Die Bedeutung zellulärer Anheftungsfaktoren für die Filovirus

Die Bedeutung zellulärer Anheftungsfaktoren
für die Filovirus-Infektion
Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades
vorgelegt von
Andrea Marzi
aus Weiden i. d. Opf.
Als Dissertation genehmigt von den
Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung:
27. Juni 2007
Vorsitzender der Promotionskommission:
Prof. Dr. Eberhard Bänsch
Erstberichterstatter:
Prof. Dr. Uwe Sonnewald
Zweitberichterstatter:
Prof. Dr. Bernhard Fleckenstein
Drittberichterstatter:
Prof. Dr. Stephan Becker, Berlin
Für meinen kleinen Bruder Conny
Es gibt eine Zeit für tätige Hingabe an die Arbeit
und eine Zeit der Zurückgezogenheit.
Es gibt eine Zeit, in der man seine Aufgabe voll wahrnimmt.
Es gibt eine Zeit, in der man sie philosophisch betrachtet,
und es gibt eine Zeit, in der man schlicht darüber lacht.
Robert Townsend
DANKE
Herrn Prof. Dr. Uwe Sonnewald danke ich für die Bereitschaft, die vorliegende Doktorarbeit vor
dem Fachbereich II der Naturwissenschaftlichen Fakultät zu vertreten und für die gute
Zusammenarbeit beim Pflanzen-Projekt.
Herrn Prof. Dr. Bernhard Fleckenstein möchte ich für die Möglichkeit danken, die Doktorarbeit am
Institut für Virologie unter sehr guten Arbeitsbedingungen durchzuführen. Außerdem ein MERCI
für die schönen Skifreizeiten, die immer ein Highlight im Jahr gewesen sind.
Ein herzliches DANKE gilt meinem Betreuer Herrn Prof. Dr. Stefan Pöhlmann, der mich während
dieser Zeit der Promotion immer sehr engagiert betreut und unterstützt hat und immer Zeit hatte,
wenn’s mal nötig war. „Thanks“ für alles!
DANKESCHÖN an Prof. Dr. Manfred Marschall: Ohne Deine Hilfe hätte ich nach der schlimmen
Zeit nicht wieder so gut ins Laborleben und den Laboralltag zurück gefunden. Ich dank Dir für die
vielen guten Gespräche und Ratschläge in den letzten Jahren – hast mir sehr geholfen ;o)
Weiterhin „many thanks“ an alle Member der AG Pöhlmann im Laufe der Jahre, vor allem an die
Postdocs Heike und Elke, den Tom und ganz besonders an Anja, Katja und Eva: Es hat sooooo
viel Spaß gemacht mit euch zu arbeiten. Schön war’s! Gut war’s! Danke.
Mein weiterer Dank gilt allen Mitarbeitern des Instituts für Klinische und Molekulare Virologie für
die gute Zusammenarbeit und die freundliche Atmosphäre. Besonders bedanken möchte ich mich
an dieser Stelle bei den Diagnostik-TAs für die vielen p24-ELISAs.
Ein großes DANKE gebührt allen meinen Freunden, die während dieser Zeit der Promotion und
besonders in der schlimmen Zeit 2004 immer für mich da gewesen sind. Danke für die tolle Zeit
mit euch, eure Geduld mit mir, fürs Zuhören und die vielen, vielen guten Gespräche. Ein ganz
großes MERCI an Katrin – fürs phonen, aufbaun, zuhören und Tipps geben: danke, danke, danke!
Der wichtigste Dank geht an meine Familie: meine Eltern und meine Schwester Birgit. Die Zeit der
Arbeit hier schließt auch die schlimmste Zeit in unserem Leben mit ein. Doch wir haben das alles
geschafft – auch dieses Werk. Es geht uns gut und vor allem unser Leben ging und geht weiter –
und Conny ist mit dabei!
Ich sag deshalb DANKE aus ganzem Herzen für eure Unterstützung, für euer Interesse an meiner
Arbeit, für eure Zeit für mich und dafür, dass ich immer heim kommen konnte. DANKE dass es
euch gibt.
Ganz herzlich bedanken möchte ich mich auch und vor allem bei meinem Freund Thorsten. Ich
dank Dir für deine Unterstützung, deine unendliche Geduld mit mir, auch wenn’s nicht immer leicht
gewesen ist mit einer „Laborratte“ wie mir. DANKE.
Und zum Schluss noch MERCI an Baba, Maria, Heike und viele mehr, die einfach da gewesen
sind, wenn ich sie gebraucht hab.
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
A. Zusammenfassung
9
A. Summary
10
B. Einleitung
11
1. Das Ebolavirus
11
2. Das EBOV-GP vermittelt den Eintritt in Zielzellen
14
3. Zelluläre Anheftungsfaktoren verstärken die EBOV-Infektion
16
3.1. DC-SIGN, ein universaler Anheftungsfaktor für Pathogene
3.2. Das DC-SIGN verwandte Protein DC-SIGNR
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19
C. Ziel der Arbeit
21
D. Material & Methoden
22
1. Biologisches Material
22
1.1. Bakterien
1.2. Eukaryote Zellen
1.2.1. Primäre Zellen
1.2.2. Zelllinien
1.3. Seren und Antikörper
1.3.1. Polyklonale Seren und monoklonale Antikörper
1.3.2. Sekundärantikörper
2. Nukleinsäuren
22
22
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23
23
24
24
2.1. Oligonukleotide
2.1.1. Oligonukleotide für PCR-Mutagenese und PCR-Klonierung
2.1.2. Oligonukleotide für die Sequenzierung
2.2. Vektoren und Plasmide
2.2.1. Vektoren
2.2.2. Zur Verfügung gestellte Plasmide und Reporterkonstrukte
2.2.3. Konstruierte Plasmide
3. Enzyme, Medien, Lösungen und Standardreagenzien
3.1. Enzyme
3.2. Medien, Lösungen und Puffer
3.2.1. Bakterienkulturmedien
3.2.2. Zellkulturmedien
3.2.3. Lösungen und Puffer
3.3. Standardreagenzien und Chemikalien
4. DNA-Methoden
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4.1. DNA-Standardmethoden
4.2. PCR-Mutagenese
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31
5. Zellkulturverfahren
31
5.1. Kultivierung von Zellen
5.2. Transfektion eukaryoter Zelllinien
5.2.1. Transfektion mit der CaPO4-Methode
6
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32
Inhaltsverzeichnis
5.2.2. Transfektion von HeLa-Zellen mit Lipofectamine2000TM
6. Produktion pseudotypisierter Viren und virusähnlicher Partikel (VLPs)
6.1. Herstellung pseudotypisierter Viren
6.2. Herstellung von HIV-1 NL4-3 luc Reporterviren
6.3. Herstellung von VLPs
7. Virale Infektions-, Transmissions- und Bindungsexperimente
7.1. Infektionsexperimente
7.2. Transmissionsexperimente
7.3. Virale Bindungsexperimente
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8. Proteinmethoden
35
8.1. Durchflusszytometrie (FACS)
8.2. Internalisierung, Protein- und VLP-Bindung
8.3. in vitro-Transkriptions-Translations-Reaktion
8.4. Western Blot-Analyse
8.5. Biochemische Analyse von Glykoproteinen
E. Ergebnisse
35
35
36
36
37
38
1. DC-SIGN und DC-SIGNR interagieren mit dem MARV-GP und
dem Spike-Protein des SARS-Coronavirus
1.1. DC-SIGN und DC-SIGNR verstärken die MARV-GP- und SARS-CoV-Sgetriebene Infektion
1.2. DC-SIGN/R fungieren nicht als Rezeptoren für SARS-CoV
1.3. DC-SIGN-abhängige Transmission von SARS-CoV-S-Pseudoviren auf
suszeptible Zellen
2. Das EBOV-GP-Signalpeptid beeinflusst die Interaktion mit den zellulären
Lektinen DC-SIGN und DC-SIGNR
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38
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42
44
2.1. DC-SIGN/R verstärken die ZEBOV- und SEBOV-GP-vermittelte Infektion
unterschiedlich stark
44
2.2. Die Effizienz der GP-Inkorporation in Pseudopartikel beeinträchtigt die
DC-SIGN/R-Interaktion
45
2.3. ZEBOV-, jedoch nicht SEBOV-GP-Inkorporation in filovirale VLPs vermittelt
die effiziente Bindung an DC-SIGN/R
46
2.4. Der Glykosylierungsstatus von EBOV-GP ist eine wichtige Determinante der
Interaktion mit DC-SIGN/R
48
2.5. Die Muzindomäne und spezifische Glykosylierungssignale in SEBOV- und
ZEBOV-GP haben keinen Einfluss auf die DC-SIGN/R-Interaktion
49
2.6. Das EBOV-GP-Signalpeptid moduliert die Interaktion mit DC-SIGN/R
50
2.7. Das EBOV-GP-Signalpeptid beeinflusst die Modifikation von GP mit
hochmannosylierten Glykanen
53
2.8. Das EBOV-GP-Signalpeptid moduliert die GP-Glykosylierung im sekretorischen
Weg und ist im reifen EBOV-GP nicht präsent
55
3. Modulation der Inkorporation des EBOV-GPs in Virionen:
Effekte auf Anheftung, Zelleintritt und Neutralisation
58
3.1. Induzierbare Expression der EBOV-GPs in 293 T-REx-Zellen
58
3.2. Die GPs der vier EBOV-Subtypen induzieren Zellrundung mit unterschiedlicher
Effizienz
60
3.3. Geringe GP-Mengen sind ausreichend für den effizienten Zelleintritt von
Pseudotypen
61
7
Inhaltsverzeichnis
3.4. Nur Pseudoviren mit hohem GP-Gehalt können zelluläre Anheftungsfaktoren
für die Infektionsverstärkung effizient nutzen
3.5. Erhöhte Neutralisationssensitivität durch gesteigerte GP-Inkorporation in
Pseudoviren
3.6. Die ZEBOV-GP-Expression interferiert nicht mit dem ZEBOV-GP-vermittelten
Zelleintritt, blockiert jedoch dosisabhängig die VSV-G-getriebene Infektion
4. Analyse der Interaktion des EBOV-GPs mit DC-SIGN und DC-SIGNR
4.1. DC-SIGN/R vermitteln den EBOV-GP-abhängigen Eintritt in B-THP-Zellen
4.2. Potenzielle Internalisierungssignale in der zytoplasmatischen Domäne von
DC-SIGN haben keinen Einfluss auf die Verstärkung der EBOV-GPabhängigen Infektion
4.3. Die ersten 20 AS des DC-SIGN N-Terminus sind für die Verstärkung der
ZEBOV-GP-vermittelten Infektion von ansonsten nicht-permissiven Zellen
verzichtbar
4.4. Die Verstärkung der ZEBOV-GP-vermittelten Infektion durch DC-ISGN ist
abhängig von der jeweiligen B-Zelllinie und von der Effizienz der
Virusbindung an die Zelloberfläche
4.5. IMDDC-Infektion mit ZEBOV ist teilweise abhängig von mannosebindenden
Lektinen wie DC-SIGN
F. Diskussion
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63
64
65
65
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68
70
72
73
1. DC-SIGN/R interagieren mit MARV-GP und SARS-CoV-S
73
2. Das EBOV-GP-Signalpeptid beeinflusst die Interaktion mit DC-SIGN/R
74
3. Modulation der EBOV-GP Virusinkorporation: Effekte auf Anheftung,
Zelleintritt und Neutralisation
76
4. DC-SIGN/R verstärken die EBOV-Anheftung an Zellen, wirken jedoch nicht
als Rezeptoren
80
G. Literaturverzeichnis
82
H. Anhang
92
8
Zusammenfassung
A.
Zusammenfassung
Die Filoviren Ebolavirus (EBOV) und Marburgvirus (MARV) verursachen hämorrhagisches
Fieber im Menschen. Die Interaktion des EBOV-Glykoproteins (EBOV-GP) mit zellulären
Rezeptoren vermittelt den infektiösen Eintritt des EBOV in Zielzellen und stellt den ersten
essentiellen Schritt im viralen Replikationszyklus dar. Welche zellulären Faktoren als EBOVRezeptoren fungieren, ist gegenwärtig unklar. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass EBOV
zelluläre Lektine wie DC-SIGN und DC-SIGNR (gemeinsam abgekürzt als DC-SIGN/R) für die
Anheftung an Zellen nutzt. DC-SIGN/R werden auf wichtigen Zielzellen der EBOV-Infektion
exprimiert: DC-SIGN auf dendritischen Zellen (dendritic cells, DC) und bestimmten
Gewebemakrophagen, DC-SIGNR auf Endothelzellen in Leber und Lymphknoten. Da die
Virusbindung an diese Lektine zu einer massiven Verstärkung der viralen Infektion führt, wurde
postuliert, dass die Interaktion mit DC-SIGN/R die EBOV-Ausbreitung im Wirt beeinflussen
könnte. Es war jedoch unklar, welche Parameter die DC-SIGN/R-Bindung an EBOV bestimmen,
ob die DC-SIGN/R-Benutzung zwischen den EBOV-Subspezies und MARV konserviert ist, und
ob DC-SIGN/R lediglich die Virusanheftung an Zellen fördern oder als Rezeptoren den viralen
Eintritt vermitteln.
In
Rahmen
dieser
Arbeit
konnten
MARV
und
das
SARS-Coronavirus
als
neue
Interaktionspartner für DC-SIGN/R identifiziert werden. DC-SIGN/R binden an die GPs dieser
Viren und verstärken den viralen Eintritt in Zielzellen. Das GP der EBOV-Subspezies Zaire
(ZEBOV-GP), jedoch nicht das des Subtyps Sudan (SEBOV) interagierte effizient mit DCSIGN/R. Die Analyse der Faktoren, die dieser unterschiedlichen Bindung zugrunde liegen,
zeigte, dass DC-SIGN/R mannosereiche Oligosaccharide auf der Oberfläche der viralen GPs
erkennen. Diese Glykane sind in ZEBOV-, jedoch kaum in SEBOV-GP nachweisbar und ihre
Präsenz im reifen GP wird durch das GP-Signalpeptid beeinflusst. Das Signalpeptid kann daher
als neue Determinante der posttranslationalen Prozessierung von GPs im sekretorischen Weg
angesehen werden. Ein weiterer Faktor, der die EBOV-Interaktion mit DC-SIGN/R moduliert, ist
die Effizienz der GP-Inkorporation in Virionen: sie beeinflusst nicht nur die Interaktion mit
Rezeptoren und Anheftungsfaktoren, sondern auch die Neutralisation durch Antikörper.
Weiterhin konnte demonstriert werden, dass DC-SIGN/R nicht aktiv den infektiösen Eintritt von
EBOV in Zielzellen fördern und somit nicht als Rezeptoren fungieren. Statt dessen
konzentrieren diese Lektine Viren auf der Oberfläche von Zellen und verstärken so den
rezeptorabhängigen Eintritt. Die ZEBOV-Infektion unreifer DCs ist jedoch nur zu etwa 50% von
mannosebindenden Lektinen wie DC-SIGN abhängig, weitere zelluläre Faktoren scheinen eine
wichtige Rolle zu spielen. Die im Zuge dieser Arbeit gemachten Beobachtungen tragen
wesentlich zum Verständnis der Interaktion von DC-SIGN/R mit Liganden bei. Sie weisen
jedoch auch darauf hin, dass andere Faktoren für den EBOV-Eintritt in DCs wichtig sind und
zeigen Unterschiede in der DC-SIGN/R-Bindung der vier EBOV-Subspezies auf – Befunde die
eine wichtige Rolle von DC-SIGN/R in der Filovirus-Infektion in Frage stellen.
9
Summary
A.
Summary
The filoviruses Ebolavirus (EBOV) and Marburgvirus (MARV) cause hemorrhagic fever in
humans. The EBOV glycoprotein (EBOV-GP) interacts with cellular receptors and mediates
infectious viral entry into target cells – the first essential step in the viral replication cycle. It is
currently unclear which cellular factors act as EBOV receptors. However, it has been shown that
EBOV utilizes cellular lectins like DC-SIGN and DC-SIGNR (collectively referred to as DCSIGN/R) for its attachment to target cells. DC-SIGN/R are expressed on important EBOV target
cells: DC-SIGN on dendritic cells (DC) and certain types of macrophages, DC-SIGNR on
endothelial cells in liver and lymph node. Virus binding to these lectins augments viral infection.
Therefore, it was postulated that the interaction with DC-SIGN/R might influence the EBOV
dissemination in the host. However, it was unclear which parameters determine DC-SIGN/R
binding to EBOV, if DC-SIGN/R usage is conserved between the EBOV subspecies and MARV,
and whether DC-SIGN/R merely promote virus attachment to cells or mediate viral entry as
receptors.
Within this work two viruses could be identified as new DC-SIGN/R interaction partners: MARV
and the SARS coronavirus. DC-SIGN/R bind to the GPs of both viruses and enhance viral entry
into target cells. GP of the EBOV subspecies Zaire (ZEBOV-GP) but not of the subspecies
Sudan (SEBOV) was found to interact efficiently with DC-SIGN/R. Factors, which could form the
basis for this differences in binding were analyzed, and results show that DC-SIGN/R recognize
high-mannose carbohydrates present on the surface of the EBOV-GPs. These glycans could be
readily detected in ZEBOV- but barely in SEBOV-GP and their presence in mature GP was
modulated by the GP signal peptide. Therefore, the signal peptide can be considered a novel
determinant of posttranslational processing of GPs in the secretory pathway. Another factor,
which influences the EBOV interaction with DC-SIGN/R, is the efficiency of GP incorporation
into virions. It could be shown that the interaction with receptors and attachment factors, and
also the neutralization by antibodies is modulated by the amount of GP present in the viral
envelope. Further results demonstrated that DC-SIGN/R could not actively mediate EBOV
infection of target cells and therefore do not function as EBOV receptors. Instead, both lectins
function as attachment factors and concentrate viral particles on the cell surface, which leads to
an enhancement of receptor-mediated infectious entry. Finally, the infection of immature DCs
with ZEBOV was found to depend to about 50% on mannose specific lectins, implicating that
cellular factors apart from mannose binding molecules are important for ZEBOV infection of
primary cells.
The discoveries reported in this study increase the understanding of DC-SIGN/R interactions
with ligands. However, the results also show that factors other than DC-SIGN/R critically
contribute to EBOV infection of DCs and that not all EBOV subspecies engage DC-SIGN/R
efficiently – findings that question an important role of DC-SIGN/R in filovirus infection.
10
Einleitung
B.
Einleitung
1.
Das Ebolavirus
Das Ebolavirus (EBOV) bildet zusammen mit dem Marburgvirus (MARV) die Familie der
Filoviridae, welche der Ordnung der Mononegavirales angehört (Sanchez et al., 2004). Diese
Ordnung umfasst alle umhüllten Viren, die ein einzelsträngiges, unsegmentiertes RNA-Genom
in
negativer
Orientierung
tragen.
EBOV
verursacht
im
Menschen
ein
schweres
hämorrhagisches Fieber und ist zum ersten Mal 1976 zeitgleich in zwei afrikanischen Staaten
aufgetreten: in der Demokratischen Republik Kongo (DRK, ehemaliges Zaire) und im Sudan
(Bowen et al., 1977). Bei diesen Ausbrüchen wurden in Zaire 318 und im Sudan 284 Infektionen
diagnostiziert, wobei die Sterberate für Virusinfizierte extrem hoch war, und zwar in Zaire mit
88% noch höher als im Sudan mit 53% (WHO 1978a; WHO 1978b). Das Virus wurde sehr leicht
über direkten Kontakt von Mensch zu Mensch übertragen und löschte ganze Dörfer in den
betroffenen Gebieten aus. Erst Jahre später konnte festgestellt werden, dass sich die Viren in
beiden Ländern unterschieden und somit verschiedene EBOV-Subtypen darstellen: Zaire EBOV
(ZEBOV) und Sudan EBOV (SEBOV) (Buchmeier et al., 1983; Cox et al., 1983; McCormick et
al., 1983). Von 1976 an kam es bis heute in den zentralafrikanischen Staaten Gabun, Sudan,
Republik Kongo, DRK und Uganda immer wieder zu EBOV-Epidemien, ausgelöst durch beide
Subtypen des Virus, wobei sich erneut bestätigte, dass die Infektion mit ZEBOV mit einer
höheren Mortalitätsrate (ca. 80%) als die SEBOV-Infektion (ca. 50%) assoziiert ist (Feldmann et
al., 2003; Peters & LeDuc 1999).
Im Jahr 1994 wurde im Staat Elfenbeinküste an der Westküste Afrikas eine weitere EBOVUnterart isoliert: Ivory Coast EBOV (ICEBOV) (Le Guenno et al., 1995). Dieses Virus bzw. die
Antikörper gegen ICEBOV wurden bislang erst im Serum zweier Personen nachgewiesen, die
augenscheinlich an Ebola-Hämorrhagischem-Fieber (EHF) erkrankt waren, jedoch die Infektion
überlebten (Formenty et al., 1999a; Formenty et al., 1999b; Le Guenno et al., 1999). Auf
genetischer Ebene zeigte ICEBOV eine größere Ähnlichkeit zu ZEBOV als zu SEBOV, war
jedoch weit weniger pathogen als eines dieser beiden Isolate (Feldmann et al., 2003). Aufgrund
der hohen Mortalitätsrate, des großen Potenzials der Mensch-zu-Mensch-Übertragung und des
Fehlens einer Vakzine oder Therapiemöglichkeit gegen EHF wurde das EBOV als ein
Organismus der Biologischen Sicherheitsstufe 4 (BSL 4) eingeordnet und kann in Deutschland
nur in den Hochsicherheitslaboratorien in Marburg und Hamburg erforscht werden.
Im Jahr 1989 kam es in einem Primatenzentrum in Reston, Virginia, USA zu einem EBOVAusbruch, initiiert durch infizierte Tiere, die aus den Philippinen eingeführt worden waren. Das
neue Isolat, welches in Affen EHF auslöst, im Menschen bisher aber als apathogen gilt, wurde
Reston EBOV (REBOV) genannt. Die Quelle und die Verbreitung dieses Isolats im asiatischen
11
Einleitung
Raum konnte nie genau ermittelt werden; REBOV löste jedoch weitere Epidemien in
Primatenzentren aus: USA 1990, 1996 (Rollin et al., 1999) und Italien 1992 (WHO 1992).
Das natürliche Reservoir des EBOV konnte bis heute nicht eindeutig definiert werden. Seit
einigen
Jahren
gibt
es
jedoch
immer
wieder
Berichte
über
EBOV-Epidemien
in
zentralafrikanischen Primatenpopulationen (Leroy et al., 2004; Walsh et al., 2003). Das Virus
scheint während der Trockenperioden im Jahr, wenn Futterknappheit herrscht, durch
Fledermäuse, die asymptomatisch mit EBOV infiziert sind (Leroy et al., 2005), an Gorillas und
Schimpansen weitergegeben zu werden und somit zur Erkrankung der Affen zu führen (Leroy et
al., 2005). Der Aspekt, dass Fledermäuse asymptomatisch mit EBOV infiziert sein könnten,
führte zu der Annahme, dass bestimmte Fruchtfledermausarten das natürliche Reservoir für
EBOV darstellen könnten (Biek et al., 2006; Leroy et al., 2005). Diese These konnte jedoch
noch nicht im Detail bestätigt werden. Die Annahme, dass es sich bei dem natürlichen EBOVWirt um eine Nagetier- oder Fledermausart handeln könnte, wird dennoch wissenschaftlich
weiter verfolgt.
Ebolaviren bestehen aus filamentösen Partikeln (Abb. 1A), die eine Länge von bis zu 14 µm
aufweisen können und eine Membranhülle tragen. In diese Lipidschicht zellulären Ursprungs ist
das virale Glykoprotein (GP) inseriert, welches für die Infektion essenziell ist, da es die
Rezeptorbindung sowie die Fusion der viralen mit der zellulären Membran vermittelt (siehe
Abschnitt 2, untenstehend). Weiterhin besitzen diese Viren ein negativ orientiertes,
einzelsträngiges RNA-Genom, das nicht segmentiert und etwa 19 kb groß ist. Es kodiert die
genetische Information für sieben Proteine (Abb. 1B): Nukleoprotein (NP), virales Protein 35
(VP35;
Polymerasekofaktor),
virales
Protein
40
(VP40;
Hauptmatrixprotein
[major]),
Glykoprotein (GP) und lösliches Glykoprotein (sGP), virales Protein 30 (VP30; zweites
Nukleoprotein [minor]), virales Protein 24 (VP24; untergeordnetes Matrixprotein [minor]), RNAabhängige RNA-Polymerase (L).
A
B
Abb. 1: Elektronenmikroskopische und skizzierte Darstellung eines EBOV-Partikels.
(A) Elektronenmikroskopische Aufnahme eines EBOV-Partikels. (B) Schematische Darstellung eines filamentösen
EBOV-Partikels mit dem Glykoprotein (GP) auf der Oberfläche und den sieben durch das virale Genom kodierten
Leserahmen (Takada & Kawaoka 2001).
12
Einleitung
Das RNA-Genom liegt in einer Kopie in Form eines helikalen Ribonukleoproteinkomplexes
(RNP) in Assoziation mit den Nukleoproteinen NP und VP30, der Polymerase L und ihrem
Kofaktor VP35 vor (Feldmann et al., 2003). Der RNP ist im viralen Partikel von den beiden
Matrixproteinen VP40 und VP24 umgeben, die in die Lipidhülle inseriert sind (Hoenen et al.,
2006). Das virale GP befindet sich in Form eines Homotrimers auf der Virusoberfläche
(Sanchez et al., 2004). Die Variante sGP ist nicht im Viruspartikel enthalten, sondern wird von
den infizierten Zellen sekretiert (Feldmann et al., 2003).
Budding,
Abschnüren neuer
EBOVs
sGP-Sekretion
Strukturproteine
4
Translation
3
7
2
Transkription
Zelleintritt
1
(-) RNP
(-) RNP
5
6
(+) RNP
Replikation
Rezeptorbindung
= mRNA
= VP40, VP24 & GP
= RNP
= NP, VP30, VP35 & L
Abb. 2: Der EBOV-Replikationszyklus im Zytoplasma einer infizierten Zelle.
Der Replikationszyklus (Abb. 2) beginnt mit der Bindung des Virions an einen zellulären
Rezeptor. Die Rezeptorinteraktion führt zur endozytotischen Aufnahme des Virus in die Zelle.
Anschließend vermittelt das GP, ausgelöst durch den niedrigen pH-Wert in Endosomen, die
Fusion der viralen mit der zellulären Endosomenmembran, wodurch der virale RNP in das
zelluläre Zytoplasma eingeschleust wird. Das Virus repliziert im Zytoplasma infizierter Zellen,
beginnend mit der Transkription des Genoms durch die virale Polymerase L und ihren Kofaktor
VP35. Die Transkripte werden von der zellulären Translationsmaschinerie als messenger RNAs
(mRNAs) erkannt, und die kodierten Proteine werden synthetisiert. Das sGP wird von den
Zellen sekretiert, während volle Länge-GP an die Zelloberfläche transportiert wird. Neue Kopien
der Polymerase L bewirken die effizientere Transkription des viralen Genoms, wobei eine Kopie
des Genoms in positiver Orientierung als Matrize zur Herstellung neuer Genome in negativer
13
Einleitung
Orientierung dient. Diese RNA-Kopien bilden zusammen mit NP, VP30, VP35 und der
Polymerase im Zytoplasma der infizierten Zelle neue RNPs, die dann an die Zelloberfläche
transportiert werden, und zwar vorzugsweise an GP-enthaltende Mikrodomänen, so genannte
lipid rafts (Bavari et al., 2002). Durch Interaktion der beiden Matrixproteine VP40 und VP24 mit
GP und dem RNP an der Zelloberfläche wird der Budding-Prozess ausgelöst und neue,
infektiöse EBOV-Partikel schnüren sich von der Zelle ab.
Bei einer Infektion des Menschen dringen die Viren über kleinste Verletzungen der Haut (Cutis)
und Schleimhäute (Mukosa) in ihren Wirt ein und infizieren ihre primären Zielzellen –
dendritische Zellen (dendritic cells, DCs) und Makrophagen (Hoenen et al., 2006), welche sich
in den Geweben unter der Haut bzw. Schleimhaut befinden. Vor allem DCs werden durch diese
Bindung aktiviert und wandern in das lymphatische Gewebe ein. Das Virus gelangt so in das
lymphatische System sowie in die Blutbahn und infiziert ein extrem breites Spektrum an
Zelltypen; mit Ausnahme von B- und T-Zellen sind, zumindest in vitro, alle analysierten
Zelltypen permissiv (Geisbert et al., 2003b; Wool-Lewis & Bates 1998; Yang et al., 1998). Das
Virus verursacht eine extreme Form des viralen hämorrhagischen Fiebers in Menschen und
Affen indem es die Immunantwort unterdrückt und sehr effizient zu hohen Virustitern repliziert
(Feldmann et al., 2003). Infizierte Personen leiden an multiplen hämorrhagischen Symptomen,
insbesondere Fieber, Schüttelfrost, Erbrechen, Durchfall, Gerinnungsstörungen und Blutungen;
letztlich versterben zwischen 50% und 90% der Patienten ein bis zwei Wochen nach dem
Auftreten der ersten Symptome an systemischen Schockzuständen (Feldmann et al., 2003).
2.
Das EBOV-GP vermittelt den Eintritt in Zielzellen
Das EBOV kodiert in seinem 4. Leserahmen (open reading frame, ORF) im Genom beide
Formen des viralen Glykoproteins, sGP und GP (Takada & Kawaoka 2001). Das Auftreten
zweier Leseraster resultiert aus einem RNA-editing der viralen Polymerase an der
Ribonukleotidposition
880-887
im
ORF.
An
dieser
Stelle
befinden
sich
sieben
aufeinanderfolgende Adenosinreste. Die Polymerase L fügt bei der Transkription acht
Uracilreste in etwa 20% der mRNAs ein, wodurch ein zweites Leseraster benutzt wird und ein
verlängertes Transkript mit über 2 kb Länge für volle Länge-GP entsteht (Volchkov et al., 1995).
Beide GP-Varianten besitzen dieselben aminoterminalen (N-terminalen) 295 Aminosäuren (AS),
gefolgt von 69 AS spezifisch für sGP bzw. 381 AS spezifisch für GP (Volchkova et al., 1999).
Die mRNA für sGP wird translatiert und das entstandene Protein als Homodimer über den
sekretorischen Weg von der Zelle abgegeben (Sanchez et al., 1998). Für sGP konnte bislang
keine eindeutige Funktion beschrieben werden, es wird jedoch spekuliert, dass dieses Protein
neutralisierende Antikörper (Ak) abfängt und somit eine effizientere Virusreplikation ermöglicht.
14
Einleitung
Das GP wird als 676 AS langes Vorläuferprotein GP0 in der Zelle produziert und aufgrund
seiner aminoterminalen Signalsequenz (SP; Abb. 3) in das endoplasmatische Retikulum (ER)
transportiert. Dort wird das Signalpeptid abgespalten und N-Glykosylierungsmotive (NXS/T)
werden mit Mannose- und Glukose-enthaltenden Karbohydratketten verknüpft (Sanchez et al.,
1998). Beim Weitertransport des GPs in den Golgi-Apparat werden die Zuckerketten durch
verschiedene Oligosaccharide substituiert, so dass im reifen Protein hochmannosylierte,
hybride und komplexe Karbohydratketten zu finden sind. Das GP enthält eine muzinähnliche
Domäne (Abb. 3), in welcher zahlreiche Signale für O- und N-verknüpfte Glykosylierung
enthalten sind (Sanchez et al., 1998). Während in dieser Domäne alle O-verknüpften
Glykosylierungssignale in GP zu finden sind, kommen N-verknüpfte Karbohydratketten auch an
weiteren Stellen im GP vor.
GP1
GP2
Rezeptorbindung
Y
SP
YY Y YY Y
Fusion
Y
Y Y Y YY Y YY YY YY
Muzindomäne
FP
Y
CD
TM
Abb. 3: Das EBOV-GP.
Schematische Darstellung des viralen Oberflächenproteins. SP Signalpeptid, FP Fusionspeptid, CD coiled-coilDomäne, TM Transmembrandomäne, Y N-verknüpfte Glykosylierungssignale, ↓ Furin-Spaltstelle (AS 501).
Das GP wird nach der Prozessierung im Golgi-Apparat im trans-Golgi-Netzwerk durch die
zelluläre Protease Furin bei AS 501 gespalten und ist über seine Transmembrandomäne (TM;
Abb. 3) in die Zytoplasmamembran der Zelle inseriert (Sanchez et al., 1998). Die bei der
Spaltung durch Furin entstandenen Untereinheiten GP1 und GP2 sind etwa 130 bzw. 24 kDa
groß und bleiben über Disulfidbrücken miteinander assoziiert (Sanchez et al., 1998). Sie
werden als Heterodimer an die Zelloberfläche transportiert, wo sich jeweils drei der GPHeterodimere zu einem Homotrimer zusammenlagern (Takada & Kawaoka 2001). Für diese
Strukturausbildung ist die coiled-coil-Domäne in GP2 (Abb. 3) verantwortlich (Sanchez et al.,
2004). Das Protein ist für das Virus von essenzieller Bedeutung, da es dessen Eintritt in
Zielzellen über die Bindung an einen bisher unbekannten Rezeptor vermittelt. Die Arbeitsgruppe
von Dr. Michael Farzan, Harvard University, Boston konnte zeigen, dass die AS 54-201 im
ZEBOV-GP für die Interaktion mit dem Rezeptormolekül verantwortlich sind (Kuhn et al., 2006).
Die Rezeptorbindung führt zur endozytotischen Aufnahme des Viruspartikels in die Zelle. In
diesem Kompartiment führt die spezifische pH-Änderung in den Sauren Bereich zur Aktivierung
der zellulären Cysteinproteasen Cathepsin B und Cathespin L, die GP1 endoproteolytisch
spalten (Chandran et al., 2005; Schornberg et al., 2006). Dieser Schritt ist nötig, um die
Membranfusionsaktivität in GP2 auszulösen (Abb. 3). Die Fusion der viralen Hüllmembran mit
15
Einleitung
der endosomalen Membran erlaubt das Einschleusen der genetischen Information des EBOV
ins Zytoplasma der Zielzelle, wo dann die Replikation stattfindet.
3.
Zelluläre Anheftungsfaktoren verstärken die EBOV-Infektion
Der Eintritt von Viren in Zellen wird vermittelt durch Interaktionen zwischen den viralen
Hüllproteinen und Faktoren auf der Oberfläche von Zielzellen. Zelluläre Strukturen, die durch
virale Hüllproteine gebunden werden, aktiv am viralen Eintritt beteiligt sind und für die
erfolgreiche Infektion der Zelle unverzichtbar sind, bezeichnet man als Rezeptoren. Neben den
Rezeptoren können Viren auch so genannte Anheftungsfaktoren für die Bindung an die Zelle
nutzen. Im Gegensatz zur Rezeptorbindung ist die Interaktion mit Anheftungsfaktoren für die
Infektion
verzichtbar,
sie
kann
jedoch
die
Infektionseffizienz
massiv
erhöhen.
Anheftungsfaktoren können sowohl an zelluläre Faktoren auf der Oberfläche von Viren als auch
an die viralen Hüllproteine binden. So werden bei der Virusfreisetzung Wirtszellfaktoren in die
virale Membran eingelagert und diese interagieren mit Liganden auf Zielzellen. Die Verstärkung
des zellulären Eintritts des humanen Immundefizienz-Virus (HIV) durch Wechselwirkungen
zwischen ICAM-1 auf der Virus-Oberfläche und LFA-1 auf der Oberfläche von Zielzellen ist ein
Beispiel für eine solche Interaktion (Tardif & Tremblay 2005). Wichtige Anheftungsfaktoren, die
mit viralen Hüllproteinen interagieren, sind Kalzium (Ca2+)-abhängige (C-type) Lektine. Diese
zuckerbindenden Proteine erkennen Oligosaccharide auf der Oberfläche von viralen
Hüllproteinen (Appelmelk et al., 2003; Feinberg et al., 2001; Guo et al., 2004; Hong et al.,
2002). Die infektionsverstärkende Wirkung von Anheftungsfaktoren beruht wahrscheinlich auf
der Ankonzentration von Viruspartikeln auf der Zelloberfläche, welche die folgende Bindung an
Rezeptoren erleichtert (O'Doherty et al., 2000; Pöhlmann et al., 2001a; Simmons et al., 2003).
Werden Anheftungsfaktor(en) und Rezeptor(en) auf einer Zelle exprimiert, wird diese Zelle
verstärkt infiziert, es kommt zur so genannten Infektion in cis. Werden Anheftungsfaktor(en) und
Rezeptor(en) auf unterschiedlichen, aber benachbarten Zellen exprimiert, kann das Virus von
anheftungsfaktorpositiven Zellen an die rezeptorpositive Zellen weitergegeben werden. Dieser
Infektionsweg wird als Infektion in trans oder Transmission bezeichnet.
Für EBOV ist der zelluläre Rezeptor bis heute unbekannt, jedoch zeigt eine kürzlich
erschienene Publikation, dass die drei zellulären Proteine Axl, Dtk und Mer – Mitglieder der
Tyro3-Rezeptortyrosinkinasen-Familie – den infektiösen Zelleintritt für EBOV vermitteln können
(Shimojima et al., 2006). Es wurden weiterhin mehrere Lektine beschrieben, welche die EBOVInfektion in Zellkultur verstärken (Becker et al., 1995; Gramberg et al., 2005; Lin et al., 2003;
Takada et al., 2004). Neben den nachfolgend im Detail diskutierten Lektinen DC-SIGN und DCSIGNR, die auf DCs bzw. Endothelzellen in Leber und Lymphknoten nachgewiesen wurden
(Bashirova et al., 2001; Geijtenbeek et al., 2000c; Pöhlmann et al., 2001c), sind dabei der
16
Einleitung
Asialoglykoproteinrezeptor (ASGP-R), das Lymphknoten sinusoidale Endothelzellen C-type
Lektin (LSECtin) und das humane Makrophagen C-type Lektin spezifisch für Galaktose und NAcetylglukosamine (hMGL) zu nennen. Diese Lektine werden auf Hepatozyten bzw.
Makrophagen und DCs exprimiert (Becker et al., 1995; Gramberg et al., 2005; Takada et al.,
2004) und unterscheiden sich zum Teil in ihrer Karbohydrat-Spezifität (mannosebindend,
galaktosebindend,
fukosebindend
etc.).
Alle
besitzen
jedoch
Ca2+-abhängige
Karbohydraterkennungsdomänen (carbohydrate recognition domain, CRD). Das Kalzium ist für
die Ligandenbindung und die strukturelle Integrität der CRD notwendig (Drickamer 1999). Die
Expression dieser Lektine auf wichtigen Zielzellen der EBOV-Infektion, wie DCs und
Makrophagen, sowie die infektionsverstärkende Wirkung dieser Proteine in vitro legt die
Vermutung nahe, dass die EBOV-Bindung an diese Faktoren den viralen Zell- und
Organtropismus im infizierten Wirt beeinflussen könnte (Baribaud et al., 2002; Bosio et al.,
2003; Geisbert et al., 2003a; Geisbert et al., 2003b). Einige dieser Faktoren fungieren jedoch
als Antigen-Rezeptoren, die gebundene Antigene internalisieren und deren folgende
Prozessierung und MHC-vermittelte Präsentation einleiten. Es ist daher gegenwärtig unklar, ob
die Bindung von EBOV an Lektine auf primären Zellen hauptsächlich die Infektion verstärkt oder
die Degradation von Virionen induziert.
3.1. DC-SIGN, ein universaler Anheftungsfaktor für Pathogene
Das Ca2+-abhängige Lektin DC-SIGN (dendritic cell specific ICAM-grabbing non-integrin,
CD209) ist ein Typ II-Transmembranprotein mit einer Größe von 404 AS und einem
Molekulargewicht von etwa 45 kDa. Es liegt als Tetramer auf der Zelloberfläche vor. Seine
Expression wurde initial auf DCs beschrieben (Geijtenbeek et al., 2000c), inzwischen konnte
DC-SIGN jedoch auch auf Makrophagen in Lymphknoten (Granelli-Piperno et al., 2005),
Thrombozyten (Boukour et al., 2006; Chaipan et al., 2006) und B-Zellen (He et al., 2006;
Rappocciolo et al., 2006) nachgewiesen werden.
Lektinbindedomäne
(CRD)
Wiederholungsregion
Zytoplasmamembran
zytoplasmatische Domäne
Abb. 4: Schema-Darstellung von DC-SIGN (mit freundlicher Genehmigung von R. Doms).
17
Einleitung
Mittels Sequenz- und Funktionsanalyse konnten vier Domänen in DC-SIGN kartiert werden
(Abb. 4): eine N-terminale zytoplasmatische Domäne, gefolgt von der Transmembrandomäne,
dann die Repeat- oder Wiederholungsregion, welcher sich die CRD am C-Terminus anschließt.
Die zytoplasmatische Domäne beinhaltet ein Di-Leucin (LL)- und ein Tyrosin-basiertes (YXXL)Motiv, von denen ersteres für DC-SIGN-Internalisierung nach Ligandenbindung wichtig ist
(Mellman 1996; Wu & KewalRamani 2006). Die Wiederholungsregion besteht aus
siebeneinhalb Wiederholungen einer 23 AS langen Sequenz und ist nötig für die
Tetramerbildung (Feinberg et al., 2005; Feinberg et al., 2001). Die CRD vermittelt die
Ligandenbindung, die nur dann effizient erfolgt, wenn DC-SIGN als Tetramer vorliegt (Bernhard
et al., 2004). Es konnte gezeigt werden, dass DC-SIGN an mannosereiche Karbohydrate bindet
(Feinberg et al., 2001), jedoch auch Fukose (Feinberg et al., 2001; Guo et al., 2004) z.B. in
Lewis X-Blutgruppenzucker erkennt (van Liempt et al., 2004). Abgesehen von der Bindung
körperfremder Antigene tritt DC-SIGN auch mit körpereigenen Liganden in Wechselwirkung. Zu
diesen Molekülen zählen die Anheftungsfaktoren MAC-1, CEACAM-1 (van Gisbergen et al.,
2005), ICAM-2 und ICAM-3 (Geijtenbeek et al., 2000a; Geijtenbeek et al., 2000c). Die Bindung
von DC-SIGN auf DCs an MAC-1 und CEACAM-1 auf neutrophilen Granulozyten ist
möglicherweise für die Aktivierung der T-Zellproliferation und die Auslösung einer
Immunantwort wichtig (van Gisbergen et al., 2005). Weiterhin wurde postuliert, dass DC-SIGN
zur Verstärkung der Zell-Zell-Kontakte von DCs mit ICAM-3-exprimierenden T-Zellen bzw.
ICAM-2-positiven
Endothelzellen
beiträgt,
und
damit
eine
wichtige
Rolle
bei
der
Antigenpräsentation bzw. der Auswanderung von DCs aus der Blutbahn spielt (Geijtenbeek et
al., 2000a; Geijtenbeek et al., 2000c).
Initial wurde DC-SIGN als Molekül beschrieben, welches das Hüllprotein gp120 des HIV in
plazentalem Gewebe bindet (Curtis et al., 1992). Es wurde gezeigt, dass sowohl endogenes
DC-SIGN auf DCs, als auch exogenes DC-SIGN auf transfizierten Zellen in der Lage ist, HIVPartikel über die Interaktion mit gp120 zu binden und an CD4+ T-Zellen weiterzugeben, was zur
produktiven Infektion der T-Zellen führt (Geijtenbeek et al., 2000b). Neben den beiden HIVTypen, HIV-1 und HIV-2, und dem Affen-Immundefizienz-Virus (simian immunodeficiency virus,
SIV) wurden weitere Viren beschrieben, deren glykosylierte Hüllproteine mit DC-SIGN
interagieren können. Die Glykoproteine des Masernvirus (de Witte et al., 2006), des humanen
Cytomegalovirus (HCMV) (Halary et al., 2002), des Hepatitis C-Virus (HCV) (Lozach et al.,
2004; Pöhlmann et al., 2003), des Denguevirus (Tassaneetrithep et al., 2003), HTLV,
Alphaviren und des West Nil-Virus (Davis et al., 2006) wurden als DC-SIGN-Interaktoren
identifiziert. Insbesondere für die Denguevirus-Infektion scheint der Anheftungsfaktor von
großer Bedeutung zu sein: die Analyse der Sequenz des DC-SIGN-Promotorbereichs zeigte,
dass Polymorphismen in diesem Genomabschnitt mit einer abgeschwächten Pathogenese der
Denguevirus-Infektion einhergehen (Sakuntabhai et al., 2005). Des Weiteren wurde DC-SIGN
auch als Bindungspartner für EBOV-GP beschrieben (Alvarez et al., 2002). Es wurde gezeigt,
18
Einleitung
dass DC-SIGN die Infektion permissiver Zellen in cis und in trans verstärkt (Alvarez et al.,
2002), und dass DC-SIGN-positive Zellen wie DCs und Makrophagen in experimentell mit
EBOV infizierten Affen infiziert werden (Geisbert et al., 2003a; Geisbert et al., 2003b).
Bemerkenswerterweise unterscheiden sich die EBOV Unterarten in der Effizienz der DC-SIGNBindung (Simmons et al., 2003). Unterschiede in der Karbohydratkomposition der viralen GPs
könnten die Unterschiede in der DC-SIGN-Benutzung erklären (Lin et al., 2003). Welche viralen
und zellulären Faktoren die EBOV-GP-Glykosylierung und damit die Interaktion mit DC-SIGN
beeinflussen können, ist jedoch nur teilweise verstanden. Unklar ist außerdem, ob weitere
Parameter, wie z.B. die Effizienz der Inkorporation von GP in Viruspartikel, die Bindung an DCSIGN modulieren.
Abgesehen von Viren konnten weitere Pathogene identifiziert werden, die mit DC-SIGN
interagieren. Hierzu zählen unter anderem die Parasiten Schistosoma mansoni (Meyer et al.,
2005) und Leishmania amastigotes (Colmenares et al., 2002) sowie verschiedene Bakterien:
Mycobacterium tuberculosis (Geijtenbeek & van Kooyk 2003; Maeda et al., 2003), Helicobacter
pylori (Bergman et al., 2004) und Streptococcus pneumoniae (Koppel et al., 2005); Pilze
wurden bisher nicht als Bindungspartner beschrieben. Trotz der Fülle an DC-SIGN-Liganden ist
es in den meisten Fällen immer noch unklar, inwiefern dieser Anheftungsfaktor Zelltropismus
und Ausbreitung im Wirt beeinflusst.
3.2. Das DC-SIGN verwandte Protein DC-SIGNR
Ein weiteres Ca2+-abhängiges Lektin ist DC-SIGNR (DC-SIGN-Related protein, CD209L), auch
bekannt als L-SIGN (Liver-SIGN), welches mit DC-SIGN auf AS-Ebene zu 77% identisch ist und
auch in plazentalem Gewebe vorkommt – jedoch nicht auf DCs, sondern auf Makrophagen und
Endothelzellen der Kapillargefäße in der Plazenta (Soilleux 2003; Soilleux & Coleman 2003).
DC-SIGNR wird weiterhin auf sinusoidalen Endothelzellen der Leber (LSECs) und in
Lymphknoten exprimiert (Bashirova et al., 2001; Pöhlmann et al., 2001c); LSECs sind
möglicherweise auch positiv für DC-SIGN (Lai et al., 2006). DC-SIGNR und DC-SIGN weisen
die
gleiche
Domänenstruktur
auf.
Im
Gegensatz
zu
DC-SIGN
ist
jedoch
die
Wiederholungsregion von DC-SIGNR polymorph; die Anzahl der repetitiven Sequenzen kann
zwischen
drei
bis
neun
Sequenzwiederholungen
variieren,
gefunden
wobei
werden
im
Menschen
(Bashirova
et
al.,
am
häufigsten
2001).
Auch
sieben
in
der
Karbohydratspezifität weisen beide Anheftungsfaktoren Unterschiede auf. Während beide
Lektine an mannosereiche Zucker binden, kann nur DC-SIGN mit Lewis X-Blutgruppenzuckern
interagieren, (Feinberg et al., 2001; Guo et al., 2004; van Liempt et al., 2004; Wang et al.,
2007). Es wurde auch gezeigt, dass DC-SIGNR wie DC-SIGN an ICAM-2 und ICAM-3 bindet
(Bashirova et al., 2001). Die Relevanz dieser Interaktion und die natürliche Funktion von DCSIGNR generell sind jedoch noch weitgehend unklar.
19
Einleitung
DC-SIGNR interagiert mit denselben Pathogenen wie DC-SIGN und könnte insbesondere für
die Ausbreitung von lymph- und hepatotropen Viren im infizierten Wirt von Bedeutung sein. DCSIGNR verstärkt die EBOV-Infektion in cis und in trans (Alvarez et al., 2002; Simmons et al.,
2003), was möglicherweise den Befall von Lymphknoten und Leber in den frühen Stadien der
EBOV-Infektion fördert (Geisbert et al., 2003b). Diese These wird durch Studien mit
experimentell infizierten Affen bestärkt, welche zeigen, dass in diesen Tieren EBOV effizient in
Endothelzellen der Leber repliziert (Geisbert et al., 2003b). Außerdem bindet DC-SIGNR die
Hüllproteine von HCV und verstärkt die Infektion rezeptorpositiver Zellen (Lozach et al., 2004;
Ludwig et al., 2004; Pöhlmann et al., 2003). Aufgrund dieser Beobachtung wird spekuliert, dass
DC-SIGNR auf LSECs die Viren in diesen Zellen ankonzentriert und damit die Infektion der
benachbarten Leberzellen erleichtert. Der Sachverhalt, dass LSECs Viren binden und auf
Hepatozyten übertragen können, wurde bereits für das Enten-Hepatitis-B-Virus beschrieben
und im Tiermodell belegt (Breiner et al., 2001).
20
Ziel der Arbeit
C.
Ziel der Arbeit
Die zellulären Anheftungsfaktoren DC-SIGN und DC-SIGNR (zusammen abgekürzt als DCSIGN/R) binden in Ca2+-abhängiger Weise an glykosylierte virale Hüllproteine, wie z.B. das
EBOV-GP. Für EBOV konnte gezeigt werden, dass DC-SIGN/R auf wichtigen Zielzellen wie
DCs, Makrophagen und Leberzellen exprimiert werden und die Infektion massiv verstärken.
Diese Beobachtungen legen nahe, dass die Lektine einen wichtigen Beitrag zur EBOVAusbreitung im Wirt leisten. Noch ist jedoch weitgehend unklar, ob alle Filoviren DC-SIGN/R
binden und welche Determinanten die EBOV-GP-Interaktion mit DC-SIGN/R bestimmen.
Weiterhin ist unbekannt, ob DC-SIGN/R als EBOV-Anheftungsfaktoren oder -Rezeptoren
fungieren, und inwiefern DC-SIGN/R Zelltropismus und Replikationseffizienz von EBOV im
menschlichen Organismus beeinflussen. Experimente mit replikationsfähigen Filoviren müssen
in Laboratorien der Sicherheitsstufe 4 durchgeführt werden. Für die Bearbeitung der
aufgelisteten Fragestellungen in S2- und S3-Laboratorien wird deshalb die so genannte
Pseudotypisierungstechnik angewendet. Diese beruht auf der trans-Komplementierung von
Viren ohne genetische Information für ein Hüllprotein (z.B. Rhabdo- oder Retroviren) mit
filoviralen Hüllproteinen.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte zunächst analysiert werden, ob neben EBOV auch MARV DCSIGN/R für die Verstärkung des zellulären Eintritts nutzt. Weiterhin sollte untersucht werden,
warum DC-SIGN/R die SEBOV- und ZEBOV-GP-getriebene Infektion mit unterschiedlicher
Effizienz verstärken. Beide Proteine sind auf AS-Ebene zwar zu 67% homolog, jedoch nur der
ZEBOV-GP-vermittelte zelluläre Eintritt wird durch diese Anheftungsfaktoren wirksam verstärkt
(Lin et al., 2003; Simmons et al., 2003). Zum Verständnis dieser Beobachtungen sollten die
Interaktion mit DC-SIGN/R, die Karbohydratkomposition und die Virusinkorporation von wt- und
chimären Proteinen verglichen werden. Schließlich sollte untersucht werden, ob die Expression
von DC-SIGN/R ausreicht, um den EBOV-Eintritt in ansonsten nicht-permissive Zellen zu
vermitteln und ob die DC-SIGN/R-Internalisierung für die funktionelle Interaktion mit EBOV
wichtig ist. Die gewonnen Ergebnisse sollten dazu beitragen, die Rolle der zellulären
Anheftungsfaktoren DC-SIGN und DC-SIGNR für die Filovirus-Infektion besser zu verstehen.
21
Material & Methoden
D.
Material & Methoden
1.
Biologisches Material
1.1. Bakterien
Escherichia coli DH10B: F- endA1 hsdR17 (rk-, mk+) supE44 thi-1 λ- recA1 gyrA96 relA1
deoR∆ (lacZYA-argF)-U169 (φ80lac∆M15) (Grant et al., 1990).
1.2. Eukaryote Zellen
1.2.1. Primäre Zellen
PBMC: humane periphere mononukleäre Blutzellen (peripheral blood mononuclear cells,
PBMCs); isoliert aus humanem Vollblut mittels Ficoll-Gradient.
IMDDC: humane unreife, aus Monozyten generierte dendritische Zellen (immature monocytederived dendtritic cells, iMDDC); abgeleitet von humanen PBMCs durch Stimulation mit GMCSF und IL-4 (Prechtel et al., 2005).
1.2.2. Zelllinien
293T: humane embryonale Nierenepithelzellen; transformiert durch Adenovirus Typ 5, kodiert
das SV40 T-Antigen (Pear et al., 1993).
293 T-REx: humane 293 Nierenepithelzelllinie mit stabil inseriertem pcDNA6/TR, welcher für
den Tet-Repressor kodiert. T-REx-Zellen ermöglichen die Doxycyclin-induzierte Expression von
Fremdgenen (Invitrogen, San Diego, USA). Sie standen im Labor sowohl als parentale Zellen
als auch als Lektin-exprimierende Zelllinien zur Verfügung.
HeLa: HPV+ humane Cervix-Karzinom-Zelllinie (Nelson-Rees & Flandermeyer 1976)
Huh-7: humane Leberkarzinomzelllinie (Nakabayashi et al., 1982).
CEMx174 5.25 M7: Hybridzelllinie aus humanen B- und T-Lymphoblasten; exprimiert neben
CD4 auch die Chemokinrezeptoren CCR5 und CxCR4 (Hsu et al., 2003).
B-Zelllinien 1-22: Epstein-Barr-Virus (EBV)-transformierte humane B-Zelllinien, welche aus
PBMCs generiert (Miller et al., 1972) freundlicherweise von Dr. T. Harrer zur Verfügung gestellt
wurden.
Folgende Zelllinien wurden vom AIDS Research and Reference Reagent Program bezogen:
B-THP, Raji: EBV-transformierte humane Burkitt’s Lymphom Zelllinien (Wu et al., 2004). Diese
Zelllinien standen auch mit stabil inseriertem DC-SIGN, DC-SIGN ∆20 und DC-SIGNR im Labor
zu Verfügung (konnten von Dr. D. Littman bezogen werden).
Ramos: humane EBV-neagtive Burkitt’s Lymphom Zelllinie (Wu et al., 2004). Diese Zelllinie
stand auch mit stabil inseriertem DC-SIGN im Labor zu Verfügung.
22
Material & Methoden
NC-37: EBV-transformierte humane Burkitt’s Lymphom Zelllinie; genetisch verschieden zu BTHP und Raji (Wu et al., 2004). Diese Zelllinie stand auch mit stabil inseriertem DC-SIGN im
Labor zu Verfügung.
Sup-T1: humane non-Hodgkin’s T-Lymphoblast Tumorzelllinie (Smith et al., 1984).
1.3. Seren und Antikörper
1.3.1. Polyklonale Seren und monoklonale Antikörper
Soweit nicht anders vermerkt wurden die Seren und Antikörper in den Konzentrationen 1 µg/ml
im Western Blot und 10 µg/ml im FACS eingesetzt.
anti-EBOV-GP-Serum: polyklonales Kaninchenserum, generiert und reaktiv gegen die GP1Untereinheit des ZEBOV-GPs (freundlicherweise von Dr. P. Bates zur Verfügung gestellt).
Verdünnung 1:1.000 im Western Blot, 1:100 im FACS.
anti-EBOV-GP 1G12 & 3B11: monoklonale Mausantikörper, generiert gegen das ZEBOV;
reaktiv gegen das ZEBOV-GP (Lucht et al., 2004).
anti-HIV-1-Gag: monoklonaler Mausantikörper aus dem Überstand von Hybridomzellen; reaktiv
gegen HIV-1 Gag (Chesebro et al., 1992). Verdünnung 1:50 im Western Blot.
anti-DC-SIGN (DCN46): monoklonaler Mausantikörper der die Wiederholungsregion des
humanen DC-SIGN-Moleküls erkennt (Geijtenbeek et al., 2000b; Geijtenbeek et al., 2000c) (BD
Biosciences, San Diego, USA).
anti-DC-SIGN (507): monoklonaler Mausantikörper, der die Lektindomäne des humanen DCSIGN-Moleküls erkennt (Jameson et al., 2002) (BD Biosciences, San Diego, USA).
anti-DC-SIGN (526): monoklonaler Mausantikörper, reaktiv gegen die Lektindomäne der
humanen DC-SIGN/R-Moleküle (Jameson et al., 2002).
anti-DC-SIGNR (604): monoklonaler Mausantikörper, welcher die Lektindomäne des humanen
DC-SIGNR-Moleküls erkennt (Jameson et al., 2002).
anti-GFP: monoklonaler Kaninchenantikörper, reaktiv gegen das Green Fluorescent Protein
(GFP); wurde freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. U. Schubert. Verdünnung
1:5.000 im Western Blot.
anti-myc (9E10): monoklonaler Mausantikörper aus dem Überstand von Hybridomzellen,
reaktiv gegen das synthetische myc-Epitop N-Met-Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu-C
(freundlicherweise von Dr. T. Stamminger zur Verfügung gestellt). Verdünnung 1:10 im Western
Blot.
anti-V5: monoklonaler Mausantikörper, reaktiv gegen das synthetische V5-Epitop N-Gly-LysPro-Ile-Pro-Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-Asp-Ser-Thr-C (Invitrogen, San Diego, USA).
anti-AU1: monoklonaler Mausantikörper, reaktiv gegen das synthetische AU1-Epitop N-AspThr-Tyr-Arg-Tyr-Ile-C (Covance, USA).
23
Material & Methoden
1.3.2. Sekundärantikörper
Alle Sekundärantikörper wurden von der Firma Dianova (Hamburg) bezogen und in den
Verdünnungen 1:5.000 im Western Blot und 1:200 im FACS eingesetzt:
anti-Maus-IgG (H+L) aus Ziege, Meerrettichperoxidase (HRP)-, PE-, Cy5- oder FITCkonjugiert.
anti-Kaninchen-IgG (H+L) aus Ziege, mit HRP gekoppelt.
anti-Mensch-IgG (H+L) aus Ziege, HRP- oder Cy5-konjugiert.
2.
Nukleinsäuren
2.1. Oligonukleotide
Alle Oligonukleotide wurden von den Firmen Sigma (Deisenhofen) und Biomers (Ulm) im
geeigneten Maßstab bezogen. Die Sequenzen sind von 5’ nach 3’ notiert. Erkennungsstellen für
Restriktionsenzyme sind gegebenenfalls durch Fettdruck hervorgehoben.
2.1.1. Oligonukleotide für PCR-Mutagenese und PCR-Klonierung
p3 EboIC Xba I
p5 EboIC Hind III
p3 EboR Xba I
p5 EboR Hind III
p3 EboS (30) Xba I
p3 EboS aa149 EboZ
p3 EboS aa234 EboZ
p3 EboS aa28 EboZ
p3 EboS aa304 EboZ
p3 EboS aa324 EboZ
p3 EboS aa349 EboZ
p3 EboS aa422/419 EboZ
p3 EboS aa475/472 EboZ
p3 EboS aa499 EboZ
p3 EboS/EboZ aa120
p3 EboS/EboZ aa206
p3 EboS/EboZ aa32
p3 EboS/EboZ aa60
p3 EboS/EboZ aa90
p3 EboZ (30) Xba I
p3 EboZ aa149 EboS
p3 EboZ aa234 EboS
p3 EboZ aa28 EboS
p3 EboZ aa308
p3 EboZ mut N 228 A
p3 EboZ/EboS aa206
CCTCTAGAGGTCAAAGCATGAATTTGCAAA
CCAAGCTTACCATGGGAGCGTCAGGGATTCT
CCTCTAGAGGTCAACACAAAATCTTACATA
CCAAGCTTACCATGGGGTCAGGATATCAACT
CCTCTAGAGGTCAACAAAGCAGCTTGCAGACGCAAAGA
AGAGC
TTATGGAAGGCAAAGTCTCCCGGGCAGGGCCCGGTTCCTT
TAGGTCAAATTGTCAACCTCGAAAAGGGTCGTGGAGTGTT
GTGGATGACTCCAAGACTGTGAAAGACAACTCTTCTCCACGT
AGTTGTTCGGAGA
TGGGATGGAAAATGTTCTTTGAAATAAGATGATGACCCAAAC
GGGTCGGAAGAAGTTCGCGCCGATGTCGCATCATCGTCTT
CTGTGCACTTGAACCATTGCAGGGGAATCCTTTGGAACCA
GCGGTCGTGGCAGAGGGAGTCTCAGGGCTTGGTGCCATGG
TTCCCGCTGCTGGCACTCTCTTGTGGCAAAACAGTTTTAA
GCTTCTCTTCGAGTTCTTCTTCGAAGTCCAAGGCTCCCAA
GGCGCTGCTGGTAGACACTCGCTCCCGTCCGGCTTCTTTA
TAGCCACTAGACGGGTCCTCAGTGTAGTTTACTGCCTCTCG
TGGATGACTCCAAGTGGGATGGAAAAGGCCTTTTGAAATA
ACTGATCTCAATTGATTTGTGGATGCAAGATGATCCTTGC
ACCTTTGGTGGGACACCGGATCTGAAGCCCCAACGCTTTG
CCTCTAGAGGCTAAAAGACAAATTTGCATATACAGAATAAA
GCG
TGTGAAAGGCATAGTCACCGGCACACGGTCCCGTTCCTG
AAAGTATTATTGTTAATTTTGAACAAGTACTCTGTCTCAT
GGTCACAACACCCAAAGGCATGGAAAAGGCCTTTTGGAAA
AGGATAATTACCCAAAG
CCCGCCTGTGATCAGTCCTGCGACTCCAGCGAAAGACAAC
TCTTCACTGCG
GTACTCTGTCTCAGCGGTTCCAAAACCGGTAGCC
GGCATAGTAACTTGATGTATTTTCCGTTGCATTGACCGGCTC
24
Material & Methoden
p3 EboZ/EboS aa32
p3 EboZ V5 Xba I
p5 EboS (30) Hind III
p5 EboS aa149
p5 EboS aa206
p5 EboS aa234
p5 EboS aa33
p5 EboZ (30) Hind III
p5 EboZ aa121
p5 EboZ aa149
p5 EboZ aa206
p5 EboZ aa234
p5 EboZ aa304
p5 EboZ aa324
p5 EboZ aa33
p5 EboZ aa349
p5 EboZ aa419
p5 EboZ aa472
p5 EboZ aa490
p5 EboZ aa61
p5 EboZ aa91
p5 EboZ mut N 228 A
p5 myc EboZ Hind III
p3 ASGPR1 Xba I
p5 ASGPR1 Kpn I
p3 ASGPR2 Xba I
p5 ASGPR2 Kpn I
p3 SIGNR1 AU1 Xba I
p5 SIGNR1 Kpn I
GGTCACAACACCCAAAGGCATGGAAAATGTTCTTTGGAAA
AGG
CTCTAGAGTCACGTAGAATCGAGACCGAGGAGAGGGTTAGG
GATAGGCTTACCAAAGACAAATTTGCATATACAG
CCAAGCTTACCATGGAGGGTCTTAGCCTACTCCAATTGCCC
TGACTATGCCTTTCACAA
GAAAATACATCAAGTTACTATGCC
AAAATTAACAATAATACTTT
ATGCCTTTGGGTGTTGTGACC
AAGCTTACCATGGGCGTTACAGGAATATTGCAGTTACC
TGTCTACCAGCAGCGCC
AGACTTTGCCTTCCATAA
GGACCCGTCTAGTGGCTA
GGTTGACAATTTGACCTA
AGTTGTCTTTCACAGT
GCGAACTTCTTCCGACCC
CCCACTTGGAGTCATCCA
AATGGTTCAAGTGCACAG
TCCCTCTGCCACGACCGC
GAGTGCCAGCAGCGGGAA
TGGAGTCGCAGGACTGATCACAGGCGGG
AATCAATTGAGATCAGT
GGTGTCCCACCAAAGGT
CTACCGGTTTTGGAACCGCTGAGACAGAGTAC
GAAGCTTGACCATGGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATC
TGGGCGTTACAGGAATATTGCAG
CCGTCTAGATTATATGTATCTGTAGGTGTCAAGGAGAGGTGG
CTCCTGGCTG
GGCGGTACCCACCATGACCAAGGAGTATCAAGACCTTC
CGGTCTAGATTATATGTATCTGTAGGTGTCGGCCACCTCGCC
GGTGGCATTCC
GCCGGTACCCACCATGGCCAAGGACTTTCAAGATAT
GGTCTAGAGGTTATATGTATCTGTAGGTGTCGCCTTCAGTGC
ATGGGGT
CCGGTACCACCATGAGTGACTCCACAGAAGC
2.1.2. Oligonukleotide für die Sequenzierung
5' pAB61-seq
3’ pAB61-seq
BGH reverse
CMV forward
pCAGGS-3´seq
pCAGGS-5´seq
sp6
T7
GGCTCTGCACAACCACTACACGC
CCACGCATGTGACCTCAGGGGTCCGG
TAGAAGGCACAGTCGAGG
CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG
CAGAAGTCAGATGCTCAAGGG
CAGCTCCTGGGCAACGTGCTGG
ATTTAGGTGACACTATAG
TAATACGACTCACTATAGGG
2.2. Vektoren und Plasmide
2.2.1. Vektoren
pcDNA3.1/Zeo
(+):
eukaryoter
Expressionsvektor,
welcher
zwischen
dem
HCMV-
Promotor/Enhancer und einem BGH-Polyadenylierungssignal eine multiple Klonierungssequenz
besitzt. Weiterhin vermittelt er für die Selektion in Bakterien Ampicillinresistenz, für die Selektion
in eukaryoten Zellen Zeocinresistenz (Invitrogen, San Diego, USA).
25
Material & Methoden
pcDNA4/TO: eukaryoter Expressionsvektor, der nach dem HCMV-Promotor/Enhancer, welcher
zwei Tet-Operatoren (Tet-Repressor-Bindestellen) besitzt, eine multiple Klonierungssequenz
und ein BGH-Polyadenylierungssignal kodiert. Durch die Tet-Operatoren ist es möglich,
doxycyclinabhängig Zielgene zu exprimieren. Weiterhin vermittelt er für die Selektion in
Bakterien Ampicillinresistenz, für die Selektion in eukaryoten Zellen Zeocinresistenz (Invitrogen,
San Diego, USA).
pAB61: eukaryoter Expressionsvektor, welcher nach einem HCMV-Promotor/Enhancer und
einer multiplen Klonierungssequenz für ein C-terminales IgΚ-Fc-myc/his Fusionsprotein mit
einem BGH-Polyadenylierungssignal kodiert. Des weiteren vermittelt dieser Vektor noch eine
Ampicillinresistenz in Bakterien, und Hygromycinresistenz in eukaryoten Zellen (Birkmann et al.,
2001).
pCAGGS: eukaryoter Expressionsvektor, der neben dem HCMV-Promotor/Enhancer einen βAktin-Promotor aus dem Huhn besitzt. Zwischen beiden Promotoren und der multiplen
Klonierungssequenz liegt ein Intron. Der Vektor kodiert weiterhin für ein Kaninchen β-GlobinPolyadenylierungssignal und vermittelt Ampicillinresistenz in Bakterien (Niwa et al., 1991).
2.2.2. Zur Verfügung gestellte Plasmide und Reporterkonstrukte
pcDNA3-DC-SIGN-AU1: kodiert für das humane DC-SIGN-Molekül mit C-terminalem AU1Epitop im eukaryoten Expressionsvektor pcDNA3 .
pcDNA3-DC-SIGNR-AU1: kodiert für das humane DC-SIGNR-Molekül mit C-terminalem AU1Epitop im eukaryoten Expressionsvektor pcDNA3 .
pCR3.1-VP40myc/GFP: kodiert für das ZEBOV-VP40-Protein mit N-terminaler Fusion des
GFP-Proteins oder des myc-Epitops im eukaryoten Expressionsvektor pCR3.1 (Invitrogen, San
Diego, USA). Freundlicherweise wurde das Konstrukt von Dr. P. Bieniasz zur Verfügung
gestellt.
pCMV-MLV: eukaryoter Expressionsvektor pCMV, der den Leserahmen für das GP des
murinen Leukämie-Virus (MLV) enthält (Simmons et al., 2003).
pcDNA3-VSV-G: eukaryoter Expressionsvektor pcDNA3, der das Gen für das GP des
vesikulären Stomatitis-Virus (VSV) kodiert (Simmons et al., 2003).
pcDNA-Lassa-Env: eukaryoter Expressionsvektor pcDNA3, der den Leserahmen für das
Lassavirus-GP beinhaltet (Simmons et al., 2003).
pCAGGS-MARV-GP: eukaryoter Expressionsvektor, welcher für das MARV-GP kodiert.
Freundlicherweise wurde das Konstrukt von Dr. S. Becker zur Verfügung gestellt.
pCAGGS-SARS-S: eukaryoter Expressionsvektor, der das Gen für das GP, genannt SpikeProtein (S) des SARS-CoV enthält.
pcDNA6-SEBOV-GP-V5: eukaryoter Expressionsvektor pcDNA6 (Invitrogen, Karlsruhe),
welcher den Leserahmen des SEBOV-GPs mit einem C-terminalen V5-Epitop enthält.
Freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. P. Bates.
26
Material & Methoden
pcDNA6-ZEBOV-GP-V5: eukaryoter Expressionsvektor pcDNA6 (Invitrogen, Karlsruhe),
welcher den Leserahmen des ZEBOV-GPs mit einem C-terminalen V5-Epitop enthält.
Freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. P. Bates.
p96ZM651gag-opt: kodonoptimierter Leserahmen des HIV-1 Gag-Proteins im eukaryoten
Expressionsvektor pcDNA3.1(-) (Gao et al., 2003).
pEGFP-N1: eukaryoter Expressionsvektor, der für das enhanced GFP kodiert (Clontech,
Heidelberg).
pBRNL4-3 ∆nef luc: replikationsfähiges HIV-1 NL4-3 luc Konstrukt, welches anstelle des nef
Gens das Luziferasegen inseriert hat .
pNL4-3 env* nef* luc: HIV-1 NL4-3-Konstrukt, welches die durch Punktmutation inaktivierten
Gene env und vpr kodiert; exprimiert das Luziferasegen unter Kontrolle des viralen LTRPromotors (Connor et al., 1995).
SIVmac239 ∆env ∆nef luc: SIVmac239-Konstrukt, welches keine funktionsfähigen Gene für
env und nef kodiert; exprimiert das Luziferasegen unter Kontrolle des viralen LTR-Promotors
(Kirchhoff et al., 1997).
27
Material & Methoden
2.2.3. Konstruierte Plasmide
Folgende DNA-Fragmente wurden über PCR-Amplifikation bzw. -Mutagenese mit den
entsprechenden
Oligonukleotiden
(siehe
2.1.1.)
hergestellt
und
mittels
geeigneter
Restriktionsendonukleasen in die angegebenen Vektoren kloniert:
Nummer
Name
Gensequenz
Vektor
66
SEBOV-GP
aa 1-676 SEBOV-GP
pcDNA3.1/Zeo
69
ZEBOV-GP
aa 1-676 ZEBOV-GP
pcDNA3.1/Zeo
86
S 234 Z
aa 1-233 S aa 234-676 Z
pcDNA3.1/Zeo
87
S 304 Z
aa 1-303 S aa 304-676 Z
pcDNA3.1/Zeo
88
S 324 Z
aa 1-323 S aa 324-676 Z
pcDNA3.1/Zeo
89
S 349 Z
aa 1-348 S aa 349-676 Z
pcDNA3.1/Zeo
90
S 149 Z
aa 1-148 S aa 149-676 Z
pcDNA3.1/Zeo
107
S 419 Z
aa 1-422 S aa 419-676 Z
pcDNA3.1/Zeo
108
S 472 Z
aa 1-475 S aa 472-676 Z
pcDNA3.1/Zeo
126
ASGPR-1
aa 1-292 ASGPR-1
pcDNA4/TO
127
ASGPR-2
aa 1-312 ASGPR-2
pcDNA4/TO
136
REBOV-GP
aa 1-677 REBOV-GP
pcDNA3.1/Zeo
137
ICEBOV-GP
aa 1-676 ICEBOV-GP
pcDNA3.1/Zeo
139
S 61 Z
aa 1-60 S aa 61-676 Z
pcDNA3.1/Zeo
140
S 91 Z
aa 1-90 S aa 91-676 Z
pcDNA3.1/Zeo
141
ZEBOV-GP ∆ mucin
ZEBOV-GP ∆ aa 309-489
pcDNA3.1/Zeo
143
SIGNR-1
aa 1-332 SIGNR-1
pcDNA4/TO
147
S 121 Z
aa 1-120 S aa 121-676 Z
pcDNA3.1/Zeo
181
SZ EBOV-GP
aa 1-32 S aa 33-676 Z
pcDNA3.1/Zeo
189
Z 149 S
aa 1-148 Z aa 149-767 S
pcDNA3.1/Zeo
190
ZEBOV-GP N228A
aa 1-676 ZEBOV-GP N228A
pcDNA3.1/Zeo
191
ZSZ
aa 1-206 Z aa 207-233 S aa 234-676 Z
pcDNA3.1/Zeo
192
SZS
aa 1-206 S aa 207-233 Z aa 234-676 S
pcDNA3.1/Zeo
237
ZS EBOV-GP
aa 1-32 Z aa 33-676 S
pcDNA3.1/Zeo
327
SEBOV-GP
aa 1-676 SEBOV-GP
pcDNA4/TO
328
ZEBOV-GP
aa 1-676 ZEBOV-GP
pcDNA4/TO
329
REBOV-GP
aa 1-677 REBOV-GP
pcDNA4/TO
330
IC-EBOV-GP
aa 1-676 ICEBOV-GP
pcDNA4/TO
331
SZ EBOV-GP
aa 1-32 S aa 33-676 Z
pcDNA4/TO
332
ZS EBOV-GP
aa 1-32 Z aa 33-676 S
pcDNA4/TO
541
myc-ZEBOV-GP-V5
aa 1-676 ZEBOV-GP
pcDNA3.1/Zeo
28
Material & Methoden
3.
Enzyme, Medien, Lösungen und Standardreagenzien
3.1. Enzyme
Die für Klonierungen verwendeten Restriktionsendonukleasen wurden von den Firmen New
England Biolabs (NEB, Schwalbach), Gibco-BRL (Karlsruhe), Boehringer (Mannheim) und
Fermentas (St. Leon-Rot) bezogen. Die Vent-Polymerase, Endoglykosidase H (Endo H),
PNGase F und T4-DNA-Ligase wurden von NEB (Schwalbach) bezogen, die Pfx-Polymerase
von Invitrogen (San Diego, USA). Alle Enzyme wurden in den mitgelieferten Puffersystemen
nach Herstellerangaben eingesetzt.
3.2. Medien, Lösungen und Puffer
3.2.1. Bakterienkulturmedien
Luria-Bertani-Medium (LB-Medium): 10 g/l Bacto-Trypton, 5 g/l Bacto-Hefeextrakt, 8 g/l NaCl,
1 g/l Glucose. Der pH-Wert wurde mit NaOH auf 7,2 eingestellt; anschließend wurde die Lösung
autoklaviert.
Luria-Bertani-Platten (LB-Platten): 15 g Agar wurden in 1 l LB-Medium gelöst und
autoklaviert. Nach Abkühlen auf 55°C wurden 50 µg/ml Ampicillin oder 20 µg/ml Kanamycin
zugegeben und Platten gegossen.
SOC-Medium: 20 g/l Bacto-Trypton, 5 g/l Bacto-Hefeextrakt, 2,5 mM NaCl, 10 mM MgCl2,
20 mM Glucose in H2O. Diese Lösung wurde sterilfiltriert.
3.2.2. Zellkulturmedien
Dulbecco’s modified Eagle Medium (DMEM): Dieses Medium wurde mit 350 µg/ml LGlutamin von der Firma PAA (Pasching, Österreich) bezogen.
RPMI 1640-Medium: Dieses Medium wurde mit 350 µg/ml L-Glutamin von der Firma PAA
(Pasching, Österreich) bezogen.
Isecove’s modified Dulbecco’s Medium (IMDM): Dieses Medium wurde von der Firma
Gibco/BRL (Karlsruhe) bezogen.
Trypsin / EDTA: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,56 mM Na2HPO4, 5 mM D(+)-Glucose, 25 mM
Tris/HCl, 0,01% EDTA in 0,25%-iger Trypsin-Lösung, pH 7,0.
3.2.3. Lösungen und Puffer
PBSo (Phosphat-gepufferte Saline ohne CaCl2 und MgCl2): 138 mM NaCl, 2,7 mM KCl,
6,5 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4.
TNE-Puffer: 0,01 M Tris-HCl pH 7,4, 0,15 M NaCl, 2 mM EDTA.
1x TAE-Puffer: 24,2 g Tris, 1,7 g EDTA und 5,7 ml Eisessig ad 5 l H2O.
6x DNA-Auftragepuffer: 30% Glycerin, 0,25% Bromphenolblau, 0,25% Xylencyanol.
10x SDS-PAGE-Puffer: 286 g Glycin, 60,6 g Tris und 20 g SDS in 2 l H2O.
29
Material & Methoden
Blotpuffer: 15,1 g Tris, 75 g Glycin und 1 l Ethanol ad 5 l H2O.
4x SDS-Auftragepuffer: 125 mM Tris/HCl pH 6,8, 2 mM EDTA, 20% Glycerin, 4% SDS, 10%
ß-Mercaptoethanol, 0,01% Bromphenolblau.
2x HBS: 16,4 g NaCl, 11,9 g HEPES, 0,21 g Na2HPO4 in 1 l H2O. Der pH-Wert wurde mit
NaOH auf 7,04-7,13 eingestellt. Anschließend wurde die Lösung sterilfiltriert.
FACS-Puffer: 5% FKS und 0,01% NaN3 in PBSo.
3.3. Standardreagenzien und Chemikalien
Chemikalien wurden von den Firmen Roth (Karlsruhe) und Sigma (Deisenhofen) bezogen.
Agarose
Ammoniumpersulfat (APS)
Ampicillin
β-Mercaptoethanol (β-ME)
Big Dye-Sequenzierkit
Blasticidin
Bromphenolblau
Centricon 30 kDa Säulen
Deoxyribonukleotidtriphosphate (dNTPs)
Dimethylsulfoxid (DMSO)
Doxycyclin
Ethidiumbromid
Ethylen-Diamin-Tetraacetat (EDTA)
Fötales Kälberserum (FKS)
Gentamycin
Glycerin
Glycin
HEPES
Kanamycin
Lipofectamine2000TM
Luziferase-Lysepuffer
Luziferase-Kit
Magermilchpulver (Lasana)
Mannan
Nitrozellulosemembran
Page Ruler prestained
Paraformaldehyd (PFA)
Rotiphorese Gel A und B
Sodiumdodecylsulfat (SDS)
Sukrose
TEMED
Tris
Triton-X 100
Tween20
Wasserstoffperoxid (H2O2)
Zeocin
Invitrogen, San Diego, USA
Sigma, Deisenhofen
Sigma, Deisenhofen
Sigma, Deisenhofen
Applied Biosystems, Weiterstadt
Invitrogen, San Diego, USA
Sigma, Deisenhofen
Millipore, Schwalbach
Invitrogen, San Diego, USA
Fluka/Sigma, Deisenhofen
Sigma, Deisenhofen
Sigma, Deisenhofen
Sigma, Deisenhofen
Cambrex, Verviers, Belgien
Sigma, Deisenhofen
Sigma, Deisenhofen
Biomol, Hamburg
Sigma, Deisenhofen
Sigma, Deisenhofen
Invitrogen, San Diego, USA
Promega, Heidelberg
Promega, Heidelberg
Humana Milchunion, Herford
Sigma, Deisenhofen
Schleicher & Schuell, Dassel
Fermentas, St. Leon-Rot
Roth, Karlsruhe
Roth, Karlsruhe
Sigma, Deisenhofen
Fluka/Sigma, Deisenhofen
Sigma, Deisenhofen
Roth, Karlsruhe
Roche Diagnostics, Mannheim
Sigma, Deisenhofen
Sigma, Deisenhofen
Invitrogen, San Diego, USA
30
Material & Methoden
4.
DNA-Methoden
4.1. DNA-Standardmethoden
Folgende Standardmethoden und Reagenzsysteme wurden im Labor verwendet:
-
chemische Transformation zum Einbringen von DNA in Bakterien (Sambrook & Russell
2001)
-
kleine Plasmidpräparation (Zagursky et al., 1985)
-
große Plasmidpräparation mit dem Maxi-Kit der Firma Quiagen (Hilden) nach den
Angaben des Herstellers
-
Agarosegelelektrophorese (Sambrook & Russell 2001)
-
Elution von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen unter Verwendung des Geneclean II Kit
(Qbiogene, Heidelberg) nach Herstellerangaben
-
Polymerasekettenreaktion (PCR) zur Amplifikation von DNA-Fragmenten (Sambrook &
Russell 2001)
-
automatische Sequenzierung mit einem ABI-Prism3100-Gerät (Applied Biosystems,
Weiterstadt) nach Angaben des Herstellers
4.2. PCR-Mutagenese
Zur
Konstruktion
von
EBOV-GP-Varianten
mit
Nukleotidaustauschen
wurden
zwei
aufeinanderfolgende PCR-Amplifikationen durchgeführt. Hierzu wurde der Leserahmen in zwei
Fragmente geteilt, wobei die Mutation in beiden Teilstücken einmal C- und einmal N-terminal
enthalten war. In der ersten PCR-Runde wurden diese Fragmente amplifiziert, wobei die
Nukleotidaustausche in dem einen Oligonukleotid kodiert waren und das andere, äußere
Oligonukleotid zur Amplifikation gebraucht wurde. Die beiden erhaltenen Teilstücke enthielten in
einem überlappenden Bereich nun die gewünschte Mutation. In die zweite PCR-Runde wurden
die beiden Fragmente zusammen mit den äußeren Oligonukleotiden eingesetzt. Das Produkt
dieser Reaktion enthielt den Nukleotidaustausch und entsprach der Größe, die durch das
äußere Oligonukleotidpaar vorgegeben wurde.
5.
Zellkulturverfahren
5.1. Kultivierung von Zellen
Alle Zelllinien und primären Zellen wurden im Brutschrank (BBD 6220, Heraeus, Hanau) bei
37°C, 5% CO2 und 80% relativer Luftfeuchtigkeit kultiviert.
IMDDC: Diese Zellen wurden in RPMI 1640-Medium mit 1% humanem Serum, 10 mM HEPES,
2 mM L-Glutamin, 800 U/ml GM-CSF und 250 U/ml Interleukin-4 (IL-4) gehalten.
31
Material & Methoden
PBMC: Die frisch isolierten Zellen wurden in RPMI 1640-Medium mit 10% FKS, 350 µg/ml
L-Glutamin, 10 µg/ml Gentamycin und 100 U/ml IL-2 gehalten.
293T, HeLa und Huh-7: Diese Zelllinien wurden in DMEM mit 10% FKS, 350 µg/ml L-Glutamin
und 10 µg/ml Gentamycin kultiviert.
T-REx-Zellen: Die parentale Zelllinie wurde in DMEM mit 10% FKS, 350 µg/ml L-Glutamin,
10 µg/ml Gentamycin und 2,5 µg/ml Blasticidin gehalten. Dem Medium lektinexprimierender
T-REx-Zelllinien wurden 50 µg/ml Zeocin beigefügt. Die Expression der entsprechenden Lektine
wurde durch Zugabe von Doxycyclin in einer Endkonzentration von 100 ng/ml induziert.
B-Zelllinien 1-22: Diese Zelllinien wurden in RPMI 1640-Medium mit 20% FKS, 350 µg/ml
L-Glutamin, 10 mM HEPES und 10 µg/ml Gentamycin kultiviert.
CEMx174 5.25 M7, B-THP, Raji, NC-37 und Sup-T1: Diese Zelllinien wurden in RPMI 1640Medium mit 10% FKS, 350 µg/ml L-Glutamin und 10 µg/ml Gentamycin gehalten.
Ramos: Diese Zellen wurden in IMEM mit 10% FKS, 350 µg/ml L-Glutamin und 10 µg/ml
Gentamycin kultiviert.
5.2. Transfektion eukaryoter Zelllinien
5.2.1. Transfektion mit der CaPO4-Methode
In 293T- und parentale T-REx-Zellen wurde DNA mit Hilfe der CaPO4-Methode eingebracht. Zu
diesem Zweck wurden am ersten Tag 5x105 Zellen in 5 ml Kulturmedium in eine 25 cm2
Zellkulturflasche (Nunc, Wiesbaden) ausgesät. Am zweiten Tag wurden 12 µg DNA in einem
Reaktionsgefäß vorbereitet, mit bidestilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 225 µl
aufgefüllt und anschließend mit 25 µl 2,5 M CaCl2 versetzt. Der Ansatz wurde sodann mit 250 µl
2x HBS Lösung versetzt, für 5 min bei RT inkubiert und auf die vorbereiteten Zellen getropft.
Nach 8-16 h Inkubation im Brutschrank wurde das Transfektionsgemisch von den Zellen
genommen und durch 5 ml frisches Medium ersetzt. Die DNA-Menge und die Volumina der
Transfektionsreagenzien wurden gegebenenfalls für weniger Zellen im kleineren Maßstab
angepasst.
5.2.2. Transfektion von HeLa-Zellen mit Lipofectamine2000TM
HeLa-Zellen wurden in einer Dichte von 4x105 Zellen pro 1,6 cm2 Zellkulturschale (Nunc,
Wiesbaden) ausgesät und über Nacht bei 37°C inkubiert. Den Angaben des Herstellers folgend
wurden 2 bis 4 µg DNA transfiziert, wobei jeweils 2 bis 4 µl Lipofectamine2000™-Reagenz
verwendet wurden. Die Volumina wurden entsprechend angepasst, wenn in einem anderen
Maßstab transfiziert wurde.
32
Material & Methoden
6.
Produktion pseudotypisierter Viren und virusähnlicher Partikel
(virus-like-particles, VLPs)
6.1. Herstellung pseudotypisierter Viren
Für die Herstellung pseudotypisierter Viren wurden zwei Plasmide benötigt: ein lentivirales
Reporterkonstrukt und ein Plasmid, welches für ein virales Oberflächenprotein kodiert. Als
lentivirales Reporterkonstrukt diente für HIV-1-basierte Pseudovirionen pNL4-3 env* nef* luc
(Connor et al., 1995), für SIVmac239-basierte Reporterviren SIVmac239 ∆env ∆nef luc
(Kirchhoff et al., 1997). Die beiden Plasmide wurden zu gleichen Teilen in 293T-Zellen mittels
CaPO4-Transfektion eingebracht. Ggf. wurde dem Kulturmedium Deoxymannojirimycin (DMJ) in
einer Endkonzentration von 2,5 mM zugesetzt. Nach 48 h wurden die Zellkulturüberstände,
welche die Virionen enthielten, geerntet, mittels 0,45 µM Sterilfilter gereinigt und in 1 ml Aliquots
bei -80°C eingefroren. Die verschiedenen Pseudotypen wurden nach Infektion von 293T- oder
T-REx-Zellen auf Infektiosität abgeglichen. Für HIV-1-basierte Viren wurde der Kapsidprotein
(p24)-Gehalt mittels ELISA (Murex, Abbott Diagnostics, USA) bestimmt, um in spätere
Infektionen gleiche Mengen an Virionen einsetzen zu können.
6.2. Produktion von HIV-1 NL4-3 luc Reporterviren
Zur Herstellung von replikationsfähigen HIV-1 Reporterviren, welche das Luziferasegen anstelle
des nef Gens tragen, wurde das Plasmid pBRNL4-3 ∆nef luc
transient in 293T-Zellen
eingebracht. 48 h nach Transfektion wurden die in den Zellkulturüberständen enthaltenen Viren
geerntet, durch 0,45 µM Filter sterilfiltriert und in 1 ml Aliquots bei -80°C eingefroren. Für die
verschiedenen Virusstocks wurde eine Normalisierung über den Kapsidprotein (p24)-Gehalt
mittels ELISA (Murex, Abbott Diagnostics, USA) vorgenommen.
6.3. Herstellung von VLPs
Die Produktion von lentiviralen HIV-1-basierten VLPs erfolgte durch transiente Kotransfektion
von 293T-Zellen mit dem Gag-Expressionsplasmid p96ZM651gag-opt (Gao et al., 2003) und
dem entsprechenden Plasmid für ein virales Glykoprotein. 48 h nach Transfektion wurden die in
den Zellkulturüberständen enthaltenen lVLPs geerntet, mittels 0,45 µM Sterilfilter gereinigt und
anschließend über ein 20%-iges Sukrosekissen in der Ultrazentrifuge sedimentiert. Das Pellet
wurde in einem kleinen Volumen TNE-Puffer resuspendiert, aliquotiert und bei -80°C
eingefroren.
Die Herstellung von filoviralen ZEBOV-VP40-basierten VLPs (fVLPS) und deren Ernte erfolgte
wie oben beschrieben. Es wurden die Expressionsplasmide pCR3.1-VP40-myc oder pCR3.1VP40-GFP verwendet. Da fVLPs bis zu 14 nm lang werden können wurde bei ihrer Ernte der
Sterilfiltrationsschritt durch eine Zentrifugation bei 1.500 rpm, 5 min, RT zum Entfernen des
33
Material & Methoden
Zelldebris ersetzt. Die Anreicherung erfolgte wie beschrieben in der Ultrazentrifuge über ein
20%-iges Sukrosekissen.
Alle erzeugten VLPs wurden mittels Western Blot Analyse über ihren Gag- bzw. VP40-Gehalt
normalisiert.
7.
Virale Infektions-, Transmissions- und Bindungsexperimente
7.1. Infektionsexperimente
Für Infektionsexperimente wurden entweder am Vortag 1x104 293T-, HeLa- oder T-Rex-Zellen
in 100 µl entsprechendem Medium oder 3x104 B-THP-, Raji-, NC-37-, CEMx174 5.25 M7-, SupT1-Zellen oder B-Zelllinien in 50 µl geeignetem Medium ausgesät. Die Infektion erfolgte mit 50
µl der entsprechenden Virusverdünnung in einem Endvolumen von 100 µl auf den Zellen für 12
h bei 37°C. Dann wurde das Kulturmedium ersetzt und nach weiteren 60 h wurde die Infektion
über die Luziferaseaktivitäten in den Zelllysaten mittels des Luciferase Assay Systems
(Promega, Heidelberg) in einem Orion Microplate Luminometer (Berthold Detection Systems,
Pforzheim) quantifiziert.
7.2. Transmissionsexperimente
Zur Analyse der lektinvermittelten Transmission von HIV-1 NL4-3 luc Reporterviren oder HIV-1basierten Pseudovirionen wurden 5x104 Transmitter-Zellen (iMDDC, B-THP- oder Ramos BZellen) im Reaktionsgefäß mit 5 ng p24-normalisiertem Virus für 3 h bei 37°C und 400 rpm
inkubiert. Anschließend wurde ungebundenes Virus durch dreimaliges Waschen mit Medium
entfernt und die Transmitter-Zellen mit 3x104 HeLa- oder CEMx174 5.25 M7-Zellen für 72 h
kokultiviert. Die Infektion der Zielzellen und somit die Transmissionsrate des gebundenen Virus
wurde anhand der Luziferaseaktivitäten in den Zelllysaten unter Verwendung des Luciferase
Assay Systems (Promega, Heidelberg) in einem Orion Microplate Luminometer (Berthold
Detection Systems, Pforzheim) quantifiziert.
7.3. Virale Bindungsexperimente
Die Interaktion viraler Glykoproteine mit zellulären Anheftungsfaktoren wurde wie folgt
analysiert: 5x104 T-Rex-Zellen wurden im Reaktionsgefäß mit 5 ng p24-normalisierten
Pseudovirionen für 1 h bei 4°C inkubiert. Ungebundene Viruspartikel wurden durch dreimaliges
Waschen mit Medium entfernt und die Zellen sedimentiert. Das Viruspellet wurde in 50 µl
PBSo-1% Triton-X 100 resuspendiert und für 1 h bei 65°C inaktiviert. Anschließend wurden
Verdünnungen der Lysate hergestellt und die Menge gebundener Viren mittels p24-Gehalt im
ELISA (Murex, Abbott Diagnostics, USA) quantifiziert.
34
Material & Methoden
8.
Proteinmethoden
8.1. Durchflusszytometrie (FACS)
Für die Analyse der Oberflächenexpression von Proteinen auf transient oder stabil transfizierten
Zellen wurden 5x105 Zellen mit PBSo von der Kulturschale abgelöst und pelletiert (adhärente
Zellen) oder pelletiert und mit PBSo gewaschen (Suspensionszellen). Die Inkubation des ersten
Ak in der geeigneten Verdünnung erfolgte in 100 µl FACS-Puffer für 1 h auf Eis. Nach
zweimaligem Waschen der Zellen wurde ein fluoreszenzmarkierter Sekundärantikörper, welcher
gegen den Fc-Teil des ersten Ak gerichtet war, ebenfalls in der entsprechenden Verdünnung in
100 µl FACS-Puffer zu den Zellen gegeben. Die Bindung erfolgte für 1 h auf Eis und bei
Dunkelheit. Abschließend wurden die Zellen noch zweimal gewaschen und in 200 µl FACSPuffer und 200 µl 4%-iger Paraformaldehydlösung resuspendiert. Die Analyse der
Oberflächenexpression erfolgte im FACSCalibur flow cytometer (Becton Dickinson).
8.2. Internalisierung, Protein- und VLP-Bindung
Zelluläre Anheftungsfaktoren besitzen die Eigenschaft, nach Bindung ihres Liganden
internalisiert zu werden. Im FACS-basierten Internalisierungsassay konnten DC-SIGNVarianten auf Unterschiede bezüglich dieser Fähigkeit analysiert werden. Zu diesem Zweck
wurden die zu testenden Zellen mit den beiden monoklonalen Antikörpern (mAk) gegen DCSIGN DCN46 (gerichtet gegen die Wiederholungsregion des Proteins) und mAk 507 (gerichtet
gegen die Lektinbindedomäne des Proteins) inkubiert. Ungebundener Ak wurde durch Waschen
entfernt. Anschließend wurden die gefärbten Zellen für 0, 5, 15, 30 und 60 min auf 37°C
gestellt, um die DC-SIGN Internalisierung zu ermöglichen. Nach diesem Schritt wurde noch
vorhandenes Protein im Komplex mit dem ersten mAk auf der Zelloberfläche mit einem
fluoreszierenden Sekundärantikörper markiert. Die Analyse erfolgte im FACSCalibur flow
cytometer (Becton Dickinson).
Zur
Untersuchung
der
Interaktionseigenschaften
viraler
Glykoproteine
mit
zellulären
Anheftungsfaktoren wurden zwei verschiedene FACS-basierte Analysen durchgeführt. Zum
einen wurden normalisierte IgG-Fusionsproteine im Experiment verwendet, zum anderen fVLPs
basierend und normalisiert auf ihren GFP-VP40 Gehalt. Zellen wurden mit dem jeweiligen IgGFusionsprotein für 1 h auf Eis inkubiert, gewaschen und gebundenes Protein wurde mit einem
Ak gegen den IgG-Anteil fluoreszenzmarkiert. Im Fall der fVLPs wurden die Zellen mit den
Partikeln für 1 h auf Eis inkubiert, anschließend wurden durch Waschschritte ungebundene
fVLPs entfernt. Eine weitere Markierung der Zellen war nicht nötig, da die Partikel GFP
beinhalten und somit durch UV-Licht zur Fluoreszenz angeregt werden können. Die Analyse
erfolgte wie beschrieben im FACSCalibur flow cytometer (Becton Dickinson).
35
Material & Methoden
8.3. in vitro-Transkriptions-Translations-Reaktion
Diese Methode wurde dazu herangezogen, N-terminale Epitope im Protein sichtbar zu machen,
die in der Zelle im ER abgespalten werden und somit im reifen Protein nicht mehr vorhanden
sind. Für in vitro-Transkriptions-Translations-Analysen wurde das TnT T7 Coupled Reticulocyte
Lysate System der Firma Promega (Heidelberg) nach Angaben des Herstellers verwendet. Ein
Gesamtansatz von 50 µl Volumen wurde nach der Reaktion gedrittelt und mittels Western BlotVerfahren (siehe 8.4.) analysiert.
8.4. Western Blot-Analyse
Für die Detektion der Proteinexpression im Western Blot wurden die Zellen von ihrer
Kulturschale abgelöst, gewaschen und im 1,5 ml Reaktionsgefäß bei 4.000 rpm und RT für
5 min sedimentiert. Der Überstand wurde verworfen und zum Zellpellet wurde ein geeignetes
Volumen an 2x SDS-Auftragepuffer gegeben. VLPs und p24-normalisierte Pseudopartikel
wurden im Eppendorfgefäß für 2 h bei 14.000 rpm und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde
abgesaugt und zum Pellet wurde ein geeignetes Volumen an 4x SDS-Auftragepuffer gegeben.
Vor dem Auftragen auf ein denaturierendes Polyacrylamidgel wurden alle Proben bei 95°C für
20 min hitzedenaturiert.
Die enthaltenen Proteine wurden dann vertikal elektrophoretisch mittels denaturierender
Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt (80 V, 2h) und durch Elektroblotting (Mini-TransBlot, Bio Rad) bei 200 mA für 60 min auf eine Nitrozellulosemembran überführt. Nach diesem
Transfer wurde die Membran in 5%-iger Milchpulverlösung über Nacht bei 4°C abgesättigt, um
unspezifische Bindungen der Ak an die Membran zu reduzieren. Anschließend wurden die
Primärantikörper bzw. -antiseren in der gewünschten Verdünnung in 3 ml 3%-iger
Milchpulverlösung vorbereitet und nach der Absättigung mit der Membran für 1 h bei RT
inkubiert. Die Membran wurde dann dreimal für 5 min mit PBSo/ 0,1% Tween bei RT
gewaschen.
Währenddessen
wurde
der
Meerrettichperoxidase
(HRP)-konjugierte
Sekundärantikörper 1:5.000 in 3 ml 3%-iger Milchpulverlösung verdünnt. Nach dem dritten
Waschschritt wurde die Sekundärantikörperlösung auf die Membran gegeben und wieder für 1h
bei RT inkubiert. Anschließend folgten drei Waschschritte für je 10 min mit PBSo/ 0,1% Tween.
Die Nitrozellulosemembran wurde dann mit 5 ml ECL-Lösung (5 ml ECL-Lösung A, 50 µl ECLLösung B und 1,55 µl H2O2) versetzt und mit Hilfe des FUJIFILM Luminescent Image Analyzer
LAS-1000 (FUJIFILM Europe GmbH, Düsseldorf) erfolgte der Proteinnachweis. Der Detektion
durch Antikörper gebundener Proteine liegt zugrunde, dass in der ECL-Lösung ein Substrat der
Meerrettichperoxidase enthalten ist, welches diese umsetzt. Bei der Umsetzung handelt es sich
um eine Chemolumineszenz-Reaktion und die entstehenden Lichtsignale können von der
Kamera aufgenommen und als Bild dargestellt werden.
36
Material & Methoden
8.5. Biochemische Analyse von Glykoproteinen
Zur Analyse der Glykosylierungsmodifikationen eines Proteins wurden zwei verschiedene
Strategien
angewendet.
Zum
einen
wurden
die
zu
testenden
Proteine
mit
den
Endoglykosidasen Endo H (spaltet Mannosereste aus N-verknüpften Glykanen in Proteinen ab)
und PNGase F (spaltet alle N-verknüpften Glykane vom Protein ab) (beide NEB, Schwalbach)
für verschiedene Zeiträume verdaut und anschließend in einem Western Blot untersucht. Zum
anderen wurden die Proteine auf die Zusammensetzung ihrer Oligosaccharide hin mit dem DIG
Glycan Differentiation Kit (Roche, Mannheim) analysiert. Hierfür wurden die Proteine wie bei
einer Western Blot-Analyse im SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt und auf Nitrozellulose
transferiert. Anschließend wurde die Membran gemäß den Angaben des Herstellers blockiert;
die Zuckerbindung erfolgte mit den im Kit enthaltenen Digoxygenin-markierten Pflanzenlektinen,
die jeweils ein Oligosaccharid spezifisch erkennen. Der Nachweis der gebundenen Lektine
erfolgte über die Markierung mit den im Kit enthaltenen Komponenten.
37
Ergebnisse
E.
Ergebnisse
1.
DC-SIGN und DC-SIGNR interagieren mit dem MARV-GP
und dem Spike-Protein des SARS-Coronavirus
(Marzi, Gramberg, Simmons et al., Journal of Virology, 2004)
Die Lektine DC-SIGN und DC-SIGNR binden an mannosereiche Oligosaccharide viraler
Glykoproteine. Diese Bindung wird möglicherweise von Viren ausgenutzt, um sich im
Organismus effizienter verbreiten zu können. Als DC-SIGN/R-bindende Viren wurden
Lentiviren, Herpesviren, Flaviviren, Alphaviren, Paramyxoviren und Filoviren beschrieben
(Baribaud et al., 2002; Geijtenbeek & van Kooyk 2003; Pöhlmann et al., 2003). Es ist jedoch
weitgehend unklar, ob weitere Viren an DC-SIGN/R binden bzw. ob andere Lektine die virale
Infektion verstärken können. Im folgenden Teilprojekt wurde analysiert, ob das SARS (severe
acute respiratory syndrome) auslösende Coronavirus (SARS-CoV) und das MARV mit DCSIGN/R und weiteren zellulären Lektinen interagieren.
1.1.
DC-SIGN und DC-SIGNR verstärken die MARV-GP- und SARS-CoV-S-getriebene
Infektion
Es sollte untersucht werden, ob die Lektine DC-SIGN (exprimiert auf DCs), DC-SIGNR
(exprimiert auf LSECs), ASGP-R H1 (exprimiert auf Hepatozyten), Langerin (exprimiert auf
Langerhans-Zellen) und murines SIGNR1 (exprimiert auf Makrophagen der Maus) als
Anheftungsfaktoren
für
Viren
Anheftungsfaktoren
wurden
fungieren.
293
Für
eine
T-REx-Zellen
regulierbare
mit
Expression
Expressionsplasmiden
dieser
für
die
entsprechenden Lektine transfiziert und stabil exprimierende Zellen mit Hilfe von Antibiotika
selektioniert.
Zellzahl
DC-SIGN
DC-SIGNR
ASGP-R H1
Langerin
SIGNR1
120
120
120
120
120
120
90
90
90
90
90
60
60
60
60
60
30
30
30
30
30
0
0
0
0
100
1
101
2
102
3
103
4
104
0
100
1
101
2
102
3
103
4
104
0
100
1
101
2
102
3
103
4
104
0
1
100
101
2
102
3
103
4
104
0
100
101
102
103
104
Fluoreszenz
Abb. 5: Induzierbare Lektinexpression auf 293 T-REx-Zelllinien.
Die Expression der angeführten Lektine in 293 T-REx-Zellen wurde durch Zugabe von 0,1 µg/ml Doxycyclin (Dox)
induziert. Der Nachweis auf der Zelloberfläche erfolgte über das C-terminal vorhandene AU1-Epitop mittels
Durchflusszytometrie (FACS). Hellgrau sind Kontrollzellen dargestellt, dunkelgrau sind uninduzierte T-REx-Zellen zu
sehen und schwarz sind induzierte lektinexprimierende Zellen abgebildet. Das gezeigte repräsentative Experiment
stellt eines von drei unabhängigen Experimenten dar.
38
Ergebnisse
Das T-REx-System erlaubt die Doxycyclin (Dox)-abhängige Expression von Proteinen. Der
Nachweis der Lektinexpression auf T-Rex-Zellen erfolgte mittels eines AU1-Epitops, welches Cterminal an das Protein fusioniert war (Abb. 5). Alle Lektine wurden effizient und in Doxabhängiger Weise auf der Oberfläche von T-REx-Zellen exprimiert (Abb. 5). Die effiziente
Expression konnte in Western Blot-Analysen bestätigt werden (Daten nicht gezeigt).
Im nächsten Schritt wurden die zur Lektinexpression induzierten Zellen mit lentiviralen
Pseudopartikeln infiziert, um herauszufinden inwiefern die Lektine eine Infektionsverstärkung in
cis bewirken können. Die pseudotypisierten Reporterviren basierten auf einem lentiviralen
Konstrukt, in welchem der Hüllproteinleserahmen inaktiviert und das nef-Gen durch das
Luziferasegen ersetzt wurde. Diese Viren können einen Infektionszyklus durchlaufen, sie sind
jedoch nicht replikationsfähig. In Zielzellen wird Luziferase unter Kontrolle des viralen
Promotors exprimiert und Luziferaseaktivität wird nur dann gemessen, wenn die Viren
erfolgreich in die Zellen eingetreten sind und die provirale DNA in das Wirtszellgenom integriert
wurde. Die Enzymaktivität korreliert daher direkt mit der Infektionseffizienz.
10000
ZEBOV-GP
9000
MARV-GP
% Infektion
8000
7000
Lassa-GP
6000
SARS-CoV-S
5000
VSV-G
4000
MLV-GP
3000
2000
1000
0
Kontrolle
DC-SIGN
DC-SIGNR
ASGP-R H1
Langerin
SIGNR1
Abb. 6: Infektion lektinexprimierender 293 T-REx-Zelllinien mit pseudotypisierten Reporterviren.
Die T-REx-Zellen wurden durch 0,1 µg/ml Dox zur Lektinexpression induziert und anschließend mit den
angegebenen pseudotypisierten Luziferase-Reporterviren infiziert. Die Viren waren vorher auf vergleichbare
Infektiosität normalisiert worden. Luziferaseaktivitäten in Zelllysaten wurden 72 h nach Infektion bestimmt. Im
Diagramm ist die relative Infektion der Zelllinien dargestellt; die Infektion der permissiven T-REx Kontrollzellen wurde
als 100% gesetzt. Das gezeigte repräsentative Experiment stellt eines von drei unabhängigen Experimenten dar.
Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar.
Für die Infektion der T-REx-Zelllinien wurden Pseudotypen vergleichbarer Infektiosität
eingesetzt, die die Hüllproteine folgender Viren auf ihrer Oberfläche trugen: ZEBOV, MARV,
Lassavirus, SARS-CoV, murines Leukämie-Virus (MLV) und vesikuläres Stomatitis-Virus (VSV)
(Abb. 6). Wie bereits in anderen Arbeiten publiziert, konnte gezeigt werden, dass DC-SIGN/R
und ASGP-R H1 die ZEBOV-GP getriebene Infektion verstärken, jedoch den VSV-G-, MLV-GPund Lassa-GP-vermittelten Eintritt nicht beeinflussen (Becker et al., 1995; Simmons et al.,
39
Ergebnisse
2003). Die gesteigerte Infektion von DC-SIGN- und DC-SIGNR-exprimierenden Zellen durch
SARS-CoV-S-Pseudopartikel konnte im Rahmen dieser Arbeit erstmals gezeigt werden, ebenso
wie die infektionsverstärkende Wirkung von DC-SIGN/R und ASGP-R H1 auf MARV-GPPseudoviren. Murines SIGNR1 verstärkte ebenfalls die ZEBOV- und MARV-GP-abhängige
Infektion, jedoch mit geringerer Effizienz als DC-SIGN/R. Schließlich wurde für Langerin keine
infektionsverstärkende Wirkung beobachtet (Abb. 6).
Im nächsten Schritt sollte die Spezifität der Interaktion der SARS-CoV-S-Pseudoviren mit DCSIGN untersucht werden. Hierzu wurden T-REx Kontroll- oder T-REx DC-SIGN-Zellen mit DCSIGN/R-spezifischen monoklonalen Antikörpern (mAk) oder dem Mannosepolymer Mannan
präinkubiert und anschließend mit SARS-CoV-S-Pseudotypen infiziert (Abb. 7). Das Experiment
zeigt die Inhibition der DC-SIGN-vermittelten Infektionsverstärkung durch den DC-SIGN/Rspezifischen mAk 526 (Baribaud et al., 2002) und durch Mannan. Ein IgG-Kontrollantikörper
und der DC-SIGNR-spezifische mAk 604 hatten dagegen keinen Einfluss auf die Infektion von
T-REx DC-SIGN-Zellen.
180
160
% Infektion
140
120
100
80
60
40
20
0
IgG 507 604 526 Mannan
DC-SIGN
Kontrolle
Abb. 7: Inhibition der SARS-CoV-S vermittelten Infektion von 293 T-REx DC-SIGN-Zellen.
DC-SIGN-exprimierende T-Rex-Zellen und T-REx Kontrollzellen wurden mit Dox (0,1 µg/ml) zur Lektinexpression
induziert, mit den angegebenen mAks oder Mannan in einer Endkonzentration von 20 µg/ml für 30 min bei 37°C
präinkubiert und schließlich mit SARS-CoV-S-Pseudoviren infiziert. Luziferaseaktivitäten in Lysaten infizierter Zellen
wurden 72 h nach Infektion bestimmt. Im Diagramm ist die relative Infektion der Zelllinien dargestellt; die Infektion der
permissiven T-REx DC-SIGN-Zellen präinkubiert mit IgG-Kontrollantikörper entspricht 100%. Das gezeigte
Experiment steht repräsentativ für drei unabhängige Experimente. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar.
Warum der DC-SIGN-spezifische mAk 507 ebenfalls keine blockierende Wirkung zeigte, ist zum
gegenwärtigen Zeitpunkt unklar. Die Resultate deuten jedoch klar darauf hin, dass die
Verstärkung der SARS-CoV-S-vermittelten Infektion auf DC-SIGN-Bindung zurückzuführen ist.
40
Ergebnisse
1.2. DC-SIGN/R fungieren nicht als Rezeptoren für SARS-CoV
Das
Denguevirus
verwendet
DC-SIGN
als
Rezeptor
für
den
Eintritt
in
Zielzellen
(Tassaneetrithep et al., 2003). Für das SARS-CoV wurde die Metalloprotease ACE-2
(angiotensin converting enzyme 2) als Rezeptor identifiziert (Li et al., 2003). Es sollte nun
untersucht werden, ob DC-SIGN/R ebenfalls als SARS-CoV-Rezeptoren wirken oder nur die
Funktion von Anheftungsfaktoren übernehmen. Zu diesem Zweck wurden nicht-permissive,
ACE-2-negative Zellen mit DC-SIGN, DC-SIGNR, ACE-2 oder ACE-2 in Kombination mit DCSIGN oder DC-SIGNR transient transfiziert und anschließend mit SARS-CoV-S-, VSV-G- und
ZEBOV-GP-Pseudoviren infiziert. Vorversuche zeigten, dass die verwendeten QT6-Zellen zwar
für die VSV-G- und ZEBOV-GP- vermittelte Infektion suszeptibel sind, jedoch für
Pseudopartikel, die SARS-CoV-S auf ihrer Oberfläche trugen, nicht-permissiv sind (Daten nicht
gezeigt).
100000
% Infektion
10000
1000
100
10
Kontrolle DC-SIGN DC-SIGNR ACE-2 ACE-2 + ACE-2 +
DC-SIGN DC-SIGNR
SARS-CoV-S
VSV-G
ZEBOV-GP
Abb. 8: Infektion DC-SIGN/R- und ACE-2-exprimierender, nicht-permissiver QT6-Zellen mit SARS-CoV-SPseudoviren.
QT6-Zellen wurden transient mit den angegebenen Oberflächenproteinen transfiziert und mit normalisierten
Pseudotypen, die die Hüllproteine von VSV, ZEBOV und SARS-CoV auf ihrer Oberfläche trugen, infiziert.
Luziferaseaktivitäten im Zelllysat wurden 72 h nach Infektion bestimmt. Im Diagramm ist die relative Infektion der
QT6-Zellen dargestellt; die Infektion der Kontrollzellen für jedes Virus entspricht 100%. Das gezeigte repräsentative
Experiment stellt eines von drei unabhängigen Experimenten dar. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung.
Alle getesteten Zellen waren gleichermaßen permissiv für den Eintritt VSV-G-pseudotypisierter
Viren. Ebenso konnten QT6 Kontrollzellen und ACE-2-exprimierende Zellen effizient und
vergleichbar
durch
ZEBOV-GP-tragende
Pseudotypen
infiziert
werden,
und
die
Infektionseffizienz wurde durch DC-SIGN/R-Expression verstärkt (Abb. 8). Im Gegensatz dazu
waren Kontrollzellen für SARS-CoV-S-Pseudoviren nicht permissiv. Wurde der Rezeptor ACE-2
jedoch auf den Zellen exprimiert, konnte Infektion durch SARS-CoV-S-Pseudopartikel
nachgewiesen werden und die Infektionsstärke wurde durch DC-SIGN/R-Expression erhöht
(Abb. 8). Diese Beobachtungen demonstrieren, dass DC-SIGN/R nicht als Rezeptoren sondern
41
Ergebnisse
als Anheftungsfaktoren für SARS-CoV fungieren, da ihre Expression den Eintritt in
empfängliche Zellen verstärkt, jedoch für die Infektion refraktärer Zellen nicht ausreicht.
1.3.
DC-SIGN-abhängige Transmission von SARS-CoV-S-Pseudoviren auf suszeptible
Zellen
Es wurde beschrieben, dass DCs HIV in einer DC-SIGN-abhängigen Weise auf CD4+ T-Zellen
übertragen (Geijtenbeek et al., 2000b). Da SARS-CoV im Patienten ebenfalls auf DC-SIGNpositive Zellen trifft, wie z.B. DCs in der Haut und alveolare Makrophagen (Hofmann &
Pöhlmann 2004), stellte sich die Frage, ob DC-SIGN auch die trans-Infektion von SARS-CoV
vermittelt. Zur Beantwortung dieser Frage wurden in einem ersten Experiment B-THP DCSIGN-Zellen mit SARS-CoV-S-Pseudoviren inkubiert, gewaschen und schließlich mit
permissiven Huh-7-Zellen kokultiviert (Abb. 9A). Die Kokultivierung von Huh-7-Zellen mit
virusbeladenen B-THP DC-SIGN-Zellen (Raji B-Zellen, die stabil exogenes DC-SIGN
exprimieren) (Wu et al., 2004) resultierte in einer erhöhten Luziferaseaktivität in Zelllysaten im
Vergleich zu Huh-7-Kokulturen mit B-THP Kontrollzellen. Präinkubation der B-THP DC-SIGNZellen mit Mannan reduzierte die Transmission der SARS-CoV-S-Pseudotypen auf Werte, die
mit B-THP Kontrollzellen gemessen wurden (Abb. 9A). Schließlich resultierte die direkte
Infektion
von
B-THP
DC-SIGN-
und
B-THP
Kontrollzellen
in
Luziferasewerten
im
Hintergrundbereich. SARS-CoV-S-Pseudotypen können demzufolge in DC-SIGN-abhängiger
Weise auf suszeptible Zellen übertragen werden, ohne dass dabei die Transmitter infiziert
werden.
Im nächsten Schritt wurde getestet, ob unreife, aus Monozyten generierte DCs (immature
monocyte-derived DCs, iMDDCs), ebenso wie B-THP DC-SIGN-Zellen SARS-CoV-SPseudoviren auf permissive Zellen übertragen können. Die iMDDCs wurden mit den
Pseudotypen in An- und Abwesenheit von Mannan inkubiert, gewaschen und mit permissiven
Huh-7-Zellen kokultiviert (Abb. 9B). Die Analyse der Kokulturen zeigte, dass die Viren effizient
von iMDDCs auf Huh-7-Zellen übertragen werden. Die Transmitter selbst blieben dabei
uninfiziert (Luziferasewerte für DCs im Hintergrundbereich, Abb. 9B) und vergleichbare Daten
wurden nach iMDDC-Infektion mit replikationskompetentem SARS-CoV erhalten (Abb 9C). Die
Vorbehandlung mit Mannan resultierte in einer Reduktion der Luziferaseaktivität, allerdings
nicht bis in den Hintergrundbereich. Dieses Ergebnis zeigt, dass neben mannosebindenden
Lektinen wie DC-SIGN noch weitere Faktoren auf der Oberfläche von iMDDCs die
Transmission von SARS-CoV-S-Pseudotpyen vermitteln können.
42
Ergebnisse
A
Luziferaseaktivität (c.p.s.)
-
Huh-7
B-THP DCS
-
Huh-7
B-THP DCS
+
Huh-7
-
-
Huh-7
-
-
B-THP
-
-
B-THP DCS
B
100000
10
B-THP
10000
Zielzellen:
1000
Mannan:
100
Transmitter:
C
Luziferaseaktivität (c.p.s.)
Huh-7
iMDDC
+
Huh-7
-
-
iMDDC
-
-
Huh-7
1000000
-
100000
10
iMDDC
10000
Zielzellen:
1000
Mannan:
100
Transmitter:
SARS-CoV
Mock
Vero E6
iMDDC
Abb. 9: DC-SIGN-abhängige Transmission von SARS-CoV-S-Pseudoviren.
(A) B-THP DC-SIGN-Zellen transmittieren SARS-CoV-S-Pseudotypen. B-THP DC-SIGN (DCS)- und B-THP
Kontrollzellen wurden in An- und Abwesenheit von Mannan (20 µg/ml) mit SARS-CoV-S-pseudotypisierten
Reporterviren inkubiert, gewaschen und ggf. mit permissiven Huh-7-Zellen für 72 h kokultiviert. (B) IMDDCvermittelte Transmission der SARS-CoV-S-Pseudoviren. IMDDCs wurden in An- und Abwesenheit von Mannan
(20 µg/ml) mit SARS-CoV-S-pseudotypisierten Reporterviren inkubiert, gewaschen und ggf. mit permissiven Huh-7Zellen für 72 h kokultiviert. (A) und (B) Luziferaseaktivitäten im Zelllysat wurden 72 h nach Infektion bestimmt. Das
gezeigte Experiment steht repräsentativ für zwei unabhängige Experimente. Fehlerbalken zeigen die
Standardabweichung. (C) SARS-CoV-Infektion von iMDDCs. Vero E6-Zellen und iMDDCs wurden auf Objektträgern
ausgesät und mit replikationskompetentem SARS-CoV (Isolat Frankfurt) inokuliert. 48 h nach Infektion wurden
infizierte Zellen über einen Antikörper gegen das SARS-Nukleokapsidprotein mittels Immunfluoreszenz detektiert.
43
Ergebnisse
2.
Das EBOV-GP-Signalpeptid beeinflusst die Interaktion mit den zellulären
Lektinen DC-SIGN und DC-SIGNR
(Marzi et al., Journal of Virology, 2006)
Die Ca2+-abhängigen Lektine DC-SIGN/R binden an EBOV-GP und verstärken den infektiösen
Eintritt in Zielzellen. Die Effizienz der Infektionsverstärkung variiert jedoch zwischen den EBOVSubtypen; DC-SIGN/R verstärken massiv die Zaire EBOV (ZEBOV)-GP, jedoch nicht die Sudan
EBOV (SEBOV)-GP getriebene Infektion (Lin et al., 2003; Simmons et al., 2003). In diesem
Teilprojekt wurde analysiert, welche Determinanten die unterschiedliche Interaktion von
ZEBOV- und SEBOV-GPs mit DC-SIGN/R bedingen.
2.1.
DC-SIGN/R
verstärken
die
ZEBOV-
und
SEBOV-GP-vermittelte
Infektion
unterschiedlich stark
Für die Infektionsexperimente wurden T-REx-Zelllinien herangezogen, die Dox-induzierbar DCSIGN/R exprimieren (Pöhlmann et al., 2001b). Effiziente und vergleichbare Lektinexpression
wurde mittels FACS-Analyse bestätigt (Daten nicht gezeigt). Die Infektion dieser Zellen erfolgte
mit SIV-basierten Pseudopartikeln, die eine Deletion in env und das Luziferasegen anstelle von
nef trugen und mit ZEBOV- bzw. SEBOV-GP oder VSV-G in trans komplementiert wurden. Die
ZEBOV-GP-getriebene Infektion wurde durch DC-SIGN/R etwa 70-fach verstärkt, während die
SEBOV-GP-vermittelte Infektion durch Lektinexpression nur etwa 10-fach erhöht wurde. Der
Zelleintritt der VSV-G-Pseudotypen blieb durch DC-SIGN/R unbeeinflusst (Abb. 10).
12000
% Infektion
10000
Kontrolle
DC-SIGN
DC-SIGNR
8000
6000
4000
ZEBOV-GP
SEBOV-GP
0
VSV-G
2000
Abb. 10: ZEBOV- und SEBOV-GP interagieren unterschiedlich mit DC-SIGN/R.
T-REx DC-SIGN/R- und T-REx Kontrollzellen wurden mit Dox (0,1 µg/ml) zur Lektinexpression induziert und mit
normalisierten VSV-G-, SEBOV-GP- und ZEBOV-GP-Pseudotypen infiziert. Luziferaseaktivitäten im Zelllysat wurden
72 h nach Infektion bestimmt. Im Diagramm ist die relative Infektion der Zelllinien dargestellt; die Infektion der
permissiven T-REx Kontrollzellen wurde für jedes Virus als 100% gesetzt. Die Durchschnittswerte aus drei
unabhängigen Experimenten sind gezeigt. Fehlerbalken repräsentieren den Standardfehler des Mittelwertes.
44
Ergebnisse
2.2.
Die Effizienz der GP-Inkorporation in Pseudopartikel beeinträchtigt die
DC-SIGN/R-Interaktion
Eine mögliche Erklärung für die Differenzen in der DC-SIGN/R-Interaktion von ZEBOV- und
SEBOV-GP-tragenden Pseudotypen könnte ein unterschiedlich effizienter Einbau der GPs in
lentivirale Pseudoviren sein. Zur Untersuchung dieser Frage wurden Pseudopartikel durch
Kotransfektion titrierter GP-DNA-Mengen und konstanter Mengen an Vektor-kodierendem
Plasmid hergestellt, die bei konstantem Gag-Gehalt unterschiedliche GP-Kopienzahlen
aufwiesen (Daten nicht gezeigt).
A
ZEBOV-GP
SEBOV-GP
Luziferaseaktivität (c.p.s.)
10000000
1000000
100000
10000
100 50 25 12.5 6.3 3 1.5 0.75
100 50 25 12.5 6.3 3 1.5 0.75
% GP DNA kotransfiziert
% GP DNA kotransfiziert
DC-SIGN
120
GP
50
Gag
148
GP
antiZEBOV-GP
Gag
anti-ZEBOV-GP
100
80
60
40
20
0
Kontrolle
50
kDa
anti-V5
anti-V5
SEBOV-GP
4
ZEBOV-GP
3
Kontrolle
2
% ZEBOV-GP Inkorporation
148
C
1
SEBOV-GP
B
Kontrolle
ZEBOV-GP
1000
Abb. 11: Effizienz der ZEBOV-GP-Inkorporation in Pseudopartikel moduliert die DC-SIGN/R-Interaktion.
(A) Pseudoviren mit unterschiedlichem GP-Gehalt wurden durch Kotransfektion titrierter GP-DNA- und konstanter
Reporterplasmidmengen generiert; gleiche Volumen dieser Viren wurden zu induzierten T-REx DC-SIGN- und T-REx
Kontrollzellen gegeben. Luziferaseaktivitäten im Zelllysat wurden 72 h nach Infektion bestimmt. Im Diagramm ist das
Resultat eines von zwei unabhängigen Experimenten, durchgeführt in Triplikaten, dargestellt. Fehlerbalken
repräsentieren die Standardabweichung. (B) Lentivirale VLPs (lVLPs), die ZEBOV- und SEBOV-GP mit einem Cterminalen V5-Epitop auf ihrer Oberfläche tragen, wurden pelletiert, lysiert und unter nicht-reduzierenden
Bedingungen im Western Blot analysiert. GP wurde mittels eines V5-spezifischen Antikörpers (oberer Teil) oder
eines Kaninchenserums, generiert gegen ZEBOV-GP (unterer Teil), nachgewiesen. Der Gag-Nachweis erfolgte
durch ein anti-Gag Kaninchenserum. 1 Kontrolle, 2 Gag, 3 Gag + SEBOV-GP, 4 Gag + ZEBOV-GP. (C) Die EBOVGP-Inkorporation in lVLPs wurde wie unter (B) beschrieben analysiert und densitometrisch mit Hilfe des Programms
AIDA image analyzer basic software (version 3.10.) quantifiziert. Der GP-Gehalt relativ zu Gag ist dargestellt; die
erhaltenen Werte für ZEBOV-GP wurden als 100% gesetzt. Die Durchschnittswerte aus drei unabhängigen
Experimenten mit drei unterschiedlichen VLP-Präparationen sind gezeigt. Fehlerbalken repräsentieren den
Standardfehler des Mittelwertes.
45
Ergebnisse
Gleiche Volumina dieser Viren wurden mit T-REx DC-SIGN- und T-REx Kontrollzellen inkubiert
(Abb. 11A). Mit wenigen Ausnahmen wurde nach Infektion von DC-SIGN-positiven Zellen mit
SEBOV-GP-Pseudoviren eine im Vergleich zur Infektion von Kontrollzellen leicht erhöhte
Luziferaseaktivität gemessen. Die relative Infektion beider Zelltypen war jedoch vergleichbar,
unabhängig von der Menge verwendeter GP-DNA (Abb. 11A, rechte Teilabbildung). Im
Gegensatz dazu infizierten ZEBOV-GP-Pseudotypen DC-SIGN-exprimierende Zellen weitaus
effizienter als Kontrollzellen, wenn größere Mengen GP-DNA transfiziert wurden. Sind dagegen
Pseudopartikel mit geringerem GP-Gehalt für die Infektion eingesetzt worden, war der Eintritt in
DC-SIGN- und Kontrollzellen vergleichbar (Abb. 11A, linke Teilabbildung). Die auf
Pseudovirionen präsente Menge an ZEBOV-GP moduliert demnach die Interaktion mit DCSIGN, während die Inkorporation von SEBOV-GP, zumindest unter den getesteten
Bedingungen, keinen Einfluss auf die Wechselwirkung mit diesem Lektin hat.
Wird SEBOV-GP generell weniger effizient in Virionen eingebaut als ZEBOV-GP? Die Antwort
auf diese Frage sollte die Analyse lentiviraler VLPs (lVLPs) geben. lVLPs wurden durch
transiente Koexpression von HIV-1 Gag und EBOV-GPs mit C-terminaler V5-Sequenz
hergestellt und auf die Menge an Gag-Protein hin normalisiert. Nach Western Blot-Analyse mit
einem V5-spezifischen Antikörper (Ak) wurden vergleichbare Signale für SEBOV- und ZEBOVGP detektiert (Abb. 11B, obere Teilabbildung; Abb. 11C, linke Teilabbildung). Der
Proteinnachweis mit einem Kaninchenserum, das nach Immunisierung mit ZEBOV-GP erhalten
wurde, resultierte dagegen erwartungsgemäß in intensiveren Banden für ZEBOV- als SEBOVGP (Abb. 11B, untere Teilabbildung; Abb. 11C, rechte Teilabbildung). Diese Ergebnisse zeigen,
dass ZEBOV- und SEBOV-GP mit vergleichbarer Effizienz in lentivirale Partikel eingebaut
werden.
2.3.
ZEBOV-, jedoch nicht SEBOV-GP-Inkorporation in filovirale VLPs vermittelt die
effiziente Bindung an DC-SIGN/R
Da sich retro- und filovirale Partikel in Größe und Form unterscheiden, wurde im nächsten
Schritt untersucht, ob diese Unterschiede die Wechselwirkung mit Lektinen beeinträchtigen,
oder ob sich die Ergebnisse aus den bereits gezeigten Experimenten mit filoviralen VLPs
(fVLPs) bestätigen lassen.
Abb. 12: Herstellung von fVLPs in
293T-Zellen.
293T-Zellen wurden mit GFP-VP40
und
GP
(beides
ZEBOV)
kotransfiziert; 48 h nach Transfektion
wurden im Überstand die fVLPs
geerntet. (A) zeigt die Kernfärbung
der transfizierten Zellen (DAPI); in
(B) sind Zellen dargestellt, von
welchen sich fadenförmige Partikel
abschnüren – die GFP-enthaltenden
fVLPs.
A
46
B
Ergebnisse
FVLPs wurden hergestellt durch Kotransfektion eines für ZEBOV- bzw. SEBOV-GP
kodierenden Plasmids mit einem Expressionsvektor, der für ein Fusionsprotein zwischen GFP
und dem Hauptmatrixprotein VP40 von ZEBOV kodiert. Wie vorher bereits gezeigt (Jasenosky
et al., 2001; Noda et al., 2002; Timmins et al., 2001), schnürten sich von den transfizierten
293T-Zellen fVLPs ab, die unter UV-Licht grün leuchteten (Abb. 12B). Die fVLPs wurden in der
Ultrazentrifuge mit Hilfe eines 20%-igen Sukrosekissens gereinigt und ankonzentriert. Die
anschließende Western Blot-Analyse zeigte eine vergleichbare Inkorporation von SEBOV- und
ZEBOV-GP (Abb. 13A, B).
B
4
VP40-GFP
55
40
35
25
15
GP2
kDa
C
% GFP-positive Zellen
20
18
120
100
80
60
40
20
0
SEBOV-GP
3
ZEBOV-GP
2
Kontrolle
1
100
70
% ZEBOV-GP Inkorporation
A
16
14
12
10
8
6
4
2
0
Kontrolle
DC-SIGN DC-SIGNR
keine VLPs
SEBOV-GP + VP40-GFP
VP40-GFP
ZEBOV-GP + VP40-GFP
Abb. 13: ZEBOV-, jedoch nicht SEBOV-GP-tragende fVLPs binden effizient an DC-SIGN/R.
(A) FVLPs wurden in 293T-Zellen durch Kotransfektion von ZEBOV-VP40-GFP und EBOV-GP mit C-terminalem V5Epitop hergestellt, über ein Sukrosekissen ankonzentriert und auf VP40-GFP- (obere Teilabbildung) und EBOV-GP(untere Teilabbildung) Inkorporation hin analysiert. VP40-GFP wurde wird einem anti-GFP Serum nachgewiesen, V5
mit einem mAk gegen dieses Epitop. 1 Kontrolle (pcDNA3.1/Zeo), 2 VP40-GFP, 3 VP40-GFP + SEBOV-GP, 4 VP40GFP + ZEBOV-GP. (B) Die EBOV-GP-Inkorporation in fVLPs wurde wie unter (A) beschrieben analysiert und
densitometrisch mit Hilfe des Programms AIDA image analyzer basic software (version 3.10.) quantifiziert. Der GPGehalt relativ zu VP40-GFP ist dargestellt; die erhaltenen Werte für ZEBOV-GP wurden als 100% gesetzt. Die
Durchschnittswerte aus fünf unabhängigen Experimenten mit unterschiedlichen VLP-Präparationen sind gezeigt.
Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwertes dar. (C) B-THP DC-SIGN/R- und B-THP Kontrollzellen
wurden mit fVLPs ohne GP, mit SEBOV- oder ZEBOV-GP inkubiert und im FACS analysiert. Die prozentuale Angabe
GFP-positiver Zellen ist dargestellt. Die Resultate eines Experiments in Duplikaten sind gezeigt; vergleichbare
Ergebnisse wurden in drei weiteren Versuchen mit zwei verschiedenen VLP-Präparationen erzielt.
47
Ergebnisse
Nach Inkubation von DC-SIGN/R-exprimierenden Zellen mit ZEBOV-GP-fVLPs wurde effiziente
Bindung mittels FACS-Analyse nachgewiesen, während sich die Werte für die Wechselwirkung
mit Kontrollzellen im Hintergrundbereich (Partikel ohne Hüllprotein) befanden (Abb. 13C). Im
Gegensatz dazu war die Interaktion von SEBOV-GP-fVLPs mit lektinexprimierenden Zellen
ineffizient und vergleichbar zur Bindung an Kontrollzellen (Abb. 13C). Zusammenfassend
bestätigen diese Ergebnisse die Beobachtungen aus den Infektionsexperimenten mit
lentiviralen Pseudopartikeln und demonstrieren somit, dass das Pseudotypisierungssystem für
die Untersuchung der EBOV-GP Bindung an zelluläre Anheftungsfaktoren geeignet ist.
2.4.
Der Glykosylierungsstatus von EBOV-GP ist eine wichtige Determinante der
Interaktion mit DC-SIGN/R
Als nächstes wurde analysiert, ob es sich bei der Wechselwirkung zwischen EBOV-GP und DCSIGN/R um eine Protein-Protein- oder eine Karbohydrat-Protein-Interaktion handelt. Zu diesem
Zweck wurde die Glykosylierung von EBOV-GP mit Hilfe von Deoxymannojirimycin (DMJ)
manipuliert. DMJ hemmt Mannosidase I und erzwingt so die exklusive Modifizierung von GP mit
mannosreichen Oligosacchariden, also den Karbohydraten, die durch DC-SIGN/R erkannt
werden. ZEBOV-, SEBOV- und MLV-GP-Pseudotypen wurden in An- und Abwesenheit von
DMJ hergestellt, auf vergleichbare Infektiosität hin normalisiert und mit DC-SIGN/Rexprimierenden Zellen oder Kontrollzellen inkubiert (Abb. 14A). In Übereinstimmung mit
publizierten Daten (Lin et al., 2003) verstärkte die DMJ-Behandlung von virusproduzierenden
Zellen die DC-SIGN/R-Benutzung durch MLV-GP-Pseudopartikel (Abb. 14A), die ansonsten nur
ineffizient mit diesen Lektinen interagierten. Der zelluläre Eintritt von SEBOV-GP-Pseudotypen
in DC-SIGN/R-positive Zellen wurde durch DMJ-Behandlung der virusproduzierenden Zellen
massiv verstärkt (etwa 80-fach), während DMJ die DC-SIGN/R-Benutzung von ZEBOV-GPPseudopartikeln nur leicht erhöhte (etwa 10-fach) (Abb. 14A). Dabei ist herauszustellen, dass
ZEBOV- und SEBOV-GP-Pseudoviren, die in Gegenwart von DMJ produziert wurden, eine
vergleichbare Infektiosität für DC-SIGN/R-positive Zellen aufwiesen. Die DMJ-Behandlung hatte
dagegen keinen Einfluss auf die Expression der GPs auf der Zelloberfläche (Abb. 14B und
Daten nicht gezeigt) oder auf die Virusinkorporation von GP (Abb. 14C). Diese Resultate liefern
starke Hinweise darauf, dass es sich bei der EBOV-GP-Interaktion mit DC-SIGN/R um eine
Karbohydrat-Protein-Wechselwirkung handelt.
48
Ergebnisse
Luziferaseaktivität (c.p.s.)
A
100000
10000
1000
100
10
-
+
-
SEBOV-GP
+
-
ZEBOV-GP
Kontrolle
MLV-GP
DC-SIGN
B
:DMJ
+
DC-SIGNR
C
kDa
150
Zellzahl
148
100
98
50
50
GP
Gag
36
0
100
10
1
2
10
3
10
Fluoreszenz
10
4
Gag: GP: DMJ: -
+
-
+
+
+
+
SEBOV SEBOV ZEBOV ZEBOV
-
+
-
+
Abb. 14: Einfluss von DMJ auf die DC-SIGN/R-Benutzung durch EBOV-GP-Pseudotypen.
(A) Pseudopartikel mit den angegebenen GPs auf der Oberfläche wurden in An- und Abwesenheit von DMJ
hergestellt, auf vergleichbare Infektiosität hin normalisiert und für die Infektion von lektinexprimierenden T-RExZelllinien eingesetzt. Luziferaseaktivitäten in Zelllysaten wurden 72 h nach Infektion bestimmt. Die
Durchschnittswerte aus drei unabhängigen Experimenten sind gezeigt; die Infektion der permissiven T-REx
Kontrollzellen wurde für jedes Virus 100% gesetzt. Fehlerbalken repräsentieren den Standardfehler des Mittelwertes.
(B) 293T-Zellen wurden transient mit pcDNA3.1/Zeo (graue Fläche) oder ZEBOV-GP transfiziert. Die ZEBOV-GPZellen wurden in An- (dunkelgraue Linie) und Abwesenheit (schwarze Linie) von DMJ kultiviert. Die
Oberflächenexpression wurde im FACS unter Verwendung eines Kaninchenserums (generiert gegen ZEBOV-GP)
überprüft. Die schwarze Fläche symbolisiert ungefärbte Kontrollzellen. (C) Pseudoviren, hergestellt in An- und
Abwesenheit von DMJ, wurden auf ihren Gag- und GP-Gehalt hin analysiert. Der Nachweis erfolgte im Western Blot
mit Kaninchenseren gegen ZEBOV-GP bzw. Gag. Vergleichbare Resultate wurden in einem unabhängigen
Experiment erzielt.
2.5.
Die Muzindomäne und spezifische Glykosylierungssignale in SEBOV- und ZEBOVGP haben keinen Einfluss auf die DC-SIGN/R-Interaktion
Da die Interaktion der EBOV-GPs mit DC-SIGN/R karbohydratabhängig ist, wurde untersucht,
ob SEBOV- und ZEBOV-GP Unterschiede in ihren Glykosylierungssignalen aufweisen. Die
Deletion der Muzindomäne, die zahlreiche Signale für N- und O-verknüpfte Glykosylierung
enthält (Sanchez et al., 1998), hatte keinen Einfluss auf die Interaktion mit DC-SIGN/R und, im
Einklang mit publizierten Daten (Jeffers et al., 2002), auf die Infektiosität der Viren für
49
Ergebnisse
Kontrollzellen (Abb. 15A). Mittels Sequenzanalyse von SEBOV- und ZEBOV-GP (ohne
Muzindomäne) wurden neun Signale für N-verknüpfte Glykosylierung identifiziert. Acht der
Signale waren an identischen Stellen in ZEBOV- und SEBOV-GP lokalisiert, während die
Lokalisation eines Signals für jedes Protein spezifisch war. Eine 27 AS lange Sequenz, welche
die beiden unterschiedlich lokalisierten Signale in beiden GPs beinhaltete, wurde ausgetauscht
(Chimären SZS und ZSZ; Abb. 16A); zusätzlich wurde das spezifische Signal im ZEBOV-GP
inaktiviert (Mutante N228A; Abb. 16A). Infektionsexperimente mit den entsprechenden GPVarianten zeigten jedoch, dass das untersuchte Glykosylierungssignal für die unterschiedliche
DC-SIGN/R-Benutzung von ZEBOV- und SEBOV-GP nicht verantwortlich ist (Abb. 15B).
A
B
12000
5000
4500
Z∆MU
ZEBOV-GP
0
Kontrolle
DC-SIGN
ZEBOV-GP
1000
500
0
2000
SEBOV-GP
4000
2500
2000
1500
SZS
6000
ZSZ
8000
4000
3500
3000
N228A
% Infektion
% Infektion
10000
DC-SIGNR
Abb. 15: Die Muzindomäne und spezifische Glykosylierungssignale haben keinen Einfluss auf die
DC-SIGN/R-Interaktion von SEBOV- und ZEBOV-GP.
T-REx DC-SIGN/R- und T-REx Kontrollzellen wurden mit den angegebenen Pseudoviren infiziert: Normalisierte
Pseudotypen welche (A) GPs mit und ohne Muzindomäne und (B) GPs mit veränderten Glykosylierungssignalen
trugen, wurden für diese Infektionsexperimente eingesetzt. Luziferaseaktivitäten im Zelllysat wurden 72 h nach
Infektion bestimmt. Die gezeigten Daten stehen für ein repräsentatives Experiment, durchgeführt in Triplikaten.
Vergleichbare Resultate wurden in zwei unabhängigen Experimenten mit unterschiedlichen Virusstocks erzielt.
Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar.
2.6. Das EBOV-GP-Signalpeptid moduliert die Interaktion mit DC-SIGN/R
Zur Identifizierung von Domänen, die für die unterschiedliche DC-SIGN/R-Benutzung
verantwortlich
sind,
wurden
die
AS
1-472
im
ZEBOV-GP
schrittweise
durch
die
korrespondierenden AS-Sequenzen aus dem SEBOV-GP ersetzt (Abb. 16A). Einige dieser
Chimären waren bereits für ZEBOV- und REBOV-GP beschrieben und funktionell
charakterisiert worden (Jeffers et al., 2002). In Übereinstimmung mit dieser Publikation konnte
die Expression aller chimären GPs in 293T-Lysaten nachgewiesen werden (Abb. 16B). Auch
die Infektiosität von Pseudotypen, die chimäre GPs in ihrer Hülle tragen, war vergleichbar zu
50
Ergebnisse
der, die für Viren mit wt-GP auf ihrer Oberfläche gemessen wurde (Daten nicht gezeigt). Dies
deutete darauf hin, dass die Austausche Struktur und Funktionalität von GP nicht wesentlich
beeinflussten.
GP1
A
GP2
Rezeptorbindung
Y
YY Y YY Y
Fusion
Y
Y Y Y YY Y YY YY YY
SP
Muzindomäne
FP
Y
CD
TM
ZEBOV
Z∆MU
308
ZEBOV-GP
SEBOV-GP
S121Z
S91Z
S61Z
kDa
490
S33Z
N228A
Z∆MU
B
SZS
234
ZSZ
SZS
N228A
234
206
S234Z
206
Kontrolle
ZSZ
S149Z
SEBOV
148
98
S33Z
32 33
S61Z
60
22
121
149
304
323
348
S419Z
324
422
S472Z
kDa
349
148
Z33S
32 33
S33Z
32 33
148
98
419
475
Z149S
303
S324Z
S349Z
Z149S
234
S472Z
233
S419Z
148
S234Z
S304Z
91
S349Z
120
S324Z
S149Z
90
S304Z
S91Z
S121Z
50
61
50
472
149
22
Abb. 16: Expression der EBOV-GP-Mutanten.
(A) Schematische Darstellung aller EBOV-GP-Varianten. SP Signalpeptid, FP Fusionspeptid, CD coiled-coilDomäne, TM Transmembrandomäne, FFurin-Spaltstelle (AS 501), Y N-verknüpfte Glykosylierungssignale. (B) Die
angegebenen GP-Varianten wurden transient in 293T-Zellen exprimiert und mittels Western Blot in den Zelllysaten
nachgewiesen. Das Kaninchenserum gegen ZEBOV-GP wurde als Detektionsreagenz eingesetzt. Vergleichbare
Ergebnisse wurden in zwei unabhängigen Experimenten erhalten.
Die Infektion von DC-SIGN/R-exprimierenden T-REx-Zelllinien ergab, dass die N-terminalen
324 AS im ZEBOV-GP die Interaktion mit DC-SIGN/R bedingen, da für diese Chimären ein
reduzierter Zelleintritt, ähnlich dem des SEBOV-GPs, demonstriert werden konnte (Abb. 17A).
Unerwarteter Weise konnte bereits für den Austausch der N-terminalen 32 AS, welche dem
Signalpeptid entsprechen, eine massive Änderung in der DC-SIGN/R-Benutzung festgestellt
werden (Mutante S33Z; Abb. 17A). Die Signalsequenz ist verantwortlich für den Transport der
naszierenden Polypeptidkette in das ER und scheint die Wechselwirkung der GPs mit den
Lektinen zu modulieren – im Zusammenspiel mit weiteren AS-Motiven, lokalisiert im Bereich der
N-terminalen 324 AS. Für die genauere Analyse der Rolle des Signalpeptids wurde die ZEBOV51
Ergebnisse
GP-Signalsequenz in das SEBOV-GP eingesetzt (Mutante Z33S; Abb. 16A). Das Einbringen
des SEBOV-GP-Signalpeptids in das ZEBOV-GP (Mutante S33Z; Abb. 16A) resultierte in einer
verminderten Interaktion der Pseudovirionen mit DC-SIGN/R, während die entgegen gesetzte
Mutante Z33S effizienter an die beiden Lektine binden konnte. Der Austausch der
Signalsequenz zwischen ZEBOV- und SEBOV-GP transferiert also die Effizienz der DCSIGN/R-Benutzung von dem Spender- auf das Empfängerhüllprotein (Abb. 17B).
A
B
12000
Kontrolle
DC-SIGN
DC-SIGNR
8000
9000
8000
% Infektion
% Infektion
10000
6000
4000
10000
Kontrolle
DC-SIGN
DC-SIGNR
7000
6000
5000
4000
3000
2000
2000
ZEBOV-GP
SEBOV-GP
Z33S
ZEBOV-GP
SEBOV-GP
Z149S
S472Z
S419Z
S349Z
S324Z
S304Z
S234Z
S149Z
S121Z
S91Z
S61Z
S33Z
0
S33Z
1000
0
Abb. 17: DC-SIGN/R-Benutzung chimärer EBOV-GPs.
(A) Pseudoviren mit den angegebenen chimären EBOV-GPs auf ihrer Oberfläche wurden auf vergleichbare
Infektiosität hin normalisiert und für die Infektion von T-REx DC-SIGN/R- und T-REx Kontrollzellen eingesetzt.
Luziferaseaktivitäten im Zelllysat wurden 72 h nach Infektion bestimmt. Im Diagramm ist die relative Infektion der TREx-Zellen dargestellt; die Infektion der Kontrollzellen für jedes Virus entspricht 100%. Die dargestellten Daten
entsprechen den Durchschnittswerten aus mindestens drei unabhängigen, in Triplikaten durchgeführten
Experimenten. Fehlerbalken repräsentieren den Standardfehler des Mittelwertes. (B) Pseudopartikel mit SEBOVund ZEBOV-GP bzw. den Signalpeptidvarianten beider GPs auf der Oberfläche wurden wie unter (A) beschrieben für
die Infektion der angegebenen Zelllinien eingesetzt. Das gezeigte repräsentative Experiment steht für eines von drei
unabhängigen Experimenten. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar.
Es sollte nun überprüft werden, ob sich die Daten der Infektionsexperimente mit EBOV-GPSignalpeptidvarianten in Lektinbindungsversuchen bestätigen lassen. Als erstes wurde die
Bindung von Pseudotypen an DC-SIGN/R-exprimierende T-REx-Zellen untersucht. Dazu
wurden zunächst HIV-1-basierte EBOV-GP-Pseudoviren auf ihren Kapsidprotein (p24)-Gehalt
hin normalisiert und mit den angegebenen T-REx-Zelllinien inkubiert. Ungebundene Viren
wurden durch Waschschritte entfernt, die Zellen lysiert und die Menge gebundener Viren mittels
p24-ELISA bestimmt (Abb. 18A). Es konnte gezeigt werden, dass SEBOV-GP-Pseudoviren
weniger effizient an die DC-SIGN/R-exprimierenden Zellen binden als ZEBOV-GP-Partikel, die
Signalpeptidvarianten beider GPs jedoch eine intermediäre Bindungskapazität aufweisen (Abb.
18A). Zusätzlich wurden Bindungsstudien mit löslichem EBOV-GP, fusioniert an die Fc-Region
von humanem IgG, durchgeführt. Die Analyse der DC-SIGN/R-Bindung dieser Fusionsproteine
bestätigte die Ergebnisse aus den Pseudotypenexperimenten (Abb. 18B, C).
52
Ergebnisse
% gebundenes p24
A
40
35
30
B
Kontrolle
DC-SIGN
DC-SIGNR
2
3
4
5
100
25
70
20
55
15
40
10
35
5
25
kDa
0
S33Z
C
150
Zellzahl
1
170
130
Z33S SEBOV ZEBOV
-GP
-GP
SEBOV-GP, Z33S
ZEBOV-GP, S33Z
100
50
0
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
EBOV-GP-Ig
Abb. 18: Interaktion der EBOV-GP-Signalpeptidvarianten mit DC-SIGN/R.
(A) Pseudopartikel mit SEBOV-GP, Z33S, ZEBOV-GP oder S33Z wurden p24-normalisiert und mit den angegebenen
T-REx-Zelllinien bei 4°C inkubiert. Ungebundenes Virus wurde in Waschschritten entfernt, die Zellen lysiert und der
p24-Gehalt in den Zelllysaten bestimmt. Die gezeigten Daten stehen für ein repräsentatives Experiment, durchgeführt
in Triplikaten. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. Vergleichbare Resultate wurden in einem
unabhängigen Experiment mit unterschiedlichen Virusstocks erzielt. (B) Die eingesetzten Proteinmengen für das
Bindungsexperiment in (C) sind im Western-Blot mit einem Fc-spezifischen Antikörper charakterisiert worden. 1 FcKontrolle, 2 Z33S, 3 SEBOV-GP, 4 ZEBOV-GP, 5 S33Z. (C) T-REx DC-SIGN-Zellen wurden mit vergleichbaren
Mengen der unter (B) dargestellten Fc-Fusionsproteine inkubiert. Die Zellen wurden mit einem Fc-spezifischen
Antikörper gefärbt und im FACS analysiert: wt-EBOV-GP (dunkelgraue Linie), GP-Signalpeptidvariante (hellgraue
Linie), Fc-Kontrollprotein (gepunktete schwarze Linie). Zellen nur mit dem Sekundärantikörper gefärbt sind flächig
schwarz dargestellt. Die gezeigten Daten stehen für ein repräsentatives Experiment und wurden in einem
unabhängigen Versuch reproduziert.
2.7.
Das
EBOV-GP-Signalpeptid
beeinflusst
die
Modifikation
von
GP
mit
hochmannosylierten Karbohydraten
Wie bereits gezeigt, reicht die Modifikation der EBOV-GPs mit hochmannosylierten
Zuckerseitenketten aus, um eine effiziente Bindung an DC-SIGN/R zu gewährleisten (Abb. 14).
Es stellte sich somit die Frage, ob das Signalpeptid die Menge an mannosereichen Zuckern in
ZEBOV- und SEBOV-GP und die daraus resultierenden Interaktionsunterschiede mit DCSIGN/R
bedingt.
Zu
diesem
Zweck
wurde
mittels
enzymatischer
Verdaus
der
Glykosylierungsstatus der wt-EBOV-GPs sowie der Signalpeptidvarianten analysiert. Die
Behandlung von GP-tragenden lVLPs mit PNGase F, einem Enzym welches alle N-verknüpften
Glykane im Protein abspaltet, ergab für alle vier getesteten EBOV-GP Varianten eine
53
Ergebnisse
gesteigerte Mobilität im SDS-Gel und zeigt somit, dass die Proteine N-verknüpfte Karbohydrate
enthalten (Abb. 19A). Im Gegensatz dazu waren für die Spaltung mit Endo H (entfernt alle Nverknüpften hochmannosylierten Glykane) nur GPs sensitiv, die in der Anwesenheit von DMJ
generiert
worden
sind
(Abb.
19A).
Diese
Beobachtung
legt
nahe,
dass
unter
Normalbedingungen hochmannosylierte Zuckerseitenketten in die EBOV-GPs nur sehr
ineffizient inkorporiert werden.
Für die Detektion von kleinsten Mengen an mannosereichen Oligosacchariden in den EBOVGPs wurden lVLPs hergestellt und auf ihren GP-Gehalt hin abgeglichen. Alle vier GP-Varianten
wurden mit vergleichbarer Effizienz in lVLPs eingebaut (Abb. 19B).
A
ZEBOV-GP
kDa
0
5
30
C
S33Z
60
0
5
30
1 2 3 4 5
1 2 3 4 5
148
60 :min
148
Endo H
98
unbehandelt
98
148
PNGase F
98
SEBOV-GP
kDa
148
0
5
30
148
Z33S
60
0
5
30
60 :min
148
Endo H
98
Endo H
98
PNGase F
148
98
PNGase F
98
kDa
GNA
ZEBOV-GP + DMJ
kDa
0
5
30
60
MAA
:min
148
Endo H
98
B
D
kDa
148
98
1
2
3
4
5
kDa
GP
3
1
2
3
eingesetzt
148
1 2
3
98
98
64
50
1 2
148
kDa
GNA
MAA
Gag
36
Abb. 19: Analyse der ZEBOV- und SEBOV-GP-Glykosylierung.
(A) LVLPs wurden in 293T-Zellen in An- und Abwesenheit von DMJ hergestellt, auf ihren Gag-Gehalt normalisiert,
mit PNGase F und Endo H für die angegebenen Zeiträume inkubiert und im Western Blot analysiert. Der Nachweis
erfolgte mit einem ZEBOV-GP-spezifischen Kaninchenserum. (B) LVLPs wurden durch ein 20%-iges Sukrosekissen
ankonzentriert und im Western Blot auf Gag und EBOV-GP-Gehalt hin analysiert. Zur Detektion wurden Seren, die
gegen ZEBOV-GP bzw. Gag gerichtet sind, verwendet: 1 Gag, 2 Gag + SEBOV-GP, 3 Gag + ZEBOV-GP, 4 Gag +
S33Z, 5 Gag + Z33S. (C) EBOV-GP-Varianten auf lVLPs wurden auf ihre Reaktivität mit Pflanzenlektinen bekannter
Zuckerspezifität untersucht: 1 Gag, 2 Gag + SEBOV-GP, 3 Gag + ZEBOV-GP, 4 Gag + S33Z, 5 Gag + Z33S. Die
Behandlung mit PNGase F und Endo H erfolgte wie für (A) beschrieben. (D) Überstände transfizierter 293T-Zellen
mit den Plasmiden für Kontrolle (1), SEBOV-GP (2) und Z33S (3) wurden mittels Centricon Plus-Säulen
ankonzentriert und wie für (C) beschrieben analysiert. (C) und (D) zeigen die Ergebnisse eines repräsentativen
Experiments, die in zwei unabhängigen Versuchen bestätigt werden konnten.
54
Ergebnisse
Unterschiede in der GP-Bandenstärke sind größtenteils auf das zur Detektion benutzte
Kaninchenserum zurückzuführen, welches hauptsächlich gegen ZEBOV-GP reaktiv ist (Abb.
19B, D). Der Zuckernachweis in den GPs erfolgte mit markierten Pflanzenlektinen, die
spezifisch an ein bestimmtes Karbohydrat binden. Maackia amurensis-Agglutinin (MAA) erkennt
Sialinsäurereste, die in mehr oder weniger allen bekannten GPs vorhanden sind und zeigte eine
vergleichbare Reaktivität gegen die vier getesteten GP-Varianten (Abb. 19C, rechte
Teilabbildung). Ein anderes Bild ergab die Inkubation der lVLPs mit Galanthus nivals-Agglutinin
(GNA), das spezifisch an hochmannosylierte Glykane bindet: ZEBOV-, aber nicht SEBOV-GP
reagierte mit GNA (Abb. 19C, linke Teilabbildung), was darauf hindeutet, dass einige ZEBOVGP-Kopien auf der lVLP-Oberfläche hochmannosylierte Karbohydrate enthalten. Vergleicht man
die GNA-Signalstärken der wt-EBOV-GPs mit denen der Signalpeptidvarianten, zeigt sich eine
deutliche Abnahme für S33Z im Gegensatz zu ZEBOV-GP, während an Z33S mehr GNA als an
SEBOV-GP gebunden hat (Abb. 19C, D).
Kontrollspaltungen der GPs mit PNGase F und Endo H bestätigten die Karbohydratspezifität
der Pflanzenlektine (Abb. 19C), und eine weitere Western Blot-Analyse demonstrierte, dass die
Signale nach Lektinbindung in der Tat von EBOV-GP herrühren (Daten nicht gezeigt). Diese
Beobachtungen zeigen, dass das EBOV-GP-Signalpeptid die GP-Glykosylierung, insbesondere
die Inkorporation hochmannosylierter Zuckerseitenketten, bestimmen kann.
2.8.
Das EBOV-GP-Signalpeptid moduliert die GP-Glykosylierung im sekretorischen
Weg und ist im reifen EBOV-GP nicht präsent
Zum besseren Verständnis, welchen Einfluss das Signalpeptid auf die EBOV-GP-Expression
und seine Prozessierung im sekretorischen Weg nimmt, wurden Synthese und Glykosylierung
von EBOV-GP in einem zellfreien System untersucht. Die ORFs für ZEBOV-GP, S33Z, SEBOVGP und Z33S wurden in der An- und Abwesenheit von ER-abgeleiteter Mikrosomen, die
Proteinglykosylierung erlauben, transkribiert und translatiert. Glykosylierte Proteine wurden
anschließend anhand ihrer verminderten Mobilität im SDS-Gel identifiziert (Abb. 20, obere
Teilabbildung, schwarze Pfeile). Ein signifikant höherer Anteil der Z33S-Variante wurde im
Vergleich zum SEBOV-GP glykosyliert, während die gegensätzliche Beobachtung für ZEBOVGP und S33Z gemacht wurde (Abb. 20A). Dieses Ergebnis gibt einen deutlichen Hinweis
darauf, dass die Signalpeptidvarianten unterschiedlich effizient im sekretorischen Weg der Zelle
prozessiert werden.
Zum Nachweis der Signalpeptidabspaltung im ER wurde die oben beschriebene in vitroTranskriptions-Translations-Reaktion für SEBOV-, ZEBOV-GP und ihre beiden Varianten in
Anwesenheit der Mikrosomen und einem zusätzlichen Akzeptorpeptid nochmals durchgeführt.
Das Akzeptorpeptid kodiert für ein N-verknüpftes Glykosylierungssignal, wird im Überschuss
der
Reaktion
beigefügt
und
inhibiert
somit
die
Glykosylierung
der
naszierenden
Polypeptidketten. Erwartungsgemäß wurde kein glykosyliertes GP im SDS-Gel detektiert, wenn
55
Ergebnisse
Akzeptorpeptid und Mikrosomen vorhanden waren (Abb. 20A, obere Teilabbildung). Es trat
jedoch eine weitere Bande auf, die etwas schneller im SDS-Gel migrierte als das
unglykosylierte GP (welches außerhalb der Mikrosomen snythetisiert wurde) und die der
berechneten Größe für GP ohne Signalpeptid entsprach (Abb. 20A, obere Teilabbildung, weiße
Pfeile). Diese Resultate deuten an, dass für alle vier GP-Varianten im zellfreien System die
Signalpeptidabspaltung nach der Translokation ins ER erfolgt.
A
SEBOV-GP
-
Mikrosomen:
Akzeptorpeptid:
+
-
Z33S
+
+
-
ZEBOV-GP
+ +
- +
-
+ +
- +
P < 0.05
S33Z
-
+
-
+
+
P < 0.05
% Glykosylierung
120
80
40
0
SEBOV-GP
B
a
b
c
d
e
55
40
35
25
15
10
kDa
170
130
100
70
f
a
kDa
170
130
100
70
55
b
c
anti-ZEBOV-GP
d
e
25
15
10
I
1
40
35
IV
2
3
4
5
kDa
170
130
100
70
f
kDa
170
b
c
d
e
100
70
f
fVLPs
55
40
35
II
1
25
2
3
4
5
kDa
170
130
III
1
2
3
4
5
100
70
55
40
55
35
35
25
15
a
130
40
35
55
25
15
ZEBOV-GP S33Z
anti-V5
anti-myc
kDa
170
130
100
70
Z33S
Lysate
40
25
15
V
VI
Abb. 20: Das EBOV-GP-Signalpeptid beeinflusst die GP-Glykosylierung und wird abgespalten.
(A) Die ORFs für ZEBOV-GP, S33Z, SEBOV-GP und Z33S wurden in vitro in An- und Abwesenheit von Mikrosomen
und einem Akzeptorpeptid, einem Glykosylierungsinhibitor, synthetisiert. Die obere Teilabbildung zeigt das SDS-Gel
eines repräsentativen Experiments. Die Signale für glykosyliertes GP aus drei unabhängigen Experimenten wurden
mittels Densitometrie quantifiziert und sind in der unteren Teilabbildung gezeigt. Die prozentuale Glykosylierung stellt
die Bandenintensität glykosylierter GPs, normalisiert zur Bandenstärke des Vorläuferproteins dar. Fehlerbalken
symbolisieren den Standardfehler des Mittelwertes. (B) Western Blot-Analyse der GP-Expression in Zellüberständen
und ankonzentrierten fVLPs (Bilder I-III) oder in Zelllysaten und in vitro-Synthese. Die Detektion der ZEBOV- und
SEBOV-GP-Expression mit N-terminalem myc- und C-terminalem V5-Epitop erfolgte über die angegebenen
Reagenzien. Bilder I-III: a Kontrolle, b SEBOV-GP, c ZEBOV-GP aus Zellüberständen; d Kontrolle, e SEBOV-GP und
f ZEBOV-GP auf ankonzentrierten fVLPs. Bilder IV-VI: 1 Kontrolle, 2 ZEBOV-GP, 3 myc-VP40 aus Zelllysaten; 4
Kontrolle, 5 ZEBOV-GP in vitro synthetisiert.
56
Ergebnisse
Für die Analyse der Signalpeptidabspaltung in Zellen wurden SEBOV- und ZEBOV-GPKonstrukte hergestellt, die N-terminal für das myc-Epitop und C-terminal für das V5-Epitop
kodierten. Die myc-Sequenz wurde vor dem Signalpeptid in den ORF inseriert. Im
Infektionsexperiment vermittelten diese GPs denselben effizienten Zelleintritt wie GPs ohne
antigene Epitope (Daten nicht gezeigt). Die mit myc- und V5-Epitopen ausgestatteten GPs
wurden in 293T-Zellen exprimiert, oder es wurden fVLPs durch Kotransfektion der GP-DNAs mit
einem myc-VP40-Plasmid generiert und über ein Sukrosekissen ankonzentriert. Der Nachweis
mit einem ZEBOV-GP-spezifischen Serum zeigte effiziente Inkorporation beider GPs in fVLPs,
wohingegen weniger GP im Überstand von Zellen zu sehen war, die nur mit GP, jedoch nicht
mit VP40 transfiziert wurden (Abb. 20B, Bild III).
Diese Beobachtung konnte mit einem V5-spezifischen Antikörper bestätigt werden, der die
GP2-Untereinheit von GP erkennt: das Signal für GP2 ist in fVLPs Präparationen stärker als in
Überständen von 293T, die lediglich mit GP transfiziert wurden (Abb. 20B, Bild II). Nach
Inkubation mit einem myc-Antikörper wurde hingegen nur ein Signal für VP40, jedoch nicht für
GP detektiert (Abb. 20B, Bild I), was darauf hindeutet, dass das Signalpeptid während der
Translokation ins ER von GP abgespalten wird. Wenn dies der Fall ist, sollte in vitro
synthetisiertes GP in der Abwesenheit von Mikrosomen das myc-Epitop noch enthalten. Für
diese Untersuchung wurden in einer Western Blot-Analyse die GPs aus transfizierten 293TZellen und einer in vitro-Transkriptions-Translations-Reaktion verglichen (Abb. 20B, Bilder IVVI). Die Detektion mit ZEBOV-GP-spezifischem Serum und dem V5-Antikörper ergab deutliche
Signale für in vitro synthetisiertes ZEBOV-GP und ZEBOV-GP aus transfizierten Zellen (Abb.
20B, Bilder V, VI). Mit dem myc-Antikörper konnte hingegen nur in vitro synthetisiertes GP
nachgewiesen werden (Abb. 20B, Bild IV). Dies legt den Schluss nahe, dass in vitro das mycmarkierte Signalpeptid nach EBOV-GP-Synthese in der Abwesenheit von Mikrosomen im reifen
Protein vorhanden ist. Im Gegensatz dazu wird in Zellen das Signalpeptid während der
Translokation des entstehenden Proteins in das ER abgespalten.
57
Ergebnisse
3.
Modulation der Inkorporation des EBOV-GPs in Virionen:
Effekte auf Anheftung, Zelleintritt und Neutralisation
(Marzi et al., Virology, 2006)
Das Hüllprotein des Ebolavirus vermittelt den infektiösen Eintritt der Partikel in Zellen und ist ein
attraktiver Ansatzpunkt für Therapeutika und Vakzinentwicklung. Im folgenden Teilprojekt sollte
analysiert werden, inwiefern die Effizienz der EBOV-GP-Inkorporation in pseudovirale Partikel
die Anheftung, den Zelleintritt und die Neutralisationssensitivität dieser Viren beeinflusst.
3.1. Induzierbare Expression der EBOV-GPs in 293 T-REx-Zellen
Es sollte herausgefunden werden, ob die Effizienz der EBOV-GP-Inkorporation in Virionen die
Interaktion dieser Partikel mit zellulären Faktoren moduliert. Für diese Untersuchungen wurde
das von 293-Zellen abgeleitete T-REx-Zellsystem herangezogen, welches eine durch Dox
regulierbare Expression fremder Gene erlaubt. Ein weiterer Vorteil dieses Zellsystems ist die
hohe Transfektionsrate, welche die Produktion von Pseudoviren erleichtert. Plasmide, die für
die GPs der vier EBOV-Subtypen kodieren, wurden in die parentale Zelllinie eingebracht,
transfizierte Zellen selektioniert und die induzierbare GP-Expression im Western Blot analysiert
(Abb. 21A). Es konnte die effiziente und Dox-abhängige Expression aller EBOV-GPs
nachgewiesen werden, Kontrollzellen ergaben kein Signal. Das zur Detektion benutzte Serum
wurde gegen das ZEBOV-GP generiert und erkennt dieses Protein präferenziell (Daten nicht
gezeigt). Die Unterschiede in der Signalstärke der vier verschiedenen EBOV-GPs sind
demzufolge größtenteils auf die Spezifität des Serums zurückzuführen (Abb. 21A). Die Größe
der nachgewiesenen GP-Banden stimmt mit publizierten Daten überein (Feldmann et al., 1994;
Marzi et al., 2006).
Als nächstes wurde die Oberflächenexpression der EBOV-GPs auf induzierten T-REx-Zellen
überprüft. Relativ schwache Signale wurden für SEBOV- und ICEBOV-GP gemessen, während
REBOV- und vor allem ZEBOV-GP effizient auf der Zelloberfläche nachgewiesen werden
konnten (Abb. 21B, C und Daten nicht gezeigt). Diese Beobachtungen stimmen mit den
Western Blot-Resultaten überein (Abb. 21A). Die FACS-Analyse der ZEBOV- und REBOV-GP
Expression zeigte Dox-Abhängigkeit, jedoch nicht in dem Maße wie sie im Western Blot
beobachtet wurde (Abb. 21A). Weiterhin konnte selbst in uninduzierten Zellen ZEBOV-GPExpression detektiert werden (Abb. 21B, C), was zeigt, dass die Dox-abhängige Regulation der
GP-Expression nicht vollständig erfolgte.
Die Zelllinien wurden dann zur Herstellung von Pseudoviren eingesetzt, die unterschiedliche
Mengen an GP auf ihrer Oberfläche trugen. In vorangegangen Studien konnte bereits gezeigt
werden, dass das Pseudotypisierungssystem ein adäquates Modell für die Analyse des EBOVGP vermittelten Zelleintritts darstellt (Marzi et al., 2006; Wool-Lewis & Bates 1998; Yang et al.,
1998). Zu diesem Zweck wurden die T-REx-Zelllinien transient mit einem env-defekten HIV-1
58
Ergebnisse
Reportergenom transfiziert und die GP-Expression mit 100 ng/ml bzw. mit 1 ng/ml Dox
induziert. In einer Western Blot-Analyse pelletierter Pseudopartikel konnte zumindest nach
Induktion mit 100 ng/ml Dox virusassoziiertes GP detektiert werden (Abb. 21D). Im Gegensatz
dazu konnte nur ein schwaches oder kein GP-Signal auf den Pseudopartikeln nach Induktion
mit 1 ng/ml bzw. ohne Dox nachgewiesen werden (Abb. 21D).
A
B
kDa
120
170
*
*
90
Zellzahl
130
Kontrolle
0 ng/ml Dox
1 ng/ml Dox
100 ng/ml Dox
*
*
100
70
60
30
55
40
0
100
Kontrolle
Geometrisches MIttel der
Fluoreszenz
C
0
1
100
SEBOV
-GP
0
1
100
0
ZEBOV
-GP
1 100
REBOV
-GP
0
1
100
0
: Dox
100
101
102
103
(ng/ml)
ICEBOV
-GP
ZEBOV-GP
D
35
30
kDa
*
170
25
*
*
*
*
GP1
130
100
20
70
15
55
10
40
35
5
p24
25
15
0
Dox:
100
(ng/ml)
Kontrolle
Abb. 21: Induzierbare
Reporterviren.
0
1
100
100 0 1 100 0
ZEBOV-GP
EBOV-GP-Expression
Kontrolle
und
SEBOV
-GP
-Inkorporation
1 100 0 1 100 0
ZEBOV
-GP
REBOV
-GP
1 100 :Dox
ICEBOV
-GP
unterschiedlicher
(ng/ml)
GP-Mengen
in
(A) Regulierbare Expression der EBOV-GPs in T-REx-Zellen. Das T-REx-System basiert auf der Dox-abhängigen
Expression fremder Gene unter der Kontrolle des Tet-Repressors, der von diesen Zellen kodiert wird. Die
transfizierten Plasmide für EBOV-GP enthielten zwei Tet-Repressorbindestellen, sog. Tet-Operatoren. Stabil EBOVGP-exprimierende T-REx-Zellklone wurden unter Antibiotikaselektion herangezogen und kultiviert. Die EBOV-GPExpression wurde mit den angegebenen Mengen an Dox induziert und im Western Blot mit einem ZEBOV-GPspezifischen Serum nachgewiesen. Sternchen (*) markieren GP-Banden bei 100 ng/ml Dox. (B) Induzierbare
ZEBOV-GP-Oberflächenexpression. T-REx-Zellen wurden mit den angegebenen Dox-Konzentrationen zur ZEBOVGP-Expression induziert und im FACS mit einem ZEBOV-GP-spezifischen Serum analysiert. Vergleichbare
Ergebnisse wurden in zwei unabhängigen Experimenten erzielt. Kontrollzellen wurden nur mit dem
Sekundärantikörper gefärbt (schwarze Fläche). (C) Die ZEBOV-GP-Expression wurde wie unter (B) beschrieben
analysiert und das Geometrische Mittel der Fluoreszenz bestimmt. Die Durchschnittswerte aus drei unabhängigen
Experimenten sind dargestellt. Fehlerbalken repräsentieren den Standardfehler des Mittelwertes. (D) Inkorporation
unterschiedlicher Mengen der EBOV-GPs in pseudovirale Partikel. Induzierte T-REx-Zelllinien wurden mit dem
lentiviralen Reporterplasmid transfiziert und Pseudoviren konnten im Zellüberstand geerntet werden. 2,5 ng p24normalisierte Viren wurden pelletiert, inaktiviert, lysiert und im Western Blot untersucht. Vergleichbare Resultate
lieferten zwei weitere Western Blots mit unterschiedlichen Virusstocks. Sternchen (*) markieren GP-Banden.
Die Ergebnisse zeigen, dass die EBOV-GPs in stabil transfizierten T-REx-Zellen kontrolliert
exprimiert und für die Herstellung pseudotypisierter Viren mit deutlich unterschiedlichem GP-
59
Ergebnisse
Gehalt herangezogen werden konnten. Eine relativ feine Regulation der GP-Expression konnte
dagegen mit diesem System nicht erreicht werden.
3.2.
Die GPs der vier EBOV-Subtypen induzieren Zellrundung mit unterschiedlicher
Effizienz
Die
EBOV-GP-Expression
verursacht
zytotoxische
Effekte,
was
möglicherweise
zur
Pathogenität des Virus beiträgt. Eine bereits beschriebene Konsequenz dieser Beeinträchtigung
der Zellfunktionen ist die Abrundung GP-exprimierender adhärenten Zellen und der gänzliche
Verlust der Anheftung dieser Zellen an Kulturschalen (Chan et al., 2000; Simmons et al., 2002;
Takada et al., 2000; Yang et al., 2000). Simmons und Kollegen konnten zeigen, dass sich
Zellen, die SEBOV- oder ZEBOV-GP exprimieren, effizienter von der Kulturschale ablösen als
Zellen, die REBOV-GP produzieren (Simmons et al., 2002). Es sollte untersucht werden, ob die
Zellablösung von der Kulturschale in den vier EBOV-GP T-REx-Zelllinien durch Dox-Zugabe
induziert werden kann. In Übereinstimmung mit den publizierten Daten war ein Dox-abhängiger
Adhäsionsverlust bei SEBOV- und ZEBOV-GP exprimierenden Zellen festzustellen (Simmons
et al., 2002). Dagegen lösten sich REBOV-GP exprimierende Zellen nur bei maximaler DoxKonzentration ab, und nach ICEBOV-GP Expression wurde keine Ablösung von Zellen
beobachtet (Abb. 22). Dieses Resultat bestätigt publizierte Ergebnisse (Chan et al., 2000;
Simmons et al., 2002; Takada et al., 2000; Yang et al., 2000) und zeigt, dass die induzierte GPExpression in 293 T-REx-Zellen gleiche zytotoxische Effekte verursacht wie die EBOV-GPExpression nach transienter Transfektion in anderen adhärenten Zelltypen.
Zellen im Überstand (%)
100000
0 ng/ml Dox
1 ng/ml Dox
100 ng/ml Dox
10000
1000
100
10
Kontrolle ZEBOV SEBOV REBOV ICEBOV
-GP
-GP
-GP
-GP
Abb. 22: Die Expression der GPs der vier EBOV-Subspezies induziert Adhäsionsverlust in 293 T-REx-Zellen
mit unterschiedlicher Effizienz.
293 T-REx-Zellen wurden mit den angegebenen Dox-Konzentrationen zur EBOV-GP-Expression induziert. 48 h nach
Dox-Zugabe wurden die Kulturüberstände geerntet und darin enthaltene Zellen im FACS gezählt. Die
Durchschnittswerte aus drei unabhängigen Experimenten sind dargestellt. Fehlerbalken repräsentieren den
Standardfehler des Mittelwertes.
60
Ergebnisse
3.3.
Geringe GP-Mengen sind ausreichend für den effizienten Zelleintritt von
Pseudotypen
Die Effizienz der Hüllprotein-Inkorporation in Virionen moduliert die Infektiosität von HIV-1 und
SIV (Bachrach et al., 2005; Yuste et al., 2005; Yuste et al., 2004). In den folgenden
Experimenten sollte untersucht werden, inwiefern der EBOV-GP-Gehalt in Pseudoviren den
infektiösen
Eintritt
in
Zielzellen
beeinflusst.
Als
Infektionskontrolle
dienten
VSV-G-
pseudotypisierte Viren, die in parentalen T-REx-Zellen in der Anwesenheit von Dox generiert
wurden (Abb. 23). Alle eingesetzten Virusstocks wurden auf den Kapsidgehalt hin normalisiert,
um gleiche Partikelmengen für die Infektion permissiver 293T- und Huh-7-Zellen einsetzen zu
können. Viren, die in uninduzierten EBOV-GP T-REx-Zellen generiert wurden, waren nicht
infektiös (Abb. 23). Auch die Präsenz weniger ZEBOV-GP-Kopien auf diesen Zellen (Abb. 21B)
war nicht ausreichend, um eine Infektion vermitteln zu können. Pseudovirionen, die in
induzierten T-REx EBOV-GP-Zellen generiert wurden (1 und 100 ng/ml Dox) waren dagegen
infektiös. Dabei wurde kein Unterschied in der Infektiosität von ZEBOV- und SEBOV-GP
Partikeln nach Induktion mit 1 und 100 ng/ml Dox festgestellt (Abb. 23). Im Gegensatz dazu
waren ICEBOV- und REBOV-GP-pseudotypisierte Viren bei Induktion von virusproduzierenden
Zellen mit 100 ng/ml Dox infektiöser als bei Induktion mit 1 ng/ml (Abb. 22). Diese Beobachtung
weist darauf hin, dass zumindest für ICEBOV und REBOV die GP-Menge die Infektiosität
limitieren könnte, während ZEBOV und SEBOV möglicherweise auch bei sehr ineffizienter GPInkorporation noch hochinfektiös sind.
1000000
Luziferaseaktivität (c.p.s.)
293T
Huh-7
100000
10000
1000
100
Dox:
(ng/ml)
10
0
1
100
ZEBOV-GP
0
1 100
SEBOV-GP
0
1 100
REBOV-GP
0
1 100
ICEBOV-GP
0
1 100 100
VSV-G
-
Abb. 23: Die Effizienz der GP-Inkorporation in Virionen beeinflusst die virale Infektiosität.
Lentivirale Pseudopartikel mit den GPs der vier EBOV-Subtypen auf der Oberfläche wurden wie in Abb. 21
beschrieben hergestellt. VSV-G-pseudotypisierte Viren wurden durch Kotransfektion parentaler T-REx-Zellen mit
einem lentiviralen Reporterplasmid und einem VSV-G-Expressionsplasmid hergestellt. Transfizierte Zellen wurden in
Medium mit Dox kultiviert. 293T- und Huh-7-Zellen wurden mit gleichen Volumina 100 pg enthaltender, p24normalisierter Virusüberstände inkubiert. Luziferaseaktivitäten im Zelllysat wurden 72 h nach Infektion bestimmt. Das
gezeigte repräsentative Experiment steht für eines von drei unabhängigen Experimenten mit verschiedenen
Virusstocks. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar.
61
Ergebnisse
3.4.
Nur Pseudoviren mit hohem GP-Gehalt können zelluläre Anheftungsfaktoren für
die Infektionsverstärkung effizient nutzen
Die Anheftung an verschiedene zelluläre Lektine kann die EBOV-Infektion massiv verstärken
(Alvarez et al., 2002; Becker et al., 1995; Gramberg et al., 2005; Lin et al., 2003; Simmons et
al., 2003; Takada et al., 2004) und es gibt Hinweise darauf, dass exogene Lektinexpression die
Infektion von ansonsten nicht-permissiven Zellen vermitteln kann (Alvarez et al., 2002). Es
wurde daher postuliert, dass EBOV zelluläre Anheftungsfaktoren nutzten könnte, um sich im
Patienten effizienter zu verbreiten. Vor dem Hintergrund dieser Beobachtungen sollte
untersucht werden, ob die Effizienz der GP-Inkorporation in EBOV-GP-Pseudotypen die
Interaktion mit den Lektinen DC-SIGN, LSECtin und ASGP-R H1 beeinflusst. Zu diesem Zweck
wurden lektinexprimierende T-REx-Zellen mit Viren gleicher Infektiosität inkubiert, und anhand
der erhaltenen Luziferasewerte die infektionsverstärkende Wirkung der Lektine bestimmt. Für
ZEBOV- und REBOV-GP-Pseudopartikel war klar erkennbar, dass Virionen mit relativ hohem
GP-Gehalt (100 ng/ml Dox) effizienter mit Lektinen interagieren als Pseudoviren mit relativ
wenig GP-Molekülen auf ihren Oberflächen (1 ng/ml Dox) (Abb. 24). Bei SEBOV-GPPseudotypen hingegen war die GP-Menge für die Bindung an Anheftungsfaktoren nicht
ausschlaggebend und ICEBOV-GP-tragende Viren interagierten generell nur ineffizient mit den
getesteten Lektinen (Abb. 24). Die VSV-G-vermittelte Infektion wurde erwartungsgemäß durch
die Lektine nicht beeinflusst (Abb. 24).
100000
Kontrolle
ASGP-R H1
DC-SIGN
% Infektion
10000
LSECtin
1000
100
10
Dox:
(ng/ml)
1
100
ZEBOV
-GP
1
100
SEBOV
-GP
1
100
REBOV
-GP
1
100
ICEBOV
-GP
1
100
VSV-G
Abb. 24: Einfluss der Effizienz der Inkorporation von GP in Viruspartikel auf die Interaktion mit zellulären
Lektinen.
Reporterviren mit unterschiedlichen GP-Mengen wurden wie in Abb. 21 beschrieben hergestellt. VSV-Gpseudotypisierte Viren wurden durch Kotransfektion von parentalen T-REx-Zellen mit einem lentiviralen
Reporterplasmid und einem VSV-G-Expressionsplasmid generiert. Die transfizierten Zellen wurden in der Gegenwart
von Dox kultiviert. Alle Viren wurden auf vergleichbare Infektiosität für T-REx Kontrollzellen normalisiert und für die
Infektion der lektinexprimierenden Zelllinien eingesetzt. Luziferaseaktivitäten wurden 72 h nach Infektion bestimmt.
Im Diagramm ist die relative Infektion der Zelllinien dargestellt; die Infektion der permissiven T-REx Kontrollzellen
entspricht für jedes Virus 100%. Die gezeigten Daten repräsentieren den Durchschnitt aus zwei bis fünf
unabhängigen Experimenten. Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwertes dar.
62
Ergebnisse
3.5.
Erhöhte
Neutralisationssensitivität
durch
gesteigerte
GP-Inkorporation
in
Pseudoviren
Das GP auf der Virusoberfläche stellt den Hauptangriffspunkt für neutralisierende Antikörper
dar. Für SIV konnte bereits gezeigt werden, dass die Menge an Hüllprotein auf der
Virusoberfläche die Neutralisationseffizienz beeinflusst (Yuste et al., 2005). Es sollte daher
untersucht werden, ob ein ähnlicher Zusammenhang auch für ZEBOV-GP-Pseudotypen gilt. Zu
diesem Zweck wurde die Neutralisation von Pseudovirionen analysiert, die auf Infektiosität
abgeglichen
wurden,
sich
jedoch
in
ihrem
ZEBOV-GP-Gehalt
unterschieden.
Als
neutralisierendes Agens diente ein Kaninchenserum, welches gegen ZEBOV-GP generiert
worden war, und mit dem die Viren vor dem Aufbringen auf Zielzellen inkubiert wurden. VSV-Gpseudotypisierte Viren dienten dabei als Kontrolle. Das Serum hatte erwartungsgemäß keinen
Einfluss
auf
die
VSV-G-vermittelte
Infektion
(Abb.
25),
ebenso
konnten
einige
Kaninchenkontrollseren die Infektiosität der ZEBOV-GP-Pseudoviren nicht beeinflussen (Daten
nicht gezeigt). Das gegen ZEBOV-GP gerichtete Kaninchenserum inhibierte jedoch moderat die
Infektion
der
293T-Zellen
durch
ZEBOV-GP-Pseudopartikel
(Abb.
25).
Bei
der
Serumverdünnung 1:25 wurden Reporterviren mit hohem GP-Gehalt deutlich effizienter inhibiert
als Viren mit niedrigerer GP-Menge. Bei einer Verdünnung 1:75 des Serums war dieser Effekt
jedoch nicht zu beobachten (Abb. 25). Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass zumindest unter
bestimmten Bedingungen die Dichte der GP-Moleküle auf
der Virusoberfläche die
Neutralisationssensitivität beeinträchtigt.
160
140
% Infektion
120
100
80
60
40
20
0
kein
Serum
1:225
1:75
1:25
VSV-G
ZEBOV-GP
ZEBOV-GP
100 ng/ml Dox
100 ng/ml Dox
1 ng/ml Dox
Abb. 25: Die Effizienz der GP-Inkorporation in Pseudoviren beeinflusst die Neutralisationssensitivität.
ZEBOV-GP-Pseudoviren wurden wie in Abb. 21 beschrieben hergestellt; VSV-G-pseudotypisierte Viren wurden
durch Kotransfektion eines lentiviralen Reporterplasmids und eines VSV-G-Expressionsplasmids in induzierte
parentale T-REx-Zellen generiert. Alle Viren wurden auf gleiche Infektiosität der 293T-Zellen abgeglichen und mit
dem Serum in den angegebenen Verdünnungen inkubiert. Luziferaseaktivitäten wurden 72 h nach Infektion im
Zelllysat bestimmt. Die gezeigten Daten repräsentieren den Durchschnitt aus drei unabhängigen Experimenten.
Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwertes dar.
63
Ergebnisse
3.6. Die ZEBOV-GP-Expression interferiert nicht mit dem ZEBOV-GP-vermittelten
Zelleintritt, blockiert jedoch dosisabhängig die VSV-G-getriebene Infektion
Die Expression des viralen Hüllproteins kann mit der Expression des viralen Rezeptors
interferieren, wie es bereits für HIV-1 und sein Rezeptormolekül CD4 gezeigt wurde (Hoxie et
al., 1986; Martin & Nayak 1996a; Martin & Nayak 1996b). Im folgenden Experiment wurde
deshalb untersucht, ob die Expression des bislang unbekannten EBOV-Rezeptors auf der
Zelloberfläche, und somit die Permissivität der Zellen gegenüber der EBOV-GP-getriebenen
Infektion, durch Koexpression des EBOV-Hüllproteins beeinflusst wird. Zu diesem Zweck
wurden T-REx ZEBOV-GP- und T-REx Kontrollzellen mit verschiedenen Dox-Konzentrationen
zur Expression unterschiedlicher GP-Mengen induziert. Anschließend wurden die Zellen mit
HIV-1-basierten Pseudoviren infiziert, die die Hüllproteine des ZEBOV, VSV und MLV auf ihren
Oberflächen trugen, und auf Infektiosität abgeglichen worden waren. Die Induktion der T-REx
Kontrollzellen mit verschiedenen Dox-Konzentrationen hatte keinen Einfluss auf den Zelleintritt
der drei Pseudoviren (Abb. 26, linke Teilabbildung). Ebenso war kein Einfluss der GPExpression auf die Infektion durch ZEBOV-GP-Partikel festzustellen (Abb. 26, rechte
Teilabbildung). Die Infektiosität der MLV-GP- und VSV-G-Pseudotypen hingegen wurde durch
die Expression des ZEBOV-Hüllproteins beeinträchtigt: je mehr ZEBOV-GP auf den Zielzellen
vorhanden war, desto schlechter wurde der infektiöse Zelleintritt durch beide Hüllproteine
vermittelt
(Abb.
26,
rechte
Teilabbildung).
Diese
Beobachtung
spricht
gegen
die
Herabregulation des ZEBOV-Rezeptors durch ZEBOV-GP, jedoch scheint die ZEBOV-GPExpression zelluläre Faktoren zu beeinflussen, die für den zellulären Eintritt von VSV und MLV
wichtig sind.
T-REx Kontrolle
140
T-REx ZEBOV-GP
% Infektion
120
100
80
60
40
20
0
0
0.1
0.5
1
100
0
0.1
Dox (ng/ml)
MLV-GP
0.5
1
100
Dox (ng/ml)
ZEBOV-GP
VSV-G
Abb. 26: ZEBOV-GP-Expression inhibiert die VSV-G- und MLV-GP-getriebene Infektion, jedoch nicht den
ZEBOV-GP-vermittelten infektiösen Eintritt.
T-REx ZEBOV-GP- (rechte Teilabbildung) und T-REx Kontrollzellen (linke Teilabbildung) wurden mit verschiedenen
Dox-Konzentrationen zur Expression unterschiedlicher GP-Mengen induziert und mit VSV-G-, MLV-GP- und ZEBOVGP-Pseudoviren infiziert. Luziferaseaktivitäten im Zelllysat wurden 72 h nach Infektion bestimmt. Die gezeigten
Daten repräsentieren den Durchschnitt aus drei unabhängigen Experimenten. Fehlerbalken stellen den
Standardfehler des Mittelwertes dar.
64
Ergebnisse
4.
Analyse der Interaktion des EBOV-GPs mit DC-SIGN und DC-SIGNR
(Marzi et al., Journal of Infectious Diseases, im Druck)
In den vorherigen Projekten wurden Determinanten der Interaktion von EBOV-GP mit DCSIGN/R untersucht. Es war jedoch unklar, ob diese Lektine als Anheftungsfaktoren oder
Rezeptoren von EBOV für die Infektion genutzt werden. Ziel dieses Teilprojekts war es, zu
definieren, ob DC-SIGN auf B-Zelllinien und DCs als Rezeptor oder Anheftungsfaktor für EBOV
fungiert und welche Bedeutung die DC-SIGN-Internalisierung für die funktionelle Interaktion mit
EBOV hat.
4.1. DC-SIGN/R vermitteln den EBOV-GP-abhängigen Eintritt in B-THP-Zellen
Zunächst sollte überprüft werden, ob die DC-SIGN/R-Expression die Infektion nicht-permissiver
Zellen mit EBOV-GP-pseudotypisierten Viren bewirken kann. Hierzu wurden die von Raji BZellen abgeleiteten B-THP-Zellen (Wu et al., 2004) gewählt, da B-Zelllinien in vorangegangenen
Arbeiten als nicht-permissiv für die EBOV-Infektion beschrieben wurden (Wool-Lewis & Bates
1998). Die Infektion der parentalen B-THP-Zellen mit Pseudotypen, die die GPs der vier EBOVSubspezies trugen und auf Infektiosität normalisiert waren, resultierte in der Tat in
Luziferasewerten im Hintergrundbereich (Abb. 27A). Im Gegensatz dazu wurden DC-SIGN/Rexprimierende B-THP-Zellen effizient infiziert (Abb. 27A).
B
1000000
100000
Luziferaseaktivität (c.p.s.)
Luziferaseaktivität (c.p.s.)
A
10000
1000
100
10
100000
10000
1000
100
10
Kontrolle DC-SIGN DC-SIGNR
ZEBOV-GP
SEBOV-GP
1000000
PBS
REBOV-GP
ICEBOV-GP
DC-SIGN
IgG
604
507
DC-SIGNR
526
PBS
Kontrolle
Abb. 27: DC-SIGN/R erlauben den Eintritt von EBOV-GP-pseudotypisierten Viren in ansonsten nichtpermissive B-THP Zellen.
(A) DC-SIGN/R verstärken die EBOV-GP-vermittelte Infektion von B-THP-Zellen. Parentale B-THP- und B-THP DCSIGN/R-Zellen wurden mit Pseuotypen infiziert, die die GPs der vier EBOV-Subspezies trugen und auf Infektiosität
normalisiert wurden. Die Luziferaseaktivität wurde 72 h nach Infektion bestimmt. Ein repräsentatives Experiment ist
gezeigt, dessen Ergebnisse in zwei unabhängigen Versuchen bestätigt wurden. Fehlerbalken stellen die
Standardabweichung dar. (B) Die EBOV-GP-vermittelte Infektion von B-THP-Zellen ist lektinabhängig. Die Infektion
der B-THP-Zellen mit ZEBOV-GP-Pseudoviren erfolgte wie unter (A) beschrieben. Die Zellen wurden jedoch mit den
angegebenen mAks in einer Endkonzentration von 10 µg/ml für 30 min bei 37°C präinkubiert. Der mAk 604 ist für
DC-SIGNR-spezifisch, mAk 507 erkennt DC-SIGN und mAk 526 reagiert mit beiden Lektinen. Ein repräsentatives
Experiment ist gezeigt. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar.
65
Ergebnisse
In Übereinstimmung mit den bereits gezeigten Beobachtungen (Teilprojekte 2. und 3.) war auch
in diesem Experiment die infektionsverstärkende Wirkung beider Lektine für Pseudopartikel mit
ZEBOV-
und
REBOV-GP größer
als für
Virionen
mit
SEBOV-
und
ICEBOV-GP.
Inhibitionsexperimente mit Antikörpern zeigten, dass der ZEBOV-GP-vermittelte Zelleintritt auf
die GP-Interaktion mit DC-SIGN/R zurückzuführen ist: Der DC-SIGNR-spezifische mAk 604
blockierte die Infektion der B-THP DC-SIGNR-Zellen, beeinflusste die Infektion der B-THP DCSIGN-Zellen jedoch nicht (Abb. 27B). Die umgekehrte Beobachtung wurde für den DC-SIGNspezifischen mAk 507 gemacht (Abb. 27B). MAk 526 erkennt ein in beiden Lektinen präsentes
Epitop und inhibierte somit die ZEBOV-GP-vermittelte Infektion von B-THP DC-SIGN- und BTHP DC-SIGNR-Zellen (Abb. 27B).
4.2.
Potenzielle Internalisationssignale in der zytoplasmatischen Domäne von
DC-SIGN haben keinen Einfluss auf die Verstärkung der
EBOV-GP-abhängigen Infektion
Im zytoplasmatischen Teil von DC-SIGN sind zwei potenzielle Internalisationssignale enthalten:
LL und YXXL (Abb. 28A). Das erste Motiv findet man auch in DC-SIGNR (Abb. 28A). Beide
Motive könnten den Transport von gebundenen EBOV-Partikeln in Endosomen vermitteln, was
eine Voraussetzung für die produktive EBOV-Infektion darstellt (Chandran et al., 2005). Im
folgenden Abschnitt wurde der Einfluss dieser AS-Motive auf die EBOV-GP-abhängige Infektion
analysiert. Hierzu wurden beide Motive in DC-SIGN und das LL-Motiv in DC-SIGNR mutiert
(AA- und AXXG-Mutanten vgl. Abb. 28A) und zusätzlich der gesamte zytoplasmatische Teil
beider Lektine deletiert (N-ter vgl. Abb. 28A). Alle Varianten wurden stabil in EBOV
permissiven 293-Zellen exprimiert. Eine quantitative FACS-Analyse (Baribaud et al., 2002;
Pöhlmann et al., 2001b) zeigte verschiedene Expressionsstärken für die Varianten. Die
Mutation des YXXL-Motivs in DC-SIGN führte zu einer schwächeren Expression im Vergleich
zum wt-Protein, während die Mutation des LL-Motivs die Expression kaum beeinflusste (Abb.
28B, linke Teilabbildung). Die Expression der Doppelmutante AA + AXXA und der N-terVariante waren im Vergleich zum wt-Protein um 50% bzw. 80% reduziert (Abb. 28B, linke
Teilabbildung). Die Mutation des LL-Motivs in DC-SIGNR resultierte in einer leicht erhöhten
Expression im Vergleich zu wt-DC-SIGNR, während die N-ter-Variante schwächer auf der
Zelloberfläche exprimiert war (Abb. 28B, linke Teilabbildung).
66
Ergebnisse
A
AA
AKSG
TM
LL
AKSG
TM AXXG
AA
YKSL
TM
AA
TM
∆20
TM
∆N-ter
TM
wt
TM
wt
TM
∆N-ter
TM
AA
MSDSKEPRLQQLG LL EEEGLRG--------LGFRQTRG YKSL AGCLGHG
|||||||| |||| || ||
| | | ||
||||||
MSDSKEPRVQQLG LL EEDPTTSGIRLFPRDFQFQQIHG HKSS TGCLGHG
AA
B
5000
300
Oberflächenexpression
4500
% Infektion
250
% Expression
AA + AXXG
200
150
100
4000
DC-SIGN
DC-SIGNR
ZEBOV-GP-vermittelte
Infektion in cis
3500
3000
2500
2000
1500
1000
50
DC-SIGN
DC-SIGNR
DC-SIGN
AA
∆N-ter
wt
AA + AXXG
AXXG
AA
∆N-ter
wt
Kontrolle
0
AA
∆N-ter
wt
AA + AXXG
AXXG
AA
∆N-ter
wt
Kontrolle
500
0
DC-SIGNR
Abb. 28: Die zytoplasmatischen Domänen von DC-SIGN/R sind nicht essenziell für die Verstärkung der
ZEBOV-GP-vermittelten Infektion.
(A) Schematische Darstellung der analysierten DC-SIGN/R-Varianten. TM Transmembrandomäne, N-ter NTerminus. (B) Expression der DC-SIGN/R-Varianten (obere Teilabbildung) und ihre infektionsverstärkende Wirkung
(untere Teilabbildung). In einer quantitativen FACS-Analyse (Baribaud et al., 2002) wurden die Kopienzahlen der DCSIGN- (schwarz) und DC-SIGNR-Mutanten (weiß) analysiert. Die auf wt-DC-SIGN-Zellen gemessenen 189000
Kopien wurden 100% gesetzt. Der Durchschnitt aus fünf unabhängigen Experimenten ist dargestellt. Fehlerbalken
repräsentieren den Standardfehler des Mittelwertes. Dieselben Zellen wurden mit ZEBOV-GP-Pseudoviren infiziert
und nach 72 h wurde die Luziferaseaktivität bestimmt. Im Diagramm ist die relative Infektion der Zelllinien dargestellt;
die Infektion der permissiven Kontrollzellen entspricht 100%. Ein repräsentatives Experiment ist gezeigt;
Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar.
Alle Mutanten erlaubten die ZEBOV-GP-vermittelte Infektion der Zellen (Abb. 28B, rechte
Teilabbildung) und die Effizienz der Infektionsverstärkung korrelierte mit der Expressionsstärke
der jeweiligen Variante (Abb. 28B). Eine strikte Korrelation zwischen der Stärke der DCSIGN/R-Expression und der Verstärkung der ZEBOV-GP-getriebenen Infektion war bereits in
vorangegangenen Arbeiten dokumentiert worden (Simmons et al., 2003). Der zytoplasmatische
Teil beider Lektine scheint daher für die Verstärkung der ZEBOV-GP-getriebenen Infektion von
permissiven Zellen verzichtbar zu sein.
67
Ergebnisse
4.3.
Die ersten 20 AS des DC-SIGN N-Terminus sind für die Verstärkung der ZEBOVGP-vermittelten Infektion von ansonsten nicht-permissiven Zellen verzichtbar
Als nächstes wurde überprüft, ob das LL-Motif sowie die umliegenden Sequenzen für die
Infektion von B-THP-Zellen wichtig sind. Diese Zellen sind in Abwesenheit von DC-SIGN/R
nicht permissiv (Abb. 27A). Zu diesem Zweck wurden B-THP-Zellen, welche stabil die DCSIGN-Variante 20 exprimieren (Abb. 29A), im FACS und im Infektionsexperiment analysiert.
Parentale B-THP-, B-THP DC-SIGN- und B-THP hiDC-SIGN-Zellen - Zellen mit besonders
hoher DC-SIGN-Expression - wurden als Kontrollen benutzt. Die FACS-Analyse der
Lektinexpression zeigte, dass B-THP DC-SIGN20-Zellen weniger Lektin exprimierten als BTHP DC-SIGN-Zellen, die höchste DC-SIGN-Dichte wurde auf der Oberfläche der B-THP hiDCSIGN-Zellen detektiert (Abb. 29A). Diese vier Zelllinien wurden mit pseudotypisierten ZEBOVGP-Partikeln infiziert. Es konnte eine klare Verstärkung der Infektion durch die DC-SIGN20Variante beobachtet werden (Abb. 29B). Die gemessenen Luziferasewerte korrelierten jedoch
mit den Expressionsdaten: B-THP hiDC-SIGN-Zellen wurden am besten, B-THP DC-SIGN20Zellen am schlechtesten infiziert (Abb. 29B). Schließlich sollte überprüft werden, ob die Deletion
der N-terminalen 20 AS in DC-SIGN mit der Lektininternalisierung interferiert. Ein FACSbasiertes Experiment, bei welchem die Lektininternalisierung durch die Bindung des CRDspezifischen mAks 507 oder des Kontroll-mAks DCN46 (erkennt die Wiederholungsregion)
ausgelöst wurde, bestätigte frühere Beobachtungen (Engering et al., 2002; Lozach et al., 2005;
Sol-Foulon et al., 2002), dass die N-terminalen 20 AS bzw. das darin gelegene LL-Motiv für die
effiziente DC-SIGN-Internalisierung wichtig ist (Abb. 29C). Zusammenfassend sind also die Nterminalen 20 AS von DC-SIGN für die Lektininternalisierung, jedoch nicht für die Verstärkung
der ZEBOV-GP-vermittelten Infektion wichtig.
68
Ergebnisse
A
B
10000000
1000000
120
% Infektion
80
40
103
1000
104
100
Fluoreszenz
10
Kontrolle
hiDC-SIGN
DC-SIGN
DC-SIGN ∆20
C
140
0 min
5 min
15 min
30 min
60 min
120
% Oberflächenexpression
DC-SIGN∆20
102
DC-SIGN
101
10000
hiDC-SIGN
0
100
100000
Kontrolle
Zellzahl
160
100
80
60
40
20
0
DC-SIGN
DC-SIGN∆20
mAb 507
DC-SIGN
DC-SIGN∆20
mAb DCN 46
Abb. 29: Die N-termianlen 20 AS im zytoplasmatischen DC-SIGN-Anteil sind nicht essenziell für die
ZEBOV-GP vermittelte Infektionsverstärkung.
(A) Oberflächenexpression von DC-SIGN. Im FACS wurde die Expression der DC-SIGN-Varianten analysiert. hiDCSIGN: sortierte Zellen mit starker DC-SIGN Expression. (B) Verstärkung der ZEBOV-GP-vermittelten Infektion. Die
angegebenen B-THP DC-SIGN-Zellen wurden mit Infektiositäts-normalisierten ZEBOV-GP-Pseudoviren infiziert und
Luziferasewerte 72 h nach Infektion im Zelllysat bestimmt. Im Diagramm ist die relative Infektion der Zelllinien
dargestellt; die Infektion der B-THP-Kontrollzellen entspricht 100%. Die Durchschnittswerte aus drei unabhängigen
Experimenten sind dargestellt; Fehlerbalken repräsentieren den Standardfehler des Mittelwertes. (C) DC-SIGNInternalisierung. B-THP DC-SIGN- und B-THP DC-SIGN20-Zellen wurden mit den DC-SIGN-spezifischen mAks 507
(gerichtet gegen die Lektinbindedomäne) und DCN 46 (bindet an die Wiederholungsregion) bei 4°C inkubiert und für
die angegebenen Zeiträume auf 37°C gestellt. Die Oberflächenpräsenz des Lektins wurde anschließend im FACS
analysiert. Das Geometrische Mittel der Fluoreszenz von Zellen nur bei 4°C wurde als 100% gesetzt. Die
dargestellten Werte sind der Durchschnitt aus drei unabhängigen Experimenten; Fehlerbalken repräsentieren den
Standardfehler des Mittelwertes.
69
Ergebnisse
4.4.
Die Verstärkung der ZEBOV-GP-vermittelten Infektion durch DC-SIGN ist abhängig
von der jeweiligen B-Zelllinie und von der Effizienz der Virusbindung an die
Zelloberfläche
Fungiert DC-SIGN als Rezeptor für den EBOV-Eintritt in B-Zelllinien, so würde man erwarten,
dass exogenes DC-SIGN die Infektion verschiedener, ansonsten nicht-permissiver B-Zelllinien
vermittelt. Zunächst wurde der Einfluss von DC-SIGN auf die EBOV-GP-abhängige Infektion
von B-THP- und Ramos B-Zellen getestet. Beide Zelllinien exprimierten vergleichbare Mengen
an DC-SIGN (Abb. 30A) und vermittelten die HIV-Transmission mit vergleichbarer Effizienz
(Abb. 30B). Weiterhin wurde mit beiden Zelllinien eine effiziente DC-SIGN-Internalisierung nach
Ligandenbindung beobachtet (Abb. 29C und Daten nicht gezeigt).
A
B
B-THP
Ramos
HIV-1
10000000
100
50
0
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
DC-SIGN
C
1000000
100000
10000
1000
100
10
1000000
Luziferaseaktivität (c.p.s.)
Luziferaseaktivität (c.p.s.)
Zellzahl
150
ZEBOV-GP
B-THP
Infektion in cis
VSV-G
100000
Kontrolle DC-SIGN Kontrolle DC-SIGN
Ramos
Infektion in trans
10000
1000
100
10
293T Kontrolle DC-SIGN Kontrolle DC-SIGN
B-THP
Ramos
Abb. 30: DC-SIGN-Expression auf B-THP-, aber nicht auf Ramos B-Zellen verstärkt die ZEBOV-GP-vermittelte
Infektion.
(A) B-THP- und Ramos B-Zellen exprimieren vergleichbare Mengen exogenes DC-SIGN. Die DC-SIGN-Expression
wurde im FACS analysiert. (B) B-THP- und Ramos B-Zellen vermitteln die HIV-1 Infektion mit vergleichbarer
Effizienz. Die angegebenen Zelllinien wurden mit 5 ng replikationskompetentem HIV-1 Reportervirus inkubiert.
Ungebundene Partikel wurden durch Waschschritte entfernt und die Zellen entweder mit permissiven CEMx174 R5
Zielzellen oder nur in Medium kultiviert. Die Luziferasewerte wurden 72 h nach Beginn der Kultivierung in den
Zelllysaten bestimmt. Ein repräsentatives Experiment ist gezeigt. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar.
(C) B-THP DC-SIGN-, aber nicht Ramos DC-SIGN-Zellen verstärken die ZEBOV-GP-vermittelte Infektion. Die
genannten Zelllinien wurden mit Infektiositäts-normalisierten Pseudoviren mit den entsprechenden Hüllproteinen
infiziert und nach 72 h die Luziferaseaktivität in den Zelllysaten bestimmt. Ein repräsentatives Experiment ist gezeigt.
Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar.
70
Ergebnisse
Die DC-SIGN-Expression vermittelte den effizienten Eintritt von ZEBOV-GP-Pseudotypen in BTHP-Zellen, nicht jedoch in Ramos B-Zellen (Abb. 30C), wobei beide Zelltypen mit VSV-Gpseudotypisierten Viren infiziert werden konnten, wenn auch unterschiedlich effizient (Abb.
30C). Dies deutet darauf hin, dass neben DC-SIGN andere Faktoren für die ZEBOV-GPgetriebene Infektion von B-Zelllinien wichtig sind und diese Faktoren auf Ramos B-Zellen nicht,
oder nicht in ausreichender Menge exprimiert werden. Diese Ergebnisse legen weiterhin nahe,
dass DC-SIGN nicht als EBOV-Rezeptor auf B-Zelllinien fungiert. Statt dessen könnte DC-SIGN
virale Partikel auf der Zelloberfläche konzentrieren und somit die Benutzung von Rezeptoren
erleichtern, die auf machen B-Zelllinien (wie B-THP-Zellen), nicht jedoch auf anderen (wie
Ramos B-Zellen) exprimiert werden.
A
B
100000
uninfiziert
ZEBOV-GP
B-THP
DC-SIGN
BZ 22
10
+
BZ 21
B-THP
-
BZ 19
+
BZ 12
-
BZ 11
10
Spin:
100
BZ 9
100
BZ 3
1000
1000
Nalm6
p=
0,0002
10000
NC-37
DC-SIGN
10000
uninfiziert
ZEBOV-GP
VSV-G
NC-37
p=
0,01
293T
100000
Luziferaseaktivität (c.p.s.)
Luziferaseaktivität (c.p.s.)
1000000
VSV-G
Abb. 31: Spininfektion erlaubt den ZEBOV-GP-vermittelten Zelleintritt in einige B-Zelllinien.
(A) Spininfektion erlaubt die ZEBOV-GP-vermittelte Infektion parentaler B-THP-Zellen. Die genannten Zelllinien
wurden mit Infektiositäts-normalisierten Pseudotypen infiziert und entweder bei 37°C inkubiert oder für 1 h bei
1200 rpm zentrifugiert und anschließend bei 37°C inkubiert. 72 h später wurde die Luziferaseaktivität in den
Zelllysaten bestimmt. Ein repräsentatives Experiment ist gezeigt; Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar.
(B) Spininfektion verschiedener B-Zelllinien. Die angegebenen B-Zelllinien wurden mit normalisierten ZEBOV-GPund VSV-G-pseudotypisierten Viren spininfiziert. 72 h später wurde die Luziferaseaktivität in den Zelllysaten
bestimmt. Ein repräsentatives Experiment ist gezeigt; Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar.
Zur Analyse, ob DC-SIGN-vermittelte Ankonzentrierung viraler Partikel ausschlaggebend für die
Infektion von B-THP-Zellen ist, wurden B-THP DC-SIGN- und parentale B-THP-Zellen mit
ZEBOV-GP-Pseudotypen infiziert und anschließend gegebenenfalls zentrifugiert (Spininfektion).
Durch den Zentrifugationsschritt werden Viruspartikel auf der Zelloberfläche konzentriert und
die Infektionsrate erhöht (O'Doherty et al., 2000). Der Zentrifugationsschritt erlaubte die
Infektion der parentalen B-THP-Zellen und resultierte in erhöhten Luziferasewerten nach
Infektion von B-THP DC-SIGN-Zellen mit ZEBOV-GP-Pseudoviren (Abb. 31A). Das Ergebnis
spricht für die Expression des ZEBOV-Rezeptors auf B-THP-Zellen und zeigt, dass durch
exogene DC-SIGN-Expression bzw. Zentrifugation die Viruspartikeldichte auf der Zelloberfläche
71
Ergebnisse
ausreichend hoch wird, um den infektiösen Zelleintritt zu erlauben. Dieselbe Beobachtung
konnte auch für die B-Zelllinie NC-37 gemacht werden: sowohl exogene DC-SIGN-Expression
als auch Spininfektion resultierten in effizienter Infektion dieser Zelllinie (Abb. 31B). Weitere 22
B-Zelllinien, welche aus frisch isolierten humanen B-Zellen abgeleitet worden sind (BZ 1-22),
wurden auf Empfänglichkeit gegenüber der Infektion mit ZEBOV-GP-Pseudotypen hin getestet.
Jedoch nur für die Zelllinie BZ 11 konnte ein infektiöser Eintritt nach Spininfektion demonstriert
werden (Abb. 31B und Daten nicht gezeigt).
4.5.
IMDDC-Infektion mit ZEBOV ist teilweise abhängig von mannosebindenden
Lektinen wie DC-SIGN
In vorangegangen Studien wurde bereits die verstärkende Wirkung exogener DC-SIGNExpression auf die EBOV-GP-vermittelte Infektion beschrieben. Es war jedoch unbekannt, ob
endogenes DC-SIGN die Infektion primärer humaner Zellen verstärkt. Für diese Analyse
wurden iMDDCs, die endogen hohe Mengen an DC-SIGN exprimieren (Baribaud et al., 2002;
Bosio et al., 2003; Mahanty et al., 2003), mit replikationskompetentem ZEBOV in An- und
Abwesenheit des Mannosepolymers Mannan infiziert. Mannan bindet an DC-SIGN und andere
mannosespezifische Lektine und kann die Bindung viraler Hüllproteine an diese Moleküle
inhibieren. Die Präinkubation der iMDDCs mit Mannan führte zu einer signifikanten, aber nicht
vollständigen Reduktion der ZEBOV-Infektion (p = 0,029; Abb. 32), was darauf hindeutet, dass
neben mannosebindenden Lektinen wie DC-SIGN andere Faktoren zur produktiven Infektion
beitragen.
A
B
p = 0,029
10
9
uninfiziert
% positive Zellen
8
ZEBOV
7
6
5
4
3
2
1
ZEBOV
+ Mannan
72
Mannan
PBS
0
Abb. 32: Die Infektion von
iMDDCs mit ZEBOV ist
teilweise
abhängig
von
mannosebindenden Lektinen.
IMDDCs wurden durch Zytokinbehandlung aus Monozyten
generiert und mit replikationskompetentem ZEBOV in Anund Abwesenheit von Mannan
infiziert. (A) 48 h nach Infektion
wurde mit Hilfe eines gegen
ZEBOV gerichteten Ziegenserums
und
eines
FITCAntikörpers
im
Immunfluoreszenztest die ZEBOVReplikation analysiert. Zellkerne
sind mit DAPI gefärbt. (B) Der
prozentuale Anteil infizierter
Zellen wurde bestimmt und ist
dargestellt. Es sind jeweils die
Ergebnisse eines repräsentativen
Experiments
in
Quadruplikaten gezeigt. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung
dar.
Für
die
statistische Analyse wurde der
T-Test
abhängiger
Werte
angewendet.
Diskussion
F.
Diskussion
1.
DC-SIGN/R interagieren mit MARV-GP und SARS-CoV-S
In dieser Arbeit konnte demonstriert werden, dass die zellulären Lektine DC-SIGN und DCSIGNR mit Karbohydraten auf der Oberfläche von Filovirus- und Coronavirus-Hüllproteinen
interagieren und die Infektion der entsprechenden Viren verstärken. DC-SIGN/R sind jedoch
nicht ausreichend für den infektiösen Eintritt der Viren in Zellen und fungieren daher nicht als
Rezeptoren, sondern als Anheftungsfaktoren. Dies konnte in einem ersten Teilprojekt für das
SARS-CoV und das Filovirus MARV gezeigt werden.
Die DC-SIGN/R-Expression auf permissiven Zellen verstärkt die Infektion von SARS-CoV-SPseudotypen, die Expression dieser Lektine reicht jedoch nicht aus, um eine effiziente Infektion
von
nicht-permissiven
Zellen
zu
ermöglichen
(Abb.
8).
Die
Lektine
stellen
somit
Anheftungsfaktoren für SARS-CoV dar, während ACE-2 als Rezeptor fungiert (Li et al., 2003).
Im Einklang dazu konnte gezeigt werden, dass iMDDCs, die hohe Mengen an DC-SIGN
exprimieren (Baribaud et al., 2002; Bosio et al., 2003; Mahanty et al., 2003), nicht oder nur
gering permissiv für das SARS-CoV sind (Abb. 9B, C). Diese Zellen können jedoch Virionen
binden und auf permissive Zellen übertragen (Abb. 9B). Dieses Szenario trifft möglicherweise
nicht nur auf DCs zu: auch stimulierte alveolare Makrophagen exprimieren DC-SIGN (Tailleux
et al., 2005) und könnten das SARS-CoV binden und an Pneumozyten übertragen, was zur
Virusausbreitung in der Lunge beitragen könnte (Hofmann & Pöhlmann 2004). Die Ergebnisse
dieser Arbeit demonstrieren jedoch auch, dass zumindest auf iMDDCs neben DC-SIGN noch
weitere Faktoren zur SARS-CoV Übertragung beitragen. Der Mechanismus der SARS-CoVTransmission bedarf deshalb noch genauerer Analyse.
Jeffers und Kollegen beschrieben DC-SIGNR-Expression in der Lunge (Jeffers et al., 2004)
und, wie oben stehend für DC-SIGN ausgeführt, kann eine verstärkende Wirkung dieses
Lektins auf die SARS-CoV-Ausbreitung
in der Lunge postuliert werden. DC-SIGNR wurde
darüber hinaus in Leber und Lymphknoten nachgewiesen. (Bashirova et al., 2001; Pöhlmann et
al., 2001c). Das Lektin könnte in diesen Organen zur Anreicherung des SARS-CoV beitragen.
In der Tat wurde gezeigt, dass Leberzellen sowohl in vitro als auch in SARS-Patienten infiziert
werden (Chau et al., 2004; Farcas et al., 2005; To et al., 2004) und dass die SARS-CoVInfektion oft mit einer Beeinträchtigung der Leberfunktion einhergeht (Ding et al., 2003). Neuere
Studien liefern sogar Hinweise darauf, dass es sich bei SARS um eine Multi-Organ-Erkrankung
handelt, da das Virus in zahlreichen Organen und Geweben im Patienten repliziert (Ding et al.,
2004; Farcas et al., 2005). Der Einfluss von Anheftungsfaktoren auf die SARS-CoV-Ausbreitung
im Menschen ist daher möglicherweise größer als bisher angenommen.
73
Diskussion
DC-SIGN/R werden in vivo auf Zellen exprimiert, die früh während der Filovirus-Replikation
infiziert werden (Bosio et al., 2003; Geisbert et al., 2003a; Geisbert et al., 2003b; Hoenen et al.,
2006), wie Makrophagen und DCs. Ob jedoch DC-SIGN/R zum präferenziellen Befall dieser
Zellen im infizierten Wirt beitragen, ist noch nicht geklärt. DC-SIGN/R wurden bereits in früheren
Studien als EBOV-Anheftungsfaktoren identifiziert (Alvarez et al., 2002; Lin et al., 2003;
Simmons et al., 2003). Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass auch der MARVGP-vermittelte Zelleintritt durch DC-SIGN/R verstärkt wird (Abb. 6). Die Konservierung der DCSIGN/R-Benutzung zwischen EBOV und MARV unterstreicht die potenziell wichtige Rolle dieser
Lektine für die Virusausbreitung im Wirt. Eine Verstärkung der viralen Ausbreitung könnte auch
auf indirekte Effekte zurückzuführen sein. So wird spekuliert, dass DC-SIGN auf DCs einen
Beitrag dazu leistet, die Immunantwort gegenüber Filoviren zu unterdrücken (Soilleux et al.,
2002).
2.
Das EBOV-GP-Signalpeptid beeinflusst die Interaktion mit DC-SIGN/R
Filoviren infizieren alle bekannten Zelltypen außer B- und T-Zellen in vivo und in vitro (Geisbert
et al., 2003a; Geisbert et al., 2003b; Wool-Lewis & Bates 1998), was dafür spricht, dass der
zelluläre Rezeptor ubiquitär exprimiert wird. Die Identität des Rezeptors ist jedoch unbekannt.
Mehrere Studien zeigten, dass zelluläre Lektine filovirale GPs binden können: ASGP-R (Becker
et al., 1995; Lin et al., 2003), DC-SIGN (Alvarez et al., 2002), DC-SIGNR (Alvarez et al., 2002),
hMGL (Takada et al., 2004) und LSECtin (Gramberg et al., 2005). Diese Lektine verstärken die
Filovirus-Infektion in Zellkultur (Baribaud et al., 2002; Pöhlmann 2006). Bisher ist aber unklar,
ob diese Lektine Rezeptorfunktion ausüben oder lediglich als Anheftungsfaktoren fungieren, die
Viren auf der Oberfläche permissiver Zellen konzentrieren und somit die Rezeptorbindung
erleichtern (Alvarez et al., 2002; Simmons et al., 2003). Inwiefern die Lektine den viralen
Tropismus im infizierten Wirt beeinflussen, ist gegenwärtig ebenfalls unklar. Auffallend ist
jedoch, dass diese Lektine auf wichtigen Zielzellen bzw. in wichtigen Zielorganen der FilovirusInfektion exprimiert werden. So wurden DC-SIGN und hMGL auf DCs und Makrophagen
nachgewiesen (Geijtenbeek et al., 2000b; Geijtenbeek et al., 2000c; Higashi et al., 2002a;
Higashi et al., 2002b), während ASGP-R-, DC-SIGNR- und LSECtin-Expression in der Leber
detektiert wurde (Bashirova et al., 2001; Becker et al., 1995; Liu et al., 2004). Es kann daher
spekuliert werden, dass die Lektine für den präferenziellen Befall von DCs, Makrophagen und
Leberzellen während früher Stadien der Virusausbreitung mitverantwortlich sind (Simmons et
al., 2003). In der Tat konnte gezeigt werden, dass z.B. DC-SIGN-positive Zellen früh in
experimentell mit ZEBOV infizierten Makaken befallen werden (Geisbert et al., 2003a; Geisbert
et al., 2003b). Die Analyse der Interaktion von EBOV-GP mit zellulären Lektinen könnte daher
74
Diskussion
zum besseren Verständnis der EBOV-Infektion beitragen und die Identifizierung neuer
Angriffspunkte für Therapeutika erlauben.
Im zweiten Teilprojekt dieser Arbeit wurde untersucht, welche Determinanten in EBOV-GP die
Interaktion mit DC-SIGN/R beeinflussen. Diese Untersuchungen basieren auf der Beobachtung,
dass lediglich ZEBOV-, jedoch nicht SEBOV-GP effizient mit DC-SIGN/R interagiert. Die
unterschiedliche DC-SIGN/R-Bindung wurde sowohl mit lentiviralen Pseudotypen, als auch mit
lenti- bzw. filoviralen VLPs (lVLP, fVLP) nachgewiesen (Abb.10, 13C) und wirft die Frage nach
den zugrunde liegenden Faktoren auf. Es konnte gezeigt werden, dass die Effizienz der GPInkorporation in Virionen die ZEBOV-GP-, jedoch nicht die SEBOV-GP-vermittelte Anheftung an
DC-SIGN/R beeinflusst (Abb. 11A). Dabei wurde ausgeschlossen, dass SEBOV-GP generell
ineffizienter in Partikel eingebaut wird als ZEBOV-GP (Abb. 11B, C). Interessanterweise hatte
die Effizienz der ZEBOV- und SEBOV-GP-Inkorporation in Pseudotypen dagegen kaum
Einfluss auf die Infektiosität für lektinnegative Kontrollzellen (Abb. 11A). Die ZEBOV-GPInkorporation in Virionen moduliert demzufolge die Bindung an Anheftungsfaktoren, während
SEBOV-GP einen grundlegenden Defekt in der DC-SIGN/R-Interaktion aufweist, der auch
durch Optimierung der Anzahl möglicher Rezeptor-Ligand-Interaktionen nicht ausgeglichen
werden kann. Im Gegensatz dazu scheinen auch relativ geringe Mengen an GP ausreichend zu
sein, um den effizienten Eintritt in Zielzellen zu vermitteln, was wichtige Implikationen für z.B.
gegen GP-gerichtete antivirale Strategien hat (siehe auch Abschnitt 3, untenstehend).
SEBOV-GP,
das
in
DMJ-behandelten
Zellen
generiert
wurde
und
ausschließlich
hochmannosylierte Karbohydratketten enthielt, interagierte effizient mit DC-SIGN/R, ohne dass
die Oberflächenexpression oder die Virusinkorporation verändert wurden (Abb. 14). Diese
Beobachtung ist in Übereinstimmung mit bereits publizierten Daten (Guo et al., 2004; Lin et al.,
2003) und zeigt, dass es sich bei der DC-SIGN/R-Bindung an EBOV-GP um eine ProteinKarbohydrat-Wechselwirkung handelt. Die unterschiedliche DC-SIGN/R-Benutzung durch
ZEBOV- und SEBOV-GP ist daher möglicherweise auf den differenziellen Einbau von
hochmannosylierten Oligosacchariden in die GPs zurückzuführen. In der Tat konnte ein Signal
für N-verknüpfte Glykosylierung identifiziert werden, das eine unterschiedliche Lokalisation in
der
ZEBOV-
unterschiedlich
relativ
zu
glykosyliert
SEBOV-GP-Sequenz
wird.
Die
aufweist,
Mutation
des
und
daher
spezifischen
möglicherweise
N-verknüpften
Glykosylierungssignals und die Deletion der Muzindomäne in beiden GPs zeigten jedoch, dass
diese Motive die Interaktion mit DC-SIGN/R nicht beeinflussen (Abb. 15). Dennoch
unterschieden
sich
beide
GPs
in
ihrer
Glykosylierung.
Die
Anwesenheit
von
hochmannosylierten Glykanen konnte lediglich in ZEBOV-GP, nicht jedoch in SEBOV-GP
nachgewiesen werden (Abb. 19). Diese Beobachtung stimmt mit Daten, die zur Glykosylierung
von Filovirus-assoziiertem GP erhoben wurden, überein (Feldmann et al., 1994) und zeigt, dass
75
Diskussion
die EBOV-GP-Interaktion mit DC-SIGN/R sowohl von der Effizienz der Inkorporation von GP in
Virionen, als auch der GP-Modifikationen mit mannosereichen Glykanen abhängig ist.
Überraschender Weise zeigte die Analyse von chimären Hüllproteinen, dass das Signalpeptid
die Bindung an DC-SIGN/R moduliert (Abb. 17, 18). So führte der Austausch der Signalsequenz
zwischen den beiden EBOV-GPs dazu, dass die ZEBOV-GP-getriebene Infektion weniger
effizient durch DC-SIGN/R verstärkt wurde, während das Gegenteil für die Verstärkung des
SEBOV-GP-vermittelten Zelleintritts beobachtet wurde. Dabei ist herauszustellen, dass weitere
N-terminale Sequenzen in GP die Signalpeptid-kontrollierte Interaktion mit DC-SIGN/R
beeinflussen (Abb. 17). Die Mechanismen die dieser Regulation zugrunde liegen sind jedoch
gegenwärtig unklar (Abb. 17B).
Eine detaillierte Untersuchung der EBOV-GP-Signalpeptidvarianten S33Z und Z33S zeigte,
dass die Signalsequenz die GP-Glykosylierung beeinflusst und, wie schon für MARV-GP
beschrieben (Volchkov et al., 2000), während der GP-Maturation abgespalten wird (Abb. 19,
20). Für Signalpeptide viraler Proteine konnte neben der wichtigen Funktion des ER-Imports
(Martoglio & Dobberstein 1998) bislang kein Zusammenhang mit Proteinglykosylierung gezeigt
werden. Es gibt jedoch Hinweise dafür, dass Signalpeptide multifunktionell sind. So sind
Signalsequenzen in der Lage, die Interaktion zwischen dem Ribosom und dem Translokon zu
modulieren und zu bestimmen, wie lange die naszierende Polypeptidkette dem reduzierenden
Milieu im Zytoplasma bzw. der oxidierenden Umgebung im ER zugänglich ist (Fons et al., 2003;
Kim & Hegde 2002; Kim et al., 2002; Rutkowski et al., 2001). Signalpeptide können weiterhin
die Topologie des reifen Proteins beeinflussen (Kang et al., 2006; Kim et al., 2001) und ihre
Interaktion mit dem Translokon determiniert den Zeitpunkt der Signalpeptidabspaltung, was
wiederum die Effizienz der Proteinglykosylierung bestimmen kann (Rutkowski et al., 2003). Dies
geschieht
dadurch,
dass
das
Signalpeptid
die
Zugänglichkeit
von
N-verknüpften
Glykosylierungsstellen im N-Terminus für den Oligosaccharyltransferasekomplex ändert, indem
es die Konformation des N-Terminus und seine Lokalisation bezüglich der ER-Membran
modifiziert (Chen et al., 2001; Nilsson & von Heijne 1993; Rutkowski et al., 2003). Die
dokumentierte Rolle des Signalpeptids in der Proteinglykosylierung steht im Einklang mit dem in
dieser Arbeit beobachteten Einfluss des EBOV-GP-Signalpeptids auf den Einbau von
mannosereichen Oligosacchariden in GP und damit auf die Interaktion mit DC-SIGN/R. Im Falle
der EBOV-GP-Signalsequenz scheint jedoch der Zeitpunkt der Signalpeptidabspaltung für die
Glykosylierung
von
GP
nicht
entscheidend
zu
sein,
denn
die
Analyse
von
Translokationsintermediaten zeigte keine Unterschiede zwischen ZEBOV- und SEBOV-GP in
Bezug auf den Zeitpunkt der Signalpeptidabspaltung. Die Spaltung ereignete sich bei beiden
GPs während der Translokation der AS 95-219 (Daten nicht gezeigt). Weitere Studien sind
76
Diskussion
daher notwendig, um den molekularen Mechanismus der Signalpeptid-kontrollierten EBOV-GPGlykosylierung und DC-SIGN/R-Interaktion aufzuklären.
3.
Modulation der EBOV-GP Virusinkorporation: Effekte auf Anheftung,
Zelleintritt und Neutralisation
Das EBOV-GP ist essenziell für die Virusreplikation, da es den infektiösen Zelleintritt vermittelt.
Im Patienten ist das GP der Hauptangriffspunkt für neutralisierende Antikörper. Im Mausmodell
konnten diese Antikörper einen wirksamen Schutz vor der EBOV-Infektion vermitteln (Wilson et
al., 2000). In infizierten Menschen dagegen ist die Produktion neutralisierender Antikörper
ineffizient (Peters & LeDuc 1999). Als wichtigste Zielstruktur der Antikörperantwort ist GP ein
zentraler Kandidat für die Vakzinentwicklung und es konnten bereits wichtige Erfolge mit GPbasierten Impfstoffen erzielt werden: Die Immunisierung mit GP-kodierenden Adenoviren
(Sullivan et al., 2003; Sullivan et al., 2000) und vesikulären Stomatitis-Viren (VSV) (Jones et al.,
2005) schützt Affen vor der Filovirus-Infektion.
In diesem Teilprojekt sollte untersucht werden, wie sich die EBOV-GP-Virusinkorporation auf
die Zellanheftung, den Zelleintritt und die Neutralisation durch Antikörper auswirkt. Zu diesem
Zweck wurde ein induzierbares System zur GP-Expression eingesetzt. Die Analyse des GPEinbaus in Viren (Abb. 21) zeigte, dass nur die Herstellung pseudoviraler Partikel mit großen
und kleinen GP-Mengen möglich war; die Expression bzw. die Virusinkorporation von
intermediären Mengen an GP gelang nicht. Interessanterweise scheint bei hoher GPExpression das Protein intrazellulär zu akkumulieren, da es im Western Blot aus Zelllysaten
zwar gut nachgewiesen werden konnte, die FACS-Daten jedoch nur eine schwache Erhöhung
der Expression auf der Zelloberfläche zeigten (Abb. 21). Die Effizienz der GP-Inkorporation in
lentivirale Partikel hingegen korrelierte besser mit der Menge an GP in Zelllysaten (Abb. 21).
Dies legt die Vermutung nahe, dass die Inkorporation von GP in lentivirale Partikel intrazellulär
geschehen könnte, ähnlich wie von Sandrin und Kollegen für MLV-basierte Pseudoviren
beschrieben (Sandrin & Cosset 2006; Sandrin et al., 2004).
Für ZEBOV- und SEBOV-GP wurde bereits gezeigt, dass ihre transiente Expression das
Ablösen der Zellen von der Kulturschale induziert, eine Beobachtung die jedoch nicht auf das
REBOV-GP zutrifft (Chan et al., 2000; Simmons et al., 2002). Mit den hier verwendeten stabilen
293 T-REx-Zelllinien konnte diese Beobachtung bestätigt werden. Zellen, die nach Induktion
ZEBOV- bzw. SEBOV-GP exprimierten, lösten sich effizient von der Kulturschale ab, während
nach Expression von REBOV- und ICEBOV-GP kein vergleichbarer Effekt beobachtet wurde
(Abb. 22). Interessanterweise korreliert das Vermögen, die Ablösung von adhärenten Zellen zu
77
Diskussion
induzieren, mit der Pathogenität der EBOV-Subspezies im Menschen. Weitere Untersuchungen
sind notwendig, um die zugrunde liegenden Mechanismen aufzuklären. Erste Studien zeigen
eine Rolle von Dynamin in der GP-vermittelten Zytotoxizität (Sullivan et al., 2005). Schließlich
ist hervorzuheben, dass eine geringe und kontinuierliche GP-Expression in 293T-Zellen nicht
mit zytotoxischen Effekten wie Zellrundung einherzugehen scheint, und dies möglicherweise die
Situation zu Beginn einer EBOV-Infektion widerspiegelt, in der in infizierten Zellen viele
Nachkommenviren gebildet werden (Alazard-Dany et al., 2006). Diese Beobachtungen legen
nahe, das die GP-Expression während der EBOV-Infektion kontrolliert wird, um zumindest in
frühen Stadien zytotoxische Effekte zu unterbinden (Alazard-Dany et al., 2006).
Bereits geringe Mengen an GP auf der Virusoberfläche waren ausreichend, um permissive
Zellen wie 293T und Huh-7 effizient zu infizieren (Abb. 23). Möglicherweise sind daher nur sehr
wenige GP-Kopien auf EBOV-Partikeln nötig, um effizient Rezeptorinteraktion und Eintritt zu
vermitteln. Besonders Viren mit ZEBOV- bzw. SEBOV-GP auf der Oberfläche waren
unabhängig von der GP-Menge vergleichbar infektiös, während Viren mit relativ wenig ICEBOVbzw. REBOV-GP etwas geringere Infektiosität aufwiesen als Viren mit relativ hoher GPInkorporation. Die hochpathogenen EBOV-Subspezies Zaire und Sudan zeichnen sich daher
möglicherweise durch gleich bleibend hohe Infektiosität bei sehr geringer GP-Inkorporation aus,
was wichtige Konsequenzen für die Entwicklung von Impfstoffen und Therapeutika hätte.
Die Effizienz der Virusinkorporation von GP beeinflusste auch die Infektionsverstärkung durch
zelluläre Lektine (Abb. 24). So wurde der Eintritt von ZEBOV- und REBOV-GP-Pseudotypen
durch DC-SIGN/R und ASGPR effizienter verstärkt, wenn diese Viren relativ große Mengen an
GP in ihrer Hüllmembran trugen. Diese Beobachtung deckt sich mit den im vorangegangen
Teilprojekt im transienten Expressionssystem für ZEBOV-GP erhaltenen Daten (Abb. 11). Im
Gegensatz dazu interagierten ICEBOV-GP-Pseudotypen generell ineffizient mit Lektinen und
dieser Defekt wurde auch durch die Virusinkorporation von relativ hohen GP-Mengen nicht
ausgeglichen
(Abb.
24).
Der
experimentell
induzierte
ausschließliche
Einbau
von
hochmannosylierten Glykanen in ICEBOV-GP resultierte, ähnlich wie für SEBOV-GP (Abb. 14),
in einer massiven Infektionsverstärkung durch DC-SIGN/R (Daten nicht gezeigt). Dies zeigt,
dass der Glykosylierungsstatus von ICEBOV-GP die Interaktion mit Lektinen limitiert.
Kürzlich beschriebene Vakzine schützen im Affenmodell effizient vor der EBOV-Infektion über
die Induktion der zellulären und humoralen Immunantwort (Jones et al., 2005; Warfield et al.,
2005). Es ist deshalb von Interesse herauszufinden, welche Parameter die Virusneutralisation
durch Antikörper beeinflussen. Infektionsversuche mit einem gegen ZEBOV-GP-gerichteten
Kaninchenserum demonstrierten bessere Antikörperneutralisation pseudoviraler Partikel mit
hohem GP-Gehalt im Vergleich zu Viren mit wenigen GP-Kopien auf ihrer Oberfläche,
zumindest bei niedrigeren Serumverdünnungen (Abb. 25). Aufgrund von Daten aus dem
78
Diskussion
HIV/SIV-System (Yuste et al., 2005) würde man eine inverse Korrelation zwischen GPInkorporation und Neutralisationseffizienz erwarten. Die Mechanismen hinter der hier
dokumentierten Beobachtung sind daher gegenwärtig unklar, und die Durchführung weiterer
Experimente mit Seren höherer neutralisierender Aktivität sind notwendig. Es kann jedoch
spekuliert werden, dass Antikörper nicht alle EBOV-GP-Trimere binden müssen, sondern dass
bereits ein Bruchteil inaktivierter GP-Trimere ausreicht, um die Infektion zu blockieren. In
diesem Fall würden Virionen mit geringen GP-Mengen weniger gut durch das Serum erkannt
werden und deshalb resistenter gegenüber der Neutralisation sein, obwohl sie gleichermaßen
infektiös sind wie Partikel mit hohem GP-Gehalt (Abb. 23).
Viele Viren haben Strategien entwickelt, die infizierte Zellen vor der Superinfektion durch
Nachkommenviren schützt. So interferiert HIV-1 über verschiedene Mechanismen mit der
Expression seines Rezeptors CD4, wie z.B. die Ausbildung von Komplexen zwischen HIV-GP
und CD4 im sekretorischen Weg, was die Expression von CD4 auf der Zelloberfläche reduziert
(Hoxie et al., 1986; Martin & Nayak 1996a; Martin & Nayak 1996b). Die EBOV-GP Expression
moduliert die Oberflächenexpression verschiedener zellulärer Moleküle (Simmons et al., 2002),
unter anderem β1-Integrine und α5β3-Integrin (Sullivan et al., 2005; Takada et al., 2000). Es
wurde daher untersucht, ob GP auch mit der Oberflächenexpression des bis dato unzureichend
definierten EBOV-Rezeptors interferiert und somit möglicherweise die Superinfektion von Zellen
verhindert. Es zeigte sich jedoch, dass die induzierte Expression von ZEBOV-GP in 293-Zellen
keinen Einfluss auf die ZEBOV-GP-vermittelte pseudovirale Infektion hat. Dies legt die
Vermutung nahe, dass die Expression von GP in unserem System nicht mit einer
Herabregulation des EBOV-Rezeptors einherging, oder zumindest noch ausreichend Rezeptor
auf der Oberfläche exprimiert wurde, um den effizienten Eintritt in Zellen zu vermitteln (Abb. 26).
Die GP-Expression reduzierte jedoch die Infektion durch MLV-GP- und VSV-G-pseudotypisierte
Viren (Abb. 26) und könnte demnach zur Herabregulation zellulärer Faktoren führen, die für die
Infektion dieser Viren wichtig sind. Interessanterweise lieferte eine andere Studie Hinweise
darauf, dass die Expression von MARV- und EBOV-GP ohne Muzindomäne dosisabhängig die
Infektion von Zielzellen durch MARV- oder EBOV-GP- pseudotypisierte Viren verringert, die
VSV-G-vermittelte Infektion dagegen nicht beeinflusst (Manicassamy et al., 2007). Die
Muzindomäne ist daher möglicherweise für den in der vorliegenden Arbeit beobachteten
Einfluss der GP-Expression auf die Permissivität von Zielzellen verantwortlich. Schließlich ist zu
beachten, dass die dargestellten Ergebnisse mit GP-exprimierenden Zelllinien erhalten wurden,
die mit lentiviralen Pseudopartikeln infiziert wurden. Die Vermehrung von EBOV in Zielzellen hat
dagegen vielfältigen Einfluss auf den Stoffwechsel der Wirtszelle. Eine Modulation der
Expression des bislang unbekannten EBOV-Rezeptors in infizierten Zellen kann und sollte
daher nicht ausgeschlossen werden.
79
Diskussion
4.
DC-SIGN/R verstärken die EBOV-Anheftung an Zellen, wirken jedoch nicht
als Rezeptoren
Filoviren sind in der Lage in vivo und in vitro außer B- und T-Zellen alle bekannten Zelltypen zu
infizieren (Geisbert et al., 2003a; Geisbert et al., 2003b; Wool-Lewis & Bates 1998; Yang et al.,
1998). Der bislang unvollständig definierte Filovirus-Rezeptor scheint daher ubiquitär exprimiert
zu sein. Die zellulären Lektine DC-SIGN/R verstärken die filovirale Infektion (Lin et al., 2003;
Simmons et al., 2003) und sind auf wichtigen Zielzellen der EBOV-Infektion präsent (Baribaud
et al., 2002; Bosio et al., 2003; Geisbert et al., 2003a; Geisbert et al., 2003b). Es ist jedoch
bislang unklar, ob sie als Rezeptoren für Filoviren fungieren.
In diesem Teilprojekt wurde untersucht, ob sich B-Zelllinien, die für die EBOV-Infektion nicht
permissiv sind, nach exogener DC-SIGN-Expression durch EBOV-GP-Pseudotypen infizieren
lassen. Handelt es sich bei DC-SIGN um einen EBOV-Rezeptor, so sollte DC-SIGN den EBOVGP-vermittelten Eintritt in verschiedene B-Zelllinien erlauben. Darüber hinaus sollte DC-SIGN
die endozytotische Aufnahme und den nachfolgenden Transport von Viren in späte Endosomen
induzieren, wo GP1 durch Cathepsine endoproteolytisch gespalten und die Membranfusion
ausgelöst wird (Chandran et al., 2005; Schornberg et al., 2006). Während, im Einklang mit
publizierten Arbeiten zur EBOV-Infektion von T-Zellen (Alvarez et al., 2002), exogenes DCSIGN die Infektion von B-THP-Zellen, einer von Raji B-Zellen abgeleiteten Zelllinie erlaubt (Abb.
27, 30), war DC-SIGN nicht ausreichend, um den infektiösen Eintritt in Ramos B-Zellen zu
vermitteln (Abb. 30). Darüber hinaus erwiesen sich Internalisierungssignale in DC-SIGN (und
auch in DC-SIGNR) als verzichtbar für die Infektion (Abb. 28, 29). Diese Resultate zeigen
deutlich, dass DC-SIGN auf B-Zellen nicht als Rezeptor für EBOV fungiert. Statt dessen
vermittelt DC-SIGN wahrscheinlich die Anheftung von Viren an diese Zellen und erhöht so die
Benutzung eines bisher unbekannten Rezeptors, der auf B-Zellen in geringen Mengen
exprimiert zu sein scheint. Ein Indiz für diese These ist die Beobachtung, dass die
Ankonzentrierung von Virionen auf der Oberfläche von B-Zellen die DC-SIGN-Funktion
ersetzen kann (Abb. 31). Diese Ergebnisse sind möglicherweise von direkter Relevanz für die
EBOV-Ausbreitung im Wirt, da eine Subpopulation aktivierter, primärer B-Zellen DC-SIGN
exprimiert (He et al., 2006; Rappocciolo et al., 2006). Allerdings scheiterten unsere Versuche
endogenes DC-SIGN auf aktivierten, primären B-Zellen (oder B-Zelllinien) zu detektieren (Daten
nicht gezeigt). Die Gründe dafür sind gegenwärtig unklar.
IMDDCs exprimieren große Mengen endogenes DC-SIGN und können durch EBOV infiziert
werden (Baribaud et al., 2002; Bosio et al., 2003; Mahanty et al., 2003). Zellen mit DCMorphologie und endogener DC-SIGN-Expression werden auch zu allen Stadien der EBOVAusbreitung in experimentell infizierten Affen befallen (Geisbert et al., 2003a; Geisbert et al.,
2003b). In vitro-Experimente mit iMDDCs zeigten jedoch, dass mannosebindende Lektine wie
80
Diskussion
DC-SIGN nur etwa 50% zur Infektion mit replikationskompetentem ZEBOV beitragen (Abb. 32).
Es sind demnach weitere zelluläre Faktoren an der ZEBOV Infektion von iMDDCs beteiligt.
Weiterhin ist zu beachten, dass gegenwärtig umstritten ist, ob es sich bei den DC-SIGNpositiven Zellen in lymphoidem Gewebe um DCs oder Makrophagen handelt (Granelli-Piperno
et al., 2005; Gurney et al., 2005; Krutzik et al., 2005). Diese Beobachtung und die hier
angeführten Daten lassen Zweifel an einer wichtigen Rolle von DC-SIGN auf DCs für die
EBOV-Ausbreitung im Patienten aufkommen.
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91
Anhang
H.
Anhang
Abkürzungen
% (v/v)
Volumenprozent
% (w/v)
Gewichtsprozent
Abb.
Abbildung
AS
Aminosäure
bp
Basenpaar
c.p.s.
counts per second
d
Tag
DMEM
DMSO
Dulbecco’s Minimalmedium (Dulbecco’s Modified Eagle
Medium)
Dimethylsulfoxid
DNA
Desoxyribonukleinsäure
dNTP
Desoxynukleosidtriphosphoat
EBV
Epstein-Barr-Virus
ECL
E. coli
verstärkte Chemo-Lumineszenz (Enhanced ChemoLuminescence)
Escherichia coli
EDTA
Ethylen-Diamin-Tetra-Acetat
EGFP
verstärktes grün-fluoreszierendes Protein (Enhanced GFP)
ELISA
Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay
FACS
Fluorescence Activated Cell Sorting
FKS
fötales Kälberserum
GFP
grün-fluoreszierendes Protein (Green Fluorescent Protein)
ggf.
gegebenenfalls
h
Stunde
HCMV
Humanes Cytomegalovirus
HCV
HepatitisC-Virus
HIV
Humanes Immundefizienz-Virus
HRP
Meerrettichperoxidase
kbp
Kilobasenpaare
kDa
Kilodalton
l
Liter
LB
Luria-Bertani-Medium
µ-
mikro-
m-
milli-
mAk
monoklonaler Antikörper
92
Anhang
min
Minute
MLV
murines Leukämie-Virus
mRNA
messenger RNA
MW
molare Masse (molecular weight)
ng
Nanogramm
OD
optische Dichte
ORF
offener Leserahmen (Open Reading Frame)
PAGE
Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PBS
Phosphate Buffered Saline
PCR
Polymerasekettenreaktion (Polymerase Chain Reaction)
pg
Pikogramm
RNA
Ribonukleinsäure
sek
Sekunde
SDS
Natriumdodecylsulfat
SIV
Affen-Immundefizeinz-Virus (Simian Immunodeficiency
Virus)
so gennant
sog.
TCID50
Dosis für 50% Zellkultur-Infektion (Tissue Culture Infectious
Dose)
Tris
Tris-Hydroxymethylaminomethan
VSV
vesikuläres Stomatitis-Virus
z.B.
zum Beispiel
93
Anhang
Lebenslauf
Zur Person
Andrea Marzi
geb. am 9. Dezember 1978
in Weiden i. d. Opf.
Schulausbildung
1985 – 1989
1989 – 1998
Volksschule Pressath
Gymnasium Eschenbach
mathematisch-naturwissenschaftlicher Zweig
Abschluss: Allgemeine Hochschulreife
Studium
1998 –2003
2002 – 2003
Studium der Biologie an der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Diplomarbeit am Institut für Klinische und Molekulare Virologie der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Thema:
„Funktionelle Untersuchung der Interaktion zwischen zwei
zellulären Proteinen und der viralen Proteinkinase pUL97
hinsichtlich des Replikationszyklus des humanen
Cytomegalovirus“
Betreuer:
Prof. Dr. Wolfgang Hillen, Mikrobiologie
PD Dr. Manfred Marschall, Virologie
Abschluss:
Diplom-Biologin
Promotion
2003 – 2007
Promotion an der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Institut für Klinische und Molekulare Virologie der Friedrich-AlexanderUniversität Erlangen-Nürnberg
Labor:
Prof. Dr. Stefan Pöhlmann
Thema:
„Die Bedeutung zellulärer Anheftungsfaktoren für die
Filovirus-Infektion“
Betreuer:
Prof. Dr. Uwe Sonnewald, Biochemie
Prof. Dr. Bernhard Fleckenstein, Virologie
94
Anhang
Eigene Publikationen
1)
Marzi A., Möller P., Hanna S.L., Harrer T., Eisemann J., Steinkasserer A., Becker S.,
Baribaud F., Pöhlmann S. Analysis of the interaction of Ebolavirus glycoprotein with DCSIGN and DC-SIGNR. J. Infect. Dis. 2007. im Druck
2)
Pöhlmann S., Münch J., Aziz S., Reeves J.D., Otto C., Leslie G.J., Hofmann H., Puffer
B.A., Baribaud F., Marzi A., Gramberg T., Chen Z., Stolte N., Haaft P.T., Heeney J.L.,
Stahl-Hennig C., Matz-Rensing K., Schneider T., Doms R.W., Kirchhoff F. A simian
immunodeficiency virus V3 loop mutant that does not efficiently use CCR5 or common
alternative coreceptors is moderately attenuated in vivo. Virology. 2007. im Druck
3)
Hofmann H., Marzi A., Gramberg T., Geier M., Pyrc K., van der Hoek L., Berkhout B.,
Pöhlmann S. Attachment factor and receptor engagement of SARS coronavirus and
human coronavirus NL63. Adv. Exp. Med. Biol. 2006. 581: 219-227
4)
Romaker D., Schregel V., Maurer K., Auerochs S., Marzi A., Sticht H., Marschall M.
Analysis of the structure-activity relation (SAR) of four UL97-subfamily herpesviral
protein kinases reveals partial but not full functional conservation. J. Med. Chem. 2006.
419(24): 7044-7053
5)
Chaipan C., Soilleux E.J., Simpson P., Hofmann H., Gramberg T., Marzi A., Geier M.,
Stewart E.A., Eisemann J., Steinkasserer A., Suzuki-Inoue K., Fuller G.L., Pearce A.C.,
Watson S.P., Hoxie J.A., Baribaud F., Pöhlmann S. DC-SIGN and CLEC-2 mediate
HIV-1 capture by platelets. J. Virol. 2006. 80(18): 8951-5960
6)
Hofmann H., Simmons G., Rennekamp A.J., Chaipan C., Marzi A., Gramberg T., Geier
M., Wegele A., Bates P., Pöhlmann S. Highly conserved regions within the S-protein of
hCoV-229E and hCoV-NL63 determine recognition of their respective cellular receptors.
J. Virol. 2006. 80(17): 8639-8652
7)
Marzi A., Wegele A., Pöhlmann S. Modulation of virion incorporation of Ebolavirus
glycoprotein: Effects on attachment, cellular entry and neutralization. Virology. 2006.
352(2): 345-356
8)
Marzi A., Akhavan A., Simmons G., Gramberg T., Hofmann H., Bates P., Lingappa V.R.,
Pöhlmann S. The signal peptide of the Ebolavirus glycoprotein influences the interaction
with the cellular lectins DC-SIGN and DC-SIGNR. J. Virol. 2006. 80(13): 6305-6317
9)
Gramberg T., Zhu T., Chaipan C., Marzi A., Liu H., Wegele A., Andrus T., Hofmann H.,
Pöhlmann S. Impact of polymorphisms in the DC-SIGNR neck domain on the interaction
with pathogens. Virology. 2006. 347(2): 354-363
95
Anhang
10)
Gramberg T., Hofmann H., Möller P., Lalor P.F., Marzi A., Geier M., Krumbiegel M.,
Winkler T., Kirchhoff F., Adams D.H., Becker S., Münch J., Pöhlmann S. LSECtin
interacts with filovirus glycoproteins and the spike protein of SARS coronavirus.
Virology. 2005. 340(2): 224-236
11)
Marschall M., Marzi A., aus dem Siepen P., Jochmann R., Kalmer M., Auerochs S.,
Lischka P., Leis M., Stamminger T. Cellular p32 recruits cytomegalovirus kinase pUL97
to redistribute the nuclear lamina. J. Biol. Chem. 2005. 280(39): 33357-33367
12)
Marzi A., Gramberg T., Simmons G., Möller P., Rennekamp A.J., Krumbiegel M., Geier
M., Eisemann J., Turza N., Saunier B., Steinkasserer A., Becker S., Bates P., Hofmann
H., Pöhlmann S. DC-SIGN and DC-SIGNR interact with the glycoprotein of Marburg
virus and the S protein of severe acute respiratory syndrome coronavirus. J. Virol. 2004.
78(21): 12090-12095
13)
Hofmann H., Geier M., Marzi A., Krumbiegel M., Peipp M., Fey G.H., Gramberg T.,
Pöhlmann S. Susceptibility to SARS coronavirus S-protein driven infection correlates
with expression of angiotensin converting enzyme 2 and infection can be blocked by
soluble receptor. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. 319(4): 1216-1221
14)
Hofmann H., Hattermann K., Marzi A., Gramberg T., Geier M., Krumbiegel M., Kuate S.,
Überla K., Niedrig M., Pöhlmann S. S protein of severe acute respiratory syndromeassociated coronavirus mediates entry into hepatoma cell lines and is targeted by
neutralizing antibodies in infected patients. J. Virol. 2004. 78(12): 6134-6142
15)
Pöhlmann S., Davis C., Meister S., Leslie G.J., Otto C., Reeves J.D., Puffer B.A.,
Papkalla A., Krumbiegel M., Marzi A., Lorenz S., Münch J., Doms R.W., Kirchhoff F.
Amino acid 324 in the simian immunodeficiency virus SIVmac V3 loop can confer CD4
independence and modulate the interaction with CCR5 and alternative receptors. J.
Virol. 2004. 78(7): 3223-3232
96
Anhang
Beiträge zu nationalen und internationalen Kongressen
1)
Filoviruses: Recent Advances and Future Challenges, 2006
Winnipeg, Manitoba, Kanada
Determinants of Ebolavirus glycoprotein interactions with the cellular attachment factors
DC-SIGN and DC-SIGNR
(Poster)
2)
XIII. Conference on Negative Strand Viruses, 2006
Salamanca, Spanien
The signal peptide of the Ebolavirus glycoprotein determines the interaction with the
cellular lectins DC-SIGN and DC-SIGNR
(Poster)
3)
Jahrestagung der Gesellschaft für Virologie, 2006
München
The signal peptide of the Ebolavirus glycoprotein determines the interaction with the
cellular lectins DC-SIGN and DC-SIGNR
(Mündlicher Beitrag)
4)
Keystone Symposia on Cell Biology of Virus Entry, Replication and Pathogenesis, 2006
Santa Fe, New Mexico, USA
The signal peptide of the Ebolavirus glycoprotein determines the interaction with the
cellular lectins DC-SIGN and DC-SIGNR
(Poster)
5)
Jahrestagung der Gesellschaft für Virologie, 2005
Hannover
Signal petide modulated glycosylation determines the interaction of Ebolavirus
glycoproteins with DC-SIGN and DC-SIGNR
(Poster)
6)
Jahrestagung der Gesellschaft für Virologie, 2004
Tübingen
Domains of the Ebolavirus glycoprotein responsible for binding the cellular attachment
factors DC-SIGN and DC-SIGNR
(Poster)
97