Die Rolle der Natürlichen Killerzellen bei der spezifischen T
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Aus der Abteilung für Hämatologie und Internistische Onkologie am Universitätsklinikum der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Direktor: Prof. Dr. med. Andreas Mackensen Die Rolle der Natürlichen Killerzellen bei der spezifischen T-Zellantwort im Rahmen der Tumorimmunität Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde an der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg vorgelegt 2012 von Karina Bösl geboren in Nabburg Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Dekan: Prof. Dr. Dr. h. c. Jürgen Schüttler Referent: Prof. Dr. Evelyn Ullrich Korreferent: Prof. Dr. Andreas Mackensen Tag der mündlichen Prüfung: 25. Juni 2013 Meinen Eltern -4- INHALTSVERZEICHNIS INHALTSVERZEICHNIS Seite 1. ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................................ 6 2. ABSTRACT .............................................................................................................. 7 3. EINLEITUNG ............................................................................................................ 8 3.1 Mechanismen der angeborenen und erworbenen Immunität .............................................. 8 3.1.1 Die angeborene Immunität .......................................................................................... 8 3.1.2 Die erworbene Immunität............................................................................................ 9 3.2 Aufbau des Immunsystems ............................................................................................... 12 3.2.1 Strukturelemente des Immunsystems ........................................................................ 12 3.2.2 Antigenerkennung durch Lymphozyten .................................................................... 14 3.3 Natürliche Killerzellen (NK-Zellen)................................................................................. 15 3.3.1 Entwicklung und Reifung der NK-Zellen ................................................................. 15 3.3.2 Aktivierung und Effektorfunktion der NK-Zellen .................................................... 16 3.3.3 Interaktion von NK-Zellen im Immunsystem ........................................................... 16 3.3.4 NK-Zell Gedächtnis .................................................................................................. 18 3.3.5 NK-Zellsubpopulationen ........................................................................................... 18 3.4 Ziele dieser Arbeit ............................................................................................................ 18 4. MATERIAL UND METHODEN ................................................................................ 20 4.1 Material............................................................................................................................. 20 4.1.1 Medien....................................................................................................................... 20 4.1.2 Antikörper ................................................................................................................. 20 4.1.3 Zelllinien ................................................................................................................... 20 4.1.4 Versuchstiere ............................................................................................................. 21 4.1.5 Verbrauchsmaterialien .............................................................................................. 21 4.1.6 Geräte ........................................................................................................................ 21 4.2 In vitro Methoden ............................................................................................................. 22 4.2.1 Zellaufbereitung und Färbung ................................................................................... 22 4.2.2 Annexinfärbung von B16OVA Tumorzellen ............................................................ 24 4.2.3 Durchflusszytometrie ................................................................................................ 24 4.2.4 Antigen-spezifische Restimulation von Zellen ......................................................... 25 4.2.5 ELISA ....................................................................................................................... 25 4.2.6 anti-NK1.1 Antikörperaufreinigung .......................................................................... 27 4.3 In vivo Methoden.............................................................................................................. 28 4.3.1 Immunisierungsmodell .............................................................................................. 28 4.3.2 Tumormodell ............................................................................................................. 29 4.4 Statistische Auswertungen ................................................................................................ 31 5. ERGEBNISSE ........................................................................................................ 32 5.1 Analyse der Immunantwort nach Ovalbumin spezifischer Vakzinierung ........................ 32 5.1.1 IFN-γ Produktion im Rahmen der Vakzinierung ...................................................... 32 5.1.2 Immunmonitoring nach OVA/CpG Vakzinierung .................................................... 36 5.1.3 Immunmonitoring der OVA/CpG Vakzinierung nach NK-Depletion ...................... 41 -5- INHALTSVERZEICHNIS 5.2 Tumorimmunität in vivo ................................................................................................... 48 5.2.1 OVA-spezifisches Tumormodell in immunkompetenten Tieren .............................. 48 5.2.2 OVA-spezifisches Tumormodell in NK-defizienten Tieren ..................................... 48 5.3 Tumorimmunität durch Doxorubicin-behandelte Tumorzellen ........................................ 51 5.3.1 Apoptose-Induktion durch Chemotherapie ............................................................... 51 5.3.2 Vakzinierung mit immunogenen Tumorzellen.......................................................... 52 6. DISKUSSION.......................................................................................................... 55 6.1 NK-Zellen in Vakzinierungsmodellen .............................................................................. 55 6.1.1 NK – DC Interaktionen ............................................................................................. 56 6.1.2 NK – T-Zellinteraktionen .......................................................................................... 56 6.1.3 Modell der NK-Zellinteraktionen im Vakzinierungsmodell ..................................... 58 6.2 Tumorimmunität in vivo ................................................................................................... 60 6.2.1 Ovalbumin spezifisches Tumormodell ...................................................................... 60 6.2.2 Tumorimmunität durch Doxorubicin-behandelte Tumorzellen ................................ 62 6.2.3 Drei-Phasen-Modell der Tumorimmunität ................................................................ 63 6.3 Ausblick ............................................................................................................................ 64 7. LITERATURVERZEICHNIS .................................................................................... 65 8. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ............................................................................... 71 9. DANKSAGUNG ...................................................................................................... 73 10. LEBENSLAUF ...................................................................................................... 74 -6- ZUSAMMENFASSUNG 1. ZUSAMMENFASSUNG Hintergrund und Ziele: Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) sind bei der Invasion von Pathogenen in den Organismus eine der ersten Zellpopulationen, welche diese eliminieren. Daher wurde die Funktion der NK-Zellen lange Zeit der angeborenen Immunität zugeschrieben. Neuere Erkenntnisse zeigen jedoch, dass NK-Zellen darüber hinaus ein wichtiges Bindeglied zur adaptiven Immunität darstellen. Die genaue Rolle der NK-Zellen bei der Modulation der adaptiven Immunantwort ist noch unklar. Es gibt sowohl Hinweise für eine Unterdrückung der T-Zell-Antwort als auch für eine T-Zell aktivierende Wirkung der NK-Zellen. Die vorliegende Arbeit untersuchte die Effekte von NK-Zellen auf die spezifische T-Zellantwort im Rahmen eines Vakzinierungs- und Tumormodells. Methoden: Im Rahmen dieser Arbeit wurde zunächst ein Ovalbumin-spezfisches Vakzinierungsmodell etabliert. Als Tumormodell wurden OVA-exprimierende Melanomzellen (B16OVA) in C57Bl/6 Mäusen verwendet. Nach Vakzinierung mit dem spezifischen Protein Ovalbumin (OVA) zusammen mit einem Adjuvans (CpG) oder mit Doxorubicin behandelten B16OVA-Zellen erfolgte die Analyse der Immunantwort nach 12 – 60 Stunden in vivo und in vitro mittels Durchflusszytometrie und Analyse der Zytokinsekretion. Zudem wurden die Immunaktivierung und das Tumorwachstum abhängig von der Vakzinierungsmethode und einer NK-Zelldepletion untersucht. Ergebnisse: Zunächst gelang es uns, eine erfolgreiche Reduktion des Tumorwachstums sowohl nach Vakzinierung mit OVA/CpG, als auch mit immunogenen Doxorubicin behandelten Tumorzellen zu erzielen. Im OVA/CpG Vakzinierungsmodell zeigte sich eine gesteigerte Differenzierung und IFN-γ Produktion von T-Zellen. Interessanterweise konnte in diesen Modellen die Proliferation und IFN-γ Produktion der T-Zellen sowie die antitumorale Immunantwort durch Depletion von NK-Zellen während der frühen Vakzinierungsphase gesteigert werden. Schlussfolgerungen: Im Rahmen dieser Arbeit gelang es, durch NK-Depletion den Einfluss der NK-Zellen auf die antitumorale Immunantwort in einem OVA-spezifischen Vakzinierungs- und Tumormodell in Mäusen zu analysieren. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass NK-Zellen inhibitorische Funktionen auf T-Zellen ausüben können. In wieweit dies direkt durch Lyse von T-Zellen oder Dendritischen Zellen oder indirekt entweder über die Regulation der Zytokinsekretion oder Interaktionen mit weiteren Immunzellen von statten geht, gilt es in weiteren Experimenten zu klären. -7- ABSTRACT 2. ABSTRACT Background and Objectives: Natural killer cells (NK cells) are one of the first cells to defend the organism against pathogens. Therefore, their functions were contributed to the innate immune system for a long time. However, new findings show that NK cells seem to be an important link between the innate and adaptive immune system. Nevertheless, their exact role in modulation of adaptive immune responses remains still unknown as different studies show an activating as well as inhibiting function of NK cells on T cells. This study examined the role of NK cells concerning T cell activation or inhibition in a vaccination mouse model as well as in a tumor mouse model. Methods: We first established an Ovalbumin (OVA) specific vaccination and tumor model by use of OVA-expressing melanoma cells (B16OVA). The vaccination was performed by administration of the specific protein OVA combined with CpG as an adjuvant or by administration of Doxorubicin treated B16OVA tumor cells. After 12 – 60 hours the antitumor immune response has been addressed in vivo and in vitro by flow cytometry and cytokine analysis. In addition, tumor growth was observed dependent on NK cell depletion. Results: First, we could show a successful reduction of tumor growth after vaccination with OVA/CpG and Doxorubicin treated tumor cells. Furthermore, we could show an increased differentiation as well as an increased IFN-γ production of T helper cells in our vaccination models. Interestingly, the proliferation and IFN-γ secretion of all CD3+ T cells as well as the antitumor immune response increased upon depletion of NK cells during the early vaccination period. Conclusions: This project allowed addressing the role of NK cells in an OVA-specific vaccination and tumor mouse model by depletion of NK cells. Our results show that NK cells might negatively impact the T cell driven antitumor immune response. Whether these regulations result of direct killing of T cells or dendritic cells or either is due to indirect regulation via cytokine releases or modulated via other immune cells needs to be investigated in further experiments. -8- EINLEITUNG 3. EINLEITUNG 3.1 Mechanismen der angeborenen und erworbenen Immunität Unser Immunsystem besteht aus einer so genannten „angeborenen, unspezifischen“ und „erworbenen, spezifischen“ Immunität. Bei einer effizienten Immunantwort gehen diese fließend ineinander über und interagieren auf vielfältige Weise miteinander und regulieren so eine präzise Immunantwort [34]. Funktioniert eines dieser Systeme nicht oder nur fehlerhaft, können Immundefizite entstehen, die teilweise nicht mit dem Leben vereinbar sind [34]. 3.1.1 Die angeborene Immunität Täglich dringen Erreger in den Organismus ein. Der Großteil wird sofort erkannt und innerhalb weniger Minuten von Mechanismen des angeborenen Immunsystems zerstört, welche nicht erst induziert werden müssen. Erst wenn dieser Mechanismus fehl schlägt und weitere Systeme benötigt werden, machen sich klinische Symptome bemerkbar [34]. Physikalische Barrieren, wie zum Beispiel die Mukusschicht der Epithelien, stellen den ersten Abwehrmechanismus des Immunsystems dar. Weiterhin gibt es chemische Barrieren, die aus Substanzen mit mikrozider Wirkung wie Säuren, Enzymen oder Peptiden bestehen. So besetzen Surfactantproteine der Lungenepithelien Bakterienoberflächen und führen zu einer Opsonisierung des Erregers. Diese Opsonisierung wird durch das Komplementsystem übernommen, das wiederum durch Virusneutralisation, Chemotaxis, gesteigerte Gefäßpermeabilität und Kontraktion der glatten Muskulatur weitere Abwehrmechanismen auslösen kann [12]. Überwindet ein Pathogen physikalische und chemische Barrieren, wird es meist sofort durch phagozytierende Zellen, zum Beispiel durch Makrophagen oder neutrophile Granulozyten (PMN = polymorphonuclear neutrophilic leukocytes) mittels Toll-likeRezeptoren (TLR, = Oberflächenproteine) erkannt, aufgenommen und zerstört. Die so entstandene Inflammation des Gewebes lockt weitere neutrophile Granulozyten und Makrophagen an [34]. Die Toll-like-Rezeptoren erkennen den Eindringling und phagozytieren diesen oder induzieren andere Abwehrmechanismen. TLRs sind im Genom für viele verschiedene Pathogene kodiert und werden von Zellen des angeborenen Systems exprimiert, wodurch sie eine sofortige Immunantwort auslösen. -9- EINLEITUNG Sie binden spezielle, sich wiederkehrende Genomsequenzen, wie das CpG (= CytidinGuanosin-Dinukleotid) auf der Bakterien-DNA und werden daher auch „patternrecognition receptors“, kurz PAMP genannt [36, 43]. Kostimulatorische Moleküle der B7-Familie (CD80, CD86) auf Makrophagen und Dendritischen Zellen werden durch die TLR Aktivierung exprimiert und führen zu einer Stimulation des angeborenen Immunsystems mit Aktivierung naiver CD4+ T-Zellen [31]. Diesen Effekt haben wir uns im später beschriebenen Immunisierungsmodell zu Nutze gemacht, in dem CpG, ein bakterieller DNA Abschnitt mit Wiederholung von Cytidin-Guanosin-Dinukleotid Sequenzen, den TLR-9 stimuliert und somit mit Hilfe dieses Adjuvans die Immunantwort gesteigert werden kann [34, 38]. Ein weiterer wichtiger Bestandteil des angeborenen Immunsystems ist das Komplementsystem, ein System aus Plasmaproteinen, welche mit Pathogenen interagieren und sie für die Zerstörung durch Phagozyten markieren [22]. Dies kann durch drei verschiedene Wege veranlasst werden, welche unabhängig voneinander induziert werden können und zu einer Opsonisierung des Antigens, Gewebsinflammation und Lyse des Pathogens führen [6, 12]. Darüber hinaus existiert eine Reihe von induzierbaren Effektormechanismen. Makrophagen sezernieren Interleukine (IL), welche weitere phagozytotische Zellen, vor allem neutrophile Granulozyten, aber auch Makrophagen und Monozyten, an den Infektionsort rekrutieren [73]. Außerdem lösen Zytokine Fieber, die Produktion von Akute Phase Proteinen und die Mobilisation von Antigenpräsentierenden Zellen (APC) aus und triggern so die erworbene Immunität. Viral infizierte Zellen produzieren Interferone (IFN) und unterdrücken somit die virale Replikation, aktivieren NK-Zellen, die wiederum infizierte Zellen erkennen und lysieren können [12]. 3.1.2 Die erworbene Immunität Konnte das angeborene Immunsystem den Erreger nicht eliminieren, so kommt es meist in den ersten drei Tagen nach Infektion zur Aktivierung des erworbenen Immunsystems. Die spezifische Immunantwort lässt sich in drei Phasen gliedern: (1) die afferente Phase, in der Erreger in sekundäre lymphatische Organe transportiert und den Lymphozyten zugänglich gemacht werden, (2) die Induktionsphase in der die Lymphozyten aktiviert werden, sich durch Zellteilung expandieren und zu Effektorzellen differenzieren und (3) die efferente Phase, in der Effektorzellen die lymphatischen Organe über die Blut- oder Lymphbahn verlassen und Pathogene eliminieren. - 10 - EINLEITUNG Den ersten Schritt der adaptiven Immunantwort stellt die Aktivierung der T-Zellen durch Antigenpräsentierenden Zellen dar. Diese präsentieren kostimulatorische Moleküle der B7-Familie (B7.1 und B7.2 Moleküle) zusammen mit dem Pathogen und ermöglichen so eine T-Zellantwort. Zu den APCs zählen Makrophagen, B-Zellen und Dendritische Zellen (DC). Letztgenannte stellen die potentesten T-Zell-Stimulatoren dar, welche zusätzlich zu den Molekülen der B7-Familie und der Antigenpräsentation an MHC I und II Molekülen („major histocompatibility complex I und II“) Chemokine sezernieren. Dadurch werden vermehrt naive T-Zellen angelockt und eine effektive CD4+ und CD8+ T-Zellantwort in Gang gesetzt [26, 34, 63, 65]. An dieser Aktivierung ist auch die angeborene Immunität ausschlaggebend beteiligt, da die Expression der B7 Moleküle durch Signale der angeborenen Immunität über Tolllike-Rezeptoren induziert wird. Durch die Notwendigkeit einer gleichzeitigen Kostimulation schützt sich das Immunsystem vor Reaktionen gegen körpereigene Strukturen [9]. Nach ihrer Aktivierung proliferieren T-Zellen zu so genannten Effektor-TZellen (TH1-, TH2-Zellen und weitere Subpopulationen). Erkennen diese einen mit Antigen besetzten MHC Komplex, so werden die Effektorfunktionen ohne kostimulatorische Moleküle ausgeführt [34]. IFN-γ ist ein wichtiges Zytokin der CD8+ T-Zellen. Es hemmt direkt die virale Replikation und trägt durch Abtötung infizierter Zellen zur Viruselimination bei. Weiterhin werden Makrophagen durch IFN-γ Sekretion stimuliert. Perforine und Granzyme werden aus zytotoxischen Granula und CD8+ T-Zellen freigesetzt, die ebenfalls zur Viruselimination beitragen können [12, 34, 52]. Abbildung 3.1 stellt einen Überblick über die Zellpopulationen dar. Zytokinsekretion und Zellinteraktionen der einzelnen T- - 11 CD8 T-Zellen: Peptid + MHC I Zytotoxische T-Zellen TH1-Zellen EINLEITUNG CD4 T-Zellen Peptide + MHC II CD40L Zytokine TH2-Zellen Zytokine CD40 intrazelluläre Erreger Virusinfizierte Zelle zytotoxische Effektormoleküle andere Perforin Granzyme Granulysin Fas Ligand IFN- IFN-ß IFN-a Makrophage CD40L CD40 Bakterielle Toxine Antigen-spezifische B-Zelle Makrophagen aktivierende Moleküle andere Makrophagen aktivierende Moleküle Andere TNF-a GM-CSF TNF-a CD40L Fas Ligand IFN- IL-3 TNF-ß CXCL2 IL-4 IL-5 IL-15 CD40L IL-3 TGF-ß GM-CSF IL-10 CCL11/17 Abb. 3.1: Effektor-T-Zellen (adaptiert nach Immunobiology, Janeway [34]). + CD8 T-Zellen sezernieren vor allem Perforine und Granzyme. TH1-Zellen sezernieren IFN-γ, den wichtigsten Stimulus für Makrophagen und Lymphotoxin, auch als TNF-β bekannt.TH2Zellen sezernieren vor allem IL-4, IL-5, IL-9 und IL-13 und tragen einen CD40 Liganden (CD40L) auf ihrer Oberfläche, dessen Stimulation zu einer B-Zellaktivierung führt. Zusätzlich sezernieren sie IL-10, das die Makrophagenaktivierung hemmt. Die angeborene Immunität wird jedoch nicht von T-Zellen alleine getragen, sondern auch durch B-Zellen, die mittels der humoralen Immunantwort extrazelluläre Pathogene über Phagozytose oder Granulafreisetzung eliminieren [46]. Plasmazellen sezernieren Antikörper, um Pathogene zu neutralisieren und eine Bindung an gesunde Zellen zu verhindern. Des Weiteren können Antikörper mittels Opsonisierung oder Komplementaktivierung zur Phagozytose oder Lyse eines Pathogens führen. Für die Aktivierung der B-Zellen werden T-Helferzellen benötigt, die diese körperfremden Peptidfragmente an MHC II Komplexen erkennen [49]. Durch Interaktion des CD40 Ligands (CD40L) mit CD40 auf der B-Zelloberfläche werden B-Zell stimulierende Zytokine wie IL-4, IL-5 und IL-6 sezerniert [34]. Daraufhin kommt es zur BZellaktivierung und Proliferation mit der Entwicklung zu Antikörper produzierenden Plasmazellen und B-Gedächtniszellen (s. Abb. 3.2). - 12 Antigenerkennung induziert Expression von Effektormolekülen durch T-Zellen, welche wiederum B-Zellen aktivieren B-Zellproliferation EINLEITUNG Differenzierung zu ruhenden Gedächtniszellen und AKsezernierenden Plasmazellen Gedächtniszelle AK sezernierende Plasmazellen Abb. 3.2: B-Zellaktivierung durch T-Helferzellen (nach Immunobiology, Janeway [33, 34]). T-Helferzellen erkennen das fremde Antigen am MHC II Komplex. Es kommt zu einer CD40/CD40L Interaktion und zur Ausschüttung von B-Zell aktivierendem IL-4, IL-5 und IL-6. Dies führt zu einer B-Zell Proliferation und Differenzierung zu Plasmazellen und BGedächtniszellen. Das immunologische Gedächtnis durch Gedächtnis-T-Zellen oder Antikörperproduzierende B-Zellen stellt eine besondere Funktion des erworbenen Immunsystems dar. Dadurch wird bei einer Re-Infektion eine schnellere Immunantwort ermöglicht, so dass Zweitinfektionen meist subklinisch verlaufen. Aus diesem Grund ist es auch möglich, Impfungen durchzuführen und somit immunologischen Schutz vor unter Umständen tödlich verlaufenden Krankheiten aufzubauen [27, 54]. Neueste Erkenntnisse aus der Forschung zeigen, dass dieses Privileg des immunologischen Gedächtnisses auch so genannte Memory-NK-Zellen ausüben können [15]. 3.2 Aufbau des Immunsystems 3.2.1 Strukturelemente des Immunsystems Für die Genese der Immunzellen sind die primären lymphatischen Organe verantwortlich. Im Knochenmark werden pluripotente hämatopoetische Stammzellen gebildet, welche die Vorläufer aller Blutzellen darstellen. Zu den Leukozyten (weiße Blutkörperchen) zählen Granulozyten, Mastzellen, Monozyten, Makrophagen, Dendritische Zellen und Lymphozyten. Die Lymphozyten entwickeln sich aus der gemeinsamen lymphatischen Vorläuferzelle weiter zu B- und T-Zellen, sowie den - 13 - EINLEITUNG Natürlichen Killerzellen (NK-Zellen). Aus der gemeinsamen myeloischen Vorläuferzelle entstehen die unterschiedlichen Leukozyten, Erythrozyten und Megakaryozyten, aus denen die Thrombozyten hervor gehen. Abbildung 3.3 gibt einen kurzen Überblick über die Entwicklung der Blutzellen aus einer pluripotenten Stammzelle im Knochenmark [34]. Pluripotente Stammzelle im Knochenmark Gemeinsame myeloide Vorläuferzelle Thrombozyten Granulozyten Erythrozyten Gemeinsame lymphatische Vorläuferzelle Monozyten T-Lymphozyt zytotox. T-Zelle Neutrophil Basophil Eosino- Makrophagen phil DCs T-Gedächtnis- T-Helferzelle zelle NKs B-Lymphozyt regulator. T-Zelle Plasmazelle DCs Antikörper Autoantikörper Mastzellen Abb. 3.3: Blutbildung (adaptiert nach Deutsches Krebsforschungszentrum, DKFZ [16]). Entwicklung der Blutzellen aus einer pluripotenten Stammzelle, welche sich in eine myeloische und lymphatische Vorläuferzelle entwickelt. T- und B-Lymphozyten differenzieren entweder im Thymus oder im Knochenmark. Die reifen Zellen zirkulieren anschließend im Blut und in den peripheren lymphatischen Geweben. Nach Antigenkontakt entwickeln sich B-Zellen zu Antikörpersezernierenden Plasmazellen, während sich die T-Zellen zu Effektor-T-Zellen differenzieren. NK-Zellen hingegen besitzen keine Antigenspezifität, sondern erkennen Pathogene mit Hilfe ihrer speziellen aktivierenden und inhibitorischen NK-Zell-Rezeptoren. Granulozyten zirkulieren ebenfalls im Blut und treten insbesondere in entzündetes oder infiziertes Gewebe über. Hierbei werden Neutrophile zur Phagozytose von Bakterien herangezogen, während Eosinophile und Basophile bei allergischen Reaktionen oder parasitärem Befall aktiviert werden. Unreife DCs zirkulieren im Blut und treten in peripheres Gewebe über. Treffen sie dort auf Pathogene, reifen sie heran und wandern - 14 - EINLEITUNG wieder in lymphatisches Gewebe zurück, um antigenspezifische T-Lymphozyten aktivieren. In den sekundären lymphatischen Organen erfolgt die Organisation der adaptiven Immunantwort. Hierzu zählen Milz, Lymphknoten und das schleimhautassoziierte lymphatische Gewebe (MALT) [12, 34]. 3.2.2 Antigenerkennung durch Lymphozyten B-Zellen erkennen fremde Antigene und deren Produkte durch lösliche Antikörper, und entfernen diese durch Antigen-Antikörperbindung [34]. T-Zellunabhängige B- Zellaktivierung durch Antigenbindung am B-Zell-Rezeptor (BCR) hat eine Veränderung der transkriptionellen Aktivität der Zelle zur Folge. Die veränderte Proteinexpression kann unterschiedliche Auswirkungen von Apoptose der Zelle bis hin zur klonalen Expansion und Differenzierung in Antikörpersezernierende Plasmazellen haben. Die stärkere T-Zellabhängige B-Zellaktivierung erfolgt durch Antikörperaufnahme und Präsentation an MHC II Molekülen. Die aktivierten T-Zellen interagieren mit ihrem CD40 Liganden (CD40L) mit CD40 Molekülen auf B-Zellen und aktivieren diese wiederum [12]. T-Zellen hingegen erkennen nur an MHC Moleküle anderer Zellen gebundene Antigene [17]. Makrophagen phagozytieren Erreger und bauen diese intrazellulär ab, präsentieren die Antigenbestandteile mittels MHC Molekülen an ihrer Oberfläche, welche von T-Zellen erkannt werden und zu einer T-Zellaktivierung und –proliferation führen [34]. Somit können infizierte Zellen, die antigene Peptide an der Oberfläche exprimieren, eliminiert und weitere Immunreaktionen durch Aktivierung weiterer Immunzellen ausgelöst werden [4]. Eine besonders wichtige Zellpopulation für die TZellaktivierung sind die DCs. Wie auch Makrophagen nehmen DCs Antigene auf und prozessieren diese. Nach der Antigenprozessierung werden DCs mobilisiert und wandern über die drainierende Lymphe zu den regionalen Lymphknoten und präsentieren über MHC Moleküle die Antigenfragmente naiven T-Lymphozyten, welche durch die Antigenerkennung aktiviert werden [34]. Aufgrund ihrer Eigenschaft Zellen zu töten, müssen T-Zellen in der Lage sein, sowohl körpereigene als auch körperfremde Strukturen zu erkennen und zu unterscheiden. CD8+ T-Zellen binden MHC I Moleküle, welche innerhalb der Zelle synthetisierte Proteinfragmente exprimieren, während CD4+ T-Zellen MHC II Moleküle erkennen, die ins Zellinnere aufgenommene und dort proteolytisch verdaute Substanzen präsentieren. MHC I Moleküle befinden sich auf allen kernhaltigen Zellen (T- und B-Zellen, Makrophagen, APC, neutrophile - 15 - EINLEITUNG Granulozyten), die durch intrazelluläre Erreger befallen werden können. MHC II Moleküle hingegen finden sich normalerweise nur auf B-Lymphozyten, Dendritischen Zellen und Makrophagen befinden sich somit auf Zellen, die andere Effektorzellen des Immunsystems aktivieren können [12, 23, 34]. Jeder T-Zell-Rezeptor (TCR) ist spezifisch für die Kombination eines Peptids mit einem MHC Molekül. Um ein möglichst großes Repertoire für unterschiedliche Peptidbindungen zu erlangen, werden viele verschiedene MHC Moleküle auf T-Zellen exprimiert. 3.3 Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) Natürliche Killerzellen wurden 1975 von Kiessling et al. zum ersten mal beschrieben und den Lymphozyten zugerechnet [35]. Sie werden durch die Oberflächenmarker CD3-CD56+ beim Menschen und CD3-NK1.1+ bei C57Bl/6 Mäusen charakterisiert. Als speziesübergreifender Marker dient NKp46 [25, 71]. NK-Zellen besitzen die Eigenschaft, Zielzellen, die als „fremd“ erkannt werden, zu töten und immunregulatorische Zytokine, vor allem IFN-γ, zu produzieren [13]. 3.3.1 Entwicklung und Reifung der NK-Zellen NK-Zellen entwickeln sich aus einer mit den T-Zellen gemeinsamen lymphatischen Vorläuferzelle im Knochenmark. Für die Entwicklung zur reifen humanen NK-Zelle (CD56+CD3-) werden IL-15, Flt-3 Ligand und Stammzellfaktor (SCF) benötigt [48]. NK-Zellen bilden einen der ersten Abwehrmechanismen im Organismus und eliminieren infizierte oder transformierte Zellen oder auch solche, die Stresssignale aussenden. Hierfür wird keine Antigenerkennung benötigt, da NK-Zellen ihre Zielzellen anhand ihrer fehlenden MHC Moleküle („missing self“ Theorie) über NK-ZellRezeptoren erkennen [59]. Ebenso können NK-Zellen durch Bindung von fremden Glykoproteinen oder deren Abkömmlingen an ihre aktivierenden Rezeptoren (2B4, NKp46, NK1.1, NKG2D, CD16), sowie durch Zytokine (IFN Typ I, IL-12, IL-15, IL-18) angeregt werden [32, 48]. Um Reaktionen gegen körpereigene Zellen zu vermeiden, exprimieren NK-Zellen verschiedene Rezeptoren zur Aktivitätsregulation. Inhibitorische Rezeptoren (Ly49 in - 16 - EINLEITUNG Mäusen und KIR =killing inhibitory receptor in Menschen) verhindern die Zerstörung körpereigener Zellen durch Erkennung körpereigener MHC I Moleküle. Dieser Regulationsmechanismus wird als „Licensing“ bezeichnet [32, 51, 66]. Neue Studien zeigen, dass von einer ständigen Veränderung der NK-Zell-Reagiblität, durch Umgebungsveränderungen im Organismus, ausgegangen werden muss [59]. 3.3.2 Aktivierung und Effektorfunktion der NK-Zellen Die Aktivierung der NK-Zellen kann über drei verschiedene Mechanismen in Gang gesetzt werden. Zum einen können NK-Zellen Pathogene („non-self recognition“), Stresssignale körpereigener Zellen („stress-induced-self recognition“) oder die Herabregulation eigener Proteine auf Körperzellen („missing-self recognition“) erkennen [69]. Über Rezeptoraktivierung oder Zytokinausschüttung kann eine NK-Zell Proliferation und Stimulation bis hin zur Lyse ausgelöst werden [39]74]. NK-Zellen können jedoch auch durch Zytokinausschüttung (v.a. IL-12, IL-15, IL-18) durch antigenpräsentierende Zellen, insbesondere durch DCs, angeregt werden, worauf eine IFN-γ- oder Granzym B- und Perforin Produktion der NK-Zellen erfolgt [15]. Die Dendritischen Zellen spielen bei der NK-Zell-Aktivierung eine wichtige Rolle. Sie produzieren nicht nur wichtige Zytokine, wie IFN-α/β, IL12 und IL-15, sondern bilden mit NK-Zellen wichtige Zellkontakte aus und können diese so aktivieren [21, 69]. Aktivierte NK-Zellen produzieren nun ebenfalls Zytokine (IFN-γ, TNF-α, GM-CSF = Granulocyte macrophage colony-stimulating factor) und Chemokine (CCL-3, -L4, -L5), welche zum so genannten „NK-Killing“ der Zielzelle führen. IFN-γ führt wiederum zu einer Differenzierung von T-Zellen zu TH1- und TH2-Zellen und einer gesteigerten TZellantwort [37, 39]. NK-Zellinduzierte Apoptose von Tumorzellen hingegen wird über Liganden der TNF-Familie eingeleitet. Dazu gehören Fas Ligand (FasL), TNF (Tumornekrosefaktor) und TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand) [7, 48]. 3.3.3 Interaktion von NK-Zellen im Immunsystem NK-Zellen sind durch ihre vielfältigen Interaktionen mit anderen Zellen des Immunsystems wichtige Mediatoren zwischen dem angeborenen und erworbenen Immunsystem. Sie können jedoch auch selbst als potente APCs nach ihrer Aktivierung agieren, indem sie stimulatorische Moleküle (MHC II, CD80, CD86) hoch regulieren, - 17 - EINLEITUNG unabhängige Mechanismen der Antigenaufnahme und Präsentation erwerben und dadurch T-Zellen aktivieren [28, 44, 55]. Eine der wichtigsten Zellpopulationen für NK-Zell-Interaktionen sind Dendritische Zellen. DCs sind zur Antigenaufnahme, -transport, -prozessierung und -präsentation an T-Zellen spezialisiert und aktivieren NK-Zellen, indem sie nach Antigenerkennung NKZellstimulierende Zytokine sezernieren und Zellkontakt über NKp30 aufnehmen [68, 69]. Im Gegenzug tragen durch Pathogenbindung an TLR aktivierte NK-Zellen in den Lymphknoten zur DC-Reifung durch TNF-α und IFN-γ Sekretion und durch Zellkontakt bei [45, 69]. Unreife DCs werden von NK-Zellen abgetötet, wohingegen reife DCs durch MHC I Hochregulation überleben [19, 20, 41]. Durch den Selektionsvorteil reifer DCs interagieren T-Zellen fast nur noch mit antigenpräsentierenden DCs, was eine effektivere T-Zellantwort ermöglicht. Somit trägt die IFN-γ Sekretion auch zum CD8+ TZellpriming bei und initiiert die T-zellspezifische Tumorantwort [37, 42, 62, 69]. Tumorzellen können auch direkt NK-Zellen in Folge von Rezeptorinteraktionen aktivieren. Die Tumorlyse durch NK-Zellen kann durch Interaktionen mit Dendritischen Zellen weiter gefördert werden. Im Gegenzug können aktivierte NK-Zellen durch IFN-γ Produktion die Reifung von DCs unterstützen, welche IL-12 produzieren und so eine protektive CD8+ T-Zell-Antwort auslösen [65, 68]. DCs benötigen jedoch externe Stimuli, um NK-Zellen zu aktivieren. TLR 3, TLR 4 oder TLR 9 Liganden können durch apoptotische Tumorzellen freigesetzt werden, welche mit DCs interagieren und NKZellen aktivieren [57, 65]. Im Zuge einer CpG Stimulation interagieren DCs und NKZellen über Zellkontakte mit der Folge einer erhöhten NK-Zell-Zytotoxizität und erhöhter IFN-γ Produktion, sowie NK-Zell-Proliferation. Diese IFN-γ Produktion trägt zu weiterer DC-Reifung bei und ermöglicht eine TH1-Antwort [1, 65]. Neueste Erkenntnisse weisen darüber hinaus auf eine weitere Zellpopulation hin, die so genannten Interferon-produzierenden Killer Dendritischen Zellen (IKDC). Diese tragen sowohl Merkmale der NK-Zellen, als auch der DCs. Sie sind in der Lage Tumorzellen zu lysieren, apoptotische Zellteile aufzunehmen und dabei selbst in APCs zu differenzieren und schließlich eine T-Zellantwort hervorzurufen. IKDCs weisen außerdem eine potente lytische Aktivität gegen B16F10 Tumor auf, ohne einer vorher statt gefundenen Aktivierung [60, 64, 65]. Um Reaktionen gegen körpereigene Strukturen zu vermeiden, muss auch die Aktivität der NK-Zellen reguliert werden. Treg-Zellen (regulatorische T-Zellen, CD4+CD25+) stellen 1-3% der peripheren CD4+ T-Zellen dar und gewährleisten Immuntoleranz, indem sie autoreaktive T-Zellen unterdrücken [24, 61]. Experimente haben gezeigt, dass Treg-Zellen auch NK-Zellen hemmen und Autoimmunreaktionen durch NK-Zellen verhindern können [24]. - 18 - EINLEITUNG 3.3.4 NK-Zell Gedächtnis Bis vor kurzem wurde ein immunologisches Gedächtnis alleine der adaptiven Immunantwort zugeschrieben. Umso überraschender war die Erkenntnis, dass auch einige reife NK-Zellen diese Funktion zu übernehmen scheinen [15, 50, 66]. Ähnlich den Gedächtnis-T-Zellen reagieren Gedächtnis-NK-Zellen auf Restimulation mit erhöhter lytischer Funktion und erhöhter Zytokinproduktion [47]. Zudem persistieren bereits in vitro stimulierte NK-Zellen länger im Empfängerorganismus und produzieren nach erneuter Stimulation vermehrt IFN-γ [14, 66]. 3.3.5 NK-Zellsubpopulationen NK-Zellen stellen, vergleichbar zu T- und B-Zellen, eine heterogene Zellpopulation dar, welche in verschiedene Subpopulationen unterschieden werden. Reife Maus NK-Zellen exprimieren CD11b+ [29]. CD11b+ NK-Zellen können weiter in CD27+ und CD27- NKZellen unterteilt werden. CD27+ Zellen besitzen eine hohe Migrationskapazität und finden sich zusammen mit unreifen NK-Zellen (CD11b-) vorwiegend im Knochenmark, dem NK-Zellbildungsort [30]. CD11b+CD27- NK-Zellen gelten als reife NK-Zellen mit geringer Migrationskapazität, da sie bereits vor allem im Blut vorkommen, wo sie ihre Effektorfunktionen ausüben. Für die Aktivierung reifer NK-Zellen ist zudem eine stärkere Aktivierung nötig, um so überschießende Reaktionen gegen den körpereigenen Organismus zu unterbinden [29, 30]. Humane NK-Zellen werden nach ihrer CD56 Expression eingeteilt. CD59bright NK-Zellen werden als schwach zytotoxisch mit starker Zytokinproduktion angesehen, während die CD56dim NK-Zellen zytotoxischer, aber schwächere Zytokinproduzenten sind [29]. 3.4 Ziele dieser Arbeit Es liegen sowohl Daten vor, dass NK-Zellen T-Zellen stimulieren, als auch inhibieren können [4, 42]. Ebenso verhält es sich beim Tumorwachstum. Während in vielen Experimenten NK-Zellen als wichtige Zellen in der Tumorabwehr gesehen werden, so wurde in Arbeiten anderer Arbeitsgruppen kein Einfluss oder sogar vermehrtes Tumorwachstum in Anwesenheit der NK-Zellen beschrieben [40, 58, 70]. - 19 - EINLEITUNG Ziel dieser Doktorarbeit war es, ein Vakzinierungsmodell in Mäusen zu entwickeln, das der Analyse der NK-Zell- und T-Zell-Antwort mittels durchflusszytometrisch gewonnener Untersuchungen und Zytokinassays dient. Zudem sollte in einem murinen B16OVA Melanom-Modell die Tumorprogression in Abhängigkeit der Vakzinierung überprüft werden. Mittels Depletion der NK-Zell-Funktion sollte darüber hinaus untersucht werden, welche Bedeutung der bereits beschriebenen Funktionen der NKZellen in diesen In vivo Modellen zukommt. - 20 - MATERIAL UND METHODEN 4. MATERIAL UND METHODEN 4.1 Material 4.1.1 Medien R10 500ml PBS (GIBCO, Deutschland) + 50ml FCS (GIBCO) + 5ml MEMNEAA + 5ml Pen/Strep + 5ml L-Glutamin + 5ml Sodium Pyruvat NH4CL 8,29g EDTA 0,037g KHCO3 1g 10% FCS 3% Mausserum in PBS ACK-Puffer Blocking Puffer Darmstadt, 4.1.2 Antikörper Antikörper Annexin CD4 CD11b NKp46 CD27 IFN-γ CD3 CD19 NK1.1 CD8 CD11b IFN-γ DAPI Fluorochrom FITC FITC FITC FITC PE PE PerCP PerCP PE/Cy7 APC APC APC Klon YTS 191.1.2 M1/70.15.11.5 29A1.4 LG.3A10 XMG1.2 145-2C11 6D5 PK136 53-6.7 M1/70 XMG1.2 Firma Immunotools Immunotools Miltenyi eBioscience BD BD BD BIOZOL BD eBioscience BD BD Applicem Verdünnung 1:30 1:200 1:200 1:200 1:200 1:200 1:200 1:200 1:200 1:200 1:200 1:200 1:6000 4.1.3 Zelllinien B16OVA-Tumorzellen ATCC, LGC Standards GmbH (Wesel, Deutschland) - 21 - MATERIAL UND METHODEN 4.1.4 Versuchstiere C57Bl/6 Mäuse Janvier (Le Genest-St-Isle, Frankreich) Alter: 6 – 10 Wochen Geschlecht: weiblich 4.1.5 Verbrauchsmaterialien Pipettenspitzen Greiner (Frickenhausen, Deutschland) FACS-Röhrchen Sarstedt (Nürnbrecht, Deutschland) ELISA BD (Franklin Lakes, NJ USA) 96-Well-Platten (Restimulation) Omnilab Falcon (Bremen, Deutschland) Siebe (100μm Porendurchmesser) Omnilab Falcon Tumorflaschen Greiner Antikörper-Säule Protein G HiTrap 1ml, Pharma (Darmstadt, Deutschland) 4.1.6 Geräte FACS-Gerät FACSCanto II, BD FlowJo Treestar Inc. Ashland, USA Prism 5.0 Graph Pad Software - 22 - MATERIAL UND METHODEN 4.2 In vitro Methoden 4.2.1 Zellaufbereitung und Färbung Für die beschriebenen in vitro Untersuchungen der Lymphozyten wurden C57Bl/6Mäusen die inguinalen und poplitealen Lymphknoten sowie die Milzen entnommen. Zellaufbereitung und Färbung von Milzzellen Herstellung der Einzelzellsuspension Die Milzen wurden zunächst in einer Petrischale mit 70%-igem Alkohol und R10 gereinigt, um anhaftende Haare oder Fettanhänge zu entfernen. Das Organ wurde weiter zu einer Einzelzellsuspension verarbeitet. Das nach der Zentrifugation (4°C, 10min, 500rpm) entstandene Zellpellet wurde für die anschließende Erythrozytenlyse für 10 min bei 4°C in 2ml PBS und 2ml ACK-Puffer aufgenommen. Nach Ablauf der 10-minütigen Inkubationszeit wurde die Suspension erneut zentrifugiert und in PBS (GIBCO, Darmstadt, Deutschland) aufgenommen. Anschließend erfolgte mittels der Neubauer-Zählkammer die Zellzahlbestimmung. Bestimmung der Zellzahl Für die Auszählung wurde die so genannte Neubauer-Zählkammer verwendet (s. Abb. 4.1). 10μl der Zellsuspension wurden mit 90μl Trypanblau (Invitrogen, Darmstadt, Deutschland) vermengt. Mit Hilfe folgender Formel konnte vom Mittelwert m der gezählten Zellzahl auf die Zellzahl/x μl R10 gerechnet werden. m x 90 x x μl R10 = Zellzahl/x μl R10 Abb. 4.1 Neubauerzählkammer Durchflusszytometrie Die Antikörperfärbung für die durchflusszytometrische Analyse erfolgte direkt in FACS Röhrchen. Nach Zentrifugation (4°C, 10min, 500rpm) und Abnahme des Überstands, wurden die Zellen mit je 50μl eines sog. „Blocking Puffers“ (10% FCS + 3% Mausserum in PBS) sowie 0,5μl Fc-Block versetzt und für ca. 10 Minuten bei 4°C inkubiert. Diese Vorbehandlung war nötig, um bei der nun anschließenden Färbung unspezifische Antikörperbindungen zu vermeiden. Nachfolgend erfolgte die Antikörperzugabe gemäß der Auflistung in Tabelle 4.1 in einer Verdünnung von 1:200. - 23 Antigen 1. Färbung CD11c CD3 CD4 CD8 NK1.1 MATERIAL UND METHODEN Markierung 2. Färbung PE PerCP FITC APC PE/Cy7 Antigen NKp46 CD3 CD27 CD11b NK1.1 Markierung FITC PerCP PE APC PE/Cy7 Tab. 4.1 Antikörperzusammenstellung für die FACS Analysen der Milz Zusätzlich zu den Färbungen wurden für die Einstellung und Optimierung der Kompensationen am FACS Gerät auch ungefärbte Zellen sowie Einzelfärbungen in jeder Fluoreszenz vorbereitet. Nach der Antikörperzugabe erfolgte eine Inkubationsphase für die Bindung der Antikörper mit einem darauf folgenden Waschvorgang, der überschüssige, nicht gebundene Antikörper entfernte. Nun erfolgte die durchflusszytometrische Analyse. Zellaufbereitung und Färbung von Lymphknotenzellen Für die Analysen im Rahmen dieses Projekts war insbesondere die Untersuchung der Immunzellen der Lymphknoten relevant. Die Zellaufbereitung war bis auf zwei Punkte mit der oben beschriebenen Aufreinigung aus den Milzen identisch. Zum einen wurden die Lymphknoten lediglich in R10 gereinigt, zudem war eine Erythrozytenlyse nicht erforderlich, da der prozentuale Anteil der Erythrozyten im Vergleich zur Milz deutlich geringer ist. Da uns bei der Lymphknotenanalyse die intrazelluläre IFN-γ Produktion interessierte, erfolgte eine intrazelluläre Zytokinfärbung. Zunächst wurde die gleiche Zellfärbung wie bei den Milzzellen angefertigt (s. Tab. 4.2). 1. Färbung Antigen CD8 CD4 CD3 IFN-γ Antigen Kompensation ungefärbt (jeweils 1 Tube) CD4 CD27 CD3 CD8 NK1.1 Markierung 2. Färbung APC FITC PerCP PE Antigen NK1.1 CD19/CD3 CD27 CD11b IFN-γ Markierung PE/Cy7 PerCP PE FITC APC Markierung Isotypkontrolle 1 FITC PE Isotypkontrolle 2 PerCP APC PE/Cy7 Antigen CD8 CD4 CD3 NK1.1 CD19/CD3 CD27 CD11b Markierung APC FITC PerCP PE/Cy7 PerCP PE FITC Tab. 4.2: intrazelluläre Lymphknotenfärbung mit Kompensationen & Isotypkontrollen Nach dem Waschvorgang wurden die Röhrchen jeweils mit 100μl „Fixation/Permealization Lösung“ (BD, Franklin Lakes, NJ USA) für 20 Minuten bei 4°C - 24 - MATERIAL UND METHODEN inkubiert, um die Zellmembran für den IFN-γ Antikörper durchlässig zu machen. Anschließend erfolgte ein zweimaliger Waschvorgang mit der sog. „Perm Wash Solution“ (BD, Franklin Lakes, NJ USA). Erst dann waren die Zellen durchlässig für den intrazellulär bindenden IFN-γ Antikörper. Dieser wurde in einer 1:200 Verdünnung je Röhrchen hinzugegeben. Nach einem letzten Waschschritt folgte die FACS-Analyse. 4.2.2 Annexinfärbung von B16OVA Tumorzellen Zur Analyse der Viabilität der in vitro chemotherapeutisch behandelten Tumorzellen wurden diese mittels 1,5ml Trypsin (GIBCO, Darmstadt, Deutschland) aus der Kulturflasche gelöst und in Medium (R10) aufgenommen. Anschließend erfolgte die Auszählung und Färbung der Tumorzellen. Die Annexinfärbung erfolgte entsprechend Tabelle 4.3 und dient der Darstellung apoptotischer Zellen. Dies ermöglichte eine differenzierte Aussage, wie die Tumorzellen durch Chemobehandlung beeinflusst werden. Die Apoptose stellte sich als Annexin+ / DAPI- dar. Die Analyse erfolgte mittels der Durchflusszytometrie. 1. Färbung Antigen Annexin DAPI Markierung Antigen Kompensation ungefärbt FITC (jeweils 1 Tube) Annexin DAPI Markierung FITC Tab. 4.3 Annexinfärbung B16OVA Tumorzellen und Kompensationen 4.2.3 Durchflusszytometrie Die Durchflusszytometrie (FACS / „Fluoreszenz activated cell sorting“) erfolgte mit Antikörpern, die mit Fluoreszensfarbstoffen markiert wurden. Diese werden durch einen Laserstrahl angeregt und emittieren je nach Farbstoff Licht einer bestimmten Wellenlänge. Durch die Streuung der Lichtstrahlen in Verlängerung des Laserstrahls kann die relative Zellgröße bestimmt werden (Vorwärtsstreulicht / Forwardscatter / FSC). Das an Strukturen innerhalb der Zelle in einem 90°-Winkel reflektierte Licht wird als Seitwärtsstreulicht oder Sidescatter (SSC) bezeichnet und stellt ein Maß für die Zellgranularität dar [67]. - 25 - MATERIAL UND METHODEN Abbildung 4.2 zeigt die unterschiedlichen Zellpopulationen, die sich während einer FACS Analyse zeigen. Die anschließende Auswertung der FACS Daten erfolgte mit dem Programm Flow Jo (Tresstar Inc. Ashland, USA). Abb. 4.2: Zellpopulation in der Durchflusszytometrie; adaptiert nach Luttmann, Der Experimentator [67]. Die Abbildung zeigt die FACS-Analyse unterschiedlicher Zellpopulationen im FSC und SSC. 4.2.4 Antigen-spezifische Restimulation von Zellen Eine unserer wichtigsten funktionellen Zellanalysen war die in vitro Restimulation von Zellen. Für diese Versuche wurden Lymphknoten entnommen und anschließend zu einer Einzelzellsuspension verarbeitet. 1/10 der Gesamtzellmenge der präparierten Lymphozyten wurde mit Ovalbumin (=OVA, Calbiochem, Darmstadt, Deutschland) und SIINFEKL, einem spezifischen Peptidbruchstück des Ovalbumins, in einem Mischverhältnis von 1mg/ml OVA und 50μg/ml SIINFEKL stimuliert. Diese Ansätze wurden anschließend für drei Tage bei 37°C inkubiert. Das Zellwachstum konnte durch die Größe der entstandenen Zellpellets direkt mikroskopisch beurteilt und die IFN-γ Produktion mittels ELISA (BD, Franklin Lakes, NJ USA) gemessen werden. 4.2.5 ELISA Die Abkürzung ELISA steht für „Enzyme-linked Immunosorbent Assay“ und ist aktuell einer der am häufigsten angewandten quantitativen Immunoassays. Für unsere Analysen verwendeten wir die ELISA Methode, um die Menge an IFN-γ, die von einer spezifischen Zellmenge sezerniert wurde, zu detektieren [67]. Das Prinzip des Assays wird in Abbildung 4.3 dargestellt. - 26 - MATERIAL UND METHODEN Capture Antibody Mikrotiterplatte sezerniertes IFN-γ stimulierte Zelle durch Capture Antibody gebundenes IFN-γ Detection Antibody mit Enzym Farbreaktion Substratlösung Abb. 4.3: schematische Darstellung eines IFN-γ ELISAs; adaptiert nach Luttmann, Der Experimentator [67]. Im IFN-γ ELISA wurde zunächst ein Capture Antibody auf die Platte gebracht, der das sezernierte IFN-γ band. Dieses wurde wiederum von einem Detection Antibody gebunden, welches mit Hilfe einer Substratlösung eine Farbreaktion hervorrief. Bereits am Tag vor der eigentlichen IFN-γ Messung wurde die ELISA Platte mit einem Capture Antibody (BD, Franklin Lakes, NJ USA) in einer 1:250 Verdünnung in Coating Buffer (BD, Franklin Lakes, NJ USA) angesetzt. Der Antikörper adsorbierte hierbei an der speziellen Mikrotiterplatte. Nicht gebundener Antikörper wurde anschließend durch Waschen mit ELISA Wash Buffer (BD, Franklin Lakes, NJ USA) entfernt. Um die Hintergrundaktivität, die durch unspezifisch adsorbierte enzymmarkierte Antikörpermoleküle verursacht wurde, möglichst gering zu halten, wurden freie Proteinbindungsstellen geblockt. Nach einem Waschvorgang wurden 50μl der Standards und der Proben auf die Platte gegeben. Der Standard stellte hierbei Referenzwerte für die spätere Messung der IFN-γ Konzentration dar. Nach einem erneuten Waschvorgang wurde der Working Detector (BD, Franklin Lakes, NJ USA) hinzugegeben, der aus Assay Diluent, Detection Antibody (1:250 Verdünnung) und SAv-HRP (=Streptavidin-Horseradish Peroxidase, 1:250 Verdünnung) bestand. Die Zugabe der Substratlösung (BD, Franklin Lakes, NJ USA) setzte eine ca. 30-minütige Farbreaktion in Gang, bei welcher die Horseradish Peroxidase die Farbänderung induzierte. Durch Zugabe von 50μl 1M Phosphorsäure (Roth) wurde die Farbreaktion - 27 - MATERIAL UND METHODEN gestoppt. Die anschließende photometrische Messung fand bei einer Wellenlänge von 450nm gegen 570nm statt. Mit Hilfe der Messergebnisse konnte die IFN-γ Produktion errechnet werden. 4.2.6 anti-NK1.1 Antikörperaufreinigung Der für die NK-Zelldepletion benötigte anti-NK1.1 Antikörper (PK136) konnte aus Antikörperenthaltendem Aszites hergestellt werden, der freundlicherweise von der AG Zitvogel aus dem Institut Gustave Roussy, Villejuif, Frankreich bereitgestellt wurde. Der NK1.1-Zellen enthaltende Aszites musste zunächst zentrifugiert und dann filtriert werden, um Proteinaggregate zu entfernen. Die Aufreinigung erfolgte über eine Säule (Protein G HiTrap 1ml Pharmacia, Darmstadt, Deutschland), welche nur den gewünschten NK1.1 Antikörper band. Der restliche Durchfluss wurde gesammelt und konnte beliebig oft erneut über die Säule aufgereinigt werden. Das Lösen des Antikörpers erfolgte mittels 0,1M Glycin (pH 2,5-2,7). Von dem gelösten Antikörper wurden 0,5ml in einem Eppendorf Röhrchen mit 25μl Tris (pH=9,0) aufgefangen, um das saure Antikörper-Glycin-Gemisch zu neutralisieren und den Antikörper vor Denaturierung zu schützen. Anschließend wurde die Antikörperkonzentration in den einzelnen Eppendorf Röhrchen mittels Photometer gemessen. Die Fraktionen mit den höchsten Konzentrationen wurden für die Gelelektorpherese gepoolt, mit deren Hilfe die genaue Antikörperkonzentration Gelelektrophorese mussten die bestimmt werden Antikörperfraktionen konnte. über Vor der Nacht zur Antikörperstabilisierung und pH Neutralisation gegen PBS dialysiert werden. Abbildung 4.4 zeigt die durchgeführte Elektropherese, in der die dicken Banden die spezifischen Antikörperfraktionen darstellen. Bis zu seiner Verwendung wurde der Antikörper aliquotiert und bei -20°C aufbewahrt. - 28 - kDa MATERIAL UND METHODEN kDa Abb. 4.4: Gelelektropherese nach anti-NK1.1 Aufreinigung. Abbildung 4.4 zeigt die Gelelektropherese der Antikörperfraktionen nach einer Dialyse gegen PBS über Nacht. 10ml enthalten à 3,56 mg/ml Protein. 4.3 In vivo Methoden 4.3.1 Immunisierungsmodell Für die in vivo Vakzinierung wählten wir Ovalbumin (OVA) als Antigen, welches mit dem Adjuvans CpG (=Cytidin-Guanosin-Dinukleotid, MWG-Biotech), einem Toll-likeRezeptor 9 (TLR 9) Stimulans, subkutan in die Fußsohle von C57Bl/6 Mäusen appliziert wurde. Der Vakzinierungseffekt wurde anhand der IFN-γ Produktion der Immunzellen des drainierenden Lymphknotens (DLK) zu unterschiedlichen Zeitpunkten (12-60 Stunden) untersucht (s. Abb. 4.5). In weiteren Versuchen wurden NK-Zellen an Tag 4 und 1 vor der OVA/CpG Vakzinierung mittels anti-NK1.1-Antikörper depletiert, um den Einfluss der NK-Zellen in vivo zu untersuchen. - 29 - MATERIAL UND METHODEN FACS Analyse DLN in vivo IFN- Sekretion OVA 1mg + CpG 10μg 12-60h Zytokinfreisetzung (ELISA) C57BL/6 Mäuse NK-Zellen d-4 und d-1 DLN in vitro Restimulation + OVA/SIINFEKL für 3 Tage FACS Analyse Abb. 4.5 Immunisierungsmodell. Naive C57/Bl6 Mäuse erhielten durch eine s.c. Injektion von Ovalbumin und CpG eine spezifische Vakzinierung. Nachfolgend wurde zu unterschiedlichen Zeitpunkten (12-60 Stunden) die Immunantwort analysiert. Die Analyse erfolgte entweder direkt nach Entnahme der drainierenden Lymphknoten mittels FACS-Analyse der IFN-γ Expression oder nach dreitägiger Restimulation mittels IFN-γ ELISA oder ebenfalls FACS-Analyse. 4.3.2 Tumormodell Tumormodell im Rahmen einer OVA/CpG Vakzinierung Als Tumormodell wählten wir einen subkutan applizierten OVA-exprimierenden Melanomtumor (B16OVA). Abbildung 4.6 stellt das in vivo Tumormodell dar. An Tag 0 wurde C57Bl/6 Mäusen zur antitumoralen Vakzinierung OVA/CpG in die Fußsohle s.c. injiziert und nach 7-tägiger Immunisierungsphase auf der gleichen Seite B16OVA Tumor in die Flanke appliziert. Anschließend erfolgte eine ca. 14-tägige Beobachtung des Tumorwachstums mit Dokumentation der Tumorgröße. In einem weiteren Versuchsansatz erfolgte eine NK-Zelldepletion mittels anti-NK1.1 Antikörper, um den NK-Zell-Effekt auf das Tumorwachstum zu untersuchen. - 30 - MATERIAL UND METHODEN B16OVA Tumor OVA 1mg + CpG 10μg Tumor Progression NK-Zellen C57BL/6 Mäuse d-4 + d-1 d0 d7 d21 Abb. 4.6: Tumormodell bei Vakzinierung mit OVA/CpG. An Tag 0 erhielten die Mäuse eine OVA/CpG Vakzinierung. Nach 7 Tagen Immunisierungsphase wurden B16OVA Tumorzellen injiziert. Anschließend erfolgte eine ca. zweiwöchige Beobachtung des Tumorwachstums. Je nach Fragestellung erfolgte eine NKZelldepletion vier Tage vor sowie einen Tag vor der Vakzinierung mit OVA/CpG. Vakzinierung mit Doxorubicin behandeltem B16OVA Tumor In einem weiteren Vakzinierungsmodell (s. Abb. 4.7) erfolgte in C57Bl/6 Mäusen eine Vakzinierung mit Doxorubicin (1μM) behandelten B16OVA Tumorzellen an Tag 0. An Tag 7 erfolgte die Applikation der B16OVA Tumorzellen (5x105 Zellen) in die Flanke. Im Verlauf wurde das Tumorwachstum für ca. 14 Tage beobachtet und die Größenzunahme alle 3 bis 4 Tage dokumentiert. Doxorubicin behandelter B16OVA Tumor B16OVA Tumor Tumor Progression C57BL/6 Mäuse d0 d7 d21 Abb. 4.7: Tumormodell bei Vakzinierung mit Doxorubicin behandeltem B16OVA Tumor. An Tag 0 erhielten Mäuse Doxorubicin behandelte B16OVA Tumorzellen. 7 Tage später erfolgte die Injektion eines unbehandelten Tumors mit anschließender Beobachtung des Tumorprogresses. - 31 - MATERIAL UND METHODEN 4.4 Statistische Auswertungen Die erhobenen Daten wurden mit dem Statistikprogramm Prism 5 (Graph Pad) ausgewertet und dargestellt. Die graphische Darstellung der Daten erfolgte bei Analysen der Immunantwort mittels Säulendiagrammen und im in vivo Tumormodell mittels Verlaufskurven der Tumorgrößen. Daten aus den ELISA Versuchen wurden mit dem unpaired t-Test analysiert. Die Werte der intrazellulären Färbung wurden mittels 2way ANOVA und dem Bonferroni Post Test statistisch geprüft. Bei den Verlaufskurven im Tumorwachstum erfolgte eine Analyse mittels One Way ANOVA mit anschließendem Bonferroni’s Multiple Comparison Test. - 32 - ERGEBNISSE 5. ERGEBNISSE 5.1 Analyse der Immunantwort nach Ovalbumin spezifischer Vakzinierung 5.1.1 IFN-γ Produktion im Rahmen der Vakzinierung Naive C57Bl/6 Mäuse erhielten durch eine s.c. Injektion von Ovalbumin (OVA) und CpG eine spezifische Vakzinierung (s. Abb. 5.1). Nachfolgend wurde zu unterschiedlichen Zeitpunkten (12-60h) die IFN-γ Expression der Immunzellen drainierender Lymphknoten (DLK) mittels durchflusszytometrischer Messung analysiert und mit einer unbehandelten Kontrollgruppe verglichen. FACS Analyse OVA 1mg + CpG 10μg 12-60h DLK in vivo IFN- Sekretion naive C57Bl/6 Abb. 5.1: Versuchsaufbau IFN-γ Produktion im Rahmen der Vakzinierung. Naive C57Bl/6 Mäuse erhielten durch eine s.c. Injektion von Ovalbumin (OVA) und CpG eine spezifische Vakzinierung. Nachfolgend wurde zu unterschiedlichen Zeitpunkten (12-60h) die IFN-γ Expression der Immunzellen drainierender Lymphknoten (DLK) mittels durchflusszytometrischer Messung analysiert. Abbildung 5.2 zeigt die FACS Analysen nach 20 Stunden in vivo Vakzinierung. Es ließ sich kein signifikanter Unterschied der Zellzahl der CD4+, CD8+ T-Zellen oder NKZellen feststellen. Untersuchte man jedoch die NK-Zell-Subpopulationen genauer, so zeigte sich ein signifikanter Anstieg der CD11b+ NK-Zellen, was entweder auf eine Reifung der NK-Zellen oder auf eine spezifische Migration der CD11b+ NK-ZellSubpopuation im Rahmen der Vakzinierung schließen lässt. 20 Stunden nach in vivo Vakzinierung konnte nachgewiesen werden, dass die NK-Zellen die Hauptproduzenten des IFN-γ sind. In allen NK-Zell-Subpopulationen wurde ein signifikanter Anstieg der Interferon-Produktion nachgewiesen, vor allem in den CD27+CD11b+ NK-Zellen, deren Charakteristikum bekanntermaßen die IFN-γ Produktion ist [29, 30]. - 33 - A ERGEBNISSE Lymphozytenpopulation *** *** 20 ns ** 10 ns CD3+/CD4+ ** CD3+/CD8+ 0 CD3-/NK1.1+ CD27+CD11b- Lymphozytenpopulation B CD27+CD11b+ 30 ** ns ns Zellzahl in % 40 Zellzahl in % CD27-CD11b+ NK Subpopulationen 50 30 20 20 Kontrolle OVA/CPG ns ns 10 ns 10 0 Kontrolle OVA/CPG IFN- % IFN- % 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 NK Subpopulationen 30 CD3+/CD4+ CD3+/CD8+ CD3-/NK1.1+ 0 CD27+CD11b- CD27+CD11b+ CD27-CD11b+ Abb. 5.2: IFN-γ und Zellzahl Produktion im Rahmen der OVA/CpG Vakzinierung nach 20 Stunden. (A) Intrazelluläre IFN-γ Färbung der drainierenden poplitealen Lymphknoten (DLK) 20 Stunden nach OVA/CpG Vakzinierung versus Kontrollgruppe. In der frühen Immunisierungsphase wurde + + die IFN-γ Produktion durch die NK-Zellen, insbesondere der CD27 /CD11b Subpopulation + gestellt. (B) In der prozentualen Zellpopulation war ein Anstieg der CD27 /CD11b NK Zellen zu verzeichnen während die anderen Subsets und T-Zellen keine wesentlichen Veränderungen aufzeigten (n=2-3, 2way ANOVA Analyse mit Bonferroni postests, ns p>0.05, ** p<0.01, *** p<0.001). Die Analyse der Immunantwort 40 Stunden nach der in vivo Vakzinierung zeigte, dass die IFN-γ Produktion der NK-Zellen im weiteren Verlauf zurück ging und sich kein signifikanter Unterschied mehr zu den unstimulierten Kontrollen feststellen lies. Zu diesem Zeitpunkt produzierten weder die CD4+ noch die CD8+ T-Zellen IFN-γ. Darüber hinaus war ein Rückgang des prozentualen Anteils der CD4+ T-Zellen zu bemerken (s. Abb. 5.3). Da die Gesamtzahl der NK-Zellen bei diesen Untersuchungen besonders gering war, ließen sich die Subpopulationen nicht analysieren. - 34 - Entwicklung der Zellzahl A 50 Zellzahl in % 40 ERGEBNISSE * Kontrolle OVA/CpG ns 30 20 10 0 ns CD3+/CD4+ CD3+/CD8+ NK1.1+/CD3- Entwicklung der IFN- Produktion B 10 Kontrolle IFN- % 8 OVA/CpG 6 4 ns ns ns 2 0 CD3+/CD4+ CD3+/CD8+ NK1.1+/CD3- Abb. 5.3 Zellzahl und IFN-γ Produktion im Rahmen der OVA/CpG Vakzinierung nach 40 Stunden. Intrazelluläre IFN-γ Färbung der drainierenden poplitealen Lymphknoten 40 Stunden nach OVA/CpG Vakzinierung versus Kontrollgruppe. (A) Nach länger andauernder + Immunisierungsphase war ein leichter Abfall der CD4 T-Zellen zu bemerken. (B) Bezüglich der IFN-γ Produktion waren keine signifikanten Veränderungen feststellbar (n=4, Versuche insgesamt dreimal wiederholt, 2way ANOVA Analyse mit Bonferroni postests, ns p>0.05, * p<0.05). 60 Stunden nach in vivo Stimulation war bezüglich der IFN-γ Produktion der T-Zellen wiederum kein Unterschied zwischen den vakzinierten Mäusen und der Kontrollgruppe feststellbar. Jedoch konnte ein signifikanter Rückgang des prozentualen Zellanteils der CD4+ T-Zellpopulation nachgewiesen werden (s. Abb. 5.4). - 35 - ERGEBNISSE Entwicklung der Zellzahl A 50 Kontrolle ** OVA/CpG 40 Zellzahl in % ns 30 20 10 0 ns CD3+/CD4+ CD3+/CD8+ NK1.1+/CD3- Entwicklung der IFN- Produktion B 10 Kontrolle 8 IFN- % OVA/CpG 6 4 ns 2 0 CD3+/CD4+ ns ** CD3+/CD8+ NK1.1+/CD3- Abb. 5.4 Zellzahl und IFN-γ Produktion im Rahmen der OVA/CpG Vakzinierung nach 60 Stunden. Intrazelluläre IFN-γ Färbung der drainierenden poplitealen Lymphknoten 60 Stunden nach OVA/CpG Vakzinierung versus Kontrollgruppe. (A) Nach länger andauernder + Immunisierungsphase war ein weiterer Abfall der CD4 T-Zellen zu bemerken. (B) Bezüglich der IFN-γ Produktion waren keine signifikanten Veränderungen nachweisbar (n=4, insgesamt dreimal wiederholt, 2way ANOVA Analyse mit Bonferroni postests, ns p>0.05, ** p<0.01). Abbildung 5.5 verdeutlicht zusammenfassend die Entwicklung der prozentualen Anteile der einzelnen Zellpopulationen bezüglich der IFN-γ Produktion. Nach längerer in vivo Stimulation über 40 bzw. 60 Stunden zeigte sich ein deutlicher Rückgang des prozentualen Zellanteils der CD4+ und CD8+ T-Zellen, während NK-Zellen keine signifikanten Veränderungen aufwiesen. Bezüglich der IFN-γ Produktion beobachteten wir eine Zunahme der IFN-γ Produktion der CD4+ und der CD8+ T-Zellen nach 40 Stunden, die nach 60 Stunden wieder stark abfiel. Bei den NK-Zellen war die signifikant höchste IFN-γ Produktion nach 20 Stunden zu verzeichnen, diese nahm jedoch mit zunehmender Stimulationsdauer deutlich ab. - 36 - ERGEBNISSE Entwicklung der Zellzahl A 50 *** *** ns Zellzahl in % 20 Stunden 40 Stunden 60 Stunden *** 40 ** 30 ns 20 ns 10 ns 0 CD3+/CD4+ CD3+/CD8+ ns NK1.1+/CD3- Entwicklung der IFN- Produktion B *** *** 10 IFN- % 8 6 4 ns *** *** 20 Stunden 40 Stunden 60 Stunden * *** *** ns 2 0 CD3+/CD4+ CD3+/CD8+ NK1.1+/CD3- Abb. 5.5 Entwicklung prozentuale Zellzahl & IFN-γ Produktion im Rahmen der OVA/CpG Vakzinierung. Intrazelluläre IFN-γ Färbung der drainierenden poplitealen Lymphknoten (DLK) 20, 40 und 60 Stunden nach OVA/CpG Vakzinierung versus Kontrollgruppe. (A) Rückgang des prozentualen + + Zellanteils nach längerer Stimulation. (B) Sowohl die CD4 als auch die CD8 T-Zellen zeigten 40h nach OVA/CpG Vakzinierung in der intrazellulären Färbung einen signifikanten IFN-γ Anstieg, der allerdings nach 60h wieder signifikant abfiel. Bei den NK-Zellen zeigte sich die höchste IFN-γ Produktion nach 20h (n=4, aus drei Experimenten, 2way ANOVA Analyse mit Bonferroni posttests, ns p>0.05, * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001). 5.1.2 Immunmonitoring nach OVA/CpG Vakzinierung Nach Etablierung des in vivo Vakzinierungsmodells wurden die Lymphknotenzellen nach 24 Stunden in vivo Stimulation entnommen und für drei Tage mit OVA/SIINFEKL bei 37°C in vitro restimuliert. Anschließend bestimmten wir die Zellproliferation und die IFN-γ Produktion sowohl mittels ELISA, als auch einer intrazellulären Färbung. Tabelle 5.1 zeigt die mikroskopisch semi-quantitativ analysierte in vitro Zellproliferation der Versuchsgruppen nach Restimulation. - 37 - ERGEBNISSE Tiernummer Stimulation Proliferation 1 2 3 4 --------- + + + + 5 6 1 2 3 4 5 6 ----OVA/CpG OVA/CpG OVA/CpG OVA/CpG OVA/CpG OVA/CpG + + + ++ ++ ++ + + Legende o + ++ +++ keine Proliferation mäßige Proliferation gute Proliferation sehr gute Proliferation Tab. 5.1 Proliferation nach OVA/CpG Stimulation. Nach 24h in vivo Vakzinierung mit OVA/CpG und anschließender in vitro Restimulation mit OVA/SIINFEKL für 3 Tage war nur ein geringer makroskopischer Unterschied bezüglich der Zellproliferation zu beobachten. Es zeigte sich kaum ein Unterschied in der Zellproliferation nach 24 Stunden in vivo Vakzinierung zwischen den in vivo OVA/CpG stimulierten Mäusen und den unstimulierten Kontrolltieren. Dieser Befund bestätigte sich auch im IFN-γ ELISA. Bei der OVA/CpG Gruppe konnte nur eine geringe, nicht signifikante, IFN-γ Produktion im Bereich von 50pg/ml gemessen werden (Abb. 5.6). IFN- Produktion ns IFN [pg/mL] 80 60 40 20 0 Kontrolle OVA/CpG Abb. 5.6: IFN-γ ELISA nach 24 Stunden in vivo OVA/CpG Vakzinierung + 3 Tage Restimulation in vitro. Im drainierenden poplitealen Lymphknoten konnten nur geringe, nicht signifikante IFN-γ-Werte im Bereich von 50pg/ml gemessen werden (n=12, t-Test Analyse, p=0.1678). Es stellte sich nun die Frage, ob die IFN-γ Produktion mit zunehmender in vivo Stimulation ansteigt. Hierfür wurden die Lymphknotenzellen erst nach 48 Stunden in vivo Stimulation entnommen und wie im vorherigen Experiment mit OVA/SIINFEKL - 38 - ERGEBNISSE restimuliert. Zusätzlich zu den poplitealen Lymphknoten wurden nun auch die inguinalen Lymphknoten analysiert. Zusätzlich untersuchten wir, ob eine alleinige Restimulation mit OVA ausreichend ist oder ob eine Kombination von OVA mit SIINFEKL, einem spezifischen Peptidbruchstück des OVA, eine höhere IFN-γ Sekretion zur Folge hat. Nach der in vitro Restimulation erfolgte sowohl ein IFN-γ ELISA des Überstands, als auch eine intrazelluläre IFN-γ Färbung. Abbildung 5.7 zeigt die Entwicklung des prozentualen Zellzahlanteils in der FACSAnalyse. Es war ein deutlicher Rückgang der prozentualen Anteile sowohl der CD8+, als auch der CD4+ T-Zellen in den in vivo OVA/CpG stimulierten Mäusen in beiden Lymphknotenregionen zu verzeichnen. Bei den NK-Zellen ließ sich weder eine Änderung in der Gesamtzahl aller NK-Zellen, noch eine Populationsverschiebung der Subgruppen nachweisen. A Lymphozyten 40 *** *** *** *** Zellzahl in % 30 20 ns ns 10 0 CD3+/CD8+ B CD3+/CD4+ NK1.1+/CD3- NK Subpopulationen ns 5 ns Zellzahl in % 4 Kontrolle inguinal OVA/CpG popliteal OVA/CpG 3 2 ns ns ns ns 1 0 CD27+/CD11b- CD27+/CD11b+ CD27-/CD11b+ Abb. 5.7: FACS-Analyse: in vivo OVA/CpG Vakzinierung + 3 Tage Restimulation in vitro. FACS-Analyse der drainierenden poplitealen Lymphknoten (DLK) nach 48 Stunden OVA/CpG Vakzinierung in vivo mit Restimulation für 3 Tage in vitro versus Kontrollgruppe. (A) + (B) Es + + war ein signifikanter Rückgang des prozentualen CD4 und CD8 T-Zellanteils, während bei den NK-Zellen kein Unterschied feststellbar war (n=6, drei Versuche, 2way ANOVA Analyse mit Bonferroni posttest, ns p>0.05, *** p<0.001). - 39 - ERGEBNISSE Es fand sich eine gesteigerte IFN-γ Produktion nach Kombinationsstimulation, jedoch im nicht signifikanten Bereich (s. Abb. 5.8). Inguinaler Lymphknoten A B 1600 1400 1200 ns IFN [pg/mL] IFN [pg/mL] ns 1400 1200 1000 800 250 200 150 100 50 0 Poplitealer Lymphknoten 1600 OVA OVA + SIINFEKL 1000 800 250 200 150 100 50 0 OVA OVA + SIINFEKL Abb. 5.8: Restimulation mit OVA versus OVA/SIINFEKL nach 48 Stunden. Sowohl im (A) inguinalen als auch (B) poplitealen Lymphknoten lässt sich eine leichte, jedoch nicht signifikant erhöhte IFN-γ Produktion nach Kombinationsstimulation mit OVA/SIINFEKL erzielen (n=6, t-Test Analyse (A) p=0.2145, (B) p=0.4356). Betrachtet man die Ergebnisse des IFN-γ ELISA (Abb. 5.9), so zeigte sich eine unterschiedliche IFN-γ Produktion der Lymphozyten in Abhängigkeit der untersuchten Lymphknotenregion, wobei die INF-γ Produktion in den poplitealen Lymphknoten höher war. Bei in vitro Kombinationsrestimulation (OVA + SIINFEKL) ließen sich erneut höhere IFN-γ Werte erzielen als bei alleiniger Restimulation mit OVA. Daher wurde in den weiteren Versuchen die Kombinationsrestimulation verwendet. IFN [pg/mL] IFN [pg/mL] *** 1500 1000 ns 500 0 Kontrolle *** 2000 *** 2000 OVA/SIINFEKL B OVA A inguinal popliteal ** 1500 1000 500 *** 0 Kontrolle inguinal popliteal Abb. 5.9: IFN-γ ELISA nach 48h in vivo OVA/CpG Vakzinierung + 3 Tagen Restimulation in vitro. IFN-γ ELISA der drainierenden poplitealen Lymphknoten (DLK) 48 Stunden nach OVA/CpG Vakzinierung in vivo mit Restimulation für 3 Tage in vitro versus Kontrollgruppe. Es zeigte sich vor allem der poplitealen Lymphozyten ein signifikanter Anstieg der IFN-γ Produktion der stimulierten Lymphknoten verglichen zur unstimulierten Kontrolle sowohl in der (A) OVA als auch in der (B) OVA/SIINFEKL Restimulation (n=12, drei Versuche, unpaired t-Test, ns p>0.05, *** p<0.0001). Die Analyse der Proliferation 60 Stunden nach in vivo Stimulation (s. Tab. 5.2) zeigte die beste Proliferationsrate in den untersuchten Lymphozyten der poplitealen - 40 - ERGEBNISSE Lymphknoten, wohingegen bei den inguinalen Lymphknoten eine nur mäßig erhöhte Zellproliferation nach OVA/CpG Vakzinierung zu beobachten war. inguinaler Lymphknoten poplitealer Lymphknoten Tiernummer Stimulation Proliferation Tiernummer Stimulation Proliferation 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 ------------OVA/CpG OVA/CpG OVA/CpG OVA/CpG OVA/CpG OVA/CpG + ++ + ++ + ++ +++ + + + +++ ++ 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 ------------OVA/CpG OVA/CpG OVA/CpG OVA/CpG OVA/CpG OVA/CpG O O O O O O +++ +++ ++++ +++ ++ +++ Legende o + ++ +++ keine Proliferation Mäßige Proliferation gute Proliferation sehr gute Proliferation Tab. 5.2: Proliferationstabelle nach 60h in vivo OVA/CpG Stimulation. 60h nach in vivo OVA/CpG Vakzinierung zeigte sich nach 3 Tagen in vitro OVA/SIINFEKL Restimulation besonders im poplitealen drainierenden Lymphknoten ein deutlicher Unterschied zwischen den in vivo stimulierten und nicht stimulierten Lymphknoten. Der IFN-γ ELISA zeigte eine unterschiedlich hohe IFN-γ Produktion in den inguinalen bzw. den poplitealen Lymphknoten. In diesem Versuch erreichten die Werte im poplitealen drainierenden Lymphknoten durchschnittlich 1500pg/ml, während die inguinalen drainierenden Lymphknoten nur Werte von durchschnittlich 40pg/ml (s. Abb. 5.10) erzielten. Aufgrund dieser Ergebnisse wurden in den Folgeexperimenten nur noch die poplitealen Lymphknoten untersucht. - 41 - Inguinaler Lymphknoten 2500 2000 1500 1000 80 70 60 50 40 30 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 *** Kontrolle Poplitealer Lymphknoten B IFN [pg/mL] IFN [pg/mL] A ERGEBNISSE 2500 2000 1500 1000 80 70 60 50 40 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 OVA/CpG *** Kontrolle OVA/CpG Abb. 5.10: IFN-γ ELISA nach 60h in vivo OVA/CpG Vakzinierung + 3 Tagen Restimulation in vitro. IFN-γ ELISA der drainierenden Lymphknoten (DLK) nach 60 Stunden OVA/CpG Vakzinierung in vivo mit Restimulation für 3 Tage in vitro versus Kontrollgruppe. Es zeigte sich sowohl in den (A) inguinalen als auch in den (B) poplitealen Lymphozyten ein deutlicher IFN-γ Anstieg in den in vivo OVA/CpG stimulierten Lymphknoten verglichen mit den nicht stimulierten (n=12, drei Versuche, t-Test Analyse, *** p<0.0001). Da 60 Stunden nach in vivo Stimulation keine wesentliche Steigerung der IFN-γ Werte zur 48-stündigen Stimulation erreicht werden konnte (s. Abb. 5.11), wurden die folgenden Versuche mit einer 48-stündigen in vivo OVA/CpG Stimulation durchgeführt. Inguinaler Lymphknoten A B 2500 2000 1000 250 200 150 100 50 5 4 3 2 1 0 ns IFN [pg/ml] IFN [pg/ml] 1500 ns unstim DLK OVA/CPG Poplitealer Lymphknoten 2500 2000 1500 1000 250 200 150 100 50 5 4 3 2 1 0 ns 48h 60h ns unstim DLK OVA/CPG Abb. 5.11: IFN-γ ELISA nach 48h versus 60h in vivo OVA/CpG Vakzinierung + 3 Tage Restimulation in vitro. Sowohl im (A) inguinalen als auch im (B) poplitealen Lymphknoten konnte im Vergleich zu einer 48-stündigen OVA/CpG Vakzinierung die IFN-γ Produktion nach 60 Stunden nicht gesteigert werden (n=12, 2way ANOVA mit Bonferronie post-test, ns p>0.05). 5.1.3 Immunmonitoring der OVA/CpG Vakzinierung nach NK-Depletion Eine wichtige Fragestellung dieser Arbeit war der Einfluss von NK-Zellen im Rahmen der OVA/CpG Vakzinierung. Schema 5.12 zeigt das Versuchsprotokoll, welches eine Kontrollgruppe und eine Gruppe NK-Zell depletierter Tiere umfasst. - 42 - ERGEBNISSE Zytokinfreisetzung (ELISA) OVA 1mg + CpG 10μg DLK in vitro Restimulation + OVA/SIINFEKL für 3 Tage 48h C57BL/6 Mäuse NK Zellen d-4 und d-1 FACS Analyse Abb. 5.12: Versuchsaufbau Immunmonitoring nach OVA/CpG Vakzinierung mit NKDepletion. Naive C57Bl/6 Mäuse erhielten durch eine s.c. Injektion von Ovalbumin und CpG eine spezifische Vakzinierung. Nachfolgend wurden nach 40 Stunden die Zellen der poplitealen Lymphknoten entnommen und für 3 Tage mit OVA und SIINFEKL restimuliert. Anschließend erfolgte ein IFN-γ ELISA und mittels Durchflusszytometrie eine Analyse der Zellpopulation, sowie der intrazellulären IFN-γ Expression. 25 *** ** Zellzahl Kontrolle OVA/CpG Zellzahl in % 20 ns anti NK1.1 + OVA/CpG ns 15 10 ** ns 5 0 CD3+/CD4+ CD3+/CD8+ NK1.1+/CD3- Abb. 5.13: Splenozytenfärbung nach NK-Depletion und OVA/CpG Vakzinierung. Zellfärbung der Milz nach OVA/CpG Vakzinierung mit und ohne NK-Zelldepletion versus Kontrollgruppe. Nachweis der erfolgreichen NK Depletion nach anti-NK1.1 Antikörperinjektion (n=6, drei Versuche, 2way ANOVA Analyse mit Bonferroni postests, ns p>0.05, ** p<0.01, *** p<0.001). Nach erfolgreicher NK-Zelldepletion waren kaum NK1.1+CD3- Zellen mehr in den Splenozyten nachweisbar (s. Abb. 5.13). Ebenso sank die Zahl der CD4+ T-Zellen bereits nach alleiniger OVA/CpG Vakzinierung signifikant und noch deutlicher nach NK-Depletion. Dieser Befund konnte bei den CD8+ T-Zellen nicht erhoben werden. Tabelle 5.3 zeigt das mikroskopisch sichtbare Ausmaß der Zellproliferation nach Restimulation. Wie schon in den vorherigen Versuchen proliferierten die in vivo OVA/CpG stimulierten Lymphozyten deutlich besser als die der Kontrollgruppe. Bei der NK-Zell depletierten Gruppe wurde diese Proliferation weiter verstärkt. - 43 - Tiernummer Stimulation Proliferation 1 2 3 4 5 6 ------------- + + + + + + 1 2 3 4 5 6 OVA/CpG OVA/CpG OVA/CpG OVA/CpG OVA/CpG OVA/CpG anti-NK1.1 + OVA/CpG anti-NK1.1 + OVA/CpG anti-NK1.1 + OVA/CpG anti-NK1.1 + OVA/CpG anti-NK1.1 + OVA/CpG anti-NK1.1 + OVA/CpG + ++ ++ + ++ ++ 1 2 3 4 5 6 ERGEBNISSE Legende o + ++ +++ keine Proliferation mäßige Proliferation gute Proliferation sehr gute Proliferation +++ +++ +++ ++ +++ +++ Tab. 5.3: Proliferation nach 48 Stunden OVA/CpG Vakzinierung mit NK-Zelldepletion. Nach 3-tägiger OVA/SIINFEKL Restimulation zeigte sich eine deutlich erhöhte Zellproliferation der Lymphknotenzellen nach NK-Zelldepletion und in vivo OVA/CpG Stimulation verglichen zu reiner in vivo OVA/CpG Stimulation. Nach Ablauf der Restimulation wurde im Überstand die IFN-γ Konzentration mittels ELISA bestimmt. Die verbliebenen Zellpellets wurden mittels einer Intrazellulärfärbung per FACS analysiert. In diesen Versuchen wurde sowohl die Immunantwort der poplitealen, als auch der inguinalen Lymphknoten untersucht, um einen umfassenden Überblick über den Einfluss der NK-Zelldepletion auf das Immunsystem zu gewinnen. - 44 - A ERGEBNISSE Zellzahl inguinaler Lymphknoten *** *** 60 ns Zellzahl in % ns 40 Kontrolle OVA/CpG anti NK1.1 + OVA/CpG 20 0 B CD3+/CD4+ CD3+/CD8+ IFN- inguinaler Lymphknoten 4 ** IFN- % 3 2 ns Kontrolle OVA/CpG anti NK1.1 + OVA/CpG * ns 1 0 CD3+/CD4+ CD3+/CD8+ Abb. 5.14: Intrazelluläre IFN-γ Färbung des inguinalen drainierenden Lymphknotens. Intrazelluläre IFN-γ Färbung der drainierenden inguinalen Lymphknoten (DLK) 48 Stunden nach OVA/CpG Vakzinierung in vivo mit und ohne NK-Zelldepletion versus Kontrollgruppe. (A) Der + prozentuale CD4 T-Zellanteil sank deutlich nach in vivo OVA/CpG Stimulation, unabhängig von NK-Zellen. (B) Die IFN-γ Produktion stieg hingegen nach in vivo OVA/CpG Stimulation deutlich an, besonders in Abwesenheit von NK-Zellen (n=6, drei Versuche, 2way ANOVA Analyse mit Bonferroni posttests, ns p>0.05, * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001). Die intrazelluläre Färbung (s. Abb. 5.14) des drainierenden inguinalen Lymphknotens zeigte bei der IFN-γ Produktion einen signifikanten Anstieg in der CD8+ TZellpopulation nach OVA/CpG Vakzinierung und noch deutlicher nach NK- Zelldepletion. Ein deutlicher Rückgang des prozentualen Anteils der CD4+ T-Zellen nach OVA/CpG Stimulation konnte unabhängig von einer NK-Zelldepletion beobachtet werden, was jedoch bei der CD8+ T-Zellpopulation nicht gesehen wurde. Bei der Kalkulation der absoluten Zellzahlen konnte bei den CD4+ T-Zellen ein signifikanter Rückgang nach OVA/CpG Stimulation beobachtet werden, der nach NK-Depletion leichtgradig, jedoch nicht signifikant, anstieg. Die CD8+ T-Zellpopulation wies ähnliche Tendenzen auf, blieb jedoch stets im nicht signifikanten Bereich (s. Abb. 5.15). - 45 - ERGEBNISSE Absolute Zellzahl ns absolute Zellzahl x 10 6 2.5 2.0 * ns ns Kontrolle OVA/CpG anti NK1.1 + OVA/CpG 1.5 1.0 0.5 0.0 CD3+/CD4+ CD3+/CD8+ Abb. 5.15: Intrazelluläre IFN-γ Färbung des inguinalen drainierenden Lymphknotens. Intrazelluläre IFN-γ Färbung der drainierenden inguinalen Lymphknoten (DLK) 48 Stunden nach OVA/CpG Vakzinierung in vivo mit und ohne NK-Zelldepletion versus Kontrollgruppe. Bei der + Kalkulation der absoluten Zellzahlen konnte bei den CD4 T-Zellen ein signifikanter Rückgang der Zellzahl nach OVA/CpG Stimulation beobachtet werden, der nach NK-Depletion wieder, + nicht signifikant, anstieg. Die CD8 T-Zellpopulation wies ähnliche Tendenzen auf, blieb jedoch stets im nicht signifikanten Bereich. (n=5, drei Versuche, 2way ANOVA Analyse mit Bonferroni posttests, ns p>0.05, * p<0.05). In den drainierenden poplitealen Lymphknoten (s. Abb. 5.16) zeigte sich ein ähnliches Bild. Allerdings war der prozentuale Rückgang der CD4+ T-Zellen noch deutlicher und die CD8+ T-Zellen nahmen, im Gegensatz zu den inguinalen Zellen, ebenfalls signifikant ab. Bei Betrachtung der absoluten Zellzahlen zeigte sich hingegen nach OVA/CpG Vakzinierung ein Anstieg der T-Zellpopulation, besonders der CD8+ TZellen, welche nach NK-Depletion nicht weiter signifikant anstieg. In den CD8+ T-Zellen war zudem ein sehr markanter Anstieg der IFN-γ Produktion in der OVA/CpG immunisierten Gruppe erkennbar. Dieser wurde, anders als in den inguinalen Lymphknoten, durch die NK-Depletion kaum weiter gesteigert. In den CD4+ T-Zellen war eine nicht signifikant erhöhte IFN-γ Produktion in den Lymphozyten der OVA/CpG stimulierten Mäusen erkennbar, die jedoch nach NK-Depletion wieder abnahm. - 46 - A IFN- Produktion *** *** IFN- in % 6 4 2 0 Kontrolle OVA/CpG anti NK1.1 + OVA/CpG ns * CD3+/CD4+ CD3+/CD8+ Prozentuale Zellzahl B Zellzahl in % 60 *** *** *** *** 40 ns ns 20 0 C CD3+/CD4+ CD3+/CD8+ Kontrolle OVA/CpG anti NK1.1 + OVA/CpG NK1.1+/CD3- Absolute Zellzahl * 0.5 Zellzahl absolut x 10 6 ERGEBNISSE ns 0.4 * Kontrolle OVA/CpG anti NK1.1 + OVA/CpG 0.3 0.2 0.1 0.0 CD3+/CD4+ CD3+/CD8+ Abb. 5.16: Intrazelluläre IFN-γ Färbung des poplitealen drainierenden Lymphknotens. (A) Die IFN-γ Produktion stieg nach OVA/CpG in vivo Stimulation NK-zellunabhängig in den + + CD8 T-Zellen an, bei den CD4 T-Zellen stieg diese nur nach OVA/CpG Stimulation in vivo + + signifikant an. (B) Es nahmen sowohl die CD4 als auch die CD8 T-Zellen nach OVA/CpG in vivo Stimulation unabhängig von NK-Zellen prozentual deutlich ab. (C) Die Betrachtung der absoluten Zellzahlen zeigte jedoch nach OVA/CpG Vakzinierung einen Anstieg der T+ Zellpopulation, besonders der CD8 T-Zellen, welche nach NK-Depletion nicht signifikant anstieg (n=6, dreimal insgesamt wiederholt und bestätigt; 2way ANOVA Analyse mit Bonferroni posttests, ns p>0.05, * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001). - 47 - ERGEBNISSE Mit dem IFN-γ ELISA (s. Abb. 5.17) war in den inguinalen Lymphknoten kaum IFN-γ messbar. Im poplitealen drainierenden Lymphknoten hingegen erreichten die IFN-γ Werte der OVA/CpG stimulierten Gruppe durchschnittlich Werte von 1500pg/ml, während bei zusätzlicher NK-Zelldepletion nochmals signifikant gesteigerte Werte von 10.000pg/ml gemessen werden konnten. A Inguinaler Lymphknoten 40 ns IFN [pg/mL] 30 ns 20 10 0 B Kontrolle OVA/CpG anti-NK1.1 + OVA/CpG Poplitealer Lymphknoten poplitealer Lymphknoten *** 12000 IFN [pg/mL] 10000 *** 8000 6000 1500 *** 1000 500 0 Kontrolle OVA/CpG anti NK11 + OVA/CpG Abb. 5.17: IFN-γ ELISA inguinaler und poplitealer drainierender Lymphknoten. IFN-γ ELISA der drainierenden poplitealen und inguinalen Lymphknoten (DLK) nach 48 Stunden OVA/CpG Vakzinierung in vivo mit und ohne NK-Zelldepletion mit Restimulation für 3 Tage in vitro versus Kontrollgruppe. (A) In den inguinalen Lymphknoten war keine nennenswerte IFN-γ Messung nachweisbar. (B) Im drainierenden poplitealen Lymphknoten (DLK) zeigte sich, dass die in vivo NK-Zelldepletierten + OVA/CpG stimulierten Zellen deutlich mehr IFN-γ produzierten als die Kontrollgruppe oder die Mäuse mit alleiniger OVA/CpG Vakzinierung (n=12, insgesamt dreimal wiederholt und bestätigt; unpaired t-Test, ns p>0.05, *** p<0.0001). - 48 - ERGEBNISSE 5.2 Tumorimmunität in vivo 5.2.1 OVA-spezifisches Tumormodell in immunkompetenten Tieren Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Testung des OVA/CpG Vakzinierungsprotokolls in einem Tumormodell in vivo. Die Versuchstiere wurden mit Ovalbumin (OVA) als Antigen in Kombination mit CpG als Adjuvans s.c. vakziniert. Sieben Tage nach Vakzinierung wurden OVA-exprimierende Melanomzellen (B16OVA) in die Flanke subkutan injiziert und das Tumorwachstum alle 3-4 Tage dokumentiert. Nach einer 14tägigen Beobachtungszeit oder ab einer Tumorgröße > 200mm² wurde der Versuch beendet. Abbildung 5.18 zeigt das Ergebnis dieses Versuchs. Bereits 9 Tage nach Tumorinjektion lies sich ein, im Vergleich zu einer nicht vakzinierten Kontrollgruppe, deutlich gemindertes Tumorwachstum nach OVA/CpG Vakzinierung beobachten. Verlauf der Tumorgröße Tumorgröße in mm2 150 Kontrolle OVA/CpG Vakzinierung 100 *** *** 50 ns * 0 Tag 6 Tag 9 Tag 12 Tag 15 Abb. 5.18: OVA-spezifisches Tumormodell in immunkompetenten Tieren. Gemessene Tumorgröße nach OVA/CpG Immunisierung versus Kontrollgruppe. Mit OVA/CpG immunisierte Mäuse zeigten nach B16OVA Tumorinjektion ein signifikant deutlich geringeres Tumorwachstum (n=5, drei Versuche, 2way ANOVA Analyse mit Bonferroni postests, ns p>0.05, * p<0.05. *** p<0.001.) 5.2.2 OVA-spezifisches Tumormodell in NK-defizienten Tieren OVA-spezifisches Tumormodell in NK-defizienten Tieren ohne OVA/CpG Nach Etablierung des Modells erfolgte ein NK-Zell Depletionsversuch im Rahmen des Tumormodells. Hierbei wurde das Wachstum unbehandelter Mäuse (Kontrollgruppe) mit durch anti-NK1.1-Antikörper Injektion NK-Zelldepletierten Mäusen verglichen. Die Depletion fand vier Tage und einen Tag vor der B16OVA Injektion statt und wurde mit einer einmaligen Injektion pro Woche aufrechterhalten. - 49 - ERGEBNISSE An Tag 21 nach B16OVA Injektion zeigte sich kein signifikanter Unterschied im Tumorwachstum zwischen den einzelnen Gruppen (Abb. 5.19), wenn auch die NKZelldepletierte Gruppe ein etwas größeres Tumorwachstum zu verzeichnen hatte. Bei Überschreiten der Tumorgröße >200mm2 musste der Versuch beendet werden. Tumorgröße in mm2 Verlauf der Tumorgröße Kontrolle NK-Zelldepletiert 200 ns 100 0 Tag 11 Tag 15 Tag 18 Tag 21 Abb. 5.19: Tumormodell in NK-defizienten Tieren ohne OVA/CpG Vakzinierung. Tumorgröße nach NK-Zelldepletion im Vergleich zu einer immunkompetenten Kontrollgruppe. Es zeigte sich kein signifikanter Unterschied im B16OVA Tumorwachstum zwischen unbehandelten Mäusen verglichen mit NK-defizienten Mäusen (n=5, drei Versuche, 2way ANOVA Analyse mit Bonferroni Post-tests, ns p>0.05). Tumormodell in NK-defizienten Tieren nach OVA/CpG Vakzinierung Des Weiteren wurde der Einfluss der NK-Zelldepletion im Rahmen der OVA/CpG Vakzinierung im Tumormodell getestet. Die NK-Zelldepletion erfolgte vier bzw. einen Tag vor der OVA/CpG Vakzinierung, welche wiederum 7 Tage vor der Tumorinjektion statt fand (s. Abb. 5.20). NK Zellen B16OVA OVA 1mg + CpG 10μg naive C57BL/6 d-4 + d-1 d0 d7 Tumor Progression d21 Abb. 5.20: Versuchsaufbau OVA-spezifisches Tumormodell in immunkompetenten Tieren. Naive C57Bl/6 Mäuse erhielten durch s.c. Injektion von Ovalbumin und CpG in die Fußsohle eine spezifische Vakzinierung. 7 Tage später erhielten sie B16OVA Tumorzellen in die Flanke - 50 - ERGEBNISSE und es folgte eine Beobachtung des Tumorwachstums über 14 Tage. In einem weiteren Ansatz wurde die NK-Zellen 4 bzw. 1 Tag vor der Vakzinierung mit einem anti-NK1.1-Antikörper i.p. depletiert, welche mit einer Injektion 1x/Woche aufrechterhalten wurde. Es zeigte sich ein deutlich gemindertes Tumorwachstum nach OVA/CpG Vakzinierung, welches jedoch nicht durch NK-Zellen beeinflusst wurde (Abb. 5.21, (A)). Es stellte sich heraus, dass die NK-defizienten Mäuse ein etwas langsameres Tumorwachstum aufwiesen im Gegensatz zur immunkompetenten Gruppe (Abb. 5.21, (B)). Dieser Unterschied war jedoch nur minimal und auch bei Wiederholung des Versuchs konnte kein signifikanter Effekt nachgewiesen werden. A Verlauf der Tumorgröße Tumorgröße in mm2 200 unstim OVA/CPG antiNK1.1 + OVA/CPG 150 100 *** *** 50 ns ns 0 Tag 12 Tag 16 Tag 19 Tag 22 Verlauf Tumorgröße B Tumorgröße in mm2 60 OVA/CPG antiNK11 + OVA/CPG 40 ns 20 0 Tag 5 Tag 9 Tag 12 Tag 15 Abb. 5.21: Tumormodell in NK-defizienten Tieren mit OVA/CpG Vakzinierung. Tumorgröße nach OVA/CpG Immunisierung mit und ohne NK-Zelldepletion versus Kontrollgruppe. (A) Verglich man B16OVA Tumorwachstum zwischen unbehandelten Mäusen und mit OVA/CpG immunisierten Mäusen, so zeigte sich kein NK-Zellabhängiger Unterschied. (B) Betrachtet man OVA/CpG vakzinierte Mäuse gegen NK-Zelldepletierte / vakzinierte Mäuse, so zeigt sich eine langsamere Tumorprogression gerade zu Ende der Beobachtungszeit, wenn auch nicht signifikant (n=5, Experiment zweimal mit gleichem Ergebnis wiederholt, 2way ANOVA Analyse mit Bonferroni postests, ns p>0.05, *** p<0.001). - 51 - ERGEBNISSE Die erfolgreiche NK-Zelldepletion wurde durch eine Splenozytenfärbung kontrolliert. Der Anteil der NK-Zellen betrug nach Depletion nahezu 0% (s. Abb. 5.22). Zellzahl 25 Zellzahl in % 20 *** *** 15 10 *** ns 5 0 unstim OVA/CPG anti NK1.1 + OVA/CPG *** ** CD4+ Tcells CD8+ Tcells NKcells Abb. 5.22: Milzfärbung nach NK-Depletion und OVA/CpG Vakzinierung. Zellfärbung der Milz nach OVA/CpG Vakzinierung mit und ohne NK-Zelldepletion versus Kontrollgruppe. Nachweis der erfolgreichen NK Depletion nach anti-NK1.1 Antikörperinjektion (n=6, drei Versuche, 2way ANOVA Analyse mit Bonferroni postests, ns p>0.05, ** p<0.01, *** p<0.001). 5.3 Tumorimmunität durch Doxorubicin-behandelte Tumorzellen 5.3.1 Apoptose-Induktion durch Chemotherapie Im letzten Teil dieser Arbeit galt es, ein Tumormodell zu etablieren, in welchem die Tumorimmunität Publizierte durch Arbeiten Doxorubicin belegen bereits behandelte in Tumorzellen anderen Modellen induziert eine wurde. gesteigerte Tumorimmunität nach Vakzinierung mit chemotherapeutisch behandelten Tumorzellen [5, 10]. Die optimale Doxorubicindosis wurde durch in vitro Experimente mit 1μM bzw. 5μM Doxorubicin für 24 Stunden getestet. Abhängig von der Rate apoptotischer Zellen, welche mittels FACS-Analyse ermittelt wurde, konnte der direkte antitumorale Effekt von Doxorubicin bestimmt werden. Bei der Kontrollgruppe waren nur ca. 5% aller Zellen apoptotisch (s. Abb. 5.23). Nach einer Behandlung mit 1μM Doxorubicin erhöhte sich dieser Anteil nicht. Erst bei einer Zugabe von 5μM Chemotherapeutikum stieg der Anteil apoptotischer Zellen auf 30% an. Allerdings zeigten erste in vivo Versuche mit 1μM Doxorubicin, dass 5% - 52 - ERGEBNISSE apoptotischer Tumorzellen für einen Vakzinierungserfolg ausreichend waren und sich an der Vakzinierungsstelle kein Tumorwachstum zeigte. Apoptotische Zellen *** 40 *** % Zellen 30 20 ns 10 0 Kontrolle 1M Doxo 5M Doxo Abb. 5.23: Apoptose Induktion durch Chemotherapie mit Doxorubicin (Annexinfärbung). Nach Doxorubicin Behandlung von B16OVA Tumorzellen für 24h in vitro lies sich bei einer Zugabe von 1μM Doxorubicin kein Anstieg apoptotischer Zellen feststellen. Bei einer Zugabe von 5μM hingegen stieg der prozentuale Anteil apoptotischer Tumorzellen signifikant auf über 30% (n=3, 1way ANOVA Analyse mit Bonferroni’s Multiple Comparison Test, ns p>0.05, *** p<0.001). 5.3.2 Vakzinierung mit immunogenen Tumorzellen Vakzinierung mit immunogenen Tumorzellen: Abhängigkeit von Vakzinierungsstelle Zur Ermittlung der optimalen Vakzinierungsstelle bildeten wir zwei Gruppen, in denen die immunogenen Tumorzellen (4x106 Zellen) entweder s.c. in die Fußsohle oder in die Flanke injiziert wurden. 7 Tag nach Vakzinierung erfolgte die Applikation von 4x106 B16OVA-Zellen in die unbehandelte Flanke. In den ersten Tagen nach Injektion mit unbehandelten B16OVA Tumor zeigte sich zunächst kein Unterschied in der Wachstumskurve zwischen der Injektion in die Fußsohle oder in die gegenüberliegende Flanke. Ab Tag 19 wuchs der Melanomtumor der Gruppe mit Vakzinierung in die Fußsohle rasant an, während die Vakzinierung über die Flanke nach wie vor langsames Wachstum zeigte (s. Abb. 5.24). Deshalb verwendeten wir in den folgenden Experimenten die gegenüber liegende Flanke als Injektionsstelle. - 53 - ERGEBNISSE Verlauf der Tumorgröße nach Doxorubicin Behandlung Tumorgröße in mm2 400 Flanke Fußsohle Kontrolle 300 ns *** 200 ns 100 0 Tag 13 Tag 16 Tag 19 Tag 23 Abb. 5.24: Vakzinierung immunogener Tumorzellen in Abhängigkeit der Vakzinierungsstelle. Tumorgröße nach Immunisierung mit Doxorubicin behandelter B16OVA Tumorzellen in Abhängigkeit von der Vakzinierungsstelle versus unvakzinierte Kontrollgruppe. Vakzinierte man immunogene (mit Doxorubicin behandelte) B16OVA Tumorzellen in den Mäusefuß, so zeigte sich kein Immunisierungserfolg im Vergleich zur Injektion in die Flanke (n=4, 2way ANOVA mit Bonferroni posttests, ns p>0.05, *** p<0.001). Vakzinierung mit immunogenen Tumorzellen: Abhängigkeit von Anzahl der injizierten immunogenen Tumorzellen In einem weiteren Experiment sollte geklärt werden, ob der Immunisierungserfolg von der Anzahl der injizierten immunogenen Zellen abhängig ist. Eine Gruppe erhielt 1x106 Doxorubicin behandelte Tumorzellen in die Flanke, während die andere Gruppe 4x106 erhielt. Nach 7 Tagen erfolgte die Injektion von unbehandelten B16OVA-Tumorzellen in die gegenüberliegende Flanke. Die Kontrollgruppe erhielt lediglich den unbehandelten Tumor. Es zeigte sich kein gesteigerter oder verminderter Vakzinierungserfolg, wenn die Anzahl der immunogenen Zellen von 4x106Zellen auf 1x106 Zellen verändert wurde (s. Abb. 5.25). - 54 - ERGEBNISSE Injektion unterschiedlicher Mengen Doxorubicin behandelter Tumorzellen Tumorgröße in mm2 400 Kontrolle 1 Mio. Zellen 4 Mio. Zellen 300 *** 200 ns *** 100 ns 0 Tag 12 Tag 15 Tag 19 Tag 23 Abb. 5.25: Abhängigkeit von Anzahl der injizierten immunogenen Tumorzellen. Tumorgröße nach Immunisierung mit Doxorubicin behandelten B16OVA Tumorzellen in Abhängigkeit von der Anzahl injizierter Zellen im Vergleich zur unvakzinierten Kontrollgruppe. 6 6 Es zeigte sich kein Unterschied im Immunisierungserfolg in Abhängigkeit von 1x10 oder 4x10 injizierter immunogener B16OVA Tumorzellen (n=5, 2way ANOVA mit Bonferroni posttests, ns p>0.05, *** p<0.001). - 55 - DISKUSSION 6. DISKUSSION 6.1 NK-Zellen in Vakzinierungsmodellen In der Literatur gibt es bereits einige Untersuchungen bezüglich der Rolle von NKZellen in verschiedenen Vakzinierungsmodellen. In einer Studie von Krebs et al. wurde Antigen exprimierendes act-mOVA (membrangebundenes Ovalbumin mit Aktinpromoter) in einem murinen Vakzinierungsmodell getestet [37]. Dabei konnte gezeigt werden, dass NK-Zellen actmOVA eliminierten und durch ihre IFN-γ Produktion eine starke CD8+ T-Zellantwort förderten [56]. Hierbei induzierte IFN-γ die DC-Reifung, welche wiederum aktivierend auf die T-Zellantwort wirkte. Zusätzlich wurde beobachtet, dass der NK-Zell Einfluss nicht nur die T-Zelldifferenzierung, sondern auch antigenspezifische CD4+ Helferzellen förderte und somit die antigenspezifische humorale Immunantwort unterstützte. Ebenso zeigte sich in diesen Versuchen, dass NK-Zellen nach Vakzinierung Gedächtnisfunktionen übernahmen und zu einer gesteigerten Zytokinproduktion nach erneuter Pathogenexposition fähig waren [15, 37]. In einer Studie von 2010 zeigten Horowitz et al., dass NK-Zellen nach Vakzinierung CD4+ abhängig aktiviert werden konnten [33]. In dieser Studie wurden freiwillige Probanden mit Rabiesvirus vakziniert und anschließend in vitro die NK-Zellproduktion und Degranulation nach Restimulation mit inaktiviertem Rabiesvirus untersucht. NKZellen zeichneten sich durch eine frühe, als auch anhaltende IFN-γ Produktion aus, sezernierten nach erneutem Viruskontakt Perforin und wiesen eine gesteigerte Proliferationsrate auf. Für diese NK-Zellantwort schien die IL-2-Sekretion von CD45RO+CD4+ T-Zellen (=Gedächtniszellen) essentiell zu sein [14, 33]. Andrews et al. zeigten hingegen, dass NK-Zellen die Dauer und Effektivität einer virusspezifischen CD4+ und CD8+ T-Zellantwort limitieren konnten, indem sie die Antigenpräsentation durch APCs an T-Zellen begrenzten, indem sie die antigenpräsentierenden Zellen eliminieren konnten [4]. Eine Studie von Soderquest et al. aus dem Jahr 2011 zeigte in ihren Experimenten, dass die CD8+ T-Zelldifferenzierung durch NK-Zellen reguliert wurde [58]. Sowohl der prozentuale Anteil als auch die absolute Zellzahl von CD8+ T-Zellen im drainierenden Lymphknoten stiegen nach s.c. OVA/LPS Injektion in Abwesenheit von NK-Zellen an. Zudem änderte sich der Anteil der CD8+ T-Zell-Subpopulationen. In Anwesenheit von NK-Zellen exprimierten nur 20-25% der CD8+ T-Zellen CD62L und CCR7, während nach NK-Depletion der Anteil auf >70% anstieg. Ferner konnte diese Publikation - 56 - DISKUSSION zeigen, dass die CD8+ T-Zellmodulation NKG2DL- und Perforin- abhängig war. Interessanterweise war die IFN-γ Produktion durch CD8+ Zellen unabhängig von der Anwesenheit der NK-Zellen. 6.1.1 NK – DC Interaktionen Unsere ELISA Ergebnisse zeigten, dass nach NK-Zelldepletion im Rahmen der OVA/CpG Vakzinierung deutlich höhere IFN-γ Werte der poplitealen drainierenden Lymphknoten gemessen werden konnten verglichen mit alleiniger OVA/CpG Vakzinierung (s. Abb. 5.17B). Ein möglicher Erklärungsansatz für diese Beobachtung könnte die Elimination von APCs durch NK-Zellen sein. Die daraus resultierende verminderte IFN-γ Produktion in Anwesenheit der NK-Zellen würde zu einer verminderten T-Zell Aktivierung führen [4]. Depletierten wir hingegen die NK-Zellen, so stieg die IFN-γ Produktion der T-Zellen nach OVA/CpG Stimulation deutlich an (s. Abb. 5.17 B), was auf eine verbesserte T-Zellantwort in Abwesenheit der NK-Zellen hinweisen könnte. Entsprechend zeigten Andrews et al. in einer aktuellen Arbeit aus dem Jahr 2010, dass NK-Zellen mit murinem Zytomegalievirus (MCMV) infizierte DCs Perforin abhängig eliminierten [3, 4]. In den Versuchen wurden Ly49H+ (Aktivierungsrezeptor auf NK-Zellen) exprimierende Mäuse mit Ly49H- Mäusen verglichen. Es zeigte sich, dass Ly49H- Mäuse eine höhere Anzahl an infizierten APCs enthielten und daraufhin auch eine bessere T-Zellantwort erfolgte als in der Ly49H+ Gruppe. Andrews et al. erklärte dies durch die Elimination von DCs oder APCs durch NK-Zellen, was zu einer verminderten T-Zellantwort führte [4]. Diese Erkenntnisse würden unsere Daten bestätigen. Die Verwendung unseres Versuchsmodells in DC-depletierten Mäusen könnte diese These belegen oder aber auch Hinweise darauf liefern, dass NK-Zellen die frühe T-Zell Aktivierung und Differenzierung direkt und nicht über DCs beeinflussen [53]. 6.1.2 NK – T-Zellinteraktionen NK-T-Zellinteraktionen finden entweder direkt oder über indirekte Vermittlung durch Dendritische Zellen oder Zytokine statt [37, 42, 69]. In unseren Experimenten zeigte sich in der intrazellulären durchflusszytometrische Analyse, dass nach NKZelldepletion die OVA/CpG induzierte IFN-γ Produktion durch CD4+ T-Zellen im - 57 - DISKUSSION poplitealen drainierenden Lymphknoten etwas abnahm (s. Abb. 5.16), so dass wir der frühen IFN-γ Produktion durch NK-Zellen eine wichtige Rolle bezüglich des TH1Primings zuschrieben. Der prozentuale CD4+ T-Zell-Anteil wurde durch NKZelldepletion jedoch kaum beeinflusst (s. Abb. 5.16). Martín-Fontecha et al. beschäftigte sich ebenfalls mit dieser Fragestellung und konnte zeigen, dass NK-Zellen nach Stimulation mit OVA und einem Adjuvans aus dem peripheren Blut in die Lymphknoten rekrutiert und dort aktiviert wurden und daraufhin IFN-γ produzierten [42]. Dabei korrelierte die Rekrutierung der NK-Zellen mit der Induktion einer TH1-Antwort. Eine NK-Zelldepletion mit einem anti-NK1.1 Antikörper in vivo zeigte in diesen Experimenten einen Rückgang der T-Zellproliferation um 75% und einen Rückgang der IFN-γ produzierenden T-Zellen um 90%. In unseren Experimenten sahen wir zwar ähnliche Effekte der NK-Zelldepletion auf das TH1-Priming, jedoch auf einem wesentlich geringeren Niveau. Ein möglicher Erklärungsansatz hierfür könnte das gewählte Adjuvans für die Stimulation mit OVA sein. So wählten wir CpG, welches in Martín-Fontechas Arbeit nur ca. 0,8% NK-Zellen in den Lymphknoten rekrutieren konnte, sowie nur 3,4% IFN-γ Produktion zur Folge hatte. LPS-DCs (vom Knochenmark stammende durch Lipopolysaccharide gereifte Dendritische Zellen) hingegen konnten als Adjuvans bis zu 3% NK-Zellen in den Lymphknoten rekrutieren und führte zu einer IFN-γ Produktion von 14,1% [42]. Ferner konnten wir zeigen, dass nach NK-Depletion keine signifikante Änderung in der CD8+ IFN-γ Produktion der intrazellulären Färbung des poplitealen drainierenden Lymphknoten feststellbar war (s. Abb. 5.16). Ebenso beobachteten wir weder im poplitealen noch im inguinalen Lymphknoten eine veränderte prozentuale CD8+ Zellzahl nach NK-Depletion. Bei der Kalkulation der absoluten Zellzahlen im inguinalen Lymphknoten konnte bei den CD4+ T-Zellen ein signifikanter Rückgang nach OVA/CpG Stimulation beobachtet werden, der nach NK-Depletion wieder, nicht signifikant, anstieg. Die CD8+ T-Zellpopulation wies ähnliche Tendenzen auf, blieb jedoch stets im nicht signifikanten Bereich (s. Abb. 5.15). Im poplitealen drainierenden Lymphknoten hingegen zeigte sich ein deutlicher Anstieg der CD8+ T-Zellen nach OVA/CpG Vakzinierung, der nach NK-Depletion nicht mehr signifikant zunahm (s. Abb. 5.16 C). Im inguinalen Lymphknoten stieg die CD8+ IFN-γ Produktion in der intrazellulären Färbung nach NK-Zelldepletion geringfügig an (s. Abb. 5.14 B), was im poplitealen Lymphknoten allerdings nicht bestätigt werden konnte (s. Abb. 5.16 A). Im ELISA des poplitealen Lymphknotens wurde eine eindeutig höhere IFN-γ Produktion nach NKZelldepletion gemessen (s. Abb. 5.17), so dass wir von einem hemmenden Mechanismus der NK-Zellen auf die T-Zelldifferenzierung ausgehen. Entsprechend konnten wir nach Restimulation zusätzlich eine eindeutig gesteigerte Zellproliferation - 58 - DISKUSSION nach NK-Zelldepletion verzeichnen (s. Tab. 5.3), was ebenfalls die These einer Inhibition der T-Zellproliferation durch NK-Zellen unterstützen würde. Im inguinalen Lymphknoten konnten wir diesen Effekt nicht untersuchen, da in diesem voraussichtlich aufgrund der größeren Entfernung zum Vakzinierungsort zu niedrige IFN-γ Werte gemessen wurden (s. Abb. 5.17). Die Ursache der Hemmung der TZellproliferation und IFN-γ Produktion kann in der Elimination von APCs durch NKZellen gesehen werden [4, 42]. Es könnte aber auch eine direkte Elimination der TZellen durch NK-Zellen erfolgen, was in einer Studie von Soderquest et al. beschrieben wurde [53, 58]. Hier zeigte sich, dass die CD8+ T-Zellmodulation NKG2DL und Perforin abhängig war, jedoch die IFN-γ Produktion der CD8+ Zellen unabhängig von der Anwesenheit der NK-Zellen war. Die CD8+ Differenzierung erfolgte durch die Eliminierung von CD8+ T-Zellen, aufgrund deren NKG2D Expression innerhalb von 2448 Stunden nach ihrer Aktivierung. Dendritische Zellen schienen hierbei keinen Einfluss zu haben, da eine gleich bleibende Anzahl von DCs in den Lymphknoten der Kontrollen und NK-Zell depletierten Mäusen beobachtet werden konnte und DCs zudem kein NKG2DL exprimierten [4, 11, 58]. Diese Arbeit könnte ebenfalls einen weiteren Erklärungsansatz für die gesteigerte IFN-γ Produktion durch T-Zellen in unseren Experimenten liefern. Experimente mit DC-depletierten Mäusen könnten entscheidende Hinweise liefern, ob die verminderte T-Zelldifferenzierung durch eine direkte Eliminierung von T-Zellen durch NK-Zellen oder indirekt über die Eliminierung von dendritischen Zellen erfolgt. 6.1.3 Modell der NK-Zellinteraktionen im Vakzinierungsmodell In der zusammenfassenden Betrachtung der Rolle der NK-Zellen im Ovalbumin spezifischen Vakzinierungsmodell lässt sich folgendes, vereinfachtes, Modell der Zellinteraktionen darstellen. Nach OVA/CpG Injektion entwickeln sich unreife dendritische Zellen zu reifen DCs, welche NK-Zellen durch Zytokinausschüttungen (z.B. IL-12, IL-18) indirekt aktivieren. Die aktivierten NK-Zellen eliminieren nicht nur Tumorzellen, sondern sezernieren auch Zytokine und Chemokine (z.B. IFN-γ, MIP-1α). Dadurch sind NK-Zellen nicht nur eine wichtige Komponente der angeborenen Immunität, sondern stellen auch eine Verbindung zur erworbenen Immunität dar [13, 34]. Durch die Zytokinausschüttung der NK-Zellen und Expression von CD86 und MHC Molekülen auf DCs werden Tumorantigene präsentiert und spezifische T-Zellen stimuliert (sog. Priming) [26, 34, 63]. Aktuelle Forschungsergebnisse zeigen, dass NKZellen neben ihrer fördernden Rolle der T-Zelldifferenzierung, auch eine regulierende - 59 - DISKUSSION Funktion auf die T-Zellantwort haben, indem sie zum Beispiel aktivierte CD8+ T-Zellen eliminieren können [42, 53, 58]. Wir konnten ebenfalls zeigen, dass NK-Zellen neben der T-Zelldifferenzierung die IFN-γ Produktion der T-Zellen inhibieren (s. Abb. 6.1). Ovalbumin-spezifisches Vakzinierungsmodell Zeit nach in vivo Vakzinierung 40h 20h IFN-γ-Produktion NK Tcell TcellTcell Aktivierte NK-Zelle IFN-γ Produktion Tcell NK unreife NK-Zelle T-Zellaktivierung, Proliferation reife DC CD86 MHC IL-6, IL-12, IL-18, IFN OVA/CpG Vakzinierung Unreife dendritische Zelle Abb. 6.1: Ovalbumin spezifisches Vakzinierungsmodell. OVA/CpG Injektion führt zu einer Reifung von unreifen Dendritische Zellen zu reifen DCs und dadurch zu einer Aktivierung der NK-Zellen durch Zytokinausschüttung, die wiederum mit Zytokinproduktion reagieren. Ferner werden durch Zytokinausschüttung und Expression von CD86 und MHC Molekülen spezifische T-Zellen stimuliert. Entsprechend stiegen in unseren Restimulationsversuchen nach NK-Depletion sowohl die T-Zellproliferation, als auch die IFN-γ Produktion durch T-Zellen. Ob dieser Mechanismus über die Elimination von APCs/DCs vermittelt wird oder ob es sich um direkte NK-Zell Lyse der T-Zellen oder einzelner T-Zellpopulationen handelt, gilt es in weiteren Versuchen zu klären [4, 58]. - 60 - DISKUSSION 6.2 Tumorimmunität in vivo 6.2.1 Ovalbumin spezifisches Tumormodell In unserem Tumormodell konnten wir durch subkutane OVA/CpG Vakzinierung in die Fußsohle von C57Bl/6 Mäusen eine gesteigerte spezifische Tumorimmunität nachweisen (s. Abb. 5.18). Um die Rolle der NK-Zellen zu überprüfen, depletierten wir diese mittels eines anti-NK1.1 Antikörpers in vivo. Bis Tag 21 zeigte sich zwar ein leicht reduziertes Tumorwachstum nach einer OVA/CpG Vakzinierung in Abwesenheit von NK-Zellen, was jedoch statistisch nicht signifikant war (s. Abb. 5.21 B). Bei Betrachtung des Tumorwachstums ohne Vakzinierung in Abwesenheit bzw. Anwesenheit von NKZellen stellten wir bis Tag 21 kein vermindertes Tumorwachstum in Abwesenheit von NK-Zellen fest, was sich statistisch gesehen zu diesem Zeitpunkt jedoch als nicht signifikant erwies (s. Abb. 5.19). Diese Beobachtung, dass NK-Zellen das Tumorwachstum zu minimieren schienen, wenn keine Vakzinierung vorher statt fand (s. Abb. 5.19), die Progression jedoch zu fördern schienen, wenn eine Vakzinierung vorher statt fand (s. Abb. 5.21 B), war ein unerwartetes Ergebnis. Allerdings waren unsere Ergebnisse statistisch gesehen nicht signifikant, da sich die unterschiedlichen Verläufe des Tumorwachstums erst kurz vor Ende unserer Experimente zeigten. Um die Daten zu bestätigen, müssten unsere Versuche erneut über einen längeren Zeitraum beobachtet werden. Es könnte jedoch auch sein, dass die NK-Zellen in den beiden Experimenten unterschiedliche Rollen wahrnehmen. So könnten NK-Zellen TZellen während der Vakzinierung inhibieren, was das vermehrte Tumorwachstum und die geringere IFN-γ Produktion in ihrer Anwesenheit erklären könnte (s. Abb. 5.17 C; s. Abb. 5.21 B). Bei Tumorexposition ohne vorherige Vakzinierung hingegen schienen die NK-Zellen die Tumorprogression zu kontrollieren (s. Abb. 5.19). So ist auch in der Literatur bekannt, dass die B16OVA Tumorkontrolle bei systemischer Applikation NKZell abhängig ist und in Abwesenheit der NK-Zellen vermehrtes Tumorwachstum statt findet [18]. Um diese These zu belegen, könnten Vakzinierungen nach NK-Depletion durchgeführt werden und nach Ende des T-Zelldifferenzierung, laut unseren Ergebnissen ca. 48 Stunden später (s. Abb. 5.5 B), einen erneuten NK-Zelltransfer durchzuführen. Solch ein Versuch könnte neue, wertvolle Hinweise für die Rolle der NK-Zellen im Verlauf einer Vakzinierung und der Tumorimmunität liefern. Soderquest et al. beschrieb ein unseren Ergebnissen ähnliches Phänomen [58]. Wie auch in unseren Experimenten erzielte die Vakzinierung, unabhängig von NK-Zellen, eine deutlich gesteigerte Tumorgrößenreduktion. Bis Tag 21 zeigte sich auch hier kein - 61 - DISKUSSION Unterschied in der Tumorkontrolle in Abhängigkeit von NK-Zellen. Erst ab Tag 24 lies sich statistisch eine signifikant geringere Tumorgröße nach NK-Zell Depletion nachweisen. Daher suggerierte diese Arbeit, dass NK-Zell Depletion zum Zeitpunkt der T-Zelldifferenzierung zu mehr T-Gedächtniszellen (durch Verschiebung der T-Zell Subpopulationen nach NK-Zell Depletion) führte und somit effizientere Immunantworten ausgelöst werden konnten [58]. Da sich diese Effekte erst ab Tag 21 zeigten, also zu einem Zeitpunkt, an dem wir unseren Versuch bereits beendet hatten, wäre es sinnvoll unser Versuchsmodell über einen längeren Beobachtungszeitraum zu wiederholen um so signifikante Aussagen über den Einfluss der NK-Zellen auf die Tumorprogression in unserem Versuchsmodell zu treffen. Adam et al. hingegen zeigte in seiner Arbeit, dass durch DC-NK Crosstalk ein CD4+ TZell unabhängiger Mechanismus zur Aktivierung einer antitumoralen zytotoxischen TZellantwort in Gang gesetzt wurde [1]. Mittels DC induzierter NK-Zell Aktivierung wurde sowohl eine primäre Tumorabstoßung als auch eine lang andauernde zytotoxische TZell Antwort hervorgerufen. In diesen Experimenten führte eine NK-Zell Depletion zu einer verminderten Tumorabstoßung, so dass in dieser Studie davon ausgegangen wurde, dass NK-Zellen durch IFN-γ Sekretion aktiviert wurden und so Dendritische Zellen zur IL-12-Produktion stimulierten, was wiederum zu einer Induktion einer CD8+ T-Zell Antwort führte [1]. Ein möglicher Erklärungsansatz für die Unterschiede zu unserer Arbeit könnte die unterschiedliche Expression von NKG2D Liganden auf der Tumoroberfläche sein, da wir B16OVA Tumorzellen verwendeten und Adam et al. A20 Lymphomzellen. NKG2D Liganden induzieren die NK-Zell vermittelte Tumorabstoßung [72]. Auch die Applikationsform des Tumors könnte eine Rolle spielen. Da wir unseren B16OVA Tumor subkutan injizierten, könnten die NK-Zellen eine geringere Rolle in der Tumorkontrolle einnehmen als bei systemischer A20 Lymphom Applikation, da bei in vitro Versuchen unserer Arbeitsgruppe durchaus B16OVA Tumorzellen von NK-Zellen abgetötet wurden. Um diese Fragen zufrieden stellend zu klären, gilt es, unsere Vakzinierungsversuche nochmals zu wiederholen und über einen längeren Zeitraum die Tumorprogression zu beobachten. Ferner könnte unser Vakzinierungsmodell auch mit anderen Tumorlinien wiederholt werden, die sich in ihrer Expression von NKG2D Liganden unterscheiden [1]. Ein weiterer Versuchsansatz könnte die systemische i. v. Applikation des B16OVA Tumors sein, um den Einfluss der NK-Zellen auf die Tumorprogression bei systemischer Applikation zu untersuchen. - 62 - DISKUSSION 6.2.2 Tumorimmunität durch Doxorubicin-behandelte Tumorzellen Publizierte Arbeiten belegen, dass Tumorimmunität nicht nur durch Vakzinierung mit auf Tumorzellen exprimierten Peptiden, sondern auch durch Injektion von apoptotischen, so genannten immunogenen, Tumorzellen erreicht werden kann [5, 10]. In unseren Versuchen analysierten wir das Tumorwachstum eines B16OVA Tumors in Abhängigkeit einer vorangegangenen Vakzinierung mit Doxorubicin behandelten B16OVA Tumorzellen. Diese immunogenen Tumorzellen werden von DCs aufgenommen und mittels MHC I Molekülen präsentiert. Dies löst eine effektive CD8+ T-Zell-Immunantwort aus [2, 8, 10]. Es zeigte sich in unseren Experimenten bereits bei sehr niedriger Dosierung mit 1μM Doxorubicin eine erfolgreiche Immunisierung (s. Abb. 5.21). Eine Erhöhung der Anzahl der apoptotischer Zellen auf eine Konzentration von 5μM Doxorubicin erschien nicht nötig (s. Abb. 5.23), da im in vivo Modell 1μM Doxorubicin bereits einen ausreichenden Effekt auf die Tumorkontrolle hatte, da ein signifikant vermindertes Tumorwachstum nach Vakzinierung zu beobachten war (s. Abb. 5.25) und kein Tumorwachstum an der Vakzinierungsstelle beobachtet werden konnte. Dies weißt darauf hin, dass bei 1μM Doxorubicin die Tumorzellen ausreichend in die Apoptose übergegangen waren, was sich anschließend weiter in vivo fortzusetzen schien. Die durch Apoptose entstandenen Zellbestandteile können von den DCs effektiver aufgenommen werden als vitale, unbehandelte Tumorzellen. Dies führt zu einer Aktivierung der CD8+ T-Zellantwort [10]. Casares et al. zeigte in seiner Arbeit ähnliche Effekte [10]. Hierbei wurden CT26 Tumorzellen verwendet, welche in Balb/c Mäusen ein Kolonkarzinom hervorrufen. Auch hier führte die Vakzinierung mit immunogenen Tumorzellen zu einer verbesserten Tumorabstoßung bei erneuter Injektion von unbehandelten Tumorzellen. Interessanterweise war dieser Effekt völlig unabhängig von der Präsenz der NK-Zellen. Nur nach CD8+ Depletion oder in Mäusen ohne Thymus konnte keine verbesserte Tumorabwehr erzielt werden, so dass von einer durch dendritische Zellen vermittelten zytotoxischen Immunantwort ausgegangen wurde [10]. Daher gilt es in weiteren Experimenten zu untersuchen, ob auch in unserem Modell mit C57Bl/6 Mäusen und Doxorubicin behandeltem B16OVA Tumor eine NK-Zell unabhängige Tumorkontrolle stattfindet. Dies kann durch NK-Zelldepletion mittels anti-NK1.1-Antikörper getestet werden. Die Rolle der dendritischen Zellen könnte durch Versuche in DC-defizienten Mäusen analysiert werden. - 63 - DISKUSSION 6.2.3 Drei-Phasen-Modell der Tumorimmunität Zusammenfassend lässt sich aus eigenen Ergebnissen und Literatur folgendes DreiPhasen-Modell bezüglich der Rolle der NK-Zellen in der Tumorimmunität erstellen. T-Zellen können den Tumor primär nicht ohne vorherige Aktivierung erkennen und bekämpfen. Dazu bedarf es Zellen des angeborenen Immunsystems, wie zum Beispiel den NK-Zellen, welche den Tumor direkt lysieren können und Zellreste erzeugen. Die so entstandenen Tumorbestandteile werden von unreifen DCs aufgenommen und nach Maturierung der DCs an MHC Molekülen den T-Zellen präsentiert. Diese werden aktiviert und tumorspezifische T-Zellklone werden zur Proliferation angeregt, wodurch es zu einer zytotoxischen T-Zellantwort gegen den Tumor kommt. Die bisher veröffentlichten Daten aus der Literatur konnten den NK-Zellen keine eindeutige Rolle zusprechen. Die Daten dieser Doktorarbeit deuten darauf hin, dass NK-Zellen einen eher hemmenden Effekt auf die spezifische Tumorkontrolle durch T-Zellen ausüben. Zur vollständigen Klärung dieser Hypothese bedarf es ergänzender Experimente, in denen die Tumorimmunität über einen längeren Zeitraum überwacht und die Zell-ZellInteraktionen in vivo analysiert werden und die NK-Depletion zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Vakzinierung und Tumorgenese durchgeführt wird [58]. Ob die hemmende Funktion der NK-Zellen über die Elimination der DCs erfolgt, die TZellproliferation durch NK-Zellen unterbunden oder T-Zellen direkt lysiert werden, gilt es in weiteren Versuchen zu klären [4, 53, 58]. - 64 - DISKUSSION Drei-Phasen-Modell der Tumorimmunität in vivo Tumor Aktivierte NK-Zelle NK NK ? ? Tcell Tcell reife DC CD8 6 MH C IL-6, IL-12, IL-18, IFN Tcell T-Zellaktivierung, Proliferation Apoptose / Debris Unreife dendritische Zelle Abb. 6.3: Drei-Phasen-Modell der Tumorimmunität in vivo. Tumorzellen werden von NK-Zellen erkannt und lysiert. Anschließend erfolgt die Aufnahme der apoptotischen Tumorzellen durch unreife DCs, welche nun maturieren und spezifische T-Zellen aktivieren, die anschließend proliferieren und den Tumor ebenfalls lysieren können. Die Rolle der aktivierten NK-Zellen in der Tumorkontrolle ist jedoch noch nicht vollständig geklärt. 6.3 Ausblick Abschließend kann gesagt werden, dass trotz intensiver Forschung die Rolle der NKZellen im Immunsystem noch nicht vollständig geklärt ist. Die vielen neuen Erkenntnisse aus jüngsten Forschungsarbeiten zeigen jedoch, dass eine intensive Auseinandersetzung mit dieser Zellpopulation weiterhin essentiell ist, um die Vorgänge im Immunsystem während Infektionen oder Tumorbelastung zu verstehen. Nur so kann es gelingen, gezielte immunmodulatorische Therapiekonzepte in Ergänzung zu den bisherigen Behandlungsoptionen zu entwickeln. - 65 - LITERATURVERZEICHNIS 7. LITERATURVERZEICHNIS 1. Adam, C., S. King, T. 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ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ACK-Puffer Ammoniumchlorid-Kaliumhydrogencarbonat + EDTA AK Antikörper APC antigenpräsentierende Zellen B16OVA OVA-exprimierender B16 Melanomtumor BCR B-Zell-Rezeptor CD cluster of differentiation CD40L CD40 Ligand CD62L CD62 Ligand auf Leukozyten CpG Cytidin-Guanosin-Dinukleotid d days / Tage DC dendritische Zellen DLK drainierender Lymphknoten DNA Desoxyribonukleinsäure FACS „Fluoreszenz activated cell sorting“ (Durchflusszytometrie) FSC Forwardscatter / Vorwärtslichtstrahl GM-CSF granulocyte macrophage colony stimulating factor h hours / Stunden i.p. intraperitonal IFN Interferon Ig Immunglobuline IKDC Interferon-produzierende Killer dendritische Zelle IL Interleukin ing inguinal KIR killing inhibitory receptor LK Lymphknoten LPS Lipopolysaccharid, TLR 4 Stimulanz Ly49H+ Aktivierungsrezeptor auf NK-Zellen MAC membran attack complex MALT schleimhautassoziertes lymphatisches Gewebe MCMV muriner Zytomegalievirus MHC major histocompatibility complex NK Natürliche Killerzellen NKG2D Natural-killer group 2D (=Aktivierungsrezeptor auf NK-Zellen) NKG2DL NKG2D Ligand ns nicht signifikant - 72 - ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS OVA Ovalbumin PAMP Pathogen assoziierte molekulare Strukturen PBS phosphatgepufferte Salzlösung PD-L1 programmed cell death ligand 1 pop popliteal RAG-Mäuse Mäuse ohne T- und B-Lymphozyten, aber mit NK-Zellen rpm rounds per minute s.c. subkutan SCF Stammzellfaktor SIINFEKL OVA agonistisches Peptid, TLR9 Stimulanz SSC Sidescatter / Seitwärtslichtstrahl TCR T-Zell-Rezeptor TH-Zellen T-Helferzellen TLR Toll-Like-Rezeptor TNF Tumornekrosefaktor TRAIL TNF-related apoptosis inducing Ligand Treg regulatorische T-Zellen - 73 - DANKSAGUNG 9. DANKSAGUNG Besonders bedanken möchte ich mich bei Frau Prof. Dr. Evelyn Ullrich für die Vergabe dieses interessanten Themas und für die stets hervorragende Betreuung während meiner gesamten Arbeit. Vor allem die zahlreichen Diskussionen waren dabei sehr hilfreich. Herrn Prof. Dr. Andreas Mackensen danke ich für die Möglichkeit, meine Dissertation an seiner Klinik durchzuführen. Großer Dank gilt ebenfalls Dr. Irena Kröger, Dipl.-Biol. Kathrin Meinhardt und Alexandra Abendroth, welche mir eine große Hilfe bei der Einarbeitung in meine Labortätigkeit waren und bei Problemen immer mit Rat und Tat weiter halfen. Für die finanzielle Förderung des Projekts geht Dank an den ELAN-Fond der Universitätsklinik Erlangen. Nicht zuletzt möchte ich mich auch bei meiner Familie bedanken, welche mir immer zur Seite stand und mich in jeglicher Hinsicht unterstützt hat. - 74 - LEBENSLAUF 10. LEBENSLAUF PERSÖNLICHE DATEN: Name: Karina Bösl Adresse: Zengeröd 9, 92559 Winklarn Geburtsort/ -datum: 09. Juli 1986, Nabburg Eltern: Richard Bösl Monika Bösl, geb. Scheiber Geschwister: Maria Bösl Michael Bösl Theresa Bösl AUSBILDUNG: 1992 – 1996 Grundschule Winklarn 1996 – 2005 Ortenburg-Gymnasium Oberviechtach 2005 Abitur 2005 – 2006 Auslandsjahr in Neuseeland Seit 10/2006 Studium der Humanmedizin an der FriedrichAlexander-Universität Erlangen-Nürnberg 08/2008 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung 2009 – 2012 Promotion in der AG Ullrich, Medizinische Klinik 5, Universitätsklinik Erlangen 08/2011 – 07/2012 Praktisches Erlangen/D) Jahr (Lachen/CH; Kapstadt/ZA;
