Kein Folientitel - Erlangen (Hans

Konzepte der Immunologie
für Naturwissenschaftler
(MOLIM-S1)
SS 2007
Humorale Immunität
(Antikörper – Methoden & Anwendungen)
Prof. Hans-Martin Jäck
Abteilung für Molekulare Immunologie
an der Medizinischen Klinik III
Nikolaus-Fiebiger-Zentrum
Tel.:
09131-8535912
E-Mail:
[email protected]
1
HUMORALE IMMUNITÄT
SS 2005
Thema 2:
Antikörper - Anwendungen
• Ak/Ag-Reaktionen
• Gewinnung spezifischer AK
• Anwendungen – Diagnostik & Forschung
• Anwendungen – Therapie
Prof. Dr. Hans-Martin Jäck
Abteilung für Molekulare Immunologie
an der Medizinischen Klinik III
2
Antikörper sind bifunktional
VH
CH1
VL
CL
CH2
CH3
•
Variable Region der H- und L-Kette
definiert die Spezifität
•
Konstante Region der H-Kette
bestimmt die biochemischen
und
biologischen
Eigenschaften (Effektorfunktion)
3
Antikörper – Antigenreaktionen
Hypervariable (HV) Regionen (oder CDRs) der H- und
L-Kette bilden das Paratop
Epitop – Bindungsstelle im Ag
Paratop – Bindungsstelle im AK
HV3 (CDR3)
HV1 (CDR1)
HV2 (CDR2)
Aus Janeway: Immunobiology
4
Wechselwirkungen
Wasserstoffbindungen
Brückenbildung zwischen Sauerstoff- oder
Stickstoffatomen von Antigen und
Antikörper (Ag-O - H - O-Ak oder Ag-N - H
- N-Ak)
Elektrostatische Kräfte
entstehen, wenn sich positive und negative
freie Ladungen auf Antigen und Antikörper
gegenüber liegen
Van der Waals-Kräfte
resultieren aus der Interaktion zwischen
Elektronenwolken (Dipole)
Hydrophobe Wechselwirkungen
basieren auf einer Verdrängung von WasserMolekülen durch apolare, hydrophobe
Gruppen (aromatische Aminosäuren). Diese
Bindungsart kann bis zu 50% der
Bindungskräfte ausmachen.
5
Nieder- und hochaffine Antikörper
Anziehungskräfte wirken nur über sehr kleine Distanzen
Antigenbindungsstelle
des Antikörpers
Antigenbindungsstelle
des Antikörpers
Epitop des Antigens B
Epitop des Antigens B
kD = 10-8 Mol-1
kD = 10-5 Mol-1
6
Antigene – Definitionen und Struktur
Antigen (Antikörper generierend)
Jede Substanz, die an einen Antigenrezeptor
bindet. Antigenrezeptoren sind Immunglobuline
und T-Zellrezeptoren
B-Zell-Epitope
Konformationsepitop
Lineares
Epitop
NeoEpitop
Immunogen
Substanz, die nach Injektion oder Infektion eine
Antikörperantwort auslöst
• Gut: Proteine und Kohlenhydrate
• Schwach: DNA, Lipide, kurze Polypeptide
• Negativ: Aminosäuren, Haptene
Hapten (Halbantigen)
Kleines chemisch synthetisiertes Molekül, das an
Rezeptor bindet, alleine aber keine
Immunantwort auslöst. Immunogen nach
Kopplung an Trägerprotein
Epitop bzw. immunogene
Determinante
Der Bereich eines Immunogens, der mit dem
Antikörper interagiert (bei Proteinen: 6-8
Aminosäurereste)
Aus: Kuby, Immunology
7
B-Zell-Antigene - Einteilung
•
Nach Herkunft
 Natürlich (Proteine, Kohlenhydrate, Nukleinsäuren, bakt. Toxine, Zellen)
 Synthetisch (Haptene, Polypeptide)
•
Nach chemischen Gesichtspunkten






•
Proteine
Kohlenhydrate
Nukleinsäuren
Konjugierte Proteine (Hapten-Protein)
Polypeptide
Lipide
Nach genetischer Beziehung zwischen Spender und Empfänger




Autoantigen
Isoantigen
Alloantigen
Xenoantigen
-
aus dem zu immunisierenden Individuum
aus einem genetisch identischen (syngenen) Spender (Inzuchtmäuse)
aus einem nichtverwandeten Spender derselben Spezies (Bl6, Balb/c)
aus einem Spender einer anderen Spezies
8
Vergleich von B-Zell- und T-Zellepitopen
TZR
Aus Janeway
MHC I
BZR
Antigenprozessierung
und
-präsentation
MHC II
Ag
9
Affinität und Avidität
AFFINITÄT
• Maß für die Stärke der Wechselwirkung
zwischen einer Ag-Bindungsstelle
(Paratop) auf dem AK und einem
Epitop auf dem Antigen
• Gute Affinität:
ka = 10-8 - 10-10 M-1
• Mittlere Affinität:
ka = 10-5 - 10-7 M-1
AVIDITÄT
• Maß für die Stärke, mit der ein
bivalenter Antikörper an ein intaktes
polyvalentes Antigen (z.B. Bakterien
und Viren) bindet
• Größer als Affinität
http://www-immuno.path.cam.ac.uk/~immuno/part1/
lec06/lec6_97.html
10
Avidität (eine weitere Erklärung)
“Natürliche Antigene, wie beispielsweise Viren
oder Bakterien besitzen viele gleiche AntigenDeterminanten auf ihrer Oberfläche. Wenn ein
multivalentes Antigen sich mit mehr als einer
Fab-Region des Antikörpers verbindet, ist die
entstehende Bindungsenergie beträchtlich
grösser als die Summe der beteiligten
Einzelbindungen,
da
sämtliche
Ag-Ak
Bindungen gleichzeitig aufgebrochen werden
müssen, wenn Ag und Ak sich wieder trennen
sollen. Falls eine Fab-Stelle loslässt, ist die
Wahrscheinlichkeit, dass eine andere FabRegion des Ak gerade gebunden ist, recht
gross, was die Bindungsstärke mehr als nur
verdoppelt. Die Kraft, die ein solcher
multivalentes Ag mit einem multivalenten Ak
bindet nennt man Avidität, sie ist, wie in der
Abbildung dargestellt zwischen 103 und 107
mal stärker als die entsprechende Affinität.
Unter physiologischen Bedingungen spielt die
Avidität eine wichtigere Rolle, im Labor findet
jedoch die Affinität häufiger Verwendung”.
Quelle: leider verloren gegangen
11
Gewinnung spezifischer Antikörper
Immunisierung von Labortieren mit Antigenen
 Polyklonale Antiseren
 Heterogenes Gemisch von Antikörper, die verschiedene Epitope auf dem Immunogen erkennen
 Immunisieren von Tieren mit Antigen in komplettem
Freunds Adjuvans [besteht aus Mineralöl (→ Depotwirkung)
und
abgetöteten
Tuberkelbazillen→(unspezifische Aktivierung von DZ u. MF)]
 Immunisierungen
(Boosts)
werden
mehrmals
wiederholt
 Monoklonale Antikörper
 homogener Antikörper, der nur ein Epitop auf dem
Immunogen erkennt
 Immunisierung von Maus, Ratte, Hamster, Kaninchen
oder (Mensch)
 Generierung von Hybridomen
12
Hybridomatechnik: Gewinnung monoklonaler Antikörper
(Köhler und Milstein, 1976, Nobelpreis 1984)
Milz-B
HGPRT +
Ig+
sterblich
Myelom
PEG
HGPRT Igunsterblich
Aminopterin blockiert De Novo
Purin- und Pyrimidinsynthese
De Novo
Salvage Pathway
Thymidin
Hypoxanthin
B-Zell/Myelom-Hybrid
HAT-Medium:
Hypoxanthin,
Aminopterin,
Thymidin
Aminopterin
Ig+
HGPRT +
unsterblich
Thymidinkinase
(TK+)
HypoxanthinGuaninPhosphoribosyltransferase
(HGPRT+)
Nukleotide
Aus Kuby
DNA, RNA
13
Antikörper gegen Immunglobuline
Durch Immunisieren z.B. eines Kaninchens mit gereinigtem Maus-IgM aus einer weißen Maus =
BALB/c wird die Produktion folgender Kaninchen-Antikörper induziert.
BALB/c
BALB/c
C57Bl/6
Anti-isotypische AK
Anti-allotypische AK
Anti-idiotypische AK
(gegen Epitope in C-Regionen
der H- und L-Kette)
(gegen ein bestimmtes Epitop
In C-Region)
(gegen Epitope in V-Regionen
der H- und L-Kette)
Gegen verschiedene
AK-Klassen (iso)
Gegen verschiedene Formen
eines bestimmten AK (allo)
Gegen eine bestimmte
(private= idio) Form
eines AK
Die konstante Region der mH-Kette aus einer BALB/c-Maus (weiß) und
einer C57Bl/6-Maus (schwarz) unterscheidet sich in einer Aminosäure 
verschiedene Allotypen codiert durch Varianten desselben Gens bzw.
Allels)
14
Aus Janeway:
Immunobiology
Antikörperphagen
B-Zellen
aus immunisiertem
oder
nicht-immuninisiertem
Tier
Klonierung in
Phagenvektor
PhagenantikörperBücherei
Isolierung durch
Panning

Isolierung von VH und VL-DNA-Fragmenten aus B-Zellen mittels PCR

Klonierung der VH- und VL-Fragmente in Bakteriophagen-Vektoren

Transformation in E.coli

Isolierung spezifischer Antikörperphagen mittels Affinitätschromatographie oder ‚Panning‘ an
immobilisiertem Antigen
15
Pepsinverdau
F(ab’)2
Rekombinant in E.coli, Hefe und
Insekten- bzw. Säugetierzellen
Papainverdau
Fab
Bispezifischer
IgG-Antikörper
Rekombinante
Manipulation
CH3
Natürlich
vorkommender,
monospezifischer
IgG-Antikörper
CH2
Antikörper und Antikörper (Ak)-Fragmente
Fd
scFv
(Fragment of
Domains)
(Single-chain Fragment
of Varibale regions)
Diabody
16
Humanisierte Maus-Antikörper
Murine VH-Region
Muriner Ak
Chimärer Ak
Humaner Ak
Humanisierter,
chimärer Ak
Sequenzen des Paratops (Hypervaribale Region = CDR) im humanen
Ak werden rekombinant durch
entsprechende Sequenzen aus
Maus-Ak ersetzt
Chimäre - feuerspeiendes Ungeheuer aus der griechischen
Mythologie mit dem Kopf eines Löwen, dem Körper einer
Ziege und dem Schwanz eines Drachen.
17
Anwendungen von Antikörper in
Forschung und klinischer Diagnose
o Nachweis und Quantifizieren löslicher Moleküle
o Nachweis intrazellulärer und membrangebundener Proteine auf
Einzelzellniveau
o Nachweis und Quantifizierung von Zellpopulationen innerhalb einer
Zellsuspension
o Nachweis sezernierender Zellen
o Anreicherung und Isolierung definierter Zellpopulationen
o Proteinreinigung und Untersuchung von Proteinkomplexen
o Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen
18
Nachweis und Quantifizierung löslicher Moleküle
In Lösung: Heidelberger Titrationskurve
Antikörper-Konzentration
Antigen-Konzentration
Menge der Ak-Ag-Komplexe
Aus Janeway: Immunobiology
19
Im Gel: Doppelimmundiffusion nach Ouchterlony
Prinzip:
Beispiel:
Antigen und Antiserum werden in Vertiefungen in der Agarmatrix pipettiert
Antigen
Antikörper
Agarmatrix
Ag1 und Ag 3 haben
keine gemeinsamen
Epiotope, i.e., sie
sind verschiedenen
Präzipitatslinie
Anfärben
Ag1 und Ag 2 besitzen
identische Epiotope
Aus Janeway: Immunobiology
20
Radialer Immundiffusionstest (nach Mancini)
Präzipitationsring
Ak
Ag
Ag
Ak
Durchmesser
• Quantitativer Nachweis von Antigenen
(z.B. Serum IgG)
• Antikörper wird in Agar eingegossen
• Antigen wird in Vertiefung gegeben
Diffusion des Antigens
• Äquivalenzpunkt => Präzipitation
• Durchmesser des Präzipitationsrings
~ Konzentration
• Mitführen eines Ag-Standard
• Bestimmung der Ag-Konzentration aus
Eichkurve
21
Nachweis und Quantifizierung löslicher Moleküle
ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)
Qualitativer und quantitativer Nachweis löslicher Moleküle
direkt
mit spez. AK
„capture“
indirekt
Enzym
Antigen
H
H O
N
H
H2O2
2 H2O
O
N H
22
Übliche Enzyme
Alkalische Phosphatase (AP)
O-
O-
+ H2O
O
O
P
N+
O
OH
+
N+
O
O-
O-
O
P
OH
O-
OOH-
gelb
farblos
Meerrettich-Peroxidase (Horseradish peroxidase = HRP)
H
H
O
N
O
farblos
N
H
H
H2O2
2 H2O
Konjugiertes P-Elektronensystem ➙ farbig
23
Schwangerschaftsnachweis durch Agglutinationsinhibition
HCG
• human chorionic gonadotropin
Humanes Chorion-Gonadotropin
• Schwangerschaftshormon
• Wird zuerst von Blastozyste, dann von
Plazenta gebildet
• Kann bereits 6-15 Tage nach der
Befruchtung im Urin nachgewiesen werden
• Verantwortlich für morgentliches Erbrechen
Kein HCG
Im Urin
HCG
Im Urin
 nicht schwanger
 schwanger
Aus Janeway
24
Blutgruppennachweis durch Hämagglutinationsreaktion
Agglutination:
Verklumpung korpuskulärer
Bestandteile durch Anti-körper
Aus Janeway
25
Nachweis von Antigenen in und auf Zellen
 Photoimmunfluoreszenz
 Durchflusszytometrie
 Analyse eines Antigens auf Einzelzellbasis
26
Photoimmunfluoreszenz
+ AK
Fluorochrom
Aus Janeway: Immunobiology
AK
Zelle
+ irrelevanter AK
(FITC)
27
Durchflusszytometrische Analyse von Proteinen
auf der Oberfäche von Zellen
z.B.: Nachweis von CD8- und CD4-positiven T-Zellen in der Milz
Granularität
Aus Janeway, Immunobiology
FITC-anti-CD4
PE-anti-CD8
Grün
(Düse)
Rot
Zellgöße
Granularität
Photozellen
Zellgöße
28
Durchflusszytometrie und FACS
 FACS steht für Fluorescence activated cell sorting und beschreibt ein
Verfahren, das in der Biologie und in der Medizin zur Anwendung kommt.
Der Ausdruck "FACS" ist eine geschützte Handelsmarke der Firma Becton
Dickinson. Der Name ist eigentlich irreführend, da meist keine Sortierung
vorgenommen wird, sondern nur eine Messung der Eigenschaften von
Zellen
 Die allgemeine Bezeichnung des Verfahrens lautet Durchflusszytometrie.
 Das Prinzip der Untersuchung beruht auf der Emission von optischen
Signalen seitens der Zelle, wenn diese einen Laserstrahlpassiert.
29
Durchflusszytometrische Analyse von Proteinen
auf der Oberfäche von Zellen
z.B.: Nachweis von CD8- und CD4-positiven T-Zellen in der Milz
200
PE anti-CD4
100
50
0
0
10
Rot
Granularität
Zellgöße
2
10
FL2-H
3
10
4
10
0
10
1
10
2
10
FL1-H
3
10
4
10
Fluoreszenzintensität = FI ()
Dotplots
Grün
1
10
FI (PE anti-CD4)
Aus Janeway, Immunobiology
PE-anti-CD4
100
50
0
FITC-anti-CD8
FITC anti-CD8
150
Count
Zellzahl
Count
150
Histogramm
200
FI (FITC anti-CD8)
30
Quantitativer Nachweis sezernierender Zellen
 Jerne-Plaque-Assay
 Durchflusszytometrie
 Elispot-Assay
 Bestimmung der Frequenz sezernierender Zellen
31
Hemolytischer (Jerne) Plaque Assay
(N. Jerne, A. Nordin & C. Henry)
Bestimmung der Frequenz AK-sezernierender Plasmazellen in einer Milzzellkultur
Plasmazelle
SRBC:sheep red blood cells
PFC: plaque-forming units
Aus Kuby, 4th edition
32
Nachweis sezernierender Zellen mittels der Elispot-Technik
Bestimmung der Frequenz Zytokin-sezernierender Milzzellen vor und nach Stimulierung
Aus Janeway 4th edition
-
+
Animation unter: http://www.elispot-analyzers.de/english/elispot-animation.html
33
Durchflusszytometrischer Nachweis sezernierender Zellen
Beispiel: Nachweis Zytokin-produzierender T-Zellpopulationen
(Assay nach Milteny Biotech)
PE
•
Zellen werden mit IFN-γ Catch-Reagent
beladen
•
Zellen werden stimuliert  IFN-g wird
sezerniert und von IFN-g-Catch
abgefangen
•
Gebundenes IFN-g wird mit Fluorochrom
-konjugierten (PE) anti- IFN-g -Ak
inkubiert
•
Zellen können durchflusszytometrisch
analysiert
•
Alternativ können Zellen mit magnetisierbaren anti-PE-Ak behandelt und
IFN-g sezernierende Zelle magnetisch
ange-reichter werden
(PE anti-IFNγ)
34
Isolierung definierter Zellpopulationen
Durchflusszytometrsiche Methode
(FACS)
Magnetische Methode
(MACS)
Sortierung von Zellen anhand von Oberflächenproteinen
Aus Janeway: Immunobiology
35
Anreicherung sezernierter Zellen mittels der
FACS- oder MACS-Technik
Beispiel: Anreicherung Zytokin-produzierender T-Zellpopulationen
(nach der FACS/MACS-Methode von Milteny Biotech)
Magnetisierbare
anti-PE-AK
• Zellen werden mit IFN-γ Catch-Reagent
beladen
• Zellen werden stimuliert  IFN-g wird
sezerniert und von IFN-g-Catch
abgefangen
• Gebundenes IFN-g wird mit Fluorochrom
-konjugierten (PE) anti- IFN-g -Ak
inkubiert
• Zellen können durchflusszytometrisch
analysiert
• und gleichzeitig durchflusszytometrisch
sortiert werden
• Alternativ können Zellen mit magnetisierbaren anti-PE-Ak behandelt und
IFN-g sezernierende Zelle magnetisch
ange-reichter werden
36
Proteinaufreinigung und Analyse von
Proteinkomplexen
Aufreinigung von Proteinen mittels Affinitätschromatographie
Aus Janeway: Immunobiology
37
Immunpräzipitation metabolisch radioaktiv-markierter Polypeptide
1. Zellkultur-Überstand
2. Zell-Lysat
St
Metabolische Markierung
IgM-produzierende
Zellen
1
2
kD
200
97
m
66
45
31
Anti-mH-Ak
k
Autoradio- oder
Fluorogramm
Aus Janeway: Immunobiology
38
Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen mittels einer
kombinierten Immunpräzipitations-/Westernblotanalyse
Versuch: Untersuchung des Einflusses einer IgL-Kette auf die Interaktion einer IgH-Kette
mit dem Chaperon BiP
Zelllysate aus H+ und H+L+ Plasmalinie
mHL mH
Zelllinie
Elektrophorese
IP: anti-IgH
antiIgH
(1)
Elektrotransfer
antiBiP
(2)
SDS-Polyacylamidgel
IgH
Enzymkonjugierte
Sekundärantikörper
BiP
Membran
39
Anwendungen von AK in der Therapie
o Immundefizienz
o Entzündung
o Autoimmunität
o Infektion
o Krebs
40
Modifizierte Antikörper als Virus- bzwTumortherapeutika
Tumor- oder
HIV-infizierte
Zelle
Tumorantigen oder
Virales Hüllprotein
kill
Immunotoxin
oder
TZR
KillerT-Zelle
nativer AK
kill
Bispezifischer
Antikörper
Toxin/
Isotop
Retuximab
Anti-CD20 AK
(B-Lymphome)
(http://www.prolife.de/
aktuelles/38.html)
41
Wirkmechanismen therapeutischer Antikörper
4. Transport
zytotoxischer
Substanzen
3. Komplementabhängige
zell-vermittelte
Zytotoxizität (CDC)
5. Blockieren
2. Antikörper-abhängige
zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC)
Promotionsvortrag 2007
Dr. Michael Schwemmlein
FAU Lehrstuhl für Genetik
1. Signalisieren
42
Katalytische Antikörper (Abzyme)
(Richard Lerner, San Diego, 1986; Peter Schultz, Berkely 1986)
Conventional
Antibody
Binds antigen but
does not cleave
Is "used" up during
reaction
Catalytic Antibody
Binds antigen and cleaves it
Is regenerated after reaction
43
Periodatoxidation von p-Nitro-Toluol-methyl-Sulfid zu Sulfoxid
Instabiler Übergangszustand
Hapten
(Stabiles Analog zum
Übergangszustand)
Aminophosphonsäure
L.C.Hsieh-Wilson, P.G.Schultz, and R.C.Stevens. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:5363-5367 (1996).
44
Enzymatische Spaltung und Inaktivierung von Kokain
(Landy and coworkers, New York 1993)
H C
3
O
O
N
OCH 3
O
H 3C
N
O
O
OCH 3
O
H 3C
O
N
HO
OCH 3
OH
O
+
C
HO
HO
Cocaine
(active)
Unstable
Transition State
Cleavage Products
(inactive)
O
H C
3
N
OCH 3
O
O
P
HO
Stable Transition
State Analog
45