Untersuchungen zu lokalen Immunreaktionen nach Impfung gegen
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Tierärztliche Hochschule Hannover Untersuchungen zu lokalen Immunreaktionen nach Impfung gegen das Newcastle Disease Virus mit einem rekombinanten Putenherpesvirus und einer herkömmlichen Lebendvakzine INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae ( Dr. med. vet. ) vorgelegt von Jens-Christian Cors aus Bonn Hannover 2013 Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Silke Rautenschlein, PhD Klinik für Geflügel der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover 1.Gutachter: Prof. Dr. Silke Rautenschlein, PhD 2.Gutachter: Apl.-Prof. Dr. med. vet. Ludwig Haas Tag der mündlichen Prüfung: 05.11.2013 Meiner Familie V Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis ....................................................................................................... V Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................ VIII Abbildungsverzeichnis .............................................................................................. XII Tabellenverzeichnis ................................................................................................. XIV Veröffentlichungen .................................................................................................... XV 1 Einleitung ............................................................................................................. 1 2 Literaturübersicht ................................................................................................. 3 2.1 Newcastle Disease .......................................................................................... 3 2.1.1 Einleitung ................................................................................................ 3 2.1.2 Definition ................................................................................................. 3 2.1.3 Historische Entwicklung .......................................................................... 3 2.1.4 Ätiologie/Taxonomie ............................................................................... 5 2.1.5 Morphologie und Genomaufbau.............................................................. 6 2.1.6 Replikation .............................................................................................. 7 2.1.7 Virulenz im Wirt ....................................................................................... 8 2.1.8 Molekularbiologische Grundlagen der Virulenz ....................................... 8 2.1.9 Epidemiologie ....................................................................................... 10 2.1.10 Klinisches Bild ....................................................................................... 12 2.1.11 Pathologie ............................................................................................. 13 2.1.12 Histologie .............................................................................................. 14 2.1.13 Diagnose ............................................................................................... 15 2.1.14 Vorbeuge- und Kontrollmaßnahmen ..................................................... 16 2.2 Impfung gegen die Newcastle Disease .......................................................... 17 2.2.1 Einleitung .............................................................................................. 17 2.2.2 Lebendimpfstoffe .................................................................................. 18 2.2.3 Inaktivatvakzinen .................................................................................. 19 2.2.4 Zukunftsentwicklungen ......................................................................... 20 2.2.5 Impfstrategien ....................................................................................... 20 VI 2.2.6 Einschätzen des Impferfolgs ................................................................. 22 2.2.7 Rekombinante Impfstoffe ...................................................................... 23 2.3 Immunität gegen die Newcastle Disease ....................................................... 26 2.3.1 Angeborene Immunmechanismen ........................................................ 26 2.3.2 Zellvermittelte Immunität ....................................................................... 27 2.3.3 Humorale Immunität.............................................................................. 27 2.3.4 Maternal vermittelte Immunität .............................................................. 28 2.3.5 Lokale Immunität................................................................................... 28 3 Fragestellung der eigenen Untersuchung .......................................................... 33 4 Material und Methoden ...................................................................................... 35 4.1 Tiere............................................................................................................... 35 4.2 Impfstoffe ....................................................................................................... 35 4.2.1 Titration des Impfvirus ........................................................................... 36 4.3 Versuchsaufbau ............................................................................................. 38 4.4 Untersuchungsmethoden ............................................................................... 42 4.4.1 Serologische Untersuchungen .............................................................. 42 4.4.2 Klinischer Score .................................................................................... 43 4.4.3 Histologische Untersuchungen ............................................................. 43 4.4.4 Immunhistochemische Untersuchungen ............................................... 44 4.4.5 Virus-RNA Isolierung ............................................................................ 47 4.4.6 Nachweis von APMV-1 mittels qRT-PCR (quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) ........................................... 47 4.4.7 PCR (Polymerase Chain Reaction) des Impfvirus ................................ 49 4.4.8 Zellzählung............................................................................................ 50 4.4.9 Durchflusszytometrie ............................................................................ 50 4.5 Statistische Analyse ....................................................................................... 51 5 Ergebnisse ......................................................................................................... 53 5.1 Titration des Impfvirus.................................................................................... 53 5.2 Nachweis des rHVT-ND nach Impfung durch Anzucht in vitro (Exp. 1) oder mittels Polymerase Kettenreaktion (Exp. 2) ................................................... 53 VII 5.3 Immunhistochemische Untersuchungen von Immunzellpopulationen ........... 54 5.4 Immunzellpopulationen 5 Tage nach der Impfung bei Broilern ...................... 55 5.5 Immunzellpopulationen 10 Tage nach der Impfung bei SPF- Hühnern und Broilern........................................................................................................... 61 5.6 Virusdetektion von Tracheal- und Kloakaltupfern durch qRT-PCR ................ 72 5.6.1 Virusanzucht im embryonierten Hühnerei ............................................. 73 5.7 Serologische Untersuchungen - humorale Immunantwort ............................. 76 5.8 Durchflusszytometrische Untersuchungen..................................................... 82 6 Diskussion.......................................................................................................... 86 6.1 Zielsetzung der Studie ................................................................................... 86 6.2 Klinisches Bild nach Impfung mit rHVT-ND und ND-Lebendimpfstoff sowie nach APMV-1 Stamm LaSota Belastungsinfektion ........................................ 87 6.3 Pathologische und histopathologische Läsionen nach ND-Impfung .............. 88 6.4 Einfluss von rHVT-ND und dem ND-Lebendimpfstoff auf Immunparameter .. 89 6.4.1 Systemische Immunparameter ............................................................. 89 6.4.2 Lokale Immunität................................................................................... 93 6.5 Virusausscheidung....................................................................................... 100 6.6 Vergleich von SPF-Hühnern und Broilern .................................................... 102 6.7 Weiterführende Untersuchungen ................................................................. 103 6.8 Fazit ............................................................................................................. 104 7 Zusammenfassung........................................................................................... 105 8 Summary.......................................................................................................... 107 9 Literaturverzeichnis .......................................................................................... 109 10 Anhang ........................................................................................................ 133 10.1 SPF-Liste................................................................................................... 133 10.2 Lösungen, Puffer, Medien ......................................................................... 134 11 Danksagung................................................................................................. 138 VIII Abkürzungsverzeichnis °C Grad Celsius µg Mikrogramm µl Mikroliter µm Mikrometer Abb. Abbildung ABC Avidin-Biotin-Complex AGG Agglutinations-Test AGP Agar-Gel-Präzipitationstest AOV Analysis of variance APMV-1 Aviäres Paramyxovirus Serotyp 1 BALT Bronchus-associated lymphoid tissue bp Base pairs BU Bakteriologische Untersuchung CALT Conjunctiva-associated lymphoid tissue Cat.No. Catalogue number CMI Cell-mediated immunity CpG Cytosinphosphat Guanin-Oligonukleotide Ct Cycle threshold DAB Diaminobenzidin DNA Desoxyribonukleinsäure E Glutaminsäure EID Egg infectious dose ELD Egg lethal dose ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay EWG Europäische Wirtschaftsgemeinschaft F Phenylalanin FACS Fluorescence activated cell sorting FAM Carboxyfluorescein Fluoreszenzfarbstoff FAT Fluoreszenz Antikörper Test FCS Bovines Kälberserum (fetal calf serum ) F-Protein Fusionsprotein G Glyzin IX GALT Gut-associated lymphoid tissue H&E Hämatoxylin-Eosin H+L Heavy and light chains H2O2 Wasserstoffperoxid HAH-Test Hämagglutinationshemmungstest HALT Head-associated lymphoid tissue HA-Test Hämagglutinationstest HAU hämagglutinierende Einheit HN Hämagglutinin-Neuraminidase Protein HRP Horseradish Peroxidase HVT Herpesvirus of turkeys ICPI Intrazerebraler Pathogenitätsindex IgA Immunglobulin A IgG Immunglobulin G IgM Immunglobulin M IgY Immunglobulin Y K Lysin Kbp Kilobase pairs KCl Kaliumchlorid KH2PO4 Kaliumdihydrogenphosphat KU klinische Untersuchung L Leucin L RNA-Polymerase LSD-Test Fishers Least Significant Difference-Test M Matrixprotein MALT Mucosa-associated lymphoid tissue MCA Monoklonaler Antikörper min Minuten ml Milliliter mRNA Messenger ribonucleic acid N Negative Na2HPO4 Dinatriumhydrogenphosphat NaCl Natriumchlorid ND Newcastle Disease X NDV Newcastle Disease Virus NK-Zelle Natürliche Killerzelle nm Nanometer NOD Nucleotide-Binding Oligomerization Domain Pattern NP Nukleoprotein NPPT Neomycin, Polymyxin, Pimafucin, Tylosin NT Nicht getestet OD Optische Dichte OIE Weltorganisation für Tiergesundheit P Phosphoprotein P Positivkontrolle (IDEXX®) P Probe (BioCheck®) PAMP Pathogen-Associated Molecular Pattern PBL periphere Blut-Leukozyten PBS phosphatgepufferte Salzlösung PCR Polymerase Chain Reaction PFU Plaque Forming Unit pH negativ dekadischer Logarithmus der Konzentration von Protonen (H+) PK Positivkontrolle (BioCheck®) PM Post mortem PMV-1 Paramyxovirus Serotyp 1 PPMV-1 Pigeon Paramyxovirus Serotyp 1 PRR Pattern Recognition Receptor pv Post vaccination p-Wert Überschreitungswahrscheinlichkeit Q Glutamin R Arginin rHVT-ND Rekombinantes Putenherpesvirus mit Fusionsprotein RNA Ribonucleic acid RNP-Komplex Ribonukleoproteinkomplex rpm Rounds per minute rRT-PCR Real-Time-Reverse Transkriptase-PolymeraseKettenreaktion XI RT-PCR Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion S Probe (IDEXX®) SPF Spezifisch-pathogen frei TLR Toll-Like Receptor TMB Tetramethylbenzidin tni Tage nach Impfung V Valin v/v Volume/volume VNT Virus-Neutralisationstest VVND Viszerotrope Disease w/v Weight/volume velogene Form der Newcastle XII Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Versuchsdurchführung des ersten Versuchs ....................................... 40 Abbildung 2: Versuchsdurchführung des zweiten Versuchs ..................................... 41 Abbildung 3 a,b (A-H): Immunhistochemische Detektion von CD4+ Zellen (A-D) und CD8+ Zellen (E-H) in verschiedenen Organen (Hardersche Drüse, CALT, Lunge, Zäkaltonsille) von kommerziellen Broilern am 5. Tag nach ND-Impfung. ................. 56 Abbildung 4 (A-D): Immunhistochemische Detektion von CD4+ Zellen bei 200-facher Vergrößerung in Harderschen Drüsen von Broilern am fünften Tag nach ND-Impfung. ................................................................................................................................. 57 Abbildung 5 a, b (A-H): Immunhistochemische Detektion von Bu-1+ Zellen (A-D) und KUL01+ Zellen (E-H) in verschiedenen Organen (Hardersche Drüse, CALT, Lunge, Zäkaltonsille) von kommerziellen Broilern am 5. Tag nach ND-Impfung. ................. 59 Abbildung 6 (A-D): Immunhistochemische Detektion von IgA+ Zellen (A-D) in verschiedenen Organen (Hardersche Drüse, CALT, Lunge, Zäkaltonsille) von kommerziellen Broilern am fünften Tag nach ND-Impfung. ...................................... 60 Abbildung 7 (A-J): Immunhistochemische Detektion von verschiedene Immunzelltypen in Harderschen Drüsen von SPF-Hühnern (A, C, E, G, I) und Broilern (B, D, F, H, J) am 10. Tag nach ND-Impfung. ............................................. 63 Abbildung 8 (A-D): Immunhistochemische Detektion von CD4+ Zellen bei 200-facher Vergrößerung in Harderschen Drüsen von SPF-Hühnern am 10. Tag nach NDImpfung..................................................................................................................... 64 Abbildung 9 (A-J): Immunhistochemische Detektion von verschiedenen Immunzelltypen in Lungen in Nähe eines Parabronchus unter einem lateroventralen sekundären Bronchus von SPF-Hühnern (A, C, E, G, I) und Broilern (B, D, F, H, J) am 10. Tag nach ND-Impfung. ................................................................................. 66 Abbildung 10 (A-D): Immunhistochemische Detektion von CD4+ Zellen bei 200facher Vergrößerung eines Parabronchus ventral eines lateroventralen sekundären Bronchus in Lungen von SPF-Hühnern am 10. Tag nach ND-Impfung. ................... 67 XIII Abbildung 11 (A-E): Immunhistochemische Detektion von verschiedenen Immunzelltypen im Konjunktiva-assoziierten lymphatischem Gewebe (CALT) von Broilern am 10. Tag nach ND-Impfung. .................................................................... 68 Abbildung 12 (A-J): Immunhistochemische Detektion von verschiedenen Immunzelltypen in Zäkaltonsillen von SPF-Hühnern (A, C, E, G, I) und Broilern (B, D, F, H, J) am 10. Tag nach ND-Impfung. ..................................................................... 71 Abbildung 13 (A-C): Serum-NDV-Antikörpertiter im BioCheck®-ELISA (A), IDEXX®ELISA (B) und HAH-Test (C) aus Seren von SPF-Hühnern nach ND Impfung, null und sieben Tage nach Belastungsinfektion (35 und 42 Tage nach ND Impfung). .... 78 Abbildung 14 (A-C): Serum-NDV-Antikörpertiter im BioCheck®-ELISA (A), IDEXX®ELISA (B) und HAH-Test (C) aus Seren von Broilern nach ND Impfung, null und sieben Tage und 10 Tage nach Belastungsinfektion (=Challenge). ......................... 80 Abbildung 15: IDEXX®-ELISA IgG-NDV Antikörper aus Tränenflüssigkeiten von kommerziellen Broilern am 35. Tag nach ND-Impfung. ............................................ 81 Abbildung 16 (A-R): Detektion von verschiedenen Milz- (linke Spalte) und peripheren Blutleukozyten (rechte Spalte) von Broilern mittels Durchflusszytometrie zu verschiedenen Zeitpunkten nach der ND-Impfung. .................................................. 84 Abbildung 17: Übersicht über signifikant erhöhte Immunzellparameter von SPFHühnern am zehnten Tag nach ND-Impfung (p<0,05; Kruskal–Wallis One-way AOV mit anschließendem paarweisem Vergleich) ............................................................ 98 Abbildung 18: Übersicht über signifikant erhöhte Immunzellparameter von Broilern am fünften Tag nach ND-Impfung (p<0,05; Kruskal–Wallis One-way AOV mit anschließendem paarweisem Vergleich) .................................................................. 98 XIV Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Aminosäuresequenzen an der Spaltstelle des F0-Proteins verschiedener NDV-Stämme ............................................................................................................. 9 Tabelle 2 : Virusstämme als Lebendimpfstoffe gegen die Newcastle Disease ......... 19 Tabelle 3: Antikörper zur immunhistochemischen Detektion von verschiedenen Immunzellpopulationen ............................................................................................. 46 Tabelle 4: Virusausscheidung über die Trachea nach Belastungsinfektion mit dem APMV-1 Stamm LaSota am 35. Tag nach Impfung. ................................................. 74 Tabelle 5: Virusausscheidung über die Kloake nach Belastungsinfektion mit dem APMV-1 Stamm LaSota am 35. Tag nach Impfung .................................................. 75 XV Veröffentlichungen Tagungsvorträge Esser, K.-H., Cors, J.-C., Meyer-Kühling, B., Gruber, A., Günther, R., Rautenschlein, S. (2013) Elektroenzephalographische Untersuchungen zur Betäubung beim Geflügel. 84. Geflügelfachgespräch, Hannover, Mai 2013 Cors, J.-C., Koopman, R., Malo, A., Rautenschlein, S. (2013) Induktion lokaler Immunität bei Hühnern nach Impfung mit einer rHVT-ND Vakzine. 84. Geflügelfachgespräch, Hannover, Mai 2013 Rautenschlein, S., Cors, J.-C., Koopman, R., Malo, A. (2013) Induction of Local Respiratory Immunity following Vaccination of Chickens with an HVT-NDVRecombinant. The American Association Of Avian Pathologists Symposium and Scientific Program, Chicago, Juli 2013 Poster-Präsentation Cors, J.-C., Koopman, R., Malo, A., Rautenschlein, S. (2013) A recombinant Herpesvirus-vectored Newcastle Disease vaccine induces local immune reaction and protection in chickens. 23rd Annual Meeting of the Society for Virology, Kiel, März 2013 XVI 1 1 Einleitung Die Newcastle-Krankheit (ND) oder atypische Geflügelpest ist weltweit verbreitet und führt jährlich zu erheblichen wirtschaftlichen Verlusten (ALEXANDER u. SENNE 2008). Bei Huhn und Pute kann die Erkrankung in Abhängigkeit von der Virulenz des aviären Paramyxovirus Serotyp 1 (APMV-1)-Stammes vom plötzlichen perakuten Tod bis zur subklinischen Erkrankung variieren. Es werden apathogene, lentogene, mesogene und velogene Stämme in Abhängigkeit von ihren krankmachenden Eigenschaften unterschieden. Die Newcastle-Krankheit liegt nach GeflügelpestVerordnung und Richtlinie 92/66/EWG (Gemeinschaftsmaßnahmen zur Bekämpfung der Newcastle-Krankheit) nur dann vor, wenn die Erkrankung durch einen definierten Pathotypen, also ein APMV-1 Isolat mit einem intrazerebralen Pathogenitätsindex von mindestens 0,7 verursacht wurde, also eines mesogenen oder velogenen Virusstammes. Die sich derzeit in Deutschland im Einsatz befindlichen Impfstoffe gegen die Newcastle-Krankheit basieren meistens auf einem entweder inaktivierten (Totimpfstoff) oder abgeschwächten lentogenen Virusstamm (Lebendimpfstoff), welcher eine protektive Immunität hervorruft, ohne aber in klinisch gesunden Herden respiratorische oder systemische Symptome zu erzeugen. Die jedoch in Europa und weltweit immer wieder auftretenden Ausbrüche der ND mit erheblichen Verlusten zeigen, dass die Erkrankung mit diesen Impfprogrammen nicht ausreichend kontrolliert werden kann (DORTMANS et al. 2012). Impfdurchbrüche und eine Ausbreitung des Feldvirus unter der Impfdecke werden immer wieder beobachtet. Möglicherweise ist dies bedingt durch fehlerhafte Impfstoffapplikation, unzureichende Induktion lokaler Immunität an den Eintrittspforten des Newcastle Disease Virus (NDV) und mangelnde Kreuzimmunität zwischen Feld- und Impfviren. Rekombinante Impfstoffe auf der Basis des Putenherpesvirus (HVT), welches dann entsprechend Proteine des NDV exprimiert, stellen eine interessante Alternative zu den herkömmlichen avirulenten oder lentogenen NDV-Impfstämmen dar (PALYA et al. 2012). Diese können bereits in-ovo oder direkt nach dem Schlupf verabreicht werden. Außerdem kommt es zu keiner Interferenz mit maternalen Antikörpern, 2 wodurch die Tiere somit früh in ihrer Entwicklung die Möglichkeit haben, nach Impfung eine protektive Immunität auszubilden (MORGAN et al. 1993). Inwieweit ein rekombinanter HVT-ND-Impfstoff auch lokale Immunmechanismen im Bereich des oberen Respirationstraktes, der Haupteintrittspforte von NDV, und im Bereich des Gastrointestinaltraktes stimuliert, ist nicht bekannt. Ziel dieser Studie war es, einen rekombinanten HVT-ND-Impfstoff (rHVT-ND) mit einer herkömmlichen NDV-Lebendvakzine zu vergleichen sowie eine gleichzeitige Verabreichung beider Impfstoffe auf ihre Protektion gegen eine Belastungsinfektion zu testen. Insbesondere sollte die Induktion lokaler Immunmechanismen im oberen Respirationstrakt sowie die Kontrolle der Ausscheidung von Belastungsvirus näher untersucht werden. Diese Untersuchungen werden zum Verständnis der Wirksamkeit und Protektionsmechanismen nach Vakzination mit unterschiedlichen NDV- Impfstoffen sowie auch der Rolle der lokalen Immunität in der Protektion gegen die atypische Geflügelpest beitragen, was nachhaltig zur Verbesserung aktueller Bekämpfungsmaßnahmen dieser Krankheit führen kann. 3 2 Literaturübersicht 2.1 Newcastle Disease 2.1.1 Einleitung Die Newcastle-Krankheit (ND) oder auch atypische Geflügelpest ist eine hoch ansteckende Krankheit des Geflügels, hervorgerufen durch das aviäre Paramyxovirus Serotyp 1 (APMV-1). Die Übertragung erfolgt von Tier zu Tier über Inhalation und Ingestion von vermehrungsfähigen Viruspartikeln oder auch über Vektoren (ALEXANDER 2003). Die Krankheit variiert in ihrem klinischen Bild von milden subklinischen Verläufen bis hin zu hohen Mortalitätsraten. 2.1.2 Definition Die Newcastle Disease ist eine Infektion mit einem aviären Paramyxovirus des Serotyps 1 (APMV-1), welches entweder einen intrazerebralen Pathogenitätsindex von mindestens 0,7 in Eintagsküken (Gallus gallus) aufweist und/oder mehrere basische Aminosäuren im Virus am C-Terminus des F2-Proteins und Phenylalanin am Rest 117, dem N-Terminus des F1-Proteins, besitzt. Der Begriff „mehrere basische Aminosäuren“ umfasst mindestens drei Arginin- oder Lysinreste zwischen Rest 113 und 116 (OIE 2008). 2.1.3 Historische Entwicklung ND wurde erstmalig 1926 in Newcastle upon Tyne und auf der Insel Java (heutiges Indonesien) beschrieben, obwohl schon vorherige Ausbrüche möglich gewesen sein könnten (MACPHERSON 1956; ALEXANDER 2001). 4 Der seit 1926 auftretende hochpathogene Verlauf der Viruserkrankung legt nahe, dass seitdem grundlegende Veränderungen auf Virus- oder Wirtsebene aufgetreten sind. Nach Hanson (HANSON 1972) gibt es drei Theorien zu dem plötzlichen Auftreten der Krankheit. Die erste Theorie besagt, dass virulente Virenstämme schon immer endemisch in der Geflügelpopulation waren und erst seit Beginn der kommerziellen Geflügelhaltung auffällig wurden. In der zweiten Theorie geht man davon aus, dass das Virus in anderen Spezies endemisch war, wo es nur einen leichteren Krankheitsverlauf auslöste und dann auf das Nutzgeflügel überging. Diese Theorie wurde durch die Beobachtungen in der zweiten Panzootie von 1970-1973 bestätigt, als die Krankheit durch Import von Hauspsittaziden weltweit verbreitet wurde, ohne aber bei diesen eine schwerwiegende Erkrankungen zu verursachen. In der dritten Theorie geht man davon aus, dass das Virus durch Mutation hochpathogene Eigenschaften erlangte. Die dritte Theorie könnte durch große Ähnlichkeiten der NDV-Variante, welche bei Ausbrüchen der atypischen Geflügelpest in Irland um 1990 isoliert wurde, mit niedrig pathogenen Varianten, welche in Irland in 1987 isoliert wurden, begründet werden (MCNULTY et al. 1988). Diese beiden sehr ähnlichen Varianten unterschieden sich antigenetisch und genetisch von allen anderen Newcastle Disease Viren (ALEXANDER u. SENNE 2008). Der eigentlich nur als vorläufig gedachte Name Newcastle Disease wurde von Doyle gewählt und blieb bis heute erhalten (DOYLE 1935). Seit 1926 sind vier panzootische Verläufe der ND bekannt. Beim ersten Verlauf geht man davon aus, dass sich die Krankheit von 1926 bis 1960 sehr schnell in Asien und dann langsamer im Rest der Welt ausbreitete (ALEXANDER et al. 2012). Die zweite Panzootie verlief deutlich schneller, breitete sich vom mittleren Osten aus und erreichte ab den späten 1960er Jahren alle Länder bis 1973. Dieser weitaus schnellere Verlauf wurde durch einen intensiveren internationalen Handel der Geflügelindustrie ermöglicht. Außerdem wurde die Virusverbreitung durch den rasch ansteigenden Import von Hauspsittaziden zu dieser Zeit beschleunigt, bei dem das Virus durch diese Tiere aus endemischen Ländern in ND-freie Länder verschleppt wurde. Der Einfluss dieser zweiten Panzootie auf die Geflügelwirtschaft führte zur Entwicklung von Impfstoffen 5 und Impfplänen, die bei der Geflügelhaltung unerlässlich wurden. In den späten 1970er Jahren kam es zur dritten Panzootie, vermutlich hervorgerufen durch den universellen Einsatz von Impfstoffen, welche zwar die Geflügelbestände schützten, aber auch eine Adaption und Replikation der Virusstämme förderten, was in weiteren Ausbrüchen der Krankheit resultierte (ALEXANDER et al. 2012). Die vierte Panzootie ereignete sich hauptsächlich in der Brief- und Haustaubenpopulation in den Jahren 1982 und 1983 und wurde durch eine antigenetische Variante des AMPV-1 hervorgerufen. Hierbei handelte es sich um das Paramyxovirus Type 1 der Tauben (PPMV-1), welches sich nach Untersuchungen mit monoklonalen Antikörpern als antigenetisch unterschiedlich zu anderen AMPV-1 Varianten erwies (ALDOUS et al. 2004). Die Krankheit äußerte sich hauptsächlich in zentralnervösen Erscheinungen und wässrig-grünlichem Durchfall. In den späten 1970er Jahren traten solche Fälle gehäuft im mittleren Osten auf und verbreiteten sich von dort aus durch Wettflüge in der restlichen Welt. Das hierbei involvierte Virus fand seinen Weg auch über durch Tauben kontaminiertes Futter 1984 in Hühnerbetriebe, was zu 20 Ausbrüchen führte (ALEXANDER et al. 1985). Bis heute wurde das Newcastle Disease Virus auf der ganzen Welt isoliert. Endemische ND ist heutzutage trotz aller Impfprogramme ein limitierender Faktor in der weltweit wachsenden Geflügelproduktion (ALEXANDER 2011), nicht nur durch verheerende Verluste, sondern auch durch die dadurch resultierenden Handelsrestriktionen und Embargos der betroffenen Länder. Im Jahre 1995 wurde in Deutschland eine Impfpflicht gegen die Newcastle Disease für Hühner- und Putenbestände eingeführt (GEFLÜGELPEST-VERORDNUNG 2007). 2.1.4 Ätiologie/Taxonomie Das Newcastle Disease Virus gehört in die Ordnung der Mononegavirales, die Familie der Paramyxoviridae mit der Unterfamilie Paramyxovirinae und dem Genus Avulavirus an. Es gibt 11 Serotypen des Aviären Paramyxovirus (APMV-1), wobei nur Stämme des ersten Serotyps die Newcastle Disease auslösen können (BRIAND et al. 2012). Zur Klassifizierung der Newcastle Disease Viren, welche eine hohe 6 genetische und antigenetische Diversität aufweisen, sind zwei unterschiedliche Systeme beschrieben (MILLER et al. 2010). Hierbei wurde eine Vielzahl von NDV-Isolaten nach phylogenetischer Analyse der Nukleotidsequenz des F-Gens in Linien oder Genotypen eingeteilt. Das erste System nach Aldous et al. teilt NDV in sechs Hauptlinien und dreizehn Unterlinien ein (ALDOUS et al. 2003). Später wurde eine siebte Hauptlinie und sieben Unterlinien hinzugefügt (DIEL et al. 2012a). Das zweite Klassifizierungssystem nach BallargiPordany et al. teilt NDV in zwei Klassen von Genotypen ein, wobei die erste in neun und die zweite in elf Genotypen unterteilt wird (BALLAGI-PORDANY et al. 1996). Die Genotypen I, II, VI und VII wurden weiter eingeteilt in Sub-Genotypen Ia und Ib, II und IIa, VIa bis VIf und VIIa bis VIIh (DIEL et al. 2012a). 2.1.5 Morphologie und Genomaufbau Paramyxoviren aus der Ordnung der Mononegavirales haben eine einzelsträngige RNA mit negativer Polarität. Das behüllte Virion des NDV ist pleomorph und hat einem Durchmesser von etwa 100-350 nm. Das nicht segmentierte RNA-Genom ist über 15000 Nukleotide lang und kodiert für folgende sechs Strukturproteine: Nukleoprotein (NP), Phosphoprotein (P), Matrixprotein (M), Fusionsprotein (F), Hämagglutinin-Neuraminidase Protein (HN) und die RNA-Polymerase (L). Die Gene sind folgendermaßen angeordnet: 3′-NP-P-M-F-HN-L-5′. Das Nukleoprotein, Phosphoprotein und die RNA-Polymerase bilden mit dem RNA-Genom den Ribonukleoproteinkomplex (RNP) (MILLER et al. 2010; RAMP 2012). Die Virulenz des NDV ist zwar abhängig von mehreren Genen, jedoch wirken sich Veränderungen an der F-Proteinspaltstelle am stärksten auf die Virulenz aus. Niedrig virulente Viren besitzen weniger basische Aminosäuren an der Spaltstelle und die Aminosäure Leucin anstelle von Phenylalanin an Position 117 (DE LEEUW et al. 2003). Phylogenetische Untersuchungen zeigten, dass die zwei Klassen der NDV in drei Genomgrößenkategorien aufgrund ihrer Nukleotidanzahlen eingeteilt werden können. Alle Viren der Klasse I (Genotyp 1-9) besitzen eine Genomlänge von 15198 7 Nukleotiden. Diese Viren blieben in ihrem ursprünglichem Reservoir, den Wildwasservögeln. Viren der zweiten Klasse gingen auf die Hühnerpopulation über und erlangten virulente Eigenschaften. Die Genotypen I-IV der zweiten Klasse, welche vor 1960 isoliert wurden, haben eine Länge von 15186 Nukleotiden. Die ausschließlich pathogenen Genotypen V-VIII der zweiten Klasse (Isolierung nach 1960) weisen eine Genomlänge von 15192 Nukleotiden auf (CZEGLEDI et al. 2006). 2.1.6 Replikation Die Virusanheftung an die Wirtszelle erfolgt über das transmembrane virale Oberflächenprotein Hämagglutinin-Neuraminidase (HN-Protein), welches an die sialinsäurehaltigen Oberflächenrezeptoren der Zelle bindet. Daraufhin wird die Membranfusion hydrophoben durch das Aminosäuren Fusionsprotein am eingeleitet, Aminoterminus des welches mit F1-Proteins seinen mit der Wirtszellmembran interagiert (FERREIRA et al. 2004). Die Virushülle und die Wirtszellmembran fusionieren bei neutralem pH-Wert und das Nukleokapsid wird in die Zelle abgegeben. Die Virusreplikation findet ausschließlich im Zytoplasma statt. Sie beginnt mit der Transkription der Virus-RNA zu mRNAs durch die Polymerase des Virus. Zusätzlich wird durch den RNP-Komplex ein zusammenhängender positiver RNA-Strang der Virus-RNA erzeugt (Antigenom), welcher zur Synthese neuer Virusgenome dient. Die viralen Proteine werden am rauen endoplasmatischen Retikulum translatiert. Parallel dazu erfolgt die Glykosylierung der HN- und FProteine und die Spaltung des F0-Proteins (inaktives F-Vorläuferprotein) mithilfe der wirtseigenen Polymerase im Golgiapparat. Dadurch ensteht die aktive Form des FProteins, welches aus einer F1- und einer F2-Untereinheit besteht, die über DisulfidBrückenbindung zusammenhängen. Sobald genügend NP-Proteine vorhanden sind, beginnt die Replikation, bei der die neu synthetisierten Genome umhüllt werden. Das neue Ribonukleotid verbindet sich daraufhin mit dem Matrixprotein an der Wirtszellmembran und das Virion wird durch „Knospung“ entlassen (LAMB 2001). 8 2.1.7 Virulenz im Wirt Die Virulenz eines NDV Stammes ist wirtsabhängig und hängt von folgenden Eigenschaften ab: Umweltbedingungen, Virus-Dosis, welche Übertragungsweg, sich begünstigend Alter, auf den Immunstatus und Krankheitsverlauf auswirken. Je jünger die Tiere, desto akuter ist der Verlauf der Erkrankung, der Tod tritt ein, bevor klinische Symptome zu beobachten sind. Bei älteren Tieren ist ein eher protrahierter Verlauf mit charakteristischen klinischen Symptomen zu beobachten. 2.1.8 Molekularbiologische Grundlagen der Virulenz Bei der Replikation des NDV wird das Vorläufer-Glykoprotein F0 des F-Proteins durch Proteasen in die beiden Untereinheiten F1 und F2 gespalten (ROTT 1988). Diese nach der Translation stattfindende Spaltung erfolgt durch eine zelleigene Protease (NAGAI et al. 1976). Die Spaltbarkeit des F0-Vorläufermoleküls steht in direktem Zusammenhang zur Virulenz des Virus in vivo (NAGAI et al. 1976; ALEXANDER u. BELL 2004). F0-Vorläufermoleküle von virulenten Viren können von ubiquitär vorkommenden, Furin-ähnlichen Proteasen gespalten werden (NAGAI et al. 1976; GOTOH et al. 1992). Dies erlaubt dem Virus eine Verbreitung in zahlreichen Geweben und Zellen des Wirtes und resultiert in einer Schädigung lebenswichtiger Organe. Nicht virulente Viren werden nur durch Trypsin-ähnliche Proteasen gespalten und können sich dadurch auch nur in den Geweben vermehren, in denen diese Enzyme häufig vorkommen, nämlich im Respirations- und Gastrointestinaltrakt (ALEXANDER u. BELL 2004). Die Virulenz basiert hauptsächlich auf dem Aminosäuremuster der F0-Spaltstelle, dem Vorhandensein von basischen Aminosäuren an den Positionen 113, 115 und 116 und Phenylalanin an Position 117 in virulenten NDV-Stämmen. Die Sequenz lautet häufig: 113 RQK/RR*F117, wobei die meisten virulenten Viren auch an Position 112 eine basische Aminosäure besitzen (ALEXANDER u. BELL 2004). Tabelle 1 zeigt die Aminosäuremuster der F0-Spaltstelle von verschiedenen Virusstämmen (Tabelle 1). 9 Neben der Aminosäurefrequenz der Spaltstelle des F-Proteins ist auch das HNProtein eine Virulenzdeterminante. Stämme mit gleicher Aminosäurefrequenz an der F-Protein-Spaltstelle weisen unterschiedliche Virulenzeigenschaften auf. Eine Studie von de Leeuw et al. zeigte eine Veränderung in der Virulenz des Virusstammes beim Austausch der HN-Gene von verschieden virulenten Virusstämmen (DE LEEUW et al. 2005). Tabelle 1: Aminosäuresequenzen an der Spaltstelle des F0-Proteins verschiedener NDV-Stämme Virusstamm Virulenz Spaltstelle Aminosäuren 111 bis 117 Herts 33 hoch -G-R-R-Q-R-R*F- Essex ‘70 hoch -G-R-R-Q-K-R*F- 135/93 hoch -V-R-R-K-K-R*F- 617/83 hoch -G-G-R-Q-K-R*F- 34/90 hoch -G-K-R-Q-K-R*F- Beaudette C hoch -G-R-R-Q-K-R*F- La Sota niedrig -G-G-R-Q-G-R*L- D26 niedrig -G-G-K-Q-G-R*L- MC110 niedrig -G-E-R-Q-E-R*L- 1154/98 niedrig -G-R-R-Q-G-R*L- (modifiziert nach Alexander 2008, Diseases of Poultry 11 th edition, * zeigt die Spaltstelle an; E= Glutaminsäure, F= Phenylalanin, G= Glycin, K= Lysin, L= Leucin, Q= Glutamin, R= Arginin, V= Valin) 10 2.1.9 Epidemiologie 2.1.9.1 Wirte Es ist anzunehmen, dass alle Vögel für ND empfänglich sind, jedoch mit artabhängiger Ausprägung der Krankheit. Hauptsächlich sind jedoch Hühnervögel, Sperlingsvögel, Tauben, Kormorane, Papageien, Raubvögel und weniger Wasservögel klinisch betroffen. Auch andere Tiere wie Reptilien und der Mensch sind empfänglich (LANCASTER 1966). Newcastle Disease Viren wurden regelmäßig von ziehenden Wasservögeln isoliert. Die meisten Isolate zählten zu den niedrigvirulenten Varianten und können asymptomatisch- enterischen Pathotypen zugeordnet werden. Trotzdem sind auch Ausbrüche der virulenten ND in Wildvögeln zu beobachten, wie zum Beispiel ein Ausbruch in Nordamerika während der 1990er Jahre, bei dem Kormorane betroffen waren. (ALEXANDER u. BELL 2004). 1992 fand ein Ausbruch der Krankheit in der Kormoranpopulation in Westkanada und im Nordwesten der USA statt, bei dem das Virus auf domestizierte Puten überging (MIXSON u. PEARSON 1992). 2.1.9.2 Zoonotisches Potential Das NDV ruft beim Menschen Augeninfektionen hervor mit uni- und bilateralen Rötungen, Tränenfluss, Augenlidödemen, Konjunktividen und subkonjunktivalen Blutungen (ALEXANDER 2003). Aber auch Fälle mit Fieber und Kopfschmerzen mit und ohne Konjunktivitis wurden dokumentiert (CHANG 1981). Die Infektion heilt schnell ab, die Hornhaut ist nicht betroffen. Meist wurden Infektionen durch direkten Kontakt mit infizierter Allantoishöhlenflüssigkeit hervorgerufen, welche bei Laborunfällen ins Auge spritzte, oder durch Einreiben von Viruspartikeln in die Augen mit kontaminierten Händen, nachdem infizierte Vögel angefasst wurden. Auch bei Sprayvakzinierung kann durch Aerosol-Augen-Kontakt eine Infektion hervorgerufen werden (UTTERBACK u. SCHWARTZ 1973; BURRIDGE et al. 1975; JORGENSEN et al. 2000). 11 Allgemein gilt aber menschlicher Kontakt zu infiziertem Geflügel als wenig risikoreich. Übertragungen von Mensch zu Mensch sind bis dato nicht dokumentiert (ALEXANDER 2003). 2.1.9.3 Verbreitung Die Verbreitung der Newcastle Krankheit hängt von den Eradikationsversuchen und Kontrollmaßnahmen der jeweiligen Länder ab. Auch die Haltung ist ausschlaggebend. Länder mit hauptsächlich großen kommerziellen Geflügelherden haben weniger Probleme mit dem Ausbruch der Krankheit als Länder, in denen Hühner hauptsächlich in ländlichen Hinterhofherden gehalten werden (ALEXANDER 2003). Als NDV Erregerreservoir gelten einheimische Wild- und Zugvögel, ebenso kann eine Einschleppung über die Einfuhr von Wildvogelarten aus endemischen Gebieten erfolgen (DIEL et al. 2012b). Der Einsatz von NDV-Vakzinen beim Nutzgeflügel rund um den Globus erschwert eine Schätzung der tatsächlichen Verteilung des NDV. Über serologische Untersuchungen kann nicht zwischen niedrig- und hoch-virulenten Varianten sowie Impfstoffen unterschieden werden. Auch können in immunisierten Herden Ausbrüche der Newcastle Disease vorkommen (ABOLNIK et al. 2004). Eine antigenetische Diversität zwischen Impfstoffen und Feldviren könnte hierbei eine Rolle spielen (KAPCZYNSKI u. KING 2005; HU et al. 2009; MILLER et al. 2009b), jedoch zeigte eine Studie von Dortmans et al. von 2012, dass eine klassische Lebendvakzine des Genotyps II, welche sich antigenetisch von einem virulenten Virusstamm unterscheidet, die gleichen protektiven Eigenschaften hat, wie eine genotypisch gleiche Lebendvakzine, gemessen an klinischen Symptomen (DORTMANS et al. 2012). Die Autoren machten eher schlechte Impfpraxis und Doppelinfektionen mit anderen immunsuppressiven Krankheitserregern für Ausbrüche in immunisierten Herden verantwortlich, als eine antigenetische Varianz zwischen Impf- und Feldvirus. Andere Studien zeigen jedoch auch, dass durch eine Impfung mit einem dem Belastungsvirus genotypisch gleichen Lebendimpfstoff eine signifikante Reduzierung der Virusausscheidung bei Hühnern nach einer Belastungsinfektion erreicht werden 12 kann (MILLER et al. 2009b), was ausschlaggebend für die Verbreitung und den Verlauf der Erkrankung ist. Die Lebendimpfstämme der letzten 50 Jahre gehören phylogenetisch zu den Genotypen I und II und unterscheiden sich von den Virusstämmen, welche in den letzten zwei Dekaden verantwortlich für Ausbrüche der ND waren. Die hierbei hauptsächlich beteiligten Virusstämme aus den USA stammten von Genotyp V (PEDERSEN et al. 2004), in Europa, Asien und Afrika vom Genotyp IV (Pigeon Paramyxovirus Type I) und Genotyp VII (YU et al. 2001; ABOLNIK et al. 2004; LIEN et al. 2007; LIU et al. 2007; IRVINE et al. 2009; KE et al. 2010). 2.1.10 Klinisches Bild Die klinischen Symptome der ND hängen von verschiedenen Faktoren ab. Virusstamm, Wirtsspezies, Alter, Immunstatus, Virusdosis und Expositionsweg, Koinfektion mit anderen Erregern sowie Umwelt- und sozialbedingter Stress spielen eine ausschlaggebende Rolle. Die Verläufe der ND werden anhand der klinischen Symptome in fünf Formen eingeteilt: 1. viszerotrope velogene Form (VVND) , 2. neurotrope velogene Form, 3. mesogene Form, 4. lentogene oder respiratorische Form und 5. subklinisch enterische Form (ALEXANDER 2003). Bei der schweren viszerotropen Form der Newcastle Disease kommt es sehr schnell zu extrem hohen Mortalitätsraten mit wenigen oder ausbleibenden klinischen Symptomen. Das Krankheitsgeschehen spielt sich im Gastrointestinaltrakt ab, aber auch leichte bis schwere respiratorische Erscheinungen werden beobachtet. Grünlich-schleimiger Kot wird häufig bei Vögeln beobachtet, welche nicht in der initialen Phase der Infektion sterben. Kurz vor dem Tod zeigen sich Muskeltremor, Tortikollis, Opisthotonus sowie Flügel- und Beinparalysen. In Herden mit voll empfänglichen Hühnern kann die Mortalität bis zu 100% erreichen (SUSTA et al. 2011). Bei der neurotropen velogenen Form der ND, welche hauptsächlich in den USA vorkommt, zeigen sich schwere respiratorische Symptome, gefolgt von neurologischen Symptomen. Die Legeleistung fällt rapide ab, die Eier sind teilweise dünnschalig bis schalenlos. Die 13 Morbidität kann bis zu 100 % betragen, die Mortalität variiert je nach Alter der Vögel, bei jungen Vögeln bis zu 90%, bei alten Tieren um die 50% (SUSTA et al. 2011). Mesogene Stämme verursachen vorwiegend respiratorische Symptome sowie eine reduzierte Legeleistung, welche ein paar Wochen anhält. Auch neurologische Symptome können auftreten. Die Mortalität ist niedrig. Lentogene ND-Viren rufen normalerweise keine Erkrankung in erwachsenen Vögeln hervor. Junge vollempfängliche Hühner können jedoch mit respiratorischen Symptomen erkranken. Bei der vierten Pandemie in den späten 1970er Jahren, welche hauptsächlich die Taubenpopulation betraf und durch eine AMPV-1 Variante, dem PPMV-1 hervorgerufen wurde, zeigten neurologische Symptome. Die betroffene Tauben Tauben fielen grünlichen durch uni- Durchfall und und bilaterale Bewegungsstörungen der Flügel und Beine sowie Tortikollis auf (KALETA et al. 1985). Respiratorische Symptomatik wurde hingegen kaum beobachtet. Puten sind ebenso wie Hühner empfänglich für velogene Newcastle Disease VirusStämme, zeigen aber weniger schwerwiegende klinische Symptome (BOX et al. 1970; ALEXANDER 1999). Enten und Gänse werden als natürliches Virusreservoir angesehen und sind ebenfalls empfänglich für das Virus, zeigen aber kaum bis keine klinischen Symptome (ZHANG et al. 2011). Die klinischen Symptome in anderen Geflügelspezies sind unterschiedlich und von der betroffenen Spezies abhängig. Nicht geimpfte Fasane sind empfänglich für die ND und zeigen ähnliche klinische Symptome wie das Huhn (ALDOUS u. ALEXANDER 2008). Je empfänglicher die Spezies, desto stärker die klinische Ausprägung (ALDOUS et al. 2010). Am empfänglichsten ist das Huhn, gefolgt von Pute, Taube und Enten (ALDOUS et al. 2010). 2.1.11 Pathologie Die Ausprägungen der pathologischen Veränderung bei einer AMPV-1 Infektion variieren ähnlich wie die klinischen Symptome enorm und sind von Virusstamm, Wirt und Begleitfaktoren abhängig. Bei der Pathologie der Newcastle Disease gibt es keine pathognomonischen Veränderungen. Velogene viszerotrope Formen der ND 14 sind durch hämorrhagische Läsionen in der Mukosa des Verdauungstraktes der Hühner vom Proventrikulus bis zum Kolon gekennzeichnet. Diphtheroide Entzündungen der Peyerschen Platten führen zu nekrotisch ulzerativen Läsionen. Bei längeren und schwereren Verläufen sind knopfförmige ulzerativ diphtheroide Herde („Boutons/Buttons“) in der Darmwand zu finden (MAZUMDER et al. 2012). Im Drüsenmagen zeigen sich petechiale Blutungen, die Zäkaltonsillen sind hämorrhagisch verändert (HANSON et al. 1973), was bei der neurotropischen Form nicht zu beobachten ist. Bei keiner Form der ND zeigen sich makroskopische Läsionen im Bereich des zentralen Nervensystems. Im Respirationstrakt finden sich mukosale Blutungen und deutliche Kongestionen in der Trachea. Luftsackentzündungen können auftreten, welche mit Verdickungen der Luftsäcke und mit katarrhalischen oder käsigen Exsudaten durch bakterielle Sekundärinfektionen einhergehen. Als weitere pathologische Veränderungen werden Blutungen im unteren Augenlid, fokale Nekrosen in der Milz und paratracheales Ödem am Brustkorbeingang beobachtet. Bei Infektionen von Hühnern und Puten in der Legeperiode mit velogenem NDV findet sich gewöhnlich Eidotter in der Bauchhöhle, Blutungen an Ovidukt und Uterus sowie eine Dislokation dieser Organe (BWALA et al. 2012). 2.1.12 Histologie Histologische Veränderungen zeigen sich in allen Hirnstrukturen außer im Großhirn. Eine nicht eitrige Enzephalomyelitis mit neuronaler Degeneration und perivaskulären lymphozytären Infiltrationen sowie Ansammlungen von Gliazellen und eine Hypertrophie von Endothelzellen sind in diesen Bereichen zu beobachten (CATTOLI et al. 2011). Ödeme und Blutungen zeigen sich in Organen in der Nähe von Blutgefäßen. Die Kapillaren und Arteriolen sind hyalinisiert und weisen nekrotische Endothelzellen auf. Infektionen mit virulenten Stämmen zeigen einen durch Blutungen und Nekrosen in schleimhaut-assoziierten Lymphgeweben gekennzeichneten Verdauungstrakt. In der Trachea finden sich einen Tag nach Infektion hypertrophierte Becherzellen. Das Trachealepithel zeigt nach ein- bis 15 zweitägigem Infektionsverlauf zilienlose Bereiche hauptsächlich um die Ausführungsgänge muköser Drüsen, welche mit zunehmendem Krankheitsverlauf größer werden. Nach vier Tagen zeigen sich kleine Vakuolen mit Lymphozyten und heterophilen Granulozyten in der Epithelzellschicht (KOTANI et al. 1987). In der Schleimhaut des oberen Respirationstraktes finden sich zudem Ödeme und Zellinfiltrationen, welche aus Lymphozyten und Makrophagen bestehen. Die Reproduktionsorgane sind durch Follikelatresie mit Infiltration von Entzündungszellen und Formierung von lymphoiden Aggregaten an Follikel und Ovidukt gekennzeichnet. Selten werden fokale Nekrosen und Einblutungen in Leber, Gallenblase und Herz beobachtet. Kongestionen und Petechien am Kamm der Tiere sowie Ulzerationen und Blutungen der Haut treten bei vizerotropen velogenen NDV-Infektionen auf (CATTOLI et al. 2011). 2.1.13 Diagnose Zur Bekämpfung der ND muss eine Identifikation und Isolation der jeweiligen Virusvarianten erfolgen. Eine Unterscheidung zwischen niedrig- und hoch virulenten Varianten sowie die Unterscheidung zwischen infizierten und nicht-infizierten Hühnern muss erfolgen, da es keine pathognomonisch-pathologischen Veränderungen gibt. Zur Isolation des Agens eignen sich Tupfer aus Rachen, Trachea und Kloake sowie Organproben aus Hirn, Leber, Niere, Milz und pathologisch veränderten Organen. Das Probenmaterial wird in der Eikultur auf replizierendes Virus und nachfolgend im HAH-Test weiter differenziert oder zu weiteren molekularen Untersuchungen herangezogen (OIE 2012). Monoklonale Antikörper können zur Hämagglutinationshemmungstest erhältliche Identifikation eingesetzt RT-PCR/rRT-PCR Systeme Genomabschnitten zur Verfügung. von werden. Es zur Detektion Durch APMV-1 stehen von im kommerziell NDV-spezifischen Sequenzierung kann zwischen niedrigpathogenen und hoch pathogenen Varianten des APMV-1 unterschieden werden (MILLER et al. 2010). Virales Antigen kann direkt durch immunhistochemische und Immunfluoreszenzuntersuchungen detektiert werden. Als 16 serologische Tests stehen der Hämagglutinationshemmungstest (HAH-Test), der Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA), sowie Multiplex Assays in Kombination mit einem Luminex Analysesystem zur Verfügung (OIE 2008). 2.1.13.1 Molekulare Techniken zur Diagnose von ND Bei der Identifikation des Virus wird eine reverse Transkription mit anschließender PCR durchgeführt, wodurch eine DNA Kopie der Virus-RNA erzeugt wird. Bei der real Time RT-PCR werden fluorogene Proben in Echtzeit amplifiziert gemessen und detektiert. Mit gegen das M-Gen gerichteteten Primern wurden oft Viren der Klasse I nicht detektiert (KIM et al. 2007), weswegen eine multiplex rRT-PCR entwickelt wurde, bei der Primer zusätzlich gegen das L-Gen eingesetzt wurden (MIA KIM et al. 2008). Eine Identifizierung von virulenten Isolaten ist durch eine rRT-PCR möglich, welche sich gegen die Spaltstelle des F-Gens richtet (WISE et al. 2004). 2.1.14 Vorbeuge- und Kontrollmaßnahmen Kontrollstrategien gegen die Newcastle Disease obliegen den jeweiligen Ländern. Durch Vorgabe der World Organization for Animal Health (OIE) zur internationalen Seuchenbekämpfung ist die Newcastle Disease in allen industrialisierten Ländern eine anzeigepflichtige Tierseuche. Bei einem Primärausbruch der ND ist eine Virusisolation und -identifikation sowie die Einschätzung der Virulenz des Isolats nötig, um geeignete Bekämpfungsmaßnahmen einzuleiten. Nach Ende eines Ausbruchs gilt die ND in Deutschland als erloschen, wenn das Geflügel des betroffenen Bestandes verendet oder getötet und beseitigt wurde, eine Desinfektion erfolgte und seitdem 30 Tage vergangen sind. Der Verdacht gilt als beseitigt, wenn die ND nicht durch virologische Untersuchung bestätigt werden kann und die betroffenen Tiere verendet, getötet und beseitigt wurden (GEFLÜGELPESTVERORDNUNG 2007). Die Kontrolle der Newcastle Disease besteht hauptsächlich aus Optimierung des Managements der Betriebe, „Biosicherheit“, Hygienemaßnahmen in Kombination mit 17 präventiver Impfung von Herden, in der Verhinderung der Virusverbreitung durch das Keulen von infizierten oder verdächtigen Tieren sowie der Einrichtung von Sperrbezirken und Beobachtungsgebieten. Die Verhinderung der Einschleppung der Krankheit ist in Newcastle Disease-freien Ländern die höchste Priorität. In Deutschland besteht eine generelle Impfpflicht für Hühner und Puten, welche bei einem ND-Seuchenausbruch oder -verdacht ausgesetzt wird. Danach ist eine behördliche Genehmigung zur Impfung erforderlich. Die aktuelle Verordnung zum Schutz gegen die Geflügelpest (Geflügelpest-Verordnung in der Fassung der Bekanntmachung vom 8. Mai 2013, BGBl. I S. 1212) weist darauf hin, dass die Vorschriften der Geflügelpest-Verordnung in der Fassung der Bekanntmachung vom 20. Dezember 2005 (BGBl. I S. 3538) hinsichtlich der Newcastle-Krankheit weiter anzuwenden sind. 2.2 Impfung gegen die Newcastle Disease 2.2.1 Einleitung Eine Impfung gegen die ND wird in Ländern durchgeführt, in denen virulente Stämme der ND endemisch sind. Auch in Ländern ohne Vorkommen von virulenten Stämmen, in denen aber durch niedrig virulente Stämme signifikante wirtschaftliche Verluste während der Aufzucht bei Zucht- oder Legehennen oder in der Broilermast verursacht werden, müssen Impfungen durchgeführt werden (SENNE et al. 2004). Das Prinzip der Impfung besteht in der Induktion einer immunologischen Antwort gegen das Virus, ohne eine Erkrankung auszulösen. Inaktivierte Vakzinen sind abgetötete oder abgeschwächte Viren die dem Vogel direkt injiziert werden. Nicht virulente oder lentogene Virusstämme können dem Vogel lebend verabreicht werden und fallen unter die Kategorie Lebendimpfstoffe. Als dritte Kategorie stehen nach neueren Entwicklungen rekombinante Impfstoffe zur Verfügung, bei denen ein Trägervirus fremdes genetisches Material exprimiert. 18 2.2.2 Lebendimpfstoffe Als Lebendvakzinen werden asymptomatische enterische (avirulente), mesogene oder lentogene Virusstämme verwendet, welche lebend verabreicht werden und sich im Wirt vermehren können. Ihre Herstellung ist verhältnismäßig einfach und sie können über das Trinkwasser oder als Spray verabreicht werden. Einzelne Tiere können über Augentropfen geimpft werden. Mesogene Virusstämme werden aufgrund ihrer Virulenz nur in ND-endemischen Ländern eingesetzt und intramuskulär oder über die Wing-Web-Methode verabreicht. Die weltweit am meisten verwandten und bekanntesten Impfvirusstämme sind der APMV-1 Stamm LaSota, F und Hitchner B1, welche um 1940 in den USA entwickelt wurden. Seltener werden die Stämme Ulster und V4 (lentogene Stämme) eingesetzt (SENNE et al. 2004). Die Verabreichungsdosis bei lentogenen Impfstoffen beträgt 10 6.5EID50 (ALLAN u. LANCASTER 1978). Folgende mesogene Stämme werden als Lebendvakzinen genutzt: Roakin, Komarov, Hertfordshire (H) und Mukteswar (CZEGLEDI et al. 2003). Die Stämme sind nach der OIE Definition Auslöser der Newcastle Disease, da sie einen intrazerebralen Pathogenitätsindex von oder über 0,7 aufweisen (OIE 2008). Mesogene Lebendimpfstoffe sollten nicht bei Tieren unter acht Wochen oder als Primärimmunisierung eingesetzt werden, da sie schwerwiegende Erkrankungen in voll empfänglichen Herden hervorrufen können (MEULEMANS 1988). Der APMV-1 Stamm LaSota ist potenter in der Induktion einer Immunantwort als Hitchner B1 und dadurch auch virulenter. Deswegen wird der APMV-1 Stamm LaSota häufig nach einer intitialen B1 Impfung als Booster eingesetzt (SENNE et al. 2004). Lebendimpfstoffe können auch mit Adjuvantien wie Aluminiumhydroxidgel parenteral verabreicht werden. Lebendimpfstoffe bieten den Vorteil, dass nicht-geimpfte Tiere von ausscheidenden Tieren angesteckt werden und somit ebenfalls Impfschutz erhalten. Sie stimulieren lokale und systemische Immunität und rufen eine schnelle Protektion hervor. Als nachteilig erweist sich ihr Potential, eine klinische Erkrankung hervorzurufen. So sollte zum Beispiel der APMV-1 Stamm LaSota nicht als 19 Primärimpfung bei sehr jungen Tieren eingesetzt werden, da nach der Impfung respiratorische Symptome auftreten können (ALEXANDER u. BELL 2004). Auch maternale Immunität kann eine ausreichende Immunisierung verhindern. Um einer virulenten ND-Infektion vorzubeugen, bedarf es mehrerer Lebendvirusimpfungen oder einer Kombination aus Lebendvirusimpfung mit inaktivierten Öl-Adjuvant Impfstoffen. Aber jedoch kann selbst ein hoher Antikörpertiter eine ND Infektion und Virusauscheidung oftmals nicht verhindern (SENNE et al. 2004). Tabelle 2 zeigt die intrazerebralen Pathogenitätsindices von verschiedenen Impfstämmen. Tabelle 2 : Virusstämme als Lebendimpfstoffe gegen die Newcastle Disease Virus Queensland V4 Ulster 2C VG/GA Clone 30 Hitchner B1 F (Asplin) La Sota Mukteswar Pathotyp avirulent avirulent lentogen lentogen lentogen lentogen lentogen mesogen ICPI 0 0 0,03* 0,11* 0,2 0,25 0,4 1,4 (modifiziert nach Alexander 2008, Diseases of Poultry 11 th edition, * = (MA et al. 2009)) 2.2.3 Inaktivatvakzinen Inaktivatvakzinen werden aus infektiöser Allantoishöhlenflüssigkeit gewonnen, nachdem das Virus in embryonierten Eiern angezüchtet wurde. Das Virus wird hierbei mit Formalin oder β-Propiolacton abgetötet und nachfolgend mit einem Adjuvans, wie Aluminiumhydroxid oder mit Öl zu einer Emulsion vermischt (STONE 1997). Öl-basierte Inaktivatimpfstoffe sind immunogener als Aluminiumhydroxidbasierte Inaktivatimpfstoffe (MEULEMANS 1988). Die Applikation erfolgt entweder subkutan oder intramuskulär. Inaktivierte NDV Impfstoffe werden häufig bei Elterntieren in Kombination mit Lebendimpfstoffen kurz vor der Eiablage eingesetzt, um möglichst hohe maternale Antikörpertiter zu erreichen (VAN ECK 1990). 20 Inaktivierte Impfstoffe sind verhältnismäßig teuer in ihrer Herstellung und umständlicher zu verabreichen, da jedes Tier einzeln geimpft werden muss. Sie interferieren jedoch nicht so stark mit maternaler Immunität wie Lebendimpfstoffe. Generell induzieren Inaktivatimpfstoffe keine mukosalen Immunmechanismen, jedoch zeigte eine Studie von 2008 eine Erhöhung von IgG- Antikörpern in Trachealund Nasalwaschungen nach Impfung mit einer Inaktivatvakzine (CHIMENO ZOTH et al. 2008), was mit erhöhten Anti-NDV-IgG-Typ Antikörpertitern in Verbindung stehen könnte, die durch das Inaktivat induziert werden. 2.2.4 Zukunftsentwicklungen Alternativen zu herkömmlichen Newcastle Disease Vakzinen, wie die HN-Expression in transgenen Nicotiana benthamiana- und Reispflanzen (GOMEZ et al. 2009) (YANG et al. 2007), die Entwicklung von Immune Stimulating Complexes (ISCOMs) (HOMHUAN et al. 2004) oder Virosomen (KAPCZYNSKI u. TUMPEY 2003) oder Virus-Like-Particles (MCGINNES et al. 2010) (PANTUA et al. 2006) bieten neue Ansätze zur Immunisierung. Die in-ovo Impfung zum Zeitpunkt des Überführens der Eier in den Schlupfbrüter mit ND-Lebendimpfstoffen liefert zurzeit keine befriedigenden Schlupfresultate (DILAVERIS et al. 2007) (RAMP et al. 2012). 2.2.5 Impfstrategien Impfprogramme und –zeitpunkte sollten immer folgende Faktoren berücksichtigen: Maternale Immunität, Gesundheitszustand der Herde, Interferenz mit anderen Impfstoffen, Größe und Alter der Herde, sowie die aktuelle endemische Lage der Newcastle Disease in den jeweiligen Gebieten. Die angestrebte Protektion, der Immunstatus der Tiere, der lokal vorkommende Virustyp, die Verabreichungsart der Vakzine sowie das Überwachen der Immunantwort sind ebenfalls wichtige Parameter (ALLAN u. LANCASTER 1978). Ein angestrebtes Ziel bei der Immunisierung einer Herde ist ein möglichst homogener Antikörpertiter der gesamten Herde. Bei Bezug von Eiern verschiedener Elterntierherden mit unterschiedlichem Immunstatus der 21 Elterntiere muss auch immer der dadurch resultierende Unterschied in der passivübermittelten Immunität Antikörpertitern innerhalb beachtet einer werden. Herde Bei unterschiedlich kommt es zu keiner ausgeprägten homogenen Immunisierung durch eine Lebendvakzine, da diese unterschiedlich stark durch maternal-übertragene Antikörper gehemmt wird. Bei einer Newcastle Infektion würde das zum Beispiel die Krankheitsdauer einer Herde verlängern, da Teile der Herde während der Erkrankung durch zeitlich versetztes Nachlassen der Antikörpertiter neu erkranken können (ALLAN 1975). 2.2.5.1 Impfprogramme Bei Impfprogrammen gegen die ND müssen die Virulenz des Impfvirus sowie die Immunkompetenz der Tiere aufeinander abgestimmt werden. Auch Impfungen gegen andere Krankheiten, die in der Herde durchgeführt werden, müssen berücksichtigt werden (ALLAN 1975). 2.2.5.1.1 Hühner Legehennen werden generell in den ersten fünf Lebenswochen mit Hitchner B1 über das Trinkwasser oder über Aerosol erstmalig immunisiert. Eine Revakzination erfolgt um die 10. Lebenswoche mit dem APMV-1 Stamm LaSota oder bei Legebeginn und Transfer in die Produktionseinheit entweder mit dem APMV-1 Stamm LaSota oder einer inaktivierten Vakzine. Abhängig vom Vorkommen der ND in dem Gebiet des Bestands werden verschiedene Impfstrategien angewandt. Hat die ND eine niedrige Inzidenz und kommt nur sporadisch mit sehr milden Verläufen in der entsprechenden Region vor, in der die Herde immunisiert werden soll, so kann eine Impfung am 1.-5. oder am 18.-21. Tag mit einem milden lentogenen Stamm wie zum Beispiel B1 durch Aerosol oder über das Trinkwasser verabreicht werden. Der APMV-1 Stamm LaSota kann ebenfalls am 18.-21. Tag über das Trinkwasser oder am Tag 70 zur Revakzinierung eingesetzt werden. Als „Point of Lay“ Impfung, also eine Impfung ab der Legeperiode, kann ebenfalls der APMV-1 Stamm LaSota eingesetzt werden, 22 wobei es gelegentlich zu Legeleistungsdepressionen kommt (ALLAN 1975). In Gebieten, in denen ND mit schwereren Verläufen endemisch ist, sollte eine Grundimmunisierung am 1.-5. Tag mit einem milden lentogenen Stamm wie B1 über Sprayanwendung stattfinden und zusätzlich am 21. und am 35.-42. Lebenstag eine Revakzinierung mit B1. Nachfolgend kann zur Revakzinierung ab dem 70. Lebenstag ein mesogener Impfstamm oder ein Inaktivatimpfstoff eingesetzt werden, welcher auch zu Beginn der Legeperiode genutzt werden kann. 2.2.5.1.2 Broiler und Puten In der Broilermast ist aufgrund der kurzen Lebensdauer der Tiere ein genaues Abstimmen des Impfzeitpunkts besonders wichtig. Generell werden Broiler einmal innerhalb der ersten beiden Lebenswochen entweder über Spray-, Aerosol- oder über das Trinkwasser mit den APMV-1 Stämmen Hitchner B1 oder LaSota vakziniert. Die Immunisierung junger Puten erfolgt mit dem APMV-1 Stamm LaSota durch Augentropfen oder intranasale Instillation, Spray oder Aerosol. Hierbei können zellproliferative histologische Veränderungen in der Trachea auftreten, welche sich aber nach vier bis sechs Tagen wieder normalisieren (MEULEMANS 1988). Eintagsputenküken mit maternaler Immunität können mit APMV-1 Stamm LaSota in Kombination mit einem Inaktivatimpfstoff erfolgreich immunisiert werden (MEULEMANS 1988). Eine Revakzinierung kann in der 5. Woche erfolgen (YADIN 1976). 2.2.6 Einschätzen des Impferfolgs Die Anwesenheit von neutralisierenden Antikörpern gegen NDV schützt vor klinischer Erkrankung, jedoch wird eine Infektion mit Virusvermehrung und Ausscheidung im Wirt nicht verhindert (REYNOLDS u. MARAQA 2000a). Zur Einschätzung einer Immunantwort auf eine ND-Impfung sind der HAH-Test und ELISA geeignete Mittel (SIEGMANN 1973). Eine Herdenprotektion ist nach einer Studie von van Boven et al. erst dann erreicht, wenn über 85 Prozent der Herde einen HAH- Antikörpertiter höher 23 gleich 23 besitzen (VAN BOVEN et al. 2008). Feldstudien zeigen, dass nur Tiere einer Herde mit einem Titer von oder über 24 eine virulente ND-Infektion überleben (KAPCZYNSKI u. KING 2005). Frühere Angaben gehen von HAH-Titern über 25 oder höher aus, um eine Herde zu schützen (ALLAN u. LANCASTER 1978). Trotz nachgewiesener Aktivität von rHVT-ND im HAH-Test (PALYA et al. 2012) kann dessen Protektivität laut Kapczynski et al. nicht durch Anwesenheit von HAHAntikörpern eingeschätzt werden (KAPCZYNSKI et al. 2013). In einer Studie von Palya et al. (PALYA et al. 2012) stellte sich rHVT-ND jedoch positiv im HAH-Test dar. Bestimmte ELISA Kits eignen sich zur Erfassung der Impfantwort rekombinanter Viren ab dem 35. Tag nach subkutaner oder in-ovo Impfung (SLACUM 2012). Jedoch sind noch weitere Parameter neben systemischer humoraler Immunität ausschlaggebend für eine Protektivität, wie lokale Immunmechanismen und zellvermittelte Immunität (CMI). CMI allein, ohne Anwesenheit von neutralisierenden Antikörpern, schützt nicht vor einer velogenen Newcastle Disease Challenge (REYNOLDS u. MARAQA 2000b). Jedoch reicht bei hoher CMI ein sehr niedriger Antikörpertiter, um eine Protektion herbeizuführen (CANNON u. RUSSELL 1986), wodurch die CMI erheblich zum Immunschutz beiträgt. Systemische Immunität allein ist ebenfalls nicht protektiv, lokale Immunität trägt grundlegend zur Protektion bei (MALKINSON u. SMALL 1977). 2.2.7 Rekombinante Impfstoffe Rekombinante Impfstoffe oder Vektorimpfstoffe sind eine neue Generation von Impfstoffen, bei denen Fremdgene in das Genom eines Trägervirus (viraler Vektor) integriert werden. Das Fremdgen wird hierbei in Plasmiden kloniert, von Vektor-DNA Sequenzen flankiert und in die Zelle transfiziert. Das Plasmid enthält eine Vektorsequenz, welche durch eine „Expressionskassette“ unterbrochen ist. Diese Expressionskassette besteht aus einem Promotor des Virusvektors und einer einmaligen Restriktionsschnittstelle für die Spaltung und Verbindung mit der VektorDNA. Dahinter befindet sich die Fremdgensequenz. Durch DNA Rekombination während der Virusreplikation in der Zelle wird das Gen in die komplette Vektor-DNA 24 integriert. Die Immunantwort des Wirts richtet sich somit gegen Vektorproteine und das Fremdantigen. Als Vektoren eignen sich große persistierende DNA- oder RNAViren, wie zum Beispiel Adenoviren, Herpesviren, Pocken- und Paramyxoviren (MOSS 1991). rHVT-ND kann entweder als selbständig replizierendes Lebendvirus in-ovo am 18. Bebrütungstag oder am ersten Lebenstag intramuskulär, subkutan, intraperitoneal oder intravenös verabreicht werden (COCHRAN 1999). 2.2.7.1 Die Das Putenherpesvirus als Vektor Mareksche Erkrankung oder auch Marek’s Disease (MD) ist eine lymphoproliferative Erkrankung des Hausgeflügels, welche Veränderungen an peripheren Nerven und viszeralen Organen verursacht. Sie tritt bei Hühnern ab der 3.-4. Lebenswoche und am häufigsten zwischen der 12. und 30. Lebenswoche auf. Als klinische Symptome zeigen sich Paralysen der Gliedmaßen mit einhergehender Vergrößerung der peripheren Nerven (SWAYNE et al. 1989). Virulente MD– Virusstämme können auch besonders bei Abwesenheit von maternalen Antikörpern die Mortalität bei Hühnern zwischen der ersten und zweiten Lebenswoche durch Immunsuppression erhöhen. Abhängig vom beteiligten Virusstamm können Lymphome in Ovar, Leber, Milz, Nieren, Lunge, Herz und Proventrikulus und Haut vorkommen. Diese bestehen hauptsächlich aus lymphoiden Zellen (OIE 2010). Das Mareks Disease Virus (MDV) ist ein zell-assoziiertes Alphaherpesvirus und gehört zu den DNA-Viren. Die 3 Serotypen werden als Gallid Herpesvirus 2 ( Serotyp 1), Gallid Herpesvirus 3 (Serotyp 2) und Meleagrid Herpesvirus 1 (Serotyp 3) oder auch Herpesvirus of Turkeys (HVT) bezeichnet (SCHAT 2008). Viren vom Serotyp 1 können onkogene Eigenschaften besitzen, Viren des zweiten und dritten Serotyps nicht. HVT wird als Impfvektor genutzt, hat ein 160 kbp langes Genom und beinhaltet über 99 Gene, wovon die meisten homolog mit anderen MD-Viren sind (AFONSO et al. 2001). HVT Impfstoffe können als zell-assoziiertes oder zell-freies Virus appliziert werden und induzieren innerhalb von fünf Tagen eine starke zell-vermittelte Immunantwort gegen virulente MDV-Stämme (SONDERMEIJER et al. 1993). 25 2.2.7.1.1 Konstruktion von rHVT-ND HVT kann genetisch so modifiziert werden, dass es virusfremde Glykoproteine des Infektösen Bursitis Virus, des Marek’s Disease Virus, des Newcastle Disease Virus, des Infektiösen Laryngotracheitis Virus oder des Infektiösen Bronchitis Virus exprimiert (COCHRAN 1999). Der Vektor für die rekombinante Vakzine rHVT-ND in diesem Falle ist der HVT PB1-Stamm (CHURCHILL et al. 1973; SONDERMEIJER et al. 1993). Der Einsatz des Putenherpesvirus (HVT) als Vektor gegen die ND, welcher das F- oder/und das HN-Protein exprimiert, stellt eine Alternative zu herkömmlichen ND-Vakzinen dar (MORGAN et al. 1992). Zur Insertion des F-Gens wurde eine Region auf dem einzigartigen kurzen Sequenzelement/Unique Short Segment (US) des Virus ausgewählt, basierend auf der von Igarashi et al. publizierten Restriktionskarte von HVT (IGARASHI et al. 1987). Das F-Gen des rHVT-ND befindet sich an der BG/II Restriktionsstelle an Position 138193 des HVT-Genoms. Das F-Gen stammt von einem aus embryonierten Hühnereiern vermehrtem APMV-1 Clone 30 Stamm. Die HVT Unique Short Region US und das F-Gen wurden in Lambda Insertionsvektoren geklont. Anschließend erfolgte ein Co-Transfektion der Plasmide mit HVT DNA in Hühnerembryo-Fibroblastenkultur. Die Selektion des FProtein exprimierenden rekombinanten Virus erfolgte mittels Immunfluoreszenz. rHVT-ND zeigt eine Viruspersistenz bis zu acht Wochen (REDDY et al. 1996). Die Expression des F-Genes ist 30 Wochen nach einer Administration von rHVT-ND noch messbar (COCHRAN 1999). Die Interferenz mit maternalen Antikörpern gegen das NDV ist bei rHVT-ND nicht so hoch wie bei herkömmlichen Lebendimpfstoffen (MORGAN et al. 1993). Die Verabreichung ist sicher und hat keinen Einfluss auf die Schlupfrate oder das Überleben der Tiere, wie in einem Versuch mit in-ovo geimpften spezifisch-pathogen freien SPF-Hühnern gezeigt wurde (REDDY et al. 1996; PALYA et al. 2012). Serologische Immunantworten bilden sich langsamer aus als bei Lebendimpfstoffen und sind erst ab der vierten Woche detektierbar (MORGAN et al. 1992; PALYA et al. 2008). 26 2.3 Immunität gegen die Newcastle Disease Die Immunität gegen die Newcastle Disease kann in humorale, zellvermittelte und lokale Immunität eingeteilt werden. Zusätzlich wird zwischen angeborenen und erworbenen Immunmechanismen unterschieden. Eine Virusanheftung und – verbreitung wird generell durch gegen F- und HN-Proteine gerichtete neutralisierende Antikörper eingeschränkt und virusbefallene Zellen werden durch natürliche Killerzellen (NK-Zellen) und zytotoxische T-Zellen abgetötet (KAPCZYNSKI et al. 2013). 2.3.1 Als Angeborene Immunmechanismen angeborene Immunmechanismen werden infektionslimitierende Faktoren bezeichnet, welche schon vor einem primären Erregerkontakt im Wirt existieren und auf ein Eindringen von Mikroorganismen reagieren können. Beim Geflügel sind das physikalischen phagozytierende Barrieren wie Zelltypen Federn, wie Haut und NK-Zellen lokale und Schleimproduktion, Makrophagen, das Komplementsystem sowie Zytokine und Interferone (KAPCZYNSKI et al. 2013). In der initialen Phase der Infektion werden durch Pattern Recognition Receptors (PRR), Toll-Like Receptors (TLR) oder Nucleotide-Binding Oligomerization Domain Proteins (NOD) Mikroben anhand ihrer spezifischen Muster, den PAMPs (PathogenAssociated Molecular Patterns) erkannt. Diese induzieren intrazelluläre Signale, welche Gene für proinflammatorische Zytokine, anti-apoptotische Faktoren und antimikrobielle Peptide aktivieren (KAPCZYNSKI et al. 2013). Bei einer NDVInfektion produzieren periphere mononukleare Blutlymphozyten und heterophile Granulozyten Stickoxid. Eine Hochregulation von Interferon-α und Interferon-β mRNA kann in Makrophagen, Interferon-γ mRNA in peripheren mononukleären Blutmonozyten detektiert werden (CRIPPEN et al. 2003; AHMED et al. 2007). Interferon-γ wird später von NK-Zellen gebildet, welche auch direkt virusinfizierte Zellen töten, und aktiviert einen Tag nach Infektion die zellulär-vermittelte Immunität (CMI) (LOWENTHAL et al. 1995; REYNOLDS u. MARAQA 2000a, b). 27 2.3.2 Zellvermittelte Immunität Zellvermittelte Immunität (CMI) bedeutet eine spezifisch erworbene, durch T-Zellen (CD4+ T-Helferzellen und CD8+ zytotoxische T-Lymphozyten) erzeugte Immunität, welche einen wichtigen Faktor zur Entwicklung einer Protektion gegen eine NDV Infektion darstellt und zur lokalen Virusreduktion durch Abtöten von infizierten Zellen beiträgt (RUSSELL et al. 1997; REYNOLDS u. MARAQA 2000b). Ebenfalls findet eine Aktivierung von B-Zellen und Makrophagen statt. Die CMI allein reicht nicht aus, um den Wirt vor einer ND Belastungsinfektion zu schützen, jedoch spielt die Menge der IFN-γ-Bildung, welches von NK-Zellen und T-Zellen gebildet wird, in der Reduktion der Mortalität und Morbidität einer ND Erkrankung eine Rolle (SUSTA et al. 2013). Ein Zusammenspiel von CMI und antikörpervermittelter Immunität ist essentiell für den Schutz vor ND. Beispielsweise verstärkt das von T-Zellen gebildete Interleukin-4 die humorale Immunantwort (SAWANT et al. 2011). Ebenso werden bei einer ND höhere Antikörpertiter bei höheren Werten von durch Markophagen gebildetem Stickoxid beobachtet (GUIMARAES et al. 2011). 2.3.3 Humorale Immunität Antikörper sind die Schlüsselregulatoren zur Bekämpfung einer NDV-Infektion (KAPCZYNSKI et al. 2013). Sie können mittels des Hämagglutinationshemmungstestes (HAH), des Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISA) oder des Virusneutralisationstestes (VNT) bestimmt werden. Humorale Immunantworten sind normalerweise sechs bis zehn Tage nach Impfung/Infektion lokal sowie systemisch im Blut messbar. Nach NDV Kontakt differenzieren B-Lymphozyten zu Plasmazellen, welche 3 Typen von antigenspezifischen neutralisierenden Antikörpern bilden: IgG (=IgY), IgM und IgA. Das Hühner-Aquivalent zum IgG der Säugetiere wird auch als IgY bezeichnet und weist einige strukturelle Unterschiede auf. Als erstes wird IgM produziert und ist vier Tage nach NDV-Infektion nachweisbar. IgY und IgA werden 7 Tage nach Infektion gebildet (AL-GARIB et al. 2003). 28 2.3.4 Maternal vermittelte Immunität Elterntiere mit NDV Antikörpern übertragen diese über den Dottersack an ihre Nachkommen (HELLER et al. 1977). Im Eidotter finden sich hauptsächlich IgGImmunglobuline, wohingegen im Eiweiß IgA und IgM als Resultat mukosaler Sekretion des Oviduktes dominieren (ROSE et al. 1974; HAMAL et al. 2006). Der Transfer von IgG von dem Elterntier in das Hühnerei läuft folgendermaßen ab: IgG wird aus dem Blut der Henne in das Eigelb übertragen (CUTTING u. ROTH 1973) und findet dann über den embryonalen Kreislauf in das Küken. Die Menge an Antikörpern, welche durch den Dottersack resorbiert wird, ist proportional zur maternalen IgG Serum Konzentration (AL-NATOUR et al. 2004). 2.3.5 Lokale Immunität Schleimhautoberflächen des Respirations-, Gastrointestinal- und Urogenitaltraktes sind Haupteingangspforten für Pathogene. Die den Schleimhautoberflächen zugrunde liegenden lymphoiden Gewebe werden in ihrer Gesamtheit als mucosaassociated lymphoid tissues (MALTs) bezeichnet. Das MALT kann in gut associated lymphoid tissue (GALT), bronchus-associated lymphoid tissue (BALT), headassociated lymphoid tissue (HALT) und conjunctiva-associated lymphoid tissue (CALT) unterteilt werden. Die Schleimhautoberflächen sind stark mit Immunzellen besiedelt, deren Plasmazellanteil lokal hauptsächlich IgA produziert. IgG und IgM sind jedoch auch in den lymphoiden Geweben zu finden (JEURISSEN et al. 1989). Die lymphoiden Elemente des MALTs liegen entweder organisiert vor und bilden mukosale Lymphfollikel, welche für die Induktionsphase der Immunantwort verantwortlich sind oder unorganisiert diffus, wobei sich Leukozyten im ganzen Epithel und dessen Lamina propria verteilen und die Effektorstelle bilden (MONTILLA 2004). Dadurch, dass Hühner keine Lymphknoten wie Säugetiere besitzen, ist das MALT beim Huhn sehr umfangreich (JEURISSEN et al. 1989). Lokale Immunität kann anhand des IgA Gehaltes in Tränenflüssigkeit, Trachealspülungen und Gallenflüssigkeit nach intranasaler Verabreichung oder Augentropfen von ND-Lebendimpfstoffen eingeschätzt werden. Die IgA-Antikörper 29 sind verantwortlich für die Neutralisierung freier Virionen (RUSSELL u. EZEIFEKA 1995; PEROZO et al. 2008). Auch IgM-Antikörper werden lokal produziert. IgG findet sich gleichfalls lokal, eine Transsudation aus dem Blut kann hier als mögliche Ursache gesehen werden (AL-GARIB et al. 2003). Eine Messung der lokalen Immunität kann auch durch die Bestimmung lokaler Immunzellpopulationen erfolgen (DUMRONGSOONTORNCHAI 1999). Nach Newcastle Disease Impfung/Infektion finden sich vermehrt lokale T- und BZellpopulationen und Makrophagen im oberen Respirationstrakt, welche eine lokale Protektion gegen die ND erzeugen (RUSSELL et al. 1997; DUMRONGSOONTORNCHAI 1999). 2.3.5.1 Lokale Immunität im Bereich der Harderschen Drüse Die Hardersche Drüse (Glandula membranae nictitans) oder auch Nickhautdrüse sitzt hinter beiden Augäpfeln retrobulbär ventral und medial zum interorbitalen Septum und produziert hauptsächlich Tränenflüssigkeit sowie ein mukoides lipidhaltiges Sekret, welches die Nickhaut und Kornea befeuchtet und sauber hält und zudem auch immunogene Faktoren enthält (BUZZELL 1996). Beim Huhn ist die Drüse verhältnismäßig groß, exokrin und tubuloazinös. Sie selbst besitzt kein Schleimhautgewebe und keine spezifisch funktionellen Abwehrmechanismen wie ein dichtes Lymphepithel, hochendotheliale Venolen oder follikelartige Ansammlungen von intraepithelialen Lymphozyten (BANG u. BANG 1968). B-, T-Lymphozyten sowie Plasmazellen befinden sich im interstitiellen Gewebe. Das IgA-haltige Sekret der Harderschen Drüse gelangt in den Bereich des Augenlids und von dort aus über den Tränennasenkanal in den oberen Respirationstrakt. Daher sind die Hardersche Drüse sowie auch das Konjunktiva-assoziierte Lymphgewebe (CALT) beim Huhn funktionelle Organe der lokalen Immunität des Respirationstrakts, obwohl sie anatomisch nicht dazugehören (SMIALEK et al. 2011). Bei einer NDV Infektion steigen B- und T-Zellpopulationen in der Harderschen Drüse an (RUSSELL et al. 1997), wobei der höchste Anstieg bei CD8+ Zellen zu verzeichnen ist. Bei lokaler 30 Virusreplikation einer ND steigen lakrimale Immunglobuline aller Klassen an (RUSSELL 1993). 2.3.5.2 Lokale Immunität im Bereich des Konjunktiva-assoziierten lymphoiden Gewebes/Conjunctiva-associated lymphoid tissue (CALT) Das Konjunktiva-assoziierte Lymphgewebe befindet sich in den Falten des oberen und unteren Augenlids und bildet zusammen mit der Harderschen Drüse die wichtigsten paraokularen Immunstrukturen (VAN GINKEL et al. 2012). Eine Woche nach dem Schlupf ist im unteren Augenlid eine heterogene Lymphoyzytenpopulation mit Lymphoblasten und Makrophagen zu finden. Nach 4 Wochen befinden sich dort Plasmazellen und B-Zell Keimzentren (FIX u. ARP 1991). Im erwachsenen Vogel befinden sich B-Zellen, T-Helfer- und zytotoxische T-Zellen mit einer ähnlichen Verteilung wie die Lymphozytenpopulationen in der Harderschen Drüse im CALT (VAN GINKEL et al. 2012). T-Lymphozyten umranden die B-Zellreichen Keimzentren, wobei CD3+ T-Lymphozyten in der vierten Lebenswoche dominieren. CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten-Konzentrationen steigen ab der ersten bis zur vierten Lebenswoche an, was die Spekulation zulässt, dass das CALT circa vier Wochen zur Reifung braucht (VAN GINKEL et al. 2012). 2.3.5.3 Lokale Immunität im Bereich der Trachea Ein weiterer Bestandteil der lokalen Immunität des oberen Respirationstraktes ist die Schleimhaut der Trachea, welche allerdings kein funktionelles Lymphgewebe besitzt. In zwei Wochen alten Hühnern befinden sich IgM+, IgG+ und IgA+ Plasmazellen unterhalb des Trachealepithels (JEURISSEN et al. 1989). Die Schleimhaut reagiert im Falle einer experimentellen Mykoplasma gallisepticum-Infektion mit B- Zellinfiltrationen und der Entstehung von sekundären Lymphfollikeln aus B-Zellen, welche mit CD4+ Zellen umrandet sind (GAUNSON et al. 2006). Bei einer Newcastle 31 Disease verliert das Epithel seine Zilien und Lymphozyten sowie heterophile Granulozyten wandern in die Epithelschicht ein (KOTANI et al. 1987). 2.3.5.4 Bronchus-assoziiertes Lymphgewebe/Bronchus Associated Lymphoid Tissue (BALT) Bienenstock et al. beschrieben 1973 das erste Mal organisierte lymphoide Zellansammlungen und Strukturen in der Bronchialschleimhaut von Hühnerlungen (BIENENSTOCK et al. 1973), welche sich an den Verbindungen von primären zu sekundären Bronchien sowie an den Ostien zu den Luftsäcken befinden (MYERS u. ARP 1987; VAN ALSTINE u. ARP 1988; FAGERLAND u. ARP 1993b). Das Bronchus-assoziierte lymphoide Gewebe (BALT) besteht aus lymphozytären Ansammlungen, welche durch eine deutliche Lymph-Epithelzellschicht, dem sogenannten Lymphothel oder Follikel-assoziiertem Epithel (FAE), abgedeckt sind (FAGERLAND u. ARP 1993a). In sechs bis acht Wochen alten Hühnern befinden sich Keimzentren in den meisten Lymphfollikeln des BALTs sowie Plasmazellen, Makrophagen und heterophile Granulozyten (FAGERLAND u. ARP 1993b). 2.3.5.5 Lokale Immunität im Bereich der Zäkaltonsille Die Zäkaltonsille ist Teil des darmassoziierten lymphatischen Gewebes (GALT) (LILLEHOJ u. TROUT 1996). Sie besteht aus großen lymphoiden Zellansammlungen in der Zellwand der Zäka an ihrem Eingang in das Rektum (CASTELEYN et al. 2010). Die Zellansammlungen bilden tonsillenartige Einheiten, welche durch bindegewebige Septen voneinander getrennt sind, mit einer zentral gelegenen Furche, welche sich in Krypten aufzweigt und direkten Kontakt zum Lumen des Zäkums hat. Die Krypten besitzen auf ihrer Oberfläche ein hochprismatisches Epithel mit integrierten M-Zellen. Die schon embryonal vorhandenen Zäkaltonsillen entwickeln sich direkt nach dem Schlupf. Am ersten Tag können bereits B- und TLymphozyten in der Zäkaltonsille nachgewiesen werden, wobei T-Lymphozyten 32 überwiegen. Nach sechs Wochen steigt die Anzahl der B-Lymphozyten signifikant gegenüber den T-Lymphozyten an (GOMEZ DEL MORAL et al. 1998). Die genaue Funktion der Zäkaltonsillen ist nicht geklärt. Nach Kitawa et al. (1998) wird vermutet, dass sie zur Neutralisierung der Antigene beitragen, welche durch den Harnsäurereflux in das Zäkum getragen werden (KITAGAWA et al. 1998). Lerner et al. (1971) spekulieren hingegen, dass die Zäkaltonsille Bursa cloacalisähnliche Eigenschaften besitzt, da Hühner bei einer Zerstörung der Bursa immer noch spezifische Antikörper bilden können (LERNER et al. 1971). Die Zäkaltonsille könnte daher eine Rolle bei der Differenzierung von Stammzellen zu funktionalen BLymphozyten spielen (BEFUS et al. 1980; CASTELEYN et al. 2010). Im Falle einer experimentellen Newcastle Disease Infektion konnten Gohm et al. vier Wochen nach Infektion Blutungen und Nekrosen in der Zäkaltonsille feststellen (GOHM et al. 2000). Bei einer intranasalen Newcastle Disease Impfung in SPFHühnern in Kombination mit immunstimulatorischen CpG-Oligodeoxynucleotiden zeigten Zhang et al. signifikant höhere IgA-Antikörpergehalte in intestinalen Waschungen und Kot von geimpften Tieren im Vergleich zu ungeimpften Tieren (ZHANG et al. 2008). Nach einer Newcastle Disease Augentropfenimpfung zeigte sich eine signifikante Erhöhung von IgG+ Zellen im Vergleich zu IgA+ und IgM+ Zellen in Zäkaltonsillen 14 und 28 Tage nach der Impfung (NASRIN et al. 2013). Da die Zäkaltonsillen einen Hauptanteil des GALT darstellen, einen hohen Anteil an Lymphozyten besitzen (JANARDHANA et al. 2009) und sich bei einer Newcastle Disease im Krankheitsgeschehen verändert zeigen, könnten sie eine wesentliche Rolle in der Bildung der lokalen Immunität gegen NDV spielen. 33 3 Fragestellung der eigenen Untersuchung Die Interferenz mit maternalen Antikörpern ist oft von entscheidender Bedeutung für einen Impferfolg einer Lebendvakzine gegen die Newcastle Disease (ND). Rekombinante Impfstoffe wie ein rekombinantes Putenherpesvirus, welches das FProtein des NDV exprimiert, werden nicht durch maternale Antikörper gegen die ND in der Ausbildung einer Immunität inhibiert und bieten daher eine interessante Alternative zu herkömmlichen ND Lebendimpfstoffen. Die Möglichkeit zur in-ovo Applikation der bivalenten Vakzine bietet zusätzlich Vorteile. rHVT-ND erzeugt geringere Antikörpertiter als eine herkömmliche Lebendvakzine, bietet aber Schutz vor einer ND Infektion. Eine Kombination von rHVT-ND mit einer Lebendvakzine erzeugt eine länger anhaltende klinische Protektion als die alleinige Verabreichung einer Lebendvakzine (PALYA et al. 2008). Die genauen Mechanismen dieser Protektion sind jedoch nicht geklärt. Ob rHVT-ND lokale Immunmechanismen im Bereich des oberen Respirationstrakts, der Haupteingangspforte von NDV induziert, wie sie bei der Verabreichung von Lebendimpfstoffen beobachtet werden, ist unklar, und ob sich eine Kombination von rHVT-ND und einem Lebendimpfstoff eventuell synergistisch oder additiv auch auf diesen Bereich auswirkt, ist nicht bekannt. In dieser Studie wurde die Wirkung eines rekombinanten Putenherpesvirus gegen die ND (rHVT-ND) alleine und in Kombination mit einer ND-Lebendvakzine auf die lokale und systemische Immunität sowie auf die lokale Virusausscheidung des Respirationstrakts untersucht. Es wurden zwei Tierversuche mit spezifisch pathogen-freien Hühnern und kommerziellen Broilern durchgeführt, um diesbezüglich eine Nutzungslinienvergleichende Aussage treffen zu können. Die lokale Virusausscheidung, die Stimulation von lokalen Immunzellpopulationen und die Höhe des serologischen AntiNDV Antikörpertiters wurden nach Impfung und Belastungsinfektion untersucht. Tund B-Immunzellpopulationen sowie Makrophagen wurden in Harderscher Drüse, der Konjunktiva, der Lunge und der Zäkaltonsille an verschiedenen Tagen nach Impfung dargestellt. Die Virusausscheidung und -übertragung wurden nach einer 34 Challenge mit dem lentogenen APMV-1 Stamm LaSota durch Real-Time PCR in Trachea und im zweiten Versuch zusätzlich in der Kloake detektiert. Ebenfalls wurden im zweiten Tränenflüssigkeit Versuch sowie der Anti-ND Milzzellen- Lymphozytenpopulationen untersucht. und IgG-Antikörpergehalt periphere Blut- in der und 35 4 Material und Methoden 4.1 Tiere Es wurden 220 Eier (VALO SPF flock Nos. 10704) von SPF-Hühnern vom Legetyp der Lohmann Tierzucht GmBH (Cuxhaven) bezogen. Diese wurden vom ersten bis zum 17. Tag bei 37,8-38,0° C und 50 – 60% Luftfeuchtigkeit in einem Brutschrank (Firma Grumbach, Asslar) vorbebrütet. Davon schlüpften 171 Küken, nachdem sie drei Tage zuvor in den klinikeigenen Schlupfbrüter verbracht wurden, in der Klinik für Geflügel, bei 37°C Temperatur und 70 % Luftfeuchtigkeit. 100 nicht geimpfte kommerzielle Broiler-Eintagsküken vom Ross-308 Typ (Weser Ems Brüterei, Rechterfeld) beiden Geschlechts wurden in die Stallungen der Klinik für Geflügel verbracht. Die SPF-Hühner wurden mit einem Alleinfuttermittel für Legehennen „allmash L“ (Firma Deuka) gefüttert. Die Broiler bekamen Landkornstarter (Firma Deuka) in den ersten Tagen, danach Landkornmast (Firma Deuka). Futter und Wasser wurden ad libitum bereitgestellt. 4.2 Impfstoffe Für den ersten Versuch wurden rHVT-ND (Innovax®-ND, 4000 Dosen, Lot-Nr.: 91790017, Verfallsdatum: 05-2012) und eine auf dem FC126-Stamm basierende HVT Vakzine (Nobilis® Marexine CA 126, 1000 Dosen, Lot-Nr: A267B, Verfallsdatum: 04-2012) von der Firma MSD Tiergesundheit (Boxmeer, Niederlande) zur Verfügung gestellt, in flüssigem Stickstoff transportiert und gelagert. rHVT-ND wurde dann in einem vorgewärmten Wasserbad ca. 95 sec. bei 25°C aufgetaut und so mit Nobilis Diluent CA (MSD Animal Health, 200 ml, Lot: LC 140) verdünnt, dass eine Dosis 200µl enstprach. Eine Dosis enthielt 6180 Plaque Forming Units (PFU/Dose (NDV-F)). Der Impfstoff Clone 30 wurde in 35 Millilitern eines wässrigen Lösungsmittels (für 1000 Dosen, Diluent Oculo Nasal, B408A01, Verfallsdatum 06-2013, MSD 36 Tiergesundheit) verdünnt. Ein Tropfen entsprach einer Impfdosis von mind. 6,0 log 10 Embryo-infektiöse Dosis 50 % (EID50). Der APMV-1 Stamm LaSota (Charge: A002D; Code:027908, MSD Tiergesundheit) fungierte als Belastungsinfektionsvirus und wurde ebenfalls mit einem wässrigen Lösungsmittel (für 1000 Dosen, Diluent Oculo Nasal, B408A01, Verfallsdatum 06-2013, (MSD Tiergesundheit) verdünnt (1 Dosis: mind. 6,0 log10 EID50). Im zweiten Versuch wurde rHVT-ND (Innovax®-ND, 4000 Dosen, Lot-Nr.: 91790024, Verfallsdatum: 01-2013 (MSD Tiergesundheit) mit 6945 PFU/Dose (200 µl) eingesetzt. Der Titrationsstandard HVT CA 126 (Nobilis® Marexine CA 126, 1000 Dosen, Lot-Nr.: A267B, MSD Tiergesundheit) wurde als Kontrolle bei der rHVT-NDImpftitrierung verwendet. Der APMV-1 Stamm Lasota (Nobilis® ND LaSota, 1000 doses, Lot-Nr.: A002D, MSD Tiergesundheit) fungierte mit einer Dosis von mind. 6,0 log10 EID50 als Belastungsvirus. ND Clone 30 (Nobilis® ND Clone 30, 1000 Dosen, MSD Tiergesundheit) wurde mit einer Dosis (mind. 6,0 log10 EID50, ein Augentropfen pro Tier) als Lebendvakzine per Augentropfen verwendet. 4.2.1 Titration des Impfvirus Zur Bestätigung des Titers und Quantifizierung des Virusgehalts wurde rHVT-ND auf sekundären Hühnerembryofibroblasten (0,3 -0,4 x 106 Zellen/ml, M6B8 (MSD Animal Health)) Medium (199/F10, MSD Animal Health/Medium+0,1% NPPT (v/v) (Neomycin, Polymyxin, Pimafucin, Tylosin)) mit 1% bovinem Kälberserum (FCS) als Erhaltungsmedium und 5% im Nährmedium in Polystyrene Zellkulturplatten (Corning Cell Culture Dish, 430196, mit 2 mm Zählgitter oder Costar, cat. No. 3060 mit 2mm Zählgitter) angezüchtet. Der Virusgehalt wurde im Plaquetest nach serienmäßiger Verdünnung der Ausgangsimpfvirussupension unter einem flüssigen OverlayMedium (M6B8 (MSD Animal Health) zweimal konzentriert mit 0,2% NPPT plus Bactoagar 2,25 % und 5% NaHCO3) bestimmt. 24 Stunden nach der Infektion wurde das Medium gewechselt und das Agaroverlay für drei Tage hinzugefügt. Die Platten wurden jeden Tag kontrolliert und bei Ablösen der Fibroblasten sofort für eine Stunde mit 96% Ethanol fixiert und für 24 Stunden bei Raumtemperatur getrocknet. Jede 37 infizierte Zelle ruft im Zellmonolayer einen Plaque hervor. Die Anzahl der Plaques wurde gezählt, zusätzlich wurde ein Titrationsstandard mit bekanntem Titer, hier mit dem Marekimpfstoff Marexine CA, durchgeführt. Die Titrationen werden für zwei Verdünnungen (1:50 und 1:500) jeweils im Doppelansatz ausgeführt. Der Titer wird als Plaque Forming Units pro Milliliter (PFU/ml) angegeben und folgendermaßen kalkuliert: Titer pro Milliliter (log10) = Durchschnitt gezählter Plaques x 4.2.1.1 x rHVT-Detektion mittels Immunfluoreszenztest Replizierendes rHVT-ND wurde am 10. Tag nach rHVT-ND Impfung aus Milzzellen in Cokultivierung mit Hühnerembryofibroblasten nach dem oben genannten Protokoll von MSD Tiergesundheit nachgewiesen. Sekundäre Hühnerembryofibroblasten wurden mit 37° C warmen, 1% FCS-haltigen M6B8 (MSD Animal Health) Erhaltungsmedium in Polystyrene Zellkulturplatten (Corning Cell Culture Dish, 430196, mit 2 mm Zählgitter oder Costar, cat. No. 3060 mit 2mm Zählgitter) für 24 Stunden mit Milzzellen der geimpften Tiere cokultiviert. Bei der Milzentnahme wurde die Milzkapsel entfernt, die Milz mechanisch zerkleinert und zertrennt, mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS 0,01M, Na2HPO4 2,9 g, NaCl 8g, KCl 2g, KH2PO4 0,2 g, pH 7,4) durch einen 100 µm Filter (BD Falcon, Heidelberg) in ein Falcon Tube (50 ml Röhre, 114 x28 mm, PP, lot. 3040401, Sarstedt AG & Co, Nümbrecht, Deutschland) überführt und in Zellkulturmedium M6B8 (MSD Animal Health) mit 5%FCS gelöst. Anschließend wurden die restlichen Zellen mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS 0,01 s.o.) aus dem Filter gewaschen. Dann wurden die Zellen für 10 Minuten bei 1500 rpm und 4°C zentrifugiert, der Überstand verworfen, das Zellpellet in zwei Milliliter Medium (M6B8 (MSD Animal Health, 5% FCS)) resuspendiert und eine Zellkonzentration von 5 x 106 Zellen pro Milliliter hergestellt (Neubauer Zählkammer). Ein Milliliter dieser Zelllösung (5 x 106 Zellen) wurde dann auf die Platten mit konfluenten Monolayern aus sekundären Hühnerembryofibroblasten, welche fünf 38 Milliliter frisches Erhaltungsmedium (1% FCS, 37°C) enthielten, gegeben. Die Zellen wurden drei Tage unter warmen Erhaltungsmedium (37° C, 1% FCS) belassen und jeden Tag kontrolliert. Nach drei Tagen wurden die Plaques nach einstündiger Ethanol-Fixierung (96%) und 24-stündiger Raumtemperatur-Lufttrocknung mit einem monoklonalen Antikörper gegen das F-Protein (MCA NDV-F, lot. MAB040226DM, exp. MAB-0320-102D, MSD Tiergesundheit) und einem fluoreszierenden Zweitantikörper (Alexa Fluor ® 488 goat anti-mouse IgG (H+L), Lot: 861163, InvitrogenTM Eugene, Oregon, USA) sichtbar gemacht. Anschließend wurde unter einem Inversmikroskop bei 25-facher Vergrößerung ausgezählt (Inverses Mikroskop IM 35, Carl Zeiss, Göttingen, Deutschland). Zytopathische Effekte (Plaques) wurden mikroskopisch detektiert und die Anzahl der positiven immunfluoreszierenden Plaques gezählt. Die positiven Plaques wurden drei Tage nach Inkubation gezählt, die Durchschnittsanzahl der Plaque Forming Units (PFU) pro Tier und pro Tiergruppe angegeben (Daten nicht gezeigt). 4.3 Versuchsaufbau Es wurden zwei Tierversuche mit SPF-Hühnern und kommerziellen Broilern durchgeführt (Abbildungen 1 und 2). Im ersten Versuch wurden Eier von SPFHühnern in der Klinik für Geflügel in Hannover ausgebrütet. Die Tiere wurden per Zufall in vier verschiedene Gruppen eingeteilt und gegen die Newcastle Disease geimpft. Die erste Gruppe wurde ungeimpft als Kontrollgruppe belassen. Der dritten und vierten Gruppe wurde die ND-Lebendvakzine per Augentropfen verabreicht. rHVT-ND wurde der zweiten sowie vierten Gruppe subkutan im Nackenbereich appliziert. Am 10. und 35. Tag nach der Impfung wurden 7 Tiere pro Gruppe durch Kopfschlag betäubt, durch Blutentzug getötet und anschließend seziert. HVT wurde am 10. Tag nach Impfung durch Co-Kultivierung der Milzellen in Hühnerembryofibroblasten detektiert. Hardersche Drüse, Konjunktiva, Trachea, Lunge und Zäkaltonsille wurden zur immunhistochemischen Analyse auf verschiedene Immunzellpopulationen entnommen. Ebenfalls wurden Proben zur histologischen Untersuchung von Lunge, Trachea und Harderschen Drüsen am 10. 39 Tag entnommen. Die Belastungsinfektion fand am 35. Tag nach dem Schlupf mit einer Impfdosis mit dem APMV-1 Stamm LaSota statt. Die Tiere (n=5-10) wurden zur Belastungsinfektion und im Zeitraum danach in Isolationseinheiten vom HorsfallBauer Typ verbracht und gehalten, die restlichen Tiere (n=5) verblieben ohne Belastungsinfektion in den Ställen. Am 35. Tag nach der Impfung vor der APMV-1 Stamm LaSota Inokulation wurden Trachealtupferproben entnommen (7/Gruppe), pro Gruppe zusammengelegt und auf APMV-1 mittels qRT-PCR untersucht. Am 36. und 40. Tag nach dem Schlupf (einen und fünf Tage nach der APMV-1 Stamm LaSota Challenge) wurden Kontaktsentineltiere (5/Gruppe) zu den belastungsinfizierten Tieren hinzugesetzt. Die zweite Gruppe Sentinels wurde fünf Tage nach Belastungsinfektion für fünf Tage hinzugesetzt, nachdem die erste entfernt worden war. Die Tiere wurden jeden Tag auf klinische Symptome untersucht, Trachealtupfer wurden am 3., 5., 7. und 10. Tag nach Challenge gesammelt, um NDV durch qRT-PCR zu detektieren. Serumproben wurden am 36. und am 43. Tag (sowie im zweiten Versuch am 46. Tag von nicht belastungsinfizierten Tieren) nach dem Schlupf entnommen (5-7/Gruppe), um sie mittels ELISA und HAH-Test auf NDV spezifische Antikörper zu untersuchen. Am 46. Tag nach der Impfung wurden alle Vögel durch Kopfschlag betäubt, durch Blutentzug getötet und seziert. Der zweite Versuch hatte neben einigen Abweichungen den gleichen Versuchsaufbau wie der erste und wurde mit kommerziellen Broilern durchgeführt (Abb. 2). Zusätzlich zum ersten Versuch wurden anstelle von sieben Tieren fünf Tiere pro Gruppe eingesetzt. Am 35. Tag nach der Impfung wurden drei bis vier Vögel pro Gruppe getötet und seziert. Auch wurden Milz und Blutlymphozyten am sechsten, 11. und 36. Tag des Versuchs entnommen und auf verschiedene Immunzellpopulationen wie bei der Immunhistochemie in der Durchflusszytometrie untersucht. Tränenflüssigkeitsproben wurden am Tag der Challenge entnommen (35 Tage nach der Impfung), welche im ELISA auf APMV-1 Antikörper untersucht wurden. Die PCR Untersuchung auf rHVT-ND fand ebenfalls nur im zweiten Versuch statt und wurde mit Milzzellen vom 36. Versuchstag durchgeführt. 40 *= zu den grau-unterlegten Zeitpunkten befanden sich die Tiere in Isolationseinheiten vom Horsfall-Bauer Typ Abbildung 1: Versuchsdurchführung des ersten Versuchs 41 *= zu den grau-unterlegten Zeitpunkten befanden sich die Tiere in Isolationseinheiten vom Horsfall-Bauer Typ =Tränenflüssigkeitsentnahme zur Anti-NDV Bestimmung =Milzentnahme zur durchflusszytometrischen Analyse von Splenozyten =Blutentnahme zur durchflusszytometrischen Analyse Blutleukozyten Abbildung 2: Versuchsdurchführung des zweiten Versuchs von peripheren 42 4.4 Untersuchungsmethoden 4.4.1 Serologische Untersuchungen 4.4.1.1 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Zur Bestimmung des Antikörpertiters wurden folgende, kommerziell erhältliche TestKits von BioCheck® („(NDV) Newcastle Disease Antibody Test Kit“, Product Code: CK 116, Smart Veterinary Diagnostics, Niederlande) und von IDEXX Laboratories®, Inc. (IDEXX® FlockChek, „Newcastle Disease Virus Antibody Test Kit“, Product Code 5080.00, Maine, USA) untereinander verglichen. Das zu untersuchende Serum wurde 1: 500 verdünnt und mit den mitgelieferten Positiv- und Negativkontrollen in den Vertiefungen der mitgelieferten Mikrotiterplatten für 30 Minuten bei Raumtemperatur belassen, sodass die NDV Antikörper an die mit Virusantigen beschichteten Wellböden binden konnten. Nach den folgenden Waschschritten wurde das Konjugat (BioCheck®: Anti-Huhn: Konjugiert mit Alkalischer Phosphatase in Tris-Puffer mit Proteinstabilisatoren, IDEXX®: Ziege Anti-Huhn, konjugiert mit Meerrettichperoxidase und Zusatz von Proteinstabilisatoren) für 30 Minuten bei Raumtemperatur in den Vertiefungen der Mikrotiterplatten belassen. Nach erneuten Waschschritten wurde das TMB (3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin)-Substrat für 15 Minuten bei Raumtemperatur zugegeben und anschließend eine Stop-Lösung (Natriumhydroxid in Diaethanolaminpuffer) zugegeben. Der entstandene Farbumschlag wurde mittels OD-Wertmessung bei einer Wellenlänge von 405 nm (BioCeck®) und 650 nm (IDEXX®) mit dem Spektrometer Tecan Sunrise (Tecan Group AG, Österreich) gemessen. Zur Auswertung wurde das Programm Magellan TM (V6.5, Tecan Austria GmbH) genutzt. Die Titer wurden folgendermaßen berechnet: Log10Titer = 1,0(Log(P/PK)+3,52 (BioCheck®)*1 Log10Titer = 1,09(log10S/P)+3,36 (IDEXX®)*2 Proben mit Titer ≥ 396 (BioCheck®) und ≥ 1159 (IDEXX®) wurden als positiv betrachtet. *1 = P = Probe; 2 * = S = Probe; PK = Positivkontrolle = BioCheck® P= Positivkontrolle =IDEXX® 43 4.4.1.2 Hämagglutinations-Hemmungstest Durch die Neutralisation der Viren durch NDV-Antikörper kann die durch APMV-1 verursachte Erythrozytenagglutination gehemmt werden und somit der NDVAntikörpergehalt in Seren nach Erstellen einer Verdünnungsreihe (log 2-Verdünnung) bestimmt werden. Der Hämagglutinations-Hemmungstest (HAH-Test) wurde nach den Richtlinien der Welttiergesundheitsorganisation (OIE 2008) in Mikrotiterplatten mit rundem Boden durchgeführt. Anstelle von phosphatgepufferter Salzlösung wurde sterile Kochsalzlösung (9 g/L) verwendet. Der HAH-Test wurde mit einer Antigenkonzentration von vier hämagglutinierenden Einheiten (HAU) des APMV-1 Stammes LaSota durchgeführt. Die Serumproben wurden mit der Antigenlösung in Kochsalzlösung 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde eine 1%ige Hühnererythrozyten-Suspension für 30 Minuten in jede Reaktionsvertiefung gegeben. Als Hemmtiter gilt die höchste Antiserumverdünnung, die vier Viruseinheiten vollständig hemmt. Die Nummer der letzten Vertiefung, bei dem eine Hämagglutinationshemmung vorliegt, ist die Titerkennzahl. Der Titer ist dargestellt als 2er Potenz. 4.4.2 Klinischer Score Der klinische Score für respiratorische klinische Symptome wurde nach dem Scoring System von Jones et al. (JONES et al. 1992) durchgeführt. Er wurde jeden Tag für 10 Tage nach der Belastungsinfektion erhoben. Score 0 = keine klinischen Symptome; Score 1 = klares nasales Exsudat; Score 2 = trübes nasales Exsudat; Score 3 = Schwellung des Sinus Infraorbitalis. 4.4.3 Histologische Untersuchungen Histologische Proben von Harderscher Drüse, Trachea und Lunge wurden sofort nach ihrer Entnahme in 4 %igem gepuffertem Formalin fixiert, in Paraffinwachs eingebettet und nach (DUMRONGSOONTORNCHAI herkömmlichen 1999). Hierbei wurden Methoden die Proben bearbeitet in einer 44 aufsteigenden Alkoholreihe (Isopropanol 50 %, 70 %, 80%, 90%, 100% für jeweils 60 min 2x, Isopropanol/Azeton 1:1 für 90 min, Aceton für 60 min, 2x) entwässert und anschließend in Paraffinblöcke eingebettet. Die Paraffinblöcke wurden über Nacht im Kühlschrank (4°C) gelagert und anschließend mit einem Mikrotom (Model 2040 Autocut (Reichert-Jung, Cambridge Instrument GmbH, Nußloch) mit einer Schnittdicke von 2 µm geschnitten. Die Gewebeschnitte wurden in ein 40°C warmes Wasserbad überführt und anschließend von dort aus auf mit Serum-Glycerin (Waldeck GmbH, Division Chroma, Münster, Deutschland) beschichtete Glasobjektträger verbracht. Im Anschluss erfolgte eine Trocknung für eine Stunde bei Raumtemperatur. Anschließend wurden die Schnitte mittels Hämatoxylin-Eosin (H&E) gefärbt. Hierbei wurde zuerst eine Deparaffinierung und Rehydratation der Schnitte mit absteigender Alkoholreihe durchgeführt. Anschließend wurden die Objektträger in Hämatoxylin- und Eosin (1%)- Lösungen gefärbt. Die Schnitte wurden danach mit DePEx Mounting Medium (BDH Laboratory Supplies, England) überschichtet und mit einem Deckglas abgedeckt. Danach erfolgte die mikroskopische Begutachtung und wurde nach folgendem Score, angelehnt an die histopathologischen Veränderung nach NDV-Infektion (CATTOLI et al. 2011), bewertet: Score 0 - keine Veränderung; Score 1 - milde lymphozytäre oder heterophilzellige Infiltrationen in Epithelschicht oder lamina propria und ein oder mehrere lymphoide Zellansammlungen; Score 2 - massive Infiltration von Entzündungszellen in Epithelschicht oder Lamina propria, fokal oder diffus, Hypertrophie von mukösen Drüsen; Score 3 - massive fokale und diffuse Infiltration von Entzündungszellen im Epithel oder in der Lamina propria und Ablösung des zilientragenden Epithels. 4.4.4 Immunhistochemische Untersuchungen Hardersche Drüse, Konjunktiva, Trachea, Lunge und Zäkaltonsille wurden den Tieren während der Sektion entnommen, mit Einbettmedium für Gefrierschnitte (Jung, Leica Microsystems Nussloch GmBH, Heidelberg, Batch-Nr.:03655539) auf herkömmlichem Papier fixiert, in flüssigem Stickstoff gefroren und anschließend bei 45 -70 °C gelagert. Die tiefgefrorenen Organe wurden mit einem Kryostaten (Model 2800 Frigocut (Reichert-Jung, Leica GmbH, Beasheim)) mit einer Schnittdicke von 5 µm bei -22°C geschnitten und auf Glasobjektträger (Thermo Scientific, Superfrost Ultra Plus ®, Objektträger, geschliffen, Braunschweig, Deutschland) überführt. Die Kryostatschnitte wurden in einem Exsikkator bei Raumtemperatur für 24 Stunden getrocknet. Danach wurden die Schnitte in -20°C kaltem Aceton für 10 Minuten bei Raumtemperatur fixiert und bei Raumtemperatur getrocknet. Diese Azeton-fixierten Schnitte können für 6 Monate in einem Exsikkator bei Raumtemperatur gelagert oder direkt bearbeitet werden. Zwischen jedem der nun folgenden Arbeitsschritte erfolgte eine kurze (10 Sekunden) und eine lange Waschung (fünf Minuten) der Schnitte mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, 0,01M, Na2HPO4 2,9 g, NaCl 8g, KCl 2g, KH2PO4 0,2 g, pH 7,4) in einer Glaskammer. Pro Objekträger wurden 500 µl der jeweiligen Lösungen aufgetragen. Nach dem Fixierungsschritt wurden alle Schnitte zur Inaktivierung von endogenen Peroxidaseaktivitäten der Organe bei 0,03 % H2O2 für 15 Minuten in einer Glasküvette belassen. Danach wurde ein Blocking Antikörper (Pferdeserum in PBS verdünnt, Vectastain ®, Vector Laboratories, Inc., Burlingame. USA plus Avidin D) für 20 Minuten auf den Schnitten belassen, um freie Proteinstrukturen, welche unspezifische Bindungen hervorrufen können, zu blockieren. Nach diesem Schritt erfolgte die Zugabe der primären Antikörper, welche für eine Stunde bei 37°C inkubiert wurden. Die Erstantikörper wurden von der Firma Southern Biotech (Alabama, USA) über Biozol Diagnostica Vertrieb GmbH (Eching, Deutschland) bezogen: CD4+ ,CD8+ (T-Zellen), BU-1+ (unreife und reife B-Zellen, keine Plasmazellen (HOUSSAINT et al. 1989) , KUL01+ (Hühner Monozyten und Makrophagen sowie interdigitierende dendritische Zellen und aktivierte Mikrogliazellen) und IgA+ Zellen wurden mit den in Tabelle 3 gelisteten primären Antikörpern markiert (Tabelle 3). 46 Tabelle 3: Antikörper zur immunhistochemischen Detektion von verschiedenen Immunzellpopulationen Antikörper Cat.No.* µg/ml Mouse Anti-Chicken CD 4 8210-01 1 Mouse Anti-Chicken CD 8β 8280-01 1 Mouse Anti-Chicken BU-1 8395-01 1 Mouse Anti-Chicken KUL01 8420-01 1 Mouse Anti-Chicken IgA 8330-01 0,05 (*=Cat.No., Southern Biotechnology Associates, Inc. (Alabama, USA)) Alle Antikörper außer Mouse Anti-Chicken IgA wurden 1:500 in PBS verdünnt und mit Biotin versetzt (Vectastain ®, Vector Laboratories, Inc., Burlingame. USA). Mouse Anti-Chicken IgA wurde 1:10000 in PBS verdünnt. Nach einem Waschschritt wurde der biotinylierte Zweitantikörper für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf die Objektträger gegeben. Als Zweitantikörper wurde ein biotinylierter Antikörper aus dem Vectastain ABC Kit (Mouse IgG, PK-6102, Vectastain ®, Vector Laboratories, Inc., Burlingame, USA) verwendet. Danach wurde das ABC Konjugat für 30 Minunten auf die Schnitte gegeben. Dieses besteht aus einem Avidin und biotinyliertem Enzymkomplex (Horseradisch Peroxidase=HRP), welcher sich durch die hohe Affinität von Avidin zu Biotin irreversibel an den Zweitantikörper bindet. Die Färbung erfolgte mittels DAB (3,3'-Diaminobenzidin) als Enzymsubstrat, welches nach Reaktion mit der HRP des Enzym-Avidinkomplexes ein braunes Endprodukt erzeugt und somit positive Zellen braun darstellt. Anschließend wurde noch eine Gegenfärbung mit Hämatoxylin für 10 Sekunden durchgeführt und die Schnitte unter fließendem Wasser für zwei Minuten gespült. Dann wurden die Objektträger mit drei bis vier Tropfen eines wässrigen Eindeckmittels (Aquatex ®, Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) und Deckgläßchen (24 x 60 Millimeter) abgedeckt und für einen Tag zum Trocknen bei Raumtemperatur belassen. Die positiv markierten Zellen wurden bei 400-facher Vergrößerung in drei bis fünf Feldern mikroskopisch ausgezählt und ein Mittelwert pro Tier gebildet. Aus den 47 Einzelwerten/Tier wurde ein Mittelwert pro Gruppe gebildet, welche miteinander verglichen wurden. Bei Zellpopulationsbestimmungen in Konjunktiva-assoziertem lymphoiden Gewebe und in der Zäkaltonsille wurde aufgrund der hohen Zellzahlen ein alternatives Scoring System angewandt. Dieses basierte auf dem Score von McDonald und Pilgram (MCDONALD u. PILGRAM 1999), bei dem bei 200-facher mikroskopischer Vergrößerung Zellvorkommen prozentual eingeschätzt wurden: Score 0 = 0% der Zellen im mikroskopischen Sichtfeld sind bräunlich gefärbt; Score 1 = weniger als 25 % der Zellen im mikroskopischen Sichtfeld sind bräunlich gefärbt; Score 2 = weniger als 50 % der Zellen im mikroskopischen Sichtfeld sind bräunlich gefärbt; Score 3 = mehr als 50 % der Zellen im mikroskopischen Sichtfeld sind bräunlich gefärbt. 4.4.5 Virus-RNA Isolierung Gesamt-RNA wurde von Tracheal- und Kloakal-Tupferproben mit peqGOLD TriFast™ (peqlab, Erlangen, Deutschland) entsprechend den Angaben des Herstellers isoliert. Die RNA in den Tupferproben wurde mit Chloroform, Isopropanol und Ethanol (75%) isoliert und anschließend in 30 µl RNAse/DNAse-freiem Wasser gelöst. Die Probe wurde daraufhin mit einem Spektrophotometer auf den RNAGehalt und ihre Qualität untersucht und entweder bei -80°C gelagert oder direkt untersucht. 4.4.6 Nachweis von APMV-1 mittels qRT-PCR (quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) Vermehrungsfähige und inaktive Viruspartikel des APMV-1 können mit der qRT-PCR nachgewiesen werden. Bei der APMV-1 One-Step Real-Time PCR wird eine Gensequenz auf dem Polymerase L-Gen über mehrere Vervielfältigungszyklen amplifiziert und durch Fluoreszenzfärbung sichtbar gemacht. Hierbei ist ein qualitativer und quantitativer Nachweis des Virus möglich. Der Cycle threshold (Ct) gibt den Zyklus an, bei dem die Fluoreszenz signifikant über das 48 Hintergrundfarbsignal steigt. Die Fluoreszenz stammt von sogenannten Reporterfarbstoffen, die mit der Sonde gekoppelt sind. FAM ist der FluoreszenzFarbstoff, welcher synchron sequenzspezifisch mit der Anreicherung der PCRProdukte (142 bp) ansteigt. Nicht korrekt gebundene und daher nicht durch die Polymerase hydrolisierte Sonden werden durch einen sogenannten Quencher (BHQ1) daran gehindert, zu fluoreszieren. Als Reference Dye, also ein weiterer Reporterfarbstoff, welcher ebenfalls eingesetzt wird, um nicht PCR-bedingte Variationen in der Fluoreszenz auszugleichen, wurde ROX eingesetzt. Alle Proben bis auf die Kontrollen wurden im Doppelansatz untersucht. Es wurde das PCR Kit Ambion Ag Path-ID™ One-Step RT-PCR Kit verwendet. Pro PCR-Mix (25 µl) wurden 3 µl RNase-freies Wasser, 12,5 µl Reaktionsmix (2x RTPCR Buffer), 1,875 µl des Vorwärtsprimers (NDF; 10 pmol/µl), 0,625 µl des Rückwärtsprimers (NDR; 10pmol/µl), je 0,5 µl jeder Sonde (NDpro1, NDpro2; 1,25 pmol/µl), 1 µl Enzym-Mix (25x RT-PCR Enzyme Mix) und 5 µl der Proben-RNS verwendet. Die Primersequenzen lauten wie folgt: NDforward primer: GAGCTAATGAACATTCTTTC, Position 12679-12696; NDreverse primer: AATAGGCGGACCACATCTG, Position 12820-12838; ND-probe 1: [FAM]TCATTCTTTATAGAGGTATCTTCATCATA[BHQ1], Position 12738-12766; ND-probe 2: [FAM]TCATACACTATTATGGCGTCATTCTT[BHQ1], Position 12759-12784. Zur APMV-1 rRT-PCR wurde das real time PCR-Gerät Stratagene MX 3005P (Stratagene, La Jolla, CA) eingesetzt. Das Thermalprofil wurde mit einem Zyklus bei 45°C für 10 Minuten, einem Zyklus bei 95°C für weitere 10 Minuten, 40 Zyklen bei 95°C für 15 Sekunden und 55°C für 45 Sekunden eingestellt. Insgesamt wurden 40 Zyklen durchgeführt. Sobald die Fluoreszenz der Probe 0,018 Fluorescence dRn (delta Rn = normalisiertes Reportersignal) überschritt, wurde die Probe als positiv bewertet. 49 4.4.7 PCR (Polymerase Chain Reaction) des Impfvirus Aufgrund technischer Schwierigkeiten beim Nachweis von replizierendem rHVT-ND wurde im zweiten Versuch parallel zum rHVT-Plaquetest eine HVT-PCR durchgeführt. HVT-DNA wurde aus Milzzellen isoliert, welche am 36. Tag nach Schlupf entnommen wurden. Hierbei wurde nach Angaben des Herstellers vorgegangen. Zur Isolation wurde das InnuPrep DNA Minikit (Analytik Jena Bio Solutions, Lot-Nr.: 016-08) benutzt. Die Primer wurden nach Becker et al. (1992) modifiziert (BECKER et al. 1992) und mithilfe des Programms Primer3 (v. 0.4.0; http://primer3.wi.mit.edu/) erstellt. Forward Primer: CGTCGATACCCATCATATCC (20 mer); Reverse Primer: ACATTCTTTTCGTTGGCGTGGTAT (24mer); Die Herstellung und Lieferung der Primer erfolgte durch die Firma Eurofins MWG Operon (Ebersberg; Germany). Das Takara ExTaq PCR Kit® (Takara BioInc, Japan, Lot-Nr.: KA5501EA) wurde mit folgenden Mastermixkonzentrationen eingesetzt: 50 ExTaq Polymerase 0,25 µl ExTaq 10x Buffer 5,00 µl dNTPmix 4,00 µl HVT-F 2,00 µl HVT-R 2,00 µl H20 31,75 µl DNA 5,00 µl (200 ng/µl) Die folgenden PCR Zyklen wurden mit dem SensoQuest Labcycler (Biomedizinische Elektronik, Göttingen, Germany) durchgeführt: Ein Zyklus bei 94 °C für 240 Sekunden, 45 Zyklen für 94°C für 15 Sekunden, 56°C für 60 Sekunden, 72°C für 95 Sekunden und anschließend ein Zyklus bei 72°C für 120 Sekunden. 4.4.8 Zellzählung Die Zellen wurden mithilfe einer Neubauer Zählkammer gezählt. Jede Probe wurde 1:10 in Trypan Blau Farbe 0,4% (Gibco, Invitrogen cooperation, Darmstadt) verdünnt und die Zellen unter dem Lichtmikroskop gezählt. Die Zellzahl wurde unter einem Großquadrat (Volumen 0,1 µl) ermittelt und auf 1 ml hochgerechnet (Faktor 10 4). 4.4.9 Durchflusszytometrie Im zweiten Versuch wurden am sechsten und am 36. Tag nach dem Schlupf die Milz, am 11. und 36. Tag nach dem Schlupf Blutproben in heparinisierten Reagenzröhrchen zur durchflusszytometrischen Analyse nach bekannter Methode (SCHWARZ et al. 2011) entnommen. Bei der Milzentnahme wurde die Milzkapsel entfernt, die Milz zerkleinert und zerteilt mit und Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS 0,01M) durch einen 70 µm Filter (BD Falcon, Heidelberg) in ein Falcon Tube (50 ml Röhre, 114 x28 mm, PP, lot. 3040401, Sarstedt AG & Co, Nümbrecht, Deutschland) überführt. Anschließend wurde die frisch gewonnene Zellsupsension bei 1500 rpm für 10 min bei 4 °C zentrifugiert. Die folgenden Antikörper der Firma Southern Biotech (Alabama, USA), bezogen über Biozol Diagnostica Vertrieb GmbH 51 (Eching, Deutschland) wurden verwendet: Maus-Anti-CD4; CD4/αβ; CD4/δγ; CD8/αβ; CD8/γδ; CD8; BU-1; KUL01; IgA. Die Antikörper waren alle bis auf CD4 (PE), CD8β und IgA FITC markiert. CD4 war PE-markiert, CD8β und IgA wurden Spectral Red konjugiert (Antikörper: Konjugat-Verhältnis = 2:1). Alle Antikörper wurden 1:100 verdünnt. Diese optimale Verdünnungstufe wurde mittels einer Titration der Antikörper mit Milzzellen im Vorversuch ermittelt. Vor dem Färben der Zellen wurden die isolierten Milzzellen auf eine Zellkonzentration von 1 x 106 Zellen eingestellt und davon 100 µl pro Well auf eine 96-well Platte gegeben. Die Zellen wurden für vier Minuten bei 4 °C mit 2000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zell-Pellet mit 100 µl FACS-Puffer (1% Bovines Serumalbumin in PBS) mit den darin gelösten Antikörpern für 30 Minuten bei 4 °C in Dunkelheit inkubiert. Anschließend wurden die Zellen wieder mit 100 µl FACS-Buffer bei 2000 rpm für 5 Minuten gewaschen. 4.4.9.1 Durchflusszytometrische Analyse Die gefärbten Zellen wurden mit dem Beckman Coulter Epics XL Flow Zytometer (Beckman Coulter, Krefeld) gemessen und mit Hilfe des EXPO 32 ADC Programmes analysiert. Die Lymphozyten wurden nach Größe und Granularität mittels ihrer Foward- und Sideward-Laser Streuung zugeordnet. Ungefärbte Zellen und einzelgefärbte Zellen dienten als Kontrollen. Eine Kompensation fand jedes Mal vor den Messungen mithilfe dieser Kontrollen statt. Bei Milz sowie auch Blutzellen wurden 10000 Einheiten für 180 Sekunden gemessen. 4.5 Statistische Analyse Die statistische Analyse wurde mit der SAS-Software (SAS 9.3) für die TrachealTupfer Ergebnisse und mit der Statistix® 9 Software für alle anderen Ergebnisse durchgeführt. Für die Tracheal-Tupferproben wurde der Fishers Exact Test angewendet. Bei der Bewertung der Ergebnisse der Serologie, Durchflusszytometrie und Immunhistochemie wurde die Kruskal-Wallis One-Way AOV mit anschließendem 52 paarweisem Vergleich durchgeführt. Bei einem p-Wert <0.05 wurden Unterschiede als statistisch signifikant angesehen. Werte, welche mit unterschiedlichen kleinen Buchstaben voneinander. (a, b) gekennzeichnet wurden, unterscheiden sich signifikant 53 5 Ergebnisse Die Ergebnisse der Versuche 1 (SPF-Hühner) und 2 (Broiler) werden vergleichend dargestellt. In beiden Tierversuchen wurden die lokale und systemische Immunantwort nach Newcastle Disease Impfung untersucht. Es wurden lokale T- und B-Zellpopulationen sowie Makrophagen in Harderscher Drüse, CALT, Trachea, Lunge und Zäkaltonsille sowie lokale Virusausscheidung aus der Trachea untersucht. Lokale und systemische Antikörperbildung sowie ein Impfvirusnachweis wurden ebenfalls durchgeführt. Eine rHVT-ND vakzinierte Gruppe und eine mit Lebendimpfstoff vakzinierte Gruppe als auch eine mit beiden Impfstoffen geimpfte Gruppe wurden mit einer ungeimpften Kontrollgruppe und untereinander verglichen. 5.1 Titration des Impfvirus Die Titer der rHVT-ND Vakzine stimmten in beiden Versuchen annähernd mit den Angaben des Herstellers überein. Die Impfstoffe wurden auf Zellkulturplatten mit sekundären Hühnerembryofibroblasten gegeben. Im ersten Versuch wurde der Titer der Vakzine vom Hersteller mit 7,3 log10 PFU/ml angegeben. Die direkt im Anschluss erfolgende Titration ergab einen Titer von 6,9 log10 PFU/ml. Im zweiten Versuch wurde der Titer vom Hersteller mit 7,0 log10 PFU/ml angegeben. Nach Verdünnung und Impfung wurde der Impfstoff einen Tag später (24 h) titriert und wies den gleichen Titer von 7,0 log10 PFU/ml auf. 5.2 Nachweis des rHVT-ND nach Impfung durch Anzucht in vitro (Exp. 1) oder mittels Polymerase Kettenreaktion (Exp. 2) Im ersten Versuch wurde replizierendes rHVT-ND aus Milzzellen nach Cokultivierung mit sekundären Hühnerembryofibroblasten in der Zellkultur nachgewiesen. Jedoch konnten nicht alle Platten ausgewertet werden, da eine vorzeitige Ablösung der Hühnerembryofibroblasten von den Zellkulturböden das Auszählen der Plaques verhinderte. Beide Gruppen der mit rHVT-ND geimpften Tiere zeigten HVT- 54 spezifische Plaques, welche mit einem monoklonalen Antikörper, der gegen das NDF-Protein gerichtet war, angefärbt und ausgezählt werden (Daten nicht gezeigt). Im zweiten Versuch konnten bei drei von drei Tieren aus der rHVT-ND geimpften Gruppe und bei drei von ND/Lebendimpfstoffkombinationsgruppe vier Tieren rHVT-ND mittels aus der rHVT- PCR nachgewiesen werden. Die restlichen Tiere verblieben negativ auf rHVT-ND. 5.3 Immunhistochemische Untersuchungen von Immunzellpopulationen Bei den SPF-Hühnern in Versuch 1 wurden die immunhistochemischen Untersuchungen der Immunzellpopulationen am 10. Tag nach der Impfung (post vaccination=pv) durchgeführt, bei Broilern am fünften und 10. Tag pv. Die Ergebnisse vom 10. Tag pv der SPF-Hühner und Broiler werden vergleichend dargestellt (Abb. 7, 9, 11, 12) während die Ergebnisse des fünften Tages pv nur für den Broilerversuch dargestellt werden. Es wurden lokale T- und B- Zellpopulationen sowie Makrophagen in Harderscher Drüse, Konjunktiva, Lunge und Zäkaltonsille 10 Tage pv in Experiment 1 dargestellt. Im zweiten Experiment wurden am fünften sowie 10. Tag pv die gleichen Zellpopulationen bei Broilern in Harderscher Drüse, Konjunktiva, Lunge und Zäkaltonsille dargestellt. 55 5.4 Immunzellpopulationen 5 Tage nach der Impfung bei Broilern Abb. 3a: CD4+ Zellen bei Broilern 5 Tage nach ND-Impfung A B C D Abb. 3b: CD8+ Zellen bei Broilern 5 Tage nach ND-Impfung E G F H 56 Abbildung 3 a,b (A-H): Immunhistochemische Detektion von CD4+ Zellen (A-D) und CD8+ Zellen (E-H) in verschiedenen Organen (Hardersche Drüse, CALT, Lunge, Zäkaltonsille) von kommerziellen Broilern am 5. Tag nach ND-Impfung. Dargestellt ist der jeweilige Durchschnitt der Anzahl (A, C, E, G) bzw. der Scores (B, D, F, H) der unterschiedlichen Immunzellpopulationen pro Gruppe und Organ. Es wurden 3-5 Blickfelder pro Tier bei 400x (Score 200x) Vergrößerung evaluiert. Unterschiedlich kleine Buchstaben (a, b) über den Säulen kennzeichnen Gruppen, die sich signifikant voneinander unterscheiden (p<0,05; Kruskal–Wallis One-way AOV mit anschließendem paarweisem Vergleich). In Harderschen Drüsen zeigten am fünften Tag nach der Impfung beide mit dem Lebendimpfstoff geimpften Broilergruppen signifikant erhöhte CD4+, CD8+ und BU1+ Zellenzahlen im Vergleich zur ungeimpften Gruppe (p<0,05), (Abb. 3 A, E, 5 A). KUL01+ Zellen waren ebenfalls in beiden mit Lebendimpfstoff geimpften im Vergleich zur ungeimpften Gruppe erhöht, signifikant jedoch nur in der Gruppe, welche mit dem Lebendimpfstoff allein geimpft wurde (p<0,05), (Abb. 5 E). Eine Zellzahlerhöhung findet sich ebenfalls bei CD4+ und CD8+ Zellen im Konjunktiva-assoziiertem lymphoidem Gewebe bei Tieren aus der Gruppe, welche alleinig mit dem Lebendimpfstoff geimpft wurden im Vergleich zu den restlichen Gruppen (Abb. 3 B, F). In der Lunge zeigten sich erhöhte CD4+ und CD8+ Zellen in den Lebend-geimpften Gruppen im Vergleich zur ungeimpften Gruppe (Abb. 3 C, G). Ein signifikanter Anstieg von CD4+ Zellen im Vergleich zur Kontrollgruppe wurde ebenfalls in der rHVT-ND Gruppe beobachtet (p<0,05) (Abb. 3 C). CD4+ Zellen waren in Zäkaltonsillen von Broilern in Gruppen, welche mit einer Kombination beider Impfstoffe geimpft wurden, erhöht im Vergleich zu den restlichen Gruppen (Abb.3 D). 57 A B C D Abbildung 4 (A-D): Immunhistochemische Detektion von CD4+ Zellen bei 200-facher Vergrößerung in Harderschen Drüsen von Broilern am fünften Tag nach ND-Impfung. A - ungeimpfte Kontrollgruppe, B - rHVT-ND geimpfte Gruppe, C - mit Lebendimpfstoff geimpfte Gruppe, D - mit rHVT-ND und Lebendimpfstoff geimpfte Gruppe. CD4+ Zellen stellen sich braun dar. Generell zeigten sich im interstitiellen Gewebe, um den Hauptausführungsgang und um die Nebenausführungsgänge der Harderschen Drüse erhöhte Zellzahlen in NDvakzinierten Tieren im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abbildung 4 A-D). 58 Abb. 5a: Bu-1+ Zellen bei Broilern 5 Tage nach ND-Impfung A B C D Abb. 5b: KUL01+ Zellen bei Broilern 5 Tage nach ND-Impfung E F G H 59 Abbildung 5 a, b (A-H): Immunhistochemische Detektion von Bu-1+ Zellen (A-D) und KUL01+ Zellen (E-H) in verschiedenen Organen (Hardersche Drüse, CALT, Lunge, Zäkaltonsille) von kommerziellen Broilern am 5. Tag nach ND-Impfung. Dargestellt ist der jeweilige Durchschnitt der Anzahl (A, C, E, G) bzw. Scores (B, D, F, H) der unterschiedlichen Immunzellpopulationen pro Gruppe und Organ. Es wurden 3-5 Blickfelder pro Tier bei 400x (Score 200x) Vergrößerung evaluiert. Unterschiedlich kleine Buchstaben (a, b) über den Säulen kennzeichnen Gruppen, die sich signifikant voneinander unterscheiden (p<0,05; Kruskal–Wallis One-way AOV mit anschließendem paarweisem Vergleich). 60 Abb. 6: IgA+ Zellen bei Broilern 5 Tage nach ND-Impfung A B C D Abbildung 6 (A-D): Immunhistochemische Detektion von IgA+ Zellen (A-D) in verschiedenen Organen (Hardersche Drüse, CALT, Lunge, Zäkaltonsille) von kommerziellen Broilern am fünften Tag nach ND-Impfung. Dargestellt ist der jeweilige Durchschnitt der Anzahl (A, C) bzw. Scores (B, D) der unterschiedlichen Immunzellpopulationen pro Gruppe und Organ. Es wurden 3-5 Blickfelder pro Tier bei 400x (Score 200x) Vergrößerung evaluiert. Unterschiedlich kleine Buchstaben (a, b) über den Säulen kennzeichnen Gruppen, die sich signifikant voneinander unterscheiden (p<0,05; Kruskal–Wallis One-way AOV mit anschließendem paarweisem Vergleich). Eine signifikante Erhöhung im Vergleich zur rHVT-ND und zur rHVT- ND/Lebendimpfstoff-geimpften Gruppe von IgA+ Zellen in Harderschen Drüsen fand bei Tieren statt, welche nur mit dem Lebendimpfstoff geimpft wurden (p<0,05) (Abb. 6 A). 61 In der Lunge zeigen sich IgA+ Zellen in der Kombinationsgruppe signifikant erhöht zu den restlichen Gruppen (p<0,05) (Abb. 6 C). 5.5 Immunzellpopulationen 10 Tage nach der Impfung bei SPFHühnern und Broilern Bei den SPF-Hühnern war ein signifikanter Anstieg der CD4+, BU-1+ und KUL01+ Zellzahlen in Harderschen Drüsen bei den mit Lebendimpfstoff geimpften Tieren im Vergleich zur Kontrollgruppe zu beobachten (Abb. 7 A, E, G) (p<0,05). In der rHVT-ND geimpften Gruppe waren CD4+, CD8+, BU-1+, KUL01+ und IgA+ Zellen im Vergleich zur Kontrollgruppe erhöht (Abb. 7 A, C, E, G, I). Bei der Doppelvakzinierung zeigten sich im Vergleich zur Kontrollgruppe eine signifikant Zellzahlerhöhung der CD8+ Zellen in Harderschen Drüsen (p<0,05) (Abb. 7 C). Bei Broilern war eine Erhöhung der CD8+ Zellzahlen am 10. Tag in allen geimpften Gruppen in Harderschen Drüsen zu beobachten (Abb. 7 D). Die Kombinationsgruppe unterschied sich hierbei signifikant von der ungeimpften Gruppe (p<0,05) (Abb. 7 D). Bei den restlichen Zellzahlpopulationen konnten keine signifikanten Unterschiede im Vergleich zur Kontrollgruppe und innerhalb der Gruppen festgestellt werden (p>0,05). CD4+ Zellen bei Broilern in Harderschen Drüsen zeigten sich in Lebendimpfstoffgruppe erhöht im Vergleich zu den restlichen Gruppen (Abb. 7 B). der 62 Abb. 7: Verschiedene Immunzellpopulationen in Harderschen Drüsen am 10. Tag nach ND-Impfung A C E G B D F H 63 Abb. 7: Fortsetzung: Verschiedene Immunzellpopulationen in Harderschen Drüsen am 10. Tag nach ND-Impfung I Abbildung J 7 (A-J): Immunhistochemische Detektion von verschiedene Immunzelltypen in Harderschen Drüsen von SPF-Hühnern (A, C, E, G, I) und Broilern (B, D, F, H, J) am 10. Tag nach ND-Impfung. Dargestellt ist der jeweilige Durchschnitt der Anzahl der unterschiedlichen Immunzellpopulationen pro Gruppe und Organ. Es wurden 3-5 Blickfelder pro Tier bei 400x Vergrößerung evaluiert. Unterschiedlich kleine Buchstaben (a, b) über den Säulen kennzeichnen Gruppen, die sich signifikant voneinander unterscheiden (p<0,05; Kruskal–Wallis One-way AOV mit anschließendem paarweisem Vergleich). 64 A C B D Abbildung 8 (A-D): Immunhistochemische Detektion von CD4+ Zellen bei 200-facher Vergrößerung in Harderschen Drüsen von SPF-Hühnern am 10. Tag nach NDImpfung. A - ungeimpfte Kontrollgruppe, B - rHVT-ND geimpfte Gruppe, C - mit Lebendimpfstoff geimpfte Gruppe, D - mit rHVT-ND und Lebendimpfstoff geimpfte Gruppe. CD4+ Zellen stellen sich bräunlich dar. Es wurde eine Erhöhung der CD4+ Zellzahlen im Interstitium der Drüse und um den Ausführungsgang bei SPF-Hühnern aus ND-geimpften Gruppen beobachtet (Abb.8 B, C, D). 65 Abb. 9: Verschiedene Immunzellpopulationen in Lungen am 10. Tag nach NDImpfung A B C D E F G H 66 Abb. 9: Fortsetzung: Verschiedene Immunzellpopulationen in Lungen am 10. Tag nach ND-Impfung I Abbildung J 9 (A-J): Immunhistochemische Detektion von verschiedenen Immunzelltypen in Lungen in Nähe eines Parabronchus unter einem lateroventralen sekundären Bronchus von SPF-Hühnern (A, C, E, G, I) und Broilern (B, D, F, H, J) am 10. Tag nach ND-Impfung. Dargestellt ist der jeweilige Durchschnitt der Anzahl der unterschiedlichen Immunzellpopulationen pro Gruppe und Organ. Es wurden 3-5 Blickfelder pro Tier bei 400x Vergrößerung evaluiert. Unterschiedlich kleine Buchstaben (a, b) über den Säulen kennzeichnen Gruppen, die sich signifikant voneinander unterscheiden (p<0,05; Kruskal–Wallis One-way AOV mit anschließendem paarweisem Vergleich). rHVT-ND und lebend-geimpfte SPF-Hühner (Gruppe vier) zeigten eine signifikante Erhöhung der CD4+ Zellpopulationen in Lungenanschnitten in Bereichen der Parabronchien ventral der sekundären Bronchien im Vergleich zur Kontrollgruppe (p<0,05) (Abb. 9 A). KUL01+ Zellzahlen zeigten eine signifikante Verringerung in der rHVT-ND/Lebendimpfstoff-Kombinationsgruppe im Vergleich zu der rHVT-ND und der Lebend-ND Gruppe (p<0,05) (Abb. 9 G). Die Zellzahlen der Immunzellen in Lungen von Broilern wiesen am 10. Tag nach Impfung keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen auf (p>0,05) (Abb. 9 B, D, F, H, J). Hier zeigten sich CD8+, Bu-1+ und IgA+ Zellenzahlen in mit Lebendimpftoff geimpften Gruppen im Vergleich zur ungeimpften Gruppe erhöht (Abb. 9 D, F, J). 67 Im immunhistochemischen Schnitt stellen sich positiv gefärbte Zellen braun dar. Abb. 10 (A-D) zeigt CD4+ gefärbte Zellen um einen Parabronchus in den verschiedenen Gruppen. A C B D Abbildung 10 (A-D): Immunhistochemische Detektion von CD4+ Zellen bei 200facher Vergrößerung eines Parabronchus ventral eines lateroventralen sekundären Bronchus in Lungen von SPF-Hühnern am 10. Tag nach ND-Impfung. A - ungeimpfte Kontrollgruppe, B - rHVT-ND geimpfte Gruppe, C - mit Lebendimpfstoff geimpfte Gruppe, D - mit rHVT-ND und Lebendimpfstoff geimpfte Gruppe. CD4+ Zellen stellen sich braun dar. 68 Abb. 11: Verschiedene Immunzellpopulationen des Konjunktiva-assoziierten lymphatischen Gewebes am 10. Tag nach ND-Impfung A B C D E Abbildung 11 (A-E): Immunhistochemische Detektion von verschiedenen Immunzelltypen im Konjunktiva-assoziierten lymphatischem Gewebe (CALT) von Broilern am 10. Tag nach ND-Impfung. Dargestellt sind die jeweiligen Scores der unterschiedlichen Immunzellpopulationen pro Gruppe und Organ. Es wurden 3-5 Blickfelder pro Tier bei 200x Vergrößerung evaluiert. 69 Die Immunzellen in Konjunktiva-assoziierten lymphoiden Geweben von Broilern wiesen am 10.Tag nach Impfung keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen auf (Abb.11 A-E) (p<0,05). Eine Erhöhung zeigte sich bei CD4+ Zellen in der mit Lebendimpfstoff geimpften Gruppe sowie bei IgA+ Zellen in der mit beiden Impfstoffen geimpften Gruppe (Abb. 11 A, E). 70 Abb. 12: Verschiedene Immunzellpopulationen in Zäkaltonsillen am 10. Tag nach ND-Impfung A B C D E F G H 71 Abb. 12: Fortsetzung: Verschiedene Immunzellpopulationen in Zäkaltonsillen am 10. Tag nach ND-Impfung I Abbildung J 12 (A-J): Immunhistochemische Detektion von verschiedenen Immunzelltypen in Zäkaltonsillen von SPF-Hühnern (A, C, E, G, I) und Broilern (B, D, F, H, J) am 10. Tag nach ND-Impfung. Dargestellt sind die jeweiligen Scores der unterschiedlichen Immunzellpopulationen pro Gruppe und Organ. Es wurden 3-5 Blickfelder pro Tier bei 200x Vergrößerung evaluiert. Bei SPF-Hühnern zeigten CD4+ Zellzahlen in Zäkaltonsillen am 10. Tag nach Impfung eine Verringerung in der kombiniert geimpften Gruppe im Vergleich zu der Kontrollgruppe (Abb. 12 A). Die CD8+ Zellzahlen erhöhten sich nach rHVT-ND Impfung verglichen mit den Zellzahlen der restlichen Gruppen (Abb. 12 B). BU-1+ Zellen waren in ND-geimpften Gruppen niedriger als in der Kontrollgruppe (Abb.12 E). Eine Erhöhung fand im Bereich der KUL-01+ Zellen beider mit Lebendimpfstoff geimpfter Gruppen statt (Abb. 12 G). IgA+ Zellzahlen zeigten eine Reduktion in der rHVT-ND geimpften Gruppe im Vergleich zu den restlichen Gruppen (Abb. 12 I). Bei Broilern wurde eine Erhöhung von Bu-1+ Zellen in den ND-geimpften Gruppen im Vergleich zur Kontrollgruppe beobachtet (Abb. 12 F). KUL01+ Zellen waren in der Gruppe erhöht, welche nur mit dem ND-Lebendimpfstoff geimpft wurde (Abb. 12 H). 72 5.6 Virusdetektion von Tracheal- und Kloakaltupfern durch qRTPCR Im ersten und zweiten Versuch wurde bei SPF-Hühnern und kommerziellen Broilern die Virusausscheidung aus der Trachea nach Belastungsinfektion mit dem APMV-1 Stamm LaSota mittels qRT-PCR detektiert. Im zweiten Versuch wurde zusätzlich die Virusausscheidung aus der Kloake durch qRT-PCR von Tupferproben untersucht. Am 35. Tag nach der Impfung wurden vor der Belastungsinfektion im ersten und zweiten Versuch Trachealtupfer von sieben Tieren pro Gruppe entnommen. Fünf Sentineltiere wurden jeweils einen Tag nach der Belastungsinfektion zu den Tieren hinzugegeben und fünf Tage später entfernt. An dem Tag, an dem die erste Gruppe der Sentineltiere entfernt wurde, wurde eine neue Gruppe von fünf Sentinels für fünf weitere Tage hinzugesetzt. Am dritten, fünften, siebten und zehnten Tag nach der Belastungsinfektion wurden Trachealtupfer der belastungsinfizierten SPFHühner und Sentinels entnommen, sowie an den gleichen Tagen zusätzlich Kloakentupfer der Broiler. Am 35. Tag nach Impfung wurde bei keinem Tier Virus in der qRT-PCR detektiert (Tabelle 4). Alle SPF-Hühner der Kontrollgruppe schieden den APMV-1 Virusstamm LaSota bis zum siebten Tag nach der Belastungsinfektion aus. Am 10. Tag nach der Belastungsinfektion war nur noch ein Tier aus der Kontrollgruppe positiv (Tabelle 4). Alle Tiere der rHVT-ND geimpften Gruppe schieden Virus bis zum siebten Tag nach der Belastungsinfektion aus. Am 10. Tag nach Belastungsinfektion war keines dieser Tiere mehr Paramyxovirus Serotyp 1-positiv in der qRT-PCR. In der ersten Sentinelgruppe der rHVT-ND Gruppe wurde bei keinem Tier rHVT-ND detektiert. Diese Sentinelgruppe unterschied sich signifikant in der Virusausscheidung von der ersten Sentinelgruppe der ungeimpften Gruppe, wo fünf von fünf Tieren das Belastungsvirus ausschieden (p<0,05) (Tabelle 4). Keines der mit Lebendimpfstoff inokulierten Tiere sowie die Sentinels aus diesen Gruppen schieden das Belastungsvirus aus. Im zweiten Versuch bei Broilern konnte am Tag der Belastungsinfektion in keinem Trachealtupfer APMV-1 nachgewiesen werden (Tabelle 4). Am dritten und fünften 73 Tag nach der Belastungsinfektion schieden vier bis fünf Tiere der insgesamt fünf belastungsinfizierten Tiere und Sentinels der Kontrollgruppe und rHVT-ND geimpften Gruppe Belastungsvirus aus. Tiere aus der dritten und vierten Gruppe, welche mit dem Lebendimpfstoff immunisiert worden waren, zeigten nur ein positives Tier aus der vierten Gruppe am dritten Tag nach der Belastungsinfektion. In der dritten Gruppe (Lebend ND) schieden am dritten Tag nach der Belastungsinfektion drei von fünf Sentinels den APMV-1 Stamm LaSota aus, aus der vierten Gruppe (rHVTND/Lebend ND) drei von fünf Tieren am dritten Tag nach Belastungsinfektion und zwei von fünf Tieren am fünften Tag nach Belastungsinfektion. APMV-1 wurde auch aus Kloakaltupferproben bei jeweils einem von fünf Tieren am dritten und fünften und zehnten Tag nach der Belastungsinfektion in nicht geimpften Tieren nachgewiesen (Tabelle 5). Am dritten Tag nach der Belastungsinfektion wurde bei einem Tier von fünf aus der rHVT-ND/Lebend ND Gruppe APMV-1 nachgewiesen. Keines der Sentineltiere schied APMV-1 über die Kloake aus (Tabelle 5). 5.6.1 Bei Virusanzucht im embryonierten Hühnerei der Lebendvirusdetektion wurden Tracheal- und Kloakaltupfer der belastungsinfizierten Broiler aus dem zweiten Versuch entnommen und mittels Eianzucht auf APMV-1 untersucht. Aus Trachealtupfern konnte in der ungeimpften Gruppe infektiöses APMV-1 am dritten und fünften Tag nach der Belastungsinfektion nachgewiesen werden sowie am dritten Tag nach der Belastungsinfektion aus der rHVT-ND Gruppe (Tabelle 4). Aus Kloakaltupfern konnte nur am fünften und siebten Tag nach Belastungsinfektion APMV-1 in der ungeimpften Gruppe nachgewiesen werden (Tabelle 5). 74 Tabelle 4: Virusausscheidung über die Trachea nach Belastungsinfektion mit dem APMV-1 Stamm LaSota am 35. Tag nach Impfung. Tierart Tage nach Challenge ungeimpft Sentinels 1 SPF Broiler 0 rHVT-ND 2 1 0/7 5/5 a 3/5 5/5 5 5/5 Lebend ND 2 0/7 a 3 Sentinels a 5/5 a 5/5 a a a Sentinels rHVT-ND/ Sentinels 1 Lebend ND 1 2 0/7 0/5 b 0/5 2/5 a 0/5 a 0/7 b b 0/5 0/5 b 0/5 b 0/5 b 0/5 b 0/5 b b 7 5/5 2/5 5/5 1/5 0/5 0/5 0/5 10 1/5 1/5 0/5 1/5 0/5 0/5 0/5 0 0/7 3 5 7 10 a 5/5 a 5/5 ab 1/5 0/5 0/7 (+) (+) (-) (-) ac 5/5 4/5 a a 5/5 5/5 3/5 a 5/5 a 4/5 0/5 0/7 (+) (-) (-) (-) b 5/5 5/5 0/5 a b 0/5 1/5 a 4/5 b 0/5 0/5 2 b 0/5 0/5 0/7 (-) (-) (-) (-) 3/5 b 0/5 0/5 b 0/5 1/5 bc (-) 3/5 0/5 b (-) 2/5 0/5 b (-) 0/5 (-) 0/5 0/5 Sentinels 1 – zugesetzte Gruppe von Sentinels (n=5) am 36. Tag nach Impfung. Sentinels 2 – zugesetzte Gruppe von Sentinels (n=5) am 41. Tag nach Impfung. Mit qRT-PCR wurde APMV-1 aus Trachealtupfern von spezifisch-pathogenen Hühnern (SPF) und Broilern nach Belastungsinfektion (Challenge) detektiert. „/“ trennt die Anzahl positiver Tiere von der an diesem Versuchstag getesteten Gesamtzahl. Unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen Gruppen und Sentinels, die sich innerhalb einer Zeile signifikant voneinander unterscheiden (Fisher’s Exact Test; p<0,05). (+)/(-) = Detektion von APMV-1 Lebendvirus in Einanzucht, (+) = Virus detektiert, (-) = Virus nicht detektiert b 75 Tabelle 5: Virusausscheidung über die Kloake nach Belastungsinfektion mit dem APMV-1 Stamm LaSota am 35. Tag nach Impfung Tierart Tage nach Challenge ungeimpft Sentinels 1 Broiler rHVT-ND 2 Sentinels 1 Lebend ND 2 Sentinels rHVT-ND/ Sentinels 1 Lebend ND 1 2 2 3 1/5 (-) 0/5 0/5 (-) 0/5 0/5 (-) 0/5 1/5 (-) 0/5 5 1/5 (+) 0/5 0/5 (-) 0/5 0/5 (-) 0/5 0/5 (-) 0/5 7 0/5 (+) 0/5 0/5 (-) 0/5 0/5 (-) 0/5 0/5 (-) 0/5 10 1/5 (-) 0/5 0/5 (-) 0/5 0/5 (-) 0/5 0/5 (-) 0/5 Sentinels 1 – zugesetzte Gruppe von Sentinels (n=5) am 35. Tag nach Impfung. Sentinels 2 – zugesetzte Gruppe von Sentinels (n=5) am 41. Tag nach Impfung. Mit qRT-PCR wurde APMV-1 aus Kloakaltupfern von Broilern nach Belastungsinfektion (Challenge) detektiert. „/“ trennt die Anzahl positiver Tiere von der an diesem Versuchstag getesteten Gesamtzahl. Unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen Gruppen und Sentinels, die sich innerhalb einer Zeile signifikant voneinander unterscheiden (Fisher’s Exact Test; p<0,05). (+)/(-) = Detektion von APMV-1 Lebendvirus in Eianzucht, (+) = Virus detektiert, (-) = Virus nicht detektiert 76 5.7 Serologische Untersuchungen - humorale Immunantwort Für die Versuche 1 und 2 wurden von den SPF-Hühnern und den kommerziellen Broilern am 36. und 43. Tag nach dem Schlupf Blutproben entnommen und der Antikörperspiegel mit Hilfe eines NDV-Antikörper ELISAs und Hämagglutinationshemmungstests (HAH) zu den zwei Zeitpunkten (am Tag der Challenge und sieben Tage nach der Challenge) bestimmt. Bei Broilern wurden zusätzlich die Titer von nicht belastungsinfizierten Tieren vom 45. Tag nach Impfung im Säulendiagramm mit aufgeführt (Abb. 14 A, C). Im ersten Versuch mit SPF-Hühnern zeigten alle Tiere aus geimpften Gruppen höhere APMV-1 Antikörpertiter als Tiere aus der ungeimpften Kontrollgruppe (Abb. 13 A, B, C). Die Titer beider Gruppen, welche mit dem ND Lebendimpfstoff inokuliert wurden, zeigten signifikant erhöhte Titer im Vergleich zur Kontrollgruppe (p<0,05) am Tag der Belastungsinfektion (35 Tage nach Impfung) im BioCheck®- sowie im IDEXX®-ELISA Test Kit (Abb. 13 A, B). Sieben Tage nach der Belastungsinfektion stiegen die Titer in allen Gruppen an (Abb. 13 A, B, C). Im HAH-Test zeigten alle geimpften Gruppen höhere Titer im Vergleich zur Kontrollgruppe zu beiden Zeitpunkten (Abb. 13 C). Am Tag der Belastungsinfektion sowie sieben Tage danach war der Titer der mit beiden Impfstoffen geimpften Gruppe signifikant erhöht im Vergleich zur Kontrollgruppe (p<0,05)(Abb.13 C). Im zweiten Versuch mit kommerziellen Broilern zeigten Tiere aus den geimpften Gruppen am Tag sowie sieben und zehn Tage nach der Belastungsinfektion erhöhte Titer im Vergleich zur Kontrollgruppe im ELISA und HAH-Test (Abb. 14 A, B, C). Sieben Tage nach der Belastungsinfektion wurde eine Titererhöhung aller Gruppen im Vergleich zum Titer der Gruppen am Tag der Belastungsinfektion detektiert (Abb.14 A, B, C). Im IDEXX® ELISA Test Kit zeigte sich eine signifikante Titererhöhung der rHVTND/Lebendimpfstoffgruppe am Tag und sieben Tage nach der Belastungsinfektion im Vergleich zur Kontrollgruppe (p<0,05) (Abb. 14 B). Sieben Tage nach NDChallenge erhöhten sich die Titer der Gruppen (Abb. 14 B). 77 Im HAH-Test zeigten sich am Tag der Belastungsinfektion die Titer der Lebendimpfstoffgruppe und die der rHVT-ND/Lebendimpfstoff Kombinationsgruppe signifikant erhöht zu dem der Kontrollgruppe (p<0,05) (Abb. 14 C). In den nichtbelastungsinfizierten Gruppen wurde ein signifikanter Unterschied 10 Tage nach der Belastungsinfektion zwischen der mit beiden Impfstoffen geimpften Gruppe und der nicht geimpften Gruppe (p<0,05) im ELISA und im HAH-Test detektiert (Abb. 14 A, C). Die Deklaration sowie die Gesamthöhen der Titer von positiven und negativen Tieren fiel in den beiden ELISA Kits unterschiedlich aus (Abb. 13 A, B; Abb. 14 A, B). 78 Abb. 13 A B C Abbildung 13 (A-C): Serum-NDV-Antikörpertiter im BioCheck®-ELISA (A), IDEXX®ELISA (B) und HAH-Test (C) aus Seren von SPF-Hühnern nach ND Impfung, null und sieben Tage nach Belastungsinfektion (35 und 42 Tage nach ND Impfung). 79 Unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen Gruppen, die sich signifikant unterscheiden (p<0,05; Kruskal-Wallis One-Way AOV), gestrichelte Linie = „Cut-Off“ (BioCheck® ≥ 396, IDEXX® ≥ 1159) zwischen positiven und negativen Tieren. 80 Abb. 14 A B C Abbildung 14 (A-C): Serum-NDV-Antikörpertiter im BioCheck®-ELISA (A), IDEXX®ELISA (B) und HAH-Test (C) aus Seren von Broilern nach ND Impfung, null und sieben Tage und 10 Tage nach Belastungsinfektion (=Challenge). 81 Bei den am 10. Tag nach Challenge beprobten Tieren handelte es sich um nichtbelastungsinfizierte Tiere. Unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen Gruppen, die sich signifikant unterscheiden (p<0,05; Kruskal-Wallis One-Way AOV), gestrichelte Linie = „Cut-Off“ (BioCheck® ≥ 396, IDEXX® ≥ 1159) zwischen positiven und negativen Tieren. Abb. 15 Abbildung 15: IDEXX®-ELISA IgG-NDV Antikörper aus Tränenflüssigkeiten von kommerziellen Broilern am 35. Tag nach ND-Impfung. Unterschiedliche Buchstaben über den Säulen (a, b) kennzeichnen Gruppen, die sich signifikant unterscheiden (p<0,05; Kruskal-Wallis One-Way AOV). Die Antikörpertiter in Tränenflüssigkeiten von geimpften Broilern zeigten erhöhte Durchschnittswerte im Vergleich zur Kontrollgruppe. Signifikante Erhöhung im Vergleich zum Antikörpertiter der Kontrollgruppe und der rHVT-ND Gruppe zeigte die Gruppe, welche mit dem ND-Lebendimpfstoff und dem rHVT-ND Impfstoff in Kombination inokuliert wurde (p<0,05) (Abb. 15). 82 5.8 Durchflusszytometrische Untersuchungen Abb. 16: Detektion von verschiedenen Milz- (linke Spalte) und peripheren Blutleukozyten (rechte Spalte) von Broilern mittels Durchflusszytometrie. A B C D E F G H 83 Abb. 16: Fortsetzung: Detektion von verschiedenen Milz- (linke Spalte) und peripheren Blutleukozyten (rechte Spalte) von Broilern mittels Durchflusszytometrie. I J K L M N O P 84 Abb. 16: Fortsetzung: Detektion von verschiedenen Milz- (linke Spalte) und peripheren Blutleukozyten (rechte Spalte) mittels Durchflusszytometrie von Broilern. Q R Abbildung 16 (A-R): Detektion von verschiedenen Milz- (linke Spalte) und peripheren Blutleukozyten (rechte Spalte) von Broilern mittels Durchflusszytometrie zu verschiedenen Zeitpunkten nach der ND-Impfung. Unterschiedlich kleine Buchstaben (a, b) kennzeichnen Gruppen, die sich signifikant unterscheiden (p<0,05; Kruskal-Wallis One-Way AOV), (5, 10 pv = 5, 10 Tage nach Impfung = post vaccination). Generell zeigten sich bei Milz- und Blutleukozyten zum späteren Zeitpunkt (35 Tage pv) erhöhte relative Zellzahlen in geimpften und nicht geimpften Gruppen im Vergleich zu den früheren Zeitpunkten (5,10 Tage pv) außer bei CD4+, IgA+ und KUL01+ Milzzellen, und bei KUL01+ peripheren Blutleukozyten (Abb. 16 C, O, Q, R). In Milzzellpopulationen konnte am fünften Tag pv Erhöhungen bei CD4+, CD4/αβ+, CD4/γδ+, CD8+ und KUL01+ Zellen in ND-geimpften Gruppen im Vergleich zur ungeimpften Gruppe detektiert werden (Abb. 16 C, E, G, I, Q). Am 35. Tag pv zeigten sich prozentuale Erhöhungen der relativen Milzzellzahlen von Bu-1+, CD4+, CD4/γδ+ und CD8/γδ+ in ND-geimpften Gruppen im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abb. 16 A, C, G, M). Bei peripheren Blutleukozytenpopulationen wurde eine Zellzahlerhöhung bei Bu-1+, CD4+, CD4/γδ+, CD8+, CD8/γδ+ und KUL01+ Zellen in mit ND-Lebendimpfstoff 85 geimpften Gruppen im Vergleich zur ungeimpften Gruppe am zehnten Tag pv detektiert (Abb. 16 B, D, H, J, L, R). Am 35. Tag pv wurden bei peripheren Blutleukozyten höhere Bu-1+, CD4/γδ+, IgA+ und KUL01+ Zellzahlen in der rHVT-ND Gruppe detektiert (Abb 16 B, H, P, R). Bei peripheren Blutleukozyten zeigte sich am zehnten Tag nach Impfung zusätzlich eine signifikante Erhöhung der CD4+ Zellen in der mit beiden Impfstoffen geimpften Gruppe im Vergleich zur rHVT-ND geimpften Gruppe (p<0,05) (Abb. 16 D). 86 6 Diskussion 6.1 Zielsetzung der Studie Die ständige Gefahr einer NDV-Infektion erfordert neben umfangreichen Hygieneund Abschirmungsmaßnahmen eine möglichst frühe protektive Immunität. NDLebendvakzinen sind dafür bekannt, eine gute Immunantwort zu generieren, doch können sie je nach verwendetem Virusstamm und Zeitpunkt der Anwendung auch mit klinischen Symptomen und Leistungsdepression einhergehen. Das Ziel einer Impfung sollte neben der Stimulation von spezifischen und unspezifischen Immunantworten die Induzierung einer systemischen und lokalen Immunantwort sein. ND-Lebendvakzinen können bei einer frühen Applikation durch maternale Antikörper neutralisiert werden und somit bei der Ausbildung einer protektiven Immunität gehemmt werden (WESTBURY et al. 1984; BELL et al. 1991; CZIFRA et al. 1998). Rekombinante HVT-Impfstoffe bieten die Möglichkeit einer sehr frühen Applikation inovo oder am ersten Lebenstag und weisen eine geringere Interferenz als NDLebendimpfstoffe mit maternalen Antikörpern auf (MORGAN et al. 1992; MORGAN et al. 1993). Tierversuche, in denen klinische Protektion und Virusausscheidung nach einer Belastungsinfektion untersucht wurden, zeigten, dass durch eine in-ovo rHVTND Impfung eine verbesserte klinische Protektion und eine signifikante Verringerung der Virusausscheidung im Vergleich zu den Kontrollgruppen ermöglicht wurde (PALYA et al. 2012). Fünf Wochen nach Impfung konnten vergleichbare Antikörpertiter (IgG) in Tränenflüssigkeiten nach Impfung mit rHVT-ND und einem ND-Lebendimpfstoff gemessen werden (RAUW et al. 2010). Eine Kombination der rHVT-ND Vakzine mit einer ND-Lebendvakzine erhöht die klinische Protektion (RAUW et al. 2010). Ob nach einer Applikation von rHVT-ND auch eine lokale zellvermittelte Immunität an der Haupteintrittsspforte des APMV-1, dem oberen Respirationstrakt erzeugt wird, wie bei einer Lebendvakzine, ist unklar. Untersuchungen zur möglichen Vermehrung von lokalen Immunzellzahlpopulationen 87 in Organen des oberen Respirationstraktes sowie der Lunge und Zäkaltonsille als weitere ND-Zielorgane liegen nicht vor. In unserer Studie wurde der Vektorimpfstoff rHVT-ND mit der ND-Lebendvakzine „Clone 30“, basierend auf dem lentogenen APMV-1 Clone 30 Stamm, hinsichtlich der Induktion unterschiedlicher Immunparameter verglichen und auch kombininert getestet. Es wurde die Induktion von lokalen und systemischen Immunreaktionen nach subkutaner rHVT-ND und Augentropfen-Lebendimpfstoff-Applikation sowohl bei SPF-Hühnern als auch bei kommerziellen Broilern festgestellt. Im Vergleich zu einer ND-Lebendvakzine fielen die lokalen, humoralen und zell-vermittelten Immunantworten bei einer rHVT-ND-Impfung niedriger aus. Die Kombination beider Impfstoffe führte jedoch bei einigen Immunparametern zu einer noch höheren Immunantwort als die alleinige Applikation der Lebendvakzine. Diese Effekte stellten sich bei SPF-Hühnern deutlicher dar als bei Broilern. 6.2 Klinisches Bild nach Impfung mit rHVT-ND und NDLebendimpfstoff sowie nach APMV-1 Stamm LaSota Belastungsinfektion Bei einer Impfung mit HVT zeigen Hühner normalerweise keine klinischen Symptome, da HVT für Hühner apathogen ist (SONDERMEIJER et al. 1993). In unseren Versuchen wurden nach alleiniger subkutaner rHVT-ND-Applikation sowie auch in Kombination mit dem ND-Lebendimpfstoff keine klinischen Symptome nach der Impfung beobachtet. Unter Feldbedingungen mit höherem Infektionsdruck und zusätzlichen Stressfaktoren für die Tiere können sich nach einer sehr frühen NDLebendimpfung jedoch durchaus auch gelegentlich milde respiratorische Symptome entwickeln und je nach Infektionsdruck komplizieren (NAKAMURA et al. 1994). Es können hierbei auch pathologische und histopathologische Veränderungen auftreten. Respiratorische Symptome nach einer ND-Lebendimpfung werden zum Beispiel bei einer Mycoplasma gallisepticum Co-Infektion beschrieben (SATO et al. 1970). 88 Die Belastungsinfektion mit dem APMV-1 Stamm LaSota fand am 35. Tag nach der Impfung statt. Wie erwartet, wurden keine klinischen Symptome beobachtet. 6.3 Pathologische und histopathologische Läsionen nach NDImpfung Es konnten bei keinem der untersuchten Tiere pathologisch-anatomische Läsionen, weder nach Impfung noch nach Belastungsinfektion, detektiert werden. Zehn Tage nach der ND-Lebendimpfung wurden geringgradige histopathologische Veränderungen bei SPF-Hühnern beobachtet. Bei okularer, intranasaler oder Sprayverabreichung von lentogenen ND-Lebendvakzinen werden häufig zu frühen Zeitpunkten milde respiratorische Symptome beobachtet (ALLAN u. LANCASTER 1978). Auch milde histopathologische Veränderungen im Respirationstrakt, wie sie hier beobachtet wurden, können nach Impfung auftreten (KOTANI et al. 1987). Nach rHVT-ND- oder ND-Lebendimpfung von kommerziellen Broilern wurden in dieser Studie keine histopathologischen Veränderungen beobachtet. HVT gelangt nach Applikation über die Lunge in den Organismus. Hierbei wird es von phagozytierenden Zellen aufgenommen, bleibt ab diesem Zeitpunkt strikt intrazellulär und wird zu lymphoiden Geweben transportiert, wo es zuerst BLymphozyten und dann aktivierte T-Lymphozyten infiziert (HOLLAND et al. 1998; DAVISON 2004a). Diese Phase dauert etwa sieben Tage an. Danach wird die Latenzphase eingeleitet, in der das Virus hauptsächlich in CD4+ T-Lymphozyten und anderen Lymphozytenpopulationen persistiert. Während dieser Phasen führte HVT zu keinen pathologischen oder zytolytischen Veränderungen in lymphoiden Organen (FABRICANT et al. 1982). Auch kommt es zu keinen immunsuppressiven Einflüssen oder zu Beeinträchtigungen der Integrität der mukosalen Oberflächen (FRIEDMAN et al. 1992). 89 6.4 Einfluss von rHVT-ND und dem ND-Lebendimpfstoff auf Immunparameter 6.4.1 6.4.1.1 Systemische Immunparameter Humorale Immunparameter rHVT-ND und die ND-Lebendvakzine induzierten sowohl bei den SPF-Hühnern als auch bei Broilern messbare APMV-1 Serum-Antikörpertiter, welche sich fünf Wochen nach der Impfung im HAH-Test und ELISA nachweisen ließen. Der durch rHVT-ND induzierte Antikörpertiter ist niedriger als der der Lebendvakzine. Nach einer Belastungsinfektion erhöhten sich die Serum-Antikörpertiter in allen Gruppen (Abb. 13+14). Der von rHVT-ND induzierte Antikörpertiter war vermutlich niedriger als der der Lebendvakzine, da rHVT-ND nur das F-Protein exprimierte. Neben weiteren Faktoren, wie der unterschiedlichen Verteilung und Replikationsrate der beiden Impfstoffe, könnte die Tatsache, dass bei einer ND-Lebendimpfung Antikörper gegen weitere APMV-1 spezifische virale Polypeptide gebildet werden, eine Ursache für die unterschiedlichen Höhen der Antikörpertiter sein (REYNOLDS u. MARAQA 2000a). Die Anti-F-Antikörper gegen rHVT-ND stellten sich in unserer Studie auch durch den HAH-Test detektierbar dar. Auch Palya et al. zeigten in ihrer Studie von 2012, dass die durch rHVT-ND induzierten, gegen das APMV-1 F-Protein gerichteten Antikörper HAH-Eigenschaften besitzen. Palya et al. (2012) spekulierten, dass hierfür eine sterische Hinderung der Virusanhaftung an die Erythrozyten durch die gegen das FProtein gerichteten Antikörper verantwortlich sein könnte (PALYA et al. 2012). Im Gegensatz dazu wurden in einer Studie von Morgan et al. von 1992 praktisch keine Antikörper im HAH-Test und ELISA nach einer rHVT-ND Impfung bei Hühnern detektiert (MORGAN et al. 1992). Jedoch ist der detektierbare Antikörpertiter auch abhängig vom eingesetzten ELISA Kit, bzw. der Antigenkonzentration im HAH-Test. In unserer Studie zeigte ein sensitiveres ELISA Test-Kit durchaus messbare Antikörpertiter, wohingegen sich in einem anderen ELISA Test-Kit die Antikörpertiter generell niedriger darstellten (Abb. 13+14). Morgan et al. setzten eine 90 Antigenkonzentration von zehn hämagglutinierenden Einheiten (HAU) ein (MORGAN et al. 1992), während in unserer Studie vier HAUs genutzt wurden. In einem Übersichtsartikel von 2013 bewerteten Kapczynski et al. die durch rHVT-ND induzierten HAH- und ELISA-Antikörpertiter als nicht geeignetes Mittel, um für diese Vakzine eine Aussage über die Immunität zu treffen, da diese häufig zu niedrig ausfallen (KAPCZYNSKI et al. 2013). Dies ist jedoch abhängig von der angewendeten serologischen Untersuchungsmethode. Die Titer der SPF-Hühner, welche mit beiden Impfstoffen vakziniert wurden, waren höher als die Titer der Tiere, welche nur eine Vakzine erhalten hatten (Abb. 13 A, B, C). Bei SPF-Hühnern waren alle ND-Antikörper-Titer der Kombinationsgruppen zu beiden Probezeitpunkten signifikant erhöht im Vergleich zu der Kontrollgruppe, außer im IDEXX® ELISA Test Kit (Abb.13). Bei Broilern zeigten sich diese signifikanten Unterschiede der mit beiden Impfstoffen geimpften Gruppe nur in einem ELISA-Test Kit (Abb. 14 B). Im zweiten Versuch wurden zusätzlich die ND-Antikörpertiter aus Tränenflüssigkeiten im ELISA Test-Kit bestimmt. Fünf Wochen nach Impfung konnte ein erhöhter Gehalt an ELISA-IgG-Antikörpern in Tränenflüssigkeiten in allen geimpften Gruppen gezeigt werden. Am höchsten waren diese Titer in der Kombinationsgruppe. Unsere Ergebnisse bestätigen die auch von Rauw et al. gezeigten Ergebnisse. Hier zeigten ebenfalls die mit rHVT-ND in Kombination mit einem Lebendimpfstoff geimpften Gruppen die höchsten ND-Antikörpertiter in Tränenflüssigkeiten im Vergleich zu einzeln geimpften Gruppen (RAUW et al. 2010). Sieben Tage nach der Belastungsinfektion mit dem APMV-1 Stamm LaSota zeigten sich sowohl im ELISA- als auch im HAH-Titer deutliche Boostereffekte (MAJIYAGBE u. HITCHNER 1977). Dieser Boostereffekt entsteht, wenn sich nach einem primären Antigenkontakt Gedächtnis B-Zellen im ganzen Körper verteilt haben und diese Zellen auf einen wiederholten Antigenkontakt mit einer erneuten und schnelleren Immunantwort als bei primärem Antigenkontakt reagieren (JEURISSEN et al. 2000). Dadurch werden schnellere humorale und lokale Immunantworten ermöglicht. Dieser Effekt zeigte sich im ELISA sowie im HAH-Test in beiden Versuchen. 91 Bei SPF-Tieren wurden fünf Wochen nach der Impfung deutlich höhere Titer in den Lebendimpfstoffgruppen detektiert als bei kommerziellen Broilern, welche maternale Antikörper besaßen. Die Hemmung des ND-Lebendimpfstoffes durch maternale Antikörper ist hier vermutlich ausgeprägter als die des rHVT-ND. Diese durch maternale Antikörper induzierte Hemmung einer Lebendvakzine wurde auch in anderen Studien gezeigt (MORGAN et al. 1993). Bei rHVT-ND beeinträchtigt die Hemmung durch maternale Antikörper, welche gegen den Vektor oder das Fremdantigen gerichtet sein können, die Replikationsrate des Virus und somit die Ausbildung einer Protektivität nur unwesentlich (MORGAN et al. 1993). Die Kombination von rHVT-ND mit dem Lebendimpfstoff induzierte in unserer Studie die höchsten Antikörpertiter. Dies konnte auch bei einer Kombination von einem NDLebendimpfstoff mit einem inaktivierten Impfstoff beobachtet werden (FOLITSE et al. 1998). Es kann spekuliert werden, dass durch den Lebendimpfstoff ein „Priming“ des Immunsystems stattfindet, bei dem eine spezifische Immunität gebildet wird. Bei einer parallelen rHVT-ND Applikation befindet sich rHVT-ND etwa ab dem siebten Tag nach Impfung in der Latenzphase, wodurch eine kontinuierliche beziehungsweise wiederholende Stimulation des Immunsystems aufrechterhalten bleibt. Am 45. Tag nach der Impfung registrierten wir in nicht belastungsinfizierten Tieren einen Rückgang der Antikörperproduktion, welcher bei der lebendgeimpften Gruppe deutlicher ausfiel als bei der Kombinationsgruppe (Abb. 14 A,C). 6.4.1.2 Zell-vermittelte Immunität Eine durchflusszytometrische Untersuchung erlaubt eine Messung der relativen Zahlen von Immunzellpopulationen und ermöglicht somit einen Hinweis auf eine Impfstoff-induzierte Stimulation des Immunsystems. In Experiment 2 dieser Studie wurden periphere Blut-Leukozyten zehn und 35 Tage nach Impfung und Milzzellen fünf und 35 Tage nach der Impfung auf CD4+, CD8+, BU-1+, KUL01 und IgA+ Zellen sowie auf die αβ- und γδ- T-Zellsubpopulationen untersucht. 92 Zwischen den beiden Zeitpunkten war ein Unterschied in den relativen Zellzahlen der ungeimpften und geimpften Gruppen zu erkennen. Diese zeigten sich am 35. Tag nach der Impfung bis auf einige Ausnahmen prozentual erhöht. Bei peripheren Blutleukozyten waren diese Unterschiede deutlicher als bei den Milzzellen. Diese Zellzahlerhöhungen an einem späteren Zeitpunkt nach der ND-Impfung könnten auf einen altersbedingten Unterschied in den relativen Zellzahlen hindeuten, da sich die gleichen Unterschiede auch in den nicht geimpften Gruppen außer bei BU-1+ Milzzellen zeigen. Hier befanden sich die Zellzahlen der ungeimpften Tiere an beiden Zeitpunkten auf einer Höhe. In Milzen zeigte sich am fünften Tag nach der Impfung eine Erhöhung des relativen Anteils von CD4+ Zellen in geimpften Gruppen. Diese Erhöhung fiel noch deutlicher in der dual-vakzinierten Gruppe aus, was in Zusammenhang mit der Kombination von rHVT-ND mit dem Lebendimpfstoff stehen kann und auf einen additiven Effekt der beiden Impfstoffe hindeutet (Abb. 16 C). In diesem Experiment wurde rHVT-ND am 10. Tag nach Applikation in Milzen von SPF-Hühnern nachgewiesen. In anderen Studien konnte HVT vier bis 14 Tage nach Einbringung in den Organismus in der Milz nachgewiesen werden (FABRICANT et al. 1982). Eine Replikation von rHVT-ND in der Milz könnte hier in Zusammenhang mit dem erhöhten CD4+ Zellanteil stehen. Eine Erhöhung fand sich auch am fünften Tag bei CD4+/αβ+, CD4+/γδ und CD8+/αβ+ Milzzellen in rHVT-ND geimpften Gruppen. 35 Tage nach der Impfung zeigten sich deutlichere Erhöhungen in der rHVT-ND Gruppe im Vergleich zu der Kontrollgruppe bei Bu-1+, CD4+, CD4+/γδ+, CD8+, CD8+/αβ+ und CD8+/γδ+ Milzzellen. Die Erhöhung dieser Zellzahlparameter könnte ebenfalls mit einer rHVT-ND Replikation in Verbindung stehen. Der prozentuale Anteil von KUL01+ Zellen zeigte sich hier in zirkulierenden Blutleukozyten 10 Tage nach rHVT-ND Impfung, aber auch nach ND- Lebendimpfung, erhöht. Der Transport von HVT von der Lunge in die lymphoiden Organe erfolgte durch Makrophagen, was eine Erhöhung dieser Zellzahlen verursachen könnte (DAVISON 2004b). 93 Eine antivirale Immunität gegen Herpesviren wird prinzipiell durch CD8αβ+ zytotoxische T-Lymphozyten und CD4+ Helferzellen eingeleitet (DAVISON 2004a). CD4+ und CD4/γδ+ Zellzahlen zeigten Erhöhungen in Milzen in rHVT-ND geimpften Gruppen an beiden Zeitpunkten. Eine deutliche Erhöhung von CD8αβ+ in Milz und PBL konnte jedoch nicht in rHVT-ND geimpften Gruppen beobachtet werden. CD4+ periphere Blut-Leukozyten zeigten am zehnten Tag nach der Impfung eine Erhöhung in den mit Lebendimpfstoff geimpften Gruppen im Vergleich zur ungeimpften und rHVT-ND Gruppe. Dies bestätigt die Studie von Dalgaard et al. von 2010, wo durch eine ND-Lebendimpfung oder -Infektion eine antigenspezifische Proliferation von zirkulierenden CD4+ und CD8+ T-Zellen hervorgerufen wurde (DALGAARD et al. 2010). Diese am zehnten Tag pv erfolgte Erhöhung in den mit Lebendimpfstoff geimpften Gruppen zeigte sich nicht am 35. Tag pv. 6.4.2 6.4.2.1 Lokale Immunität Effekt auf lokale Immunzellpopulationen Die erste zelluläre Immunantwort gegen virale Erreger erfolgt durch natürliche Killerzellen (NK-Zellen), Granulozyten und Makrophagen. Sobald APMV-1 die Barrieren der angeborenen Immunität überwunden hat, wird eine weitere, pathogenspezifische Immunantwort durch T- und B-Zellen eingeleitet, welche sich in lokaler Erhöhung dieser Zellzahlen äußert. In Abbildung 17 und 18 sind die signifikanten Anstiege von Immunzellpopulationen in den einzelnen Organen nach ND-Impfung von SPF-Hühnern und Broilern des Ergebnisteils zusammengefasst. Interstitielle CD8+ und CD4+ Zellpopulationen wurden rund um die Ausführungsgänge der Harderschen Drüse bereits am ersten Tag nach dem Schlupf gefunden und stiegen bei ungeimpften Tieren dann bis zur achten Lebenswoche an (DUMRONGSOONTORNCHAI 1999). Nach ND-Lebendimpfung zeigten sich in dieser Studie jedoch schon früher erhöhte T- und B-Zellpopulationen in Harderschen Drüsen. 94 Bei SPF-Hühnern zeigte sich zehn Tage nach der ND-Lebendimpfung ein Anstieg von CD4+, CD8+, BU-1+, KUL01+ und IgA+ Zellen in der Harderschen Drüse im Vergleich zur Kontrollgruppe. Dieses Ergebnis steht in Zusammenhang mit dem Lebendimpfstoff, welcher die Erhöhung dieser Zellzahlen induziert (RUSSELL et al. 1997). CD8+ Zellen tragen zur viralen Clearance bei, da sie lokal APMV-1-befallene Zellen töten (AL-GARIB 2003). Bei Broilern zeigten sich am fünften Tag nach Lebendimpfung CD4+, CD8+, Bu-1+, KUL01+ und IgA+ Zellen in Harderschen Drüsen ebenfalls erhöht. Bei CD4+, CD8+, Bu-1+ und KUL01+ Zellen fielen diese Erhöhungen signifikant im Vergleich zur nicht geimpften Gruppe aus (Abb 18). Bei SPF-Tieren zeigten sich in der Harderschen Drüse am zehnten Tag nach rHVTND Impfung ebenfalls Anstiege in der zweiten Gruppe von CD4+, CD8+, Bu-1+ und KUL01+ Zellen in der Harderschen Drüse im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abb. 7 A, C, E, G). Falls rHVT-ND die Hardersche Drüse erreicht, könnte dies mit einer Herpesvirus-spezifischen Zellabwehr in Verbindung stehen (DAVISON 2004a). Bei SPF-Hühnern wurde ein signifikanter Anstieg von BU-1+ Zellen in Harderschen Drüsen im Vergleich zur ungeimpften Gruppe am zehnten Tag pv in der mit dem NDLebendimpfstoff allein geimpften Gruppe festgestellt. Bei Broilern zeigte sich ein signifikanter Anstieg von B-Zellen fünf Tage nach der ND-Impfung bei beiden mit NDLebendimpfstoff geimpften Gruppen, am zehnten Tag stiegen nur Bu-1+ Zellen der dual-vakzinierten Gruppe an, jedoch nicht signifikant. Der BU-1 Marker wird auf jeder B-Zelle, außer auf Plasmazellen, detektiert (HOUSSAINT et al. 1987). Nach einer konjunktivalen Impfung mit einer ND Lebendvakzine stiegen BU-1 Zellpopulationen in der Harderschen Drüse um das Zweifache an (RUSSELL et al. 1997). Dies konnte in unserer Studie nach ND-Lebendimpfung bei SPF-Tieren bestätigt werden. In der rHVT-ND einzeln geimpften Gruppe zeigten sich erkennbare, aber nicht signifikante Anstiege von Bu-1+ Zellen bei Broilern fünf Tage nach der Impfung und bei SPF-Hühnern zehn Tage nach der Impfung in der Harderschen Drüse. Die Hardersche Drüse bei Hühnern besitzt interstitielle Plasmazellpopulationen, welche bis zur vierten Lebenswoche prozentual ansteigen und von dem Zeitpunkt an 95 ein Plateau erreichen (DUMRONGSOONTORNCHAI 1999). IgA+ Zellen können bereits einen Tag nach dem Schlupf in den Harderschen Drüsen von nicht-geimpften Broilern detektiert werden (DUMRONGSOONTORNCHAI 1999). Durch NDLebendimpfung erfolgte eine Erhöhung dieser Zellen in dieser Studie. Bei der Untersuchung von Zellzahlen in der Lunge war eine serienmäßige Anfertigung und Auswertung von Anschnitten des Bronchus-assoziierten lymphoiden Gewebes (BALT) aufgrund der Kleinheit der BALT-Areale nicht möglich. Es wurden stattdessen Lungenparenchymbereiche um Parabronchien in unmittelbarer Nähe der BALT-Areale ventral der Ausmündungen der Sekundärbronchien untersucht und bewertet. Diese Bereiche eigneten sich gut zur Auszählung von Immunzellen und erlauben durch ihre Nähe zu den Sekundärbronchien eine Bewertung von lokalen Immunreaktionen. In dieser Studie wurden Anstiege von T-Zellpopulationen im Lungenparenchym bei SPF-Hühnern und Broilern registriert, was mit einer Virusreplikation in Verbindung stehen könnte. Hierbei wurde eine signifikante Erhöhung von CD4+ Zellen im Vergleich zur Kontrollgruppe in dual vakzinierten SPF-Tieren festgestellt (Abb. 17). Bei Broilern zeigten sich signifikante Anstiege der CD4+ Zellzahlen am fünften Tag nach Impfung in der rHVT-ND geimpften Gruppe (Abb. 18). HVT sowie rekombinante Varianten von HVT replizieren lokal in der Lunge (GIMENO et al. 2011). In dieser Studie wurden Anstiege von CD4+ und CD8+ Zellpopulationen in Lungen von SPF-Hühnern und Broilern detektiert, was mit der lokalen Virusreplikation in Verbindung stehen könnte. rHVT persistiert und zirkuliert für mindestens 30 Wochen in lokalen Lymphozyten und peripheren Blutleukozyten (TSUKAMOTO et al. 2002). Diese dringen in lymphoide Gewebe des Respirationsund Gastrointestinal-Traktes ein, wo lokal Fremdantigene präsentiert werden (TSUKAMOTO et al. 2002). Es ist bekannt, dass Marek’s Disease Herpesviren in der zytolytischen Phase der Erkrankung von Makrophagen aus den Lungen in den Blutkreislauf transportiert werden und von dort aus strikt zell-assoziiert über lymphoide Zellen in die lymphoiden Gewebe gelangen. Virales MDV-Genom kann in der Milz, dem GALT, der Zäkaltonsille, der Harderschen Drüse und dem CALT vom zweiten bis zum siebten Infektionstag nachgewiesen werden (BARROW et al. 2003; 96 DAVISON 2004b). Inwieweit rHVT-ND bei einer subkutanen oder in-ovo Applikation diese Gewebe erreicht, ist nicht bekannt. In der Zäkaltonsille konnte ein Anstieg von CD8+ Zellen in der rHVT-ND einzeln geimpften Gruppe bei SPF-Tieren festgestellt werden (Abb. 12 C). KUL01+ Zellen zeigten sich in den beiden mit ND-Lebendimpfstoff geimpften Gruppen zu diesem Zeitpunkt ebenfalls erhöht (Abb 12 G). Bei Broilern konnte in Zäkaltonsillen in allen geimpften Gruppen am fünften Tag pv leicht erhöhte CD4+ Zellzahlen detektiert werden (Abb. 3 D) und zehn Tage nach Impfung leicht erhöhte B-Zellzahlen (Abb. 12 F). CD8+ Zellen zeigen sich bei SPF-Tieren 10 Tage pv in der rHVT-ND Gruppe erhöht (Abb. 12 C). Wenn rHVT-ND die Zäkaltonsille erreicht, könnte auch hier eine Herpesvirus spezifische CD8-T-Zellabwehr eine Erklärung für die erhöhten CD8+ Zellen sein (DAVISON 2004a), jedoch findet sich hier keine Erhöhung von CD8+ Zellen in der rHVT-ND mit Lebendimpstoff kombinierten Gruppe (Abb. 12 C). Die Erhöhung von KUL01+ Zellen bei SPF-Tieren am zehnten Tag nach NDLebendimpfung in Zäkaltonsillen könnte mit einer APMV-1 Replikation in Verbindung stehen, jedoch repliziert der hier beteiligte APMV-1 Stamm LaSota-Klon „Clone 30“ normalerweise nur im Respirationstrakt (WAKAMATSU et al. 2006). Bei der Auswertung des Konjunktiva-assoziierten lymphatischen Gewebes(CALT) konnten im ersten Versuch bei SPF-Hühnern aufgrund der aufrechten Einbettung der Augenlider auf dem Papier zu wenige BALT-Areale serienmäßig angeschnitten werden, um eine statistische Beurteilung durchzuführen. Im zweiten Versuch wurde das Augenlid flach mit der Rückseite auf das Filterpapier gelegt. Somit waren serienmäßige Anschnitte möglich. Bei Broilern zeigten sich Anstiege von CD4+ und CD8+ Zellzahlen in ND-lebendgeimpften Gruppen, welche vermutlich durch eine lokale APMV-1 Virusreplikation des Impfvirus Clone 30 hervorgerufen wurden (RUSSELL et al. 1997). Zusammengefasst zeigte sich in Harderschen Drüsen nach einer rHVT-ND Impfung eine Erhöhung von CD4+, CD8+, Bu-1+ und KUL01+ Zellen und eine Erhöhung dieser Zellen in der Lunge am zehnten Tag nach Impfung von SPF-Hühnern. In der 97 Lunge von Broilern wurde ein signifikanter Anstieg von CD4+ T-Zellen am fünften Tag nach rHVT-ND Impfung festgestellt (Abb. 18). Der ND-Lebendimpfstoff erzeugt in Harderschen Drüsen von SPF-Hühnern eine signifikante Erhöhung von CD4+, Bu1+ und KUL01+ Zellen im Vergleich zur ungeimpften Gruppe (Abb. 17). In der Harderschen Drüse von Broilern sind die signifikanten Unterschiede zur ungeimpften Gruppe am fünften Tag nach ND-Lebendimpfung bei CD4+, CD8+, Bu1+ und KUL01+ Zellen detektiert worden (Abb. 18). In der Lunge zeigten sich bei Broilern fünf Tage nach ND-Lebendimpfung erhöhte CD4+ und CD8+ Zellzahlen. Diese Zellinfiltrate interferieren lokal mit der Virusreplikation und bieten somit Schutz vor einer NDV-Infektion (AL-GARIB 2003). rHVT-ND erhöht lokale Immunzellpopulationen in Harderscher Drüse und Lunge. Diese sind niedriger als nach einer Impfung mit der Lebendvakzine. 98 SPF Zelltypen Hardersche Drüse Lunge R L R+L R Zäkaltonsille L R+L R L R+L CD4+ CD8+ Bu-1+ KUL01+ IgA+ Abbildung 17: Übersicht über signifikant erhöhte Immunzellparameter von SPFHühnern am zehnten Tag nach ND-Impfung (p<0,05; Kruskal–Wallis One-way AOV mit anschließendem paarweisem Vergleich) Weißer Pfeil: signifikant erhöhte Immunzellzahlen im Vergleich zur ungeimpften Gruppe am zehnten Tag nach Impfung; R = rHVT-ND-geimpfte Gruppen; L = ND-Lebendimpfstoff-geimpfte Gruppen; R+L = mit rHVT-ND und Lebendimpfstoff-geimpfte Gruppen Broiler Zelltypen Hardersche Drüse Lunge R L R+L R L R+L Zäkaltonsille CALT R R L R+L L R+L CD4+ CD8+ Bu-1+ KUL01+ IgA+ Abbildung 18: Übersicht über signifikant erhöhte Immunzellparameter von Broilern am fünften Tag nach ND-Impfung (p<0,05; Kruskal–Wallis One-way AOV mit anschließendem paarweisem Vergleich) 99 Schwarzer Pfeil: signifikant erhöhte Immunzellzahlen im Vergleich zur ungeimpften Gruppe am fünften Tag nach Impfung; R= rHVT-ND-geimpfte Gruppen; L = Lebendimpfstoff-geimpfte Gruppen; R+L = mit rHVT-ND und Lebendimpfstoff-geimpfte Gruppen; CALT= Konjunktiva-assoziiertes lymphatisches Gewebe 6.4.2.2 Antikörper in Tränenflüssigkeiten Lokale Anti-APMV-1 IgG Antikörper wurden im zweiten Versuch nach Impfung von kommerziellen Broilern aus Tränenflüssigkeiten am 36. Versuchstag bestimmt. Eine Studie von Rauw et al. von 2010 (RAUW et al. 2010) zeigte eine lokale, gegen APMV-1 gerichtete IgG-Antikörper-Antwort in Tränenflüssigkeiten von Hühnern fünf Wochen nach Impfung mit rHVT-ND. Dort zeigten Gruppen, welche mit einer Lebendvakzine geimpft worden waren, erhöhte lokale IgG-Titer in Tränenflüssigkeiten. Dies wurde auch durch unsere Studie bestätigt. Die Höhen der lokalen IgG-Titer korrelierten hierbei mit den Antikörper-Serumwerten. Die mit beiden Impfstoffen vakzinierten Gruppen zeigten eine signifikante Erhöhung der Titer und den höchsten Titer aller Gruppen in Tränenflüssigkeiten im Vergleich zur Kontrollgruppe, ähnlich wie bei den Serumtitern. Eine mögliche Ursache für das Vorkommen dieser IgG-Antikörper in und auf den Schleimhäuten kann eine partielle Transsudation aus dem Blut in lokale lymphoide Gewebe sein (AL-GARIB et al. 2003). Jedoch werden IgG-Antikörper auch lokal in der Submukosa produziert (KAETZEL et al. 1994). Ein ähnliches Phänomen kann nach Impfung mit inaktivierten ND-Vakzinen beobachtet werden, welche bei parenteraler Applikation hauptsächlich eine humorale Immunantwort generieren. Diese Vakzinen erzeugen einen sehr hohen und langanhaltenden humoralen Titer durch lange Antigenpräsentation. Auch hier können lokale Anstiege in Tränenflüssigkeiten und trachealen Waschungen von spezifischen Anti-APMV-1 Antikörpern beobachtet werden, wie eine Studie von Zoth et al. von 2008 zeigte (CHIMENO ZOTH et al. 2008). Al-Garib et al. zeigten 2003 in ihrer Studie, dass sowohl spezifische IgM als auch IgG, aber nicht IgA nach Impfung mit einer 100 inaktivierten Vakzine in Trachealflüssigkeiten anstiegen (AL-GARIB et al. 2003). Die in unserer Studie detektierten IgG-Antikörper aus den Tränenflüssigkeiten sind daher Bestandteil der lokalen Immunität, aber wahrscheinlich hauptsächlich systemischen Ursprungs. Diese Antikörper tragen durch Neutralisierung der Viren und Verhinderung der initialen Replikation lokal an den Eingangspforten des APMV-1 zur protektiven Immunität gegen die ND bei. 6.5 Virusausscheidung Eine Infektion, Ausscheidung und Übertragung von APMV-1 kann ohne klinische Erkrankung stattfinden. Impfprogramme reduzieren die klinische Erkrankung und Mortalität während eines Newcastle Disease Ausbruches, die Virusausscheidung und Übertragung wird aber nicht in jedem Fall reduziert, sodass sich die Erkrankung endemisch ausbreiten kann (DORTMANS et al. 2012). APMV-1 wird über oropharyngeale Sekrete und auch über Faeces ausgeschieden. Immunisierte Hühner scheiden APMV-1 normalerweise für sechs bis acht Tage nach einer Belastungsinfektion aus (KAPCZYNSKI u. KING 2005). rHVT-ND bietet vollen klinischen Schutz nach in-ovo und subkutan- Applikation gegen eine Newcastle Disease Virus Belastungsinfektion (Stamm TEXAS G.B./48) (REDDY et al. 1996). Bei Untersuchungen zur lokalen respiratorischen Immunität in diesem Versuch wurde eine Virusausscheidung jedoch nicht verhindert. Das Belastungsvirus konnte fünf Tage nach einer in der vierten Lebenswoche stattgefundenen Belastungsinfektion aus Tracheen fast aller Tiere isoliert werden, was bei einer in diesem Experiment verwandten Lebendvakzine nicht der Fall war (REDDY et al. 1996). Die Erhöhung der rHVT-ND Impfdosis hatte in dem Versuch von Reddy et al. keinen Einfluss auf die lokale Virusausscheidung. Ebenfalls wurde in jener Studie spekuliert, dass die unterschiedlichen Ausbreitungswege der beiden Vakzinen einen unterschiedlichen Einfluss auf die Immunität haben. Herkömmliche respirotrope Lebendvakzinen replizieren vermehrt lokal, infizieren den Respirationstrakt und erzeugen dort eine lokale Immunität, wohingegen rHVT-ND zell-assoziiert repliziert und sich systemisch verbreitet. 101 Klinische Ausbrüche der ND können jedoch auch nach ND-Impfung stattfinden (KE et al. 2010). Eine antigenetische und/oder phylogenetische Variation zwischen Impfund Feldvirus kann als mögliche Ursache für eine ungenügende Immunisierung und dadurch resultierende Feld-Virusausscheidung in Frage kommen. Die heutzutage gängigsten Lebendimpsftoffe basieren auf APMV-1 Virusstämmen, welche phylogenetisch zu den Genotypen I und II gehören. APMV-1 Virusstämme, welche in den letzen zwei Jahrzehnten verantwortlich für Ausbrüche der ND waren, gehörten zu Genotyp IV, V und VII (YU et al. 2001; ABOLNIK et al. 2004; PEDERSEN et al. 2004; LIEN et al. 2007; LIU et al. 2007; IRVINE et al. 2009; KE et al. 2010). Eine genetische Übereinstimmung von Impf- und Feldviren, kann, muss aber nicht mit einer besseren Protektion in Verbindung stehen (KAPCZYNSKI u. KING 2005; MILLER et al. 2007; HU et al. 2009; MILLER et al. 2009a). Genotypisch unterschiedliche Impfstoffe besitzen in einer von Dortmans et al. gezeigten Studie die gleichen protektiven Eigenschaften wie eine Lebendvakzine des gleichen Genotyps (DORTMANS et al. 2012). Für einen Impferfolg sind gute Impfpraxis, Hygiene- und Stallmanagement ebenso ausschlaggebend wie die Wahl des richtigen Impfprogrammes. Ein möglichst hoher homogener Antikörpertiter innerhalb der Herde sowie eine möglichst geringe Virusausscheidung sind Hauptziele einer NDImmunisierung. Eine Lebenvakzine kann neben Anpassung an phylogenetische und antigenetische Gegebenheiten auch mit inaktivierten Impfstoffen gegen die ND kombiniert werden, um eine stärkere humorale Immunantwort herbeizuführen (GIAMBRONE u. CLAY 1986; FOLITSE et al. 1998). Eine Kombination von rHVT-ND mit einem Lebendimpfstoff ist eine Alternative zu gängigen Lebendimpfstoff-Inaktivat Kombinationen. In unserem Versuch war bei SPF-Hühnern die Virusausscheidung in der rHVT-ND Gruppe und in der Kontrollgruppe am dritten, fünften und siebten Tag vergleichbar hoch. In der rHVT-ND-Gruppe fand somit keine signifikante Reduzierung der Virusausscheidung statt, wie in ND-Lebendgeimpften Gruppen. Die Virusübertragung auf die Kontaktsentinels war in der rHVT-ND Gruppe jedoch im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant verringert. rHVT-ND induzierte also eine Teilimmunität, die zu einer Reduktion der Virusübertragung nach Belastungsinfektion führte. Die 102 Lebendimpfstoffgruppe und die Kombinationsgruppe zeigten protektive respiratorische Immunität, kein Tier schied Virus nach Belastungsinfektion aus. Bei kommerziellen Broilern wurde die bei SPF-Tieren beschriebene Teilimmunität nicht beobachtet, in der rHVT-ND Gruppe fand eine volle Virusausscheidung und Übertragung statt. Die Lebendvakzine zeigte eine signifikante Reduzierung der trachealen Virusausscheidung im Vergleich zu ungeimpften Tieren. Bei SPF-Tieren stellte sich eine signifikante Reduzierung der Übertragung von Belastungsvirus auf naive Empfängertiere in der rHVT-ND Gruppe dar, was bei Broilern nicht beobachetet wurde. Weiterführende Untersuchungen mit unterschiedlichen Belastungsvirusstämmen von unterschiedlicher Virulenz könnten hilfreich sein, um die Protektivität von rHVT-ND zu prüfen. 6.6 Vergleich von SPF-Hühnern und Broilern Aufgrund genetischer Selektion unterscheiden sich Broiler und Hühner vom Legetyp in ihren immunologischen Eigenschaften (KOENEN et al. 2002). Humorale und zelluläre Immunantworten fallen bei Legehennen generell höher aus als bei Broilern, welche wahrscheinlich aufgrund der gezielten Selektion auf Körpergewicht und Futterverwertung immunologische Nachteile besitzen (KOENEN et al. 2002). So reagierten Legehennen beispielsweise nach intravenöser Applikation von 2,4,6Trinitrophenyl mit einer höheren IgG-Antwort als Broiler (KOENEN et al. 2002). Diese linienbedingten Unterschiede konnten auch in dieser Studie beobachtet werden. Humoral systemische Immunantworten fielen in dieser Studie bei SPFHühnern vom Legetyp höher aus als bei kommerziellen Broilern. Die lokal zellulären Immunantworten fielen in diesem Versuch auch bei SPF-Hühnern höher aus, außer bei Harderschen Drüsen, bei denen die gezählten Zellzahlen der Broiler am elften Versuchstag höher waren als bei SPF-Hühnern (Abb.7). Die APMV-1-Antikörperfreiheit bei SPF-Hühnern spielt ebenfalls in der Ausbildung der Immunität eine große Rolle. Die ND-Lebenvakzine wird hierbei nicht von maternalen Antikörpern gehemmt, was zu einer ausgeprägteren Immunantwort führt, 103 als bei Broilern. Auch zeigte eine Studie mit dem Hitchner B1-Stamm bei SPFHühnern einen besseren Schutz vor einer Belastungsinfektion als bei Broilern (MORGAN et al. 1993). Bei kommerziellen Broilern interferieren maternale Antikörper mit den Impfstoffen und verhindern somit die Ausbildung einer vollen Immunität. Die Immunantworten verliefen aber in unserer Studie tendenziell ähnlich im Vergleich zu SPF-Hühnern. 6.7 Weiterführende Untersuchungen Ob eine lokale rHVT-ND Replikation in Verbindung mit erhöhten Immunzellpopulationen steht, könnten immunhistochemische Untersuchungen nach rHVT-ND Antigenen in der Lunge und weiteren Organen klären. Ein Nachweis von rHVT-ND in der Harderschen Drüse und dem CALT des Augenlids könnten beispielweise klären, inwieweit rHVT-ND in diese lymphatischen Gewebe vordringt. Auch könnte die Konstruktion eines neuen rHVT-ND Vektors mit mehreren F-Genen eine Verbesserung des Schutzes vor einer Belastungsinfektion erwirken, wie es eine Studie mit einem rekombinanten HVT gegen die Infektiöse Bursitis des Huhns zeigte, wo sich die Menge des exprimierten Antigens weitaus mehr auf die Immunität auswirkte als die Replikationsrate des Vektors (TSUKAMOTO et al. 2002). Impfstoffe, welche sero- und genotypisch an den Feldstamm angepasst sind, könnten die Virusausscheidung effizienter verringern als nicht-homologe Impfstoffe (SUAREZ et al. 2006; VAN BOVEN et al. 2008). Der APMV-1 Stamm LaSota, welcher hier als Challengevirus fungierte, ist, wie auch der APMV-1 Stamm Clone 30, vom Genotyp II. Das F-Protein, welches hier in den Vektor integriert wurde, wurde ebenfalls vom APMV-1 Stamm Clone 30 kloniert. Die Vakzinen und das Belastungsvirus stimmten in unserem Versuch geno- sowie serotypisch überein. Weiterführende Untersuchungen mit einem genotypisch unterschiedlichen Belastungsvirus könnten Aufschluss über die Wirksamkeit von rHVT-ND im Feld mit verschieden Virustypen geben. Untersuchungen mit einem velogenen Virusstamm könnten weitere Erkenntnisse über die klinische Protektion und Virusausscheidung geben. 104 6.8 Fazit In dieser Studie wurde erstmals der Einfluss eines rekombinanten Putenherpesvirus, welches das F-Protein des APMV-1 exprimiert, auf die zell-vermittelte lokale Immunität nachgewiesen. Hierbei wurde eine Einzelapplikation und eine Kombination mit einer Lebendvakzine untersucht. Wir konnten zeigen, dass es bei einer rHVT-ND Immunisierung zu einer lokalen respiratorischen Teilimmunität kommt. Die mit APMV-1 Stamm LaSota belasteten Tiere schieden das Belastungsvirus nach rHVT Impfung zwar aus, jedoch wurde es bei SPF-Tieren signifikant reduziert auf naive Empfängertiere übertragen. Dies war bei Broilern nicht der Fall. Lokale Immunzellpopulationen zeigten sich nach rHVTND-Impfung im Vergleich zur Kontrollgruppe leicht erhöht. rHVT-ND induziert einen durch HAH und ELISA messbaren Antikörper-Titer. Bei einer Kombination von rHVTND mit einer Lebendvakzine zeigten sich stärkere Immunantworten als bei Applikation der einzelnen Vakzinen allein. Die Antikörpertiter waren in der dualvakzinierten Gruppe immer höher als in den restlichen Gruppen. Eine Kombination beider Vakzinen bietet somit neben der Erhöhung und Verlängerung der Immunantwort weitere Vorteile, wie die in-ovo Applikation, eine geringere Interferenz mit maternalen Antikörpern und längere Expression des Antigens, sowie einem additiven, wenn nicht sogar synergistischen Effekt aus Priming der Lebendvakzine und parallel stattfindend anhaltender Antigenexprimierung des latenten rHVT-ND. Die Kombination zukunftsweisende von rHVT-ND Alternative zur mit einer ansonsten Lebendvakzine üblichen bietet Kombination eine eines Lebendimpfstoffes und einer Inaktivatvakzine, da rHVT-ND eine lokale Teilimmunität induziert und einen Boosterfeffekt durch eine lange Latenzzeit mit langer Antigenexprimierung herbeiführt. Auch ist durch die in-ovo Methode und Verabreichung des Lebendimpfstoffs über das Trinkwasser eine Massenapplikation dieser Kombination möglich (RAUW et al. 2010). 105 7 Zusammenfassung Jens-Christian Cors (2013): Untersuchungen zu lokalen Immunreaktionen nach Impfung gegen das Newcastle Disease Virus mit einem rekombinanten Putenherpesvirus und einer herkömmlichen Lebendvakzine Die Newcastle Disease (ND) wird durch das aviäre Paramyxovirus Serotyp 1 (APMV1) verursacht. Bei Huhn und Pute kann die Erkrankung in Abhängigkeit von der Virulenz des APMV-1 Stammes vom perakuten Tod bis zur subklinischen Erkrankung variieren. Trotz umfangreicher Impfprogramme und Schutzmaßnahmen werden durch die Erkrankung weltweit erhebliche wirtschaftliche Verluste verursacht. Herkömmliche Impfprogramme induzieren lokale und systemische Immunität, jedoch gehen sie teilweise mit Impfreaktionen einher und verhindern nicht in allen Fällen eine Erkrankung und Virussauscheidung. Rekombinante Vakzinen auf der Basis eines Putenherpesvirus (HVT), welche das FProtein des APMV-1 exprimieren (rHVT-ND), stellen eine interessante Alternative zu herkömmlichen Impfstoffen dar. Durch rHVT-ND kann eine Immunität sowohl gegen die Newcastle Disease als auch die Marek’s Disease erzeugt werden. In dieser Arbeit wurde die Wirkung einer rHVT-ND-Vakzine auf systemische sowie lokale Immunreaktionen des oberen Respirationstraktes, der Lunge und der Zäkaltonsillen untersucht. Die Effekte wurden bei spezifisch pathogen-freien Hühnern (Experiment 1) und kommerziellen Broilern (Experiment 2) untersucht und mit der Wirkung einer herkömmlichen Lebendvakzine verglichen. rHVT-ND wurde zusätzlich mit dieser Lebendvakzine kombiniert, um eine mögliche Steigerung der Immunität zu untersuchen. Folgende Parameter wurden zwischen ungeimpften, rHVT-ND-, ND-Lebend- und rHVT-ND+ND-Lebend-geimpften Gruppen verglichen: 1) Die Anzahl zirkulierender sowie lokaler B-, T-Zell- und Makrophagenpopulationen in Harderscher Drüse, in Konjunktiva-assoziiertem lymphatischem Gewebe, in Lunge und in Zäkaltonsille. 2) 106 Die systemische und lokale ND-Antikörperproduktion. 3) Die tracheale und kloakale Virusauscheidung nach einer Belastungsinfektion. In dieser Studie waren nach einer rHVT-ND Impfung lokale Immunzellpopulationen im Vergleich zur Kontrollgruppe leicht erhöht. Bei Broilern wurde eine signifikante Erhöhung von CD4+ Zellen in Lungen fünf Tage nach rHVT-ND Impfung beobachtet (p<0,05). Zudem wurde nach rHVT-ND-Impfung ein durch den HAH-Test und ELISA messbarer Antikörpertiter erzeugt. Es konnte gezeigt werden, dass eine rHVT-ND-Impfung zur einer Verringerung der Virusübertragung von belastungsinfizierten SPF-Tieren auf naive Empfängertiere führte. Nach einer Belastungsinfektion mit dem APMV-1 Stamm LaSota von rHVTND geimpften SPF-Tieren schieden diese das Virus zwar aus, jedoch war die Übertragung auf naive Empfängertiere signifikant reduziert (p<0,05). Bei Broilern zeigte sich diese verringerte Übertragung aufgrund von Interferenz mit maternal vermittelter Immunität nicht. Es wurden stärkere Immunantworten bei einer Kombination von rHVT-ND und der Lebendvakzine beobachtet. Neben der Erhöhung und Verlängerung der Immunantwort bietet die Kombination durch rHVT-ND weitere Vorteile, wie die Möglichkeit der in-ovo Applikation, den Vorteil einer geringeren Interferenz mit maternalen Antikörpern und einer längeren Expression des Antigens im Vergleich zu herkömmlichen Lebendvakzinen. Die Erhöhung der Immunantworten kommt wahrscheinlich durch einen additiven, wenn nicht sogar synergistischen Effekt der beiden Vakzinen zustande. Dieser beruht wahrscheinlich auf dem Priming der Lebendvakzine und der parallel dazu stattfindenden konstanten Antigenexprimierung und dadurch Boosterung des latenten rHVT-ND. Somit bietet eine zukunftsweisende rHVT-ND-Kombination Alternative zu der in mit einer Lebendvakzine herkömmlichen eine Impfprogrammen verwendeten Kombination eines Lebendimpfstoffes mit einer Inaktivatvakzine, wobei rHVT-ND eine lokale respiratorische Teilimmunität bei SPF-Tieren stimuliert und zusätzlich einen verstärkten Effekt mit der ND-Lebendvakzine bewirkt. 107 8 Summary Jens-Christian Cors (2013): Investigations of local immunity following vaccination with a recombinant Herpesvirus of turkeys against Newcastle Disease (rHVT-ND) and a commercial Newcastle Disease-live vaccine Newcastle Disease (ND), caused by the Avian Paramyxovirus Serotype 1 (APMV-1), is responsible for severe damages and economical losses in the poultry industry worldwide. The development of clinical disease is dependent on the virulence of the involved AMPV-1 strain, the host species and the immune status of the host. Symptoms may vary from subclinical infection to peracute death with high mortality in a flock. Conventional vaccination regimes stimulate local and systemic immunity and may provide clinical protection in most cases, but viral shedding and spreading of disease still may occur. Therefore, optimisation of existing vaccination strategies is required. New generation vaccines like a recombinant herpesvirus of turkeys expressing the F-protein of APMV-1 are interesting alternatives to conventional vaccines. If and to what extent they may induce local immunity, and reduce or prevent viral shedding in the upper respiratory tract is not clear. In this study, we investigated the effect of rHVT-ND on systemic as well as local immunity in the upper respiratory tract, the lung and cecal tonsils. The following parameters were compared between non-vaccinated, rHVT-ND-, live ND- and rHVT-ND + live ND-vaccinated SPF-chickens (experiment 1) and commercial broilers (experiment 2): 1) Circulating as well as local B-, T-cell and macrophage populations in the Harderian gland, in the conjunctiva-associated lymphoid tissue, in lung and cecal tonsil. 2) Local and systemic antibody production. 3) Tracheal and cloacal virus shedding after a challenge infection. The study has shown that local immune cell populations were raised slightly in rHVTND groups compared to the control group. CD4+ cells were raised significantly in the lung on day five post rHVT-ND vaccination in broilers (p<0,05). 108 rHVT-vaccination alone induced partial local respiratory immunity. After challenge with APMV-1 strain LaSota SPF-chickens from the rHVT-ND vaccinated group shed virus comparable to the control group, but spreading to naive sentinels was reduced significantly (p<0,05). Possibly due to interference with maternal immunity, these effects were not seen in broiler chickens. Vaccination with rHVT-ND induced detectable serological HI- and ELISA-titers. Immune responses were higher in the dual-vaccinated groups as seen in higher humoral antibody titers. Furthermore, application of rHVT-ND provides several advantages such as the possibility of in-ovo application, lower interference with maternal antibodies and a longer antigen expression compared to conventional NDvaccines, especially inactivated ND-vaccines. The enhancement of the immunological response in dual-vaccinated chickens may be explained by an additive or synergistic effect of the both vaccines, which consists of priming of the ND-live vaccine and steady antigen expression and thereby boostering by the latent rHVT-ND. Therefore, a combination of rHVT-ND and ND-live vaccine provides an alternative to conventional vaccination regimes, where ND-live is combined with inactivated NDvaccines. rHVT-ND provides next to partial local immunity and a long latency period with long antigen expression an increased immunological effect in combination with a live vaccine. 109 9 Literaturverzeichnis ABOLNIK, C., R. F. HORNER, S. P. BISSCHOP, M. E. PARKER, M. ROMITO u. G. J. VILJOEN (2004): A phylogenetic study of South African Newcastle disease virus strains isolated between 1990 and 2002 suggests epidemiological origins in the Far East. Archives of Virology 149, 603-619 AFONSO, C. L., E. R. TULMAN, Z. LU, L. ZSAK, D. L. ROCK u. G. F. KUTISH (2001): The genome of turkey herpesvirus. Journal of Virology 75, 971-978 AHMED, K. A., V. K. SAXENA, A. ARA, K. B. SINGH, N. R. SUNDARESAN, M. SAXENA u. T. J. 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Plos One 6, e25000 133 10 Anhang 10.1 SPF-Liste Die folgenden Tests wurden gemäß den Vorgaben der "European Pharmacopoiea" durchgeführt. Erreger Testmethode Ergebnis Aviäre Adenoviren, Gruppe 1 AGP N Aviäre Adenoviren, Gruppe 3, EDS HAH N Aviäre Leukoseviren/RSV ELISA N Aviäre Orthoreoviren ELISA N Aviäres Metapneumovirus (TRT) ELISA N Aviäres Nephritis Virus ELISA N Hühnerpockenvirus KU/PM N Inluenzavirus Typ A AGP N Marek’s Disease Virus AGP N Mycobacterium avium KU/PM N Mycoplasma gallisepticum AGG N Mycoplasma synoviae AGG N Newcastle Disease Virus HAH N Reticuloendotheliose-Virus ELISA N Salmonella pullorum AGG N Salmonella spp. BU N Virus der aviären Enzephalomyelitits ELISA N Virus der Infektiösen Bronchitits ELISA N Virus der Infektiösen Bursitis Serotyp 1 ELISA N Virus der Infektiösen Bursitis Serotyp 2 VN N Virus der Infektiösen Laryngotracheitis ELISA N Virus der Infektösen Kükenanämie (CAV) ELISA N N = Negativ P = Positiv NT = nicht getestet KU = klinische Untersuchung HAH = Hämagglutinationshemmungstest PM = post mortem AGP = Agar-Gel-Präzipitationstest FAT = Fluoreszenz Antikörper Test AGG = Agglutinations-Test VN = Virus-Neutralisationstest BU = bakteriologische Untersuchung ELISA = Enzyme Linked Immunosorbent Assay 134 10.2 Lösungen, Puffer, Medien Phosphat-Puffer (PBS) 0,01 M NaCL 8 g 137 mM KCl 0,2 g 2,7 mM Na2HPO4 2,17 g 10 mM (0,01 M) KH2PO4 0,2 2 mM Aqua bidest. ad 1000 ml pH 7,4 g gepuffertes Formalin Na2HPO4 6,5 g Na2HPO4*H2O 4,0 g Aqua bidest. Ad 900 ml Formaldehyd 37% (entsäuert) 100 ml pH 7,0 Eosin-Stammlösung Eosin 1 g Aqua bidest. 100 ml Eosin-Stammlösung 80 ml Aqua bidest. 160 ml Thymolkristalle einige kleine Kristalle Eosin-Gebrauchslösung 135 Hämalaun-Stammlösung Lösung A Hämatoxylin-Kristalle 1 g Aqua bidest. 400 ml KAl(SO4)2*12 H2O 59 g NaJO3 0,2 g Aqua bidest. 600 ml Chloralhydrat-Kristalle 50 g Zirtonensäure-Kristalle 1 g Aqua bidest. 100 ml Lösung B Hämalaun-Gebrauchslösung Lösung C 200 ml Hämalaun Stammlösung (A+B) mit 10 ml Lösung C vermischen und vor Gebrauch mindestens 24 Stunden ruhen lassen. Leibowitz/McCoy Medium Leibwotz/McCoy Medium (Biochrom AG, Berlin) 1:1 Antibiotikum (Penicillin (100 U/ml)/Streptomycin (100 µg / ml)) Biochrom AG, Berlin) Fetales Bovines Serum (Biochrom AG, Berlin) M6B8 Medium CaCl2 (wasserfrei) CaCl2*2H2O Fe(NO3)3*9H2O MgSO4 (wasserfrei) KCl 1% 136 NaCl NaHCO3 NaH2PO4 (wasserfrei) NaH2PO4*H2O L-Alanin L-Arginin HCl L-Asparagin H2O L- Asparaginsäure L-Cystein HCI*H2O L-Cystin 2HCl L-Glutaminsäure L-Glutamin Glycin L-Histidin HCI*H2O L-Isoleucin L-Leucin L-Lysin HCl L-Methionin L-Phenylalanin L-Prolin L-Serin L-Threonin L-Tryptophan L-Tryosin 2Na*2H2O L-Valin D-Ca Pantothenat Cholinchlorid Folsäure Myo-Inositol Nicotinamid Pyridoxal HCl Riboflavin Thiamin HCl D-Glukose 137 Phenol Rot Natriumpyruvat TPB 8.3% (w/v) TC Tryptose 10% (w/v) TC Lactalbumin Hydrolysat 12% (w/v) TAE-Puffer (für Gelelektrophorese) Stocklösung 50x: Tris-Base 242 g Eisessig 57,1 ml EDTA (0,5 mM pH 8,0) 100 ml Herstellen der Gebrauchslösung: 10 ml TAE 50x in 490 ml Aqua bidest. TAE Gebrauchslösung = 40mM Tris-Acetat, 1mM EDTA Agargelelektrophorese 2% mit Biozym LE Agarose 138 11 Danksagung An dieser Stelle möchte ich mich bei allen bedanken, die mich bei der Durchführung dieser Arbeit hilfreich unterstützt haben. Ich möchte mich recht herzlich bei meiner Betreuerin Prof. Dr. Silke Rautenschlein für die sehr gute Betreuung bedanken. Großer Dank gilt auch der Firma MSD Animal Health, speziell Aris Malo, Rik Koopman, Sigrid Spies, Gerdy ten Dam, Sandra Vogels, Maaike Bekkers, Ennie Willems und Ans Peters. Ebenfalls möchte ich mich bei Christine Haase für die Einarbeitung und Hilfe bei meinem Projekt bedanken. Vielen Dank an Sonja Bernhard, Sabrina Techel und Katja Stolpe, welche mich bei der Tierhaltung unterstützt haben. Dank gilt auch Herrn Dr. Martin Ryll und Hans Bertram, welche bei technischen Arbeiten unterstützten. Vielen Dank an meine Kollegen Henning Petersen, Colin Pielsticker, Lydia Teske, Sandra Hartmann, Annette Kaiser, Tamiru Alkie Negash, Diana Petzoldt, Samuel Fischer, Arne Jung, Andreas Stamm, Martina Hesse, Hicham Sid und Zifeng Han welche mich in meinem Projekt mit tatkräftiger Hilfe und fachlichem Rat unterstützt haben. Vielen Dank an meine Eltern und meinen Bruder, die mich während meiner Dissertationszeit unterstützt haben.
