Histopathologische, morphometrische und immunhistochemische
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Tierärztliche Hochschule Hannover Institut für Pathologie Histopathologische, morphometrische und immunhistochemische Untersuchungen zur Phänotypisierung von Immunzellen in Biopsien aus dem Intestinaltrakt von Katzen mit chronischen idiopathischen Darmentzündungen INAUGURAL-DISSERATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.) Vorgelegt von Sina Marsilio (Peine) Hannover 2007 Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. M. Hewicker-Trautwein 1. Gutachterin: Univ.-Prof. Dr. M. Hewicker-Trautwein 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Meyer Tag der mündlichen Prüfung: 15.11.2007 Denen, die an mich glauben Ich kann, weil ich will, was ich muss (Immanuel Kant) Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung ...................................................................................................... 1 2 Literaturübersicht ........................................................................................ 2 2.1 Histologischer Aufbau des Intestinaltraktes...................................................................... 2 2.1.1 Dünndarm........................................................................................................................................ 2 2.1.2 Kolon............................................................................................................................................... 3 2.1.3 GALT – Gut-Associated Lymphoid Tissue .................................................................................... 3 2.1.3.1 Aggregiertes lymphoretikuläres Gewebe und Peyersche Platten........................................... 4 2.1.3.2 Diffuses lymphatisches Gewebe............................................................................................ 5 2.1.3.3 Leukozyten der Lamina propria mucosae.............................................................................. 7 2.1.3.4 Orale Toleranz ..................................................................................................................... 10 2.2 Inflammatory Bowel Disease bei Katze und Hund ......................................................... 13 2.2.1 Histopathologische Diagnostik und Befundinterpretation bei IBD............................................... 13 2.2.1.1 Bioptate................................................................................................................................ 14 2.2.1.2 Histopathologische Veränderungen ..................................................................................... 15 2.2.1.3 Befundinterpretation ............................................................................................................ 17 2.2.2 Klassifikation der IBD-Formen bei Katze und Hund .................................................................... 18 2.2.2.1 Lymphoplasmazelluläre Enteritis und Kolitis...................................................................... 19 2.2.2.2 Eosinophile Gastroenteritis, Enteritis, Enterokolitis und Kolitis ......................................... 20 2.2.2.3 Eosinophile granulomatöse Gastroenterokolitis .................................................................. 21 2.2.2.4 Chronische eitrige Kolitis .................................................................................................... 21 2.2.2.5 Histiozytäre ulzerative Kolitis des Boxers........................................................................... 21 2.2.2.6 Transmurale granulomatöse Enterokolitis (regionale Enteritis) .......................................... 22 2.2.2.7 Granulomatöse Enteritis, Kolitis und Enterokolitis ............................................................. 23 2.2.2.8 Immunproliferative Enteropathie des Basenjihundes .......................................................... 23 2.2.2.9 Diarrhoe-Syndrom des norwegischen Lundehundes ........................................................... 23 2.2.3 Ätiologie der IBD.......................................................................................................................... 24 2.2.3.1 Physiologische enterale mikrobielle Flora........................................................................... 24 2.2.3.2 Pathogene Mikroorganismen ............................................................................................... 26 2.2.3.3 Nahrungsantigene ................................................................................................................ 26 2.2.4 Immunpathogenese der IBD.......................................................................................................... 27 2.2.4.1 Einfluss der mukosalen Integrität auf die Pathogenese der IBD.......................................... 28 2.2.4.2 Immunzellen ........................................................................................................................ 28 2.2.4.3 Zytokine, Mediatoren und Transkriptionsfaktoren .............................................................. 30 2.2.5 Klinische Befunde und Differentialdiagnosen bei IBD................................................................. 32 2.2.5.1 Defizitäre Erscheinungen..................................................................................................... 32 2.2.5.2 Extraintestinale Erkrankungen............................................................................................. 33 2.2.5.3 Klinische Befunde ............................................................................................................... 34 2.2.5.4 Differentialdiagnosen .......................................................................................................... 35 2.2.6 Management und Therapie............................................................................................................ 36 2.2.6.1 Diätetische Maßnahmen ...................................................................................................... 36 2.2.6.2 Pharmakotherapeutische Maßnahmen ................................................................................. 37 3 Material und Methoden ............................................................................. 39 3.1 3.1.1 3.1.2 Untersuchungsmaterial ..................................................................................................... 39 Kontrolltiere .................................................................................................................................. 39 Katzen mit chronischer idiopathischer lymphoplasmazellulärer Enterokolitis (IBD-Tiere) ......... 40 3.2 Präparation der Gewebeproben für die Histopathologie und Immunhistochemie...... 42 3.3 Physikochemische Färbungen........................................................................................... 43 3.3.1 3.4 Histologische Beurteilungskriterien .............................................................................................. 43 Immunhistochemie............................................................................................................. 47 3.4.1 Antikörper, Seren, Chromogen und Kontrollen ............................................................................ 47 3.4.1.1 Primäre Antikörper .............................................................................................................. 47 3.4.1.2 Kontrollseren ....................................................................................................................... 48 3.4.1.3 Sekundärantikörper.............................................................................................................. 49 3.4.1.4 Blockseren ........................................................................................................................... 49 3.4.1.5 Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (ABC-Komplex) ........................................................ 49 3.4.1.6 Chromogen .......................................................................................................................... 49 3.4.1.7 Kontrollen............................................................................................................................ 50 3.4.2 Demaskierungsverfahren............................................................................................................... 50 3.4.3 Immunhistochemische Untersuchungsmethode ............................................................................ 51 3.4.3.1 Protokoll der immunhistochemischen Untersuchungen....................................................... 53 3.4.4 Computergestützte Morphometrie................................................................................................. 56 3.4.4.1 Digitale Fotodokumentation und Bildverarbeitung mit der PC-Software analySIS® 3.1.... 56 3.4.4.2 Morphometrische Analyse................................................................................................... 56 3.5 4 Statistische Auswertung .................................................................................................... 58 Ergebnisse ................................................................................................... 59 4.1 Ergebnisse der histologischen Untersuchung .................................................................. 59 4.1.1 Ergebnisse der histologischen Untersuchung von Bioptaten der Kontrolltiere ............................. 59 4.1.2 Ergebnisse der histologischen Untersuchung von Bioptaten der IBD-Tiere................................. 59 4.1.2.1 Histopathologische Befunde extraintestinaler Bioptate ....................................................... 67 4.2 4.2.1 4.2.2 4.2.3 4.3 Ergebnisse der immunhistochemischen Reaktionen....................................................... 68 Reaktionsmuster der CD3+ Zellen ................................................................................................. 68 Reaktionsmuster der Plasmazellen ................................................................................................ 68 Reaktionsmuster der L1+ Zellen.................................................................................................... 68 Ergebnisse der computergestützten Morphometrie ....................................................... 69 4.3.1 CD3+ Zellen .................................................................................................................................. 70 4.3.1.1 Verteilung der CD3+ Zellen innerhalb der Gruppe der Kontrolltiere .................................. 70 4.3.1.2 Verteilung von CD3+ Zellen innerhalb der Gruppe der IBD-Tiere...................................... 71 4.3.1.3 Gruppenvergleich ................................................................................................................ 72 4.3.2 IgA-Plasmazellen .......................................................................................................................... 79 4.3.2.1 Verteilung von IgA-Plasmazellen innerhalb der Gruppe der Kontrolltiere ......................... 79 4.3.2.2 Verteilung von IgA-Plasmazellen innerhalb der Gruppe der IBD-Tiere ............................. 80 4.3.2.3 Gruppenvergleich ................................................................................................................ 81 4.3.3 IgG-Plasmazellen .......................................................................................................................... 88 4.3.3.1 Verteilung der IgG-Plasmazellen innerhalb der Gruppe der Kontrolltiere .......................... 88 4.3.3.2 Verteilung IgG-Plasmazellen innerhalb der Gruppe der IBD-Tiere .................................... 89 4.3.3.3 Gruppenvergleich ................................................................................................................ 90 4.3.4 IgM-Plasmazellen ......................................................................................................................... 94 4.3.4.1 Verteilung von IgM-Plasmazellen innerhalb der Gruppe der Kontrolltiere......................... 94 4.3.4.2 Verteilung von IgM-Plasmazellen innerhalb der Gruppe der IBD-Tiere............................. 95 4.3.4.3 Gruppenvergleich ................................................................................................................ 96 4.3.5 L1+ Zellen.................................................................................................................................... 100 4.3.5.1 Verteilung von L1+ Zellen innerhalb der Gruppe der Kontrolltiere................................... 100 4.3.5.2 Verteilung von L1+ Zellen innerhalb der Gruppe der IBD-Tiere....................................... 100 4.3.5.3 Gruppenvergleich .............................................................................................................. 100 4.3.6 Zusammenfassung der Ergebnisse der computergestützten Morphometrie ................................ 104 4.3.6.1 Verteilungsmuster von Immunzellen in der Lamina propria ............................................. 104 4.3.6.2 Vergleich der Kontrolltiere mit den IBD-Tieren ............................................................... 104 4.3.7 Korrelationen zwischen histopathologischen und morphometrischen Befunden ........................ 105 II 5 Diskussion.................................................................................................. 107 5.1 Alter, Rasse und histopathologische Veränderungen ................................................... 108 5.2 Extraintestinale Erkrankungen...................................................................................... 109 5.3 Immunhistochemie und Morphometrie ......................................................................... 110 5.3.1 5.3.2 5.3.3 5.3.4 5.3.5 5.3.6 5.4 Anzahl und Verteilungsmuster von CD3+ T-Lymphozyten ........................................................ 111 Quantitative Untersuchungen von CD3+ T-Lymphozyten bei Katzen mit IBD im Vergleich zu darmgesunden Kontrolltieren ...................................................................................................... 115 Anzahl und Verteilungsmuster von Plasmazellen ....................................................................... 118 Quantitative Untersuchungen von Plasmazellen bei Katzen mit IBD im Vergleich zu darmgesunden Kontrolltieren ...................................................................................................... 122 Verteilungsmuster von L1+ Zellen .............................................................................................. 124 Quantitative Untersuchungen von L1+ Zellen bei Katzen mit IBD im Vergleich zu darmgesunden Kontrolltieren ...................................................................................................... 126 Schlussfolgerungen .......................................................................................................... 127 6 Zusammenfassung .................................................................................... 129 7 Summary ................................................................................................... 131 8 Literatur .................................................................................................... 133 9 Anhang....................................................................................................... 150 9.1 Angaben zu den Kontrolltieren ...................................................................................... 150 9.2 Angaben zu den IBD-Tieren ........................................................................................... 153 9.3 Angaben zu statistischen Ergebnissen............................................................................ 159 9.4 Färbungsprotokolle.......................................................................................................... 170 9.5 Pufferrezepte für die Immunhistochemie ...................................................................... 170 9.6 Vorbehandlungsmethoden für die Immunhistochemie ................................................ 171 9.7 Reagenzien für die Immunhistochemie.......................................................................... 171 9.8 Bezugsquellen für Chemikalien und Antikörper .......................................................... 172 9.9 Bezugsquellen für Geräte und Einmalartikel................................................................ 174 9.10 Abkürzungsverzeichnis ................................................................................................... 176 III 1 Einleitung Bei den chronischen idiopathischen Darmentzündungen der Katze (engl. Inflammatory Bowel Disease) handelt es sich um einen heterogenen Krankheitskomplex, welcher durch klinische Symptome einer chronischen persistierenden oder rezidivierenden gastrointestinalen Erkrankung unbekannter Ursache in Zusammenhang mit histologischen Merkmalen einer Darmentzündung gekennzeichnet ist. Die Inflammatory Bowel Disease ist die häufigste Ursache für chronischen Vomitus und Diarrhoe bei der Katze. Die Diagnose „IBD“ kann nur im Rahmen einer Ausschlussdiagnostik gestellt werden, und die histopathologische Untersuchung endoskopischer oder transmuraler gastrointestinaler Bioptate ist zur Diagnosesicherung obligatorisch. Charakteristisch für die IBD ist eine erhöhte Anzahl an Entzündungszellen wie Lymphozyten und Plasmazellen sowie zum Teil Makrophagen, eosinophile und/oder neutrophile Granulozyten in der Mukosa des Intestinaltraktes. Die Ätiologie und Pathogenese dieses Krankheitskomplexes sind bislang weitgehend ungeklärt. Vermutet wird, dass möglicherweise luminale Antigene eine Dysregulation des intestinalen Schleimhautimmunsystems auslösen und dies im Folgenden zu einem Zusammenbruch der intestinalen Toleranz mit perpetuierender Entzündungsreaktion führen könnte. Die Vermutung, dass Immunzellen des GALT eine wesentliche Rolle bei der Immunpathogenese der IBD spielen könnten, hat einige Untersucher veranlasst, die Immunzellpopulationen der Mukosa bei Hunden mit IBD mittels immunhistochemischer und morphometrischer Methoden zu analysieren. Im Gegensatz zur IBD beim Hund ist die Charakterisierung der Immunzellpopulationen in der Mukosa des Dünndarmes an IBD erkrankter Katzen bisher nur ansatzweise erfolgt. Qualitative und quantitative Daten zur Zusammensetzung der Entzündungszellpopulation der Mukosa des Kolons von darmgesunden Katzen oder Katzen mit IBD sind im einschlägigen Schrifttum bislang nicht verfügbar. Ziel der vorliegenden Studie war die Charakterisierung und Quantifizierung von CD3+ TZellen, Makrophagen und Plasmazellen (IgA-, IgG-, IgM- produzierende Plasmazellen) mittels immunhistochemischer Methoden und computergestützter Morphometrie in transmuralen Bioptaten des Dünn- und Dickdarmes von Katzen mit Inflammatory Bowel Disease im Vergleich zu klinisch und histologisch darmgesunden Hauskatzen. 1 2 Literaturübersicht 2.1 Histologischer Aufbau des Intestinaltraktes 2.1.1 Dünndarm Der Dünndarm mit seinen drei Abschnitten Duodenum, Jejunum und Ileum zeigt über seine gesamte Länge hinweg eine weitgehende histomorphologische Übereinstimmung. Die Schleimhautoberfläche ist geprägt von Ausstülpungen der Lamina propria, den Dünndarmzotten (Villi intestinales) die mit einem einschichtigen hochprismatischen Epithel bedeckt sind. Die Zotten von Karnivoren sind schlank und gestreckt und im Ileum kürzer als im Duodenum und Jejunum (SMOLLICH u. MICHEL 1992; LIEBICH 1999). Demgegenüber stellen die Krypten (Glandulae intestinales) Einstülpungen der Schleimhaut dar, die innerhalb der Lamina propria schlauchförmig, gerade und unverzweigt verlaufen und bis an die Lamina muscularis mucosae reichen (LIEBICH 1999). Das Schleimhautepithel besteht maßgeblich aus hochprismatischen Epithelzellen mit feingranuliertem, azidophilem Zytoplasma und einem basal gelegenen längsovalen Kern (BANKS 1993). Verstreut zwischen den Epithelzellen liegen intraepitheliale Lymphozyten, enterochromaffine Zellen sowie Becherzellen, deren Anzahl in Richtung Kolon stetig zunimmt (SEGAL u. PETRAS 1992; BANKS 1993; GUILFORD 1996a; STROMBECK 1996; LIEBICH 1999). Die subepithelial gelegene Lamina propria besteht aus lockerem Bindegewebe mit Myofibroblasten sowie glatten Muskelzellen und führt neben Blut- und Lymphgefäßen auch Nerven. Ein erheblicher Teil der distal der Zotten gelegenen Lamina propria wird von den Lieberkühnschen Krypten eingenommen und schließt eine große Menge lymphoretikulären Gewebes und Immunzellen ein (BANKS 1993; LIEBICH 1999). Die Tela submucosa besteht aus lockerem, kollagenfaserreichem Bindegewebe mit einer unterschiedlichen Zahl von Adipozyten und enthält neben Lymph- und Blutgefäßen auch autonome Ganglien sowie lymphoidzellige Aggregate. Im Duodenum sind darüber hinaus in der Tela submucosa die Brunnerschen Drüsen (Glandulae submucosae) eingelagert, deren Ausführungsgänge in die Krypten münden. Lymphatische Einrichtungen, wie Noduli lymphatici aggregati oder Peyersche Platten, können sich über die Lamina propria hinaus bis in die Tunica submucosa erstrecken (SEGAL u. PETRAS 1992; BANKS 1993; STROMBECK 1996; LIEBICH 1999). Im lockeren Bindegewebe der Tela submucosa sind in allen Lokalisationen des Dünndarmes 2 2 LITERATURÜBERSICHT vereinzelt Lymphozyten und Plasmazellen anzutreffen (LIEBICH 1999). Die Tunica muscularis, mit ihrem inneren Stratum circulare und ihrem äußeren Stratum longitudinale, besteht aus glatten Muskelzellen und enthält zwischen beiden Schichten den Plexus myentericus (Auerbachscher Plexus) sowie zahlreiche Blut- und Lymphgefäße (LIEBICH 1999). Das einschichtige Plattenepithel der Tunica serosa bildet als Deckschicht die äußere Begrenzung zum Abdomen (LIEBICH 1999). 2.1.2 Kolon Der histologische Wandaufbau des Kolons entspricht in seiner Vierschichtigkeit dem des Dünndarmes. Als Abschnitt des Dickdarmes ist dem Kolon jedoch das Fehlen der Zotten als Charakteristikum zu Eigen. Die Oberfläche des Darmes wird von hochprismatischen Epithelzellen gebildet. Von der Oberfläche aus führen die Krypten als Einstülpungen der Lamina propria in die Tiefe bis zur Lamina muscularis mucosae. Die Krypten (Glandulae intestinales) nehmen den größten Teil der Lamina propria ein und liegen als schmale, gerade, unverzweigte Einziehungen parallel und dicht aneinander und nahe der Lamina muscularis mucosae (CANFIELD et al. 1980; BANKS 1993; ANTONIOLI u. MADARA 1998; LIEBICH 1999). Das Kryptepithel schließt, neben den iso- bis hochprismatischen Epithelzellen, eine Vielzahl von muzinbildenden Becherzellen ein (CANFIELD et al. 1980; BANKS 1993; LIEBICH 1999). Die Lamina propria, die durch die dicht aneinander liegenden Krypten einen nur minimalen Raum einnimmt, enthält neben Lymphozyten und Plasmazellen in unterschiedlicher Zahl und Dichte auch einige eosinophile Granulozyten und vereinzelt auch neutrophile Granulozyten und Makrophagen (CANFIELD et al. 1980). Der übrige Wandaufbau entspricht dem des Dünndarms mit vereinzelten lymphoidzelligen Aggregaten in der Lamina propria und Tunica submucosa (LIEBICH 1999). Es gibt nur wenige Arbeiten über die Zusammensetzung der Leukozytenpopulation im Kolon von Karnivoren. Qualitative und quantitative Daten zu Immunzellen im Kolon darmgesunder Katzen wurden bislang nicht veröffentlicht. 2.1.3 GALT – Gut-Associated Lymphoid Tissue Das gastrointestinale Immunsystem ist eines der größten und komplexesten Abwehrzentren des Körpers. Es spielt eine wichtige Rolle sowohl in der lokalen wie in der systemischen Abwehr. Gleichzeitig moduliert und reguliert es die Immunantwort und ist Ort der Induktion 3 2 LITERATURÜBERSICHT oraler Toleranz, der Hyporeaktivität gegenüber nicht-invasiven Antigenen. Als eines der wichtigsten lymphatischen Organe des Körpers ist dem Darm eine große Menge lymphatischen Gewebes eigen. So enthält die Mukosa das größte B-Zell-System des Körpers (GUILFORD 1996a). Das darmassoziierte lymphatische Gewebe, auch als Gut-Associated Lymphoid Tissue (GALT) bezeichnet, umfasst aggregiertes und diffuses lymphoretikuläres Gewebe in der gastrointestinalen Mukosa. Unter aggregiertem lymphoretikulärem Gewebe versteht man Lymphknötchen und Peyersche Platten. Das diffuse oder nicht aggregierte Gewebe schließt luminale, intraepitheliale und Leukozyten der Lamina propria ein (GUILFORD 1996a). 2.1.3.1 Aggregiertes lymphoretikuläres Gewebe und Peyersche Platten Lymphknötchen (Noduli lymphatici solitarii) sind einzeln oder in aggregierter Form in der Lamina propria im gesamten Gastrointestinaltrakt anzutreffen (SMOLLICH u. MICHEL 1992; GUILFORD 1996a; LIEBICH 1999). Dabei können sie sich über die Lamina propria hinaus bis in die Tela submucosa erstrecken und eine Größe zwischen 0,5 bis 3 mm erreichen (GUILFORD 1996a). Durch die Vereinigung dieser Lymphknötchen entstehen lymphoretikuläre Gewebekomplexe zum Teil beträchtlichen Ausmaßes, die als Noduli lymphatici aggregati oder Peyersche Platten bezeichnet werden und die vor allem im Ileum vorhanden sind (SMOLLICH u. MICHEL 1992; GUILFORD 1996a). Beide lymphatischen Einrichtungen bilden durch Vorwölbung ins Darmlumen und Verdrängung der Zotten so genannte Domes oder Dome-Areale, die mit einem spezialisierten Epithel, dem follikelassoziierten Epithel bedeckt sind (SMOLLICH u. MICHEL 1992; ANTONIOLI u. MADARA 1998). Der Dome besteht vorwiegend aus T-, B- und antigenpräsentierenden Zellen sowie Makrophagen. Darunter befindet sich der Follikel mit seiner Corona, die vorwiegend B- und T-Helfer-Zellen enthält. Im Inneren der Corona befindet sich ein Germinal- oder Keimzentrum aus proliferierenden B-Zellen. Die interfollikuläre Region beinhaltet vor allem T-Zellen (JANEWAY u. TRAVERS 2002; DAY 1999). Das follikelassoziierte Epithel enthält, als eine spezialisierte Einrichtung des lymphoretikulären Gewebes, neben absorptiven Epithelzellen so genannte M-Zellen (Microfold/Membranous cells). Diese M-Zellen sind maßgeblich am transepithelialen Antigentransport beteiligt, indem sie über Endozytosemechanismen Antigene aufnehmen und zu dem darunter liegenden lymphoretikulären Gewebe transportieren. Gleichzeitig 4 können Lymphozyten und 2 LITERATURÜBERSICHT Makrophagen in taschenartige Ausstülpungen der apikalen Membran von M-Zellen eindringen und intraepithelial mit Antigenen in Kontakt treten (SMOLLICH u. MICHEL 1992; BANKS 1993; GUILFORD 1996a; ANTONIOLI u. MADARA 1998; BRANDTZAEG 2001b). Das GALT ist Ort der Induktion von Immunantworten. Nach Antigenaufnahme und – präsentation kommt es in den Peyerschen Platten zu einer Aktivierung von B- und THelferzellen, vor allem von solchen, die auf die Synthese von IgA spezialisiert sind. Diese erreichen über die Mesenteriallymphknoten und den Ductus thoracicus den Kreislauf. Anschließend gelangen die zirkulierenden Lymphoblasten aus dem Kreislauf über spezielle Rezeptoren, die Selektine, zurück in alle mukosaassoziierten lymphatischen Gewebe und werden hier zu Effektormolekülen der Immunantwort. Diesen Prozess nennt man “Homing” (DOE 1989; GEBBERS u. LAISSURE 1989; JANEWAY u. TRAVERS 2002). 2.1.3.2 Diffuses lymphatisches Gewebe Das diffuse lymphatische Gewebe der Mukosa ist die Effektorseite der Immunantwort im Darm. Hierher gelangen ausgereifte Lymphozyten nach ihrer Antigenerkennung und Aktivierung in den Lymphknötchen und Peyerschen Platten, der anschließenden Zirkulation durch den Kreislauf und das abschließende Homing (DOE 1989; GEBBERS u. LAISSURE 1989; JANEWAY u. TRAVERS 2002). Drei Kompartimente werden hier unterschieden, das luminale, das intraepitheliale und das Kompartment der Lamina propria (GUILFORD 1996a). Luminale Leukozyten Luminale Leukozyten sind stets eng mit der Mukosa assoziiert, sie migrieren offenbar durch antigene Stimulation aus der Mukosa ins Lumen. Ihre Funktion ist weitgehend unbekannt, sie treten jedoch bei entzündlichen Prozessen vermehrt auf und sind daher ein diagnostischer Indikator inflammatorischer Veränderungen (GUILFORD 1996a). Intraepitheliale Lymphozyten (IEL) Intraepitheliale Lymphozyten sind eine morphologisch, phänotypisch und funktionell heterogene Population lymphoider Zellen (GUILFORD 1996a). Konsens besteht darüber, dass es sich im Intestinaltrakt von Katzen und Hunden bei der Mehrzahl der intraepithelialen Lymphozyten um T-Zellen handelt, wobei der Anteil einzelner Subpopulationen kontrovers diskutiert wird (ROCCABIANCA et al. 2000; WALY et al. 2001; STOKES u. WALY 2006). Die Ergebnisse verschiedener Studien, die 5 mittels Durchflusszytometrie oder 2 LITERATURÜBERSICHT morphometrischer Methoden unterschiedliche Subtypen von T-Zellen im Intestinaltrakt der Katze untersuchten, zeigen, dass die Mehrzahl der intraepithelialen T-Lymphozyten aus CD8+ T-Zellen, also aus T-Zellen vom zytotoxischen oder suppressorischen Phänotyp besteht (ROCCABIANCA et al. 2000; WALY et al. 2001, 2004; STOKES u. WALY 2006). Demgegenüber handelt es sich den Autoren zufolge bei den T-Zellen der Lamina propria vorwiegend um CD4+ T-Lymphozyten, also um B-Zellen-aktivierende T-Helfer-Zellen (TH2Zellen) oder inflammatorische T-Zellen (TH1-Zellen). Diese Ergebnisse entsprechen weitgehend den Untersuchungen von Arbeiten über den humanen und kaninen Intestinaltrakt (SELBY et al. 1983; BRANDTZAEG et al. 1988; TREJDOSIEWICZ 1992; ELWOOD et al. 1997; GERMAN et al. 1999b). CD8+ zytotoxische oder suppressorische T-Zellen erkennen an den MHC-Klasse-I-Rezeptor von Epithelzellen gebundene Antigene und induzieren den programmierten Zelltod (GEBBERS u. LAISSURE 1989; GUILFORD 1996a; JANEWAY u. TRAVERS 2002). Auf diese Weise werden infizierte oder transformierte Zellen erkannt und getötet, bevor sich eine Infektion oder ein Tumorgeschehen manifestieren können (JANEWAY 1988). Ergebnisse aus Studien am menschlichen Intestinaltrakt deuten darauf hin, dass intraepitheliale Lymphozyten zum Großteil aus dem lymphoretikulären Gewebe in das Epithel migrieren. Die Migration selbst ist anscheinend weitgehend Antigen-unabhängig, da intraepitheliale Lymphozyten auch bei Feten nachgewiesen wurden (SPENCER et al. 1986). Neben CD8+ T Zellen ist anscheinend auch eine erhebliche Zahl regulatorischer T-Zellen, so genannter TregZellen im Epithel angesiedelt, die über immunregulatorische und immunsuppressive Mechanismen zur Aufrechterhaltung oraler Toleranz, der Hyporeaktivität gegenüber nicht-invasiven Antigenen, beitragen (GUILFORD 1996a). GERMAN et al. (1999b) untersuchten mittels immunhistochemischer und morphometrischer Methoden intraepitheliale Lymphozyten bei Hunden. Die Autoren zeigten, dass je nach Darmabschnitt zwischen 7 und 20 intraepitheliale Lymphozyten pro 100 Enterozyten vorhanden sind. Morphometrische Untersuchungen bei Katzen ergaben erheblich höhere Zahlen für diese Spezies. Während im Kryptepithel, je nach untersuchtem Dünndarmabschnitt, zwischen 4 und 6 intraepitheliale Lymphozyten pro 100 Epithelzellen vorkommen, erhöht sich diese Zahl in der Zotte auf 48 IELs pro 100 Enterozyten im 6 2 LITERATURÜBERSICHT Duodenum und bis auf 80 IELs je 100 Enterozyten im Ileum (WALY et al. 2001). Über die Zahlen intraepithelialer Lymphozyten im Kolon der Katze gibt es bislang keine publizierten Ergebnisse. 2.1.3.3 Leukozyten der Lamina propria mucosae Die Lamina propria ist insgesamt reich an lymphoretikulärem Gewebe und Immunzellen (BANKS 1993; LIEBICH 1999). Bisher gibt es allerdings nur zwei publizierte Untersuchungen, in denen das Infiltrat von Leukozyten in der Mukosa von gesunden Katzen qualitativ und quantitativ charakterisiert wurde (WALY et al. 2001, 2004). Ergebnisse mehrerer Untersuchungen am Intestinaltrakt von Katzen, Hunden und des Menschen weisen IgA-produzierende Plasmazellen als den zahlenmäßig dominierenden Isotyp unter den Plasmazellen der Lamina propria aus (HART 1979; KLOTZ et al. 1985; BRANDTZAEG et al. 1988; VIBE-PETERSEN 1991; SEGAL u. PETRAS 1992; GUILFORD 1996a; GERMAN et al. 1999b; JERGENS et al. 1999; WALY et al. 2001, 2004; KLEINSCHMIDT et al. 2007). Unterschiedliche Ansichten herrschen indes darüber, ob mehrheitlich T-Zellen oder IgA-Plasmazellen die Lamina propria besiedeln. Morphometrische Untersuchungen der Lamina propria von Katzen und Hunden zeigen jedoch, dass diese Frage nicht pauschal beantwortet werden kann. Vielmehr spielt die Lokalisation innerhalb der Mukosa eine entscheidende Rolle. Während T-Zellen offensichtlich in größerer Zahl in den Zotten vorkommen, ist die Zahl der IgA-Plasmazellen, aber auch die der IgG- und IgM- produzierenden Plasmazellen anscheinend in den Kryptregionen am größten (GERMAN et al. 1999b; WALY et al. 2001). Insgesamt ist in der Lamina propria, einem Bereich mit ständigem Antigenkontakt, bei Katzen und Hunden eine große Anzahl von Lymphozyten und Plasmazellen vorhanden, und in geringerer Zahl sind dort auch Makrophagen, eosinophile Granulozyten und Mastzellen anzutreffen. Im Kolon können vereinzelt auch neutrophile Granulozyten vorkommen (CANFIELD et al. 1980; ROTH et al. 1990; YAMASAKI et al. 1996; JERGENS et al. 1998b; GERMAN et al. 1999a; WALY et al. 2001, 2004). T-Zellen (CD3+ Zellen) T-Zellen sind eine extrem heterogene Gruppe immunologisch aktiver Zellen, die sich anhand verschiedener Oberflächenmarker in Subtypen unterscheiden lassen. Wichtige Subtypen sind 7 2 LITERATURÜBERSICHT CD4+ Zellen, welche als T-Helferzellen B-Zellen und Makrophagen aktivieren sowie CD8+ Zellen mit zytotoxischen oder suppressorischen Eigenschaften. Die mögliche Funktion der mit Hilfe monoklonaler Antikörper phänotypisierbaren Lymphozytensubpopulationen ist bislang für viele andere Expressionsmuster noch nicht geklärt. Allen T-Zellen ist jedoch der so genannte CD3-Komplex gemein, ein an den T-Zellrezeptor gebundener Proteinkomplex, welcher an der Signaltransduktion beteiligt ist (JANEWAY u. TRAVERS 2002). Die Mehrzahl der T-Zellen der Lamina propria sind bei der Katze wie auch beim Hund CD4+ THelferzellen (ELWOOD et al. 1997; GERMAN et al. 1999b; WALY et al. 2001, 2004). Sie erkennen an MHC-Klasse-II-Moleküle gebundene Antigene und können sich nach Aktivierung in drei Arten von Effektorzellen, die T-Helfer-Zellen Typ1 (TH1), T-HelferZellen Typ 2 (TH2) und die T-Helfer-Zellen Typ 3 (TH3), differenzieren. TH1-Zellen sind Teil der zellvermittelten Immunität. Sie aktivieren einerseits Makrophagen, andererseits regen sie B-Zellen zur Produktion von IgG an. Dieser Isotyp opsonisiert sehr effektiv extrazelluläre Pathogene für die Aufnahme durch phagozytierende Zellen und kann darüber hinaus die Komplementkaskade auslösen. TH2-Zellen aktivieren naive antigenspezifische B-Zellen, lösen so eine humorale Immunantwort aus und steuern darüber hinaus den Isotypenwechsel der Immunglobuline. Daneben existiert in der Mukosa eine weitere wichtige Untergruppe von T-Lymphozyten, die TH3-Zellen. Sie spielen im Rahmen der oralen Toleranzinduktion durch die Sekretion antiinflammatorischer Zytokine eine entscheidende Rolle (JANEWAY u. TRAVERS 2002; ALLENSPACH u. GASCHEN 2003). Plasmazellen Wie bereits erwähnt, wurde in zahlreichen Studien gezeigt, dass unter den verschiedenen Plasmazell-Isotypen die IgA-Plasmazellen im Intestinaltrakt von Katzen und Hunden vorherrschen (HART 1979; KLOTZ et al. 1985; BRANDTZAEG et al. 1988; VIBEPETERSEN 1991; SEGAL u. PETRAS 1992; GUILFORD 1996a; GERMAN et al. 1999b; JERGENS et al. 1999; WALY et al. 2001, 2004; KLEINSCHMIDT et al. 2007). Sekretorisches IgA bindet Antigene im Darmlumen und hemmt somit deren Anlagerung und Aufnahme in die intestinale Mukosa. Auf diese Weise verhindert IgA nicht nur effektiv Infektionen, sondern vermeidet auch allergische oder Hypersensibilitätsreaktionen im Intestinaltrakt (DOE 1989; WILLARD 1999). Immunglobulin A bildet somit an mukosalen Oberflächen die so genannte “first line of defence“ (BRANDTZAEG 1995). Darüber hinaus 8 2 LITERATURÜBERSICHT schützen die IgA-Antikörper die Mukosa indirekt, da sekretorisches IgA, im Gegensatz zu IgG oder IgM, nicht in der Lage ist, Entzündungsmediatoren zu aktivieren (DOE 1989). Antigene werden aber auch von M-Zellen und Epithelzellen aufgenommen, prozessiert und darunter liegenden T-Zellen präsentiert oder sie werden direkt bis in Lymphknötchen oder Peyersche Platten transportiert und dort von dendritischen Zellen den T-Zellen präsentiert. Die dadurch aktivierten T-Helferzellen stimulieren ihrerseits B-Zellen und unterstützen deren Differenzierung in IgA produzierende Plasmazellen (BRANDTZAEG et al. 1989; GEBBERS u. LAISSURE 1989). L1+ Zellen Zellen, die sich mit dem Antikörperklon MAC387, der mit dem L1-Antigen reagiert, anfärben lassen, repräsentieren bei der Katze eine Gruppe von Zellen mit den morphologischen Charakteristika von Makrophagen und Monozyten (WALY et al. 2001). Beim Hund reagiert der Antikörper anscheinend zusätzlich mit neutrophilen Granulozyten (GERMAN et al. 1999b). Makrophagen erfüllen innerhalb des Systems der Immunabwehr mehrere Funktionen. Sie besitzen eine Vielzahl von Rezeptoren, wie den Mannose- oder den scavenger-Rezeptor, mit deren Hilfe sie Antigene erkennen, binden und phagozytieren können. Damit sind sie Teil der unspezifischen oder angeborenen Immunantwort. Im Anschluss an die Phagozytose erfolgt die Prozessierung der Antigene in Endosomen und Lysosomen. Die dabei entstandenen Peptide werden durch MHC-Klasse-II-Moleküle an der Zelloberfläche der Makrophagen den T-Zellen präsentiert. Durch die Antigenaufnahme wird zeitgleich die Bildung und Expression von MHC-Klasse-II-Molekülen sowie von B7-Molekülen stimuliert. B7-Moleküle sind costimulierende Moleküle auf antigenpräsentierenden Zellen. Der entsprechende Rezeptor auf T-Zellen ist CD28 auf naiven T-Zellen sowie CTLA-4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4) auf bewaffneten T-Effektorzellen. Durch ihre costimulierende Aktivität regen Makrophagen naive T-Zellen zur Proliferation und Differenzierung an. Bei der Bindung von B7 an CTLA-4 kommt es zu einem negativen Signal an die aktivierten T-Effektorzellen, wodurch ihre proliferative Antwort begrenzt wird (BRANDTZAEG et al. 1988; JANEWAY u. TRAVERS 2002). Die Antigenpräsentation durch MHC-Klasse-II-Moleküle sowie die costimulierende Aktivität von Makrophagen machen sie auch zu einem Teil der adaptiven Immunantwort. 9 2 LITERATURÜBERSICHT 2.1.3.4 Orale Toleranz Im Gegensatz zu den meisten anderen lymphatischen Geweben ist eine vollständige Elimination der luminalen Antigene durch das GALT nicht möglich. Es gilt eine Balance zwischen der Elimination virulenter Antigene und der Toleranz gegenüber harmlosen, persistent vorhandenen Antigenen herzustellen (MACDERMOTT 1996). Daher verfügt das GALT über ein komplexes suppressorisches System zur Kontrolle der Immunantwort, vor allem gegenüber bekannten, avirulenten enterischen Antigenen, wozu auch diätetische Antigene oder die normale mikrobielle Flora gehören. Dieses suppressorische System besteht im Wesentlichen aus drei Elementen, einer Permeabilitätsbarriere gegenüber Makromolekülen, einer vorherrschenden IgA-Antikörperantwort sowie einer effektiven TSuppressorzell-Funktion. Essentiell ist eine intakte mukosale Barriere, die die Lamina propria vor Kontakt mit unbekannten Antigenen schützt. Nur sehr wenige Nahrungsantigene durchdringen die intakte Mukosaschranke. Bei erwachsenen Tieren sind dies etwa 0,002% aller mit der Nahrung aufgenommenen Antigene (ALLENSPACH u. GASCHEN 2003). So wird die Lamina propria vor einer Überflutung mit unbekannten Antigenen geschützt. Darüber hinaus ist Immunglobulin A als der vorherrschende Antikörperisotyp im Darm von Bedeutung. Sekretorische IgA-Antikörper aggregieren einerseits luminale Antigene und schirmen so die Mukosa von Antigenen ab, andererseits provozieren sie, anders als andere Isotypen, keine starken Komplementsystemes. Eine inflammatorischen entscheidende Reaktionen Rolle spielt durch außerdem Aktivierung das des Netzwerk regulatorischer T-Zellen und hyporeaktiver antigenpräsentierender Zellen, das neben der lokalen auch eine systemische Toleranz gegenüber harmlosen Antigenen induziert. Die TZellen haben eine zentrale Funktion bei der Entwicklung der oralen Toleranz. Die normale Immunantwort im Darm ist eine durch T-Helfer-Zellen-Typ 2 dominierte, so genannte TH2Antwort, mit Induktion von regulatorischen T-Zellen, antiinflammatorischen Zytokinen und IgA-produzierenden B-Zellen (MAGNE 1992; GUILFORD 1996a, 1996b; STROBEL 2002; ALLENSPACH u. GASCHEN 2003; CAVE 2003). Die Peyerschen Platten sind zentraler Ort der Induktion einer Immunantwort. Spezialisierte M-Zellen des follikelassoziierten Epithels stellen Unterbrechungen der mukosalen Schranke dar. Sie nehmen, wie erwähnt, rezeptorvermittelt oder über unspezifische Mechanismen unlösliche, partikuläre Antigene oder ganze Mikroorganismen auf (BRANDTZAEG 2001b). 10 2 LITERATURÜBERSICHT Diese werden zu subepithelial gelegenen antigenpräsentierenden Zellen (APC) wie B-Zellen, Makrophagen und dendritischen Zellen transportiert. Antigenpräsentierende Zellen prozessieren die Antigene und präsentieren sie naiven B- und T-Zellen im darunter liegenden Follikel. Im Gegensatz zu anderen APCs weisen die der intestinalen Mukosa einen Mangel costimulierender Moleküle, wie CD80 und CD86 auf. Die aktivierten B- und T-Zellen proliferieren daher nur wenig. In Zusammenhang mit einer spezifischen Mikroumgebung und bestimmten Chemokinen, die sich von anderen Lymphgeweben des Körpers unterscheiden, kommt es zur Induktion von regulatorischen TH2 und TH3 Zellen (KELLERMANN u. MCEVOY 2001). Diese verlassen die Mukosa über afferente Lymphbahnen, erreichen so den Kreislauf und gelangen anschließend durch Bindung an zelluläre Adhäsionsmoleküle (cellular adhesion molecules, CAM), die von Venulen mit hohem Endothel exprimiert werden, zurück in die Lamina propria der Schleimhäute. Hier verweilen sie als T- und B-Gedächtniszellen bis zu einem weiteren Kontakt mit ihrem spezifischen Antigen. Als T-Effektorzellen der Lamina propria des Intestinaltraktes sezernieren sie nach ihrer Aktivierung vorwiegend antiinflammatorische Zytokine wie den Transforming Growth Factor β (TGF-β) oder Interleukin 10 (IL-10). Diese führen bei B-Zellen zu einem Isotypenswitch zu Immunglobulin A, während die Immunglobulin G Produktion und TH1-Lymphozyten supprimiert werden. Durch Aggegation von Antigenen schützt Immunglobulin A die Darmoberfläche vor übermässigem Kontakt mit Antigenen und trägt so zur Aufrechterhaltung der oralen Toleranz bei (JANEWAY u. TRAVERS 2002; ALLENSPACH u. GASCHEN 2003; CAVE 2003). Um trotz Suppression der Immunantwort dennoch mit ausreichender Effektivität gegen pathogene Agenzien vorgehen zu können, sind dem Immunsystem des Darms spezielle Rezeptoren für hochkonservierte Strukturen von Mikroorganismen eigen. Die am besten charakterisierten Rezeptoren sind die Toll-like Rezeptoren (TLR) mit ihren 10 Varianten (AKIRA 2003). Wichtige TL-Rezeptoren sind der TLR-4, welcher einen Lipopolysaccharidrezeptor repräsentiert sowie der TLR-2, der an Peptidoglykane von gramnegativen Bakterien bindet (HEINE u. LIEN 2003). Die Antigenbindung an den Tolllike Rezeptor führt zu einer intrazellulären Signalkaskade, mit Freisetzung des transcription nuclear factor NF-κB von dem inhibitorischen Molekül (IκB) und der Induktion der Gentranskription verschiedener Gene, die für inflammatorische Zytokine und costimulierende 11 2 LITERATURÜBERSICHT Faktoren kodieren (IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, CD80/CD86). Die Toll-like Rezeptoren sind somit Sensoren, welche die Präsenz von Mikroorganismen anzeigen können (CAVE 2003). Zellen innerhalb der Mukosa zeigen nur wenig TLR-2 und TLR-4 Expression. Die Expression kann jedoch durch inflammatorische Zytokine innerhalb kürzester Zeit heraufreguliert werden (ABREU et al. 2001). Intestinale antigenpräsentierende Zellen exprimieren indes in Abwesenheit solcher „Warnsignale“ keine costimulierenden CD80/CD86-Moleküle und produzieren nur wenig proinflammatorische Zytokine wie TNF-α, IL-1 und IL-12. Durch solche APCs aktivierte T-Zellen zeigen nur geringe Proliferationsneigung mit vielfacher Apoptose der Lymphozytenklone. Überlebende Gedächtniszellen tendieren zur Produktion der antiinflammatorischen suppressorischen Chemokine TNF-β und IL-10 (JENKINS et al. 2001). Die Kombination aus Apoptose zahlreicher T-Zellklone aktivierter T-Zellen und Sekretion von antiinflammatorischen und die IgA-Produktion fördernden Zytokinen ist die Basis der immunologischen Toleranz gegenüber nicht-invasiven, luminalen Antigenen. Die orale Toleranz ist demnach eine sensible Balance. Einerseits wird Immunsuppression durch Induktion von Immunglobulin A, T-Zell-Deletion und Anergie gefördert. Andererseits bleibt das Reaktionspotential durch Retention von antigenspezifischen Lymphozyten, mit der Fähigkeit auf invasive Antigene mit Immunglobulinswitch zu IgM, IgG oder IgE sowie mit der Produktion inflammatorischer Zytokine zu reagieren, erhalten (CAVE 2003). 12 2 LITERATURÜBERSICHT 2.2 Inflammatory Bowel Disease bei Katze und Hund Der Begriff „chronisch idiopathische Enteropathie“ oder englisch “Inflammatory Bowel Disease (IBD)“ beschreibt einen Erkrankungskomplex, der durch persistierende oder rezidivierende Symptome einer gastrointestinalen Erkrankung unbekannter Ursache in Zusammenhang mit histologischen Merkmalen einer entzündlichen Reaktion gekennzeichnet ist (GUILFORD 1996b; WILLARD 1999; JERGENS 2002; TAMS 2003). IBD ist eine der häufigsten Ursachen für chronischen Vomitus und Diarrhoe bei der Katze (TAMS 1993, 2003; GUILFORD 1996b; JERGENS 1999; MENESES et al. 2003). Da die Erkrankung idiopathisch auftritt, ist eine umfassende klinische Untersuchung zum Ausschluss der zahlreichen Differentialdiagnosen essentiell. Für eine definitive Diagnose ist die histopathologische Untersuchung endoskopisch oder chirurgisch entnommener Bioptate des Intestinaltraktes obligatorisch (TAMS 1986a, 1993; GHERMAI 1989; JERGENS 2002, 2003; MENESES et al. 2003). Eine Rasse- oder Geschlechtsprädisposition gibt es, den meisten Autoren zufolge, bei der Katze nicht (TAMS 1986a, 1987, 1993; JERGENS et al. 1992; GUILFORD 1996b; MENESES et al. 2003). Eine Häufung von IBD-Fällen ist jedoch, einigen Untersuchern zufolge, bei Katzen mittleren und hohen Alters zu beobachten (TAMS 1986a, 1987, 2003; DENNIS et al. 1992, 1993; JERGENS et al. 1992; MÜNSTER 1995, WALY et al. 2004). Einige Autoren berichten auch von vermehrten Krankheitsfällen bei männlichen Tieren oder reinrassigen Katzen, jedoch ohne eine bestimmte Rasseprädisposition (DENNIS et al. 1993; HART et al. 1994; LECOINDRE u. CHEVALLIER 1997). 2.2.1 Histopathologische Diagnostik und Befundinterpretation bei IBD Die Diagnose des Vorliegens von IBD erfordert in jedem Fall die histopathologische Untersuchung von Bioptaten aus dem Intestinaltrakt (TAMS 1987, 2003; JERGENS et al. 1992; GUILFORD 1996b; JERGENS 1999; WILCOCK 1992; JERGENS 2004). Jedoch berichten WILLARD et al. (2002) in einer Studie über die histopathologische Evaluation von Proben aus dem Intestinaltrakt von Katzen und Hunden darüber, dass es erhebliche Variationen in der Befundung zwischen verschiedenen Untersuchern gibt. Dies liegt vor allem daran, dass die vermehrte Infiltration der Lamina propria mit Entzündungszellen zwar ein Charakteristikum bei IBD ist, die Lamina propria jedoch gleichzeitig eine physiologische Infiltration mit Immunzellen als Teil des diffusen Gut-Associated Lymphoid Tissue aufweist 13 2 LITERATURÜBERSICHT (WILCOCK 1992; LIEBICH 1999; WILLARD 1999; WALY et al. 2004). Darüber hinaus kommen für eine erhöhte Anzahl inflammatorischer Zellen in der Lamina propria verschiedene Auslöser in Betracht. Dazu zählen bei der Katze Hyperthyreoidismus (Thyreotoxikose), verschiedene infektiöse Erreger, wie Bakterien, Viren und Parasiten sowie Neoplasien (TAMS 1993, 2003; JERGENS 2002; CARRERAS et al. 2003; MENESES et al. 2003; WALY et al. 2005; EVANS et al. 2006). Isolierte Veränderungen der Leukozytenpopulation der Lamina propria ohne weitere Anzeichen einer entzündlichen Reaktion oder Schädigung von Enterozyten stellen keinen Beweis für das Vorliegen von IBD dar (WILCOCK 1992; JERGENS 2002, 2003). Vielmehr sollten weitere Veränderungen der Mukosa, wie Epithelveränderungen oder Architekturstörungen berücksichtigt werden, da sie, je nach Art und Ausprägung, den Grad und die Chronizität des Prozesses widerspiegeln (WILCOCK et al. 1992; JERGENS 2002, 2003). 2.2.1.1 Bioptate Die histopathologische Untersuchung von Bioptaten aus dem Intestinaltrakt von Katzen mit IBD ist für die Diagnosesicherung des Vorliegens von IBD obligatorisch. Zwei Biopsietechniken sind dabei von Bedeutung: die endoskopische Probenentnahme und die Gewinnung von Vollstückbiopsien, die laparoskopisch oder laparotomisch als Stanzbiopsie oder durch chirurgische Resektion entnommen werden (NOLTE 1997; MENESES et al. 2003; BILZER 2006; EVANS et al. 2006) Die endoskopische Bioptatgewinnung ist ein minimalinvasiver Eingriff, bei dem Bioptate aus dem Magen, proximalen Anteilen des Dünndarms sowie dem Kolon entnommen werden können. Allerdings enthalten die Proben ausschließlich Anteile der Mukosa bis zur Lamina muscularis mucosae und können darüber hinaus nur aus den genannten Anteilen des Gastrointestinaltraktes entnommen werden. Ein entscheidender Nachteil der Endoskopie ist außerdem, dass Erkrankungen im Bauchhöhlenbereich, z.B. Serosawand des Magens, infiltrierende Tumoren, Peritonitis, Pankreatitis, Pankreasneoplasien, die die gleichen Symptome hervorrufen können, wie sie beim Vorliegen einer Gastritis, einer entzündlichen Enteritis oder einer Kolitis auftreten, mit diesem Untersuchungsverfahren nicht diagnostiziert werden können (NOLTE 1997). Veränderungen der Mukosa, wie Zerreißbarkeit des Gewebes, Ödem, Erythem oder granuläres, kopfsteinpflasterartiges Aussehen deuten auf eine entzündliche Reaktion hin (WILLARD 1999). Jedoch können auch Bereiche, die bei der endoskopischen Untersuchung 14 2 LITERATURÜBERSICHT unauffällig waren, deutliche histopathologische Abweichungen aufweisen (DENNIS et al. 1992). Offensichtliche Läsionen wie Erosionen oder Ulzerationen sind bei der Katze selten und, sofern vorhanden, nicht pathognomonisch (TAMS 1986a; DENNIS et al. 1992, 1993; BAEZ et al. 1999; WILLARD 1999; BILZER 2006). Die Laparotomie bietet die Vorteile einer transmuralen Bioptatgewinnung. Neben der Mukosa können so auch die Tela submucosa, Tunica muscularis und die Serosa histopathologisch beurteilt werden. Vor allem in Fällen mit lymphoplasmazellulärer IBD ist dadurch eine bessere Abgrenzung zur wichtigsten Differentialdiagnose, dem diffusen intestinalen Lymphom, möglich (TAMS 1986a; EVANS et al. 2006). Darüber hinaus können Proben auch aus Jejunum und Ileum entnommen und histopathologisch beurteilt werden (TAMS 1987; VAN DER GAAG 1988; VAN DER GAAG u. HAPPÉ 1990; WILCOCK 1992; TAMS 2003). KLEINSCHMIDT et al. (2006) konnten in Gastrointestinaltraktes einer von retrospektiven Hunden mit Studie klinischen an transmuralen Symptomen Bioptaten einer des chronischen Enteropathie zeigen, dass die histopathologische Diagnosestellung bei transmuralen Bioptaten im Vergleich zu endoskopisch gewonnenen Gewebeproben sicherer ist. Dies gilt den Autoren zufolge vor allem für die Diagnose von diffusen intestinalen Lymphomen. 2.2.1.2 Histopathologische Veränderungen Wie bereits erwähnt, ist die Infiltration der Lamina propria und zu Teil auch der Tela submucosa und Tunica muscularis mit unterschiedlichen Immunzellen ein charakteristisches Merkmal der entzündlichen Reaktion für zum Formenkreis der IBD gehörender Darmerkrankungen (TAMS 1986a, 1993, 2003; NELSON et al. 1984; GHERMAI 1989; DENNIS et al. 1992, 1993; LECOINDRE u. CHEVALLIER 1997; GUILFORD 1996b; MENESES et al. 2003). Das Entzündungszellinfiltrat kann aus Lymphozyten, Plasmazellen, Makrophagen und/oder eosinophilen und neutrophilen Granulozyten bestehen (TAMS 1986a, 1987, 1993, 2003; GHERMAI 1989; JERGENS et al. 1992; WILCOCK 1992; GUILFORD 1996b; LECOINDRE u. CHEVALLIER 1997; JERGENS 1999; TAMS 2003; JERGENS 2004). Die Klassifizierung der IBD erfolgt anhand des entzündlichen Infiltrates und des betroffenen Darmabschnittes (GUILFORD 1996b; GERMAN et al. 2003; MENESES et al. 2003) (siehe Abschnitt 2.2.2: Klassifikation der IBD-Formen). 15 2 LITERATURÜBERSICHT Neben den entzündlichen Infiltraten können jedoch zahlreiche weitere Veränderungen in der Mukosa auftreten (TAMS 1986a; GHERMAI 1989; ROTH et al. 1990; DENNIS et al. 1992, 1993; WILCOCK 1992; LECOINDRE u. CHEVALLIER 1997; JERGENS 2002, 2003; KLEINSCHMIDT et al. 2006). Abweichende Befunde der Gewebemorphologie können im Epithel, an den Zotten, an den Krypten sowie in der Lamina propria auftreten oder die Mukosa insgesamt betreffen (BARLOUGH et al. 1981; VAN DER GAAG 1988; VIBEPETERSEN 1991; WILCOCK 1992; DENNIS et al. 1992, 1993; LECOINDRE u. CHEVALLIER 1997; TAMS 2003; WALY et al. 2004; KLEINSCHMIDT et al. 2006). Zu den Veränderungen des Darmepithels, die bei IBD vorkommen können, gehören Hypertrophie, Abflachungen oder Degenerationen von Epithelzellen sowie Erosionen und Ulzerationen. Teilweise kommen vermehrt intraepitheliale Lymphozyten oder vermehrt Mitosen von Epithelzellen vor. Zuweilen kann im Kolon ein Becherzellverlust auftreten. Abweichungen der Zottenmorphologie stellen sich als verkürzt aussehende, plumpe Zotten bis hin zur Zottenatrophie sowie als Zottenfusionen dar. Zu den Veränderungen der Kryptenmorphologie, die bei IBD vorkommen können, gehören Kryptendilatationen sowie Kryptenabszesse mit Ansammlung neutrophiler Granulozyten in den Lumina. In schwerwiegenden Fällen kommt es zu Kryptenverlusten. Durch Ödematisierung oder Infiltration der Lamina propria mit Entzündungszellen können die Krypten auseinander gedrängt und von der Lamina muscularis mucosae abgehoben werden. Lymphangiektasien können in der Mukosa, Submukosa und/oder der Tunica muscularis sowie transmural auftreten. Das Gesamterscheinungsbild der Mukosa kann durch Atrophie oder Hypertrophie geprägt sein. Infolge lang anhaltender Entzündungsreaktionen entstehen Fibrosierungen in der Mukosa (BARLOUGH et al. 1981; VAN DER GAAG 1988; VIBE-PETERSEN 1991; WILCOCK 1992; DENNIS et al. 1992, 1993; LECOINDRE u. CHEVALLIER 1997; TAMS 2003; WALY et al. 2004; KLEINSCHMIDT et al. 2006). Bei der lymphoplasmazellulären Form der IBD kann die Abgrenzung zum diffusen intestinalen Lymphom schwierig sein. Bei beiden Erkrankungen kommen, neben einer Infiltration der Mukosa mit Lymphozyten, zahlreiche Veränderungen der Gewebearchitektur wie Zottenatrophie und –fusion und Kryptenverlust vor (WILCOCK 1992; WASMER et al. 1995; KRECIC und BLACK 2000; TAMS 2003; CARRERAS et al. 2003; WALY et al. 16 2 LITERATURÜBERSICHT 2005). Frühere Arbeiten beschreiben als Kennzeichen eines diffusen intestinalen Lymphoms Parameter wie Infiltration extraintestinaler Organe, Uniformität der Lymphozytenpopulation, zahlreiche Mitosen sowie progressive Infiltration bis in die Tunica muscularis und die Serosa hinein (WILCOCK 1992; TAMS 2003). WALY et al. (2005) konnten jedoch in einer retrospektiven Studie an Katzen mit intestinalem Lymphom mittels immunhistochemischer Färbungen zeigen, dass auch Lymphome mit gemischtem B- und T- Zellphänotyp vorkommen. Mitosen traten, den Autoren zufolge, relativ selten auf. In einigen Fällen wurde aufgrund der immunhistochemischen Untersuchungsergebnisse die Diagnose eines Lymphomes revidiert, und es wurde stattdessen ein inflammatorischer Prozess festgestellt. Die Autoren empfehlen daher zur Differenzierung zwischen entzündlichen Veränderungen und diffusen intestinalen Lymphomen immunhistochemische Untersuchungsmethoden zu verwenden. Bei endoskopisch entnommenen Bioptaten ist zu beachten, dass diese maximal bis zur Tela submucosa reichen und daher eine Infiltration tieferer Gewebeschichten mit Tumor- oder Entzündungszellen, wie der Tunica muscularis, nicht erkannt werden kann (WILCOCK 1992; TAMS 2003). 2.2.1.3 Befundinterpretation Wie bereits erwähnt, bestehen hinsichtlich der histopathologischen Diagnosen z. T. erhebliche Varianzen zwischen verschiedenen Untersuchern (WILLARD 2002). Dies hat in der Vergangenheit mehrere Autoren veranlasst, histologische Beurteilungsschemata für intestinale Gewebeproben von Katzen und Hunden zu erstellen (JERGENS et al. 1992; WILCOCK 1992; DENNIS et al. 1992, 1993; LECOINDRE u. CHEVALLIER 1997; WALY et al. 2004; ROTTER 2005; BILZER 2006; MÜNSTER et al. 2006). Bislang konnte sich allerdings keines dieser Schemata allgemein durchsetzen. Daher gründete die World Small Animal Veterinary Association (WSAVA) die Gastrointestinal Standardization Group mit dem Ziel, eine international anerkannte und verbindliche Klassifikation für die histologische Beurteilung gastrointestinaler Bioptate von Katzen und Hunden zu formulieren. Die Artikel sollen in gebundener Form, in Fachzeitschriften sowie im Internet veröffentlicht werden, stehen derzeit jedoch noch nicht zur Verfügung (BILZER 2006). Eine Graduierung der histopathologischen Befunde bei IBD in gering-, mittel- oder hochgradige Veränderungen erfolgt im Allgemeinen unter Berücksichtigung der Ausprägung 17 2 LITERATURÜBERSICHT und der Kombination verschiedener Veränderungen wie Zellinfiltrationen und/oder Architektur- und Epithelveränderungen (HART et al. 1994; JERGENS 2002; ROTTER 2005). Die meisten Untersucher sprechen von einer geringgradigen entzündlichen Veränderung, wenn eine Entzündungszellinfiltration ohne weitere Abweichungen der Gewebemorphologie vorliegt (ROTH et al. 1990; DENNIS et al. 1992, 1993; WEISS et al. 1996; TAMS 2003). Anderen Autoren zufolge sind darüber hinausgehende geringgradige Abweichungen der normalen Gewebemorphologie, wie geringgradig plump erscheinende Zotten, mäßiges Ödem und/oder Fibrose, vereinzelte neutrophile Granulozyten oder vermehrt intraepitheliale Lymphozyten, noch als geringgradige Entzündungserscheinungen zu klassifizieren (LECOINDRE u. CHEVALLIER 1997; ROTTER 2005; BILZER 2006; MÜNSTER et al. 2006). Mittelgradige entzündliche Veränderungen liegen, den meisten Untersuchern nach, bei Architekturveränderungen vermehrtem der entzündlichem Gewebemorphologie Infiltrat vor. in Verbindung Dazu gehören mit die Auseinanderdrängung von Krypten durch Infiltrate, Ödem oder Fibrose, verstärkt plump aussehende Zotten, Epithelabflachung, Epithelunreife oder Nekrosen von Epithelzellen sowie vermehrt intraepitheliale Lymphozyten. Bei einer mittel- bis hochgradigen Infiltrationen der Mukosa mit Entzündungszellen in Kombination mit Architekturveränderungen des Gewebes, die über die oben genannten hinausgehen, spricht die Mehrheit der Autoren von hochgradiger Darmentzündung. Dazu zählen Veränderungen wie ausgeprägte Auseinanderdrängung von Krypten durch Infiltrate, Ödem und/oder Fibrosen, deutliche Zottenatrophie und/oder –fusion, Kryptenatrophien und/oder Verlust von Krypten sowie Erosionen und Ulzerationen (ROTH et al. 1990; DENNIS et al. 1992, 1993; WEISS et al. 1996; LECOINDRE u. CHEVALLIER 1997; TAMS 2003; ROTTER 2005; BILZER 2006; MÜNSTER et al. 2006). 2.2.2 Klassifikation der IBD-Formen bei Katze und Hund Die Klassifizierung der IBD erfolgt einerseits nach dem Typ des entzündlichen Infiltrates, andererseits nach dem betroffenen Bereich des Intestinaltraktes (GUILFORD 1996b; GERMAN et al. 2003; MENESES et al. 2003). Außer dem jeweiligen entzündlichen Infiltrat finden sich bei allen IBD Formen mehr oder weniger stark ausgeprägte Veränderungen des Epithels, der Zotten und/oder der Kryptenmorphologie sowie Abweichungen von der normalen Gewebetextur in der Lamina propria (siehe Abschnitt 2.2.1.2: Histopathologische Veränderungen). Die entzündlichen Veränderungen können auf den Dünndarm beschränkt 18 2 LITERATURÜBERSICHT sein (Enteritis), bestimmte Abschnitte des Dünn- oder Dickdarms betreffen (Duodenitis, Jejunitis, Ileitis, Kolitis) oder Dünndarm und Kolon insgesamt (Enterokolitis) einbeziehen. Enterokolitiden können bei der Katze zwar vorkommen, häufiger ist jedoch nur der Dünndarm betroffen (TAMS 2003). Zwischen den verschiedenen Formen der IBD kann es Überschneidungen geben, so dass nicht jede chronische idiopathische entzündliche Enteropathie endgültig klassifiziert werden kann. Bei der Katze werden die lymphoplasmazelluläre Enteritis und Kolitis, die eosinophile Enteritis, das hypereosinophile Syndrom, die eosinophile granulomatöse Gastroenterokolitis, die chronische eitrige Kolitis, die granulomatöse Enteritis, Enterokolitis oder Kolitis sowie die transmurale granulomatöse Enterokolitis unterschieden. Neben den genannten Formen gibt es beim Hund weitere Erkrankungen, die dem Formenkreis der IBD zuzurechnen sind und für die offensichtlich eine genetische Prädisposition besteht. Dazu gehören die histiozytäre ulzerative Kolitis (histiocytic ulcerative Colitis - HUC) des Boxers, die immunproliferative Enteropathie des Basenjihundes sowie das Diarrhoe-Syndrom des norwegischen Lundehundes. Derartige rassespezifische Erkrankungen, die dem Formenkreis der IBD zugerechnet werden, sind bei der Katze nicht bekannt. 2.2.2.1 Lymphoplasmazelluläre Enteritis und Kolitis Die häufigste Form der IBD bei Katze und Hund ist die lymphoplasmazelluläre Enteritis (LPE), lymphoplasmazelluläre Kolitis (LPK) oder lymphoplasmazelluläre Enterokolitis (LPEK). Klinisch stehen Vomitus und Diarrhoe, aber auch zahlreiche weitere Symptome wie Gewichtsverlust und Hypoproteinämie im Vordergrund (GHERMAI 1989; DENNIS et al. 1992, 1993; JERGENS 1992; WILCOCK 1992; TAMS 1993; GUILFORD 1996b; LECOINDRE u. CHEVALLIER 1997; WILLARD 1999; TAMS 2003; CRAVEN et al. 2004). Beim Hund werden Rasseprädispositionen für den Deutschen Schäferhund, den Shar Pei und den Boxer angegeben (VAN DER GAAG 1988). Derartige Rasseprädispositionen sind bei der Katze bislang nicht beschrieben worden. DENNIS et al. (1992, 1993) berichten allerdings von einer Häufung bei Rassekatzen im Allgemeinen. Sowohl bei der Katze als auch beim Hund sind in der Regel Tiere mittleren und höheren Alters betroffen (VAN DER GAAG u. HAPPÉ 1990; DENNIS 1992, 1993). Die histologischen Veränderungen sind gekennzeichnet durch eine Infiltration der Mukosa mit Lymphozyten und Plasmazellen. 19 2 LITERATURÜBERSICHT Vereinzelt können auch eosinophile oder neutrophile Granulozyten sowie Makrophagen vorkommen. Des Weiteren werden die erwähnten variablen Veränderungen der Gewebemorphologie, wie vermehrte intraepitheliale Lymphozyten, Architekturveränderungen der Mukosa oder Epithelschädigungen beobachtet (siehe Abschnitt 2.2.1.2: Histopathologische Veränderungen) (WILCOCK 1992; JERGENS 2002, 2003; TAMS 2003). Differentialdiagnostisch ist vor allem das diffuse intestinale Lymphom zu berücksichtigen (WILCOCK 1992; TAMS 2003). 2.2.2.2 Eosinophile Gastroenteritis, Enteritis, Enterokolitis und Kolitis Die eosinophile Gastroenterokolitis ist die zweithäufigste Form der IBD bei Katze und Hund. Hypersensivitätsreaktionen gegenüber Futtermittelallergenen oder Parasiten könnten die pathogenetische Grundlage der Erkrankung darstellen. Jedoch kann die Erkrankung nicht in allen Fällen durch Eliminationsdiäten oder Antiparasitika günstig beeinflusst werden. Fälle von eosinophiler Enteritis unbekannter Unrasche werden daher dem Formenkreis der IBD zugeordnet (GUILFORD 1996b). Histologisch ist die eosinophile Gastroenterokolitis der lymphoplasmazellulären Form sehr ähnlich mit dem Unterschied, dass eosinophile Granulozyten den herausragenden Anteil des entzündlichen Infiltrates darstellen (WILCOCK 1992; TAMS 1993, 2003). Die Infiltration ist meistens diffus und erstreckt sich häufig auch in tiefere Gewebeschichten wie die Tela submucosa (WILCOCK 1992). Je nach betroffenem Abschnitt des Gastrointestinaltraktes liegt eine Gastroenteritis, Enteritis oder Kolitis vor. Differentialdiagnostisch müssen gastrointestinale Parasiten, Futtermittelallergien und Mastzelltumore ausgeschlossen werden. Von der eosinophilen Gastroenterokolitis ist das hypereosinophile Syndrom der Katze zu differenzieren. Dieses stellt eine seltene, aber lebensbedrohliche Form der IBD dar, die mit einer massiven Infiltration des Darms mit eosinophilen Granulozyten und anderen Entzündungszellen, aber auch extraintestinaler Organe, wie Leber, Nieren, Milz, Lymphknoten, Herz oder Knochenmark, einer Blut-Eosinophilie sowie oft hochgradiger Verdickung der Darmwand einhergeht (TAMS 1993, 2003). Die Erkrankung kommt vorwiegend bei über 7 Jahre alten Tieren vor. Klinische Erscheinungen sind den unter 2.2.2.1 genannten IBD Formen ähnlich, darüber hinaus treten jedoch verstärkt Verdickungen der Darmwand, Hepatomegalie und Hämatochezie auf (GUILFORD 1996b). 20 2 LITERATURÜBERSICHT 2.2.2.3 Eosinophile granulomatöse Gastroenterokolitis Diese Erkrankung ist durch das Vorkommen von aus mehrheitlich eosinophilen Granulozyten bestehenden Granulomen in Ösophagus, Magen, Dünn- und/oder Dickdarm gekennzeichnet. Die Granulome lassen sich oftmals sonographisch darstellen, endoskopisch sind häufig fokale Verdickungen der Mukosa vorhanden. Derartige Granulome können sich transmural ausbreiten und so zu intestinalen Obstruktionen führen. Klinisch zeichnet sich die Erkrankung vor allem durch Erbrechen aus. Sie tritt vorwiegend bei jüngeren Hunden auf, und eine Rasseprädisposition wird für den Rottweiler angegeben. Bei der Katze wird von ähnlichen Veränderungen auch in der Mundhöhle und an den Lippen berichtet (GUILFORD 1996b). BRELLOU et al. (2006) beschrieben erstmals einen Fall von eosinophiler granulomatöser Gastroenteritis und Hepatitis unbekannter Ursache bei einem Siberian Husky. 2.2.2.4 Chronische eitrige Kolitis Neutrophile Granulozyten nehmen bei den meisten chronischen intestinalen Darmentzündungen höchstens einen kleinen Anteil des entzündlichen Infiltrates ein. Sie deuten in der Regel auf eine bakterielle Beteiligung hin und begleiten die zelluläre Immunantwort bei einer akuten Entzündungsreaktion im Gastrointestinaltrakt (WILCOCK 1992; GUILFORD 1996b). Es sind jedoch auch Fälle von chronischen Kolitiden beschrieben, bei denen neutrophile Granulozyten einen großen oder gar den überwiegenden Anteil des Infiltrates ausmachen. Die Erkrankung tritt anscheinend vorwiegend im felinen Kolon auf und trägt daher die Bezeichnung „chronische eitrige Kolitis“. Differentialdiagnostisch sind vor allem Infektionen mit enteropathogenen Erregern wie Salmonella sp., Clostridium sp., E. coli, Yersinia sp., Proteus sp. u.a. zu berücksichtigen. Als weitere Ursache werden zudem auch Reaktionen auf chronische Abrasionen durch aufgenommene Haare angenommen (GUILFORD 1996b; LEIB et al. 1986). 2.2.2.5 Histiozytäre ulzerative Kolitis des Boxers Die histiozytäre ulzerative Kolitis oder granulomatöse Kolitis des Boxers kommt vorwiegend bei Boxern unter 4 Jahren vor, ist jedoch auch bei einigen anderen Rassen beschrieben worden. Sie ist gekennzeichnet durch die Infiltration der Mukosa und Submukosa des Kolons mit PAS (periodic acid shift) positiven Makrophagen; daneben können auch Lymphozyten und Plasmazellen Bestandteil des entzündlichen Infiltrates sein. Im Rahmen der 21 2 LITERATURÜBERSICHT entzündlichen, granulomatösen Veränderungen kommt es in den betroffenen Bereichen zu starken Wandverdickungen und Ulzerationen (GERMAN et al. 2000b, 2003; STOKES et al. 2001; TANAKA et al. 2003; HOSTUTLER et al. 2004; VAN KRUININGEN et al. 2005; SIMPSON et al. 2006). Das in den Makrophagen befindliche PAS positive Material besteht aus lipidreichen, überwiegend cholesterolhaltigen Membranen der Phagolysosomen. Bisweilen enthalten die Makrophagen zusätzlich Bakterien. Neuere Untersuchungen von VAN KRUININGEN et al. (2005) zeigten mittels immunhistochemischer Färbungen mit einem polyklonalen Antikörper gegen Escherichia coli-Antigene positive Reaktionen in Gewebeschnitten aus dem Kolon von betroffenen Boxern. Darüber hinaus konnten SIMPSON et al. (2006) in einer weiteren Untersuchung mittels in situ Hybridisierung und Infektionsversuchen in der Zellkultur adhärente und invasive E. coli Erreger in Kolonbioptaten von an HUC erkrankten Boxern nachweisen. Der Erreger zeigte, den Autoren zufolge, Parallelen zu einem Escherichia coli (LF82) Stamm, der mit Morbus Crohn, einer der beiden IBD Formen des Menschen, in ätiologischen Zusammenhang gebracht wird. Bei der Katze ist eine derartige histiozytäre ulzerative Kolitis mit PAS positiven Makrophagen bisher nicht beschrieben worden. 2.2.2.6 Transmurale granulomatöse Enterokolitis (regionale Enteritis) Die transmurale granulomatöse Enterokolitis (regionale Enteritis) ist eine seltene Erkrankung aus dem Formenkreis der IBD, die jedoch anscheinend häufiger bei der Katze als beim Hund vorkommt. Sie ist durch segmentale, transmurale, granulomatöse, nekrotisierende und ulzerierende Wandverdickungen des Ileums und Kolons gekennzeichnet (WILCOCK 1992). Klinisch zeichnet sich die Erkrankung durch schweren Vomitus mit Hämatemesis, Gewichtsverlust und Obstipation durch Obstruktionen des Ileums, Kolons oder Rektums in Folge der granulomatösen Zubildungen aus. Palpatorisch können abdominal manchmal Umfangsvermehrungen in der Ileozäkalregion festgestellt werden. Bisweilen können bei rektaler Palpation Wandverdickungen oder Strikturen ertastet werden. Granulomatöse Entzündungen der Perianalregion können zu Fistelbildung führen. Im Rahmen einer Kolonoskopie werden häufig fokal oder multifokal Areale mit mukosaler Proliferation in Verbindung mit Ulzerationen und Einengungen des Lumens festgestellt. Zusätzlich zu den für die granulomatöse Enteritis genannten Differentialdiagnosen müssen Neoplasien, parasitäre 22 2 LITERATURÜBERSICHT Granulome und Campylobacter-assoziierte proliferative Enteritiden ausgeschlossen werden (GUILFORD 1996b). 2.2.2.7 Granulomatöse Enteritis, Kolitis und Enterokolitis Eine weitere seltene Form der IBD ist die idiopathische granulomatöse Enteritis. Histologisch zeichnet sie sich durch eine Infiltration der Lamina propria mit Makrophagen aus, die allerdings, im Gegensatz zur histiozytären ulzerativen Kolitis beim Boxer, kein PAS positives Material enthalten (GUILFORD 1996b; BROWN et al. 2007). Die klinischen Symptome ähneln den zuvor für die anderen IBD-Formen genannten. Die wichtigste Differentialdiagnose bei der Katze ist die feline infektiöse Peritonitis (FIP), aber auch Phykomykose oder Tuberkulose sind, vor allem im Vorfeld einer immunsuppressiven Therapie, zu berücksichtigen (GUILFORD 1996b). 2.2.2.8 Immunproliferative Enteropathie des Basenjihundes Bei der immunproliferativen Enteropathie des Basenjihundes handelt es sich um eine Erkrankung des Dünndarmes, die mit chronischer Diarrhoe einhergeht. Histopathologisch ist sie durch lymphoidzellige Infiltration und mukosale Hypertrophie vor allem im proximalen Bereich des Gastrointestinaltraktes gekennzeichnet. Darüber hinaus treten regelmäßig Zottenatrophie und -fusionen auf (GUILFORD 1996b; GERMAN et al. 2003). Von der LPE unterscheidet sie sich durch ihre Rasseprädisposition für den Basenji sowie durch meist schwerwiegende Entzündungserscheinungen mit progressivem oder rezidivierendem Verlauf. Da die Erkrankung mit hoher Prävalenz und ausschließlich beim Basenji vorkommt, werden genetische Faktoren in Zusammenhang mit Umwelteinflüssen als ätiologische Auslöser diskutiert (GUILFORD 1996b). 2.2.2.9 Diarrhoe-Syndrom des norwegischen Lundehundes Das Diarrhoesyndrom des Lundehundes ähnelt klinisch und histologisch der lymphoplasmazellulären Enteritis, verläuft im Unterschied zu dieser jedoch stets progressiv und zeigt eine starke genetische Prädisposition für diese Rasse (GUILFORD 1996b). 23 2 LITERATURÜBERSICHT 2.2.3 Ätiologie der IBD Die Ätiologie der Inflammatory Bowel Disease der Katze ist wie die des Hundes und des Menschen bislang ungeklärt. Die zentrale Hypothese zur Entstehung bzw. Aufrechterhaltung der Erkrankung beim Menschen und bei verschiedenen Tiermodellen geht von einem Verlust der Toleranz gegenüber der intestinalen Mikroflora und/oder Nahrungsantigenen aus (CAVE 2003; GERMAN et al. 2003). Darüber hinaus werden pathogene Mikroorganismen als auslösende Agenzien von IBD diskutiert (CAVE 2003). 2.2.3.1 Physiologische enterale mikrobielle Flora Die Rolle der endogenen intestinalen Mikroflora in der Ätiologie und Pathogenese von IBD bei Katze und Hund ist bis heute weitgehend unklar. Studien bei Menschen mit IBD und an Mausmodellen lassen jedoch vermuten, dass intestinale Mikroorganismen ätiologisch beteiligt sein könnten (CAVE 2003). Eine Dysregulation der Immunantwort könnte einen Zusammenbruch der Toleranz gegenüber der physiologischen enterischen Flora zur Folge haben. Dieses wird sowohl beim Menschen als auch bei der Katze diskutiert (JERGENS 2002, 2003; DANESE u. FIOCCHI 2006). So zeigten Untersuchungen an knock-out Mausmodellen, dass sich an Gnotobioten experimentell keine Kolitiden erzeugen ließen (BRANDWEIN et al. 1997; TAUROG et al. 1994; DIANDA et al. 1997). Umgekehrt kommt es bei Mausmodellen mit experimentell erzeugter Kolitis zu einer starken serologischen Antikörperaktivität gegenüber bestimmten intestinalen Bakterienspezies (BRANDWEIN et al. 1997). Darüber hinaus treten die beiden IBD-Formen des Menschen, Morbus Crohn und ulzerative Kolitis, gehäuft im Ileum und Kolon auf, also Darmabschnitten mit, im Vergleich zu den übrigen Darmsegmenten, hoher Dichte an intestinaler Flora (DANESE u. FIOCCHI 2006). Weiterhin stellt die Verabreichung von Antibiotika als primäre oder zusätzliche Maßnahme bei Fällen von IBD sowohl in der Humanmedizin wie auch bei Katzen und Hunden eine allgemein anerkannte Maßnahme mit nachfolgender klinischer Remission durch Senkung der bakteriellen Darmbesiedlung dar (PEPPERCORN 1993; TAMS 1993, 2003; LINSKENS et al. 2001; OHKUSA et al. 2004; OHKUSA u. SATO 2005). Eine Dysregulation der Rezeptorexpression bei antigenpräsentierenden Zellen mit nachfolgender entgleisender Reaktion von Immunzellen gegenüber der intestinalen Flora 24 2 LITERATURÜBERSICHT könnte ebenfalls eine Schlüsselrolle in der Pathogenese der IBD spielen (CAVE 2003). So zeigten verschiedene Studien an intestinalen dendritischen Zellen, Epithelzellen und Makrophagen erhöhte Expressionen des Toll-like Rezeptors 2 und 4 (TLR-2 und TLR-4) bei Patienten mit Enteritis und IBD (CARIO u. PODOLSKY 2000; HAUSMANN et al. 2002). Der Toll-like Rezeptor erkennt Zellwandbestandteile gramnegativer Bakterien. Im gesunden Intestinaltrakt wird er nur in geringem Maße exprimiert. Ob jedoch die vermehrte Expression der Toll-like Rezeptoren Auslöser der Entzündungsreaktion oder lediglich ein Epiphänomen darstellt, ist bislang unklar. Publizierte Daten über das Expressionsmuster dieser Rezeptoren bei Katzen und Hunden mit IBD sind bislang nicht verfügbar. Neben der überschießenden Immunantwort gegenüber der normalen intestinalen Flora könnte auch eine unphysiologische Vermehrung der enterischen Flora Entzündungsreaktionen zur Folge haben. Die als Small Intestinal Bacterial Owergrowth (SIBO) bekannte Erkrankung stellt eine bei Hunden beschriebene, unphysiologische Proliferation der intestinalen Flora des Dünndarmes dar, die mit Diarrhoe und Gewichtsverlust einhergeht. Durch die Sekretion proinflammatorischer Peptide durch Bakterien werden chemotaktisch Leukozyten angelockt und lösen eine Entzündungsreaktion aus (GUILFORD 1996b). Die Erkrankung betrifft vorwiegend junge Hunde, und es besteht eine Prädisposition beim Deutschen Schäferhund. Der Grund dieser Prädisposition ist nicht bekannt, vermutet wird aber die Beteiligung einer Immunglobulin A Defizienz, die bei betroffenen Individuen dieser Rasse nachgewiesen wurde (GERMAN et al. 2000a). Ob SIBO primär, d.h. idiopathisch, oder sekundär als Folge einer Motilitätshemmung auftritt, ist bisher ungeklärt. Denkbar wäre allerdings eine durch Hypotonie bedingte verminderte Absorptionsfähigkeit des Darms, die eine Substraterhöhung für Bakterien und Proliferation der bakteriellen Darmflora nach sich ziehen könnte (CAVE 2003). Untersuchungen von JOHNSTON et al. (2001) an gesunden Katzen und Katzen mit chronischen Erkrankungen des Intestinaltraktes zeigen indes, dass SIBO bei Katzen mit chronischen Enteritiden anscheinend keine Rolle spielt. Die Autoren fanden im Duodenum dieser Tiere im Vergleich zu darmgesunden Kontrollkatzen keine erhöhten Zahlen von Bakterien. 25 2 LITERATURÜBERSICHT 2.2.3.2 Pathogene Mikroorganismen Neben der Theorie des Zusammenbruches der oralen Toleranz gegenüber der physiologischen Darmflora gab es immer wieder Hinweise für eine Beteiligung pathogener Erreger an der Entstehung der IBD. Dabei konnte für spezielle Erreger, die im Verdacht standen, eine Rolle in der Ätiologie der IBD des Menschen zu spielen, wie Listeria monocytogenes, Chlamydia trachomatis, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae oder Cytomegalievirus, bislang allerdings keine ursächliche Beteiligung nachgewiesen werden. Speziell Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP), der Erreger der Johneschen Krankheit, einer granulomatösen Enteritis bei Wiederkäuern, tritt immer wieder in den Fokus von Untersuchungen bei Mensch und Tier (GUILFORD 1996b; DANESE u. FIOCCHI 2006). So konnten durch die Verabreichung von Mykobakterienspezies, die von Morbus Crohn Patienten gewonnen wurden, bei Ziegen granulomatöse Enteritiden ausgelöst werden (HEAD u. JURENKA 2004). Neuere Studien über die granulomatöse Colitis des Boxers deuten, wie erwähnt, auf eine ätiologische Beteiligung bestimmter E. coli-Stämme bei dieser Erkrankung hin (siehe Abschnitt 2.2.2.5 Histiozytäre ulzerative Kolitis des Boxers) (VAN KRUININGEN et al. 2005; SIMPSON et al. 2006). Bei der Inflammatory Bowel Disease der Katze gibt es Anhaltspunkte dafür, dass chronische intestinale Entzündungszellinfiltrate durch Mikroorganismen wie Kryptosporidien oder Toxoplasmen hervorgerufen werden können. FEINSTEIN und OLSSON (1992) wiesen bei Katzen mit chronischer Gastroenteritis spiralförmige Organismen im Epithel von Magen und Kolon nach. Andere Untersucher zeigten bei Katzen eine lymphozytäre Duodenitis nach intestinaler Infektion mit Cryptosporidium parvum (LAPPIN et al. 1997). PETERSON et al. (1991) stellten bei zwei Katzen nach Verabreichung immunsuppressiver Medikamente eine rezidivierende Toxoplasmose mit assoziierter lymphoplasmazellulärer Enteritis fest. Die Autoren vermuteten, dass die Infektion zu persistierenden entzündlichen Infiltraten führte. 2.2.3.3 Nahrungsantigene Als Auslöser von IBD kommen auch Reaktionen gegenüber Nahrungsantigenen in Betracht. Die Abgrenzung gegenüber einer echten Futtermittelintoleranz oder -allergie ist indes schwierig. Eine Sensibilität gegenüber verschiedenen Futtermitteln könnte sich auch sekundär entwickeln. Durch die entzündliche Reaktion und erhöhte Permeabilität wäre ein Vordringen 26 2 LITERATURÜBERSICHT von Nahrungsmittelantigenen in die Lamina propria denkbar, die den entzündlichen Prozess weiter unterhalten könnten, obwohl keine primäre Sensibilität vorlag (GUILFORD 1996b; CAVE 2003). So zeigten Untersuchungen von GUILFORD et al. (2001) in einer Studie an 55 Katzen mit chronischen idiopathischen Gastroenteritiden, dass es bei 11 Tieren nach Verabreichung einer Eliminationsdiät zur vollständigen klinischen Remission kam. Bei diesen Tieren trat nach erneuter Gabe des vorangegangenen Futters kein Rezidiv auf, so dass in diesen Fällen eine Futtermittelintoleranz oder –allergie ausgeschlossen wurde. 2.2.4 Immunpathogenese der IBD Wenngleich die Pathogenese der Inflammatory Bowel Disease zum heutigen Zeitpunkt nicht vollständig bekannt ist, so weist doch eine wachsende Zahl klinischer und experimenteller Ergebnisse aus der Human- und Veterinärmedizin auf eine chronische Entzündung des Intestinaltraktes als Folge einer Dysregulation der Immunantwort gegen die normale intestinale Mikroflora oder Nahrungsantigene hin (LOCHER et al. 2001; PAVLICK et al. 2002; CAVE 2003). Entsprechende Dysregulationen könnten auf zellulärer Ebene (Immunzellen), auf Mediatorebene (Chemokine und deren Transkriptionsfaktoren) oder in Form von Veränderungen des histologischen Gefüges (erhöhte Permeabilität der mukosalen Barriere) vorliegen. Die zentrale Hypothese der Immunpathogenese beim Menschen geht davon aus, dass Schädigungen der mukosalen Barriere durch Verletzungen, Entzündungen oder Infektionen zur Dysregulation im enterischen Immunsystem und zum Verlust der Toleranz führen (BRANDTZAEG 2001a; ALLENSPACH u. GASCHEN 2003). Über durchlässige interzelluläre tight junctions könnten Mikroorganismen und Nahrungsantigene in die Lamina propria eindringen und das lokale Immunsystem mit diesen Antigenen überfluten. Der Hypothese nach verschiebt sich die Immunantwort von einer vorherrschenden TH2Immunantwort mit regulatorischen TH2 und TH3 Zellen, antiinflammatorischen Zytokinen (IL-10, IL-13, TGF-β) und Aktivierung IgA sezernierender Plasmazellen zu einer Entzündungsreaktion vom Typ TH1 mit zytotoxischen Reaktionen, proinflammatorischen Zytokinen und vermehrt IgG-Plasmazellen. Regulatorische Mechanismen werden überfordert und die protektive Immunantwort entfällt. Die Zytokine wirken darüber hinaus wahrscheinlich chemotaktisch auf weitere Leukozyten inklusive eosinophile Granulozyten 27 2 LITERATURÜBERSICHT und Mastzellen, welche wiederum inflammatorische Mediatoren sezernieren. Diese bewirken, dass die bereits veränderte Darmmukosa weiter geschädigt wird. Der Prozess ist somit in hohem Maße selbsterhaltend und resultiert in einem circulus vitiosus. Ob allerdings die Verletzungen der mukosalen Integrität die Dysregulationen des lokalen Immunsystems und die Entzündungsreaktionen hervorrufen oder primäre Entzündungserscheinungen zu Verletzungen der mukosalen Barriere führen ist bis heute ungeklärt (ALLENSPACH u. GASCHEN 2003; CAVE 2003). 2.2.4.1 Einfluss der mukosalen Integrität auf die Pathogenese der IBD Die Bedeutsamkeit einer intakten mukosalen Barriere im Darm wurde deutlich an Cadherinnegativen Mauschimären gezeigt. Cadherin ist ein für die Zelladhäsion der Epithelzellen im Darm verantwortliches und für die Aufrechterhaltung der epithelialen Integrität bedeutsames Molekül. Mauschimären mit variabler Expression des entsprechenden Gens wiesen in Darmabschnitten mit einer Mutation im Cadherin-Gen Epitheldefekte und Darmentzündungen auf. Im Gegensatz dazu zeigen Bereiche mit normaler Genexpression keine entzündlichen Reaktionen (HERMISTON u. GORDON 1995). Eine erhöhte Permeabilität könnte sowohl Auslöser als auch Folge entzündlicher Reaktionen der Mukosa bei IBD sein, geht jedoch meist mit diesen einher. So wurde in Untersuchungen an Hunden mit chronischer Enteropathie eine erhöhte Permeabilität der Darmwand für große Kohlenhydratmoleküle wie Laktulose nachgewiesen (ALLENSPACH et al. 2006). Untersuchungen am menschlichen Intestinaltrakt und an Tiermodellen zeigen, dass die Zytokine INF-γ und TNF-α die Permeabilität des Epithels erhöhen können. Diese Zytokine führen einzeln oder gemeinsam durch eine Schwächung der tight-junctions zwischen den Enterozyten sowie durch die Induktion vorzeitiger Apoptose des Zottenepithels zu einer erhöhten Permeabilität des Epithels. Im Rahmen intestinaler Entzündung konnte vermehrt für diese Zytokine kodierende m-RNA nachgewiesen werden (GITTER et al. 2000; GASSLER et al. 2001). 2.2.4.2 Immunzellen Die Hypothese der Dysregulation der normalen intestinalen Immunantwort als pathogenetisches Schlüsselereignis für die Entstehung von IBD und für das bei IBD charakteristische Entzündungszellinfiltrat in der Darmmukosa hat mehrere Untersucher 28 2 LITERATURÜBERSICHT veranlasst, mit Hilfe immunhistochemischer und morphometrischer Methoden die Zahl und die Verteilung von Immunzellen im Gastrointestinaltrakt von Hunden und Katzen mit IBD zu untersuchen. T-Zellen und Zytokine stehen in vielen Studien über die zellulären Veränderungen im Intestinaltrakt bei IBD im Mittelpunkt des Interesses. Untersuchungen an Mausmodellen mit Defekten der für die antiinflammatorischen Zytokine IL-2, IL-10 oder TGF-β kodierenden Gene zeigten, dass sich bei diesen Tieren intestinale Entzündungen entwickelten (GERMAN et al. 2003). Da diese Zytokine in der Hauptsache von T-Lymphozyten sezerniert werden, wurde aus diesen Ergebnissen eine Beteiligung von T-Lymphozyten, und zwar vor allem der CD4+ T-Zellen abgeleitet (GERMAN et al. 2003). In einer Reihe von immunhistochemischen und morphometrischen Studien an Hunden mit chronischen idiopathischen entzündlichen Enteropathien konnte eine Zunahme von T Zellen in der Lamina propria des Intestinaltraktes betroffener Tiere gezeigt werden (YAMASAKI et al. 1996; STONEHEWER et al. 1998; JERGENS et al. 1999; GERMAN et al. 2000b, 2001). Eine Charakterisierung der Subtypen von T-Zellen im Duodenum von neun Hunden mit IBD durch GERMAN et al. (2001) ergab zudem signifikant erhöhte Anzahlen von CD4+ T-Lymphozyten und αβ-TCR+-T-Zellen. Die Autoren machen allerdings keine Angaben zur Form der IBD bei den von ihnen untersuchten Tieren. Darüber hinaus zeigten mehrere Untersuchungen an Zellen der B-Zelllinie bei Hunden mit lymphoplasmazellulärer Enteritis oder Kolitis erhöhte Zellzahlen, vor allem für IgA- und IgGPlasmazellen mit einem Shift zu vermehrt IgG produzierenden Plasmazellen (MAYORAL et al. 1996; STONEHEWER et al. 1998; VIBE-PETERSEN 1991; YAMASAKI et al. 1996; JERGENS 1999; GERMAN et al. 2001). GERMAN et al. (2000b, 2001) untersuchten Makrophagen (L1+ Zellen) im Duodenum von Hunden mit LPE sowie in Kolonbioptaten von Boxern mit HUC mittels immunhistochemischen und morphometrischen Methoden. Beide Studien ergaben signifikant höhere Zahlen von L1+-Zellen bei diesen Hunden. Bisher wurde nur eine immunhistochemische und morphometrische Arbeit über die Leukozytenpopulation im Darm von Katzen mit Inflammatory Bowel Disease publiziert. 29 2 LITERATURÜBERSICHT WALY et al. (2004) untersuchten im Duodenum die Leukozytenzahl und –verteilung bei Katzen mit IBD im Vergleich zu gesunden SPF-Tieren. Die Autoren konnten keine Erhöhung von CD3+ T Zellen, Makrophagen oder IgA- und IgG-Plasmazellen feststellen. Allerdings ergab die Untersuchung einen signifikanten Anstieg von IgM-Plasmazellen in der Gruppe der IBD Katzen. Damit stehen die Ergebnisse von WALY et al. (2004) bei der Katze den Ergebnissen verschiedener Untersuchungen am Intestinaltrakt von Hunden entgegen (MAYORAL et al. 1996; JERGENS et al. 1999; GERMAN et al. 2000b). Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass Dysregulationen im enterischen Immunsystem und der Verlust der Toleranz gegenüber luminalen Antigenen als Schlüsselereignisse in der Pathogenese der Inflammatory Bowel Disease angenommen werden (LOCHER et al. 2001; PAVLICK et al. 2002; CAVE 2003). Diese Dysregulation ist beim Hund anscheinend durch eine erhöhte Anzahl von T-Lymphozyten, vermutlich CD4+ Zellen, und von IgA- und IgGproduzierenden Plasmazellen charakterisiert (MAYORAL et al. 1996; STONEHEWER et al. 1998; VIBE-PETERSEN 1991; YAMASAKI et al. 1996; JERGENS 1999; GERMAN et al. 2000b, 2001). Publizierte Untersuchungsergebnisse zur Immunzellpopulation in der intestinalen Mukosa von Katzen mit IBD sind bisher ausgesprochen spärlich. Mögliche Veränderungen der Anzahl, der topographischen Verteilung oder die Funktion von Immunzellen des intestinalen Schleimhautimmunsystems bei Katzen mit IBD im Vergleich zu gesunden Individuen sind bislang unzureichend oder gar nicht untersucht worden. 2.2.4.3 Zytokine, Mediatoren und Transkriptionsfaktoren Zytokine Neben zellulären Veränderungen sind auch veränderte Zytokinexpressionsmuster bei Katzen und Hunden mit IBD beschrieben worden (GERMAN et al. 2000c; NGUYEN et al. 2006). Aus Studien am menschlichen Gastrointestinaltrakt ist bekannt, dass die antikörpervermittelte Immunantwort schwerpunktmäßig auf einer Immunglobulin A Produktion beruht (GARSIDE u. MOWAT 2001). Dies wird durch die Induktion von TH3 und TH2 Zellen der Lamina propria sichergestellt. Vor allem TH3-Zellen induzieren durch ihre TGF-β Produktion den Isotypenwechsel zu Immunglobulin A (CAVE 2003). NGUYEN et al. (2006) untersuchten mit Hilfe quantitativer real-time PCR Transkriptionsgene verschiedener Zytokine bei Katzen mit histopathologisch nachgewiesenen Entzündungserscheinungen im Darm. Die Autoren 30 2 LITERATURÜBERSICHT berichten von signifikant mehr Transkriptionsgenen für verschiedene proinflammatorische Interleukine und Tumornekrosefaktoren. Aus der Veröffentlichung geht jedoch die bei den erkrankten Katzen vorliegende IBD-Form nicht hervor. Eine Untersuchung von GERMAN et al. (2000c) an Hunden mit lymphoplasmazellulärer Enteritis oder Kolitis zeigte ähnliche Ergebnisse. Besonders wichtig ist anscheinend die Aufregulation von IL-2, IL-6, IL-12, INF-γ und TNF-α (CAVE 2003). Im Rahmen lymphoplasmazellulärer Enteritiden oder Kolitiden kommt es anscheinend zu einer vermehrten Produktion von proinflammatorischen T-ZellZytokinen. Hierdurch könnte sich die Art der Immunantwort von einer vorwiegend humoralen, durch Immunglobulin A und TH2-Lymphozyten vermittelten, hin zu einer eher zellulären, durch TH1-Zellen dominierten Immunreaktion mit einem Shift zu vermehrter IgG Produktion verschieben (CAVE 2003). In Anbetracht der Tatsache, dass Immunglobulin G ein hohes Potential zur Auslösung der Komplementkaskade besitzt, könnte eine IgGantikörpervermittelte Reaktion ein möglicher Auslöser der Gewebsschädigung und perpetuierender Entzündungsreaktionen bei IBD sein (JANEWAY u. TRAVERS 2002; MAYORAL et al. 1996; CAVE 2003). Transkriptionsfaktor NF-κB Neben den Zytokinen selbst nimmt anscheinend auch der Transkriptionsfaktor NF-κB eine Rolle in der Pathogenese der IBD ein (CAVE 2003). Er reguliert die Transkription verschiedener proinflammatorischer Zytokine (IL-1, IL-6, IL-8, IL-12), der costimulierenden Moleküle antigenpräsentierender Zellen CD80/CD86, inflammatorischer Adhäsionsmoleküle (vascular adhesion molecule VCAM-1, E-Selektin und intercellular adhesion molecule ICAM-1) sowie die Transkription der induzierbaren NO-Synthase (iNOS) und der Cyclooxygenase-2 (HANADA u. YOSHIMURA 2002). Die Induktion dieser Faktoren führt zu einem Verlust der T-zellinduzierten Toleranz mit erhöhter Leukozyteneinwanderung, Apoptose des Epithels und erhöhter Permeabilität. Verschiedene pharmakologische Studien über IBD suchen daher Wege, den Transkriptionsfaktor dieser Moleküle, NF-κB, zu inhibieren (DIJKSTRA et al. 2002). iNOS und NO Die induzierbare NO-Synthase (iNOS) respektive das durch sie gebildete Stickoxid (NO) spielt in der Pathogenese der IBD anscheinend ebenfalls eine Rolle (CAVE 2003). Im 31 2 LITERATURÜBERSICHT Rahmen entzündlicher Reaktionen wird iNOS in den meisten aktivierten Leukozyten und Epithelzellen induziert (GRISHAM et al. 2002). NO ist ein wichtiger Faktor der intestinalen Homöostase. Es fängt freie Radikale ab und fördert so die epitheliale Integrität. In hohen Konzentrationen kann NO jedoch anscheinend auch entzündliche Reaktionen verstärken. In großen Mengen führt Stickoxid zu Apoptosen des Epithels mit Integritätsverlust und Bakterientranslokation, Induktion oder Inhibition inflammatorischer Zytokine sowie zu irreversibler Nitrolysierung und Dysfunktion verschiedener körpereigener Proteine (GUANAWARDANA et al. 1997; PAVLICK et al. 2002; CAVE 2003). Studien bei Hunden mit IBD zeigten die Expression von iNOS in intestinalen Gewebeproben sowie eine signifikant höhere NO-Konzentration in der Kolonlavage von Hunden mit lymphoplamazellulärer Form der IBD (GUNAWARDANA et al. 1997; JERGENS et al. 1998a). 2.2.5 Klinische Befunde und Differentialdiagnosen bei IBD 2.2.5.1 Defizitäre Erscheinungen Folge der Entzündungsreaktion ist eine Störung der Nahrungsabsorption. Durch geringere Absorption, intestinalen Proteinverlust, kalorische Insuffizienz und erhöhten Katabolismus kommt es bei Katzen und Hunden mit IBD zu Hypoalbuminämie, Panhypoproteinämie, Muskelabbau und Gewichtsverlust (JACOBS et al. 1990; DENNIS et al. 1992, 1993; JERGENS et al. 1992; HART et al. 1994; MÜNSTER 1995; BAEZ et al. 1999; MÜNSTER et al. 2006). Die Hydoroxylierung und Metabolitbildung der unabsorbierten Fettsäuren durch Bakterien führt zur Epithelschädigung und erhöhter Sekretion im Kolon und zu sekretorischer Diarrhoe (RAMAKRISHNA et al. 1994). Anämie tritt in Folge eines Blutverlustes über den Darm oder einer verminderten Synthese auf (CAVE 2003). RISTIC u. STIDWORTHY (2002) berichten von hochgradigem Eisenmangel bei zwei Hunden mit IBD. Bei Katzen wurde in Zusammenhang mit IBD und anderen gastrointestinalen Erkrankungen ein Kobalaminmangel (Vitamin B12) nachgewiesen (SIMPSON et al. 2001). Eisen- und/oder Kobalaminmangel können zu einer Suppression der Hämatopoese führen. Darüber hinaus führt ein Kobalaminmangel möglicherweise zu einer Verzögerung der Mukosaheilung (CAVE 2003). 32 2 LITERATURÜBERSICHT Neben Eisen- und Kobalaminmangel zählen offensichtlich Vitamindefizienzen (vor allem fettlöslicher Vitamine) zu den möglichen Folgen von IBD (CAVE 2003). So kommen bei Katzen mit IBD Koagulopathien infolge einer Hypovitaminose K vor (CENTER et al. 2000; TAMS 2003). Darüber hinaus weisen Patienten mit Morbus Crohn oder ulzerativer Kolitis häufig einen Mangel der Vitamine A, E, und B6, Thiamin (Vitamin B1) sowie von Riboflavin und Zink auf. Solche Defizienzen können zu einem oxidativen Gewebsschaden, erhöhter intestinaler Permeabilität, persistierender Entzündung und Anämie beitragen. Darüber hinaus konnten STURNIOLO et al. (2001) im Rahmen von Resorptionsstudien mit Lactulose und Mannitol an Patienten mit Morbus Crohn eine Verbesserung der intestinalen Impermeabilität durch tägliche Zink-Supplementierung zeigen. Das Auftreten ähnlicher Defizienzen in Zusammenhang mit IBD bei Katzen ist wahrscheinlich und sollte bei der Therapie berücksichtigt werden (CAVE 2003). 2.2.5.2 Extraintestinale Erkrankungen IBD ist bei der Katze häufig mit Cholangitis und/oder Cholangiohepatitis und/oder Pankreatitiden assoziiert. Dies hat zu dem Terminus „Tri-itis“ oder auch „Triaditis“ geführt, welcher das gemeinsame Auftreten von IBD, Cholangiohepatitis und Pankreatitis beschreibt. Ein ursächlicher Zusammenhang konnte bisher jedoch nicht gezeigt werden (WEISS et al. 1996; WILLARD 1999; SWIFT et al. 2000; RÜST et al. 2005). Die Pathogenese der so genannten Triaditis ist bislang unklar. Einige Untersucher vermuten, dass sich eine Cholangiohepatitis durch in das Gallengangsystem aufsteigende Infektionen entwickelt. Bei der Katze münden der Ductus pancreaticus und der Ductus choledochus gemeinsam auf der Papilla duodeni major in den Anfangsteil des Duodenums. Die Pankreatitis könnte daher Folge einer aufsteigenden Entzündung oder des Verschlusses des gemeinsamen Ausführungsganges mit aufsteigender Infektion und/oder Reflux von Pankreassekret sein (WEISS et al. 1996; MANSFIELD u. JONES 2001a). Daher wird bei Katzen mit Cholangiohepatitiden die Abklärung des möglichen Vorliegens von IBD zur Entwicklung einer Therapiestrategie empfohlen (WEISS et al. 1996; CAVE 2003). 33 2 LITERATURÜBERSICHT 2.2.5.3 Klinische Befunde Erbrechen und Diarrhoe sind die häufigsten klinischen Symptome von IBD bei der Katze (DENNIS et al. 1992; MÜNSTER 1995; LECOINDRE u. CHEVALLIER 1997; WILLARD 1999). Daneben treten Gewichtsverlust, erhöhte Kotabsatzfrequenz, Appetitlosigkeit, Lethargie, Flatulenz, Borborygmus, abdominaler Schmerz, Aszites, Tenesmus und/oder mukoider Stuhl auf (GHERMAI 1989; DENNIS et al. 1992, 1993; GUILFORD 1996b; LECOINDRE u. CHEVALLIER 1997). Hämatochezie kommt vor allem in Zusammenhang mit entzündlichen Dickdarmveränderungen vor (DENNIS et al. 1993; MÜNSTER 1995; WILLARD 1999). Die Symptome bestehen über Wochen, Monate oder sogar Jahre und können intermittierend, zyklisch, persistierend oder kontinuierlich progredient auftreten (TAMS 1986a, 1987, 1993, 2003; GUILFORD 1996b; WILLARD 1999; JERGENS 2002; MENESES et al. 2003). Die Ergebnisse der klinischen Untersuchung sind oft unspezifisch. Blutbild und klinische Chemie können eine geringgradige, nicht regenerative Anämie (durch Malabsorption und/oder gastrointestinale Blutungen), Leukozytose, Hypoproteinämie oder geringgradige Hyperproteinämie (durch Hyperglobulinämie), Hypocholesterinämie und Hypokobalaminämie (durch verminderte Absorption), Hypokaliämie (durch Vomitus und Diarrhoe), Azotämie sowie erhöhte Leberenzymwerte (ALT, AP) aufweisen (GHERMAI 1989; MÜNSTER 1995; LECOINDRE u. CHEVALLIER 1997; WILLARD 1999; TAMS 2003). JERGENS et al. (2003) fanden bei Hunden mit IBD eine hohe Korrelation zwischen dem Wert des C-reaktiven Proteins (CRP) im Serum und dem klinischen Grad der IBD. Im Rahmen palpatorischer, röntgenologischer oder sonographischer Untersuchungen sind im Einzelfall verdickte Darmwände oder mit Luft oder Flüssigkeit gefüllte Darmschlingen darstellbar (GHERMAI 1989; JERGENS et al. 1992; MÜNSTER 1995; BAEZ et al. 1999; MENESES et al. 2003). Zur klinischen Beurteilung des Krankheitsschweregrades und der Ergebnisse therapeutischer Maßnahmen wurde für den Hund der so genannte kanine IBD Aktivitätsindex (CIBDA) entwickelt. Dieser Index bewertet klinische Parameter wie Allgemeinbefinden, Appetit, Vomitus, Kotkonsistenz, Frequenz des Kotabsatzes und Gewichtsverlust (MÜNSTER 1995; JERGENS et al. 2003). Für die Katze ist ein solcher Index bisher nicht publiziert worden. 34 2 LITERATURÜBERSICHT 2.2.5.4 Differentialdiagnosen Die Inflammatory Bowel Disease ist definitionsgemäß eine idiopathische Erkrankung, die über eine Auschlussdiagnostik festgestellt wird (GUILFORD 1996b; GUILFORD et al. 2001; JERGENS 2002; MENESES et al. 2003; MÜNSTER et al. 2006). Die beiden wichtigsten Differentialdiagnosen sind Futtermittelhypersensibilität oder –allergie sowie das diffuse intestinale Lymphom. Futtermittelunverträglichkeiten und -allergien müssen durch Eliminationsdiäten ausgeschlossen werden (TAMS 1993; GUILFORD et al. 2001; JERGENS 2002, 2003). Darüber hinaus sind durch histopathologische Untersuchungen von Bioptaten verdächtiger Bereiche des Darmes diffuse intestinale Lymphome auszuschließen. Maligne Lymphome gehören zu den häufigsten neoplastischen Erkrankungen der Katze, und der Intestinaltrakt ist das am meisten betroffene Organ. Insofern ist eine histopathologische Untersuchung für die Entscheidung, ob es sich um ein entzündliches oder neoplastisches Infiltrat handelt, unabdingbar. Auch andere Neoplasien, vor allem Adenokarzinome, können im Gastrointestinaltrakt vorkommen und sind demnach differentialdiagnostisch zu berücksichtigen (BARLOUGH et al. 1981; TAMS 1993; JERGENS 2002; CARRERAS et al. 2003; TAMS 2003; WALY et al. 2005). Um Erkrankungen wie Hyperthyreoidismus, Diabetes mellitus und Nierenversagen als Krankheitsursache auszuschließen, sollten ein komplettes Blutbild, ein biochemisches Profil inklusive der Bestimmung des T4 Wertes, Tests auf FeLV, FIV und FIP sowie eine Urinanalyse eingeleitet werden. Vor allem bei älteren Katzen ist Hyperthyreoidismus differentialdiagnostisch zu berücksichtigen (TAMS 1986a, 1993, 2003; NOLTE 1997). So beschreibt TAMS (1986a, 1993, 2003), dass Katzen mit Hyperthyreoidismus und Thyreotoxikose häufig entzündliche Infiltrate im Intestinaltrakt aufweisen, die, ebenso wie IBD, zu Vomitus und Diarrhoe führen können. Kotuntersuchungen dienen dem Ausschluss parasitärer und bakterieller Infektionen. Differentialdiagnostisch kommen hier bei der Katze Enteritiden durch parasitäre Infektionen mit Giardia sp., Trichuris sp., Kyptosporidien oder Hackenwürmern sowie bakterielle Infektionen mit Campylobacter sp., Clostridium perfringens, E. coli, Proteus. sp., Salmonella sp., Yersinia sp. oder Enterotoxämien sowie Infektionen mit dem felinen Immundefizienz Virus (FIV), dem felinen Leukämie Virus (FeLV) oder dem felinen infektiösen Peritonitis 35 2 LITERATURÜBERSICHT Virus (FIP) in Frage (LEIB et al. 1986; DENNIS et al. 1992, 1993; GUILFORD 1996b; WILLARD 1999; TAMS 2003). Des Weiteren müssen chronische Pankreatitiden und exokrine Pankreasinsuffizienzen differentialdiagnostisch berücksichtigt werden. Der Ausschluss sollte jedoch nicht allein anhand des TLI-Wertes (Trypsin-like Immunoreactivity) erfolgen. Nach MANSFIELD u. JONES (2001b) deuten Werte von TLI < 8 µg/l auf Pankreasinsuffizienzen hin. Andere Untersucher konnten indes anhand der TLI Bestimmung keine zuverlässige Differenzierung zwischen IBD und chronischer Pankreatitis zeigen (MENESES et al. 2003). 2.2.6 Management und Therapie Da die Ätiologie von IBD bei Katze und Hund noch immer unbekannt ist, ist eine ursächliche Therapie nicht möglich. Das Management basiert auf diätetischen Maßnahmen und dem Einsatz immunmodulatorischer Pharmaka zur Reduktion entzündlicher Reaktionen (GHERMAI 1989; MÜNSTER 1995; WILLARD 1999; JERGENS 2003; MÜNSTER et al. 2006) 2.2.6.1 Diätetische Maßnahmen Da IBD Patienten häufig unter Gewichtsverlust und Anorexie leiden, ist eine hochverdauliche hypoallergene Diät angezeigt. Diese verbessert den Ernährungsstatus des Patienten, vermeidet Stillstände des Ingestastromes und reduziert die Menge unverdauter Nahrung, die ihrerseits zu osmotischer Diarrhoe, bakterieller Überwucherung und antigener Stimulation führen kann (GHERMAI 1989; JERGENS et al. 1992; DENNIS et al. 1992, 1993; GUILFORD 1996b; NOLTE 1997; JERGENS 2002). Einige Untersucher vermuten, dass durch die gesteigerte Permeabilität des Epithels unter anderem Nahrungsantigene in die Lamina propria vordringen und so zu Futtermittelsensibilität und –allergie führen können (GUILFORD 1996b; CAVE 2003). Andere Autoren gehen davon aus, dass Nahrungsmittelintoleranzen und -allergien Auslöser von IBD sein können (MÜNSTER 1995; GUILFORD 1996b). Um primäre oder sekundäre entzündliche Reaktionen auf Nahrungsmittelantigene auszuschließen, sollte daher eine unbekannte Proteinquelle gefüttert werden (TAMS 1993; GUILFORD 1996b; JERGENS 2002; TAMS 2003). GUILFORD (1996b) empfiehlt darüber hinaus einen Wechsel der Proteinquelle nach zwei Wochen, da dem Autor zufolge während der Frühphase der Therapie durch die bestehende Entzündung und damit einhergehende Defekte der mukosalen Integrität 36 2 LITERATURÜBERSICHT Nahrungsmittelallergien entstehen könnten. Besonders bei Beteiligungen des Dickdarmes am Entzündungsgeschehen empfiehlt sich die Fütterung einer zusätzlichen ballaststoffreichen Diät. Diese wirkt sich positiv auf die Kolonmotilität und die Kotformung aus, bindet Allergene und fördert die Bildung kurzkettiger Fettsäuren wie Butyrat, welches seinerseits die Darmfunktion günstig beeinflusst (DENNIS et al. 1993; TAMS 1993; GUILFORD 1996b; WILLARD 1999; JERGENS 2002). Die oben erwähnten Hypovitaminosen und Zinkdefizienzen sollten ebenfalls therapeutisch berücksichtigt werden (CAVE 2003). Darüber hinaus können verstärkt Omega-3 Fettsäuren supplementiert werden. Diese hemmen kompetitiv die Synthese von Prostaglandinen und Leukotrienen aus Arachidonsäure und senken so die Konzentration proinflammatorischer Fettsäuremetaboliten (GERMAN et al. 2003; TAMS 2003). Einige Tiere zeigen durch diätetische Maßnahmen deutliche Verbesserungen des klinischen Zustandes oder sogar vollständige Remissionen (GUILFORD et al. 2001). Indes sind vor allem bei der Katze häufig zusätzliche pharmakotherapeutische Maßnahmen angezeigt (NELSON et al. 1984; MÜNSTER 1995; JERGENS 2003). 2.2.6.2 Pharmakotherapeutische Maßnahmen Zu den pharmakotherapeutischen Maßnahmen bei IBD von Katzen und Hunden zählt vor allem die Gabe immunsuppressiver Pharmaka (GHERMAI 1989; JERGENS et al. 1992; JERGENS 1999, 2002, 2003). Unter den Immunsuppressiva sind kurzwirksame Glukokortikoide, wie Prednisolon, wegen ihrer guten Dosier- und Steuerbarkeit Mittel der Wahl. Neben ihrer antiinflammatorischen und immunsuppressiven Wirkung zeigen sie kurzfristig positive Effekte auf den Gastrointestinaltrakt, wie Appetitsteigerung und eine gesteigerte Natrium- und Wasserabsorption. Aufgrund zahlreicher Nebenwirkungen, wie iatrogenem Hyperadrenokortizismus, Polyurie, Polydipsie, Hepatopathien, Pankreatitiden u.a. sollten sie jedoch nicht über längere Zeiträume verabreicht werden. Ein neueres Pharmakon aus der Gruppe der Glukokortikoide stellt das Kortikosteroid Budesonide dar. Es weist nur eine geringe Bioverfügbarkeit auf und wird daher nur in geringen Mengen systemisch über den Intestinaltrakt aufgenommen. Gleichzeitig zeigt es jedoch eine hohe Rezeptorbindungsaffinität in der Mukosa. Durch diese Eigenschaften wirkt es bei oraler Verabreichung weitgehend lokal im Darm. Budesonide stellt somit eine Alternative zu Prednisolon, vor allem bei Kortikosteroid-Unverträglichkeiten oder bei Tieren mit Diabetes mellitus dar (TAMS 2003). 37 2 LITERATURÜBERSICHT Bei perisistierender oder rezidivierender IBD können, alternativ oder zusätzlich zu Kortikosteroiden, Metronidazol oder Zytostatika, wie Azathioprin, Chlorambucil oder Cyclosporin A angezeigt sein (TAMS 1986a, 2003; GHERMAI 1989; JERGENS et al. 1992; GUILFORD 1996b; GERMAN et al. 2003). Metronidazol inhibiert einerseits die zellvermittelte Immunität, andererseits wirkt es antibiotisch und antiprotozoisch und hat vor allem im gramnegativen Bereich ein breites Wirkungsspektrum (TAMS 1993, 2003; GUILFORD 1996b; JERGENS 2002). Azathioprin und Chlorambucil hemmen die Replikation von Zellen mit hoher Zellteilungsrate wie Immunoblasten und sind somit hochpotente Immunsuppressiva (TAMS 2003). Cyclosporin A inhibiert, durch Blockade des IL-2 Rezeptors auf T-Lymphozyten und durch die Hemmung der IL-2 Freisetzung, vor allem T-Helferzellen. Eine antibiotische Therapie mit Amoxicillin, Metronidazol, Enrofloxazin oder TrimetoprimSulfonamid-Kombinationen sollte bei Katzen mit IBD bei Verdacht auf bakterielle Beteiligung eingesetzt werden. Dazu gehören neben histologischen Hinweisen, wie vermehrt neutrophile Granulozyten oder Kryptabszesse, auch klinische Anzeichen wie eine geringe Beeinflussbarkeit des Verlaufs durch Kortikosteroide. Bei Hunden mit histiozytärer ulzerativer Kolitis wurde erfolgreich Enrofloxazin einzeln oder in Verbindung mit Metonidazol und/oder Amoxicillin eingesetzt (HOSTUTLER et al. 2004). Bei chronischen idiopathischen Kolitiden ist das schwer resorbierbare Sulfonamid Sulfasalazin das Mittel der Wahl (NELSON et al. 1984; GHERMAI 1989; JERGENS et al. 1992; DENNIS et al. 1992, 1993; TAMS 1993; MÜNSTER 1995; GUILFORD 1996b; WILLARD 1999). 38 3 Material und Methoden 3.1 Untersuchungsmaterial 3.1.1 Kontrolltiere Die transmuralen, aus verschiedenen Lokalisationen des Intestinaltraktes entnommenen Proben von 12 Kontrolltieren stammten aus einem, von den Arbeitsgruppen von Frau Prof. Dr. M. Hewicker-Trautwein (Institut für Pathologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover) und Prof. Dr. I. Nolte (Klinik für Kleintiere, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover), gemeinsam durchgeführten Forschungsprojekt. Die Tiere zeigten klinisch keinerlei Hinweise auf eine Erkrankung des Gastrointestinaltraktes. Sie wurden aus Gründen, die nicht im Zusammenhang mit einer Erkrankung des Magen-Darmtraktes standen, wegen infauster Prognose intra operationem euthanasiert. Bei allen Tieren erfolgte die Entnahme von Bioptaten im Rahmen einer Laparotomie unter Zuhilfenahme einer 4 mm Biopsiestanze. Dabei wurde je eine Probe aus dem Duodenum descendens, dem mittleren Teil des Jejunums, dem Ileum sowie dem Colon descendens entnommen. In der Gruppe der Kontrolltiere lagen von 11 Tieren Proben aus allen vier untersuchten Bereichen des Intestinaltraktes vor. Bei einem Tier (Tier K12; E 2835/05) fehlte die Probe des Ileums. Die Kenndaten der Kontrolltiere sind der Tabelle 3.1 zu entnehmen. Die histologischen Befunde werden im Folgenden in Kapitel 4 „Ergebnisse“ in Abschnitt 4.1.1. beschrieben. Angaben zu den klinischen Befunden und histopathologischen Diagnosen der Bioptate von den Kontrolltieren sind in den Tabellen 9.1, 9.2 und 9.3 im Anhang zusammenfassend dargestellt. 39 3 MATERIAL UND METHODEN Tabelle 3.1 Kenndaten der Kontrolltiere LFD.NR. E-NR. RASSE GESCHLECHT ALTER K1 5436/99 EKH mk 5 K2 526/00 Perser mk 3 K3 1909/00 EKH mk 9 K4 5016/00 Kartäuser mk 12 K5 1828/04 Perser mk 6 K6 2670/04 Kartäuser mk 6 K7 2840/04 EKH mk 8 K8 4697/04 EKH wk 11 K9 1735/05 EKH wk 10 K10 1903/05 EKH wk 4 K11 2833/05 EKH mk 8 K12 2835/05 EKH mk 6 Alter: in Jahren; E-Nr.: Einsendungsnummer des Institutes für Pathologie; EKH: Europäisch Kurzhaar; Lfd.Nr.: laufende Nummer; mk: männlich kastriert; wk: weiblich kastriert 3.1.2 Katzen mit chronischer idiopathischer lymphoplasmazellulärer Enterokolitis (IBD-Tiere) In einem Zeitraum zwischen 1998 und 2002 wurden transmurale Bioptate des Intestinums von Katzen mit chronischer Magen-Darm-Symptomatik analog zu der Vorgehensweise bei den Kontrolltieren gewonnen. Klinische Symptome wie gestörtes Allgemeinbefinden, Vomitus, Diarrhoe, Inappetenz, Gewichtsverlust, Anorexie, abdominale Schmerzen, Hämatochezie, Tenesmus oder mukoider Kot bestanden persistierend oder rezidivierend über mehrere Wochen. Die histopathologische Untersuchung der Bioptate ergab bei allen betroffenen Tieren entzündliche Veränderungen im Sinne einer lymphoplasmazellulären Enteritis bzw. Enterokolitis. Dabei konnte weder im Rahmen der klinischen Untersuchungen noch durch die 40 3 MATERIAL UND METHODEN histopathologische Untersuchung eine Ursache ermittelt werden, so dass die Veränderungen dem Formenkreis der chronischen idiopathischen Darmentzündungen (engl. “Inflammatory Bowel Disease“ – IBD) zugerechnet wurden. Diese Katzen werden im Folgenden als IBDTiere bezeichnet. In der Gruppe der Katzen mit IBD standen von allen Tieren Gewebeproben aus Duodenum und Jejunum zur Verfügung, wobei die Bioptate des Duodenums von zwei Tieren (Tiere: IBD3 und IBD9) nur aus Mukosa bestanden; bei den übrigen Bioptaten handelte es sich um transmurale Proben. Bioptate des Ileums wurden von 4 Tieren mit IBD entnommen. Des Weiteren waren, mit Ausnahme eines Falles (Tier IBD1), von allen Tieren Proben aus dem Kolon vorhanden. Neben den Bioptaten aus dem Gastrointestinaltrakt standen in einigen Fällen zusätzlich Proben aus Leber, Pankreas, Lymphknoten und anderen Organen zur Verfügung. 3 der 9 erkrankten Tiere wiesen zusätzliche histologische Veränderungen im Sinne einer chronischen Pankreatitis und periportalen Hepatitis auf. Die Kenndaten der IBD-Tiere sind der Tabelle 3.2 zu entnehmen. Die histopathologischen Befunde der IBD-Tiere werden im Folgenden in Kapitel 4 „Ergebnisse“ im Abschnitt 4.1.2.2 und 4.1.2.3 beschrieben. Angaben zu den klinischen und histopathologischen Befunden sind in den Tabellen 9.4, 9.5, 9.6 und 9.7 im Anhang zusammenfassend dargestellt. 41 3 MATERIAL UND METHODEN Tabelle 3.2: Kenndaten der Katzen mit lymphoplasmazellulärer Enterokolitis (IBD) LFD.NR. E-NR. RASSE GESCHLECHT ALTER IBD1 3027/98 EKH mk 2 IBD 2 4059/99 EKH mk 12 IBD 3 626/00 EKH wk 12 IBD 4 3493/00 NW wk 8 IBD 5 3638/00 EKH n.b. n.b. IBD 6 4394/01 EKH wk 6 IBD 7 5509/01 EKH wk 12 IBD 8 1490/02 EKH wk 11 IBD 9 1598/02 EKH mk 5 Alter: in Jahren; E-Nr.: Einsendungsnummer des Institutes für Pathologie; EKH: Europäisch Kurzhaar; Lfd.Nr.: laufende Nummer; mk: männlich kastriert; wk: weiblich kastriert; n.b.: nicht bekannt 3.2 Präparation der Gewebeproben für die Histopathologie und Immunhistochemie Die Gewebeproben wurden nach einer Fixationszeit von etwa 24 bis 48 Stunden in 10%igem gepuffertem Formalin unter Verwendung eines Gewebeeinbettungsautomaten (Tissue-Tek III, Fa. Shandon, Pittsburgh, PA, USA) in Paraplast Plus® (Fa. Shandon, Pittsburgh, PA, USA) eingebettet. Von den so hergestellten Gewebeblöcken wurden mit Hilfe eines Schlittenmikrotoms (Fa. Microm, Heidelberg) 2-3 µm dicke Gewebeschnitte angefertigt, in einem Paraffin-Streckbad (TFB 45, Fa. Medite Medizintechnik, Burgdorf) bei 40°C gestreckt und für die histopathologische Untersuchung auf Objektträger (Fa. Knittel, Braunschweig) sowie für immunhistologische Untersuchungen auf Superfrost Plus® Objektträger (Fa. Menzel, Wiesbaden) aufgezogen. Im Anschluss erfolgte die Trocknung der Gewebeschnitte für 2 Stunden bei 65°C im Wärmeschrank (B 5042, Fa. Heraeus, Hanau). Die Archivierung der Gewebeblöcke sowie der Gewebeschnitte wurde bei Raumtemperatur im Dunkeln vorgenommen. 42 3 MATERIAL UND METHODEN 3.3 Physikochemische Färbungen Je ein Gewebeschnitt pro Lokalisation wurde nach einem standardisierten Laborprotokoll mit Hämatoxylin und Eosin (HE) gefärbt und anschließend einer histopathologischen Beurteilung unterzogen. 3.3.1 Histologische Beurteilungskriterien Die histopathologische Untersuchung der Bioptate aus dem Duodenum, Jejunum, Ileum und Kolon erfolgte an Hämatoxylin und Eosin (HE) gefärbten Gewebeschnitten anhand eines histologischen Beurteilungs- und Graduierungsschemas. Im Rahmen dieser Studie wurde dieses Schema, in Anlehnung an die von ROTTER (2005), BILZER (2006) und MÜNSTER et al. (2006) für den Hund publizierten Kriterien, in Zusammenarbeit mit Frau Prof. M. Hewicker-Trautwein und der Tierärztin Jasmine Harder aus der Arbeitsgruppe für Immunpathologie des Institutes für Pathologie, für die histomorphologischen Gegebenheiten am felinen Intestinaltrakt modifiziert. Bewertet wurden neben der zellulären Infiltration der Mukosa und der Tela submucosa auch Texturveränderungen des Gewebes wie Veränderungen des Epithels, Morphologie der Zotten und Krypten sowie Abweichungen der Gewebemorphologie innerhalb der Lamina propria. Der Aufbau des Bewertungsbogens war für die verschiedenen Darmabschnitte ähnlich, wobei die jeweiligen anatomischen Besonderheiten Berücksichtigung fanden (siehe Abbildungen 3.1 und 3.2). Die histologische Beurteilung wurde an einem Mikroskop des Typs Labolux (Fa. Leitz, Oberkochen) vorgenommen. Entzündliche Veränderungen wurden als geringgradig klassifiziert, wenn geringgradige Infiltrate von Entzündungszellen sowie geringgradige Veränderungen der Mikroarchitektur auftraten. Hochgradige entzündliche Veränderungen wurden bei deutlich erhöhten Zellinfiltraten in Zusammenhang mit erheblichen Texturstörungen festgestellt. Mittelgradige Fälle zeigten hinsichtlich der Entzündungszellinfiltration und den Matrixveränderungen intermediäre Veränderungen. An Hand des Gesamtbildes wurden die histopathologischen Veränderungen in gering-, mittel oder hochgradig eingeteilt. Eine Darstellung des verwendeten Beurteilungs- und Graduierungsschemas sowie die Interpretationskriterien zur Einteilung des Schweregrades der Veränderungen sind in den Abbildungen 3.1, 3.2 und 3.3 dargestellt. 43 3 MATERIAL UND METHODEN Abbildung 3.1: Histologisches Beurteilungs- und Graduierungsschema für den Dünndarm DÜNNDARM VERÄNDERUNGEN ☼ NORMALBEFUNDE ARICHITEKTURVERÄNDERUNGEN SCHLEIMHAUTOBERFLÄCHE eben o Erosion o ZOTTEN schlank / gestreckt o Atrophie KYPTEN regulär, ohne Architekturstörungen o Hyperplasie Ulzeration o o Fusion o o Kryptdilatation Kryptabszess o o Krytverlust o DETAILVERÄNDERUNGEN DER EINZELNEN SCHICHTEN LYMPHGEFÄßE unauffällige Lymphgefäße o Lymphangiektasie in der Lamina propria o Lymphangiektasie in der Tela submucosa o Zelldegeneration o Lymphangiektasie o in der Tunica muscularis EPITHEL → ZOTTENEPITHEL → IEL → KRYPTEPITHEL LAMINA PROPRIA → ZELLDICHTE* → ZELLARTEN intakt, hochprismatisch, Nukleus basal und längsoval Abflachung o (isoprismatisch bis flach, o Nukleus abgerundet) Je nach Darmsegment und Lokalisation in der Mukosa o bis zu 80 IELs pro 100 Enterozyten ‡ intakt, hochprismatisch, Nukleus basal und längsoval vermehrt o Hypertrophie (große Zellen mit hellem, Abflachung o großem Kern und großen o (isoprismatisch bis flach, o Zelldegeneration Nukleoli) Nukleus abgerundet) vermehrte Mitosen Krypten aus einander gedrängt durch: schmal, Krypten dicht beieinander o Ödem sowie dicht an der Lamina muscularis Duodenum: mäßig (häufig Zellkonzetration an erhöht superficial Zottenbasis) o erhöht basal Jejunum: gering Ileum: gering Lymphozyten, Plasmazellen, ggr.: > 20%* eosinophile Granulozyten; Lymphozyten, insgesamt ≤ 20%* in drei o Plasmazellen, eosinophile Gesichtsfeldern bei 40x Granulozyten; Objektiv (* im Duodenum (* im Duodenum > 30%) ≤ 30%) Plasmazellen Lymphozyten o o Infiltration o Fibrose o o o erhöht diskontinuierlich o erhöht transmucosal o hgr.: > 40%* mgr.: > 30%* Lymphozyten, Lymphozyten, Plasmazellen, eosinophile Plasmazellen, eosinophile o o o Granulozyten; Granulozyten, vereinzelte neutrophile zahlreiche neutrophile Granulozyten; Granulozyten; (* im Duodenum > 40%) (* im Duodenum > 50%) o eosinophile Granulozyten o neutrophile Granulozyten o → LGL einige Lymphozyten und Plasmazellen, lockeres TELA SUBMUCOSA Bindegewebe teilweise mit Adipozyten vereinzelte Neurone → AUTONOME GANGLIEN mit umgebenden PLEXUS SUBMUCOSUS Satellitenzellen TUNICA regulär, ohne MUSCULARIS Architekturstörungen vereinzelte Neurone → AUTONOME GANGLIEN mit umgebenden PLEXUS MYENTERICUS Satellitenzellen regulär, ohne TUNICA SEROSA Architekturstörungen o vermehrt Lymphozyten o vermehrt Plasmazellen o neutrophile Granulozyten o eosinophile Granulozyten o Infiltration der Ganglien bzw. deren Umgebung mit: (schriftliche Angabe von o Veränderungen) o Infiltration der Ganglien bzw. deren Umgebung mit: (schriftliche Angabe von o Veränderungen) o ☼: Grade der jeweiligen Veränderung werden schriftlich festgehalten und gegebenenfalls näher ausgeführt; IEL ‡: intraepitheliale Lymphozyten: Zottenepithel bis ca. 50 IELs/ 100 Enterozyten im Duodenum, bis ca. 80 IELs im Jejunum und Ileum; Kryptepithel: 4-6 IELs /100 Enterozyten; *: für das Duodenum gelten bezüglich der Zelldichte und -arten besondere Bedingungen; o: Feld zum Ankreuzen vorliegender Befunde; bzw.: beziehungsweise; ggr.: geringgradig; hgr.: hochgradig; LGL: large granular lymphocytes; mgr.: mittelgradig; modifiziert nach ROTTER (2005), BILZER (2006) und MÜNSTER et al. (2006) 44 3 MATERIAL UND METHODEN Abbildung 3.2: Histologisches Beurteilungs- und Graduierungsschema für das Kolon KOLON VERÄNDERUNGEN ☼ NORMALBEFUNDE ARCHITEKTURVERÄNDERUNGEN SCHLEIMHAUTOBERFLÄCHE KRYPTEN eben o Erosion o Ulzeration o gerade, parallel o Hyperplasie o Kryptdilatation Kryptabszess o o Krytverlust o Lymphangiektasie in der Tunica muscularis o Zelldegeneration o Fibrose o Aggregate, Granulome o hgr.: >40% Lymphozyten, Plasmazellen, eosinophile Granulozyten, zahlreiche neutrophile Granulozyten o neutrophile Granulozyten o neutrophile Granulozyten eosinophile Granulozyten o o DETAILVERÄNDERUNGEN DER EINZELNEN SCHICHTEN LYMPHGEFÄSSE EPITHEL → IEL → MITOSEN LAMINA PROPRIA → ZELLDICHTE → ZELLARTEN unauffällige Lymphgefäße o Lymphangiektasie in der Lamina propria o Lymphangiektasie in der Tela o submucosa intakt, hochprismatisch, Abflachung (isoprismatisch längsovaler Nukleus basal, o o Verlust von Becherzellen o bis flach, Nukleus abgerundet) diffus verteilte Becherzellen ca. 2 IELs pro 100 o vermehrt o Enterozyten basal vermehrt, auch im basal, 2-3 pro Krypte o o superficialen Drittel Krypten aus einander gedrängt durch: schmal, Krypten dicht bei einander, sowie dicht an der o Ödem o Infiltration o Lamina muscularis erhöht superficial o erhöht, transmucosal o gering o erhöht basal o erhöht, diskontinuierlich o Lymphozyten, Plasmazellen, mgr.: > 30% Lymphozyten, ggr.: > 20% Lymphozyten, eosinophile Granulozyten; Plasmazellen, eosinophile o Plasmazellen, eosinophile o o insg. ≤ 20% in drei Granulozyten; vereinzelte Gesichtsfeldern bei 40x Granulozyten neutrophile Granulozyten Objektiv Plasmazellen o eosinophile Granulozyten o Lymphozyten o → LGL TELA SUBMUCOSA → AUTONOME GANGLIEN PLEXUS SUBMUCOSUS TUNICA MUSCULARIS → AUTONOME GANGLIEN PLEXUS MYENTERICUS TUNICA SEROSA einige Lymphozyten und Plasmazellen, lockeres Bindegewebe teilweise mit Adipozyten o vermehrt Lymphozyten o vermehrt Plasmazellen o Infiltration der Ganglien bzw. deren Umgebung mit: (schriftliche Angabe von Veränderungen) vereinzelte Neurone mit o umgebenden Satellitenzellen regulär, ohne Architekturstörungen o Infiltration der Ganglien bzw. deren Umgebung mit: (schriftliche Angabe von Veränderungen) vereinzelte Neurone mit o umgebenden Satellitenzellen regulär, ohne Architekturstörungen o ☼: Grade der jeweiligen Veränderung werden schriftlich festgehalten und gegebenenfalls näher ausgeführt; o: Feld zu ankreuzen vorliegender Befunde; bzw.: beziehungsweise; ggr. geringgradig; hgr.: hochgradig; IEL: intraepitheliale Lymphozyten; insg.: insgesamt; LGL: large granular lymphocytes; mgr.: mittelgradig modifiziert nach ROTTER (2005), BILZER (2006) und MÜNSTER et al. (2006) 45 3 MATERIAL UND METHODEN Abbildung 3.3: Graduierungskriterien für entzündliche Veränderungen im Intestinaltrakt von Katzen GRAD DER ENTZÜNDLICHEN VERÄNDERUNG GERINGGRADIG MITTELGRADIG HOCHGRADIG - - multifokal/diffus mgr. Zellinfiltrat in der Lamina propria (vgl. Abb. 3.1 und 3.2) - multifokal/diffus hgr. erhöhtes Zellinfiltrat in der Lamina propria (vgl. Abb. 3.1 und 3.2) - vermehrt Lymphozyten und Plasmazellen in der Tela submucosa - vermehrt Lymphozyten und Plasmazellen in der Tela submucosa - neutrophile/eosinophile Granulozyten in der Tela submucosa multifokal/diffus ggr. erhöhtes Zellinfiltrat in der Lamina propria (vgl. Abb. 3.1 und 3.2) - fokal ggr. Krypthyperplasie/dilatation - (multi-) fokal mgr. Krypthyperplasie/-dilatation - (multi-) fokal mgr. bis hgr. Krypthyperplasie/-dilatation - - (multi-) fokal mgr. Abflachungen des Zotten-/ Kryptepithels - (multi-) fokal mgr. bis hgr. Abflachungen des Zotten-/ Kryptepithels - vermehrt IELs (vgl. Abb. 3.1 und 3.2) - vermehrt IELs (vgl. Abb. 3.1 und 3.2) - Kryptabszesse - Epithelzelldegeneration im Zottenoder Kryptepithel - mgr. bis hgr. Zottenatrophie - Kryptverluste - (multi-) fokal mgr. bis hgr. Erosionen - Ulzerationen fokal ggr. Abflachungen des Zotten-/ Kryptepithels - - ggr. Zottenatrophie fokal ggr. Erosionen - Becherzellverluste * - Becherzellverluste * - ggr. bis mgr. Lymphangiektasie (vgl. Abb. 3.1 und 3.2) - mgr. Lymphangiektasie in mehreren Lokalisationen (vgl. Abb. 3.1 und 3.2) - mgr. bis hgr. Lymphangiektasie in mehreren Lokalisationen (vgl. Abb. 3.1 und 3.2) - fokale/ggr. Ödematisierung der Lamina propria - multifokale/diffuse mgr. Ödematisierung der Lamina propria - multifokale/diffuse mgr. bis hgr. Ödematisierung und/oder - fokal ggr. Fibrose der Lamina propria und/oder - multifokal/diffus mgr. bis hgr. Fibrose der Lamina propria/ Tela submucosa Abb.: Abbildung; ggr.: geringgradig; mgr.: mittelgradig; hgr.: hochgradig; IEL: intraepitheliale Lymphozyten; vgl.: vergleiche; *: Parameter für die Beurteilung des Kolons modifiziert nach ROTTER (2005), BILZER (2006) und MÜNSTER et al. (2006) 46 3 MATERIAL UND METHODEN 3.4 Immunhistochemie Mittels immunhistochemischer Färbungen wurden die Anzahl und die Verteilung von CD3+ T-Lymphozyten, Plasmazellen (IgA-, IgG- und IgM-Plasmazellen) und Makrophagen in Paraffinschnitten aus dem Intestinaltrakt von Katzen mit IBD im Vergleich zu den gesunden Kontrolltieren untersucht. Für die Untersuchung wurden Antikörper gegen den CD3-Komplex von T-Zellen, gegen die Immunglobuline A, G und M sowie gegen das L1-Antigen von Makrophagen auf die Gewebeschnitte aufgetragen. Die phänotypische Darstellung der Immunzellen erfolgte mittels der Streptavidin-Biotin-Komplex (ABC)-Methode. 3.4.1 Antikörper, Seren, Chromogen und Kontrollen 3.4.1.1 Primäre Antikörper Alle primären Antikörper wurden, soweit nicht anders angegeben, in Verdünnungen mit PBS verwendet, dem 1% BSA zugegeben wurde. Die Verdünnungen sind der Tabelle 3.3 zu entnehmen. Die Primärantikörper wurden bei +4°C aufbewahrt. Antikörper gegen den CD3 Komplex der T-Zellen Der verwendete Antikörper richtet sich gegen den CD3-Komplex von T-Zellen, welcher in der Transmembranregion nicht kovalent an den T-Zell-Rezeptor gebunden ist. Er besteht aus mindestens vier verschiedenen Proteinen: CD3γ, CD3δ, CD3ε und CD3ζ . Diese besitzen eine extrazelluläre Domäne, eine Transmembrandomäne sowie eine zytoplasmatische Domäne. Die zytoplasmatischen Domänen tragen Sequenzen, die man als immunoreceptor tyrosinbased activation motives (ITAMs) bezeichnet. Nach einer Antigenerkennung durch den TZellrezeptor ermöglichen diese Sequenzen durch Assoziation mit zytosolischen Proteintyrosinkinasen eine Signaltransduktion ins Zellinnere. Es handelt sich um einen polyklonalen Pan-T-Zellmarker (CAMPANA et al. 1987). Dieser Antikörper wurde bereits in verschiedenen immunhistochemischen Studien an Gewebe von Katzen erfolgreich angewendet (DAY 1998; PEREZ et al. 1999; WALY et al. 2001, 2004). Der Antikörper ist unter der Bezeichnung Polyclonal Rabbit anti-Human CD3 (DakoCytomation GmbH, Hamburg) kommerziell erhältlich. 47 3 MATERIAL UND METHODEN Antikörper gegen das Immunglobulin A Zur Anwendung kam ein unter der Bezeichnung Cat IgA Antibody FITC conjugated kommerziell erhältlicher Antikörper mit spezifischer Bindungsaffinität zum Immunglobulin A von Katzen. Die Spezifität wurde mittels Immunelektrophorese sowie im ELISA nachgewiesen (Bethyl Laboratories, Inc., Frankfurt). Antikörper gegen das Immunglobulin G Verwendet wurde ein kommerziell erhältlicher, gegen das Fc-Fragment von Immunglobulin G von Katzen gerichteter Antikörper, dessen Spezifität mittels Immunelektrophorese und ELISA nachgewiesen wurde. Er ist unter der Bezeichnung Cat IgG-Fc Antibody FITC conjugated verfügbar (Bethyl Laboratories, Inc., Frankfurt). Antikörper gegen das Immunglobulin M Der verwendete Antikörper bindet spezifisch an Immunglobulin M von Katzen. Seine Spezifität wurde mittels Immunelektrophorese und ELISA nachgewiesen. Er ist unter der Bezeichnung Cat IgM Antibody FITC conjugated kommerziell erhältlich (Bethyl Laboratories, Inc., Frankfurt). Antikörper gegen das L1-Antigen (Synonym: Myeloid/Histiocyte Antigen) Der verwendete Klon MAC387 reagiert mit dem in menschlichen Granulozyten, Blutmonozyten und Gewebshistiozyten exprimierten zytoplasmatischen L1 Antigen (FLAVELL et al. 1987). In Studien am Intestinaltrakt von Katzen zeigten WALY et al. (2001, 2004), dass der Antikörper bei der Katze Zellen mit den morphologischen Charakteristika von Makrophagen und Monozyten darstellt. Die Spezifität wurde durch Western-Blotting nachgewiesen. Der Antikörper wurde auf dem Third International Workshop and Conference on Human Leucocyte Differentiation Antigens als Anti-Myeloid eingestuft. Er ist unter der Bezeichnung Monoclonal Mouse Anti-Human Myeloid/Histiocyte Antigen Clone MAC387 Isotyp IgG1, Kappa kommerziell erhältlich (DakoCytomation GmbH, Hamburg). 3.4.1.2 Kontrollseren Als negative Kontrolle für den aus dem Kaninchen stammenden Primärantikörper gegen den CD3-Komplex der T-Zellen diente inaktiviertes Serum gesunder Kaninchen, welches von der Klinik für Kleintiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt 48 3 MATERIAL UND METHODEN wurde. Für die aus der Ziege stammenden Antikörper gegen die Immunglobuline A, G und M diente inaktiviertes Ziegenserum welches von der Klinik für kleine Klauentiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt wurde. Die Serumgewinnung erfolgte nach Blutgerinnung durch Zentrifugation für 10 Minuten bei etwa 3000 U/min; die so gewonnenen Seren wurden portioniert bei -20°C gelagert. Als negative Kontrolle für den aus der Maus stammenden Antikörper gegen das L1 Antigen diente kommerziell erhältlicher Mäuseascites (Balb/C Mäuseascites, Fa. Biologo, Kronshagen), der bei 4°C aufbewahrt wurde. 3.4.1.3 Sekundärantikörper Als Sekundärantikörper für den polyklonalen Kaninchen anti-humane T-Zellen-Antikörper wurde ein biotinylierter Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper (gar-b, IgG (H+L), Fa. Vector Laboratories, CA, USA) eingesetzt. Da die Primärantikörper gegen die Immunglobuline A, G und M mit der Substanz Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) markiert waren, kam in diesen Fällen ein biotinylierter Ziege anti-FITC Antikörper zum Einsatz (ga-FITC-b, Fa. Vector Laboratories, CA, USA). Als sekundäres Antiserum gegen den monoklonalen Maus antihumanes Myeloid/Histiocyte Antigen diente ein biotinylierter Ziege anti-Maus Antikörper (gam-b IgG (H+L)) (siehe Tabelle 3.3) (Fa. Vector Laboratories, CA, USA). 3.4.1.4 Blockseren Um unspezifische Bindungen des Primärantikörpers an elektrostatisch geladene Proteine im Gewebe zu verhindern, wurde regelmäßig Ziegen-Normalserum (ZNS) eingesetzt. Zusätzlich wurde dem Verdünnungspuffer für die Primärantikörper 1% bovines Serumalbumin (BSA) (Firma Serva, Heidelberg) zugesetzt. Die Seren wurden nach der Blutgerinnung durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 3000 U/min gewonnen und bei -20°C portioniert gelagert. 3.4.1.5 Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (ABC-Komplex) Eingesetzt wurde ein kommerziell erhältlicher Avidin-Biotin-Komplex (Vectastain ® Elite ABC Kit, Fa. Vector Laboratories, CA, USA), der bei 4°C verwahrt wurde. 3.4.1.6 Chromogen Als Chromogen diente 3`3-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid (DAB) (Fa. Sigma-Aldrich, Taufkirchen). Das DAB wurde in Form von stock solution aliquots bei -25°C aufbewahrt. 49 3 MATERIAL UND METHODEN 3.4.1.7 Kontrollen Bei allen Untersuchungen wurde eine positive Kontrolle in Form eines makroskopisch und histologisch unveränderten Katzenlymphknotens aus dem Sektionsgut des Institutes für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover sowie eine negative Kontrolle mitgeführt. Als Negativkontrolle wurde beim Nachweis der Plasmazellen je ein Darmschnitt statt mit primärem Antikörper mit Ziegenserum inkubiert. Als negative Kontrolle für den CD3 Antikörper wurde Kaninchenserum eingesetzt. Die Spezifitätskontrolle des monoklonalen L1 Antiköpers erfolgte durch Inkubation des Paraffinschnittes mit Balb/cSerum (Biologo, Kronshagen). 3.4.2 Demaskierungsverfahren Citratpuffer (Demaskierungsverfahren für den Nachweis CD3 positiver Zellen) Die Schnitte wurden in einer hitzefesten Küvette stehend in 600 ml kalte Gebrauchslösung von Citratpuffer (Fa. Biocyc, Luckenwalde) verbracht und in einer Mikrowelle (Fa. Bauknecht, Stuttgart) bei 900 W zum Sieden gebracht. Sobald der Kochvorgang startete, wurde die Mikrowelle auf 750 W herunter reguliert. Die Präparate wurden zweimal für je 5 Minuten bei 750 W in der siedenden Citratpuffer-Lösung belassen (KAHVECI et al. 2003). Anschließend erfolgte die Abkühlung für 10 Minuten bei Zimmertemperatur. Demaskierungslösung G (Demaskierungsverfahren für den Nachweis des L1 Antigens) Die benötigte Menge Demaskierungslösung G (Fa. Biologo, Kronshagen) wurde in einer Verdünnung von 1:4 mit Aqua dest. angesetzt und im Wasserbad auf 95°C vorgewärmt. Die Schnitte verblieben für 20 Minuten bei 95°C in der Demaskierungslösung G. Pronase E (Demaskierungsverfahren für den Nachweis der Immunglobuline A, G und M) In 37°C warmem PBS wurden 0,1 g Pronase E (Fa. VWM TM International GmbH, Darmstadt), sowie 0,2g CaCl2×H2O2 gelöst und die Lösung mit 0,1 M NaOH auf pH 7,4 eingestellt. In der so hergestellten 0,05%igen Pronase E-Lösung wurden die Schnitte für 20 Minuten bei 37°C im Brutschrank belassen (BAHN 1988). 50 3 MATERIAL UND METHODEN 3.4.3 Immunhistochemische Untersuchungsmethode Die Darstellung der Immunzellen erfolgte mit Hilfe der Streptavidin-Biotin-Methode (ABCMethode). Bei dieser indirekten immunenzymatischen Färbemethode bindet zunächst ein unkonjugierter Primärantikörper an seine antigenen Determinanten im Gewebe. Anschließend wird ein biotinylierter Sekundärantikörper aufgetragen, der an das Fc-Fragment des Primärantikörpers bindet. Der Sekundärantikörper ist gegen Immunglobuline der Spezies gerichtet, aus welcher der Primärantikörper stammt. Im dritten Schritt wird ein Avidin-BiotinPeroxidase-Komplex aufgetragen. Dieser Komplex ist dergestalt, dass an drei von vier möglichen Bindungsstellen des Avidins enzymgekoppeltes Biotin gebunden ist. Die Biotinmoleküle des Komplexes sind mit dem Enzym Peroxidase gekoppelt, welches die Umsetzung eines Chromogens katalysiert. Auf diese Weise entsteht ein Avidin-BiotinPeroxidase-Komplex. Nach Auftragen des Komplexes auf die Gewebeschnitte wird die vierte Bindungsstelle durch das an den Sekundärantikörper gekoppelte Biotin besetzt, der AvidinBiotin-Peroxidase-Komplex bindet, vermittelt durch das Biotin, an den Sekundärantikörper. Schließlich erfolgt die Substrat-Chromogenreaktion. Hierbei bildet zunächst das Chromogen mit der Peroxidase einen Enzym-Substrat-Komplex, treibt als Elektronendonor die Katalyse von zugegebenem H2O2 an und bildet schließlich durch Oxidation eine unlösliche Farbverbindung. Die Ablagerung in unmittelbarer Nähe des Antigens ermöglicht schließlich dessen Visualisierung. Die hohe Affinität von Avidin zu Biotin macht diese Technik zu einer der derzeit sensitivsten. Da alle oben genannten Substanzen in wässrigen Lösungen gelöst sind, ist eine Entparaffinierung und Rehydratisierung der Schnitte notwendig. Hierzu werden die Schnitte zunächst 3 mal in frisches Roti®-Histol (Fa. Roth, Karlsruhe) verbracht und anschließend in einer absteigenden Alkoholreihe rehydratisiert (Isopropanol, 96%iges, sowie 70%iges Ethanol). Durch endogene Enzymaktivität kann es zu einer ungerichteten Umsetzung des Chromogens und zu einer, je nach Enzymgehalt des Gewebes, unterschiedlich starken Hintergrundfärbung kommen. Daher erfolgte eine Hemmung der endogenen Peroxidaseaktivität durch Verbringen der Schnitte in mit 0,5%igem H2O2 versetztes 85%iges Ethanol. Durch Formalinfixierung und Paraffineinbettung kann es zu mannigfachen Veränderungen der Gewebsstrukturen kommen. Die Gewebefixation mit Formalin wird durch Reaktion des Formalins mit basischen Aminosäuren unter Bildung von Hydroxymethylenbrücken ermöglicht. Dadurch wird die Permeabilität für Makromoleküle 51 3 MATERIAL UND METHODEN herabgesetzt und intrazytoplasmatische Proteine werden konserviert. Hierdurch können Veränderungen der Epitope selbst oder benachbarter Bereiche mit nachfolgender Antigenmaskierung auftreten. Um eine störungsfreie Bindung des Primärantikörpers an die antigenen Determinanten im Gewebe zu gewährleisten, ist eine Vorbehandlung des Gewebes notwendig, die ein Epitop-Retrieval sicherstellt. Durch eine antikörperspezifische enzymatische Demaskierung können verdeckte Determinanten wieder frei gelegt werden. Die verwendeten Demaskierungsverfahren sind der Tabelle 3.3 zu entnehmen. Neben der endogenen Enzymaktivität ist die unspezifische Bindung der eingesetzten Antikörper an Membranen oder Fettgewebe durch hydrophobe Wechselwirkung eine der wichtigsten Ursachen von Hintergrundfärbungen. Vor allem der Umstand, dass die Antikörper im Überschuss zugesetzt werden ist ein kritischer Punkt. Um derartige Wechselwirkungen zu vermeiden, wurden die Schnitte mit inaktivierten Normalsera aus den Tierspezies behandelt, aus denen der Sekundärantikörper stammte. Die Proteine des Normalserums dienen der Absättigung von elektrostatischen Ladungen und verhindern so unspezifische Bindungen an das Detektionssystem. Der im Anschluss eingesetzte Primärantikörper geht auf diese Weise ausschließlich spezifische Bindungen mit seinem Epitop ein. Der Zusatz von 1% BSA dient, ebenso wie die Behandlung mit Normalseren, einer Reduzierung unspezifischer Hintergrundfärbungen. Zur Sicherstellung der Spezifität des Primärantikörpers wurden als negative Kontrolle Normalsera aus derselben Tierart oder Ascites der Maus (Balb/c) eingesetzt. Hierdurch werden alle Eigenschaften des Primärantikörpers mit Ausnahme seiner Antigenspezifität imitiert. Die Inkubation des Primärantikörpers sowie der Kontrollsera erfolgte bei 4°C über Nacht. Nach der spezifischen Bindung des Primärantikörpers an seine Epitope im Gewebe erfolgte die Kopplung des Fc-Fragments an einen biotinylierten Sekundärantikörper. Das Biotin des Zweitantikörpers bindet an die vierte Bindungsstelle des nachfolgend zugegebenen Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplexes. Die Peroxidase katalysiert die Oxidation des Chromogens 3´3 Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid, dessen Reaktionsprodukt in unmittelbarer Umgebung des Epitops zu einem stabilen braunen Farbniederschlag ausfällt. Eine Gegenfärbung mit Hämalaun nach Mayer erlaubt die Sichtbarmachung der Zell- und Gewebsstrukturen. Die Schnitte wurden mit Roti-Histokit® (Fa. Roth, Karlsruhe) eingedeckt. 52 3 MATERIAL UND METHODEN 3.4.3.1 Protokoll der immunhistochemischen Untersuchungen Die Darstellung der Immunzellen erfolgte nach der von HSU et al. (1981) beschriebenen Avidin-Biotin-Komplex (ABC)-Methode. 1. Aufziehen der Schnitte auf Superfrost® plus Objektträger (Fa. Menzel, Braunschweig) und anschließende Trocknung der Schnitte bei 65°C im Wärmeschrank für mindestens 2 Stunden. 2. Entparaffinierung in Rotihistol® (Fa. Roth, Karlsruhe) dreimal für je 5 Minuten und nachfolgende Rehydratisierung in absteigender Alkoholreihe stehend in einer Glasküvette. Verbleib für 5 Minuten in Isopropanol, anschließend je 3 Minuten in 96%igem, 70%igem und 50%igem Ethanol. 3. Hemmung der endogenen Peroxidase durch Verbringen der Schnitte in 197 ml 85%igen Ethanols mit Zusatz von 3ml 30%igem H2O2. Verbleib unter Rühren für 30 Minuten. 4. Spülen der Schnitte, dreimal für je 5 Minuten in PBS unter langsamem Rühren. 5. Demaskierung der Epitope je nach verwendetem Primärantikörper. 6. Spülen der Schnitte, dreimal für je 5 Minuten in PBS unter langsamem Rühren. 7. Verbringen der Schnitte in Coverplates (Shandon Sequenza®, Firma Shandon, Pittsburgh, PA, USA) und Blockierung unspezifischer Bindungsstellen im Gewebe durch Inkubation der Schnitte mit inaktiviertem Ziegen-Normalserum bei Zimmertemperatur für 20 Minuten. Verdünnung 1:5 (im Falle des Nachweises von Immunglobulin M Verdünnung 1:10), Pipettiermenge 150 µl. 8. Kälteinkubation der Schnitte mit je 150µl Primärantikörper bzw. entsprechendem Kontrollserum verdünnt in PBS mit 1% BSA über Nacht im Kühlschrank bei 4°C (siehe Tabelle 3.3) 9. Entnahme der Schnitte aus dem Kühlschrank und Erwärmen bei Zimmertemperatur für mindestens 30 Minuten. 53 3 MATERIAL UND METHODEN 10. Spülen der Schnitte mit PBS unter Zugabe von 0,05% Tween, dreimalig. 11. Inkubation der Schnitte mit je 150 µl Sekundärantikörper (siehe Tabelle 3.3) bei Zimmertemperatur für 30 Minuten. 12. Spülen der Schnitte mit PBS unter Zugabe von 0,05% Tween, dreimalig, anschließend dreimaliges Spülen mit PBS. 13. Überschichten der Schnitte mit je 150µl ABC Komplex (Vectastain ® Elite ABC Kit, Fa. Vector Laboratories, CA, USA) und Inkubation für 30 Minuten bei Zimmertemperatur. Der Ansatz erfolgt mindestens 30 Minuten vor Gebrauch wie folgt: Vorlage von 1 ml PBS, Zugabe von 15 µl Reagenz A, anschließend gut schütteln. Zugabe von 15 µl Reagenz B, wiederum gut schütteln. 14. Spülen der Schnitte, dreimal für je 5 Minuten in PBS, anschließende Entnahme der Objektträger aus den Coverplates und Verbringen in eine Glasküvette mit PBS. 15. Verbringen der Schnitte in 200ml einer DAB-Lösung und Inkubation bei Raumtemperatur unter langsamem Rühren für 5 Minuten. Die DAB-Lösung wird vor Gebrauch wie folgt hergestellt. 100 mg 3´3 Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid (DAB) werden in 50 ml PBS aufgelöst und bei -25°C als stock solution aliquots gelagert. Vor der Anwendung Lösung bei Zimmertemperatur in der Dunkelheit auftauen, nach Zugabe von 150 ml PBS Filtration durch zwei unsterile Filterpapiere (Firma Schleicher und Schuell, Dassel). 2 ml der Lösung verwerfen und nachfolgend Zugabe von 2 ml 3%igem H2O2. 16. Spülen der Schnitte, zweimal für je 5 Minuten in PBS unter langsamem Rühren, anschließend für 5 Minuten Verbringen in fließendes, kaltes Leitungswasser. 17. Gegenfärbung in Hämalaun nach Mayer für 30 Sekunden. 18. Bläuen der Schnitte für 15 Minuten unter fließendem kaltem Leitungswasser. 54 3 MATERIAL UND METHODEN 19. Dehydratation in aufsteigender Alkoholreihe. Die Schnitte je 3 Minuten in 50%igem, 70%igem sowie 96%igem Ethanol belassen, anschließend für je 5 Minuten einmalig in Isopropanol sowie dreimalig in Rotihistol® (Firma Roth, Karlsruhe). 20. Eindecken der Schnitte in Roti-Histokit® (Fa. Roth, Karlsruhe) Tabelle 3.3: Verwendete Antikörper, Verdünnungen und Demaskierungsverfahren ANTIKÖRPERSPEZIFITÄT DEMASKIERUNG PRIMÄRANTIKÖRPER VERDÜNNUNG IN 1% BSA SEKUNDÄRANTIKÖRPER (Verdünnung 1:200 in PBS) CD3 Citratpuffer Rabbit AntiHuman CD3, polyclonal 1:800 gar-b mit 10% KNS IgA Pronase E Goat anti-Cat IgA FITC conjugated, polyclonal 1:12000 ga-FITC-b mit 35% KNS IgG Pronase E Goat Anti-Cat IgM FITC conjugated, polyclonal 1:9000 ga-FITC-b mit 35% KNS IgM Pronase E Goat Anti-Cat IgG-Fc FITC conjugated, polyclonal 1:9000 ga-FITC-b mit 35% KNS L1 Antigen DemaskierungsLösung G Mouse AntiHuman Myeloid/ Histiocyte Antigen Clone MAC387 1:200 gam-b mit 10% KNS BSA: Bovines Serum Albumin; gam-b: biotinylierter Ziege-anti-Maus-Antikörper; ga-FITC-b: biotinylierter goat-anti-FITC-Antikörper; gar-b: biotinylierter goat-anti-rabbit-Antikörper; KNS: Katzen-Normal-Serum; PBS: Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung 55 3 MATERIAL UND METHODEN 3.4.4 Computergestützte Morphometrie 3.4.4.1 Digitale Fotodokumentation und Bildverarbeitung mit der PC-Software analySIS® 3.1 Es wurden digitale Bilder der immunhistochemisch gefärbten Schnitte mit Hilfe eines Mikroskops (Typ BX41TF, Fa. Olympus, Hamburg) in 10facher Vergrößerung und einer dazugehörigen Videokamera (Typ Color View Soft Imaging System U-TV1X-2, Fa. Olympus Hamburg) angefertigt. Die Aufnahme und Verarbeitung leistete eine spezielle Software (analySIS® 3.1, Fa. Olympus Soft Imaging Solutions, Münster). Das Programm analySIS® 3.1 verfügt über zahlreiche Funktionen der digitalen Bildaufnahme, -verarbeitung und analyse. Um die optimalen Einstellungen zu ermitteln und eine maximale Exaktheit der Daten gewährleisten zu können, wurden zahlreiche Voruntersuchungen vorgenommen. Diese gestalteten sich derart, dass zunächst ein Raster über die Digitalbilder gelegt wurde und via Untersucherauge die auf dem jeweiligen Bildabschnitt vorliegende Anzahl von Zellen bestimmt wurde (STONEHEWER et al. 1998). Die so detektierte Zellzahl galt als Goldstandard. Im Anschluss daran wurden die Einstellungen von analySIS® 3.1 so angepasst, dass die durch das Programm detektierte Zellzahl möglichst nah oder auf dem Goldstandard lag. Für jede Einstellung wurde die Differenz der Computer-detektierten Zellen zum visuellen Ergebnis mit der dazugehörigen Fehlerquote ermittelt. Um die Präzision der Methode weiter zu erhöhen, wurden mehrere Schnitte jeweils unterschiedlicher Tiere dem gleichen Prozedere folgend ausgewertet. Im Anschluss wurde das Bestimmtheitsmaß R2 ermittelt. Das errechnete R2 lag bei der Methode, je nach Antikörper, zwischen 0,9935 und 0,9998. 3.4.4.2 Morphometrische Analyse Die Aufnahmen erfolgten in Serien von fünf Zotten und den dazugehörigen Kryptregionen. Im Falle des Kolons wurden fünf Kamerafelder fotografisch dokumentiert. Fotografiert wurden dabei möglichst hintereinander gelegene, gut orientierte, unbeschädigte Abschnitte. Die Lamina propria wurde in drei Areale aufgeteilt, Areal 1 wurde definiert als der in den Zotten gelegene Teil der Lamina propria, Areal 2 schloss die obere Hälfte der Lamina propria der Kryptregion ein und Areal 3 bezog sich auf die untere Hälfte der Lamina propria der Kryptregion (siehe Abbildung 3.4) (GERMAN et al. 1999a; WALY et al. 2001). Entsprechend wurden für das Kolon nur zwei Areale definiert (siehe Abbildung 3.5). Die 56 3 MATERIAL UND METHODEN positiv gefärbten Zellen wurden für jedes Areal getrennt betrachtet und die Ergebnisse der Zählung auf eine Fläche von 10.000 µm2 Lamina propria bezogen ausgedrückt (GERMAN et al. 1999a, WALY et al. 2001). Blut- oder Lymphgefäße sowie das Epithel wurden ausgeschlossen. Für die folgenden Vergleiche wurde der aus diesen fünf Messungen entstandene Mittelwert verwendet. Die Auswertung der Daten erfolgte für jeden Antikörper in vertikaler Richtung (Zotte (Areal 1) → obere Kryptregion (Areal 2) → untere Kryptregion (Areal 3) sowie in horizontaler Richtung (Duodenum → Jejunum → Ileum → Kolon). Abbildung 3.4: Schematische Darstellung der Arealeinteilung im Dünndarm Abbildung 3.5: Schematische Darstellung der Arealeinteilung im Kolon 57 3 MATERIAL UND METHODEN 3.5 Statistische Auswertung Die statistische Auswertung der immunhistochemischen Ergebnisse erfolgte mit dem Statistikprogramm SAS (Statistical Analysis System) für Windows, Version 3.1 (SAS Institute Inc., Cary, USA). Alle ermittelten und errechneten Daten wurden zunächst einer Untersuchung auf Normalverteilung unterzogen. Aufgrund der heterogenen Verteilung der Daten wurden der Vergleichbarkeit wegen Testverfahren für nicht parametrisch verteilte Daten verwendet. Der paarweise Vergleich der verbundenen Stichproben erfolgte mit dem Wilcoxon´s signed-rank Test. Für den paarweisen Gruppenvergleich wurde der Wilcoxon´s rank-sum Test Signifikanzniveau als nicht wurde parametrische in Ein-Weg-Varianzanalyse Bezugnahme auf die gewählt. Das vergleichsbezogene Irrtumswahrscheinlichkeit auf p ≤ 0,05 festgelegt. Von einer statistischen Tendenz wurde bei p ≤ 0,10 ausgegangen. Ein Teil der grafischen Darstellungen wurde auf einem Personalcomputer mit dem Programm SPSS (Superior Performing Software System, Version 13.0) erzeugt. 58 4 Ergebnisse 4.1 Ergebnisse der histologischen Untersuchung 4.1.1 Ergebnisse der histologischen Untersuchung von Bioptaten der Kontrolltiere Die untersuchten 47 Gewebeproben aus Duodenum, Jejunum, Ileum und Kolon der Kontrolltiere zeigten bei der histologischen Untersuchung keine pathomorphologischen Veränderungen. Gelegentlich traten vereinzelte Kryptdilatationen, Lymphangiektasien oder fokal geringgradig vermehrt Leukozyten in der Lamina propria auf. Insgesamt waren die Bioptate der Kontrolltiere jedoch als normal zu bewerten. Eine tabellarische Darstellung der Ergebnisse der klinischen und histopathologischen Untersuchungen ist den Tabellen 9.1, 9.2 und 9.3 im Anhang zu entnehmen. Abbildung 4.1 zeigt einen Ausschnitt aus dem Ileum eines Kontrolltieres. Die Abbildung 4.3 zeigt einen Ausschnitt aus dem Kolon eines Kontrolltieres. 4.1.2 Ergebnisse der histologischen Untersuchung von Bioptaten der IBD-Tiere Insgesamt lagen 30 transmurale Bioptate aus dem Intestinaltrakt von 9 Katzen mit IBD vor. Die histopathologische Untersuchung dieser Proben ergab bei 8 Tieren pathomorphologische Veränderungen in allen untersuchten Lokalisationen. Ein Tier wies im Duodenum einen Normalbefund auf. Entzündliche Veränderungen im Sinne einer lymphoplasmazellulären Enteritis oder lymphoplasmazellulären Kolitis traten in insgesamt 20 untersuchten Proben auf. 9 Bioptate zeigten Architekturveränderungen des Gewebes ohne Entzündungszellinfiltration. Die histopathologische Untersuchung der vorliegenden 22 Dünndarmbioptate zeigte bei 17 Proben eine vermehrte Infiltration mit Entzündungszellen in der Lamina propria. Die Entzündungszellinfiltration wurde in 6 Proben als geringgradig, in 9 Proben als mittelgradig und in 2 Proben als hochgradig klassifiziert. Das Infiltrat bestand in allen Fällen aus Lymphozyten und Plasmazellen, bei 12 Proben waren zusätzlich vereinzelt neutrophile Granulozyten vorhanden. In 21 Dünndarmbioptaten lagen Veränderungen der Gewebearchitektur vor. Darunter waren 14 Proben mit mittel- bis hochgradigen Veränderungen in Form von Zottenatrophie, Zottenfusionen, Kryptabszessen und/oder Kryptverlusten. 18 Proben zeigten in ein oder mehreren Gewebeschichten deutliche Lymphangiektasien. Epithelveränderungen in Form von Hypertrophie, Abflachungen 59 4 ERGEBNISSE und/oder Zelluntergang wurden bei 12 Bioptaten festgestellt. Texturabweichungen der Lamina propria mit Ödematisierung, Infiltration und/oder Fibrosen konnten in 20 der 21 veränderten Bioptate festgestellt werden. Neben Veränderungen des Epithels und der Lamina propria traten in 12 Proben Infiltrationen der Tela submucosa mit Lymphozyten und Plasmazellen auf. Wie in Abschnitt 3.3.1 dargestellt, wurde die histopathologische Diagnose anhand des histologischen Gesamtbildes unter Berücksichtigung des Entzündungszellinfiltrates sowie der Architekturveränderungen der Mukosa gestellt. Bei 5 Bioptaten aus dem Dünndarm wurde eine geringgradige, bei 12 Dünndarmbioptaten eine mittelgradige lymphoplasmazelluläre Enteritis festgestellt. 4 Proben aus dem Dünndarm wiesen Architekturveränderungen ohne erhöhtes Entzündungszellinfiltrat auf. Ein Bioptat aus dem Duodenum zeigte keine histopathologischen Veränderungen. Eine Übersicht über die histopathologischen Diagnosen der verschiedenen Darmabschnitte bei den IBD-Tieren ist in Tabelle 4.1 dargestellt. Die einzelnen histopathologischen Befunde im Dünndarm der IBDTiere ist der Tabelle 9.5 im Anhang zu entnehmen. Abbildung 4.2 zeigt einen Ausschnitt aus dem Duodenum eines IBD-Tieres mit mittelgradiger lymphoplasmazellulärer Duodenitis. 60 4 ERGEBNISSE Abbildung 4.1: Dünndarm eines Kontrolltieres Tier K5, Ileum, HE-Färbung, 100fache Originalvergrößerung Die Zotten sind schlank und gestreckt und die Krypten liegen parallel und dicht beieinander sowie dicht an der Lamina muscularis mucosae (durchgehendes Rechteck). Das Epithel ist hochprismatisch (gestricheltes Rechteck). Es liegt eine von der Zahl und Verteilung her normale Infiltration mit Entzündungszellen vor (vgl. Abbildung 3.1 und 3.3), wobei es sich mehrheitlich um Lymphozyten und Plasmazellen handelt (Pfeilköpfe). 61 4 ERGEBNISSE Abbildung 4.2: Dünndarm eines IBD-Tieres – mittelgradige lymphoplasmazelluläre Duodenitis. Tier IBD6 Duodenum, HE-Färbung, 100fache Originalvergrößerung Verkürzt erscheinende, plumpe Zotten; mittelgradige Infiltration der Lamina propria mit Lymphozyten und Plasmazellen (Kreise). Die Krypten sind nicht parallel angeordnet, sondern verlaufen gekrümmt innerhalb der Lamina propria und sind durch das erhöhte Zellinfiltrat auseinander gedrängt; darüber hinaus liegen Kryptdilatationen (Rechtecke), Abflachungen des Kryptepithels (geschlossene Pfeile) sowie teils Hypertrophien des Kryptepithels (offene Pfeile) vor. 62 4 ERGEBNISSE Die histopathologische Untersuchung der 8 Kolonbioptate der IBD-Tiere ergab bei allen Proben histopathologische Veränderungen. Ein Bioptat wies eine geringgradige, zwei Proben eine mittelgradige Infiltration mit Lymphozyten und Plasmazellen auf. Drei weitere Proben zeigten fokal vermehrt Lymphozyten und Plasmazellen. Bei 4 Bioptaten waren zusätzlich vereinzelt neutrophile Granulozyten vorhanden. In allen Bioptaten aus dem Kolon waren Abweichungen der Gewebearchitektur in Form von Kryptdilatationen, Abflachungen des Kryptepithels und/oder Kryptverluste vorhanden. Darüber hinaus lagen bei 2 Proben Erosionen der Schleimhautoberfläche vor. In einem Bioptat wurde ein deutlicher Becherzellverlust festgestellt. Lymphangiektasien in ein oder mehreren Lokalisationen traten in 5 Proben auf. Wie im Dünndarm, so wurde auch für die Biopate aus dem Kolon die histopathologische Diagnose anhand der Entzündungszellinfiltration sowie der Architekturabweichungen der Mukosa gestellt (siehe Abschnitt 3.3.1). Eine geringgradige lymphoplasmazelluläre Kolitis wurde bei zwei Bioptaten festgestellt, eine Probe aus dem Kolon wies eine mittelgradige lymphoplasmazelluläre Enteritis auf. Fünf Kolonbioptate zeigten Architekturveränderungen der Mukosa ohne Entzündungszellinfiltration. Tabelle 4.1 gibt einen Überblick über die histopathologischen Diagnosen in den Kolonbioptaten der IBDTiere. Die einzelnen klinischen und histopathologischen Befunde bei den Bioptaten aus dem Kolon von IBD-Tieren ist den Tabellen 9.4, 9.5, 9.6 und 9.7 im Anhang zu entnehmen. Abbildung 4.4 zeigt einen Ausschnitt aus dem Kolon eines IBD-Tieres mit mittelgradiger lymphoplasmazellulärer Kolitis. 63 4 ERGEBNISSE Abbildung 4.3: Kolon eines Kontrolltieres Kontrolltier K11, HE-Färbung, 100 fache Originalvergrößerung Die Krypten sind gerade und parallel angeordnet und liegen dicht beieinander. Das Epithel der Krypten ist hochprismatisch und enthält viele Becherzellen. Es liegt eine von der Zahl und Verteilung her normale Infiltration mit Entzündungszellen vor (vgl. Abbildung 3.2 und 3.3), wobei es sich mehrheitlich um Lymphozyten und Plasmazellen handelt (Pfeilköpfe). 64 4 ERGEBNISSE Abbildung 4.4: Kolon eines IBD-Tieres – mittelgradige lymphoplasmazelluläre Kolitis Tier IBD8, HE-Färbung, 100fache Originalvergrößerung Abflachung des Oberflächenepithels (gestricheltes Rechteck); Kryptdilatationen (Sterne); mittelgradige diffuse Infiltration der Lamina propria mit Lymphozyten und Plasmazellen (durchgehende Kreise). Die Krypten sind durch das erhöhte Zellinfiltrat auseinander gedrängt. Darüber hinaus sind vermehrt Lymphozyten und Plasmazellen in der Tela submucosa vorhanden (gestrichelter Kreis). 65 4 ERGEBNISSE Tabelle 4.1 Histopathologische Diagnosen an den Bioptaten der IBD-Tiere LFD.Nr. Duodenum Jejunum Ileum Kolon IBD1 mgr. LPE mgr. LPE - - IBD2 ggr. LPE mgr. LPE - ggr. LPK IBD3 ‡ mgr. LPE - ‡ IBD4 ggr. LPE mgr. LPE ‡ ggr. LPK IBD5 mgr. LPE ggr. LPE ‡ ‡ IBD6 mgr. LPE mgr. LPE - ‡ IBD7 mgr. LPE mgr. LPE mgr. LPE ‡ IBD8 ggr. LPE ggr. LPE ‡ mgr. LPK IBD9 * mgr. LPE - ‡ ggr.: geringgradig; mgr.: mittelgradig; Lfd.Nr.: laufende Nummer; LPE: lymphoplasmazelluläre Enteritis; LPK: lymphoplasmazelluläre Kolitis; * : ohne besonderen histopathologischen Befund; ‡: Bioptat weist Architekturveränderungen der Lamina propria ohne Entzündungszellinfiltration auf; -: kein Bioptat entnommen 66 4 ERGEBNISSE 4.1.2.1 Histopathologische Befunde extraintestinaler Bioptate 3 der 9 Tiere mit lymphoplasmazellulärer Enterokolitis wiesen, zusätzlich zu den Veränderungen im Intestinaltrakt, weitere histopathologische Befunde in Leber und Pankreas auf (Tiere IBD4, IBD8 und IBD9). Alle drei Tiere zeigten histologisch eine chronische, diffuse oder multifokale Pankreatitis, wobei zwei Fälle als hochgradig und einer als mittelgradig klassifiziert wurden. Zusätzlich lag bei diesen Tieren eine multifokale, geringbis mittelgradige, periportale, gemischtzellige Hepatitis vor. Diese Fälle wurden als TriaditisFälle klassifiziert. Zusätzlich zu den Gewebeproben aus dem Intestinaltrakt, dem Pankreas und der Leber, waren bei 5 Katzen Bioptate der Lymphonodi mesenteriales verfügbar. Vier dieser Proben wiesen eine mittel- bis hochgradige lymphatische Hyperplasie auf. Zusätzlich wurde bei 2 Bioptaten eine gering- bis mittelgradige eitrige Lymphadenitis festgestellt. In einem Fall lagen keine abweichenden Befunde vor. Die Darstellung der histopathologischen Befunde an extraintestinalen Organen ist der Tabelle 9.7 im Anhang zu entnehmen. 67 4 ERGEBNISSE 4.2 Ergebnisse der immunhistochemischen Reaktionen 4.2.1 Reaktionsmuster der CD3+ Zellen Positiv gefärbte Zellen wiesen eine membranassoziierte Reaktion unter Aussparung des Zellkernes auf. 4.2.2 Reaktionsmuster der Plasmazellen Die Plasmazellen zeigten eine zytoplasmatische Färbung in Form von Ablagerungen des braunen Reaktionsproduktes. Die Zellkerne waren von der Färbung ausgenommen. Reaktionen mit dem Anti-IgA-, Anti-IgG- und Anti-IgM-Antikörpern wiesen zusätzlich eine homogene Reaktion im Gefäßlumen auf. Darüber hinaus zeigten Anti-IgA- und Anti-IgMAntikörper Ablagerungen von Reaktionsprodukt in Form eines linearen, schmalen Saumes auf der Kryptenepithel- und teils auf der Zottenepitheloberfläche sowie feingranuläre Ablagerungen in den Kryptenlumina (siehe Abbildung 4.13). 4.2.3 Reaktionsmuster der L1+ Zellen Positive gefärbte Zellen zeigten ein zytoplasmatisches, feingranuläres Färbemuster, wobei häufig eine nierenförmige Kernaussparung sichtbar war. 68 4 ERGEBNISSE 4.3 Ergebnisse der computergestützten Morphometrie Ziel der morphometrischen Untersuchungen war die Ermittlung der Anzahl und des Verteilungsmusters der unter 4.2 genannten Zellen in den Lokalisationen Duodenum, Jejunum, Ileum und Kolon in transmuralen Bioptaten von IBD-Tieren im Vergleich zu darmgesunden Kontrolltieren. Die Untersuchung der Verteilungsmuster erfolgte einerseits in vertikaler, andererseits in horizontaler Richtung. Die Untersuchung in vertikaler Richtung beschreibt die Verteilung von den Zotten (Areal 1) in Richtung der Krypten (Areal 2 und Areal 3) innerhalb einer Darmlokalisation. Die Untersuchung in horizontaler Richtung beschreibt die Verteilung zwischen den Darmsegmenten Duodenum, Jejunum, Ileum und Kolon sowie zwischen Dünndarm und Kolon insgesamt. Außerdem wurden die Areale in horizontaler Richtung auf Unterschiede hin untersucht, d.h. jeweils die Zotten und die Kryptenregionen der Darmlokalisationen. In der folgenden Darstellung der Ergebnisse wird zunächst das Verteilungsmuster des jeweiligen Zelltyps bei den Kontrolltieren dargelegt. Im Anschluss wird diesen Ergebnissen das Verteilungsmuster bei den IBD-Tieren gegenübergestellt. Abschließend werden die zwischen beiden Gruppen ermittelten Unterschiede hinsichtlich der Areale und Lokalisationen dargestellt. 69 4 ERGEBNISSE 4.3.1 CD3+ Zellen 4.3.1.1 Verteilung der CD3+ Zellen innerhalb der Gruppe der Kontrolltiere Die Untersuchung des vertikalen Verteilungsmusters (siehe Abbildung 4.5) ergab für alle untersuchten Dünndarmabschnitte eine signifikant höhere Dichte an CD3+ Zellen in den Zotten im Vergleich zu den tiefer gelegenen Arealen mit einer kontinuierlichen Zunahme der Zellzahl von Areal 3 (tiefe Kryptregion) zu Areal 1 (Zotten). Gleiches gilt für das Kolon, in dem eine signifikante Zunahme der Anzahl CD3+ Zellen von Areal 3 zu Areal 2 zu beobachten war. So wurde für alle untersuchten Darmabschnitte eine Zunahme der Dichte von CD3+ Zellen von distal nach proximal festgestellt. Die p-Werte der Einzelvergleiche sind der Tabelle 9.8 im Anhang zu entnehmen. Ferner ist die vertikale Zellverteilung von Kontrollund LPE-Tieren in Abbildung 4.9 dargestellt. Abbildung 4.5: Vertikales Verteilungsmuster der CD3+ Zellen in den untersuchten Lokalisationen der Kontrolltiere Die Untersuchung der horizontalen Verteilung in Areal 1 ergab eine signifikante, kontinuierliche Zunahme der Zellzahl vom Duodenum in Richtung des Ileums. Die Untersuchung der Areale 2 und 3 ergab keine signifikanten Unterschiede zwischen den Lokalisationen. Jedoch kann auch die Gesamtzellzahl der Kryptregion betrachtet werden. Die Zellzahl der Kryptregion insgesamt berechnet sich durch Addition der Zellzahlen der Areale 2 und 3 und Division durch 2 (Areal 2+3/2 = Gesamtzellzahl der Kryptregion). Bei der Betrachtung dieser Gesamtzellzahl der Kryptregion ließ sich eine diskontinuierliche Zunahme der Dichte an CD3+ Zellen vom Duodenum in Richtung des Ileums feststellen. Dabei 70 4 ERGEBNISSE existierten zwischen Duodenum und Ileum sowie zwischen Jejunum und Ileum signifikante Unterschiede. Der Unterschied zwischen Duodenum und Jejunum war nummerischer Natur. Wie in Abbildung 4.6 dargestellt, ergab der Vergleich der Gesamtzellzahl der einzelnen Darmabschnitte eine kontinuierliche, signifikante Zunahme der Zellzahl vom Duodenum in Richtung des Ileums. Beim Vergleich von CD3+ Zellen von Duodenum und Jejunum stellte sich nur eine tendenzielle Zunahme heraus. Der Vergleich der Gesamtzellzahl des Dünndarms mit der des Kolons erbrachte eine signifikant höhere Zelldichte an CD3+ Zellen im Dünndarm. Eine detaillierte Darstellung der p-Werte aller Einzelvergleiche kann der Tabelle 9.9 im Anhang entnommen werden. Die horizontalen Verteilungen sind für beide Gruppen in der Abbildung 4.10 grafisch dargestellt. Abbildung 4.6: Horizontales Verteilungsmuster der CD3+ Zellen in den untersuchten Lokalisationen der Kontrolltiere 4.3.1.2 Verteilung von CD3+ Zellen innerhalb der Gruppe der IBD-Tiere Das vertikale Verteilungsmuster war, mit Abnahme der Zelldichte von proximal nach distal, im Wesentlichen wie bei den Kontrolltieren. Ausnahmen hiervon bildeten das Areal 1 des Duodenums sowie die Differenz von Zotte zur Gesamtkryptregion des Jejunums, wobei jeweils Tendenzen sichtbar wurden. Im Jejunum bestand zwischen Areal 1 und 2 kein signifikanter Unterschied. Statistische Aussagen innerhalb des Ileums waren aufgrund der geringen Stichprobengröße von n = 4 Bioptaten für keinen der verwendeten Antikörper möglich. Daher wurde hier ausschließlich auf nummerische Unterschiede hin untersucht. Alle übrigen Lokalisationen in vertikaler Richtung waren signifikant voneinander unterschiedlich. 71 4 ERGEBNISSE Das horizontale Verteilungsmuster unterschied sich von dem der Kontrolltiere. Ein signifikanter Unterschied bestand zwischen Dünndarm und Kolon, wobei sich eine signifikant niedrigere Zellzahl im Kolon zeigte. Zwischen den einzelnen Arealen sowie den Lokalisationen insgesamt konnte kein bestimmtes Verteilungsmuster ausgemacht werden. Ein aussagekräftiger Vergleich der verschiedenen Areale mit Arealen des Ileums oder dem Ileum insgesamt war auf statistischer Ebene nicht möglich, da die Stichprobenzahl mit Duodenum und Jejunum (je n = 9 Bioptate und Ileum n = 4 Bioptate) zu stark schwankte. Eine statistische Aussage über abhängige Stichproben (repeated measurements) ist bei derart unterschiedlichen Stichprobengrößen nicht erlaubt. Es werden daher im Folgenden nummerische Unterschiede untersucht, die jedoch bezüglich der Dichte von CD3+ Zellen nicht vorlagen. Die p-Werte der Einzelvergleiche sind den Tabellen 9.8 und 9.9 im Anhang zu entnehmen. Die vertikale und horizontale Verteilung von CD3+ Zellen ist in den Abbildungen 4.9 und 4.10 dargestellt. 4.3.1.3 Gruppenvergleich Wie aus Tabelle 4.2 ersichtlich, ergab der Vergleich der Dichte von CD3+ Zellen zwischen Kontrolltieren und IBD-Tieren eine nummerische Erhöhung der Mediane in der Gruppe der IBD-Tiere für die Lokalisationen des Duodenums und Ileums. Hinsichtlich der Gesamtzellzahl des Duodenums konnten signifikante Erhöhungen der Anzahl CD3+ Zellen gezeigt werden. Tendenzen einer erhöhten Zellzahl in der Gruppe der IBD-Tiere ließen sich in Areal 2 des Duodenums sowie bei der Betrachtung der Kryptgesamtzellzahl des Duodenums ablesen. Diese Unterschiede wurden in Richtung des Ileums zunehmend kleiner und kehrten sich in dieser Lokalisation sogar leicht um. Abbildung 4.9 stellt die Differenzen der Zellzahlen zwischen verschiedenen Arealen dar. Wendet man sich den verschiedenen Darmlokalisationen insgesamt, d.h. ohne eine Arealunterteilung zu, so konnte eine signifikante Erhöhung der Zellzahl im Duodenum für die Gruppe der IBD-Tiere nachgewiesen werden. Im Jejunum sowie im Dünndarm insgesamt waren nummerische Erhöhungen bei den IBD-Tieren zu beobachten. Im Ileum und Kolon war die Zellzahl jeweils bei den Kontrolltieren höher als bei den IBD-Tieren, wobei dieser Unterschied statistisch nicht relevant war. Der Vergleich der Zahlen für den gesamten Darm ergab eine nummerische Erhöhung in der Gruppe der IBD-Tiere. Die Ergebnisse für die Darmlokalisationen ohne 72 4 ERGEBNISSE Arealeinteilung können der 4.3 Tabelle sowie der Abbildung 4.10 entnommen werden. Die pWerte der Einzelvergleiche sind in Tabelle 9.10 im Anhang dargestellt. Abbildung 4.7 zeigt die Infiltration mit CD3+ T-Zellen in den Dünndarmzotten bei einem Kontrolltier. Die Abbildung 4.8 zeigt die vermehrte Infiltration einer Dünndarmzotte mit CD3+ T-Zellen bei einem IBD-Tier. 73 4 ERGEBNISSE Abbildung 4.7: Darstellung von CD3+ T-Zellen in den Dünndarmzotten eines Kontrolltieres Tier K9, Duodenum, 100 fache Originalvergrößerung Die Pfeile zeigen CD3+ T-Lymphozyten in der Lamina propria der Dünndarmzotten. Die Pfeilköpfe deuten auf CD3+ T-Zellen im Zottenepithel. 74 4 ERGEBNISSE Abbildung 4.8: Darstellung von CD3+ Zellen in einer Dünndarmzotte eines IBD-Tieres mit mittelgradiger lymphoplasmazellulärer Enteritis. Tier IBD2 Jejunum, 10 fache Originalvergrößerung Die durchgehenden Rechtecke zeigen die mittelgradige Infiltration der Lamina propria mit CD3+ T-Lymphozyten. Die gestrichelten Rechtecke markieren die vermehrte Infiltration des Zottenepithels mit CD3+-T-Zellen. 75 4 ERGEBNISSE Tabelle 4.2: CD3+ Zellen: Tabellarische Darstellung der morphometrischen Ergebnisse Median der gemessenen Zellzahlen/ 10.000 µm2 Lamina propria (P25; P75) KONTROLLTIERE DUODENUM 1 _ 28,34 (7,56; 15,01) (14,40; 23,59) (18,00; 32,28) 6,79 3 9,97 8,81 3,58 (4,80; 11,82) (7,45; 14,69) (2,92; 5,29) 1,54 1,50 3,37 2,78 (1,08; 3,33) (0,66; 2,96) (1,81; 6,35) (1,51; 5,26) a 4,92 5,76 7,34 3,30 (3,78; 7,02) (5,51; 11,54) (2,43; 5,26) 20,54 16,43 26,17 _ (13,58; 24,47) (13,79; 30,23) (17,36; 37,75) 4 b (2,51; 6,14) 12,46 a (7,97; 22,07) 3 12,95 8,33 3,40 (5,53; 28,19) (6,85; 13,24) (2,63; 13,44) 2,35 3,21 2,68 1,61 (0,91; 3,76) (1,03; 6,51) (1,33; 4,54) (1,09; 5,07) 8,08 5,51 2,38 (3,28; 17,35) (4,09; 8,86) (2,03; 9,25) 10,71 4 KOLON 18,60 (3,42; 9,97) 2 ILEUM 13,87 2 1 IBD-TIERE JEJUNUM b (5,16; 11,72) 1: Areal 1 (Zotten); 2: Areal 2 (obere Kryptregion); 3: Areal 3 (untere Kryptregion); 4: Kryptregion insgesamt; Nur signifikante Differenzen zwischen den Gruppen sind dargestellt; a und b zeigen statistisch relevante Differenzen; hellgraue Felder: Tendenzen p ≤ 0,1; P25: 25% Quartil; P75: 75% Quartil; -: im Kolon ist kein Areal 1 (Zotten) vorhanden Tabelle 4.3: CD3+ Zellen: Ergebnisse der morphometrischen Untersuchung, Darstellung der Mittel über die Lokalisationen Median der gemessenen Zellzahlen/ 10.000 µm2 Lamina propria (P25; P75) DUODENUM K IBD 7,80 (4,23; 8,94) 11,31 (10,76; 14,19) JEJUNUM a a 9,86 (7,05; 12,98) 12,27 (9,82; 22,69) ILEUM 15, 23 DÜNNDARM KOLON (11,10; 16,48) 11, 31 3,30 (8,96; 13,02) (2,43; 5,26) 12, 39 12,39 (8,51; 18,51) (11,51; 13,33) 2,38 (2,03; 9,25) DARM 9,86 (6,78; 12,55) 11,29 (9,89; 12,31) Nur signifikante Differenzen zwischen den Gruppen sind dargestellt; a zeigt statistisch relevante Differenzen; dunkelgraue Felder: Signifikanzen p ≤ 0,05; K: Kontrollgruppe; IBD: Gruppe der Tiere mit IBD; P25: 25% Quartil; P75: 75% Quartil 76 4 ERGEBNISSE 50 Kontrolltiere Kontrolltiere (K) CIE7 45 CIE-Tiere IBD-Tiere (CIE) CIE2 40 Maximum 75%Quartil 35 Anzahl CD3+ Zellen Median 25%Quartil 30 Minimum 25 K6 CIE2 20 K5 CIE2 15 CIE2 CIE5 K9 10 5 D1: Duodenum Areal 1 D2: Duodenum Areal 2 D3: Duodenum Areal 3 D2\3: Duodenum Areal 2+3/2= Gesamtzellzahl der Kryptregion J1: Jejunum Areal 1 J2: Jejunum Areal 2 J3: Jejunum Areal 3 IL1: Ileum Areal 1 IL2: Ileum Areal 2 IL3: Ileum Areal 3 C2: Kolon Areal 2 C3: Kolon Areal 3 p ≤ 0,05 Signifikanz p ≤ 0,1 0 D1 D2 D2\3: D3 J1 J2 J3 IL1 IL2 IL3 C2 C3 angegeben sind ausschließlich signifikante/ tendenzielle Unterschiede zwischen den Gruppen Lokalisation Abbildung 4.9: Darstellung der Anzahl von CD3+ Zellen in den untersuchten Lokalisationen und Vergleich der Gruppe der Kontrolltiere mit der Gruppe der IBD-Tiere Abbildung 4.9 verdeutlicht für beide Gruppen die hohe Dichte von CD3+ Zellen in den Zotten mit Abnahme in Richtung der Kryptregion. Der Vergleich der Gruppe der Kontrolltiere (weiße Boxplots) mit den IBD-Tieren (graue Boxplots) zeigt die Erhöhung der Zellzahl besonders im Duodenum (D1 - D3) und Jejunum (J1 – J3). Statistisch relevant waren die tendenziellen Erhöhungen in Areal 2 des Duodenums (D2) und in der gesamten Kryptregion des Duodenums (D2+D3) (nicht als gesonderter Boxplot dargestellt). 77 4 ERGEBNISSE 40 Legende Kontrolltiere Kontrolltiere IBD-Tiere CIE-Tiere CIE2 35 CIE2 (K) (CIE) Maximum CIE2 30 75%Quartil Anzahl CD3+ Zellen Median CIE7 25 25%Quartil CIE7 CIE7 Minimum 20 K6 15 K5 10 CIE9 p ≤ 0,05 5 K8 K8 CIE3 CIE3 CIE3 0 Duodenum Jejunum Ileum Dünndarm K Colon Darm_gesamt angegeben sind ausschließlich signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen Angaben der Gesamtzellzahl pro untersuchter Lokalisation Lokalisation Abbildung 4.10: Darstellung der Gesamtzahlen von CD3+ Zellen in den untersuchten Lokalisationen und Vergleich der Gruppe der Kontrolltiere mit der Gruppe der IBD-Tiere Wie aus Abbildung 4.10 ersichtlich, zeigten beide Gruppen einen Anstieg der Anzahl CD3+ Zellen vom Duodenum in Richtung des Ileums sowie eine höhere Dichte von CD3+ Zellen im Dünndarm im Vergleich zum Kolon. Darüber hinaus werden die erhöhten Zellzahlen im Duodenum und Jejunum und für den Darm insgesamt in der Gruppe der IBD-Tiere im Vergleich zur Gruppe der Kontrolltiere deutlich. Es konnte eine signifikant erhöhte Zellzahl im Duodenum der IBD-Tiere festgestellt werden. 78 4 ERGEBNISSE 4.3.2 IgA-Plasmazellen 4.3.2.1 Verteilung von IgA-Plasmazellen innerhalb der Gruppe der Kontrolltiere Abbildung 4.11 zeigt die vertikale Verteilung von IgA-Plasmazellen. Für alle untersuchten Dünndarmlokalisationen ist eine Zunahme der Dichte von IgA-Plasmazellen von der Zotte in Richtung der Krypten, mit einer signifikant höheren Zellzahl in den tiefer gelegenen Kryptanteilen zu beobachten. Es lag also in allen Fällen ein signifikanter Unterschied zwischen Areal 1 und Areal 3 vor. Darüber hinaus konnte in jedem untersuchten Abschnitt des Dünndarms ein signifikanter Unterschied zwischen den Zotten und der Gesamtzellzahl der Kryptregion gezeigt werden, so dass eine Abnahme der Zellzahl von den Zotten in Richtung der Krypte konstatiert werden kann. Im Kolon gab es einen geringen nummerischen Unterschied zwischen Areal 2 und 3, dieser erwies sich jedoch als statistisch nicht signifikant. Abbildung 4.16 verdeutlicht hierzu das vertikale Verteilungsmuster beider Gruppen. Abbildung 4.11: Vertikales Verteilungsmuster von Darmlokalisationen der Kontrolltiere IgA-Plasmazellen in den untersuchten Die Untersuchung des horizontalen Verteilungsmusters ergab eine Abnahme der Gesamtzellzahl vom Duodenum in Richtung des Ileums mit einem signifikanten Unterschied zwischen Duodenum und Ileum und einem tendenziellen Unterschied zwischen Duodenum und Jejunum (siehe hierzu auch Abbildung 4.12). Der Vergleich der einzelnen Lokalisationen ergab statistische Unterschiede vor allem zwischen Lokalisationen des Duodenums und des Ileums. In Areal 1 wurde eine signifikante Abnahme der Zellzahl vom Duodenum in Richtung 79 4 ERGEBNISSE des Ileums deutlich, des Weiteren war die Kryptgesamtzellzahl zwischen Duodenum und Ileum signifikant unterschiedlich, mit einer Abnahme der Zellzahl von kranial nach kaudal. Zwischen Dünndarm und Kolon konnte nahezu kein Unterschied festgestellt werden und wurde daher in Abbildung 4.12 nicht dargestellt. Insgesamt konnte für den Dünndarm eine diskontinuierliche Abnahme der Dichte von IgA produzierenden Zellen von kranial nach kaudal ermittelt werden. Eine detaillierte Darstellung der p-Werte der einzelnen Vergleiche in horizontaler und vertikaler Richtung für beide Gruppen ist den Tabellen 9.11 und 9.12 im Anhang zu entnehmen. Ferner ergibt sich die horizontale Zellverteilung beider Gruppen aus der Abbildung 4.17. Abbildung 4.12: Horizontales Verteilungsmuster der Darmlokalisationen der Kontrolltiere IgA-Plasmazellen in den untersuchten 4.3.2.2 Verteilung von IgA-Plasmazellen innerhalb der Gruppe der IBD-Tiere Das vertikale Verteilungsmuster war im Wesentlichen wie bei den Kontrolltieren. Der Vergleich der Anzahl IgA+ Zellen der Zotten mit der gesamten Kryptregion ergab auch hier eine signifikante Zunahme der Zellzahl von proximal nach distal, wobei das Ileum wiederum nur nummerisch bewertet wurde. Auch das horizontale Verteilungsmuster entsprach ebenfalls dem der Kontrolltiere mit einer signifikant höheren Zellzahl im Duodenum im Vergleich zum 80 4 ERGEBNISSE Jejunum sowie nummerischen Unterschieden zwischen Duodenum respektive Jejunum und Ileum. Damit war auch in der Gruppe der IBD-Tiere eine Abnahme der Zellzahl von kranial in Richtung kaudaler Dünndarmabschnitte festzustellen. Zwischen der Anzahl von IgAPlasmazellen in Dünndarm und Kolon bestand auch in der Gruppe der IBD-Tiere kein Unterschied. 4.3.2.3 Gruppenvergleich Wie der Tabelle 4.4 und der Abbildung 4.16 zu entnehmen ist, ergaben sich in der Gruppe der IBD-Tiere tendenziell mehr IgA-Plasmazellen in der unteren Kryptregion des Duodenums und in der Zotte des Jejunums. Die gesamte Kryptregion des Duodenums unterschied sich in beiden Gruppen signifikant, mit höherer Dichte von IgA-Plasmazellen bei den IBD–Tieren. Bei außer Acht lassen der Arealeinteilung, ergaben sich für den Dünndarm sowie den Darm insgesamt signifikant höhere Zellzahlen von IgA-Plasmazellen in der Gruppe der IBD-Tiere im Vergleich zu darmgesunden Tieren. Tendenziell höhere Zahlen wurden für das Duodenum und Jejunum festgestellt. Die Daten für die Gesamtzellzahlen der Darmlokalisationen insgesamt sind in Tabelle 4.5 sowie Abbildung 4.17 dargestellt. Die genauen p-Werte der Einzelvergleiche können aus Tabelle 9.13 im Anhang entnommen werden. Die folgenden Abbildungen 4.13, 4.14 und 4.15 zeigen exemplarisch die Verteilung der IgAPlasmazellen bei den Kontrolltieren bzw. die Zunahme der IgA sezernierenden Plasmazellen bei den IBD-Tieren im Vergleich zu darmgesunden Katzen. Abbildung 4.13 zeigt die normale Verteilung von IgA- produzierenden Plasmazellen. IgAPlasmazellen sind bei den Kontrolltieren vorwiegend in den Kryptregionen lokalisiert, und ihre Zahl nimmt in Richtung der Zotten deutlich ab. Demgegenüber wird aus Abbildung 4.14 deutlich, dass IgA-Plasmazellen bei den IBD-Tieren mit lymphoplasmazellulärer Enteritis vermehrt vorkommen. Abbildung 4.15 ist ein vergrößerter Ausschnitt der Abbildung 4.14 (siehe schwarzes Quadrat in Abbildung 4.14). 81 4 ERGEBNISSE Abbildung 4.13: Darstellung von IgA-Plasmazellen im Dünndarm eines Kontrolltieres Tier K5, Ileum, 100 fache Originalvergrößerung. Die Pfeile zeigen IgA-Plasmazellen in der Lamina propria des Dünndarms. Die Pfeilköpfe deuten auf Ablagerungen des immunhistochemischen Reaktionsproduktes in Form eines linearen, schmalen Saumes auf der Zottenepitheloberfläche (geschlossene Pfeilköpfe) sowie den Kryptenlumina (offene Pfeilköpfe). 82 4 ERGEBNISSE Abbildung 4.14: Darstellung von IgA-Plasmazellen im Dünndarm eines IBD-Tieres mit geringgradiger lymphoplasmazellulärer Enteritis Tier IBD4 Duodenum, 200fache Originalvergrößerung. Die Ellipsen markieren die Infiltration der Lamina propria mit IgA-Plasmazellen. Die Zahl der IgAPlasmazellen ist sowohl in der Lamina propria der Kryptregion, als auch in der Lamina propria der Zotten gegenüber den Kontrolltieren erhöht. Das Rechteck markiert den Bildausschnitt, der in Abbildung 4.15 wiedergegeben ist. 83 4 ERGEBNISSE Abbildung 4.15: Bildausschnitt aus Abb. 4.14 - Darstellung on IgA-Plasmazellen im Dünndarm eines IBD-Tieres mit geringgradiger lymphoplasmazellulärer Enteritis Tier IBD4, Duodenum, 400fache Originalvergrößerung Die Pfeile zeigen IgA-Plasmazellen in der Lamina propria der Kryptregion eines IBD-Tieres. Die Dichte an IgA-Plasmazellen ist gegenüber den Kontrolltieren deutlich erhöht. 84 4 ERGEBNISSE Tabelle 4.4: IgA-Plasmazellen: Tabellarische Darstellung der morphometrischen Ergebnisse Median der gemessenen Zellzahlen/ 10.000 µm2 Lamina propria (P25; P75) KONTROLLTIERE DUODENUM 1 2 8,23 2,57 (2,72; 16,56) (1,41; 5,15) 10,32 10,71 (2,97; 12,00) (9,42; 13,14) a b 15,84 10,10 11,84 (12,65; 16,88) (6,73; 13,44) (9,41; 14,84) 11,72 10,49 11,81 (10,39; 14,32) (4,45; 12,72) (9,41; 14,84) 1,86 _ 15,04 7,74 (8,28; 18,22) (2,26; 13,71) c (1,26; 4,94) 20,52 12,10 6,59 14,32 (17,80; 25,62) (10,41; 16,75) (5,03; 9,53) (9,12; 18,14) 24,71 a (21,25; 25,97) 22,18 4 (0,93; 6,45) 8,58 16,66 3 _ 2,20 (7,03; 11,93) (11,80; 19,72) 2 c KOLON 14,20 (11,96; 21,31) 4 ILEUM (10,45; 18,74) 18,13 3 1 IBD-TIERE JEJUNUM b (20,87; 24,26) 24,72 15,29 15,27 (15,93; 26,81) (7,93; 21,60) (10,85; 18,89) 16,40 10,94 15,29 (11,93; 22,47) (6,72; 15,32) (9,91; 18,72) 1: Areal 1 (Zotten); 2: Areal 2 (obere Kryptregion); 3: Areal 3 (untere Kryptregion); 4: Kryptregion insgesamt; Nur signifikante Differenzen zwischen den Gruppen sind dargestellt; a-c zeigen statistisch relevante Differenzen; hellgraue Felder: Tendenzen p ≤ 0,1; dunkelgraue Felder: Signifikanzen p ≤ 0,05; P25: 25% Quartil; P75: 75% Quartil; -: im Kolon ist kein Areal 1 (Zotten) vorhanden Tabelle 4.5: IgA-Plasmazellen: Ergebnisse der morphometrischen Untersuchung mit Darstellung der Mittel über die Lokalisationen Median der gemessenen Zellzahlen/ 10.000 µm2 Lamina propria (P25; P75) DUODENUM K IBD 13,40 (10,22; 17,74) 20,83 (16,67; 21,87) JEJUNUM a a 8,63 (7,33; 11,38) 11,55 (11,37; 17,75) ILEUM 7,41 b b DÜNN- KOLON DARM 10,43 (3,40; 10,90) (7,93; 12,58) 7,91 14,60 (4,90; 11,86) (12,66; 19,73) c c DARM 11,81 10,19 (9,41; 14,84) (8,54; 12,18) 15,29 14,60 (9,91; 18,72) (13,52; 18,68) Nur signifikante Differenzen zwischen den Gruppen sind dargestellt; a zeigt statistisch relevante Differenzen; hellgraue Felder: Tendenzen p ≤ 0,1; dunkelgraue Felder: Signifikanzen p ≤ 0,05; K: Kontrollgruppe; IBD: Gruppe der IBD-Tiere; P25: 25% Quartil; P75: 75% Quartil 85 d d 4 ERGEBNISSE 45 KKontrolltiere (K) CIE IBD-Tiere (CIE) CIE3 40 CIE3 Maximum K8 35 75%Quartil K8 Median Anzahl IgA+ Zellen 30 25%Quartil CIE3 Minimum 25 K7 K7 D1: Duodenum Areal 1 D2: Duodenum Areal 2 D3: Duodenum Areal 3 D2\3: Duodenum Areal 2+3/2= Gesamtzellzahl der Kryptregion J1: Jejunum Areal 1 J2: Jejunum Areal 2 J3: Jejunum Areal 3 IL1: Ileum Areal 1 IL2: Ileum Areal 2 IL3: Ileum Areal 3 C2: Kolon Areal 2 C3: Kolon Areal 3 20 15 K7 10 CIE8 CIE8 K9 5 p ≤ 0,05 0 D1 D2 D3 J1 J2 J3 IL1 IL2 IL3 Lokalisation C2 C3 p ≤ 0,1 angegeben sind ausschließlich signifikante/ tendenzielle Unterschiede zwischen den Gruppen Lokalisation D2\3: Abbildung 4.16: Darstellung der Anzahl von IgA-Plasmazellen in den untersuchten Lokalisationen und Vergleich der Gruppe der Kontrolltiere mit der Gruppe der IBD-Tiere Die Abbildung zeigt deutlich die steigenden Zahlen von IgA-Plasmazellen von den Zotten (jeweils Areal 1) in Richtung der Kryptregion (Areale 2 und 3) für alle untersuchten Lokalisationen in beiden Gruppen. Darüber hinaus sind die erhöhten Zellzahlen in der Gruppe der IBD-Tiere (graue Boxplots) im Vergleich zu den Kontrolltieren (weiße Boxplots) sichtbar. Statistisch relevant sind die tendenziellen Erhöhungen in Duodenum (D3) und Jejunum (J1). Ein signifikanter Unterschied konnte für die Kryptregion des Duodenums insgesamt ermittelt werden (D2+D3) (nicht als gesonderter Boxplot dargestellt). 86 4 ERGEBNISSE 40 Kontrolltiere (K) KT IBD-Tiere (CIE) CIE CIE3 35 Maximum 75%Quartil 30 Anzahl IgA+ Zellen CIE3 Median 25%Quartil K8 25 Minimum 20 15 10 p ≤ 0,05 CIE8 CIE8 5 p ≤ 0,1 angegeben sind ausschließlich signifikante/ tendenzielle Unterschiede zwischen den Gruppen 0 Duodenum Jejunum Ileum Dünndarm Kolon Colon Darm_ges Angabe der Gesamtzellzahl pro untersuchter Lokalisation Lokalisation Abbildung 4.17: Darstellung der Gesamtzahlen von IgA Plasmazellen in den untersuchten Lokalisationen und Vergleich der Gruppe der Kontrolltiere mit der Gruppe der IBDTiere Abbildung 4.17 zeigt die deutliche Abnahme der Zahl von IgA-Plasmazellen von kranial in Richtung der kaudalen Dünndarmabschnitte sowie die leicht höheren Zellzahlen im Kolon im Vergleich zum Dünndarm. Der Vergleich der Gruppe der Kontrolltiere (weiße Boxplots) mit den IBD-Tieren (graue Boxplots) zeigt in allen Lokalisationen eine deutlich höhere Zahl bei den IBD-Tieren, mit Ausnahme des Ileums. Signifikant höhere Zahlen in der Gruppe der IBD-Tiere ergaben sich für den Dünndarm und den Darm insgesamt. Tendenzen einer Zunahme der Zellzahl bei den IBD-Tieren wurden für das Duodenum und Jejunum deutlich. 87 4 ERGEBNISSE 4.3.3 IgG-Plasmazellen 4.3.3.1 Verteilung der IgG-Plasmazellen innerhalb der Gruppe der Kontrolltiere Die Untersuchung des vertikalen Verteilungsmusters (siehe Abbildung 4.18) ergab eine signifikant höhere Zelldichte von IgG-Plasmazellen in Areal 2 in Vergleich zu Areal 1 für die untersuchten Lokalisationen im Dünndarm. Im Duodenum ließ sich diesbezüglich eine Tendenz ablesen. Darüber hinaus war im Duodenum und Jejunum eine signifikant höhere Zellzahl in Areal 2 gegenüber Areal 3 evident; ein derartiger Unterschied ließ sich für das Ileum nicht feststellen. Insgesamt zeigten die Ergebnisse mit einer höheren Dichte von IgGPlasmazellen in Areal 2 im Vergleich zu Areal 1 und 3 ein rautenförmiges Verteilungsmuster von IgG-Plasmazellen im Dünndarm, welches in Abbildung 4.18 dargestellt ist. Die Zellzahlen im Kolon deuteten auf eine ähnliche Zellverteilung mit höherer Zellzahl in Areal 2 gegenüber Areal 3 hin, die Unterschiede waren jedoch nicht signifikant. Tabelle 9.14 im Anhang zeigt die genauen p-Werte der Einzelvergleiche. Aus Abbildung 4.20 geht das vertikale Verteilungsmuster von IgG-Plasmazellen für beide Gruppen hervor. Abbildung 4.18: Vertikales Verteilungsmuster der Darmlokalisationen der Kontrolltiere IgG-Plasmazellen in den untersuchten Das horizontale Verteilungsmuster (siehe Abbildung 4.19) wies eine signifikant höhere Gesamtzellzahl im Duodenum gegenüber dem Jejunum und Ileum auf, so dass sich eine Abnahme der Zellzahl von kranial nach kaudal bis zum Jejunum zeigte. Jejunum und Ileum unterschieden sich nummerisch nur unwesentlich voneinander. Auch die einzelnen Areale 88 4 ERGEBNISSE unterschieden sich vor allem zwischen Duodenum und Jejunum, mit höheren Zellzahlen im Duodenum. Gegenüber dem Ileum waren die Unterschiede weniger ausgeprägt. Der Vergleich der Gesamtzellzahlen zwischen Dünndarm und Kolon ergab keinen signifikanten Unterschied und wurde daher in Abbildung 4.19 nicht dargestellt. Eine detaillierte Darstellung der p-Werte der einzelnen Vergleiche ist der Tabelle 9.15 im Anhang zu entnehmen. In Abbildung 4.21 wird das horizontale Verteilungsmuster in beiden Gruppen noch einmal grafisch dargestellt. Abbildung 4.19: Horizontales Verteilungsmuster der Darmlokalisationen der Kontrolltiere IgG-Plasmazellen in den untersuchten 4.3.3.2 Verteilung IgG-Plasmazellen innerhalb der Gruppe der IBD-Tiere Die vertikale Verteilung entspricht mit einer rautenförmigen Verteilung durch eine höhere Zellzahl in Areal 2 im Vergleich zu Areal 1 und 3 dem der Kontrolltiere. Statistisch relevante Unterschiede bestanden zwischen Areal 1 und 2 sowie zwischen Areal 2 und 3 des Duodenums, mit jeweils einer tendenziell höheren Zellzahl in Areal 2. Weitere Unterschiede waren nummerischer Art (siehe Anhang Tabelle 9.14). Das horizontale Verteilungsmuster war auf nummerischer Ebene dem der Kontrolltiere ähnlich mit einer Abnahme der Zellzahl von kranial nach kaudal in nahezu allen Arealen und Lokalisationen, wobei Duodenum und Jejunum sich stets besonders stark unterschieden. Statistisch ergaben sich keine signifikanten 89 4 ERGEBNISSE Unterschiede. Vergleiche mit dem Ileum konnten statistisch nicht angestellt werden, bestanden in den meisten Fällen jedoch nummerisch. Die Darstellung der p-Werte erfolgt in den Tabellen 9.14 und 9.15 im Anhang. Aus den Abbildungen 4.20 und 4.21 werden das horizontale und vertikale Verteilungsmuster deutlich. 4.3.3.3 Gruppenvergleich Wie Tabelle 4.6 zeigt, ergab der Vergleich der Gruppenmediane eine nummerische Erhöhung der Zellzahl in der Gruppe der IBD-Tiere im Vergleich mit den Kontrolltieren, mit Ausnahme des Areals 2 des Ileums. Signifikante Unterschiede konnten für das Jejunum, bezogen auf die die Kryptgesamtzellzahl sowie in Areal 3 gezeigt werden. Im Areal 1 des Duodenums und Areal 2 des Jejunums zeichneten sich jeweils tendenzielle Unterschiede mit einer höheren Zahl von IgG-Plasmazellen in der Gruppe der IBD-Tiere ab. Bei der Untersuchung der verschiedenen Darmlokalisationen insgesamt wurde für das Jejunum ein signifikanter, für den Darm insgesamt ein tendenzieller Unterschied, mit jeweils höherer Dichte von IgGPlasmazellen in der Gruppe der IBD-Tiere festgestellt. Die Ergebnisse hierfür können der Tabelle 4.7 entnommen werden. Abbildung 4.21 stellt neben der horizontalen Verteilung auch den Vergleich beider Gruppen grafisch dar. Die p-Werte der Einzelvergleiche können Tabelle 9.16 im Anhang entnommen werden. 90 4 ERGEBNISSE Tabelle 4.6: IgG-Plasmazellen: Ergebnisse der morphometrischen Untersuchung Median der gemessenen Zellzahlen/ 10.000 µm2 Lamina propria (P25; P75) KONTROLLTIERE DUODENUM 0,67 1 (0,36; 1,26) 2 3 4 3 4 KOLON 0,16 0,00 _ (0,07; 0,89) (0,00-0,46) 2,04 0,58 (0,30; 1,98) 0,06 0,00 (0,00; 0,92) (0,00; 0,28) 1,02 0,35 (0,30; 2,08) (0,15; 1,15) a (0,76; 3,91) 2 ILEUM (0,51; 3,36) 2,35 1 IBD-TIERE a JEJUNUM b c 0,82 0,78 (0,00;1,50) (0,51; 1,21) 0,21 0,64 (0,00; 1,06) (0,39; 1,38) 0,80 0,64 (0,00; 1,23) (0,39; 1,38) 0,97 1,18 _ (0,73; 1,76) (0,51; 2,46) 5,67 1,59 (0,81; 6,77) (1,43; 5,05) 1,12 0,96 (0,09; 2,27) (0,43; 1,95) 3,97 2,19 (0,96; 4,40) (0,96; 3,00) d b c d 0,36 1,80 (0,27; 1,84) (1,25; 2,49) 1,02 0,85 (0,39; 3,00) (0,67; 1,37) 1,02 1,16 (0,39; 3,00) (0,86; 1,99) 1: Areal 1 (Zotten); 2: Areal 2 (obere Kryptregion); 3: Areal 3 (untere Kryptregion); 4: Kryptregion insgesamt; Nur signifikante Differenzen zwischen den Gruppen sind dargestellt; a-d zeigen statistisch relevante Differenzen; hellgraue Felder: Tendenzen p ≤ 0,1; dunkelgraue Felder: Signifikanzen p ≤ 0,05; P25: 25% Quartil; P75: 75% Quartil; -: im Kolon ist kein Areal 1 (Zotten) vorhanden Tabelle 4.7: IgG-Plasmazellen: Ergebnisse der morphometrischen Untersuchung mit Darstellung der Mittel über die Lokalisationen Median der gemessenen Zellzahlen/ 10.000 µm2 Lamina propria (P25; P75) DUODENUM K IBD JEJUNUM 0,93 0,27 (0,31; 1,93) (0,12; 1,09) 3,43 1,80 (0,88; 4,43) (0,94; 4,15) ILEUM a a DÜNNDARM KOLON 0,61 0,74 0,64 (0,00; 0,91) (0,35-2,08) (0,39; 1,38) 1,07 2,94 1,16 (0,43; 2,82) (1,02; 4,67) (0,86; 1,99) DARM 0,73 (0,31; 1,55) 2,42 (0,98; 4,12) Nur signifikante Differenzen zwischen den Gruppen sind dargestellt; a zeigt statistisch relevante Differenzen; hellgraue Felder: Tendenzen p ≤ 0,1; dunkelgraue Felder: Signifikanzen p ≤ 0,05; K: Kontrollgruppe; IBD: Gruppe der IBD-Tiere; P25: 25% Quartil; P75: 75% Quartil 91 b b 4 ERGEBNISSE 20 K1 Kontrolltiere Kontrolltiere (K) IBD-Tiere (CIE) CIE-Tiere 18 Maximum 16 75%Quartil Median 14 Anzahl IgG+ Zellen K1 25%Quartil CIE7 12 Minimum K2 K2 10 CIE1 8 CIE2 6 K5 K9 K1 CIE2 K9 4 K8 K1 K2 K9 2 K2 p ≤ 0,05 K3 p ≤ 0,05 0 D1 D2 D3 J1 J2 J3 D1: Duodenum Areal 1 D2: Duodenum Areal 2 D3: Duodenum Areal 3 J1: Jejunum Areal 1 J2: Jejunum Areal 2 J3: Jejunum Areal 3 J2\3: Jejunum Areal 2+3/3= Gesamtzellzahl der Kryptregion IL1: Ileum Areal 1 IL2: Ileum Areal 2 IL3: Ileum Areal 3 C2: Kolon Areal 2 C3: Kolon Areal 3 IL1 IL2 IL3 C2 C3 angegeben sind ausschließlich signifikante/ tendenzielle Unterschiede zwischen den Gruppen J2\3: Lokalisation Abbildung 4.20: Darstellung der Anzahl von IgG-Plasmazellen in den untersuchten Lokalisationen und Vergleich der Gruppe der Kontrolltiere mit der Gruppe der IBD-Tiere Abbildung 4.20 zeigt für beide Gruppen die höheren Zellzahlen im Areal 2 in Vergleich zu den Arealen 1 und 3, wodurch ein rautenförmiges Verteilungsmuster entsteht (siehe hierzu auch Abbildung 4.18). Ferner werden die höheren Zellzahlen in nahezu allen untersuchten Lokalisationen für die Gruppe der IBD-Tiere deutlich. Signifikant höhere Zellzahlen bei den IBD-Tieren ergaben sich in Lokalisationen des Jejunums (J3 und J2+J3) Tendenzen der Zunahme von IgG-Plasmazellen wurden in den Lokalisationen D1 und J2 beobachtet. 92 4 ERGEBNISSE 34 K1 KKontrolltiere (K) 32 CIE IBD-Tiere (CIE) CIE7 30 Maximum 28 75%Quartil 26 Median 24 Anzahl IgG+ Zellen K2 25%Quartil 22 Minimum 20 18 16 14 12 10 K9 K1 8 p ≤ 0,05 6 K1 4 p ≤ 0,1 angegeben sind ausschließlich signifikante/ tendenzielle Unterschiede zwischen den Gruppen 2 0 Duodenum Jejunum Ileum Dünndarm Kolon Colon Darm Angabe der Gesamtzellzahl pro untersuchter Lokalisation Lokalisation Abbildung 4.21: Darstellung der Gesamtzahlen von IgG-Plasmazellen in den untersuchten Lokalisationen und Vergleich der Gruppe der Kontrolltiere mit der Gruppe der IBDTiere Abbildung 4.21 stellt die Abnahme der Dichte von IgG-Plasmazellen vom Duodenum in Richtung der kaudalen Dünndarmabschnitte und des Kolons bei beiden Gruppen heraus. In der Gruppe der Kontrolltiere zeigt das Ileum leicht höhere Zahlen als das Jejunum, während bei den IBD-Tieren der kontinuierliche Abfall der Zellzahl von kranial nach kaudal dargestellt ist. Darüber hinaus wird die höhere Zahl von IgG-Plasmazellen in der Gruppe der IBD-Tiere in allen untersuchten Lokalisationen deutlich. Signifikant höhere Zellzahlen für die IBD-Tiere waren im Jejunum zu verzeichnen. Für den Darm insgesamt zeichnete sich eine Tendenz ab. 93 4 ERGEBNISSE 4.3.4 IgM-Plasmazellen 4.3.4.1 Verteilung von IgM-Plasmazellen innerhalb der Gruppe der Kontrolltiere Wie Abbildung 4.22 zeigt, ergab die Untersuchung des vertikalen Verteilungsmusters für alle untersuchten Lokalisationen des Dünndarms eine kontinuierliche, signifikante Zunahme der Zellzahl von den Zotten in Richtung der Krypten. Dabei unterschieden sich sowohl alle einzelnen Areale voneinander als auch die Zotten von der Kryptgesamtzellzahl. Auch im Kolon konnte eine signifikante Zunahme von IgM-Plasmazellen von Areal 2 in Richtung des Areals 3 beobachtet werden, so dass für alle untersuchten Lokalisationen eine signifikante Zunahme der Anzahl von IgM-Plasmazellen von proximal nach distal festgestellt werden konnte. Die Ergebnisse der Einzelvergleiche sind in Tabelle 9.17 im Anhang dargestellt. Abbildung 4.24 zeigt die vertikale Verteilung der IgM-Plasmazellen für beide Gruppen. Abbildung 4.22: Vertikales Verteilungsmuster der Darmlokalisationen der Kontrolltiere IgM-Plasmazellen in den untersuchten Bei der Untersuchung des horizontalen Verteilungsmusters (siehe Abbildung 4.23) zeigte sich im Dünndarm eine kontinuierliche, signifikante Abnahme der Zellzahl vom Duodenum in Richtung Ileum. Ferner ergab auch die Untersuchung der Zellzahlen der einzelnen Areale für alle Lokalisationen signifikante Unterschiede mit einer Abnahme der Zellzahl von kranial nach kaudal. Ausnahmen bildeten die Zotten von Jejunum und Ileum sowie die tiefen Kryptregionen von Duodenum und Jejunum, deren Zellzahl sich jeweils nicht signifikant voneinander unterschied. Darüber hinaus kam es zu einer signifikanten Abnahme der Zellzahl 94 4 ERGEBNISSE vom Dünndarm zum Kolon, so dass für den gesamten Darm eine Abnahme der Zellzahl von kranial nach kaudal festgestellt werden konnte. Die p-Werte der Einzelvergleiche können für beide Gruppen der Tabelle 9.18 im Anhang entnommen werden. Abbildung 4.25 enthält eine grafische Darstellung des horizontalen Verteilungsmusters der beiden Gruppen. Abbildung 4.23: Horizontales Verteilungsmuster der Darmlokalisationen der Kontrolltiere IgM-Plasmazellen in den untersuchten 4.3.4.2 Verteilung von IgM-Plasmazellen innerhalb der Gruppe der IBD-Tiere Das vertikale Verteilungsmuster entsprach im Wesentlichen dem der Kontrolltiere mit einer signifikanten Zunahme der Zahl von IgM+ Zellen von proximal nach distal. Im Unterschied zu den Kontrolltieren handelte es sich jedoch statistisch um eine diskontinuierliche Zunahme, da sich die Areale 2 und 3 des Duodenums und Jejunums jeweils nicht signifikant voneinander unterschieden. In jedem Fall konnte ein signifikanter Anstieg der Zellzahl beim Vergleich der Zotte mit der Kryptregion insgesamt beobachtet werden. Der Vergleich der Lokalisationen mit dem Ileum war aus statistischen Gründen nicht möglich. Nummerisch kam es jedoch auch in dieser Lokalisation beim Vergleich der Zotten mit der Kryptregion insgesamt zu einer Zunahme der Zellzahl. Die Untersuchung des horizontalen Verteilungsmusters ergab, wie bei den Kontrolltieren, eine signifikante Abnahme der Zellzahl vom Dünndarm in Richtung Kolon. Der Vergleich der einzelnen Areale erbrachte nummerische Abnahmen von kranial nach kaudal bei den Tieren mit IBD. 95 4 ERGEBNISSE 4.3.4.3 Gruppenvergleich Der Vergleich der beiden Gruppen ergab ein sehr heterogenes Bild. Wie Tabelle 4.8 zeigt waren in einigen Lokalisationen nummerische Erhöhungen der Anzahl von IgM-Plasmazellen in der Gruppe der IBD-Tiere zu beobachten, in einigen Lokalisationen jedoch auch Erniedrigungen oder keine Unterschiede zur Gruppe der Kontrolltiere. Statistisch existierten zwischen beiden Gruppen keinerlei signifikante Unterschiede. Die Ergebnisse der morphometrischen Untersuchung können der Tabelle 4.8 und 4.9 entnommen werden. Ferner sind die p-Werte der Einzelvergleiche der Tabelle 9.19 im Anhang zu entnehmen. Die Abbildung 4.25 zeigt die horizontale Verteilung von IgM-Plasmazellen innerhalb der Gruppen sowie den Vergleich der beiden Gruppen miteinander. 96 4 ERGEBNISSE Tabelle 4.8: IgM-Plasmazellen: Ergebnisse der morphometrischen Untersuchung Median der gemessenen Zellzahlen/ 10.000 µm2 Lamina propria KONTROLLTIERE (P25; P75) DUODENUM JEJUNUM ILEUM KOLON 1,97 0,33 0,25 _ (0,98; 4,19) (0,08; 0,92) (0,14; 0,50) 1 2 3 4 9,40 5,81 3,98 0,63 (5,49; 11,86) (1,92; 7,64) (1,24; 4,54) (0,51; 1,13) 14,02 11,30 7,17 1,81 (9,24; 15,73) (7,44; 13,88) (3,16; 10,11) (1,65; 2,77) 10,70 8,64 4,64 1,47 (9,03; 14,00) (5,00; 11,65) (2,36; 7,78) (1,14; 1,78) _ IBD-TIERE 1 2 3 4 1,63 0,70 0,23 (0,22; 3,26) (0,44; 1,61) (0,00; 0,56) 13,06 2,84 0,18 0,70 (6,33; 14,92) (2,08; 4,01) (0,00; 2,35) (0,36; 1,05) 15,14 8,63 7,03 1,52 (9,84; 15,93) (5,70; 9,24) (3,97; 10,22) (1,22; 2,47) 13,36 5,01 4,44 1,06 (8,08; 17,00) (4,07; 7,32) (2,12; 6,99) (0,92; 1,62) 1: Areal 1 (Zotten); 2: Areal 2 (obere Kryptregion); 3: Areal 3 (untere Kryptregion); 4: Kryptregion insgesamt; 25% Quartil; P75: 75% Quartil; -: im Kolon ist kein Areal 1 (Zotten) vorhanden Tabelle 4.9: IgM-Plasmazellen: Ergebnisse der morphometrischen Untersuchung mit Darstellung der Mittel über die Lokalisationen Median der gemessenen Zellzahlen/ 10.000 µm2 Lamina propria (P25; P75) DUODENUM K IBD JEJUNUM DÜNN- ILEUM DARM KOLON DARM 7,85 5,86 3,14 6,33 1,47 5,54 (6,86; 9,95) (3,33; 7,91) (1,62; 5,46) (4,31; 6,95) (1,14; 1,78) (3,87; 5,95) 9,31 3,42 2,96 6,77 1,06 5,33 (5,93; 11,33) (3,10; 5,13) (1,45; 4,73) (4,52; 7,22) (0,92; 1,62) (3,59; 5,87)) K: Kontrolltiere; IBD: IBD-Tiere; P25: 25% Quartil; P75: 75% Quartil 97 4 ERGEBNISSE 24 KKontrolltiere (K) 22 CIE IBD-Tiere (CIE) CIE5 20 Maximum CIE5 75%Quartil 18 Median Anzahl IgM+ Zellen 16 25%Quartil 14 Minimum 12 10 8 D1: Duodenum Areal 1 D2: Duodenum Areal 2 D3: Duodenum Areal 3 J1: Jejunum Areal 1 J2: Jejunum Areal 2 J3: Jejunum Areal 3 IL1: Ileum Areal 1 IL2: Ileum Areal 2 IL3: Ileum Areal 3 C2: Kolon Areal 2 C3: Kolon Areal 3 6 4 K3 2 0 D1 D2 D3 J1 J2 J3 IL1 IL2 IL3 C2 C3 Lokalisation Abbildung 4.24: Darstellung der Anzahl von IgM-Plasmazellen in den untersuchten Lokalisationen und Vergleich der Gruppe der Kontrolltiere mit der Gruppe der IBD-Tiere Abbildung 4.24 zeigt die für beide Gruppen zutreffende deutliche Zunahme der IgM produzierenden Plasmazellen von den Zotten (Areal 1) in Richtung der Kryptregion (Areal 2 und Areal 3). Zwischen beiden Gruppen waren keinerlei statistisch relevante Unterschiede evident. 98 4 ERGEBNISSE 14 CIE5 KKontrolltiere (K) CIE IBD-Tiere (CIE) 12 Maximum 75%Quartil Anzahl IgM+ Zellen 10 Median 25%Quartil 8 Minimum 6 4 K6 2 0 Duodenum Jejunum Ileum Dünndarm Colon Kolon Darm Angabe der Gesamtzellzahl pro untersuchter Lokalisation Lokalisation Abbildung 4.25: Darstellung der Gesamtzahlen von IgM+ Zellen in den untersuchten Lokalisationen und Vergleich der Gruppe der Kontrolltiere mit der Gruppe der IBD-Tiere Abbildung 4.25 zeigt die deutliche Abnahme der Zahl von IgM-Plasmazellen von kranial nach kaudal über alle Lokalisationen von Dünndarm und Kolon hinweg. Unterschiede zwischen den Gruppen konnten auch hier nicht festgestellt werden. 99 4 ERGEBNISSE 4.3.5 L1+ Zellen 4.3.5.1 Verteilung von L1+ Zellen innerhalb der Gruppe der Kontrolltiere Sowohl die Untersuchung der vertikalen Verteilung als auch die der horizontalen Verteilung ließ keinerlei regelmäßiges Muster erkennen. Die statistische Auswertung erbrachte keine signifikanten oder tendenziellen Unterschiede zwischen den untersuchten Arealen oder Lokalisationen. Die Ergebnisse der morphometrischen Untersuchung können der Tabelle 4.10 und der Tabelle 4.11 entnommen werden. Darüber hinaus sind die Ergebnisse in den Abbildungen 4.26 und 4.27 für beide Gruppen grafisch dargestellt. Eine Darstellung der pWerte der Einzelvergleiche in vertikaler und horizontaler Richtung ist den Tabellen 9.20 und 9.21 im Anhang zu entnehmen. 4.3.5.2 Verteilung von L1+ Zellen innerhalb der Gruppe der IBD-Tiere Ebenso wie in der Gruppe der Kontrolltiere ergaben sich für die vertikale Verteilung wie für die horizontale Verteilung keinerlei statistische oder nummerische Unterschiede, so dass auch hier kein spezifisches Verteilungsmuster ausgemacht werden konnte. Eine tabellarische Darstellung der p-Werte der Vergleiche in vertikaler und horizontaler Richtung kann für beide Gruppen den Tabellen 9.20 und 9.21 im Anhang entnommen werden. Aus den Abbildungen 4.26 und 4.27 ergeben sich die Zahlen der L1+ Zellen bei den Kontroll- und bei den IBDTieren. 4.3.5.3 Gruppenvergleich Der in Tabelle 4.10 dargestellte paarweise Gruppenvergleich ergab in den meisten Fällen eine nummerische Erniedrigung der Anzahl L1+ Zellen in der Gruppe der IBD-Tiere im Vergleich zur Gruppe der Kontrolltiere. Statistisch zeigte Areal 3 des Kolons eine signifikante Erniedrigung der Anzahl L1+ Zellen in der Gruppe der IBD-Tiere sowie tendenziell geringere Zellzahlen für die Areale 2 des Duodenums und Jejunums, die Kryptregion des Duodenums und die Gesamtzellzahl über den gesamten Darm gemittelt. Die Ergebnisse der morphometrischen Untersuchung zeigen die Tabellen 4.10 und 4.11 sowie die Abbildungen 4.26 und 4.27. Die p-Werte der Vergleiche zwischen den Gruppen sind in Tabelle 9.22 im Anhang dargestellt. 100 4 ERGEBNISSE Tabelle 4.10: L1+ Zellen: Ergebnisse der morphometrischen Untersuchung Median der gemessenen Zellzahlen/ 10.000 µm2 Lamina propria KONTROLLTIERE (P25; P75) 1 JEJUNUM ILEUM KOLON 0,35 1,25 1,68 _ (0,28; 2,52) (0,46; 3,22) (0,55; 3,15) 1,26 2 (0,40; 2,60) 3 1,35 0,56 (0,28; 1,86) (0,39; 1,62) 0,67 0,79 1,03 (0,24; 1,81) (0,70; 1,53) 0,75 0,90 0,74 (0,63; 1,83) (0,45; 1,68) (0,58; 1,83) 0,61 0,51 1,12 _ (0,42; 1,84) (0,18; 1,77) (0,59; 1,88) 0,26 b a 0,37 (0,12; 0,93 c 0,84 0,62 (0,66; 1,66) (0,14; 137) 0,29 0,67 0,79 0,45 (0,00; 0,61) (0,17; 0,89) (0,00; 2,33) (0,13; 0,58) 0,22 4 c (0,30; 1,87) (0,07; 0,45) 3 0,94 (0,66; 1,88) 0,34 (0,41; 1,63) 2 a (0,23; 0,84) 0,87 4 1 IBD-TIERE DUODENUM (0,13; 0,78) b 0,52 1,55 0,60 (0,14; 0,91) (0,33; 2,72) (0,20; 1,01) d d 1: Areal 1 (Zotten); 2: Areal 2 (obere Kryptregion); 3: Areal 3 (untere Kryptregion); 4: Kryptregion insgesamt; Nur signifikante Differenzen zwischen den Gruppen sind dargestellt; a-d zeigen statistisch relevante Differenzen; hellgraue Felder: Tendenzen p ≤ 0,1; dunkelgraue Felder: Signifikanzen p ≤ 0,05; P25: 25% Quartil; P75: 75% Quartil; -: im Kolon ist kein Areal 1 (Zotten) vorhanden Tabelle 4.11: L1+ Zellen: Ergebnisse der morphometrischen Untersuchung mit Darstellung der Mittel über die Lokalisationen Median der gemessenen Zellzahlen/ 10.000 µm2 Lamina propria (P25; P75) DUODENUM K IBD JEJUNUM ILEUM DÜNNDARM KOLON 0,81 1,12 0,91 1,37 0,74 (0,38; 2,07) (0,57; 1,94) (0,74; 2,15) (0,83; 3,69) (0,58; 1,83) 0,66 0,68 1,41 0,82 0,60 (0,25; 0,94) (0,17; 0,95) (0,42; 2,45) (0,62; 0,94) (0,20; 1,01) DARM 1,29 (0,82; 2,97) 0,70 (0,57; 1,05) Nur signifikante Differenzen zwischen den Gruppen sind dargestellt; a gibt einen statistisch signifikanten Unterschied an; hellgraue Felder: Tendenzen p ≤ 0,1; K: Kontrollgruppe; IBD: Gruppe der IBD-Tiere; P25: 25% Quartil; P75: 75% Quartil 101 a a 4 ERGEBNISSE 15 14 K Kontrolltiere (K) K7 CIE IBD-Tiere (CIE) 13 Anzahl AnzahlMyeloid/Histiocyte der L1 + Zellen Antigen+ Zellen Maximum 12 K2 75%Quartil 11 K4 10 K6 K6 K2 9 Median 25%Quartil K2 K6 Minimum K7 8 7 K6 K4 K6 CIE7 CIE4 6 5 4 CIE8 K11 3 CIE4 2 D1: Duodenum Areal 1 D2: Duodenum Areal 2 D3: Duodenum Areal 3 D2\3: Duodenum Areal 2+3/2= Gesamtzellzahl der Kryptregion J1: Jejunum Areal 1 J2: Jejunum Areal 2 J3: Jejunum Areal 3 IL1: Ileum Areal 1 IL2: Ileum Areal 2 IL3: Ileum Areal 3 C2: Kolon Areal 2 C3: Kolon Areal 3 CIE5 p ≤ 0,05 1 p ≤ 0,05 0 D1 D2 D2\3: Abbildung: 4.26: D3 J1 J2 J3 IL1 IL2 IL3 C2 C3 angegeben sind ausschließlich signifikante/tendenzielle Unterschiede zwischen den Gruppen Lokalisation Darstellung der Anzahl von L1+ Zellen in den untersuchten Lokalisationen und Vergleich der Gruppe der Kontrolltiere mit der der IBD-Tiere Abbildung 4.26 zeigt die häufigen Erniedrigungen der Gruppenmediane in der Gruppe der IBD-Tiere (graue Boxplots). Signifikant niedrigere Zellzahlen in der Gruppe der IBD-Tiere ergaben sich für die tiefen Kryptregionen des Kolons (Areal C3). Tendenzen zeigten sich für Lokalisationen des Duodenums (D2 und D2+3) und Jejunums (J2). 102 4 ERGEBNISSE 10 KKontrolltiere (K) K7 K2 9 Maximum K4 8 Anzahl Zellen Anzahl Myeloid/Histiocyte+ der L1 + Zellen CIE IBD-Tiere (CIE) K6 75%Quartil K6 Median 7 25%Quartil 6 Minimum 5 4 CIE4 3 CIE4 CIE4 CIE7 p ≤ 0,05 2 p ≤ 0,1 angegeben sind ausschließlich signifikante/tendenzielle Unterschiede zwischen den Gruppen 1 CIE3 0 Duodenum Jejunum Ileum Dünndarm Colon Kolon Darm Angaben in Gesamtzellzahl pro untersuchter Lokalisation Abbildung 4.27: Darstellung der Gesamtzahlen von L1+ Zellen in den untersuchten Lokalisationen und Vergleich der Gruppe der Kontrolltiere mit der der IBD-Tiere Aus Abbildung 4.27 wird die tendenziell niedrigere Zellzahl im Darm insgesamt für die Gruppe der IBD-Tiere deutlich. 103 4 ERGEBNISSE 4.3.6 Zusammenfassung der Ergebnisse der computergestützten Morphometrie 4.3.6.1 Verteilungsmuster von Immunzellen in der Lamina propria Der Vergleich der Verteilungsmuster von CD3+ Zellen und Plasmazellen ergab jeweils gegensätzliche Verteilungen. Während CD3+ Zellen vorwiegend in den Zotten bzw. im Kolon in den lumennahen Abschnitten der Lamina propria lokalisiert waren und in Richtung der tieferen Kryptbereiche abnahmen, zeigten Plasmazellen ein gegensätzliches Verhalten mit zunehmend höherer Dichte in den tiefen Kryptregionen des Dünndarmes und des Kolons (Ausnahme: IgG+ Zellen mit größter Dichte in Areal 2). Darüber hinaus wurde eine Zunahme von CD3+ Zellen vom Duodenum in Richtung der kaudalen Dünndarmabschnitte nachgewiesen, während die Dichte der Plasmazellen allgemein im Duodenum am größten war und nach kaudal hin abnahm. Das Verteilungsmuster der betreffenden Zellen war dabei für Kontrolltiere und IBD-Tiere weitgehend gleich. Entsprechend der Ergebnisse waren in den Zotten die CD3+ Zellen und in den Krypten die IgA-Plasmazellen der jeweils vorherrschende Zelltypus in der Mukosa. Der zweithäufigste Plasmazelltyp waren die IgM produzierenden Plasmazellen. IgG-Plasmazellen kamen nur vereinzelt in der Lamina propria vor. Für die nur spärlich in der Mukosa L1+ vorkommenden Zellen konnte kein regelmäßiges Verteilungsmuster ermittelt werden. 4.3.6.2 Vergleich der Kontrolltiere mit den IBD-Tieren Insgesamt wurde ein Anstieg von CD3+ Zellen, IgA-Plasmazellen sowie IgG-Plasmazellen bei Katzen mit lymphoplasmazellulärer Enteritis im Vergleich zu darmgesunden Katzen festgestellt. Besonders klare Unterschiede ergaben sich für das Duodenum und Jejunum sowie bei der Betrachtung des gesamten Dünndarmes und des Darmes insgesamt. Im Duodenum ergaben sich in der Gruppe der IBD-Tiere signifikant mehr CD3+ Zellen sowie statistisch tendenziell mehr IgA-Plasmazellen. Für IgG-Plasmazellen konnte zumindest ein nummerischer Anstieg verzeichnet werden. Im Jejunum wurden signifikant mehr IgGPlasmazellen sowie tendenziell höhere Zellzahlen von IgA-Plasmazellen bei den IBD-Tieren im Vergleich zu den Kontrolltieren festgestellt. CD3+ Zellen zeigten hier nur nummerisch höhere Zellzahlen bei den IBD-Katzen. Die Ergebnisse für das Ileum waren sehr variabel. Es konnten jedoch keine statistisch relevanten Unterschiede festgestellt werden. Im Kolon fanden sich nummerische Anstiege von IgA-Plasmazellen, ansonsten waren auch hier die Ergebnisse sehr indifferent. 104 4 ERGEBNISSE Der Dünndarm insgesamt wies eine signifikante Erhöhung von IgA-Plasmazellen, sowie nummerische Erhöhungen bei CD3+ Zellen und IgG-Plasmazellen in der Gruppe der IBDFälle auf. Bei der Betrachtung des Darmes in seiner Gesamtheit ließ sich in der Gruppe der IBD-Tiere für CD3+ Zellen ein nummerischer Anstieg ablesen, für IgA-Plasmazellen ergab sich eine signifikant höhere Dichte und für IgG-Plasmazellen waren tendenziell höhere Zahlen bei den IBD-Tieren evident. Die Anzahl der IgM-Plasmazellen differierte zwischen beiden Gruppen kaum. L1+ Zellen zeigten in vielen Lokalisationen niedrigere Zellzahlen bei den IBD-Tieren. Im Duodenum und Jejunum bestanden statistisch tendenziell geringere Zahlen an L1+ Zellen in den Kryptregionen, und im Kolon wurde eine signifikant geringere Zahl an L1+ Zellen festgestellt. Für den Darm als Ganzes konnte ebenfalls eine signifikant geringere Dichte von L1+ Zellen bei den IBD-Tieren nachgewiesen werden. Insgesamt nahmen demnach CD3+Zellen, IgA- und IgG-Plasmazellen in der Gruppe der IBDTiere in verschiedenen Lokalisationen zu. Dabei zeigten, in absoluten Zahlen, die IgAPlasmazellen den stärksten zahlenmäßigen Anstieg, gefolgt von CD3+ Zellen. Der Anstieg von IgG-Plasmazellen am Gesamtanstieg dieser drei Immunzelltypen bei den IBD-Tieren war in absoluten Zahlen am geringsten. Festzuhalten ist jedoch, dass die Zahl von IgGPlasmazellen relativ zu ihrem spärlichen Vorkommen in der Lamina propria bei den Kontrolltieren im Vergleich zu den IgA-Plasmazellen und den CD3+ Zellen bei den IBDTieren am stärksten zugenommen hatte. 4.3.7 Korrelationen zwischen histopathologischen und morphometrischen Befunden Die Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung der Gewebeproben von Tieren mit lymphoplasmazellulärer Enteritis ergaben für 7 von 9 Bioptaten aus dem Duodenum und für alle Bioptate aus dem Jejunum eine verstärkte Infiltration mit Lymphozyten und Plasmazellen. Korrespondierend dazu konnten in den morphometrischen Untersuchungen signifikant mehr CD3+ Zellen, IgA-Plasmazellen und/oder IgG-Plasmazellen in den Lokalisationen Duodenum und Jejunum bei den IBD-Tieren nachgewiesen werden. Hingegen zeigten 3 von 4 Bioptaten aus dem Ileum erkrankter Tiere histologisch keine diffus verstärkte Infiltration der Lamina propria. Somit ergab sich bei der morphometrischen Untersuchung kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Gruppen. Entsprechendes galt für die Bioptate des Kolons. Histologisch zeigten hier 5 von 8 Kolonbioptaten keine allgemein 105 4 ERGEBNISSE erhöhte Zelldichte der Lamina propria. Korrespondierend dazu konnte in der morphometrischen Untersuchung keine signifikante Erhöhung von Immunzellen in der Gruppe der IBD-Tiere gezeigt werden. 106 5 Diskussion Ziel der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung und Quantifizierung von CD3+ TZellen, L1+ Zellen sowie Plasmazellen (IgA-, IgG-, IgM- produzierende Plasmazellen) mittels immunhistochemischer Methoden und computergestützter Morphometrie an transmuralen Bioptaten des Intestinaltraktes von Katzen mit Inflammatory Bowel Disease (IBD) im Vergleich zu darmgesunden Hauskatzen. Die Ergebnisse dieser Studie sollen einen Beitrag zur Aufklärung der Immunpathogenese der IBD bei der Katze leisten. Bisher gibt es im einschlägigen Schrifttum nur zwei Publikationen, die das Vorkommen, die Verteilung und die Zahl von Leukozyten im Dünndarm gesunder Katzen beschreiben (ROCCABIANCA et al. 2000; WALY et al. 2001). Eine Charakterisierung und Quantifizierung der Immunzellpopulationen in der Mukosa des Intestinaltraktes an IBD erkrankter Katzen ist bislang nur ansatzweise erfolgt. WALY et al. (2004) verglichen mittels immunhistochemischer Färbungen und computergestützter Morphometrie die Verteilung und Anzahl verschiedener Immunzellen im Duodenum spezifisch pathogenfreier Katzen mit denjenigen von Katzen mit IBD. Bislang gab es keine publizierten Untersuchungen, in denen die Verteilung und Anzahl von T-Zellen, Plasmazellen und Makrophagen mittels immunhistochemischer Methoden und computergestützter Morphometrie qualitativ und quantitativ in transmuralen Bioptaten aller Dünndarmabschnitte und des Kolons von Katzen mit Inflammatory Bowel Disease im Vergleich zu darmgesunden Hauskatzen charakterisiert wurde. 107 5 DISKUSSION 5.1 Alter, Rasse und histopathologische Veränderungen Die bislang publizierten Untersuchungen über die Leukozytenpopulationen in der intestinalen Mukosa von Kontrollkatzen im Vergleich zu Katzen mit IBD wurden teils an transmuralen, teils an endoskopisch gewonnenen Proben durchgeführt, die ausschließlich aus dem Duodenum stammten (WALY et al. 2004). In der vorliegenden Arbeit wurden erstmals verschiedene Dünndarmabschnitte und das Kolon von Katzen mit der lymphoplasmazellulären Form der IBD im Vergleich zu darmgesunden Kontrolltieren untersucht. Dazu wurden ausschließlich intra operationem gewonnene, transmurale Bioptate von 12 klinisch und histologisch darmgesunden Katzen und von 9 Katzen mit chronischen idiopathischen entzündlichen Enteropathien verwendet. Die Kontrolltiere waren aufgrund extraintestinaler Erkrankungen während der Operation euthanasiert worden. Die Tiere der Kontrollgruppe hatten ein durchschnittliches Alter von 7,3 Jahren (3 bis 12 Jahre). Bei den Katzen mit IBD erfolgte die Bioptatentnahme aus diagnostischen Gründen. Die Tiere hatten ein durchschnittliches Alter von 8,5 Jahren (2 bis 12 Jahre). Aus der Literatur ist bekannt, dass IBD gehäuft bei Katzen mittleren bis hohen Alters auftritt. Eine Rasse- oder Geschlechtsprädisposition besteht den meisten Autoren zufolge nicht (TAMS 1986a, 1987, 2003; DENNIS et al. 1992, 1993; JERGENS et al. 1992; MÜNSTER 1995, MENESES et al. 2003; WALY et al. 2004). Das durchschnittliche Alter der Katzen aus der IBD Gruppe der vorliegenden Studie entspricht mit 8,5 Jahren einem mittleren Alterssegment und somit den Altersangaben in der Literatur. Anhaltspunkte für eine Rasseoder Geschlechtsprädisposition ergaben sich aus den Untersuchungsergebnissen dieser Arbeit nicht. Die histopathologische Untersuchung der Bioptate erfolgte an Hämatoxylin und Eosin (HE) gefärbten Paraffinschnitten anhand eines histologischen Beurteilungs- und Graduierungsschemas. Im Rahmen dieser Studie wurde dieses Schema, in Anlehnung an die von ROTTER (2005), BILZER (2006) und MÜNSTER et al. (2006) für den Hund publizierten Kriterien für die histomorphologischen Gegebenheiten am felinen Intestinaltrakt modifiziert. Die histopathologische Untersuchung der Kontrolltiere ergab vereinzelt geringgradig vermehrt Lymphozyten und Plasmazellen in Dünndarmsegmenten oder im Kolon. Diese 108 5 DISKUSSION wurden jedoch nicht von deutlichen Architekturveränderungen begleitet. Aus der Literatur ist bekannt, dass derartige Infiltrate von Entzündungszellen bei der Katze vorkommen können und vermutlich Ausdruck der normalen Immunantwort gegenüber verschiedenen Stimuli durch Nahrungsantigene oder der mikrobiellen Flora sind (WILCOCK 1992; JERGENS 2002, 2003). Im Gegensatz dazu zeigten 8 von 9 Tieren mit IBD in allen untersuchten Darmabschnitten histopathologische Veränderungen, die in allen Fällen durch Läsionen der Gewebearchitektur wie Zottenatrophie, Kryptverluste, Epithelveränderungen sowie Ödeme, Infiltrationen und/oder Fibrosen der Lamina propria und zum Teil durch ein deutlich vermehrtes Entzündungszellinfiltrat gekennzeichnet waren. Ein Tier wies im Duodenum histologisch keine abweichenden Befunde auf, alle übrigen Darmsegmente zeigten jedoch die oben genannten Veränderungen. Alle histologischen Veränderungen wurden anhand des entzündlichen Infiltrates als lymphoplasmazelluläre Enteritis bzw. Enterokolitis klassifiziert. Die Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung führten in Zusammenhang mit den klinischen Anzeichen einer chronischen Enteropathie unbekannter Ursache zur Verifizierung der Diagnose der lymphoplasmazellulären Form der Inflammatory Bowel Disease. Die vorliegenden Befunde der histopathologischen Untersuchung entsprechen im Hinblick auf die Abweichungen die Gewebearchitektur den aus der Literatur bekannten histologischen Veränderungen bei LPE und anderen zum Formenkreis der IBD zählenden Erkrankungen bei Katzen und Hunden (BARLOUGH et al. 1981; VAN DER GAAG 1988; VIBE-PETERSEN 1991; WILCOCK 1992; DENNIS et al. 1992, 1993; LECOINDRE u. CHEVALLIER 1997; TAMS 2003; WALY et al. 2004; KLEINSCHMIDT et al. 2006). 5.2 Extraintestinale Erkrankungen In der Literatur wird zwischen der IBD der Katze und extraintestinalen Erkrankungen, insbesondere der Pankreatitis und/oder (Cholangio-) Hepatitis oft ein Zusammenhang hergestellt. Das gehäufte gemeinsame Auftreten dieser drei Erkrankungen hat zu dem Terminus „Triaditis“ geführt (WEISS et al. 1996; WILLARD 1999; SWIFT et al. 2000; RÜST et al. 2005). In der vorliegenden Studie standen von drei Katzen aus der Gruppe der IBD-Tiere außer Gewebeproben aus dem Intestinaltrakt zusätzlich Bioptate aus Leber und Pankreas zur Verfügung. Alle diese Proben wiesen histologisch entzündliche Veränderungen 109 5 DISKUSSION im Sinne der so genannten Triaditis auf. Neben gering- bis mittelgradigen lymphoplasmazellulären Enterokolitiden lagen bei diesen Tieren auch mittel- bis hochgradige Pankreatitiden sowie gering- bis mittelgradige gemischtzellige Hepatitiden vor. Zusätzlich war von einem weiteren Tier ein Pankreasbioptat vorhanden, welches histologischen eine mittelgradige gemischtzellige Pankreatitis aufwies. Obwohl die Fallzahlen der vorliegenden Studie im Hinblick auf die statistische Untersuchung einer Korrelation zwischen lymphoplasmazellulärer Enteritis, Hepatitis und Pankreatitis zu gering sind, ist die Häufung des Zusammentreffens dieser Erkrankungen in der vorliegenden Untersuchung jedoch auffallend. 5.3 Immunhistochemie und Morphometrie In der vorliegenden Arbeit wurden die Anzahl und die topografische Verteilung von T-Zellen, Makrophagen und Plasmazellen in der Lamina propria in den verschiedenen Darmsegmenten des felinen Intestinaltraktes untersucht und miteinander verglichen. Auf diese Weise wurde zunächst die Leukozytenpopulation in der Darmmukosa gesunder Katzen charakterisiert und quantifiziert. Anschließend wurden die Ergebnisse mit denen im Intestinaltrakt von Katzen mit Inflammatory Bowel Disease verglichen. Die Untersuchung erfolgte mittels Immunhistochemie und computergestützter Morphometrie. Der Begriff Morphometrie bezeichnet im Allgemeinen die Charakterisierung von Objekten durch Maßzahlen. Im Rahmen der Untersuchung der Leukozytenpopulation im Intestinaltrakt von Hunden bedienten sich mehrere Untersucher der manuellen Morphometrie. Hierbei wurde innerhalb eines definierten Gewebebereiches eine manuelle respektive visuelle Zählung immunhistochemisch gefärbter Zellen vorgenommen (YAMASAKI et al. 1996; STONEHEWER et al. 1998; JERGENS et al. 1999). Andere Untersucher verwendeten die so genannte computergestützte Morphometrie, eine automatisierte pixelbasierte Zellzählung, bei der Digitalaufnahmen der betreffenden Gewebeareale mit Hilfe eines Computerprogramms ausgewertet und immunhistochemisch positiv gefärbte Zellen des Bereiches gezählt wurden (GERMAN et al. 1999a, 1999b, 2000b, 2001). WALY et al. (2001, 2004) wandten diese Technik erstmals zur immunhistochemischen Charakterisierung der Leukozytenpopulation des felinen Dünndarmes und jener des Duodenums von Katzen mit IBD an. Die Vorzüge der Methode liegen in ihrer Automatisierbarkeit, ihrer Geschwindigkeit und der Kontinuität der 110 5 DISKUSSION Ergebnisse. Diese Vorteile könnten im Rahmen der histopathologischen Untersuchung von Bioptaten von Katzen und Hunden mit Verdacht auf chronische idiopathische Enteropathien von großem Nutzen sein. So erfolgt bis heute die Diagnostik der IBD überwiegend auf der Basis von semiquantitativen, mehr oder weniger subjektiven Dichteschätzungen von Entzündungszellen in der Lamina propria. Wie bereits erwähnt, wurden im Hinblick auf die Beurteilung der Bioptate teils erhebliche Diskrepanzen zwischen verschiedenen Untersuchern festgestellt (WILLARD et al. 2002). Die Definition der Leukozytenpopulation der Lamina propria von Katzen mit Inflammatory Bowel Disease mit Hilfe immunhistochemischer Färbemethoden und computergestützter Morphometrie könnte die Diagnosestellung der IBD objektivierbar machen und darüber hinaus neue Einblicke in die Pathogenese der Erkrankung bieten (WALY et al. 2004). 5.3.1 Anzahl und Verteilungsmuster von CD3+ T-Lymphozyten Die vorliegende Studie untersuchte Anzahl und Verteilungsmuster von CD3+ T-Lymphozyten am Intestinaltrakt von gesunden Hauskatzen und von Tieren mit Inflammatory Bowel Disease. In beiden Gruppen war die Zahl von CD3+ T-Zellen in den Dünndarmzotten am größten und nahm in Richtung der tieferen Kryptregion ab. Entsprechend sank die Zahl dieser Zellen im Kolon von den lumennahen Bereichen in Richtung der distal gelegenen Kryptbereiche signifikant. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit den Arbeiten anderer Autoren, die mittels immunhistochemischen und morphometrischen Methoden Vorkommen und Verteilung von CD3+ T-Zellen am Intestinaltrakt von Katzen und Hunden untersuchten (ELWOOD et al. 1997; JERGENS et al. 1998b; GERMAN et al. 1999a; WALY et al. 2001, 2004; KLEINSCHMIDT et al. 2006). Die starke Präsenz von CD3+ T-Zellen in der Lamina propria der Zotten könnte möglicherweise dadurch begründet sein, dass die T-Zellantwort von der Antigenpräsentation durch den MHC-II-Rezeptor antigenpräsentierender Zellen (APC) abhängt. Untersuchung von WALY et al. (2001) ergaben, dass Zellen mit hoher MHC-IIExpression bei der Katze offensichtlich Makrophagen und dendritische Zellen sind, deren Zahl ebenfalls in der Lamina propria der Zotten am größten ist und in Richtung der Kryptregion abnimmt (WALY et al. 2001). Darüber hinaus zeigte die Untersuchung eine hohe positive Korrelation zwischen dem Vorkommen von MHC-II+ Zellen und der Anzahl von T- 111 5 DISKUSSION Zellen (WALY et al. 2001). Die starke Präsenz von T-Zellen in den Zotten ist damit möglicherweise Folge der Aktivierung durch dendritische Zellen nach der Antigenaufnahme, -prozessierung und –präsentation an naive T-Zellen oder T-Effektorzellen in diesem Bereich. Hier bleibt allerdings die Frage offen, wie Antigene durch das Epithel in die Lamina propria der Zotten gelangen. Immunhistochemische und morphometrische Untersuchungen beim Hund zeigten, dass MHC-II-Rezeptoren bei dieser Spezies auch von intestinalen Epithelzellen exprimiert werden, welche möglicherweise Antigene aus dem Lumen aufnehmen und an darunter liegende APCs präsentieren (ELWOOD et al. 1997; GERMAN et al. 1998). Bei der Katze exprimieren intestinale Epithelzellen den MHC-II-Rezeptor offenbar nicht konstitutiv, die Expression kann jedoch anscheinend induziert werden (WALY et al. 2001, 2004). Weitere Untersuchungen zur MHC-II-Expression intestinaler Epithelzellen bei der Katze könnten für das Verständnis der Antigenaufnahme und –präsentation im felinen Intestinaltrakt hilfreich sein. Hinsichtlich der horizontalen Verteilung der T-Zellen ergab sich in dieser Studie in der Gruppe der Kontrolltiere eine signifikante Zunahme der T-Zellzahlen vom Duodenum in Richtung des Ileums sowie signifikant mehr Zellen im Dünndarm im Vergleich zum Kolon. Im Gegensatz dazu unterschieden sich in der Gruppe der IBD-Tiere die einzelnen Abschnitte des Dünndarmes nicht signifikant voneinander. Die Ergebnisse bei den Kontrolltieren stimmen mit den Resultaten von WALY et al. (2001) am Dünndarm von gesunden, spezifisch pathogenfreien Katzen überein. Die Autoren untersuchten ebenfalls mittels immunhistochemischer Methoden und computergestützter Morphometrie die Leukozytenverteilung und fanden, entsprechend den Ergebnissen der vorliegenden Studie, eine signifikante Zunahme der Zahl von CD3+-T-Lymphozyten vom Duodenum in Richtung des Ileums. In der betreffenden Arbeit wurden jedoch nur Dünndarmabschnitte untersucht, so dass über die Verteilung im Kolon bislang nichts bekannt war. Möglicherweise steht die zunehmende Zahl von T-Lymphozyten in Richtung der kaudalen Dünndarmabschnitte in Zusammenhang mit einer ansteigenden Dichte der bakteriellen Darmflora in Richtung des Ileums (SMITH 1965). Eine nähere Charakterisierung der T-Zellsubtypen könnte möglicherweise weitere Rückschlüsse auf die funktionelle Bedeutung des vorliegenden Verteilungsmusters zulassen. 112 5 DISKUSSION Im Gegensatz zu den Ergebnissen der vorliegenden Studie und den Untersuchungen von WALY et al. (2001) wurden in anderen Arbeiten mittels immunhistochemischer und morphometrischer Methoden am Dünndarm von Hunden im Hinblick auf die Zahl von CD3+T-Zellen keine Unterschiede zwischen verschiedenen Dünndarmabschnitten festgestellt (ELWOOD et al. 1997; KLEINSCHMIDT et al. 2006). Untersuchungen von GERMAN et al. (1999a) zeigten mittels immunhistochemischer Färbung und computergestützter Morphometrie am kaninen Intestinaltrakt sogar signifikant mehr CD3+ T-Zellen im Duodenum im Vergleich zu Jejunum und Kolon. Möglicherweise bestehen im Hinblick auf die Zahl von T-Lymphozyten im Intestinaltrakt speziesbedingte Unterschiede zwischen Katzen und Hunden. Derartige speziesbedingte Unterschiede wurden bereits im Rahmen immunhistochemischer und morphometrischer Untersuchungen am Intestinaltrakt von Katzen und Hunden für einige andere Zellen beschrieben. So zeigten, wie erwähnt, intestinale Epithelzellen bei der Katze im Gegensatz zum Hund keine konstitutive Expression von MHC-II-Rezeptoren. Andererseits ist die Zahl intraepithelialer Lymphozyten bei der Katze offensichtlich erheblich höher als die beim Hund (WALY et al. 2001; GERMAN et al. 1999a). Außerdem kommen CD3+ T-Zellen in der Lamina propria der Katze anscheinend in geringerer Dichte vor als dies beim Hund der Fall ist (WALY et al. 2001; GERMAN et al. 1999a). Diese Befunde zeigen, dass speziesbedingte Unterschiede durchaus eine mögliche Ursache für die unterschiedlichen Verteilungsmuster von CD3+ T-Lymphozyten im intestinalen Schleimhautimmunsystem von Katzen und Hunden sein könnten. Andererseits wären auch unterschiedliche Detektionstechniken und Einstellungen im Rahmen der computergestützten Morphometrie als Ursache für die Diskrepanzen denkbar. Während die Zahl von CD3+ T-Lymphozyten in den vorliegenden Untersuchungen bei den Kontrolltieren vom Duodenum in Richtung des Ileums signifikant zunahm, ergaben sich bei den IBD-Tieren keine signifikanten Unterschiede zwischen den Darmabschnitten. Möglicherweise deutet dies auf unterschiedliche topografische Verteilungen der CD3+ TLymphozyten bei Katzen mit IBD im Vergleich zu gesunden Individuen hin. Vermutlich handelt es sich hierbei um ein Epiphänomen, welches durch eine Erhöhung der Anzahl von CD3+ T-Lymphozyten in einzelnen Darmabschnitten entstehen könnte und so zu einer 113 5 DISKUSSION Verschiebung der topographischen Verteilung dieser Zellen im Intestinaltrakt führen könnte. Vergleiche mit Angaben aus der Literatur sind nicht möglich, da derart ausführliche Untersuchungen über das Verteilungsmuster von Leukozyten an verschiedenen Darmsegmenten bei Katzen mit IBD im Vergleich zu darmgesunden Tieren bislang nicht existierten. Die Quantifizierung von CD3+ T-Zellen in der Mukosa gesunder Kontrolltiere ergab Unterschiede zwischen den Ergebnissen dieser Arbeit und Untersuchungen anderer Autoren. WALY et al. (2001, 2004) ermittelten in zwei Studien an spezifisch pathogenfreien Katzen höhere Zahlen für CD3+ T-Zellen als in der vorliegenden Studie. Unter Umständen sind auch hier unterschiedliche Detektionseinstellungen der computergestützten Morphometrie Grund für die differierenden Ergebnisse. Jedoch könnte auch die Verwendung unterschiedlicher Kontrolltiere Ursache der Diskrepanzen sein. WALY et al. (2001) untersuchten Bioptate des Intestinaltraktes spezifisch pathogenfreier Katzen im Alter zwischen 16 und 18 Monaten. Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Kontrolltiere stammten aus dem Patientengut einer Klinik und hatten ein durchschnittliches Alter von 7,3 Jahren. Bei diesen Tieren handelte es sich um klinisch und histologisch darmgesunde Hauskatzen. Möglicherweise unterscheidet sich die Immunzellpopulation von Hauskatzen von derjenigen spezifisch pathogenfreier Katzen aufgrund genotypischer Variabilität und/oder von Haltungsbedingungen und Unterschieden in der intestinalen und/oder der sie umgebenden Flora (NGUYEN et al. 2006). Ferner könnte auch das Alter der Tiere einen Einfluss auf die Untersuchungsergebnisse haben. Untersuchungen an transmuralen Bioptaten aus dem Intestinaltrakt von darmgesunden Hunden zeigten eine altersabhängige Reduktion der Zahl von CD3+ T-Zellen in der Lamina propria älterer Tiere (KLEINSCHMIDT et al. 2006). Auch aus Studien am menschlichen Intestinaltrakt sind entsprechende altersbedingte Abnahmen der T-Zellzahl bekannt (DUNLOP et al. 2004). Es ist nicht auszuschließen, dass eine alterbedingte, geringere Expression von zellulären Adhäsionsmolekülen wie MAdCAM-1 und anderen Molekülen zu einem gestörten Homing mit der Folge einer reduzierten Zahl von T-Zellen in der Lamina propria von älteren Tieren führen könnte, wie dies bereits für die Ratte beschrieben wurde (SCHMUCKER et al. 2002) Da die Kontrollkatzen in der vorliegenden Studie im Vergleich zu den Kontrolltieren aus der Untersuchung von WALY et al. (2004) wesentlich älter waren, 114 5 DISKUSSION wäre eine altersbedingte Reduktion der T-Zellzahl eine mögliche Erklärung für diese Diskrepanzen. 5.3.2 Quantitative Untersuchungen von CD3+ T-Lymphozyten bei Katzen mit IBD im Vergleich zu darmgesunden Kontrolltieren Der Vergleich der Zahl von CD3+ T-Lymphozyten der Lamina propria ergab signifikant mehr CD3+ T-Zellen im Duodenum der Katzen mit lymphoplasmazellulärer Enterokolitis im Vergleich zu darmgesunden Kontrolltieren. Dieses Ergebnis entspricht den Daten von Untersuchungen an endoskopisch gewonnenen Bioptaten aus Duodenum und Kolon von Hunden mit Inflammatory Bowel Disease (STONEHEWER et al. 1998; JERGENS et al. 1999; GERMAN et al. 2000b). Die Autoren stellten mittels immunhistochemischer Färbungen und teils manueller, teils computergestützter Morphometrie Erhöhungen der Anzahl von CD3+ T-Lymphozyten in der Darmmukosa von Hunden mit lymphoplasmazellulärer Enteritis bzw. Kolitis und histiozytärer ulzerativer Kolitis fest. Im Gegensatz dazu fanden WALY et al. (2004) in ihrer immunhistochemischen und morphometrischen Untersuchung an Bioptaten aus dem Dünndarm von Katzen bezüglich der Anzahl von CD3+ T-Zellen keine Unterschiede zwischen spezifisch pathogenfreien Kontrolltieren und Tieren mit Inflammatory Bowel Disease. Die Autoren machten jedoch keine Angaben über die Form der Inflammatory Bowel Disease und sprachen im Rahmen der Auswertung histopathologischer Befunde lediglich von zellulärer Infiltration. Im Rahmen der vorliegenden Untersuchungen wurden jedoch ausschließlich Tiere mit der lymphoplasmazellulären Form der Inflammatory Bowel Disease verwendet. Außer der Gruppe der erkrankten Tiere unterschieden sich, wie bereits angesprochen, auch die Kontrollgruppen hinsichtlich ihres Alters und ihrer Umweltbedingungen voneinander. Der Status spezifischer Pathogenfreiheit sowie das Alter der Kontrolltiere könnten einen Einfluss auf die Ergebnisse haben. Darüber hinaus unterschied sich auch die Art des Bioptatmaterials von Kontrolltieren und IBD-Tieren. Bei dem von WALY et al. (2004) verwendeten Kontrollgewebe handelte es sich um post mortem gewonnene, transmurale Proben. Das Bioptatmaterial erkrankter Tiere wurde in vivo endoskopisch entnommen. Bei der Entnahme von Proben mittels Endoskopie können jedoch Probleme hinsichtlich der Vollständigkeit und Orientierung der Proben, insbesondere in der Kryptregion, durch das Instrumentarium und die 115 5 DISKUSSION Technik auftreten (GERMAN et al. 2001). Für die computergestützte Morphometrie sind diese Parameter jedoch offensichtlich entscheidende Einflussgrößen. So ergaben sich in einer immunhistochemischen und morphometrischen Studie von GERMAN et al. (2001) an Bioptaten des Intestinaltraktes von Hunden mit chronischen idiopathischen Enteropathien und Kontrollhunden im Hinblick auf die Zellzahlen für T-Zellen, Plasmazellen, L1+ Zellen u.a. bei endoskopischen Proben im Vergleich zu laparotomisch entnommenen Bioptaten zum Teil unterschiedliche Resultate. KLEINSCHMIDT et al. (2006) zeigten in einer Studie an Bioptaten aus dem Intestinaltrakt von Hunden mit Symptomen chronischer gastrointestinaler Erkrankungen, dass bei transmuralen Bioptaten im Gegensatz zu endoskopisch gewonnenen Gewebeproben in der Mehrzahl der Fälle histologisch eine definitive Diagnose gestellt werden kann. Im Rahmen der vorliegenden Studie wurden daher ausschließlich intra operationem entnommene transmurale Biopate verwendet. Insgesamt zeigte die vorliegende Untersuchung eine erhöhte Anzahl von T-Zellen im Duodenum der IBD Tiere. Wie oben erwähnt, besteht eine hohe Korrelation zwischen der Expression von MHC-II-Rezeptoren an der Oberfläche antigenpräsentierender Zellen und den durch sie aktivierten T-Zellen. MHC-II+ Zellen kommen anscheinend gehäuft an Orten mit hohem Antigenkontakt wie den Zotten vor. Entsprechend ist auch die Zahl der T-Zellen in den Zotten am größten (WALY et al. 2001). Verschiedene Untersuchungen am Intestinaltrakt von Katzen und Hunden zeigten insgesamt signifikant mehr MHC-II+ Zellen bei Tieren mit IBD (GERMAN 2000b; WALY et al. 2004). Eine erhöhte Zahl MHC-II+ antigenpräsentierenden Zellen in Verbindung mit einer höheren Dichte von CD3+ TLymphozyten in der Lamina propria von Katzen mit IBD könnte auf eine Immunreaktion gegenüber luminalen Antigenen hindeuten. Weiterhin könnte die erhöhte Zahl von CD3+ T-Lymphozyten eine Verschiebung der TH2 Immunantwort im Darm zu einer vermehrt TH1 dominierten Reaktion widerspiegeln, wie dies bereits für IBD des Menschen vermutet wird (BRANDTZAEG 2001a). Als Auslöser einer solchen entzündlichen Reaktion ist eine Typ IV Hypersensivitätsreaktion (verzögerter, Typ, zellvermittelte Allergie) nicht auszuschließen. Bei dieser Reaktion setzen durch Antigene sensibilisierte T-Lymphozyten bei erneutem Antigenkontakt zahlreiche proinflammatorische Zytokine frei, die chemotaktisch zur Emigration weiterer Immunzellen wie Lymphozyten, 116 5 DISKUSSION Plasmazellen und Makrophagen führen. Entsprechende proinflammatorische Zytokine wurden bereits in der Darmmukosa von Hunden mit IBD nachgewiesen (GERMAN et al. 2000c). Die lymphoplasmazellulären Infiltrate bei der LPE und LPK der Katze könnten somit ein TH1 dominiertes Entzündungszellinfiltrat widerspiegeln. Allerdings muss erwähnt werden, dass in der vorliegenden Untersuchung signifikante Erhöhungen von T-Lymphozyten nur im Duodenum bzw. in den Kryptbereichen des Duodenums gefunden wurden. In Abschnitt 5.4 werden die erhöhten Zahlen von CD3+ T-Lymphozyten im Kontext der weiteren Untersuchungsergebnisse dargestellt und dort gemeinsam diskutiert. Im Rahmen zukünftiger Untersuchungen wäre die nähere Charakterisierung der verschiedenen Subtypen von T-Lymphozyten in der Lamina propria des Intestinaltraktes von Katzen mit IBD von Interesse. So zeigten Untersuchungen von MAUL et al. (2005) über regulatorische T-Lymphozyten in der Lamina propria des Darms beim Menschen erhöhte Zahlen an regulatorischen T-Zellen, so genannten FOX-P3+ bzw. CD25+-regulatorischen-TZellen, in der Mukosa von IBD Patienten im Vergleich zu gesunden Individuen. Den Autoren zufolge spielen diese Zellen eine Rolle bei der Prävention oder Hemmung entzündlicher Reaktionen bei IBD. Aus ihren Ergebnissen folgern sie, dass Kompensationsmechanismen des intestinalen Immunsystems bei IBD fehlschlagen könnten. Neben Veränderungen der Leukozytenzahl spielen im Rahmen der Immunpathogenese der IBD des Menschen offenbar auch Funktionsstörungen von Zellen eine Rolle. Eine Studie von BRIMNES et al. (2005) ergab, dass regulatorisch wirkende CD8+ Zellen bei gesunden Individuen die Immunglobulinproduktion innerhalb der Lamina propria hemmen. CD8+ Zellen aus der Lamina propria von Patienten mit Morbus Crohn oder ulzerativer Kolitis wiesen diese suppressorische Eigenschaft nicht auf. Diese Beispiele zeigen, dass es weiterer Untersuchungen der verschiedenen T-Zellsubtypen und ihrer Funktion bei Katzen mit IBD zur Klärung der Immunpathogenese dieses Krankheitskomplexes bedarf. 117 5 DISKUSSION 5.3.3 Anzahl und Verteilungsmuster von Plasmazellen Die Anzahl und das Verteilungsmuster von IgA, IgM und IgG produzierenden Plasmazellen wurden mittels immunhistochemischer und morphometrischer Methoden bei Katzen mit lymphoplasmazellulärer IBD im Vergleich zu gesunden Kontrolltieren untersucht. Zahlenmäßiges Verhältnis der Plasmazellen zueinander Insgesamt zeigten die Untersuchungsergebnisse der vorliegenden Studie in beiden Gruppen, dass Immunglobulin A produzierende Plasmazellen der zahlenmäßig dominierende Zelltyp unter den Plasmazellen ist, gefolgt von IgM-Plasmazellen. In beiden Gruppen kamen IgGPlasmazellen nur vereinzelt in der Lamina propria vor. Zu diesem Ergebnis kamen auch andere Autoren, die mittels immunhistochemischer und morphometrischer Methoden die Anzahl und die Verteilung von Plasmazellen in der Lamina propria des Intestinaltraktes bei Katzen und Hunden untersuchten (VIBE-PETERSEN 1991; JERGENS et al. 1996; GERMAN et al. 1999a; WALY et al. 2001, 2004). Horizontale Verteilung der Plasmazellen im Darm Die Zahl aller Plasmazellisotypen war in der vorliegenden Untersuchung im Duodenum am größten und nahm in Richtung der kaudalen Dünndarmabschnitte ab. Für die IgMPlasmazellen wurde darüber hinaus eine signifikant größere Zahl im Dünndarm gegenüber dem Kolon festgestellt. Im Hinblick auf dieses Verteilungsmuster verhielten sich beide Gruppen weitgehend gleich. Auch dieses Ergebnis steht im Einklang mit den aus der Literatur über das Schleimhautimmunsystem im Darm von Hunden bekannten Daten (HART 1979; WILLARD et al. 1982; JERGENS et al. 1998; GERMAN et al. 1999; KLEINSCHMIDT et al. 2006). Eine mögliche Ursache für die in kaudaler Richtung auftretende Abnahme der Plasmazellzahl könnte eine abnehmende Antigenlast vom Duodenum in Richtung des Ileums durch die zunehmende Lyse und den Abbau von Antigenen aus der Ingesta sein. Demgegenüber stellten WALY et al. (2001) für IgM und IgG produzierende Plasmazellen bei der Katze keine signifikanten Unterschiede zwischen einzelnen Dünndarmabschnitten fest. Die Autoren berichteten sogar über einen Trend zur Erhöhung der Anzahl von IgAPlasmazellen in Richtung des Ileums. Die differierenden Ergebnisse könnten, entsprechend den Unterschieden bei den CD3+ T-Zellen, durch die Unterschiede beim Kontrollmaterial oder durch unterschiedliche Detektionseinstellungen bedingt sein (siehe Abschnitt 5.3.2.). 118 5 DISKUSSION Vertikale Verteilung der Plasmazellen im Darm Die vertikale Verteilung der Plasmazellen innerhalb der Mukosa zeigt bei IgA und Immunglobulin M produzierenden Plasmazellen weitgehende Übereinstimmung, während sich das Verteilungsmuster der Immunglobulin G-Plasmazellen hiervon leicht unterschied. Die Anzahl der IgA- und IgM-Plasmazellen zeigte einen signifikanten Anstieg in Richtung der distalen Kryptbereiche mit der stärksten Präsenz in Areal 3 (tiefe Kryptregion). Dieses Verteilungsmuster galt für beide Gruppen gleichermaßen. Diese Ergebnisse für das vertikale Verteilungsmuster von IgA- und IgM-Plasmazellen entsprechen den Untersuchungsergebnissen anderer Autoren, die Plasmazellen in der intestinalen Mukosa von Katzen und Hunden mit semiquantitativen oder morphometrischen Methoden detektierten (WILLARD et al. 1982; GERMAN et al. 1999a; JERGENS et al. 1999; WALY et al. 2001; KLEINSCHMIDT et al. 2006). Anders als die IgA- und die IgM-Plasmazellen waren IgG-Plasmazellen in der vorliegenden Studie in beiden Gruppen vorwiegend in den oberen Kryptbereichen angesiedelt und ihre Zahl nahm sowohl nach proximal in Richtung der Zotten als auch in distaler Richtung zu den tiefer gelegenen Kryptbereichen hin signifikant ab. Damit ergab sich für die IgG-Plasmazellen ein rautenförmiges Verteilungsmuster innerhalb der Mukosa. Entsprechend war auch die Zahl von IgG-Plasmazellen im Kolon in der proximalen Kryptregion größer als im distalen Kryptbereich. Ein derartiges Verteilungsmuster wurde in der Literatur bisher nicht beschrieben. Die meisten Untersuchungen, welche mittels morphometrischer Methoden das Verteilungsmuster der IgG-Plasmazellen am Intestinaltrakt von Hunden untersuchten, konnten weder innerhalb der Mukosa noch zwischen einzelnen Darmabschnitten signifikante Unterschiede in der Zellzahl feststellen (GERMAN et al. 1999a; KLEINSCHMIDT et al. 2006). Allerdings beschrieben GERMAN et al. (1999a) und VIBE-PETERSEN (1991), dass IgG-Plasmazellen im Vergleich zur Lamina propria der Zotten vermehrt in den basalen Bereichen vorkommt. Auch WALY et al. (2001, 2004) konnten bei ihren morphometrischen Untersuchungen an gesunden Kontrollkatzen keinerlei Unterschiede zwischen verschiedenen Bereichen der Mukosa oder den Abschnitten des Intestinaltraktes ermitteln. Allerdings gilt auch hier wieder der Verweis auf die Kontrolltiere der Untersuchungen, die sich von den im Rahmen dieser Untersuchung verwendeten zum Teil deutlich unterschieden (siehe Abschnitt 5.3.2). Unterschiede zwischen der vorliegenden Arbeit und den Untersuchungen von 119 5 DISKUSSION GERMAN et al. (1999a) und KLEINSCHMIDT et al. (2006) am kaninen Intestinaltrakt könnten auf speziesspezifische Unterschiede im Hinblick auf das Vorkommen und die Verteilung IgG produzierender Plasmazellen im Intestinaltrakt von Katzen und Hunden hindeuten (siehe Abschnitt 5.3.1). Andererseits kann nicht ausgeschlossen werden, dass diese Diskrepanzen durch technische Unterschiede bei der Detektion entstanden sein könnten. Die Verteilung und das zahlenmäßige Verhältnis der drei untersuchten Plasmazell-Isotypen stehen möglicherweise in engem Zusammenhang mit ihrer Funktion bzw. der Funktion der von ihnen produzierten Antikörper. Die Immunantwort des intestinalen Schleimhautimmunsystems beruht schwerpunktmäßig auf einer TH2 dominierten humoralen Immunantwort mit der Produktion von Immunglobulin A (ALLENSPACH u. GASCHEN 2003). Sekretorisches IgA tritt, verbunden durch ein als J-Kette bezeichnetes Peptid, als Dimer auf. Diese J-Kette wird ebenfalls von der Plasmazelle gebildet und ermöglicht die Bindung der dimeren sekretorischen IgA-Antikörper an die so genannte sekretorische Komponente, ein Molekül, welches an der basolateralen Membran von intestinalen Epithelzellen exprimiert wird (DOE 1989; JANEWAY u. TRAVERS 2002). Die so gebundenen Antikörper werden in zytoplasmatischen Vesikeln transzytoplasmatisch bis zur apikalen Membran transportiert und hier ins Darmlumen freigesetzt (BRANDTZAEG et al. 1989). Die sekretorische Komponente stabilisiert die Polymere und schützt sie vor enzymatischer Spaltung (DOE 1989; JANEWAY u. TRAVERS 2002). Die J-Ketten ermöglichen auch die Polymerisierung von IgM-Antikörpern zu einem Pentamer und die Bindung an die sekretorische Komponente von Epithelzellen. Auf diese Weise ist auch sekretorisches IgM in der Lage ins Darmlumen zu gelangen (DOE 1989). Sekretorisches Immunglobulin A aggregiert sehr effektiv Antigene im Darmlumen und hindert diese somit an der Kontaktaufnahme mit und am Eindringen in die Mukosa. Damit bildet Immunglobulin A an der mukosalen Oberfläche die so genannte “first line of defence“ (BRANDTZAEG 1995). Gleichzeitig hat Immunglobulin A im Gegensatz zu anderen Antikörper-Isotypen keine opsonisierende Wirkung für zytotoxische T-Zellen oder Makrophagen und vermag auch nicht die Komplementkaskade zu aktivieren (DOE 1989). Hierdurch schützt die vorwiegend Immunglobulin A vermittelte Immunantwort des intestinalen Immunsystems die Mukosa auch indirekt, indem keine starken Entzündungsreaktionen durch die zelluläre Immunantwort ausgelöst werden. Dies wäre möglicherweise eine Erklärung für die mit Abstand vor den 120 5 DISKUSSION anderen Plasmazell-Isotypen vorherrschende Präsenz der IgA-Plasmazellen in der Mukosa der untersuchten Kontrollkatzen. Gleichzeitig erklärt diese Hypothese, warum IgG produzierende Plasmazellen möglicherweise nur sehr vereinzelt in der Mukosa gesunder Katzen und Hunde, aber auch der des Menschen vorkommen. Als Teil der zellulären Immunantwort opsonisiert IgG Antigene für B-Zellen, T-Zellen und Makrophagen und kann außerdem die Komplementkaskade auslösen und so Erreger oder infizierte Zellen töten. Dadurch können jedoch auch teils erhebliche Entzündungsreaktionen entstehen (DOE 1989). Dies gefährdet möglicherweise die Aufrechterhaltung der intestinalen Toleranz. Auf der anderen Seite ist Immunglobulin G ein im Gewebe aktiver Antikörper. Durch enzymatische Spaltung verliert er im Darmlumen schnell seine Aktivität (MAYORAL et al. 1996; JANEWAY u. TRAVERS 2002). Diese Ineffektivität von IgG an mukosalen Oberflächen auf der einen und das von diesem Isotyp ausgehende Gefährdungspotential für das intestinale Schleimhautimmunsystem auf der anderen Seite erklärt möglicherweise das äußerst geringe Vorkommen dieses Plasmazell-Isotyps in der intestinalen Mukosa darmgesunder Katzen. Die vermehrte Ansammlung von IgA- und IgM-Plasmazellen in den distalen Kryptbereichen hängt unter Umständen mit einem dort lokalisierten Transportmechanismus zusammen. Intestinale Epithelzellen, insbesondere solche der Kryptregion, exprimieren, wie erwähnt, an ihrer basolateralen Membran die so genannte sekretorische Komponente. Nur dimere Immunglobuline A bzw. polymere Immunglobuline M sind durch die J-Kette in der Lage, an die sekretorische Komponente zu binden. Indes steht dieser Transportmechanismus IgG Antikörpern nicht zur Verfügung (BRANDTZAEG 1995; MOSTOV et al. 1994; LAMM 1998). Verschiedenen Studien am menschlichen Intestinaltrakt und an dem von Ratten zeigen, dass Enterozyten der Kryptregion deutlich mehr sekretorische Komponenten exprimieren als die Epithelzellen der Zotten (BRANDTZAEG et al. 1988; SCHMUCKER et al. 2001; SCHMUCKER et al. 2002). Dies wäre eine mögliche Erklärung dafür, dass IgA- und IgMPlasmazellen im Dünndarm von Katzen vermehrt in den distalen Kryptbereichen vorkommen, nicht aber IgG produzierende Plasmazellen. Quantitative Verteilung von Plasmazellen im Darm Vergleicht man die quantitativen Ergebnisse der vorliegenden Arbeit für Plasmazellen bei den Kontrolltieren mit Untersuchungen anderer Autoren am Intestinaltrakt gesunder Katzen, so 121 5 DISKUSSION zeigte diese Studie vor allem im Duodenum und Jejunum höhere Zahlen für IgA- und IgMPlasmazellen (WALY et al. 2001, 2004). Möglicherweise ist dies die Folge eines altersbedingten Effektes. So zeigten Untersuchungsergebnisse von KLEINSCHMIDT et al. (2006) einen altersabhängigen signifikanten Anstieg der Zahl der IgA produzierenden Plasmazellen in der Lamina propria des Hundes. Unter Umständen könnte dies als Ausdruck einer altersbedingten längeren Antigenexposition gedeutet werden. WALY et al. (2001, 2004) verwendeten, wie erwähnt, spezifisch pathogenfreie Tiere im Alter zwischen 16 bis 18 Monaten. Das durchschnittliche Alter der Kontrolltiere der vorliegenden Studie lag jedoch bei 7,3 Jahren. Insofern könnte ein altersbedingter Anstieg von Immunglobulin A produzierenden Plasmazellen auch bei der Katze nicht ausgeschlossen werden und könnte die Diskrepanzen zwischen den Ergebnissen von WALY et al. (2001, 2004) und den eigenen Resultaten erklären. 5.3.4 Quantitative Untersuchungen von Plasmazellen bei Katzen mit IBD im Vergleich zu darmgesunden Kontrolltieren Neben der Charakterisierung von Quantität und Verteilungsmuster der Plasmazellen wurden in der vorliegenden Arbeit auch Unterschiede der Plasmazellzahlen zwischen den verschiedenen Gruppen untersucht. Die Ergebnisse zeigten in einzelnen Dünndarmabschnitten signifikant mehr IgA- und IgG-Plasmazellen im Intestinaltrakt von Katzen mit Inflammatory Bowel Disease im Vergleich zu gesunden Kontrolltieren. Die Anzahl der IgM-Plasmazellen unterschied sich zwischen den Gruppen nicht signifikant. Zu einem ähnlichen Ergebnis kamen Untersucher an unterschiedlichen Abschnitten des Intestinaltraktes von Hunden mit Inflammatory Bowel Disease (MAYORAL et al. 1996; JERGENS et al. 1999). GERMAN et al (2000b, 2001) zeigten mittels immunhistochemischer und morphometrischer Methoden am Duodenum und Kolon von Hunden mit lymphoplasmazellulärer Duodenitis bzw. HUC jeweils signifikant mehr IgG-Plasmazellen, während IgA- und IgM-Plasmazellen sich nicht signifikant zwischen den Gruppen unterschieden. VIBE-PETERSEN et al. (1991) fanden in einer semiquantitativen Studie Erhöhungen aller drei Isotypen bei Hunden mit lymphoplasmazellulärer Enteritis. Demgegenüber stehen die Ergebnisse einer immunhistochemischen und morphometrischen Untersuchung von WALY et al. (2004) am Duodenum von Katzen mit IBD im Vergleich zu 122 5 DISKUSSION spezifisch pathogenfreien Katzen. Die Autoren berichteten von signifikant mehr IgMPlasmazellen bei IBD-Tieren. Indes ergaben sich den Autoren zufolge im Hinblick auf die Anzahl von CD3+ T-Zellen, IgA- und IgG-Plasmazellen sowie Makrophagen keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen. Insgesamt zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Studie, dass IgA- und IgG-Plasmazellen in der Mukosa von Katzen mit IBD stärker vertreten sind als dies bei gesunden Individuen der Fall ist. Obwohl die Anzahl der IgA-Plasmazellen bei den IBD-Tieren deutlich höher ist als die der IgG-Plasmazellen, stellen diese jedoch den Isotyp mit der proportional stärksten quantitativen Steigerung von den gesunden Katzen zu den IBD- Tieren dar. Möglicherweise kommt es auch bei der LPEK der Katze durch eine vermehrte Sekretion proinflammatorischer Zytokine wie INF-γ oder TNF-α zu einer Verschiebung der Isotypenverhältnisse zugunsten von Immunglobulin G, wie dies bereits beim Menschen beschrieben wurde (BRANDTZAEG et al. 2001a). GERMAN et al. (2001) konnten unter anderem signifikant mehr für INF-γ kodierende mRNA im Intestinaltrakt von Deutschen Schäferhunden mit IBD oder SIBO im Vergleich zu gesunden Kontrolltieren nachweisen. In Anbetracht der Tatsache, dass nur Immunglobulin M und G die Komplementkaskade über den klassischen oder alternativen Weg auslösen können und in der vorliegenden Untersuchung ein Isotypenshift mit vermehrt Immunglobulin G bei IBD-Tieren festgestellt wurde, könnte ein IgG-antikörpervermittelter Gewebeschaden ein möglicher Mechanismus einer perpetuierenden Entzündungsreaktionen sein. Außerdem konnte in der vorliegenden Arbeit in einigen Dünndarmsegmenten ein signifikanter Anstieg der IgA-Plasmazellen bei Tieren mit IBD festgestellt werden. Da Immunglobulin A im Darmlumen agiert und dort Antigene bindet, ist die verstärkte Präsenz von IgA-Plasmazellen in der Lamina propria von Katzen mit IBD möglicherweise als eine gesteigerte Immunantwort auf luminale Antigene interpretierbar. Weiterhin wäre, wie bereits erwähnt (siehe Abschnitt 5.3.2.), eine Hypersensivitätsreaktion vom Typ IV denkbar, bei der durch Antigenkontakt sensibilisierte T-Lymphozyten bei erneutem Zusammentreffen mit ihrem Antigen durch die Sekretion proinflammatorischer Zytokine weitere Immunzellen chemotaktisch anlocken (MAGNE 1992; JANEWAY u. 123 5 DISKUSSION TRAVERS 2002). Auf diese Weise wären die erhöhten Zahlen von IgA- und IgGPlasmazellen in der Lamina propria von Katzen mit LPE und LPK erklärbar. 5.3.5 Verteilungsmuster von L1+ Zellen In der vorliegenden Untersuchung zeigten die Makrophagen respektive die L1+-Zellen eine eher zufällige Verteilung innerhalb der Mukosa. Sie wurden nicht, wie dies für die intestinale Mukosa des Menschen beschrieben wurde, vorwiegend unterhalb des Epithels der Zotten gefunden (NAGASHIMA et al. 1996). Es konnten sowohl in der Gruppe der Kontrolltiere, als auch in der Gruppe der IBD-Tiere keine signifikanten Unterschiede zwischen den Zotten und Kryptbereichen oder zwischen verschiedenen Darmabschnitten festgestellt werden. Zu diesem Ergebnis kamen auch KLEINSCHMIDT et al. (2006) in einer Untersuchung der Leukozytenpopulation von 15 Kontrollhunden verschiedener Alterstufen mittels immunhistochemischer Färbung und computergestützter Morphometrie. Die Autoren fanden in keiner der Altersgruppen eine unterschiedliche Verteilung von Makrophagen innerhalb der Mukosa (vertikale Verteilung) oder zwischen verschiedenen Darmabschnitten (horizontale Verteilung). Über ähnliche Ergebnisse einer immunhistochemischen und morphometrischen Untersuchung am Dünndarm von spezifisch-pathogenfreien Katzen berichten WALY et al. (2001). Dabei gab es ebenfalls keine Unterschiede zwischen den verschiedenen Arealen der Mukosa. Jedoch berichteten die Autoren von signifikant mehr Makrophagen im Ileum im Vergleich zu den anderen Dünndarmabschnitten. Demgegenüber stehen die Ergebnisse von NAGASHIMA et al. (1996) über Makrophagen in der Lamina propria des menschlichen Intestinaltraktes. Die Untersuchungen ergaben, dass die Makrophagen vorwiegend unterhalb des Epithels in den Spitzen der Dünndarmzotten lokalisiert sind. Den Autoren zufolge besteht die Hauptfunktion dieser Makrophagen offensichtlich in der Beseitigung apoptotischer Epithelzellen, außerdem sollen sie eine Beteiligung an der Regulation der Epithelerneuerung sowie antigenpräsentierende Eigenschaften haben. Die unterschiedlichen Ergebnisse im Hinblick auf das Verteilungsmuster von Makrophagen beim Menschen und bei der Katze bzw. beim Hund könnten mit unterschiedlichen, speziesspezifischen Mechanismen des Epithelverlustes zusammenhängen. Bei einigen Spezies wandern die Epithelzellen aus der Proliferationszone in den Krypten innerhalb weniger Tage bis zu den Zottenspitzen, wo es daraufhin zur 124 5 DISKUSSION Apoptose oder Nekrose kommt. Anschließend werden sie entweder ganz oder teilweise ins Darmlumen abgegeben. Diesen Mechanismus des physiologischen Epithelverlustes im Darm konnten CHENG u. LEBLOND (1974) bei der Maus sowie MYKLEBUST u. MAYHEW (1998) für Rentiere und Seehunde zeigen. Die Ergebnisse einer Studie von NAGASHIMA et al. (1996) über die Bedeutung der Makrophagen in der Lamina propria des menschlichen Darms deuten indes auf eine Phagozytose untergehender Epithelzellen in der Zottenspitze durch die Makrophagen hin. Anscheinend werden die Epithelzellen beim Menschen also nicht ins Darmlumen abgeschilfert, sondern von subepithelial lokalisierten Makrophagen phagozytiert. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass sich die Mechanismen des Epithezellverlustes beim Menschen und bei der Katze und dem Hund unterscheiden und dies Auswirkungen auf die Verteilung der Makrophagen innerhalb der Lamina propria hat. Jedoch könnte auch die Verwendung unterschiedlicher Antikörper die Unterschiede zwischen den Untersuchungsergebnissen erklären. Während in den Arbeiten von KLEINSCHMIDT et al. (2006), WALY et al. (2001) und in der vorliegenden Arbeit jeweils ein monoklonaler Antikörper gegen das L1-Antigen auf menschlichen Makrophagen und neutrophilen Granulozyten verwendet wurde, welcher mit Makrophagen von Katzen und Hunden kreuzreagiert, wurden in der Arbeit von NAGASHIMA et al. (1996) mehrere unterschiedliche mono- und polyklonale Antikörper gegen verschiedene Antigene auf Makrophagen verwendet. Darüber hinaus erkennt der in dieser Studie verwendete Antikörperklon MAC 387 gegen das L1 Antigen auf Monozyten anscheinend bei Menschen und Hunden nur unreife Makrophagen (GERMAN et al. 1999a, 2000b). Demnach wäre es denkbar, dass eine nicht detektierte Makrophagensubpopulation unterhalb des Epithels existiert (siehe Abschnitt 5.3.6). Vergleicht man die quantitativen Untersuchungesergebnisse im Hinblick auf die Anzahl der Makrophagen in der Lamina propria, so ergeben sich einige Unterschiede. Die Untersuchungen von WALY et al. (2001) über den Dünndarm der Katze und von GERMAN et al. (1999a) über den Darm beim Hund ergaben im Hinblick auf die L1+ Zellen vergleichsweise höhere Zahlen als in der eigenen Studie. In beiden Arbeiten wurden die Daten, wie auch in der vorliegenden Untersuchung, durch immunhistochemische Färbemethoden und computergestützte Morphometrie ermittelt. Die von WALY et al. (2001) nachgewiesenen höheren Anzahlen von Makrophagen in der Lamina propria von Katzen 125 5 DISKUSSION könnten, wie bereits ausgeführt, mit der Auswahl der Kontrolltiere zusammenhängen (siehe Abschnitt 5.3.2.). Darüber hinaus wäre auch eine altersbedingte Differenz als Erklärung für die unterschiedlichen Daten denkbar. Ergebnisse einer Studie von KLEINSCHMIDT et al. (2006) zeigten eine altersabhängige signifikante Erniedrigung der Makrophagenanzahl in der Lamina propria gesunder Hunde. Da die in dieser Arbeit verwendeten Kontrolltiere erheblich älter als die von WALY et al. (2001) untersuchten Tiere waren, kann ein Einfluss des Alters auf die Ergebnisse auch bei dieser Spezies nicht ausgeschlossen werden. Die unterschiedliche Anzahl von Makrophagen in dieser Arbeit und der Arbeit von GERMAN et al. (1999) in der Lamina propria von Hunden könnten dagegen auf speziesbedingte Unterschiede hindeuten. Jedoch könnten auch verschiedene Detektionseinstellungen bei der computergestützten Morphometrie zu den unterschiedlichen Ergebnissen beigetragen haben. 5.3.6 Quantitative Untersuchungen von L1+ Zellen bei Katzen mit IBD im Vergleich zu darmgesunden Kontrolltieren Der quantitative Vergleich von Makrophagen zwischen den Kontrolltieren und den Katzen mit IBD ergab signifikant weniger L1+-Zellen in den tieferen Kryptbereichen des Kolons in der Gruppe der IBD-Tiere sowie tendenziell weniger Zellen in den oberen Kryptbereichen von Duodenum und Jejunum. Derartige Befunde sind im einschlägigen Schrifttum bisher nicht beschrieben worden. Eine Studie von WALY et al. (2004) an Bioptaten aus dem Duodenum von Katzen mit chronischen idiopathischen Enteropathien ergab keinen Unterschied zwischen Tieren dieser Gruppe und einer Kontrollgruppe von spezifisch pathogenfreien Katzen. Demgegenüber erzielten GERMAN et al. (1999, 2000b) in Untersuchungen am Duodenum von Hunden mit lymphoplasmazellulärer Enteritis und am Kolon von Boxern mit HUC andere Ergebnisse. Beide Untersuchungen ergaben signifikant mehr L1+-Zellen in der Gruppe der Tiere mit LPE bzw. HUC im Vergleich zu Kontrolltieren. Die Gründe für die differierenden Ergebnisse sind unklar, jedoch könnten Spezifitätsunterschiede des Antikörpers eine Rolle spielen. Das humane L1 Protein ist ein zytoplasmatisches kalzium-bindendes Protein mit antimikrobieller und chemotaktischer Wirkung (STEINBAKK et al. 1990; BHARDWAJ et al. 1992). Der Antikörper gegen das L1 Protein markiert bei der Katze Zellen mit den 126 5 DISKUSSION morphologischen Charakteristika von Makrophagen und Monozyten (WALY et al. 2001, 2004). Beim Hund reagiert der Antikörper anscheinend auch mit neutrophilen und möglicherweise auch mit eosinophilen Granulozyten (GERMAN et al. 1999; PEETERS et al. 2005). Bei der Katze sind solche Kreuzreaktionen mit anderen Zellen nicht bekannt. Untersuchungen des Expressionsmusters beim Menschen zeigten eine Expression vorwiegend bei frühen Stadien der Differenzierung mit anschließender Herunterregulierung bei ausgereiften Makrophagen (ZWALDO et al. 1988). In diesem Zusammenhang sind Untersuchungen von GERMAN et al. (2000b) über die HUC von Bedeutung. Bei dieser Erkrankung gibt es Hinweise auf eine progressive Differenzierung von emigrierten Monozyten zu Gewebsmakrophagen, die PAS+ Material enthalten (RUSSEL et al. 1971; GOMEZ et al. 1977). Die Untersuchung von GERMAN et al. (2000b) zeigten bei PAS+ Makrophagen keine L1 Expression, was den Autoren zufolge für eine Ausreifung dieser Zellen spricht. Möglicherweise kommt es auch bei der LPE der Katze zu einer verstärkten Emigration von Monozyten aus dem Blut in das Gewebe mit progressiver Differenzierung zu reifen Makrophagen. Diese These würde die geringere Zahl von L1+-Zellen in dieser Gruppe erklären, da der Antikörper anscheinend nur eine Subgruppe von unreifen Makrophagen detektiert. 5.4 Schlussfolgerungen In dieser Arbeit wurde erstmal eine phänotypische Charakterisierung und Quantifizierung des Entzündungszellinfiltrates in transmuralen Bioptaten aus dem gesamten Darmtrakt von Katzen mit lymphoplasmazellulärer Enteritis und Enterokolitis aus dem Formenkreis der IBD im Vergleich zu darmgesunden Katzen vorgenommen. Dabei wurden die Immunzellen (CD3+ T-Zellen, IgA-, IgG- und IgM-Plasmazellen sowie L1+ Zellen) in Bioptaten von Katzen mit lymphoplasmazellulärer Enterokolitis mit Hilfe computergestützter morphometrischer Methoden quantitativ analysiert und die Ergebnisse mit denen darmgesunder Kontrolltiere verglichen. Die Ergebnisse zeigen einen signifikanten Anstieg von CD3+ T-Lymphozyten sowie IgA- und IgG-Plasmazellen. Die Zahl der IgM-Plasmazellen unterschied sich hingegen in beiden Gruppen kaum. Anscheinend ist dieser Plasmazellisotyp bei der lymphoplasmazellulären Enteritis der Katze von unterordneter Bedeutung. Die Zahl von L1+ Zellen war in der vorliegenden Untersuchung in der Gruppe der Katzen mit LPE und LPK geringer als bei den Kontrolltieren. Der Antikörper weist jedoch möglicherweise nur unreife 127 5 DISKUSSION Makrophagen nach, so dass unter Umständen weitere Makrophagensubtypen in der Lamina propria vorkommen, die von dem verwendeten Antikörper nicht detektiert werden. In der Immunpathogenese der IBD des Menschen spielt ein Shift von einer durch TH2-Zellen vermittelten hin zu einer vermehrt durch TH1 Zellen dominierten Immunantwort eine Rolle (BRANDTZAEG 2001a). Dabei wird anscheinend die vorherrschende regulatorische, durch TH2-Zellen, antiinflammatorische Zytokine und Immunglobulin A Sekretion gekennzeichnete, humorale Immunantwort zugunsten einer zellulären Immunreaktion mit TH1-Zellen zurückgedrängt. Es kommt zu einem Anstieg der Zahl von T-Helfer-Zellen Typ 1 (TH1 Zellen), einer vermehrten Produktion proinflammatorischer Zytokine sowie zu einem Antikörper-Isotypenshift mit vermehrter Produktion von Immunglobulin G (BRANDTZAEG et al. 2001a; ALLENSPACH u. GASCHEN 2003; CAVE 2003). Als Auslöser dieser vermehrt TH1 dominierten Immunantwort wäre auch eine Hypersensivitätsreaktion vom Typ IV mit durch Antigene sensibilisierte T-Zellen denkbar. Die vorliegende Untersuchung konnte in verschiedenen Darmlokalisationen von Katzen mit der lymphoplasmazellulären Entzündungsform der IBD einen Anstieg von CD3+ T-Zellen sowie von IgA- und IgGPlasmazellen zeigen. Die Ergebnisse dieser Untersuchung weisen darauf hin, dass die für die IBD des Menschen angenommenen immunpathologischen Mechanismen auch bei der zum Formenkreis der Inflammatory Bowel Disease der Katze gehörenden lymphoplasmazellulären Enteritis und Kolitis eine Rolle spielen könnten. 128 6 Zusammenfassung Histopathologische, morphometrische und immunhistochemische Untersuchungen zur Phänotypisierung von Immunzellen in Biopsien aus dem Intestinaltrakt von Katzen mit chronischen idiopathischen Darmentzündungen Sina Marsilio Der Begriff „chronische idiopathische Enteropathie“ oder englisch “Inflammatory Bowel Disease“ (IBD) beschreibt einen Krankheitskomplex, welcher durch eine chronische, persistierende oder rezidivierende, klinische gastrointestinale Symptomatik unbekannter Ursache in Zusammenhang mit histologischen Merkmalen einer Darmentzündung gekennzeichnet ist. Die Inflammatory Bowel Disease ist die häufigste Ursache für chronischen Vomitus und Diarrhoe bei der Katze. Obwohl die Ätiologie der IBD bis heute ungeklärt und die Pathogenese nur ansatzweise verstanden ist, gibt es Hinweise dafür, dass möglicherweise luminale Antigene zu einer Dysregulation des intestinalen Schleimhautimmunsystems führen. Dies könnte den Zusammenbruch der intestinalen Toleranz und perpetuierende Entzündungsreaktionen zu Folge haben. Die Diagnose „IBD“ kann nur im Rahmen einer Ausschlussdiagnostik gestellt werden und bedarf stets der Diagnosesicherung durch die histopathologische Untersuchung endoskopischer oder transmuraler Bioptate des Gastrointestinaltraktes. Charakteristisches Merkmal für IBD ist ein erhöhtes Entzündungszellinfiltrat in der Mukosa des Intestinaltraktes. Bislang ist die Charakterisierung der Immunzellpopulationen in der Darmmukosa von an IBD erkrankten Katzen nur ansatzweise erfolgt. Ziel der vorliegenden Studie war die Charakterisierung und Quantifizierung von CD3+ TZellen, Makrophagen sowie Plasmazellen (IgA-, IgG-, IgM- produzierende Plasmazellen) mittels immunhistochemischer Methoden und computergestützter Morphometrie an transmuralen Bioptaten des Intestinaltraktes von Katzen mit lymphoplasmazellulärer Enterokolitis im Vergleich zu klinisch und histologisch darmgesunden Hauskatzen. 129 6 ZUSAMMENFASSUNG In der vorliegenden Arbeit wurden intra operationem entnommene transmurale Bioptate aus verschiedenen Dünndarmsegmenten lymphoplasmazellulärer Enteritis sowie bzw. dem Kolon Enterokolitis von 9 sowie von 12 Tieren mit darmgesunden Kontrolltieren verwendet. Die histopathologische Untersuchung der Bioptate erfolgte an Hämalaun und Eosin (HE) gefärbten Paraffinschnitten. Als Schema für die histologische Beurteilung diente ein, in Anlehnung an Angaben aus dem Schrifttum, im Rahmen dieser Arbeit modifiziertes Beurteilungs- und Graduierungsschema. Die Bioptate der Kontrolltiere wiesen histologisch keinerlei pathomorphologische Befunde auf. Die histopathologische Untersuchung der Katzen mit IBD zeigte, mit Ausnahme einer Lokalisation, in allen Gewebeproben erhöhte lymphoplasmazelluläre Infiltrate und/oder verschiedene Veränderungen der Mukosaarchitektur wie Epithelschädigungen, Abweichungen der Zottenund/oder Kryptmorphologie sowie Veränderungen der Gewebetextur der Lamina propria. Neben einer Darmentzündung wurden in drei Fällen extraintestinale Entzündungserscheinungen des Pankreas und der Leber festgestellt. Mittels immunhistochemischer Färbungen und computergestützter Morphometrie wurde das Infiltrat in Bioptaten von Katzen mit lymphoplasmazellulärer Enterokolitis untersucht und mit den Ergebnissen bei darmgesunden Kontrolltieren verglichen. Die Ergebnisse zeigten für verschiedene Darmlokalisationen einen signifikanten Anstieg von CD3+ T-Lymphozyten sowie IgA- und IgG-Plasmazellen in der Lamina propria von Katzen mit lymphoplasmazellulärer Enterokolitis. Die Zahl der IgM-Plasmazellen unterschied sich zwischen beiden Gruppen kaum. Die Untersuchung von L1+ Zellen ergab in einigen Darmsegmenten bei den IBD-Tieren signifikant weniger Zellen als bei den Kontrolltieren. Die Ergebnisse der vorliegenden Untersuchung weisen darauf hin, dass in der Immunpathogenese der lymphoplasmazellulären Enteritis der Katze möglicherweise ein Shift von einer T-Helfer-Zellen Typ 2 (TH2-Zellen) dominierten Immunantwort hin zu einer vermehrt T-Helfer-Zellen Typ 1 (TH1) dominierten Immunantwort eine Rolle spielen könnte. 130 7 Summary Histopathological, morphometrical and immunohistochemical investigations on the phenotypes of immune cells in intestinal biopsies from cats with chronic inflammatory bowel disease. Sina Marsilio The term “inflammatory bowel disease” (IBD) describes a group of chronic intestinal disorders, which are characterised by persistent or refractory clinical symptoms of gastrointestinal disease of undetermined cause together with histological signs of intestinal inflammation. Inflammatory bowel disease is the most common cause of chronic vomiting and diarrhoea in cats. Although the aetiology of IBD is unknown and its pathogenesis is not completely understood, certain findings indicate that dysregulation of the intestinal immune system may be caused by luminal antigens. This could lead to a breakdown of oral tolerance and ongoing intestinal inflammation. The diagnosis can only be made by ruling out other causes of intestinal inflammation, and has to be confirmed by histopathological examination of endoscopic or full-thickness biopsy specimens. The characteristic histological lesion in IBD is an increased infiltration of the lamina propria with inflammatory cells. So far, the analysis of immune cell populations in the intestinal mucosa of cats with IBD is incompletely characterised. The aim of this study was to characterise and to quantify CD3+ T-cells, macrophages and plasma cells (IgA, IgG and IgM producing plasma cells) by using immunohistochemical methods and computer-aided morphometry in full thickness biopsy specimens from the intestinal tract of cats with lymphocytic-plasmacytic enterocolitis (LPEC) in comparison with clinically and histologically healthy cats. In this study, full-thickness biopsies from the small intestine and colon of 9 cats with LPEC and from 12 cats without clinical or histological signs of gastrointestinal diseases were used. The samples were collected intra operationem at laparotomy. Samples were examined histopathologically on HE stained sections by using a histological grading scheme modified 131 7 SUMMARY according to the literature. The cats of the control group showed no histopathological lesions. Histopathological examination of cats with IBD revealed an increased lymphoplasmacytic infiltration within the mucosal and/or different lesions of the mucosa architecture including changes of the epithelium, disruption of villi or crypts and structural changes of the lamina propria. In addition to intestinal inflammation, pancreatitis and hepatitis was found in three cats. Results obtained by immunohistochemical staining and computer-aided morphometry in cats with IBD were compared with results from control cats. The results showed a significant increase in CD3+ T-cells, IgA plasma cells and IgG plasma cells in cats with IBD. The number of IgM plasma cells did not significantly differ between the two groups. The results for L1+ cells showed significantly lower numbers in cats with IBD in some intestinal segments. The results of this study strongly suggest that a shift in the immune response from a mainly TH2 reaction to a TH1 dominated response might play an important role in the immunopathogenesis of lymphocytic-plasmacytic enterocolitis in cats. 132 8 Literatur ABREU, M. T., P. VORA, E. FAURE, L. S. THOMAS, E. T. ARNOLD u. M. ARDITI (2001): Decreased expression of Toll-like receptor-4 and MD-2 correlates with intestinal epithelial cell protection against dysregulated proinflammatory gene expression in response to bacterial lipopolysaccharide. J. Immunol. 167, 1609-1616 AKIRA, S. (2003): Mammalian Toll-like receptors. Curr. Opin. Immunol. 15, 5-11 ALLENSPACH, K., F. GASCHEN (2003): Chronische Darmerkrankungen beim Hund: Eine Übersicht. Schweiz. Arch. Tierheilk. 145, 209-222 ALLENSPACH, K., J. M. STEINER, B. N. SHAH, N. BERGHOFF, C. RUAUX, D. A. WILLIAMS, J. W. BLUM u. F. 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Immunol. 72, 510-515 149 150 LFD NR. E-NR. RASSE G A K1 5436/99 EKH mk 5 K2 526/00 Perser mk 3 Euthanasie aus unbekannten Gründen K3 1909/00 EKH mk 9 Traumapatient K4 5016/00 Kartäuser mk 12 Tumor ZNS K5 1828/04 Perser mk 6 maligner Tumor mit Osteolyse in der rechten Nasenhöhle mit Beteiligung von Orbita und Rhinenzephalon K6 2670/04 Kartäuser mk 6 Felines urologisches Syndrom mit hgr. Zystitis und Urosepsis K7 2840/04 EKH mk 8 Euthanasie aufgrund von Polytrauma K8 4697/04 EKH wk 11 Anämie K9 1735/05 EKH wk 10 Mammatumoren mit Lungenmetastasen K10 1903/05 EKH wk 4 Polytrauma, multiple Frakturen der Hintergliedmaße K11 2833/05 EKH mk 8 Aortenthrombus K12 2835/05 EKH mk 6 Urämie KLINISCHE BEFUNDE Tarsalgelenksluxation, Metatarsalluxation und –fraktur links, nach Operation verendet A: Alter, E.Nr.: Einsendungsnummer; EKH: Europäisch Kurzhaar; G: Geschlecht; Lfd.Nr.: laufende Nummer; mk: männlich kastriert; wk: weiblich kastriert; ZNS: zentrales Nervensystem 9 Anhang Kontrolltiere: Kenndate n und Angabe de r klinische n Be funde bzw. Diagnose n 9.1 Angaben zu den Kontrolltieren Tabe lle 9.1: Tabelle 9.2: Ergebnisse der histopathologischen Untersuchungen in der Gruppe der Kontrolltiere – Lokalisationen des Dünndarmes Architekturveränderungen Tier Lo 151 D K1 J IL D K2 J IL D K3 J IL D K4 J IL D K5 J IL D K6 J IL D K7 J IL D K8 J IL D K9 J IL D K10 J IL D K11 J IL D K12 J Schleimhautoberfläche N Ero. Ulz. + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - Zotten Krypten Lymphgefäße N Atr. Fus. N Hyp. Dil. Verl. Abs. N E.L.p. E.T.s. E.T.m. N + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Detailveränderungen der einzelnen Schichten Epithel Lamina propria Zelldichte Zellarten Zotte IEL Krypte Lamina propria Abfl. Unt. N ↑ N Hy. Abfl Unt. N Öd. Inf. Fib. N ↑s. ↑b. ↑d. ↑t. N ggr. mgr. hgr. Pl. + - + + + - - - - + - + + - + + - + - - - - + - + + - + + - + - - - - + - + + - + - + - + - - + - + + - + - + - - + - + - + + - + - + + - - + - + - + + - + + + - - - - + - + + - + - + + - + - - + - + + - + + - + - - - - + - + + - + + - + - - - - + - + + - + - + - + - - + - + + - + + - + - - - - + - + + - + + - + - - - - + - + + - + + - + - - - - + - + + - + + - + - - - - + - + + - + + - + - - - - + - + + - - + + - + - - - - + - + + - + + - + - - - - + - + + - + + + - - - - + - + + - - + - + - + - - + - + + - + + - + - - - - + - + + - + + + - - - - + - + + - + + + - - - - + - + + - + + - + - - - - + - + + - + + + - - - - + - + + - + + - + - - - - + - + + - + + - + - - - - + - + + - + + - + - - - - + - + + - + + - + - - - - + - + + - + + - + - - - - + - + - + + + - + - - - - + - + + - + + - + - - - - + - + + - + + - + - - - - + - + + - - + + - + - - - - + - + + - + + - + - - - - + - + histopathologische LGL N ↑Pl. ↑Ly. e.G. n.G. Diagnose Tela submucosa Ly. e.G. n.G. + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - - - - N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N 9 ANHANG Lo: Lokalisation; N: Normalbefund; Ero.: Erosion; Ulz.: Ulzeration; Atr.: Atrophie; Fus.: Fusion; Hyp.: Hyperplasie; Dil:.Dilatation; Verl.: Verlust; Abs.: Abszess; E.L.p.: Lyphangiektasie in der Lamina propria;E.T.s.: Lyphangiektasie in derTela submucosa; E.T.m.: Lyphangiektasie in der Tunica muscularis; Abfl.: Abflachung; Unt.: Zelluntergang; ↑: Erhöhung; Hy.: Hypertrophie; Öd.: Ödem; Inf.: Infiltration; Fib.: Fibrose; ↑s.: Zelldichte superficial erhöht; ↑b.: Zelldichte basal erhöht; ↑d.: Zelldichte diskontinuierlich erhöht; ↑t.: Zelldichte transmucosal erhöht; ggr.: insgesamt geringgradige Erhöhung der Zellzahl, im Duodenum ≥30% im Jejunum und Ileum ≥ 20%; mgr.: insgesamt mittelgradige Erhöhung der Zellzahl, im Duodenum ≥40% im Jejunum und Ileum ≥ 30%; hgr.: insgesamt hochgradige Erhöhung der Zellzahl, im Duodenum ≥50% im Jejunum und Ileum ≥ 40%; Pl.: Plasmazellen; Ly.: Lymphozyten; e.G.: eosinophile Granulozyten; n.G.: neutrophile Granulozyten; LGL: large granular lymphocytes; 9 ANHANG Tabelle 9.3: Tier 152 K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K10 K11 K12 Ergebnisse der histopathologischen Untersuchungen in der Gruppe der Kontrolltiere im Kolon Architekturveränderungen SchleimhautKrypten Lymphgefäße oberfläche N Ero. Ulz. N Hyp. Dil. Verl. Abs. N E.L.p. E.T.s. E.T.m. + - - - + - + + - - - + - + + + - - + - - - + + - - + - - - + + + - - - + - + + - - - - + + + - - - + - + + - - - + - + + - - - + - + + - - + - - - + + - - - + - + + - - + - - - + - Epithel N Abfl. BV Unt. + - - - + - + - - + - - - + - + - - + - - + - - - + - + - - + - - + - - - IEL N ↑ + + + + + + + + + + + + - Mit N ↑ + + + + + + + + + + + + - N + + + + + + + + + + Detailveränderungen der einzelnen Schichten Lamina propria L.p. Zelldichte Öd. Inf. Fib. N ↑s. ↑b. ↑d. ↑t. A/G N ggr. - + - - - - + - - - + - - - + - - - - - + - - - + - - - - - + - - - + - - - - - + - - - - - - + - - + - + - - - - + - - - + - - - + - - - - - + - - - + - - - - - + - - - + - - - - - + - - - + - - - - - + - - - + - - - - - + - - - + - - - - - + - histopathologische LGL N ↑Pl. ↑Ly. e.G. n.G. Diagnose Tela submucosa mgr. - Zellarten hgr. Pl. - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + Ly. + + + + + + + + + e.G. n.G. - - - - - - + - - - - - - - + + + + + + + + + + + + - - - - N N N N N N N N N N N N Lo: Lokalisation; N: Normalbefund; Ero.: Erosion; Ulz.: Ulzeration; Hyp.: Hyperplasie; Dil:.Dilatation; Verl.: Verlust; Abs.: Abszess; E.L.p.: Lyphangiektasie in der Lamina propria;E.T.s.: Lyphangiektasie in derTela submucosa; E.T.m.: Lyphangiektasie in der Tunica muscularis; Abfl.: Abflachung; BV: Becherzellverlust; Unt.: Zelluntergang; ↑: Erhöhung; Öd.: Ödem; Inf.: Infiltration; Fib.: Fibrose; ↑s.: Zelldichte superficial erhöht; ↑b.: Zelldichte basal erhöht; ↑d.: Zelldichte diskontinuierlich erhöht; ↑t.: Zelldichte transmucosal erhöht; A/G: Aggregate/ Granulome; ggr.: insgesamt geringgradige Erhöhung der Zellzahl, ≥20% ; mgr.: insgesamt mittelgradige Erhöhung der Zellzahl ≥30%; hgr.: insgesamt hochgradige Erhöhung der Zellzahl, ≥ 40%; Pl.: Plasmazellen; Ly.: Lymphozyten; e.G.: eosinophile Granulozyten; n.G.: neutrophile Granulozyten; LGL: large granular lymphocytes; N: Normalbefund Katzen mit IBD: Kenndaten, Angabe des Vorberichtes und der klinischen Befunde BLUTBILD, BIOCHEMIE UND SONSTIGE LABORWERTE 153 E-NR. RASSE G A IBD1 3027/98 EKH mk 2 Vorbericht: Seit Wochen zunehmend Inappetenz und Vomitus; Laparatomie: ggr. Ascites in Form von 10 ml klarer, seröser Flüssigkeit mit einem. spezifischen Gewicht von 1010; hgr. Aktivierung der Mesenteriallymphknoten Leukozytose, mit Kernlinksverschiebung; erhöhte Bilirubinwerte IBD2 4059/99 EKH mk 12 Vorbericht: Kachexie, Vomitus, Polyphagie, Polydipsie; Laparatomie: Pankreas gerötet, kleine granulomartige Knötchen; etwa erbsengroße multiple Zysten im rechten Pankreasschenkel, Mesenteriallymphknoten vergrößert Leukozytose, Erhöhung des Gesamteiweißes; FIP positiv IBD3 626/00 EKH wk 12 Vorbericht: Seit 4 Wochen anhaltender Vomitus, V.a. Pankreatitis Ultraschall: Splenomegalie, Leber hyperechogen und stumpfrandig, Nieren beidseits zentral verdichtet, Gastroskopie: stecknadelkopfgroßes hyperämisches Areal im Pylorusbereich Laparatomie: UV im Pylorusbereich; hyperämisches Pankreas, korrespondierender Lymphknoten mgr. vergrößert; Lobus dexter der Leber zeigte eine bohnengroße knotige UV o.b.B. IBD4 3493/00 NW wk 8 Vorbericht: Verdacht auf chronische Pankreatitis Ultraschall: Leber hyper- bzw. inhomogen; dilatierter, geschlängelter Gallengang, Pankreas hyperechogen mit fokalem 0,45mm großen echoarmen Bezirk, Splenomegalie Laparatomie: hyperämisches Pankreas, hgr. erweiterter Gallengang (ca. kleinfingerdick), palpatorische Verdickung der Gallenblasenwand, Vergrößerung der Jejunuallymphknoten, ggr. Stau der Leberlappen Leukozytose, erhöhte Werte für ALT, GLDH Glucose, Gesamteiweiß, Bilirubin, IBD5 3638/00 EKH n.b. n.b. Vorbericht: therapieresistente, chronisch-rezidivierende, phasenweise blutige Diarrhoe Laparatomie: mgr. Vergrößerung der Darmlymphknoten, ggr. freie wässrige Bauchhöhlenflüssigkeit, Pankreas ggr. gerötet Leukozytose, erhöhte Werte für Kreatinin und Gesamteiweiß IBDE6 4394/01 EKH wk 6 Vorbericht: Anorexie, chronische Diarrhoe Ultraschall: Leber hyperechogen, ggr, dilatierter Gallengang, ggr freie Flüssigkeit im Abdomen Laparatomie: flüssigkeitsgefülltes Colon, sonstige Organe soweit einsehbar o.b.B. o.b.B. KLINISCHE BEFUNDE 9 ANHANG LFD NR. 9.2 Angaben zu den IBD-Tieren Tabelle 9.4: 9 ANHANG BLUTBILD, BIOCHEMIE UND SONSTIGE LABORWERTE E-NR. RASSE G A KLINISCHE BEFUNDE IBD7 5509/01 EKH wk 12 Vorbericht: chronischer Vomitus, V.a. Pankreatitis Ultraschall: Gekröse im Bereich des kranialen Abdomens inhomogen und echoreich, Pankreasregion inhomogen, Leber ggr. hyperechogen Gastroskopie: ggr. Schleimhautrötung im Bereich des distalen Ösophagus Laparatomie: ggr. Hyperämie des Pankreas; mgr. Vergrößerung der Jejunuallymphknoten, Gefäße in diesem Bereich ggr. injiziert Leukozytose, erhöhte Werte für Glucose und Gesamteiweiß IBD8 1490/02 EKH wk 11 Vorbericht: chronische Diarrhoe, Diabetes mellitus, V.a. tumoröse Veränderung des Pankreas mit sekundärem Gallestau Ultraschall: hgr. hyperechogene Splenomegalie, Portalgefäße erweitert, Gallengang gestaut, zwischen Milz, Niere und Magen hgr. inhomogene UV mit Perfusion; duodenaler Pankreasschenkel hyperechogen und inhomogen Laparatomie: Pankreas insgesamt grobkörnig und derb, Leber ggr. marmoriert und gelblich gefärbt, Gallenblase ausdrückbar, Jejunuallymphknoten vergrößert; Zytologie: reaktiv-hyperplastische Lymphadenopathie, erhöhte Anzahl an Plasmazellen und Lymphoblasten ggr. degenerative Zellen und lympho-plasmazellulärer Infiltration des Pankreas, mgr. fettige Leberzelldegeneration, intrazytoplasamtische Vakuolen Leukozytose, Glucosurie IBD9 1598/02 EKH mk 5 Vorbericht: chronische Diarrhoe, hgr. Atrophie des Pankreas Ultraschall: Nierenrinde bds. ggr. inhomogen; Mesenteriallymphkonten deutlich aktiviert Leukozytose, Erhöhung des ALT-Wertes 154 LFD NR. A: Alter; ALT: Alanin-Amino-Transferase; bds. beidseits; ca.: circa; EKH: Europäische Kurzhaar Katze; E-Nr.: Einsendungsnummer; FIP. Feline infektiöse Peritonitis, G: Geschlecht; ggr.: geringgradig; GLDH: Glutamatdehydrogenase; hgr. hochgradig; Lfd.Nr.: laufende Nummer; mgr.: mittelgradig; mm: Millimeter; mk: männlich kastriert; n.b.: nicht bekannt; NW: Norwegische Waldkatze; o.b.B.: ohne besonderen Befund; V.a.: Verdacht auf; UV: Umfangsvermehrung; wk: weiblich kastriert Tabelle 9.5: Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung in der Gruppe der Katzen mit IBD – Lokalisationen des Dünndarmes Architekturveränderungen Tier Lo IBD 1 IBD 2 IBD 3 IBD 4 155 IBD 5 IBD 6 IBD 7 IBD 8 IBD 9 D* J D J D J D* J* IL D J IL D J D J IL D J IL D J Schleimhautoberfläche N Ero. Ulz. + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - - Zotten N Atr. Fus. - + - + - + + - - + - + + - + - + + - + - + + - + - + - + - - + - + - + + - + - + - + - + - - Krypten N Hyp. Dil. Verl. - - + - - + + - - '- - + - - + + - - + + + - - - - + + - - - - + + - - + - - + - - + + - - + + - - + + - - + - - + + + - - + - - - - + + - - + - - + + Lymphgefäße Abs. + + + - N E.L.p. E.T.s. E.T.m. + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + _ + + + + + - N + + + + + + + + + + + + + + + + + Epithel Zotte IEL Abfl. Unt. N ↑ N + - - + - - - + + + - - + + - - + - - - - + - - - + + - - + - + - - + - + - - + - + - - + - - - + - + - - + - - - + - - - + - + - - + + - - + + - - + - - + - + - - + - + - - + - + - - + - + - - + - - Detailveränderungen der einzelnen Schichten Lamina propria Krypte L.p. Zelldichte Zellarten LGL Hy. Abfl. Unt. N Öd. Inf. Fib. N ↑s. ↑b. ↑d. ↑t. N ggr. mgr. hgr. Pl. Ly. e.G. n.G. + + - - + + + - - - - + - + - - + + - + - - - - + + - - + - - - - + - - + + - + - - - - - + - - - - - + - - + - + + - - - + - - + + - - - - - + - - - + + + - - + + - - + - - - - - + - + - - - + + - - - - - - + + - - - + - - - + - - + + - - - - - - + + - - - - - + - + - - + + - + + - - - - + + - - - - + - - + - - + + - + + - - - + - - - + - - - - + - - - + + - - + - + - - - + - - - - - + - + - - + + - - - - - - + + - - - - - + - - + - + + - + - + - - + - - + - - - - + - - - + + - - + - - - - + - - - + - - - - + - + + - + - + - - - + + - - + - - - - + - + + - + + + - - - + + - - - - + - - + - + + - + - + - - - + - - - - - + - - - + + + - + - - + - - + + - - - - + - - + - + + - + - - - - - + + - - - - + - - + - + + - - + - - - - + + + - - - + - - - + - + + - - - - - - - - + + - - - - + - - - + + - + - - - + - - - + - - - - + - - - + + - - + - - - - + + - - - + - - - + - + + - + - histopathologische N ↑Pl. ↑Ly. e.G. n.G. Diagnose Tela submucosa + + + + + + + + + + + + - + + + + + + - + + + + + + + + + + - - mgr. LPE mgr. LPE ggr.LPE mgr. LPE ‡ mgr. LPE ggr.LPE mgr. LPE ‡ mgr. LPE ggr.LPE ‡ mgr. LPE mgr. LPE mgr. LPE mgr. LPE mgr. LPE ggr.LPE ggr.LPE ‡ N mgr. LPE Lo: Lokalisation; N: Normalbefund; Ero.: Erosion; Ulz.: Ulzeration; Atr.: Atrophie; Fus.: Fusion; Hyp.: Hyperplasie; Dil:.Dilatation; Verl.: Verlust; Abs.: Abszess; E.L.p.: Lyphangiektasie in der Lamina propria;E.T.s.: Lyphangiektasie in derTela submucosa; E.T.m.: Lyphangiektasie in der Tunica muscularis; Abfl.: Abflachung; Unt.: Zelluntergang; ↑: Erhöhung; Hy.: Hypertrophie; Öd.: Ödem; Inf.: Infiltration; Fib.: Fibrose; ↑s.: Zelldichte superficial erhöht; ↑b.: Zelldichte basal erhöht; ↑d.: Zelldichte diskontinuierlich erhöht; ↑t.: Zelldichte transmucosal erhöht; ggr.: insgesamt geringgradige Erhöhung der Zellzahl, im Duodenum ≥30% im Jejunum und Ileum ≥ 20%; mgr.: insgesamt mittelgradige Erhöhung der Zellzahl, im Duodenum ≥40% im Jejunum und Ileum ≥ 30%; hgr.: insgesamt hochgradige Erhöhung der Zellzahl, im Duodenum ≥50% im Jejunum und Ileum ≥ 40%; Pl.: Plasmazellen; Ly.: Lymphozyten; e.G.: eosinophile Granulozyten; n.G.: neutrophile Granulozyten; LGL: large granular lymphocytes; ‡: Bioptat weist Architekturveränderungen der Lamina propria ohne Entzündungszellinfiltration auf; *: IBD1 D*: vermehrt neutrophile Granulozyten in der Lamina intermuscularis; IBD4 D*: ggr. Infiltration der Peripherie des Plexus myentericus mit Lymphozyten und neutrophilen Granulozyten; IBD4 J*: fokal geringgradige Infiltration der Lamina intermuscularis mit Lymphozyten und neutrophilen Granulozyten; 9 ANHANG 9 ANHANG Tabelle 9.6: Tier 156 IBD2* IBD3 IBD4 IBD5 IBD6 IBD7 IBD8 IBD9 Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung in der Gruppe der Katzen mit IBD im Kolon Architekturveränderungen Epithel SchleimhautKrypten Lymphgefäße IEL oberfläche N Ero. Ulz. N Hyp. Dil. Verl. Abs. N E.L.p. E.T.s. E.T.m. N Abfl. BV Unt. N ↑ + - - + - + - + - + - - + + - - - + + + + + - + - - + + - - - + - + - + - - + + - - - + + + - - - + + - - + - - - + - + + - + - + - - + + + - + - - + - + - - + + + + + - + - - + + - - - + + - + - - + - Mit N ↑ + + + + + + + + - Detailveränderungen der einzelnen Schichten Lamina propria Lamina propria Zelldichte N Öd. Inf. Fib. N ↑s. ↑b. ↑d. ↑t. A/G N ggr. - - + - - - - - + - - - + - - + - - - - - + - - + - - - - + - - - + - + + - - - - + - - + - - + - - - - + - - + - - + + - + - - - - + - - + + - - - - + - - - - + - + - - - - - + - histopathologische LGL N ↑Pl. ↑Ly. Diagnose Tela submucosa mgr. + + - Zellarten hgr. Pl. - + - + - + - + - + - + - + - + Ly. + + + + + + + + e.G. - n.G. + + + + - + + + + + - + + + + + - ggr.LPC ‡ ggr.LPC ‡ ‡ ‡ mgr.LPC ‡ Lo: Lokalisation; N: Normalbefund; Ero.: Erosion; Ulz.: Ulzeration; Hyp.: Hyperplasie; Dil:.Dilatation; Verl.: Verlust; Abs.: Abszess; E.L.p.: Lyphangiektasie in der Lamina propria;E.T.s.: Lyphangiektasie in derTela submucosa; E.T.m.: Lyphangiektasie in der Tunica muscularis; Abfl.: Abflachung; BV: Becherzellverlust; Unt.: Zelluntergang; ↑: Erhöhung; Öd.: Ödem; Inf.: Infiltration; Fib.: Fibrose; ↑s.: Zelldichte superficial erhöht; ↑b.: Zelldichte basal erhöht; ↑d.: Zelldichte diskontinuierlich erhöht; ↑t.: Zelldichte transmucosal erhöht; A/G: Aggregate/ Granulome; ggr.: insgesamt geringgradige Erhöhung der Zellzahl, ≥20% ; mgr.: insgesamt mittelgradige Erhöhung der Zellzahl ≥30%; hgr.: insgesamt hochgradige Erhöhung der Zellzahl, ≥ 40%; Pl.: Plasmazellen; Ly.: Lymphozyten; e.G.: eosinophile Granulozyten; n.G.: neutrophile Granulozyten; LGL: large granular lymphocytes; *: IBD2*: fokale Infiltration der Tunica muscularis mit Lymphozyten und neutrophilen Granulozyten Tabelle 9.7: IBD-Katzen: Ergebnisse der histopathologischen Untersuchungen extraintestinaler Bioptate und Zusammenfassung der intestinalen Befunde PATHOHISTOLOGISCHE DIAGNOSE LFD E-NR. RASSE G A NACH DEM HISTOLOGISCHEN BEURTEILUNGS- UND GRADUIERUNGSSCHEMA PATHOHISTOLOGISCHE DIAGNOSE SONSTIGE ORGANE NR. DUODENUM JEJUNUM ILEUM KOLON EKH mk 2 mgr. LPE mgr. LPE - - Lnn. mesenteriale: hgr. lymphatische Hyperplasie IBD2 4059/99 EKH mk 12 ggr. LPE mgr. LPE - ggr. LPK Magen: o.b.B. Pankreas: mgr. chronisch-rezidivierende lymphoplasmazelluläre bis gemischtzellige Pankreatitis mit Untergang von Pankreasgewebe und Fibrose IBD3 626/00 EKH wk 12 mgr. LPE mgr. LPE - mgr. LPK Magen: ggr. fokale Fibrosierung der Mucosa, ggr. gemischtzellige Gastritis IBD4 3493/00 NW wk 8 ggr. LPE mgr. LPE ggr. LPE ggr. LPK Magen: o.b.B. Leber: mgr. multifokale periportale gemischtzellige Hepatitis mit ggr. Cholestase Pankreas: hgr. diffuse chronische rezidivierende Pankreatitis Gallenblase: mgr. subepitheliale multifokale lymphoplasmazelluläre Ductcholangitis mit hochgradigen papilliformen Schleimhautproliferationen Lnn. mesenteriale: o.b.B. IBD5 3638/00 EKH n.b. n.b. mgr. LPE ggr. LPE ggr. LPE ggr. LPK Magen: ggr. lymphoplasmazelluläre Gastritis; Lnn. mesenteriale: mgr. follikuläre lymphatische Hyperplasie IBD6 4394/01 EKH wk 6 mgr. LPE mgr. LPE - ggr. LPK Magen: o.b.B. IBD7 5509/01 EKH wk 12 mgr. LPE mgr. LPE mgr.LPE mgr. LPK Magen: o.b.B. IBD8 1490/02 EKH wk 11 ggr. LPE ggr. LPE ggr. LPE hgr. LPK mgr. LP K Magen: o.b.B. Leber: ggr. multifokale periportale lymphoplasmazelluläre bis gemischtzellige Hepatitis Lnn. mesenteriale: mgr. eitirge Lymphadenitis Pankreas: mgr. multifokale noduläre Hyperplasie des exokrinen Pankreasgewebes, mgr. chronisch fibrosierende Pankreatitis mit ggr. interlobulären lymphoplasmazellulären Infiltraten. Lnn. mesenteriale: mgr. eitrige Lymphadenitis mit mgr. follikulärer lymphatischer Hyperplasie 9 ANHANG 3027/98 157 IBD1 9 ANHANG LFD E-NR. RASSE G A PATHOHISTOLOGISCHE DIAGNOSE NACH DEM HISTOLOGISCHEN BEURTEILUNGS- UND GRADUIERUNGSSCHEMA NR. 1598/02 EKH mk 5 JEJUNUM o.b.B. mgr. LPE I IBD9 DUODENUM ILEUM PATHOHISTOLOGISCHE DIAGNOSE SONSTIGE ORGANE KOLON ggr. LPK 158 Magen: o.b.B. Leber: ggr multifokale periportale lymphoplasmazelluläre Hepatitis Pankreas: hgr. diffuse chronisch rezidivierende lymphoplasmazelluläre Pankreatitis mit Verlust von Pankreasgewebe und intra- und interlobuläre Fibrosen Lnn. mesenteriale: ggr. eitrige Lymphadenitis mit hgr. follikulärer lymphatischer Hyperplasie A: Alter; E-Nr.: Einsendungsnummer; G: Geschlecht; ggr.: geringgradig; hgr.: hochgradig; Lfd.Nr.: laufende Nummer; Lnn: Lymphonodi; LPE: lymphoplasmazelluläre Enteritis; LPK: lymphoplasmazelluläre Kolitis; mgr.: mittelgradig; m.k.: männlich kastriert; n.b.: nicht bekannt; o.b.B.: ohne besonderen Befund; - : kein Bioptat entnommen 9 ANHANG 9.3 Angaben zu statistischen Ergebnissen Tabelle 9.8 CD3+ Zellen: Tabellarische Darstellung der p-Werte des paarweisen Vergleichs der Lokalisationen in vertikaler Richtung (Wilcoxon´s signed rank test) VARIABLE KONTROLLTIERE IBD-TIERE p= p= D_1_2_DIFF 0,0010 0,0742 D_1_3_DIFF 0,0005 0,0039 D_2_3_DIFF 0,0005 0,0039 D_Z_K_DIFF 0,0005 0,0117 J_1_2_DIFF 0,0005 0,4961 J_1_3_DIFF 0,0005 0,0039 J_2_3_DIFF 0,0005 0,0039 J_Z_K_DIFF 0,0005 0,0742 IL_1_2_DIFF 0,0049 aufgrund der zu geringen IL_1_3_DIFF 0,0010 Stichprobengröße (Ileum: n = 4) ist IL_2_3_DIFF 0,0010 eine statistische Aussage nicht möglich IL_Z_K_DIFF 0,0010 C_10_11_DIFF 0,0300 0,0078 weiße Felder: nicht signifikant; hellgraue Felder: statische Tendenz; dunkelgraue Felder: signifikant D_1_2_DIFF = Unterschied zwischen Areal 1 und Areal 2 des Duodenums D_1_3_DIFF = Unterschied zwischen Areal 1 und Areal 3 des Duodenums D_2_3_DIFF = Unterschied zwischen Areal 2 und Areal 3 des Duodenums D_Z_K_DIFF = Unterschied zwischen Areal 1und der Gesamtzellzahl der Kryptregion (Areal 2+3/2) des Duodenums J_1_2_DIFF = Unterschied zwischen Areal 1 und Areal 2 des Jejunums J_1_3_DIFF = Unterschied zwischen Areal 1 und Areal 3 des Jejunums J_2_3_DIFF = Unterschied zwischen Areal 2 und Areal 3 des Jejunums J_Z_K_DIFF = Unterschied zwischen Areal 1und der Gesamtzellzahl der Kryptregion (Areal 2+3/2) des Jejunums IL_1_2_DIFF = Unterschied zwischen Areal 1 und Areal 2 Ileums IL_1_3_DIFF = Unterschied zwischen Areal 1 und Areal 3 des Ileums IL_2_3_DIFF = Unterschied zwischen Areal 2 und Areal 3 des Ileums IL_Z_K_DIFF = Unterschied zwischen Areal 1und der Gesamtzellzahl der Kryptregion (Areal 2+3/2) des Ileums C_10_11_DIFF = Unterschied zwischen Areal 2 und Areal 3 des Kolons 159 9 ANHANG Tabelle 9.9: CD3+ Zellen: Tabellarische Darstellung der p-Werte beim paarweisen Vergleich der Lokalisationen in horizontaler Richtung (Wilcoxon´s signed rank test) VARIABLE KONTROLLTIERE IBD-TIERE p= p= D_J_1_DIFF 0,0049 0,7344 D_IL_1_DIFF 0,0010 keine Aussage erlaubt J_IL_1_DIFF 0,0420 keine Aussage erlaubt D_J_2_DIFF 0,6221 0,4961 D_IL_2_DIFF 0,1475 keine Aussage erlaubt J_IL_2_DIFF 0,3652 keine Aussage erlaubt D_J_3_DIFF 0,9658 1,0000 D_IL_3_DIFF 0,1230 keine Aussage erlaubt J_IL_3_DIFF 0,1016 keine Aussage erlaubt D_J_2/3_DIFF 0,9697 0,4961 D_IL_2/3_DIFF 0,0186 keine Aussage erlaubt J_IL_2/3_DIFF 0,0322 keine Aussage erlaubt D_J_DIFF 0,0771 1,0000 D_IL_DIFF 0,0020 keine Aussage erlaubt J_IL_DIFF 0,0068 keine Aussage erlaubt DUEDA_C_DIFF 0,0244 0,0156 weiße Felder: nicht signifikant; hellgraue Felder: statische Tendenz; dunkelgraue Felder: signifikant; keine Aussage erlaubt: aufgrund der stark unterschiedlichen Stichprobengrößen (Duodenum, Jejunum je n =9; Ileum: n=4) ist eine statistische Aussage über abhängige Stichproben nicht erlaubt; D_J_1_DIFF = D_IL_1_DIFF = J_IL_1_DIFF = D_J_2_DIFF = D_IL_2_DIFF = D_C_2_DIFF = J_IL_2_DIFF = J_C_2_DIFF = IL_C_2_DIFF = D_J_3_DIFF = D_IL_3_DIFF = D_C_3_DIFF = J_IL_3_DIFF = J_C_3_DIFF = IL_C_3_DIFF = D_J_2/3_DIFF = D_IL_2/3_DIFF = D_C_2/3_DIFF = J_IL_2/3_DIFF = J_C_2/3_DIFF = IL_C_2/3_DIFF = D_J_DIFF = D_IL_DIFF = J_IL_DIFF = DUEDA_C_DIFF = Unterschied zwischen Areal 1des Duodenums und Jejunums Unterschied zwischen Areal 1 des Duodenums und Ileums Unterschied zwischen Areal 1 des Jejunums und Ileums Unterschied zwischen Areal 2 des Duodenums und Jejunums Unterschied zwischen Areal 2 des Duodenums und Ileums Unterschied zwischen Areal 2 des Duodenums und des Kolons Unterschied zwischen Areal 2des Jejunums und Ileums Unterschied zwischen Areal 2 des Jejunums und Kolons Unterschied zwischen Areal 2 des Ileums und Kolons Unterschied zwischen Areal 3 des Duodenums und des Jejunums Unterschied zwischen Areal 3 des Duodenums und Ileums Unterschied zwischen Areal 3 des Duodenums und Kolons Unterschied zwischen Areal 3 des Jejunums und Ileums Unterschied zwischen Areal 3 des Jejunums und Kolons Unterschied zwischen Areal 3 des Ileums und des Kolons Unterschied zwischen der Gesamtzellzahl der Kryptregion (Areal 2+3/2) des Duodenums und Jejunums Unterschied zwischen der Gesamtzellzahl der Kryptregion (Areal 2+3/2) des Duodenums und Ileums Unterschied zwischen der Gesamtzellzahl der Kryptregion (Areal 2+3/2) des Duodenums und Kolons Unterschied zwischen der Gesamtzellzahl der Kryptregion (Areal 2+3/2) des Jejunums und Ileums Unterschied zwischen der Gesamtzellzahl der Kryptregion (Areal 2+3/2) des Jejunums und Kolons Unterschied zwischen der Gesamtzellzahl der Kryptregion (Areal 2+3/2) des Ileums und Kolons Unterschied zwischen der Gesamtzellzahl des Duodenums und des Jejunums Unterschied zwischen der Gesamtzellzahl des Duodenums und des Ileums Unterschied zwischen der Gesamtzellzahl des Jejunums und des Ileums Unterschied zwischen der Gesamtzellzahl des Dünndarms und des Kolons 160 9 ANHANG Tabelle: 9.10 CD3+ Zellen: Tabellarische Darstellung Lagevergleiches (Wilcoxon´s rank-sum Test) LOKALISATION KONTROLLTIERE MEDIAN (P25;P75) der Lageparameter IBD-TIERE MEDIAN (P25;P75) Duodenum_A1 und p-Wert des p-WERT des LAGEVERGLEICHES 0,1098 13,87 20,54 (7,56; 15,01) (13,58; 24,47) Duodenum_A2 0,0817 6,79 12,46 (3,42; 9,97) (7,97; 22,07) Duodenum_A3 0,6959 1,54 2,35 (1,08; 3,33) (0,91; 3,76) Duodenum_A2/3 0,0597 4,92 10,71 (2,51; 6,14) (5,16; 11,72) Duodenum_A1/2/3 0,0252 7,80 11,31 (4,23; 8,94) (10,76; 14,19) Jejunum_A1 1,0000 18,60 16,43 (14,40; 23,59) (13,79; 30,23) Jejunum_A2 0,2136 9,97 12,95 (4,80; 11,82) (5,53; 28,19) Jejunum_A3 0,2136 1,50 3,21 (0,66; 2,96) (1,03; 6,51) Jejunum_A2/3 0,2410 5,76 8,08 (3,78; 7,02) (3,28; 17,35) Jejunum_A1/2/3 0,3028 9,86 12,27 (7,05; 12,98) (9,82; 22,69) Ileum_A1 0,7441 28,34 26,17 (18,00; 32,28) (17,36; 37,75) Ileum_A2 0,8447 8,81 8,33 (7,45; 14,69) (6,85; 13,24) Ileum_A3 0,5569 3,37 2,68 (1,81; 6,35) (1,33; 4,54) Ileum_A2/3 0,6477 7,34 5,51 (5,51; 11,54) (4,09; 8,86) Ileum_A1/2/3 0,8447 15, 23 12, 39 (11,10; 16,48) (8,51; 18,51) GZZ_Dünndarm 0,3619 11, 31 12,39 (8,96; 13,02) (11,51; 13,33) Kolon_A2 0,8471 3,58 3,40 (2,92; 5,29) (2,63; 13,44) Kolon_A3 0,6160 2,78 1,61 (1,51; 5,26) (1,09; 5,07) GZZ_Kolon 0,8471 3,30 2,38 (2,43; 5,26) (2,03; 9,25) 0,5940 GZZ_Darm 9,86 11,29 (6,78; 12,55) (9,89; 12,31) weiße Felder: nicht signifikant; hellgraue Felder: statische Tendenz; dunkelgraue Felder: signifikant; A1:Areal 1; A2: Areal 2; A3: Areal 3; Median: Median der ermittelten Zellzahlen bezogen auf eine Fläche von 10.000 µm2 der Lamina propria;; GZZ_Dündarm: Gesamtzellzahl des Dünndarmes; GZZ_Darm: Gesamtzellzahl des Darmes insgesamt; P25: 25% Quartil; P75: 75% Quartil 161 9 ANHANG Tabelle 9.11: IgA-Plasmazellen: Tabellarische Darstellung der p-Werte des paarweisen Vergleichs der Lokalisationen in vertikaler Richtung (Wilcoxon´s signed rank Test) VARIABLE KONTROLLTIERE IBD-TIERE p= p= D_1_2_DIFF 0,0522 0,0273 D_1_3_DIFF 0,0342 0,0039 D_2_3_DIFF 0,9697 0,2500 D_Z_K_DIFF 0,0210 0,0039 J_1_2_DIFF 0,0005 0,0078 J_1_3_DIFF 0,0005 0,0039 J_2_3_DIFF 0,0640 0,0273 J_Z_K_DIFF 0,0005 0,0039 IL_1_2_DIFF 0,0010 aufgrund der zu geringen IL_1_3_DIFF 0,0010 Stichprobengröße (Ileum: n = 4) ist IL_2_3_DIFF 0,4648 eine statistische Aussage nicht möglich IL_Z_K_DIFF 0,0010 C_10_11_DIFF 0,5186 0,9453 weiße Felder: nicht signifikant; hellgraue Felder: statische Tendenz; dunkelgraue Felder: signifikant; Abkürzungserläuterung: siehe 9.8; Tabelle 9.12: IgA-Plasmazellen: Tabellarische Darstellung der p-Werte des paarweisen Vergleichs der Lokalisationen in horizontaler Richtung (Wilcoxon´s signed rank Test) VARIABLE KONTROLLTIERE IBD-TIERE p= p= D_J_1_DIFF 0,0068 0,0742 D_IL_1_DIFF 0,0020 keine Aussage erlaubt J_IL_1_DIFF 0,6377 keine Aussage erlaubt D_J_2_DIFF 0,2036 0,0039 D_IL_2_DIFF 0,1016 keine Aussage erlaubt J_IL_2_DIFF 0,4131 keine Aussage erlaubt D_J_3_DIFF 0,8501 0,4961 D_IL_3_DIFF 0,0244 keine Aussage erlaubt J_IL_3_DIFF 0,0537 keine Aussage erlaubt D_J_2/3_DIFF 0,3804 0,0391 D_IL_2/3_DIFF 0,0322 keine Aussage erlaubt J_IL_2/3_DIFF 0,1230 keine Aussage erlaubt D_J_DIFF 0,0771 0,0195 D_IL_DIFF 0,0098 keine Aussage erlaubt J_IL_DIFF 0,1475 keine Aussage erlaubt DUEDA_C_DIFF 0,4697 0,4609 weiße Felder: nicht signifikant; hellgraue Felder: statische Tendenz; dunkelgraue Felder: signifikant; keine Aussage erlaubt: aufgrund der stark unterschiedlichen Stichprobengrößen (Duodenum, Jejunum je n =9; Ileum: n=4) ist eine statistische Aussage über abhängige Stichproben nicht erlaubt; Abkürzungserläuterung: siehe Tabelle 9.9 162 9 ANHANG Tabelle 9.13: IgA-Plasmazellen: Tabellarische Darstellung der Lageparameter und p-Wert des Lagevergleiches (Wilcoxon´s rank sum Test) LOKALISATION KONTROLLTIERE MEDIAN (P25;P75) IBD-TIERE MEDIAN (P25;P75) Duodenum_A1 p-WERT des LAGEVERGLEICHES 0,2707 8,23 15,04 (2,72; 16,56) (8,28; 18,22) Duodenum_A2 0,1265 14,20 20,52 (10,45; 18,74) (17,80; 25,62) Duodenum_A3 0,0949 18,13 24,71 (11,96; 21,31) (21,25; 25,97) Duodenum_A2/3 0,0428 16,66 22,18 (11,80; 19,72) (20,87; 24,26) Duodenum_A1/2/3 0,0817 13,40 20,83 (10,22; 17,74) (16,67; 21,87) Jejunum_A1 0,0699 2,57 7,74 (1,41; 5,15) (2,26; 13,71) Jejunum_A2 0,3374 8,58 12,10 (7,03; 11,93) (10,41; 16,75) Jejunum_A3 0,1886 15,84 24,72 (12,65; 16,88) (15,93; 26,81) Jejunum_A2/3 0,1452 11,72 16,40 (10,39; 14,32) (11,93; 22,47) Jejunum_A1/2/3 0,0507 8,63 11,55 (7,33; 11,38) (11,37; 17,75) Ileum_A1 0,9480 2,20 1,86 (0,93; 6,45) (1,26; 4,94) Ileum_A2 0,6547 10,32 6,59 (2,97; 12,00) (5,03; 9,53) Ileum_A3 0,4727 10,10 15,29 (6,73; 13,44) (7,93; 21,60) Ileum_A2/3 0,6477 10,49 10,94 (4,45; 12,72) (6,72; 15,32) Ileum_A1/2/3 0,8447 7,41 7,91 (3,40; 10,90) (4,90; 11,86) GZZ_Dünndarm 0,0360 10,43 14,60 (7,93; 12,58) (12,66; 19,73) Kolon_A2 0,3749 10,71 14,32 (9,42; 13,14) (9,12; 18,14) Kolon_A3 0,2976 11,84 15,27 (9,41; 14,84) (10,85; 18,89) GZZ_Kolon 0,2976 11,81 15,29 (9,41; 14,84) (9,91; 18,72) GZZ_Darm 0,0302 10,19 14,60 (8,54; 12,18) (13,52; 18,68) weiße Felder: nicht signifikant; hellgraue Felder: statische Tendenz; dunkelgraue Felder: signifikant; A1:Areal 1; A2: Areal 2; A3: Areal 3; Median: Median der ermittelten Zellzahlen bezogen auf eine Fläche von 10.000 µm2 der Lamina propria; GZZ-Dündarm: Gesamtzellzahl des Dünndarmes; GZZ_Darm: Gesamtzellzahl des Darmes insgesamt; P25: 25% Quartil; P75: 75% Quartil 163 9 ANHANG Tabelle 9.14: IgG-Plasmazellen: Tabellarische Darstellung der p-Werte des paarweisen Vergleichs der Lokalisationen in vertikaler Richtung (Wilcoxon´s signed rank Test) VARIABLE KONTROLLTIERE IBD-TIERE p= p= D_1_2_DIFF 0,0923 0,0742 D_1_3_DIFF 0,1514 0,1289 D_2_3_DIFF 0,0186 0,0742 D_Z_K_DIFF 0,8501 0,3008 J_1_2_DIFF 0,0010 0,1953 J_1_3_DIFF 0,4961 0,7422 J_2_3_DIFF 0,0010 0,3125 J_Z_K_DIFF 0,1230 0,2500 IL_1_2_DIFF 0,0156 aufgrund der zu geringen IL_1_3_DIFF 0,2188 Stichprobengröße (Ileum: n = 4) ist IL_2_3_DIFF 0,3750 eine statistische Aussage nicht möglich IL_Z_K_DIFF 0,0469 C_10_11_DIFF 0,6221 0,1094 weiße Felder: nicht signifikant; hellgraue Felder: statische Tendenz; dunkelgraue Felder: signifikant; Abkürzungserläuterung: siehe Tabelle 9.8; Tabelle 9. 15: IgG-Plasmazellen: Tabellarische Darstellung der p-Werte des paarweisen Vergleichs der Lokalisationen in horizontaler Richtung (Wilcoxon´s signed rank Test) VARIABLE KONTROLLTIERE IBD-TIERE p= p= D_J_1_DIFF 0,0640 0,4258 D_IL_1_DIFF 0,0186 keine Aussage erlaubt J_IL_1_DIFF 0,2031 keine Aussage erlaubt D_J_2_DIFF 0,0342 0,4258 D_IL_2_DIFF 0,0371 keine Aussage erlaubt J_IL_2_DIFF 0,7002 keine Aussage erlaubt D_J_3_DIFF 0,1094 1,0000 D_IL_3_DIFF 0,6406 keine Aussage erlaubt J_IL_3_DIFF 0,2500 keine Aussage erlaubt D_J_2/3_DIFF 0,0425 0,9102 D_IL_2/3_DIFF 0,1602 keine Aussage erlaubt J_IL_2/3_DIFF 0,7646 keine Aussage erlaubt D_J_DIFF 0,0296 0,7344 D_IL_DIFF 0,0322 keine Aussage erlaubt J_IL_DIFF 0,8984 keine Aussage erlaubt DUEDA_C_DIFF 0,7646 0,3828 weiße Felder: nicht signifikant; hellgraue Felder: statische Tendenz; dunkelgraue Felder: signifikant; keine Aussage erlaubt: aufgrund der stark unterschiedlichen Stichprobengrößen (Duodenum, Jejunum je n =9; Ileum: n=4) ist eine statistische Aussage über abhängige Stichproben nicht erlaubt; Abkürzungserläuterung: siehe Tabelle 9.9 164 9 ANHANG Tabelle 9.16: IgG-Plasmazellen: Tabellarische Darstellung der Lageparameter und p-Wert des Lagevergleiches (Wilcoxon´s rank-sum Test) LOKALISATION KONTROLLTIERE MEDIAN (P25;P75) IBD-TIERE MEDIAN (P25;P75) Duodenum_A1 p-WERT des LAGEVERGLEICHES 0,0817 0,67 2,35 (0,36; 1,26) (0,76; 3,91) Duodenum_A2 0,4138 2,04 5,67 (0,51; 3,36) (0,81; 6,77) Duodenum_A3 0,2573 0,06 1,12 (0,00; 0,92) (0,09; 2,27) Duodenum_A2/3 0,3028 1,02 3,97 (0,30; 2,08) (0,96; 4,40) Duodenum_A1/2/3 0,2136 0,93 3,43 (0,31; 1,93) (0,88; 4,43) Jejunum_A1 0,1630 0,16 0,97 (0,07; 0,89) (0,73; 1,76) Jejunum_A2 0,0880 0,58 1,59 (0,30; 1,98) (1,43; 5,05) Jejunum_A3 0,0193 0,00 0,96 (0,00; 0,28) (0,43; 1,95) Jejunum_A2/3 0,0329 0,35 2,19 (0,15; 1,15) (0,96; 3,00) Jejunum_A1/2/3 0,0329 0,27 1,80 (0,12; 1,09) (0,94; 4,15) Ileum_A1 0,4646 0,00 1,18 (0,00-0,46) (0,51; 2,46) Ileum_A2 0,6858 0,82 0,36 (0,00;1,50) (0,27; 1,84) Ileum_A3 0,5496 0,21 1,02 (0,00; 1,06) (0,39; 3,00) Ileum_A2/3 0,5496 0,80 1,02 (0,00; 1,23) (0,39; 3,00) Ileum_A1/2/3 0,4646 0,61 1,07 (0,00; 0,91) (0,43; 2,82) GZZ_Dünndarm 0,1106 0,74 2,94 (0,35-2,08) (1,02; 4,67) Kolon_A2 0,1137 0,78 1,80 (0,51; 1,21) (1,25; 2,49) Kolon_A3 0,4636 0,64 0,85 (0,39; 1,38) (0,67; 1,37) GZZ_Kolon 0,1137 0,64 1,16 (0,39; 1,38) (0,86; 1,99) GZZ_Darm 0,0597 0,73 2,42 (0,31; 1,55) (0,98; 4,12) weiße Felder: nicht signifikant; hellgraue Felder: statische Tendenz; dunkelgraue Felder: signifikant; A1:Areal 1; A2: Areal 2; A3: Areal 3; Median: Median der ermittelten Zellzahlen bezogen auf eine Fläche von 10.000 µm2 der Lamina propria; ; GZZ-Dündarm: Gesamtzellzahl des Dünndarmes; GZZ_Darm: Gesamtzellzahl des Darmes insgesamt; P25: 25% Quartil; P75: 75% Quartil 165 9 ANHANG Tabelle 9.17: IgM-Plasmazellen: Tabellarische Darstellung der p-Werte beim paarweisen Vergleich der Lokalisationen in vertikaler Richtung (Wilcoxon´s signed rank Test) VARIABLE KONTROLLTIERE IBD-TIERE p= p= D_1_2_DIFF 0,0005 0,0078 D_1_3_DIFF 0,0005 0,0039 D_2_3_DIFF 0,0049 0,1641 D_Z_K_DIFF 0,0005 0,0039 J_1_2_DIFF 0,0005 0,0078 J_1_3_DIFF 0,0005 0,0039 J_2_3_DIFF 0,0005 0,0547 J_Z_K_DIFF 0,0005 0,0039 IL_1_2_DIFF 0,0010 aufgrund der zu geringen IL_1_3_DIFF 0,0010 Stichprobengröße (Ileum: n = 4) ist IL_2_3_DIFF 0,0010 eine statistische Aussage nicht möglich IL_Z_K_DIFF 0,0010 C_10_11_DIFF 0,0024 0,0156 weiße Felder: nicht signifikant; hellgraue Felder: statische Tendenz; dunkelgraue Felder: signifikant; Abkürzungserläuterung: siehe Tabelle 9.8; Tabelle 9.18: IgM-Plasmazellen: Tabellarische Darstellung der p-Werte des paarweisen Vergleichs der untersuchten Lokalisationen in horizontaler Richtung (Wilcoxon´s signed rank Test) VARIABLE KONTROLLTIERE IBD-TIERE p= p= D_J_1_DIFF 0,0024 0,3594 D_IL_1_DIFF 0,0020 keine Aussage erlaubt J_IL_1_DIFF 0,3203 keine Aussage erlaubt D_J_2_DIFF 0,0005 0,0195 D_IL_2_DIFF 0,0010 keine Aussage erlaubt J_IL_2_DIFF 0,00420 keine Aussage erlaubt D_J_3_DIFF 0,2334 0,3594 D_IL_3_DIFF 0,0010 keine Aussage erlaubt J_IL_3_DIFF 0,0137 keine Aussage erlaubt D_J_2/3_DIFF 0,0015 0,0977 D_IL_2/3_DIFF 0,0010 keine Aussage erlaubt J_IL_2/3_DIFF 0,0322 keine Aussage erlaubt D_J_DIFF 0,0010 0,0977 D_IL_DIFF 0,0010 keine Aussage erlaubt J_IL_DIFF 0,0322 keine Aussage erlaubt DUEDA_C_DIFF 0,0005 0,0156 weiße Felder: nicht signifikant; hellgraue Felder: statische Tendenz; dunkelgraue Felder: signifikant; keine Aussage erlaubt: aufgrund der stark unterschiedlichen Stichprobengrößen (Duodenum, Jejunum je n =9; Ileum: n=4) ist eine statistische Aussage über abhängige Stichproben nicht erlaubt; Abkürzungserläuterungen siehe Tabelle 9.9 166 9 ANHANG Tabelle 9.19: IgM-Plasmazellen: Tabellarische Darstellung der Lageparameter und p-Wert des Lagevergleiches (Wilcoxon´s rank-sum Test) LOKALISATION KONTROLLTIERE MEDIAN (P25;P75) IBD-TIERE MEDIAN (P25;P75) Duodenum_A1 VERGLEICH p-WERT 0,2705 1,97 1,63 (0,98; 4,19) (0,22; 3,26) Duodenum_A2 0,5458 9,40 13,06 (5,49; 11,86) (6,33; 14,92) Duodenum_A3 0,8590 14,02 15,14 (9,24; 15,73) (9,84; 15,93) Duodenum_A2/3 0,6441 10,70 13,36 (9,03; 14,00) (8,08; 17,00) Duodenum_A1/2/3 0,7491 7,85 9,31 (6,86; 9,95) (5,93; 11,33) Jejunum_A1 0,1446 0,33 0,70 (0,08; 0,92) (0,44; 1,61) Jejunum_A2 0,5458 5,81 2,84 (1,92; 7,64) (2,08; 4,01) Jejunum_A3 0,2707 11,30 8,63 (7,44; 13,88) (5,70; 9,24) Jejunum_A2/3 0,3028 8,64 5,01 (5,00; 11,65) (4,07; 7,32) Jejunum_A1/2/3 0,3744 5,86 3,42 (3,33; 7,91) (3,10; 5,13) Ileum_A1 0,8434 0,25 0,23 (0,14; 0,50) (0,00; 0,56) Ileum_A2 0,2145 3,98 0,18 (1,24; 4,54) (0,00; 2,35) Ileum_A3 0,9480 7,17 7,03 (3,16; 10,11) (3,97; 10,22) Ileum_A2/3 0,7441 4,64 4,44 (2,36; 7,78) (2,12; 6,99) Ileum_A1/2/3 0,7441 3,14 2,96 (1,62; 5,46) (1,45; 4,73) GZZ_Dünndarm 0,8036 6,33 6,77 (4,31; 6,95) (4,52; 7,22) Kolon_A2 0,7285 0,63 0,70 (0,51; 1,13) (0,36; 1,05) Kolon_A3 0,3348 1,81 1,52 (1,65; 2,77) (1,22; 2,47) GZZ_Kolon 0,3348 1,47 1,06 (1,14; 1,78) (0,92; 1,62) GZZ_Darm 0,9720 5,54 5,33 (3,87; 5,95) (3,59; 5,87) A1:Areal 1; A2: Areal 2; A3: Areal 3; Median: Median der ermittelten Zellzahlen bezogen auf eine Fläche von 10.000 µm2 der Lamina propria; GZZ-Dündarm: Gesamtzellzahl des Dünndarmes; GZZ_Darm: Gesamtzellzahl des Darmes insgesamt; P25: 25% Quartil; P75: 75% Quartil 167 9 ANHANG Tabelle 9.20: L1+ Zellen: Tabellarische Darstellung der p-Werte beim paarweisen Vergleich der Lokalisationen in vertikaler Richtung (Wilcoxon´s signed rank Test) VARIABLE D_1_2_DIFF D_1_3_DIFF D_2_3_DIFF D_Z_K_DIFF J_1_2_DIFF J_1_3_DIFF J_2_3_DIFF J_Z_K_DIFF IL_1_2_DIFF IL_1_3_DIFF IL_2_3_DIFF IL_Z_K_DIFF C_10_11_DIFF Abkürzungserläuterung: siehe Tabelle 9.8; Tabelle 9.21: KONTROLLTIERE p= 0,9667 0,7646 0,5693 0,7334 0,6772 0,0771 0,0269 0,2334 0,1641 0,5566 0,5566 0,3750 0,7334 IBD-TIERE p= 0,3125 0,1484 0,4609 0,1484 0,6404 0,5781 1,0000 0,9453 aufgrund der zu geringen Stichprobengröße (Ileum: n = 4) ist eine statistische Aussage nicht möglich 0,1563 L1+ Zellen: Tabellarische Darstellung der p-Werte beim paarweisen Vergleich der Lokalisationen in horizontaler Richtung (Wilcoxon´s signed rank Test) VARIABLE KONTROLLTIERE IBD-TIERE p= p= D_J_1_DIFF 0,2036 0,5469 D_IL_1_DIFF 0,3203 keine Aussage erlaubt J_IL_1_DIFF 0,7002 keine Aussage erlaubt D_J_2_DIFF 0,6772 0,7344 D_IL_2_DIFF 1,0000 keine Aussage erlaubt J_IL_2_DIFF 0,5771 keine Aussage erlaubt D_J_3_DIFF 1,000 0,2969 D_IL_3_DIFF 0,5195 keine Aussage erlaubt J_IL_3_DIFF 1,000 keine Aussage erlaubt D_J_2/3_DIFF 0,6221 0,4258 D_IL_2/3_DIFF 0,6377 keine Aussage erlaubt J_IL_2/3_DIFF 0,5771 keine Aussage erlaubt D_J_DIFF 0,5693 1,0000 D_IL_DIFF 0,5195 keine Aussage erlaubt J_IL_DIFF 0,4648 keine Aussage erlaubt DUEDA_C_DIFF 0,2061 0,3125 keine Aussage erlaubt: aufgrund der stark unterschiedlichen Stichprobengrößen (Duodenum, Jejunum je n =9; Ileum: n=4) ist eine statistische Aussage über abhängige Stichproben nicht erlaubt; Abkürzungserläuterungen siehe Tabelle 9.9 168 9 ANHANG Tabelle: 9.22 : L1+ Zellen: Tabellarische Darstellung der Lagevergleiches (Wilcoxon´s rank-sum Test) LOKALISATION KONTROLLTIERE MEDIAN (P25;P75) Lageparameter IBD-TIERE MEDIAN (P25;P75) Duodenum_A1 und p-Wert des VERGLEICH p-WERT 0,6697 0,35 0,61 (0,28; 2,52) (0,42; 1,84) Duodenum_A2 0,0755 1,26 0,26 (0,40; 2,60) (0,07; 0,45) Duodenum_A3 0,4084 0,34 0,29 (0,23; 0,84) (0,00; 0,61) Duodenum_A2/3 0,0817 0,87 0,22 (0,41; 1,63) (0,13; 0,78) Duodenum_A1/2/3 0,4138 0,81 0,66 (0,38; 2,07) (0,25; 0,94) Jejunum_A1 0,3372 1,25 0,51 (0,46; 3,22) (0,18; 1,77) Jejunum_A2 0,0507 0,94 0,37 (0,66; 1,88) (0,12; 0,93 Jejunum_A3 0,5432 0,67 0,67 (0,30; 1,87) (0,17; 0,89) Jejunum_A2/3 0,1098 0,75 0,52 (0,63; 1,83) (0,14; 0,91) Jejunum_A1/2/3 0,1886 1,12 0,68 (0,57; 1,94) (0,17; 0,95) Ileum_A1 0,7439 1,68 1,12 (0,55; 3,15) (0,59; 1,88) Ileum_A2 1,0000 1,35 0,84 (0,28; 1,86) (0,66; 1,66) Ileum_A3 0,7419 0,79 0,79 (0,24; 1,81) (0,00; 2,33) Ileum_A2/3 1,0000 0,90 1,55 (0,45; 1,68) (0,33; 2,72) Ileum_A1/2/3 0,9480 0,91 1,41 (0,74; 2,15) (0,42; 2,45) GZZ_Dünndarm 0,1106 1,37 0,82 (0,83; 3,69) (0,62; 0,94) Kolon_A2 0,5198 0,56 0,62 (0,39; 1,62) (0,14; 137) Kolon_A3 0,0049 1,03 0,45 (0,70; 1,53) (0,13; 0,58) GZZ_Kolon 0,2030 0,74 0,60 (0,58; 1,83) (0,20; 1,01) GZZ_Darm 0,0949 1,29 0,70 (0,82; 2,97) (0,57; 1,05) weiße Felder: nicht signifikant; hellgraue Felder: statische Tendenz; dunkelgraue Felder: signifikant; A1:Areal 1; A2: Areal 2; A3: Areal 3; Median: Median der ermittelten Zellzahlen bezogen auf eine Fläche von 10.000 µm2 der Lamina propria; GZZ-Dündarm: Gesamtzellzahl des Dünndarmes; GZZ_Darm: Gesamtzellzahl des Darmes insgesamt; P25: 25% Quartil; P75: 75% Quartil 169 9 ANHANG 9.4 Färbungsprotokolle H.E.-Färbung am Paraffinschnitt Entparaffinisieren der Schnitte in einer absteigenden Alkoholreihe beginnend mit Xylol 1-3 je 5 Min., Isopropanol 5 Min., dann 96%iges, 70%iges und 50%iges Ethanol je 2 bis 3Min., dann Aqua dest. 15 Min. in Hämalaun nach P. Mayer, 10 Min. in Leitungswasser bläuen, in Aqua dest. spülen, 1 Min. in Eosin 1%ig (Zugabe von 1 Tropfen Eisessig pro Küvette), in Aqua dest. spülen. Entwässern der Schnitte in einer aufsteigenden Alkoholreihe beginnend mit 70%igem, dann 96%igem Ethanol 2 bis 3 Min., Isopropanol 5 Min., dann Xylol 1- 3 je 5 Min. Eindecken in Roti-Histol (Eindeckmittel Roti-Histokitt, Roth C. GmbH & Co. KG, Karlsruhe) Lösungen für die H.E.-Färbung Hämalaun nach P. Mayer 1g Hämatoxylin in 1000 ml Aqua dest. lösen. 0,2g Natriumjodat und 50g chemisch reines Kalialaun (=Kaliumaluminiumsulfat-12-hydrat) dazugeben und erwärmen. Nach dem Erkalten: 50g Chloralhydrat und 1g kristalline Zitronensäure dazugeben und kalt lösen, danach filtrieren. Eosin 1%ig in Aqua dest. lösen. Nach dem Erkalten filtrieren, zum Färben auf 100ml Eosin 1%ig 2 Tropfen Eisessig geben. 9.5 Pufferrezepte für die Immunhistochemie Citratpuffer Herstellung der Endkonzentration aus Konzentrat (Fa. BIOCYC Gesellschaft für Biotechnologie und Recyclingverfahren mbH&Co., Luckenwalde): Eine Flasche Citrat-Puffer-Konzentrat mit Aqua dest. auf exakt 1 Liter auffüllen. 170 9 ANHANG Tween 20 200ml PBS und 0,5ml Tween 20 (Fa. Serva Feinbiochemica GmbH und Co KG, Heidelberg) lösen (mit Magnetrührer). 9.6 Vorbehandlungsmethoden für die Immunhistochemie Demaskierung mit Demaskierungslösung G Gebrauchsverdünnung aus Demaskierungslösung G und PBS im Verhältnis 1:4 herstellen. Lösung auf im Wasserbad auf 95°C erhitzen. Schnitte für 20 Min. im Wasserbad bei 95°C in der Demaskierungslösung G belassen. Anschließend Schnitte 10 Min abkühlen lassen. Demaskierung mit Citratpuffer in der Mikrowelle Schnitte in 600ml Gebrauchslösung Citratpuffer in der Mikrowellen-Küvette für 10-20 Min. (je nach Antikörper) bei 700 Watt in der Mikrowelle (Fa. Bauknecht) kochen lassen. Anschließend in der Lösung auf ca. 60°C abkühlen lassen. Demaskierung mit 0,05% Pronase E-Lösung 0,1g Pronase E [VWR TM International GmbH, Darmstadt (ehemals Merck KGaA, Darmstadt)] und 0,2g CaCl2 * 2 H2O [VWR TM International GmbH, Darmstadt (ehemals Merck KGaA, Darmstadt)] in 200ml vorgewärmtes PBS ansetzen und auf einem Magnetrührer auflösen, mit 1 N NaOH auf pH 7,4 einstellen. Schnitte darin 40 Min. bei 37°C im Brutschrank (Firma Heraeus, Hanau) belassen. 9.7 Reagenzien für die Immunhistochemie ABC-Gebrauchslösung (Vectastain-ABC-Kit Elite®, Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA) 20_l Lösung A und 20 _l Lösung B in 1 ml PBS, gut mischen. 30 Min. vor Gebrauch ansetzen. DAB-Gebrauchslösung Stammlösung: 100mg DAB in 50ml PBS, Lagerung bei –20°C, vor Gebrauch im Dunkeln auftauen lassen. Gebrauchslösung: 50ml Stammlösung in 150ml PBS lösen und 3ml 3%iges H2O2 zugeben. 171 9 ANHANG Lösung filtrieren (doppeltes Filterpapier) und auf dem Magnetrührer mischen. 9.8 Bezugsquellen für Chemikalien und Antikörper Bethyl Laboratories, Inc., Frankfurt Anti-feliner IgA-Antikörper aus der Ziege, A 20-1001F Anti-feliner IgG-Antikörper aus der Ziege, A20-117F Anti-feliner IgM-Antikörper aus der Ziege, A 20-100F Biologo, Dr. Hartmut Schultheiß e.K., Immunbiologische Produkte, Kronshagen Aszitesflüssigkeit von nicht-immunisierten Balb/c Mäusen, CL8100 Demaskierungslösung G, Peroxidase-Substratkit AEC (3-Amino-9-Ethyl-Carbazol), AE 002-3 BIOCYC Gesellschaft für Biotechnologie und Recyclingverfahren mbH&Co., Luckenwalde (Vertrieb quartett Immundiagnostika und Biotechnologie GmbH, Berlin) Pro Taqs Citrat-Puffer-Konzentrat, 400300692 BfB (Bundesmonopolverwaltung für Branntwein) Verwertungsstelle für Agraralkohol, Offenbach am Main Ethanol unvergällt (mind. 99,8% Vol), Sorte 510 DakoCytomation GmbH (ehemals Dako® Diagnostika GmbH), Hamburg Anti-humaner CD3-Antikörper, polyklonal aus dem Kaninchen, A 0452 Anti-humaner L1-Antikörper, monoklonal aus der Maus, Klon: MAC387, M0747 Roth C. GmbH & Co. KG, Karlsruhe Chloralhydrat, 2425 Eindeckmittel Roti®-Histokitt, 6638.1 Essigsäure-n-butylester (EBE), 4600.7 Ethanol, vergällt, K928.2 Hämalaunlösung nach Mayer, T865.2 Natriumchlorid (NaCl), P029.2 172 9 ANHANG Natriumjodat p.a., 6549 2-Propanol (Isopropanol) Rotipuran® 9866.4 Rotiprotect®-Nitrilhandschuhe, P777.1 Roti®-Histol, 6640.2 Salzsäure Rotipuran® 25% p.a., 6331.3 Serva Feinbiochemica GmbH und Co Kg, Heidelberg Bovines Serumalbumin (BSA), 11930 Tween® 20 pure, 37470 Shandon/Firma ThermoElectron Corporation, Pittsburgh PA, USA Paraplast Plus Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen (ehemals Sigma, Fluka, Riedel de Haën) Aceton, 24201 Citronensäure-1-hydrat p.a., 33114 3,3’-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid Dihydrat purum (DAB) p.a., 32750 Isopentan (N-Methylbutan), 59080 Natriumdihydrogenphosphat wasserfrei, 71496 Natriumchlorid, 71381 Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA, über Biologo, Kronshagen Biotinyliertes Ziege-anti-Kaninchen-IgG (H+L), BA 1000 Biotinyliertes Ziege-anti-FITC (H+L), BA-0601 Biotinyliertes Ziege-anti-Maus IgG (H+L), BA-9200 Vectastain Elite ABC-Kit, PK-6100 VWR TM International GmbH, Darmstadt (ehemals Merck KGaA, Darmstadt) Calciumchlorid-2-hydrat krist., 2382 Formaldehydlösung, mind. 37%., 1.03999 Natriumhydroxid-Plätzchen (NaOH) p.a., 1.06498 Natronlauge, 1.09137 Pronase E (aus Streptomyces griseus), 0743 173 9 ANHANG Salzsäure (HCl) 1N, 1.09057 Salzsäure (HCl) 2N, 1.09063 Wasserstoffperoxid 30% H2O2 (Perhydrol®) p.a., 1.07209 9.9 Bezugsquellen für Geräte und Einmalartikel Bauknecht Mikrowelle Excellence MWS 2924 Gerhard Menzel Glasbearbeitungswerk GmbH & Co. KG, Braunschweig SuperFrost®Plus Objektträger, 041300 Firma Heraeus, Hanau Wärmeschrank B5042 W. Knittel Glasbearbeitungs GmbH, Braunschweig Deckgläser Objektträger Köttermann Labortechnik Wasserbad Typ 3047 Leica Microsystems NussWell GmbH, Wetzlar Färbeautomat Leica ST 4040 Firma Leitz, Oberkochen Mikroskop, Labolux Medite Medizintechnik, Burgdorf Objektträger-Eindeckautomat Promounter RCM 2000 Paraffinstreckbad TFB45 174 9 ANHANG Firma Microm, Heidelberg Schlittenmikrotom HM 400R Firma Olympus, Hamburg Mikroskop BX41TF Videokamera Color View Soft Imaging System U-TV1X-2 Polaroid, Massachusetts, USA Kamera MP 4 Sartorius AG, Göttingen Sartorius excellence Präzisionswaage E1200S Papierfaltenfilter 270 mm Durchmesser, FT-4-303-270 Schleicher & Schuell, Dassel Papierfilter, S&S Rundfilter 150 mm Durchmesser, 311612 Shandon/Firma ThermoElectron Corporation, Pittsburgh PA, USA Shandon Coverplates®, 72110013 Shandon Sequenza® Slide Racks (Einsätze für Coverplates), 7331017 Automatensystem Tissue-Tek III ®, Einbettsystem 175 9 ANHANG 9.10 Abkürzungsverzeichnis APC engl.: antigen presenting cells (antigenpräsentierende Zellen) ALT Alanin-Amino-Transferase AP Alkalische Phosphatase CAM engl.: cellular adhesion molecule (zelluläre Adhäsionsmoleküle) CD engl.: Cluster of differentiation (System zur Bezeichnung von Antigenen zur Leukozytendifferenzierung) CIE chronische idiopathische Enteritis CTLA4 cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 (hochaffiner Rezeptor für B7 Moleküle auf T-Zellen) DAB 3`3-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid d.h. das heißt engl. englisch et al. et alii (lat. und andere) evtl. eventuell Fa. Firma FeLV Felines Leukämie Virus FIV Felines Immundefizienz Virus FITC Fluoreszeinisothiocyanat FOXP3 Mitglied der Familie der forkhead/winged-helix Familie von Transkriptionsfaktoren. Es handelt sich um den Hauptfaktor der Entwicklung und Funktion von regulatorischen T-Zellen. GALT engl.: gut-associated lymphoid tissue (Darm-assoziiertes lymphatisches Gewebe) ggr. geringgradig HE Hämatoxylin-Eosin hgr. hochgradig IBD inflammatory bowel disease IEL Intraepitheliale Lymphozyten IgA Immunglobulin A 176 9 ANHANG IgG Immunglobulin G IgM Immunglobulin M IL Interleukin INF-γ Interferon-gamma iNOS induzierbare NO-Synthase lat. lateinisch Lfd.Nr. laufende Nummer LPE Lymphoplasmazelluläre Enteritis LPEK Lymphoplasmazelluläre Enterokolitis LPK Lymphoplasmazelluläre Kolitis mgr. mittelgradig MAdCAM-1 mucosal addressin cellular adhesion molecule-1 MHC engl.: major histocompatibility complex (Haupthistokompatibilitätskomplex) PAS engl.: periodic acid shift PLE engl.: protein losing enteropathy (Proteinverlust Enteropathie) RT-PCR engl: reverse transkriptase polymerase chain reaction SIBO engl.: small intestinal bacterial overgrowth TCR engl.: T cell-receptor (T-Zellrezeptor) TGF engl.: transforming growth factor TH1 T-Helfer-Zellen Typ 1 TH2 T-Helfer-Zellen Typ 2 TH3 T-Helfer-Zellen Typ 3 TLI Trypsin-like Immunoreactivity TLR engl.:Toll-like Receptor TNF Tumornekrosefaktor u. und u.a. und andere ZNS Ziegen-Normalserum z.T. zum Teil 177 Mein besonderer Dank gilt… …Frau Prof. M. Hewicker-Trautwein, für die Überlassung des hoch interessanten Themas, die Bereitstellung des Untersuchungsmaterials, die wissenschaftliche Betreuung, die gute Zusammenarbeit sowie die jederzeit gewährte freundliche Unterstützung und Beratung bei der Durchführung dieser Arbeit, besonders in der Endphase. …Sven Kleinschmidt für seinen fachlichen Rat und die zahlreichen Tipps rund um die Immunhistochemie und Morphometrie und den „AnalySIS“, sowie die Durchsicht des Manuskripts. …Herrn K.-P. Kuhlmann für die Einarbeitung in die Labortechniken, seine Unterstützung und die jederzeit gewährten Ratschläge. …meinen Bürokolleginnen und Freundinnen Renate und Jasmine für ihren fachlichen und freundschaftlichen Rat, ihr offenes Ohr, die zahllosen schönen Gespräche und die tolle Atmosphäre bei uns. …Anne, Kathrin und Christiane für die schönen mittäglichen Spaziergänge mit fachlichem und freundschaftlichem Austausch. …Claudia für die zügige und kritische Durchsicht des Manuskripts. …meinen Freunden für zahlreiche schöne Stunden und ihr Verständnis dafür, dass ich mich während der Anfertigung dieser Arbeit sehr zurückgezogen und darüber wahrscheinlich so manch` drückenden Schuh übersehen habe. ….Alex für ihre konstruktiven, strukturierten und freundschaftlichen Ratschläge, ihr geduldiges Zuhören, ihre Beharrlichkeit, ihren Glauben an mich, ihre bedingungslose Freundschaft und die zahllosen Ablenkungsmanöver unter anderem während der MittagsHuRus und bei schön-anstrengenden Nächten im Heinz. …meinem Freund Andi, dem ich für seine unendliche Geduld und Zuversicht, die liebevolle Unterstützung, sein großes Verständnis und so manchen wertvollen Rat eigentlich nicht genug danken kann. Ohne seine Liebe und seinen Beistand wäre diese Arbeit sicherlich erheblich schwieriger und der Weg sehr viel steiniger gewesen. Der größte Dank gebührt meiner Mutter, Ilse Marsilio, die mir das Studium und diese Dissertation nicht nur finanziell, sondern vor allem auch moralisch ermöglicht hat. Die mir stetig verlässlichen Rückhalt gibt und mir jederzeit mit unerschütterlicher Zuversicht, ihrem Glauben an mich und ihren mütterlichen Ratschlägen zur Seite steht (und die mich immer zum Essen einlädt).
