Separation der Blutzellen
Werbung
Separation der Blutzellen Isolation der mononuklearen Zellen aus dem Blut: Präparation des Blutausstrichs, Cytopreps und der Anfärbung Universität Pécs, Fakultät für Medizin Institut für Immunologie und Biotechnologie Der Blutausstrich Blutausstriche von EDTA-Venenblut müssen innerhalb von 2 - 4 Stunden angefertigt werden, da man später häufig Abbauformen und atypische Zellen antrifft. 1-2 Tropfen auf das äußere Drittel eines entfetteten Objektträgers geben: Einen zweiten entfetteten Objektträger (oder ein Deckgläschen) mit der schmalen Kante in der Mitte des ersten Objektträgers aufsetzen und im Winkel von 45 - 60° an den Bluttropfen heranführen, bis sich dieser an der Kante gleichmäßig verteilt hat: Den zweiten Objektträger im Winkel von 15 - 40° über den ersten hinwegschieben. Das anhängende Blut wird so gleichmäßig aufgestrichen. Je kleiner der Ausstrichwinkel und je langsamer man ausstreicht, um so dünner wird der Ausstrich Der Blutausstrich Die Aufteilung der Lymphozyten im menschlichen Blut 15% NK -Z e 10% l l en B n lle e -Z 45% 28% 75% T -Zellen Isolation der mononuklearen Zellen aus dem Blut I 1. Methoden, die auf physikalischen Parametern basieren: - Filtration (wegen verschiedener Größe der Blutzellen) - Zentrifugation ( wegen verschiedener Sedimentationskonstanten der Blutzellen) 2. Methoden, die auf der Leukozytenadhärenz basieren: -Nylonwatte: Monozyten, B-Zellen Adhäsion; T-Zellen keine Adhäsion -Plastik- oder Glasoberfläche: Adhäsion von Monozyten (Anreicherung), und Beseitigung von Lymphozyten Verteilung von Leukozyten – Dichtegradiente - Zentrifugation Ficoll-Dichte 1.077 Trennung der mononuklearen Zellen 1. Frisches Blut (Gerinnung mit Heparin oder EDTA gehemmt) wird in PBS (1:1 Verhältnis, gebrauchsfertig) verdünnt 2. Blut wird vorsichtig auf die Ficoll-Hypaque - Lösung gefüllt (überschichtet), 2 ml Ficoll – 4 ml verdünntes Blut 3. Zentrifugieren des Röhrchens bei 900g 20 Min, RT 4. Aufnehmen der mononuklearen Zellschicht durch das Serum mit einer Pipette 5. Leukozyten werden mit PBS verdünnt (1:3) und dann bei 500 g 10 Min. zentrifugiert. 6. Das Pellet wird in 5 Tropfen PBS aufgelöst 7. Davon werden Cytopreps gemacht 900 g 20 min 500 g 10 min Leukozytenseparation durch Dichtegradienten • Ficoll: – Saccharosepolymer – Dichte = 1.077 g/ml – entwickelt für die Isolation von Lymphozyten aus peripherem Blut • Percoll – PVP-beschichtete Silicapartikeln bilden einen isoosmotischen Gradienten 1.0 – 1.3 g/ml – geeignet für Zellseparation Percoll -Gradientenzentrifugation Blut auf Percoll Serum Supernatant Mononukleare Zellen Percoll Erythrozyten Pellet Zentrifugierung Cytoprep von isolierten mononuklearen Zellen Isolation der mononuklearen Zellen vom Blut II 3. Separationsmethoden basierend auf Zelloberflächenstrukturen: - Rosette: Bindung zwischen CD2-Molekül humaner T-Zellen und Rotblutzellen des Schafes (SRBC) -Immunrosette mit Antikörper-beschichteten SRBC (zelloberflächenspezifische Antikörper) -Immunrosette mit Antikörperkomplex, (Antikörperkombination von zelloberflächenspezifischen-und RBK-spezifischen Antikörpern) - Paramagnetische Kügelchen (MACS) - Zellaffinitätschromatographie - FACS - Immunopanning - Antikörper-beschichtete Plastikoberfläche - Komplementvermittelte Zellenlyse - Elimination der durch Antikörper markierten Zellen durch das Komplementsystem Schematische Abbildung der Immunrosette Affinitätschromatographie Immunopanning 1. Zelloberflächenproteinspezifische Antikörperbeschichtete Petrischale 2. Spezifische Bindung zwischen Zellen und Antikörpern Komplementvermittelte Zellenlyse Zellseparation mit Antikörperbeschichteten magnetischen Körperchen (MACS) Zellseparation mit Durchflusszytometrie I: auf Größe und Granularität basierend Zellseparation mit Durchflusszytometrie II: mit fluoreszenten Molekülen konjugierte Antikörper May-Grünwald-Giemsa-Färbung 1, Trocknen der Blutausstriche, Cytopreps. 2, Fixierung mit May-Grünwald-Lösung 3 Min. 3, Verdünnen der May-Grünwald-Lösung mit destilliertem Wasser, Färben 1-3 Min. 4, Vorsichtiges Waschen der Ausstriche, Cytopreps mit destilliertem Wasser 5, Färbung mit Giemsa-Lösung 20 Min. Die Blutausstriche und Cytopreps dürfen nicht austrocknen, es soll genug Färbelösung auf der Probe sein!
