Übersicht Chimäre Rezeptoren verleihen T
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Übersicht Chimäre Rezeptoren verleihen T-Lymphozyten MHC-unabhängige Antigen-Spezifität: Ein alternatives Konzept für die adoptive Immuntherapie? Chimeric Receptors Endow T Lymphocytes with MHC-independent Antigen Specificity: An Alternative in Adoptive Immunotherapy? A. Hombach1, Claudia Heuser1, C. Pohl2, H. Abken1·3 Zusammenfassung: Ein vielversprechender Ansatz der adoptiven Immuntherapie beruht auf der Induktion einer spezifischen zellulären anti-Tumor-Reaktion mit Hilfe Antigen-spezifischer, zytotoxischer T-Zellen. Da Tumor-spezifische T-Zellen selten in hinreichender Anzahl isolierbar sind, wurde vorgeschlagen, zytotoxische T-Zellen mit einem Antigen-spezifischen, rekombinanten T-Zell-Rezeptor auszustatten, der aus einer extrazellulären Antigen-bindenden Domäne, abgleitet von einem Antikörper (scFv), und einer intrazellulären Signalkette (CDS- ; FceRI- ) besteht. Der chimäre Rezeptor verleiht den T-Zellen Spezifität für das jeweilige Antigen und vermag nach Antigen-Bindung eine MHC-unabhängige zelluläre Aktivierung zu induzieren. In diesem Konzept werden die Vorteile des humoralen Arms des Immunsystems zur Antigenerkennung mit dem zellulären Arm der Vermittlung einer komplexen Immunreaktion kombiniert. Die prinzipielle Durchführbarkeit und Wirksamkeit dieses Ansatzes wurde in vitro dokumentiert. Die klinische Erprobung wird in der nächsten Zukunft zeigen, ob das chimäre Rezeptor-Konzept in der adoptiven zellulären Immuntherapie mit genetisch modifizierten, Antigen-spezifischen Effektorzellen zur effizienten Ergänzung der konventionellen Tumortherapie geeignet ist. Schlüsselwörter: Rezeptoren, Antigen-, T-Zell; Chimäre Proteine/Genetik; Immuntherapie, adoptive; Immunglobulinfragmente/Genetik; Antikörper, antiidiotypische; Gentransfer Summary: A promising approach in adoptive immunotherapy is based on the induction of a specific cellular anti-tumor reaction by antigen-specific, cytolytic T cells. Due to difficulties in isolating tumorspecific T cells in sufficient amounts, it was proposed 1 Lab. Tumorgenetik, Klinik l für Innere Medizin, Universität zu Köln Evangelisches Krankenhaus Köln-Kalk, Köln, Germany 3 Korrespondenzadresse: Univ.-Prof. Dr. H. Abken, Lab. Tumorgenetik, Klinik l für Innere Medizin, Universität zu Köln, Joseph-Stelzmann-Str. 9, D-50931 Köln, Germany. Fax: +49-221-478-4130; E-Mail: [email protected] Nach einem Vortrag von H. Abken auf dem Kongreß „Molekulare und zelluläre Diagnostik", gehalten am 4. Oktober 1999 in Regensburg Eingegangen: 20. Dezember 1999 126 to graft cytolytic T cells with an antigen-specific, recombinant T cell receptor that consists of an extracellular antigen-binding domain, derived from an antibody (scFv), and an intracellular signalling domain derived from the CDS- or FceRI-y chain. The chimeric receptor confers antigen specificity to T cells and induces MHC-independent cellular activation after binding to antigen. This approach combines the advantages of the humoral division of the immune system in antigen recognition with the cellular division in mediating a complex immune reaction. The feasibility and efficacy of this approach in vitro was recently documented. Clinical trials in the near future will reveal whether the chimeric receptor approach in the adoptive cellular immunotherapy utilizing genetically modified, antigen-specific effector cells will be suitable to strengthen conventional tumor therapy. Keywords: Receptors, Antigen, T-Cell; Chimeric Proteins/genetics; Immunotherapy, Adoptive; Immunoglobulin Fragments/genetics; Antibodies, Anti-Idiotypic; Gene Transfer. ie spezifische Immuntherapie maligner ErkrankunD gen hat in den vergangenen Jahren zunehmend an Bedeutung gewonnen. Grundsätzlich unterscheidet man Antikörper-vermittelte Ansätze von den immuntherapeutischen Strategien, die auf der Zuhilfenahme des zellulären Arms des Immunsystems basieren. Beide immuntherapeutische Ansätze können für eine Vielzahl von Erkrankungen eingesetzt werden. In dieser Übersicht sollen die Möglichkeiten einer kombinierten Anwendung für die Therapie maligner Tumore mittels rekombinanter T-Zell-Rezeptoren analysiert werden. Für eine erfolgreiche Anwendung der zellulären Immuntherapie 'von Malignomen müssen mehrere Voraussetzungen erfüllt sein. Die verwendeten immunologischen Effektorzellen sollen (i) einfach isolierbar sein, (ii) eine hohe Tumorspezifität besitzen und (iii) in der Lage sein, eine umfassende anti-Tumor-Reaktion zu vermitteln. Tumor-infiltrierende T-Zellen (TIL) besifzten häufig eine hohe Tumorspezifität und können insbesondere nach ex vivo-Aktivierung eine effiziente Unauthenticated J Lab Med 2000; 24 (3): 126-134 © 2000 Download Date | 5/12/16 4:35 AMBlackwell Wissenschafts-Verlag, Berlin A. Hombach et al.: Chimäre Rezeptoren Tabelle 1 Vor- und Nachteile von Antikörpern und Tumor-spezifischen T-Zellen zur spezifischen Immuntherapie von malignen Erkrankungen Vorteile Antikörper Tumorspezifische T-Zellen MHC-unabhängige Antigen-Erkennung. Erkennung von Antigen unterschiedlicher Zusammensetzung. Vermittlung komplexer Immunreaktionen. Expansion spezifischer T-Zellen nach Antigenkontakt. Fähigkeit zur aktiven Tumorpenetration. Hohe zytolytische Aktivität, Nachteile Keine Effektordomänen zur Aktivierung von T-Zellen. MHC-restringierte Erkennung von Peptidantigenen. Geringe eigene zytolytische Wirkung. Aufwendige Präparation. zytolytische Aktivität gegen die jeweiligen Tumprzellen entwickeln. Jedoch ist die Präparation und ex vivo Expansion dieser Zellen mit einem erheblichen zeitlichen und apparativen Aufwand verbunden. Darüber hinaus ist die spezifische Erkennung der Tumorzellen durch die T-Zellen an die Expression von MHC-Molekülen durch die Tumorzellen und deren Beladung mit spezifischen Peptidantigen gebunden. Häufig ist jedoch die Expression von MHC-Molekülen auf den Tumorzellen reprimiert oder es findet eine defiziente Prozessierung von Tumor-spezifischen Peptid-Antigenen statt, so daß eine spezifische T-Zellerkennung und somit eine zelluläre Immunreaktion ausbleibt. Andererseits exprimieren Tumorzellen häufig sog. „Tumor-assoziierte Antigene44, die mit Hilfe spezifischer Antikörper erkannt werden können. Im Gegensatz zur MHC-restringierten Antigen-Erkennung durch den T-Zell-Rezeptor ist die Bindung des Antikörpers an das Antigen MHC-unabhängig. Ein wesentlicher Unterschied zwischen dem Antigen eines Antikörpers und dem eines T-Zellrezeptors besteht weiterhin darin, . daß potentiell nahezu jede hinreichend komplexe Struktur, unabhängig von ihrer Zusammensetzung, von Antikörpern erkannt werden kann, während die Antigenerkennung des T-Zellrezeptors in der Regel auf MHC-gebundene Peptid-Antigene beschränkt ist. Im Gegensatz zu zellulären Effektoren besitzen Tumorspezifische Antikörper, soweit sie nicht modifiziert wurden, jedoch nur ein geringes zytotoxisches Potential. Tabelle l faßt die Vor- und Nachteile von Antikörpern und- von Antigen-spezifischen T-Zellen in ihrer Anwendung in der Tumortherapie zusammen. Durch die in den letzten Jahren erzielten Fortschrit: te in der Generierung von rekombinanten Einzelkettenantikörpern (single chain fragment of variable region, scFv) und der Entwicklung effizienter Gentransferverfahren zur Übertragung von rekombinanter DNA in T-Zellen des peripheren Bluts ist die Konstruktion und Nicht standardisierte Abkürzungen: BSM, bovine submaxillary mucin; CA. cancer antigen; HMW-MAA, high-molecular weight melanoma-associated antigen; ITAM, immunoreceptor tyrosinebased activation motif; MHC, major histocompatibility complex; CD, cluster designation; ScFv, single chain fragment of variable region; TAG, tumor-associated glycoprotein; TCR, T-cell receptor; TIL, tumor-infiltrating lymphocyte. Expression von rekombinanten T-Zell-Rezeptoren mit Antikörper-ähnlicher Spezifität ermöglicht geworden [l, 2, zur Übersicht 3]. Derartige „chimäre" T-Zell-Rezeptoren werden durch die Fusion eines rekombinanten Einzelkettenantikörpers (scFv) mit dem transmembranen und intrazellulären Anteil einer Signal-leitenden T-Zell-Rezeptoruntereinheit generiert, wobei die Signaleinheit aus der CDS- Kette oder aus anderen multimeren Rezeptoren mit der Fähigkeit zur Leukozyten-Aktivierung, wie z.B. aus der -Kette des FceRI Rezeptors, abgeleitet sein kann (Abb. l). Durch diese Konstruktion verknüpfen die Rezeptoren die universalen Bindungseigenschaften von Antikörpern mit den umfangreichen Fähigkeiten von T-Zellen zur Induktion und Vermittlung einer effizienten zellulären Immunreaktion, wobei die MHC-unabhängige Antigenbindung durch den Antikörper für die Auslösung der zellulärer Aktivierung genutzt wird. Die DNS einer Expressionskassette, die für einen derartigen rekombinanten Rezeptor kodiert, wird mit Hilfe eines retroviralen Gentransfer-Verfahrens in T-Lymphozyten überfuhrt. Die T-Zellen, die nach Gentransfer den rekombinanten TZell-Rezeptor exprimieren, besitzen die Spezifität der jeweiligen Antikörper-Bindungsstelle und werden nach Antigen-Bindung zu einer MHC-unabhängigen Immunreaktion gegen die Zellen aktiviert, die das spezifische Antigen exprimieren. Auf der Grundlage dieses Konzepts haben wir mehrere chimäre scFv- - und scFv- T-Zel l-Rezeptoren mit Spezifität gegen Tumor-assoziierte Antigene generiert (Tabelle 2). Nach Expression dieser Rezeptoren in T-Lymphozyten wird eine spezifische zelluläre und MHC-unabhängige anti-Tumor-Reaktion induziert. Folgende Voraussetzungen sollten zur Realisierung des Konzepts für eine adoptive Immuntherapie von Tumoren erfüllt sein: 1. die Antigen-Bindungsdomäne muß hohe Spezifität für das jeweilige Membran-gebundene Tumorantigen besitzen; 2. der rekombinante Rezeptor muß stabil auf der Oberfäche der Effektor-Zellen exprimiert werden und nach Antigenkontakt eine effiziente zelluläre Aktivierung vermitteln; 3. die Ausstattung von peripheren T-Zellen mit rekombinanten Rezeptoren erfordert ein effizientes Gentransferverfahren. J Lab Unauthenticated Med 2000; 24 (3): 126-134 Download Date | 5/12/16 4:35 AM 127 A Hombach et al.: Chimäre Rezeptoren Rekombinanter T-Zell-Rezeptor T-Zelle U Antikörper Rezeptor Mastzelle Zelluläre Aktivierung }. scFv- / -Rezeptor} Effektor-Zelle ("T-Cell-Body") mit MHC-unabhänger Spezifität Abbildung 1 ' Schematische Darstellung der Herstellung und -Expression rekombinanter T-Zell-Rezeptoren mit MHC-unabhängiger, Antikörper-ähnlicher Spezifität. Im folgenden werden die Vor-und Nachteile dieses Konzepts für die Anwendung in der zellulären Immuntherapie von Tumoren anhand der oben genannten Voraussetzungen diskutiert. Die Antigen-Bindungsdomäne Eine Voraussetzung zur Generierung rekombinanter TZel l-Rezeptoren mit MHC-unabhängiger Antigen-Bindedomäne ist die Verfügbarkeit von tumorspezifischen Einzelkettenantikörpern (scFv). Die „Phage-Display"Technik erlaubt die schnelle und effiziente Isolierung spezifischer Einzel ketten- Antikörper aus cDNS-Ban- 128 ken von Hybridomzellen oder B-Zellen immunisierter und nicht-immunisierter Versuchstiere in Form von Phagen-Antikörpern (M13-scFv) [9]. Dieses Verfahren beruht darauf, daß das scFv Fragment als Fusionsprotein mit dem gp3 Phagenprotein auf der Oberfläche des M13 Phagen exprimiert wird. Die Isolierung gewünschter scFv erfolgt durch Bindung und Anreicherung der M13-scFv-Phagenantikörper an das jeweilige Antigen (panning). Darüber hinaus ist mit Hilfe dieser Technik auch die Isolierung von humanen scFv aus den cDNS-Banken humaner B-Zellen möglich. Sind ausreichende Mengen des entsprechenden Antigens in notwendiger Reinheit verfügbar, können mit Hilfe der Panning-Technik in kurzer Zeit Tumor-spezifische Unauthenticated J Lab Med 2000; 24 (3): 126-134 Download Date | 5/12/16 4:35 AM A. Hombach et al.: Chimäre Rezeptoren Tabelle 2 Spezifität der rekornbinanten T-Zell-Rezeptoren Antikörper (scFv) Spezifität , Tumor Referenz B72.3 CC49 NS19-9 HRS3 763.74 BW431/26 TAG72 (CA72-4) TAG72 (CA72-4) CA19-9 CD30 HMWMAA Verschiedene Adenokarzinome Verschiedene Adenokarzinome Pankreas-Karzinom, kolorektale Karzinome Hodgkin-Lymphom, verschiedene NHL Melanom Kolorektale Karzinome [4] [5] Unpublizierte Daten [6] [7] [8] CEA Antigen zur Absorption der PhagenAntikörper anti-idiotypischer Antikörper L IjN Vorteile Surrogat-Antigeh I Indirekt immobilisiertes Antigen aus ZellLysat/ZellkulturÜberstand ! !b s Geringe unspezifische Bindung. Geringe unspezifische Bindung. Der anti-idiotypische Antikörper kann leicht in größeren Mengen produziert werden. Das Surrogat-Antigen kann Epitope des ursprünglichen Antigens ersetzen. Zur Selektion von Phagen-Antikörpern können AntigenRohpräperationen verwendet werden. Keine Absorption der Phagen-Antikörper auf Zellen erforderlich. Keine Absorption der Phagen-Antikörper auf Zellen erforderlich. Nachteile Abbildung 2 Darstellung unterschiedlicher Strategien zur Generierung-von rekornbinanten Einzelkettenantikörpern und deren jeweiliger Vor-und Nachtei- Begrenzte Anzahl von Epitopen für die Selektion von PhagenAntikÖrpem. Evtl. Präabsorption der Phagenantikörper gegen den Fc-Änteil notwendig. Präabsorpdon der Begrenzte Anzahl von Epitopen für die Selektion Phagenantikörper von Phagen-Antikörpem. notwendig. Präabsorption der Phagenantikörper notwendig. le. scFv isoliert werden. In der Regel steht jedoch das entsprechende Tumor-assoziierte Antigen nicht in ausreichender Menge und Reinheit zur Verfügung, um eine Anreicherung der spezifischen M13-scFv Phagen durch Panning zu erzielen. Eine alternative Möglichkeit ist die Anreicherung Tumor-spezifischer Phagenantikörper durch Bindung an Antigen-positive Tu- . Verfahren nur anwendbar für multivalente Antigene/Epitope. Ein Fang-Antikörper muß zur Verfügung stehen. morzellen. Dieses Verfahren erfordert jedoch eine aufwendige Vorabsorption der Phagen-Antikörper an Antigen-negative Zellen und resultiert häufig in der Isolierung unspezifisch bindender Phagen-Antikörper. Zur Vermeidung dieser Probleme haben wir Panning-Strategien entwickelt, die im Folgenden kurz dargestellt werden (Abbildung 2): Unauthenticated J Lab Med 2000; 24 (3): 126-134 Download Date | 5/12/16 4:35 AM 129 A Hombach et al. Chimäre Rezeptoren /. Anreicherung Antigen-spezifischcr scFv mil Hilfe anti-idiotypischer Antikörper. Anti-idioiypischc Antikörper gegen den Tumor-spezifischen monoklonalcn Antikörper können das primäre Antigen ersetzen und sind leicht in ausreichender Menge und Reinheit herstellbar. Mit Hilfe derartiger Antikörper gelang uns die Isolierung von scFv mit Spezifität für das Hodgkin-Lymphom-assoziierte CD30 Antigen (HRS3-scFv) [10] sowie für das Melanom-assoziierte HMW-MAA Antigen (763.74-scFv) [7] aus der cDNS zweier Hybridomzellinien. Mit einer Reihe verschiedener anti-idiotypischer Antikörper, die jeweils unterschiedliche Idiotope auf den parentaJen Antikörpern erkennen, konnten wir zeigen, daß der rekombinante anti-CD30 HRS3-scFv das gleiche idiotypische Profil besitzt wie der entsprechende parentale Antikörper [11J. Hingegen kam es bei dem in dieser Weise isolierten anti-HMW MAA 763.74-scFv im Vergleich zu dem parentalen Antikörper zu einem Verlust von Idiotopen (unpublizierte Daten). Weiterhin zeigte sich, daß chimäre scFv- T-Zellrezeptoren, die derartig isolierte scFv als Antigen-Bindungsdomäne tragen, ein unterschiedliches Potential für eine zelluläre Aktivierung haben. Interessanterweise ist das Aktivierungspotential darüber hinaus abhängig von dem jeweiligen Liganden. Während der anti-CD30-scFvRezeptor sowohl nach Kreuzvernetzung durch die antiidiotypischen Antikörper als auch durch das CD30 Antigen eine effiziente zelluläre Aktivierung induziert, führt die Bindung des anti-HMW-MAA-scFv- Rezeptors mit dem HMW-MAA Antigen nur zu einer schwachen zellulären Aktivierung, obwohl die Kreuzvernetzung mit einem Bindungs-aktiven anti-idiotypisehen Antikörper eine effiziente zelluläre Aktivierung induziert [7]. 2. Anreicherung Tumor-spezifischer scFv durch ein Surrogat-Ann gen. Anstelle des nativen Tumor-Antigens verwendeten wir ein Surrogat-Antigen (Bovines Submaxillläres Muzin; BSM) zur Isolierung eines M13-Phagenantikörpers mit Spezifität für das CA72-4 Tumorantigen (TAG72), das von unterschiedlichen Adenokarzinomen exprimiert wird. Das Surrrogat-Antigen besitzt ein dem CA72-4 Antigen ähnliches Glykolisierungsmuster. Das Muzin wurde auf der Plastikoberfläche immobilisiert und ein spezifisch bindender scFv aus der cDNS-Bank einer Hybridomzellinie (B72.3) mit Hilfe des PanningVerfahrens isoliert. Der resultierende scFv'besitzt Spezifität für ein Kohlenhydrat-Epitop des CA72-4 Antigens (Sialy-Tn). Der hiervon abgeleitete rekombinante B72.3-scFv-y Rezeptor kann die Spezifität der Rezeptor-exprimierenden T-Zellen gegen das Sialy-Tn-Kohlenhydratepitop des CA72-4 Antigens auf kolorektalen Tumorzellen richten [4]. 3. Isolierung Antigen-spezifischer scFv mit Hilfe von indirekt immobilisiertem Antigen mit repetitiven Antigen-Strukturen. Zur Isolierung eines scFv Einzelkettenantikörpers mit Spezifität für das Tumor-assoziierte Antigen CA19-9 130 verwendeten wir Antigen-Rohpräperationen aus Tumorzell-Lysaten oder alternativ den Zelikulturüberstand einer Tumorzellinie, die das CA19-9 in hoher Konzentration in den Kulturüberstand sezerniert. Das Antigen besitzt repetitive Kohlenhydratepitope und kann durch einen monoklonalen anti-CA19-9 iFangantikörper (NSJ9-9) indirekt immobilisiert werden, ohne dadurch die entsprechenden Epitope vollständig zu blockieren. Mit Hilfe dieses Verfahrens isolierten wir aus der cDNS-Bank der Hybridomzellinie des Antikörpers NS19-9 einen scFv mit Spezifität für das CA19-9 Antigen. Jedoch war bei diesem Vorgehen der Anteil von Phagenantikörpern mit unspezifischer Bindung an den Fangantikörper relativ hoch, so daß beim Screening von Phagen-Banken mit hoher Diversität, z.B. Phagen-Banken aus primären Lymphozyten, eine Präabsorption der Phagenantikörper mit dem Fangantikörper erwogen werden sollte. Einfluß der Signal-Domäne auf die Expression des Chimären Rezeptors Zur Herstellung von Chimären Rezeptoren aus Antigen-bindender scFv Domäne und Signaldomäne verwendeten wir die transmembranen und intrazellulären Anteile der -Signalkette des hochaffinen IgE Rezeptors (FceRI-v) und der -Signalkette (CDS- ) des TZell-Rezeptor-Komplexes (TCR). Beide Signalketten weisen große Homologien auf, jedoch besitzt die Signaldomäne nur ein Thyrosin-Aktivierungsmotiv (ITAM) im Gegensatz zu drei Aktivierungsmotiven auf der -Kette. Mit Hilfe der FceRI- Kette als Signaldomäne konnten wir eine Reihe von Chimären scFv- Rezeptoren mit Spezifität für unterschiedliche Tumor-assoziierte Antigene generieren (Tabelle 2), die nach Gentransfer in T-Zellen funktionell und stabil exprimiert werden. Im Gegensatz zu den scFv- Rezeptoren erwies sich jedoch die Expression der analogen scFv- Rezeptoren als instabil (Tabelle 3). Von Moritz et al. [12] wurde gezeigt, daß bei Chimären -Rezeptoren die Minimalkonfiguration des Rezeptors, bestehend aus der Antigen-Bindungsdomäne und dem transmembranen- und intrazellulären Anteil der Signaldomäne, durch eine zusätzliche extrazelluläre Domäne modifiziert werden muß, um eine stabile Expression zu erreichen. Aus diesem Grund inserierten wir zwischen jdie Antigenbindungs- und SignalDomäne den konstanten Fc Anteil des humanen IgGl (Hinge-CH2/CH3). Wir zeigten, daß die in dieser Weise modifizierten -Rezeptoren stabil exprimiert werden und gleichermaßen funktionell sind wie die analogen -Rezeptoren (Tabelle 3). Die Expressionsdichte der entsprechenden -Rezeptoren auf der Zellmembran von Rezeptor-exprimierenden T-Zellen ist jedoch deutlich höher als diejenige der korrespondierenden -Ketten Rezeptoren, obwohl die Transkription der - und -Rezeptoren unter der Kontrolle des gleicheji Promotors erfolgt. Jedoch konnten wir keine Korrelation zwischen dem Ausmaß einer Rezeptor- Unauthenticated J Lab Med 2000; 24 (3): 126-134 Download Date | 5/12/16 4:35 AM A. Hombach et al.: Chimäre Rezeptoren Tabelle 3 Funktionelle und stabile Expression von rekombinanten - und -Rezeptoren Rekombinanter Rezeptor B72.3-scFv-y B72.3-scFv< B72.3-scFv-Fc-Y ' CC49-scFv-Fc-Y CC49-scFv-Fc^ HRSS-scFvHRS3-scFv-Fc-Y . HRSS-scFvHRS3-scFv-Fc^ 763.74-scFv-Y humBW431/26-scFv-Y humBW431/26-scFv-Fc-Y humBW431/26-scFv-Fc-£ NS19-9-scFv-Fc-y lgG1 FcDomäne Rezeptors Expression1 + + + i.A.2 1 Die funktionelle Expression des rekgmbinanten Rezeptors wurde definiert durch stabile Expression auf der Zelloberfäche und zellulärer Aktivierung nach spezifischer Rezeptor-Kreuzvernetzung. 2 In Analyse. vermittelten zellulären Aktivierung und der Expressionsdichte der entsprechenden Rezeptoren auf der Zellmembran beobachten. Andererseits zeigte sich, daß die Expression von rekombinanten -Rezeptoren sowohl bei einer Maus T-Hybridom-Zellinie als auch bei menschlichen T-Zellen aus dem peripheren Blut schneller supprimiert wird als die Expression des entsprechenden -Rezeptors (unveröffentliche Daten). Einfluß der konstanten Domäne auf die Rezeptor-Expression Rekombinante - und - T-Zell-Rezeptoren unterscheiden sich im Hinblick auf die minimalen Voraussetzungen zur funktionellen und stabilen Expression. Wie oben dargestellt, können rekombinante -Rezeptoren nur mittels einer geeigneten konstanten Domäne zwischen Antigenbindungs- und Signal-Domäne funktionell und stabil exprimiert werden. Die analogen scFvV Rezeptoren werden jedoch auch ohne diese Domäne stabil exprimiert und sind funktionell aktiv. Um zu untersuchen, ob sich durch die inserierte extrazelluläre Domäne die Eigenschaften eines rekombinanten Rezeptors ändern, haben wir zwei rekombinante -Ketten Rezeptoren hergestellt, die die gleichen Antigenbindungs- (HRS3-scFv) und Signaldomänen ( -Kette) enthalten, sich jedoch durch eine zusätzliche extrazelluläre konstante Domäne unterscheiden (humane IgGl Fc-Domäne) (unpublizierte Daten). Beide Rezeptoren (HRS3-scFv-v; HRS3-scFv-Fc-y) wurden funktionell und stabil in einer T-Hybridomzellinie und nach retroviralem Gentransfer in peripheren T-Zellen exprimiert und ihre Eigenschaften im Hinblick auf Antigen-Bindung und zelluläre Aktivierung nach Antigen-Kontakt verglichen (Tabelle 4). Dabei zeigte sich, daß sowohl der HRS3-scFv-y- als auch der HRS3-scFv-Fc-y Rezeptor als 'Homodimere exprimiert werden und eine gleich effiziente Konjugat-Bildung zwischen Rezeptor-exprimierenden T-Zellen und Antigen-positiven Tumorzellen vermittelten. Jedoch ist die Rezeptor-vermittelte T-Zell-Aktivierung durch den HRS3-scFv-FcY Rezeptor deutlich schwächer als durch den HRS3scFv- Rezeptor, was zeigt, daß die extrazelluläre FcDomäne die Signal weiterleitung nach Antigen-Bindung beeinträchtigt. Ein weiterer Unterschied zeigte sich bei der Aktivierung Rezeptor-exprimierender Zellen in Gegenwart des löslichem Antigens. Der HRS3scFv-Fc- Rezeptor wurde hierbei durch 5-10fach niedrigere Konzentrationen des löslichen Antigens blockiert als der korrespondierende HRS3-scFv-y Rezeptor ohne Fc-Domäne. Dieses ist insbesondere im Hinblick auf einen möglichen therapeutischen Einsatz bedeutsam, da Tumor-assoziierte Antigene häufig sezerniert werden und eine Rezeptor-vermittelte T-ZellAktivierung mit nachfolgender anti-tumoraler Immunreaktion blockieren können. Expression der rekombinanten Rezeptoren in peripheren T-Zellen und Monitoring der Rezeptor-Expression Die klinischen Anwendung rekombinanter Rezeptoren für die adoptive Immuntherapie erfordert: 1. einen effizienten Gentransfer in T-Zellen des peripheren Blutes; 2. ein einfaches Monitoring der transduzierten Zellen; 3. eine Verfahren zur Anreicherung transduzierter und Rezeptor exprimierender T-Zellen. Die zur Zeit effizientesten Verfahren für einen Gentransfer in periphere T-Lymphozyten beruhen auf der Verwendung replikationsdefizienter amphotroper Retroviren. Diese werden von Helferzellinien produziert, die stabil die retroviralen Gene (gag, pol, env) exprimieren und in die der retrovirale Vektor mit dem Verpackungssignal und der Expressionskassette für den Chimären Rezeptor transfiziert wird. Dieses Vorgehen hat allerdings den Nachteil, daß stabile Zell-Klone mit hoher Virusproduktion isoliert und propagiert werden müssen. Darüber hinaus besteht, insbesondere bei Langzeitkulturen, die Gefahr einer Infektion der Produzenten-Zellinien mit Wild-Typ-Viren und die Gefahr einer Rekombination der retroviralen Gene, die zur Produktion replikationskompetenter Viren führen kann. Aus diesem Grund werden zum Gen transfer in · jüngster Zeit replikationsdefiziente amphotrope Retroviren verwendet, die von transienten Produzentenlinien sezerniert werden [2, 13]. Hierbei wird eine geeignete Zellinie (293T) mit einem MuLV-abgeleiteten reUnauthenticated J Lab MedDate 2000; 24 (3): 126-134 Download | 5/12/16 4:35 AM 131 A. Hombach et al.: Chimäre Rezeptoren (roviralcn Vektor, der die DNS-Sequenz für den rekomhinantcn Rezeptor trägt, zusammen mit Express!ons-Plasmiden, die die DNS-Sequenzen für die retroviralcn Hclfcrfirnktionen tragen (MuLV-gag- und pol, GALV-env), kotransfiziert. Die transfiziertcn Zellen se/ernieren anschließend transient hohe Titer replikationsdefizicntcr Retroviren. Nach Infektion von Lym- pho/yten aus dem peripheren Blut lassen sich, abhängig vom jeweiligen Blut-Spender, Transduktionsraten von bis zu ca. 60% erreichen. Mit Hilfe dieses transienlen Produktionssystems konnten wir ampholrope Viren generieren, die eine Transduktion peripherer TLymphozyten und Expression der rekombinanten Rezeptoren mit hoher Effizienz erlauben (Tabelle 5). Tabelle 4 Einfluß der konstanten Rezeptor-Domäne auf Expression und Funktion HRSS-scFvMembran-Expression des rekombinanten Rezeptors Expression als Homodimer Expression als Monomer Konjugat-Bildung zwischen Effektor- und Tumorzellen Rezeptor-Blockierung durch lösliches Antigen Rezeptor-vermittelte Proliferation Rezeptor-vermittelte Zytokin-Sekretion HRS3-scFv-Fc-y W4 1 Die Rezeptor-Expression wurde durchflußzytometrisch mit Hilfe eines anti-idiotypischen Antikörpers bestimmt. + = hohe; (+) = schwache; - = keine Rezeptor-Expression. 2 Der Nachweis der Rezeptoren erfolgte im Western-Blot mittels spezifischer Antikörper gegen die -Signalkette unter reduzierenden- und nicht-reduzierenden Bedingungen. 3 Effektor- und Target-Zellen wurden mit grünen (PKH2) und roten (PKH26) Fluoreszenzfarbstoffen markiert und die Anzahl doppelt fluoreszierender konjugierter Zellen in Gegenwart blockierender anti-idiotypischer oder nicht-blockierenden Antikörpers durchflußzytometrisch bestimmt. + = hohe Konjugatbildung; (+) = geringe Konjugatbildung; - = keine Konjugatbildung. 4 Mikrotiterplaten wurden mit einem anti-idiotypischen Antikörper oder dem CD30 Antigen beschichtet und chimäre Rezeptoren exprimierende T-Hybridomzellen in Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen des löslichen Liganden inkubiert. Das Maß der zellulären Aktivierung wurde durch die Quantifizierung der IL-2 Sekretion mit Hilfe eines ELISA bestimmt, + = Inhibition durch niedrige Ligandenkonzentrationen; (+) = Inhibition erst durch hohe Konzentrationen; - = keine Inhibition. 5 Chimäre Rezeptoren exprimierende periphere T-Zellen wurden in CD30-beschichteten Mikrotiterplaten inkubiert und die Menge der BrdU-Inkorporation in proliferierende Zellen bestimmt, + = hohe Proliferation; (+) = mäßige Proliferation; - = keine Proliferation. 6 Chimäre Rezeptoren exprimierende periphere T-Zellen wurden mit CD30-positiven Tumor-Zellen kokultiviert und das Maß der zellulären Aktivierung durch die Quantifizierung der IFN-y-Sekretion mit Hilfe eines ELISA bestimmt. ++ = hohe zelluläre Aktivierung; + = mittlere zelluläre Aktivierung; (+) = geringe zelluläre Aktivierung; - = keine zelluläre Aktivierung. . Tabelle 5 Detektion und Anreicherung Rezeptor exprimierender Zellen ScFv B72.3-scFv CC49-scFv HRS3-scFv 763.74-scFv humBW431/26-scFv NS19-9-scFv anti-idiotypischer Antikörper vorhanden + + + - Detektion/Anreiche- Rezeptor-Modifikation rung durch den anti- mit lgG1 Fc-Domäne1 idiotypischen Antikörper -/-/+/+ +/n.t.2 . +/+ -/- - Detektion/Anreicherung durch einen anti-lgG1 Fc Antikörper + + + + + +/+ 1 Die rekombinanten - und -Rezeptoren wurden modifiziert durch Insertion des konstanten Anteils humaner lgG1 zwischen die Antigenbindungs- und Signaldomäne. 2 Nicht untersucht. 132 J Lab Med 2000; 24 (3): 126-134 Unauthenticated Download Date | 5/12/16 4:35 AM A. Hombach et al.: Chimäre Rezeptoren Das Monitoring erfolgreich transduzierter T-Zellen nach retroviraler Infektion erfordert ein einfaches und schnelles Verfahren zur Detektion des rekombinanten Rezeptors auf der Zellmembran. Hierzu verwenden wir anti-idiotypische Antikörper mit Spezifität für den Antigenbindungsteil des rekombinanten Rezeptors. Mit Hilfe der anti-idiotypischen Antikörper und der Durchflußzytometrie läßt sich die Anzahl transduzierter T-Zellen leicht bestimmen. Darüber hinaus ist mit anti-idiotypischer Antikörper eine Anreicherung Rezeptor-exprimierender T-Zellen diurch Zell-Sortierungs-Verfahren, beispielsweise mittels Magnet-Partikel'gekoppelter Antikörper (MACS), möglich (Tabelle 5, unpublizierte Daten). Dies ist insbesondere bei den Lymphozyten-Spendern bedeutsam, bei denen die Transduktion mit amphotropen Retroviren nur zu einer relativ geringen Anzahl Rezeptor-exprimierender Zellen führt. Der Einsatz anti-idiotypischer Antikörper wird jedoch dadurch limitiert, daß nur für wenige Antikörper anti-idiotypische Antikörper zur Verfügung stehen. Darüber hinaus kann es bei rekombinanten Einzelketten-Antikörpern im Vergleich zu den parentalen Antikörpern zu einem Idiotop-Verlust kommen, wie oben dargestellt. Um rekombinante T-Zell-Rezeptoren unabhängig von der jeweiligen Antigen-Bindungsdomäne zu detektieren. haben wir in eine Reihe der von uns entwickelten Rezeptoren. den konstanten Fc-Anteil des humanen IgGl Immunglobulins eingefügt. Der Gentransfer dieser Konstrukte in T-Zellen führt zur Expression stabiler und funktioneller - und -Ketten Rezeptoren (Tabelle 3). Die Expression dieser Rezeptoren kann dann, unabhängig von der jeweiligen Antigenbindungs-Domäne, mit Hilfe eines anti-humanen IgGl Fc Antikörpers durchflußzytometrisch nachgewiesen werden. Darüber hinaus wird mit Hilfe dieser Antikörper, analog zu der Verwendung der anti-idiotypischen Antikörper, eine Anreicherung von Rezeptorexprimierenden T-Zellen mittels Zell-Sortierungs-Verfahren ermöglicht (Tabelle 5, unpublizierte Daten). Ein Nachteil bei diesem Vorgehen ist jedoch, daß der konstante Anteil der Rezeptor-Domäne die Eigenschaften des Rezeptors in Hinblick auf Signaltransduktion verändern und zu einer Verschlechterung der zellulären Aktivierung nach spezifischer Antigen-Bindung führen kann. Zusammenfassung und offene Fragen Die Effizienz der Induktion einer spezifischen anti-tumoralen Immunreaktion mit Hilfe rekombinanter TZell-Rezeptoren ist von zahlreichen Faktoren abhängig. Von herausragender Bedeutung sind hierbei eine Antigen-spezifische Bindungs-Domäne, die für den Rezeptor verwendete Signal-Domäne und die Rezeptor-Konfiguration. Darüber hinaus sind bisher folgende Fragen ungelöst: 1. Welchen Einfluß besitzt die Avidität des rekombinanten Rezeptors auf die Effizienz der zellulären Aktivierung? 2. Welchen Einfluß besitzen kostimulierende Moleküle und deren Liganden auf eine Rezeptor-vermittelte zelluläre Aktivierung? Läßt sich eine Rezeptor-vermittelte Immunreaktion beispielsweise durch Interaktion des CD28-Rezeptors mit B7-Liganden oder mit anti-CD28 Antikörpern modulieren? 3. Läßt sich mit Hilfe von Rezeptor-exprimierenden peripheren T-Zellen eine Immunreaktion gegen autologe Tumorzellen richten? 4. Ist eine von murinen Antikörpern abgeleitete Antigenbindungs-Domäne bei einem therapeutischen Einsatz immunogen? Könnte eine therapielimitierenden Immunreaktion des Empfängers gegen die TZellen mit rekombinanten Rezeptoren auftreten? Sind bei einem therapeutischen Einsatz humane oder humanisierte Einzelkettenantikörper den murinen scFv überlegen? 5. Welche Rolle spielt die Art des Zielantigens und dessen Interaktion mit dem rekombinanten T-ZellRezeptor? Sind alle Antigene gleichermaßen als Zielstruktur für derartige Rezeptoren geeignet oder gibt es Rezeptor-Antigen-Interaktionen, die nicht zu einer zellulären Aktivierung der Effektor-Zelle führen? Die Induktion einer spezifischen zellulären antiTumor-Reaktion mit Hilfe rekombinanter T-Zell-Rezeptoren ist ein vielversprechender neuer Ansatz der zellulären Immuntherapie. Das Konzept kombiniert hierbei die Vorteile des humoralen und zellulären Arms des Immunsystems zur Antigenerkennung und Vermittlung einer komplexen Immunreaktion. Die Wirksamkeit und prinzipielle Durchführbarkeit dieses Ansatzes wurde in zahlreichen in vitro Studien dokumentiert. Jedoch wird erst die klinische Erprobung zeigen, ob dieses alternative Konzept einer zellulären Immuntherapie zur Ergänzung der konventionellen Tumortherapie geeignet ist. Danksagung Die Arbeiten der Autoren wurden unterstützt durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft Bonn, durch den Sonderforschungsbereich 502 an der Universität zu Köln, durch die Deutsche Krebshilfe Bonn und durch das Fortune-Programm der Universität zu Köln. Literatur 1. Eshhar Z, Waks T, Gross G, Schindler DG. 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