Wechselwirkungen des Parasiten Trypanosoma cruzi mit zellulären
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Inhaltsverzeichnis I Inhaltsverzeichnis 1 Gesamteinleitung.............................................................................................................1 1.1 Trypanosoma cruzi und die Chagas-Krankheit ................................................................. 1 1.2 Das Immunsystem.......................................................................................................... 3 1.3 Wechselbeziehungen zwischen Trypanosoma cruzi und dem Immunsystem........................ 13 1.4 Gentechnisch veränderte immundefiziente Mäuse als Infektionsmodelle ............................ 17 1.5 Fragestellungen der Arbeit............................................................................................ 18 2 Material und Methoden.................................................................................................19 2.1 Parasiten, Labortiere und Zellinien............................................................................... 19 2.1.1 Parasiten............................................................................................................... 19 2.1.2 Labortiere.............................................................................................................. 19 2.1.3 LLCMK2 Zellinie .................................................................................................. 20 2.2 Infektion der Labortiere und der Zellinie LLCMK2 ....................................................... 20 2.2.1 Herstellung von Parasitenstabilaten............................................................................ 20 2.2.2 Infektionsversuche .................................................................................................. 21 2.2.3 Infektion der LLCMK2 Zellinie ................................................................................ 21 2.3 Bestimmung des Infektionsverlaufs ............................................................................... 21 2.4 Abtötung und Lyse von T. cruzi ................................................................................... 22 2.5 Aufbereitung von Serum und Zellsuspensionen für immunologische Untersuchungen....... 22 2.5.1 Blutentnahme zur Gewinnung von Serum ................................................................... 22 2.5.2 Herstellung von Milzzellsuspensionen........................................................................ 23 2.6 Immunologische Analysen ............................................................................................ 23 2.6.1 NO-Bestimmung .................................................................................................... 23 2.6.2 Durchflußcytometrische Analyse von Zellen (FACS-Analyse)......................................... 24 2.7 Statistische Auswertungen ............................................................................................ 24 3 Die Bedeutung von IL-12 für die Produktion von IFN-γγ in der Abwehr einer Trypanosoma cruzi Infektion.........................................................................................25 3.1 Einleitung................................................................................................................... 25 3.2 Material und Methoden................................................................................................ 27 3.2.1 Labortiere und Zellinien........................................................................................... 27 3.2.2 Generierung der doppeltdefizienten Mauslinie IL-12p35×RAG2-/- .................................... 27 3.2.3 Infektion der Mäuse ................................................................................................ 29 3.2.4 Gewinnung von Serum, RNA, Zellsuspensionen und deren Überständen........................... 29 3.2.4.1 RNA Präparation................................................................................................ 29 3.2.4.2 Gewinnung von Zellen und Zellsuspensionen.......................................................... 30 3.2.5 Bestimmung des Parasitämieverlaufs und der Überlebensrate .......................................... 32 3.2.6 Immunologische Analysen ....................................................................................... 32 3.2.6.1 Kinetische Untersuchung der Zellveränderungen in der Milz mittels FACS-Analyse ....... 32 3.2.6.2 In vitro Stimulierungen von Milzzellen.................................................................. 32 3.2.6.3 Bestimmung von TNF-α auf RNA-Ebene mittels Northern blotting............................ 33 3.2.6.4 Bestimmung der Cytokinexpression auf RNA-Ebene mittels RNase-Protection assay...... 35 3.2.6.5 Bestimmung von IFN-γ auf Proteinebene mittels ELISA .......................................... 37 Inhaltsverzeichnis II 3.2.6.6 3.2.6.7 Bestimmung von TNF-α auf Proteinebene mittels Bioassay ...................................... 38 Bestimmung von NO im Serum und in Zellüberständen............................................ 39 3.3 Ergebnisse................................................................................................................... 40 3.3.1 Parasitämie und Überlebensrate von IL-12p35-defizienten Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen bei verschiedenen Infektionsdosen ...................................................... 40 3.3.2 Rekrutierung von Lymphocyten in die Milz von Wildtyp- und IL-12p35-defizienten Mäusen während der akuten Phase der Infektion mit T. cruzi.......................................... 41 3.3.3 Produktion von Cytokinen und Effektorsubstanzen in Wildtyp- und IL-12p35-defizienten Mäusen während der Infektion mit T. cruzi ................................................................. 42 3.3.3.1 Veränderung der Cytokinexpression in der Milz von Wildtyp- und IL-12p35-defizienten Mäusen während der Infektion mit T. cruzi............................................................. 42 3.3.3.2 Konzentration von IFN-γ, TNF-α und NO im Serum infizierter Tiere.......................... 44 3.3.4 IFN-γ Produktion restimulierter Milzzellen ................................................................. 46 3.3.5 Bestimmung der zellulären Quelle des IFN-γ in Wildtyp- und IL-12p35-defizienten Mäusen nach der Infektion mit T. cruzi ...................................................................... 47 3.3.6 Antigenspezifische Stimulierung von CD4+ Splenocyten durch infizierte PeritonealMakrophagen......................................................................................................... 48 3.3.7 Vergleich der Parasitämie, Überlebensrate und IFN-γ-Produktion von IL-12p35defizienten mit IL-12p35 × RAG-doppeltdefizienten und Wildtyp-Mäusen........................ 49 3.3.8 Induktion der mRNA-Expression von IFN-γ und IL-18 in der Milz von Wildtyp- und IL-12p35-defizienten Mäusen nach einer Infektion mit T. cruzi ....................................... 51 3.3.9 Stimulierbarkeit der IFN-γ-Produktion von Splenocyten aus IL-12p35-defizienten Mäusen mit IL-18.............................................................................................................. 52 3.3.10 Auswirkung der Behandlung von T. cruzi infizierten IL-12p35-defizienten Mäusen mit IL-18 neutralisierenden Antikörpern ........................................................................... 53 3.4 Diskussion.................................................................................................................. 55 3.5 Zusammenfassung ....................................................................................................... 61 4 Die Rolle von cytotoxischen Zellen in der Abwehr von Trypanosoma cruzi.............62 4.1 Einleitung................................................................................................................... 62 4.2 Material und Methoden................................................................................................ 64 4.2.1 Herkunft der Mäuse................................................................................................. 64 4.2.2 Infektion der Mäuse ................................................................................................ 64 4.2.3 Bestimmung des Infektionsverlaufs und der Überlebensrate ............................................ 64 4.2.4 Histologische Analysen ........................................................................................... 64 4.2.5 Immunologische Analysen ....................................................................................... 64 4.3 Ergebnisse .................................................................................................................. 65 4.3.1 Die Parasitämie und Überlebensrate von Perforin-, Granzym A × B-, Perforin × Granzym A × B- und Fas-defizienten Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen bei einer Infektion mit T. cruzi........................................................................................................... 65 4.3.2 Histopathologische Auswirkungen der Infektion von Perforin-, Granzym A × B-, Perforin × Granzym A × B- und Fas-defizienten Mäusen im Vergleich zu WildtypMäusen mit T. cruzi 21 Tage nach Infektion................................................................ 68 4.3.3 Analyse der T. cruzi-induzierten NO-Produktion in Perforin-, Granzym A × B-, Perforin × Granzym A × B- und Fas defizienten und Wildtyp-Mäusen 21 Tage nach Infektion............................................................................................................... 72 4.4 Diskussion.................................................................................................................. 73 4.5 Zusammenfassung ....................................................................................................... 77 5 Beeinflußung der B-Zellen in Milz und Knochenmark während der akuten Phase einer Trypanosoma cruzi Infektion...................................................................78 5.1 Einleitung................................................................................................................... 78 Inhaltsverzeichnis III 5.2 Material und Methoden................................................................................................ 80 5.2.1 Herkunft der Mäuse................................................................................................. 80 5.2.2 Infektion der Mäuse ................................................................................................ 80 5.2.3 Gewinnung von Serum und Zellsuspensionen.............................................................. 80 5.2.4 Immunologische Untersuchungen .............................................................................. 81 5.2.4.1 Untersuchung der Zellen in Milz und Knochenmark per FACS-Analyse ....................... 81 5.2.4.2 Stimulierung von Stromazellen aus dem Knochenmark in vitro .................................. 82 5.2.4.3 Bestimmung der Aktivierung von Stromazellen durch Stimulanzien in vitro ................. 83 5.2.4.4 Inkubation von naiven B-Zellvorläufern mit Stromazellen.......................................... 83 5.2.4.5 NO-Bestimmung aus dem Überstand stimulierter Stromazellen................................... 83 5.3 Ergebnisse .................................................................................................................. 84 5.3.1 Entwicklung der Anzahl von reifen B-Zellen in der Milz von T. cruzi infizierten Mäusen .... 84 5.3.1.1 Apoptose der B-Zellen in der Milz während der Infektion mit T. cruzi ......................... 85 5.3.1.2 Untersuchung verschiedener defizienter Mausstämme ................................................ 87 5.3.2 Entwicklung der Anzahl von transitionellen B-Zellen in der Milz von T. cruzi infizierten Mäusen................................................................................................................. 87 5.3.3 Entwicklung der Anzahl von transitionellen B-Zellen und ihren Vorläuferzellen im Verlauf der Infektion mit T. cruzi .............................................................................. 88 5.3.4 Untersuchung verschiedener defizienter Mausstämme..................................................... 90 5.3.5 Die Entwicklung des Knochenmark-Stromas T. cruzi-infizierter Mäuse............................. 91 5.3.6 In vitro Untersuchungen zur Bestimmung des für die Stroma-Depletion verantwortlichen Faktors................................................................................................................. 93 5.3.7 Weiterführende Untersuchungen................................................................................. 98 5.3.7.1 Untersuchungen der Stromazellen von RAG2- und µMT-defizienten Mauslinien............ 98 5.3.7.2 Untersuchungen zur Arginin-Supplementation in vivo ..............................................100 5.3.7.3 Weiterführende Untersuchungen zur Natur des stromadepletierenden Faktors im Serum T. cruzi infizierter Mäuse ...................................................................................100 5.4 Diskussion.................................................................................................................101 5.5 Zusammenfassung ......................................................................................................106 6 Gesamtdiskussion.........................................................................................................107 7 Gesamtzusammenfassung...........................................................................................112 8 Abkürzungsverzeichnis ...............................................................................................113 9 Literatur.........................................................................................................................117 10 Tabellarischer Lebenslauf...........................................................................................142 11 Veröffentlichungen ......................................................................................................143 11.1 Abstracts....................................................................................................................143 11.2 Publikationen ............................................................................................................143 12 Danksagungen ..............................................................................................................144
