Kruhm_Michaela_Aspergillus_fumigatus

Identifizierung und Isolierung
Aspergillus fumigatus spezifischer T-Zell-Rezeptoren
und funktionelle Charakterisierung nach Transfer auf
humane T-Zellen
Dissertation zur Erlangung des
naturwissenschaftlichen Doktorgrades
der Bayerischen Julius-Maximilians-Universität Würzburg
vorgelegt von
Michaela Kruhm
aus Kassel
Würzburg 2014
Eingereicht am: 14.08.2014
Mitglieder der Promotionskommission:
Vorsitzender: Herr Prof. Dr. Engstler (Dekan)
Gutachter:
Herr Prof. Dr. Topp
Gutachter:
Herr Prof. Dr. Benz
II
Erklärung:
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig verfasst habe. Es
wurden nur die in der Arbeit angegebenen Hilfsmittel verwendet. Die Stellen, die
dem Wortlaut oder Sinne nach anderen Arbeiten entnommen wurden, sind durch
Angaben der Quellen kenntlich gemacht worden. Diese Arbeit hat weder in gleicher
noch in ähnlicher Form in einem anderen Prüfungsverfahren vorgelegen. Ich erkläre
weiterhin, dass ich, außer den mit dem Zulassungsgesuch urkundlich vorgelegten
Graden, keine akademischen Grade erworben habe, noch versucht habe zu
erwerben. Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen
und Gewissen vollständig und der Wahrheit entsprechend gemacht habe.
Datum, Unterschrift:
13.08.2014
III
Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit vom 15.03.2008 bis 13.08.2014 an der
medizinischen Klinik und Poliklinik II in der Abteilung für Translationale
Immuntherapie der Bayerischen Julius-Maximilians-Universität Würzburg unter
Anleitung von PD Dr. Max S. Topp angefertigt.
IV
Für meine Familie
V
Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Hermann Einsele und Prof. Max Topp für die
Möglichkeit diese Arbeit anzufertigen und ihre Unterstützung während der
Erstellung.
Ferner möchte ich mich bei Prof. Dr. Roland Benz für die Begutachtung der
Dissertation bedanken.
Des Weiteren bedanke ich mich besonders bei den Doktoren Tanja Bedke und
Carsten Berges für die wertvollen Hilfestellungen und Anregungen. Frau Dr. Claudia
Stühler und Frau Dr. Nina Khanna für die wissenschaftlichen Diskussionen. Für die
Informationen im Bereich des T-Zell-Rezeptor Transfers bedanke ich mich bei
Dr. Daniel Sommermeyer und Dr. Michael Hudecek. Zudem gilt mein Dank
Dr. Sabine Britting und Dr. Dragana Slavkoviv-Lukic für die hilfreiche Unterstützung
und Beratung während der abschließenden Ausarbeitungen.
Nicht zuletzt möchte ich mich bei meiner Familie und meinen Freunden für die
Motivation und Unterstützung während der letzten Jahre bedanken.
VI
Inhaltsverzeichnis
1 Zusammenfassung ............................................................................................ 11
2 Summary ............................................................................................................ 13
3 Einleitung ........................................................................................................... 14
3.1 Der Pilz Aspergillus fumigatus....................................................................... 14
3.2 Angeborene und erworbene Immunität gegen Aspergillus fumigatus ............ 15
3.2.1 Angeborene Immunität gegen Aspergillus fumigatus ......................... 15
3.2.2 Erworbene Immunität gegen Aspergillus fumigatus ........................... 16
3.2.3 Strategien von Aspergillus fumigatus dem Immunsystem
auszuweichen .................................................................................... 18
3.3 Klinische Relevanz von Aspergillus fumigatus Infektionen ............................ 19
3.3.1 Behandlungsstrategien von Aspergillus fumigatus Infektionen........... 19
3.4 Antigenerkennung durch T-Zellen ................................................................. 21
3.4.1 Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) .......................................... 21
3.4.2 αβ T-Zell-Rezeptor ............................................................................ 22
3.4.3 Die Umordnung der T-Zell-Rezeptor Gene ........................................ 24
3.4.4 αβ T-Zell-Rezeptor Komplex .............................................................. 25
3.4.5 αβ T-Zell-Rezeptor Signalübertragung ............................................... 26
3.5 T-Zell-Rezeptor Optimierungen und der T-Zell-Rezeptor Transfer
auf T-Zellen................................................................................................... 26
4 Ziele der Arbeit................................................................................................... 29
5 Materialien .......................................................................................................... 31
5.1 Medien, Versuchssysteme, Chemikalien und Reagenzien ............................ 31
5.1.1 Kulturmedien und Zusätze ................................................................. 31
5.1.2 Versuchssysteme .............................................................................. 32
5.1.3 Chemikalien und Reagenzien ............................................................ 32
5.2 Hergestellte Medien und Puffer ..................................................................... 33
5.3 Crf1/p41 Peptid und MHC Klasse II Tetramer ............................................... 33
5.4 Fluoreszenz- konjugierte Antikörper für die Durchflusszytometrie ................. 34
5.5 Retroviraler Vektor pMP71 und Oligonukleotide ............................................ 34
5.5.1 Retroviraler Vektor pMP71 ................................................................ 34
5.5.2 Oligonukleotide .................................................................................. 35
5.6 Zelllinien und Bakterien ................................................................................. 36
5.6.1 Zelllinien ............................................................................................ 36
5.6.2 Bakterien ........................................................................................... 36
5.7 Verbrauchsmaterialien .................................................................................. 37
5.8 Verwendete Analyse- Computerprogramme ................................................. 37
VII
6 Methoden............................................................................................................ 39
6.1 Kultivierung humaner Zellen und Zelllinien .................................................... 39
6.1.1 Zellen und ihre Kultivierungsbedingungen ......................................... 39
6.1.2 Bestimmung der Zellzahl und Zellvitalität ........................................... 39
6.1.3 Einfrieren und Auftauen von Zellen .................................................... 40
6.2 Isolierung von Zellpopulationen..................................................................... 40
6.2.1 Isolation peripherer mononukleärer Zellen aus Vollblut gesunder
Spender ............................................................................................. 40
6.2.2 Isolation von CD4+ T-Zellen via magnetischer Zell-Separation .......... 40
6.2.3 Isolation und Kultivierung von Monozyten .......................................... 41
6.2.4 Generierung dendritischer Zellen aus Monozyten .............................. 41
6.3 Stimulation und Klonierung von T-Zellen ....................................................... 41
6.3.1 Stimulation von T-Zellen und Generation A. fumigatus
spezifischer T-Zelllinien ..................................................................... 41
6.3.2 Klonierung von Crf1/p41 spezifischen T-Zellen über
Grenzverdünnung (limiting dilution) ................................................... 42
6.3.3 Expansion humaner T-Zellklone und T-Zell-Rezeptor
transduzierter T-Zellen....................................................................... 42
6.4 Phänotyp-Analyse und Untersuchungen der Effektor-Funktion
von T-Zellen .................................................................................................. 43
6.4.1 Restimulation von T-Zellen und T-Zell-Rezeptor transduzierten
T-Zellen ............................................................................................. 43
6.4.2 Interferon-γ Enzym- Linked- Immunosorbent Assay .......................... 43
6.4.3 Durchflusszytometrische Messungen ................................................ 44
6.4.4 Bestimmung der T-Zell-Rezeptor β Kette von Crf1/p41
spezifischen Klonen mittels Durchflusszytometer .............................. 45
6.4.5 MHC Klasse II Tetramer Färbung ...................................................... 46
6.4.6 Messung der Proliferation nach Crf1/p41 spezifischer Stimulation ..... 46
6.4.7 Cytometric Bead Array (CBA) ............................................................ 46
6.5 Isolation und Identifizierung von T-Zell-Rezeptor Ketten ............................... 47
6.5.1 Isolation von RNA aus Crf1/p41 spezifischen T-Zellklonen ................ 47
6.5.2 Isolation und Identifikation unbekannter T-Zell-Rezeptor
Sequenzen mittels RACE-PCR.......................................................... 48
6.5.3 Gelelektrophorese ............................................................................. 50
6.6 Klonierung retroviraler Vektoren und Transduktion in humane Zelllinien
und primäre T-Zellen ..................................................................................... 50
6.6.1 Klonierung retroviraler Vektoren mit A. fumigatus
spezifischen T-Zell-Rezeptoren ......................................................... 50
6.6.2 Produktion von retroviralem Kulturüberstand ..................................... 53
VIII
6.6.3 Transduktion von humanen Zelllinien und primären T-Zellen mit
A. fumigatus spezifischen T-Zell-Rezeptoren..................................... 53
7 Ergebnisse ......................................................................................................... 55
7.1 Generierung A. fumigatus spezifischer T-Zellklone ....................................... 55
7.1.1 Expansion Crf1/p41 spezifischer T-Zellen.......................................... 55
7.1.2 Spezifitätstest der hergestellten T-Zellklone
via Crf1/p41 Tetramer ........................................................................ 56
7.1.3 Interferon-γ Produktion der Crf1/p41 spezifischen T-Zellklone ........... 61
7.2 Identifizierung und Isolierung A. fumigatus spezifischer
T-Zell-Rezeptoren ......................................................................................... 64
7.2.1 Identifizierung der T-Zell-Rezeptor β Ketten mit
dem IO Beta Mark Kit (Beckman Coulter) .......................................... 64
7.2.2 Identifizierung der T-Zell-Rezeptor β Ketten durch
SMARTer RACE PCR ....................................................................... 66
7.2.3 Identifizierung der T-Zell-Rezeptor α Ketten ...................................... 69
7.2.4 Isolierung der T-Zell-Rezeptor α und β Ketten und
Klonierung in den retroviralen Vektor pMP71..................................... 70
7.3 Transfer von A. fumigatus spezifischen T-Zell-Rezeptoren auf
Jurkat 76 Zellen ............................................................................................ 72
7.4 Transfer eines Codon- und Vektor- optimierten T-Zell Rezeptor
auf Jurkat 76 ................................................................................................. 73
7.5 Transfer von A. fumigatus spezifischen T-Zell-Rezeptoren auf
humane CD4+ T-Zellen .................................................................................. 76
7.5.1 Isolation und Expansion CD4+ T-Zellen mit optimiertem TCR 1 ......... 78
7.6 Proliferation und Zytokinproduktionsanalyse TCR 1 optimiert
transduzierter T-Zellen nach Crf1/p41 spezifischer Stimulation ..................... 79
8 Diskussion ......................................................................................................... 83
8.1 Die T-Zellantwort von Crf1/p41 ist polyklonal ................................................ 83
8.2 Der endogene TCR verringert die Oberflächenexpression von
transduzierten Crf1/p41 spezifischen T-Zell-Rezeptoren auf T-Zellen ........... 84
8.3 Optimierung des Vektors pMP71 (TCR 1 optimiert) führt zu einer
erhöhten Expression von TCR 1 auf Jurkat 76 Zellen und
primären CD4+ T-Zellen ................................................................................ 85
8.4 Die Spezifität und Funktionalität der Crf1/p41 spezifischen
T-Zell-Rezeptor transduzierter auf CD4+ T-Zellen wurde bestätigt ................ 87
8.5 Einsatzmöglichkeiten funktioneller Crf1/p41 spezifischer
T-Zell-Rezeptor transduzierter T-Zellen ........................................................ 88
8.6 Fazit und Ausblick ......................................................................................... 89
9 Literaturverzeichnis ........................................................................................... 91
IX
10 Anhang .................................................................................................................. i
10.1
Abkürzungen .........................................................................................i
10.2
Publikationen ....................................................................................... iv
X
Zusammenfassung
1
Der
Zusammenfassung
humanpathogene
Pilz
Aspergillus fumigatus
(A. fumigatus)
kann
in
immunsupprimierten Patienten zum Teil schwere invasive Infektionen auslösen. Trotz
Fortschritten in den Behandlungsmöglichkeiten und der medikamentöser Prophylaxe
bleibt die Sterblichkeitsrate bei invasiven Erkrankungen hoch. Aus diesem Grund ist die
Entwicklung von spezifischeren Immuntherapien von Nöten. Ein Ansatz ist die genetische
Modifikation von T-Zellen, durch den Transfer von A. fumigatus spezifischen
T-Zell-Rezeptoren (TCRs), für eine adoptive Therapie. Um dieses Konzept zu evaluieren
wurden TCRs, die für die extrazellulären Zellwandglykonase Crf1 (Crf1/p41) spezifisch
sind, auf primäre T-Zellen transferiert und die Effektor-Funktion analysiert.
Das
Crf1/p41
Epitop induziert
bei
gesunden
Spendern
eine funktionelle TH1
Immunantwort gegen A. fumigatus und führt zur Produktion hoher Mengen von
Interferon-γ (IFN-γ). Für die Identifikation von A. fumigatus spezifischen TCRs wurden
siebenunddreißig Crf1/p41 spezifische T-Zellklone von drei HLA-DRB1*04 Spendern
generiert.
Anschließend
wurden
komplementaritätsbestimmende
die
Region
TCR
3
β
Ketten
(CDR3)
über
bestimmt.
die
Es
sehr
variable
konnten
zwölf
unterschiedliche TCRs ermittelt werden, von denen vor allem die variablen β (Vβ) Kette
18 sehr dominant, während die Vβ Ketten 1 und 6 nur in wenigen Klonen vertreten waren.
Zur weiteren Charakterisierung der Crf1/p41 spezifischen TCRs wurden die variablen α
(Vα) Ketten bestimmt (Vα 3, Vα 15 und Vα 26). Somit liegt eine polyklonale T-Zell
Immunantwort vor. Anschließend wurden die Crf1/p41 spezifischen TCRs in den
retroviralen Vektor pMP71 kloniert und auf Jurkat 76 Zellen, welche keinen endogenen
TCR exprimieren, und auf primäre CD4+ T-Zellen transferiert. Die Expression von
Crf1/p41 spezifischen TCRs, transduziert in CD4+ T-Zellen, zeigten spenderspezifische
Unterschiede und die Expression war niedriger im Vergleich zu den transduzierten
Jurkat 76 Zellen. Daher wurde auf Optimierungsstrategien zurückgegriffen, die für den
adoptiven Transfer mit TCR-modifizierten T-Zellen zur Behandlung von Krebs entwickelt
wurden. Angewandt wurden die Codonoptimierung der TCR codierenden Sequenz,
Murinisierung der TCR konstanter Ketten, Induktion einer weiteren Disulfidbrücke.
Ebenfalls wurde das Vektorsystem optimiert. Der Optimierungsprozess der Crf1/p41
spezifischen TCR 1 führte zu einer erhöhten Oberflächenexpression des TCR sowohl in
Jurkat 76 (3 bis 5fach) als auch in primären CD4+ T-Zellen (2fach). In funktionellen
Analysen wurde die Proliferationsfähigkeit und IFN-γ Produktion, durch die Stimulation
von transduzierten CD4+ T-Zellen (TCR 1 optimiert) mit Crf1/p41 beladenen dendritischen
Zellen (DCs), bestätigt.
11
Zusammenfassung
Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass der Transfer von A. fumigatus spezifischen
TCRs eine protektive anti-fungale Immunantwort fördern könnte. Demzufolge auch als ein
geeignetes Mittel in einer potentiellen Immuntherapie gegen A. fumigatus Infektionen in
immunsupprimierten Patienten, eingesetzt werden könnte.
12
Summary
2 Summary
The human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) can cause severe
invasive infections in immunosuppressed patients. Despite progresses in the treatment
and prophylaxis of invasive infections the mortality rate remains high. On that account the
development of a more specific immune therapy seems necessary. One approach is
genetic modification of T-cells by transfer of A. fumigatus specific T-cell-receptors (TCR)
for an adoptive therapy. To evaluate this concept, TCRs specific for a peptide derived from
extracellular cell wall glucanase Crf1 (Crf1/p41) were transferred to primary T cells. Than
their effector function was analyzed.
In healthy donors the epitope Crf1/p41 induces a functional TH1 immune response
towards A. fumigatus combined with a high Interferon-γ (IFN-γ) production. To identify A.
fumigatus specific TCRs, thirty-seven Crf1/p41 specific T-cell clones were generated from
three HLA-DRB1*04 positive healthy donors. Afterwards, the TCR β chains were analyzed
by sequencing the most variable complementarity determining region 3 (CDR3). Twelve
different TCRs were detected whereas variable β (Vβ) 18 was very dominant, and Vβ 1
and Vβ 6 were present only in some clones. For further characterization of Crf1/p41
specific TCRs, variable α (Vα) chains were identified (Vα 3, Vα 15 and Vα 26). Thus, the
T-cell response is polyclonal. Subsequently Crf1/p41 specific TCRs were cloned into the
retroviral vector pMP71 and transduced into Jurkat 76 cells that lack the expression of
endogenous TCR, and into primary CD4+ T-cells. The expression of Crf1/p41 specific
TCR transduced in CD4+ T-cells was donor-dependent and the expression was lower
compared to transduced Jurkat 76 cells. Consequently, optimizing strategies engineered
for TCR-modified adoptive T-cell transfer in cancer therapy were used to induce a higher
TCR expression on T cells. Those strategies include codon-optimization of the TCR
coding sequence, murinization of constant chains of TCR, induction of an additional
disulfide bond. Additionally the vector system was optimized. The optimization process of
Crf1/p41 TCR 1 led to a higher surface expression in Jurkat 76 (3-5x) and primary CD4+
T-cells (2x). Functional analyses revealed proliferation and IFN-γ production after the
stimulation of transduced CD4+ T-cells (TCR 1 optimiert) with Crf1/p41 pulsed mature
dendritic cells (mDC).
These data suggest that the transfer of A. fumigatus specific TCRs might foster protective
anti-fungal
immune
responses.
Therefore
this
might
be
a
suitable
tool
immunotherapeutic use against A. fumigatus infections in immunosuppressed patients.
13
for
Einleitung
3
Einleitung
3.1
Der Pilz Aspergillus fumigatus
Der Pilz Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) gehört zu den Schimmelpilzen (Phylum
Ascomycota (Schlauchpilze)) und ist ein weltweit verbreiteter Saprobiont. Die Gattung
Aspergillus (Gießkannenschimmel) besitzt einen Aspergillus-förmigen Sporenträger
(Konidiophore), deren Konidien klein (2-3 µm) und widerstandsfähig gegenüber extremen
Temperaturen und Dehydratisierung sind. Kommt es zur Keimung der Konidien, so bilden
sich zunächst einzelne Hyphen, die sich zu einem Myzel verzweigen. An deren
Oberfläche bilden sich einzelne Konidophoren, die wiederum 10.000 neue Konidien bilden
und sich als Bestandteil des Aerosols der Luft verteilen (45-110 Sporen m3, maximale
Messung 100.000 Sporen m3) (Abbildung 1). Der Pilz besitzt die Fähigkeit, auf vielen
verschiedenen Substraten bei einem breiten Spektrum von Umweltbedingungen zu leben,
so zum Beispiel auch auf lebendem und totem Gewebe von Menschen und Tieren (KwonChung et al. 2013).
Abbildung 1: Konidiophore und Hyphe von A. fumigatus. Eine Rasterelektronenmikroskopische
Aufnahme der Konidiophoren von A. fumigatus (Latge 2001) (A). Schematische Darstellung der
Konidiophore und der Hyphe von A. fumigatus (Romani 2004) (B).
A. fumigatus gehört zu den humanpathogenen Pilzen (Latge 2001; Romani 2011; KwonChung et al. 2013). Ein gesundes Immunsystem verhindert in der Regel eine Infektion,
jedoch
können
Allergien
(bronchopulmonale
Aspergillose),
Aspergillome
und
insbesondere bei immunsupprimierten Patienten eine invasive Aspergillose durch den Pilz
ausgelöst werden (siehe 3.3).
14
Einleitung
3.2
Angeborene und erworbene Immunität gegen Aspergillus fumigatus
Die Immunabwehr kann in zwei voneinander abhängige Bereiche unterteilt werden. Zum
einen die angeborene Immunität und zum anderen die erworbene Immunität. Die
Mechanismen der angeborenen Immunität sind vor allem die physiologischen Barrieren
(z.B. Epithelien), die Opsonisierung durch das Komplementsystem, die zellvermittelte
Phagozytose (z.B. durch Makrophagen und Granulozyten) und die natürlichen Killerzellen
(NK), die eine Apoptose induzieren können. Die erworbene Immunität beinhaltet die
humorale
und
zellvermitteltende
Immunität,
verbunden
mit
der
Fähigkeit
ein
immunologisches Gedächtnis auszubilden. Die Zellen der erworbenen Immunität sind
T-Lymphozyten und B-Lymphozyten. Die Stimulation von angeborenem Immunsystem
aktiviert das erworbene Immunsystem, welches wiederum die protektiven Mechanismen
des angeborenen Immunsystems verstärken (Brown 2011; Romani 2011; Wuthrich et al.
2012).
3.2.1
Angeborene Immunität gegen Aspergillus fumigatus
Eingeatmete Aspergillus Konidien werden in erster Instanz durch die Barrierefunktion der
Haut und der mukosalen Epithelzellen der Oberfläche des Respirationssystems bekämpft.
Wesentliche
Abwehrmechanismen
sind
die
Opsonisierung,
durch
das
Komplementsystem, sowie die Sekretion von Defensin und Kollektin, welche eine
vielfältige mikrobielle Aktivität gegen Bakterien und Pilzen besitzen (Alekseeva et al. 2009;
Romani 2011). Konidien, die der Phagozytose und Zerstörung durch alveolare
Makrophagen entkommen, können sprossen und zu Hyphen auswachsen. Neutrophile
Granulozyten (polymorphkernige Leukozyten) können Konidien, sprossende Konidien und
Hyphen attackieren. Von den neutophilen Granulozyten werden bevorzugt Pilzstrukturen
von Hyphen phagozytiert, welche effektiv in intrazellulären Vesikeln zerstört werden
(Schaffner et al. 1982). Dies wird mit Hilfe von Enzymen, die in der Granula gespeichert
werden, erreicht. Sind die Pilzstrukturen zu groß für eine Phagozytose, produzieren und
setzen
neutrophile
Granulozyten
toxische
Substanzen
frei,
wie
zum
Beispiel
Sauerstoffderivate, Stickoxid und mikrobiell aktive Peptide (Defensine und kationische
Proteine) (Brown 2011). Für Patienten mit anhaltender Neutropenie ist das Risiko hoch an
einer Aspergillus Infektion zu erkranken. Dies weist auf die Wichtigkeit, der durch
neutrophile Granulozyten vermittelte Immunantwort, zur Bekämpfung von Aspergillus
Infektionen, hin (Marr et al. 2002). Für die Erkennung der sogenannten Pathogenassoziierten molekularen Muster (PAMPs; pathogen-associated molecular patterns) sind
die Mustererkennungs- Rezeptoren (PRRs; pattern recognition receptor), wie Toll-like
Rezeptoren (TLRs), C-Typ Lektin Rezeptoren (CLRs) und Proteine der Galektin Familie
15
Einleitung
zuständig (van de Veerdonk et al. 2008). PAMPs sind vor allem Strukturen der fungalen
Zellwand, wie β-Glucane, Chitin und Mannane sowie fungale Nukleinsäuren. Nach der
Erkennung der PAMPs durch die PRRs werden, über Signaltransduktion, Immunzellen
aktiviert, was zur Phagozytose der Konidien und zur Produktion inflammatorischer
Zytokine und Chemokine führt. Diese wiederum verstärken die Aktivierung weiterer
Immunzellen der angeborenen Immunität, wie polymorphkernige Leukozyten (PMN) und
dendritische Zellen (DC) am Ort der Infektion (Gersuk et al. 2006). Dabei verbinden die
DCs die Mechanismen der angeborenen mit der erworbenen Immunität, indem sie durch
PRR-vermittelte Zytokinausschüttung die T-Zell Immunantworten beeinflussen (Wuthrich
et al. 2012).
3.2.2
Erworbene Immunität gegen Aspergillus fumigatus
Neben der angeborenen Immunität hat sich die erworbene Immunität als ein wichtiger
Faktor in der Bekämpfung von A. fumigatus Infektionen erwiesen. In Tiermodellen konnte
durch die Restimulation von immunisierten Tieren mit A. fumigatus Konidien oder anderen
fungalen Antigenen ein Immungedächtnis nachgewiesen werden (Cenci et al. 1997; Cenci
et al. 2000; Ito et al. 2006). Auch der adoptive Transfer von T-Zellen immunisierter Tiere
wirkte lebensverlängernd auf infizierte Tiere (Cenci et al. 2000). Lymphozyten gesunder
Menschen, stimuliert mit A. fumigatus Antigenen, besitzen die Fähigkeit zu proliferieren
und Zytokine wie Interferon-γ (IFN-γ) zu produzieren, was eine erworbene Immunität und
ein Immungedächtnis nachweist (Grazziutti et al. 1997; Hebart et al. 2002; Beck et al.
2006). Die adaptiven Immunantworten und das Immungedächtnis gegen A. fumigatus
werden durch DCs induziert, welche mit Bestandteilen von Konidien und Hyphe
beladenen sind. Die beladenen DCs initiieren die Differenzierung verschiedener
T-Helferzellen (TH). Abhängig vom Aktivierungsprofil der DC und vom Immunstatus des
Wirtes können CD4+ T-Zellen zu T-Helferzellen Typ 1 (TH1), T-Helferzellen Typ 2 (TH2),
T-Helferzellen Typ 17 (TH17) oder regulatorischen T-Zellen (Treg) differenzieren (Romani
2011; Wuthrich et al. 2012) (Abbildung 2). T-Zellen der erworbenen Immunität sind vor
allem für die Regulation der Balance zwischen toleranzbildenden und inflammatorischen
Immunantworten verantwortlich (Romani et al. 2007; Romani 2008).
Insbesondere TH1 Immunantworten spielen eine entscheidende Rolle in der Immunität
gegen A. fumigatus. Die pro-inflammatorischen Zytokine Interleukin- (IL)-12 und
Tumor-Nekrose-Faktor α (TNF-α) induzieren eine Differenzierung von TH1 Zellen, welche
Interferon-γ (IFN-γ) und koloniestimulierende Faktoren (CSF) ausschütten. Durch IFN-γ
und CSF werden die Zellen der angeborenen Immunität stimuliert, welche die Infektion
bekämpfen (Romani 2008; Romani 2011).
16
Einleitung
TH2 Immunantworten können zu fungaler Allergie führen oder sogar die Infektion
verstärken. Dabei zeigen Patienten mit einem Rückfall oder einer Verstärkung der
Infektion oft eine schwache IFN-γ Produktion mit einer erhöhten Produktion von TH2
Zytokinen, wie IL-4 und IL-10. Zudem kommt es zu einer erhöhten Ausschüttung von IgE
Antikörpern und Eosinophilen (Hebart et al. 2002; Chaudhary et al. 2010). Erhöhte TH2
Antworten, ausgelöst durch A. fumigatus, führen oft zu einer Verschlechterung der
invasiven
Erkrankung,
aufgrund
der
damit
verbundenen
Reduktion
der
T H1
Immunantworten (Hebart et al. 2002; Romani 2011).
TH17 sind weitere Zellen der erworbenen Immunität gegen A. fumigatus, deren
Differenzierung durch das Zytokin IL-23 induziert wird und die Produktion der Zytokin
IL-17 und IL-22 auslösen. Diese wiederum führen zu einer starke inflammatorischen
Immunantwort, ohne eine protektive Immunität zu induzieren (Zelante et al. 2007). Die
IL-17 Neutralisierung führt im Tiermodel zu einer erhöhten Beseitigung des Pilzes, einer
Verbesserung der inflammatorischen Pathologie und einer Wiederherstellung der TH1
Immunität (Romani et al. 2007). Bei einer überhöhte TH17 Immunantwort kommt es zu
einer erhöhten fungalen Belastung, indem die Aktivierung von neutrophilen Granulozyten
behindert und eine hyper-inflammatorische Immunantwort ausgelöst wird (Wuthrich et al.
2012).
Bei einer protektiven Immunantwort werden erhöhte inflammatorische Immunreaktionen
limitiert durch Treg, welche die regulatorischen Zytokine IL-10 und TGF-β (transforming
growth factor) produzieren, und damit eine Zerstörung des Gewebes verhindert wird
(Romani et al. 2007; Romani 2011). Zwei wichtige Klassen von regulatorischen T-Zellen
innerhalb der CD4+ T-Zellen sind die CD4+CD25+Foxp3+ Treg und regulatorische T-Zellen
Typ 1
(Tr1).
Sie
Transkriptionsfaktoren,
unterscheiden
ihrer
sich
zellulären
bezüglich
Marker
und
ihres
in
den
Zytokinprofils,
ihrer
Mechanismen
der
Immunsuppression (Murugaiyan et al. 2009). Kürzlich wurde gezeigt, dass A. fumigatus
(Crf1/p41) spezifische Tr1 T-Zellen neben hohen Mengen IL-10 auch IFN-γ koproduzieren
und die Fähigkeit besitzen, die Aktivierung von naiven und anti-fungalen T-Zellen zu
supprimieren (Bedke et al. 2014).
17
Einleitung
+
Abbildung 2: CD4 T-Zell Subpopulationen bei Pilzinfektionen. Gezeigt ist, wie DCs, durch die
+
Stimulation mit Pilzantigenen, die Differenzierung zu CD4
TH Zellen und Treg Zellen, in
Abhängigkeit von Transkriptionsfaktoren und des Zytokinmilieu initiieren. Dabei können die Zellen
als Effektor- Immunzellen und als Regulatoren der Inflammation und Effektor- Antworten von Zellen
der angeborenen Immunität fungieren. Die Abbildung wurde der Arbeit von Romani 2011
entnommen. CARD9, caspase recruitment domain-containing protein 9; DC-SIGN, DC-specific
ICAM3-grabbing non-integrin; FcRγ, Fc Rezeptor γ-Kette; IDO, indoleamine 2,3-dioxygenase;
IFN-γ, Interferon-γ; IL, Interleukin; MR, Mannoserezeptor; MYD88, myeloid differentiation primary
response protein 88; SYK, spleen tyrosin kinase; TLR, Toll-like Rezeptor; TRIF, TIR domaincontaining adaptor protein induziert IFN-β (TICAM1); VLA, very late antigen 5.
3.2.3
Strategien von Aspergillus fumigatus dem Immunsystem auszuweichen
Der Pilz hat einige Strategien entwickelt, die zu seiner Pathogenität beitragen, unter
anderem durch die Sekretion von Proteasen und Lipasen, die zu einem Gewebeabbau
führen (Latge 1999). Durch die Produktion von Mycotoxinen (Fumagillin, Fumitremorgine,
Gliotoxin und Sphingofungine) verschafft sich der Pilz weitere Vorteile zum Fortbestand
unter schwierigsten Bedingungen. Zum Beispiel hat das Gliotoxin immunsuppressive
Eigenschaften auf Zellen der angeborenen Immunität, indem es aktiv die Phagozytose
und den respiratorischen Burst der Granulozyten inhibiert. Einfluss auf die adaptive
Immunität hat das Gliotoxin, indem es die Aktivierung des NF-κB Signalweg in T- und
B-Lymphozyten verhindert. Ebenso indem es eine Apoptose in Monozyten, dendritischen
Zellen
und
Thymozyten
auslöst,
wodurch
die
Aspergillus
spezifischen
T-Zell
Immunantworten supprimiert werden (Orciuolo et al. 2007; Kwon-Chung et al. 2009).
18
Einleitung
Neben seiner Fähigkeit, ribosomale 28S RNA eukaryontischer Ribosomen zu schneiden,
kann das Ribotoxin AspF1 eine Zellnekrose verursachen (Lamy et al. 1991). Weitere
Virulenz-Faktoren sind reaktive Antioxidantien (Katalase und Superoxiddismutase), die
den Pilz vor einem oxidativem Burst durch Phagozyten und Granulozyten beschützen
(Latge 2001). Auch die Pilzzellwand hat einige Abwehrmechanismen entwickelt, so zum
Beispiel bietet Melanin in der Zellwand Schutz vor reaktiven Sauerstoffspezies (ROS=
reactive oxygen species) und verhindert die Phagozytose. Außerdem ist die Zellwand der
A. fumigatus Konidien von cysteinreichen hydrophoben Proteinen (hydrophobins)
umgeben, die eine Erkennung durch das Immunsystem maskieren können (Brakhage et
al. 2002; Aimanianda et al. 2009). Die Zellwand besteht zu 90% aus Polysacchariden
(meist α- und β-Glucan, Mannan, Glactomannan und Chitin) und bietet nicht nur Schutz
vor der Umwelt und dem Immunsystem, sondern sie ist auch die Quelle der meisten
Antigene, wie z.B. die Zellwandglykonase Crf1 (Latge 2010).
3.3
Klinische Relevanz von Aspergillus fumigatus Infektionen
Der Pilz A. fumigatus kann je nach Immunzustand des Wirtes verschiedene Krankheiten
auslösen. Aspergillome, eine Ansammlung von Mukus, Pilzhyphen und Zellbestandteilen,
können bei Patienten mit normaler Immunlage auftreten und in der Regel problemlos
operativ entfernt werden. Bei Patienten mit geschwächtem Immunsystem kann
A. fumigatus zum Teil schwere invasive Infektionen auslösen (Romani 2011). Bei
neutropenischen Patienten, Patienten die an atopischen Asthma oder an Mukoviszidose
leiden, besteht ein erhöhtes Risiko an allergische bronchopulmonale Aspergillose (ABPA)
zu erkranken. ABPA, eine durch Aspergillus verursachte Lungenerkrankung, kann ein
breites Spektrum an Symptomen auslösen, wie Rachenentzündung, Lungenfibrose oder
sogar die Zerstörung der Lunge (Chaudhary et al. 2011). Transplantationspatienten sind
aufgrund der begleitenden immunsupprimierenden Therapie besonders gefährdet, an
einer meist lebensbedrohlichen invasiven Aspergillose (IA) zu erkranken, aber auch
Krebs- und AIDS- Patienten sind gefährdet. Bei IA kommt es zum Wachstum des Pilzes in
der Lunge bzw. auf der Bronchialwand, was häufig tödlich für den Patienten sein kann
(Latge 1999; Marr et al. 2002; Romani 2004; Rivera et al. 2006). Trotz fortschreitenden
Verbesserungen in der Behandlung und medikamentöser Prophylaxe bleibt die
Sterblichkeitsrate bei invasiven Erkrankungen hoch (Baddley et al. 2013).
3.3.1
Behandlungsstrategien von Aspergillus fumigatus Infektionen
Zurzeit ist die Hauptbehandlungsstrategie von A. fumigatus Infektionen die Verabreichung
von antifungalen Medikamenten. Neuere Behandlungsmethoden werden laufend
19
Einleitung
weiterentwickelt, wie die Unterstützung des Immunsystems durch die Gabe von
Granulozyten, Zytokinen, Chemokinen oder Wachstumsfaktoren, die Vakzinierung und die
adoptive T-Zelltherapie (Bozza et al. 2004; Perruccio et al. 2005; Segal et al. 2006).
Im Allgemeinen werden in der antifungalen Therapie vor allem die Medikamente
Amphotericin B, liposomales Amphotericin B, Posaconazol, Fluconazol und Voriconazol
eingesetzt (Segal et al. 2006; Hamill 2013; Jorgensen et al. 2014). Der erfolgreiche
therapeutische Einsatz ist stark beeinflusst von den toxischen Eigenschaften der
Medikamente,
die
ein
breites
Spektrum
an
Nebenwirkungen
von
Fieber
bis
Nierenschäden auslösen können. Ein weiterer zu beachtender Faktor bei der
Verabreichung dieser Medikamente ist die Entstehung von Resistenzen innerhalb der
Pilzstämme (Vermeulen et al. 2013; Alcazar-Fuoli et al. 2014). Bei IA werden bevorzugt
Voriconazol oder liposomales Amphotericin B eingesetzt. In neueren Studien werden auch
Kombinationstherapien auf ihre Effektivität untersucht, bisher konnte in vitro noch kein
entscheidender Vorteil zur Einzeltherapie nachgewiesen werden (Marr et al. 2004; Elefanti
et al. 2013).
Weitere Behandlungsstrategien sind der Einsatz von immunstimulatorischen Mitteln.
Dabei ist die Gabe von Granulozyten eher umstritten. Trotz einzelner erfolgreicher Studien
(Bielorai et al. 2000; Dinser et al. 2005; Grigull et al. 2006) wurde die Effektivität der
Methode angezweifelt und teilweise eine Verschlechterung der IA beschrieben (Raad et
al. 2013). Durch die unterstützende Behandlung mit verschiedenen Zytokinen und
Wachstumsfaktoren zur Stärkung des Immunsystems und der Beeinflussung der TH1/TH2
Balance, konnte die Effektivität in vorklinischen Studien in vitro und in vivo bestätigt
werden (Roilides et al. 2003; Safdar 2006).
Ein Anti-β-Glucan Antikörper wurde im Mausmodel untersucht. Dabei hat sich gezeigt,
dass der Antikörper mit den Zellwänden von Candida albicans, A. fumigatus und
Crypotcoccus neoformans reagierte, das Wachstum der Pilze inhibierte und eine
experimentell induzierte Candidiasis und Aspergillose verhindert (Torosantucci et al. 2005;
Torosantucci et al. 2009).
Die Erkenntnisse über Vakzinierungen zur Bekämpfung von A. fumigatus ausgelösten
Infektionen wurden vorwiegend durch Untersuchungen im Mausmodell erworben. Eine
protektive TH1 Immunantwort konnte durch die Vakzinierung mit wachstumsfähigen
Konidien und Hyphen-Extrakt induziert werden, wohingegen die Gabe hitzeinaktivierter
Konidien zu einer TH2 Immunantwort führte (Cenci et al. 2000; Bozza et al. 2002). Neben
Pilz-Extrakten sind auch rekombinante Proteine wie Asp f16, Asp f 3 und Crf1 fähig, eine
protektive Immunität auszulösen (Bozza et al. 2002; Ito et al. 2006; Diaz-Arevalo et al.
2011; Stuehler et al. 2011).
20
Einleitung
Aufgrund der Plastizität und der Schlüsselfunktion in der Initiierung und der Regelung der
Immunität wurden antigenpräsentierende DCs eingesetzt, um die Immunantwort in eine
bestimmt TH Richtung zu lenken. In einer Studie wurden DCs mit fungaler mRNA
transfiziert oder mit Antigen beladen. Es hat sich gezeigt, dass die Immunantwort von der
DC Subpopulation abhängig ist, welche die verschiedenen TH Zellen (TH1, TH2, Treg)
aktivieren (Perruccio et al. 2004; Bellocchio et al. 2005).
Eine weitere Möglichkeit zur Bekämpfung von Infektionen, ausgelöst durch A. fumigatus,
ist der adoptive Transfer von funktionellen TH1 Zellen, um eine protektive Immunantwort
zu induzieren. Dieser Ansatz wurde neben der Erforschung im Mausmodell auch in einer
klinischen
Studie
an
Patienten,
mit
vorangegangener
Stammzelltransplantation,
eingesetzt. Im Mausmodell wurde durch den adoptiven Transfer zum einen von
dendritischen Zellen beladen mit Aspergillus Antigenen und zum anderen von Aspergillus
spezifischen CD4+ Splenozyten, eine Reduktion der fungalen Infektion (Cenci et al. 2000)
sowie die Induktion einer protektiven TH1 Immunantwort festgestellt (Bozza et al. 2003). In
einer klinischen Studie wurde gezeigt, dass durch den adoptiven Transfer von Aspergillus
spezifischen TH1 T-Zellklonen in Patienten, die an einer Aspergillus Infektion nach einer
hämatopoetischen Stammzelltransplantation erkrankten, eine stabile T-Zell Immunantwort
induziert wird, ohne eine Transplantat-Wirt Reaktion (GvHD, Graft-versus-Host-Disease)
auszulösen (Perruccio et al. 2005).
3.4
Antigenerkennung durch T-Zellen
T-Zellen erkennen und reagieren auf Antigen oder ein Peptid, wenn dieses verbunden mit
einem eigenen Haupthistokompatibilitätskomplex Molekül (MHC, major histocompatibility
complex) präsentiert wird. Der Antigenrezeptor auf den T-Zellen ist dabei der
αβ T-Zell-Rezeptor (TCR) (Davis 1988; Fremont et al. 1996). Im folgenden Abschnitte
werden die Strukturen und Mechanismen der Antigenerkennung durch T-Zellen
beschrieben.
3.4.1
Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)
Bei Menschen werden MHC Gene als humane Leukozyten Antigene (HLA) bezeichnet
und befinden sich auf Chromosom 6. Die Gene lassen sich in zwei Klassen unterteilen, in
Klasse-I (A, B und C), die von CD8+ T-Zellen erkannt werden und in Klasse-II (DP, DQ
und DR) die von CD4+ T-Zellen erkannt werden. Peptide von Krankheitserregern, wie z.B.
Viren, werden durch die MHC Klasse-I Moleküle den zytotoxischen CD8+ T-Zellen
präsentiert. Die Hauptfunktion der CD4+ T-Zellen, die MHC Klasse II Moleküle erkennen,
ist die Aktivierung anderer Effektorzellen des Immunsystems (Rudolph et al. 2006).
21
Einleitung
MHC Proteine sind Heterodimere, das heißt sie besitzen Untereinheiten bestehend aus
einer α und β Kette. MHC Klasse-I Moleküle bestehen aus einer α Kette unterteilt in drei
Domänen und einer invarianten β2-Mikroglobulin Kette. Dabei bilden die α1 und α2
Domänen die Peptid-Bindungsfurche und α3 ist in der Zellmembran verankert. Für MHC
Klasse-I existieren drei verschiedene α Gene (HLA-A, HLA-B und HLA-C) (Marsh et al.
2001; Schreuder et al. 2001). MHC Klasse-II besitzt zwei membrangebundene Ketten (α
und β), wobei die Peptid-Bindungsfurche von den α1 und β1 Domänen gebildet wird. Die
MHC Klasse-II Gene werden in die drei Moleküle HLA-DR, HLA-DP und HLA-DQ
unterteilt. In den verschiedenen MHC- Varianten sitzen an bestimmten Stellen der
peptidbindenden Furche unterschiedliche Aminosäuren (AS) an Schlüsselpositionen für
die
Peptidwechselwirkung.
Wodurch
unterschiedliche
MHC- Varianten
bevorzugt
unterschiedliche Peptide binden (Rudolph et al. 2006; Murphy et al. 2012).
Ohne eine Peptidbindung sind die MHC Moleküle instabil, da die MHC Moleküle das
Peptid als integralen Bestandteil ihrer Struktur binden. Die MHC Klasse-I Moleküle
können kurze, acht bis zehn Aminosäure (AS) lange Peptide, binden. Die Bindung erfolgt
über eine Reihe von Wasserstoffbrückenbindungen und ionischen Wechselwirkungen, an
beiden Enden des Peptids. MHC Klasse-II Moleküle können Peptide mit einer Länge von
dreizehn
AS
(oder
länger)
binden,
durch
Wechselwirkungen,
wie
Wasserstoffbrückenbindungen, entlang der Peptid-Bindungsfurche an MHC Klasse-II
Moleküle. Aufgrund der Bindung über das Peptidrückrat kann das Peptid an beiden Seiten
der
Peptid-Bindungsfurche
herausragen
und
somit
ist
das
Peptid
keiner
Längenbegrenzung unterzogen, jedoch werden Peptide nach ihrer Bindung an MHC
Klasse-II Moleküle in den meisten Fällen durch Peptidasen auf eine Länge von 13 bis 17
AS verkürzt. Der TCR bindet den MHC/Peptid Komplex über die CDR Schleifen. CDR3
bindet dabei hauptsächlich das Peptid. CDR1 und CDR2 den MHC (Rudolph et al. 2006;
Marrack et al. 2008; Murphy et al. 2012).
3.4.2
αβ T-Zell-Rezeptor
Der TCR besteht aus zwei Transmembranproteinen, einer α und einer β Kette, die über
eine Disulfidbrücke in der extrazellulären Domäne miteinander verbunden sind. Jede
Kette kann in eine N-terminale variable und eine C-terminale konstante Region unterteilt
werden (Abbildung 3). Die variable Region trägt die Antigen Bindungsstelle und liegt
extrazellulär. Die konstante Region ist unterteilt in eine immunoglobulinähnliche Domäne,
eine Gelenkdomäne, welche das Zystein für die Ausbildung der Disulfidbrücke einschließt,
gefolgt von der Transmembrandomäne und einer kurzen zytoplasmatischen Domäne. Die
dreidimensionale Struktur des TCR ist immunoglobulinähnlich, das heißt die strukturelle
22
Einleitung
Basis bilden β-Faltblätter. Ausnahme ist die immunoglobulinähnliche Domäne der α Kette,
deren eine Hälfte eine β-Faltblatt-Struktur aufweist, während die andere in losen Strängen
miteinander verbunden ist und in einer α- Helix endet, welche an dieser Stelle über die
Disulfidbrücke die β Kette verbindet (Garcia et al. 2010; Murphy et al. 2012).
Abbildung
3:
Struktur
des
αβ T-Zell-Rezeptors.
Der
Rezeptor
besteht
aus
den
Transmembranglykoproteinketten α (lila) und β (grün). Der extrazelluläre Teil jeder Kette besteht
aus einer variablen und einer konstanten Region. Über die Gelenkregion, welche das Cystein zur
Ausbildung einer Disulfidbrücke enthält, werden die externen Regionen mit der Membran
verbunden. Die Transmembrandomäne und die zytoplasmatische Domäne sind schematisch
dargestellt. Modifizierte Darstellung des Banddiagramm von Bjorkman 1997 und Abbas et al. 2007.
Die hypervariblen Regionen der variablen α (Vα) und variablen β (Vβ) Kette liegen nach
oben gerichtet in Schleifen und werden als komplementaritätsbestimmende Regionen
(complementarity determining region; CDR) bezeichnet. Es gibt drei CDRs, welche die
Bindungsstelle zwischen Peptid:MHC und TCR bilden. Die Sequenzen der CDRs sind
sehr variabel, wobei CDR3 die variabelste Sequenz exprimiert (Garcia et al. 2010; Murphy
et al. 2012). Die Regionen zwischen den CDRs sind weniger variabel und werden als
Gerüstregionen (framework region; FR) bezeichnet (Abbildung 4).
23
Einleitung
Abbildung 4: Schematische Darstellung der TCR α und TCR β Ketten. Die schematische
Darstellung der TCR α (A) und TCR β Ketten (B) unterteilt in die V(D)J Segmente. SP=
Signalpeptid; FR= Gerüstregion (Framework Region); CDR= komplementaritätsbestimmende
Regionen (complementary determining region); IG: immunoglobin-ähnliche Domäne der C Region;
VP= Verbindungs- Peptid (Gelenkdomäne)
TM= Transmembrandomäne; IZ= Intrazelluläre
Domäne (zytoplasmatische Domäne).
3.4.3
Die Umordnung der T-Zell-Rezeptor Gene
Der humane TCR α- Locus ist auf dem Chromosom 14 lokalisiert und der TCR β- Locus
befindet sich auf Chromosom 7. Die TCR Vielfalt entsteht im Wesentlichen durch
kombinatorische und junktionale Genumordnung der verschiedenen V (variable) und J
(junktionale) Segmente der α Kette und der V, D (Diversität) und J Segmente der β Kette.
Die variable Region von TCR α kann von ca. 70 bis 80 verschiedenen Vα Segmenten
aufgebaut werden, wobei jedes eine Signalsequenz besitzt und ca. 61 verschiedene Jα
Segmente. Die variablen Regionen von TCR β können auf ein Repertoire von 54 Vβ, 14
Jβ und zwei Dβ zurückgreifen. Für die konstante α Region ist ein Cα Segment und für die
konstante β Region sind zwei Cβ Segmente vorhanden. Während der Reifung der
T-Zellen im Thymus werden diese Gene umgelagert, wobei die Umlagerungsreaktion
zuerst für die TCR β Kette startet (Davis 1988). Für die Rekombination befindet sich hinter
jedem V Segment und vor jedem J Segment, welches von einem D Segment flankiert
wird, eine Rekombinationssignalsequenz (RSS) (Fugmann et al. 2000). Diese
Signalsequenzen sind die Erkennungsstruktur für die V(D)J Rekombinasen (RAG
Rekombinasen = RAG-1 und RAG-2; recombination- activation gene). Die konstanten
Ketten werden nach der Transkription durch Spleißen mit den variablen Ketten verbunden
(Abbey et al. 2008; Murphy et al. 2012).
24
Einleitung
3.4.4
αβ T-Zell-Rezeptor Komplex
Das TCRαβ Heterodimer wird durch die invarianten Dimere CD3γε (CD = cluster of
differentiation), CD3δε und ξξ stabilisiert und sind verantwortlich für die Signalübertragung
(Call et al. 2004). Die invarianten Ketten CD3γ, CD3δ und CD3ε bestehen aus einer
immunoglobinähnlichen extrazellulären Domäne, einer Transmembrandomäne und einer
zytoplasmatischem Domäne mit einer Immunrezeptor Tyrosinaktivierungssequenz (ITAM,
immunoreceptor tyrosin-based activation motif). Die ξξ Ketten besitzen nur eine kurze
extrazelluläre Domäne, eine Transmembrandomäne und eine lange zytoplasmatische
Domäne mit drei ITAMs. In ihren Transmembrandomänen besitzen die CD3 Ketten
negativ geladene, saure Reste, die mit den positiven Ladungen der α und β Ketten
wechselwirken können (Abbildung 5) (Call et al. 2007). Die Stöchiometrie des TCR αβ
Heterodimer zu den invarianten CD3 Heterodimeren wird noch diskutiert, jedoch wurde
bisher eine Anordnung des TCR αβ Heterodimer flankiert von den CD3 Dimeren als
wahrscheinlichste postuliert (Sun et al. 2004). Dagegen wurde in neueren Arbeiten
gezeigt, dass die CD3 Heterodimere in einem Verbund auf einer Seite des TCR αβ
Heterodimer lokalisiert sind (Fernandes et al. 2012; Kuhns et al. 2012).
Abbildung 5: Der αβ T-Zell-Rezeptor Komplex. Der TCR Komplex besteht aus einem
αβ Heterodimer, assoziiert mit zwei invarianten CD3 Heterodimeren (CD3γε und CD3δε) und mit
einem Homodimer (ξξ). Jede CD3 Kette besitzt ein ITAM (immunoreceptor tyrosine-based
activation motif) und jede ξ Kette drei ITAMs. Die Transmembranregionen sind entweder positiv
(αβ Heterodimer) oder negativ (invariante Ketten CD3 und ξ) geladen. Abbildung aus Murphy et al.
2012.
Die Komponenten des TCR Komplex werden durch die Ribosome im Endoplasmatischen
Retikulum (ER) synthetisiert. Der Aufbau des TCR Komplex startet mit den invarianten
Heterodimeren CD3γε und CD3δε, welche anschließend mit den TCR α und TCR β
25
Einleitung
Ketten verbunden werden. Abschließend werden die ξξ Homodimer hinzugefügt. Wird der
TCR Komplex im ER nicht richtig zusammengefügt, so werden die Komponenten
aufgrund ihrer allein stehenden, polaren Transmembranreste erkannt und abgebaut. Ein
korrekt verbundener TCR Komplex wird dagegen zur Zelloberfläche transportiert (Call et
al. 2007).
3.4.5
αβ T-Zell-Rezeptor Signalübertragung
Es werden verschiedene Modelle bezüglich der Signalübertragung der antigenbindenden
Region der TCR α und TCR β Ketten zu den signalübertragenden CD3γε, CD3δε und ξξ
diskutiert, unter anderem die Zusammenlagerung von TCRs in einen Komplex, die
Verstärkung durch Ko-Rezeptoren und Konformationsänderungen (Kuhns et al. 2007;
Fernandes et al. 2012; Yin et al. 2012).
Bindet der TCR antigenspezifisch an ein MHC Klasse-II/Peptid, so wird über die
Aktivierung von Kinasen (z.B. Fyn) die Phosphorylierung der ITAMs von CD3 und ξ
induziert. An die phosphorylierten ITAMs binden die ZAP-70 Tyrosinkinase. Über die
Bindung des Ko-Rezeptors an das MHC Molekül wird Lck phosphoryliert und ZAP-70
aktiviert. ZAP-70 Aktivierungen führen zur Phosphorylierung von LAT und SLP-76, welche
wiederum die Phospolipase C-γ aktivieren. Über Proteinkinasen, die Erhöhung der
interzellularen Ca2+ Konzentration und durch Induktion der MAP-Kinase Kaskade werden
die Transkriptionsfaktoren NFκB, NFAT (nuclear factor of activated T cells) und Ap-1
aktiviert, die wiederum spezielle Gentranskriptionen induzieren. Ferner benötigen T-Zellen
zur vollständigen Aktivierung ein weiteres kostimulierendes Signal, wie z.B. durch CD28,
was zur Proliferation, Differenzierung der Zellen und zur Ausschüttung des Zytokins IL-2
führt (Murphy et al. 2012; Guy et al. 2013).
3.5
T-Zell-Rezeptor Optimierungen und der T-Zell-Rezeptor Transfer auf T-Zellen
Die Entwicklungen des adoptiven Transfers, mit TCR-modifizierten T-Zellen, wurden vor
allem für die Krebstherapie vorangetrieben (Kalos et al. 2013; Koste et al. 2014). Dabei
hat sich herausgestellt, dass transferierte TCRs mit endogenen TCRs konkurrieren
müssen und kombinierte TCRs entstehen können, welche möglicherweise das Risiko von
Autoimmunreaktionen erhöhen. Bendle et al. 2010 haben gezeigt, dass ein TCR Gen
Transfer im Mausmodell eine tödliche Autoimmunreaktion durch Zytokinausschüttung
induziert und dass die kombinierten TCRs für das Auslösen einer Autoimmunreaktion
verantwortlich sind. Auch bei der Transduktion von TCRs in humane T-Zelllinien reduziert
sich die Expression des gewünschten TCR, durch die Entstehung verschiedener TCR α/β
Kombinationen, wodurch allo- und auto-reaktive T-Zellen entstehen können (van Loenen
26
Einleitung
et al. 2010). Die Auswirkungen der kombinierten TCRs, sowie das Auslösen der
Autoimmunreaktionen werden auch in einigen neueren Arbeiten diskutiert (Linnemann et
al. 2011; Wieczorek et al. 2013). Um die Möglichkeit gemischter TCRs zu eliminieren bzw.
zu reduzieren, werden verschiedene Strategien verfolgt. Ein Ansatz ist die Murinisierung
der TCR konstanten Ketten, die verglichen mit denen des unveränderten TCR, eine
stärkere Bindung der murinen Sequenz zu CD3 Komplexen zeigen. Zudem wurde eine
stärkere Bindung der murinen Ketten zueinander und die daraus resultierende Reduktion
der Expression gemischter TCRs gezeigt (Cohen et al. 2006; Sommermeyer et al. 2010).
Für den klinischen Einsatz ist bei der Optimierung durch Murinisierung die erhöhte
Expression mit den Risiken einer induzierten Immunogenität, abzuwägen. Auch der
Einbau weiterer Disulfidbrücken in die konstante Region des TCR führt zu einer erhöhten
Oberflächenexpression und reduziert das Auftreten kombinierter TCRs (Cohen et al.
2007; Kuball et al. 2007). Entscheidend für einen erfolgreichen Transfer von TCRs ist ein
stabiler TCR Komplex. Diese Stabilität kann durch eine erhöhte Bindung der TCR α und β
Ketten zueinander, durch Expressions- „starke“ TCRs erreicht werden (Sommermeyer et
al. 2006). Eine Kombination von Expressions- „starken“ TCRs und einer starken Bindung
der CD3 Komponenten CD3γε, CD3δε und ξξ untereinander und zum TCR sind
entscheidend für die Stabilität des TCR-Komplexes (Heemskerk et al. 2007). Momentan
forschen einige Arbeitsgruppen daran, die komplexen extrazellulären Bindungen von CD3
Komponenten und TCR Komplexen zu identifizieren (Kuhns et al. 2007; Fernandes et al.
2012; Kuhns et al. 2012). Die Anwendung von Modifikationen innerhalb der Sequenzen
kann ebenfalls Einfluss auf den Translationslevel haben. Einige dieser Modifikationen
sind, z.B. die Entfernung kryptischer Spleißstellen (cryptic splice sites), instabiler RNA
Bindungsstellen (RNA instability motifs) und der Austausch von seltenen Codons, die für
selten auftretende tRNA codieren, die Effektivität der Translation mindern und so die
Expression beeinflussen. Ein Codon gilt als “selten”, wenn dieses 50 % seltener
angetroffen wird, als Codons die für dieselbe Aminosäure codieren (Scholten et al. 2006).
Neben der Codonoptimierung wurde gezeigt, dass eine Vektoroptimierung ebenfalls zu
Verbesserungen in der Expression führt. So wies die Vektorklonierung von β Kette und α
Kette, getrennt durch einen Peptidlinker, in einen einzigen retroviralen Vektor, die höchste
Expression auf (Leisegang et al. 2008). Einige Arbeitsgruppen verfolgen im Hinblick auf
Vektorsysteme andere Ansätze, die allerdings im Vergleich zum retroviralen Vektorsystem
im klinischen Maßstab noch nicht häufig eingesetzt wurden. So kommen zum Beispiel
lentivirale Vektoren (Bobisse et al. 2007), nicht-virale Transposon basierte Vektorsysteme
(Sleeping Beauty transposon) (Peng et al. 2009) oder modifizierter Verpackungsproteine,
die auf bestimmte Zellpopulationen spezialisiert sind und die Vektorfunktionen erhöhen,
zum Einsatz (Funke et al. 2008).
27
Einleitung
Aufgrund der Konkurrenzproblematik zum endogenen TCR wurden chimärische Antigen
Rezeptoren (CARs) entwickelt. CARs haben den Vorteil, dass sie aus einem einzelnen
variablen Fragment (scFv) gebunden an CD3 bestehen und so bei einem Transfer nicht
mit endogenem TCR konkurrieren oder kombinieren. Ebenso sind sie im Vergleich zu
TCRs HLA-unabhängig. Jedoch sind auch Nachteile bezüglich der CARs zu beachten,
zum einen wurde in frühen Studien gezeigt, dass CARs exprimierende T-Zellen weniger
sensitiv gegenüber Peptiden sind als T-Zellen, die einen αβ TCR exprimieren (Zhang et
al. 2004). Zum anderen können CARs eine zu hohe Zytokinausschüttung induzieren. In
einigen Fällen könnte die Signalschwelle so niedrig sein, dass in T-Zellen auch ohne
Antigenpräsentation eine Immunantwort ausgelöst werden kann (Ramos et al. 2011).
Ebenfalls sollte die Immunogenität nicht außer Acht gelassen werden, da das scFv von
der Maus stammt und somit eine Immunantwort und Eliminierung der CAR transduzierten
T-Zellen ausgelöst werden kann (Thomas et al. 2010; Wieczorek et al. 2013).
Der erfolgreiche Transfer von genetisch modifizierten T-Zellen zur Bekämpfung von
malignem Melanom und Sarkom wurde bereits beschrieben (Morgan et al. 2006; Robbins
et al. 2011). Die Entwicklungen, Modifikationen und die Optimierung von TCRs für einen
erfolgreichen Transfer auf Empfänger T-Zellen, für eine Krebstherapie, könnten auch für
andere Therapien interessant sein.
28
Ziele der Arbeit
4
Ziele der Arbeit
Mit dem Ziel, die Entwicklung der Behandlungsmethoden von A. fumigatus Infektionen
voranzubringen, wurden in dieser Arbeit A. fumigatus (Crf1/p41) spezifische TCRs
identifiziert und auf T-Zellen transferiert. In den letzten Jahren wurde gezeigt, dass die
erworbene Immunität einen großen Einfluss bei der Bekämpfung fungaler Infektionen hat,
so spielen TH1 Zellen, induziert durch dendritische Zellen, eine entscheidende Rolle in der
Immunantwort gegen A. fumigatus (Romani 2008). Bei der Bekämpfung von Aspergillus
Infektionen nach hämatopoetische Stammzelltransplantation wurde gezeigt, dass durch
den adoptiven Transfer von Aspergillus spezifischen TH1 T-Zellklonen, eine stabile T-Zell
Immunantwort
induziert
werden
kann,
ohne
eine
Transplantat-Wirt
Reaktion
(Graft-versus-host disease = GvHD) auszulösen (Perruccio et al. 2005).
Eine Erweiterung stellt der adoptive Transfer von spezifischen genetisch modifizierten
T-Zellen dar, welcher bisher in der Krebstherapie angewandt und vorangetrieben wurde
(Restifo et al. 2012; Kalos et al. 2013). Der erfolgreiche Transfer von genetisch
modifizierten T-Zellen zur Bekämpfung des malignen Melanom und Sarkom wurde bereits
beschrieben (Morgan et al. 2006; Robbins et al. 2011). Eine Adaption dieses Verfahrens
könnte
zur
Bekämpfung
von
Aspergillus
Infektionen
oder
als
zusätzliche
Behandlungsmethode zur medikamentösen anti-fungalen Therapie eingesetzt werden.
Ein transduktionsfähiger, funktioneller A. fumigatus spezifischer TCR wäre für die
Entwicklung eines solchen adoptiven Transfers von modifizierten T-Zellen ein Anfang.
•
Für die Etablierung eines solchen TCR Transfers müssen zunächst A. fumigatus
(Crf1/p41) spezifische TH1 T-Zellklone für die Identifizierung ihrer TCRs generiert
werden.
•
Im Anschluss müssen die TCRs der A. fumigatus (Crf1/p41) spezifischen
TH1 T-Zellklone über ihre Sequenz identifiziert werden.
•
Die Isolation der spezifischen TCRs erfolgt über die cDNA der A. fumigatus
(Crf1/p41) spezifischen TH1 T-Zellklone, mit anschließender Klonierung in einen
retroviralen Vektor.
•
Im Folgenden werden die Vektoren, mit Genen der A. fumigatus (Crf1/p41)
spezifischen TCRs, für die Generierung von retroviralen Kulturüberstand
eingesetzt, um eine Transduktion auf die Zelllinie Jurkat 76 und primäre
CD4+ T-Zellen durchzuführen.
•
Mit der TCR negative Zelllinie Jurkat 76 wird die Oberflächenexpression der
verschieden A. fumigatus (Crf1/p41) spezifischen TCRs ohne den Einfluss von
endogenem TCR ermittelt und die Transduktionsfähigkeit bestätigt werden.
29
Ziele der Arbeit
•
Bei geringer Oberflächenexpression ist es sinnvoll, den TCR und das
Vektorsystem zu optimieren. Einige Methoden wurden vor allem für die
Krebstherapie vorangetrieben, so auch die Vektorsysteme und der Einsatz von
Optimierungsmethoden, um die Expression des induzierten TCR zu erhöhen
(Engels et al. 2003; Sommermeyer et al. 2006; Xue et al. 2007).
•
Es folgt die Ermittlung der Transduktionsfähigkeit durch die Oberflächenexpression
von A. fumigatus (Crf1/p41) spezifischen TCRs auf transduzierten primäre
CD4+ T-Zellen.
•
Die funktionellen Eigenschaften von primären CD4+ T-Zellen, transduziert mit
A. fumigatus
(Crf1/p41)
Proliferationsfähigkeit
und
spezifischem
IFN-γ
TCR,
Produktion
werden
nach
durch
die
antigenspezifischer
(Crf1/p41 spezifischer) Stimulation bestätigt.
30
Materialien
5
Materialien
5.1
Medien, Versuchssysteme, Chemikalien und Reagenzien
5.1.1
Kulturmedien und Zusätze
Kulturmedien und Zusätze
Firma/Hersteller
Bicoll Seperationslösung
Biochrom (Berlin)
Blasticidin
Sigma-Aldrich (München)
Bovines Serum Albumin (BSA)
Sigma-Aldrich (München)
CD3/CD28 Dynabeads®
Life Technologies, Invitrogen (Darmstadt)
Dimethylsulfoxid (DMSO)
Sigma-Aldrich (München)
Dulbecco´s modification of Eagle´s Medium (DMEM) Life Technologies, Invitrogen (Darmstadt)
Dulbecco´s Phosphat Saline Puffer (PBS)
Life Technologies, Invitrogen (Darmstadt)
Ethylendiamintetraacetat (EDTA) Lösung 0,5 M
AppliChem (Darmstadt)
Fötales Kälberserum (FCS)
Biochrom (Berlin)
GM-CSF
PromoCell (Heidelberg)
Humanserum
ZKT (Tübingen)
IL-1β
R&D system (Wiesbaden)
IL-2
Proleukin, Chiron, Novartis
IL-4
R&D system (Wiesbaden)
IL-6
R&D system (Wiesbaden)
OKT-3 (Orthoclone) (CD3)
Janssen-Silac (Neuss)
Penicillin/Streptomycin
Life Technologies, Invitrogen (Darmstadt)
Prostaglandin E2 (PGE2)
ehemals Pharmacia
Puromycin
Sigma-Aldrich (München)
RPMI 1640 Zellkulturmedium
Life Technologies, Invitrogen (Darmstadt)
TNF-α
R&D system (Wiesbaden)
Trypsin/EDTA Lösung
Life Technologies, Invitrogen (Darmstadt)
31
Materialien
5.1.2
Versuchssysteme
Versuchssysteme (Kits)
Firma/Hersteller
BD Cytometric Bead Array (CBA) (human)
Becton Dickinson (BD) (Heidelberg)
+
CD4 T Cell Isolation Kit II
Miltenyi Biotech (Bergisch-Gladbach)
IO Beta Mark TCR Kit (TCRβ Bestimmung)
+
MACS®-Cell-Sorting-System (CD14 Beads;
Beckman Coulter (Krefeld)
Miltenyi Biotech (Bergisch-Gladbach)
PE-Beads)
NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up
Macherey-Nagel GmbH & Co KG (Düren)
Plasmid DNA Purification Kit
Macherey-Nagel GmbH & Co KG (Düren)
RNasy Mini Kit
Qiagen (Hilden)
SMARTer™ RACE cDNA Amplification Kit
Clontech Laboratories (Mountain View, USA)
5.1.3
Chemikalien und Reagenzien
Chemikalien und Reagenzien
Firma/Hersteller
ABTS
Roche (Penzberg)
Agar
AppliChem (Darmstadt)
Agarose
PeqLap (Erlangen)
Ampicillin
Roth (Karlsruhe)
Ammoniumpersulfat (APS)
Sigma-Aldrich (München)
Carbonat-Bicarbonat Puffer
Sigma-Aldrich (München)
Not1 Restriktionsenzym
New Englang Biolabs (Frankfurt)
EcoR1 Restriktionsenzym
New England Biolabs (Frankfurt)
DNA Ladder 1kb PLUS
Life Technologies, Invitrogen (Darmstadt)
Desoxyribonukleosidtriphosphat (dNTPs)
Life Technologies, Invitrogen (Darmstadt)
Effectene® Transfektions Reagenz
Qiagen (Hilden)
Endogen M700A (anti-IFN-γ Antikörper A)
Thermo Fischer, Perbio (Bonn)
Endogen M701B (anti-IFN-γ Antikörper B)
Thermo Fischer, Perbio (Bonn)
Ethanol
AppliChem (Darmstadt)
FACSclean
Becton Dickinson (BD) (Heidelberg)
FACSflow
Becton Dickinson (BD) (Heidelberg)
FACSrinse
Becton Dickinson (BD) (Heidelberg)
Hefeextrakt
AppliChem (Darmstadt)
32
Materialien
Chemikalien und Reagenzien
Firma/Hersteller
IFN-γ Standard
Thermo Fischer, Perbio (Bonn)
Kalziumchlorid
Sigma- Aldrich (München)
Kanamycin
Life Technologies, Invitrogen (Darmstadt)
Midori Green Advance
Nippon Genetics Europe GmbH (Düren)
Natriumchlorid
AppliChem (Darmstadt)
NBT/BCIP Substrat Lösung
Mabtech (Nacka Strand, Schweden)
Proliferations-Farbstoff eFluor®670
eBioscience (Frankfurt)
Q5 Polymerase
New Englang Biolabs (Frankfurt)
RDI-PHRP20 Streptavidin
Fitzgerald (Acton, USA)
RDI-PHRPDIL Blocker
Fitzgerald (Acton, USA)
RetroNectin®
Clontech Laboratories (Mountain View, USA)
StreptavidinALP-PQ
Mabtech (Nacka Strand, Schweden)
T4 DNA Ligase
New Englang Biolabs (Frankfurt)
Tris-Acetat- EDTA (TAE) Puffer
Life Technologies, Invitrogen (Darmstadt)
5.2
Hergestellte Medien und Puffer
Medien/Puffer
Inhaltsstoffe
LB Kulturmedium
10 g Trypton; 5 g Hefeextrakt; 10 g NaCl; 1 l dH2O; pH 7.0
LB Agar
10 g Trypton; 5 g Hefeextrakt; 10 g NaCl; 15 g Agar; 1 l dH2O; pH 7.0
MACS Puffer
PBS; 0,5 % BSA; 2 mM EDTA
FACS Puffer
PBS, 0,2 % BSA
ELISA Waschpuffer
PBS, 0,05 % Tween20
5.3
Crf1/p41 Peptid und MHC Klasse II Tetramer
Peptide/Tetramer
Firma/Hersteller
Crf1/p41 Peptid (HTYTIDWTKDAVTWS)
Beckman Coulter (Krefeld)
MHC Klasse II Tetramer (HLA-DRB1*0401 FHTYTIDWTKDAVTW; Beckman Coulter (Krefeld)
Phycoerythrin (PE) markiert)
33
Materialien
5.4
Fluoreszenz- konjugierte Antikörper für die Durchflusszytometrie
Spezifität
Fluoreszenzfarbstoff
Firma/Hersteller
CD3
Allophycocyanin (APC)
Becton Dickinson (BD) (Heidelberg)
CD4
APC
Becton Dickinson (BD) (Heidelberg)
CD8
Fluoresceinisothiocyanat (FITC)
Becton Dickinson (BD) (Heidelberg)
IgG1
APC
Becton Dickinson (BD) (Heidelberg)
IgG1
Phycoerythrin (PE)
Becton Dickinson (BD) (Heidelberg)
IgG1
FITC
Becton Dickinson (BD) (Heidelberg)
5.5
5.5.1
Retroviraler Vektor pMP71 und Oligonukleotide
Retroviraler Vektor pMP71
Der retrovirale Vektor pMP71 wurde freundlicherweise von Dr. M. Hudecek (Medizinische
Klinik und Poliklinik II, Würzburg) zur Verfügung gestellt (in Abbildung 6 ist die Vektorkarte
dargestellt). Gene werden über die Restriktionsschnittstellen Not1 und EcoR1 in den
Vektor kloniert. Dem Gen folgt ein posttranskriptionelles regulatorisches Element (PRE)
des Woodchuck Hepatitis Virus. Das Gen und PRE werden von „long terminal repeats“
(LTR) vom myeloproliferativem Sarcoma Virus flankiert. Der Vektor besitzt eine
Ampicillin-Resistenz (AmpR). Bei dem Vektor pMP71 handelt es sich um einen Vektor der
eine stabile und hohe Expressionsrate in T-Lymphozyten zeigt und in vielen Studien des
TCR Transfers erfolgreich eingesetzt wurde (z.B. Engels et al. 2005; Sommermeyer et al.
2006; Heemskerk 2010; Thomas et al. 2010; Linnemann et al. 2013).
34
Materialien
Abbildung
6:
Das
retrovirale
Vektorplasmid
pMP71.
Gene
werden
über
die
Restriktionsschnittstellen Not1 und EcoR1 in den Vektor kloniert. Dem Gen folgt ein
posttranskriptionelles regulatorisches Element (PRE) des Woodchuck Hepatitis Virus. Gen und
PRE werden flankiert von „long terminal repeats“ (LTR) vom myeloproliferativem Sarcoma Virus.
Der Vektor besitzt eine Ampicillin-Resistenz (AmpR).
5.5.2
Oligonukleotide
Tabelle 1: Primer für die T-Zell-Rezeptor Identifizierung und Vektorklonierung. Die Primer
wurden von Sigma- Aldrich (München) hergestellt.
Name
Sequenz (5´- 3`)
Verwendung
RACE a rev
GGTGAATAGGCAGACAGACTT
Isolation TCRα cDNA
RACE b rev
GTGGCCAGGCACACCAGTGT
Isolation TCRβ cDNA
MP71 for
CAGCATCGTTCTGTGTTGTCT
Sequenzierung Insert
von pMP71 Vektor
MP71 rev
CATTTAAATGTATACCCAAATCAA
Sequenzierung Insert
von pMP71 Vektor
TCRbC1 rev EcoR1
AGCTTGGAATTCTCAGAAATCCTTTCTCTTGACC
Sequenzierung/
Isolation TCRβ
TCRbC2 rev EcoR1
AGCTTGGAATTCCTAGCCTCTGGAATCCTTTCTC
Sequenzierung/
Isolation TCRβ
TCRaC rev EcoR1
AGCTTGGAATTCTCAGCTGGACCACAGCCGCAGC
Sequenzierung
/Isolation TCRα
TCR1opti for Not1
ACTGCGGCCGCGCCAACCATGGATACCAGACTGCTG
Sequenzierung/
Isolation TCR1 optimiert
TCR1opti rev EcoR1
AGCTTGGAATTCATCACACGGGGCTGGT
Sequenzierung/
Isolation TCR1 optimiert
35
Materialien
Name
Sequenz (5´- 3`)
Verwendung
TCR1α wt for Not1
GGGCGGCCGCGCCACCATGGAGACTGTTCTGCAAGTACTCCTAG Sequenzierung/
Isolation TCR1α
TCR1β wt for Not1
ACTGCGGCCGCCATGGACACCAGACTACTCTGCTGT
Sequenzierung/
Isolation TCR1β
TCRα for Not1 (TRAV17)
ACTGCGGCCGCCATGGAAACTCTCCTGGGAG
Sequenzierung/
Isolation TCR2α und
TCR4α
TCRβ for Not1 (TRBV18)
ACTGCGGCCGCCATGGACACCAGACTACTCTGCTGT
Sequenzierung/
Isolation TCR2β und
TCR4β
TCR3α for Not1 (TRAV5)
ACTGCGGCCGCCATGAAGACATTTGCTGGA
Sequenzierung/
Isolation TCR3α
TCR3β for Not1 (TRBV9)
ACTGCGGCCGCCATGGGCTTCAGGCTCCTCTG
Sequenzierung/
Isolation TCR3β
5.6
5.6.1
Zelllinien und Bakterien
Zelllinien
Zelllinie
Eigenschaft
Jurkat 76
TCRαβ , CD3
-
Firma/Herkunft
-
Freundlicherweise zur Verfügung gestellt von
Dr. M. Hudecek (Medizinische Klinik und
Poliklinik II, Würzburg)
Platinum A
Amphotrophe Verpackungszelllinie Cell Biolabs, Inc. (San Diego, USA)
T2 Zellen
Humane Lymphoblast Zelllinie
American Type Culture Collection (ATCC)
verwendet als Feeder-Zellen.
(Manassas, USA)
5.6.2
Bakterien
Bakterien
Eigenschaft
Firma/Hersteller
E. coli DH5α™
Chemisch kompetente Zellen (Genotyp:
New England Biolabs (Frankfurt)
fhuA2 Δ(argF-lacZ)U169 phoA glnV44
Φ80 Δ(lacZ)M15 gyrA96 recA1 relA1
endA1 thi-1 hsdR17)
36
Materialien
5.7
Verbrauchsmaterialien
Verbrauchsmaterialien
Firma/Hersteller
6-Well Zellkulturschalen
Corning (Kaiserslautern)
24-Well Zellkulturschalen
Corning (Kaiserslautern)
96-Well Mikrotiterplatten
Corning (Kaiserslautern)
Zellkulturschalen (10 cm)
Corning (Kaiserslautern)
15 ml Zentrifugenröhrchen
Falcon/BD (Franklin Lake,USA)
50 ml Zentrifugenröhrchen
Falcon/BD (Franklin Lake,USA)
200 µl Reaktionsgefäße
Sarsted (Nürnbrecht)
1,5 ml Reaktionsgefäße
Sarsted (Nürnbrecht)
FACS-Röhrchen
Sarsted (Nürnbrecht)
MACS-Trennsäulen
Miltenyi Biotech (Bergisch-Gladbach)
5 ml Pipetten
Corning (Kaiserslautern)
10 ml Pipetten
Corning (Kaiserslautern)
25 ml Pipetten
Corning (Kaiserslautern)
50 ml Pipetten
Corning (Kaiserslautern)
1,5 ml Kryoröhrchen
Greiner (Frickenhausen)
Zellschaber
SLP Life Science (über Hartenstein, Würzburg)
Zellkulturflaschen (50 ml)
Greiner (Frickenhausen)
Zellkulturflasche (100 ml)
Greiner (Frickenhausen)
5.8
Verwendete Analyse- Computerprogramme
Programm
Funktion
Hersteller/Entwickler
BD FACSDiva 8.0
Zur Aufnahme und Analyse
Becton Dickinson (BD)
durchflusszytometrischer Messungen
(Heidelberg)
durch den FACSCanto II.
FCAP Array 2.0
Auswertung der CBA Daten
Becton Dickinson (BD)
(Heidelberg)
FlowJo 7.6
Auswertung durchflusszytometrischer
Treestar (Ashland, USA)
Messungen
GENtle
Darstellung und Bearbeitung von
Markus Manske (Köln)
Sequenzierdaten und Vektorkarten.
Simulierung des Restriktionsverdau.
37
Materialien
Programm
Funktion
Hersteller/Entwickler
GraphPad Prism 6
Statistische Auswertungen und
GraphPad Software (La Jolla,
grafische Darstellung
USA)
Datenbank zur Identifizierung der TCR
gegründet 1989 von Marie-
Ketten
Paule Lefranc (Direktor)
IMGT Datenbank
(Montpellier Cedex 5,
Frankreich)
SnapGene Viewer 2.1.2
Darstellung und Bearbeitung von
GSL Biotech LLC (Chicago,
Vektorkarten.
USA)
38
Methoden
6
Methoden
6.1
Kultivierung humaner Zellen und Zelllinien
Bei der Kultivierung von Zellen wurde auf sterile Bedingungen geachtet. Es wurde mit
sterilem Material, Lösungen und Medien unter einer Sterilbank gearbeitet, um
Kontaminationen mit Bakterien, Hefen und Pilzen zu verhindern.
6.1.1
Zellen und ihre Kultivierungsbedingungen
In dieser Arbeit wurde ausschließlich mit humanen Zellen gearbeitet. Es wurden primäre
humane Zellen aus Vollblut gesunder Spender entnommen. Primäre Zellen, sowie aus
ihnen generierte Klone und transduzierte primäre Zellen wurden in RPMI 1640 mit
10 %igem
hitzeinaktiviertem
Humanserum,
100 U/ml
Penicillin
und
100 µg/ml Streptomycin (Kulturmedium 1) kultiviert. Die humane TCR αβ Ketten-defiziente
T-Zell Lymphom Zelllinie Jurkat 76 (Heemskerk et al. 2003) und ihre Transduktanden
wurden in RPMI 1640 mit 10 %igem hitzeinaktiviertem FCS, 100 U/ml Penicillin und
100 µg/ml Streptomycin (Kulturmedium 2) expandiert. Für die Produktion von retroviralem
Kulturüberstand wurde die amphotrophe Verpackungs-Zelllinie Platinum A (Cell Biolabs)
verwendet, welche nach Angaben des Herstellers in DMEM Kulturmedium mit 10 %igem
hitzeinaktiviertem FCS kultiviert wurde (Kulturmedium 3). Die Inkubation der Zellen
erfolgte bei 37°C, 5 % CO2 und 95 %iger Luftfeuchtigkeit (Ausnahme: Generierung von
retroviralem Kulturüberstand: 32°C, 5 % CO2 und 95 %iger Luftfeuchtigkeit).
6.1.2
Bestimmung der Zellzahl und Zellvitalität
Die Zellzahl und ihre Vitalität wurden bestimmt, indem 10 µl der Zellsuspension 1:10 mit
Trypanblau
versetzt
wurden.
Die
Farbstoff-Zell-Suspension
wurde
in
eine
Neubauer-Zählkammer überführt und unter einem Lichtmikroskop wurde die Zellzahl
ermittelt. Mit Hilfe der Trypanblau-Färbung ist es möglich die Vitalität der Zellen sichtbar
zu machen. Vitale lebende Zellen sind in der Lage den Farbstoff aktiv durch ihre
Ionenkanäle abzugeben, während sich bei toten Zellen der Farbstoff anreichert und die
Zellen blau einfärben. Die Vitalität wurde durch den Abzug der blaugefärbten und somit
geschädigten Zellen von der Gesamtzahl ermittelt.
39
Methoden
6.1.3
Einfrieren und Auftauen von Zellen
Zellen die nicht sofort für Experimente benötigt wurden und für weitere Experimente
aufbewahrt werden sollten, wurden in Aliquote von mindestens 1x106 bis maximal
1x107 Zellen/ml
in
Kryoröhrchen
überführt.
Anschließend
im
entsprechendem
Kulturmedium, versetzt mit 10 % DMSO (zur Verhinderung von Eiskristallbildung), in
einem Einfriercontainer (Einfrierrate -1°C/min) bei -80°C eingefroren. Für längere
Lagerung wurden die eingefrorenen Zellen im flüssigen Stickstoffdampf aufbewahrt. Das
Auftauen von Zellen erfolgte durch schnelle Erwärmung in einem Wasserbad (37°C).
Während des Auftauvorgangs wurden die Kryoröhrchen leicht geschwenkt. Die aufgetaute
Zellsuspension wurde sofort in 10 bis 13 ml kaltes Kulturmedium 2 überführt, zentrifugiert
(10 min, 365 x g) und der Überstand verworfen. Durch einen weiteren Waschschritt im für
die Zellen entsprechenden Kulturmedium wurden die Reste des DMSO, welches toxisch
für die Zellkultur wirkt, entfernt. Die aufgetauten Zellen wurden dann in ihrem spezifischen
Kulturmedium aufgenommen, kultiviert (siehe 6.1.1.) bzw. in Experimenten eingesetzt.
6.2
6.2.1
Isolierung von Zellpopulationen
Isolation peripherer mononukleärer Zellen aus Vollblut gesunder Spender
Für die Isolierung von mononuklearen Zellen des peripheren Blutes (PBMC) wurde Blut
von gesunden Spendern abgenommen und zu gleichen Teilen mit PBS versetzt. Mittels
Dichtegradienten-Zentrifugation in Ficoll-Separierungslösung (Biochrom) wurde das
verdünnte Blut in seine Bestandteile separiert (15 min, 699 x g, 20°C ohne Bremse). Die
leukozytenreiche Interphase des Gradienten wurde abgenommen und zweimal in PBS
gewaschen (10 min, 365 x g, 20°C). Die angereicherten PBMC wurden in Kulturmedium 1
aufgenommen.
6.2.2
Isolation von CD4+ T-Zellen via magnetischer Zell-Separation
Bei der magnetischen Zell- Separation handelt es sich um eine Trennung nach
zellspezifischen Oberflächenmolekülen, ermöglicht durch eine antikörpervermittelte
magnetische Markierung (Beads) der Zellen. Die markierten Zellen werden dabei über
eine Trennsäule in einem magnetischen Feld von nicht-markierten Zellen isoliert. Die
magnetische Zellsortierung wurde mit dem sogenannten MACS®-Cell-Sorting-System von
Miltenyi Biotec nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Im Fall der CD4+ T-Zell
Isolation wurde mit dem CD4+ Isolation Kit II gearbeitet. Dieses Kit ermöglicht eine
indirekte Separation der CD4+ T-Zellen, ohne eine mögliche Voraktivierung durch die
40
Methoden
Antikörperbindung.
Für
die
+
Separation
wurden
alle
Zellen
ausgenommen
der
8
CD4 T-Zellen aus bis zu 1x10 PBMC magnetisch markiert. Eine Trennsäule (LS) in
einem magnetischen Feld wurde eingesetzt, um CD4+ T-Zellen von den restlichen Zellen
zu trennen. Die isolierten Subpopulationen wurden in Kulturmedium 1 aufgenommen und
in weiteren Versuchen eingesetzt.
6.2.3
Isolation und Kultivierung von Monozyten
Für die Isolation und Kultivierung von Monozyten wurden 1x107 PBMC in 2 ml
Kulturmedium 1 pro Well einer 6-Well Zellkulturplatte ausgesät und für 2 Stunden
inkubiert. Nicht adhärente Zellen wurden vorsichtig mit Kulturmedium 1 entfernt und die
adhärenten Zellen über Nacht im Brutschrank bei 37°C kultiviert. Für die Präsentation von
Peptid- Antigen wurden die separierten Zellen mit 1 µg/ml Peptid für eine Stunde inkubiert
und im Anschluss mit Kulturmedium 1 gewaschen (10 min, 365 x g, 20°C).
6.2.4
Generierung dendritischer Zellen aus Monozyten
Die Generierung dendritischer Zellen (DC) wurde nach dem Protokoll von Dauer et al.
2003 und Dauer et al. 2005 mit leichten Änderungen durchgeführt. Immature dendritische
Zellen wurden aus CD14+ isolierten Zellen hergestellt. Die Isolation von CD14+ Zellen aus
PBMC
erfolgte
mit
Hilfe
MACS®-Cell-Sorting-System
der
(siehe
magnetischen
auch 6.2.2).
Über
Separation
positive
durch
das
Selektion (unter
Verwendung von CD14+ Beads) isolierte Zellen wurden mit 500 U/ml GM-CSF und
1400 U/ml IL-4 in Kulturmedium 1 in einer 6-Well Zellkulturschale im Brutschrank kultiviert.
Die Zellen wurden nach 24 bis 36 Stunden mittels 25 ng/ml TNF-α, 5 ng/ml IL-1β,
10 ng/ml IL-6 und 1 µg/ml PGE2 maturiert. Nach weiteren 24 Stunden wurden die
maturierten DC (mDC) abgenommen und in Experimenten eingesetzt oder eingefroren.
Für die Peptid-Antigen Präsentation wurden die mDC mit 1 µg/ml Peptid für 1 Stunde bei
37°C inkubiert und anschließend mit Kulturmedium 1 gewaschen (10 min, 365 x g, 20°C).
6.3
6.3.1
Stimulation und Klonierung von T-Zellen
Stimulation von T-Zellen und Generation A. fumigatus spezifischer T-Zelllinien
Für die Generation A. fumigatus spezifischer T-Zellen wurde ein 15-mer Peptid aus der
Zellwandglykonase Crf1 (Crf1/p41) verwendet. Crf1/p41 kann von unterschiedlichen MHC
Klasse II Allelen präsentiert werden (HLA-DRB1*03, HLA-DRB1* 04 und HLA-DRB1*13
Allele, welche von 59,9% der kaukasischen Bevölkerung exprimiert werden) (Stuehler et
al. 2011). Es wurden 1x107 PBMC pro Well einer 6-Well Zellkulturplatte mit
41
Methoden
1 µg/ml Crf1/p41 Peptid für 7 Tage bei 37°C im Brutschrank kultiviert. Jeden zweiten Tag
wurden 5 U/ml IL-2 zur Kultur gegeben und bei Bedarf das Kulturmedium gewechselt.
Nach 7 Tagen wurde die Kultur mit Crf1/p41 Peptid präsentierenden Monozyten (siehe
6.2.3) im Verhältnis 1:10 (Monozyten:Zellen) restimuliert und jeden zweiten Tag mit
5 U/ml IL-2 versorgt und Kulturmedium nach Bedarf ersetzt. Nach 14 Tagen wurde die
Spezifität der generierten Zellen mit Crf1/p41 Tetramer und anti-CD4 Antikörper
durchflusszytometrisch bestimmt.
6.3.2
Klonierung
von
Crf1/p41
spezifischen
T-Zellen
über
Grenzverdünnung
(limiting dilution)
Mit dem Prinzip der Grenzverdünnung können Zellen einer Zellsuspension durch
Verdünnung soweit vereinzelt werden, bis statistisch nur noch eine oder keine Zelle in
einer Verdünnungsstufe vorhanden ist (bis zur Nachweisgrenze). Aus der vereinzelten
Zelle kann eine monoklonale Zellkultur generiert werden. Für die Klonierung von Crf1/p41
spezifischen T-Zellklonen wurden PBMC für 14 Tage Crf1/p41 spezifisch stimuliert
(siehe 6.3.1). Die stimulierten Zellen wurden mit MHC Klasse II Crf1/p41 Tetramer gefärbt
(siehe 6.4.5). Durch den Fluoreszenzfarbstoff Phycoerythrin (PE), mit dem das Tetramer
gekoppelt ist, wurden die spezifischen Crf1/p41 Tetramer positiven T-Zellen mit Hilfe von
PE-Beads über das MACS®-Cell-Sorting-System selektiert. Für die Grenzverdünnung
wurden 300 der isolierten spezifischen Zellen mit 7,5x106 bestrahlten T2 (60Gy) und
1x108 bestrahlten
PBMC
(30Gy)
in
200 ml
Kulturmedium 1
aufgenommen,
mit
30 ng/ml OKT-3 und 50 U/ml IL-2 versetzt und in 10x 96-Well Mikrotiterplatten für 14 Tage
bei 37°C kultiviert. Crf1/p41 spezifische Klone wurden im Anschluss mittels Crf1/p41
Tetramer und anti-CD4 Antikörper durchflusszytometrisch identifiziert.
6.3.3
Expansion humaner T-Zellklone und T-Zell-Rezeptor transduzierter T-Zellen
Primäre humane T-Zellen, T-Zellklone und TCR transduzierte T-Zellen wurden nach dem
Schnell-Expansions-Protokoll unter Verwendung des monoklonalen Antikörper CD3
angereichert (Riddell et al. 1990; Beck et al. 2006). Die TCR transduzierten Zellen wurden
zunächst über das Crf1/p41 Tetramer mittels Fluoreszenzfarbstoff Phycoerythrin (PE), mit
dem das Tetramer gekoppelt ist und über das MACS®-Cell-Sorting-System selektiert.
Über PE-Beads wurden die Crf1/p41 Tetramer spezifischen Zellen im magnetischen Feld
von anderen Zellen separiert. Es wurden 2x105 T-Zellen, TCR transduzierte Zellen oder
1x105 T-Zellklone mit 5x106 bestrahlten T2 Zellen (60Gy) und 2,5x107 bestrahlten PBMC
(30Gy), welche als Stimulationszellen fungieren, kultiviert. Die Zellen wurden in
25 ml Kulturmedium 1 aufgenommen und mit 30 ng/ml OKT-3 versetzt. An Tag eins und
42
Methoden
anschließend jeden dritten Tag wurden 50 U/ml IL-2 zugegeben, ebenso wurde an Tag 4
das Kulturmedium komplett entfernt, um überschüssigen CD3 Antikörper zu entfernen.
Kulturmedium wurde nach Bedarf ersetzt. Nach 14 Tagen wurden die Zellen in weiteren
Experimenten eingesetzt.
6.4
6.4.1
Phänotyp-Analyse und Untersuchungen der Effektor-Funktion von T-Zellen
Restimulation von T-Zellen und T-Zell-Rezeptor transduzierten T-Zellen
Für die Crf1/p41 spezifische Restimulation wurden 2x105 T-Zellen oder TCR transduzierte
T-Zellen in Duplikaten in jeweils 200 µl Medium in 96-Well Kulturplatten ausgesät.
Stimuliert wurden die Zellen mit Crf1/p41 beladenen Monozyten oder mDC (siehe 6.2.3
und 6.2.4) in einem Verhältnis von 1:5 (Monozyten oder mDC:Zellen). Nach 24 Stunden
wurde der Kulturüberstand abgenommen und die IFN-γ Konzentration wurde mit
IFN-γ Enzym Linked Immunosorbent Assay (ELISA) oder über Cytometric Bead Array
(CBA) ermittelt.
6.4.2
Interferon-γ Enzym- Linked- Immunosorbent Assay
Zur Identifizierung Crf1/p41 spezifischer Effektor T-Zellklone wurde die IFN-γ Produktion
nach Crf1/p41 spezifischer Stimulation mittels ELISA bestimmt. Der ELISA ist ein
enzymgekoppelter Immunabsorptionstest, im Fall des Zytokin IFN-γ wurde ein
Sandwich-ELISA durchgeführt (Abbildung 7). Für diesen Test wurden ELISA Platten mit
100 µl/Well Endogen M700A Antikörper (0,3 µg/ml, anti-IFN-γ Antikörper; Perbio),
aufgenommen in Karbonat-Bikarbonat Puffer (pH von 9,6), über Nacht bei 4°C,
beschichtet.
Die
Platten
wurden
dreimal
mit
ELISA
Waschpuffer
(PBS
mit
0,05 % Tween20) gewaschen und mit 200 µl/Well RDI-PHRPDIL Blocker (Fitzgerald) für
eine Stunde bei Raumtemperatur geblockt. Der Blocker wurde entfernt und in Duplikaten
wurden 50 µl/Well der Proben in verschiedenen Verdünnungen (1:20; 1:100), sowie ein
IFN-γ Standard (0-200 ng/ml) in die Platten pipettiert. Die ELISA Platten wurde für
90 Minuten auf einem Schüttler bei Raumtemperatur inkubiert. 100 µl/Well von
Endogen M701B Antikörper (0,5 µg/ml, anti-IFN-γ Antikörper; Perbio), aufgenommen in
Blocker-Puffer, wurden zugegeben und für weiter 90 Minuten inkubiert. Die Platten
wurden fünfmal mit ELISA Waschpuffer gewaschen und 30 Minuten mit 100 µl/Well
RDI-PHRP20 Streptavidin (250 ng/ml; Fitzgerald), aufgenommen in Blocker-Puffer
inkubiert. Im Anschluss wurden die Platten sechsmal gewaschen und nach einer
Inkubation von 5 bis 15 Minuten mit 100 µl/Well ABTS Substratlösung wurde die
43
Methoden
Absorption bei 405 nm gemessen. Durch Mitführen eines Standards konnte die IFN-γ
Konzentrationen quantifiziert werden.
Abbildung 7: Prinzip des IFN-γ ELISA. Dargestellt ist das Prinzip des IFN-γ ELISA
(Sandwich-ELISA) Mit den anti-IFN-γ Antikörpern Endogen M700A (Coating-Antikörper) und
Endogen M701B (detektierender Antikörper). Bei der Bindung des Detektier-Antikörper mit IFN-γ
wurde eine enzymatische Reaktion durch das Biotin-Streptavidin-Konjugat ausgelöst, wodurch das
farblose Substrat ABTS in ein farbiges Produkt umgewandelt wurde. Die Absorption wurde bei
einer Wellenlänge von 405 nm gemessen und mit Hilfe eines Standards können die IFN-γ
Konzentration berechnet werden.
6.4.3
Durchflusszytometrische Messungen
Bei der Durchflusszytometrie wird eine Zellsuspension durch eine Durchflussmesszelle
geleitet, dabei passiert jede einzelne Zelle den Messbereich eines Laserstrahls. Das
Streulicht wird detektiert und vom Computer registriert. Dabei ist das Vorwärtsstreulicht
(FCS = Forward Scatter) ein Maß für die Beugung des Lichts im flachen Winkel und hängt
von der Größe der Zelle ab. Beim Seitwärtsstreulicht (SSC = Side Scatter) handelt es sich
um ein Maß für die Brechung des Lichts im rechten Winkel, welche von der Granularität
der Zelle, Struktur ihres Zellkerns und der Vesikel in der Zelle abhängig ist. Neben dem
Streulicht können auch Fluoreszenzfarben eingesetzt werden, die mit Hilfe von
Antikörpern an bestimmte Bestandeile der Zellen (z.B. Oberflächenmoleküle) binden.
Durch Einsatz von verschiedenfarbigen Lasern und Filtern ist es möglich die Anzahl der
einsetzbaren Farbstoffe zu erhöhen. Wodurch die zu untersuchenden Zellpopulationen in
einer Messung detaillierter charakterisiert werden können.
44
Methoden
Für die durchflusszytometrische Analyse wurden 1x106 Zellen in 5 ml FACS-Röhrchen
überführt, in FACS-Puffer (PBS und 0,2 % BSA) aufgenommen und zentrifugiert (10 min,
365 x g, 7°C). Die Zellen wurden in 80 µl FACS- Puffer aufgenommen und mit
Fluoreszenz gekoppelten Antikörpern (je nach Antikörper 1 bis 10 µl) für 20 Minuten bei
4°C inkubiert. Die Zellen wurden erneut gewaschen, in 150 µl FACS-Puffer aufgenommen
und am Durchflusszytometer FACS Canto™ oder FACS Calibur™ (Becton Dickinson, BD)
gemessen. Die Daten wurden mit der Software FACSDiva 8.0 (BD) und dem Programm
FlowJo® 7.6 (TreeStar Inc.) ausgewertet.
6.4.4
Bestimmung der T-Zell-Rezeptor β Kette von Crf1/p41 spezifischen Klonen mittels
Durchflusszytometer
Zur Analyse des TCR β Ketten Repertoire wurde der IO Beta Mark TCR Kit von Beckman
Coulter Inc. (Krefeld) verwendet. Die Durchführung erfolgte nach Angaben des Herstellers
und beruht auf der Markierung von TCR β Ketten durch unterschiedliche FluoreszenzAntikörper, die mittels Durchflusszytometer identifiziert wurden. Mit diesem Kit können 24
verschiedene Vβ Ketten Familien untersucht werden (Tabelle 2).
Tabelle 2: Vβ Antikörper aus dem IO Beta Mark TCR Kit (Beckman Coulter). Tabelle der 24
eingesetzten Antikörper und ihrer Fluorochrome zur Bestimmung von 24 verschiedenen Vβ Ketten
Familien. Tabelle stammt aus dem IO Beta Mark TCR Kit Manual.
45
Methoden
6.4.5
MHC Klasse II Tetramer Färbung
Die Identifizierung Crf1/p41 spezifischer T-Zellen, T-Zellklone und TCR transduzierten
T-Zellen wurde über das MHC Klasse II Tetramer (Crf1/p41 spezifisch) verifiziert. Für die
Crf1/p41 Tetramer Färbung wurden 1x106 T-Zellen oder 5x105 T-Zellklone pro 50 µl
Kulturmedium 1 mit 0,5 bis 1 µl Crf1/p41 Tetramer für 2 Stunden bei 37°C kultiviert. Die
Zellen wurden mit 2 ml Waschpuffer (PBS mit 0,1 % BSA) gewaschen (7 min, 365 x g,
20°C). Im Anschluss wurden noch weiter Oberflächenmoleküle mit Fluoreszenz
gekoppelten Antikörpern gefärbt (siehe 6.4.3).
6.4.6
Messung der Proliferation nach Crf1/p41 spezifischer Stimulation
Um die Zellproliferation von TCR transduzierten T-Zellen nach Crf1/p41 spezifischer
Stimulation zu verfolgen, wurde der Fluoreszenzfarbstoff eFluor®670 verwendet. Der
Fluoreszenzfarbstoff bindet an zelluläre Proteine die primäre Amine enthalten, welche bei
der Zellteilung zu gleichen Teilen an die Tochterzellen abgegeben werden. Das
wiederholte
Ausdünnen
des
Fluoreszenzfarbstoffs
bei
Zellteilung
wurde
7
durchflusszytometrisch über die Fluoreszenzintensität verfolgt. Bis zu 1x10 transduzierte
Zellen (Crf1/p41 spezifisch) wurden mit PBS gewaschen, um das Kulturmedium 1
vollständig zu entfernen. Anschließend wurden die Zellen mit dem Fluoreszenzfarbstoff
eFluor®670 für 10 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Die Reaktion wurde
mit der Zugabe von FCS gestoppt und die nun gefärbten Zellen wurden dreimal mit
Kulturmedium 2 gewaschen (10 min, 365 x g), um überschüssigen Farbstoff und
überschüssiges FCS zu entfernen. 2x105 der gefärbten Zellen wurden in Duplikaten in
jeweils 200 µl Medium in 96-Well Kulturplatten ausgesät. Stimuliert wurden die Zellen mit
Crf1/p41 beladenen mDC (siehe 6.2.3 und 6.2.4) in einem Verhältnis von 1:5 (mDC:Zelle).
Für die Positivkontrolle wurden die Zellen mit CD3/CD28 Dynabeads®, für die
Negativkontrolle mit unbeladenen mDC stimuliert. Die Proliferationsfähigkeit der TCR
transduzierten
Zellen
nach
Crf1/p41
spezifischer
Stimulation
wurde
über
die
Fluoreszenzintensität mit dem Durchflusszytometer ermittelt.
6.4.7
Mit
Cytometric Bead Array (CBA)
dem
CBA
wurde
die
Zytokinkonzentration
im
Kulturüberstand
nach
Crf1/p41 spezifischer Stimulation (siehe 6.4.1) mittels Durchflusszytometrie gemessen.
Bei einem CBA kommen Beads bekannter Größe und Fluoreszenz zum Einsatz.
Capture-Beads (Fluoreszenz konjugiert), welche aus einem Capture-Antikörper spezifisch
für ein bestimmtes Zytokin bestehen, bilden einen Sandwich-Komplex mit einem
46
Methoden
Detections-Reagenz,
einem
Mix
aus
PE-konjugierten
Antikörpern,
welche
ein
Fluoreszenzsignal in der Abhängigkeit von gebundenem Zytokin im Durchflusszytometer
messbar machen. Durch das Mitführen eines Standards wurde eine Standardkurve
ermittelt, die zur Berechnung der Konzentration der Zytokine verwendet wurde. Die
Auswertungen wurden mit dem Programm FCAP-Array 2.0 durchgeführt.
6.5
6.5.1
Isolation und Identifizierung von T-Zell-Rezeptor Ketten
Isolation von RNA aus Crf1/p41 spezifischen T-Zellklonen
Für die Identifizierung der Crf1/p41 spezifischen TCRs ist es notwendig, die RNA aus den
T-Zellklonen zu isolieren. Die RNA ist Grundlage für die RACE cDNA Amplifikation (siehe
6.5.2). Für die RNA Isolierung wurde der RNeasy Mini Kit (Qiagen) verwendet.
5 bis 10x106 Crf1/p41 spezifischer T-Zellklone wurden dreimal mit PBS gewaschen
(7 min, 300 x g) und so von Kulturmedium befreit. Die pelletierten T-Zellklone wurden
bei -80°C eingefroren und für spätere RNA Isolationen verwendet. Bei der Isolation von
RNA wurden im ersten Schritt die Zellwände, Membranen und Organellen der pelletierten
Zellen lysiert. Die Homogenisierung der genomischen DNA und der zellulären
Komponenten mit hohem Molekulargewicht erfolgte über QIAshredder-Säulen (enthalten
im RNeasy Mini Kit) und Zentrifugation (2 min, 8000 x g). Im nächsten Schritt wurde das
Lysat mit 70 %igem Ethanol versetzt und über RNeasy Zentrifugen-Röhrchen (enthalten
im RNeasy Mini Kit) wurde die Gesamt-RNA der Zellklone in der Membran aufgefangen
(15 s, 8000 x g). Nach dreimaligem Waschen wurde die RNA von der Membran der
Säulen eluiert (1 min, 8000 x g) (Abbildung 8). Aufgrund ihrer Instabilität wurde die RNA in
Aliquote bei -80°C gelagert.
Abbildung 8: RNA Isolierung aus humanen Zellen mit dem RNasy Mini Kit (Qiagen). Humane
Zellen wurden lysiert, homogenisiert (über QIAschredder-Röhrchen; 2 min, 8000 x g) und mit
Ethanol versetzt. Die totale RNA wird an der Membran eines Zentrifugen-Röhrchen gebunden
(15 s, 8000 x g) und über Zentrifugation dreimal gewaschen (15 s, 8000 x g). Mit 30 µl RNasefreiem Wasser wurde die RNA eluiert (1 min, 8000 x g).
47
Methoden
6.5.2
Isolation und Identifikation unbekannter T-Zell-Rezeptor Sequenzen mittels
RACE-PCR
Mit Hilfe der SMARTer RACE cDNA Amplifikation (Clontech Laboratories) ist es möglich,
die komplette cDNA beginnend am 5´ Ende der zu identifizierenden Sequenz aus totaler
RNA Crf1/p41 spezifischer Klone zu isolieren (Abbildung 9).
Abbildung 9: Mechanismus der SMARTer cDNA Synthese. Im ersten Schritt wird ein
modifizierter Oligo(dT) Primer für die „First-Strand-Synthese“ verwendet. Hat die SMARTScribe
Reverse Transkriptase (RT) das Ende des mRNA Template erreicht werden einige zusätzliche
Nucleotide angehängt. Die SMART II A Oligonucleotide binden an das Ende der cDNA und
fungieren als erweitertes Template für die SMARTScribe RT. (Abbildung aus „Clontech SMARTer
Race cDNA Amplification Kit User Manual“)
Die SMARTer RACE cDNA Amplifikation wurde nach Angaben des Herstellers
durchgeführt. Für den ersten Syntheseschritt wurde ein Oligo(dT) Primer verwendet, der
am polyA 3´ Ende der mRNA bindet. Hat die SMARTScribe reverse Transkriptase (RT)
das 5´ Ende des mRNA Template erreicht, wurden einige zusätzliche Nucleotide
angehängt. Dabei fungieren die SMART II Oligonucleotide als erweitertes Template für die
SMARTScribe RT, in dem sie an das Ende der cDNA binden. Die generierte 5´ cDNA dient
als Ausgangsmaterial für RACE PCR zur Anreicherung und Identifizierung der variablen
Ketten der Crf1/p41 spezifischen TCR.
48
Methoden
Abbildung 10: SMARTer RACE PCR. Durchführungsschema der SMARTer RACE PCR zur
Identifizierung von variabler α (A) und β (B) Kette des TCR. Der SMARTer RACE PCR
Reaktionsansatz und die Einstellungen während der PCR sind in (C) aufgelistet.
Für
die
SMARTer
RACE
PCR
Reaktion
wurde
die
5 ´cDNA
mit
einem
Universalprimer A Mix, welcher am 5´ Ende der cDNA bindet und mit einem rückwärts
orientierten Primer, der zu Beginn der konstanten Region der α bzw. β-Kette des TCR
lokalisiert ist, angesetzt (Primerliste siehe Tabelle 1). Mit Hilfe der PCR wurde die
vollständige variable Region für die Identifikation amplifiziert (Abbildung 10). Mittels
Gelelektrophorese (siehe 6.5.3) wurde die korrekte Länge, über die Anzahl der
49
Methoden
Basenpaare (bp), des PCR-Produkts kontrolliert (Vα ~ 600bp; Vβ ~ 650bp). Anschließend
wurde das PCR Produkt aus dem Gel ausgeschnitten und mit dem NucleoSpin® Gel und
PCR Clean-up Kit (Macherey Nagel) aufgereinigt. Die Proben wurden für die
Sequenzierungen an GATC-Biotech (Konstanz) gesendet. Für die Analyse der
Sequenzier-Ergebnisse wurde das Programm GENtle von Magnus Manske (Köln) und die
Datenbank von Immunogenetics (IMGT) (Lefranc 2004) verwendet.
6.5.3
Gelelektrophorese
Mit der Gelelektrophorese wurden die Längen der cDNA und der DNA aus den PCR
Reaktionen überprüft. Für die Gelelektrophorese wurden 1 %ige Agarosegele hergestellt,
dafür wurde 1 g Agarose mit 100 ml TAE-Puffer vermischt und zum Kochen gebracht.
Nachdem das Gel auf ca. 60°C abgekühlt war, wurden 5 µl Midori Green Advance
(DNA-Farbstoff) zugegeben. Das Gel wurde in eine Gelkammer gegossen und in das Gel
wurde ein Kamm gesetzt, um Taschen für die DNA Proben zu formen. Die Gelkammer
wurde mit TAE Puffer gefüllt und das abgekühlte und fest gewordene Gel hineingelegt.
Die DNA Proben wurden mit 6x Ladepuffer versetzt und in die vorgesehen Taschen des
Gels pipettiert. Ebenfalls wurde ein Marker (1kb) aufgetragen, um die Länge der DNA
Fragmente in den Proben zu bestimmen. Die DNA Fragmente wurden durch die
Gelelektrophorese ihrer Länge nach getrennt (30 min, 100- 120 V). Mittels UV-Licht
wurden die Banden durch den DNA Farbstoff Midori Green sichtbar gemacht.
6.6
Klonierung retroviraler Vektoren und Transduktion in humane Zelllinien und
primäre T-Zellen
6.6.1
Klonierung retroviraler Vektoren mit A. fumigatus spezifischen T-Zell-Rezeptoren
Für die Klonierung wurde die zuvor amplifizierte SMARTer RACE 5´ cDNA in einer PCR
zur Isolierung von Crf1/p41 spezifischen TCR α und TCR β Ketten verwendet (Abbildung
11). In der PCR wurden spezifische Primer eingesetzt, die am 5´Ende des TCR und am
3`Ende der konstanten Region binden (Primerliste Tabelle 1). Nach der PCR wurde die
DNA in einer Gelelektrophorese auf die korrekte Länge hin überprüft (TCR α ~ 850bp;
TCR β ~ 950bp) und mit dem NucleoSpin® Gel Clean-up Kit (Macherey-Nagel) nach
Herstellerangaben aufgereinigt.
50
Methoden
Abbildung 11: PCR zur Anreicherung von TCRs. Durchführungsschema der PCR zur Isolierung
von TCR α (A) und TCR β Ketten (B) aus 5´ SMARTer RACE cDNA von Crf1/p41 spezifischen
Klone. In (C) sind der PCR- Ansatz und die PCR Einstellungen zur Anreicherung der TCRs
dargestellt. * Die Primer der jeweiligen TCRs sind in Tabelle 1 aufgelistet.
Die TCR α Kette, die TCR β Kette und eGFP wurden jeweils über die Schnittstellen Not1
und EcoR1 in den Vektor pMP71 kloniert (Abbildung 12 A, B, C). Für eine parallele
Expression beider TCR Ketten wurden die Gene mit einem 2A Peptidlinker (p2A)
(Szymczak et al. 2004) verbunden und in einen Vektor kloniert (Abbildung 12 D). Das Gen
von Vektor D wurde vor der Klonierung von GeneArt (Life Technologies) einer
Codonoptimierung unterzogen und die konstanten Ketten wurden durch murine konstante
51
Methoden
Ketten ersetzt (siehe 3.5). Das optimierte und kombinierte TCR α - p2A - TCR β Element
wurde ebenfalls über die Schnittstellen Not1 und EcoR1 in den Vektor pMP71 kloniert.
Abbildung 12: Vektorkarten des retroviralen Vektor pMP71. Die verschiedenen retroviralen
Vektoren wurden für die Transduktion der TCRs eingesetzt. pMP71 Vektoren sind mit einem long
terminal
repeat
des
myeloproliferative
Sarcoma
Virus
(MPSV-LTR)
und
einem
Woodchuck-Hepatitis-Virus posttranskriptionalen regulatorischen Element (PRE) ausgestattet und
besitzen eine Ampicillinresistenz (AmpR). In (A) mit der TCR α Kette, (B) mit der TCR β Kette, (C)
mit eGFP und in (D) sind TCR α Kette und TCR β Kette getrennt durch einen Peptidlinker (p2A).
Für den Restriktionsverdau wurden das amplifizierte Insert, das TCR α - p2A - TCR β
Element sowie der pMP71 Vektor mit den Restriktionsenzymen Not1 und EcoR1 verdaut
(1 h, bei 37°C) und anschließend per Gelelektrophorese aufgetrennt. Die richtigen
Banden wurden aus dem Gel ausgeschnitten und mittels NucleoSpin® Gel Clean-up
aufgereinigt. Die Ligation von Vektor und Insert (isolierte TCR α, TCR β Kette oder
TCR α - p2A - TCR β Element) wurde mit T4 Ligase ausgeführt (Inkubation 1 h bei 16°C).
Vor der Transformation wurden die Ligationsansätze mit dem NucleoSpin® Gel and PCR
Clean-up Kit gereinigt. Die Transformation der Vektor-DNA in 5α chemisch kompetente
E.coli (NEB) wurde nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Die transformierten
Bakterien wurden auf Ampicillin (100 µg/ml)-LB-Agar Platten ausgestrichen. Durch das
Antibiotikum Ampicillin vermehrten sich nur die Bakterien, die den Vektor pMP71
aufgenommen haben, da dieser eine Ampicillinresistenz besitzt. Nach 24 Stunden wurde
von den Bakterienkolonien eine Kultur mit Ampicillin (100 µg/ml)-LB-Medium angesetzt.
Von der Bakterienkultur wurde die Plasmid-DNA über das Plasmid DNA Purification Kit
(Macherey Nagel) isoliert. Die Vektor-DNA wurde für die Transfektion von Platinum A
Zellen (Verpackungszellen) verwendet.
52
Methoden
6.6.2
Produktion von retroviralem Kulturüberstand
Um Crf1/p41 spezifische TCRs auf T-Zellen zu transduzieren, wurde retroviraler
Überstand mit der amphotrophen Verpackungszelllinie Platinum A (Cell Biolabs.Inc)
generiert. Die Zellen wurden in Zellkulturschalen von 10 cm Durchmesser bis zu einer
Konfluenz von 60 bis 80 % bei 37°C im Brutschrank in Kulturmedium 3 (DMEM
Kulturmedium mit 10 % FCS) nach Angaben des Herstellers expandiert. Für die
Transfektion der Platinum A Zellen mit retroviraler Vektor-DNA wurde das Effectene®
Transfektions Reagenz nach Herstellerangaben der Firma Qiagen GmbH (Hilden)
verwendet. Eingesetzt wurden 2 µg Vektor-DNA (1 µg TCR α und 1 µg TCR β). Der
entstandene DNA-Effectene-Komplex wurde tropfenweise auf die Verpackungszelllinie
Platinum A gegeben und bei 32°C für 48 Stunden kultiviert. Anschließend wurde der
Überstand abgenommen und filtriert. Nicht sofort verwendeter Virusüberstand wurde in
Aliquote bei -80°C eingefroren.
6.6.3
Transduktion von humanen Zelllinien und primären T-Zellen mit A. fumigatus
spezifischen T-Zell-Rezeptoren
Die Transduktion spezifischer TCRs auf humane Zelllinien bzw. primäre Zellen wurde mit
RetroNectin® (Clonetech Laboratories) beschichteten Zellkulturplatten und generiertem
retroviralem Virusüberstand durchgeführt (siehe 6.6.2). Durch RetroNectin® wurden die
Viruspartikel
und
die
Zielzellen
räumlich
zusammengeführt,
wodurch
die
Transduktionseffizienz erhöht wurde (Abbildung 13). Für eine erste Überprüfung der
Transduzierbarkeit der Crf1/p41 spezifischen TCRs wurde die Zelllinie Jurkat 76
verwendet. Es handelt sich bei dieser Zelllinie um eine TCR und CD3 negative humane
T-Zell Lymphom Jurkat Zelllinie. Der exogene TCR muss nicht mit endogenen TCRs
konkurrieren und dessen Expression kann mit Hilfe von anti-CD3 Antikörper und Crf1/p41
Tetramer durchflusszytometrisch verfolgt werden. Für die Transduktion spezifischer TCR
in primäre Zellen wurden CD4+ T-Zellen isoliert (siehe 6.2.2) und für zwei Tage mit
CD3/CD28
Dynabeads®
(Invitrogen)
aktiviert.
Die
Beschichtung
von
24-Well Zellkulturplatten mit RetroNectin® erfolgte einen Tag vor der Transduktion und
wurde nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Am Tag der Transduktion wurden die
beschichteten Platten für 30 Minuten mit PBS und 2 % BSA geblockt und mit PBS
gewaschen, um überschüssiges BSA zu entfernen. 1 ml Virusüberstand pro Well wurde in
die RetroNectin®- beschichteten Platten gegeben und für 30 Minuten bei 32°C inkubiert.
Die Jurkat 76 Zellen bzw. die aktivierten CD4+ T-Zellen wurden zum Virusüberstand
gegeben und zentrifugiert (1 Stunde, 699 x g, 32°C). Die CD4+ T-Zellen erhielten
zusätzlich 30 U/ml IL-2. Für die transduzierten CD4+ T-Zellen und die transduzierten
53
Methoden
Jurkat 76 Zellen betrug die Inkubation 48 Stunden bei 37°C. Die erfolgreiche Transduktion
wurde
durchflusszytometrisch
mit
Crf1/p41
Tetramer,
anti-CD4
Antikörper
(bei
+
CD4 T-Zellen) bzw. anti-CD3 Antikörper (bei Jurkat 76) überprüft. Es wurde ein
Kontrollvektor mit grün fluoreszierenden Protein (GFP) eingesetzt, um die Transduktion
auch unter dem Lichtmikroskop bei UV-Licht verfolgen zu können. Um die TCR
transduzierten Zellen weiter zu untersuchen (z.B. Crf1/p41 spezifische Stimulation zur
Untersuchung der Proliferation oder Zytokinanalyse) wurden diese über das Crf1/p41
Tetramer und das MACS®Cell-Sorting-System angereichert und weiter expandiert (siehe
6.3.3).
Abbildung 13: Hypothetischer Mechanismus der RetroNectin® vermittelten Transduktion. Die
Zellen binden über die CS-1 Region über VLA-4 und über die C-Domäne durch VLA-5. Die
Viruspartikel können über die H-Domäne des RetroNectin® binden. Retronectin schafft die
räumliche Nähe zwischen Viruspartikel und Zielzelle, wodurch eine höhere Transduktionseffizienz
erreicht wurde. (Abbildung aus der RetroNectin® Produktanleitung)
54
Ergebnisse
7
Ergebnisse
7.1
Generierung A. fumigatus spezifischer T-Zellklone
Mit dem Ziel A. fumigatus spezifische TCRs zu identifizieren und zu charakterisieren,
wurden zunächst T-Zellklone hergestellt und auf die Expression eines A. fumigatus
spezifischen TCR untersucht. Für die Charakterisierung wurde ein 15-mer Peptid aus der
Zellwandglykonase Crf1 (Crf1/p41) verwendet, das eine hohe Immunogenität besitzt und
von Personen erkannt wird, die das MHC Klasse II Allel HLA-DRB1*03, HLA-DRB1*04
oder HLA-DRB1*13 exprimieren (dies entspricht einer Abdeckung von 59,9 % der
kaukasischen Bevölkerung) (Stuehler et al. 2011). Nach Expansion, Isolierung und
Klonierung wurde die Spezifität und Effektor-Funktion der Crf1/p41 spezifischen
CD4+ T-Zellklone, über die IFN-γ Produktion nach einer Crf1/p41 spezifischen Stimulation
bestimmt.
7.1.1
Expansion Crf1/p41 spezifischer T-Zellen
Es hat sich gezeigt, dass nach der Isolierung von mononuklearen Zellen des peripheren
Blutes (PBMC) aus dem Vollblut gesunder HLA-DRB1*04+ Spender, die Vorläuferfrequenz
von Crf1/p41 spezifischen CD4+ T-Zellen nicht nachweißbar ist (Stuehler et al. 2011). Um
Crf1/p41 positive CD4+ T-Zellen nachweisen zu können, mussten diese zunächst
innerhalb der PBMC Crf1/p41 spezifisch expandiert werden. Dazu wurden PBMC mit dem
Crf1/p41 Peptid und unter Zugabe von IL-2 kultiviert. Nach einer Woche erfolgte eine
Restimulation der Zellen mit Crf1/p41 Peptid beladenen Monozyten und Zugabe von IL-2.
Die Zellen wurden nach 14-tägiger Expansion mit Crf1/p41 spezifischem Tetramer und
einem anti-CD4 Antikörper gefärbt und durchflusszytometrische analysiert (Abbildung 14).
Eine Crf1/p41 spezifische CD4+ T-Zellpopulation wurde nachgewiesen, deren Anteil an
der PBMC-Population bei 1,3 % (Spender 1), 5,35 % (Spender 2) und 7,8 % (Spender 3)
lag (Abbildung 14 B).
55
Ergebnisse
A
Spender 1 (DRB1*0408)
Spender 2 (DRB1*0401)
Spender 3 (DRB1*0401)
CD4
ohne
Stimulation
B
14 Tage
Stimulation
Tetramer-Crf1/p41
Abbildung 14: Expansion Crf1/p41 spezifischer T-Zellen aus PBMC von drei verschiedenen
Spendern mit HLA-DRB1*04 Allel. Für die Expansion wurden PBMC von drei verschiedenen
Spendern für 14 Tage ohne (A) und mit Crf1/p41 Peptid (B) stimuliert. Crf1/p41 spezifische
+
CD4 T-Zellen
wurden
mit
Crf1/p41
spezifischem
Tetramer
und
anti-CD4
Antikörper
durchflusszytometrisch ermittelt.
7.1.2
Spezifitätstest der hergestellten T-Zellklone via Crf1/p41 Tetramer
Im Anschluss an die Expansion Crf1/p41 spezifischer T-Zellen, wurden diese mit Hilfe des
Crf1/p41 Tetramers und magnetischer PE-Beads angereichert und durch limiting dilution
vereinzelt. Auf diese Weise erhaltene Klone wurden erneut auf ihre Spezifität überprüft,
um ausschließlich Crf1/p41 spezifische Klone auf ihre TCR näher zu analysieren.
56
Ergebnisse
CD4
A
Spender 1 (DRB1*0408)
Spender 2 (DRB1*0401)
Spender 3 (DRB1*0401)
Klon 48
Klon 71
Klon 78
Klon 1B5
Klon 1F6
Klon 8F3
B
Tetramer-Crf1/p41
Abbildung 15: Crf1/p41 Spezifität der generierten Klone. Crf1/p41 spezifische T-Zellen wurden
über eine Verdünnungsreihe mit bestrahlten Stimulationszellen (T2 Zellen und allogenen PBMC) in
Anwesenheit eines monoklonalen anti-CD3 Antikörpers und IL-2 über zwei Wochen kloniert. Die
+
generierten Crf1/p41 spezifischen CD4 T-Zellklone wurden mittels Crf1/p41 Tetramer und
anti-CD4 Antikörper durchflusszytometrisch identifiziert. Es sind repräsentativ je ein positiver (A)
und eine negativer Klon (B) pro Spender, dargestellt.
Abbildung 15 zeigt repräsentativ jeweils einen Crf1/p41 spezifischen Klon und einen
Crf1/p41 unspezifischen Klon von drei unterschiedlichen Spendern. Es wurden insgesamt
64 potentielle Klone von Spender 1, 25 von Spender 2 und 27 potentielle Klone von
Spender 3 durchflusszytometrisch auf ihr Crf1/p41 und CD4 Spezifität untersucht.
Zusammenfassend konnten 52 Crf1/p41 spezifische CD4+ Klone von Spender 1 (Tabelle
3), 20 von Spender 2 (Tabelle 4) und 21 Crf1/p41 spezifische CD4+ Klone von Spender 3
(Tabelle 5) identifiziert werden. Dabei ergab sich, dass von allen untersuchten potentiellen
Klonen von Spender 1 und Spender 2 80 % und von Spender 3 78 % Crf1/p41 spezifisch
und CD4+ sind.
57
Ergebnisse
Tabelle 3: Ergebnisse der durchflusszytometrischen Messung von potentiellen Crf1/p41
spezifischen T-Zellklonen von Spender 1. Durch limiting dilution kultivierte Crf1/p41und CD4
positive Klone sind grau hervorgehoben und haben einen Klonnamen erhalten. Angaben in % der
Gesamt- Population.
Probe
Crf1/p41 Tetramer +
Crf1/p41 Tetramer -
Crf1/p41 Tetramer -
CD4 +
CD4 +
CD4 -
Angaben in %
Angaben in %
Crf1/p41 Tetramer + Klonname
CD4 -
Angaben in %
Angaben in %
1B5
0,52
99,42
0,03
0,03
~
3F8
99,03
0,93
0,01
0,02
1
1H5
99,35
0,57
0,04
0,04
2
1D12
13,58
86,29
0,05
0,08
~
4A4
99,33
0,53
0,08
0,06
3
3C5
99,01
0,86
0,06
0,07
4
5A5
98,4
1,5
0,05
0,05
5
5B11
99,1
0,82
0,07
0,02
6
1C6
0,06
99,92
0,01
0,01
~
2E7
98,43
1,52
0,03
0,02
7
5E7
99,57
0,42
0
0,01
8
6C11
98,82
1,02
0,09
0,08
9
6G5
98,31
1,54
0,11
0,04
10
2A1
0,04
99,93
0,02
0,01
~
7G6
99,54
0,42
0,04
0
11
4B8
96,37
3,27
0,2
0,17
12
7C2
97,31
2,67
0,02
0
13
7D5
99,34
0,63
0,01
0,02
14
2F2
99,46
0,48
0,04
0,02
15
2F8
97,96
1,84
0,13
0,07
16
2E10
99,06
0,84
0,07
0,03
17
2B4
0,72
8,48
2,23
88,57
~
1H12
99,5
0,43
0,03
0,04
18
6A5
98,92
0,97
0,1
0,01
19
7E8
90,03
9,89
0,04
0,04
20
4G9
98,61
1,35
0,02
0,02
21
6H2
99,23
0,66
0,07
0,05
22
2C4
61,46
38,45
0,02
0,07
~
4B6
99,42
0,48
0,02
0,08
23
6C8
98,59
1,37
0,02
0,02
24
1H10
97,44
2,49
0,02
0,05
25
2C12
7,25
88,56
0,13
4,06
~
2D11
0,11
99,84
0,02
0,03
~
4B2
99,48
0,44
0,01
0,07
26
4C11
99,43
0,53
0,02
0,02
27
2B2
84,17
15,8
0,02
0,01
28
3A2
99,53
0,38
0,04
0,05
29
2C8
99,17
0,83
0
0
30
4D2
98,98
0,98
0,01
0,03
31
58
Ergebnisse
Probe
Crf1/p41 Tetramer +
Crf1/p41 Tetramer -
Crf1/p41 Tetramer -
Crf1/p41 Tetramer + Klonname
CD4 +
CD4 +
CD4 -
CD4 -
Angaben in %
Angaben in %
Angaben in %
Angaben in %
1B6
64,35
35,62
0,02
0,01
32
3F9
98,21
1,75
0,03
0,01
33
5A10
99,06
0,9
0,03
0,01
34
2C7
99,2
0,76
0,01
0,03
35
3B9
0,09
99,84
0,03
0,04
~
1F12
99,6
0,36
0,03
0,01
37
3D7
99,38
0,52
0,03
0,07
38
2C3
98,4
1,32
0,01
0,28
39
4C8
99,51
0,39
0,03
0,07
40
3D9
97,44
2,53
0,02
0,02
41
1A10
93,52
6,43
0,05
0
42
5C7
99,58
0,34
0,05
0,03
43
4B9
98,5
1,43
0,02
0,05
44
1D9
98,95
1,02
0,02
0,01
45
1C10
99,35
0,54
0,04
0,06
46
3E6
0,07
99,92
0,01
0
~
1H8
99,12
0,72
0,14
0,02
47
3C2
99,53
0,44
0,02
0,01
48
4B5
63,92
36,02
0,04
0,01
~
5C8
97,63
2,32
0,03
0,02
49
6F11
98,13
1,73
0,11
0,03
50
7B8
98,89
0,98
0,08
0,05
51
3C10
99,44
0,49
0,02
0,05
52
5A8
3,85
96,1
0,01
0,04
~
6B11
20,66
79,22
0,06
0,06
~
Tabelle 4: Ergebnisse der durchflusszytometrischen Messung von potentiellen Crf1/p41
spezifischen T-Zellklonen von Spender 2. Durch limiting dilution kultivierte Crf1/p41 und CD4
positive Klone sind grau hervorgehoben und haben einen Klonnamen erhalten. Angaben in % der
Gesamt- Population.
Probe
3F8
Crf1/p41 Tetramer +
Crf1/p41 Tetramer -
Crf1/p41 Tetramer -
Crf1/p41 Tetramer + Name Klon
CD4 +
CD4 +
CD4 -
CD4 -
Angaben in %
Angaben in %
Angaben in %
Angaben in %
98,18
1,57
0,24
0
53
10C12 98,97
0,91
0
0,11
54
1F6
0,61
99,15
0,08
0,16
~
7E10
95,41
1,86
2,51
0,22
55
2D2
83,98
13,8
0,95
1,26
56
2G3
95,5
3,42
0,54
0,54
57
2H9
3,65
94,05
0,54
1,76
~
1B12
95,89
2,53
0,53
1,05
58
10F12
96,08
3,52
0,2
0,2
59
59
Ergebnisse
Probe
Crf1/p41 Tetramer +
Crf1/p41 Tetramer -
Crf1/p41 Tetramer -
Crf1/p41 Tetramer + Name Klon
CD4 +
CD4 +
CD4 -
CD4 -
Angaben in %
Angaben in %
Angaben in %
Angaben in %
8C2
97,56
0,12
0,85
1,46
60
3D10
96,53
2,94
0,32
0,21
61
3G7
94,92
2,05
2,83
0,2
62
3B7
81,62
15,9
1,15
1,33
~
7H11
98,35
1,29
0,09
0,28
63
9H2
99,27
0,37
0,26
0,11
64
5A9
97,68
1,67
0,07
0,58
65
6D7
1,01
98,35
0,37
0,28
~
7F4
97,41
1,55
0,36
0,67
66
4E3
98,7
0,96
0,15
0,19
67
4C5
88,26
9,57
0,7
1,48
~
10C8
98,4
1,15
0,22
0,22
68
4F5
95,01
3,51
0,65
0,83
69
4B3
96,51
1,41
1,49
0,58
70
1E1
97,57
0,59
1,55
0,29
71
6E7
97,2
1,31
0,37
1,12
72
Tabelle 5: Ergebnisse der durchflusszytometrischen Messung von potentiellen Crf1/p41
spezifischen T-Zellklonen von Spender 3. Durch limiting dilution kultivierte Crf1/p41 und CD4
positive Klone sind grau hervorgehoben und haben einen Klonnamen erhalten. Angaben in % der
Gesamt- Population.
Probe
Crf1/p41 Tetramer +
Crf1/p41 Tetramer -
Crf1/p41 Tetramer -
Crf1/p41 Tetramer + Name Klon
CD4 -
CD4 +
CD4 -
CD4 -
Angaben in %
Angaben in %
Angaben in %
Angaben in %
3B2
99,71
0,16
0,11
0,02
73
5A9
99,36
0,44
0,16
0,04
74
3B1
0,2
1,08
98,72
0
~
6H12
99,58
0,31
0,08
0,02
75
2C4
99,69
0,21
0,04
0,05
76
4G2
99,85
0,11
0,01
0,02
77
4C7
0,71
99,25
0,04
0
~
5A7
0,19
99,7
0,1
0
~
5C8
99,75
0,08
0,09
0,09
78
7A1
99,1
0,74
0,16
0
79
6F8
98,48
1,36
0,11
0,04
80
6B7
99,38
0,37
0,13
0,13
81
6A9
98,42
1,48
0,07
0,02
82
2F3
99,24
0,62
0,15
0
83
8G10
99,68
0,27
0,03
0,02
84
7C12
98,68
0,88
0,18
0,26
85
6C8
0,38
0,9
98,69
0,02
~
1F4
99,78
0,17
0,03
0,03
86
2A9
0,31
6,86
92,53
0,31
~
60
Ergebnisse
Probe
Crf1/p41 Tetramer +
Crf1/p41 Tetramer -
Crf1/p41 Tetramer -
Crf1/p41 Tetramer + Name Klon
CD4 -
CD4 +
CD4 -
CD4 -
Angaben in %
Angaben in %
Angaben in %
Angaben in %
7F8
98,79
0,39
0,39
0,44
87
6D12
98,94
0,97
0,08
0,01
88
11H10
99,41
0,24
0
0,35
89
8C3
98,94
0,12
0,35
0,59
90
8F3
0,01
99,88
0,06
0,06
~
2H1
99,29
0,47
0,24
0
91
11D12
99,35
0,13
0,13
0,39
92
12D2
98,43
0,72
0,48
0,36
93
7.1.3
Interferon-γ Produktion der Crf1/p41 spezifischen T-Zellklone
TH1 Zellen, welche nach antigenspezifischer Stimulation IFN-γ produzieren, spielen eine
entscheidende Rolle in der Immunantwort gegen einige pathogene Pilze inklusive
A. fumigatus (Romani 2011; Wuthrich et al. 2012) (siehe 3.2). Somit stellen Crf1/p41
spezifische CD4+ T-Zellklone mit nachgewiesener IFN-γ Produktion potentielle TCRs, die
für
einen
TCR-Transfer
+
spezifischen CD4 T-Zellklone
geeignet
mit
sind.
Crf1/p41
Dabei
Peptid
wurden
beladenen
die
Crf1/p41
Monozyten
und
unbeladenen Monozyten für 24 Stunden stimuliert und anschließend der Kulturüberstand
auf ihre IFN-γ Konzentration mittels ELISA untersucht. Für Spender 1 wurden 23 Klone
mit einer hohen IFN-γ Produktion (über 5000 pg/ml IFN-γ), 7 Klone mit mittlerer IFN-γ
Produktion (über 2500 pg/ml), 6 Klone mit geringer IFN-γ Produktion (über 800 pg/ml), 9
Klone mit sehr geringer (unter 800 pg/ml) und 7 Klone mit nahezu keiner IFN-γ Produktion
(unter 300 pg/ml) ermittelt (Abbildung 16). Für alle untersuchten Crf1/p41 spezifischen
Klone von Spender 2 wurden hohe IFN-γ Konzentrationen (über 5000 pg/ml) gemessen
(Abbildung 17). Von Spender 3 wurden 21 Crf1/p41 spezifische Klone untersucht, dabei
zeigten 5 Klone eine hohen IFN-γ Produktion (über 5000 pg/ml IFN-γ), 5 Klone eine
mittlere IFN-γ Produktion (über 2500 pg/ml), 8 Klone eine geringe IFN-γ Produktion (über
800 pg/ml) und 3 Klone sehr geringe (unter 800 pg/ml über 300 pg/ml) IFN-γ Produktion
(Abbildung 18). Da davon ausgegangen werden kann, dass Klone mit hoher IFN-γ
Produktion zum Zeitpunkt der Messung eine hohe Effektor-Funktion zeigen und deren
TCR potentiell für den Transfer geeignet ist, wurden diese für weitere Analysen
ausgewählt.
61
Ergebnisse
+
Abbildung 16: IFN-γ Produktion Crf1/p41 spezifischer CD4 T-Zellklone von Spender 1 nach
Crf1/p41 spezifischer Stimulation. 52 Crf1/p41 spezifische Klone wurden mit Crf1/p41 Peptid
beladenen Monozyten (1:5) für 24 Stunden stimuliert ((A) Klon 1-26; (B) Klon 27-52). Der
Kulturüberstand wurde im Anschluss mittels ELISA auf die Konzentration des Zytokins IFN-γ
untersucht. Durch das Mitführen eines IFN-γ Standards wurden die Konzentrationen in pg/ml
berechnet.
62
Ergebnisse
+
Abbildung 17: IFN-γ Produktion Crf1/p41 spezifischer CD4 T-Zellklone von Spender 2 nach
Crf1/p41 spezifischer Stimulation. 20 Crf1/p41 spezifische Klone wurden mit Crf1/p41 Peptid
beladenen Monozyten (1:5) für 24 Stunden stimuliert. Der Kulturüberstand wurde im Anschluss
mittels ELISA auf die Konzentration des Zytokins IFN-γ untersucht. Durch das Mitführen eines
IFN-γ Standards wurden die Konzentrationen in pg/ml berechnet.
+
Abbildung 18: IFN-γ Produktion Crf1/p41 spezifischer CD4 Z-Zellklone von Spender 3 nach
Crf1/p41 spezifischer Stimulation. 21 Crf1/p41 spezifische Klone wurden mit Crf1/p41 Peptid
beladenen Monozyten (1:5) für 24 Stunden stimuliert. Der Kulturüberstand wurde im Anschluss
mittels ELISA auf die Konzentration des Zytokins IFN-γ untersucht. Durch das Mitführen eines
IFN-γ Standards wurden die Konzentrationen in pg/ml berechnet.
63
Ergebnisse
7.2
Identifizierung und Isolierung A. fumigatus spezifischer T-Zell-Rezeptoren
Die sehr geringe Vorläuferfrequenz von Crf1/p41 spezifischen T-Zellen in PBMC hat sehr
wahrscheinlich zur Folge, dass bei der Crf1/p41 spezifischen Expansion, Zellen
identischer Herkunft expandiert und anschließend kloniert wurden. Mit dem Ziel
unterschiedliche spezifische TCRs zu identifizieren wurden die TCRs der Crf1/p41
spezifischen Klone näher untersucht. Durch die geringere Variabilität der β Ketten
Familien, verglichen mit denen der α Ketten, wurden zuerst die Vβ Ketten über
Durchflusszytometrie und auf Sequenzebene analysiert. Aufgrund der sehr hohen
Diversität der CDR3 (siehe 3.4.2) kann bei unterschiedlichen Sequenzen in diesem
Bereich der Vβ Ketten sehr wahrscheinlich davon ausgegangen werden, dass die
Crf1/p41 spezifischen CD4+ T-Zellklone aus verschiedenen Vorläufern hervor gegangen
sind. Zur weiteren Charakterisierung der TCRs wurden die Vα Ketten, über
Sequenzanalysen, ermittelt. Die identifizierten Crf1/p41 spezifischen TCRs wurden isoliert
und in einen retroviralen Vektor kloniert, für eine Transduktion auf humane T-Zellen.
7.2.1
Identifizierung der T-Zell-Rezeptor β Ketten mit dem IO Beta Mark Kit (Beckman
Coulter)
Für eine erste Analyse der TCRs der Crf1/p41 spezifischen T-Zellklone, wurden die Klone
mit dem IO Beta Mark Kit (Beckman Coulter) durchflusszytometrisch auf ihre
variable β (Vβ) Kette untersucht (Abbildung 19). Die Klone wurden nach Protokoll des
Herstellers gefärbt und die durchflusszytometrischen Messungen ergaben die in Tabelle 6
dargestellten Vβ Ketten. Des Weiteren wurden „negative“ Klone, mit doppelten
Populationen bzw. mehrfach positiven Vβ Ketten Familien identifiziert und aussortiert. Bei
Spender 1 konnte die Vβ Kette 18 bei allen Crf1/p41 spezifischen Klonen festgestellt
werden (Tabelle 6 A). Für die Klone von Spender 2 wurden die Vβ Ketten Familien 18 und
1 ermittelt (Tabelle 6 B). Für Crf1/p41 spezifische Klone von Spender 3 wurden die Vβ
Ketten 18, 1 und 13.6 identifiziert (Tabelle 6 C). Zusammenfassend wurde festgestellt,
dass die Vβ Ketten Familie 18 bei allen drei Spendern mehrfach vertreten ist und Vβ 1 bei
zwei von drei Spendern auftritt. Die Vβ Kette von Klon 69 (Spender 2), sowie die Vβ Kette
der Klone 74, 75, 83, 85, 86, 87, 92 und 92 von Spender 3 konnte nicht bestimmt werden.
Das Kit deckt ca. 70 % des humanen Vβ- Repertoire ab, somit sollten die nicht
identifizierten Klone eine der verbliebenen Vβ Familien exprimieren.
64
Ergebnisse
+
Abbildung 19: Durchflusszytometrische Messung Crf1/p41 spezifischer CD4
T-Zellklone
+
gefärbt mit dem IO Beta Mark Kit (Beckman Coulter). Crf1/p41 spezifische CD4 T-Zellklone
wurden nach Angaben des Herstellers gefärbt und auf ihre Vβ Ketten Familie untersucht.
Repräsentativ sind ein Vβ 18 Klon (Spender 1/ Klon 2), ein Vβ 1 Klon (Spender 3/ Klon 73) und ein
„negativer“ Klon (Spender 2/ Klon 58) dargestellt. Der Klon 58 wurde als negativ eingestuft,
aufgrund der doppelten Population bei der durchflusszytometrischen Messung (eine Population
Vβ 18 und eine nicht feststellbare Vβ Familie).
Tabelle 6: Vβ Ketten Identifizierung Crf1/p41 spezifischer T-Zellklone. Durchflusszytometrische
Identifizierung der Vβ Kette des TCR von Crf1/p41 spezifischen Klonen von Spender 1 (A),
Spender 2 (B) und Spender 3 (C) durch den IO Beta Mark Kit (Beckman Coulter). *Nomenklatur
nach Arden et al. 1995.
65
Ergebnisse
7.2.2
Identifizierung der T-Zell-Rezeptor β Ketten durch SMARTer RACE PCR
Da es das Ziel ist unterschiedliche TCRs mit hoher Spezifität zu erhalten, wurden die
Sequenzen der Vβ Ketten der Crf1/p41 spezifischen CD4+ T-Zellklone mit der SMARTer
RACE PCR bestimmt. Aufgrund der sehr hohen Diversität der CDR3 kann bei
unterschiedlichen Sequenzen in diesem Bereich der Vβ Ketten sehr wahrscheinlich davon
ausgegangen
werden,
dass
die
Crf1/p41
spezifischen
CD4+ T-Zellklone
aus
verschiedenen Vorläufern hervor gegangen sind. Des Weiteren wurden die Vβ Ketten die
mit dem IO Beta Mark Kit nicht bestimmt werden konnte, identifiziert. Die Identifizierung
unterschiedlicher TCRs erfolgt über die Aminosäuresequenz der Vβ Ketten der Crf1/p41
spezifischen T-Zellklone. Über die sogenannte SMARTer RACE cDNA Amplifikation
(Clontech) ist es möglich die komplette cDNA beginnend am 5´ Ende der zu
identifizierenden Sequenz aus totaler RNA zu isolieren. Mit dieser Methode wurde die
vollständige Vβ Kette amplifiziert und mittels Agarosegel deren korrekte Länge kontrolliert.
Die Banden der Vβ Ketten liegen bei ca. 650 bp (Abbildung 20). Diese wurden
ausgeschnitten und die DNA wurde über den NucleoSpin® Gel Clean-up Kit (Macherey
Nagel) aufgereinigt.
Abbildung 20: 5´ RACE PCR der Vβ Ketten. (A) 5´ RACE PCR Schema der Vβ Kette der Crf1/p41
spezifischen Klone. (B) Das Agarosegel zeigt die 5´ RACE PCR Amplifikation der Vβ Kette von
Klon 78 (Spender 3) und einen 1kb DNA-Marker zur Bestimmung der Länge der amplifizierten DNA.
66
Ergebnisse
Abbildung 21: Sequenzierungsergebnis und Identifizierung der Vβ Kette eines TCR. (A)
Sequenz der von GATC-Biotech durchgeführten Sequenzierung. (B) Identifizierung der Sequenz
mit Hilfe der IMGT Datenbank. Die Vβ Sequenz von Klon 77 von Spender 3 ist hier repräsentativ
dargestellt. Mit 100%iger Übereinstimmung handelt es sich um die Vβ-Kette TRBV9*01; dies
entspricht Vβ 1 nach Arden et. Al (1995).
67
Ergebnisse
Die anschließende Sequenzierungen der gereinigten DNA wurde von GATC-Biotech
durchgeführt und die Analyse erfolgte mit dem Programm GENtle und der Datenbank
Immunogenetics (IMGT) (Abbildung 21). Die Analyse der Sequenzierungen ergab die in
Tabelle 7 dargestellten Vβ Ketten der Crf1/p41 spezifischen CD4+ T-Zellklone mit ihrer
jeweiligen Aminosäuresequenz der CDR3. Die Nomenklatur erfolgt nach Arden et al.
1995. Aus der Sequenzierung wurde ersichtlich, dass von 11 untersuchten Klonen
(Spender 1), drei unterschiedliche Vβ 18 Ketten vertreten sind. Von Spender 2 wurden 12
Klone untersucht, welche drei verschiedene Vβ Ketten (Vβ 1, Vβ 6 und Vβ 18) lieferten.
Für Spender 3 wurden die Vβ Ketten 1, 6, 13.6 und 18 aus 14 Klonen ermittelt. Die
Ergebnisse der Durchflusszytometrischen Untersuchungen konnten somit bestätigt
werden und für die verbliebenen Klone wurde die Vβ Ketten Familie 6 ermittelt. Durch die
Identifizierung der Vβ Ketten konnten 12 TCRs mit unterschiedlichen Vβ Ketten und somit
abstammend von unterschiedlichen Vorläuferzellen, von drei Spendern identifiziert
werden.
Tabelle
7:
Aminosäuresequenz
der
CDR3
der
Vβ Ketten
der
Crf1/p41 spezifischer
+
CD4 T-Zellklone. Nomenklatur der Vβ Ketten nach Arden et al. 1995.
Vβ 18
1,2 bzw. 3
stehen für unterschiedliche Vβ 18 Ketten.
Spender
CDR3 Region der Vβ Kette
Vβ
Klon
1
ASSP LSGSDTQYFGPGTRLTV
181
1, 2, 5, 6, 9, 40, 48
1
ASSP LNGGDEQYFGPGTRLTV
182
41, 49
1
ASSR LSGSDIQYFGAGTRLSV
183
8, 23
2
ASSV GGSDTEAFFGQGTRLTV
1
60, 64
2
ASSR LSGSDIQYFGAGTRLSV
18
53, 54, 55, 59, 61, 67, 70, 71, 72
2
ASSS SPYEQYVGPGTRLTV
6
69
3
ASSR TSGQETQYFGPGTRLLV
18
80
3
ASSP TNGDTQYFGPGTRLTV
18
78
3
ASSV GGSDTEAFFGQGTRLTV
1
73, 77
3
ASSG TSGDTQYFGPGTRLTV
6
74, 75, 83, 85, 86, 87, 92, 93
3
ASRG TGSLSADTQYFGPGTRLTV
13.6
88
3
ASSG TSCGPQYSGPEARRSGC
18
79
68
Ergebnisse
7.2.3
Identifizierung der T-Zell-Rezeptor α Ketten
Zur weiteren Charakterisierung der Crf1/p41 spezifischen TCRs, wurden von den
Crf1/p41 spezifischen CD4+ T-Zellklonen mit unterschiedlichen Vβ Ketten und mit einer
nachgewiesenen IFN-γ Produktion die variable α (Vα) Ketten ermittelt. Durch das
Auftreten von Vβ 18 bei allen drei Spendern, wurde jeweils ein Klon pro Spender mit
nachgewiesener IFN-γ Produktion für einen Vergleich gewählt (Klon 48 von Spender 1;
Klon 71 von Spender 2; Klon 78 von Spender 3), um mögliche von Spendern abhängige
Unterschiede aufzudecken. Da die Vβ Kette 1 von Klonen in zwei von drei Spendern
vorkommt, wurde diese für einen gegenüberstellenden Vergleich bezüglich Vβ 18
hinzugezogen (Klon 77 von Spender 3). Die Identifizierung der Vα Ketten erfolgte über die
vorher beschriebenen RACE PCR und anschließender Sequenzierung. Die vollständige
Vα Kette wurde amplifiziert und mittels Agarosegel auf ihre Länge kontrolliert. Dabei liegt
die korrekte Bande der Vα Kette bei ca. 600 bp (Abbildung 22).
Abbildung 22: 5´RACE-PCR der Vα Ketten. (A) 5´RACE PCR Schema der Vα Kette der Crf1/p41
spezifischen Klone. (B) Das Agarosegel zeigt die 5´RACE PCR Amplifikation der Vα Kette von
Klon 78 (Spender 3) und einen 1kb DNA-Marker zur Bestimmung der Länge der amplifizierten
DNA.
Die aus dem Agarosegel extrahierte und aufgereinigte DNA wurde von GATC-Biotech
sequenziert und die Ergebnisse mittels der Software GENtle und der Datenbank
Immunogenetics analysiert. Aus diesen ergaben sich die in Tabelle 8 dargestellten
69
Ergebnisse
Vα Ketten
und
die
entsprechenden Aminosäuresequenzen
der
CDR3
für
die
+
ausgewählten Crf1/p41 spezifischen CD4 T-Zellklone. Für die unterschiedlichen Vβ 18,
Klone 48 (Spender 1) und 71 (Spender 2), ergab sich für beide die Vα Kette 3, welche
sich in der Aminosäuresequenz der CDR3 unterscheiden. Der Klon 77 (Spender 3) mit
Vβ 1 hat die Vα Kette 15, während der Klon 78 (Spender 3) die Vα Kette 26 exprimiert.
Nach der Identifikation der Crf1/p41 spezifischen TCRs wurden diese isoliert und in einen
retroviralen Vektor kloniert, um retroviralen Kulturüberstand für einen Transfer zu
generieren.
Tabelle
8:
Aminosäuresequenz
der
CDR3
der
Vα Ketten
der
Vα
Vβ
Crf1/p41
+
spezifische CD4 T-Zellklone.
Nomenklatur der Vα/Vβ Ketten nach Arden et.al 1995.
1
Vβ 18 steht für eine bestimmte Vβ 18 Kette von Spender 1.
Spender
7.2.4
CDR3 Region der variablen α Kette
1
Klon
1
SYFC ATDRIIQGAQKLVCATDRIIQGAQKLVF CATD
3
18
48
2
SYVC ATDAIVQGAQKLVCATDAIVQGAQKLVF CATD
3
18
71
3
SAIYFC AESPGGSYIPTCAESPGGSYIPTF CAE
15
1
77
3
IYLC GARPIQGAQKLV CGARPIQGAQKLVF CGA
26
18
78
Isolierung der T-Zell-Rezeptor α und β Ketten und Klonierung in den retroviralen
Vektor pMP71
Für die Durchführung eines Transfers von Crf1/p41 spezifischen TCRs auf eine
Empfänger-T-Zelle und für die vergleichende Analyse der ausgewählten TCRs ist es
nötig, diese zu isolieren und in den retroviralen Vektor pMP71 zu klonieren (siehe 5.5.1).
Die retroviralen pMP71 Vektoren, ausgestattet mit TCR- DNA wurden für die Produktion
von retroviralem Kulturüberstand verwendet. Über den retroviralen Kulturüberstand wurde
die
TCR-DNA
in
die
Empfänger-T-Zellen
transferiert.
Die
identifizierten
Aminosäuresequenzen der TCRs wurden mit Hilfe spezifischer Primer (Tabelle 1) aus der
cDNA des entsprechenden Klons isoliert. Die anschließende Klonierung in den
retroviralen Vektor MP71 erfolgte über die Restriktionsschnittstellen Not1 und EcoR1.
Ebenfalls wurde ein Kontrollvektor, ausgestattet mit eGFP, kloniert, um die erfolgreiche
Transduktion über das Mikroskop zu verfolgen (Abbildung 23).
70
Ergebnisse
Abbildung 23: Klonierung von pMP71 Vektoren für einen TCR Transfer. Isolierung von TCR α
und TCR β Ketten aus der cDNA Crf1/p41 spezifischer T-Zellklone über RACE PCR, Aufreinigung
der korrekten Banden (TCR α ~ 850bp; TCR β ~ 950bp) aus Agarosegel (repräsentativ von Klon
48; Spender 1; TCR 4) (A) und Klonierung in pMP71 Vektoren (B). Die Vektoren sind mit einer
DNA-Wiederholungseinheit (long terminal repeat)
(MPSV-LTR)
und
einem
des „myeloproliferative sarcoma virus“
„Woodchuck-Hepatitis-Virus“-Posttranskriptionalem
regulatorischem
Element (PRE) ausgestattet und besitzen eine Ampillicinresistenz (AmpR). In den Kontrollvektor
wurde eGFP kloniert (C).
Es konnten die identifizierten TCRs aus der cDNA entsprechender Klone isoliert werden
und die erfolgreiche Klonierung wurde durch Sequenzierung bestätigt. In Tabelle 9 wurden
Informationen über die generierten Vektoren zusammengefasst.
71
Ergebnisse
Tabelle 9: Zusammenfassung der isolierten Crf1/p41 spezifischen TCR Ketten in ihren
jeweiligen pMP71 Vektoren. Dargestellt sind die Vα und Vβ Ketten und die Crf1/p41 spezifische
+
CD4 T-Zellklone aus denen sie isoliert wurden, sowie der Name des Vektors in den sie kloniert
wurden. Nomenklatur der Vα/Vβ Ketten nach Arden et.al 1995.
7.3
Vektor
Klon
Vα
MP71-TCR1α
78
26
MP71-TCR1β
78
MP71-TCR2α
71
MP71-TCR2β
71
MP71-TCR3α
77
15
MP71-TCR3β
77
MP71-TCR4α
48
MP71-TCR4β
48
Vβ
Spender
3
18
3
3
-
2
-
18
2
3
1
3
3
-
1
-
18
1
Transfer von A. fumigatus spezifischen T-Zell-Rezeptoren auf Jurkat 76 Zellen
Um zu ermitteln, ob die Crf1/p41 spezifischen TCRs für einen Transfer auf andere
T-Zellen geeignet sind, wurden sie zunächst auf Jurkat 76 Zellen transduziert. Die Zelllinie
Jurkat 76 ist für die erste Überprüfung der Expression und Funktionalität der TCRs
besonders geeignet, da es sich um eine TCR und CD3 negative humane T-Zell Lymphom
Jurkat Zelllinie handelt. Der induzierte TCR muss nicht mit endogenen TCRs konkurrieren.
Ebenso kann eine Expression mit Hilfe von anti-CD3 Antikörper durchflusszytometrisch
verfolgt werden, da CD3 nur bei erfolgreicher Transduktion exprimiert wird. Die
Transduktion Crf1/p41 spezifischer TCRs erfolgte über retroviralen Kulturüberstand,
generiert durch Platinum A transfiziert mit der jeweiligen Plasmid-DNA der TCR α Kette
und TCR β Kette, und mit RetroNectin®-beschichteten Zellkulturplatten. Die Spezifität der
transduzierten Jurkat 76 Zellen wurde mit Hilfe des Crf1/p41 Tetramer und anti-CD3
Antikörper durchflusszytometrisch ermittelt (Abbildung 24).
72
Ergebnisse
Abbildung 24: Expression Crf1/p41 spezifischer TCRs transduziert auf Jurkat 76 Zellen. Jurkat 76
transduziert mit pMP71 eGFP Vektor (A), ohne Vektor (Negativ; (B)) und jeweils transduziert mit
TCR 1, TCR 2, TCR 3 und TCR 4 (C). Durchflusszytometrische Messung an Tag 3 nach Transduktion
mit Crf1/p41-Tetramer und anti-CD3 Ab. Eine Messung ist hier repräsentativ für mehrere
durchgeführte Transduktionen dargestellt.
Der erfolgreiche Transfer auf die Zelllinie Jurkat 76, von TCR 1, TCR 3 und TCR 4 konnte
mittels Crf1/p41 Tetramer und anti-CD3 Antikörper nachgewiesen werden. TCR 2 zeigte
eine positive CD3 Färbung, jedoch wurde kein Crf1/p41 Tetramer gebunden. Der TCR 1
wurde auf 2,78 % der transduzierten Zellen nachgewiesen. Mit TCR 2 transduzierte Zellen
zeigten 6,70% CD3 positive Zellen, allerdings keine Bindung des Crf1/p41 Tetramers.
1,46 % von, TCR 3 transduzierten Zellen, und 2,77 % der TCR 4 transduzierten Zellen
waren CD3 positiv und haben Crf1/p41 Tetramer gebunden. Die Expression von
pMP71 eGFP transduzierten Zellen lag bei 50,6 % eGFP positiver Zellen, was die
erfolgreiche Transduktion bestätigt.
7.4
Transfer eines Codon- und Vektor- optimierten T-Zell Rezeptor auf Jurkat 76
Aufgrund
der
geringen
Frequenzen
der
transduzierten
Zellen
wurde
eine
Codonoptimierung der TCR Sequenz durchgeführt, um die Translation des Transgenes zu
erhöhen (Scholten et al. 2006). Die Codonoptimierung, durchgeführt von GeneArt® (Life
Technologies),
erhöht
die
Proteinmenge,
aber
begünstigt
nicht
den
korrekten
73
Ergebnisse
Zusammenbau des transferierten TCR. Um die korrekte Paarung des TCR zu erhöhen
wurden die α und β Kette in einen Vektor kloniert und mittels eines p2A-Elements
voneinander getrennt. Für eine höhere funktionale Avidität bezüglich des modifizierten
TCR wurden die Cα und Cβ Kette durch murine Ketten ersetzt. Zur weiteren Stabilisierung
des TCRs wurde eine weitere Disulfidbrücke eingebaut, welche die C- Regionen von
TCR α und TCR β verbinden.
Abbildung 25: Optimierter Vektor pMP71. Das von GeneArt (Life Technologies) optimierte
TCR α - p2A - TCR β Element wurden über die Restriktionsschnittstellen Not1 und EcoR1 in den
Vektor pMP71 kloniert. Der Vektor ist mit DNA-Wiederholungseinheiten (long terminal repeat) des
„myeloproliferative
sarcoma
virus“
(MPSV-LTR),
einem
„Woodchuck-Hepatitis-Virus“-Posttranskriptionalem regulatorischem Element (PRE) und einer
Ampicillinresistenz (AmpR) ausgestattet.
Für die Optimierung wurde TCR 1 ausgewählt, da er bei der Transduktion auf Jurkat 76
eine hohe Transduktionseffizienz zeigte. Die optimierte Sequenz wurde mittels Not1 und
EcoR1 Restriktionsschnittstelle in den Vektor pMP71 kloniert (Abbildung 25). Der Vektor
MP71 TCR 1 optimiert wurde für die Herstellung von retroviralem Kulturüberstand
eingesetzt. Die Transduktionseffizienz von TCR 1 und optimiertem TCR 1 auf Jurkat 76
wurde vergleichend analysiert. Mittels Durchflusszytometrie wurde drei Tage nach
Transduktion eine Erhöhung der Expression um das 5fache bei optimiertem TCR 1
festgestellt (Abbildung 26). Die Transduktionseffizienz von eGFP lag bei 24,3 %
transduzierter Zellen.
74
Ergebnisse
Abbildung 26: Expression von Crf1/p41 spezifischem TCR 1 und optimiertem TCR 1 auf
Jurkat 76. Durchflusszytometrische Messung von Jurkat 76 transduziert mit pMP71 eGFP Vektor
(A), ohne Vektor (Negativ) und jeweils transduziert mit TCR 1 und TCR 1 optimiert (B). Die
Messung erfolgte 3 Tage nach Transduktion mittels Crf1/p41 Tetramer und anti-CD3 Antikörper.
Eine Messung ist hier repräsentativ für mehrere durchgeführte Transduktionen dargestellt.
Wiederholte
Transduktion
auf
Jurkat 76
zeigte
eine
durchschnittliche
Transduktionseffizienz für TCR 1 von 2,5 % (n=2), TCR 1 optimiert mit 9,7 % (n=3), TCR 3
mit 1 % (n=2) und von TCR 4 betrug 3,5 % (n=2). TCR 2 wurde auch bei wiederholter
Transduktion (n=2) nicht exprimiert (Abbildung 27).
75
Ergebnisse
Abbildung 27: Expression Crf1/p41 spezifischer TCR nach Transduktion auf Jurkat 76. Die
Crf1/p41 spezifischen TCR 1 (n=2), TCR 1 optimiert (n=3), TCR 2 (n=2), TCR 3 (n=2) und TCR 4
(n=2) wurden auf Jurkat 76 transduziert und anschließend durchflusszytometrisch die Expression
mittels Crf1/p41 Tetramer und anti-CD3 Antikörper ermittelt.
7.5
Transfer von A. fumigatus spezifischen T-Zell-Rezeptoren auf humane
CD4+ T-Zellen
Für den Einsatz in einer möglichen adoptiven Therapie müssen die Crf1/p41 spezifischen
TCRs auf humane T-Zellen unterschiedlicher Empfänger transferiert werden können.
Darum wurden Spender mit unterschiedlichen HLA DRB1* Allel gewählt, um festzustellen,
ob die TCRs von Spendern mit HLA DRB1*04 Allel auch auf Spender mit einem anderen
HLA DRB1* Allel transferiert und zur Expression gebracht werden können. Für den
Transfer A. fumigatus spezifischer TCRs in humane CD4+ T-Zellen wurden TCR 1, TCR 1
optimiert, TCR 2, TCR 3 und TCR 4 über retroviralen Kulturüberstand und mit
RetroNectin®-beschichtete Zellkulturplatten in die Spender 4, 5 und 6 transferiert. Es
wurden CD4+ T-Zellen transferiert, da in vorherigen Untersuchungen gezeigt wurde, dass
Crf1/p41 eine CD4+ TH1 Immunantwort bei Aspergillus- Infektionen in Menschen und in
Mäusen auslöst (Bozza et al. 2009; Stuehler et al. 2011). Zwei Tage vor Transduktion
wurden CD4+ T-Zellen aus PBMC der drei Spender isoliert und mit CD3/CD28
Dynabeads® stimuliert. Die durchflusszytometrische Auswertung erfolgte 3 Tage nach
Transduktion mittels Crf1/p41 Tetramer. Abbildung 28 zeigt die durchflusszytometrische
Messung von Spender 4 repräsentativ für alle Spender. Spender 4 zeigt eine deutliche
76
Ergebnisse
Expression der Rezeptoren TCR 1 mit 3,16 % und TCR 1 optimiert mit 10,8 %, die
Rezeptoren TCR 3 (~1 %) und TCR 4 (~1 %) zeigen nur eine sehr schwache Expression.
TCR 2 konnte, wie auch schon auf den Jurkat 76, nicht zur Expression gebracht werden.
Die Expression von eGFP durch den Kontrollvektor lag bei 21,9 %. Zusammenfassend für
alle drei Spender hat sich gezeigt, dass sich der TCR 1 und besonders der optimierte
TCR 1 am besten transduzieren lassen (Abbildung 29).
+
Abbildung 28: Expression Crf1/p41 spezifischer TCRs nach Transduktion auf CD4 T-Zellen.
+
CD4 T-Zellen von Spender 4 wurden mit pMP71 eGFP transduziert (eGFP Kontrolle), ohne Vektor
(Negativ)
und
jeweils
mit
TCR 1,
TCR 1 optimiert,
TCR 2,
TCR 3,
TCR 4.
Die
durchflusszytometrische Messung wurde durchgeführt an Tag 3 nach Transduktion mit Crf1/p41
Tetramer und anti-CD4 Antikörper.
77
Ergebnisse
+
Abbildung 29: Expression Crf1/p41 spezifischer TCR nach Transduktion auf CD4 T-Zellen.
Die prozentuale Expression von TCR 1 (n=2), TCR 1 optimiert (n=3), TCR 2 (n=1), TCR 3 (n=2)
+
und TCR 4 (n=2) nach Transduktion auf CD4 T-Zellen von 3 verschiedenen Spendern
(Spender 4, 5 und 6) wurde ermittelt mit Hilfe des Crf1/p41Tetramer und anti-CD4 Antikörper über
Durchflusszytometrie.
7.5.1
Isolation und Expansion CD4+ T-Zellen mit optimiertem TCR 1
Da sich durch die vorangegangenen Versuche gezeigt hat, dass der optimierte TCR 1 im
Vergleich die höchste Transduktionseffizienz hat, wurde dieser für weitere Analysen
ausgewählt. Aufgrund der geringen Zellmengen der transduzierten Zellen ist für die
Durchführung weiterer funktioneller Tests eine Anreicherung der TCR 1 optimierten
spezifischen Zellen von Nöten. Mit Hilfe des Crf1/p41 Tetramer und magnetischer
Separation können die spezifischen Zellen isoliert werden. Die isolierten Zellen wurden
nach Expansionsprotokoll für 14 Tage expandiert. Mittels durchflusszytometrischer
Messung mit Crf1/p41 Tetramer vor Isolation und nach Expansion wurden die Zellen auf
ihre Spezifität überprüft. Für Spender 4 hat sich mit Hilfe der Isolation und Expansion eine
Anreicherung auf 79,45 % Crf1/p41 spezifische Zellen ergeben (Abbildung 30). Die
Crf1/p41 spezifischen Zellen von Spendern 6 wurden auf 26 %, die Zellen von Spender 7
auf 31 % und die Zellen von Spender 8 auf 41% spezifische Zellen angereichert. Die
angereicherten,
spezifischen
Zellen
wurden
in
Proliferations-
und
Zytokinproduktion- Analysen eingesetzt.
78
Ergebnisse
+
Abbildung 30: Expression Crf1/p41 spezifischer TCR 1 optimiert transduzierter CD4 T-Zellen
nach
Expansion.
Durchflusszytometrische
Messung
von
Crf1/p41 spezifischen
und
+
TCR 1 optimiert transduzierten CD4 T-Zellen von Spender 4 vor Isolation und nach Isolation mit
14-tägiger Expansion. Die Expression wurden gemessen mit Crf1/p41 Tetramer und anti-CD4
Antikörper.
7.6
Proliferation und Zytokinproduktionsanalyse TCR 1 optimiert transduzierter
T-Zellen nach Crf1/p41 spezifischer Stimulation
Um zu ermitteln, ob die angereicherten TCR 1 optimiert transduzierten CD4+ T-Zellen die
Fähigkeit besitzen eine Immunantwort zu induzieren, wurden sie bezüglich ihrer
Proliferationsfähigkeit und der IFN-γ Produktion nach Crf1/p41 spezifischer Stimulation
untersucht.
Es
wurden
transduzierte
Zellen
von
drei
verschiedene
Spendern
(Spender 4, 6, und 8) untersucht, die negativ für das HLA-DRB1*04 Allel waren und von
einem Spender 7 der das HLA-DRB1*04 Allel exprimiert. Für die Ermittlung der
Proliferationsfähigkeit von TCR 1 optimierten transduzierten CD4+ T-Zellen wurden diese
mit dem Fluoreszenzfarbstoff eFluor®670 gefärbt und mit allogenen bzw. autologen mDC
(beladen mit Crf1/p41 Peptid) stimuliert (Abbildung 31). Als Positivkontrolle wurde bei
Spender 4 ein bakterielles Superantigen (SEB) eingesetzt bei den anderen Spendern
wurden CD3/CD28 Dynabeads® verwendet. Es zeigte sich eine positive Proliferation bei
der Stimulation mit SEB von 22,5 % (Spender 4), und die Stimulationen mit CD3/CD28
ergaben positive Proliferationen von 44,8 % (Spender 6), 98,4 % für Spender 7 und 86 %
(Spender 8). Keine Proliferation konnte bei der Stimulation mit allogenen mDC von
Spendern mit einem HLA-DRB1*13 Allel (gezeigt in Abbildung 31) und HLA-DRB1*06, 15
Allel ermittelt werden. Bei der Stimulation mit allogenen bzw. autologen Crf1/p41
beladenen mDC von Spendern mit HLA-DRB1*04 Allel (Spender 9 und Spender 7) wurde
die Proliferation der TCR 1 optimiert transduzierten CD4+ T-Zellen nachgewiesen. Nach
Abzug der Negativkontrolle (Stimulation mit unbeladenen mDC) zeigten die transduzierten
Zellen stimuliert mit allogenen Crf1/p41 beladenen mDC (Spender 9) von Spender 4 eine
79
Ergebnisse
positive Proliferation von 72 %, Spender 6 von 40 %, Spender 7 von 87 % und Spender 8
von 67 % der Crf1/p41 spezifischen CD4+ T-Zellpopulation (Abbildung 31). Es wurde
gezeigt, dass die TCR 1 optimiert transduzierten CD4+ T-Zellen von allen Spendern, nach
Crf1/p41 spezifischer Stimulation die Fähigkeit zur Proliferation besitzen.
80
Ergebnisse
Abbildung
31:
transduzierter
Proliferation
+
CD4 T-Zellen.
nach
Die
Crf1/p41
mit
spezifischer
Proliferationsfarbstoff
Stimulation
gefärbten
TCR 1 optimiert
TCR 1
optimiert
transduzierten Zellen von Spender 4, 6 7 und 8 wurden mit Crf1/p41 beladenen allogenen mDC
(HLA-DRB1*13; Spender 5) und mDC (HLA-DRB1*04; Spender 7) stimuliert. Nach 4 Tagen wurden
die Zellen mit Crf1/p41 Tetramer und anti-CD4 Antikörper gefärbt und die Proliferation von Crf1/p41
+
spezifischer CD4 T-Zellen wurde durchflusszytometrisch ermittelt. Negativkontrolle = unbeladene
mDC (HLA DRB1*04, Spender 7); Positivkontrolle = Superantigen (SEB) bei Spender 4 und
CD3/CD28 Dynabead® Stimulation bei Spender 6, 7, und 8.
81
Ergebnisse
Um die Funktionalität der transduzierten Zellen weiter zu präzisieren wurde die IFN-γ
Produktion
nach
Crf1/p41
Stimulation
(24
Stunden)
bestimmt.
Für
die
+
Zytokin-Konzentration von IFN-γ (Funktion: Differenzierung von CD4 T-Zellen zu TH1)
wurden die TCR 1 optimiert transduzierten Zellen mit Crf1/p41 beladenen allogenen bzw.
autologen mDC für 24 Stunden kultiviert und im Anschluss die IFN-γ Produktion
gemessen. In Abbildung 32 sind die Ergebnisse der durchflusszytometrischen Analyse für
die Spender 4, 6, 7 und 8 zusammengefasst. Die Zellen von allen Spendern wurden mit
Crf1/p41 beladenen autologen bzw. allogenen mDC von Spendern mit DRB1*04
negativem Allel (DRB1*06, 15, Spender 4; DRB1*13, Spender 5)) und allogenen mDC
von Spendern, mit DRB1*04 positivem Allel (DRB1*04; Spender 9) stimuliert. Die
Zytokinanalyse hat gezeigt, dass lediglich Crf1/p41 beladene mDC von Spendern mit
einem HLA DRB1*04 Allel in der Lage waren eine IFN-γ Produktion zu induzieren. Für
Spender 4 wurde ein IFN-γ Produktion von 3400 pg/ml, für Spender 6 wurden 640 pg/ml,
für Spender 7 wurden 1720 pg/ml und für Spender 8 wurden 1070 pg/ml IFN-γ gemessen.
Mit
den
funktionellen
Analysen
der
antigenspezifischen
Proliferation
und
Zytokinproduktion wurde bestätigt, dass Zellen, transduziert mit TCR1 optimiert Crf1/p41
spezifisch stimuliert werden und die Ausschüttung von Zytokinen induzieren können und
es sich um einen funktionellen TCR handelt.
Abbildung
32:
transduzierten
Zytokinproduktion
+
CD4 T-Zellen.
nach
Crf1/p41
TCR 1 optimiert
Stimulation
transduzierte
von
+
TCR 1 optimiert
CD4 T-Zellen
von
vier
unterschiedlichen Spendern wurden mit Crf1/p41 Peptid beladenen allogenen und autologen mDC
von Spendern mit HLA-DRB1*04 negativen und positiven Allelen für 24 Stunden stimuliert. Mittels
CBA wurden die Konzentrationen von IFN-γ im Kulturüberstand in pg/ml ermittelt. Für die
Auswertung wurden der mitgeführte Standard und die Software FCAP Array 2.0 verwendet.
82
Diskussion
8
Diskussion
Der Pilz A. fumigatus gehört zu den humanpathogenen Pilzen und kann in
immunsupprimierten Patienten zum Teil schwere invasive Infektionen auslösen. Neben
fortschreitenden Verbesserungen in der Behandlung und medikamentöser Prophylaxe
bleibt die Sterblichkeitsrate bei invasiven Erkrankungen, wie zum Beispiel bei der
invasiven
Aspergillose
trotzdem
hoch
(Baddley
et
al.
2013).
Darum
wären
immuntherapeutische Strategien wie der adoptive Transfer Antigen spezifischer T-Zellen
ein wichtiges Mittel, um das Immunsystem der Patienten zu unterstützen und Infektionen
zu verringern oder sogar zu eliminieren (Perruccio et al. 2005; Morris et al. 2006). Ein
Ansatz für die Entwicklung solcher Strategien ist die Identifizierung A. fumigatus
spezifischer TCRs, für einen möglichen Transfer dieser Rezeptoren auf andere Zellen,
welche wiederum in einer adoptiven Therapie eingesetzt werden könnten.
Dieses Projekt konzentriert sich auf die Generation von Vektoren die A. fumigatus
spezifischen TCR exprimieren, um diese für die genetische Modifikation von T-Zellen zu
verwenden. Das Peptid Crf1/p41 wurde aufgrund von vorherigen Studien gewählt, da es
bei gesunden Spendern eine funktionelle TH1 Immunantwort gegen A. fumigatus induziert
und zur Produktion hoher Mengen von IFN-γ führt (Khanna et al. 2011; Stuehler et al.
2011; Jolink et al. 2013). Des Weiteren zeichnet sich das Crf1/p41 Epitop dadurch aus,
dass es von den MHC Klasse II Allelen HLA-DRB1*03, HLA-DRB1*04 und HLA-DRB1*13
(Stuehler et al. 2011) präsentiert werden kann, welche insgesamt von ca. 60 % der
kaukasischen Bevölkerung exprimiert werden (Schipper et al. 1996; Gonzalez-Galarza et
al. 2011). Um eine hohe TCR Expression zu erhalten wurden einige Modifikationen des
TCR und Expressionsvektors durchgeführt. Die in dieser Arbeit ermittelten Ergebnisse
zeigen, dass TCR transduzierte CD4+ T-Zellen nach antigenspezifischer Stimulation
erfolgreich aktiviert werden können. Dies legt den Schluss nahe, dass die TCR
transduzierten CD4+ T-Zellen das Potential haben in einer Immuntherapie gegen
A. fumigatus Infektionen eingesetzt zu werden.
8.1
Die T-Zellantwort von Crf1/p41 ist polyklonal
Um Crf1/p41 spezifische TCRs zu identifizieren wurden Crf1/p41 spezifische T-Zellklone
in vitro generiert. Dafür wurden Zellen von drei gesunden Spendern mit dem HLADRB1*04 Allel verwendet. Die TH1 Effektor-Funktion, der Crf1/p41 spezifischen
CD4+ T-Zellklone, wurde durch die Bestimmung der IFN-γ Produktion nach Crf1/p41
spezifischer Stimulation bestätigt. Das TH1 Zytokin IFN-γ wurde gewählt, da gezeigt
wurde, dass gesunde Spender funktionelle TH1 Immunantworten gegen A. fumigatus
83
Diskussion
induzieren und Crf1 die Ausschüttung hoher Mengen von IFN-γ initiiert (Stuehler et al.
2011). Es wurden siebenunddreißig Crf1/p41 spezifische CD4+ T-Zellklone generiert.
Aufgrund der geringen Vorläuferfrequenz von Crf1/p41 spezifischen Zellen in PBMCs
wurden, während der Crf1/p41 spezifischen Expansion, Zellen identischer Herkunft
expandiert und anschließend kloniert. Durch Unterschiede in der Sequenz, der sehr
variablen CDR3 (im Bereich der Vβ Ketten) konnten 12 unterschiedlichen TCRs (von 3
unterschiedlichen
Spendern)
aus
unterschiedlichen
Crf1/p41
spezifischen
+
CD4 T-Zellklonen ermittelt werden. Dabei war festzustellen, dass vor allem die Vβ Kette
18 sehr dominant vertreten war (bei allen drei Spendern), ebenso die Vβ Ketten 1 und 6,
welche
bei
Klonen
von
zwei
Spendern
nachgewiesen
wurden.
Zur
weiteren
Charakterisierung der Crf1/p41 spezifischen TCRs wurde die Vα Kette von jeweils einem
Vβ 18 Klon (mit nachgewiesener IFN-γ Produktion) von jedem Spender identifiziert. Für
einen gegenüberstellenden Vergleich zu Vβ 18 wurde die Vβ Kette 1 ausgewählt, da
Klone von zwei Spendern diese exprimieren. Durch diese Auswahl können mögliche
spenderspezifische und kettenspezifische Unterschiede ermittelt werden. Es wurden die
Vα Ketten 3, Vα 15 und Vα 26 bestimmt. Somit liegt hier eine polyklonale T-Zellantwort
vor.
8.2
Der endogene TCR verringert die Oberflächenexpression von transduzierten
Crf1/p41 spezifischen T-Zell-Rezeptoren auf T-Zellen
Ein effektiver TCR für eine mögliche Therapie sollte aufgrund seiner Antigenerkennung
und nach seiner Oberflächenexpression ausgewählt werden. Für die Ermittlung der
Expressionsfähigkeit, der Crf1/p41 spezifischen TCRs auf der Oberfläche von
transduzierten Zellen, müssen diese zunächst in einen retroviralen Vektor kloniert werden.
Dafür wurden die Crf1/p41 spezifischen TCRs aus der cDNA Crf1/p41 spezifischer
CD4+ T-Zellklone isoliert und in den retroviralen Vektor pMP71 kloniert. In dieser Arbeit
wurden Vektoren für 4 verschiedene TCRs generiert (Tabelle 9). Der γ-retrovirale Vektor
pMP71 (Engels et al. 2003) wurde verwendet, da er eine stabile und hohe
Expressionsrate
in
T-Lymphozyten
zeigt,
selbst
unter
Anwendung
von
good
manufacturing practice (GMP) Bedingungen. Aus diesem Grund ist dieser Vektor auch für
einen potentiellen Einsatz in klinischen Studien geeignet. Durch diese Eigenschaften
wurde der Vektor pMP71 bereits in Studien des TCR Transfers erfolgreich eingesetzt (z.B.
Engels et al. 2005; Sommermeyer et al. 2006; Heemskerk 2010; Thomas et al. 2010;
Linnemann et al. 2013).
84
Diskussion
Jurkat 76 Zellen exprimieren keinen endogenen TCR und sind somit besonders geeignet
die Expressionsfähigkeit transduzierter TCRs zu ermitteln (Heemskerk et al. 2003). Bei
der TCR Transduktion in Jurkat 76 ergaben sich für 3 von 4 unterschiedlichen TCRs die
durchschnittlichen Oberflächenexpressionen von 2,5 % (TCR 1), 1 % (TCR 3) und 3,5 %
(TCR 4) (Abbildung 27). Die Oberflächenexpression von den Crf1/p41 spezifischen TCRs,
transduziert in CD4+ T-Zellen zeigten spenderspezifische Unterschiede und die
durchschnittliche Expression war niedriger im Vergleich zu transduzierten Jurkat 76 Zellen
(Abbildung 29). Die Konkurrenz zum endogenen TCR und die komplexere Transduktion
von CD4+ T-Zellen könnten dafür verantwortlich sein (van Loenen et al. 2010; Linnemann
et al. 2011; Wieczorek et al. 2013). Bei TCR 2 konnte auch nach wiederholter
Transduktion keine Bindung des Tetramers festgestellt werden (Abbildung 28, Abbildung
29). Die Ursache könnte zum einen ein schwacher TCR sein, welcher in starker
Konkurrenz zu endogenem TCR steht und zum anderen, könnte der TCR sehr schnell
abgebaut worden sein (Recycling), durch z.B. den inkorrekter Zusammenabbau der TCR
α und β Kette während oder nach der Translation (Call et al. 2007). Aufgrund der geringen
Oberflächenexpression des TCR, ist es sinnvoll eine Optimierung der Sequenz und des
Vektorsystems durchzuführen. Die verschiedenen Optimierungsstrategien werden im
folgenden Abschnitt näher erläutert.
8.3
Optimierung des Vektors pMP71 (TCR 1 optimiert) führt zu einer erhöhten
Expression von TCR 1 auf Jurkat 76 Zellen und primären CD4+ T-Zellen
Entscheidend für einen erfolgreichen Transfer von TCRs ist ein stabiler TCR Komplex.
Diese Stabilität kann durch eine stabile Bindung der TCR α und β Ketten zu einander,
durch Expressions- „starke“ TCRs erreicht werden (Sommermeyer et al. 2006). Eine
Kombination von Expressions- „starken“ TCRs und eine starke Bindung der CD3
Komponenten CD3γε, CD3δε und ξξ untereinander und zum TCR sind entscheidend für
die Stabilität des TCR-Komplex (Heemskerk et al. 2007). Momentan forschen einige
Arbeitsgruppen daran, die komplexen extrazellulären Bindungen von CD3 Komponenten
und TCR Komplexen zu untersuchen (Kuhns et al. 2007; Fernandes et al. 2012; Kuhns et
al. 2012). Durch transferierte TCRs wird die TCR Komplexbildung stark beeinflusst, denn
es kommt zur Konkurrenz, mit endogenen TCRs wodurch kombinierte TCRs entstehen
können.
Ebenfalls
kann
sich
durch
kombinierte
TCRs
das
Risiko
von
Autoimmunreaktionen erhöhen. Bendle et al. 2010 haben gezeigt, dass ein TCR Gen
Transfer im Mausmodell eine tödliche Autoimmunreaktion durch Zytokinausschüttung
induziert und dass die kombinierten TCRs für das Auslösen der Autoimmunreaktion
verantwortlich sind. Bei der Transduktion von TCRs in humane T-Zelllinien reduziert sich
85
Diskussion
die Expression des gewünschten TCR, durch die Entstehung verschiedener TCR α/β
Kombinationen. Ebenso können durch die verschiedenen Kombinationen TCRs mit neuen
reaktiven Eigenschaften entstehen, deren T-Zellen eine gesundheitsgefährdende
Immunreaktion hervorrufen können (auto- und allo- reaktiv) (van Loenen et al. 2010). Die
Auswirkungen der kombinierten TCRs, sowie das Auslösen der Autoimmunreaktionen
werden bis heute in einigen Arbeiten diskutiert (Linnemann et al. 2011; Wieczorek et al.
2013). Sequenzen können ebenfalls Einfluss auf den Translationslevel haben, so z.B.
durch Gene die seltene Codons beinhalten, die für selten auftretende tRNA codieren und
die Effektivität der Translation mindern und so die Expression beeinflussen. Ein Codon gilt
als “selten”, wenn dieses 50 % seltener angetroffen wird, als Codons die für dieselbe
Aminosäure codieren (Scholten et al. 2006). Eine Codonoptimierung kann die Expression
des TCR erhöhen (Scholten et al. 2006; Sommermeyer et al. 2010). Alle diese
Sachverhalte haben Auswirkungen auf die Halbwertszeiten von TCRs und nehmen
Einfluss auf die Oberflächenexpression. In dieser Arbeit wurde eine Codonoptimierung
von TCR 1 durchgeführt und die höhere Stabilität und stärkere Paarung des TCR αβ
Komplex durch Optimierungen forciert (Abbildung 25). Im Einzelnen werden die
Optimierungsstrategien im folgenden Abschnitt beschreiben.
Um die Ausbildung gemischter TCRs einzuschränken bzw. zu verhindern, wurden bei der
Optimierung des Crf1/p41 spezifischen TCR 1 die konstanten Ketten durch murine ersetzt
und eine zusätzliche Disulfidbrücke im Bereich der konstanten Region eingebaut. Durch
diese Veränderungen wird die TCR Komplex Bildung der transduzierten α Ketten mit ihren
zugehörigen, transduzierten β Ketten stark erhöht. Es hat sich gezeigt, dass durch die
Murinisierung der TCR konstanten Ketten, die Oberflächenexpression höher ist,
verglichen mit der des unveränderten TCR. Gründe für diese Erhöhung könnten die
stärkere Bindung der murinen Sequenz zu CD3 Komplexen sein, aber auch die stärkere
Bindung der murinen Ketten zueinander, wodurch die Anzahl kombinierter TCRs reduziert
wird (Cohen et al. 2006; Sommermeyer et al. 2010). Der Einbau weiterer Disulfidbrücken
in die konstante Region des TCR zeichnet sich ebenfalls durch eine erhöhte
Oberflächenexpression aus und reduziert das Auftreten kombinierter TCRs (Cohen et al.
2007; Kuball et al. 2007).
Des Weiteren wurde das Vektorsystem modifiziert, indem der TCR in einen einzigen
Vektor kloniert wurde. Damit wird das Problem umgangen, dass zwei verschiedene
Vektorpartikel bzw. Viruspartikel (von TCR α Kette und von TCR β Kette) die gleiche Zelle
infizieren müssen. Eine Vektorklonierung von β Kette und α Kette, getrennt durch einen
Peptidlinker, zeigt hierbei die höchste Expression (Leisegang et al. 2008).
86
Diskussion
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass alle hier geschilderten Methoden zu einer
erhöhten Oberflächenexpression des modifizierten TCR führen und eine erhöhte
funktionelle Avidität der TCR transduzierten T-Zellen begünstigen (Hart et al. 2008). Dies
wurde auch in der vorliegenden Arbeit bestätigt, denn durch die Optimierungen des
Crf1/p41 spezifischen TCR 1 erhöhte sich die Expression um das 3 bis 5fache in
Jurkat 76 und um das 2fache in CD4+ T-Zellen.
Die verschiedenen Optimierungsstrategien werden laufend verbessert und weiteren Tests
unterzogen. So wurden durch die Konkurrenz-Problematik zum endogenen TCR die
chimärischen Antigen Rezeptoren (CARs) entwickelt. CARs haben den Vorteil, dass sie
aus einem einzelnen variablen Fragment (scFv), gebunden an CD3, bestehen und so bei
einem Transfer nicht mit endogenem TCR konkurrieren, oder kombinieren. Ebenso sind
sie im Vergleich zu TCRs HLA-unabhängig. Jedoch sind auch Nachteile bezüglich der
CARs zu beachten, zum einen wurde in frühen Studien angemerkt, dass CARs
exprimierende T-Zellen weniger sensitiv gegenüber Peptid sind, als T-Zellen, die einen
αβ TCR exprimieren (Zhang et al. 2004). Zum anderen können CARs eine zu hohe
Zytokinausschüttung induzieren oder in einigen Fällen könnte die Signalschwelle so
niedrig sein, dass in T-Zellen auch ohne Antigenpräsentation eine Immunantwort
ausgelöst werden kann (Ramos et al. 2011). Ebenfalls sollte die Immunogenität nicht
außer Acht gelassen werden, da das scFv von der Maus stammt und somit eine
Immunantwort und Eliminierung der CAR transduzierten T-Zellen ausgelöst werden kann
(Thomas et al. 2010; Wieczorek et al. 2013). Aufgrund der hier aufgeführten Nachteile, die
nicht für den αβ TCR zutreffen, ist der TCR Einsatz für einen Transfer den CARs
vorzuziehen.
8.4
Die Spezifität und Funktionalität der Crf1/p41 spezifischen T-Zell-Rezeptor
transduzierter auf CD4+ T-Zellen wurde bestätigt
Für transduzierte CD4+ T-Zellen (TCR 1 optimiert) von 4 unterschiedlichen Spendern, die
unterschiedliche
HLA-DRB1*
Allele
exprimieren,
wurden
funktionelle
Analysen
durchgeführt. Dabei konnte gezeigt werden, dass transduzierte CD4+ T-Zellen (TCR 1
optimiert), stimuliert durch Crf1/p41 beladene mDC (von Spendern, die das HLA-DRB1*04
Allel exprimieren), proliferieren und das TH1 Zytokin IFN-γ produzieren (Abbildung 31,
Abbildung 32). Über diese Analysen ist die Funktionalität der Crf1/p41 spezifischen TCR 1
optimiert transduzierten T-Zellen bestätigt.
87
Diskussion
8.5
Einsatzmöglichkeiten funktioneller
Crf1/p41
spezifischer
T-Zell-Rezeptor
transduzierter T-Zellen
Ein funktioneller A. fumigatus spezifischer TCR könnte eingesetzt werden für die
Entwicklung eines adoptiven Transfers von modifizierten T-Zellen. Der adoptive Transfer
von spezifischen T-Zellen, sowohl genetisch modifiziert, als auch nicht modifiziert, wurde
bisher in der Krebstherapie angewandt und vorangetrieben (Restifo et al. 2012; Kalos et
al. 2013). Auch bei anti-viralen Therapien kommt der adoptive Transfer spezifischer
T-Zellen zum Einsatz (Einsele et al. 2002; Stemberger et al. 2014). Bei Infektionen,
ausgelöst durch A. fumigatus konnte gezeigt werden, dass ein adoptiver Transfer von
funktionellen TH1 Zellen eine protektive Immunantwort induziert. Im Mausmodell konnte
durch den adoptiven Transfer von dendritischen Zellen, beladen mit Aspergillus
Antigenen, oder durch Aspergillus spezifische CD4+ Splenozyten eine Reduktion der
fungalen Infektion festgestellt werden (Cenci et al. 2000) und eine protektive TH1
Immunantwort wurde induziert (Bozza et al. 2003). In klinischen Studien wurde gezeigt,
dass durch den adoptiven Transfer von Aspergillus spezifischen TH1 T-Zellklonen in
Patienten,
die
an
einer
Aspergillus
Infektion
nach
einer
hämatopoetischen
Stammzelltransplantation erkrankten, eine stabile T-Zell Immunantwort induziert wird,
ohne eine GvHD auszulösen (Perruccio et al. 2005). Diese vielversprechenden
Untersuchungen veranlassten viele Wissenschaftler diese weiter zu entwickeln, im
Hinblick auf Aspergillus spezifische Antigene und ihre Immunantwort (Beck et al. 2006;
Bozza et al. 2009; Stuehler et al. 2011; Jolink et al. 2013; Bedke et al. 2014). Des
Weiteren wurden Protokolle entwickelt, um Aspergillus spezifische T-Zellen mit
kommerziell verfügbaren Materialen und unter GMP Bedingungen zu generieren, was für
die Durchführung klinischer Studien ein wichtiges Kriterium darstellt (Khanna et al. 2011;
Gaundar et al. 2012; Tramsen et al. 2013).
Der adoptive Transfer, mit TCR-modifizierten T-Zellen, hat gegenüber dem klassischen
(nicht genetisch modifizierten) adoptiven Transfer den Vorteil, dass TCRs auf
verschiedene T-Zell Sub-Populationen transferiert werden können, um so eine bestimmte
antigenspezifische Immunreaktion auszulösen. (Kalos et al. 2013; Koste et al. 2014). Der
TCR Transfer hat ebenfalls den Vorteil, dass der TCR den ursprünglichen Signalweg der
T-Zelle verwendet und so das Risiko eines cytokine release syndrome minimiert wird
(Wieczorek et al. 2013). Der erfolgreiche Transfer von genetisch modifizierten T-Zellen zur
Bekämpfung des malignen Melanom und Sarkom wurde bereits beschrieben (Morgan et
al. 2006; Robbins et al. 2011). Eine Adaption dieses Verfahrens könnte zur Bekämpfung
von
Aspergillus
Infektionen
oder
als
zusätzliche
Behandlungsmethode
zur
medikamentösen anti-fungalen Therapie eingesetzt werden. Mit dieser Arbeit wurde durch
88
Diskussion
die Identifizierung A. fumigatus spezifischer TCRs, die für einen Transfer geeignet sind,
der erste Schritt gemacht.
8.6
Fazit und Ausblick
In dieser Arbeit wurden A. fumigatus spezifische TCRs identifiziert, isoliert und in Vektoren
kloniert. Die A. fumigatus spezifischen TCRs wurden erfolgreich auf CD4+ T-Zellen
transferiert, was durch die Expressionsanalysen gezeigt wurde. Die funktionellen
Eigenschaften der TCR transduzierten Zellen wurden durch die IFN-γ Produktion nach
antigenspezifischer Stimulation bestätigt.
Für zukünftige Projekte wäre die Identifizierung weiterer TCRs von weiteren Spendern,
die Optimierung dieser TCRs und weitere Transduktionen auf unterschiedliche T-Zell SubPopulationen, mit Analyse des Zytokinprofils, denkbar.
Insbesondere für den klinischen Einsatz sollten folgende Ansätze zur Optimierung in
Erwägung gezogen werden. Bei der Optimierung durch Murinisierung ist die erhöhte
Expression mit den Risiken einer induzierten Immunogenität abzuwägen. Sommermeyer
et al. 2010 konnten zeigen, dass der Austausch von wenigen murinen Aminosäuren in der
konstanten Region des humanen TCR zu einer erhöhten Expression des TCR führt und
sich das Risiko einer Immunogentität, aufgrund der geringen Anzahl muriner
Aminosäuren,
nur geringfügig
erhöht. Optimierungsstrategien,
das
Vektorsystem
betreffend, könnten auch in Erwägung gezogen werden. Wie zum Beispiel lentivirale
Vektoren (Bobisse et al. 2007), die den Vorteil besitzen, das inaktivierte Zellen
transduziert werden können. Zu berücksichtigen ist, dass ein Einsatz lentiviraler Vektoren
im klinischen Maßstab noch nicht so etabliert ist, wie die retroviralen MLV-Vektoren (Doerr
et al. 2010, siehe www.clinicaltrails.gov). Ein nicht-virales Transposon basiertes
Vektorsystem (Sleeping Beauty transposon) wurde weiterentwickelt, wobei die geringe
Transduktionseffizienz, gegenüber retroviralen Vektorsystemen, besonders im Fokus steht
(Peng et al. 2009). Ebenfalls könnten modifizierte Verpackungsproteine eingesetzt
werden, die spezialisiert sind auf bestimmte Zellpopulationen, um die Effektivität von
Vektoren zu erhöhen (Funke et al. 2008).
Die Transduktion der optimierten TCRs auf verschiede T-Zell Sup-Populationen (z.B. TH1
und Treg) ermöglicht es, Einfluss auf ein breites Spektrum von Immunantworten, zu
nehmen und durch Analysen des Zytokinprofils näher zu untersuchen.
Die A. fumigatus spezifischen TCR transduzierten Zellen sollten weiteren funktionellen
Tests unterzogen werden, z.B. bezüglich der Fähigkeit eine protektive Immunantwort bei
der Stimulation mit Hyphen und Konidien zu induzieren. Der adaptive Transfer in ein
89
Diskussion
Mausmodell wäre auch eine Möglichkeit die Wirksamkeit, für einen zukünftigen Einsatz in
der humanen Therapie, weiterführend zu analysieren.
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106
Anhang
10 Anhang
10.1 Abkürzungen
Abkürzung
Erklärung
A. fumigatus
Aspergillus fumigatus
ABPA
allergische bronchopulmonale Aspergillose
AmpR
Ampicillin Resistenz
APC
Allophycocyanin
APS
Ammoniumpersulfat
bp
Basenpaare
BSA
Bovines Serum Albumin
CAR
Chimärischer Antigen Rezeptor
CBA
Cytometric Bead Array System
CD
cluster of differntiation
CDR
komplementaritätsbestimmende Region (complementarity determining
region)
CLR
C-Typ Lektin Rezeptor
CSF
koloniestimulierender Faktor
Cα bzw. Cβ
konstante α Kette bzw. konstante β Kette des TCR
D
vielfältige/diverse Segmente (Diversität) des TCR β Locus
DC
dendritische Zellen
DMSO
Dimethyl Sulfoxid
DNA
Desoxyribonukleinsäure
dNTPs
Desoxyribonukleosidtriphosphate
EDTA
Ethylendiamintetraacetat
ELISA
Enzyme Linked Immunosorbent Assay
ER
Endoplasmatisches Retikulum
FACS
fluorescence-activated cell sorting
FCS
fetales Rinderserum (fetal calf serum)
i
Anhang
Abkürzung
Erklärung
FCS
forward scatter
FITC
Fluoresceinisothiocyanate
FR
Gerüstregion (framework region)
GFP
grünes Fluoreszenzprotein (green fluorescent protein)
GM-CSF
Granulocyte macrophage colony-stimulating factor
GMP
Good manufacturing practice
GvHD
Graft versus host disease
Gy
das Gray (SI-Einheit)
HLA
humane Leukozytenantigen (human leukocyte antigen)
HSCT
hämatopoetische Stammzelltransplantation (Hematopoietic stem cell
transplantation)
IA
Invasive Aspergillose
IFN-γ
Interferon-γ
IL
Interleukin
ITAM
Immunrezeptor Tyrosinaktivierungssequenz (immunoreceptor tyrosin-based
activation motif)
J
junktionale Segmente des TCR Locus
LB
Nährmedium für Bakterien (lysogeny broth)
LTR
DNA Wiederholungseinheit (long terminal repeat)
MHC
Haupthistokompatibilitätskomplex (major histocompatility comlex)
MHC
Haupthistokompatibilitätskomplex (major histocompatibility complex)
NFAT
nuclear factor of activated T cells
NK
natürliche Killerzellen
P2A
2A Peptidlinker
PAMP
Pathogen-assoziierte molekulare Muster (pathogen-associated molecular
pattern)
PBMC
mononucleare Zellen des peripheren Blutes (peripheral blood mononucleated
cell)
PBS
phosphatgepufferte Salzlösung (phosphate buffered saline)
ii
Anhang
Abkürzung
Erklärung
PCR
Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction)
PE
Phycoerythrin
PGE2
Prostaglandin E2
PMN
polymorphkernige Leukozyten (polymorphonuclear leukocytes)
PRE
posttranskriptionales regulatorisches Element
PRR
Mustererkennungs- Rezeptor (pattern recognition receptor)
RAG
recombination-activation gene
RNA
Ribonukleinsäure
ROS
oxidative Sauerstoffspezies (reactive oxygen species)
RPMI 1640
Roswell Park Memorial Institute Medium
RSS
Rekombinationssignalsequenz
RT
reverse Transkriptase
scFv
Single chain variable Fragment
SEB
Superantigen (bakteriell)
SSC
side scatter
TAE
Tris- Acetat EDTA Puffer
TCR
T-Zell-Rezeptor (T cell receptor)
TGF
transforming growth factor
TH
T-Helferzellen
TLR
Toll-like Rezeptor
TNF
Tumor- Nekrose- Faktor
Tr1
regulatorische T-Zellen Typ 1
Treg
regulatorische T-Zellen
tRNA
Transfer Ribonukleinsäure
UV
Ultraviolet
V
variable Segmente des TCR Locus
Vβ bzw. Vα
variable β bzw. α Kette des TCR
iii
Anhang
10.2 Publikationen
2011
Stuehler, C., Khanna, N., Bozza, S., Zelante, T., Moretti, S.,
Kruhm, M., Lurati, S., Conrad, B., Worschech, E., Stevanovic,
S., Krappmann, S., Einsele, H., Latgé, J. P., Loeffler, J.,
Romani, L. and Topp, M. S. (2011). Cross-protective TH1
immunity against Aspergillus fumigatus and Candida albicans.
Blood. 117; 5881-5891
2014
Berges, C., Bedke, T., Stühler, C., Khanna, N., Zehnter, S.,
Kruhm, M., Winter, N., Chatterjee, M. M, Einsele, H., Topp, M.
S. (2014). Combined targeting of PI3K/Akt and HSP90
synergistically suppresses essential functions of alloreactive T
cells by multiple mechanisms. (Manuskript eingereicht zur
Publikation)
iv