentell-allergischen Neuritis (Shoenfeld et al. 1996)
versucht man die Pathophysiologie als zellvermittelte Autoimmunreaktion gegen die
Myelinstruktur der peripheren Nerven zu beschreiben. Dabei sind sowohl Nerv, als auch
Nervenwurzel von der Zellinfiltration mit Lymphozyten und Makrophagen betroffen.
Initial kommt es zu einer Permeabiltätsstörung der nervenversorgenden Gefäße. Dies
führt einerseits zu einem gesteigerten endoneuralen Druck und der Entwicklung eines
Ödems im Bereich der Nerven und andererseits zum Auswandern von Makrophagen
und großen mononukleären Zellen; schließlich kommt es zur Myelinschädigung. Ein
Übergreifen auf das Zentralnervensystem tritt erst im fortgeschrittenen Stadium, selten
initial, auf. Nur in etwa 10% der Fälle kommt es zu einer primär axonalen Schädigung,
73
wobei auch die Vorderhornzellen mit beteiligt sind. Ausgehend von diesem
Pathomechanismus, beginnend in einem vom Liquorraum entfernten Kompartiment, ist
die kaum vorhandene zelluläre Beteiligung im durch die Blut-Gehirn-Schranke gut
abgeschirmten Liquorkompartiment gerade auch in der Phase der diagnostischen
Erstpunktion gut erklärbar.
Die von unserem Ergebnis deutlich abweichenden Studie von Polman et al. (1987) ist in
diesem Modell ebenfalls zu verstehen, da Polman neben dem Guillain-Barré-Syndrom
auch chronische Erkrankungsformen (CDIAP, Lupus-Immunvaskulitis) in die
Patientengruppe mit neuroimmunologischen Erkrankungsformen aufgenommen hat. Die
Zusammensetzung dieser Studiengruppe mit einem großen Anteil chronischer
Erkrankungsformen bei kleiner Patientenzahl, kann für die erhöhte CD4/CD8-Ratio im
Gegensatz zu den anderen Arbeiten mit Guillain-Barré-Syndrom ursächlich sein.
Im Liquor der Patienten unserer Studie spiegelt der CD4/CD8-Quotient die Aktivität der
Erkrankung während des unkomplizierten Heilungsverlaufes wider. Sollten sich diese
vorläufigen Befunde an einem Kollektiv mit abweichendem Krankheitsverlauf
(Therapieversagern) bestätigen lassen, so wäre dieses Ergebnis für praktische Zwecke in
der Klinik von großer Bedeutung. Meningoradikulitiden können zu jedem Zeitpunkt
zum Stillstand und zum Abklingen kommen. Parameter, um dies prospektiv abschätzen
zu können, sind nicht bekannt. Es ist deshalb im Einzelfall und oft auch in
Therapiestudien schwer abzuschätzen, ob eine Therapie sinnvoll ist oder ob die
Remission bereits begonnen hat. Die dargestellten Grundlagen sind bei der
Beantwortung differentialdiagnostischer Streitfragen zum Beispiel hinsichtlich einer
neoplastischen Beteiligung des ZNS (Ross et al. 1991) ebenfalls nützlich und stellen
eine Basis für weitere Studien entzündlicher Erkrankungen dar. Bei neoplastischen
Erkrankungen, mit Beteiligung der weichen Hirnhäute, ist der CD4/CD8-Quotient
erniedrigt (Stark 1988). Der in unserer Studie beschriebene Verlauf der Ratio bei
unkomplizierter Klinik, in Abhängigkeit von der Akuität der Erkrankung, sollte durch
weiterführende Studien untersucht werden. Die Ergebnisse lassen vermuten, verglichen
mit den Ergebnissen aus der Literatur, daß die Analyse der CD4/CD8-Ratio im Liquor
nützlich ist, um sowohl zwischen akuten und chronischen Krankheitsverläufen zu
differenzieren, als auch die diagnostischen und therapeutischen Auswirkungen und
deren Folgen zu verstehen. Dazu benötigt man jedoch ein umfangreiches Studiendesign,
in das auch Patienten mit gestörten Krankheitsverläufen und Therapieversager
aufgenommen werden.
74
Auch die Hinweise aus der Literatur über den Verlauf der in der Akutphase stark
reduzierten CD4/CD8-Ratio bei Mumps-Infektionen sind für die weitere Untersuchung
des zellulären Immunstatus im Liquorkompartiment von besonderer Bedeutung.
75
5 Zusammenfassung
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die mononukleären Liquorzellen
immunzytologisch zu differenzieren und bestehende Unterschiede zwischen den
Erkrankungen herauszuarbeiten. Des weiteren sollte versucht werden, bei den einzelnen
entzündlichen Erkrankungen des Nervensystems eine Verlaufsdynamik zu beschreiben.
Es wurden Liquorproben von 50 Patienten mit Zoster, 19 Patienten mit aseptischer
Meningitis, 16 Patienten mit septischer Meningitis, 9 Patienten mit Bannwarth-Syndrom
und 19 Patienten mit Guillain-Barré-Syndrom untersucht. Liquorproben von
13 Patienten ohne entzündlich/ pathologische Liquorveränderungen wurden als
Kontrollgruppe in die Untersuchung mit aufgenommen.
In den Liquorproben wurden die T- und B-Lymphozyten mit den monoklonalen
Antikörpern CD4, CD8, IgM und HLADR markiert. Als immunzytologisches
Nachweisverfahren wurde die APAAP-Methode angewandt. Neben ihrer großen
Empfindlichkeit gegenüber anderen immunologischen Färbetechniken ist sie bei der
Untersuchung von Liquorzellen wegen ihrer geringen Hintergrundreaktion zu der
alternativ in der Literatur beschriebenen Immunperoxidase-Methode von Vorteil. Durch
die Unterdrückung der endogenen Peroxidase in Erythrozyten und Granulozyten werden
die antigenen Zellstrukturen deutlich mit beeinflußt, was durch die Hemmung der
endogenen alkalischen Phosphatasen durch Levamisol vermieden wird.
Trotz des zeitlich aufwendigen Verfahrens überwogen im Ergebnis die Vorteile:
♦
Die bei der Untersuchung der Liquorproben zur Anwendung gekommenen
monoklonalen Antikörper lieferten in Verbindung mit der APAAP-Methode gute,
optisch einfach zu differenzierende Färbeergebnisse. Als besonders vorteilhaft bei
der Beurteilung verschmutzter Präparate (Talkum), oder auch bei einem
Überwiegen nicht positiver Zellen, wie dem Granulozytenanteil bei septischer
Meningitis, erwies sich die Wahl des Neufuchsins als Substrat, da aus seiner
Umsetzung eine leuchtende Rotmarkierung resultierte.
♦
Bei der nur geringen zur Verfügung stehenden Anzahl an Präparaten konnte die
Farbintensität der markierten Zellen ohne Verlust durch die Wiederholung der
Färbeschritte gesteigert werden.
♦
Die
Aktivität
endogener
alkalischer
Phosphatasen
(alkalische
Neutrophilenphosphatase) konnte ohne Beeinträchtigung antigener Zellstrukturen
durch Levamisol effektiv gehemmt werden.
76
♦
Neben der Möglichkeit im gleichen Präparat die morphologischen und auch die
immunzytologischen Ergebnisse beurteilen zu können, erlaubte der unlösliche rote
Azofarbstoff die lange Konservierung der markierten Präparate, so daß jederzeit
eine erneute Beurteilung des Präparats durchgeführt werden konnte.
In den Liquorproben unserer Patienten fiel der Anteil der CD4 positiven
T-Lymphozyten deutlich größer aus, als der Anteil der CD8 positiven Zellen und der
anderen mituntersuchten Subpopulationen. Von Vorteil erwies sich die Bildung der
Ratio aus den Anteilen der CD4 und CD8 positiven Zellen. Die Darstellung der
Lymphozytenanteile ist in der Literatur nicht einheitlich. Teilweise basiert sie, wie in
unserer Arbeit, auf der bei der Punktion gezählten Gesamtzellzahl, bei anderen Autoren
basiert der Anteil der Subpopulationen auf der Lymphozytenzahl. Ein direkter
Vergleich der Lymphozytensubpopulationen zwischen den Patientengruppen ist daher
nicht sinnvoll, weshalb sich die Untersuchung der CD4/CD8-Ratio anbietet.
In der Akutphase des entzündlichen Prozesses stieg das Helfer/ Suppressor-Verhältnis
deutlich an und fiel im Laufe der untersuchten Erkrankungen ab. Zwischen den
untersuchten Krankheitsgruppen ergab sich, mit Ausnahme des Guillain-BarréSyndroms, kein Hinweis auf einen abweichenden Verlauf der CD4/CD8-Ratio in ihrem
Verhältnis zur Kontrollgruppe.
Durch die gegenläufige Entwicklung der CD4 und CD8 positiven Zellen im
Krankheitsverlauf kommt ihrer Ratio eine mögliche Bedeutung als Akuitätsparameter
zu, um die Aktivität der Entzündung bei Zoster, aseptischer und septischer Meningitis,
sowie dem Bannwarth-Syndrom im Liquorraum zu beschreiben. Dabei ließ sich jedoch
kein Hinweis auf die Ätiologie der untersuchten Entzündungen finden, da der Verlauf
der Ratio sowohl bei den bakteriellen, als auch den viralen und aseptischen
Entzündungen im Liquor einen ähnlichen Verlauf zeigte. Einen im Vergleich zu den
anderen Patientengruppen atypischen Verlauf zeigte die Ratio bei der Patientengruppe
mit Guillain-Barré-Syndrom. Hier gab es im Krankheitsverlauf keine Veränderung des
Verteilungsmusters der CD4/CD8-Ratio im Vergleich zur Kontrollgruppe.
Die Anteile der mituntersuchten Antikörper IgM und HLADR blieben deutlich unter
den Werten der CD4 und CD8 Marker und ließen, mit Ausnahme der Patientengruppe
mit Bannwarth-Syndrom, keine typische Entwicklung im Krankheitsverlauf erkennen.
Beim Bannwarth-Syndrom fiel der bei der diagnostischen Erstpunktion mit bis zu 15%
deutlich erhöhte Anteil IgM positiver Zellen auf, wodurch ihm eine Bedeutung bei der
Anwendung als immunologischen Marker für die Neuroborreliose zukommt. Als
77
Verlaufsparameter ist er jedoch nicht geeignet, da er unabhängig vom positiven
Krankheitsverlauf, lange Zeit auf dem hohen Ausgangswert stagnierte.
Wegen der nur geringen Anzahl an möglichen Präparaten, wäre es von Interesse, das
angewandte APAAP-Verfahren als Doppelfärbung mit verschiedenfarbigen
Diazofarbstoffen zu modifizieren. Dadurch wäre es möglich, einen zweiten Antikörper
zum Einsatz zu bringen und den Phänotyp der Zelle weiter zu spezifizieren, wie es
bereits im Blut, unter Anwendung der Durchflußzytometrie, möglich ist.
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Danksagung
Für die Überlassung des Themas der Doktorarbeit danke ich Herrn Prof. Dr. J.-P. Malin.
Ebenfalls danke ich Herrn PD Dr. E. Sindern für die Hilfestellung bei der Wertung der
Ergebnisse, die stete Gesprächsbereitschaft und die wohlwollende Unterstützung.
Schließlich gilt mein herzlicher Dank auch Frau A. Brauckmann für die technische
Hilfe im Liquorlabor der Neurologischen Klinik.
96
Lebenslauf
Ronald Plennis
Persönliche Daten
Geburtstag und -ort: 17. November 1967 in Ulm/ Donau
Familienstand: ledig
Schulbildung:
1974 - 1978: Kath. Grundschule in St. Augustin/ Nordrhein Westfalen
1978 - 1987: Kardinal-Frings-Gymnasium in Bonn-Beuel/ Nordrhein Westfalen
Zeugnis der Allgemeinen Hochschulreife (26. Mai 1987)
Beruflicher Werdegang
1987:Eintritt in die Bundeswehr als Sanitätsoffizieranwärter/ Zeitsoldat (SaZ 16)
1988 - 1995: Studium der Humanmedizin an der Ruhr-Universität Bochum
Immatrikulation im WS 1988/89
Physikum am 11. September 1990
1. Staatsexamen 18. September 1991
2. Staatsexamen 15. April 1994
PJ im Prosperhospital Recklinghausen; Wahltertial in der Abt. Anästhesie
3. Staatsexamen 17. Mai 1995
1995 - 1996 Arzt im Praktikum
1995 - 1996: Bundeswehrkrankenhaus Kiel; 24 119 Kronshagen/ Schleswig-Holstein
26.05.95 bis 30.06.96 in der Abteilung X
(Anästhesie und Intensivmedizin)
1996 - 1999: Schiffahrtmedizinisches Institut der Marine; 24 119 Kronshagen/ S.-H.
1.07.96 bis 30.06.99 in der Abteilung II (Tauch- und Überdruckmedizin)
1999:Bundeswehrzentralkrankenhaus Koblenz; 56 072 Koblenz/ Rheinland-Pfalz
ab 01.07.99 in der Abteilung X
(Anästhesie, Intensivmedizin und Rettungsmedizin)
97