versuch 2: grundlagen der durchflusszytometrie

VERSUCH 2: GRUNDLAGEN DER
DURCHFLUSSZYTOMETRIE
LERNZIELE:
1) Theoretische Grundlagen der Durchflusszytometrie
2) „Trockentraining“ mit dem FACS-Simulator
3) Erstellen einer Kalibrierung am Gerät mittels Kalibrierbeads
HINTERGRUND:
VORBEMERKUNG:
Mit diesem Übungsbeispiel möchten wir Ihnen erste Grundlagen in der Durchflusszytometrie
vermitteln, eine Technik die oft auch als „FACS“ bezeichnet wird. Die Abkürzung steht dabei für
Fluorescence Activated Cell Scanning, da es sich um eine reine Analysemethode handelt, d.h. die
analysierten Partikel (meist Zellen) sind nach der Analyse verloren. Im Unterschied dazu, handelt
es sich beim Fluorescence Activated Cell Sorting (das gemeinerweise auch als FACS abgekürzt
wird), um eine sehr viel anspruchsvollere Technik, bei der die Zellen nach der Analyse
entsprechend ihrer Eigenschaften in unterschiedliche Röhrchen sortiert werden und dann
weiterverwendet werden können.
Da es an der Universität Salzburg nur ein FACS gibt, das zudem noch stark ausgelastet ist, ist es
schwierig den Studenten in Übungen einen wirklichen Einblick in diese Technik zu geben. Daher
haben wir für Sie eine Software entwickelt, mit der Sie sich die wichtigsten Grundlagen ohne
Zeitdruck erarbeiten können. Trotzdem werden Sie natürlich in der Übung auch die Möglichkeit
bekommen Ihre Proben am echten Gerät zu messen.
DIE DURCHFLUSSZYTOMETRIE:
Durchflusszytometrie erlaubt die gleichzeitige Messung verschiedener physikalischer Parameter
einzelner Partikel in Lösung. Meist handelt es sich bei den Partikeln um Zellen. Diese Partikel
werden nun mit einem Laserstrahl beleuchtet und aus dem resultierenden Streulicht und den
Fluoreszenzemissionen können Parameter gemessen werden.
Grundsätzlich besteht ein FACS aus einem Flüssigkeitssystem, das für den Transport und die
Fokussierung der Zellen in der Messzelle verantwortlich ist. In der Messzelle trifft der Laserstrahl
auf die Zellen (moderne Geräte haben mehrere unterschiedliche Laser hintereinander) und das
Streu-/Fluoreszenzlicht wird über das optische System mittels verschiedener Spiegel und Filter
in einzelne Wellenlängenpakete unterteilt und den unterschiedlichen Detektoren zugeführt.
Dort wird das Licht in elektronische Signale umgewandelt, die über einen Computer ausgewertet
werden.
ABB.1 AUFBAU EINES DURCHFLUSSZYTOMETERS. Über das Flüssigkeitssystem werden die Zellen in die
Messzelle transportiert und dort fokussiert (hydrodynamische Fokussierung). Dadurch wird erreicht, dass
der Laserstrahl immer genau auf eine einzelne Zelle trifft. Das resultierende Streu-/Fluoreszenzlicht wird
über das optische System zu den verschiedenen Detektoren geleitet und dort in elektronische Signale
umgewandelt. Quelle: http://flow.csc.mrc.ac.uk
DAS FLÜSSIGKEITSSYSTEM:
Bei den Geräten der Firma Becton Dickinson werden die Zellen in der Messzelle mittels
hydrodynamischer Fokussierung zentriert. Dazu wird die Probenflüssigkeit (die die Zellen
beinhaltet), in einen Flüssigkeitsstrom („sheath fluid“) injiziert. Man nennt das auch „stream in
stream“ Methode. Damit der Probenstrom in den Hüllstrom injiziert werden kann, muss der
Druck der Probenflüssigkeit größer als der Druck der Hüllflüssigkeit sein, jedoch ist die
Geschwindigkeit des Hüllstroms deutlich höher als die der Probenflüssigkeit. Dadurch werden
die Zellen „mitgerissen“ und zu einem feinen Strahl fokussiert. Über Änderung des Drucks kann
man die Geschwindigkeit, mit der in den Hüllstrom injiziert wird, beeinflussen und damit die
Anzahl der Zellen/Sekunde, die durch die Messzelle wandern. Die Geschwindigkeit der einzelnen
Zellen wird jedoch nur durch die Geschwindigkeit des Hüllstroms bestimmt und muss immer
konstant sein!
ABB.2 HYDRODYNAMISCHE FOKUSSIERUNG. Die
Durchflussrate wird über den Druck der Probenflüssigkeit
reguliert. Ist der Druck nur geringfügig größer als der
Druck der umgebenden sheath fluid, wird der
Probenstrahl eng fokussiert und die Durchflussrate ist
niedrig. Durch Erhöhung des Druckes der
Probenflüssigkeit wird die Durchflussrate erhöht.
Quelle: http://flow.csc.mrc.ac.uk
OPTISCHES SYSTEM:
Wenn der Laserstrahl in der Messzelle auf eine Zelle trifft, entsteht einerseits Streulicht und
andererseits Fluoreszenzlicht, wenn die Zelle mit einem entsprechenden Fluorochrom
(Fluoreszenzfarbstoff) markiert ist.
Die Streulichtdetektoren
Jedes Durchflusszytometer besitzt zwei Streulichtdetektoren (Englisch – „Scatter“). Der Forward
Scatter Detektor liegt in derselben Ebene wie der Laserstrahl, der Side Scatter Detektor misst
das Streulicht, dass im 90° Winkel von der Zelle gestreut wird.
ABB.3 STREULICHTDETEKTOREN. Der Forward Scatter Detektor misst das Licht, das von der Zelle in
derselben Achse wie der Laser gestreut wird, der Side Scatter Detektor misst das Streulicht, das im 90°
Winkel abgelenkt wird. Quelle: http://flow.csc.mrc.ac.uk
Streulicht entsteht, wenn einfallendes Laserlicht von der Zelle gebeugt wird. Der Forward
Scatter entsteht, wenn das Licht an der Zelloberfläche abgelenkt wird, während der Side Scatter
z.B. durch Beugung an inneren Zellmembranen (ER, Golgi Apparat), Vesikeln oder am Zellkern
entsteht.
ABB.4 FORWARD SCATTER (FSC) UND
SIDE SCATTER (SSC). FSC entsteht durch
Beugung des Lichts an der Zelloberfläche,
während
SSC
durch
Beugung
an
Membranen und Vesikeln im Zellinneren
entsteht. Quelle: http://flow.csc.mrc.ac.uk
Wenn nun eine Zelle durch den Laserstrahl wandert, wird über die Zeit am Detektor ein Signal
in Form von Spannung aufgenommen. Dieses Signal wird dann in einen Messwert am Computer
umgewandelt. Meistens verwendet man dafür die Fläche unter der Spannungskurve („area“).
Man kann aber für bestimmte Anwendungen auch die maximale Höhe der Kurve verwenden
(„peak“).
ABB.5 SIGNALUMWANDLUNG. Wenn eine Zelle durch den Laserstrahl wandert, wird das gestreute Licht
am Detektor in ein Spannungssignal umgewandelt. Die Fläche unter der Kurve („area“), oder der
maximale
Ausschlage
der
Kurve
(„peak“)
entspricht
dann
dem
Messwert.
Quelle:
http://flow.csc.mrc.ac.uk
Anhand dieses Beispiels wird auch klar, wieso der FSC proportional der Größe (eigentlich der
Oberfläche) der gemessenen Zelle ist. Das Signal am SSC Detektor hingegen hängt von der
„inneren Komplexität“ oder Granularität der Zelle ab.
ABB.6 SIGNAL AM FSC DETEKTOR. Das Signal am FSC Detektor ist proportional der Größe der Zelle.
Quelle: http://flow.csc.mrc.ac.uk
Mittels der Streulichtdetektoren können wir also schon einiges über eine Zelle aussagen. In der
Regel werden in einem Diagramm (2D Plot) der FSC auf der X-Achse gegen den SSC auf der
Y-Achse aufgetragen. Im Praktikum werden Sie sich z.B. lysiertes Mausblut ansehen (lysiert
bedeutet, dass die Erythrozyten durch Zelllyse zerstört wurden, doch dazu später mehr). Nur auf
Grund der Größe und Granularität können wir unterschiedliche Populationen an Leukozyten
(weiße Blutkörperchen) unterscheiden.
ABB.7 LYSIERTES MAUSBLUT
Über FSC (Größe) und SSC
(Granularität) können im Blut
verschiedene
Zellpopulationen
unterschieden werden.
Die Fluoreszenzdetektoren
Komplizierter wird das Ganze bei den Fluoreszenzdetektoren. Diese fangen die Signale von
Fluorochromen, die vom Laser angeregt werden und dann Licht einer höheren Wellenlänge
emittieren, auf. In der Regel sind diese Fluorochrome an Antikörper gebunden, mit denen die
Zellen vorher markiert wurden (dazu später noch mehr), genauso können jedoch auch
fluoreszierende Farbstoffe (die beispielsweise DNA binden), oder fluoreszierende Proteine, die
von den Zellen selber hergestellt werden (z.B. GFP) nachgewiesen werden.
Welche Fluorochrome verwendet werden können, hängt von der Ausstattung des Gerätes ab. So
kann mit einem bestimmten Laser nur eine begrenzte Anzahl an Farbstoffen angeregt werden.
Gute Geräte besitzen daher in der Regel mehrere Laser, damit eine größere Anzahl an
Fluorochromen gleichzeitig gemessen werden kann.
Mit einem bestimmten Laser kann man natürlich nur Fluorochrome anregen, die in dem
entsprechenden Wellenlängenbereich eine gute Absorption zeigen. Wie Sie in Abb. 8 sehen
können, kann man mit einem Argon Laser (488nm) z.B. die Farbstoffe Fluorescein (FITC),
Phycoerythrin (PE) und Peridinin-Chlorophyll (PerCP, nicht in der Grafik dargestellt) anregen, die
daraufhin grünes, oranges, oder rotes Licht emittieren. Mit dem Helium-Neon Laser (633nm)
kann man hingegen z.B. Allophycocyanin (APC) anregen.
ABB.8 FLUORESZENZ SPEKTREN. Absorptions- (weiße Kurven) und Emissionsspektren (farbige Kurven)
verschiedener Fluorochrome. Die senkrechten farbigen Linien zeigen die Anregungswellenlänge typischer
Laser: 406nm Krypton Laser, 488nm Argon Laser, 633nm Helium Neon Laser (in der Grafik ist ein 595nm
Laser dargestellt, aber der 633nm Laser ist gängiger). Grafik: BD.
Bei PerCP/Cy5.5, PE/Cy7 und APC/Cy7 handelt es sich um sogenannte Tandemkonjugate. D.h.,
dass der erste Farbstoff vom Laser angeregt wird und als Energiedonor für den zweiten Farbstoff
(Cy5 oder Cy7) dient. Diesen Energietransfer nennt man auch Energie Resonanz Transfer. Der
zweite Farbstoff emittiert dann die Energie, die er vom ersten Farbstoff erhalten hat als
längerwelliges Licht.
Das Fluoreszenz- bzw. Streulicht wird wie in Abb. 9 dargestellt im 90° Winkel von einer Linse
gesammelt und anschließend über Dichroitische Spiegel aufgeteilt. Ein Dichroitischer Spiegel
lässt Licht über (long pass) oder unter (short pass) einer bestimmten Wellenlänge durch,
während der Rest reflektiert wird. In der Abbildung wird das Licht so nach Wellenlängen auf die
verschiedenen Detektoren verteilt. Das kurzwellige Licht landet beim SSC Detektor, das „grüne“
Licht beim FL1 Detektor, das „gelbe“ bei FL2 und das „rote“ Licht beim FL3 Detektor. Vor den
einzelnen Detektoren sind noch zusätzlich Bandpassfilter installiert, die das Spektrum, das auf
den Detektor fällt, noch weiter eingrenzen. Die Bezeichnung 530/30nm eines Bandpassfilters
bedeutet, dass bei 530nm 100% des Lichts durch den Filter kann, während bei ±15nm nur 50%
des Lichts passieren kann (Abb. 10).
ABB.9 SPIEGEL UND FILTER. Über verschiedene Spiegel und Filter wird das Licht in einzelne
Wellenlängenpakete
unterteilt
und
zu
den
entsprechenden
Detektoren
geleitet.
Quelle:
http://flow.csc.mrc.ac.uk
ABB.10
BANDPASSFILTER.
Hypothetischer
Bandpassfilter. Bei der Frequenz f0 passiert 100% des
Lichts
den
Filter.
Das
Passband
gibt
den
Frequenzbereich an, bei dem noch 50% des Lichts
passiert. Bei einem 530/30nm Bandpassfilter ist 530
die f0 und 30nm das Passband.
Quelle:
http://what-when-how.com/technology-terms/back
haul-to-bandpass-filter-technology-terms/
Detektoren
Das Licht unterschiedlicher Wellenlänge fällt auf die Detektoren. Dabei handelt es sich um
Photomultiplier Tubes (PMTs), die das Lichtsignal in ein entsprechendes Spannungssignal
umwandeln. Die PMTs für die einzelnen Fluorochrome sind alle ident und können nicht
unterscheiden, welche Wellenlängen das einfallende Licht hat. Die Zuordnung der einzelnen
Spektralbereiche zu den verschiedenen Detektoren erfolgt ausschließlich über die
vorgeschalteten Spiegel/Filter.
Die Empfindlichkeit der einzelnen Detektoren kann über die Spannung, die an den PMTs
angelegt wird, gesteuert werden. Da jede Zelle eine gewisse Menge Streulicht in jedem
Wellenlängenbereich aussendet, wird man auch auf jedem Detektor immer ein Signal erhalten auch wenn die Zelle gar nicht mit dem entsprechenden Fluorochrom markiert ist. Eine
entsprechende Kalibrierung mit ungefärbten Zellen ist daher unbedingt notwendig (dazu später
mehr).
ELEKTRONISCHES SYSTEM:
Die von den PMTs gemessenen Signale werden digital umgewandelt und anschließend von
einem Computer ausgewertet. Diese „Rohsignale“ können dann weiter bearbeitet werden. Die
wichtigste Nachbearbeitung der Signale ist die elektronische Kompensation.
Kompensation
Da die optische Filter nicht alle spektralen Überschneidungen der einzelnen Fluorochrome (Abb.
11) beseitigen können, ist eine elektronische Subtraktion, die sogenannte spektrale
Kompensation nötig, um diese Fluoreszenzen zu entfernen
ABB.11 SPEKTRALER OVERLAP. Das Emissionsspektrum von FITC (grün) wird auf dem FL-1 Detektor (grau
schraffierter Bereich) aufgefangen. Ein Teil der Emission gelangt jedoch auch auf den FL-2 (A) und FL-3
Detektor (C). Umgekehrt strahlt die PE Emission (rot) auch auf den FL-1 (B) und den FL-3 (C) Detektor.
Falsche Kompensation führt zu falsch positiven oder falsch negativen Ergebnissen!
In Abb. 12 werden 3 Populationen von Latex beads dargestellt. Eine Population ist unmarkiert,
eine mit FITC markiert und eine PE markiert. Auf der X-Achse ist das Signal am FL-1 Detektor und
auf der Y-Achse das Signal am FL-2 Detektor dargestellt. Beachten Sie, dass die Signale
logarithmisch dargestellt sind. Die markierten beads leuchten also ~100mal so hell wie die
unmarkierten beads! Da die Signale ohne Kompensation dargestellt sind, erscheinen die
FITC-beads auf der Y-Achse nach oben verschoben (vgl. Abb 11 A). Umgekehrt erscheinen die
PE-beads auf der X-Achse nach rechts verschoben – wenn auch in geringerem Ausmaß (vgl. Abb
11 B). Man könnte also glauben, dass die FITC-beads auch für PE positiv sind (falsch positives
Signal). Daher muss das Signal entsprechend elektronisch kompensiert werden
ABB.12 UNKOMPENSIERTE SIGNALE. Ungefärbte sowie
FITC
und
PE
markierte
Latex
beads
sind
hier
unkompensiert dargestellt. Man sieht die Verschiebung
der Signale durch den spektralen Overlap.
Quelle: BD.
Dazu wird vom Computer von dem Signal, das auf den FL-1 Detektor fällt, ein bestimmter
Prozentsatz des Signals auf dem FL-2 Detektor abgezogen.
FL1 = FL1 – x * FL2/100
(wobei x der Prozentsatz ist)
Umgekehrt wird vom FL-2 Detektor ein Teil des Signals auf dem FL1 Detektor abgezogen.
FL2 = FL2 – y * FL1/100
Bei 6 Detektoren ergeben sich so 30 verschiedene Kompensationen (6 * 6 – 6). Da so viele
Kompensationen schwierig manuell einzustellen sind, können moderne Geräte diese Arbeit dem
Benutzer abnehmen. Sie werden diese automatische Kompensation im Praktikum kennenlernen.
Nach erfolgter korrekter Kompensation ergibt sich demnach folgendes Bild:
ABB.13 KORREKT KOMPENSIERTE SIGNALE. Durch die
elektronische
PE-markierten
Kompensation
beads
als
nur
erscheinen
PE-positiv
und
die
die
FITC-markierten beads als nur FITC-positiv.
Quelle: BD.
CD NOMENKLATUR:
Wenn man von Durchflusszytometrie spricht, denkt man meistens an Immunfluoreszenz, d.h.
den Nachweis von bestimmten (Oberflächen)-Antigenen mittels Fluorochrom-markierten
Antikörpern. Durch die ständig wachsende Anzahl an Oberflächenantigenen, auf Grund derer
bestimmte Zellarten identifiziert werden können, wurde erstmals 1982 auf dem „1st
International Workshop and Conference on Human Leukocyte Differentiation Antigens (HLDA)“
eine neue Nomenklatur zur Klassifikation von monoklonalen Antikörpern (mAbs) gegen Epitope
auf der Oberfläche von Leukozyten eingeführt, die sogenannte CD Nomenklatur. CD steht
hierbei für „Cluster of Differentiation“ oder „Antigen Cluster Designation“. Im Moment gibt es
über 300 verschiedene CD Antigene. In der folgenden Tabelle sind einige CD Antigene (plus zwei
weitere Antigene, für die es keine CD Nummern gibt) aufgelistet, gegen die Sie mit
entsprechenden Antikörpern färben werden.
Name
Zelltyp
Antigen
CD3
T-Zellen
Assoziiert mit dem Antigenrezeptor von T-Zellen
CD4
T-Helferzellen
Co-Rezeptor für MHC class II Moleküle
Monozyten (nur Mensch)
Rezeptor für gp120 von HIV-1 und HIB-2
Makrophagen (nur Mensch)
CD8
Zytotoxische T-Zellen
Co-Rezeptor for MHC class I Moleküle
CD14
Antigen präsentierende Zellen,
Co-Rezeptor für LPS
u.a. Monozyten
CD19
B-Zellen
Co-Rezeptor für den B-Zell Rezeptor
CD45
Alle hämatopoetischen Zellen
Tyrosinphosphatase
CD200R
Diverse myeloide Zellen, u.a.
Rezeptor für OX2 Glykoprotein.
Makrophagen aber auch
Aktivierungsmarker für Basophile Granulozyten
Basophile Granulozyten
IgE
B-Zell Rezeptor
Antikörper der Subklasse E
Über Fc-Rezeptoren gebunden
an verschiedene Zelltypen:
Dendritische Zellen, Mastzellen,
Eosinophile Granulozyten,
Basophile Granulozyten
Siglec F
Eosinophile Granulozyten
Lektin-Rezeptor
TABELLE.1 DIVERSE OBERFLÄCHENANTIGENE. Oberflächenantigene, gegen die im Praktikum mittels
monoklonaler Antikörper gefärbt wird.
Um Zellen, die diese Oberflächenantigene exprimieren, im Durchflusszytometer nachweisen zu
können, werden sie mit monoklonalen Antikörpern markiert. In der Regel sind diese Antikörper
direkt mit einem Fluorochrom markiert. Man kann jedoch auch unmarkierte oder biotinylierte
Antikörper verwenden. Im ersten Fall wird der Antikörper dann mittels eines sekundären
(Fluorochrom-markierten) Antikörpers nachgewiesen, im zweiten Fall durch Zugabe von
Fluorochrom-markiertem Streptavidin. Jedes Streptavidinmolekül besitzt 4 Bindungsstellen für
Biotin, daher kann es an den biotinylierten Antikörper binden. Um einen Antikörper zu
beschreiben wird zuerst die Spezies, in der er hergestellt wurde genannt, dann das Antigen
gegen das er gerichtet ist, gefolgt vom entsprechenden Label. Die Antikörper, die Sie im
Praktikum verwenden werden sind ursprünglich alle in Ratten hergestellt worden, da sie gegen
Antigene aus der Maus gerichtet sind. Eine genaue Bezeichnung würde z.B. wie folgt lauten:
Rat anti-mouse CD4 PE
D.h. dass es sich um einen Antikörper aus der Ratte handelt, der gegen das CD4
Oberflächenantigen der Maus gerichtet ist und der chemisch an Phycoerythrin (PE) gekoppelt
wurde. Um den Antikörper ganz genau zu beschreiben, muss man noch die Klonnummer
angeben, da es gegen ein und dasselbe Antigen oft unterschiedliche monoklonale Antikörper
gibt. Die Klonnummer gibt an, aus welchem Hybridom (die Zelllinie, aus der der Antikörper
gewonnen wird) der Antikörper stammt.
ABB.14 DIREKTE UND INDIREKTE FÄRBUNG VON OBERFLÄCHENANTIGENEN. Oberflächenantigene
können direkt mit einem Fluorochrom-markierten Antikörper markiert werden (A). Alternativ kann man
einen ungefärbten Antikörper verwenden, z.B. rat anti-mouse CD4 und diesen dann mit einem
Fluorochrom -markierten Antikörper aus einer anderen Spezies nachweisen (z.B. goat anti-rat IgG PE) (B).
Außerdem können biotinylierte Antikörper verwendet werden. Der Nachweis erfolgt dann über
Fluorochrom-markiertes Streptavidin, das an das an den Antikörper gekoppelte Biotin bindet (C).
FÄRBUNG VON BLUTPROBEN
Im Praktikum werden Sie verschiedene Zellpopulationen aus Mausblut analysieren. Da Blut
jedoch sehr große Mengen an Erythrozyten enthält, die bei der Analyse der Leukozyten stören
würden, müssen die Erythrozyten aus der Probe entfernt werden. Dafür gibt es u.a. zwei
verschiedene Methoden.
ABB.15 ZUSAMMENSETZUNG VON BLUT. Blut besteht zur Hälfte aus Plasma und zur Hälfte aus
zellulären Bestandteilen. Von den Zellen im Blut sind der Großteil Thrombozyten und Erythrozyten.
Thrombozyten sind so klein, dass sie bei der Analyse vom Gerät automatisch ausgeschlossen werden und
nicht weiter stören. Die Erythrozyten müssen jedoch entfernt werden.
Erythrozytenlyse mittels hypotonem Schock
Erythrozyten können aus der Probe durch Lösen der Zellen in einer hypotonen Lösung entfernt
werden. Durch die niedrige Salzkonzentration im Lysispuffer nehmen die Zellen Wasser aus der
Lösung auf und schwellen an. Während die Leukozyten die zusätzliche Wasseraufnahme
problemlos verkraften, platzen die Erythrozyten. Die Reste der Erythrozyten sind danach so
klein, dass sie in der Analyse, ebenso wie die Thrombozyten, nicht weiter stören.
In manchen kommerziellen Lysispuffern ist zusätzlich ein Fixiermittel (Glutaraldehyd) enthalten,
das die Zelloberfläche quervernetzt und damit stabilisiert (was praktisch ist, wenn man die
Zellen nicht sofort analysieren will, sondern die Probe einige Tage lagern muss). In diesem Fall
sollte die Lyse unbedingt nach der Färbung erfolgen, weil nicht alle Antikörper fixierte Antigene
binden können.
Reinigung mittels isopyknischer Dichtegradienzenzentrifugation
Eine andere verbreitete Methode zur Reinigung von Zellen aus Blut ist die Zentrifugation der
Blutprobe über einen Dichtegradienten, wie z.B. Ficoll. Ficoll ist ein ungeladenes
Sucrose-Polymer, dessen Dichte so eingestellt ist, dass Erythrozytenaggregate und tote Zellen
die Ficollschicht passieren. Granulozyten dringen in die Ficollphase ein, während Lymphozyten,
Monozyten und Thrombozyten sich in der Interphase ansammeln.
Durch eine isopyknische Zentrifugation werden Periphere mononukleare Zellen (B-Zellen,
Monozyten, NK-Zellen, T-Zellen, Thrombozyten) von Erythrozyten, Granulozyten und toten
Zellen getrennt.
ABB.16
DICHTEGRADIENTEN
ZENTRIFUGATION. Lymphozyten,
Monozyten und NK-Zellen bleiben
in der Interphase, während sich
Erythrozyten und Granulozyten
wegen ihrer höheren Dichte im
Pellet ansammeln.
Verhinderung der Blutgerinnung
Um das Gerinnen des Blutes währen der Färbung zu verhindern, kann man unterschiedliche
Antikoagulanzien verwenden. Ca++ - Blocker wie z.B. EDTA verhindern dabei die Aktivierung von
Prothrombin, während Heparin und Hirudin das Thrombin direkt hemmen. Im Praktikum
werden Sie heparinisiertes Vollblut erhalten.
ABB.17 BLUTGERINNUNGSKASKADE
IHRE AUFGABEN:
1. Laden Sie den FACS Simulator auf Ihren Laptop herunter. Er befindet sich mit anderen
Programmen in einem Archiv, das Sie auf PLUSonline unter dem Punkt LV-Unterlagen
herunterladen können. Der Simulator benötigt keine Installation und kann mit jedem
Webbrowser aufgerufen werden (wir empfehlen Firefox).
2. Arbeiten Sie die Übungsbeispiele am Simulator Punkt für Punkt durch.
3. Bereiten Sie Proben zur Kalibrierung des FACS-Gerätes vor und führen Sie die
Kalibrierung gemeinsam mit dem LV-Leiter am Gerät durch.
DURCHFÜHRUNG DES EXPERIMENTS:
FACS Simulator
1. Öffnen sie den FACS-Simulator (FACS_Simulator.html)
ABB.18 OBERFLÄCHE DES FACS-SIMULATORS.
2. Lesen Sie die Aufgabe im unteren Bedienfeld durch. Legen Sie die entsprechende Probe
ein (anwählen im „Sample“ Menü).
3. Starten Sie die Auswertung durch Klicken auf den „Acquire“ Knopf. Keine Angst, im
Gegensatz zu einer echten Probe ist Ihre virtuelle Probe unbegrenzt und Sie haben
beliebig Zeit, sich mit dem Gerät vertraut zu machen.
4. Die Acquisition rate bestimmt die Geschwindigkeit. Je nach Computer kann man so die
Geschwindigkeit der Darstellung anpassen.
5. Lassen Sie sich Zeit und „spielen“ Sie mit den Einstellungen. Wenn Sie eine Aufgabe
gelöst haben, zeigen Sie das Ergebnis dem LV-Leiter oder einem Tutor und wechseln Sie
zur nächsten Aufgabe.
Kalibrierbeads
Um die Kompensationen am Gerät automatisch einzustellen, benötigen wir entsprechende
Einzelfärbungen. So wie Sie im FACS-Simulator die Kompensationen zwischen FITC, PE, und
PerCP/Cy5.5 durchgeführt haben, werden Sie jetzt eine 6fach Kompensation durchführen. Wir
verwenden dazu Antikörper, die mit folgenden Fluorochromen markiert sind:
FITC
PE
PerCP/Cy5.5
PE/Cy7
APC
APC/Cy7
FITC und PE werden dabei vom 488nm Argonlaser angeregt und die emittierten Lichtsignale von
FITC, PE, Cy5.5 und Cy7 von vier unterschiedlichen Detektoren aufgefangen. APC wird vom
633nm Helium-Neon Laser angeregt und die Emissionen von APC und Cy7 werden auf zwei
weiteren Detektoren aufgefangen. So können 6 unterschiedliche Fluoreszenz-Signale (plus FSC
und SSC) auf einer Zelle gleichzeitig ausgewertet werden.
Für das Einstellen der Kompensation brauchen wir aber wie gesagt Einzelfärbungen. Am besten
werden die Ergebnisse, wenn man die Kompensation mit den gleichen Antikörpern durchführt,
die später auch für die Färbung verwendet werden. Das ist besonders bei den
Tandemfarbstoffen wichtig, da diese durch Dissoziation der zwei gekoppelten Farbstoffe bei
längerer Lagerung an Qualität verlieren können. Die Einzelfarbstoffe FITC, PE und APC sind recht
stabil und die Kompensationsergebnisse sind in der Regel zwischen verschiedenen Antikörpern
gut übertragbar.
Als Proben für die Kompensation kann man z.B. Zellen verwenden, die man mit den
entsprechenden Antikörpern färbt. Jedoch kann das mitunter schwierig sein, z.B. wenn man
einen Antikörper verwenden möchte, der nur einen sehr geringen Prozentsatz der Zellen färbt.
Für solche Fälle gibt es CompBeads, an die Antikörper gekoppelt sind, die gegen IgGs einer
bestimmten Spezies gerichtet sind. Da alle monoklonalen Antikörper, die wir im Praktikum
verwenden, aus der Ratte stammen, verwenden wir CompBeads, die mit anti-rat IgG
Antikörpern gekoppelt sind.
ABB.19 COMPBEADS. CompBeads
sind kleine Polystyrene Kügelchen,
an
deren
Antikörper
Beispiel
Oberfläche
gekoppelt
gegen
anti-IgG
sind
rat-IgG).
(im
Diese
können schnell und unkompliziert
mit
beliebigen
Antikörpern
der
entsprechenden Spezies beladen
werden.
1. Pipettieren Sie jeweils 20µL anti-rat CompBeads in sechs 1.5mL Reaktionsgefäße (pro
Farbe ein Reaktionsgefäß).
2. Pipettieren Sie 50µL ControlBeads in ein siebtes 1.5mL Reaktionsgefäß (Das sind
einfache Polystyrene Beads ohne gekoppelten Antikörper. Wir brauchen sie später um
die Detektoren einzustellen).
3. Pipettieren Sie jeweils 20µL der bereits vorbereiteten Antikörperlösungen zu den 20µL
CompBeads und mischen Sie gründlich. Die vorbereiteten Antikörper sind:
a. Anti-mouse CD4 APC/Cy7
b. Anti-mouse CD8 FITC
c. Anti-mouse CD14 APC
d. Anti-mouse CD19 PE/Cy7
e. Anti-mouse CD45 PerCp/Cy5.5
f.
Anti-mouse Siglec-F PE
g. Die Antikörper sind bereits 1:160 in FACS-Buffer (FB) verdünnt. Durch die
Zugabe von 20µL verdünntem Antikörper zu 20µL CompBeads erhalten Sie eine
Endverdünnung von 1:320.
4. Pipettieren Sie 20µL FB zu den ControlBeads und mischen Sie gründlich.
5. Inkubieren Sie 10min bei Raumtemperatur (RT)
a. Die Antikörper binden jetzt an die CompBeads.
6. Geben Sie zu jeder der 7 Proben 500µL FB zu und mischen Sie (waschen).
7. Zentrifugieren Sie die Proben 30 Sekunden bei 13.000 rpm.
8. Heben Sie vorsichtig den Überstand ab.
ABB.20
ÜBERSTAND
Pipettieren
Sie
ABHEBEN.
vorsichtig
den
Überstand ab, ohne das Pellet
aufzusaugen.
Das Pellet ist sehr klein (kleiner als
in der Abbildung)!
Quelle: http://openwetware.org
9. Resuspendieren Sie das Pellet in 150µL FB.
10. Gehen Sie mit ihren Proben zum LV-Leiter, um sie am Gerät auszuwerten.
Erstellen der Kompensationssettings
Gemeinsam mit dem LV-Leiter erstellen Sie am Gerät die Kompensationssettings mit Ihren
Proben. Ihre Settings werden gespeichert, mit diesen Settings werden Sie in den nächsten Tagen
ihre echten Proben analysieren.
MATERIAL-LISTE:
GERÄTE:
Kolbenhub-Pipetten, einstellbar für Maximal-Volumina von 1000, 200 und 20µL.
1.5mL Reaktionsgefäße
Verdünnte Antikörperlösungen (Anti-mouse CD4 APC/Cy7, Anti-mouse CD8 FITC, Anti-mouse
CD14 APC, Anti-mouse CD19 PE/Cy7, Anti-mouse CD45, PerCp/Cy5.5, Anti-mouse Siglec-F PE)
jeweils 1:160 in FACS-Buffer
Anti-rat CompBeads
ControlBeads
Zentrifuge
FACS Canto II Durchflusszytometer
LÖSUNGEN:
FACS Buffer
1% BSA, 2mM EDTA in PBS