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Universitätsklinikum Ulm Klinik für Kinder- und Jugendmedizin Ärztlicher Direktor Prof. Dr. K.-M. Debatin Rolle des PI3K-Signalweges bei der Regulation von Todesrezeptor-induzierter Apoptose in Neuroblastomzellen Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm Maxi Schneider geboren in Neustadt am Rübenberge 2009 Amtierender Dekan: Prof. Dr. Klaus-Michael Debatin 1. Berichterstatter: Prof. Dr. Simone Fulda 2. Berichterstatter: Prof. Dr. Klaudia Giehl Tag der Promotion: 24.06.2010 Inhaltsverzeichnis I Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis ......................................................................................................... I - II Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................ III - VI 1 Einleitung .................................................................................................................. 1 - 16 1.1 Tumore und Kanzerogenese................................................................................... 1 1.1.1 Kanzerogenese ...................................................................................... 1 1.1.2 Neuroblastom........................................................................................ 2 1.2 Apoptose ................................................................................................................ 4 1.2.1 Apoptose-Signalwege ........................................................................... 5 1.2.2 Regulation von Apoptose...................................................................... 6 1.2.3 Resistenzmechanismen gegenüber Apoptose ....................................... 9 1.3 Überlebenssignalwege.......................................................................................... 10 1.3.1 PI3K/Akt-Signalweg........................................................................... 10 1.3.2 Bedeutung des PI3K/Akt-Signalweges für die Apoptose im Neuroblastom ..................................................................................... 12 1.3.3 Inhibitoren des PI3K/Akt-Signalweges .............................................. 13 1.4 Fragestellung und Ziel der Arbeit ........................................................................ 16 2 Material und Methoden ......................................................................................... 17 - 28 2.1 Material ................................................................................................................ 17 2.2 Methoden ............................................................................................................. 22 3 Ergebnisse .............................................................................................................. 29 – 50 3.1 Inhibierung von PI3K sensitiviert Neuroblastomzellen für Todesrezeptor-induzierte Apoptose .................................................................... 29 3.2 Inhibierung der PI3K supprimiert das Langzeitüberleben von SH-EP Neuroblastomzellen nach TRAIL-Behandlung ...................................... 35 3.3 Inhibierung von PI3K sensitiviert SH-EP Neuroblastomzellen für TRAIL-induzierte Caspasenaktivität .................................................................. 36 Inhaltsverzeichnis II 3.4 PI-103 sensitiviert SH-EP Neuroblastomzellen für einen TRAIL-induzierten Verlust des mitochondrialen Membranpotentials ............... 43 3.5 Effekt der Kombinationsbehandlung von TRAIL und PI-103 auf Apoptose-regulierende Proteine in SH-EP Neuroblastomzellen ........................ 45 3.6 Inhibierung von PI3K in Kombination mit TRAIL reduziert die Viabilität von SH-EP Neuroblastomzellen ......................................................... 47 3.7 Inhibierung von mTOR sensitiviert SH-EP Neuroblastomzellen nicht für TRAIL-induzierte Apoptose................................................................. 48 3.8 PI-103 hemmt die Phosphorylierung von Akt und S6 ribosomalem Protein in LAN5 Neuroblastomzellen................................................................. 49 4 Diskussion............................................................................................................... 51 – 59 4.1 PI3K als Zielmolekül zur Sensitivierung von Neuroblastomzellen für Todesrezeptor-induzierte Apoptose .............................................................. 51 4.2 Bedeutung von TRAIL und Analoga in der Tumortherapie.............................. 55 4.3 Bedeutung des PI3K-Signalweges im Neuroblastom........................................ 57 5 Zusammenfassung ......................................................................................................... 60 6 Literaturverzeichnis ............................................................................................... 61 - 77 Abbildungsverzeichnis ........................................................................................ VII - VIII Danksagung....................................................................................................................... IX Abkürzungsverzeichnis III Abkürzungsverzeichnis Abb Abbildung AIDS Acquired immune deficiency syndrome ALL Akute lymphatische Leukämie AML Akute myeloische Leukämie Apaf-1 Apoptosome-associated factor-1 APS Ammoniumpersulfat ATP Adenosintriphosphat Bax Bcl-2-associated X protein BCA Bicinchoninsäure Bcl-2 B cell lymphoma-2 BDNF Brain derived neurotrophic factor Bid BH3-interacting death domain agonist BSA Bovine serum albumin C Celsius Caspase Cystein-dependent aspartate-specific protease CD Cluster of differentation CFA Colony forming assay CMX Carboxymethyldethia-Coenzym A CO2 Kohlenstoffdioxid CREB Cyclin AMP-response element-binding protein DAPI 4', 6-Diamidino-2-phenylindol DD Death domain DISC Death-inducing-signaling-complex DMEM Dulbecco's modified eagle's medium DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure DTT Dithiothreitol EBPI Eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1 ECL Enhanced Chemiluminescence EGF Epidermal growth factor elF4E Eukaryotic inititation factor 4 Abkürzungsverzeichnis ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay et al. und andere FACS Fluorescence activated cell sorting FADD Fas-associating death domain protein FCS Fetales Kälberserum FGF Fibroblast growth factor FKHR Family of Forkhead transcription factors FKHRL1 Forkhead transcription factor like 1 Flip FLICE Inhibitory Protein (FADD-like apoptosis regulator) FSC Forward-Scatter GDNF Glial cell line-derived neurotrophic factor g Gramm h Stunde HIV Human immunodeficiency virus H2O Wasser HRP Merrettich-Peroxidase IAP Inhibitor of apoptosis protein IGF Insulin-like growth factor IGFR Insulin-like growth factor receptor IgG Immunglobulin G IKK I kappa B kinase INPC International Neuroblastoma Pathology Classification INSS International Neuroblastoma Staging Systems IRS Insulin receptor substrate kDa Kilodalton, relative Molekülmasse l Liter LDH Laktatdehydrogenase M mol/l m milli µ mikro min Minute ml Milliliter MMP Mitochondriales Membranpotential mTOR Mammalian target of rapamycin IV Abkürzungsverzeichnis mTORC1 mTOR complex 1, raptor mTORC2 mTOR complex 2, rictor Mcl-1 Myeloid cell leukaemia-1 MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid NFκB Nuclear factor-kappa B ng Nanogramm NSLCL non-small cell lung cancer N-Typ Zellen Zellen neuronalen Ursprungs PAGE Polyacrylamid Gelelektrophorese PBS Phosphate buffered saline PBST Phosphate buffered saline tween PDGF Platelet derived growth factor PDK-1 3-phosphoinositide-dependent kinase-1 PH Pleckstrin homology PHLPP PH domaine leucine-rich repeat protein phosphatase PIP2 Phosphatidylinositol-3,4-bisphosphate PIP3 Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate PI3K Phosphoinositol-3-Kinase PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid % Prozent PS Phosphatidyl-Serin PTEN Phosphatase with tensin homology RNA Ribonukleinsäure rpm Rounds per minute RPMI Roswell Park Memorial Institute RT Raumtemperatur RTK Rezeptor-Tyrosin-Kinase s Sekunde SDS Sodiumdodecylsulfat SH2 Scr-homology 2 SSC Sideward-Scatter S-Typ Zellen Zellen stromalen Ursprungs t Zeit tBid truncated Bid V Abkürzungsverzeichnis TEMED Tetramethylenediamid TNF Tumor necrosis factor TRAIL Tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand TRIS Tris(hodroxymethyl)methyl-amine hydrochlorid Trk Tyrosine kinase TSC 1 Tuberous sclerosis complex 1, hamartin TSC 2 Tuberous sclerous complex2, tuberin UV ultraviolet VEGF Vascular endothelial growth factor WB Western blot 4E-BP elF4E-binding protein VI Einleitung 1 1 Einleitung 1.1 Tumore und Kanzerogenese 1.1.1 Kanzerogenese Jährlich erkranken 15 von 100.000 Kindern unter 15 Jahren an einer Krebserkrankung, in Deutschland sind dies 1.700 Neuerkrankungen pro Jahr. Der Krebserkrankung im Allgemeinen liegt ein Ungleichgewicht zwischen Zellwachstum und -proliferation auf der einen Seite und dem Absterben von Zellen auf der anderen Seite zu Grunde. Zum einen wachsen und differenzieren Tumorzellen unkontrolliert, zum anderen fehlt die Regulierung des programmierten Zelltods, der so genannten Apoptose (Löffler u. Petrides 2003). Mit der erhöhten Proliferation ist meist die Unfähigkeit zur Differenzierung verbunden, je weniger differenziert ein Tumor, desto mehr maligne ist er. Ein Tumor beruht auf einer neoplastisch veränderten Zelle und stellt damit einen Klon dar. Maligne Tumore sind untereinander sehr heterogen, aber allen gemeinsam sind sechs Merkmale: 1) Wachstum unabhängig von externen Wachstumsfaktoren, 2) NichtAnsprechen auf Anti-Wachstumssignale, 3) Vermeidung von Apoptose, 4) unerschöpfliches Reproduktionspotential, 5) verstärkte Angiogenese und 6) Gewebeinvasion und Metastasierung (Hanahan u. Weinberg 2000). Zur Entstehung maligner Erkrankungen tragen diverse Faktoren bei. Diese können exooder endogener Natur, hormonal oder auch genetisch bedingt sein. Zu ersteren zählen Strahlung, Nikotin, Fehlernährung, Virusinfektionen (Lodish et al. 2001). Zu endogenen Faktoren zählen so genannte Krebsgene, Onkogene und Tumorsuppressorgene, die eine Krebszelle genetisch verändern und diese Veränderungen akkumulieren sich über Krebszellgenerationen. Onkogene sind mutierte Gene, die an Zellteilung, -wachstum und -differenzierung beteiligt sind und zu unkontrollierter Proliferation und somit im Extremfall zur Tumorentstehung führen können (Janeway u. Medzhitov 2000). Beispiele dafür sind Ras, Phospho-Inositol-3-Kinase (PI3K) und Akt. Vorstufen von Onkogenen sind Protoonkogene, die erst durch schädliche Einflüsse, wie beispielsweise Strahlung, in die krebserzeugende Form umgewandelt werden. „Phosphatase with tensin homology“ (PTEN) und p53 sind Beispiele für Tumorsuppressorgene. Diese verhindern die Tumorentstehung, indem sie verschiedene Funktionen übernehmen, wie Regulation des Zellzyklus, der Angiogenese und Vermittlung der Zell-Zell-Kommunikation (Löffler u. Einleitung 2 Petrides 2003). Bei einem Funktionsverlust der Tumorsuppressorgene kommt es auf Grund der verminderten Hemmung zur Förderung der Tumorgenese (Weinberg 1991). Generell gilt, dass für eine manifeste Krebserkrankung nicht eine Mutation genügt, es müssen gleichzeitig mehrere genetische Veränderungen vorliegen (Löffler u. Petrides 2003). Die oben angesprochene Heterogenität maligner Tumore beruht auf Unterschieden auf molekularbiologischer Ebene und macht eine erfolgreiche, einheitliche Therapie einzelner Tumorgruppen fast unmöglich. Um eine gezielte und somit effiziente Therapie für jeden Patient zu ermöglichen, ist es unerlässlich, die molekularbiologischen Hintergründe von Tumorbildung und Resistenzmechanismen zu eruieren. Momentan stehen zur Behandlung von malignen Tumoren diverse Mittel zur Verfügung: Chemotherapie, Strahlentherapie und operative Maßnahmen. Nach wie vor sind die Therapieerfolge limitiert, da bei Therapiebeginn oftmals die Metastasierung bereits zu weit fortgeschritten ist, Resistenzen gegen Chemo- oder Strahlentherapie bei einigen Tumoren vorliegen oder sich im Therapieverlauf neu entwickeln. Auf Grund der Toxizität gegenüber normalen, gesunden Zellen ist eine Dosiserhöhung sowohl der Chemo- als auch Strahlentherapie keine Option. In dieser Arbeit möchte ich auf eine Tumorentität, die besonders in der Pädiatrie von Bedeutung ist, eingehen: dem Neuroblastom. 1.1.2 Neuroblastom Das Neuroblastom ist der häufigste extrakranielle, solide Tumor und nach Leukämien und Gliomen die dritthäufigste maligne Erkrankung im frühen Kindesalter (Brodeur 2003), der Altersmedian liegt bei 1,4 Jahren. Einerseits hat das Neuroblastom die höchste SpontanRückbildungsrate unter menschlichen Tumoren (Brodeur 2003), andererseits liegt das 5-Jahres-Überleben bei fortgeschrittenem Stadium trotz intensiver multimodaler Therapie bei nur knapp 60%, die Langzeitüberlebensrate bei unter 40% (Maris et al. 2007). Das Neuroblastom ist ein hochmaligner embryonaler Tumor, dessen Inzidenz, da er bereits bei Geburt angelegt ist, innerhalb der ersten fünf Lebensjahre am höchsten ist. Das Neuroblastom entwickelt sich aus sympathischen Nervenfasern und tritt meist im Nebennierenmark als Teil des vegetativen katecholaminbildenden Nervensystems mit chromaffinen Zellen und sympathischen Ganglienzellen auf. Selten finden sie sich im Grenzstrangbereich (Riede, Werner, Schäfer 2004). Neuroblastome sind sehr heterogene Tumore, in vitro Kulturen bestehen aus drei Subgruppen: I-Typ-Stammzellen, N-Typ neuroblastischen Vorläuferzellen und S-Typ Einleitung 3 Schwann’sche/melanoblastische Vorläuferzellen. Diese verschiedenen Zelltypen entwickeln sich entlang spezifischer neuronaler Zelllinien (Ross et al. 2003). Von prognostischer Bedeutung sind verschiedene molekulare und zytogenetische Faktoren, wie beispielsweise Chromosomendeletionen. Sie sind in 50% der Neuroblastome zu finden und meist in den Chromosomen 1p, 11q und 14q lokalisiert (Westermann u. Schwab 2002, Guo et al. 2000, Srivatsan et al. 1993). Eine Deletion des kurzen Arms des Chromosoms 1 ist die häufigste chromosomale Mutation in Neuroblastomzellen und assoziiert mit einer schlechten Prognose (Emminger u. Kia 2008, Maris et al. 2000). Des Weiteren geht sie oft mit einer Amplifikation und Überexpression von MYCN einher (Brodeur 2003, Fulda et al. 2006). Dies ist ein Marker für gesteigerte Proliferation und damit für aggressives Wachstumsverhalten (Schwab et al. 2003) und bei circa einem Viertel der Neuroblastompatienten nachweisbar (Johnsen et al. 2008). Ebenso sind Veränderungen des DNA-Gehaltes (Hyperdiploidie) prognostisch interessant, da sie mit einem besseren Tumorstadium und einem guten Ansprechen auf die Therapie einhergehen (Look et al. 1984, Look et al. 1991). Weiterhin bedeutend für die Prognose sind die TelomeraseAktivität und die Expressionsrate der Neutrophinrezeptoren „tropomyosin-related kinase“ (TrK) A und TrKB (Brodeur 2003, Li et al. 2005). Wobei TrKA prognostisch günstig ist, der Nachweis von TrKB und „brain-derived neurotrophic factor“ (BDNF) hingegen die Prognose verschlechtert (Li et al. 2005). Das Staging folgt den Richtlinien des International Neuroblastoma Staging Systems (INSS) (Warnat et al. 2007), der aktuelleren International Neuroblastoma Pathology Classification (INPC) und nach histologischen Gesichtspunkten der Shimada Classification (Brodeur 2003). Die Diagnose ist meist ein Zufallsbefund, da der Primärtumor in der Regel keine Beschwerden verursacht (Emminger u. Kia 2008). Symptome treten im Rahmen der Lokalisation auf (Maris et al. 2007). Eine unklare palpable Raumforderung im Abdomen oder eine zufällige Entdeckung bei einer sonografischen Untersuchung geben erste Hinweise. Zur Diagnosesicherung dienen Knochenmarkuntersuchungen sowie bildgebende Verfahren. Weiterhin werden Serum und Urin auf Vanillinmandelsäure und Homovanillinsäure, Abbauprodukte von Katecholaminen, getestet. Beide Metabolite dienen ebenfalls der Verlaufskontrolle. Prognostisch relevant sind außerdem LDH, Ferritin und neuronenspezifische Enolase (Koletzko 2003). Klinische Verläufe können sehr unterschiedlich sein, das Neuroblastom kann spontan zum Ganglioneurom ausreifen und somit seine malignen Eigenschaften verlieren, es kann Einleitung 4 allerdings auch trotz intensiver zytostatischer Behandlung therapieresistent werden. Die Hälfte aller Neuroblastome ist bei Diagnosestellung bereits metastasiert, bevorzugt in Knochen, Lymphknoten und Knochenmark, in fortgeschrittenen Stadien auch in Haut, Leber oder Augenhöhle. Klinisch imponieren Allgemeinsymptome wie Fieber, Diarrhoe oder Knochenschmerzen. Bei dem prognostisch meist günstigen Tumor sind auch spontane Rückbildungen möglich (Koletzko 2003). Die Therapie besteht aus einer radikalen Tumorexstirpation mit anschließender Strahlenund Chemotherapie (Emminger u. Kia 2008). Eine Therapieoption bei metastasiertem Neuroblastom bietet die autologe Stammzelltherapie (Sartelet et al. 2008). Krebserkrankungen im Kindesalter weisen sich durch eine sehr hohe Proliferationsrate aus, was ein sehr gutes Ansprechen auf eine Chemotherapie verspricht. Die Wirkung zytotoxischer Therapien beruht auf der Induktion des programmierten Zelltodes, der Apoptose. 1.2 Apoptose Der Begriff Apoptose kommt aus dem Griechischen und bedeutet „Herabfallen der Blätter von Bäumen“ (Janeway et al. 2002, Hengartner 2000). Der auch als programmierter Zelltod bezeichnete, induzierbare und energieabhängige Prozess wird hoch reguliert, dient der physiologischen Differenzierung von Geweben und erfüllt eine Schutzfunktion, indem stark geschädigte Zellen aus dem Gewebe entfernt werden. Sie geht mit einer gesteigerten RNA- und Proteinbiosynthese einher (Löffler u. Petrides 2003). Dabei bleiben Zellneubildung und Zellsterben im Gleichgewicht (Evan u. Vousden 2001). Wird dies zu Gunsten der Zellneubildung gestört, kann es zu unkontrolliertem Wachstum (Lodish et al. 2001), Progression und Therapieresistenz kommen (Lowe u. Lin 2000). Fehler im Apoptoseprogramm mit insuffizienter Apoptose können ebenso Autoimmunerkrankungen und persistierende Infektionen mit sich bringen. Bei exzessiver Apoptoserate kommen neurodegenerativen Erkrankungen, AIDS bei einer HIV-Infektion, Ischämien und ebenfalls Autoimmunerkrankungen als Folge in Betracht (Reed 2002). Morphologische Veränderungen einer Zelle während der Apoptose sind -in zeitlicher Reihenfolge- Chromosomenkondensation im Zellkern, Schrumpfung des Zellkörpers, Zerfall von Zytosol und Zellkern und Bildung apoptotischer Körperchen. Schlussendlich kommt es zur Phagozytose durch die Nachbarzellen (Kerr et al. 1972) ohne eine Schädigung des umliegenden Gewebes mit sich zu bringen. Molekulare Veränderungen wie eine Spaltung der DNA und eine Verteilung von Phosphatidyl-Serin (PS) zwischen Einleitung 5 innerer und äußerer Plasmamembran (Fadok et al. 1998) werden zum Nachweis von Apoptose genutzt. Beispielsweise können Zellen mit subdiploidem DNA-Gehalt mit einem in die DNA interkalierendem Farbstoff nachgewiesen werden (Nicoletti et al. 1991). Bei einer weiteren Methode wird das an der Zelloberfläche befindliche PS durch Annexin V detektiert (Koopman et al. 1994). Die Induktion von Apoptose kann auf verschiedene Weise durch Aktivierung unterschiedlicher Signalwege geschehen. Dabei wird unterschieden zwischen Initiationsund Effektorphase (Hengartner 2000). Zu ersterer werden extrinsischer sowie intrinsischer Signalweg gezählt, der Effektorphase entspricht die Caspasenkaskade. Diese CysteinProteasen sind Apoptose-ausführende Moleküle, sie liegen inaktiv als Zymogen vor und werden autoproteolytisch oder durch kaskadenartige Spaltung bereits aktiver Caspasen aktiviert, was wiederum zu einer Aktivierung von sekundären Proteinen und letztendlich zu Apoptose führt. Sie werden unterteilt in Initiator- (Caspasen-2, -8, -9, -10) und Effektorcaspasen (Caspasen-3, -6, -7). 1.2.1 Apoptose-Signalwege Die Auslösung des programmierten Zelltodes hat unterschiedliche Ursachen. Zum einen wird er durch ein Fehlen von externen, trophischen Faktoren induziert (Lodish et al. 2001), zum anderen durch externe Faktoren, welche eine Aktivierung von Signalwegen bewirken. Dabei liegen die Signalwege nicht inaktiv vor und warten auf ihre Aktivierung, sondern der Zelltod wird kontinuierlich durch anti-apoptotische Moleküle unterdrückt (Adams u. Cory 2007). Todesrezeptor-Signalweg Eine Möglichkeit der Aktivierung der Caspasenkaskade ist die durch Todesrezeptoren. Dabei bindet ein Todesrezeptorligand, beispielsweise „TNF-related apoptosis inducing ligand“ (TRAIL) (Merino et al. 2007) oder CD95, an den spezifischen Rezeptor an der Außenseite der Zellmembran. Als Reaktion schließen sich drei monomere Fas-Moleküle zusammen und bilden gemeinsam zytoplasmatisch eine Todesdomäne (DD, death domaine), mit der Adapterproteine, wie „Fas-associated death domain“ (FADD), interagieren. Die Adapterproteine besitzen ebenfalls eine Todesdomäne, die mit Procaspase-8 in Wechselwirkung tritt. Dieser Komplex wird als „death inducing signalling complex“ Einleitung (DISC) 6 bezeichnet (Ashkenazi 2002). Daraufhin wird die Initiatorcaspase-8 autokatalytisch gespalten und die Caspasenkaskade in Gang gesetzt. Aktive Caspase-8 löst sich von FADD und spaltet nun einerseits die Proformen der Effektorcaspasen-3, -6 und -7 und andererseits Bid zu „truncated Bid“ (tBid), welches die ebenfalls pro-apoptotischen Bcl-2-Familien-Mitglieder Bax und Bak und somit den mitochondrialen Signalweg aktiviert (Willis u. Adams 2005). Die Caspasen-3, -6 und -7 spalten nun über weitere Schritte der Kaskade pro-apoptotische Substrate. Die Proteasekaskade endet schließlich in einer caspasenaktivierten DNAse, die in den Zellkern gelangt und dort zur DNA-Fragmentierung führt (Merino et al. 2007, Ashkenazi 2002, Cory u. Adams 2002) (Abb.1). Mitochondrialer Signalweg Der intrinsische Signalweg wird über tBid, Anoikis, Fehlen von Wachstumsfaktoren oder „Stress“ aktiviert (Blume-Jensen u. Hunter 2001), welcher beispielsweise durch bestimmte Zytostatika hervorgerufen wird und eine Schädigung der DNA induziert, die wiederum über apoptotische Stimuli eine Permeabilität der Mitochondrienmembran bewirkt. Dabei gelangt das Hämprotein Cytochrom c, welches sich in der intakten Zelle zwischen äußerer und innerer Mitochondrienmembran befindet, ins Zytosol und bildet mit der Protease „apoptotic protease activating factor-1“ (Apaf-1) einen Komplex (Saelens et al. 2004). Dieser Komplex wiederum bindet und aktiviert dadurch die Initiatorcaspase-9. Der Zusammenschluss von Cytochrom c, Apaf-1 und Caspase-9 wird Apoptosom genannt (Youle u. Strasser 2008). Caspase-9 aktiviert daraufhin die Effektorcaspasen-3 und-7 (Adams u. Cory 2007, Riedl u. Shi 2004) und es kommt zu Substratspaltung und Zelltod (Abb.1). 1.2.2 Regulation von Apoptose Damit Apoptose nicht unkontrolliert abläuft, existiert ein komplexes Zusammenspiel von pro- und anti-apoptotischen Molekülen. Verschiedene Proteine regulieren die Apoptose auf verschiedenen Ebenen, die wichtigsten sollen im Folgenden kurz dargestellt werden. Als erstes werden die Proteine der „B cell lymphoma“ (Bcl)-2-Familie genannt, zu der sowohl pro- als auch anti-apoptotische Proteine gehören (Borner 2003). Bcl-2 oder auch Mcl-1 wirken anti-apoptotisch, Bid und Noxa sind Beispiele für pro-apoptotische Proteine (Cory u. Adams 2002, Mund et al. 2003). Bcl-2-Familien-Mitglieder kontrollieren Apoptose hauptsächlich durch die Regulation der Veränderungen am Mitochondrium Einleitung 7 (Wang 2001), die zur Freisetzung mitochondrialer Proteine ins Zytosol führen (Youle u. Strasser 2008). Dabei agieren Bcl-2-Proteine untereinander, indem sie Homo- oder Heterodimere formen und sich a- oder antagonisieren (Cory u. Adams 2002). Es ist beschrieben, dass sie am Mitochondrium die Bildung von Poren bewirken, durch die eine Freisetzung von Cytochrom c ins Zytosol ermöglicht wird (Willis et al. 2003). Eine Wirkung auf die Expression von pro-apoptotischen Bcl-2-Familienmitgliedern zeigt der Tumorsuppressor p53 (Mihara et al. 2003, Wu et al. 2001). Negativ reguliert wird Apoptose beispielsweise durch „cellular FLICE-inhibitory protein“ (cFlip). Flip, welches in drei verschiedenen Isoformen (Djerbi et al. 2001, Golks et al. 2005) vorliegen kann, bindet auf Grund der strukturellen Ähnlichkeit mit Caspase-8 direkt an den DISC und verhindert dadurch die Aktivierung von Caspase-8 (Fulda u. Debatin 2004). Eine weitere negative Regulierung findet auf postmitochondrialer Ebene durch „Inhibitors of apoptosis proteins“ (IAPs) statt. Die Ubiquitin-Ligasen bewirken durch eine Interaktion mit den Caspasen-3, -7 und -9 deren Inhibierung. Wichtige Vertreter dieser Gruppe sind XIAP und survivin (Salvesen u. Duckett, 2002, Du et al. 2000) (Abb.1). Einleitung 8 TRAIL Zytostatika TRAIL -Rez cFLIP DNA-Schaden FADD Bcl-2 Bax Caspase-8 tBid Bak Mcl-1 Cyt c Bid Apaf-1 Apoptosom Caspase-9 IAPs Caspase-3 Substrate DNA-Fragmentierung Apoptose Abb.1: Apoptose-Signalwege Die Auslösung des programmierten Zelltodes kann auf zwei Wegen geschehen. Bei der durch Todesrezeptorliganden-Bindung induzierten Apoptose kommt es nach der Formation des DISC-Komplexes zur Aktivierung von Caspase-8, was sowohl die Spaltung und Aktivierung von Caspase-3 als auch von Bid, der Verbindung zum mitochondrialen Signalweg, zur Folge hat. Der mitochondriale Signalweg wird bei DNA-Schäden aktiv. In seinem Mittelpunkt steht die Freisetzung von Cytochrom c aus dem Mitochondrium, was durch pro- und anti-apoptotische Proteine der Bcl-2-Familie reguliert wird. Cytochrom c bildet im Zytosol gemeinsam mit Apaf-1 und Caspase-9 das Apoptosom, dabei wird Caspase-9 aktiviert. Sowohl aktive Caspase-8 als auch -9 bewirken die Aktivierung von weiteren Caspasen, was schließlich über Spaltung anderer apoptotischer Proteine zum Zelltod führt. Eine negative Regulierung des Signalweges erfolgt sowohl auf Rezeptorebene durch cFlip als auch durch Inhibierung der Caspasenaktivität durch „Inhibitors of apoptosis proteins“ (IAPs). Einleitung 1.2.3 9 Resistenzmechanismen gegenüber Apoptose Die Auslösung von Apoptose in Krebszellen hat sich als bewährtes Mittel in der Therapie von Krebserkrankungen bewiesen. Die Wirkung wird durch gezielten Angriff bestimmter Moleküle erreicht. Hierbei zeigen sich jedoch häufig Resistenzen, die die Zellen vor Apoptose schützen und dadurch einen Therapieerfolg verhindern. In vielen verschiedenen Tumoren, inklusive dem Neuroblastom, ist eine Überexpression von Bcl-2 zu beobachten, was zu einem Überleben der Zellen durch eine direkte Inhibierung von Apoptose führt (Hockenberry et al. 1990, Reed 1999). Im Neuroblastom ist die Bcl-2-Expression mit einem ungünstigen Krankheitsverlauf und MYCNAmplifikationen assoziiert und gleichzeitig umgekehrt proportional zur Anzahl apoptotischer Zellen (Oue et al. 1996). Ebenso sind in einigen Tumoren Mutationen oder Herunterregulationen der pro-apoptotischen Mitglieder der Bcl-2-Familie Bax und Bak nachgewiesen worden (Rampino et al.1997), was ebenfalls zu einer verminderten Apoptoserate führt. Des Weiteren wurde eine Überregulation von cFlip in verschiedenen kanzerösen, apoptoseresistenten Zellen gefunden (Dutton et al. 2004, Zhou et al. 2004). Eine erhöhte Apoptoseresistenz in Neuroblastomzellen geht des Öfteren mit einem Funktionsverlust von Caspase-8 einher (Eggert et al. 2001), besonders in Zelllinien mit erhöhter MYCN-Amplifikation. Durch eine Reexpression von Caspase-8 konnte eine Erhöhung der Sensitivität dieser Zellen gegenüber Todesrezeptor- und Zytostatikainduzierter Apoptose erreicht werden (Fulda et al. 2001). Der Tumorsuppressor p53 ist in mehr als 50% aller menschlichen Tumore inaktiv (Hainaut u. Hollstein 2000). Somit wird in den entsprechenden Zellen bei einer DNA-Schädigung keine Apoptose induziert. Ebenso wird eine Überexpression von IAPs in Tumorzellen beschrieben, die Apoptoseresistenz zur Folge hat (Duckett et al. 1996). Besonderes Augenmerk fällt dabei auf survivin, welches nur in Tumorzellen exprimiert wird und somit als Tumormarker fungieren kann (Ambrosini et al. 1997). Die Expression von survivin korreliert mit aggressivem Tumorwachstum und ungünstiger Prognose unter anderem in Neuroblastomzellen (Adida et al. 1998). Um Resistenzmechanismen zu überwinden ist es von Bedeutung, neue Therapieansätze zu finden. Einer davon ist der Einsatz des Todesrezeptorliganden TRAIL. Was TRAIL für die klinische Anwendung (Johnstone et al. 2008) auszeichnet ist die Spezifität, mit der es ausschließlich Tumorzellen angreift (Fulda u. Debatin 2004). Des Weiteren führt eine TRAIL-R2-Antikörpertherapie nicht nur zur Induktion von Apoptose in sensiblen Einleitung 10 Tumorzellen sondern auch zu einem Langzeiteffekt, in dem es ein Tumor-spezifisches T-Zell-Gedächtnis induziert (Fulda u. Debatin 2004). Allerdings werden auch gegenüber TRAIL zunehmend Resistenzen von Tumorzellen entwickelt, als Folge eines hyperaktiven Überlebenssignalweges (Fulda u. Debatin 2004). Neben TRAIL werden die agonistischen, spezifischen, humanen TRAIL-Rezeptoren(R)1 (HGS-ETR1, Mapatumumab) und TRAILR2 (HGS-ETR2, Lexatumumab)-Antikörper zur Induktion von Apoptose verwendet (Ashkenazi 2002). In Tumoren finden sich häufig Mutationen, die zu einer konstitutiven Aktivierung von Überlebenssignalen und damit zu einer verminderten Apoptoserate und unkontrolliertem Zellwachstum führen. Dazu gehört der PI3K/Akt-Signalweg als ein Hauptregulator von Zellproliferation, Zellwachstum, Metabolismus und Überleben (Carracedo u. Pandolfi 2008). 1.3 Überlebenssignalwege 1.3.1 PI3K/Akt-Signalweg Eine zentrale Rolle im PI3K/Akt-Signalweg spielen die Phosphoinositol-3-Lipidkinasen (PI3K), welche nach Struktur, Bindungspartner, Aktivierung und Substratspezifität in drei Klassen unterteilt werden, Klasse I-III. Die am besten charakterisierten Klasse I PI3K werden durch Rezeptor-Tyrosin-Kinasen oder G-Protein-gekoppelte Rezeptoren aktiviert, sie haben als gemeinsame Funktion die Generierung von Phosphatidylinositol-3,4,5trisphosphat (PIP3) durch Phosphorylierung des 3-Hydroxyl-Endes des in der Membran liegenden Inositol Phospholipides (Katso et al. 2001). Klasse IA der PI3K wird nochmals in drei Isoformen unterteilt, PI3K-α, PI3K-β und PI3K-δ. PI3K besitzen eine regulatorische p85-Untereinheit und eine katalytische p110-Untereinheit (Knight et al. 2006, Ward et al. 2003)(Abb.2). Durch Bindung von Wachstumsfaktoren an den entsprechenden Rezeptor wird die Rezeptor-Tyrosin-Kinase (RTK) aktiv und deren zytoplasmatischer Anteil phosphoryliert. Daraufhin wird der p85-p110-Komplex der PI3K durch Interaktion der SH2-Domäne (Src-homology) der p85-Einheit an den Rezeptor rekrutiert und aktiviert (Cantley 2002). Vor Ligandenbindung liegt der p85-p110-Komplex inaktiv im Zytoplasma vor. Die p110Untereinheit der aktiven PI3K (Blume-Jensen u. Hunter 2001) bewirkt nun die Generierung von Phosphatidylinositol-3,4,5-Trisphosphat (PIP3) durch Phosphorylierung Einleitung 11 des in der Zellmembran gelegenem PIP2. Antagonistisch zu PI3K wirkt „Phosphatase und Tensin Homolog“ (PTEN), indem es PIP3 dephosphoryliert (Vivanco u. Sawyers 2002) (Abb.2). PTEN, der Antagonist zu Akt, ist neben p53 der am häufigsten mutierte Tumorsuppressor (Yamada und Araki 2001). Ein funktionsloses PTEN findet sich oftmals in primären Tumoren und Krebszelllinen (Franke 2008, Carnero et al. 2008), unter anderem im Neuroblastom (Munoz et al. 2004). Das als second messenger wirkende PIP3 rekrutiert Proteine mit einer „pleckstrin homology“ (PH)-Domäne an die Zellmembran, wie die Serin/Threonin-Kinase Akt (Engelman et al. 2006). Drei Isoformen von Akt, dem bedeutendsten Target von PI3K, sind bekannt: Akt1/PKBα, Akt2/PKBβ und Akt3/PKBγ (Manning u. Cantley 2007). Akt wird durch „3-phosphoinositide-dependent kinase-1“ (PDK1) an Threonin (Thr) 308 und -vermutlich- durch mTORC2 an Serin (Ser) 473 (Sarbassov et al. 2004, Sarbassov et al. 2005) phosphoryliert. Erst die Phosphorylierung an beiden Bindungsstellen führt zu einer vollständigen Aktivierung von Akt (Alessi et al. 1997). Auch an dieser Stelle wird der Signalweg durch eine Phosphatase reguliert, „PH domaine leucine-rich repeat protein phosphatase“ (PHLPP). Indem PHLPP Akt an Ser473 dephosphoryliert, kommt es zu einer Inaktivierung von Akt (Gao et al. 2005). Einmal aktiviert, reguliert Akt zahlreiche downstream-Proteine die -in drei Obergruppen zusammengefasst- zu Überleben der Zelle, Proliferation und Zellwachstum der einzelnen Zelle führen (Vivanco u. Sawyers 2002). Akt bewirkt über verschiedene direkte und indirekte Mechanismen das Zellüberleben und wirkt somit Apoptose entgegen. Beispielsweise phosphoryliert und inhibiert Akt das proapoptotische Bad, ein Mitglied der Bcl-2-Familie, welches durch Bindung an das antiapoptotische Bcl-XL dessen Wirken verhindert (Datta et al. 1997). Eine durch Akt verursachte Stabilisierung von Mcl-1 erfolgt sowohl durch direkte Phosphorylierung und Inhibierung von GSK-3 als auch auf transkriptioneller Ebene durch Phosphorylierung und Aktivierung von CREB (Parcellier et al. 2008). Auch verhindert Akt durch Phosphorylierung von „Forkhead transcription factors“, dass diese in den Zellkern gelangen und ihre Zielgene aktivieren, zu denen die pro-apoptotischen Proteine Bim, Noxa und Fas-Ligand gehören (Brunet et al. 1999). Weiterhin wird die pro-apoptotische Wirkung von Caspase-9 durch Phosphorylierung und Inhibierung verhindert (Cardone et al. 1998). Durch Phosphorylierung von IκB-Kinase (IKK) wird der anti-apoptotisch wirkende Transkriptionsfaktor NF-κB (nuclear factor of κB) und seine Zielgene, wie Bcl-XL, cIAP1 und cIAP2, durch Akt reguliert (Romashkova u. Makarov 1999). Einleitung 12 Eins der wichtigsten und am besten charakterisiertesten Targets von Akt ist mTOR. Nachdem Akt TSC1 und TSC2 phosphoryliert und aktiviert hat, aktivieren diese mTOR, was zu erhöhtem Metabolismus, Zellwachstum und Überleben der Zelle führt. In Säugetieren kommen zwei verschiedene mTOR-Komplexe vor, mTORC1 (der Rapamycin-sensitivere Komplex, Raptor) und mTORC2 (Rictor). Beide Komplexe sind zusammengesetzt aus der Proteinkinase mTOR und einer Reihe weiterer Interakteure. mTORC1 bewirkt eine Aktivierung der „p70 ribosomalen S6-Kinase“ (p70 S6K), was wiederum zu einer Aktivierung des S6 ribosomalem Proteins und des „eukaryotic inititation factor 4E (e1F4E)-binding proteins“ (4E-BPs) führt (Fingar u. Blenis 2004). p70 S6K phosphoryliert des Weiteren Insulin-Rezeptor-Substrat (IRS), ein Adapterprotein des IGF-Rezeptors. IRS wird dadurch herunterreguliert und bewirkt eine Abschwächung der PI3K-Wirkung (Guertin u. Sabatini 2007). 1.3.2 Bedeutung des PI3K/Akt-Signalweges für die Apoptose im Neuroblastom Für Patientenproben primärer Neuroblastome konnte gezeigt werden, dass sowohl Akt als auch S6 ribosomales Protein phosphoryliert vorliegen, wobei die Phosphorylierung von Akt mit einer schlechten Prognose korreliert. Dies verdeutlicht die eminente Bedeutung des PI3K/Akt-Signalweges im Neuroblastom (Opel et al. 2007). Boller et al. konnten nachweisen, dass Klasse IA PI3K p110δ in einem Großteil sowohl primärer Neuroblastomzellen als auch in Zelllinien überexprimiert wird, was zu erhöhtem Wachstum und Überleben der Neuroblastomzellen führte (Boller et al. 2008). Eine signifikante Erhöhung der Akt- und mTOR-Aktivierung in Neuroblastomzellen zeigten auch Johnsen et al., was eine eine Aktivierung des Neuroblastomwachstums in vitro und in vivo bewirkte (Johnsen et al. 2008). Mögliche Ursachen einer Erhöhung der Akt-Aktivität können Veränderungen von Wachstumsrezeptoren oder Mutation und Amplifikation von PIK3CA sein (Shaw u. Cantley 2006, Samuels et al. 2004). Wachstumsfaktoren spielen eine große Rolle in der Tumorgenese von Neuroblastomzellen, sowohl eine erhöhte IGF-Rezeptor-Expression als auch deren Aktivierung zeigten eine Aktivierung des PI3K/Akt-Signalweges mit erhöhter Proliferation und Überleben von Neuroblastomzellen (Sartelet et al. 2008). Wie bereits erwähnt, sind das Neutrophin BDNF und der Rezeptor TrKB prognostisch ungünstig. Durch eine Aktivierung des BDNF-TrKBSignalweges via Akt kommt es zum Überleben von Neuroblastomzellen und die Zellen Einleitung 13 sind vor Zytostatika-induziertem Zelltod geschützt (Li et al. 2005). Auch der Wachstumsfaktor „glial-cell-line derived neutrophic factor“ (GDNF) fördert durch die Aktivierung von p70 S6K die Proliferation von Neuroblastomzellen (Hirata u. Kiuchi 2003). Durch eine Erhöhung sowohl der Proteinexpression von survivin als auch der Phosphorylierung von Akt bewirkt VEGF das Überleben von Neuroblastomzellen (Beierle et al. 2005), während EGFR Zellwachstum, -differenzierung und -migration in Neuroblastomzellen durch die Aktivierung des PI3K/Akt-Signalweges bewirkt (Sartelet u. Oligny 2008). Eine Inhibierung des PI3K/Akt-Signalweges könnte gleichzeitig sowohl die Proliferation als auch das Tumorwachstum mindern und die Neuroblastomzellen für eine Induktion des programmierten Zelltodes sensitivieren (Garcia-Echeverria u. Sellers 2008). 1.3.3 Inhibitoren des PI3K/Akt-Signalweges Es gibt eine Vielzahl von Interventionsmöglichkeiten im PI3K/Akt-Signalweg (GarciaEcheverria u. Sellers 2008). In der vorliegenden Arbeit liegt das Augenmerk auf den PI3KInhibitoren LY294002 und PI-103. Ebenso wird Everolimus (RAD001) als mTORInhibitor vorgestellt. Das reversibel wirkende Flavon LY294002 gehört neben dem Naturprodukt Wortmannin zur ersten Generation synthetischer PI3K-Inhibitoren und inhibiert kompetetiv und reversibel die ATP-Bindungsstelle von PI3K (Djordjevic u. Driscoll 2002). Der smallmolecule Inhibitor (Chesler et al. 2006) kommt wegen seiner Unselektivität (GarciaEcheverria u. Sellers 2008) und Unlöslichkeit therapeutisch nicht zum Einsatz (Hirata u. Kiuchi 2003), konnte sich jedoch zu labortechnischen Zwecken bewähren (Lopiccolo et al. 2008). Das Pyridinylfuranopyrimidin PI-103 gehört zur zweiten Generation synthetischer PI3K-Inhibitoren. Das zellpermeable PI-103 inhibiert weitaus selektiver als die erste Generation PI3K-Inhibitoren verschiedene, bedeutende Wachstums- und Proliferationsenzyme: mTORC1, mTORC2, DNA-PK und die ATP-Bindungsstelle der Klasse I PI3KIsoformen p110α, β, δ und γ (Raynaud et al. 2007, Ihle u. Powis 2009), bevorzugt p110α (Fan et al. 2006). Des Weiteren konnte sowohl in vitro als auch in vivo eine Inhibierung der Tumorzell- und Endothelzellmigration nachgewiesen werden. PI-103 ist circa 200x potenter als LY294002 (Raynaud et al. 2007) und hat einen hohen Verteilungskoeffizient (Garcia-Echeverria u. Sellers 2008). Nachteilig sind die schnelle Metabolisierung (Garcia- Einleitung 14 Echeverria u. Sellers 2008) und die obligat parenterale Applikation. Diese pharmakologischen Eigenschaften machen PI-103 ungeeignet für den klinischen Einsatz (Ihle u. Powis 2009). Die weiterentwickelte dritte Generation PI3K-Inhibitoren, wie beispielsweise NVP-BEZ235, befindet sich bereits in klinischen Studien (Maira et al. 2008). Die Serin/Threonin-Kinase mTOR spielt eine wichtige Rolle in Zellproliferation, Metabolismus und Tumorgenese, ihre Phosphorylierung ist signifikant erhöht in primären Neuroblastomzellen (Cully et al. 2006, Johnsen et al. 2008). Ein klinisch gut wirksamer und gut verträglicher Inhibitor von mTOR ist das immunsuppressiv wirkende RapamycinDerivat Everolimus. Es hemmt sehr selektiv über Bindung an FKBP12 den mTORC1 (Guertin u. Sabatini 2007) und verhindert somit die Aktivierung von p70-S6K (Sartelet u. Oligny 2008). Des Weiteren haben Rapamycin und Derivate durch ihren antagonisierenden Effekt auf VEGF eine anti-angiogenetische Wirkung (Marone et al. 2008). Klinische Studien zeigen bei Tumoren mit erhöhter PI3K-Aktivität und hyperaktivem mTOR, dass eine Behandlung mit Rapamycin oder Derivaten gute Ergebnisse erzielt. Der Inhibitor findet bereits in verschiedenen Kombinationsschemata klinisch Anwendung zur Vermeidung von Abstoßungsreaktionen (Karow 2006). Einleitung 15 Wachstumsfaktor P P P P P IRS P PIP3 P P PIP2 P P AKT PDK1 T S p85 p110 LY294002 PI3K PTEN mTORC2 P AKT T S P PI-103 FKHR mTORC1 Everolimus Bad IKK Anti-Apoptose, Überleben p70 S6K S6 Überleben, Proliferation, Zellwachstum Abb.2: PI3K/Akt-Signalweg Die Bindung eines Wachstumsfaktors am RTK-Rezeptor führt zu Translokation und Aktivierung von PI3K, die dann den Second-Messenger PIP3 generiert. Daraufhin binden Akt und PDK-1 mit ihrer PH-Domäne an PIP3 und es kommt zur Phosphorylierung von Akt an T308 durch PDK-1. Erst die Phosphorylierung von Akt an S473 bewirkt dessen vollständige Aktivierung. Aktives Akt vermittelt über die Aktivierung von mTOR die Aktivierung von p70-S6K und S6 ribosomalem Protein, was zu Überleben, Proliferation und Wachstum der Zelle führt. Des Weiteren bewirkt aktives Akt über eine Inhibierung von FKHR, Bad und IKK eine Hemmung von Apoptose und führt auf diesem Weg ebenfalls zum Überleben der Zelle. Negativ reguliert wird der PI3K/AktSignalweg durch den Tumorsuppressor PTEN. Die Inhibierung des PI3K/Akt-Signalweges kann durch LY294002, welches an p110 der PI3K bindet, den neueren Inhibitor PI-103, der spezifisch Klasse I PI3K und mTOR hemmt, oder den selektiven mTOR-Inhibitor Everolimus, erreicht werden. Einleitung 1.3 16 Fragestellung und Ziel der Arbeit Ein Ziel der Krebsforschung ist die Induktion von Apoptose in Zellen, die auf Grund von Mutationen in den Signalwegen entartet sind (Hengartner 2000). Da Apoptose-Resistenz ein Hauptcharakteristikum maligner Zellen ist, liegt hier besondere Bedeutung. Wie also ist es möglich und welche Wege gibt es, Apoptose-Resistenz zu überwinden? In dieser Arbeit geht es um die Rolle des PI3K/Signalweges bei der Regulation von Todesrezeptor-induzierter Apoptose in Neuroblastomzellen. Es wurde PI-103, als Inhibitor von PI3K und mTOR, verwendet, um die Frage zu beantworten, ob eine kombinierte Behandlung mit dem Todesrezeptorligand TRAIL -und somit der Induktion von Apoptose über den extrinsischen Signalweg- eine viel versprechende Behandlungsoption für Patienten mit Neuroblastom darstellt. Material und Methoden 17 2 Material und Methoden 2.1 Material Alle verwendeten Chemikalien und Reagenzien wurden von Sigma, Deutschland bezogen, Ausnahmen sind nachfolgend aufgeführt. 2.1.1 Zelllinien S-Typ-Zellen N-Typ-Zellen 2.1.2 SH-EP DSMZ SK-N-AS ATCC LAN5 ATCC Zellkulturreagenzien Dulbecco’s modified eagle medium Life Technologies, Inc. Fetal Calf Serum Biochrom HEPES buffer Biochrom L-Glutamin Biochrom PBS Biochrom Penicilline/Streptomycin Biochrom RPMI 1640 Medium Life Technologies, Inc. Trypanblau Invitrogen Trypsin/EDTA Solution Biochrom 2.1.3 Proteinelektrophorese und Western Blot Analyse Ammoniumpersulfat Serva BCA Protein Assay Reagent Kit Pierce Biotechnology Bovines Serum Albumin Serva Dithiothreitol Calbiochem ECL-Entwicklerlösung Amersham Bioscience Isopropanol Fluka Nitrocellulose membrane Amersham Bioscienc Material und Methoden 18 Milchpulver Roth Polyacrylamid Rotiphorese 30 Roth ProSieve color protein marker BMA Sodiumdodecylsulfat Serva TEMED Serva 2.1.4 Protein- und Caspaseninhibitoren und ähnliches LY 294002 Calbiochem PI-103 Geneutech. Inc. Everolimus Novartis Pharma AG DMSO Merck zVAD.fmk Bachem Mito Tracker Red CMXros Molecular Probes CMXRos Molecular Probes Caspase-8-Inhibitor zIETD.fmk Bachem Caspase-3-Inhibitor zDEVD.fmk Bachem DAPI-Lösung Roche 2.1.5 Apoptoseinduktoren TRAIL R&D Systems, Inc. Anti-CD95-Rezeptor-Antikörper zur Verfügung gestellt von Dr. G. Strauß HGS-ETR1 (TRAIL-R1mAb) Human Genome Sciences, Inc. HGS-ETR2 (TRAIL-R2mAb) Human Genome Sciences, Inc. 2.1.6 Plastikverbrauchsgegenstände Das gesamte Plastikmaterial wurde von BD Falcon bezogen, Ausnahmen sind aufgelistet. Combitipps Eppendorf AG Safe-lock tubes Eppendorf AG Material und Methoden 2.1.7 19 Geräte Aggarosegel-Apparatur Appligene Developer Kodak M1000 Kodak Digitalcamera C-4040 Olympus optical Electrophoresis Power Supply EPS 300 Pharmacia Biotech ELISA ELx 800 BioTek Instruments Inc. FACScan BD Biosciences Finnpipette ThemoLabsystems Herasafe Heraeus Instruments IKA-Vibrax-VXR IKA® Works Inc. Incubator BBD 6220 Heraeus Instruments Mikroskop CK30 Olympus optical Minizentrifuge 5417R National Labnet MS2 Minishaker IKA® Works Inc. Multipette Plus Eppendorf AG Pipetboy accu IBS Integra Biosciences Pipetten Abimed Shandon Cytospin Thermo Electron Corp. Thermomixer Comfort Eppendorf AG TransBlot SD BioRad Laboratories Varifuge 3.0 RS Heraeus Instruments Wasserbad Köttermann-Rowa 2.1.8 Antikörper Mouse-anti-ß-actin monoclonal antibody Sigma Mouse anti-α-Tubulin polyclonal antibody Sigma Rabbit-anti-Bid polyclonal antibody Cell Signaling Rabbit-anti-Bim polyclonal antibody Cell Signaling Mouse-anti-Flip monoclonal antibody NF zur Verfügung gestellt von P.Krammer Rabbit-anti-Mcl-1polyclonal antibody Stressgen Mouse-anti-Noxa monoclonal antibody Alexis Material und Methoden 20 Mouse-anti-caspase-2 monoclonal antibody BD Transd. Laboratories Rabbit-anti-caspase-3 polyclonal antibody Cell Signaling Mouse-anti-caspase-8 monoclonal antibody Apotech Corporation Rabbit-anti-caspase-9 polyclonal antibody BD Pharmingen Rabbit-anti-phospho Akt (Ser473) polyclonal antibody Cell Signaling Mouse-anti-Akt monoclonal antibody BD Bioscience Rabbit-anti-phosphoS6 ribosomal protein (Ser235/236) polyclonal antibody 2.1.9 Cell Signaling Puffer und Lösungen Nicoletti-Puffer A: 0,1% Trinatriumcitrat-Dihydrat B: 0,1% Triton-X 100 C: Propidiumjodid Nicoletti-Puffer: 1 Teil A, 1 Teil B, C:50µg/ml PBST 900ml Wasser 100ml PBS (10%) 1ml Tween 20 Lyse-Puffer 30mM Tris-HCl ph 7,5 150mM NaCl 1% Triton-X 100 10% Glycerol 200ml Wasser frisch dazugegeben pro 1ml Lysepuffer: 2mM DTT 200µM PMSF 1µM Sodiumorthovanadat 1mM β-Glycerolphosphat 5mM Sodiumfluorid Material und Methoden 21 Tris-Glycerin-Laufpuffer 125mM Tris Base 1,25M SDS 10% 0,1% Glycin 1l Wasser Ladepuffer 60mM Tris HCl 1% SDS 5% Glycerol 0,01mg/ml Bromphenolblau 0,34M β-Mercaptoethanol Blotting Puffer 48mM Tris Base 39mM Glycin 0,037% SDS 10% 20% Methanol 1l Wasser Blocking Puffer 5% 500ml PBST 25g fettfreies Trockenmilchpulver Material und Methoden 2.2 Methoden 2.2.1 Zellkultur 2.2.1.1 Kultivierung von Zellen 22 Die Neuroblastomzelllinien SH-EP und SK-N-AS wurden in DMEM-Medium, LAN5 in RPMI 1640-Medium kultiviert, welche mit 10% fetalem Kalbserum, 1mM L-Glutamin, 1% Penicillin/Streptomycin und 25mM HEPES angereichert waren. Die Kultivierung erfolgte bei 37°C, 5% CO2 und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 95%. 2.2.1.2 Kryokonservierung von Zellen Die Zellen wurden 5min bei 1800 rpm und Raumtemperatur zentrifugiert, anschließend der Überstand verworfen und das Zellpellet in aus dem Kulturmedium DMEM und 10% DMSO hergestelltem Einfriermedium resuspendiert. Nach Überführung in ein Kryoröhrchen wurden die Zellen bei -80°C gelagert. 2.2.1.3 Auftauen von Zellen Zum Auftauen der eingefrorenen Neuroblastomzellen wurden die Kryoröhrchen in einem 37°C warmen Wasserbad aufgetaut und die Zellen zügig in angereichertes DMEMKulturmedium gegeben. Nach 5min bei 1800 rpm und Raumtemperatur in der Zentrifuge und Verwerfung des Überstandes wurde das Zellpellet erneut in Kulturmedium aufgenommen und die Zellen wie oben beschrieben kultiviert. 2.2.1.4 Aussaat von Zellen Um bei jeder Aussaat die gleiche Zelldichte zu erreichen, wurden die Zellen im Verhältnis 4:1 mit Trypanblau gemischt, anschließend mittels der Neubauer-Zählkammer gezählt und die Konzentration mit folgender Gleichung berechnet: Zellen / ml = gezählte Zellen x Verdünnungsfaktor x 10 Anzahl der ausgezählten Quadrate 4 Trypanblau wird nur von toten Zellen und Zelltrümmern aufgenommen, lebende Zellen tun dies nicht, aus diesem Grund werden die blau gefärbten Zellen nicht gezählt. Die Zellsuspension wird mit der entsprechenden Menge Kulturmedium gemischt und bei der darauf folgenden Aussaat in Multiwell-Platten werden SH-EP Zellen mit einer Dichte Material und Methoden 5 2 23 5 2 von 0,3x10 Zellen/cm , SK-N-AS Zellen mit 0,7x10 Zellen/cm und LAN5 Zellen mit 5 2 0,6x10 Zellen/cm ausgesät. SH-EP und SK-N-AS Neuroblastomzellen wurden alle drei bis vier Tage 1:2 bis 1:12 verdünnt, die halbadhärenten LAN5 Neuroblastomzellen wurden in Kollagen-beschichteten Kulturflaschen gezüchtet und alle drei bis vier Tage 1:12 verdünnt. Die Behandlung jeder Zelllinie erfolgte nach 24h, um die Zellen absetzen zu lassen. 2.2.1.5 Mykoplasmentest Zellen der Zellkultur sind anfällig für Mykoplasmen, welche Versuchsergebnisse verfälschen können. Zum Nachweis einer Kontamination der Zellen werden diese für 24h auf 8-well-Objektträgern kultiviert, anschließend mit PBS gewaschen und mit methanolischer DAPI-Lösung (1:5000 DAPI:Methanol) 10min bei 37°C im Dunkeln kultiviert. DAPI ist ein DNA-interkalierender Farbstoff. Nach erneutem Waschen kann das Mykoplasmen-Erbgut mittels Fluoreszenzmikroskop nachgewiesen werden. 2.2.2 Induktion und Bestimmung von Apoptose Die Induktion von Apoptose der in 24-well-Platten ausgesäten Neuroblastomzellen erfolgte mittels eines Todesrezeptorliganden, TRAIL, Anti-CD95, ETR1 oder ETR2, und in An- oder Abwesenheit eines PI3K-Inhibitor, PI-103 oder LY294002, oder des mTORInhibitors Everolimus. Die Bestimmung der Apoptoserate nach der Behandlung erfolgte mittels der Methode nach Nicoletti (Nicoletti et al. 1997). In apoptotischen Zellen kommt es zu einer DNAFragmentierung mit Abnahme des DNA-Gehalts innerhalb des Zellkerns, was mit Hilfe dieser Methode nachgewiesen werden kann. Dazu werden die Zellen zu einem festgesetzten Zeitpunkt nach der Stimulation auf Eis präpariert. Nach 5min Zentrifugation bei 4°C und 1800rpm werden die Zellen mit PBS gewaschen. Dieser Vorgang wird wiederholt und anschließend wird 100µl Nicoletti-Puffer zu dem Zellpellet gegeben. Dieser ist hypoton und enthält unter anderem Propidiumjodid (50µg/ml), welches mit der DNA der Neuroblastomzelle interkaliert. Letzteres muss vor der Messung mit dem Durchflusszytometer vier Stunden bei 4°C und ohne Lichteinwirkung inkubieren. Aus dem gemessenen DNA-Gehalt wird der prozentuale Anteil an apoptotischen Zellen in der behandelten Zellpopulation errechnet. Der Prozentsatz an spezifischer Apoptose wurde nach folgender Formel berechnet: Material und Methoden 24 100*[experimentelle Apoptose (%) − spontane Apoptose in Medium-DMSO (%)] [100% − spontane Apoptose in Medium-DMSO (%)] Bei der Durchflusszytometrie, auch FACS-Analyse genannt, wird eine Zellsuspension durch eine Kapillare gezogen, wobei die Zellen einen Laserstrahl passieren. Daraufhin streuen die Zellen einen gewissen Anteil des Lichts zurück, welcher mittels eines Detektors gemessen wird. Abhängig von Größe, Oberfläche und Komplexität der Zellen variiert die Menge des emittierten Lichts. Dabei ist das Vorwärtsstreulicht (ForwardScatter, FSC) ein Maß für das Zellvolumen, das Seitwärtsstreulicht (Sideward-Scatter, SSC) hingegen gibt Aufschluss über die Granularität der Zelle und Eigenschaften des Zellkerns. Durch vorherige Behandlung der Zellen mit einem Farbstoff, wie Propidiumjodid, ist es möglich, gezielt spezifische Fragestellungen zu beantworten, siehe unten. Die Auswertung der FACS-Messungen wurde mittels der Software Cellquest durchgeführt. 2.2.3 Messung der Zellviabilität Dazu werden die in 96-well-Platten ausgesäten Zellen zu einem festgesetztem Zeitpunkt nach Stimulation mit PBS gewaschen und anschließend mit dem gelben, wasserlöslichen Farbstoff 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) drei Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wird Isopropanol dazugegeben und die Zellen werden erneut 30min unter stetigem Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert. Die Messung erfolgt mittels ELISA-Reader bei 550nm. Die Reaktion beruht auf der NADH- und NADPH-abhängigen Reduktion des Farbstoffs zu dem blau-violetten, wasserunlöslichen Formazan durch lebende Zellen. Je höher die Viabilität der untersuchten Zellen, desto stärker die Umsetzung des Farbstoffs. 2.2.4 Colony Forming Assay 200 Zellen pro well werden in 6-well-Platten ausgesät und für 6h, 8h, 12h oder 24h mit TRAIL in An- oder Abwesenheit von PI-103 stimuliert. Um die Reaktion zu stoppen wird im Anschluss daran das Medium abgenommen und neues, unbehandeltes Medium dazu gegeben. Nach sieben bzw. zehn Tagen werden die Zellen mit Cristal violet gefärbt, um die gebildeten Kolonien darzustellen. Sie werden gezählt und quantitativ erfasst. Material und Methoden 25 2.2.5 Proteinanalyse 2.2.5.1 Proteinextraktion Hierzu werden die Zellen in 10cm-Schalen in der jeweiligen Dichte ausgesät. Da Proteine sehr hitzeempfindlich sind und leicht durch Proteasen gespalten werden, findet die Proteingewinnung auf Eis statt. Nach zwei Waschschritten mit PBS und jeweils 5 minütiger Zentrifugation mit 1800rpm bei 4°C werden die Zellpellets 15min mit Lysepuffer inkubiert. Das dabei entstehende Lysat wird 25min mit 14000rpm bei 4°C zentrifugiert und die so gewonnenen Proteine werden im Überstand abgenommen und können bei -20°C gelagert werden. 2.2.5.2 Proteinbestimmung Um den Proteingehalt der Zelllysate zu ermitteln wird das BCA Protein Assay nach Pierce genutzt. Dazu werden eine Standardverdünnungsreihe mit acht BSA-Konzentration sowie die Zellproben in jeweils dreifacher Ausführung in eine 96well-Flachboden-Mikrotiterplatte gegeben und BCA-Lösung dazu pipettiert. Vor der Messung werden die Proben 15min bei 37°C inkubiert. Die BCA-Lösung wird aus 50 Einheiten Pierce-Reagenz A und 1 Einheit Pierce-Reagenz B hergestellt. Letztere ist eine Kupfersulfatlösung, die eine Biuret-Reaktion bewirkt und 2+ 1+ eine Komplexbildung der Protein-Peptidbindung mit Cu -Ionen, die zu Cu -Ionen reduziert werden, hervorruft. Durch die in Lösung A enthaltene Bicinchoninsäure (BCA) 1+ bildet mit den vorher entstandenen Cu -Ionen einen stabilen Farbkomplex, dieser wird absorbiert und fotometrisch bei einer Wellenlänge von 562nm detektiert. Die Messung findet im Spektralfotometer (ELISA-Reader) statt. Aus der BSA-Standardreihe wird eine Eichgerade abgeleitet und daran gemessen die Proteinkonzentrationen der einzelnen Proben ermittelt. Aus den Dreierwerten wird ein Mittelwert errechnet. 2.2.5.3 Elektrophoretische Proteinauftrennung Das Prinzip der Auftrennung der Proteine in Proteinbanden beruht auf deren Denaturierung und anschließender Elektrophorese, genannt SDS-PAGE (Sodiumdoedecylsulfat- Polyacrylamidgel-Elektrophorese). Das Gel enthält Acrylamid, APS, TEMED, SDS, H2O und Puffer. Acrylamid polymerisiert durch eine Kettenreaktion zu Polyacrylamid, APS startet und TEMED katalysiert diese Reaktion. SDS als anionisches Tensid bricht nicht- Material und Methoden 26 kovalente Proteinbindungen auf und führt des Weiteren zu einer gleichmäßigen Negativierung der Proteine, was für deren Bewegung in Richtung Anode verantwortlich ist. Das SDS-Polyacrylamidgel wird zu dem Zelllysat gegeben und das Gemisch bei 96°C drei Minuten hitzedenaturiert. Anschließend werden 50µg Protein, Ladepuffer und der Proteingrößenmarker in die Geltaschen geladen. Die Proteinauftrennung durch Elektrophorese erfolgt in Puffermedium bei 120V und 400mA. Die für die Proteinauftrennung genutzten Gele bestehen aus einem 6%-igem Sammel- und einem 12%-igem Trenngel. 2.2.5.4 Western blot-Analyse Im nächsten Schritt werden die Proteinbanden von dem Polyacrylamidgel ebenfalls elektrophoretisch auf eine Trägermembran aus Nitrocellulose übertragen. In dem SemidryBlot-System wird ein elektrisches Feld von 1mA/cm², das senkrecht zum Gel läuft, genutzt, wobei das Muster der Proteinauftrennung beibehalten wird und die Proteine nun für Anitkörperbindungsversuche genutzt werden können. Zum Blotten wird ein Blottingpuffer verwendet, die Spannung beträgt 1mA/cm². Anschließend wird das an den Proteinen angelagerte SDS ausgewaschen und dadurch wieder renaturiert. Durch Zugabe eines 5%-igen, in einfach-PBST gelöstem Milchpulver werden unspezifische Proteinbindungen geblockt damit die Bindung von Antikörper an diese vermindert. 2.2.5.5 Immunochemischer Nachweis von Proteinen Um die gesuchten Proteine zu detektieren wird das Prinzip der Anitgen-AntikörperBindung genutzt. Hierzu wird ein anitgenspezifischer, mono- oder polyklonaler Primärantikörper in BSA oder Milch gelöst und 24h bei 4°C zu der Nitrozellulosemembran gegeben, wobei er an das Epitop des gesuchten Proteins bindet. Die Membran wird danach 30min mit einfach-PBST gewaschen, um überschüssige, nicht gebundene Antikörper zu entfernen und schließlich wird ein mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) konjugierter Sekundärantikörper 1:5000 in 5%-igem Milchpulver für eine Stunde zur Membran gegeben, der an die Fc-Region des Primärantikörpers bindet. Der Sekundärantikörper dient als Markierungsantikörper, über den die Detektion erfolgt. Die HRP oxidiert Luminol, welches in einer zugegebenen Chemilumineszenzlösung (ECL-Entwicklerlösung) enthalten ist. So kommt es zu einer Lumineszenz der von uns gesuchten und markierten Material und Methoden 27 Proteine, die mittels einer Entwicklermaschine auf einem fotografischen Film sichtbar werden. In allen Western Blots wurden β-Aktin oder α-Tubulin als Kontrolle für eine gleichmäßige Proteinladung verwendet. Die gezeigten Western Blots sind repräsentativ für drei voneinander unabhängige Versuche. 2.2.6 Caspaseninhibierung Um die Wirkungsabhängigkeit der Caspasen zu untersuchen, wurden die Neuroblastomzellen parallel zur Stimulation mit TRAIL in An- oder Abwesenheit von PI-103 mittels des Pancaspaseninhibitors zVAD.fmk für 24h in einer Konzentration von 20µM behandelt und somit die Caspasen inhibiert. 2.2.7 Messung der Caspasenaktivität Für den Nachweis der Aktivität von Caspase-3 und -8 werden unterschiedliche, Fluoreszenzfarbstoff-konjugierte Substrate verwendet: zDEVD für Caspase-3 und zIETD für Caspase-8. Vor der Präparation werden die Neuroblastomzellen zweimal mit PBS gewaschen und dazwischen jeweils 5min bei Raumtemperatur und 1800rpm zentrifugiert. Im Anschluss werden die Zellen mit 100µM des jeweiligen Caspasensubstrats für 30min im Wasserbad bei 37°C inkubiert. Erneutes Waschen in PBS und anschließend zügige Messung der Caspasenaktivität mittels Durchflusszytometer. 2.2.8 Messung des mitochondrialen Membranpotentials Während der Apoptose kommt es zu einer Abnahme des Membranpotentials des Mitochondriums durch Porenbildung in der äußeren Mitochondrienmembran. Mittels des Farbstoffs Mito Tracker Red CMXros wird die Permeabilisierung der Membran detektiert. Solange Mito Tracker Red CMXros reduziert ist, fluoresziert es nicht. Oxidiert wird es in aktiven Zellen durch Ros, und gelangt durch die mitochondriale Membranpermeabilisierung ins Zytosol. Um den Verlust des mitochonrialen Membranpotentials zu messen, werden die Zellen nach der Stimulation abtrypsiniert, in PBS gewaschen und nach zwei Zentrifugationsschritten für 5min bei Raumtemperatur und 1800rpm für 30min bei 37°C mit 1µM CMXros in PBS inkubiert. Durch darauf folgendes Waschen mit PBS wird der überschüssige Farbstoff entfernt. Die anschließende Messung mittels Durchflusszytometer sollte unverzüglich durchgeführt werden. Material und Methoden 2.2.9 28 Mikroskopie und Fotografie Für die Darstellung der morphologischen Veränderungen der Zellen während der Apoptose werden die Neuroblastomzellen in 6-well-Platten ausgesät, stimuliert, anschließend mit PBS gewaschen und ohne Färbung unter dem Lichtmikroskop beurteilt und fotografiert. 2.2.10 Statistik Zur statistischen Auswertung wird Microsoft® Excel genutzt. Bei der deskriptiven Statistik werden, soweit nicht anders gekennzeichnet, Mittelwerte der Dreierwerte von je drei unabhängigen Experimenten errechnet und die Standardabweichung bestimmt. Der zweiseitige Student-t-Test wird zur Ermittlung der statistischen Signifikanz genutzt, das Signifikanzniveau ist auf p = 0.05 festgelegt. Ist der errechnete p-Wert größer als das Signifikanzniveau, gilt die Nullhypothese als bestätigt. Das bedeutet, dass die vergleichenden Gruppen sich nicht signifikant unterscheiden. Ist der p-Wert unter dem Signifikanzniveau, gilt der Unterschied zwischen den beiden Gruppen als statistisch signifikant. Ein p-Wert von ≤ 0,05 (*) gilt als statistisch signifikant, von ≤ 0,001 (**) als hoch signifikant. Ergebnisse 29 3 Ergebnisse 3.1 Inhibierung von PI3K sensitiviert Neuroblastomzellen für Todesrezeptor-induzierte Apoptose Die Phosphorylierung von Akt, einem Schlüsselmolekül des PI3K/Akt-Signalweges, tritt frequentiert in primären Neuroblastom-Patientenproben auf und korreliert mit einer schlechten Prognose (Opel et al. 2007). Ziel dieses Projektes ist, die Bedeutung des PI3K/Akt-Signalweges bei der Regulation von Todesrezeptor-induzierter Apoptose im Neuroblastom zu charakterisieren. Dazu wird der spezifische PI3K-Inhibitor PI-103 verwendet, der, bereits nachgewiesen in vorliegenden Experimenten, die Phosphorylierung und damit Aktivierung von Akt als Target von PI3K dosis- und zeitabhängig hemmt. Als erstes stellte sich die Frage, ob die Hemmung der PI3K durch PI-103 Neuroblastomzellen für Todesrezeptor-induzierte Apoptose sensitiviert. Dazu wurden SH-EP und SK-N-AS Neuroblastomzellen mit TRAIL oder mit der Kombination von TRAIL und PI-103 behandelt. Der bereits etablierte PI3K Inhibitor LY294002 diente als Positivkontrolle. Durch Analyse der DNA-Fragmentierung im Durchflusszytometer nach TRAILExposition in Kombination mit PI-103, LY294002 oder DMSO als Negativkontrolle wurde die spezifische Apoptose gemessen. SH-EP Neuroblastomzellen zeigen eine signifikante Erhöhung der Apoptoserate durch die Kombinationsbehandlung von TRAIL und PI-103 gegenüber der Behandlung von TRAIL und DMSO, wobei die Apoptose TRAIL-dosisabhängig steigt (Abb.3). Bereits nach 24h scheint die maximale Apoptose erreicht, da zum späteren Zeitpunkt von 48h keine Erhöhung der Apoptose folgt. In der Kombinationsbehandlung von TRAIL mit LY294002 wurden vergleichbare Ergebnisse erzielt (Abb.3). Ergebnisse 30 90 80 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 % spezifische Apoptose ** ** 70 60 50 40 30 20 10 0 % spezifische Apoptose 48h ** * * 0. 1 0.25 0.5 1 2 ng/ml TRAIL 5 ** ** ** ** * * 0,1 0,25 0,5 1 2 5 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 % spezifische Apoptose % spezifische Apoptose 24h ** ** * * 2 0.1 0.25 0.5 1 ng/ml TRAIL 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 ng/ml TRAIL 5 ** ** ** 0,1 0,25 0,5 1 2 ng/ml TRAIL 5 Abb.3: Inhibierung von PI3K sensitiviert SH-EP Neuroblastomzellen für TRAIL-induzierte Apoptose SH-EP Neuroblastomzellen wurden für 24h und 48h mit den angegebenen TRAIL-Konzentrationen in Abwesenheit ( ) bzw. Anwesenheit von 0,6µM PI-103 ( ) oder 20µM LY294002 ( ) behandelt. Die spezifische Apoptose wurde durch die Analyse der DNA-Fragmentierung mittels FACS bestimmt. Die Daten repräsentieren Mittelwerte und Standardabweichungen von drei unabhängigen Experimenten, welche jeweils in Triplikaten durchgeführt wurden. Die Signifikanz ist dargestellt mit p* ≤ 0,05 und p** ≤ 0,001. TRAIL: Tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand Ergebnisse 31 In Abb.4 ist die Wirkung der Kombinationsbehandlung von TRAIL mit PI3K-Inhibitoren in SK-N-AS Neuroblastomzellen dargestellt. SK-N-AS Neuroblastomzellen lassen sich mit LY294002 für TRAIL-induzierte Apoptose sensitivieren. 24h 48h 10 5 40 35 30 25 20 15 10 2 * * 70 * * * 2 5 0 5 0 25 20 15 10 5 10 20 50 ng/ml TRAIL * 10 20 50 5 ng/ml TRAIL % spezifische Apoptose 15 40 35 30 2 5 10 20 ng/ml TRAIL * 60 50 * * 40 30 20 50 * * * * * 10 0 2 5 10 20 ng/ml TRAIL 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 % spezifische Apoptose 20 0 % spezifische Apoptose % spezifische Apoptose 25 % spezifische Apoptose % spezifische Apoptose 30 72h 50 2 5 10 20 ng/ml TRAIL 50 2 5 10 20 ng/ml TRAIL 50 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 Abb.4: Inhibierung von PI3K durch LY294002 sensitiviert SK-N-AS Neuroblastomzellen für TRAIL-induzierte Apoptose Die Zellen wurden für 24h, 48h und 72h mit den angegebenen TRAIL-Konzentrationen in Abwesenheit ( ) oder Anwesenheit von 0,6µM PI-103 ( ) oder 20µM LY294002 ( ) behandelt. Die spezifische Apoptose wurde durch die Analyse der DNA-Fragmentierung mittels FACS bestimmt. Die Daten repräsentieren Mittelwerte und Standardabweichungen von drei unabhängigen Experimenten, welche jeweils in Triplikaten durchgeführt wurden. Die Signifikanz ist dargestellt mit p* ≤ 0,05. TRAIL: Tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand Ergebnisse 32 Nachdem die Apoptose-Sensitivierung von SH-EP Neuroblastomzellen durch eine kombinierte Gabe von PI3K-Inhibitor und TRAIL dargestellt werden konnte, wurde CD95 als weiteres Todesrezeptorsystem verwendet, um zu testen, ob die nachgewiesene Sensitivierung von SH-EP Neuroblastomzellen durch PI-103 nicht ausschließlich auf TRAIL beschränkt ist. Folglich wurden SH-EP Neuroblastomzellen mit verschiedenen Anti-CD95-Konzentrationen in An- und Abwesenheit von PI3K-Inhibitoren behandelt und anschließend in der Durchflusszytometrie gemessen. Hierbei zeigt sich eine signifikante, dosisabhängige Erhöhung der Apoptose bei der kombinierten Gabe von CD95-Antikörper und PI-103 im Vergleich zur Stimulation von CD95-Antikörper und DMSO. Derselbe dosisabhängige und signifikante Effekt ist mit CD95-Antikörper in der Kombination mit LY294002 zu sehen (Abb.5). 60 70 50 60 * * 40 * 30 20 * 10 0 % spezifische Apoptose % spezifische Apoptose 24h 50 * * * * 10 30 100 * 40 30 20 10 1 3 10 30 100 0 1 ng/ml Anti-CD95 3 ng/ml Anti-CD95 Abb.5: PI3K-Inhibierung sensitiviert SH-EP Neuroblastomzellen für Anti-CD95-induzierte Apoptose Die Zellen wurden für 24h mit den angegebenen Anti-CD95-Konzentrationen in Abwesenheit ( ) oder Anwesenheit von 0,6µM PI-103 ( ) oder 20µM LY294002 ( ) behandelt. Die spezifische Apoptose wurde durch die Analyse der DNA-Fragmentierung mittels FACS bestimmt. Die Daten repräsentieren Mittelwerte und Standardabweichungen von drei unabhängigen Experimenten, welche jeweils in Triplikaten durchgeführt wurden. Die Signifikanz ist dargestellt mit p* ≤ 0,05. Ergebnisse 33 Im nächsten Schritt wurden unterschiedliche Stimulationsschemata angewendet. Die bisher dargestellten Ergebnisse beruhen auf der gleichzeitigen Gabe von TRAIL oder CD95Antikörper und PI3K-Inhibitor. Es stellte sich die Frage, ob es zu einer Veränderung der Apoptoserate kommt, wenn SH-EP Neuroblastomzellen mit PI-103 vor- bzw. nachher inkubiert werden. Dabei wurde sich an Western Blot-Analysen aus Vorarbeiten der Arbeitsgruppe orientiert. In diesen wurde eine vollständige Hemmung der Phosphorylierung von Akt und S6 ribosomalem Protein durch PI-103 nach 2h beobachtet. Aus diesem Grund wurden SH-EP Neuroblastomzellen 2h vor oder nach der Stimulation mit zwei verschiedenen TRAIL-Konzentrationen mit dem PI3K-Inhibitor inkubiert, im Vergleich zur gleichzeitigen Behandlung mit TRAIL und PI-103 (Abb.6). Als Ergebnis zeigen sich keine gravierenden Unterschiede der induzierten Apoptoserate bei den verschiedenen Stimulationszeitpunkten. Aus diesem Grund wird die parallele Stimulation von SH-EP Neuroblastomzellen mit PI3K-Inhibitor und TRAIL beibehalten. PI-103 * 30 * 25 20 * * 15 * 10 5 0 80 * % spezifische Apoptose % spezifische Apoptose 35 LY294002 * 70 60 * 50 40 * * * * 30 20 10 prä post prä co 0,5 co post 0 co prä 1 post prä co 0,5 post 1 ng/ml TRAIL ng/ml TRAIL Abb.6: Effekt von co-, prä- oder post-Inkubation auf PI3K-Inhibierung und TRAILinduzierte Apoptose SH-EP Neuroblastomzellen wurden für 24h mit angegebenen TRAIL-Konzentrationen in Abwesenheit ( ) oder Anwesenheit von 0,6µM PI-103 ( ) oder 20µM LY294002 ( ) 2h vor, nach oder gleichzeitig mit TRAIL behandelt. Die spezifische Apoptose wurde durch die Analyse der DNA-Fragmentierung mittels FACS bestimmt. Die Daten repräsentieren Mittelwerte und Standardabweichungen von drei unabhängigen Experimenten, welche jeweils in Triplikaten durchgeführt wurden. Die Signifikanz ist dargestellt mit p* ≤ 0,05. TRAIL: Tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand Ergebnisse 34 Zur Testung eines dritten Todesrezeptorsystems wurden im ersten Schritt zur Findung geeigneter Konzentrationen SH-EP Neuroblastomzellen mit ETR1 und ETR2 behandelt, als Negativkontrolle diente das IgG MOPC. Das Ergebnis zeigt bei der Behandlung mit ETR2 eine dosisabhängige Verminderung der Viabilität von SH-EP Neuroblastomzellen. Dies spiegelt Ergebnisse der Arbeitsgruppe wieder, die zeigen, dass SH-EP Neuroblastomzellen nicht den TRAIL-Rezeptor-1 exprimieren (Abb.7). 48h 120 Viabilität (%) 100 80 60 40 20 0 0 0,3 1 3 10 µg/ml Abb.7: ETR2 reduziert die Viabilität von SH-EP Neuroblastomzellen Die Zellen wurden für 48h mit den angegebenen Konzentrationen von ETR1 ( oder MOPC ( ), ETR2 ( ) ) behandelt. Die Viabilität wurde anschließend mittels MTT-Assay gemessen und prozentual dargestellt. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass sich SH-EP Neuroblastomzellen für TRAIL- und CD95-induzierte Apoptose durch die PI3K-Inhibitoren PI-103 und LY294002 sensitivieren lassen und durch eine Behandlung mit ETR2 die Viabilität vermindert wird. Aus diesem Grund wurden SH-EP Neuroblastomzellen für weitere Untersuchungen ausgewählt, bei denen zunächst der Aspekt auf die Wirkung der Kombinationsbehandlung auf das Langzeitüberleben untersucht wurde. Ergebnisse 3.2 35 Inhibierung der PI3K supprimiert das Langzeitüberleben von SH-EP Neuroblastomzellen nach TRAIL-Behandlung Die bisherigen Ergebnisse verdeutlichen, dass eine Inhibierung von PI3K SH-EP Neuroblastomzellen für Todesrezeptor-induzierte Apoptose sensitiviert. Jedoch wurden vorherige Untersuchungen im Sinne einer Therapie für relativ kurze Zeitpunkte durchgeführt. Zur Ermittelung des Langzeiteffektes der Kombinationstherapie wurden „Colony Forming Assays“ (CFA) durchgeführt. Wie in Abb.8 dargestellt, zeigt sich eine Abnahme der Kolonienanzahl bei Stimulation der Zellen mit TRAIL. Dieser Effekt wird durch die zusätzliche PI3K-Inhibition immens verstärkt. DMSO PI-103 24h 140 120 24h * - TRAIL % Kolonien 100 24h 80 60 40 + TRAIL 20 0 Abb.8: TRAIL und PI-103 hemmen das DMSO klonogene PI-103 TRAIL Überleben PI-103+ TRAIL von SH-EP Neuroblastomzellen SH-EP Neuroblastomzellen wurden mit 0,6µM PI-103 oder DMSO in An- oder Abwesenheit von 2ng/ml TRAIL für 6h und 24h inkubiert, das Medium wurde gewechselt und nach zehn Tagen wurden die Kolonien mit Kristallviolett angefärbt. Abb.8 repräsentiert das Resultat von drei unabhängigen Versuchen (links). Die quantitative Analyse aus drei unabhängigen Experimenten ist rechts dargestellt. Die Daten repräsentieren Mittelwerte und Standardabweichungen von drei unabhängigen Experimenten, welche jeweils in Triplikaten durchgeführt wurden. Die Signifikanz ist dargestellt mit p* ≤ 0,05. TRAIL: Tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand Ergebnisse 3.3 36 Inhibierung von PI3K sensitiviert SH-EP Neuroblastomzellen für TRAIL-induzierte Caspasenaktivität Um zu untersuchen, ob die TRAIL-induzierte Apoptose Caspasen-abhängig ist, wurde im folgenden Experiment der Pancaspaseninhibitor zVAD.fmk verwendet. SH-EP Neuroblastomzellen wurden mit TRAIL allein oder in Kombination mit PI-103 und zVAD.fmk stimuliert. Dabei zeigt sich, dass die TRAIL-induzierte Apoptose vollständig durch zVAD.fmk blockierbar ist, was darauf hindeutet, dass die Sensitivierung von SH-EP Neuroblastomzellen durch PI3K-Inhibition für TRAIL-induzierte Apoptose auf einer Aktivierung von Caspasen beruht (Abb.9). Ebbenfalls in Abb.9 zu sehen ist die zeitabhängige Wirkung der Kombinationsbehandlung von SH-EP Neuroblastomzellen. Bereits nach 2h stellt sich eine starke und signifikante Erhöhung der Apoptoserate unter Kombinationsbehandlung dar. Dieselben Ergebnisse zeigt die Behandlung mit LY294002. Aus diesem Grund werden in den folgenden Versuchen die frühen Zeitpunkte näher untersucht. Ergebnisse 37 PI-103 80 LY294002 90 * 80 * * 60 % spezifische Apoptose % spezifische Apoptose 70 * 50 40 * 30 20 * * 70 * 60 * 50 40 * 30 20 10 10 0 0 0,5 1 2 4 6 Zeit (h) 12 24 24 zVAD 0,5 1 2 4 6 12 24 24 zVAD Zeit (h) Abb.9: PI3K-Inhibierung sensitiviert SH-EP Neuroblastomzellen für Caspasen-abhängige TRAIL-induzierte Apoptose SH-EP Neuroblastomzellen wurden für die angegebenen Zeitpunkte mit 2ng/ml TRAIL in Abwesenheit ( ) oder Anwesenheit von 0,6µM PI-103 ( ) oder 20µM LY294002 ( behandelt. Weiterhin wurden die Zellen für 24h mit 2ng/ml TRAIL in An- ( ( ) ) bzw. Abwesenheit ) des jeweiligen PI3K-Inhibitors mit 20µM des Pancaspaseninhibitors zVAD.fmk inkubiert. Die spezifische Apoptose wurde durch die Analyse der DNA-Fragmentierung mittels FACS bestimmt. Die Daten repräsentieren Mittelwerte und Standardabweichungen von drei unabhängigen Experimenten, welche jeweils in Triplikaten durchgeführt wurden. Die Signifikanz ist dargestellt mit p* ≤ 0,05. TRAIL: Tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand Ergebnisse 38 Alle Zellen zeigen während der Apoptose typisch morphologische Veränderungen wie Zellschrumpfung, Blasenbildung der Zellmembran („blebbing“) und Fragmentierung des Zellkerns. Da in den vorherigen Versuchen eine starke Erhöhung der Apoptoserate in der Kombinationsbehandlung nachweisbar war, wurden SH-EP Neuroblastomzellen lichtmikroskopisch untersucht. Hier zeigt sich nach Behandlung mit PI-103 und TRAIL neben Zellschrumpfung und „blebbing“ eine starke Abnahme der Zelldichte, was durch zVAD.fmk vollständig blockiert wird. Diese Veränderungen stellen sich nicht bei alleiniger Stimulation mit PI-103 oder der DMSO-Kontrolle dar (Abb.10). DMSO PI-103 PI-103+zVAD.fmk -TRAIL +TRAIL Abb.10: Morphologische Veränderungen von SH-EP Neuroblastomzellen unter der Behandlung mit TRAIL und PI-103 und dem Caspaseninhibitor zVAD.fmk SH-EP Neuroblastomzellen wurden mit 0,6µM DMSO, 0,6µM PI-103 oder 0,6µM PI-103 und zVAD.fmk in An- oder Abwesenheit von 2ng/ml TRAIL inkubiert und nach 24h unter dem Lichtmikroskop fotografiert. Es zeigen sich typisch apoptotische Veränderungen der Morphologie ( ). Die Bilder stehen repräsentativ für drei unabhängige Experimente. TRAIL: Tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand Ergebnisse 39 Nachdem gezeigt wurde, dass die Sensitivierung von SH-EP Neuroblastomzellen für TRAIL-induzierte Apoptose durch PI3K-Inhibierung Caspasenabhängig ist, wurden ausgewählte Caspasen und deren Spaltprodukte mittels Western Blot analysiert. Dazu wurden SH-EP Neuroblastomzellen mit 0,6µM DMSO oder 0,6µM PI-103 in Anoder Abwesenheit von 2ng/ml TRAIL für unterschiedliche Zeitpunkte behandelt und die Veränderungen der Expressionslevel mittels Western Blot untersucht. Dabei ist zu sehen, dass im Gegensatz zur Stimulation mit TRAIL allein, die Kombinationsbehandlung von TRAIL und PI-103 bereits sehr früh zu einer verstärkten Spaltung der Caspasen-8 und -3 führt. Zeitlich verzögert dazu ist die Spaltung der Caspasen-9 und -2 nach Kombinationsbehandlung zu sehen, nachweisbar durch die Detektion der aktiven Spaltfragmente und Abnahme der Proform. Eine Spaltung von Bid zu tBid wird analog zu Caspase-8 relativ frühzeitig detektiert (Abb.11). Zusammenfassend zeigt die Western Blot Analyse, dass es zu verstärkter CaspasenSpaltung, gemessen am Rückgang der Proform und Erscheinen der Spaltprodukte, nach kombinierter Gabe von TRAIL und PI-103 kommt. Ergebnisse 40 0,25 1 2 4 + - + + - ++ - + + - + + - + - + + - + + - + + - + + - + + 6 12 18 24 + - + + - + + - + + - + - + + - + + - + + - + + Caspase-8 - 0,5 Zeit (h) - PI-103 TRAIL 55kD 18kD Caspase-3 18kD 32kD 20kD 18kD 12kD Bid 22kD Caspase-9 15kD 45kD 37kD Caspase-2 48kD α-Tubulin 15kD Abb.11: 55kD PI-103 sensitiviert SH-EP Neuroblastomzellen für TRAIL-induzierte Caspasenspaltung SH-EP Neuroblastomzellen wurden für die angegebenen Zeitpunkte mit 0,6µM DMSO oder 0,6µM PI-103 in An- oder Abwesenheit von 2ng/ml TRAIL inkubiert. Die Proteinexpression der Caspasen-8, -3, -9 und -2 und Bid wird mittels Western Blot Analse dargestellt. Die relative Molekülmasse der Proteine ist in kilo-Dalton (kDa) angegeben. α-Tubulin diente als Ladekontrolle. ( : Spaltprodukte : Proform ) Gezeigt ist jeweils ein repräsentatives Experiment aus drei unabhängigen Versuchen. TRAIL: Tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand Ergebnisse 41 Um die Aktivität der Caspasen-3 und -8 direkt zu untersuchen, wurden im Anschluss enzymatische Caspasenassays mit Fluoreszenz-markiertem Caspasensubstraten durchgeführt. SH-EP Neuroblastomzellen wurden für 1h bis 6h mit 2ng/ml TRAIL bzw. mit TRAIL in Kombination mit 0,6µM PI-103 oder 20µM LY294002 behandelt. Die enzymatische Aktivität der Caspasen wurde nach Zugabe der spezifischen Caspasensubstrate mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Die Ergebnisse zeigen eine zeitabhängige Zunahme der Caspase-3- und -8-Aktivität durch die Kombinationsbehandlung, dabei stellt sich der Effekt bei Caspase-8 diskreter dar (Abb.12). Zusammenfassend wurde gezeigt, dass die durch PI3K-Inhibierung sensitivierte, TRAILinduzierte Apoptose in SH-EP Neuroblastomzellen Caspasenabhängig ist. 42 Caspase-3 80 Zunahme Caspasenaktivität (%) Zunahme Caspasenaktivität (%) Ergebnisse 70 60 50 40 30 20 10 0 1 DMSO 2 4 Zeit (h) 6 Caspase-8 70 60 50 40 30 20 10 1 0 4 2 6 Zeit (h) PI-103 TRAIL TRAIL+PI-103 Ereignisse Caspase-3 Caspase-8 Fluoreszenzintensität Abb.12: PI3K-Inhibierung sensitiviert SH-EP Neuroblastomzellen für TRAIL-induzierte Caspasenaktivität SH-EP Neuroblastomzellen wurden für die angegebenen Zeitpunkten mit 2ng/ml TRAIL und in Abwesenheit ( ) oder Anwesenheit von 0,6µM PI-103 ( ) oder mit PI-103 allein ( ) stimuliert. Die enzymatische Aktivität der Caspasen-3 und -8 wurde in der Durchflusszytometrie gemessen und quantitativ ausgewertet (oben). Die Daten repräsentieren Mittelwerte von drei unabhängigen Experimenten, welche jeweils in Triplikaten durchgeführt wurden. Zur Veranschaulichung der Veränderungen der Zellpopulation unter jeweiliger Behandlung sind repräsentativ Grafiken dargestellt (unten). TRAIL: Tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand Ergebnisse 3.4 43 PI-103 sensitiviert SH-EP Neuroblastomzellen für einen TRAILinduzierten Verlust des mitochondrialen Membranpotentials Der Todesrezeptorligand TRAIL aktiviert den extrinsischen Apoptosesignalweg. Die mittels Western Blot-Analyse nachgewiesene Spaltung von Bid zu truncated Bid gibt einen Hinweis darauf, dass das Mitochondrium an der Sensitivierung für TRAIL-induzierte Apoptose mitwirkt (Abb.11). Um zu untersuchen, ob der mitochondriale Signalweg in die Sensitivierung von SH-EP Neuroblastomzellen für Todesrezeptor-induzierte Apoptose durch PI3K-Inhibition involviert ist, wurden die Veränderungen des mitochondrialen Membranpotentials (MMP) mittels Durchflusszytometrie untersucht. Dazu wurden SH-EP Neuroblastomzellen mit 2ng/ml TRAIL in An- und Abwesenheit von 0,6µM PI-103 für Zeitpunkte von 15min bis 24h stimuliert und anschließend die Veränderungen des MMP mittels Durchflusszytometrie gemessen. Dabei ist ein deutlich erhöhter, zeitabhängiger Verlust des MMP nach der Stimulation mit TRAIL und PI-103 im Vergleich zur alleinigen Behandlung gegeben (Abb.13). Ergebnisse 44 80 Abnahme des MMP % 70 60 50 40 30 20 10 0 0,25 0,5 1 2 4 6 12 18 24 Zeit (h) PI-103 TRAIL TRAIL+PI-103 Ereignisse DMSO Fluoreszenzintensität Abb.13: PI3K-Inhibierung sensitiviert SH-EP Neuroblastomzellen für TRAIL-induzierte Aktivierung des mitochondrialen Signalweges SH-EP Neuroblastomzellen wurden für die angegebenen Zeitpunkte mit DMSO ( ), mit 6µM PI-103 ( ), mit 2ng/ml TRAIL ( ) oder mit der Kombination von 2ng/ml TRAIL und 0,6µM PI-103 ( ) stimuliert. Der Verlust des mitochondrialen Membranpotentials (MMP) wurde mittels CMX.ros in der Durchflusszytometrie gemessen und quantitativ dargestellt (oben). Die Daten repräsentieren Mittelwerte von drei unabhängigen Experimenten, welche jeweils in Triplikaten durchgeführt wurden. Zur Veranschaulichung der Veränderungen der Zellpopulation unter jeweilige Behandlung sind repräsentativ Grafiken dargestellt (unten). TRAIL: Tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand Ergebnisse 3.5 45 Effekt der Kombinationsbehandlung von TRAIL und PI-103 auf Apoptoseregulierende Proteine in SH-EP Neuroblastomzellen Um Einblick in die molekularen Mechanismen von PI-103-vermittelter Sensitivierung von SH-EP Neuroblastomzellen für TRAIL-induzierte Apoptose zu gewinnen, wurden einige Apoptose-regulierende Proteine ausgewählt und deren Expressionslevel mittels Western Blot analysiert. Dazu wurden SH-EP Neuroblastomzellen mit 0,6µM DMSO oder 0,6µM PI-103 in Anoder Abwesenheit von 2ng/ml TRAIL für unterschiedliche Zeitpunkte behandelt und die Veränderungen der Expressionslevel mittels Western Blot untersucht. Wie in Abb.14 veranschaulicht, wird Fliplong durch die Kombinationsbehandlung mit PI-103 und TRAIL bereits nach 2h herunterreguliert, obgleich es sich um einen transienten Effekt handelt. Flipshort nimmt in der Kombinationsbehandlung ebenfalls ab. Mcl-1 scheint unter der Kombinationsbehandlung gegenüber der alleinigen Stimulation mit TRAIL ebenfalls transient reduziert, die Stimulation mit ausschließlich TRAIL bewirkt eine Hochregulation. Das im Gegensatz zu Flip und Mcl-1 pro-apoptotische Noxa scheint ab 12h unter der kombinierten Stimulation von TRAIL und PI-103 zuzunehmen, was auf eine Beeinflussung der transkriptionellen Regulierung durch den PI3K-Signalweg schließen lässt. Ergebnisse 0,25 0,5 1 2 4 + - + + - ++ - + + - + + - + - + + - + + - + + - + + - + + 6 12 18 24 + - + + - + + - + + - + - + + - + + - + + - + + Zeit (h) PI-103 TRAIL 56kD Mcl-1 26kD 42kD Noxa - 12kD β-Actin Flipshort Fliplong - 46 40kD Abb.14: Effekt der Kombinationsbehandlung von TRAIL und PI-103 auf verschiedene Regulationsproteine SH-EP Neuroblastomzellen wurden für die angegebenen Zeitpunkte mit 0,6µM DMSO oder 0,6µM PI-103 in An- oder Abwesenheit von 2ng/ml TRAIL inkubiert. Die anschließende Detektion der Expressionslevel von Flip, Mcl-1 und Noxa erfolgte mittels Western Blot Analyse. Die relative Molekülmasse der Proteine ist in kilo-Dalton (kDa) angegeben. β-Actin diente als Ladekontrolle. Gezeigt ist ein repräsentatives Experiment aus drei unabhängigen Versuchen. TRAIL: Tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand Ergebnisse 3.6 47 Inhibierung von PI3K in Kombination mit TRAIL reduziert die Viabilität von SH-EP Neuroblastomzellen Um zu untersuchen, ob die Inhibierung von PI3K einen Effekt auf die Zellviabilität hat, wurden MTT-Assays durchgeführt. Dazu wurden SH-EP Neuroblastomzellen mit TRAIL allein oder in Kombination mit den PI3K-Inhibitoren PI-103 oder LY294002 behandelt. Im Ergebnis zeigt sich, dass die Zellviabilität von SH-EP Neuroblastomzellen mit zunehmender TRAIL-Konzentration abnimmt. Dieser Effekt wird durch die Kombinationsbehandlung mit PI-103 und mit LY294002 verstärkt (Abb.15). 48h 120 120 100 100 Viabilität (%) Viabilität (%) 24h 80 60 60 40 40 20 20 0 0 0 0,1 0,25 0,5 1 ng/ml TRAIL 2 5 120 120 100 100 Viabilität (%) Viabilität (%) 80 80 60 40 0 0,1 0,25 0,5 1 ng/ml TRAIL 2 5 0 0,1 0,25 0,5 1 ng/ml TRAIL 2 5 80 60 40 20 20 0 0 0 0,1 0,25 0,5 1 ng/ml TRAIL 2 5 Abb.15: Inhibierung von PI3K reduziert die Viabilität von SH-EP Neuroblastomzellen nach Behandlung mit TRAIL SH-EP Neuroblastomzellen wurden 24h und 48h mit den angegebenen TRAIL-Konzentrationen in Abwesenheit ( ) oder Anwesenheit von 0,6µM PI-103 ( ) oder 20µM LY294002 ( ) behandelt. Die Viabilität wurde anschließend mittels MTT-Assay gemessen und prozentual zu den unbehandelten Zellen dargestellt. Die Daten repräsentieren Mittelwerte und Standardabweichungen von Triplikaten. TRAIL: Tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand Ergebnisse 3.7 48 Inhibierung von mTOR sensitiviert SH-EP Neuroblastomzellen nicht für TRAIL-induzierte Apoptose Western Blot-Analysen aus vorangegangenen Experimenten zeigen, dass PI-103 sowohl die Phosphorylierung von Akt als Target von PI3K als auch die Phosphorylierung von S6 ribosomalem Protein als Target von mTOR hemmt. Im nächsten Schritt sollte deshalb untersucht werden, ob die Inhibierung von PI3K oder mTOR durch PI-103 maßgeblich für die Sensitivierung von TRAIL-induzierter Apoptose von SH-EP Neuroblastomzellen ist. Dazu wurden SH-EP Neuroblastomzellen mit Everolimus, einem spezifischen mTORInhibitor in Kombination mit TRAIL behandelt. Mittels FACS-Analyse wurde anschließend die Apoptoserate gemessen. Eine Inhibierung der PI3K, nicht jedoch eine Inhibierung von mTOR mittels Everolimus sensitiviert SH-EP Neuroblastomzellen für TRAIL-induzierte Apoptose (Abb.16). Dieses Ergebnis gibt einen Hinweis darauf, dass der durch PI-103 erzielte Effekt nicht durch die Hemmung auf mTOR-Ebene zurückzuführen ist, sondern dass die Regulierung oberhalb im Signalweg auf PI3K-Ebene stattfindet. 24h % spezifische Apoptose 70 ** 60 50 40 30 20 ** 10 0 0,1 0,25 0,5 1 2 5 ng/ml TRAIL Abb.16: Everolimus sensitiviert SH-EP Neuroblastomzellen nicht für TRAIL-induzierte Apoptose SH-EP Neuroblastomzellen wurden für 24h mit angegebenen TRAIL-Konzentrationen in Abwesenheit ( ) oder Anwesenheit von 10nM Everolimus ( oder Anwesenheit von 20µM LY294002 ( ) und in Abwesenheit ( ) ) behandelt. Die spezifische Apoptose wurde durch die Analyse der DNA-Fragmentierung mittels FACS bestimmt. Die Daten repräsentieren Mittelwerte und Standardabweichungen von drei unabhängigen Experimenten, welche jeweils in Triplikaten durchgeführt wurden. Die Signifikanz ist dargestellt mit p** ≤ 0,001. TRAIL: Tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand Ergebnisse 3.8 49 PI-103 hemmt die Phosphorylierung von Akt und S6 ribosomalem Protein in LAN5 Neuroblastomzellen Die bisherigen Ergebnisse deuten auf eine entscheidende Rolle des PI3K/Akt-Signalweges bei der Sensitivierung von TRAIL-induzierter Apoptose in SK-N-AS, vor allem aber in SH-EP Neuroblastomzellen hin. Weiteres, großes Interesse liegt in der Untersuchung weiterer Neuroblastomzelllinien, um die Frage zu beantworten, ob der Inhibierung der PI3K eine bedeutende Rolle in der Therapie des Neuroblastoms zukommt. Dazu wurden LAN5 Neuroblastomzellen ausgewählt, die eine erhöhte MYCN-Amplifikation aufweisen. Diese erhöhte Amplifikation korreliert klinisch mit einer schlechten Prognose. Mittels Western Blot-Analyse wurden Expressionslevel und Phosphorylierungsstatus von Akt und S6 ribosomales Protein nach Inhibierung der PI3K untersucht. Die Phosphorylierung von Akt und S6 ribosomalem Protein wurde mit zunehmender PI-103-Konzentration verstärkt gehemmt, wobei die Phosphorylierung von Akt bereits bei einer Konzentration von 0,1µM PI-103 unterdrückt wird, von S6 ribosomalem Protein bei 0,3µM PI-103 (Abb.17). Ergebnisse DMSO (LY294002) 20 µM LY294002 DMSO (PI-103) 0.05 0.1 0.3 0.6 1 unbehandelt 50 µM PI-103 pAkt 59kD Akt 59kD pS6 32kD S6 32kD α-Tubulin 55kD Abb.17: PI-103 inhibiert die Phosphorylierung von Akt und S6 ribosomalem Protein in LAN5 Neuroblastomzellen LAN5 Neuroblastomzellen wurden mit den angegebenen PI-103-Konzentrationen für 24h stimuliert. Mittels Western Blot-Analyse werden Expressionslevel und Phosphorylierungsstatus von Akt und S6 ribosomalem Protein analysiert. Die Stimulation der Zellen mit 20µM LY294002 diente als Positiv-, mit DMSO als Negativkontrolle. Die relative Molekülmasse der Proteine ist in kilo-Dalton (kDa) angegeben. α–Tubulin diente als Ladekontrolle. Gezeigt ist ein repräsentatives Experiment aus drei unabhängigen Experimenten. Diskussion 4 51 Diskussion Trotz intensiver Bemühungen, neue und erfolgreiche Therapieansätze für Krebserkrankungen zu finden, ist die Heilungsrate besonders bei high-grade Neuroblastompatienten nach wie vor gering. Schlussfolgernd besteht die Notwendigkeit, detaillierte Kenntnisse der für Tumorgenese und Progression bedeutenden Signalwege zu gewinnen, um neue, gezielte Behandlungsmodelle zu finden. Im Mittelpunkt dieser Ansätze steht häufig eine Induktion des programmierten Zelltodes, der Apoptose, da in vielen Tumoren eine Fehlregulierung der Apoptose-Signalwege besteht, verursacht beispielsweise durch eine Hyperaktivität des PI3K/Akt-Signalweges (Fulda u. Debatin 2004). Eine entscheidende Rolle spielt hier die PI3K, deren Aktivität in verschiedenen Tumorentitäten wie dem Glioblastom, Pankreas-, Ovarial- und Nicht-kleinzelligem Bronchialkarzinom massiv gesteigert ist und deren Erhöhung mit einer ungünstigen Prognose korreliert (Chakravarti et al. 2004, Bondar et al. 2002, Stoll et al. 2005, Hu et al. 2002, Kandasamy u. Srivastava 2002). Dies konnte auch für den häufigsten extrakraniellen, soliden Tumor im Kindesalter gezeigt werden: die Phosphorylierung von Akt, einem direkten Target von PI3K, korreliert mit einer schlechten Prognose des Neuroblastoms (Opel et al. 2007). 4.1 PI3K als Zielmolekül zur Sensitivierung von Neuroblastomzellen für Todesrezeptor-induzierte Apoptose In dieser Arbeit wurde basierend auf diesen Erkenntnissen der Frage nachgegangen, ob durch eine Inhibierung des PI3K/Akt-Signalweges eine Sensitivierung für Todesrezeptorinduzierte Apoptose in Neuroblastomzellen möglich ist und dadurch eine neue Therapieoption aufgezeigt werden kann. Dazu wurde die PI3K pharmakologisch durch PI-103 inhibiert, wodurch die Todesrezeptor-induzierte Apoptose durch TRAIL oder CD95-Antikörper gesteigert werden konnte. Eine detailliertere Analyse der Auswirkungen der Kombinationsbehandlung von PI-103 und TRAIL in Neuroblastomzellen zeigte eine starke Caspasen-Abhängigkeit der induzierten Apoptose, da eine Inhibierung der Caspasen durch den Pancaspaseninhibitor zVAD.fmk die Apoptose vollständig blockierte. Weiterhin verstärkte die Gabe von PI-103 zusätzlich zu TRAIL den Verlust des mitochondrialen Membranpotentials. Dies zeigt, dass sowohl der extrinsische wie auch intrinsische Apoptosesignalweg im Aktivierungsprozess involviert sind. Hervorzuheben ist die gesteigerte Unterdrückung des Langzeitüberlebens Diskussion 52 durch die kombinierte Behandlung von PI-103 und TRAIL im Vergleich zur Behandlung ausschließlich mit dem Todesrezeptorliganden. Die immense Bedeutung der PI3K wurde in den letzten Jahren deutlich und ihre Relevanz für zahlreiche Tumorarten ist in der aktuellen Literatur viel diskutiert (Engelman et al. 2009). Vielfach konnte die Wirkung durch Inhibierung der PI3K, Tumorzellen für Radiound Chemotherapie zu sensitivieren, gezeigt werden. Zur Inhibierung der PI3K wird seit langem LY294002 genutzt, ein PI3K-Inhibitor der ersten Generation. Kim et al. beschreiben eine Sensitivierung von Neuroblastomzellen durch LY294002 für TRAILinduzierte Apoptose (Kim et al. 2004). Dieser PI3K-Inhibitor erwies sich auf Grund seiner Unselektivität und Unlöslichkeit als ungeeignet für die klinische Anwendung (Fan et al.2006, Garcia-Echeverria u. Sellers 2008). Ein Inhibitor der zweiten Generation ist PI-103 (Raynaud et al. 2007). Beispielsweise wurde im Glioblastom sowohl eine Verminderung der Zellproliferation in vitro als auch eine verminderte Tumorzellinvasion in vitro und in vivo gezeigt (Fan et al. 2006, Raynaud et al. 2007). In AML-Zellen hatte die Inhibierung der PI3K durch PI-103 eine gesteigerte, nutilin-induzierte, p53-vermittelte Apoptose zur Folge (Park et al. 2008, Kojima et al. 2008). In ALL- und NSCLC-Zellen bewirkte PI-103 alleine eine Inhibierung des Zellwachstums (Zou et al. 2009) und wirkte in ALL-Zellen zusätzlich synergistisch zu Vincristin (Chiarini et al. 2009). Außerdem zeigte PI-103 additive pro-apoptotische Effekte mit Etoposid in unreifen Leukämiezellen (Park et al. 2008). Chaisuparat et al. wiesen eine effektive Inhibierung von Endothelzellproliferation und Überleben in vitro als auch des Tumorwachstums in vivo des KaposiSarkoms nach (Chaisuparat et al. 2008). Ebenfalls wurde eine Erhöhung der Radio- und Chemosensitivität durch PI-103 in Glioblastomzellen erreicht (Chen et al. 2008, Westhoff et al. 2009). In dieser Arbeit kann erstmals für einen der aggressivsten pädiatrischen Tumore die Sensitivierung für TRAIL-induzierte Apoptose durch PI3K-Inhibierung mittels PI-103 nachgewiesen werden und diese Kombinationstherapie scheint eine neue Möglichkeit zum klinischen Einsatz zur Verstärkung der Todesrezeptor-induzierten Apoptose im Neuroblastom zu bieten. Im Mittelpunkt des Wirkmechanismus von PI-103 steht die p110α-Untereinheit der PI3K. Neben ihr scheint auch die p110δ-Untereinheit von Bedeutung zu sein, zu der sich bereits spezifische Inhibitoren in Testung befinden. Boller et al. konnten sowohl eine Überexpression von p110δ in primären Neuroblastomzellen als auch einen Einfluss der p110δ-Isoform auf Wachstum und Überleben nachweisen (Boller et al. 2008). Diskussion 53 In der Kombination von PI-103 und TRAIL wird in Western Blot-Analysen dieser Arbeit eine Herunterregulierung des anti-apoptotischen Mitglieds der Bcl-2-Familie Mcl-1 beobachtet. Mcl-1 wird durch Akt über GSK-3 und CREB reguliert (Parcellier et al. 2008). Die Veränderungen der Mcl-1-Expression unter der Kombinationsbehandlung sind interessant, da in Zellen eines Hoch-Risiko-Neuroblastoms eine erhöhte Mcl-1-Expression nachgewiesen wurde (Abel et al. 2005). Die beobachtete Herunterregulierung korreliert einerseits mit der in dieser Arbeit nachgewiesenen Erhöhung der Apoptoserate durch die Kombinationsbehandlung und andererseits mit den Versuchen von Han et al. und Ammann et al., die bei einer verminderten Mcl-1-Expression eine signifikante Steigerung der Apoptoserate durch TRAIL beschreiben (Han et al. 2006, Ammann et al. 2009). Die Herunterregulierung von Mcl-1 sensitivierte Neuroblastomzellen auch für Zytostatika und so genannte „small molecule“ Bcl-2-family-Antagonisten (Lestini et al. 2009). Des Weiteren zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit eine Erhöhung der Expression von Mcl-1 bei alleiniger Gabe des Todesrezeptorliganden. Diese TRAIL-induzierte Hochregulierung von Mcl-1 wird kontrovers diskutiert, sie wurde jedoch ebenfalls durch Ammann et al. für Neuroblastomzellen beschrieben (Ammann et al. 2009). Die Western Blot-Analyse weist außerdem auf eine Herunterregulierung des antiapoptotischen Proteins Flip durch die Kombinationsbehandlung mit PI-103 im Vergleich zur alleinigen TRAIL-Behandlung hin. Dies lässt vermuten, dass Flip in Neuroblastomzellen durch den PI3K/Akt-Signalweg reguliert wird. Das wurde unter anderem für Colonadenom-, Prostatakarzinom-, Mammakarzinom-, Nierenzellkarzinom- und Melanomzellen beschrieben (Panka et al. 2001). In Neuroblastomzellen konnte eine Herunterregulierung von Flip durch den Insulinsensitizer Troglitazon die Zellen für TRAIL-induzierte Apoptose sensitivieren und damit eine mögliche Resistenzursache überwinden (Schultze et al. 2006). Andere Studien zeigten, dass bei einer AktHyperaktivität Flip hochreguliert wird und damit die TRAIL-induzierte Apoptose in Bronchial-, Prostata-, Nierenzell-, Magenkarzinomzellen und Endothelzellen inhibiert wird (Wang et al. 2008, Nesterov et al. 2001, Thakkar et al. 2001, Asakuma et al. 2003, Nam et al. 2003, Alladina et al. 2005). Skurk et al. beschrieben, dass die Herunterregulierung von Flip durch FOXO3, einem Zielmolekül von Akt, bewirkt wird (Skurk et al. 2004). Die als Ansätze für weitere Versuche zu verstehende Analyse einiger ausgewählter Apoptose-relevanter Moleküle mittels Western Blot lässt vermuten, dass durch die Kombinationsbehandlung von TRAIL und PI-103 Apoptose im Neuroblastom auf verschiedene Ebenen durch PI3K reguliert wird: einerseits auf Rezeptorebene, andererseits Diskussion 54 am Mitochondrium, was durch die Detektion erhöhter Expressionslevel von tBid unterstützt wird. Es zeigt sich bereits bei alleiniger Behandlung mit TRAIL eine Spaltung von Bid, dieser Effekt wird durch die Kombinationsbehandlung deutlich verstärkt. Die Spaltung von Bid deutet darauf hin, dass PI3K das Überleben von Neuroblastomzellen auch oberhalb des Mitochondriums beeinflusst, da tBid durch die Interaktion mit dem proapoptotischen Bax eine Permeabilisierung der Mitochondrienmembran und somit die Cytochrom c-Freisetzung bewirkt (Lovell et al. 2008). Phosphoryliertes Akt unterdrückt die Spaltung von Bid in NSCLC-Zellen, induziert Überleben und bewirkt dadurch eine Resistenz der Zellen für TRAIL-induzierte Apoptose, die Kandasamy et al. durch PI3KInhibierung mit Wortmannin und LY294002 verhinderten (Kandasamy et al. 2002). Akt ist in verschiedene Prozesse am Mitochondrium involviert, wie der Phosphorylierung und daraus folgenden Inhibierung von Bax und Caspase-9 (Gardai et al. 2004, Xin et al. 2005, Cardone et al. 1998). In dieser Arbeit wird eine erhöhte Expression der Caspase-9Spaltprodukte durch die Kombination von PI-103 und TRAIL nachgewiesen. Für Caspase2-Spaltprodukte werden ebenfalls erhöhte Expressionslevel in der Kombinationsbehandlung von TRAIL und PI-103 detektiert. Im Gegensatz zu den Ergebnissen dieser Arbeit, bei der die Spaltung von Bid zu tBid deutlich früher als die von Procaspase-2 zu Caspase-2 detektiert wird, steht die Aussage von Wagner et al., die beschrieben, dass aktive Caspase-2 erforderlich für Bid-Cleavage und optimale Ausführung von TRAILinduzierter Apoptose ist (Wagner et al. 2004). Auch wird eine Zunahme der Expressionslevel des pro-apoptotischen Noxa nach Behandlung mit PI-103 und TRAIL detektiert. Die im Vergleich zu den anderen Ergebnissen späte Zunahme von Noxa lässt auf eine transkriptionelle Regulierung durch „forkhead transcription factor“ schließen. Obexer zeigte kürzlich, dass FKHRL1 durch eine Hochregulierung von Noxa Apoptose in Neuroblastomzellen induziert (Obexer et al. 2007) und dass die Verwendung des PI3K-Inhibitors LY294002 zu einer Translokation von FKRHL1 aus dem Zytosol in den Nukleus führt (Obexer et al. 2009). Die erhöhten Noxa-Level können jedoch auch durch die erhöhte Apoptoserate verursacht worden sein. Diese Ergebnisse sowie der in dieser Arbeit nachgewiesene Verlust des mitochondrialen Membranpotentials weisen auf die Bedeutung des mitochondrialen Apoptosesignalweges bei der Sensitivierung von Neuroblastomzellen durch PI-103 für TRAIL-induzierte Apoptose hin und zeigen, dass der PI3K/Akt-Signalweg die prä- und post-mitochondrialen Ebenen der Apoptoseregulation beeinflusst. Diskussion 55 Die nachgewiesene Wirkung der Kombinationsbehandlung von PI-103 mit TRAIL auf sowohl den Todesrezeptor- wie auch den mitochondrialen Signalweg ist vielversprechend für die weitere Testung zur Behandlung von Neuroblastomzellen. Um nähere Einblicke zu gewinnen, wie PI3K Apoptose in Neuroblastomzellen reguliert, sind weitere Untersuchungen, wie beispielsweise TRAIL-Disc-Analyse oder die Immunopräzipitation von aktivem Bax erforderlich. 4.2 Bedeutung von TRAIL und Analoga in der Tumortherapie Die Aktivierung des Todesrezeptorsignalweges durch TRAIL findet bereits klinisch Anwendung zur Induktion von Apoptose (Johnstone et al. 2008). Für TRAIL beschrieben ist eine Spezifität, mit der es ausschließlich Tumorzellen angreift (Walczak et al. 1999), daraus resultierend besteht ein geringeres Risiko für die Entstehung von Nebenwirkungen. Durch die kombinierte Gabe von TRAIL und einem PI3K-Inhibitor kann eine Verminderung der verwendeten Dosis die Nebenwirkungen weiter einschränken. Nach wie vor werden in der Klinik zur Chemotherapie hauptsächlich Zytostatika verwendet, die unselektiv durch DNA-Schäden die Induktion von Apoptose in Zellen auslösen. Der Vorteil von TRAIL gegenüber Zytostatika liegt einerseits in der nicht auf Tumorzellenspezifischen Wirkung von Zytostatika und in der direkten Aktivierung des Todesrezeptorsignalweges mit der Spaltung apoptotischer Substrate durch TRAIL, was den Zelltod zur Folge hat (Ashkenazi 2002). Die erhöhte Expression von Caspase-9 in Neuroblastomzellen nach der Behandlung mit TRAIL und PI-103 deutet auf die Interaktion des extrinsischen mit dem intrinsischen Signalweg mit einer Verstärkung der apoptotischen Signalkaskade hin. Neben TRAIL werden auch Mapatumumab (ETR1) und Lexatumumab (ETR2) zur Induktion von Apoptose eingesetzt (Ashkenazi 2002). Sie sind unter anderem auf Grund ihrer längeren Plasmahalbwertszeit im Vergleich zu TRAIL sehr geeignet für den klinischen Einsatz (Merino et al. 2007). Mapatumumab befindet sich bereits in Phase II einer klinischen Studie zur Behandlung von NSCLC (Greco et al. 2008) und auch Lexatumumab ist in einer Phase I Studie bei der Behandlung von fortgeschrittenen soliden Tumoren (Wakalee et al. 2009). In präklinischer Testung befindet sich ebenfalls das ausgehend von ETR2 weiterentwickelte Apomab (Adams et al. 2008, Camidge 2008). In dieser Arbeit bewirkt ETR2, nicht jedoch ETR1, eine Verminderung der Zellviabilität von Neuroblastomzellen. Diese ersten Versuche zeigen, dass SH-EP Neuroblastomzellen auf Diskussion 56 ETR2 reagieren und liefern die Basis für weiterführende Versuche, besonders im Hinblick auf eine kombinierte Behandlung mit PI3K-Inhibitoren, da dies für Neuroblastomzellen noch nicht beschrieben ist. Viele Tumore, unter anderem auch das Neuroblastom, zeigen jedoch Resistenzen gegenüber TRAIL-induzierter Apoptose, denen häufig ein Caspase-8-Defizit zu Grunde liegt (Teitz et al. 2000). Einige Studien beschreiben, dass eine Resistenz gegenüber TRAIL-induzierter Apoptose mit dem Fehlen von Caspase-8 in Neuroblastomzellen korreliert (Eggert et al. 2001, Mühlethaler-Mottet et al. 2003). Eine Sensitivierung von Caspase-8-defizienten-Neuroblastomzellen für TRAIL-induzierte Apoptose konnte beispielsweise durch Actinomycin D, Histon-Deazetylase-Inhibitoren und Interferon-γinduzierte Reexpression von Caspase-8 erreicht werden (Wang et al. 2007, MühlethalerMottet et al. 2006, Fulda u. Debatin 2006, Tong et al. 2007). Raguénez et al. konnten durch Fenretinid eine Caspase-8-Aktivierung und Apoptose im metastasierenden Neuroblastom bewirken (Raguénez et al. 2009). Die durch die Gabe von Caspase-8Induktoren erreichte Sensitivierung der Tumorzellen für TRAIL-induzierte Apoptose könnte sich durch die zusätzliche Gabe von PI-103 noch verstärken lassen und eine Option zur Behandlung von Neuroblastomzellen mit einem Caspase-8-Defizit darstellen. Eine TRAIL-Resistenz kann ebenso durch eine Mutation von PIK3CA verursacht werden, was jedoch in Neuroblastomzellen selten vorkommt (Dam et al. 2006). Diese Mutation führt zu einer Aktivierung der PI3K und somit zur Aktivierung von Akt und FKHR, Samuels et al. beschrieben dies für Zellen kolorektaler Tumore. Eine Behandlung von Zellen mit PIK3CA-Mutation mit TRAIL bewirkte eine weitere Aktivierung des PI3K- Signalweges, es konnte im Gegensatz zu den Zellen, die nicht diese Mutation haben, keine Apoptose induziert werden (Samuels et al. 2005). Weitere Untersuchungen anderer Zelllinien mit nicht-mutierter PIK3CA weisen durch eine Behandlung mit TRAIL konzentrationsabhängig sowohl gesteigertes Überleben als auch eine gesteigerte Proliferation (Secchiero et al. 2003) der Zellen mit Aktivierung des PI3K/Akt-Signalweges nach (Secchiero et al. 2003, Zauli et al. 2005). Die beschriebene Steigerung der Zellproliferation wurde unter anderem im Glioblastom beobachtet (Vilimanovich u. Bumbasirevic 2008). Wie in den vorliegenden Viabilitätsassays gezeigt wird, induziert die Behandlung der Neuroblastomzellen mit TRAIL eine Erhöhung der Proliferation. Dieser Effekt wurde durch die Kombinationsbehandlung mit dem PI3K-Inhibitor PI-103 aufgehoben und bewirkt sogar eine massive Abnahme der Viabilität. Dies zeigt, dass eine Erhöhung der TRAIL-induzierten Apoptose durch eine gleichzeitige Inhibierung des Diskussion 57 PI3K-Signalweges erreicht werden kann und liefert neben den Apoptose-spezifischen Experimenten einen zusätzlichen Hinweis auf den klinischen Nutzen der Kombinationsbehandlung von TRAIL mit PI-103. Häufige Mutationen in Neuroblastomzellen, die zu Überaktivität des PI3K/AktSignalweges mit folgender Behandlungsresistenz und schlechter Prognose führen, sind sowohl die Überexpression von IGF-1 als auch von TrkB und seinem Liganden BDNF (Kim et al. 2004, Ho et al. 2002, Jaboin et al. 2002). 4.3 Bedeutung des PI3K-Signalweges im Neuroblastom Die Wirkung von PI3K wird hauptsächlich über die Aktivierung von Akt vermittelt. Im folgenden Signalnetzwerk ist mTOR eines der wichtigsten Targets von Akt (Shaw u. Cantley 2006). mTOR kann auch unabhängig von Akt durch Nährstoffe, Energieangebot und zelluläre Stressfaktoren reguliert werden (Wullschleger et al. 2006, Corradetti u. Guan 2006). Neben PI3K ist auch mTOR ein interessantes Target in der Tumortherapie (Laplante u. Sabatini 2009, Guertin u. Sabatini 2007, Bjornsti u. Houghton 2007). Eine Aktivierung von sowohl PI3K als auch mTOR ist assoziiert mit Apoptoseresistenz, erhöhter Zellproliferation und dereguliertem Metabolismus (Boller et al. 2008, Johnsen et al. 2008, Hennessy et al. 2005). Welcher der Komponenten sich jedoch am besten zur Sensitivierung von TRAIL-induzierter Apoptose im Neuroblastom eignet, ist ungeklärt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass eine Inhibierung von mTOR durch Everolimus, im Gegensatz zur Inhibierung von PI3K durch PI-103, Neuroblastomzellen nicht für TRAIL-induzierte Apoptose sensitiviert. Für hyperaktives mTORC1 wurde beschrieben, dass es durch einen Rückkopplungsmechanismus zu einer Inhibierung der PI3K kommt (O’Reilly et al. 2006), umgekehrt bewirkte eine Inhibierung von mTORC1 die Aktivierung des PI3K/Akt-Signalweges (Harrington et al. 2005, Sun et al. 2005). Akt und mTOR agieren sowohl über positive wie auch negative Rückkopplungsmechanismen miteinander, Hay et al. vermuten darin die Funktion des Schutzes vor unkontrolliertem Wachstum (Hay 2005). Opel et al. beschrieben ebenfalls, dass es nicht zu einer Sensitivierung für TRAILinduzierte Apoptose durch mTOR-Inhibierung in Glioblastomzellen kommt, als Folge der transienten Aktivierung von Akt durch Inhibierung von mTOR (Opel et al. 2008). Durch die Verwendung von PI-103 konnte diese transiente Akt-Aktivierung umgangen werden. Genetische Muster von Tumorzellen beeinflussen den Therapieerfolg, dazu gehört beispielsweise eine Amplifikation von MYCN. Johnsen et al. zeigten, dass Diskussion 58 Neuroblastomzellen mit erhöhter MYCN-Amplifikation signifikant mehr sensitiv für mTOR-Inhibierung sind und es dadurch zu einer Verminderung von Proliferation und klonogenem Wachstum sowie zu erhöhter Apoptose kommt. Die Kombination von mTORInhibitor mit dem PI3K-Inhibitor LY294002 konnte die Inhibierung des Zellwachstums noch verstärken (Johnsen et al. 2008). Marimpietri et al. konnten durch die Kombination von Rapamycin mit dem Zytostatikum Vincristin einen steigernden Effekt auf Apoptose und Angiogenese in Neuroblastomzellen nachweisen (Marimpietri et al. 2007). Diese Arbeit zeigt einen deutlichen Vorteil der Kombinationsbehandlung von TRAIL mit PI-103 im Vergleich zur Kombination von TRAIL mit Everolimus. Dies untermauert die Annahme, dass eine PI3K-Inhibierung der mTOR-Inhibierung überlegen ist und somit der Vorzug besonders beim klinischen Aspekt der Kombination von TRAIL mit PI3KInhibitoren gegeben werden sollte. Noch oberhalb der PI3K im Signalweg ist der TyrosinKinase-Rezeptor „anaplastic lymphoma kinase“ (ALK) gelegen. Neueste Erkenntnisse beschreiben eine erhöhte Aktivität von ALK in Neuroblastomzellen. Durch die Suppression von ALK konnte signifikant die Phosphorylierung von Akt gesenkt und dadurch eine Induktion von Apoptose in Neuroblastomzellen erreicht werden (Chen et al. 2008, George et al. 2008, Osajima-Hakomori et al. 2005). Die Resultate der gesamten Arbeit zeigen die Bedeutung des PI3K/Akt-Signalweges und seine immense Rolle bei der Todesrezeptor-induzierten Apoptose in SH-EP Neuroblastomzellen, besonders im Hinblick auf eine verminderte Wirkung der induzierten Apoptose durch einen hyperaktiven PI3K/Akt-Signalweg. Aus diesem Grund gewinnen PI3KInhibitoren immer mehr an Bedeutung und stellen einen erfolgversprechenden Ansatz zur Überwindung von Apoptoseresistenz im Neuroblastom dar. Ziel weiterer Untersuchungen sollte sein, die Ergebnisse dieser Arbeit in anderen Neuroblastomzelllinien zu reproduzieren und nähere Einblicke in die molekularen Mechanismen der Kombinationsbehandlung zu erlangen. Beispielsweise könnte mittels si-RNA-vermittelter Herunterregulation von PI3K und mTOR die Spezifität der verwendeten Inhibitoren näher analysiert werden. Auch die Austestung der Wirkung der Kombinationsbehandlung auf primäre Neuroblastomzellen oder in Tierversuchen sollte folgen, um den klinischen Aspekt näher zu beleuchten. Diskussion 59 Wachstumsfaktor TRAIL Flip PI3K GSK-3 Caspase-8 tBid LY294002 Bax Mcl-1 AKT Noxa PI-103 Caspase-9 Caspase-3 mTOR Everolimus p70 S6K Apoptose FoxO Noxa Flip CREB S6 Mcl-1 Überleben Abb.18: Schematische Darstellung der Ergebnisse im Überblick Darstellung der Ergebnisse dieser Arbeit durch die Kombinationsbehandlung von TRAIL und PI-103 eingeordnet in die aktuelle und hier vorgestellte Literatur. Die Darstellung erfolgt aus Gründen der Übersichtlichkeit in stark vereinfachter Form und soll einen Hinweis auf mögliche Regulationssmechanismen geben. : Erhöhung : Verminderung : Verlust des MMP : in der aktuellen Literatur beschriebene Veränderung der Signalgebung : Aktivierung : Inhibierung Zusammenfassung 5 60 Zusammenfassung Das Neuroblastom als häufigster extrakranieller, solider Tumor im Kindesalter hat im fortgeschrittenen Stadium trotz massiver Therapieintensivierung eine ungünstige Prognose. Dies steht meist im Zusammenhang mit einer Therapieresistenz, die aus verschiedenen Mutationen resultieren kann und ein Ansprechen auf Chemotherapeutika verhindert. Diese zielen meist auf deregulierte Signalwege ab. Einer dieser Signalwege ist der PhosphoInositol-3-Kinase (PI3K)/Akt-Überlebenssignalweg, dessen Überaktivität häufig in Karzinomen zu beobachten ist. Dies gilt auch für das Neuroblastom. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit die Rolle des PI3K/Akt-Signalweges bei der Regulation von Todesrezeptor-induzierter Apoptose in Neuroblastomzellen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass eine Inhibierung von PI3K durch PI-103 Neuroblastomzellen signifikant für Todesrezeptor-induzierte Apoptose sensitiviert, während eine Inhibierung von mammalian target of rapamycin (mTOR) die Neuroblastomzellen nicht für tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)-induzierte Apoptose sensitivieren konnte. Weiterhin konnte die Kombination von PI-103 mit dem Todesrezeptorligand TRAIL die Kolonienbildung der Zellen unterdrücken, was den Effekt auf das Langzeitüberleben verdeutlicht. Die nähere Analyse des Apoptosesignalweges zeigte, dass die Kombinationsbehandlung zu einer Verminderung des mitochondrialen Membranpotentials, einer Aktivierung von Caspasen sowie einer Caspasen-abhängigen Apoptose führt. Die Untersuchung einiger ausgewählter Apoptoseregulierender Proteine konnte deren Bedeutung und Beeinflussung durch den PI3KSignalweg näher beleuchten. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen auf die bedeutende Rolle des PI3K/Akt-Signalweges als Target in der Therapie des Neuroblastoms hin. Seine Inhibierung kombiniert mit der Aktivierung der Todesrezeptoren liefert einen vielversprechenden Therapieansatz zur Behandlung und Resistenzüberwindung des Neuroblastoms. Literaturverzeichnis 61 Literaturverzeichnis 1. Abel, F., Sjoberg, R. M., Nilsson, S., Kogner, P., Martinsson, T. (2005). "Imbalance of the mitochondrial pro- and anti-apoptotic mediators in neuroblastoma tumours with unfavourable biology." Eur J Cancer 41: 635-646. 2. Adams, C., Totpal, K., Lawrence, D., Marsters, S., Pitti, R., Yee, S., Ross, S., Deforge, L., Koeppen, H., Sagolla, M., Compaan, D., Lowman, H., Hymowitz, S., Ashkenazi, A. (2008). 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Abbildungsverzeichnis VII Abbildungsverzeichnis Abb.1 Apoptose-Signalwege .................................................................................... 8 Abb.2 PI3K/Akt-Signalweg .................................................................................... 15 Abb.3 Inhibierung von PI3K sensitiviert SH-EP Neuroblastomzellen für TRAIL-induzierte Apoptose ........................................................................ 30 Abb.4 Inhibierung von PI3K durch LY294002 sensitiviert SK-N-AS Neuroblastomzellen für TRAIL-induzierte Apoptose ................................. 31 Abb.5 PI3K-Inhibierung sensitiviert SH-EP Neuroblastomzellen für Anti-CD95-induzierte Apoptose .................................................................. 32 Abb.6 Effekt von co-, prä- oder post-Inkubation auf PI3K-Inhibierung und TRAIL-induzierte Apoptose ................................................................ 33 Abb.7 ETR2 reduziert die Viabilität von SH-EP Neuroblastomzellen................... 34 Abb.8 TRAIL und PI-103 hemmen das klonogene Überleben von SH-EP Neuroblastomzellen ......................................................................... 35 Abb.9 PI3K-Inhibierung sensitiviert SH-EP Neuroblastomzellen für Caspasen-abhängige TRAIL-induzierte Apoptose ...................................... 37 Abb.10 Morphologische Veränderungen von SH-EP Neuroblastomzellen unter der Behandlung mit TRAIL und PI-103 und dem Caspaseninhibitor zVAD.fmk ...................................................................... 38 Abb.11 PI-103 sensitiviert SH-EP Neuroblastomzellen für TRAIL-induzierte Caspasenspaltung ........................................................... 40 Abb.12 PI3K-Inhibierung sensitiviert SH-EP Neuroblastomzellen für TRAIL-induzierte Caspasenaktivität ........................................................... 42 Abb.13 PI3K-Inhibierung sensitiviert SH-EP Neuroblastomzellen für TRAIL-induzierte Aktivierung des mitochondrialen Signalweges ............. 44 Abb.14 Effekt der Kombinationsbehandlung von TRAIL und PI-103 auf verschiedene Regulationsproteine ......................................................... 46 Abb.15 Inhibierung von PI3K reduziert die Viabilität von SH-EP Neuroblastomzellen nach Behandlung mit TRAIL ......................... 47 Abb.16 Everolimus sensitiviert SH-EP Neuroblastomzellen nicht für TRAIL-induzierte Apoptose ........................................................................ 48 Abbildungsverzeichnis Abb.17 VIII PI-103 inhibiert die Phosphorylierung von Akt und S6 ribosomalem Protein in LAN5 Neuroblastomzellen.......................................................... 50 Abb. 18 Schematische Darstellung der Ergebnisse im Überblick ............................. 59 Danksagung IX Danksagung Zu besonderem Dank bin ich Prof. Dr. med. Simone Fulda für die Überlassung des Themas und die kompetente fachliche Betreuung bei der Durchführung dieser Arbeit sowie für die wissenschaftliche Förderung und regelmäßigen konstruktiven Besprechungen verpflichtet. Bedanken möchte ich mich weiterhin bei Prof. Dr. med. Klaus-Michael Debatin, dem Leiter des Forschungslabors der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin der Universität Ulm. Für die Zweitkorrektur dieser Arbeit bedanke ich mich bei Prof. Dr. Klaudia Giehl. Besonders danken möchte ich Daniela Opel, die mich sowohl während des praktischen, theoretischen wie auch moralischen Teils dieser Arbeit mit hohem zeitlichen und konstruktivem Aufwand unterstützt und dank ihres fundiertem Fachwissens erheblich zur Erstellung dieser Arbeit beigetragen hat. Auch gilt großer Dank allen Mitarbeitern der Arbeitsgruppe „Apoptose“ und des Labors, hervorzuheben sind Sabine Häcker und Ariane Bender, die mir mit Spaß und Rat besonders in der Anfangszeit zur Seite standen. Es war eine sehr schöne und lehrreiche Zeit, die ich nicht missen möchte. Danken möchte ich auch all meinen Freunden, die mich während der gesamten Zeit unterstützt und motiviert haben. Abschließend danke ich besonders meiner Mutter und meinem Vater, die immer für mich da waren und sind.
