Bedeutung der E 7+/CD4+-T-Lymphozyten für interstitielle
Werbung
Phänotypische, funktionelle und molekulare Charakterisierung von αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten Hinweise für eine neue Subpopulation T-regulatorischer Zellen des Respirationstraktes Dissertation Zur Erlangung des akademischen Grades doctor medicinae (Dr. med.) vorgelegt dem Rat der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Schiller-Universität Jena von Andreas Gebhardt geboren am 6. März 1975 in Kaiserslautern Gutachter: 1. Prof. Dr. med. Dr. rer. nat. C. Kroegel 2. PD Dr. med. U. Markert 3. Prof. Dr. med. H. Wirtz Tag der öffentlichen Verteidigung: 8. Mai 2006 Abkürzungsverzeichnis ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS AICD “activation-induced cell death” APC “Allophyocyanin” AMP Adenosin Monophosphat AP-1 Aktivatorprotein 1 APZ Antigen-präsentierende Zelle ATS “American Thoracic Society” BALF Bronchoalveoläre Lavage Flüssigkeit BrdU Bromodeoxyuridin Btk Bruton Tyrosinkinase CD “cluster of differentiation” CLA “cutaneous lymphocyte antigene” CSK COOH-terminale Src Kinase Cy5 Carbocyanin DAG Diazylglyzerol DEPC Diethylpyrocarbonat DMSO Dimethylsulfoxid DNA “desoxyribonucleotid acid” EGF “epithelial growth factor” ERS “European Respiratory Society” FACS “fluorescence activated cell sorter” FCS “fetal calf serum” FITC “Fluoresceinisothiocyanat” GAB2 GRB assoziiertes bindendes Protein 2 GADS “GRB2-related adaptor of Shc” GAP GTPase aktivierendes Protein GM-CSF “granulocyte-macrophage colony-stimulating factor” GPCR “G-protein-coupled receptors” GRB2 “growth factor receptor-bound protein 2” GTP Guanosin 5’ Triphosphat HI Humane Immundefizienz HEV “high endothelial venules” Abkürzungsverzeichnis HT Hybridisierungstemperatur IFN Interferon IBD “inflammatory bowel disease” IL Interleukin ILD “interstitial lung disease” IEL intraepitheliale Lymphozyten Ig Immunglobulin IGF “Insuline like growth factor” ITK Interleukin-2-induzierbare T-Zell Kinase LAT “Linker for activation of T cells” LEEP-CAM “lymphocyte epithelial-endothelial cell adhesion molecule” LCK “lymphocyte-specific kinase” mAk monoklonaler Antikörper MACS “magnetic-assisted-cell-sorting” MHC “major histocompatibility complex” MPCR Multiplex PCR NF-AT nukleärer Faktor von aktivierten T-Zellen NF-κB nukleärer Faktor κB PBMC “peripheral blood mononuclear cells” PBS “phosphatebuffer saline” PCR “polymerase-chain reaction” PDGF “platelet derived growth factor” PDK1 “phosphatidylinositol-dependent kinase 1” PDE Phosphodiesterase PE “Phycoerythrin” PHA Phytohämagglutinin PI Propidiumjodid PIP3 Phosphoinositid 3-Phosphat PMA Phorbol-12-Myristat-13-Azetat (Phorbolester) PK Proteinkinase PLC Phospholipase C PtdIns Phosphatidylinositol PTEN “phosphatase and tensin homologue” PTK Proteintyrosinkinase Abkürzungsverzeichnis RAC “ras related C3-botulinum toxin substrate” RB respiratorische Bronchiolitis RNA “ribonucleic acid” RT reverse Transkriptase SEM Standardfehler vom Mittelwert SH2 src-Homologie Domäne 2 SHC “src homology and collagen” SLP76 SH2 Domäne-enthaltendes Leukozyten-Protein von 76 kDa TAPP Tandem PH Domäne-enthaltendes Protein TEC “tyrosin kinase expressed in hepatocellular carcinoma TGF “transforming growth factor” TNF Tumornekrosefaktor Th T-Helferzelle Thr Threonin Treg T-regulatorische Zelle TZR T-Zellrezeptor UE Untereinheit WT Wildtyp ZAP70 ζ-Ketten-assoziierte Proteinkinase von 70 kDa Inhaltsverzeichnis INHALTSVERZEICHNIS 1 ZUSAMMENFASSUNG……………….……………………………….………….1 2 EINLEITUNG …………………………………………………………………….....3 2.1 2.1.1 2.1.2 IDIOPATHISCHE PULMONALE FIBROSE ………………………………………………..3 Histopathologie ………………………………...………………………………………4 Pathogenese ………………………………….…………………………………………4 2.2 INTEGRIN αEβ7…………………………………………………………………………..5 2.3 T-LYMPHOZYTEN ……………………………………………………………………...6 2.3.1 CD4+ T-Lymphozyten ………………………………………………………………….6 2.3.2 T-regulatorische Lymphozyten ………………………………………………………...7 2.3.2.1 Natürliche T-regulatorische Lymphozyten ………………………………………….7 2.3.2.2 Adaptive T-regulatorische Lymphozyten …………………………………………...7 2.3.2.3 FoxP3-Expression in T-regulatorischen Lymphozyten ……………………………8 2.3.2.4 Die Rolle von T-regulatorischen Lymphozyten bei Autoimmunerkrankungen …….8 2.4 SIGNALTRANSDUKTION IN T-LYMPHOZYTEN………………………………………....9 2.4.1 T-Zellrezeptor-Stimulation……………………………………………………………..9 2.4.2 Phosphoinositid 3-Kinasen ……………………………………………………………..9 2.4.2.1 Klassifikation ………………………………………………………………………..9 2.4.2.2 Funktion ……………………………………………………………………………10 2.4.2.3 Phosphoinositid 3-Kinasen in T-Lymphozyten ……………………………………12 3 ZIELE DER ARBEIT …………………………………………………………….15 4 MATERIALIEN & METHODEN ……………………………………………...16 4.1 4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.1.4 4.1.5 4.1.6 MATERIALIEN ………………………………………………………………………...16 Geräte …………………………………………………………………………………16 Chemikalien…………………………………………………………………………...16 Enzyme und Biochemikalien………………………………………………………….17 Antikörper …………………………………………………………………………….17 Zytokine ...…………………………………………………………………………….18 Puffer ………………………………………………………………………………….18 4.1.7 Kits ……………………………………………………………………………………18 Inhaltsverzeichnis 4.2 4.2.1 4.2.1.1 4.2.1.2 4.2.2 4.2.2.1 4.2.2.2 4.2.3 4.2.3.1 4.2.3.2 4.2.3.3 4.2.4 4.2.5 4.2.5.1 4.2.5.2 4.2.5.3 4.2.5.4 METHODEN …………………………………………………………………………...19 Separation von CD4+ T-Lymphozyten ………………………………………………..19 Isolation von mononukleären Zellen aus dem peripheren Blut ……………………19 Immunomagnetische Zelleseparation ……………………………………………...20 Zellkultur ……………………………………………………………………………...22 Stimulation von CD4+ T-Lymphozyten mit anti-CD3mAk ……………………….22 LY294002 …………………………………………………………………………23 Durchflusszytometrie …………………………………………………………………23 Messung von Antigenen an der Zelloberfläche ……………………………………24 Messung der Zellproliferation mit Bromodeoxyuridin ……………………………24 Messung der intrazellulären Zytokinsynthese …………………………………......25 Zellsortierung ………………………………………………………………………....26 Nachweis der mRNA-Expression …………………………………………………….27 Isolierung der Total-RNA ………………………………………………………….27 Reverse Transkription ……………………………………………………………..27 Polymerase Ketten Reaktion ………………………………………………………28 Gelelektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte …………………………...31 4.2.6 Statistische Auswertung ………………………………………………………………31 5 ERGEBNISSE .……………………………………………………………………..32 5.1 5.1.1 PHÄNOTYPISCHE CHARAKTERISIERUNG VON αEβ7+ CD4+ T-LYMPHOZYTEN ………..32 Einfluss von CD4-Engagement auf die Oberflächenexpression von αEβ7 auf CD4+ T-Lymphozyten …………………………………………………………….32 5.1.1.1 Einfluss von CD4-Engagement auf die Zytokin-Synthese von CD4+ T-Lymphozyten ………………………………………………………33 5.1.2 Einfluss von CD4-Engagement auf den Phänotyp von αEβ7+ CD4+ T-Zellen und αEβ7- CD4+ T-Zellen ……………………………………………………………...37 5.2 PROLIFERATION VON αEβ7+ CD4+ T-LYMPHOZYTEN ………………………………....42 5.3 5.3.1 5.3.2 5.3.3 5.3.4 5.3.4.1 5.3.4.2 5.3.5 5.3.6 MOLEKULARE CHARAKTERISIERUNG VON αEβ7+ CD4+ T-LYMPHOZYTEN …………..44 Einfluss von LY294002 auf die αEβ7-Expression von CD4+ T-Lymphozyten ……….44 Einfluss von LY294002 auf die Aktivierung ………………………………………....49 Einfluss von LY294002 auf den Phänotyp……………………………………………51 Einfluss von LY294002 auf die Funktion ………...…………………………………..55 Zytokinrezeptoren- und Zytokinsynthese auf mRNA-Ebene ……………………...55 Zytokinsynthese auf Protein-Ebene ………………………………………………..59 Einfluss von LY294002 auf die Proliferation ………………………………………...63 Einfluss von LY294002 auf die Viabilität ……………………………………………64 Inhaltsverzeichnis 5.4 FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG VON αEβ7+ CD4+ T-LYMPHOZYTEN ………....65 5.4.1 FoxP3-mRNA-Expression in αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten …………………………..65 6 DISKUSSION ………………………………………………………………………66 6.1 EINFLUSS VON CD4-ENGAGEMENT AUF DIE AKTIVIERUNG VON CD4+ T-ZELLEN ….68 6.2 PHÄNOTYPISCHE CHARAKTERISIERUNG VON αEβ7+ CD4+ T-LYMPHOZYTEN ..............69 6.3 6.3.1 FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG VON αEβ7+ CD4+ T-LYMPHOZYTEN ………....70 Vergleich von αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten mit T-regulatorischen Zellen …………..70 6.3.2 αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten als periphere, adaptive T-regulatorische Zellen …….....72 6.4 PATHOGENETISCHES MODELL DER ROLLE VON αEβ7+ CD4+ T-LYMPHOZYTEN BEI DER IDIOPATHISCHEN PULMONALEN FIBROSE ..………………………………....74 6.5 6.5.1 MOLEKULARE CHARAKTERISIERUNG VON αEβ7+ CD4+ T-LYMPHOZYTEN …………..76 Beteiligung der Phosphoinositid 3-Kinasen an der Differenzierung von CD4+ T-Lymphozyten zu αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten ……………………………...77 Beteiligung der Phosphoinositid 3-Kinasen an der Zytokinrezeptoren- und Zytokinsynthese……………..……………………….78 6.5.2 6.5.3 Beteiligung der Phosphoinositid 3-Kinasen an der Proliferation und Homöostase …..80 7 SCHUSSFOLGERUNG & AUSBLICK …….…………………………………83 8 LITERATURVERZEICHNIS …………....……………………………………..85 9 ANHANG Zusammenfassung 1 1 ZUSAMMENFASSUNG Die idiopathische pulmonale Fibrose/usual interstitial pneumonia (IPF/UIP) geht mit einem narbigen Umbau des interstitiellen Gewebes der Lunge einher. Beobachtungen zeigen, dass bei Patienten mit IPF/UIP CD4+ T-Lymphozyten, die das Integrin αEβ7 exprimieren, im pulmonalen Kompartment expandieren. Während bei Gesunden 28,0% der CD4+ T-Zellen αEβ7+ sind, exprimieren bei Patienten mit IPF/UIP 74,5% der CD4+ T-Lymphozyten αEβ7. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten zu charakterisieren. Im Einzelnen ging es dabei um die Beantwortung folgender Fragen: (1) Unterscheiden sich αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten bezüglich des Aktivierungsstatus, des Phänotyps und der Proliferation von αEβ7- CD4+ T-Lymphozyten? (2) Zeichnen sich αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten durch funktionelle Eigenschaften aus, die sie von anderen Zellen unterscheiden? (3) Welche Rolle spielen Phosphoinositid 3-Kinasen bei der Differenzierung von CD4+ T-Lymphozyten zu αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten? Die Überprüfung der aufgestellten Arbeitshypothesen erfolgte mittels Durchflusszytometrie, RT-PCR und Zellsortierungen mit Hilfe eines “Mo-Flo High speed cell sorters”. Die Experimente dieser Arbeit zeigen, dass bei αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten die Expression der Aktivierungsmarker CD25 und CD69 im Vergleich zu αEβ7- CD4+ T-Zellen signifikant erhöht ist. Dieser gesteigerte Aktivierungsstatus von αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten korreliert mit einer 6-fach erhöhten Proliferation. Darüber hinaus exprimieren αEβ7+ CD4+ T-Zellen CD45RO, einen Marker für Gedächtniszellen. Um αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten hinsichtlich ihrer Funktion zu charakterisieren, wurde die Expression des Transkriptionsfaktors FoxP3 untersucht. Dieser spielt eine zentrale Rolle bei der Entwicklung und Funktion regulatorischer Zellen. Dabei ließ sich erstmals eine erhöhte FoxP3-mRNA-Expression in humanen αEβ7+ CD4+ T-Lymhozyten nachweisen. Somit zeigen die Ergebnisse der Untersuchungen der vorliegenden Dissertationsarbeit erstmals, dass humane αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten sich hinsichtlich des Aktivierungsstatus, des Phänotyps und der Proliferation von αEβ7- CD4+ T-Zellen unterscheiden. Die Zusammenfassung 2 Charakteristika von αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten legen den Schluß nahe, dass es sich bei dieser Zellpopulation um T-regulatorische Zellen (Treg) handelt. Diese Subpopulation von Treg ist mittels der Synthese der Zytokine TGF-β und IL-10 in der Lage, in die progressive Fibrosierung des Interstitiums einzugreifen. Das zweite Ziel der Arbeit war es Mechanismen aufzuklären, die an der Differenzierung von CD4+ T-Lymphozyten zu regulatorischen αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten beteiligt sind. Die Familie der Phosphoinositid 3-Kinasen (PI3K) bildet ein Schlüssel-Molekül in diesem Zusammenhang. Die verschiedenen Isoformen sind in die T-Zelldifferenzierung im Thymus involviert und werden nach T-Zellrezeptor-Stimulation aktiviert. PI3K haben eine zentrale Funktion bei der Proliferation und der Vermittlung anti-apoptotischer Signale und auf immunologischer Ebene bei der Chemotaxis von neutrophilen Granulozyten. Die hier durchgeführten Experimente zeigen, dass die PI3K die Differenzierung von CD4+ T-Lymphozyten zu αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten kontrollieren. Darüber hinaus konnte nachgewiesen werden, dass für die Proliferation und die Zytokinsynthese von CD4+ T-Lymphozyten die Aktivierung der PI3K erforderlich ist. Zusammenfassend dokumentieren die Ergebnisse dieser Arbeit, dass es sich bei αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten um eine stark aktivierte Population von Treg handelt, die an der Pathogenese von IPF/UIP beteiligt sein könnte. Offenbar spielen PI3K eine wesentliche Rolle bei der Aktivierung und Proliferation von dieser Subpopulation. Die Ergebnisse lassen neue therapeutische Zugänge für die Behandlung der IPF/UIP erkennen. Einleitung 3 2 EINLEITUNG 2.1 IDIOPATHISCHE PULMONALE FIBROSE Die idiopathische pulmonale Fibrose/usual interstitial pneumonia (IPF/UIP) ist die häufigste interstitielle Lungenerkrankung (ILD). Im Gegensatz zu anderen Entitäten dieser Gruppe nimmt sie einen progressiven Verlauf und führt nach wenigen Jahren zum Tode (mittlere Lebenserwartung nach Diagnosestellung 2,5-3 Jahre) (Augusti 2002). Charakteristisch für die IPF/UIP ist eine chronische Entzündung und progressive Fibrosierung des pulmonalen Interstitiums (Gross und Hunninghake 2001). Es resultiert ein narbiger Umbau des Lungenparenchyms (sog. “Honigwabenmuster”) mit Traktionsbronchiektasien und eine Destruktion der Alveolarsepten (Abb. 2.1). Die Architekturstörung der Lunge führt schließlich zu einem verminderten Gasaustausch und damit zu einer respiratorischen Globalinsuffisienz. Bei den betroffenen Patienten manifestiert sich die IPF/UIP in Form einer progressiven Dyspnoe und einem trockenen Husten. Abb. 2.1 Hoch auflösende CT-Thorax-Aufnahme eines Patienten mit histologisch gesicherter idiopathischer pulmonaler Fibrose/usual interstitial pneumonia. Sichtbar ist eine irreguläre Verbreiterung der Alveolarsepten (Pfeilspitze), subpleurales Lungenparenchym mit “Honigwabenmuster” (Stern) und ein dilatierter Bronchus (Bronchiektase) (Pfeil). (Gross und Hunninghake 2001) Einleitung 4 2.1.1 Histopathologie Die Diagnose einer idiopathischen pulmonalen Fibrose ist histopathologisch mit einer “gewöhnlichen interstitiellen Pneumonie” (“Usual Interstitial Pneumonia”, UIP) assoziiert (Katzenstein und Myers 1998). Dieses sog. “UIP-Muster” bietet ein heterogenes Bild bestehend aus pulmonalen Bereichen einer chronischen Entzündung (Alveolitis), Ansammlungen proliferierender Myofibroblasten und Fibroblasten (sog. “fibroblastische Foci”) (Seite 5, Abb. 2.2) als auch aus dichten Kollagenablagerungen und perifokalem Granulationsgewebe (Katzenstein und Myers 1998). Gleichzeitig findet sich in Nachbarschaft zu fibrotischen Gewebearealen eine Zerstörung der subepithelialen Basalmembran in Verbindung mit geschädigten Epithelzellen (Kuhn 1989, Selmann et al. 2001, Selmann und Pardo 2003). Die der Zerstörung der Epithelzellen zugrunde liegende Entzündung führt zu einer lokalen Rekrutierung, Differenzierung und Aktivierung von Fibroblasten (Selmann et al. 2001) über lösliche Mediatoren (TGF-β, TNF-α und IL-8) (Khalil et al. 1991). Diese Zytokine vermitteln ferner den Influx von Leukozyten (White et al. 2003) und fördern die fibrogene Reaktion des Lungengewebes. 2.1.2 Pathogenese Das der IPF/UIP primär zugrunde liegende pathogenetische Ereignis ist eine fokale epitheliale Zerstörung des Alveolarepithels und der korrespondierenden subepithelialen Abschnitte. Offen bleibt die Frage nach der primären Ursache oder Ätiologie der epithelialen Läsionen. Grundsätzlich kommen hierfür exogene (Zigarettenrauch, Staubexposition, Virusinfektion) (Gross und Hunninghake 2001) oder endogene Faktoren (Mutation des “Pro-surfactant protein-C”) (White et al. 2001) in Betracht, die Epithelzellen schädigen. Darüber hinaus wäre es möglich, dass es sich bei der Erkrankung um eine primäre Störung der Fibroblasten handelt, bei der es sekundär zu einer epithelial/subepitehlialen Läsion kommt (Uhal et al. 1995). Schließlich könnte aber auch eine immunologische Reaktion gegenüber definierten epithelialen oder subepithelialen Gewebeantigenen in Form einer autoimmunlogischen Erkrankung vorliegen (Dall’Aglio et al. 1988). Einleitung 5 Abb. 2.2: Histopathologische Charakteristika der idiopathischen pulmonalen Fibrose. Die Abbildung zeigt eine Hämatoxylin-EosinFärbung einer offenen Lungenbiopsie eines Patienten mit progressiver Dyspnoe und diffusen parenchymatösen Lungeninfiltraten in der Röntgen-Thorax-Aufnahme. (A) 15-fache Vergrößerung des Lungenparenchyms mit dichter subpleuraler Fibrose (Pfeile) und kollabierten und obliterierten Alveolen. Das Bild der pathologischen Heterogenität zeigt sich in der Nachbarschaft von dichtem Narbengewebe zu nicht von der Fibrose betroffenen Arealen. (B) In der 150-fachen Vergrößerung eines “fibroblastischen Focus” (Stern) zeigt sich die noduläre Ansammlung von linear angeordneten Spindelzellen gegenüber schwach angefärbter extrazellulärer Matrix. Die angrenzenden Alveolarsepten sind wenig verbreitert (Pfeil) (Gross und Hunninghake 2001). Arbeiten unserer Forschungsgruppe haben gezeigt, dass eine bestimmte Subpopulation von CD4+ T-Lymphozyten im Rahmen der IPF/UIP expandiert (Braun et al. 2003, Rihs et al. 1996). Während in der Bronchoalveolären Lavage Flüssigkeit (BALF) von Gesunden die Zahl der αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten im Mittel 28% aller CD4+ T-Zellen beträgt, exprimieren bei IPF/UIP 74,5% der CD4+ T-Lymphozyten αEβ7 (Lohmeyer et al. 1999). Im Gegensatz hierzu sind sowohl bei Gesunden als auch bei Patienten mit IPF/UIP 2% der Blut-CD4+ T-Zellen αEβ7+. Bisher ist noch nicht bekannt welche Rolle diese Zellpopulation bei der IPF/UIP spielt. 2.2 INTEGRIN αEβ7 Integrine bilden eine große Familie transmembranöser Adhäsionsmoleküle, die sowohl an Zell-Zell- als auch an Zell-Matrix-Interaktionen beteiligt sind. Ferner spielen sie eine Rolle bei der Antigenerkennung und agieren als kostimulierender Faktor bei der T-Zellaktivierung (Erle et al. 1994, Sims und Dustin 2002). Die heterodimeren Integrine bestehen jeweils aus einer α- und einer β-Kette (Hynes 1992). Es sind mindestens 15 α- und 8 β-Ketten bekannt, die miteinander kombiniert eine große Zahl unterschiedlicher Integrinen bilden. Während die Einleitung 6 Integrin-Unterfamilien β1, β2 und β3 auf allen Leukozyten exprimiert werden, ist die Expression von β7-Integrinen auf bestimmte Zellpopulationen beschränkt. Die Integrin-Kette αE, die auch als CD103 bezeichnet wird, ist bisher nur in Kombination mit der Kette β7 nachgewiesen worden. Dieses für humane intraepitheliale Lymphozyten (IEL) typische Integrin bindet an das epitheliale Adhäsionsmolekül E-Cadherin an der basolateralen Seite von Epithelzellen. Es vermittelt so die Anreicherung von IEL an mukosalen Oberflächen der Lunge, der Dermis und des Intestinums (Hynes 1992, Parker et al. 1992). Neben E-Cadherin wurde ein weiterer Ligand für das Integrin αEβ7 entdeckt, das “lymphocyte endothelial-epitheleial cell adhesion molecule” (LEEP-CAM) (Strauch et al. 2001). LEEP-CAM könnte als Bindungspartner von αEβ7 an Endothelzellen dienen. Die Expression von αEβ7 auf CD4+ T-Lymphozyten kann in vitro induziert werden durch die Gegenwart von TGF-β1 bei der T-Zellrezeptor-Stimulation (Rihs et al. 1996). 2.3 T-LYMPHOZYTEN Im Knochenmark und Thymus generierte T-Lymphozyten sind Teil des erworbenen Immunsystems, d. h. die Immunantwort dieser Zellen ist spezifisch gegen das Pathogen gerichtet und geht mit der Bildung eines immunologischen Gedächtnisses einher. Anhand des T-Zellrezeptors kann man αβ- von γδ-T-Lymphozyten unterscheiden. γδ-T-Lymphozyten machen 1-5% der Lymphozyten aus. Ihre bevorzugte Lokalisation sind epitheliale Oberflächen (Carding und Egan 2002). Sie besitzen zum einen zytotoxische Aktivität, sind aber auch in der Lage Zytokine und Wachstumsfaktoren zu sezernieren (Workalemahu et al. 2003 und 2004). Die Population der αβ-T-Lymphozyten kann weiterhin in 2 Subtypen unterteilt werden. CD4+ T-Lymphozyten sind vornehmlich Zytokin sezernierende T-Helferzellen, während CD8+ T-Lymphozyten auch als zytotoxische Zellen bezeichnet werden. 2.3.1 CD4+ T-Lymphozyten Innerhalb der Population der CD4+ T-Lymphozyten können Th1-Helferzellen, die mittels IL-2- und IFN-γ-Synthese in der Lage sind, eine zelluläre Immunantwort mit der Aktivierung von Makrophagen einzuleiten, von Th2-Helferzellen unterschieden werden. Die Synthese von Einleitung 7 IL-4, IL-5 und IL-10 durch Th2-Helferzellen führt zu einer humoralen Immunantwort, was die Bildung spezifischer Antikörper durch Plasmazellen zur Folge hat (Delves und Roitt 2000a, Delves und Roitt 2000b). Darüber hinaus zeigen neuere Beobachtungen die Existenz einer weiteren Subpopulation von CD4+ T-Lymphozyten, nämlich den T-regulatorischen Lymphozyten (Treg). 2.3.2 T-regulatorische Lymphozyten 2.3.2.1 Natürlich vorkommende T-regulatorische Lymphozyten Das Immunsystem ist ein höchst effektives und dynamisches zelluläres Netzwerk, das den Organismus gegenüber exogenen Faktoren wie pathogenen Mikroben und anderen potentiell schädlichen Faktoren (Antigenen) schützt. Darüber hinaus muss das Immunsystem zwischen eigenen (“Selbst”) und nicht-eigenen (“Nicht-Selbst”) Strukturen sowie zwischen schädlichen und unschädlichen Antigenen differenzieren, um eine Selbstzerstörung durch autoaggressive Immunmechanismen zu vermeiden. Hierbei ist die Induktion der Antigen-spezifischen T-Zelltoleranz und ihre Aufrechterhaltung in der Peripherie von zentraler Bedeutung. An der Vermeidung autoaggressiver Immunreaktionen sind spezifische T-Zellpopulationen mit suppressiven/regulatorischen Eigenschaften beteiligt. Hierzu gehören im Thymus heranreifende Antigen-spezifische regulatorische CD4+ T-Lymphozyten (Treg), die 5-10% der peripheren CD4+ T-Lymphozyten repräsentieren (Neg et al. 2001). Diese an der homöostatischen Kontrolle adaptiver Immunreaktionen beteiligten Zellen exprimieren CD25 und andere Antigene wie CTLA-4 konstitutiv auf ihrer Oberfläche (Suri-Payer et al. 1998). Sie vermitteln ihre suppressive Wirkung über einen direkten Zell-Zell-Kontakt durch Membran-assoziierte Moleküle (Shevash et al. 2001). Man bezeichnet diese CD25+ CD4+ T-Lymphozyten als “professionelle” oder “natürliche” T-regulatorische Lymphozyten (Trn). 2.3.2.2 Adaptive T-regulatorische Lymphozyten Von den natürlich auftretenden Treg (Trn) läßt sich eine zweite regulatorische CD4+ T-Zellpopulation abgrenzen, die ebenfalls der Überwachung autoagressiver Immunmechanismen dient. Im Unterschied zu den aus dem Thymus stammenden Trn entwickeln sich diese Zellen in der Peripherie unter definierten Bedingungen (suboptimaler Einleitung 8 Antigenkontakt und/oder einer Kostimulation) aus reifen CD25+ aber auch CD25- CD4+ T-Zellen und werden daher als “adaptive” oder “induzierte” Treg (Tra) bezeichnet (Horwitz et al. 2003). Tra Zellen vermitteln ihre suppressive Aktivität neben membranabhängigen Mechanismen indirekt über die Freisetzung immunsuppressiver Zytokine. Hiernach lassen sich CD4+ Treg nochmals in Tr1- (IL-10) (Groux 2003, Roncarolo et al. 2001) und Tr2 (Th3)-Zellen (TGF-β, IL-4, IL-10) (Levings et al. 2002, Weiner 2001) unterteilen. 2.3.2.3 FoxP3-Expression in T-regulatorischen Lymphozyten Neben den oben genannten Oberflächenrezeptoren exprimieren Trn ebenso wie Tra den sog. “forkhead transcription factor” (FoxP3)-Transkriptionsfaktor “Scurfin/FoxP3”, der für den Scurfin-transkriptionellen Regulator kodiert und für Differenzierung sowie Funktion der Treg erforderlich ist (Fontenot et al. 2003, Hori et al. 2003, Khattri et al. 2003, Walker et al. 2003). Im Menschen führt die Aktivierung von CD25- CD4+ T -Lymphozyten über eine TZR-Stimulation zur Expression des Transkriptionsfaktors. Diese Zellen zeigen eine den Trn vergleichbare suppressive Aktivität (Walker et al. 2003). Die Transfektion des Transkriptionsfaktors FoxP3 konvertiert naive CD25- CD4+ T-Lymphozyten zu Zellen mit suppressiver Aktivität (Hori et al. 2003, Walker et al. 2003). 2.3.2.4 Die Rolle von T-regulatorischen Lymphozyten bei Autoimmunerkrankungen Autoimmunerkrankungen entstehen bei einer Imbalance zwischen der Antigenpräsentation und der immunologischen Toleranz gegenüber dem Antigen. In dieser Situation wäre vorstellbar, dass eine Autoimmunopathie auf eine primäre Funktionsstörung der Treg mit Störung der Selbsttoleranz zurückgeht (Sakaguchi et al. 1985, Shevach 2002). Tatsächlich sind in der Zwischenzeit bei einer Reihe von Autoimmunopathien dysfunktionelle Treg als zentraler pathogenetischer Mechanismus identifiziert worden. Hierzu gehört z. B. der autoimmune (Typ I) Diabetes (Kukreja 2002), die Multiple Sklerose (Putheti et al. 2003, Viglietta et al. 2004) oder die rheumatoide (Cao et al. 2003) und juvenile Arthritis (de Kleer et al. 2004). Einleitung 9 2.4 SIGNALTRANSDUKTION IN T-LYMPHOZYTEN 2.4.1 T-Zellrezeptor-Stimulation Der antigenspezifische T-Zellrezeptor (TZR) der CD4+ T-Lymphozyten besteht aus den variablen α- und β-Ketten, die nichtkovalent mit den γ-, δ- und ε-Ketten des CD3-Moleküls und den ζ-Ketten des TZR assoziiert sind (Delves und Roitt 2000a, Delves und Roitt 2000b). Daneben dient das CD4-Antigen als Korezeptor. Nachdem der TZR einer CD4+ T-Zelle einen Peptid-MHC II Komplexes auf einer Antigen-präsentierenden Zelle (APZ) erkannt hat, kommt es zur Phosphorylierung bestimmter Tyrosinreste innerhalb der sog. Immunrezeptor Tyrosin-basierenden Aktivierungsmotive (ITAM) (Chan und Shaw 1996), die sich in den γ-, δ- und ε-Ketten von CD3, sowie in den ζ-Ketten des TZR befinden. Diese Phosphorylierung geschieht durch die Proteintyrosinkinasen (PTK) der src-Familie p56lck und p59fyn, die mit dem CD3-Molekül und mit dem CD4-Korezeptor assoziiert sind. Durch die Tyrosin-Phosphorylierung entsteht eine charakteristische Struktur, die von Molekülen mit sog. Src-Homologie-2 (SH2) Domänen erkannt werden. Dazu gehört die PTK ZAP-70. Sie bindet an die phosphorylierten ζ-Ketten des TZR, wird daraufhin selbst durch src-Kinasen phosphoryliert und damit aktiviert. ZAP-70 ist dann in der Lage den “linker for activation of T cells” (LAT), ein transmembranöses Adapterprotein zu phosphorylieren (Seite 14, Abb. 2.3). Dies ermöglicht das Zusammenkommen weiterer für die Signalkaskade wichtiger Proteine an der Zellmembran, u. a. den Adapterproteinen SLP-76, VAV und GADS und der Proteintyrosinkinase (PTK) TEC. Dieser Komplex ist wiederum in der Lage andere Proteine in der Signalkaskade zu aktivieren, u. a. die Phosphoinositid 3-Kinasen. 2.4.2 Phosphoinositid 3-Kinasen 2.4.2.1 Klassifikation Die Phosphoinositid 3-Kinasen (PI3K) sind eine Familie von intrazellulären Signalproteinen, die durch die Phosphorylierung der D-3 Position von Phosphoinositiden eine Vielzahl biologischer Funktionen regulieren. Anhand der Substratspezifität werden verschiedene Klassen von PI3K unterschieden (Okkenhaug und Vanhaesebroeck 2003). Als Substrate der Klasse I der PI3K dienen sowohl Phosphoinositid, als auch Phosphoinositid-(4)monophosphat und Phosphoinositid-(4,5)-bisphosphat. Substrate der Klasse II der PI3K sind Phosphoinositid und Phosphoinositid-(4)-monophosphat, der Klasse III nur Phosphoinositid. Einleitung 10 Über die Funktion der Klasse II und III der PI3K ist wenig bekannt. Ihnen wird eine Beteiligung am intrazellulären Transport von Vesikeln zugesprochen (Simonsen et al. 2001). Die Klasse I der PI3K wird hinsichtlich des Aktivierungsmechanismus in 2 Gruppen unterteilt. PI3K der Klasse IA können über Rezeptoren mit intrinsischer TyrosinkinaseAktivität, z. B. über die Rezeptoren der Wachstumsfaktoren IGF-1 (Kato et al. 1993), PDGF (Chiariello et al. 2001) bzw. EGF (Downing und Reynolds, 1991), aktiviert werden. Auch Rezeptoren mit assoziierten Tyrosinkinasen, wie Zytokinrezeptoren (IL-2R, IL-4R) (Liu et al. 1997) sind in der Lage mit PI3K vom Typ IA zu interagieren. Die Assoziation der PI3K vom Typ 1A mit phosphorylierten Tyrosin-Motiven von Rezeptoren und Adapterproteinen erfolgt über die regulatorische Untereinheit (p85α, p85β bzw. p55γ). Diese bilden mit den katalytischen UE p110α, p110β bzw. p110δ ein Heterodimer, das nach der katalytischen UE benannt wird (PI3Kα, PI3Kβ, PI3Kδ). Prinzipiell kann sich jede regulatorische Untereinheit mit jeder katalytischen Untereinheit assoziieren (Okkenhaug und Vanhaesebroeck 2003). Die katalytische Untereinheit p110γ (PI3Kγ), die mit mit der Adapter UE p101 interagieren kann, bildet die Klasse IB der PI3K, deren Aktivität sowohl durch die Gβγ-Untereinheit als auch durch die Gα-Untereinheit heterotrimerer G-Proteine reguliert werden kann (LopezIlasaca et al. 1997). G-Proteine sind involviert in die Signalkaskade von Rezeptoren mit einer charakteristischen Struktur (7-Transmembran-Helix-Rezeptoren) wie z. B. der β1-adrenerge Rezeptor, Chemokin-Rezeptoren oder der Adenosin-Rezeptor. Während die PI3Kα und PI3Kβ in allen Zelltypen von Säugetieren vorkommen, werden die PI3Kδ und PI3Kγ vornehmlich in Leukozyten exprimiert (Okkenhaug et al. 2002, Sasaki et al. 2000). Die PI3Kγ konnte allerdings auch in Zellen des Myokards nachgewiesen werden (Crackower et al. 2002, Vlahos et al. 2003). 2.4.2.2 Funktion Alle Isoformen der PI3K besitzen sowohl eine Lipidkinase-Aktivität als auch eine SerinProteinkinase-Aktivität. Für PI3Kγ konnte zusätzlich eine von der Kinase-Aktivität unabhängige “scaffold”-Funktion nachgewiesen werden (Patrucco et al. 2004). Das von den PI3K generierte Lipid PIP3 agiert als eine Bindungsstelle für zahlreiche intrazelluläre Proteine mit einer speziellen Struktur, der Pleckstrin-Homologie Domäne. Einleitung 11 Hierzu gehören die Serin/Threoninkinasen Proteinkinase B (PKB), die auch AKT genannt wird und die “phosphatidylinositol-dependent kinase 1” (PDK 1) (Vanhaesebroeck und Alessi 2000). Die Bindung von PIP3 induziert die Translokation von PKB an die Zellmembran. Dadurch ist es PDK 1 möglich Thr308 und Serin473 von PKB zu phosphorylieren und somit zu aktivieren (Toker und Newton 2000, Vanhaesebroeck und Alessi 2000). Diese ist wiederum in der Lage u. a. das Regulatorprotein Bad zu phosphorylieren, was der Zell-Apoptose entgegenwirkt (Vanhaesebroeck und Alessi 2000). Weitere Zielmoleküle der PI3K sind u. a. die TEC Familie von Tyrosinkinasen in Lymphozyten (Schmidt et al. 2004, Takesono et al. 2002, Yang et al. 2001). Über die Interaktion mit Bam 23 sind PI3K beteiligt an der Proliferation von B-Lymphozyten (Han et al. 2003). Darüber hinaus ist es allen Isoformen der PI3K möglich sich mit der kleinen GTPase Ras zu assoziieren, was die Lipidkinase-Aktivität der PI3K verstärkt (Wetzker und Rommel 2004). Die katalytischen UE der PI3K kann mittels der Serin/Threonin-Proteinkinase-Aktivität über die Autophosphorylierung der regulatorischen UE und der Phosphorylierung von H-Ras ihre Lipidkinase-Aktivität in Form einer negativen Rückkopplung regulieren (Foukas et al. 2004a und 2004b). Von p110γ ist bekannt, dass sie in der Lage ist, die Phosphorylierung der Adapter UE p101 zu katalysieren (Bondev et al. 1999, Bondeva et al. 1998). Kürzlich konnte für die PI3Kγ eine Funktion als “Scaffold”-Protein nachgewiesen werden, die über die Assoziation mit der Phosphodiesterase PDE3B möglich ist (Patrucco et al. 2004). Über diese von der KinaseFunktion unabhängige Interaktion ist die PI3Kγ in der Lage in kardialen Myozyten die cAMP-Konzentration zu reduzieren und dadurch die kardiale Kontraktilität zu regulieren (Patrucco et al. 2004). Die Fähigkeit der PI3K sowohl direkt mit Rezeptoren als auch mit Gα und Gβγ, Ras und anderen Signalproteinen zu interagieren macht die zentrale Schaltfunktion der PI3K in der Signalkaskade deutlich. In “Knock out”-Tier-Modellen zeigte sich, dass p110α und p110β defiziente Mäuse bereits als Embryos sterben (Okkenhaug und Vanhaesebroeck 2003) während Mäuse, deren p110δ bzw. p110γ deletiert wurde, ohne große Abnormalitäten überlebten, aber Leukozyten in ihrer Funktion schwer beeinträchtigt waren (Okkenhaug et al. 2002, Sasaki et al. 2000). In Mäusen mit p110δD910A/D910A, einer Punkt-Mutation, die zu einem inaktiven Genprodukt führte, waren Defekte in der Differenzierung von B-Lymphozyten im Knochenmark und in der Signaltransduktion von B- und T-Lymphozyten mit Einleitung 12 beeinträchtigtem Ca2+-Influx nachweisbar (Okkenhaug et al. 2002). Die Serum-Konzentration der Immunglobulin-Isotypen IgG und IgM war deutlich reduziert. Histologisch war eine Hypoplasie der Lymphknoten festzustellen und einige Mäuse zeigten in ihrem Phänotyp eine entzündlichen Darmkrankheit (IBD) (Okkenhaug et al. 2002). Der “Knock out” der PI3Kγ führte in neutrophilen Granulozyten zu einer Beeinträchtigung der Chemotaxis und der Bildung von Sauerstoff-Radikalen (Sasaki et al. 2000). Darüber hinaus war die Homöostase von Zellen der myeloischen Reihe gestört, was mit einer Expansion von neutrophilen Granulozyten verbunden war. In Mastzellen ist die IgE-vermittelte Granulafreisetzung abhängig von der Aktivierung der PI3Kγ (Laffargue et al. 2002). Gegenspieler der PI3K sind PTEN (Whitman et al. 1988) und SHIP (Freeburn et al. 2002). Diese Phosphatasen katalysieren die Entfernung der Phosphatpruppe in der der D3 bzw. der D5 Position des Inositolring von PIP3. Die von PTEN und SHIP katalysierte Reaktion führt zur Inaktivierung des PI3K-Signalweges. 2.4.2.3 Phosphoinositid 3-Kinasen in T-Lymphozyten Die Differenzierung von Thymozyten durchläuft definierte Ebenen: Von CD4-CD8- doppelt negativen (DN) Vorläuferzellen über CD4+CD8+ doppelt positive (DP) unreife Thymozyten Reifung hin zu CD4+ bzw. CD8+ T-Lymphozyten. Die PI3Kγ beeinflusst die Differenzierung auf 2 Ebenen: Zum einen war in PI3Kγ “Knock out”-Mäusen die Entwicklung der DP Thymozyten aus DN Vorläuferzellen beeinträchtigt (Rodriguez-Borlado et al. 2003). Zum anderen war die Differenzierung zu CD4+ bzw. CD8+ T-Lymphozyten gestört mit einer verminderten Anzahl von CD4+ T-Lymphozyten einhergehend (Rodriguez-Borlado et al. 2003). Darüber hinaus wird die PI3Kγ benötigt sowohl um eine effektive + CD8 T-Lymphozyt-abhängige antivirale Immunantwort als auch eine T-Helferzell-abhängige Immunantwort zu generieren (Sasaki et al. 2000). Die Aktivierung der PI3K in T-Lymphozyten kann über verschiedene Mechanismen erfolgen (Seite 14, Abb. 2.3): Vav, ein Guaninnukleotid Austauschfaktor (GEF), wird nach TZR-Stimulation von ZAP-70 Tyrosin-phosphoryliert und kann somit bei Rac, einem Mitglied der Rho-Familie von GTPasen den Austausch von GDP gegen GTP bewirken (Reynolds et al. 2002). Rac, das durch die Bindung von GTP aktiviert wird, ist nun selbst in der Lage, durch Assoziation mit der p85-Untereinheit, die PI3K der Klasse IA zu stimulieren (Bokoch et al. 1996, Tolias et al. 1995). Umgekehrt ist aber auch möglich, dass die Einleitung 13 Aktivierung der PI3K zur Aktivierung von Rac führt (Weiss-Haljiti et al. 2004, Welch HC et al. 2002). Neben der Stimulation über den TZR existieren weitere Mechanismen der Aktivierung der PI3K in T-Lymphozyten. TRIM (TZR interagierendes Molekül) und der kostimulierende Rezeptor CD28 enthalten jeweils ein Tyr-Xaa-Xaa-Met Motiv, das als Bindungsstelle für die SH2-Domäne von p85 fungieren kann (Okkenhaug und Vanhaesebroeck 2003). Die Ligation von Interleukin-2 an den zugehörigen Rezeptor führt über die Bildung eines Aktivierungskomplexes bestehend aus den Adapterproteinen SHC, GRB2 und GAB2 und schließlich der Interaktion von phosphorylierten Tyrosin-Motiven von GAB2 mit p85 ebenfalls zur Zunahme der Aktivität der PI3K der Klasse IA (Brennan et al. 1997). Chemokine wie SDF-1 sind über die Bindung an 7 trans-Membran Helix Rezeptoren in der Lage die PI3Kγ zu stimulieren (Curnock und Ward 2003, Suzuki et al. 2001). Einleitung 14 Okkenhaug 2003 Abb. 2.3: Phosphoinositid 3-Kinasen (PI3K) sind zentrale Signalmoleküle in T-Lymphozyten. Abkürzungen: DAG Diazylglyzerol; GAB2 GRB-assoziiertes-bindendes Protein 2; GADS “GRB2related adaptor of Shc”; GPCR “G-protein coupled receptor”; GRB2 “growth factor receptor-bound protein 2”; ITK Interleukin-2-induzierbare T-Zell Kinase; LAT “Linker for activation of T cells”; LCK “lymphocyte-specific kinase”; PDK1 “phosphatidylinositol-dependent kinase 1”; PKC Proteinkinase C; PLCγ1 Phospholipase Cγ1; PtdIns Phosphatidylinositol; PTEN “phosphatase and tensin homologue”; RAC “Ras related C3-botulinum toxin substrate”; SHC “src homology and collagen”; SLP76 SH-2 Domäne-enthaltendes Leukozyten-Protein von 76 kDa; TAPP Tandem-PH-Domäne-enthaltendes Protein; TEC “tyrosin kinase expressed in hepatocellular carcinoma”; ZAP70 ζ-Ketten-assoziierte Proteinkinase von 70 kDa. Ziele der Arbeit 15 3 ZIELE DER ARBEIT Die Pathogenese der idiopathischen pulmonalen Fibrose/usual interstitial pneumonia (IPF/UIP) ist nicht bekannt. Das der Arbeit zugrunde liegende Forschungsvorhaben basiert auf der Beobachtung, dass es im Rahmen der IPF/UIP zu einer selektiven Expansion von αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten kommt. Diese Selektivität bezieht sich zunächst auf die definierte fibrotische Lungenerkrankung und findet sich z. B. nicht im Rahmen der asthmatischen Bronchitis oder einer pneumonischen Entzündung. Die Selektivität bezieht sich ferner auf die Zellpopulation, die ausschließlich den CD4+ T-Lymphozyten zugeordnet werden kann und weder CD8+- noch γδ-T-Zellen erfasst. Die Selektivität der Expansion αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten bezieht sich schließlich auf das Organ “Lunge”, denn eine vergleichbare Vermehrung findet sich nur im bronchoalveolären Kompartment und nicht im Blut. Obwohl die Bedeutung der Expansion von αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten bei der IPF/UIP noch nicht verstanden wird, ist es schwer zu glauben, dass diese Veränderung zufällig auftritt und ohne physiologische oder pathophysiologische Relevanz sein soll. Aus diesem Grund war es das Ziel, der der Dissertationsarbeit zugrunde liegenden Forschungsarbeiten, diese Zellpopulation im Detail zu charakterisieren, sowie Mechanismen zu identifizieren, die an der Expansion von αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten beteiligt sein könnten. Im Einzelnen ging es dabei um die Beantwortung folgender Fragen: (1) Unterscheiden sich αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten bezüglich des Aktivierungsstatus, des Phänotyps und der Proliferation von αEβ7- CD4+ T-Lymphozyten? (2) Zeichen sich αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten durch funktionelle Eigenschaften aus, die sie von anderen Zellen unterscheiden? (3) Welche Rolle spielen Phosphoinositid 3-Kinasen bei der Differenzierung von CD4+ T-Lymphozyten zu αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten? Materialien & Methoden 16 4 MATERIALIEN & METHODEN 4.1 MATERIALIEN 4.1.1 Geräte Analysewaage BP 610 Sartorius, Göttingen, BRD FACSCalib Becton Dickinson, Heidelberg, BRD FACS-Auswertungssoftware CellQuest 3.1f Becton Dickinson, Heidelberg, BRD Mikroskop Axiovert 25 Carl Zeiss, Jena, BRD Kochplatte mit Magnetrührer MR 3001 Heidolph, Kelheim, BRD Labofuge 400R Heraeus, Hanau, BRD Mikroskop Axiolab Carl Zeiss, Jena, BRD Präzisionswaage BP 61 Sartorius, Göttingen, BRD Schüttelwasserbad GFL, Burgwedel, BRD Steri-Cult 200 Inkubator Forma, Scientific, Frankfurt, BRD Sterilbank Hera Safe Heraeus, Hanau, BRD Tischzentrifuge Rotana 6 RS Hettich, Tuttlingen, BRD Vakusafe-Absaugsystem Integra Biosciences, Fernwald, BRD Vortex-Genie 2 Scientific industries, Bohemia, USA 4.1.2 Chemikalien Borsäure Sigma, Deisenhofen, BRD Bromphenolblau Sigma, Deisenhofen, BRD Chloroform Sigma, Deisenhofen, BRD Diethylpyrocarbonat (DEPC) Sigma Deisenhofen, BRD Dulbecco PBS w/o Ca2+ Mg2+ Cell Concepts, Umkirch, BRD EDTA Boehringer, Mannheim, BRD Ethanol Sigma, Deisenhofen, BRD Ehidiumbromid Boehringer, Mannheim, BRD Ficoll-Paque PLUS Pharmacia, Uppsala, S Glyzerin Sigma, Deisenhofen, BRD L-Glutamin (lypophil) Seromed, Biochrom, Berlin, BRD Materialien & Methoden 17 Light Green SF Yellowish Fluka Chemika, Buchs, CH LY294002 Calbiochem, La Jolla, USA Natriumchlorid Carl Roth, Karlsruhe, BRD Natriumazid Sigma, Deisenhofen, BRD Penicillin/Streptomycin Boehringer, Mannheim, BRD Saponin Sigma, Deisenhofen, BRD Toluidinblau Fluka Chemika, Buchs, CH Tris-HCl Boehringer, Mannheim, BRD Xylenzyanol Sigma, Deisenhofen, BRD 4.1.3 Enzyme und Biochemikalien Agarose LE Roche, Mannheim, BRD Bovines Serum Albumin Sigma, Deisenhofen, BRD Fetal calf Serum BIBICO Grand Island, NY, USA RPMI-Medium Cell Concepts, Umkirch, BRD Taq-Polymerase Pekin Elmer, Wellesley, USA 4.1.4 Antikörper CD103-PE (BerACT8) Dako, Glostrup, DK CD25-FITC (M-A251) PharMingen, San Diego, USA CD3-Cy5 (UCTH1) Dako, Glostrup, DK CD4-APC Caltag Laboratories, Hamburg, BRD CD45RO-FITC Dako, Glostrup, DK CD62L-FITC Dako, Glostrup, DK CD69-FITC PharMingen, San Diego, USA CD95-FITC PharMingen, San Diego, USA IgG-FITC Caltag Laboratories, Hamburg, BRD IgG-PE Caltag Laboratories, Hamburg, BRD IgG-Cy5 Caltag Laboratoreis, Hamburg, BRD IgG1 negative control Dako, Glostrup, DK anti-CD3mAkLE/NA (HIT 3a) PharMingen, San Diego, USA Materialien & Methoden 18 4.1.5 Zytokine rh Interleukin-2 Cell Concepts, Umkirch, BRD rh Transforming growth factor-β1 Cell Concepts, Umkirch, BRD 4.1.6 Puffer “Coating Buffer”: - 0,795 g NA2CO3 (0,159% entspricht 15 mM) - 1,465 g NaHCO3 (0,293% entspricht 35 mM) - 100 mg NaN3 (0,020% entspricht 3 mM) Die Lösung wurde mit Aqua bidest. auf 500 ml aufgefüllt, auf einen pH Wert von 9,6 eingestellt und vor Gebrauch steril filtriert. 4.1.7 Kits “BrdU Flow Kit”: PharMingen, San Diego, USA - “Cytofix/Cytoperm Buffer” - “Perm/Wash Buffer” - “Cytoperm plus” “CD4+ T Cell Isolation Kit” Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, BRD - Hapten-Antikörper Cocktail - MACS Anti-Hapten MicroBeads “High pure RNA-Isolation Kit” - Lyse-Puffer - Waschpuffer I - WaschpufferII - Elutions-Puffer Roche Diagnostics, Mannheim, BRD Materialien & Methoden 19 4.2 METHODEN 4.2.1 Separation von CD4+ T-Lymphozyten Die Zellseparation bestand aus Dichtezentrifugation und anschließender immunomagnetischer Separierung 4.2.1.1 Isolierung von mononukleären Zellen aus Vollblut Die Isolierung von mononukleären Zellen aus dem Vollblut (PBMC) erfolgte in Anlehnung an die in von Miltenyi beschriebene Methode (Miltenyi et al. 1990). Hierzu wurden 54 ml Blut gesunder Spender in EDTA-Röhrchen (1,6 mg/ml Blut, Sarstedt, Nümbrecht, BRD) abgenommen, 1:2 mit PBS verdünnt, dann je 25 ml dieser Suspension auf 20 ml Ficollösung der Dichte 1.077 g/L geschichtet und 30 Minuten mit 400 g bei 20°C zentrifugiert. Das verdünnte Plasma wurde bis zur Interphase abgesaugt, die mononukleären Zellen aus der Interphase abgenommen, die so gewonnen Zellen in PBS gewaschen (10 Minuten, 350 g, 4°C) und das Zellpellet in PBS mit 2% FCS aufgenommen. Die Bestimmung der Zellzahl erfolgte mittels Kimura-Färbung. Zellfärbung mit Kimura Um den Anteil der Lymphozyten von den Leukozyten zu bestimmen, wurde ein Volumenteil Zellsuspension mit neun Volumenteilen der 14-tägig frisch angesetzten Kimuralösung vermischt und 60 Sekunden stehen gelassen. Die Zählung erfolgte in einer verbesserten Neubauer-Zählkammer (Brand, Wertheim/Main, BRD) im Lichtmikroskop. Dabei entsprach ein mittleres Zählfeld 1 x 104 Zellen. Die Färbelösung setzte sich folgendermaßen zusammen: - 11,0 ml Toluidinblau-Lösung bestehend aus 0,05 g Toluidinblau, 1,8% NaCl und 96% Ethanol ad 100 ml Wasser, was 0,05% Toluidinblau in der Endlösung entspricht - 5 ml Phosphatpuffer pH 6,4 (Endkonzentration von 0,066 M) - 0,8 ml light green (0,03% in der Endlösung entsprechend) - 0,5 ml Saponin, gesättigt in 50% Ethanol Nach dem Ansetzen wurde die Lösung gemischt, durch einen 0,45 µm Filter (Millex-HV Sterilfilter, Millipore, Bredford, MA, USA) steril filtriert und bei 4°C gelagert. Materialien & Methoden 20 4.2.1.2 Immunomagnetische Zellseparation Die Isolierung von CD4+ T-Zellen aus den PBMC erfolgte entweder durch negative oder positive Selektion mittels einer immunmagnetischer Separierung nach der von Miltenyi entwickelten Methode (Miltenyi et al. 1990). Grundlage der Trennung ist die unterschiedliche Expression von Oberflächenmolekülen auf den verschiedenen Zellpopulationen. Mit Antikörpern, an die kleinste kolloidale, paramagnetische Partikel (“Beads”) gekoppelt sind, lassen sich unter Zuhilfenahme eines starken Magneten die CD4+ Zellen von den übrigen Zellpopulationen trennen. In dieser Arbeit wurde das Magnetic Cell Sorting (MACS)-System (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, BRD) zur Separierung benutzt. Es besteht aus einem starken U-förmigen Magneten, in den Säulen eingelegt werden können. Bei der Separierung bleiben die mit “Beads” beladenen Zellen in der Säule zurück, während sich alle nichtbeladenen Zellen aus der Säule eluieren lassen. Je nach Wahl der Separationsmethode (negativ oder positiv) befinden sich die Zielzellen nach Durchlauf der PBMC-Zellsuspension durch die Säule entweder im Eluat oder in der Säule. Zellen, die in der Säule zurückgehalten werden, können mit Hilfe eines Kolbens nach Herausnahme der Säule aus dem Magneten gewonnen werden. Bei beiden Methoden lassen sich Reinheitsgrade der CD4+ T-Lymphozyten-Population von 95% bis 98% erreichen. 1 2 3 Abb. 3.1: Prinzip der immunomagnetischen Separation: Im ersten Schritt erfolgte die Bindung von mit “Beads” konjugierten Antikörpern an das zugehörige Oberflächenantigen der Zellen (1). Anschließend wurde die gemischte Zellpopulation auf eine mit Säule gegeben, in der sich eine Eisenmatrix befand, die mit PBS/2%FCS benetzt war (2). Während die mit “Beads” markierte Zellpopulation in der Säule durch den Magneten zurückgehalten wurde, konnten die nicht markierten Zellen ungehindert passieren (3). Bei der negativen Selektion wurden die nicht markierten CD4+ T-Lymphozyten durch einen Röhrchen aufgefangen. Die bei der positiven Selektion sich in der Säule befindlichen CD4+ T-Lymphozyten ließen sich durch Herausnahme aus dem Magneten und mit Hilfe eines Kolbens eluieren. Materialien & Methoden 21 Positive (direkte) Selektion Für 107 Zellen (totale Zellzahl), die in 80 µl PBS/2% FCS resuspendiert wurden, benötigte man 20 µl magnetische “Beads” der Firma Miltenyi (CD4 MicroBeads, Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, BRD). Das Zellgemisch wurde mit den “Beads” 15 Minuten bei 4°C inkubiert. Anschließend gab man die Suspension auf eine in den Magneten eingespannte Säule (LS Separationssäule, Miltenyi Biotec, BRD), deren Eisenmatrix mit PBS/2% FCS benetzt war. Zusätzlich wurde ein Filter (Pre-Separation Filter, 30 µm, Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, BRD) der Säule aufgesetzt, der verhinderte, dass Zellaggregate die Säule verstopften. Nach dem Einsickern des Zellgemisches in die Matrix wurden die nicht mit “Beads” besetzten Zellen mit 30 ml PBS/2% FCS eluiert und danach die Säule aus dem Magneten entnommen. Mit Hilfe eines Kolbens konnten die in der Säule zurückgehaltenen, mit “Beads” besetzten CD4+ T-Zellen herausgespült werden. Die Separationssäulen dienten nur zum einmaligen Gebrauch, da die Eisenmatrix von einem hydrophilen Mantel umgeben ist, der sich durch das Spülen auswäscht. Negative (indirekte) Selektion Bei der negativen Selektion wurde das “CD4+ T Cell Isolation Kit” (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, BRD) verwendet, bestehend aus einem Hapten-Antikörper Cocktail und MACS Anti-Hapten MicroBeads. Während bei der positiven Selektion die CD4+ T-Lymphozyten direkt magnetisch markiert werden, zielen bei der negativen Selektion die verschiedenen Hapten konjugierten Antikörper auf alle CD4- Zellen. Die anschließende Bindung von Anti-Hapten Antikörpern, die mit den kolloidalen, paramagnetischen MicroBeads konjugiert sind, führt dazu, dass CD4- Zellen in der Säule zurückgehalten werden, CD4+ T-Lymphozyten die Säule jedoch ungehindert passieren können. Für 107 Zellen (totale Zellzahl), die in einem Volumen von 80 µl aufgenommen wurden, verwendete man 20 µl Hapten-Antikörper Cocktail. Nach 10 Minuten Inkubation bei 4°C wurde die Zellsuspension 2 x mit PBS/2% FCS gewaschen (10 Minuten, 300 g, 4°C). Das Zellpellet aus PBMC wurde resuspendiert und mit 20 µl MACS Anti-Hapten MicroBeads pro 107 Zellen für 15 Minuten bei 4°C inkubiert. Nach einmaligem Waschen nahm man die Zellen in 500 µl PBS/2% FCS pro 108 Zellen auf und gab die Zellsuspension unter Verwendung eines Filters auf die Säule. Die nicht mit “Beads” besetzten CD4+ T-Lymphozyten wurden mit 20 bis 30 ml PBS/2% FCS eluiert, zentrifugiert und nach Auszählung der Zellzahl entsprechend in Medium aufgenommen. Materialien & Methoden 22 4.2.2 Zellkultur Über Nacht wurden die isolierten CD4+ T-Lymphozyten bei 4°C gelagert und am nächsten Morgen in einer Konzentration von 2 x 106/ml in RPMI mit 10% FCS, 2 mM Glutamin, 100 µg/ml Streptomycin und 100 U/ml Penicillin kultiviert. 4.2.2.1 Stimulation von CD4+ T-Lymphozyten mit anti-CD3mAk Vor Bestücken der Multiwell Kulturplatten (Becton Dickinson, New Jersey, USA) mit den gereinigten Zellen wurden die “Wells” mit Goat-α-mouse IgG (1 mg/ml) in einer Konzentration von 1 µl einem ml “Coating Buffer” beschichtet (Coating). Nach 30 Minuten Inkubation bei 37°C erfolgte das zweimalige Auswaschen der “Wells” mit PBS und anschließend das Ansetzen der Zellkultur. Vor der Zugabe von 10 ng/ml TGF-β1 erfolgte die Stimulation der Zellen 30 Minuten auf Eis mit anti-CD3mAk in einer Endkonzentration von 1 µg/ml. Am zweiten Tag nach Stimulationsbeginn wurde allen Zellen Interleukin-2 in einer Endkonzentration von 40 ng/ml zugegeben. Durch diese Stimulationsmethode (Beschichtung durch Goat-α-mouse IgG und Zugabe von anti-CD3mAk) wird die Interaktion von CD4+ T-Lymphozyten mit Monozyten als APZ imitiert (Walker et al. 1987). 4.2.2.2 LY294002 Teilweise wurden die CD4+ T-Lymphozyten mit dem spezifischen Inhibitor von Phosphoinositid 3-Kinasen (PI3K) LY294002 in einer Endkonzentration von 20 µM inkubiert, was in einigen Versuchen nach 24 Stunden wieder zweimalig mit 25 ml PBS-FCS ausgewaschen wurde. Derzeit existieren zwei verschiedene spezifische Inhibitoren der Klasse IA der PI3K: LY294002 und Wotmannin (Vlahos et al. 1994, Walker et al. 2000). Beide Inhibitoren blockieren die ATP-Bindungsstelle der PI3K der Klasse I und somit die Lipidkinase- und die Proteinkinase-Aktivität. Allerdings ist die Bindung von Wortmannin kovalent, während die Assoziation von LY294002 nicht kovalent und somit reversibel ist. Folglich kann man anhand des Auswaschens von LY294002 beurteilen, ob ein unspezifisch toxischer Effekt von LY294002 vorlag oder ob der Inhibitor die Aktivität der PI3K beeinflusste. Somit wurde in der vorliegenden Arbeit LY294002 zur Beurteilung der Funktion der PI3K eingesetzt. Materialien & Methoden 23 4.2.3 Durchflusszytometrie Unter Durchflusszytometrie versteht man die Analyse einer Zellpopulation hinsichtlich ihrer Größe, Granularität und Expression bestimmter Oberflächenmoleküle mittels Laserbestrahlung. Im Durchflusszytometer werden die Zellen in eine dünne Kapillare gesaugt, so dass ein Strom einzelner Zellen entsteht. Dieser Strom wird von einem Laserstrahl, der Licht einer Wellenlänge von 488 nm ausstrahlt erfasst und so zur Eigenfluoreszenz angeregt. Das resultierende Fluoreszenz- und Streulicht wird von verschiedenen Lichtdetektoren aufgefangen und nach Intensität und Farbe getrennt von einem Computer registriert. So wird für jede einzelne Zelle eine charakteristische Kombination von optischen Eigenschaften aufgezeichnet. Die Daten werden digital aufbereitet und erlauben so eine numerische Auswertung. Jede der aufgezeichneten Eigenschaften (Streu- und Fluoreszenzlicht) steht für eine bestimmte Eigenschaft der analysierten Zelle. Das Vorwärtsstreulicht (“Forward Scatter”, FSC) d. h. das in Richtung des Laserstrahls gestreute Licht korreliert mit der Zellgröße, das Seitwärtsstreulicht (im rechten Winkel zum Laserstrahl gestreutes Licht, “Sideward scatter”, SSC) mit der internen Struktur der Zelle (Granularität). Die Grundfluoreszenz der Zellen wird über Messen des Fluoreszenzlichtes bestimmt. Zur quantitativen Untersuchung von Membranmolekülen können Zellen mit Fluoreszenzfarbstoffen, die an monoklonale Antikörper gegen Oberflächenantigene gekoppelt sind, markiert werden. Diese verändern das Fluoreszenzspektrum der Zellen. Durch verschiedene Farbfilter und Detektoren können mehrere Wellenlängenbereiche des Fluoreszenzlichtes parallel analysiert werden, die den unterschiedlichen verwendeten Fluoreszenzfarbstoffen entsprechen. Die gemessenen Intensitäten korrelieren mit der Anzahl der gebundenen fluoreszenzmarkierten Antikörper, wodurch quantitative Aussagen über die durchflusszytometrisch analysierten Zellen möglich sind. Als Durchflusszytometer wurde ein FACSCalibur (Becton Dickinson, Heidelberg, BRD) verwendet, der gleichzeitig vier verschiedene Fluoreszenzen erfassen kann. Fluoresceinisothiocyanat (FITC) emittiert grünes Licht der Wellenlänge 503 nm, Phycoerythrin (PE) orangenes licht von 585 nm, alle anderen Fluoreszenzfarbstoffe emittieren rotes Licht um 650 nm Wellenlänge. Überlappende Absorptionsbereiche lassen sich durch eine bestimmte Geräteeinstellung kompensieren. Materialien & Methoden 24 4.2.3.1 Messung von Antigenen an der Zelloberfläche Gereinigte CD4+ T-Lymphozyten wurden in Multiwell Kulturplatten (Becton Dickinson, Heidelberg, BRD) kultiviert, 0, 2, 5 bzw. 7 Tage nach Stimulation in 5 ml Röhren-Tubes (Sarstedt, Nümbrecht, BRD) überführt, je 10 µl Fluoreszenz-markierter Antikörper hinzugegeben und für eine halbe Stunde 4°C inkubiert. Die verwendeten Antikörper hatten jeweils eine Konzentration von 5 µg/ml in PBS/2% FCS. Zusätzlich enthielt die Antikörperlösung 0,1% Natriumazid, um eine evtl. bakterielle Verunreinigung der Antikörperlösung bei der Lagerung zu verhindern. Die Inkubation erfolgte im Dunkeln, da unter Lichteinfluss die Gefahr des Ausbleichens der Fluoreszenzfabstoffe besteht. Danach wurde einmal mit 2 ml PBS/2% FCS gewaschen (5 Minuten, 300 x g, 4°C), das Pellet schließlich in 300 µl PBS/2% FCS aufgenommen und die Probe gemessen. Die Expression der Oberflächenantigene wurden dann mit Hilfe eines FACSCalibur (Becton Dickinson, Heidelberg, BRD) analysiert. Bei jedem zu messenden Ansatz wurde ein Teil der Zellen mit nicht spezifisch bindenden fluoreszenzgefärbten IgG1-anti-Maus-Antikörpern inkubiert und als Negativ-Kontrolle gemessen. Über die so gemessene Grundfluoreszenz konnte ein Schwellenwert definiert werden. Zellen mit einem Fluoreszenzsinal, das unter dem Schwellenwert lag, wurde als negativ, Zellen mit einem Fluoreszenzsignal, das über dem Schwellenwert lag, wurden als positiv eingestuft. Die erhaltenen Messdaten wurden mit dem Programm CellQuest (Becton Dickinson, Heideberg, BRD) auf einem Macintosh-Computer dargestellt und analysiert. Dabei wurden entsprechende Felder gesetzt und als Regionen R1 (Lymphozytenpopulation) und R2 (CD4+ Zellen) bezeichnet. Gemessen wurde die Zellmenge, die sowohl in R1 als auch in R2 auftauchte. Es wurden dann 10.000 Ereignisse in dieser Region registriert und die Resultate als Histogramm dargestellt und ausgewertet. 4.2.3.2 Messung der Zellproliferation mit Bromodeoxyuridin Um die Proliferation von αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten und αEβ7- CD4+ T-Lymphozyten in einem Ansatz zu vergleichen, wurde die Bromodeoxyuridin (BrdU)-Aufnahme der beiden CD4+ T-Zell-populationen ermittelt. Diese erfolgte nach 0, 2, 5 und 7 Tagen mit Hilfe des “BrdU Flow Kits” (BD Pharmingen, San Diego, USA) mittels Durchflusszytometrie gemäß den Angaben des Herstellers. Das Thymidin-Analogon Bromodeoxyuridin (BrdU) wird während der S-Phase des Zellzyklus (DNA-Synthese) in die DNA der Zellen eingebaut Materialien & Methoden 25 (Gratzner et al. 1975). Diese BrdU-Inkorporation der Zellen kann dann mittels eines spezifischen FITC-konjugierten Antikörpers durchflusszytometrisch gemessen werden (Gratzner 1982, Gratzner und Leif 1981). Zunächst wurden 0,5 x 105 CD4+ T-Lymphozyten in 1 ml RPMI Medium mit den unter 4.2.2 angegebenen Zusätzen und 10 µl BrdU-Stammlösung (Endkonzentration: 100 µg/ml BrdU) für 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend erfolgte die Zugabe von 5 µl CD103-PEAntikörper-lösung und die Fixierung mit 100 µl “Cytofix/Cytoperm Buffer”. Dieser enthält eine spezielle Mischung aus dem Fixiermittel Formaldehyd und aus der Detergens Saponin. Diese Reagenz führt zur reversiblen Permeabilisierung der Zellemembran bei erhaltener ZellMorphologie und ermöglicht so die intrazelluläre Färbung von BrdU mittels eines FITC-markierten Antikörpers. Daraufhin wurden die Zellen zweimal mit 1 ml “Perm/Wash Buffer” gewaschen und mit 100 µl “Cytoperm plus Buffer” bzw. mit 100 µl “Cytofix/Cytoperm” refixiert. Nach dem Waschen mit dem “Perm/wash Buffer” wurde jeweils eine Zentrifugation über 10 Minuten bei 300 g durchgeführt Danach erfolgte die Inkubation der CD4+ T-Lymphozyten in 100 µl einer DNAse-Gebrauchtlösung (Endkonzentration: 300 µg/ml) für 1 Stunde im Wasserbad bei 37°C, um das eingebaute BrdU freizulegen. Anschließend wurden die Zellen erneut mit 1 ml “Perm/Wash Buffer” gewaschen und schließlich für 20 Minuten bei Raumtemperatur mit 50µl der BrdU-FITCAntikörperlösung inkubiert. Es schloss sich ein erneuter Waschvorgang mit 1 ml “Perm/Wash Buffer” an. Der Anteil BrdU aufnehmender Zellen wurde mittels Durchflusszytometrie bestimmt. 4.2.3.3 Messung der intrazellulären Zytokinsynthese Die Messung der IL-2-, IL-4-, IL-5-, IL-10- bzw. IFN-γ-Synthese erfolgte durchflusszytometrisch mittels intrazellulärer Färbung. Hierzu wurden an den Tagen 0, 2, 5, bzw. 7 0,5 x 105 CD4+ T-Lymhozyten zunächst mit Brefeldin A in einer Endkonzentration von 5 µg/ml, Ionomyzin (Endkonzentration: 1 µg/ml) und PMA (Endkonzentration von 10 µM/ml) 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach dem zweimaligen Waschen mit 2 ml PBS/2% FCS und der Zentrifugation bei 300 g erfolgte die 15-minütige Inkubation bei Raumtemperatur mit den Fluoreszenz-markierten Antikörpern CD103-FITC und CD4-APC. Nach dem erneuten Waschen mit PBS/2%FCS wurde den Zellen 100 µl Paraformaldehyd (2%) zugegeben. Nach 10-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde Materialien & Methoden 26 das Paraformaldehyd mit 1 ml PBS/2% FCS ausgewaschen, die Zellen bei 300 g zentrifugiert und das Pellet in 400 µl PBS/2% FCS aufgenommen. Die eigentliche intrazelluläre Färbung bestand aus einer 15-minütigen Inkubation der Zellen bei Raumtemperatur mit 100 µl eines Gemischs aus 99 µl 0,1% Saponin und 1 µl Antikörperstammlösung. Danach wurden die Zellen zweimalig gewaschen, zunächst mit 1 ml eines Saponin-Azid Gemischs bestehend aus 0,1% Saponin und 0,1% Azid und danach mit 1 ml PBS/2% FCS. Anschließend erfolgte die Messung der IL-Synthese mittels Durchflusszytometrie. 4.2.4 Zellsortierung Das Prinzip der Zellsortierung basiert auf dem der Durchflusszytometrie. Wie bei der Durchflusszytometrie werden die Zellen mittels Laserstrahl zur Fluoreszenz angeregt und das emittierte Licht wird über Detektoren gemessen. Die Zellen werden auf einzelne Tröpfchen verteilt und wie an einer Perlschnur aneinander gereiht aus einer Düse ausgestoßen. Durch ihre elektrische Ladung lassen sich die einzelnen Tröpfchen in einem elektrischen Feld so ablenken, dass sie auf bis zu vier verschiedene Sotierröhrchen gezielt verteilt werden können. Die zu sortierenden Zellen wurden aus der Kultur entnommen, in ein Sotierröhrchen überführt und mit 300 g über 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet in 100 µl Antikörperfärbelösung aufgenommen, die den PE-markierten antiCD103-Antikörper in einer Konzentration von 10 µg/ml enthielt. Die gefärbten Zellen wurden durch Zugabe von 2 ml PBS/FCS und anschließendem Zentrifugieren gewaschen. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet in 2 ml PBS/FCS aufgenommen. Die gefärbten Zellen wurden mit dem Zellsortierer “MoFlo” (Cytomation Bioinstruments, Freiburg, BRD) nach CD103-positiven (αEβ7+) und CD103-negativen (αEβ7-) in zwei verschiedene Röhrchen sortiert. Zellen, die aufgrund ihrer Fluoreszenzstruktur nicht sicher vitale Lymphozyten mit eindeutiger CD103-positiver oder CD103-negativer Eigenschaft waren, wurden verworfen. Die sortierten Zellen wurden bei 4°C gekühlt gehalten. Der Zellsortierer wurde über die Software “Summit v3.0” gesteuert. Es wurde mit einer Geschwindigkeit von etwa 3000 Zellen je Sekunde sortiert. Die Überprüfung der Reinheit der sortierten Zellpopulationen erfolgte mittels Durchflusszytometrie und lag bei über 95%. Materialien & Methoden 27 4.2.5 Nachweis der mRNA-Expression 4.2.5.1 Isolierung der Total-RNA Die RNA-Isolierung erfolgte unter RNase-freien Bedingungen. Ein RNA Isolierungsansatz umfasste 5 x 106 CD4+ T-Lymphozyten. Die Zellkultivierung erfolgte in Kulturschallen mit 24 “Wells”(BD Falcon, New Jersey, USA) in RPMI mit 10% FCS, 2 mM Glutamin, 100 µg/ml Streptomycin und 100 U/ml Penicillin für 4 bzw. 24 Stunden. Die Extraktion von Total-RNA erfolgte unter Verwendung des “High pure RNA-Isolation Kit“ (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, BRD). Die Zellsuspension aus den Kulturschalen wurde in 1,5 ml Reaktionsgefäße überführt, bei 750 g 10 Minuten zentrifugiert, der Überstand abgesaugt und anschließend das Pellet in 200 µl PBS aufgenommen und mit 400 µl LysisPuffer bestehend aus 4,5 M Guanidin Hydrochlorid, 50 mM Tris-HCl und 30% Triton gut durchmischt. Nach erfolgter Zellyse bei Raumtemperatur über 5 Minuten wurde das Gemisch in ein Röhrchen mit einem Filtereinsatz gegeben und 1 Minute bei 8000 g zentrifugiert. Den Überstand verwarf man, auf den Filter wurde ein DNase-Gemisch gegeben und über 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Darauf folgte die Zugabe von 500 µl Waschpuffer I (5 M Guanidin Hydrichlorid, 20 mM Tris-HCl, 20ml Ethanol, pH 6,6) auf den Filter, die Zentrifugation bei 8000 g, anschießend die Zugabe von Waschpuffer II auf den Filter (20 mM NaCl und 2 mM Tris-HCl, 40 ml Ethanol, pH7,5), die erneute Zentrifugation bei 800 g und schließlich die nochmalige Zugabe von 200 µl Waschpuffer II. Danach wurden die Zellen bei 12.000 g über 2 Minuten zentrifugiert. Als nächster Schritt zur Eluierung der mRNA, wurde der Filtereinsatz auf RNase freie Röhrchen gesetzt und 50 µl Elution Puffer auf den Filter gegeben. Diesen ließ man über 5 Minuten bei Raumtemperatur ruhen und zentrifugierte das Reaktionsgefäß mit dem Filtereinsatz bei 12.000 g über 1 Minute zentrifugiert. Die TotalmRNA befand sich nun im RNase freien Röhrchen. 4.2.5.2 Reverse Transkription Isolierte Total-RNA wurde mit Hilfe des StrataScript First-Strand Synthesis Systems (Stratagene, Heidelberg, BRD) in die komplementäre DNA umgeschrieben. Hierzu wurde von der in 50 µl DEPC-Wasser aufgenommenen RNA 38 µl entnommen. Nach Zugabe von 3 µl Oligo(dT) Primer (100 ng/µl) und vorsichtigem Durchmischen folgte eine 5-minütige Inkubation bei 65°C im Heizblock zur Auflösung der Sekundärstrukturen. Den Ansatz ließ Materialien & Methoden 28 man langsam bei Raumtemperatur abkühlen, um den Primern die Bindung an die RNA zu ermöglichen. Danach fügte man folgende Komponenten in entsprechender Reihenfolge hinzu: - 5 µl 10x first strand buffer - 1 µl RNase Block Ribonuclease Inhibitor (40 U/µl) - 2 µl 100 mM dNTPs - 1 µl MML V-RT (50 U/µl) Der Ansatz wurde vorsichtig durchmischt und anschließend zur Erststrangsynthese 60 Minuten bei 37°C inkubiert. Daraufhin inaktivierte man die reverse Transkriptase durch 5-minütige Inkubation bei 90°C im Heizblock. Die Produkte wurden bei -80°C gelagert. Alliquots von 1 bis 5 µl fanden für die Polymerase Ketten Reaktion (PCR) Verwendung. 4.2.5.3 Polymerase Ketten Reaktion Die Polymerase Ketten Reaktion (PCR) ist eine Methode, mit der spezifische DNASequenzen in vitro amplifiziert werden können. Sie wurde 1983 von K. B. Mullis entdeckt und das Originalprotokoll 1985 publiziert (Saiki et al. 1985). Die Reaktion besteht aus 3 sich wiederholenden Teilschritten, die bei unterschiedlichen Temperaturen stattfinden. Im ersten Schritt werden die DNA-Doppelstränge bei hoher Temperatur denaturiert. Es folgt die Hybridisierung, wo die Oligonukleotidprimer an die denaturierten Stränge binden und so der DNA-Polymerase im dritten Schritt (Kettenverlängerung) als Primer dienen können. In jedem Zyklus verdoppelt sich die Menge des von den Primern eingerahmten Matrizenfragmentes, das dann im folgenden Zyklus als Ausgangs-DNA dient. 1988 wurde aus der Bakterienart Thermus aquaticus eine hitzestabile Polymerase (Taq-Polymerase) isoliert, die längere Zeit Temperaturen von 94°C zu überstehen vermag, wodurch sich die Amplifikationsmöglichkeiten verbessern lassen (Innis et al. 1988). In der vorliegenden Arbeit wurde zur Analyse der mRNA-Expression von ausgewählten Zytokinen und Zytokinrezeptoren “CytoXpress Multiplex PCR” (Biosource international, Solingen, BRD) verwendet. Diese PCR Methode setzt mehrere Primerpaare gleichzeitig ein und ermöglicht somit die simultane Amplifikation unterschiedlicher DNA-Sequenzen im gleichen Reaktionsgefäß. Die Primerpaare haben ähnliche Hybridisierungstemperaturen, so dass für alle vergleichbare Bedingungen während der Multiplex PCR (MPCR) herrschen. Die Zusammensetzung der MPCR-Puffer ist optimiert, um die Konkurrenz zwischen den Amplicons möglichst gering zu halten und die Amplifikation von längeren DNA-Fragmenten Materialien & Methoden 29 zu verstärken. Mit dem “humane Inflammatory Gene Set 3-MPCR” (hINF3 MPCR) wurde die Expression der Gene für TNF-α, TNF-R1, TNF-R2, IL-1β, IL-6, IL-6R, GM-CSF und GM-CSFR untersucht. Als Haushaltsgen, zu dessen Expression die der anderen Gene in Beziehung gesetzt wurde, diente GAPDH. Gen Primer HT (°C) Amplicon (bp) TNF-α hINF3-TNF 66 680 TNF-R1 hINF3-TNFR1 66 490 TNF-R2 hINF3-TNFR2 66 220 IL-1β hINF3-IL1 70 555 IL-6 hINF3-IL6 72 360 IL-6R hINF3-IL6R 72 300 GM-CSF hINF3-GMC 72 424 GM-CSFR hINF3-GMCR 70 607 GAPDH hINF3-GAP 63 921 Tab. 4.1: Nachweis der mRNA-Expression mittels des “humane Inflammatory Gene Set 3. Die “humane Inflammatory Gene Set 3-MPCR” (hINF3 MPCR) wurde in einem 50 µl Ansatz durchgeführt, der aus 5 µl cDNA und 45 µl MPCR-Mastermix bestand. Der MPCRMastermix setzt sich folgendermaßen zusammen: - 30,5 µl destilliertes Wasser - 5 µl 10 x hINF3G MPCR Buffer (Biosource international, Solingen, BRD) - 5 µl 10 x hINF3G MPCR Primer - 4 µl dNTP (3,12 mM) - 5 µl Taq DNA-Polymerase(5U/µl) 45 µl des MPCR Mastermix wurden mit 5 µl cDNA in 0,6 ml Reaktionsgefässen vermischt und scharf zentrifugiert. Die PCR erfolgte im Thermozykler (GeneAmp PCR System 9600, Perkin Elmer, Wellesly, USA) und umfasste folgende Phasen: - Initialphase (1 Zyklus) bestehend aus: - 5 Minuten bei 95°C zur Denaturierung der DNA Doppelstränge - Hauptphase, in der die Amplifikation stattfand (30 Zyklen), bestehend aus: - 1 Minute bei 95°C zur Denaturierung - 1 Minute bei 62°C zur Hybridisierung - 1 Minute bei 72°C zur Kettenverlängerung - Finalphase (10-minütige Kettenverlängerung bei 72°C ) Materialien & Methoden 30 Die MPCR-Produkte wurden im Kühlschrank bis zur Weiterverarbeitung gelagert. Die Bestimmung der IL-2-, Il-4-, IL-5-, IL-10-, IFN-γ- und αE-mRNA-Expression erfolgte separat mit Hilfe des entsprechenden Primers. Die PCR wurde wie oben beschrieben durchgeführt, jedoch wurde diesmal als Haushaltsgen Cyclophilin gewählt und der Mastermix setzte sich folgendermaßen zusammen: - 13,37 µl destilliertes Wasser - 2,5 µl Puffer (Applied Biosystems, Foster City, USA) - 1 µl des jeweiligen Primers - 2 µl dNTP (Tarkara Bio Europe, Greenevilliers, F) Die Hybridisierungstemperatur unterschied sich bei den einzelnen Primern und ist Tabelle 2 zu entnehmen. Gen IL-2 IL-4 IL-10 IFN-γ Primersequenz 5’-3’ s GAATGGAATTAATAATTACAAGAATC as ATGTTGTTTCAGATCCCTTTAGTTCCAGA s TTCCCCCTCTGTTCTTCCTGCTA as CGTACTCTGGTTGGCTTCCTTCAC s ATGGGGGTTGAGGTATCAGAGG as ATGCCCCAAGCTGAGAACCAAG s TTTGGGTTCTCTTGGCTGTTAC as αE Cyclo HT (°C) Amplicon (bp) 55°C 233 59°C 318 64°C 252 53°C 417 62°C 448 60°C 276 65°C 556 CTTTTTCGCTTCCCTGTTTTAG s AGGGTGTTGAGCGCTTTGCCATTG as GGAGCCCCCGCGACGTAGGAGAG s CATCTGCACTGCCAAGACTG CTGCAATCCAGCTAGGCATG FoxP3 s As GGCGGACCATCTTCTGGAT GCTGCTCCAGAGACTGTACCATCT Tab. 4.2: Zur Bestimmung der mRNA-Expression benutzte Pimersequenzen Die PCR-Produkte wurden wiederum im Kühlschrank bis zur Weiterverarbeitung gelagert. Materialien & Methoden 31 4.2.5.4 Gelelektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte Zur Gelelektrophorese wurde ein 2,5% Agarosegel in 1 x TBE-Puffer verwendet. Die Lösung wurde aufgekocht, bis keine Schlieren mehr sichtbar waren, das Gel nach Abkühlung auf 60°C in den Schlitten der Gelelektrophoresekammer gegossen und ein bzw. 2 Kämme zur Bildung von Probentaschen eingesetzt. Nach der Aushärtung überführte man den Gelschlitten in die mit 1 x BE Puffer gefüllte Elektrophoresekammer und entfernte die Kämme. Nach dem Durchmischen von 5 µl der PCR-Proben mit 0,1 Volumenanteils des 10 x Probenauftragspuffers (0,42% Bromphenolblau, 0,42% Xylenzyanol, 50% Glyzerin) wurden diese vorsichtig in die Geltaschen pipettiert. Nach einer 180-minütigen elektrophoretischen Auftrennung mit 100 Volt und 200 mA färbte man das Gel für 20 Minuten in einer 0,001%igen Etidiumbromidlösung in 1 x TBE-Puffer unter ständigem Schütteln, spülte es anschließend 10 Minuten in destilliertem Wasser und beleuchtete es mit kurzwelligen UV-Licht. Zur Dokumentation diente das Geldokumentationssystem mit der Software Phoretix ID® von Biostep (Jahnsdorf, BRD). Die Bandendichte der zu bestimmenden mRNA-Expression wurde in Relation zur Bandendichte der mRNA Expression des Haushaltsgens gesetzt. 4.2.6 Statistische Auswertung Alle statistischen Analysen wurden mit dem Programm SPSS für Windows (Vers. 8.0, Chicago, USA) durchgeführt. Die Auswertung erfolgte mit Hilfe des Wilcoxon-Tests für gepaarte Ereignisse. Die Ergebnisse sind als Mittelwerte ± Standardfehler (SEM) dargestellt. Als ein statistisch signifikanter Unterschied wurde p<0,05 angesehen, als ein statistisch tendenzieller Unterschied p<0,1. Ergebnisse 32 5 ERGEBNISSE 5.1 PHÄNOTYPISCHE CHARAKTERISIERUNG VON αEβ7+ CD4+ T-LYMPHOZYTEN CD4+ T-Lymphozyten können mittels zwei verschiedener Methoden aus dem peripheren Blut isoliert werden. Während bei der positiven Selektion durch die Ligation von mit anti-CD4mAk konjugierten “Beads” an das CD4-Antigen bereits vor Stimulation der Zellen ein Signal generiert wird, erfolgt bei der negativen Selektion keine Modulation des CD4-Rezeptors. Zunächst sollte untersucht werden, ob das CD4-Engagement die αEβ7-Expression auf CD4+ T -Lymphozyten beeinflusst. 5.1.1 Einfluss von CD4-Engagement auf die Oberflächenexpression von αEβ7 auf CD4+ T-Lymphozyten Die Isolation von CD4+ T-Lymphozyten erfolgte aus dem peripheren Blut gesunder Spender. Mononukleäre Zellen (PBMC) wurden mittels Ficoll-Zentrifugation separiert und hieraus die eine Hälfte der CD4+ T-Lymphozyten positiv, die andere Hälfte negativ isoliert. Um die Expression von αEβ7 auf CD4+ T-Lymphozyten in vitro zu induzieren, ist neben der T-Zellrezeptor (TZR)-Stimulation die Gegenwart von TGF-β notwendig. Somit wurden die CD4+ T-Zellen in einem Ansatz, zusätzlich zur anti-CD3mAk-Stimulation mit TGF-β1 inkubiert. An den Tagen 0, 2, 5 und 7 erfolgte die Messung der αEβ7-Expression mittels Durchflusszytometrie. Zur FACS-Analyse wurde ein FITC-konjugierter anti-αEmAk verwendet. Da aber an der Zelloberfläche die αE-Kette ausschließlich mit der β7-Kette ein Heterodimer bildet, wird in dieser Arbeit hinsichtlich der Oberflächenexpression von αE die Nomenklatur αEβ7 verwendet. Vor Stimulationsbeginn (Tag 0) exprimierten 1,50% der humanen CD4+ T-Lymphozyten das Integrin αEβ7. Bei unstimulierten Zellen blieb sowohl nach negativer (Abb. 5.1A) als auch nach positiver Selektion (Abb.5.1B) die αEβ7-Expression während des Beobachtungszeitraums unverändert. Wurden die Zellen mit anti-CD3mAk stimuliert, hatte die angewandte Selektionsmethode Einfluss auf die Expression von αEβ7. Während bei negativ selektierten Zellen in Gegenwart von anti-CD3mAk eine signifikante 2,8-fache Zunahme der Expression des Integrins αEβ7 Ergebnisse 33 auf 4,03% an Tag 7 zu beobachten war (Abb. 5.1A), zeigte sich bei positiv selektierten Zellen eine 4,8-fache Zunahme auf 7,42% an Tag 7 (Abb. 5.1B) (jeweils: p<0,05). Zusätzliche Inkubation mit TGF-β1 führte zu einer weiteren Steigerung der αEβ7-Expression gegenüber nur mit anti-CD3mAk stimulierten Zellen. Nach negativer Selektion nahm der Anteil αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten bis Tag 7 um das 6,9-fache (Tag 7: 10,11% der CD4+ T-Zellen), nach positiver Selektion um das 21,9-fache zu (Tag 7: 33,78% der CD4+ T-Zellen) (jeweils: p<0,05). B Kontrolle α- CD3 α- CD3+TGF-β1 30 40 Kontrolle α-CD3 α-CD3+TGF-β1 30 a, b, c a, b, c + 20 + + α Eβ 7 CD4 T-Lymphozyten (%) 40 + α Eβ 7 CD4 T-Lymphozyten (%) A a, c 10 a, c a 20 10 a, b a, b 0 0 0 2 5 7 Zeit (Tage) 0 2 5 7 Zeit (Tage) Abb. 5.1: αEβ7-Oberflächenexpression auf humanen CD4+ T-Lymphozyten in Abhängigkeit von der Selektionsmethode. Negativ selektierte (A) und positiv selektierte CD4+ T-Lymphozyten (B) wurden mit anti-CD3mAk (1 µg/ml) bzw. mit anti-CD3mAk (1 µg/ml) und TGF-β1 (10 ng/ml) inkubiert. An Tag 2 wurde IL-2 (40 ng/ml) zugegeben. Die Messung der αEβ7-Expression an den Tagen 0, 2, 5 und 7 erfolgte mittels Durchflusszytometrie. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM aus 7 voneinander unabhängigen Experimenten. (a) p<0,05 im Vergleich zur Kontrolle; (b) p<0,05 im Vergleich zu negativ selektierten CD4+ T-Lymphozyten; (c) p<0,05 im Vergleich zu nur mit anti-CD3mAk inkubierten CD4+ T-Lymphozyten. Neben dem kostimulierenden Effekt auf die αEβ7-Expression der CD4+ T-Lymphozyten steigerte CD4-Engagement auch die Expression der anderen untersuchten Oberflächenantigene (CD25, CD69, CD95, CD45RO) (eigene Beobachtungen). Hierauf wird in Kapitel 5.1.2 eingegangen, wenn die Koexpression von αEβ7 mit diesen Oberflächemarkern nach negativer und nach positiver Selektion dargestellt wird. 5.1.1.1 Einfluss von CD4-Engagement auf die Zytokin-Synthese von CD4+ T-Lymphozyten Ferner sollte untersucht werden ob CD4-Engagement, neben dem Phänotyp, auch die Zytokin-Synthese von CD4+ T-Lymphozyten beeinflusst. Dies erfolgte auf dem Niveau der mRNA-Expression. Nach negativer bzw. positiver Selektion der CD4+ T-Zellen wurden die Zellen für 4 Stunden bzw. 24 Stunden mit anti-CD3mAK bzw. mit anti-CD3mAK und Ergebnisse 34 TGF-β1 inkubiert. Anschließend erfolgte der Nachweis der IL-2-, IL-4- bzw. IFN-γ-mRNAExpression mittels RT-PCR, die in Relation zur Expression von Cyclophilin gesetzt wurde, um den Einfluss unterschiedlicher mRNA-Mengen auszugleichen. IFN-γ- und IL-2-mRNA-Expression Engagement des CD4-Antigens durch mit anti-CD4mAk besetzte “Beads” zeigte bei der Kontrolle keinen Effekt auf die IFN-γ- bzw. auf die IL-2-mRNA-Synthese humaner CD4+ T-Zellen (Abb. 5.2). Jedoch steigerte die Ligation von “Beads” an den CD4-Rezeptor bei Aktivierung der Zellen mit anti-CD3mAk bzw. mit anti-CD3mAk und TGF-β1 die Expression von IFN-γ- und IL-2-mRNA. Positiv selektierte mit anti-CD3mAk-stimulierte Zellen synthetisierten nach 4 Stunden 1,2-fach bzw. nach 24 Stunden 1,86-fach mehr IFN-γmRNA als negativ selektierte mit anti-CD3mAk stimulierte Zellen (Abb. 5.2A, 5.2C) (jeweils: p<0,05). Die IL-2-mRNA-Synthese wurde durch CD4-Engagement deutlicher als die IFN-γ-mRNA-Synthese beeinflusst. Positive Selektion der Zellen und Stimulation mit anti-CD3mAk führte nach 4 Stunden zu einer 2,25-fachen und nach 24 Stunden zu einer 6,08-fachen Erhöhung der IL-2-Synthese gegenüber negativ selektierten mit anti-CD3mAk stimulierten Zellen (Abb. 5.2B, 5.2C). Zusätzliche Inkubation mit TGF-β1 zeigte keinen Effekt auf die IFN-γ-mRNA-Synthese, reduzierte aber die IL-2-Synthese nach 4 Stunden bei positiv selektierten Zellen um 11,36% und bei negativ selektierten Zellen um 26,25%. Nach 24 Stunden war die IL-2-mRNAExpression bei positiv selektierten und zusätzlich mit TGF-β1-inkubierten Zellen um 42,31% und bei negativ selektierten Zellen um 70,91% vermindert im Vergleich zu Zellen, die nur mit anti-CD3mAk inkubiert wurden. Ergebnisse 35 A IFN-γ/ Cyclophilin Quotient 0,6 Nach positiver Selektion Nach negativer Selektion b a b a 0,4 a a b a b a 0,2 a a 0,0 B (b) (a) IL-2/Cyclophilin Quotient 0,6 (b) (a) 0,4 (a) (a) 0,2 0,0 α-CD3 - - + + - + + TGF-β1 - - - + - - + 0h 4h 24 h C Cyclophilin IFN-γ IL-2 α-CD3 - - + + - + + - - + + - + + TGF-β1 - - - + - - + - - - + - - 0h 4h 24 h Nach positiver Selektion 0h 4h + 24 h Nach negativer Selektion Abb. 5.2: IFN-γ- und IL-2-mRNA-Expression in CD4+ T-Lymphozyten in Abhängigkeit von der Selektionsmethode. Negativ selektierte und positiv selektierte CD4+ T-Lymphozyten wurden mit anti-CD3mAk (1 µg/ml) bzw. mit anti-CD3mAk (1 µg/ml) und TGF-β1 (10 ng/ml) über 4 Stunden bzw. 24 Stunden inkubiert. Der Nachweis der IFN-γ- (A) und IL-2-mRNA-Expression (B) erfolgte mittels RT-PCR. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM (A, B) und ein repräsentatives Experiment (C) aus 6 (A) bzw. 4 (B) voneinander unabhängigen Experimenten. (a) Vergleich zur Kontrolle; (b) Vergleich zu negativ selektierten CD4+ T-Lymphozyten; ohne Klammern: p<0,05; in Klammern: p<0,1. Ergebnisse 36 IL-4-mRNA-Expression Unstimulierte CD4+ T-Lymphozyten synthetisierten weder nach negativer noch nach positiver Selektion IL-4-mRNA (Abb. 5.3A, 5.3B). Durch die Ligation von “Beads” an den CD4-Rezeptor stieg bei Aktivierung der Zellen mittels anti-CD3mAk die IL-4-mRNAExpression nach 4 Stunden auf das 2,53-fache und nach 24 Stunden auf das 6,96-fache verglichen mit negativ selektierten mit anti-CD3mAk stimulierten Zellen (jeweils: p<0,5). Zusätzliche Inkubation mit TGF-β1 verminderte die IL-4-Synthese bei positiv selektierten Zellen nach 4h um 7,55% und nach 24 Stunden um 27,43% verglichen mit nur mit antiCD3mAk inkubierten Zellen. Nach negativer Selektion reduzierte die Zugabe von TGF-β1 zu mit anti-CD3mAk-stimulierten Zellen die IL-4-mRNA-Expression nach 4 Stunden um 23,16%. A b a IL-4/Cyclophilin Quotient 0,6 Nach positiver Selektion Nach negativer Selektion b a 0,4 a a 0,2 b a b a 0,0 α-CD3 - - + + - + + TGF-β1 - - - + - - + 0h 4h 24 h B Cyclophilin IL-4 α-CD3 TGF-β1 - - + + - + + - - + + - + + - - - + - - + - - - + - - 0h 4h 24 h Nach positiver Selektion 0h 4h + 24 h Nach negativer Selektion Abb. 5.3: IL-4-mRNA-Expression in CD4+ T-Zellen in Abhängigkeit von der Selektionsmethode. Negativ selektierte und positiv selektierte CD4+ T-Lymphozyten wurden mit anti-CD3mAk (1µg/ml) bzw. mit anti-CD3mAk (1µg/ml) und TGF-β1 (10 ng/ml) über 4 Stunden bzw. 24 Stunden inkubiert und die IL-4-mRNA-Expression mittels RT-PCR bestimmt. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM (A) und ein repräsentatives Experiment (B) aus 6 voneinander unabhängigen Experimenten. (a) p<0,05 im Vergleich zur Kontrolle; (b) p<0,05 im Vergleich zu negativ selektierten CD4+ T-Lymphozyten. Ergebnisse 37 5.1.2 Einfluss von CD4-Engagement auf den Phänotyp von αEβ7+ CD4+ T-Zellen und αEβ7- CD4+ T-Zellen Durch den kostimulierenden Effekt der CD4-Ligation auf die nachfolgende TZR-Stimulation erlaubte es die Anwendung beider Separationsmethoden den Aktivierungsstatus und den Phänotyp von αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten und αEβ7- CD4+ T-Lymphozyten detaillierter zu betrachten. Zum einen war es nach negativer Selektion der Zellen möglich, den Effekt einer geringen Aktivierung zu untersuchen, zum anderen ließ sich bei positiv selektierten Zellen der Effekt einer stärkeren Stimulation messen. Zunächst wurden aus dem peripheren Blut die PBMC mittels Ficoll-Zentrifugation isoliert und hieraus die eine Hälfte der CD4+ T-Lymphozyten positiv, die andere Hälfte negativ selektiert. Anschließend erfolgte die Inkubation der Zellen mit anti-CD3mAk bzw. anti-CD3mAk und TGF-β1. Zur Analyse des Aktivierungsstatus und des Phänotyps wurde die Koexpression von αE β 7 mit Aktivierungsmarkern, CD45RO und CD62L an den Tagen 0, 2, 5 und 7 mittels Durchflusszytometrie gemessen. CD25-, CD69- und CD95-Oberflächenxpression Durch das zusätzliche CD4-Engagement erhöhte sich bei CD4+ T-Lymphozyten neben der αEβ7-Expression auch die Expression der Oberflächemarker CD25, CD69, CD95 und CD45RO. In diesem Kapitel ist die Koexpression von αEβ7 mit den Antigenen CD25, CD69 und CD95 nach negativer bzw. nach positiver Selektion und Inkubation der Zellen mit antiCD3mAk und TGF-β1 dargestellt. Die Oberflächenexpression von CD25, CD69 und CD95 war unabhängig von der angewandten Selektionsmethode vor Stimulationsbeginn (Tag 0) bei αEβ7+ CD4+ T-Zellen signifikant höher als bei αEβ7- CD4+ T-Lymphozyten (jeweils: p<0,05) (Seite 40, Abb. 5.6A, 5.6B). Während CD4+ T-Lymphozyten, die nach negativer Selektion an Tag 7 αEβ7 exprimierten, zu 68,18% CD25+ waren, blieb bei αEβ7- CD4+ T-Zellen die CD25-Expression unverändert (Seite 39, Abb. 5.4B). Darüber hinaus exprimierten im beobachteten Zeitraum negativ selektierte αEβ7+ Zellen signifikant vermehrt CD69 (Seite 39, Abb. 5.4C; Seite 40, Abb. 5.6A:) und CD95 (Seite 39, Abb. 5.4D; Seite 40, Abb. 5.6A) verglichen mit αEβ7- Zellen (jeweils: p<0,05). Ergebnisse A 38 B _CD3+TGF-b.026 C _CD3+TGF-b.027 17,69% 11,20% 3,44% 100 101 102 103 IgG1 PE 104 100 101 102 103 CD103 PE D _CD3+TGF-b.030 31,77% 8,08% 6,12% 100 104 101 102 103 CD103 PE _CD3+TGF-b.031 68,10% 13,68% 104 100 18,19% 0,02% 101 102 103 CD103 PE 104 Abb. 5.4: Koexpression von αEβ7 mit CD25, CD69 bzw. CD95 auf negativ selektierten CD4+ T-Lymphozyten. Negativ selektierte CD4+ T-Lymphozyten wurden mit anti-CD3mAk (1µg/ml) und TGF-β1 (10 ng/ml) inkubiert. An Tag 2 wurde IL-2 (40 pg/ml) zugegeben. An Tag 7 erfolgte die Messung der Koexpression von αEβ7 mit den Oberflächenantigenen CD25 (B), CD69 (C) bzw. CD95 (D) mittels Durchflusszytometrie; Antikörperkontrolle (A). Dargestellt sind FACS-DOT-Plots eines repräsentativen Experimentes aus 7 voneinander unabhängigen Experimenten. Sowohl positiv selektierte αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten als auch αEβ7- CD4+ T-Lymphozyten steigerten die CD25- und die CD95-Expression innerhalb von 7 Tagen (Seite 40, Abb. 5.6B). Allerdings wurde das Maximum der Expression bei αEβ7+ CD4+ T-Lymphyozyten früher (Tag 2) erreicht als bei αEβ7- CD4+ T-Lymphozyten (Tag 7) (Abb. 5.5B, 5.5D). Darüber hinaus war der Anteil CD69-exprimierender Zellen an Tag 2 war bei αEβ7+ Zellen (89,55%) signifikant größer als bei αEβ7- Zellen (65,92%) (Seite 39, Abb. 5.5C; Seite 40, Abb. 5.4B) (p<0,05%). A B _CD3+TGF-b.026 C _CD3+TGF-b.027 55,56% 9,19% _CD3+TGF-b.030 77,42 % 0,37% 100 101 102 103 IgG1 PE 104 100 101 102 103 CD103 PE 104 D 10,10% _CD3+TGF-b.031 84,24% 0,60 % 100 101 102 103 CD103 PE 104 9,52% 0,02% 100 101 102 103 CD103 PE 104 Abb. 5.5: Koexpression von αEβ7 mit CD25, CD69 bzw. CD95 auf positiv selektierten CD4+ T-Lymphozyten. Positiv selektierte CD4+ T-Lymphozyten wurden mit anti-CD3mAk und TGFβ1 inkubiert. An Tag 2 erfolgte die Messung der Koexpression von αEβ7 mit den Oberflächenantigenen CD25 (B), CD69 (C) bzw. CD95 (D) mittels Durchflusszytometrie; Antikörperkontrolle (A). Dargestellt sind FACS-DOT-Plots eines repräsentativen Experimentes aus 7 voneinander unabhängigen Experimenten. Ergebnisse 39 Nach negativer Selektion 100 B αEβ7+ Zellen αEβ7- Zellen 80 60 a, b a, b a, b a 40 20 CD25+CD4+ T-Lymphozyten (%) CD25+ CD4+ T-Lymphozyten (%) A Nach positiver Selektion 0 100 80 2 5 b 40 a 20 7 αEβ7+ Zellen αEβ7- Zellen 0 2 a, b a, b a, b b b b 20 a CD69+CD4+ T-Lymphozyten (%) CD69+CD4+ T-Lymphozyten (%) 100 40 0 7 a, b 80 b 60 b 40 b b b 20 0 0 2 5 7 0 2 Zeit (Tage) a a a 80 b b 60 5 7 Zeit (Tage) a b 40 20 100 CD95+CD4+ T-Lymphozyten (%) CD95+CD4+ T-Lymphozyten (%) 5 Zeit (Tage) 100 60 b 60 Zeit (Tage) 80 a, b b 0 0 100 a, b a, b a 80 a a b b b 60 40 20 0 0 0 2 5 Zeit (Tage) 7 0 2 5 7 Zeit (Tage) Abb. 5.6: Oberflächenexpression von CD25, CD69 bzw. CD95 auf αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten und αEβ7- CD4+ T-Lymphozyten in Abhängigkeit von der Selektionsmethode. Negativ selektierte (A) und positiv selektierte CD4+ T-Lymphozyten (B) wurden mit anti-CD3mAk (1 µg/ml) und TGF-β1 (10 ng/ml) inkubiert. An Tag 2 wurde IL-2 (40 ng/ml) zugegeben. Die Messung der Koexpression von αEβ7 mit den Oberflächenantigenen CD25, CD69 bzw. CD95 an den Tagen 0, 2, 5 und 7 erfolgte mittels Durchflusszytometrie. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM aus 7 voneinander unabhängigen Experimenten. (a) p<0,05 im Vergleich zu αEβ7- CD4+ T-Lymphozyten; (b) p<0,05 im Vergleich zur Kontrolle an Tag 0. Ergebnisse 40 CD45RO-Oberflächenexpression 83,5% der αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten exprimierten im Beobachtungszeitraum unabhängig von der angewandten Selektionsmethode CD45RO (Abb. 5.7A, 5.7B). Im Gegensatz dazu hatte bei αEβ7- CD4+ T-Zellen die Selektionsmethode Einfluss auf die CD45RO-Expression. Nach negativer Selektion war keine signifikante Veränderung des Anteils CD45RO+ Zellen innerhalb der αEβ7- CD4+ T-Lymphozyten-Population zu beobachten (Tag 0: 45,30%; Tag 7: 49,16%) (Abb. 5.7A). Bei positiv selektierten αEβ7- Zellen hingegen erhöhte sich die CD45RO-Expression ab Tag 2 von 47,62% auf 74,29% an Tag 7 (Abb. 5.7B) (p<0,05). Nach negativer Selektion A _CD3+TGF-b.028 47,82% Nach positiver Selektion B _CD3+TGF-b.028 1,96% 40,09% 13,66% 0,41% 100 101 102 103 CD103 PE 100 101 102 103 CD103 PE Tag 2 a a 40 αEβ7+ Zellen αEβ7- Zellen 0 101 102 103 CD103 PE 2 Zeit (Tage) 80 a 100 101 102 103 CD103 PE 7 104 Tag 7 a a b a b 60 40 20 αEβ7+ Zellen αEβ7- Zellen 0 5 5,51% 104 100 a 60 0 35,09% Tag 2 80 20 100 Tag 7 a 44,19% 1,25% 104 CD45RO+CD4+ T-Lymphozyten (%) CD45RO+CD4+ T-Lymphozyten (%) 100 8,45% 1,84% 104 _CD3+TGF-b.020 _CD3+TGF-b.028 59,69% 0 2 5 7 Zeit (Tage) Abb. 5.7: CD45RO-Oberflächenexpression auf αEβ7+ CD4+ T-Zellen und αEβ7+ CD4+ T-Zellen in Abhängigkeit von der Selektionsmethode. Negativ selektierte (A) und positiv selektierte CD4+ T-Zellen (B) wurden mit anti-CD3mAk (1 µg/ml) und TGF-β1 inkubiert (10 ng/ml). An Tag 2 wurde IL-2 (40 ng/ml) zugegeben. Die Messung der Koexpression von αEβ7 mit CD45RO an den Tagen 0, 2, 5 und 7 erfolgte mittels Durchflusszytometrie. Dargestellt sind FACS-DOT-Plots eines repräsentativen Experimentes und die Mittelwerte ± SEM aus 7 voneinander unabhängigen Experimenten. (a) p<0,05 im Vergleich zu αEβ7- CD4+ T-Lymphozyten; (b) p<0,05 im Vergleich zur Kontrolle an Tag 0 . Ergebnisse 41 CD62L-Oberflächenexpression Der Anteil CD62L+ Zellen war von Tag 0 bis Tag 2 bei αEβ7- CD4+ T-Lymphozyten unabhängig von der Selektionsmethode signifikant höher als bei αEβ7+ CD4+ T-Zellen (Abb. 5.8) (p<0,05). Im weiteren Verlauf zeigte sich bei αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten eine signifikante Zunahme des Anteils CD62L+ Zellen bis auf das Niveau der CD62L-Expression von αEβ7- CD4+ T-Lymphozyten (p<0,05). Nach negativer Selektion A 0,87% 71,16% 13,5% 101 102 103 CD103 PE 100 104 101 102 103 CD103 PE Tag 2 4,84% 55,10% 31,49% 3,24% 104 100 101 102 103 CD103 PE Tag 7 4,93% 104 100 101 102 103 CD103 PE Tag 2 104 Tag 7 100 a, b 80 a, b b a 60 b b 40 20 αEβ7+ Zellen αEβ7- Zellen 0 0 2 a 80 7 a b 60 b 40 20 αEβ7+ Zellen αEβ7- Zellen 0 5 Zeit (Tage) CD62L+CD4+ T-Lymphozyten (%) 100 CD62L+CD4+ T-Lymphozyten (%) _CD3+TGF-b.029 _CD3+TGF-b.029 79,43% 4,41% 1,01% 100 B _CD3+TGF-b.029 _CD3+TGF-b.029 71,96% Nach positiver Selektion 0 2 5 7 Zeit (Tage) Abb.5.8: CD62L-Oberflächenexpression auf αEβ7+ CD4+ T-Zellen und αEβ7- CD4+ T-Zellen in Abhängigkeit von der Selektionsmethode. Negativ selektierte (A) und positiv selektierte CD4+ T-Zellen (B) wurden mit anti-CD3mAk (1 µg/ml) und TGF-β1 (10 ng/ml) inkubiert. An Tag 2 wurde IL-2 (40 ng/ml) zugegeben. Die Messung der Koexpression von αEβ7 mit CD62L an den Tagen 0, 2, 5 und 7 erfolgte mittels Durchflusszytometrie. Dargestellt sind FACS-DOT-Plots eines repräsentativen Experimentes und die Mittelwerte ± SEM aus 7 voneinander unabhängigen Experimenten. (a) p<0,05 im Vergleich zu αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten; (b) p<0,05 im Vergleich zur Kontrolle an Tag 0. Ergebnisse 42 5.2 PROLIFERATION VON αEβ7+ CD4+ T-LYMPHOZYTEN In diesem Ansatz sollte untersucht werden ob die erhöhte Aktivierungsmarker-Expression von αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten mit einer gesteigerten Proliferation korreliert. Die Analyse der Zellproliferation erfolgte durchflusszytometrisch mittels der Messung der Inkorporation des Thymidin-Analogons Bromodeoxyuridin (BrdU). Da sich nach Anwendung der positiven Selektionsmethode eine erhöhte AktivierungsmarkerExpression der Zellen zeigte, wurden für diese Experimente die CD4+ T-Lymphozyten positiv aus dem peripheren Blut isoliert und anschließend für 7 Tage mit anti-CD3mAk und TGF-β1 inkubiert. Bei αEβ7- CD4+ T-Lymphozyten war eine signifikante 8,52-fache Zunahme der BrdUAufnahme von 0,95% auf 7,10% an Tag 7 zu verzeichnen (Abb. 5.9A, 5.9C) (p<0,05). Im Gegensatz dazu steigerten αEβ7+ Zellen die BrdU-Inkorporation 17,11-fach von 2,54% auf 43,46% an Tag 7 (Abb. 5.9B, 5.9C) (p<0,05). An Tag 7 war die BrdU-Aufnahme bei αEβ7+ Zellen 6,12-fach höher als bei αEβ7- Zellen (p<0,05). Ergebnisse 43 A B 100 101 102 103 BrdU FITC 104 100 BrdU+ CD4+ T-Lymphozyten (%) αEβ7+ Zellen αEβ7- Zellen 50 40 104 αEβ7+ Zellen αEβ7- Zellen C 101 102 103 BrdU FITC a, b a, b 30 20 a, b 10 b b 5 7 0 0 2 Zeit (Tage) Abb. 5.9: Proliferation von αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten und αEβ7- CD4+ T-Lymphozyten. Positiv selektierte CD4+ T-Lymphozyten wurden mit anti-CD3mAk (1µg/ml) und TGF-β1 (10 ng/ml) inkubiert An Tag 2 wurde IL-2 (40 ng/ml) zugegeben. Die Messung der Zellproliferation erfolgte durchflusszytometrisch an den Tagen 0, 2, 5 und 7 mittels der BrdU-Aufnahme. Dargestellt sind die Histogramme eines repräsentativen Experimentes an Tag 7 (A, B) und die Mittelwerte ± SEM (C) aus 7 voneinander unabhängigen Experimenten. (a) p<0,05 im Vergleich zu αEβ7- CD4+ T-Lymphozyten, (b) p<0,05 im Vergleich zur Kontrolle an Tag 0. Ergebnisse 44 5.3 MOLEKULARE CHARAKTERISIERUNG VON αEβ7+ CD4+ T-LYMPHOZYTEN Phosphoinositid 3-Kinasen (PI3K) werden in murinen und in humanen T-Lymphozyten nach TZR-Stimulation aktiviert (Harriague und Bismuth 2002) und sind beteiligt an der Proliferation und der Differenzierung von T-Lymphozyten im Thymus (Rodriguez-Borlado et al. 2003). Durch ihre wichtige Rolle bei der Proliferation und der Viabilität sind PI3K ein potentielles Zielmolekül für die Entwicklung von Medikamenten wie Chemotherapeutika und Immunsupressiva (Drees et al. 2004, Wetzker und Rommel 2004). In der vorliegenden Arbeit war es das Ziel zu überprüfen, ob PI3K an der anti-CD3mAk und TGF-β1-induzierten Differenzierung von CD4+ T-Lymphozyten zu αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten sowie an deren Funktion und Proliferation beteiligt sind. Man kann die Klasse I der PI3K weiter in 2 Gruppen unterteilen, in die Klasse 1A und 1B (Kap. 2.4.2.1). LY294002 ist ein spezifischer Inhibitor sowohl der Tyrosinkinase-assoziierten Isoformen der PI3K der Klasse 1A, als auch der GPCR-assoziierten PI3Kγ (Klasse 1B). In Vorversuchen konnte ein konzentrationsabhängiger Effekt von LY294002, auf die anti-CD3mAk-induzierte Expression von CD25, CD69 und CD95 von CD4+ T-Lymphozyten beobachtet werden. Eine deutliche Hemmung der Oberflächenexpression von CD25, CD69 und CD95 zeigte sich bei einer Konzentration von 20 µM LY294002. Somit wurden 20 µM des selektiven PI3K-Inhibitors in den durchgeführten Experimenten zugegeben. 5.3.1 Einfluss von LY294002 auf die αEβ7-Expression von CD4+ T-Lymphozyten Für diese Experimente wurden positiv selektierte humane CD4+ T-Lymphozyten mit anti-CD3mAk, TGF-β1 und zum Teil parallel mit PI3K-Inhibitor LY294002 inkubiert und die αE-mRNA-Expression mittels RT-PCR und die αEβ7-Oberflächenexpression mittels Durchflusszytometrie an den angegebnen Zeitpunkten bestimmt. Ergebnisse 45 αE-mRNA-Expression Vor und 4 Stunden nach Stimulationsbeginn war in unstimulierten Zellen kaum αE-mRNA nachweisbar (Abb. 5.10A). Bei Stimulation der humanen CD4+ T-Lymphozyten mit anti-CD3mAk und TGF-β1 exprimierten diese nach 4 Stunden 1,65-fach bzw. 1,8-fach mehr αE-mRNA als die Kontrolle bzw. als mit anti-CD3mAk stimulierte Zellen (Abb. 5.10A, 5.10C). Bis 24 Stunden nach Stimulationsbeginn verdoppelte sich der αE-mRNA-Gehalt mit anti-CD3mAk und TGF-β1-inkubierter CD4+ T-Lymphozyten und war somit 1,2-fach bzw. 1,43-fach höher als der unstimulierter bzw. mit anti-CD3mAk-inkubierter Zellen (Abb. 5.10A, 5.10C). Von 24 Stunden bis 92 Stunden nach Stimulationsbeginn nahm die αEmRNA-Menge in unstimulierten Zellen um 25,61% ab, während in mit anti-CD3mAk- bzw. mit anti-CD3mAk und TGF-β1-inkubierten Zellen nahezu keine Veränderung der αE-mRNAExpression zu messen war (Abb. 5.10B). Die Gegenwart von LY294002 führte zu einer Verminderung der αE-mRNA-Synthese unabhängig von der Stimulation. Ergebnisse 46 A 0,8 ohne LY mit LY (a) α E/Cyclophilin Quotient 0,6 (a) (a) 0,4 0,2 0,0 α-CD3 - - + + - + + TGF-β1 - - - + - - + 0h B 4h 24 h α E/Cyclophilin Quotient 0,8 0,6 (b) (a) (b) (a) (a) (a) (a) (a) 0,4 0,2 0,0 α-CD3 - + + - + + TGF-β1 - - + - - + 48 h 72 h C Cyclophilin αE α-CD3 - - + + - + + - + + - + + TGF-β1 - - - + - - + - - + - - + LY294002 - - - - + + + - - - + + + 0h 4h 72 h Abb. 5.10: Einfluss von LY294002 auf die αE-mRNA-Expression in CD4+ T-Lymphozyten. Positiv selektierte CD4+ T-Lymphozyten wurden mit anti-CD3mAk (1µg/ml) bzw. mit anti-CD3mAk (1µg/ml) und TGF-β1 (10 ng/ml) und zum Teil mit LY294002 (20 µM) inkubiert. An Tag 2 wurde IL-2 (40 ng/ml) zugegeben. Der Nachweis der αE-mRNA-Expression nach 0 h, 4 h und 24 h (A); 48 h und 72 h (B) erfolgte mittels RT-PCR. Diese wurde in Relation zu Cyclophilin gesetzt. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM (A, B) und ein repräsentatives Experiment (C) aus 4 voneinander unabhängigen Experimenten. (a) p<0,1 verglichen mit Zellen, die mit LY294002 inkubiert wurden; (b) p<0,1 im Vergleich zur Kontrolle bzw. mit anti-CD3mAk inkubierten Zellen. Ergebnisse 47 αEβ7-Oberflächenexpression Unstimulierte CD4+ T-Lymphozyten zeigten während 7 Tagen keine Veränderung der αEβ7-Oberflächenexpression. Inkubation mit anti-CD3mAk und TGF-β1 steigerte den Anteil αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten auf 32,85% an Tag 7 signifikant (Abb. 5.11A) (p<0,05). Zusätzliche Inkubation mit dem PI3K-Inhihibtor LY294002 (20 µM) ab dem Zeitpunkt der Stimulation (Tag 0) inhibierte die anti-CD3mAk und TGF-β1-induzierte αEβ7-Expression auf den CD4+ T-Lymphozyten vollständig (Abb. 5.11B). Auch die Präinkubation der Zellen mit anti-CD3mAk und TGF-β1 und die Zugabe von LY294002 nach 24 Stunden führte zu einer Hemmung der αEβ7-Oberflächenexpression (Abb. 5.11B). Die Bindung von LY294002 an die PI3K ist nicht kovalent. Folglich ist die Inhibierung der PI3K durch LY294002 reversibel. Zur Beurteilung ob ein unspezifischer toxischer Effekt von LY294002 oder eine Inhibierung der PI3K vorlag, wurden die Zellen nach der Präinkubation über 24 Stunden mit anti-CD3mAk, TGF-β1 und LY294002 (20 µM) gewaschen und anschließend mit anti-CD3mAk und TGF-β1 restimuliert. Dabei stieg der Anteil αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten verzögert ab Tag 5 kontinuierlich an und erreichte 26,00% an Tag 7 (Tag 2: 1,63%; p<0,05). Ergebnisse 48 A 100 101 102 103 CD103 PE 104 100 101 102 103 CD103 PE Tag 0 104 100 101 102 103 CD103 PE Tag 2 100 104 101 102 103 CD103 PE Tag 5 104 Tag 7 IgG Kontrolle α-CD3 + TGF-β1 α-CD3 + TGF-β1 + LY C Kontrolle α- CD3+TGF-β1 30 a, b Ink mit LY über 7 d Präink. mit α- CD3 und TGF-β1 Präink. mit LY a, b 30 + 20 + + 40 a, b α Eβ7 CD4 T-Lymphozyten (%) 40 + α Eβ7 CD4 T-Lymphozyten (%) B 10 0 20 10 a, b 0 0 2 5 Zeit (Tage) 7 0 2 5 7 Zeit (Tage) Abb. 5.11:. Einfluss von LY294002 auf die von αEβ7−Oberflächenexpression auf humanen CD4+ T-Lymphozyten. Positiv selektierte CD4+ T-Lymphozyten wurden mit anti-CD3mAk (1µg/ml), TGF-β1 (10 ng/ml) und zum Teil parallel mit LY294002 (20 µM) inkubiert. Bei einem Ansatz wurden die mit anti-CD3mAk, TGF-β1 und LY294002 präinkubierten Zellen nach 24 Stunden gewaschen und anschließend mit anti-CD3mAk und TGF-β1 reinkubiert. Bei einem weiteren Ansatz wurde LY294002 nach 24 Stunden zu mit anti-CD3mAk und TGF-β1-inkubierten Zellen gegeben. An Tag 2 wurde IL-2 (40 ng/ml) gegeben. Die Messung der αEβ7-Oberflächen-Expression an den Tagen 0, 2, 5 und 7 erfolgte mittels Durchflusszytometrie. Dargestellt sind FACS-DOT-Plots eines repräsentativen Experimentes (A) und die Mittelwerte ± SEM aus 7 voneinander unabhängigen Experimenten (B, C). Kontrolle und Inkubation mit anti-CD3mAk und TGFβ1 (B); Inkubation mit anti-CD3mAk, TGFβ1 und LY294002 (C). (a) p<0,05 im Vergleich zur Kontrolle; (b) p<0,05 verglichen mit Zellen, die über 7 Tage mit LY294002 inkubiert wurden. Ergebnisse 49 5.3.2 Einfluss von LY294002 auf die Aktivierung Im vorausgegangenen Abschnitt konnte gezeigt werden, dass die PI3K eine wichtige Funktion übernehmen bei der anti-CD3mAk und TGF-β1-induzierten αEβ7-Expression auf humanen CD4+ T-Lymphozyten. In den folgenden Experimenten sollte untersucht werden, ob die PI3K auch an der Aktivierung der CD4+ T-Lymphozyten beteiligt sind. Da die Gegenwart von TGF-β1 notwendig ist zur Induktion von αEβ7 auf CD4+ T-Lymphozyten, wurde zusätzlich zur anti-CD3mAk-Stimulation TGF-β1 zugegeben. Zunächst wurden die positiv selektierten CD4+ T-Lymphozyten mit anti-CD3mAk, bzw. mit anti-CD3mAk und TGF-β1 stimuliert und zum Teil zusätzlich mit 20 µM LY294002 inkubiert. Die Aktivierung von Zellen äußert sich u. a. durch zunehmende Größe und Granularität. Beides lässt sich durchflusszytometrisch nachweisen. Die Größe ist in der Vorwärtsstreuung und die Granularität in der Seitwärtsstreuung beurteilbar (Kap. 4.2.3). Bei der Kontrolle war im beobachteten Zeitraum keine Veränderung der Größe und der Granularität feststellbar (Abb. 5.12A-D). Im Gegensatz hierzu führte Stimulation mit anti-CD3mAK und TGF-β1 ab Tag 2 zu einer Größenzunahme der Zellen (Abb. 5.12E-G). Die Gegenwart von LY294002 hemmte diese durch anti-CD3mAK und TGF-β1-induzierte Größenzunahme (Abb. 5.12K-M). Wurde LY294002 nach 24 Stunden ausgewaschen und die Zellen anschließend mit anti-CD3mAk und TGF-β1 reinkubiert war bis Tag 2 keine Aktivierung der Zellen zu erkennen (Abb. 5.12H), während ab Tag 5 die Größe der CD4+ T-Lymphozyten zunahm (Abb. 5.12I, Abb. 5.12J). Ergebnisse A 50 B NIL.001 0 NIL.001 0 50 100 150 200 250 FSC-Height E 50 100 150 200 250 FSC-Height _CD3+TGF-b.017 0 H K 0 Tag 0 F I 50 100 150 200 250 FSC-Height Tag 2 L 0 G 50 100 150 200 250 FSC-Height Tag 5 50 100 150 200 250 FSC-Height _CD3+TGF-b.017 0 50 100 150 200 250 FSC-Height J _CD3+TGF-b+Ly n. 24h ausgew.161 50 100 150 200 250 FSC-Height _CD3+TGF-b+Ly.041 NIL.001 0 50 100 150 200 250 FSC-Height _CD3+TGF-b+Ly n. 24h ausgew.161 0 D 50 100 150 200 250 FSC-Height _CD3+TGF-b.017 0 50 100 150 200 250 FSC-Height _CD3+TGF-b+Ly.041 NIL.001 0 50 100 150 200 250 FSC-Height _CD3+TGF-b+Ly n.24h ausgew.161 0 C 0 M 50 100 150 200 250 FSC-Height _CD3+TGF-b+Ly.041 0 50 100 150 200 250 FSC-Height Tag 7 Abb. 5.12: Einfluss von LY294002 auf die Aktivierung von CD4+ T-Lymphozyten. Positiv selektierte CD4+ T-Lymphozyten wurden mit anti-CD3mAk (1µg/ml), TGF-β1 (10 ng/ml) und zum Teil mit LY294002 (20 µM) inkubiert. An Tag 2 wurde IL-2 (40 ng/ml) zugegeben. Die Messung der Granularität und Größe an den Tagen 0, 2, 5 und 7 erfolgte mittels Durchflusszytometrie. Dargestellt sind FACS-DOT-plots eines repräsentativen Experimentes aus 7 voneinander unabhängigen Experimenten. (A-D) Unstimulierte Zellen; (E-G) Inkubation mit anti-CD3mAk und TGF-β1; (H-J) Inkubation mit anti-CD3mAk, TGF-β1 und LY294002, Auswaschen von LY294002 nach 24 Stunden und Reinkubation der Zellen mit anti-CD3mAk und TGF-β1; (K-M) Inkubation mit anti-CD3mAk, TGFβ1 und LY294002. Ergebnisse 51 5.3.3 Einfluss von LY294002 auf den Phänotyp CD25-,CD69- und CD95-Oberflächenxpression Nach Stimulation von CD4+ T-Lymphozyten ändert sich nicht nur die Größe und Granularität, sondern auf den Zellen erhöht sich auch die Expression von verschiedenen Oberflächenantigenen, der sog. Aktivierungsmarker. In dieser Versuchsreihe wurde der Einfluss von LY294002 auf die CD25-, CD69- und CD95-Oberflächenexpression von CD4+ T-Zellen untersucht. Da in Vorversuchen die Gegenwart von TGF-β1 bei TZRStimulation den Phänotyp von CD4+ T-Lymphozyten bis auf die αEβ7-Expression nicht beeinflusste, ist in den folgenden Abbildungen nur der Verlauf der OberflächenantigenExpression der Kontrolle und nach Inkubation der Zellen mit anti-CD3mAk und TGF-β1 dargestellt. Bei unstimulierten CD4+ T-Lymphozyten war keine signifikante Veränderung des Anteils CD25+ und CD69+ Zellen während 7 Tagen nachweisbar (5.13A, 5.13C). Die CD95Expression stieg von 44,50% an Tag 0 auf 58,77% an Tag 7 signifikant an (p<0,05) (Abb. 13E). Inkubation mit anti-CD3mAk und TGF-β1 steigerte den Anteil CD25+ Zellen von 8,96% an Tag 0 auf 82,83% an Tag 7 und den Anteil CD95+ Zellen von 41,17% an Tag 0 auf 92,91% an Tag 7 signifikant (Abb. 5.13A) (jeweils: p<0,05). Das Maximum der CD69Expression wurde an Tag 2 erreicht. Die Anwesenheit von LY294002 bei Inkubation der Zellen mit anti-CD3mAk und TGF-β1 führte zu einer Hemmung der Steigerung der CD25- und der CD95-Expression (Abb. 5.13B). Darüber hinaus wurde das Maximum der CD69-Expression an Tag 2 (22,21%) gegenüber den nur mit anti-CD3mAk und TGF-β1-inkubierten Zellen (60,97%) signifikant abgeschwächt (Abb. 5.13B) (p<0,05). Nach Präinkubation der Zellen mit anti-CD3mAk, TGF-β1 und LY294002, anschließendem Waschen und folgender Restimulation mit anti-CD3mAk und TGF-β1 kam es zu einer verzögerten Expression der untersuchten Oberflächenantigene. An Tag 7 exprimierten 69,66% der Zellen CD25 und 84,06% CD95. Die maximale CD69-Expression war an Tag 5 nachweisbar (61,62%) (Abb. 5.13B). Ergebnisse 52 Die Präinkubation der humanen CD4+ T-Lymphozyten mit anti-CD3mAk und TGF-β1 und die Zugabe von LY294002 nach 24 Stunden führte bis an Tag 2 zu einer Zunahme des Anteils CD25+ (24,66%) und CD95+ Zellen (61,94%) (Abb. 5.13B) (jeweils: p<0,05). Im weiteren Verlauf zeigte sich bis an Tag 7 keine weitere Steigerung der Expression der beiden Oberflächenantigene. Der Verlauf der CD69-Expression wurde durch Zugabe von LY294002 nach 24 Stunden nicht beeinflusst (Abb. 5.13B). Ergebnisse 100 B Kontrolle α-CD3+TGF-β1 80 a, b a, b 60 a, b 40 20 CD25+ CD4+ T-Lymphozyten (%) CD25+CD4+ T-Lymphozyten (%) A 53 0 100 Ink. mit LY über 7 d Präink. mit α-CD3 und TGF-β1 Präink. mit LY 80 60 40 a, b a, b 20 0 0 2 5 7 0 2 Zeit (Tage) 7 100 80 a, b 60 a, b 40 a, b 20 CD69+CD4+ T-Lymphozyten (%) CD69+CD4+ T-Lymphozyten (%) 5 Zeit (Tage) 100 0 80 a, b 60 a, b a, b a, b 40 a, b a, b a 20 a 0 0 2 5 7 0 2 Zeit (Tage) 100 5 7 Zeit (Tage) a, b 100 a, b CD95+CD4+ T-Lymphozyten (%) a, b CD95+CD4+ T-Lymphozyten (%) a, b 80 60 40 20 a, b 80 a, b a, b 60 a, b 40 20 0 0 0 2 5 Zeit (Tage) 7 0 2 5 7 Zeit (Tage) Abb. 5.13: Einfluss von LY294002 auf die CD25-, CD69-, und CD95-Oberflächenexpression auf CD4+ T-Lymphozyten. Positiv selektierte CD4+ T-Lymphozyten wurden mit anti-CD3mAk (1µg/ml), TGF-β1 (10 ng/ml) und zum Teil parallel mit LY294002 (20 µM) inkubiert. Bei einem Ansatz wurden die mit anti-CD3mAk, TGF-β1 und LY294002 präinkubierten Zellen nach 24 Stunden gewaschen und anschließend mit anti-CD3mAk und TGF-β1 reinkubiert. Bei einem weiteren Ansatz wurde LY294002 nach 24 Stunden zu mit anti-CD3mAk und TGF-β1 inkubierten Zellen gegeben. An Tag 2 wurde IL-2 (40 ng/ml) zugegeben. Die Messung der Expression der Oberflächenantigene CD25, CD69 bzw. CD95 an den Tagen 0, 2, 5 und 7 erfolgte mittels Durchflusszytometrie. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM aus 7 voneinander unabhängigen Experimenten. Kontrolle und Inkubation mit antiCD3 mAk und TGFβ1 (A); Inkubation mit anti-CD3 mAk, TGFβ1 und LY294002 (B). (a) p<0,05 im Vergleich zur Kontrolle; (b) p<0,05 verglichen mit Zellen, die über 7 Tage mit LY294002 inkubiert wurden. Ergebnisse 54 CD45RO-Oberflächenxpression Bei unstimulierten Zellen veränderte sich die CD45RO-Expression über 7 Tage nicht signifikant (Tag 0: 46,02%; Tag 7: 49,10%). Inkubation mit anti-CD3mAk und TGF-β1 führte zu einer kontinuierlichen Zunahme der CD45RO-exprimierenden Zellen von 46,02% an Tag 0 auf 77,70% an Tag 7 (Abb.5.14A) (p<0,05). Die Gegenwart von LY294002 reduzierte an den Tagen 5 und 7 die CD45RO-Expression gegenüber nur mit anti-CD3mAk und TGF-β1-inkubierten Zellen signifikant (jeweils: p<0,05) (Abb. 5.14B). Nachdem die Zellen mit anti-CD3mAk, TGF-β1 und LY294002 präinkubiert, nach 24 Stunden gewaschen und mit anti-CD3mAk und TGF-β1 reinkubiert wurden, stieg bis Tag 7 die CD45RO-Expression signifikant an (Tag 2: 44,59%; Tag 7: 55,38%; p<0,05) (Abb. 5.14B). 100 B Kontrolle α-CD3+TGF-β1 80 a, b a, b 60 40 20 0 CD45RO+CD4+ T-Lymphozyten (%) CD45RO+ CD4+ T-Lymphozyten (%) A 100 Ink. mit LY über 7 d Präink. mit α- CD3 und TGF-β1 Präink. mit LY 80 a, b 60 40 20 0 0 2 5 Zeit (Tage) 7 0 2 5 7 Zeit (Tage) Abb. 5.14: Einfluss von LY294002 auf die CD45RO-Oberflächenexpression auf CD4+ T-Zellen. Positiv selektierte CD4+ T-Zellen wurden mit anti-CD3mAk (1µg/ml), TGF-β1 (10 ng/ml) und zum Teil parallel mit LY294002 (20 µM) inkubiert. Bei einem Ansatz wurden die mit anti-CD3mAk, TGF-β1 und LY294002 präinkubierten Zellen nach 24 Stunden gewaschen und anschließend mit anti-CD3mAk und TGF-β1 reinkubiert. Bei einem weiteren Ansatz wurde LY294002 nach 24 Stunden zu mit antiCD3mAk und TGF-β1 inkubierten Zellen gegeben. An Tag 2 wurde IL-2 (40 ng/ml) zugegeben. Die Messung der CD45RO-Expression erfolgte an den Tagen 0, 2, 5 und 7 mittels Durchflusszytometrie. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM aus 7 voneinander unabhängigen Experimenten. Kontrolle und Inkubation mit anti-CD3mAk und TGFβ1 (A); Inkubation mit anti-CD3mAk, TGFβ1 und LY294002 (B). (a) p<0,05 im Vergleich zur Kontrolle; (b) p<0,05 verglichen mit Zellen, die über 7 Tage mit LY294002 inkubiert wurden. Ergebnisse 55 5.3.4 Einfluss von LY294002 auf die Funktion Die Funktion von CD4+ T-Lymhozyten besteht in der Synthese von Zytokinen und Zytokinrezeptoren, deren Expression nach anti-CD3mAk und TGF-β1-Inkubation und paralleler Inhibierung der PI3K untersucht werden sollte. Der Nachweis der Zytokin-mRNAExpression erfolgte zu den angegebenen Zeitpunkten mittels RT-PCR. Die Zytokinsynthese auf Protein-Ebene an den Tagen 0, 2, 5 und 7 wurde mittels intrazellulärer Färbung durchflusszytometrisch gemessen. In den Experimenten konnte kein Unterschied hinsichtlich der Zytokinsynthese zwischen αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten und αEβ7- CD4+ T-Lymphozyten gemessen werden. Somit wird im Folgenden die Zytokinsynthese der gesamten CD4+ T-Zell-Population dargestellt. 5.3.4.1 Zytokinrezeptoren- und Zytokinsynthese auf mRNA-Ebene IL-1β-, IL-6-, GM-CSF-, TNF-α-, TNF-R1-, TNF-R2- und IL-6R-mRNA-Expression Vor (0 h) bzw. 24 Stunden nach Stimulationsbeginn der humanen positiv selektierten CD4+ T-Lymphozyten wurde eine RT-PCR mit einem Primer Kit für inflammatorische Zytokine und Zytokinrezeptoren durchgeführt. Während vor der Stimulation TNF-R1- (Abb. 5.15A) und TNF-R2-mRNA (5.15B) deutlich nachweisbar war, wurde IL-1β-mRNA kaum exprimiert (5.15D). Unstimulierte Zellen synthetisierten keine TNF-α-, GM-CSF- und IL-6-mRNA, die auch bei Stimulation der Zellen mit anti-CD3mAk nur in 2 von 4 durchgeführten Experimenten schwach exprimiert wurde (Abb. 5.15E). Inkubation mit anti-CD3mAk bzw. mit anti-CD3mAk und TGF-β1 steigerte nach 24 Stunden die von IL-1β-mRNA-Synthese und verminderte die von TNF-R1- und TNF-R2-mRNAExpression im Vergleich zu unstimulierten Zellen. Ergebnisse 56 In den parallel hierzu mit LY294002 exponierten humanen CD4+ T-Zellen nahm die IL1-β-und TNF-R2-mRNA-Synthese ab. Die anti-CD3mAk induzierte Reduktion der TNF-R1-mRNA-Expression wurde durch Zugabe von LY294002 verhindert. Die IL-6-mRNA-Synthese (Abb. 5.15C) war in Gegenwart von LY294002 dagegen im Vergleich zu dem Ansatz mit anti-CD3mAk bzw. mit anti-CD3mAk und TGF-β1 nicht beeinträchtigt. Bei Anwesenheit von LY294002 exprimierten die Zellen keine GM-CSF-, IL-6- und TNF-α-mRNA mehr (Abb. 5.15E). Ergebnisse TNF-R1/GAPDH Quotient 1,6 B ohne LY mit LY 1,2 TNF-R2/GAPDH Quotient A 57 0,8 (b) (a) (b) (a) 0,4 1,6 1,2 0,8 (b) (a) 0,4 (b) (a) (b) (a) (b) (b) 0,0 0,0 α-CD3 - - + + TGF-β1 - - - + 0h C 24 h D IL-1β /GAPDH Quotient IL-6-R/GAPDH Quotient 1,2 0,8 0,4 0,0 - - - + + - + 24 h (b) (a) 1,6 (b) (a) 1,2 0,8 0,4 0,0 - - + + - - + + - - - + - - - + 0h E 0h 1,6 α-CD3 TGF-β1 (b) 0h 24 h GAPDH TNF-α GM-CSF-R IL-1β TNF-R1 GM-CSF IL-6 IL-6-R TNF-R2 α-CD3 - - + + - + + TGF-β1 - - - + - - + LY294002 - - - - + + + 0h 24 h 24 h Abb. 5.15: Einfluss von LY294002 auf die mRNAExpression ausgewählter Zytokinrezeptoren und Zytokine in CD4+ TZellen. Positiv selektierte CD4+ T-Zellen wurden mit anti-CD3mAk (1µg/ml), TGF-β1 (10 ng/ml) und zum Teil mit LY294002 (20 µM) inkubiert. Die TNF-R1- (A), TNFR2- (B), IL-6-R- (C), IL-1β- (D), TNF-α- und IL-6-mRNA (nicht dargestellt) wurde vor Stimulationsbeginn und nach 24 Stunden mittels RT-PCR bestimmt und die Ergebnisse in Relation zu GAPDH gesetzt. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM (AD) und ein repräsentatives Experiment (E) aus 4 voneinander unabhängigen Experimenten. (a) p<0,1 verglichen mit Zellen, die mit LY294002 inkubiert wurden; (b) p<0,1 im Vergleich zur Kontrolle. Ergebnisse 58 GM-CSF-Rezeptor-mRNA-Expression Der Rezeptor des “granulocyte-macrophage colony-stimulating factor” (GM-CSF-R) wird von T-Lymphozyten bei der Differenzierung im Thymus exprimiert. Während bei unstimulierten Zellen und in Gegenwart von anti-CD3mAk und TGF-β1 innerhalb von 24 Stunden die GM-CSF-R-mRNA-Expression nahezu konstant blieb, steigerte Inkubation mit anti-CD3mAk die Synthese von GM-CSF-R-mRNA in CD4+ T Lymphozyten um das 2,4-fache (p<0,05) (Abb. 5.15E ,5.16). In Anwesenheit von LY294002 reduzierte sich nach 24 Stunden bei unstimulierten Zellen der Gehalt an GM-CSF-R-mRNA um 39,6% verglichen mit der Kontrolle vor Stimulationsbeginn (0 h). Im Gegensatz dazu steigerte LY294002-Zugabe zu mit antiCD3mAk- bzw. mit antiCD3mAk und TGF-β1–inkubierten Zellen die Synthese von GM-CSF-R-mRNA nach 24 Stunden um das 1,7-fache (p<0,05) bzw. um das 2,6-fache (p<0,05). GM-CSF-R/GAPDH Quotient 4 b a ohne LY mit LY 3 b a b 2 1 0 α-CD3 - - + + TGF-β1 - - - + 0h 24 h Abb. 5.16: Einfluss von LY294002 auf die Expression von GM-CSF-R-mRNA in CD4+ T-Zellen. Positiv selektierte CD4+ T-Lymphozyten wurden mit anti-CD3mAk (1µg/ml), TGF-β1 (10 ng/ml) und zum Teil mit LY294002 (20 µM) inkubiert. Die GM-CSF-R-mRNA wurde vor Stimulationsbeginn und nach 24 Stunden mittels RT-PCR bestimmt und die Ergebnisse in Relation zu GAPDH gesetzt. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM aus 6 voneinander unabhängigen Experimenten. (a) p<0,05 verglichen mit Zellen, die ohne LY294002 inkubiert wurden; (b) p<0,05 im Vergleich zur Kontrolle. Ergebnisse 59 5.3.4.2 Zytokinsynthese auf Protein-Ebene Nach der Analyse der Zytokinsynthese auf mRNA-Niveau, wurde die Zytokinsynthese auf Protein-Ebene mittels intrazellulärer Färbung gemessen. Da in Vorversuchen die zusätzliche Inkubation mit TGF-β1 die Zytokinsynthese gegenüber nur mit anti-CD3mAk-stimulierten CD4+ T-Lymphozyten nicht signifikant beeinflusste, wurden die Zellen nur mit anti-CD3mAk und TGF-β1 inkubiert, um die αEβ7-Expression zu erhöhen. An den Tagen 0, 2, 5 und 7 wurde der Anteil Zytokin-positver CD4+ T-Lymphozyten mittels intrazellulärer Färbung durchflusszytometrisch bestimmt. IL-2-Expression An Tag 0 waren 15,55% der CD4+ T-Lymphozyten IL-2+ (Abb. 5.17A, 5.17B). Bei unstimulierten Zellen nahm von Tag 0 bis Tag 7 der Anteil IL-2 synthetisierender Zellen signifikant ab (Tag 7: 4,35%; p<0,05). Die Inkubation mit anti-CD3mAk und TGF-β1 führte zu einer Steigerung des Anteils IL-2+ Zellen auf 18,96% an Tag 2 (p<0,05) (Abb. 5.17A, 5.17B). Im weiteren Verlauf reduzierte sich der Anteil IL-2-exprimierender Zellen auf 5,12% an Tag 7 (p<0,05). In Gegenwart von LY29402 kam es ab Tag 2 zu einer Abnahme der IL-2-Synthese unter den Wert der Kontrolle (Abb. 5.17). Wurde LY294002 hingegen nach 24 Stunden ausgewaschen und die Zellen mit anti-CD3mAk und TGF-β1 reinkubiert, so steigerte sich der Anteil IL-2+ Zellen signifikant bis zu Tag 7 (Tag 2: 4,64; Tag 7: 11,93%; p<0,05) (Abb. 5.17). Ergebnisse 25 B Kontrolle α-CD3+TGF-β1 20 a, b 15 a, b 10 a, b 5 0 IL-2+ CD4+ T-Lymphozyten (%) IL-2+ CD4+ T-Lymphozyten (%) A 60 25 Ink. mit LY über 7 d Präink. mit LY 20 15 a, b a, b 10 5 0 0 2 5 7 0 Zeit (Tage) 2 5 7 Zeit (Tage) Abb. 5.17: Einfluss von LY294002 auf die IL-2-Expression in CD4+ T-Lymphozyten. Positiv selektierte CD4+ T-Lymphozyten wurden mit anti-CD3mAk (1 µg/ml), TGF-β1 (10 ng/ml) und zum Teil parallel mit LY294002 (20 µM) inkubiert. Bei einem Ansatz wurden die mit anti-CD3mAk, TGF-β1 und LY294002 präinkubierten Zellen nach 24 Stunden gewaschen und anschließend mit anti-CD3mAk und TGF-β1 reinkubiert. An Tag 2 wurde IL-2 (40 ng/ml) zugegeben. Die Messung der IL-2Expression an den Tagen 0, 2, 5 und 7 erfolgte durchflusszytometrisch mittels intrazellulärer Färbung. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM aus 7 voneinander unabhängigen Experimenten. Kontrolle und Inkubation mit anti-CD3mAk und TGFβ1 (A); Inkubation mit anti-CD3mAk, TGFβ1 und LY294002 (B). (a) p<0,05 im Vergleich zur Kontrolle; (b) p<0,05 verglichen mit Zellen, die über 7 Tage mit LY294002 inkubiert wurden. IFN-γ-Expression Eine Expression von IFN-γ war vor Stimulationsbeginn in 10,96% der Zellen nachweisbar. Bei unstimulierten Zellen nahm die IFN-γ-Synthese innerhalb der 7-tägigien Inkubationsperiode kontinuierlich bis auf 1,82% an Tag 7 ab. Im Gegensatz dazu steigerte Zugabe von anti-CD3mAk und TGF-β1 den Anteil IFN-γ+ Zellen auf 12,24% an Tag 2. Im weiteren Verlauf nahm bis Tag 7 die IFN-γ-Expression auf 6,17% an Tag 7 ab (Abb. 5.18A) (p<0,05). Wurden die Zellen in Anwesenheit von LY294002 mit anti-CD3mAk und TGF-β1 stimuliert, reduzierte sich der Anteil IFN-γ+ Zellen unter den Kontrollwert (Abb. 5.18B). Humane CD4+ T-Lymphozyten, die mit anti-CD3mAk, TGF-β1 und LY294002 präinkubiert, gewaschen und anschließend mit anti-CD3mAk und TGF-β1 reinkubiert wurden, zeigten eine signifikante Zunahme der IFN-γ-Synthese von 5,46% an Tag 2 auf 8,99% an Tag 7 (p<0,05). Ergebnisse 15 B a, b a, b 10 a, b 5 Kontrolle α- CD3+TGF-β1 0 0 2 IFN-γ+ CD4+ T-Lymphozyten (%) IFN-γ+ CD4+ T-Lymphozyten (%) A 61 15 Ink. mit LY über 7 d Präink. mit LY a, b 10 a, b 5 0 5 Zeit (Tage) 7 0 2 5 7 Zeit (Tage) Abb. 5.18: Einfluss von LY294002 auf die IFN-γ-Expression in CD4+ T-Lymphozyten. Positiv selektierte CD4+ T Lymphozyten wurden mit anti-CD3mAk (1 µg/ml), TGF-β1 (10 ng/ml) und zum Teil parallel mit LY294002 (20 µM) inkubiert. Bei einem Ansatz wurden die mit anti-CD3mAk, TGF-β1 und LY294002 präinkubierten Zellen nach 24 Stunden gewaschen und anschließend mit anti-CD3mAk und TGF-β1 reinkubiert. An Tag 2 wurde IL-2 (40 ng/ml) zugegeben. De Messung der IFN-γ Expression an den Tagen 0, 2, 5 und 7 erfolgte durchflusszytometrisch mittels intrazellulärer Färbung. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM aus 7 voneinander unabhängigen Experimenten. Kontrolle und Inkubation mit anti-CD3 mAk und TGFβ1 (A); Inkubation mit anti-CD3mAk, TGFβ1 und LY294002 (B). (a) p<0,05 im Vergleich zur Kontrolle; (b) p<0,05 verglichen mit Zellen, die über 7 Tage mit LY294002 inkubiert wurden. IL-4-, IL-5- und IL-10-Expression An Tag 0 waren 7,41% der humanen CD4+ T-Lymhozyten IL-4+, 20,35% IL-5+ und 5,5% IL10+ (Abb. 5.19A). Bis Tag 7 war bei der Kontrolle eine signifikante Abnahme der IL-4-, der IL-5- und der IL-10-synthetisierenden Zellen nachzuweisen (jeweils: p<0,05) (Abb. 5.19A). In Gegenwart von anti-CD3mAk und TGF-β1 erhöhte sich der Anteil IL-4+, IL-5+ und IL-10+ Zellen bis Tag 2 signifikant (Tag 2: IL-4: 15,20%; IL-5: 46,16%; IL-10: 14,20%; jeweils: p<0,05). Die Anwesenheit von LY294002 hemmte die Synthese der untersuchten Interleukine im Beobachtungszeitraum (Abb. 5.19B). Wurde der PI3K-Inhibitor nach 24 Stunden ausgewaschen und die Zellen mit anti-CD3mAk und TGF-β1 reinkubiert, nahm von Tag 2 bis Tag 7 der Anteil IL-4+, IL-5+ und IL-10+ Zellen signifikant zu (IL-4: Tag 2: 2,46%; Tag 7: 7,95%; IL-5: Tag 2: 12,41%; Tag 7: 23,68%; IL-10: Tag 2: 3,33%, Tag 7: 6,28%; jeweils p<0,05). Ergebnisse 60 B Kontrolle α-CD3+TGF-β1 IL-4+ CD4+ T-Lymphozyten (%) IL-4+ CD4+ T-Lymphozyten (%) A 62 45 30 a, b 15 a, b 0 60 Ink. mit LY über 7 d Präink. mit LY 45 30 15 2 5 7 0 5 7 a, b a, b 5 7 2 Zeit (Tage) Zeit (Tage) 60 60 a, b 45 a, b 30 a, b 15 IL-5+ CD4+ T-Lymphozyten (%) IL-5+ CD4+ T-Lymphozyten (%) a, b 0 0 0 45 30 15 0 0 2 5 7 0 2 Zeit (Tage) Zeit (Tage) 60 45 30 a, b a, b 15 a, b 0 IL-10+ CD4+ T-Lymphozyten (%) 60 IL-10+ CD4+ T-Lymphozyten (%) a, b 45 30 15 a, b a, b 5 7 0 0 2 5 Zeit (Tage) 7 0 2 Zeit (Tage) Abb. 5.19: Einfluss von LY294002 auf die Expression von IL-4, IL-5 und IL-10 in CD4+ T-Zellen. Positiv selektierte CD4+ T-Zellen wurden mit anti-CD3mAk (1µg/ml), TGF-β1 (10 ng/ml) und zum Teil parallel mit LY294002 (20 µM) inkubiert. Bei einem Ansatz wurden die mit anti-CD3mAk, TGF-β1 und LY294002 präinkubierten Zellen nach 24 Stunden gewaschen und anschließend mit anti-CD3mAk und TGF-β1 reinkubiert. An Tag 2 wurde IL-2 (40 ng/ml) zugegeben. Die Messung die der IL-4-, IL-5und IL-10-Expression an den Tagen 0, 2, 5 und 7 erfolgte durchflusszytometrisch mittels intrazellulärer Färbung. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM aus 7 voneinander unabhängigen Experimenten. Kontrolle und Inkubation mit anti-CD3mAk und TGFβ1 (A); Inkubation mit antiCD3mAk, TGFβ1 und LY294002 (B). (a) p<0,05 im Vergleich zur Kontrolle; (b) p<0,05 verglichen mit Zellen, die über 7 Tage mit LY294002 inkubiert wurden Ergebnisse 63 5.3.5 Einfluss von LY294002 auf die Proliferation In diesen Experimenten sollte untersucht werden ob die PI3K auch eine Rolle spielen bei der Proliferation humaner CD4+ T-Lymphozyten, die mittels der BrdU-Inkorporation durchflusszytometrisch bestimmt wurde. Bei der Kontrolle stieg die BrdU-Aufnahme im beobachteten Zeitraum von 1,73% an Tag auf 3,68% an Tag 7 signifikant an (p<0,05) (Abb. 5.20A). Die Anwesenheit von anti-CD3mAk und TGF-β1 führte zu einer weiteren Steigerung der BrdU-Aufnahme der humanen CD4+ T-Lymphozyten auf 19,16% an Tag 7 (p<0,05) (Abb. 5.20A). Wurden die Zellen mit anti-CD3mAk und TGF-β1 in Gegenwart von LY294002 stimuliert, nahm die BrdU-Aufnahme unter den Kontrollwert ab (Tag 7: 1,66%) (Abb. 5.20B). Präinkubation der Zellen mit LY294002 über 24 Stunden, Waschen und anschließende Zellstimulation mit anti-CD3mAk und TGF-β1 führte innerhalb von 5 Tagen zu einer signifikanten Steigerung der BrdU-Aufnahme auf 11,44% an Tag 7 (p<0,05) (Abb. 5.20B). 25 Kontrolle α- CD3 + TGF-β1 20 B a, b a, b 15 10 5 0 BrdU+ CD4+ T-Lymphozyten (%) BrdU+ CD4+ T-Lymphozyten (%) A 25 Ink. mit LY über 7 d Präink. mit LY 20 15 a, b 10 b 5 0 0 2 5 Zeit (Tage) 7 0 2 5 7 Zeit (Tage) Abb. 5.20: Einfluss von LY2940002 auf die Proliferation von CD4+ T-Lymphozyten. Positiv selektierte CD4+ T-Lymphozyten wurden mit anti-CD3mAk (1µg/ml), TGF-β1 (10 ng/ml) und zum Teil parallel mit LY294002 (20 µM) inkubiert. Bei einem Ansatz wurden die mit anti-CD3mAk, TGF-β1 und LY294002 präinkubierten Zellen nach 24 Stunden gewaschen und anschließend mit anti-CD3mAk und TGF-β1 reinkubiert. An Tag 2 wurde IL-2 (40 ng/ml) zugegeben. Die Messung der Zellproliferation erfolgte an den Tagen 0, 2, 5 und 7 durchflusszytometrisch mittels der BrdU-Aufnahme. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM aus 7 voneinander unabhängigen Experimenten. Kontrolle und Inkubation mit antiCD3mAk und TGFβ1 (A); Inkubation mit anti-CD3mAk, TGFβ1 und LY294002 (B). (a) p<0,05 im Vergleich zur Kontrolle; (b) p<0,05 verglichen mit Zellen, die über 7 Tage mit LY294002 inkubiert wurden. Ergebnisse 64 5.3.6 Einfluss von LY294002 auf die Viabilität In einem weiteren Ansatz wurde der Einfluss von LY294002 auf die Viabilität der humanen CD4+ T-Lymphozyten untersucht, die mittels Propidiumjodid-Färbung durchfluss- zytometrisch bestimmt wurde. Bei mit anti-CD3mAk und TGF-β1 inkubierten CD4+ T-Lymphozyten reduzierte LY294002 die Viabilität der Zellen an den Tagen 2, 5 und 7 signifikant verglichen mit nur mit antiCD3mAk und TGF-β1 inkubierten Zellen (Abb. 5.21). Nach 7 Tagen betrug die Viabilität noch 17,30% der Zellen, während 70,18% der mit anti-CD3mAk und TGF-β1 inkubierten Zellen vital waren (p<0,05). Wurden die Zellen mit anti-CD3mAk, TGF-β1 und LY294002 präinkubiert, nach 24 Stunden gewaschen und mit anti-CD3mAk und TGF-β1 reinkubiert, so war der Effekt weniger stark ausgeprägt (p<0,05). 100 PI- CD4+ T-Lymphozyten (%) b b 80 60 b b b 40 Kontrolle α- CD3+TGF-β1 Ink. mit LY über 7 d Präink. mit LY 20 0 0 2 5 7 Zeit (Tage) Abb. 5.21: Einfluss von LY2940002 auf die Viabilität von CD4+ T-Lymphozyten. Positiv selektierte CD4+ T-Lymphozyten wurden mit anti-CD3mAk (1µg/ml), TGF-β1 (10 ng/ml) und zum Teil parallel mit LY294002 (20 µM) inkubiert. Bei einem Ansatz wurden die mit anti-CD3mAk, TGF-β1 und LY294002 präinkubierten Zellen nach 24 Stunden gewaschen und anschließend mit anti-CD3mAk und TGF-β1 reinkubiert. An Tag 2 wurde IL-2 (40 ng/ml) zugegeben. Die Messung der Viabilität erfolgte an den Tagen 0, 2, 5 und 7 mittels Popidiumjodid-Färbung durchflusszytometrisch. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM aus 7 voneinander unabhängigen Experimenten. (b) p<0,05 verglichen mit Zellen, die über 7 Tage mit LY294002 inkubiert wurden. Ergebnisse 65 5.4 FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG VON αEβ7+ CD4+ T-LYMPHOZYTEN 5.4.1 FoxP3-mRNA-Expression in αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten FoxP3 ist ein Transkriptionsfaktor, der in T-regulatorischen Zellen (Treg) exprimiert wird (Hori et al. 2003). Um zu untersuchen, ob es sich bei αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten um T-regulatorische Zellen handelt, wurden positiv selektierte CD4+ T-Lymphozyten über 7 Tage mit anti-CD3mAk und TGF-β1 inkubiert. Anschließend erfolgte mit Hilfe eines “MoFlo cell sorters” die Sortierung der CD4+ T-Lymphozyten anhand der Fluoreszenz in αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten und αEβ7-CD4+ T-Lymphozyten (Kap. 4.2.4). Daraufhin wurde von jeder Population eine RT-PCR mit einem Primer für FoxP3 durchgeführt. Während in der Kontrolle kaum FoxP3-mRNA exprimiert wurde, war diese sowohl in αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten als auch in αEβ7 CD4+ T-Lymphozyten nachweisbar (Abb. 5.24). Cyclophilin FoxP3 K0 K7 α-CD3 αEβ7+ αEβ7- Abb. 5.22: FoxP3-Expression in αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten. Positiv selektierte CD4+ T -Zellen wurden mit anti-CD3mAk bzw. anti-CD3mAk und TGF-β1 inkubiert. An Tag 2 wurde IL-2 (40 ng/ml) zugegeben. An Tag 7 erfolgte die Auftrennung von mit anti-CD3mAk und TGF-β1 inkubierten CD4+ Lymphozyten mittels eines “MoFlo cell sorters“ in 2 Populationen, in αEβ7+ CD4+ T-Zellen und αEβ7 CD4+ T-Zellen. Daraufhin wurde eine RT-PCR mit einem Primer für FoxP3 durchgeführt. (K0) Kontrolle an Tag 0; (K7) Kontrolle an Tag 7; (α-CD3) mit anti-CD3mAk-stimulierte CD4+ T-Lymphozyten; (αEβ7+) αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten; (αEβ7-) αEβ7- CD4+ T-Lymphozyten. Dargestellt ist ein repräsentatives Experiment aus 5 voneinander unabhängigen Experimenten. . Diskussion 66 6 DISKUSSION Das Oberflächenmolekül αEβ7 gehört zur Familie der Integrine. Es vermittelt die Akkumulation von T-Lymphozyten im Epithelgewebe über seinen Liganden E-Cadherin, das sich an der basolateralen Oberfläche von Epithelzellen befindet (Butcher und Picker 1996). In der bronchoalveolären Lavage (BALF) Gesunder beträgt die Zahl der αEβ7+ CD4+ T-Zellen im Mittel 28% aller CD4+ T-Lymphozyten. Arbeiten unserer Forschungsgruppe haben gezeigt, dass diese αEβ7-exprimierende Subpopulation von CD4+ T-Zellen im Rahmen der idiopathischen pulmonalen Fibrose expandiert (Braun et al. 2003, Rihs et al. 1996). Dabei betrug die relative Zahl der CD4+ T-Lymphozyten, die αEβ7 exprimieren 74,5% (Lohmeyer et al. 1999). Im Gegensatz hierzu sind sowohl bei Gesunden, als auch bei Patienten mit IPF/UIP 2% der CD4+ T-Lymphozyten im peripheren Blut αEβ7+. Diese selektive Expansion von αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten bei IPF/UIP legt nahe, dass diese Zellpopulation eine Rolle im Rahmen der interstitiellen Lungenerkrankung spielt. Die jetzt vorgelegte Dissertation setzt hier an und verfolgt das Ziel αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten im Hinblick auf Phänotyp und Funktion zu charakterisieren, um die Bedeutung dieser Zellen bei der pulmonalen Fibrose besser zu verstehen. αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten Epithelzellen Beschädigte Epithelzellen Fibrin ? Kollagen Neutrophile Granulozyten Myofibroblasten Alveolarmakrophagen ? αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten ? Abb. 6.1: Die Rolle von αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten im Rahmen der IPF/UIP ist bisher nicht verstanden. Ein repetitiver Stimulus kann zu einer Verletzung des Alveolarepithels führen. Dies hat eine Immunreaktion zur Folge, an der neutrophile Granulozyten, Alveolarmakrophagen und αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten beteiligt sind. Das Zusammenspiel dieser Zellen resultiert schließlich in einer gesteigerten Kollagensynthese durch Fibroblasten. Diskussion 6.1 EINFLUSS 67 VON CD4-ENGAGEMENT AUF DIE AKTIVERUNG VON CD4+ T-ZELLEN Um CD4+ T-Lymphozyten aus dem peripheren Blut zu isolieren, können zwei verschiedene Selektionsmethoden angewandt werden, die die nachfolgende Stimulation der Zellen unterschiedlich beeinflussen. Bei der positiven Selektion werden durch den Gebrauch von mit anti-CD4mAk-konjugierten “Beads” CD4+ T-Lymphozyten direkt markiert (Kap. 4.2.1.2). Im Gegensatz hierzu erfolgt im Rahmen der negativen Selektion die Markierung von CD4- Zellen mit Hapten-konjugierten und anti-Hapten konjugierten Antikörpern. Die durchgeführten Experimente zeigen, dass das zusätzliche CD4-Engagement die αEβ7-Expression auf den CD4+ T-Lymphozyten steigerte (Abb. 5.1). Nach positiver Selektion und 7-tägiger Inkubation mit anti-CD3mAk und TGF-β1 waren 33,78% der CD4+ T-Lymphozyten αEβ7+, verglichen mit 10,11% nach negativer Selektion. Darüber hinaus erhöhte sich bei Ligation an das CD4-Molekül vor Stimulation der CD4+ T-Zellen die Expression der Aktivierungsmarker CD25, CD69 und CD95, sowie die Expression des Markers für Gedächtnis-Zellen, CD45RO (eigene Beobachtungen). Die mRNA-Synthese der Zytokine IFN-γ, IL-2 und IL-4 wurde durch die zusätzliche CD4-Ligation vor der Aktivierung der Zellen ebenfalls gesteigert (Abb. 5.2, 5.3). Der CD4-Rezeptor ist Teil des T-Zellrezeptor (TZR)/CD3 Komplexes (Delves und Roitt 2000a, Delves und Roitt 2000b). Bindet der TZR eines CD4+ T-Lymphozyten an ein Antigen, gebunden an den MHC II Komplex einer Antigen-präsentierenden Zelle (APZ), fungiert das CD4-Molekül als Korezeptor und assoziiert sich ebenfalls mit dem MHC II Komplex. Dies führt zur Amplifizierung des durch den TZR generierten Signals. Andererseits ist das CD4-Antigen auch in der Lage inhibierende Signale an den CD4+ T-Lymphozyten zu vermitteln. Dies ist der Fall bei Ligation des CD4-Moleküls an einen nicht mit Antigenbesetzten MHC II Komplex einer APZ (Delves und Roitt 2000a, Delves und Roitt 2000b). Das so generierte negative Signal führt zur Vermeidung nicht-erwünschter Aktivierungen des CD4+ T-Lymphozyten durch einen nicht mit Antigen-besetzten MHC II Komplex. Diese sowohl Signal-verstärkende als auch inhibierende Funktion des CD4-Antigens kann durch in vitro Beobachtungen bestätigt werden. So resultierte Präinkubation von humanen CD4+ T-Lymphozyten mit anti-CD4mAk bzw. mit einem Hüllbestandteil des HI-Virus (gp120) in einer verminderten Proliferation und einer reduzierten IL-2-Synthese durch die Diskussion 68 nachfolgende Stimulation mit anti-CD3mAk und anti-CD4mAk (Tsygankov et al. 1993). Ferner erhöhte die Kreuzvernetzung des CD4-Komplexes durch anti-CD4mAk die Suszeptibilität für Apoptose durch anschließende CD3-Stimulation (Wang et al. 1994). Auf intrazellulärer Ebene wurde durch CD4-Engagement der Ca2+-Influx, und die Bildung eines multifunktionellen Signaltransduktions-komplexes bestehend aus PLCγ1 und p120GAP, der für die T-Zellaktivierung bedeutsam ist inhibiert (Jabado et al. 1997). Hierdurch wurde die nachfolgende anti-CD3mAk bzw. PMA induzierte Translokation von NF-AT, AP-1 und NF-κB in den Nukleus verhindert (Jabado et al. 1994). Darüber hinaus führte in humanen T-Lymphozyten CD4-Ligation zur Aktivierung von Csk, einer Tyrosinkinase, die einen inhibitorisch wirksamen Tyrosin-Rest von p56lck phosphoryliert und damit die Aktivierung von ZAP-70 verhindert (Marinari et al. 2003). Im Gegensatz hierzu finden sich Beobachtungen, die zeigen, dass die Ligation an den CD4-Rezeptor zu einem positiven Signal in der Zelle führt. CD4-Engagement durch einen bestimmten anti-CD4mAk (B66.6) stimulierte den Ca2+-Influx, die Proliferation und die IL-2-Synthese von humanen T-Lymphozyten aus dem peripheren Blut auch ohne zusätzliche Kreuzvernetzung von anti-CD3mAk (Carrel et al. 2003). Andere anti-CD4mAk (101-69, LAU-T4, HP-26) waren nicht in der Lage, T-Lymphozyten zu aktivieren (Carrel et al. 1988). Während anti-CD3mAk-Inkubation ausreichte um die Proliferation und die IFN-γ-Synthese zu stimulieren, war für die IL-4-Synthese zusätzliches CD4-Engagement notwendig (Komata et al. 2003). Auf intrazellulärer Ebene führte die Ligation an den CD4-Rezeptor über die Stimulation der Tyrosinkinasen p56lck und p59fyn (Baldari et al., 1995a), sowie der Phosphoinositid 4-Kinasen und MAP-Kinasen (Schmid Antomarchi et al. 1996) zur Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-AT. Diese unterschiedlichen Effekte verschiedener CD4-Liganden könnten darauf zurückzuführen sein, dass die Bindung an distinkte Epitope des CD4-Rezeptors unterschiedliche Signale auslöst, z. B. auf der Basis von differentiellen Konformationsänderungen, wie sie für den Aspartatrezeptor beschrieben wurden (Ottemann et al. 1999). Über den zytoplasmatischen Anteil des CD4-Rezeptors wäre eine Beeinflussung der Assoziation von p56lck oder anderer Signalproteine mit dem TZR möglich, was dann die anschließende Transduktion von Signalen qualitativ und quantitativ verändern könnte. Diese Vermutung wird unterstützt durch Befunde zur Signaltransduktion in einer humanen T-Zellinie. Dort konnte gezeigt werden, dass die Inkubation mit vier verschieden anti-CD4mAk, die alle unterschiedliche Epitope erkennen differentielle Effekte auf die T-Zellfunktionen in vitro haben (Baldari et al. 1995b). Diskussion 69 6.2 PHÄNOTYPISCHE CHARAKTERISIERUNG VON αEβ7+ CD4+ T-LYMPHOZYTEN Wie bereits in Kapitel 6.1 erwähnt hatte in den durchgeführten Experimenten CD4-Engagement einen kostimulierenden Effekt + auf die Aktivierung von + CD4 T-Lymphozyten. Selbst ohne die CD4-Ligation waren CD4 T-Lymphozyten, die nach 7-tägiger Inkubation mit anti-CD3mAk und TGF-β1 das Integrin αEβ7 exprimierten, zu einem Großteil auch positiv für den Aktivierungsmarker CD25. Im Gegensatz dazu blieb die CD25-Expression von αEβ7- CD4+ T-Lymphozyten nach negativer Selektion unverändert (Abb. 5.6A). Bei zusätzlichem CD4-Engagemant erreichte die Koexpression von αEβ7 mit den Oberflächenmarkern CD25, CD95 und CD69 auf CD4+ T-Lymphozyten bereits an Tag 2 das Maximum, während bei αEβ7- CD4+ T-Lymphozyten ein trägerer Anstieg der Aktivierungsmarker-Expression zu verzeichnen war (Abb. 5.6). Dieser gesteigerte Aktivierungsstatus von αEβ7+ CD4+ T-Zellen korrelierte mit einer verstärkten Proliferation. Im Vergleich zu αEβ7- CD4+ T-Zellen war diese 6-fach erhöht (Abb. 5.9). Darüber hinaus bestand bei αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten eine erhöhte Expression des CD45RO-Antigens, was für “Memory”-Eigenschaften dieser Zellpopulation spricht (Abb. 5.7). Zusammengefasst ist es in der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal an humanen CD4+ T-Lymphozyten gelungen zu zeigen, dass αEβ7 ein Differenzierungsmarker darstellt für eine Subpopulation von CD4+ T-Lymphozyten, die charakterisiert ist durch einen gesteigerten Aktivierungsstatus, einen “Memory“-Phänotyp, eine erhöhte CD25-Expression und eine verstärkte Proliferation (Abb. 6.2). Die beschriebenen Charakteristika von αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten zeigen Ähnlichkeiten mit dem Phänotyp von T-regulatorischen Zellen (Kap. 2.3). Diskussion 70 CD62L TZR-Stimulation + TGF-β1 CD62L CD62L CD25 CD25 αEβ7+ CD95 CD45RO αEβ7CD95 CD69 CD45RO CD95 CD69 CD25 αEβ7+ C69 CD62L CD95 CD62L CD45RO CD25 αEβ7+ CD25 αEβ7CD95 CD45RO C69 CD45RO CD69 Abb. 6.2: Phänotyp von αEβ+ CD4+ T-Lymphozyten und αEβ- CD4+ T-Lymphozyten. Unter dem Einfluss von TZR-Stimulation und der Gegenwart von TGF-β1 können sich CD4+ T-Lymphozyten zu αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten differenzieren. Diese unterscheiden sich phänotypisch durch eine erhöhte CD25-, CD69-, CD95- und CD45RO- und eine reduzierte CD62L-Expression sowie einer gesteigerten Proliferation von αEβ7- CD4+ T-Lymphozyten. 6.3 FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG VON αEβ7+ CD4+ T-LYMPHOZYTEN 6.3.1 Vergleich von αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten mit T-regulatorischen Zellen Es stellt sich nun die Frage in welcher Beziehung T-regulatorische Zellen (Treg) mit den in dieser Arbeit charakterisierten αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten stehen. Zunächst ergeben sich Prallelen zwischen αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten und Treg bezüglich des Induktiosmechanismus. Um die Expression von αEβ7 auf CD4+ T-Lymphozyten zu induzieren, ist neben TZR-Engagement die zusätzliche Inkubation mit TGF-β notwendig. Auch bei der Differenzierung von peripheren CD4+ T-Lymphozyten zu adaptiven Treg (Tra) spielt die Gegenwart von TGF-β eine entscheidende Rolle. So sind adaptive Treg (Tra), die durch TZR-Engagement und TGF-β-Inkubation generiert wurden in der Lage, in einer Sekundärkultur die Proliferation und die Zytokinsynthese frisch aktivierter Lymphozyten zu inhibieren (Yamagiwa et al. 2001). Die auf diese Weise generierten Tra stammen von CD25+ CD4+ T-Lymphozyten ab (Yamagiwa et al. 2001). Es ist aber auch möglich, regulatorische Aktivität in humanen peripheren CD25- CD4+ T-Lymphozyten zu induzieren (Chen et al. 2003, Zheng et al. 2002). Allerdings ist hierbei die notwendige Dosis von TGF-β mit 10 ng/ml deutlich höher als bei der gesamten CD4+ T-Lymphozyten-Population unter Diskussion 71 Einschluß CD25+ Zellen (1 ng/ml). Damit scheinen Tra, die aus CD25- Zellen generiert wurden, einen anderen Aktivierungscharakter zu besitzen als CD25+ CD4+ T-Lymphozyten. Funktionell besteht jedoch kein Unterschied zu Tra generiert aus CD25+ CD4+ T-Zellen (Chen et al. 2003, Zheng et al. 2002). Sowohl αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten als auch Tra zeigen einen “Memory”-Phänotyp und eine erhöhte Expression von Aktivierungsmarkern (Yamagiwa et al. 2001). Dieser Phänotyp lässt den Schluß zu, dass die Zellen bereits im Thymus oder in der Peripherie durch Interaktionen mit APZ aktiviert wurden. Eine weitere Parallele von Tra und αEβ7+ CD4+ T-Zellen betrifft die verstärkte Proliferation: Nach 5-tägiger Inkubation mit IL-2 proliferierten CD25+ CD4+ T-Zellen (Tra), die mittels TZR-Stimulation und Inkubation mit TGF-β1 generiert wurden, 7-fach stärker als CD25- CD4+ T-Lymphozyten (Yamagiwa et al. 2001). Professionelle T-regulatorische Zellen (Trn) sowie adaptive T-regulatorische Zellen (Tra) sind durch die Expression des Transkriptionsfaktors FoxP3 charakterisiert. Dieser spielt eine zentrale Rolle bei der Entwicklung und Funktion von Treg (Fontenot et al. 2003, Hori et al. 2003, Khattri et al. 2003, Walker et al. 2003). Im Menschen führt die Aktivierung von CD25- CD4+ T -Zellen zur Expression des Transkriptionsfaktors (Walker et al. 2003). Diese Zellen zeigen eine den Trn vergleichbare suppressive Aktivität. FoxP3-mRNA wird in unstimulierten CD4+ T -Zellen in geringer Menge synthetisiert (Abb. 5.24). Nach TZR-Stimulation und Inkubation mit TGF-β war hingegen in αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten eine verstärkte FoxP3-mRNA-Expression nachweisbar. Allerdings ist αEβ7 kein Differenzierungsmarker, der die gesamte Population von Treg einschließt, wie die Expression von FoxP3-mRNA in αEβ7- CD4+ T-Lymphozyten vermuten lässt (Abb. 5.22). Zusammengefasst lässt sich festhalten, dass es in den durchgeführten Experimenten zum ersten Mal gelungen ist zu zeigen, dass es sich bei humanen αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten um adaptive T-regulatorische Zellen (Tra) handelt Diese Bewertung wird dadurch unterstützt, dass in “αE-Knock out”-Mäusen vermehrt kutane inflammatorische Läsionen beobachtet wurden, die auf eine überschießende Immunreaktion zurückzuführen waren (Schon et al. 2000). Diskussion 72 6.3.2 αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten als periphere, adaptive T-regulatorische Zellen L-Selektin (CD62L) wird für die Migration von Lymphozyten in Lymphknoten benötigt. Die durchgeführten Untersuchungen zeigen, dass an Tag 0 die Expression von L-Selektion (CD62L) auf αEβ7- CD4+ T-Lymphozyten im Vergleich zu αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten erhöht war (Abb. 5.8). Nach 7-tägiger Inkubation in Gegenwart von anti-CD3mAk und TGF-β1 ließ sich allerdings kein Unterschied mehr hinsichtlich der CD62L-Expression zwischen αEβ7- CD4+ T-Lymphozyten und αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten nachweisen. Beide Zellpopulationen waren mehrheitlich CD62L+. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, dass die alleinige Stimulation mittels anti-CD3mAk wahrscheinlich nicht ausreichte, um die aktivierungsbedingte “Down-Regulation” von CD62L zu gewährleisten, wie sie nach Stimulation mittels APZ beobachtet wird (Mannering et al. 2002). Die Koexpression von αEβ7 und CD62L wurde auch auf murinen, naiven regulatorischen CD25+ CD4+ T-Lymphozyten untersucht (Huehn et al. 2004). Dort ließ sich nachweisen, dass αEβ7 die Population der CD25+ CD4+ T-Lymphozyten (Trn) in 2 distinkte regulatorische Subtypen unterteilt. Bei αEβ7- CD25+ CD4+ T-Lymphozyten zeigte sich, ebenso wie in den Experimenten dieser Arbeit eine vermehrte Expression von CD62L, sowie eine erhöhte Ansprechbarkeit auf das Chemokin CCR7. Beide Merkmale spielen eine Rolle bei der Migration von Lymphozyten in lymphatisches Gewebe, was für eine Funktion als zentrale regulatorische Zellen spricht (Huehn et al. 2004). Im Gegensatz hierzu bestand bei murinen αEβ7+ CD25+ CD4+ T-Lymphozyten eine erhöhte E-Selektin- und P-Selektin-Expression, sowie eine gesteigerte migratorische Kapazität auf inflammatorische Zytokine wie CXCL9, CCL1 und CCL20. Somit handelt es sich bei αEβ7+ CD25+ CD4+ T-Lymphozyten vermutlich um adaptive, periphere regulatorische Zellen (Huehn et al. 2004). Diese Befunde sprechen für eine besondere Funktion von αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten in der Peripherie an epithelialen Oberflächen. Tatsächlich reichern sich αEβ7+ CD4+ T-Zellen, sowohl CD25+, als auch CD25-, in der Leber und nur αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten in entzündlichen Hautarealen an (Huehn et al. 2004). In einem Antigen induzierten Arthritis Modell migrierten αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten unabhängig von der CD25-Expression im Gegensatz zu αEβ7- CD25+ CD4+ T-Lymphozyten verstärkt in die betroffenen Gelenke. Diese αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten waren in der Lage die akute Entzündung effizient zu inhibieren. Der Transfer von αEβ7- CD25+ CD4+ T-Zellen hatte hingegen keinen Effekt (Huehn et al. Diskussion 73 2004). Auch bei einem Kolitismodell waren αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten in der Lage die Entwicklung einer entzündlichen Darmkrankheit (IBD) zu verhindern und zwar ebenfalls unabhängig von der CD25-Expression (Banz et al. 2003, Lehmann et al. 2002). Bei adaptiven T-regulatorischen Zellen (Tra) sind bisher 2 Subpopulationen (Tr1 und Tr2) bekannt, die sich durch das Zytokinmuster unterscheiden. Um die Nomenklatur einzuhalten, schlagen wir für die αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten die Bezeichnung Tr3 vor. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass es sich bei αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten (Tr3) um periphere, adaptive T-regulatorische Zellen (Tra) handelt. Die bevorzugte Lokalisation an epithelialen Oberflächen bzw. an inflammatorischen Foci ist über E-Cadherin und Chemokinrezeptoren möglich, wo sie u. a. durch die TGF-β-Synthese an der Gegenregulation des inflammatorischen Stimulus beteiligt sein können. Prof. Treg adaptive Treg (Tra) Trn Induktion Phänotyp Thymus Tr1 5 CD255 Tr2 Tr3 TZR-Stimulation TZR-Stimulation TZR-Stimulation + IL-103 + TGF-β + IL-22,6 + TGF-β + IL-2* CD253 CD252,6 CD25*, αEβ7* CD45RO* Proliferation ↔5 ↔3 ↑↑6 ↑↑* FoxP3 FoxP3+5 FoxP3+3 FoxP3+2 FoxP3+* Lokalisation lymph. Gewebe5 lymph. Gewebe3 lymph. Gewebe2 Epithel1,4 Zytokinmuster TGF-β ↑↑5 IL-10 ↑↑5 IL-10 ↑↑↑3 TGF-β ↑↑2,6 TGF-β ↑↑↑1,4 IL-10 ↑↑1 Tab. 6.1: Zusammenfassung der verschieden Treg-Populationen. *Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, 1 Banz et al. 2003, 2Chen et al. 2003, 3Horwitz et al. 2003, 4Huehn et al. 2004, 5Shevach 2002, 6 Yamagiwa et al. 2001. Abkürzungen: lymph. lymphatisches; prof. professionelle. Diskussion 74 6.4 PATHOGENETISCHES MODELL DER ROLLE + + VON αEβ7 CD4 T-ZELLEN BEI DER IDIOPATHISCHEN PULMONALEN FIBROSEE Die selektive Expansion von regulatorischen αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten (Tr3) bei IPF/UIP weckt aus verschiedenen Gründen besonderes Interesse: (1) Sie ist begrenzt auf interstitielle Lungenerkrankungen und findet sich nicht im Rahmen chronischer Atemwegsentzündungen wie dem Asthma bronchiale oder auch nicht bei der Pneumonie (Braun et al. 2003, Rihs et al. 1996). (2) Sie betrifft nur CD4+ T-Lymphozyten und nicht γδ-T-Lymphozyten bzw. CD8+ T-Lymphozyten, wo auch in der BALF Gesunder 45,3% bzw. 59,8% αEβ7 exprimieren (Braun et al. 2003). (3) Es findet sich eine Korrelation des Anteils αEβ+ CD4+ T-Lymphozyten mit dem Grad der Fibrosierung des Interstitiums (Lohmeyer et al. 1999). Vergleicht man nun den Phänotyp der αEβ7+ CD4+ T-Zellen aus der BALF von Patienten mit IPF/UIP mit dem Phänotyp der αEβ7+ CD4+ T-Zellen, die durch Inkubation mit anti-CD3mAk und TGF-β generiert wurden, so lässt sich folgendes beobachten: Während in den durchgeführten Experimenten eine Korrelation der CD25-Expression mit der von αEβ7 auf CD4+ T-Lymphozyten gefunden werden konnte, war diese Beziehung der Oberflächenantigene auf BALF-αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten nicht nachweisbar. Vielmehr exprimieren αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten das CD25-Antigen nicht (Braun et al. 2003). Eine Erklärung hierfür wäre, dass die CD25-Expression auf CD4+ T-Lymphozyten nach der TZR-Stimulation innerhalb weniger Tage ansteigt und nach 10-12 Tagen aber wieder abnimmt (Mannering et al. 2002). Die schon über einen längeren Zeitraum in die Lunge rekrutierten αEβ7+ CD4+ T-Zellen wären dann wieder CD25-. Darüber hinaus zeigen Beobachtungen an murinen CD4+ T-Lymphozyten, die mit einer konstitutiv aktiven Form der Phosphoinositid 3-Kinase (PI3K) transfiziert wurden, dass CD25 bei permanenter Aktivierung nicht mehr exprimiert wird. Bei konstitutiv aktivierter PI3K war die CD45RO-, die CD69- und die CD95-Expression erhöht, während CD25 nicht vermehrt exprimiert wurde (Borlado et al. 2000). Eine weitere mögliche Ursache der reduzierten CD25-Expression auf αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten in der BALF ergibt sich daraus, dass IL-2 über die Ligation an den CD25-Rezeptor nicht nur an der Proliferation von T-Lymphozyten beteiligt ist, sondern auch am “activation cells death” (AICD) (VanParijs et al. 1997). Somit würden die CD25+ αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten nach der Aktivierung vermehrt zu Grunde gehen, während CD25- Zellen länger überleben. Diskussion 75 Es ist denkbar, dass regulatorische αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten (Tr3) an der Pathogenese der IPF/UIP beteiligt sind (Abb. 6.3). Geht man von einem repetitiven Stimulus in Form einer Verletzung des Alveolarepithels als Ursache der IPF/UIP aus, führt dies zu einer Entzündungsreaktion, an der neutrophile Granulozyten, Alveolarmakrophagen, Epithelzellen und CD4+ T-Lymphozyten beteiligt sind (White et al. 2003). Alveolarmakrophagen und Epithelzellen gelten als Produzenten von TGF-β. Die TZR-Stimulation durch APZ und die Gegenwart von TGF-β könnten dazu führen, dass sich periphere CD4+ T-Zellen zu αEβ7+ CD4+ T-Zellen differenzieren und ins Epithel migrieren. Die repetiitive Stimulation durch APZ würde zu einer Reduktion der CD25-Expression von αEβ7+ CD4+ T-Zellen führen. αEβ7+ CD4+ T-Zellen könnten über zwei Mechanismen an der progressiven Fibrosierung des Interstitiums beteiligt sein. Zum einen sind sie in der Lage durch die Synthese von TGF-β (Banz et al. 2003, Huehn et al. 2004) die Kollagen-Synthese von Myofibroblasten zu stimulieren. Zum anderen können sich durch den Einfluß von IL-10 sezerniert von αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten T-Effektorzellen zu Th2-Zellen differenzieren, die über die Synthese der profibrotischen Zytokine IL-4 und IL-13 zur Pathogenese der interstitiellen Fibrose beitragen (Barbarin et al. 2005). Diskussion 76 αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten Epithelzellen Beschädigte Epithelzellen TGF-β Fibrin CD4+ T-Lymphozyten Kollagen IL-4 IL-13 MMPs Neutrophile Granulozyten Th2 TGF-β αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten IL-10 Myofibroblasten TE TGF-β Alveolarmakrophagen Abb. 6.3: Pathogenetisches Modell der Rolle von αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten bei der IPF/UIP: Ein repetitiver Stimulus kann zu einer Verletzung des Alveolarepithels führen. Dies hat eine Immunreaktion zur Folge, an der neutrophile Granulozyten, Alveolarmakrophagen und CD4+ T-Zellen beteiligt sind. Neutrophile Granulozyten sind in der Lage, mittels der Synthese von Matrixmetalloproteasen (MMPs) das Alveolarepithel zu schädigen. Durch die repetitive Stimulation durch APZ und dem Einfluß von TGF-β aus Alveolarmakrophagen wird auf den CD4+ T-Lymphozyten die Expression von αEβ7 induziert. Nun ergeben sich zwei Möglichkeiten, wodurch αEβ7+ CD4+ TLymphozyten an der Fibrosierung des Interstitiums beteiligt sein könnten. Zum einen sind sie in der Lage durch die Synthese von TGF-β die Kollagen-Synthese von Myofibroblasten zu stimulieren. Zum andern können sich durch den Einfluß von IL-10 sezerniert von αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten T-Effektorzellen zu Th2-Zellen differenzieren, die über die Synthese der profibrotischen Zytokine IL-4 und IL-13 zur Pathogenese der interstitiellen Fibrose beitragen können. 6.5 MOLEKULARE CHARAKTERISIERUNG VON αEβ7+ CD4+ T-LYMPHOZYTEN Neben der phänotypischen und funktionellen Charakterisierung sollten in der vorliegenden Arbeit auch molekulare Mechanismen analysiert werden, die an der Differenzierung von naiven CD4+ T-Lymphozyten aus dem peripheren Blut zu αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten beteiligt sind. Mögliche Schlüssel-Moleküle in diesem Zusammenhang bilden die Phosphoinositid 3-Kinasen (PI3K). Die verschiedenen Isoformen PI3Kα, β, γ und δ sind in die T-Zelldifferenzierung im Thymus involviert (Rodriguez-Borlado et al. 2003) und werden nach TZR-Stimulation aktiviert (Harriague und Bismuth 2002). Diskussion 77 6.5.1 Beteiligung der Phosphoinositid 3-Kinasen an der Differenzierung von CD4+ T-Lymphozyten zu αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten In der vorliegenden Arbeit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass der PI3K-Signalweg für die Differenzierung humaner CD4+ T-Zellen zu regulatorischen αEβ7+ CD4+ T-Zellen (Tr3) benötigt wird (Abb. 5.10, 5.11). Mit anti-CD3mAk, TGF-β1 und LY294002 inkubierte Zellen waren nicht in der Lage αEβ7 zu exprimieren. Auch die Expression der anderen untersuchten Oberflächenantigene, die den Phänotyp von αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten charakterisieren, wurde durch Inhibierung der PI3K beeinflusst. So führte Stimulation der Zellen mit anti-CD3mAk und TGF-β1 und Zugabe von LY294002 zur verminderten Expression der Aktivierungsmarker CD25, CD69 und CD95 und von CD45RO, einem Marker für Gedächtniszellen (Abb. 5.13, 5.14). Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit Resultaten aus tierexperimentellen Untersuchungen an murinen T-Lymphozyten, die mit einer p85α-Untereinheit transfiziert wurden, die die katalytische Untereinheit p110 der Klasse 1A der PI3K konstitutiv aktiviert (Borlado et al. 2000). Dort zeigte sich im Vergleich mit Wildtyp-Mäusen eine größere Fraktion von Gedächtnis-Zellen mit reduzierter CD45RB-Expression. Weiterhin wiesen die transfizierten CD4+ T-Lymphozyten einen aktivierten Phänotyp mit erhöhter CD69- und CD95-Expression auf, ohne dass eine Steigerung der CD25-Expression zu verzeichnen war (Borlado et al. 2000). An CD4+ T-Lymphozyten von p110δD910A/D910A Mäusen, die eine katalytisch inaktive p110δ exprimieren, konnte eine deutlich reduzierte Expression des CD44-Antigens, einem Aktivierungsmarker von Gedächtniszellen, nachgewiesen werden (Okkenhaug et al. 2002). Dies legt eine Beteiligung der Tyrosinkinase-assoziierten PI3K-Isoformen bei der durch TZR-Stimulation induzierten Expression von CD69, CD95 und CD45RO nahe. Im Gegensatz dazu zeigte sich bei PI3Kγ-defizienten Maus T-Lymphozyten die Oberflächenexpression von CD44, CD25, CD45, CD69 und LFA-1 (CD11b) in Lymphknoten und Milz nicht verändert (Sasaki et al. 2000). Wie bereits in Kapitel 2.4.2. dargestellt bildet AKT/PKB ein wichtiges Zielmolekül der PI3K. In murinen CD4+ T-Lymphozyten, die mit einer konstitutiv aktiven Form von Akt/PKB transfiziert waren, zeigten naive CD4+ T-Lymphozyten eine erhöhte Expression von CD69 und CD44. Nach Stimulation der Zellen war die CD69-Expression im Vergleich zu nicht transfizierten Zellen, bei unveränderter CD4- und CD3- Expression, gesteigert (Arimura et al. 2004). Diskussion 78 Um zu überprüfen, ob nicht nur die Aktivierung direkt nach Stimulation via den TZR, sondern auch die aktivierungsinduzierte Differenzierung zu Gedächtnis-Zellen PI3K-abhängig ist, wurden humane CD4+ T-Lymphozyten mit anti-CD3mAk und TGF-β1 präinkubiert und 24 Stunden nach Stimulation LY294002 hinzugegeben. Diese Experimente zeigten erstmals, dass die PI3K auch bei der aktivierungsinduzierten Differenzierung von naiven CD4+ T-Lymphozyten zu Gedächtnis-Zellen beteiligt sind. Die Expression von CD25, CD45RO und CD95 auf den Zellen blieb unverändert. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die Differenzierung von peripheren CD4+ T-Lymphozyten zu αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten und zu deren charakteristischen, aktivierten Phänotyp die Aktivierung der intrazellulären PI3K erfordert. 6.5.2 Beteiligung der Phosphoinositid 3-Kinasen an der Zytokinrezeptoren- und Zytokinsynthese In den durchgeführten Experimenten ließ sich kein Unterschied hinsichtlich der Zytokinsynthese von αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten und αEβ7- CD4+ T-Lymphozyten feststellen (eigene Beobachtungen). Eine Erklärung hierfür könnte die Aktivierung mittels anti-CD3mAk sein. Um die Zytokinsynthese von CD4+ T-Lymphozyten stärker zu stimulieren, wäre die Aktivierung der CD4+ T-Lymphozyten mittels APZ oder die zusätzliche Kostimulation via CD28 notwendig gewesen. Während die Th1-Zytokine IFN-γ und IL-2 eine zelluläre Immunantwort einleiten, sind IL-4 und IL-5 als Th2-Interleukine verantwortlich für die humorale Immunantwort (Delves und Roitt 2000a, Delves und Roitt 2000b). Die durchgeführten Experimente zeigen, dass die PI3K bei der TZR-Engagement-induzierten Synthese von IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 und IFN-γ in CD4+ T-Lymphozyten beteiligt sind. Auf mRNA-Niveau wurde die Expression von IL-2, IL-4 und IL-10 bereits 4 Stunden nach Zugabe von LY294002 beeinträchtigt, während sich die IFN-γ-mRNA-Synthese erst nach 24 Stunden deutlich abschwächte (eigene Beobachtungen). Ferner ist es in der vorliegenden Arbeit gelungen nachzuweisen, dass PI3K sowohl in die aktivierungsinduzierte Steigerung der IL-1β-mRNA-Synthese als auch in die Reduktion der TNF-R1-mRNA-Synthese involviert sind (Abb. 5.15). Allerdings wurde in diesen Ansätzen 24 Stunden nach Stimulation mittels TZR und TGF-β1 nur wenig IL-6- und GM-CSF-mRNA Diskussion 79 exprimiert. Dies könnte möglicherweise wiederum auf die unzureichende Kostimulation zurückzuführen sein. Die hier an humanen Zellen gemachten Beobachtungen können durch eine tierexperimentelle Studie an murinen T-Lymphozyten bestätigt werden (Eder et al. 1998). Die anti-CD3mAk vermittelte IL-2-Produktion von murinen T-Lymphozyten wurde sowohl durch Wortmannin und LY294002 als auch durch Einführung einer p85 UE, die nicht an p110 binden kann, inhibiert. Diese Resultate sprechen zumindest für eine Beteiligung der Klasse IA der PI3K, da die katalytische UE der Klasse IB PI3K, die PI3Kγ nicht mit p85, sondern mit p101 assoziiert ist. Allerdings finden sich auch Hinweise, dass die PI3Kγ an der IL-2 und IFN-γ-Synthese beteiligt ist, da in CD4+ T-Lymphozyten von PI3Kγ -/- Mäusen die Synthese von IL-2 und IFN-γ nach Stimulation mit anti-CD3mAk reduziert war (Sasaki et al. 2000). Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass PI3K sowohl an der Synthese von Th1als auch an Th2-Zytokinen beteiligt ist. Dies ist im Einklang mit Beobachtungen, die an CD4+ T-Lymphozyten der Maus mit einer konstitutiv aktiven Akt/PKB durchgeführt wurden. Das permanent aktivierte Enzym führte sowohl zur Amplifizierung der Th1- als auch der Th2-Antwort (Arimura et al. 2004). Bei Inhibition der PI3K und Aktivierung der Zellen mit anti-CD3mAK wurde die GM-CSF-Rezeptor-mRNA Expression gesteigert (Abb. 5.16). Der GM-CSF-Rezeptor wird bei Lymphozyten vorwiegend während der Differenzierung im Thymus exprimiert (Smith et al. 1996). Es ist bekannt, das die Transkriptionsfaktoren PU.1 und C/EBPα an der Regulierung von der GM-CSF-Rezeptor mRNA beteiligt sind (Smith et al. 1996). In einer Zelllinie aus Maus-Embryonen konnte die PI3K/Akt abhängige Aktivierung von PU.1 gezeigt werden (Rieske und Pongubala 2001). Bisher ist eine Beteiligung der PI3K bei der Aktivierung von C/EBPα nicht bekannt. Möglich wäre, dass in humanen CD4+ T-Lymphozyten die Aktivität von C/EBP durch Inhibierung der PI3K gesteigert wird oder auch, das in humanen CD4+ T-Lymphozyten distinkte Signalwege in die Regulierung der GM-CSF-Rezeptor mRNA involviert sind. Insgesamt betrachtet lässt sich festhalten, dass die PI3K in die durch TZR-Stimulation induzierte Synthese der Zytokine IL-2, IL-4, IL-10 und IFN-γ von CD4+ T-Lymphozyten. involviert sind. Des Weiteren ist die IL-1β- und TNF-R2-mRNA-Synthese nach Inhibierung der PI3K reduziert. Diskussion 80 6.5.3 Beteiligung der Phosphoinositid 3-Kinasen an der Proliferation und Homöostase Ein Charakteristikum von αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten ist die gesteigerte Proliferation. In dieser Arbeit sollte überprüft werden inwieweit die Familie der PI3K an der Proliferation und an der homöostatischen Kontrolle von CD4+ T-Lymphozyten beteiligt ist. Die durchgeführten Experimente machen deutlich, dass der Signalweg über die PI3K benötigt wird für die Proliferation von CD4+ T-Lymphozyten (Abb. 5.20). Darüber hinaus war die Viabilität der Zellen bei Inhibierung der PI3K reduziert (Abb. 5.21). In humanen T-Lymphozyten aus dem peripheren Blut gesunder Spender inhibierte Wortmannin die anti-CD3mAk und PHA-induzierte Proliferation (Exley und Varticovski 1997). Im Gegensatz dazu wurde die Aktivierung durch PMA in Jurkat Zellen nicht beeinflusst. (Exley und Varticovski 1997). PMA stimuliert T-Lymphozyten unabhängig vom T-Zellerezeptor direkt durch Aktivierung der PKC (Saloga et al. 1993). Somit ist die PI3K wahrscheinlich proximal von PKC in der Signalkaskade der T-Zellaktivierung involviert. In murinen T-Lymphozyten mit katalytisch inaktiver p110δ UE (p110δD910A/D910A) war die anti-CD3mAk und die APZ induzierte Proliferation reduziert, während die durch antiCD3mAk und anti-CD28mAk-Kostimulation bzw. die durch PMA und Ionomyzin induzierte Proliferation nicht beeinträchtigt war (Okkenhaug et al. 2002). Ähnliche Ergebnisse fanden sich auch in T-Lymphozyten von PI3Kγ-“Knock-out” -Mäusen, wo die anti-CD3mAk vermittelte Proliferation beeinträchtigt war, aber die anti-CD3mAk und anti-CD28mAk bzw. die PMA und Ionomyzin induzierte Proliferation nicht beeinflusst wurde (Sasaki et al. 2000). Diese Resultate legen eine Beteiligung der PI3K Klasse IA und B an der aktivierungsinduzierten Proliferation nahe. Allerdings existieren auch PI3K unabhängige Mechanismen, wie die nicht inhibierte Stimulation durch anti-CD3mAk und anti-CD28mAk vermuten lässt. In P65PI3K transgenen Mäusen, die mit einer Deletionsmutante von p85α transfiziert waren, welche die katalytische UE konstitutiv aktivierte, war In 12-15 Monate alten Mäusen eine massive Zunahme der CD4+ T-Lymphozyten in Milz und Lymphknoten feststellbar (Borlado et al. 2000). Die Zahl der peripheren B-Lymphozyten und Makrophagen und CD8+ T-Lymphozyten nahm hingegen nur leicht zu. Lymphoide Infiltrate, zu 60% aus CD4+ T-Zellen bestehend, waren in multiplen Organen nachweisbar, z. B. in Speicheldrüsen, Diskussion 81 Niere, Herz und Ovar. Am stärksten war jedoch die Lunge betroffen. Im Gegensatz zu CD8+ T-Lymphozyten zeigte sich die Viabilität der CD4+ T-Lymphozyten verglichen mit T-Zellen aus Wildtyp-Mäusen verlängert. Zusätzlich war in den P65PI3K transgenen Mäusen eine Prädisposition zur Entwicklung von T-Zell Lymphomen und Auto-Immunerkrankungen nachweisbar. Diese Resultate weisen auf eine Funktion der PI3K bei der Regulierung der Viabilität und der Homöostase von T-Lymphozyten, insbesondere der CD4+ Subpopulation hin. Weder in Tiermodellen, noch bei Anwendung der spezifischen Inhibtioren der PI3K wurde eine Beeinträchtigung der Tyrosin-Phosphorylierung der T-Zellrezeptor assoziierten Tyrosinkinasen nachgewiesen (Arimura et al. 2004, Eder et al. 1998, Exley und Varticovski 1997). Allerdings konnte gezeigt werden, dass die nukleäre Translokation der Transkriptionsfaktoren NF-AT und von AP-1 PI3K-abhängig ist (Eder et al. 1998). Sowohl NFAT als auch die Transkriptionsfaktoren AP-1, NF-κB und Oct-1 sind zur IL-2-Gen Expression notwendig. Dies spricht für eine Rolle der PI3K in der Signalkaskade zwischen den TZR-assoziierten Tyrosinkinasen und der Aktivierung der Tranksriptionsfaktoren. In Studien mit Jurkat Zellen, einer humanen Tumorzellinie, konnte beobachtet werden, dass die PI3K eine negative Rolle bei der TZR-vermittelten Aktivierung spielen (Reif et al. 1997). In Jurkat Zellen führte eine konstitutiv aktivierte Mutante der PI3K zur Reduktion der NFATAktivtät, während eine funktoslose Mutante der PI3K in der Aktivierung von NFAT resultiert. Ferner bestand in Jurkat Zellen keine Interferenz von Wortmannin mit der TZR-induzierten Aktivierung (Jascur et al. 1997). Vielmehr konnte nachgewiesen werden, dass die Rolle der regulatorischen Untereinheit eher einer Adapterfunktion gleicht. Die Ergebnisse der eben erwähnten Studien stehen im Widerspruch mit den Resultaten der vorliegenden Arbeit. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, dass in Jurkat Zellen PTEN nicht exprimiert wird. PTEN, Produkt eines Tumorsupressorgens, ist eine Phosphatase, welche die Entfernung des durch die PI3K übertragenen D3-Phosphatrestes katalysiert (Seminario et al. 2003). Somit liegt in Jurkat Zellen bereits in nicht aktiviertem Zustand ein hohes Niveau an PIP3 vor, was intrazelluläre Signalübertragungsmechanismen verändert. Fasst man die Ergebnisse und Beobachtungen zusammen, lässt sich hervorheben, dass bei CD4+ T-Lymphozyten der PI3K-Signalweg beteiligt ist an der Differenzierung zu αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten, der Entwicklung des aktivierten Phänotyps, der Proliferation und an der Zytokinsynthese (Abb. 6.4). Ein möglicher Mechanismus der Beteiligung der Diskussion 82 PI3K an der Aktivierung von CD4+ T-Lymphozyten beruht auf der Akkumulierung von “Lipid rafts” an der Fläche zwischen APZ und T-Lymphozyt (Okkenhaug et al. 2002). “Lipid rafts” sind Sphingolipid und Cholesterol reiche Mikrodomänen, in denen eine Anhäufung von Signalmolekülen wie src-Kinasen und GTP-asen zu beobachten ist (Schade und Levine 2002). In T-Lymphozyten aus p110δD910A/D910A Mäusen war nach Stimulation mit anti-CD3mAk und anti-CD28mAk die Kapazität zur Formierung von “Lipid rafts” deutlich reduziert (Okkenhaug et al. 2002). In der vorliegenden Arbeit gezeigt werden konnte, dass die Phosphoinositid 3-Kinasen die Differenzierung von CD4+ T-Lymphozyten zu regulatorischen αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten (Tr3) sowie deren Zytokinsynthese und Proliferation kontrollieren. Nun stellt sich die Frage, welche der verschiedenen Isoformen der PI3K hieran beteiligt sind, da sich möglicherweise durch die Entwicklung selektiver Inhibitoren der unterschiedlichen PI3K-Typen neue therapeutische Zugänge für die Behandlung der IPF/UIP, aber auch von Allergien oder Tumorerkrankungen, ergeben (Drees et al. 2004, Wetzker und Rommel 2004, Wymann et al. 2003). αEβ7 CD25 CD95 Proliferation CD69 PI3K Zytokinsynthese CD45RO Abb. 6.4: Phosphoinositid 3-Kinasen (PI3K) sind zentrale Signalmoleküle bei der TZR und TGF-β-induzierten Differenzierung von CD4+T-Lymphozyten zu αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten (Tr3). Schlussfolgerung und Ausblick 83 7. SCHLUSSFOLGERUNG & AUSBLICK In der vorliegenden Arbeit ist es gelungen zu zeigen, dass des sich bei αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten, die bei der pulmonalen Fibrose expandieren, um eine hochpotente Subpopulation von CD4+ T-Lymphozyten handelt, die durch einen erhöhten Aktivierungsstatus und eine gesteigerte Proliferation charakterisiert sind. Ferner lässt sich dieser Subtyp durch die Expression von FoxP3-mRNA den T-regulatorischen Lymphozyten (Treg) zuordnen. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass Phosphoinositid 3-Kinasen (PI3K) sowohl an die Differenzierung von CD4+ T-Lymphozyten zu regulatorischen αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten (Tr3) als auch an der Proliferation, an der Differenzierung zu Gedächtniszellen und an der Zytokinsynthese von CD4+ T-Lymphozyten beteiligt sind. Folgende Schlussfolgerungen lassen sich hieraus ableiten: Es ergeben sich therapeutische Ansätze aus den dieser Arbeit zugrunde liegenden Ergebnissen: Da CD4+ T-Lymphozyten in Anwesenheit von TGF-β bei zusätzlicher TZR-Stimulation das Integrin αEβ7 exprimieren, könnte bei IPF/UIP versucht werden die Synthese von des Zytokins zu hemmen bzw. seine Wirkung zu blockieren. Darüber hinaus ist es möglich über die Inhibierung der Phosphoinositid 3-Kinasen die Differenzierung von peripheren CD4+ T-Lymphozyten zu regulatorischen αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten (Tr3), sowie deren Zytokinsynthese und Proliferation zu inhibieren. Allerdings wurden in den durchgeführten Experimente die CD4+ T-Lymphozyten in vitro mit anti-CD3mAk bzw. anti-CD3mAk und TGF-β1 stimuliert. In vivo werden CD4+ T-Lymphozyten von Makrophagen und anderen APZ aktiviert. Ferner existiert in der Lunge, insbesondere bei der pulmonalen Fibrose ein besonderes Zytokinmilieu, das die Aktivierung der CD4+ T-Zellen beeinflussen kann. Die Untersuchung dieser Effekte hätte die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit übertroffen. Das Ziel zukünftiger Experimente ist es, die in dieser Arbeit beschriebenen Charakteristika von in vitro kultivierten αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten mit αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten aus der BALF von Patienten mit IPF/UIP zu vergleichen. Dies könnte dadurch erreicht werden, dass man αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten aus der BALF von Patienten mit IPF/UIP isoliert und die Schlussfolgerung und Ausblick 84 FoxP3-mRNA-Expression untersucht. Ferner ist es ein Ziel, die regulatorischen Mechanismen von αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten, insbesondere die Zytokinsynthese in Gegenwart verschiedener Kostimulantien, die im Rahmen der IPF/UIP eine Rolle spielen (z. B. IL-8, TNF-α) zu analysieren. Darüber hinaus erlaubt es die Entwicklung Isoform-spezifischer Inhibitoren der PI3K zu untersuchen, welche Typen der PI3K an der Aktivierung von CD4+ T-Lymphozyten beteiligt sind. Als potentielle Zielmoleküle bieten sich hierbei PI3Kγ und PI3Kδ an, die vornehmlich in Leukozyten exprimiert werden. Literaturverzeichnis 85 8 LITERATURVERZEICHNIS Agusti C (2002) American Thoracic Society/European Respiratory Society International Multidisciplinary Consensus Classification of the Idiopathic Interstitial Pneumonias (vol 165, pg 277, 2002). American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 166: 426-426. Arimura Y, Shiroki F, Kuwahara S, Kato H, Dianzani U, Uchiyama T and Yagi J (2004) Akt is a neutral amplifier for Th cell differentiation. Journal of Biological Chemistry 279: 11408-11416. Baldari CT, Disomma MM, Milia E, Bergman M and Telford JL (1995a) Interactions between the Tyrosine Kinases P56lck, P59fyn and P50csk in CD4 Signaling in T-Cells. European Journal of Immunology 25: 919-925. Baldari CT, Milia E, Disomma MM, Baldoni F, Valitutti S and Telford JL (1995b) Distinct Signaling Properties Identify Functionally Different CD4 Epitopes. European Journal of Immunology 25: 1843-1850. Banz A, Peixoto A, Pontoux C, Cordier C, Rocha B and Papiernik M (2003) A unique subpopulation of CD4+ regulatory T cells controls wasting disease, IL-10 secretion and T cell homeostasis. European Journal of Immunology 33: 2419-2428. Barabarin V, Xing Z, Delos M, Lison D and Huaux F (2005) Pulmonary overexpression of IL-10 augments lung fibrosis and Th2 responses induced by silicia particles. American Journal of Physiology - Lung cellular and molecular Physiology 288 (5): L 841-848. Bartram U and Speer CP (2004) The role of transforming growth factor β in lung development and disease. Chest 125: 754-765. Bokoch GM, Vlahos CJ, Wang Y, Knaus UG and TraynorKaplan AE (1996) Rac GTPase interacts specifically with phosphatidylinositol 3-kinase. Biochemical Journal 315: 775-779. Bondev A, Rubio I and Wetzker R (1999) Differential regulation of lipid and proteins kinase activities of phosphoinositide 3-kinase γ in vitro. Biological Chemistry 380: 1337-1340. Bondeva T, Pirola L, Bulgarelli-Leva G, Rubio I, Wetzker R and Wymann MP (1998) Bifurcation of lipid and protein kinase signals of PI3K γ to the protein kinases PKB and MAPK. Science 282: 293-296. Borlado LR, Redondo C, Alvarez B, Jimenez C, Criado LM, Flores J, Marcos MAR, Martinez C, Balomenos D and Carrera AC (2000) Increased phosphoinositide 3-kinase activity induces a lymphoproliferative disorder and contributes to turner generation in vivo. Faseb Journal 14: 895903. Braun RK, Foerster M, Grahmann PR, Haefner D, Workalemahu G and Kroegel C (2003) Phenotypic and molecular characterization of CD103+ CD4+ T cells in broncho-alveolar lavage from patients with interstitial lung diseases. Cytometry Part B-Clinical Cytometry 54B: 19-27. Braun RK, SternerKock A, Kilshaw PJ, Ferrick DA and Giri SN (1996) Integrin αEβ7 expression on BAL CD4+, CD8+, and γδ T-cells in bleomycin-induced lung fibrosis in mouse. European Respiratory Journal 9: 673-679. Literaturverzeichnis 86 Brennan P, Babbage JW, Burgering BMT, Groner B, Reif K and Cantrell DA (1997) Phosphatidylinositol 3-kinase couples the interleukin-2 receptor to the cell cycle regulator E2F. Immunity 7: 679-689. Butcher EC and Picker LJ (1996) Lymphocyte homing and homeostasis. Science 272: 60-66. Cao D, Malmstrom V, Baecher-Allan C, Hafler D, Klareskog L, Trollmo C (2003). Isolation and functional characterization of regulatory CD25bright CD4+ T cells from the target organ of patients with rheumatoid arthritis. European Journal Immunology 33: 215-223. Carding SR and Egan PJ (2002) γδ T cells: Functional plasticity and heterogeneity. Nature Reviews Immunology 2: 336-345. Carrel S, Moretta A, Pantaleo G, Tambussi G, Isler P, Perussia B and Cerottini JC (1988) Stimulation and Proliferation of CD4+ Peripheral-Blood Lymphocytes-T Induced by an AntiCD4 Monoclonal-Antibody. European Journal of Immunology 18: 333-339. Cepek KL, Shaw SK, Parker CM, Russell GJ, Morrow JS, Rimm DL and Brenner MB (1994) Adhesion between Epithelial-Cells and T-Lymphocytes Mediated by E-Cadherin and the Integrin αEβ7. Nature 372: 190-193. Chan AC and Shaw AS (1996) Regulation of antigen receptor signal transduction by protein tyrosine kinases. Current Opinion in Immunology 8: 394-401. Chen WJ, Jin WW, Hardegen N, Lei KJ, Li L, Marinos N, McGrady G and Wahl SM (2003) Conversion of peripheral CD4+CD25- naive T cells to CD4+CD25+ regulatory T cells by TGF-β induction of transcription factor Foxp3. Journal of Experimental Medicine 198: 1875-1886. Chiariello M, Marinissen MJ and Gutkind JS (2001) Regulation of c-myc expression by PDGF through Rho GTPases. Nature Cell Biology 3: 580-586. Coultas DB, Zumwalt RE, Black WC and Sobonya RE (1994) The Epidemiology of Interstitial Lung-Diseases. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 150: 967-972. Crackower MA, Oudit GY, Kozieradzki I, Sarao R, Sun H, Sasaki T, Hirsch E, Suzuki A, Shioi T, Irie-Sasaki J, Sah R, Cheng HYM, Rybin VO, Lembo G, Fratta L, Oliveira-dos-Santos AJ, Benovic JL, Kahn CR, Izumo S, Steinberg SF, Wymann MP, Backx PH and Penninger JM (2002) Regulation of myocardial contractility and cell size by distinct PI3K-PTEN signaling pathways. Cell 110: 737-749. Curnock AP and Ward SG (2003) Development and characterisation of tetracycline-regulated phosphoinositide 3-kinase mutants: assessing the role of multiple phosphoinositide 3-kinases in chemokine signaling. Journal of Immunological Methods 273: 29-41. Dall'Aglio PP, Pesci A, Bertorelli G, Brianti E, Scarpa S (1988). Study of immune complexes in bronchoalveolar lavage fluids. Respiration 54 Suppl 1:36-41. Dawson JK, Fewins HE, Desmond J, Lynch MP and Graham DR (2001) Fibrosing alveolitis in patients with rheumatoid arthritis as assessed by high resolution computed tomography, chest radiography, and pulmonary function tests. Thorax 56: 622-627. Literaturverzeichnis 87 de Kleer IM, Wedderburn LR, Taams LS, Patel A, Varsani H, Klein M, de Jager W, Pugayung G, Giannoni F, Rijkers G, Albani S, Kuis W, Prakken B (2004). CD4+CD25bright regulatory T cells actively regulate inflammation in the joints of patients with the remitting form of juvenile idiopathic arthritis. Journal of Immunology 172:6435-6443. Delves PJ and Roitt IM (2000a) Advances in immunology: The immune system - Second of two parts. New England Journal of Medicine 343: 108-117. Delves PJ and Roitt IM (2000b) The immune system - First of two parts. New England Journal of Medicine 343: 37-49. Downing JR and Reynolds AB (1991) PDGF, CSF-1, and EGF Induce Tyrosine Phosphorylation of P120, a Pp60src Transformation-Associated Substrate. Oncogene 6: 607-613. Drees BE, Millis GB, Rommel C und Prestwich GD (2004) Therapeutic potential of phosphoinositid 3-kianse inhibitors. Expert Opinion on Therapeutic Patents 14: 703-732. Eder AM, Dominguez L, Franke TF and Ashwell JD (1998) Phosphoinositide 3-kinase regulation of T cell receptor-mediated interleukin-2 gene expression in normal T cells. Journal of Biological Chemistry 273: 28025-28031. Erle DJ, Brown T, Christian D and Aris R (1994) Lung Epithelial Lining Fluid T-Cell Subsets Defined by Distinct Patterns of β-7 and β-1 Integrin Expression. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology 10: 237-244. Exley M and Varticovski L (1997) Evidence for phosphatidylinositol 3-kinase-dependent T cell antigen receptor (TCR) signal transduction. Molecular Immunology 34: 221-226. Fantini MC, Becker C, Monteleone G, Pallone F, Galle PR and Neurath MF (2004) TGF-β induces a regulatory phenotype in CD4+CD25- T cells through Foxp3 induction and down regulation of Smad7. Journal of Immunology 172: 5149-5153. Fontenot JD, Gavin MA and Rudensky AY (2003) Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology 4:330-336. Foukas LC, Beeton CA, Jensen J, Philips WA and Shepherd PR (2004a) Regulation of phosphoinositide 3-kinase by its intrinsic serine kinase activitiy in vivo. Molecular and Cellular Biology 24: 966-975. Foukas LC and Shepherd PR (2004b) eIF4E binding protein 1 and H-Ras are novel substrates for the protein kinase activity of class-I phosphoinositide 3-kinase. Biochemical and Biophysical Research communications 25: 541-549. Freeburn RW, Wright KL, Burgess SJ, Astoul E, Cantrell DA and Ward SG (2002) Evidence that SHIP-1 contributes to phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate metabolism in T lymphocytes and can regulate novel phosphoinositide 3-kinase effectors. Journal of Immunology 169: 5441-5450. Fukaura H, Kent SC, Pietrusewicz MJ, Khoury SJ, Weiner HL and Hafler DA (1996). Induction of circulating myelin basic protein and proteolipid protein-specific transforming growth factor-1secreting Th3 T cells by oral administration of myelin in multiple sclerosis patients. Journal of. Clinical Investigation 98:70-77. Literaturverzeichnis 88 Gorelik L and Flavell RA (2002) Transforming growth factor-β in T-cell biology. Nature Reviews Immunology 2: 46-53. Gratzner HG (1982) Monoclonal-Antibody to 5-Bromodeoxyuridine and 5-Iododeoxyuridine - a New Reagent for Detection of DNA-Replication. Science 218: 474-475. Gratzner HG and Leif RC (1981) An Immunofluorescence Method for Monitoring DNASynthesis by Flow-Cytometry. Cytometry 1: 385-389. Gratzner HG, Leif RC, Ingram DJ and Castro A (1975) Use of Antibody Specific for Bromodeoxyuridine for Immunofluorescent Determination of DNA-Replication in Single Cells and Chromosomes. Experimental Cell Research 95: 88-94. Gross TJ and Hunninghake GW (2001) Idopathic pulmonary fibrosis. New England Journal of Medicine 345, 517-525. Groux H (2003) Type 1 T-regulatory cells: their role in the control of immune responses. Transplantation 75:8S-12S. Han A, Saijo K, Mecklenbrauker I, Tarakhovsky A and Nussenzweig MC (2003) Bam32 links the B cell receptor to ERK and JNK and mediates B cell proliferation but not survival. Immunity 19: 621-632. Harriague J and Bismuth G (2002) Imaging antigen-induced PI3K activation in T cells. Nature Immunology 3: 1090-1096. Hirsch E, Katanaev VL, Garlanda C, Azzolino O, Pirola L, Silengo L, Sozzani S, Mantovani A, Altruda F and Wymann MP (2000) Central role for G protein-coupled phosphoinositide 3-kinase γ in inflammation. Science 287: 1049-1053. Hori S, Nomura T and Sakaguchi S (2003) Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science 299: 1057-1061. Horwitz DA, Zheng SG and Gray JD (2003) The role of the combination of IL-2 and TGF-β or IL-10 in the generation and function of CD4+CD25+ and CD8+ regulatory T cell subsets. Journal of Leukocyte Biology 74: 471-478. Huehn J, Siegmund K, Lehmann JCU, Siewert C, Haubold U, Feuerer M, Debes GF, Lauber J, Frey O, Przybylski GK, Niesner U, de la Rosa M, Schmidt CA, Bauer R, Buer J, Scheffold A and Hamann A (2004) Developmental stage, phenotype, and migration distinguish naive- and effector/memory-like CD4+ regulatory T cells. Journal of Experimental Medicine 199: 303-313. Hynes RO (1992) Integrins - Versatility, Modulation, and Signaling in Cell-Adhesion. Cell 69: 11-25. Innis MA, Myambo KB, Gelfand DH and Brow MAD (1988) DNA Sequencing with ThermusAquaticus DNA-Polymerase and Direct Sequencing of Polymerase Chain Reaction-Amplified DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 85: 9436-9440. Jabado N, Ledeist F, Fischer A and Hivroz C (1994) Interaction of HIV Gp120 and Anti-CD4 Antibodies with the CD4 Molecule on Human CD4+ T-Cells Inhibits the Binding-Activity of NF-AT, NF-Chi-B and AP1, 3 Nuclear Factors Regulating Interleukin-2 Gene Enhancer Activity. European Journal of Immunology 24: 2646-2652. Literaturverzeichnis 89 Jabado N, Pallier A, LeDeist F, Bernard F, Fischer A and Hivroz C (1997) CD4 ligands inhibit the formation of multifunctional transduction complexes involved in T cell activation. Journal of Immunology 158: 94-103. Jascur T, Gilman J and Mustelin T (1997) Involvement of phosphatidylinositol 3-kinase in NFAT activation in T cells. Journal of Biological Chemistry 272: 14483-14488. Kato H, Faria TN, Stannard B, Roberts CT and Leroith D (1993) Role of Tyrosine KinaseActivity in Signal Transduction by the Insulin-Like Growth Factor-I (Igf-I) Receptor Characterization of Kinase-Deficient Igf-I Receptors and the Action of an Igf-I-Mimetic Antibody (Alpha-Ir-3). Journal of Biological Chemistry 268: 2655-2661. Katzenstein ALA, Myers JL. Idiopathic pulmonary fibrosis (1998) Clinical relevance of pathologic classification. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 157:13011315 Khalil N, Oconnor RN, Unruh HW, Warren PW, Flanders KC, Kemp A, Bereznay OH and Greenberg AH (1991) Increased Production and Immunohistochemical Localization of Transforming Growth-Factor-Beta in Idiopathic Pulmonary Fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology 5: 155-162. Komata T, Cruikshank WW and Kelso A (2003) Sustained linked stimulation via CD3 and CD4 is required for the IL-4-independent development of IL-4 synthesizing CD4+ T cells. Immunology and Cell Biology 81: 283-288. Kristensson K, Borrebaeck CAK and Carlsson R (1992) Human CD4+ T-Cells Expressing CD45RA Acquire the Lymphokine Gene-Expression of CD45RO+ T-Helper Cells after Activation In vitro. Immunology 76: 103-109. Kuhn C. The pathogenesis of pulmonary fibrosis (1993) Monographs of Pathology 36:78-92 Kukreja A, Cost G, Marker J, Zhang C, Sun Z, Lin-Su K, Ten S, Sanz M, Exley M, Wilson B, Porcelli S and Mclaren N (2002) Multiple immuno-regulatory defects in type-1 diabetes. Journal of Clinical Investigation 109: 131-140. Laffargue M, Calvez R, Finan P, Trifilieff A, Barbier M, Altruda F, Hirsch E and Wymann MP (2002) Phosphoinositide 3-kinase γ is an essential amplifier of mast cell function. Immunity 16: 441-451. Lehmann J, Huehn J, de la Rosa M, Maszyna F, Kretschmer U, Krenn V, Brunner M, Scheffold A and Hamann A (2002) Expression of the integrin αEβ7 identifies unique subsets of CD25+ as well as CD25- regulatory T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99: 13031-13036. Levings MK, Bacchetta R, Schulz U and Roncarolo MG (2002) The role of IL-10 and TGF-β in the differentiation and effector function of T regulatory cells. International Archives of Allergy and Immunology 129:263-276. Liu KD, Gaffen SL, Goldsmith MA and Greene WC (1997) Janus kinases in interleukin-2mediated signaling: JAK1 and JAK3 are differentially regulated by tyrosine phosphorylation. Current Biology 7: 817-826. Literaturverzeichnis 90 Lohmeyer J, Friedrich J, Grimminger F, Maus U, Tenter R, Morr H, Velcovsky HG, Seeger W and Rosseau S (1999) Expression of mucosa-related integrin αEβ7 on alveolar T cells in interstitial lung diseases. Clinical and Experimental Immunology 116: 340-346. LopezIlasaca M, Crespo P, Pellici PG, Gutkind JS and Wetzker R (1997) Linkage of G proteincoupled receptors to the MAPK signaling pathway through PI 3-kinase γ. Science 275: 394-397. Mannering SI, Zhong J and Cheers C (2002) T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection. Immunology 106: 87-95. Marinari B, Simeoni L, Schraven B, Piccolella E and Tuosto L (2003) The activation of Csk by CD4 interferes with TCR-mediated activatory signaling. European Journal of Immunology 33: 2609-2618. McHugh RS, Whitters MJ, Piccirillo CA, Young DA, Shevach EM, Collins M and Byrne MC (2002) CD4+CD25+ immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveals a functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor. Immunity 16: 311-323. Miltenyi S, Muller W, Weichel W and Radbruch A (1990) High-Gradient Magnetic CellSeparation with Macs. Cytometry 11: 231-238. Neg WF, Duggan PJ, Ponchel F, Matarese G, Lombardi G, Edwards AD, Isaacs JD, and Lechler RI (2001) Human CD4+CD25+ cells: a naturally occurring population of regulatory T cells. Blood 98:2736. Okkenhaug K, Bilancio A, Emery JL and Vanhaesebroeck B (2004) Phosphoinositide 3-kinase in T cell activation and survival. Biochemical Society Transactions 32: 332-335. Okkenhaug K, Bilancio A, Farjot G, Priddle H, Sancho S, Peskett E, Pearce W, Meek SE, Salpekar A, Waterfield MD, Smith AJH and Vanhaesebroeck B (2002) Impaired B and T cell antigen receptor signaling in p110δ PI 3-kinase mutant mice. Science 297: 1031-1034. Okkenhaug K and Vanhaesebroeck B (2003) PI3K in lymphocyte development, differentiation and activation. Nature Reviews Immunology 3: 317-330. Ottemann KM, Xiao WZ, Shin YK and Koshland DE (1999) A piston model for transmembrane signaling of the aspartate receptor. Science 285: 1751-1754. Parker CM, Cepek KL, Russell GJ, Shaw SK, Posnett DN, Schwarting R and Brenner MB (1992) A Family of β-7 Integrins on Human Mucosal Lymphocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 89: 1924-1928. Patra AK, Na SY and Bommhardt U (2004) Active protein kinase B regulates TCR responsiveness by modulating cytoplasmic-nuclear localization of NFAT and NF-κB proteins. Journal of Immunology 172: 4812-4820. Patrucco E, Notte A, Baberis L, Selvetella G, Maffei A, Brancaccio, Marengo S, Russo G, Azzolino O, Rybalkin SD, Silengo L, Altruda F, Wetzker R, Wymann MP, Lembo G, Hirsch E (2004) PI3Kγ modulates the cardiac response to chronic pressure overload by distinct kinasedependent and –independent effects. Cell 118: 375-387. Literaturverzeichnis 91 Putheti P, Morris M, Stawiarz L, Teleshova N, Kivisakk P, Pashenkov M, Kouwenhoven M, Wiberg MK, Bronge L, Huang YM, Sonderstrom M, Hillert J and Link H (2003) Multiple sclerosis: a study of chemokine receptors and regulatory T cells in relation to MRI variables. European Journal of Neurology10: 529-535. Raghu G, Striker LJ, Hudson LD and Striker GE (1985) Extracellular matrix in normal and fibrotic human lungs. American Review of Respiratory Disease 131:281-289. Reif K, Lucas S and Cantrell D (1997) A negative role for phosphoinositide 3-kinase in T-cell antigen receptor function. Current Biology 7: 285-293. Reynolds LF, Smyth LA, Norton T, Freshney N, Downward J, Kioussis D and Tybulewicz VLJ (2002) Vav1 transduces T cell receptor signals to the activation of phospholipase C-gamma 1 via phosphoinositide 3-kinase-dependent and -independent pathways. Journal of Experimental Medicine 195: 1103-1114. Rieske P and Pongubala JMR (2001) AKT induces transcriptional activity of PU.1 through phosphorylation-mediated modifications within its transactivation domain. Journal of Biological Chemistry 276: 8460-8468. Rihs S, Walker C, Virchow JC, Boer C, Kroegel C, Giri SN and Braun RK (1996) Differential expression of αEβ7 integrins on bronchoalveolar lavage T lymphocyte subsets: Regulation by α4β1-integrin crosslinking and TGF-β. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology 15: 600-610. Rodriguez-Borlado L, Barber DF, Hernandez C, Rodriguez-Marcos MA, Sanchez A, Hirsch E, Wymann M, Martinez C and Carrera AC (2003) Phosphatidylinositol 3-kinase regulates the CD4/CD8 T cell differentiation ratio. Journal of Immunology 170: 4475-4482. Roncarolo MG, Bacchetta R, Bordignon C, Narula S and Levings MK (2001) Type 1 T regulatory cells. Immunolagical Reviews 182:68-79. Sakugachi S, Sakugachi N, Asanao M, Itoh M, Toda M (1995) Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2-receptor β-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. Journal of Immunology 155: 1151-1164. Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA and Arnheim N (1985) Enzymatic Amplification of Beta-Globin Genomic Sequences and Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle-Cell Anemia. Science 230: 1350-1354. Saloga J, Schwinzer R, Renz H, Terada N, Or R and Gelfand EW (1993) Characterization of the Progression Signal for Human T-Cell Proliferation Provided by Monoclonal-Antibodies to the CD3-TCR Complex. Clinical Immunology and Immunopathology 67: 232-239. Sasaki T, Irie-Sasaki J, Jones RG, Oliveira-dos-Santos AJ, Stanford WL, Bolon B, Wakeham A, Itie A, Bouchard D, Kozieradzki I, Joza N, Mak TW, Ohashi PS, Suzuki A and Penninger JM (2000) Function of PI3K γ in thymocyte development, T cell activation, and neutrophil migration. Science 287: 1040-1046. Schade AE and Levine AD (2002) Lipid raft heterogeneity in human peripheral blood T lymphoblasts: A mechanism for regulating the initiation of TCR signal transduction. Journal of Immunology 168: 2233-2239. Literaturverzeichnis 92 SchmidAntomarchi H, Benkirane M, Breittmayer V, Husson H, Ticchioni M, Devaux C and Rossi B (1996) HIV induces activation of phosphatidylinositol 4-kinase and mitogen-activated protein kinase by interacting with T cell CD4 surface molecules. European Journal of Immunology 26: 717-720. Schmidt U, Boucheron N, Unger B and Ellmeier W (2004) The role of Tec family kinases in myeloid cells. International Archives of Allergy and Immunology 134: 65-78. Schon MP, Arya A, Murphy EA, Adams CM, Strauch UG, Agace WW, Marsal J, Donohue JP, Her H, Beier DR, Olson S, Lefrancois E, Brenner MB, Grusby MJ and Parker CM (1999) Mucosal T lymphocyte numbers are selectively reduced in integrin αE (CD103)-deficient mice. Journal of Immunology 162: 6641-6649. Schon MP, Schon M, Warren HB, Donohue and Parker CM (2000) Cutaneous inflammatory disorder in integrin αE (CD103) deficient mice. Journal of Immunolgy 165: 6583-6589. Scott DE, Gause WC, Finkelman FD and Steinberg AD (1990) Anti-CD3 Antibody Induces Rapid Expression of Cytokine Genes in vivo. Journal of Immunology 145: 2183-2188. Selman M, King TE and Pardo A (2001) Idiopathic pulmonary fibrosis: Prevailing and evolving hypotheses about its pathogenesis and implications for therapy. Annals of Internal Medicine 134: 136-151. Selman M, Pardo A (2003) The epithelial/fibroblastic pathway in the pathogenesis of idiopathic pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology 29 (3 Suppl):S93-97. Seminario MC, Precht P, Wersto RP, Gorospe M and Wange RL (2003) PTEN expression in PTEN-null leukaemic T cell lines leads to reduced proliferation via slowed cell cycle progression. Oncogene 22: 8195-8204. Shevach EM (2002) CD4+CD25+ suppressor T cells: more questions than answers. Nature Reviews Immunology 2: 389-400. Simonsen A, Wurmser AE, Emr ED and Stenmark H (2001) The role of phosphoinositides in membrane transport. Current Opinion in Cell Biology 13: 485-492. Sims TN and Dustin ML (2002) The immunological synapse: integrins take the stage. Immunological Reviews 186: 100-117. Smith LT, Hohaus S, Gonzalez DA, Dziennis SE and Tenen DG (1996) PU.1 (Spi-1) and C/EBP α regulate the granulocyte colony-stimulating factor receptor promoter in myeloid cells. Blood 88: 1234-1247. Stephens LA, Mottet C, Mason D and Powrie F (2001) Human CD4+CD25+ thymocytes and peripheral T cells have immune suppressive activity in vitro. European Journal of Immunology 31:1247. Strauch UG, Mueller RC, Li XY, Cernadas M, Miggins JM, Binion DG, Parker CM (2001). αE(CD103)β7 mediates adhesion to intestinal microvascular endothelial cell lines via an ECadherin independent mechanism. Journal of Immunology 166: 3506-3514. Literaturverzeichnis 93 Suri-Payer E., Amar AZ, Thornton AM and Shevach EM (1998) CD4+CD25+ T cells inhibit both the induction and effector function of autoreactive T cells and represent a unique lineage of immunoregulatory cells. Journal of Immunology 160:1212-8. Suzuki Y, Rahman M and Mitsuya H (2001) Diverse transcriptional response of CD4+ T cells to stromal cell-derived factor (SDF)-1: Cell survival promotion and priming effects of SDF-1 on CD4+T cells. Journal of Immunology 167: 3064-3073. Takesono A, Finkelstein LD and Schwartzberg PL (2002) Beyond calcium: new signaling pathways for Tec family kinases. Journal of Cell Science 115: 3039-3048. Toker A and Newton AC (2000) Cellular signaling: Pivoting around PDK-1. Cell 103: 185-188. Tolias KF, Cantley LC and Carpenter CL (1995) Rho-Family GTPases Bind to Phosphoinositide Kinases. Journal of Biological Chemistry 270: 17656-17659. Tsygankov AY, Broker BM, Guse AH, Meinke U, Roth E, Rossmann C and Emmrich F (1993) Preincubation with Anti-CD4 Influences Activation of Human T-Cells by Subsequent Co-CrossLinking of CD4 with CD3. Journal of Leukocyte Biology 54: 430-438. Uhal BD, Joshi I, Hughes WF, Ramos C, Pardo A and Selman M. Fibroblasts isolated after fibrotic lung injury induce apoptosis of alveolar epithelial cells in vitro. American Journal of Physiology 1995; 269 (6 Pt 1): L819-828. Vanhaesebroeck B and Alessi DR (2000) The P13K-PDK1 connection: more than just a road to PKB. Biochemical Journal 346: 561-576. VanParijs L, Biuckians A, Ibragimov A, Alt FW, Willerford DM and Abbas AK (1997) Functional responses and apoptosis of CD25 (IL-2R alpha)-deficient T cells expressing a transgenic antigen receptor. Journal of Immunology 158: 3738-3745. Viglietta V, Baecher-Allan C, Weiner HL, Hafler DA (2004) Loss of functional suppression by CD4+ CD25+ regulatory T cells in patients with multiple sclerosis. Journal of Experimental Medecine199: 971-979. Vassallo R and Limper AH (2002) Pulmonary Langerhans' cell histiocytosis. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine 23: 93-101. Vlahos CJ, Matter WF and Brown RF (1994) A Specific Inhibitor of Phosphatidylinositol 3Kinase. Journal of Cellular Biochemistry 274-274. Vlahos CJ, McDowell SA and Clerk A (2003) Kinases as therapeutic targets for heart failure. Nature Reviews Drug Discovery 2: 99-113. Walker C, Bettens F and Pichler WJ (1987) T-Cell Activation by Cross-Linking Anti-Cd3 Antibodies with 2nd Anti-T-Cell Antibodies - Dual Antibody Cross-Linking Mimics Physical Monocyte Interaction. European Journal of Immunology 17: 1611-1618. Walker EH, Pacold ME, Perisic O, Stephens L, Hawkins PT, Wymann MP and Williams RL (2000) Structural determinants of phosphoinositide 3-kinase inhibition by wortmannin, LY294002, quercetin, myricetin, and staurosporine. Molecular Cell 6: 909-919. Walker MR, Kasprowicz DJ, Gersuk VH, et al. (2003) Induction of FoxP3 and acquisition of T regulatory activity by stimulated human CD4+CD25- T cells. Journal of Clinical Investigation 112: 1437-1443. Literaturverzeichnis 94 Wang ZQ, Dudhane A, Orlikowsky T, Clarke K, Li X, Darzynkiewicz Z and Hoffmann MK (1994) CD4 Engagement Induces Fas Antigen-Dependent Apoptosis of T-Cells in-Vivo. European Journal of Immunology 24: 1549-1552. Weiner HL (2001) Induction and mechanism of action of transforming growth factor-β secreting Th3 regulatory cells. Immunological Reviews 182: 207-214. Weiss-Haljiti C, Pasquali C, Ji H, Gillieron C, Curchod ML, Hirsch E, Ridley AJ, Hooft Van Huijsduijnen R, Camps M, Rommel C (2004) Involvement of PI3Kγ, Rac and PAK signaling in chemokine induced macrophage migration. Journal of Biological Chemistry 279: 43273-84. Welch HC, Coadwell WJ, Ellson CD, Ferguson GJ, Andrews SR, Erdjument-Bromage H, Tempst P, Hawkins PT, Stephans LR (2002) P-Rex 1, PtdIns(3,4,5)P3- and Gβγ-regulated guanine-nucleotide exchange factor for Rac. Cell 22: 809-821. Wetzker R and Rommel C (2004) Phosphoinositide 3-kinases as targets for therapeutic intervention. Current Pharmaceutical Design 10: 1915-1922. White ES, Lazar MH, Thannickal (2001) Idiopathic pulmonary fibrosis. Journal of Pathology 2001: 343-354. Whitman M, Downes CP, Keeler M, Keller T and Cantley L (1988) Type-I Phosphatidylinositol Kinase Makes a Novel Inositol Phospholipid, Phosphatidylinositol-3-Phosphate. Nature 332: 644-646. Workalemahu G, Foerster M, Kroegel C and Braun RK (2003) Human γδ-T lymphocytes express and synthesize connective tissue growth factor: Effect of IL-15 and TGF-β1 and comparison with αβ-T lymphocytes. Journal of Immunology 170: 153-157. Workalemahu G, Foerster M and Kroegel C (2004) Expression and synthesis of fibroblast growth factor-9 in human γδ T-lymphocytes. Response to isopentenyl pyrophosphate and TGF-β1/IL-15. Journal of Leukocyte Biology 75: 657-663. Wymann MP, Bjorklof K, Calvez R, Finan P, Thomas M, Trifilieff A, Barbier M, Altruda F, Hirsch E and Laffargue M (2003) Phosphoinositide 3-kinase γ: a key modulator in inflammation and allergy. Biochemical Society Transactions 31: 275-280. Yamagiwa S, Gray JD, Hashimoto S and Horowtiz DA (2001) A role for TGF-β in the generation and expansion of CD4+CD25+ regulatory T cells. Journal of Immunology 166: 72827289. Yang WC, Ching KA, Tsoukas CD and Berg LJ (2001) Tec kinase signaling in T cells is regulated by phosphatidylinositol 3-kinase and the Tec pleckstrin homology domain. Journal of Immunology 166: 387-395. Zheng SG, Gray JD, Ohtsuka K, Yamagiwa S and Horwitz DA (2002) Generation ex vivo of TGF-β-producing regulatory T cells from CD4+CD25- precursors. Journal of Immunology 169: 4183-4189. Anhang 9 ANHANG LEBENSLAUF ANDREAS GEBHARDT Geboren am 6. März 1975 in Kaiserslautern Staatsangehörigkeit deutsch Familienstand ledig 08/1985 - 06/1994 Staatliches Gymnasium an der Burgstrasse, Kaiserslautern, Abschluss: Abitur 07/1994 – 06/1995 Grundwehrdienst in Idar-Oberstein 08/1995 - 02/1997 Staatliche Schule für Physiotherapie, Kaiserslautern 04/1997 – 03/1999 Studium der Humanmedizin an der Johannes Gutenberg Universität, Mainz 04/1999 – 12/2003 Studium der Humanmedizin an der Friedrich Schiller Universität, Jena 12/2003 3.Staatsexamen 03/2000 – 03/2005 Promotion in der Abteilung Pneumologie & Allergologie/ Immunologie der FSU Jena, Thema: Phänotypische, funktionelle und molekulare Charakterisierung von αEβ7+ CD4+ T-Lymphozyten. Hinweise für eine neue Subpopulation T-regulatorischer Zellen des Respirationstraktes 02/2004-08/2004 Wissenschaftlicher Assistent am Institut für Klinische Pharmakologie der FSU Jena 10/2004-09/2005 Assistenzarzt in der Abteilung Innere Medizin, “Hopital du Jura” in Porrentruy, CH seit 10/2005 Assistenzarzt in der Neurologischen Klinik des Inselspitals (Universitätsspital), Bern, CH Bern, den 2. April 2006 Andreas Gebhardt Anhang Posterpräsentationen • Gebhardt A, Foerster M, Workalemahu G, Wetzker R, Kroegel C. Phosphatidylinositol 3kinase signaling is required for the differentiation of naive cells to CD103(αEβ7)+/ CD4+-T-lymphocytes. Eur Resp J 2004, (Suppl. 48), 38s. • Gebhardt A, Foerster M, Workalemahu G, Wetzker R, Kroegel C. αEβ7-positive CD4+-T-lymphocytes and αEβ7-negative CD4+-T-lymphocytes differ in their activation status. Eur Resp J 2003, 22 (Suppl.45): 75s-76s. • Gebhardt A, Foerster M, Oehrl W, Wetzker R, Kroegel C. TGF-β1-induzierte αEβ7- und CD25-Expression auf CD4+T-Lymphozyten. Differentielle Regulation durch Aktivierung der intrazellulären PI3-Kinase. Med Klinik 2002; 97:152-153 (P-269). Artikel in Zeitschriften mit Gutachtersystemen • Gebhardt A, Foerster M, Wetzer R and Kroegel C. Characteristic phenotype and Foxp3expression define human αEβ7+ CD4+ T-lymphocytes as a distinct subset of + CD4 T-lymphocytes with regulatory capacity. In Preparation. • Gebhardt A, Buhler R, Hottinger AF, Muller U and Hess CW. Transient tetraparesis with distal motor conduction block following a wasp sting. In Preparation. Anhang Danksagung Die experimentelle Grundlage der vorliegenden Arbeit wurden zwischen den Jahren 1999 und 2003 im Forschungslabor der Abteilung für Pneumologie & Allergologie/Immunologie, sowie am Institut für Molekulare Zellbiologie der Friedrich Schiller Universität, Jena, erarbeitet. Mein Dank gilt zunächst meinen wissenschaftlichen und klinischen Lehrern Herrn Prof. Dr. Dr. C. Kroegel und Herrn Prof. Dr. Wetzker für die Bereitstellung dieses faszinierenden Themas und für ihre weitreichende und anhaltende Unterstützung meiner klinischen und wissenschaftlichen Laufbahn. Die ausgezeichnete wissenschaftliche Anleitung und eine stets vertrauensvolle Atmosphäre waren die Grundlage für eine äußerst angenehme Zusammenarbeit. Darüber hinaus danke ich Herrn Dr. Braun, Herrn Dipl.-Biol. Martin Förster und Herrn Dr. Wolf Oehrl für die ständige Diskussionsbereitschaft und die zahlreichen Anregungen im Laufe der Untersuchungen der vorliegenden Arbeit. Mein ganz besonderer Dank gilt Yvonne Schlenker und Annette Hartmann, die mir bei der technischen Durchführung der Experimente stets mit Rat und Tat hilfreich zur Seite standen. Nicht zuletzt bedanke ich mich bei meinen Eltern, die mir die Grundlagen für diese Arbeit und für einen erfolgreichen Abschluss des Studiums mit auf meinen Weg gegeben haben. Anhang Ehrenwörtliche Erklärung Hiermit erkläre ich, dass • mir die Promotionsordnung der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Schiller Universität Jena bekannt ist • ich die Dissertation selbst angefertigt habe und alle von mir benutzte Hilfsmittel, persönliche Mitteilungen und Quellen in meiner Arbeit angegeben sind • mich folgende Personen bei der Auswahl und Auswertung des Materials sowie der Herstellung des Manuskripts unterstützt haben: - Prof. Dr. Dr. C. Kroegel - Dipl. Biol. M. Förster • die Hilfe eines Promotionsberaters nicht in Anspruch genommen wurde • Dritte weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen von mir für Arbeiten erhalten haben, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen • und ich die gleiche, eine in wesentlichen Teilen ähnliche oder eine andere Abhandlung nicht bei einer anderen Hochschule als Dissertation eingereicht habe Bern, den 2. April 2006 Andreas Gebhardt
