Untersuchungen zur Typ I Allergie des Pferdes
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Aus der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover Untersuchungen zur Typ I Allergie des Pferdes: Phänotypische Charakterisierung equiner Typ I Effektorzellen und ihre Antikörper vermittelte Modulation INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Doctor of Philosophy (PhD) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Jens Rohwer aus Wyk Hannover 2004 Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. med. vet. M. Hoedemaker Prof. Dr. med. R. E. Schmidt Prof. Dr. med. vet. Dr. h. c. Wolfgang Leibold 1. Gutachten: Prof. Dr. med. vet. M. Hoedemaker Prof. Dr. med. R. E. Schmidt Prof. Dr. med. vet. Dr. h. c. Wolfgang Leibold 2. Gutachter: Prof. Dr. med. S. C. Bischoff Tag der öffentlichen Disputation: Mittwoch, 10. November 2004 For what it´s worth Inhaltsverzeichnis Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen.......................................................................... 8 1 Einleitung und Zielsetzung ............................................................................................... 11 1.1 Das Sommerekzem des Pferdes - eine Typ I Allergie...........................................................11 1.2 Defizite der veterinärmedizinischen Forschung bei der Typ I Allergie .............................11 1.3 Schwerpunkte dieser Arbeit ...................................................................................................13 2 Literaturübersicht ............................................................................................................. 15 2.1 Immunglobuline ......................................................................................................................15 2.1.1 2.1.2 Immunglobulinsystem des Pferdes ............................................................................17 Sekundärfunktionen von Antikörpern........................................................................21 2.2 Allergie .....................................................................................................................................26 2.2.1 2.2.2 2.2.3 Physiologische Immunmechanismen als Grundlage der überschießenden Reaktionen bei Allergien...............................................................................................................26 Die saisonal rekurrierende atopische Dermatitis des Pferdes – das Sommerekzem..32 Immunglobulin-Isotypen und ihre potentielle Bedeutung für die Typ I-Allergie des Pferdes........................................................................................................................36 2.3 Immunmodulation...................................................................................................................37 2.3.1 2.3.2 2.3.3 Definitionen und Einsatzmöglichkeiten.....................................................................37 Immunmodulation der Typ I-Allergie........................................................................38 Immunmodulation durch allergenspezifische Antikörper anderer Isotypen als IgE..42 3 Geräte, Material und Methoden ...................................................................................... 45 3.1 Geräte .......................................................................................................................................45 3.2 Material ....................................................................................................................................46 3.2.1 3.2.2 3.2.3 3.2.4 3.2.5 3.2.6 3.2.7 3.2.8 Klinikbedarf ...............................................................................................................46 Laborbedarf................................................................................................................47 Reagenzien.................................................................................................................48 Puffer, Lösungen und Medien....................................................................................49 Allergene....................................................................................................................52 Antikörper und Seren.................................................................................................53 Lösungen für die Durchflusszytometrie und Dichtegradientenzentrifugation...........55 Tiere ...........................................................................................................................55 3.3 Methoden..................................................................................................................................56 3.3.1 3.3.2 3.3.3 3.3.4 3.3.5 3.3.6 3.3.7 3.3.8 3.3.9 3.3.10 3.3.11 3.3.12 3.3.13 3.3.14 3.3.15 3.3.16 Blutentnahme .............................................................................................................56 Serumgewinnung .......................................................................................................56 Zellzahl und Vitalitätsbestimmung ............................................................................56 Anfertigen von Blutausstrichen und Leukozytendifferenzierung ..............................57 Anfertigung von Zytospins ........................................................................................57 Quantifizierung der Zahl vitaler Zellen mit Hilfe des Durchflusszytometers (Referenzzellmethode):..............................................................................................58 Gewinnung und Isolierung von Leukozyten aus dem Blut........................................59 Magnetisches Sortieren (MACS) von IgE+ Zellen....................................................60 Funktioneller in vitro-Test (FIT) zur Bestimmung des Sensibilisierungsgrades basophiler Granulozyten ............................................................................................62 Kompetitiver Histamin-Radio-Immuno-Assay (RIA) ...............................................65 Immunisierung von Ziegen zur Gewinnung von polyklonalem goat anti Acylhistamin Antiserum ............................................................................................68 Vitalitätsbestimmung von Zellen mittels Fluorochromen .........................................69 Durchflusszytometrie .................................................................................................70 Indirekte Membranimmunfluoreszenz (MIF) ............................................................72 Statistische Verfahren ................................................................................................74 Zellkultur....................................................................................................................75 4 Ergebnisse .......................................................................................................................... 77 4.1 Phänotypische Charakterisierung IgE positiver Zellen im peripheren Blut des Pferdes.77 4.1.1 4.1.2 4.1.3 Verteilung IgE positiver Zellen im peripheren Blut des Pferdes ...............................80 Anreicherung von IgE positiven Zellen im magnetischen Feld (MACS sorting)......85 Lichtmikroskopische Darstellung IgE positiver Zellen des Pferdes ..........................89 4.2 Methodische Vorarbeiten .......................................................................................................95 4.2.1 4.2.2 Spezifität der eingesetzten monoklonalen Antikörper und Seren zur Überprüfung der generellen Sensibilisierung im FIT......................................................................95 Intraindividuelle Reproduzierbarkeit des FIT und Konfidenz der Überprüfung der generellen Sensibilisierung ........................................................................................97 4.3 Diskordante Dominanz der IgG oder IgE vermittelten Freisetzung von Histamin aus basophilen Granulozyten .......................................................................................................99 4.3.1 4.3.2 Erfassung verschiedener Reaktionsmuster bei der Überprüfung der generellen Sensibilisierung innerhalb einer Pferdepopulation. ...................................................99 Individuelle Reaktionsverläufe der generellen Sensibilisierung innerhalb einer Herde........................................................................................................................103 4.3.3 4.3.4 4.3.5 4.3.6 Analyse des bifunktionellen Nachweises der generellen Sensibilisierung ..............112 Überprüfung der Hypothese Basophile von atopischen Pferden seien IgE reagibler als die gesunder Individuen......................................................................................117 Freisetzung von Histamin durch verschiedene Konzentrationen des monoklonalen Antikörpers gegen equines IgE ................................................................................119 Modulation der Histaminfreisetzung über die kombinierte Aktivierung der generellen und der spezifischen Sensibilisierung ....................................................121 4.4 Funktionelle Überprüfung monoklonaler anti equiner Immunglobulinisotypen Antikörper im FIT ................................................................................................................127 4.4.1 4.4.2 Überprüfung der Histamin freisetzenden Potenz equiner IgG Isotypen nach Kreuzvernetzung ......................................................................................................127 Überprüfung einer inhibitorischen Potenz equiner IgG Isotypen nach Kreuzvernetzung ......................................................................................................129 5 Diskussion......................................................................................................................... 135 5.1 Untersuchungen zur Histaminfreisetzung über Antikörper gegen equine Immunglobulin Isotypen..................................................................................................................................135 5.2 Membranimmunfluoreszenz gegen equines IgE ................................................................136 5.3 Magnetisches Sortieren und lichtmikroskopische Differenzierung IgE tragender Zellen beim Pferd .............................................................................................................................140 5.4 Qualität der funktionellen, generellen Sensibilisierung basophiler Granulozyten über mehr als einen Isotyp............................................................................................................141 5.5 Interpretation der funktionellen Sensibilisierung allergischer Effektorzellen durch Immunglobuline der Klassen IgE und IgG ........................................................................145 5.6 Modulation der Histaminfreisetzung über kombinatorische Inkubationen aktivierender Stimuli....................................................................................................................................147 6 Zusammenfassung ........................................................................................................... 152 7 Summary .......................................................................................................................... 155 8 Literaturverzeichnis ........................................................................................................ 158 Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen und termini technici Abb. ADCC Anti Aqua tridest. Bo BSA bspw. bzw. C1q C5a ca. CD CD4+ CD8+ CO2 CpG CR DNA/DNS EDTA ELISA Eq, eq Events Fab FACScan® Fc FCM FCS FITC FL-1, -2, -3 FSC g G-CSF generelle Sensibilisierung GM-CSF h Abbildung Antibody Depending Cytotoxicity (Antikörperabhängige Zelltoxizität) gegen gerichtet Aqua tridestillata (dreifach destilliertes Wasser) Bovine (bovin) Bovines Serumalbumin beispielsweise beziehungsweise Fragment der Komplementkomplemente C1 aktiviertes Fragment der Komplementkomponente C5 zirka Cluster of Differentiation (System zur Bezeichnung von Differenzierungsantigenen) Zellen, die das Differenzierungsantigen CD4 an der Oberfläche exprimieren Zellen, die das Differenzierungsantigen CD8 an der Oberfläche exprimieren Kohlenstoffdioxid Cytosin-Phosphate-Guanosin Complement Receptor (Komplementrezeptor) Desoxyribonucleic Acid (Desoxyribonukleinsäure) Ethylendiamintetraacetat Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Enzymgekoppelter Immunfestphasentest) Equine (equin) Messereignisse in der Durchflusszytometrie Fragment antigen binding (atigen bindende Anteile von leichten und schweren Ketten eines Immunglobulins) Fluorescence Activated Cell Scanner (Fluoreszenzaktiviertes Zellmessgerät der Firma Becton Dickinson, Heidelberg) Fragment cristalline (kristallisierbarer Antikörperteil, carboxy- terminales Fragment von Immunglobulinen nach Papain-Spaltung) Flow Cytometer (Durchflusszytometer) Fetal Calf Serum (Fetales Kälberserum) Fluoreszeinisothiocyanat Messkanäle des Durchflusszytometers für emittierte Fluoreszenz FL-1 = Grünfluoreszenz, 530 ± 15 nm; FL-2 = Orangefluoreszenz, 585 ± 21 nm; FL-3 = Rotfluoreszenz, >650 nm) Forward Scatter (Vorwärtsstreulicht), Messparameter des FACScan® Gramm Granulocyte-Colony Stimulating Factor (Granulozyten-Wachstumsfaktor) Sensibilisierung basophiler Granulozyten durch membranständige Antikörper (IgE und IgG) Granulocyte-Monocyte-Colony Stimulating Factor (GranulozytenMonozyten-Wachstumsfaktor) hora (lateinisch: Stunde) heterobridging H&L HRF HRP ICAM IFN Ig IgA IgE IgG IgG1,2, u.a. IgM IL i.m. ITAM ITIM L LIR LRP µ m M MACS mAK mfl MHC MIF min MNC muAB MW N oder (N=…) (n=…) n NaCl n.n. Nr. NSB P PAMP PBS Kreuzvernetzen verschiedener Immunglobulinisotypen auf der Membran Basophiler Heavy and Light (schwere und leichte Ketten der Immunglobuline) Histamine Releasing Factors (Histamin freisetzende Faktoren) Horse-Radish-Peroxidase (Meerrettich Peroxidase) intercellular adhesion molecule (interzelluläres Adhäsionsmolekül) Interferon Immunglobulin Immunglobulin A Immunglobulin E Immunglobulin G Subtypen/ Isotypen aus der Klasse des Immunglobulins G Immunglobulin M Interleukin intra muskulär Immunglobulinreceptor associated Tyrosine-based Activating Motif (Immunglobulinrezeptor assoziiertes Tyrosin basierendes aktivierendes Motiv) Immunglobulinreceptor Tyrosine-based Inhibitory Motif (Immunglobulinrezeptor assoziiertes Tyrosin basierendes hemmendes Motiv Liter Leucocyte Inhibitory Receptor (Leukozyten hemmender Rezeptor) Leukozytenreiches Plasma mikro (x 10-6) milli (x 10-3) Molar (Mol/L) Magnetic Cell Sorting (magnetisches Sortieren von Zellen) monoklonale(r) Antikörper Mean Fluorescence (mittlere Fluoreszenzintensität) Major Histocompatibility Complex (Haupthistokompatibilitätskomplex) Membranimmunfluoreszenz Minute(n) Mononuclear Cells (mononukleäre Zellen des Blute) Murine Antibody(s) (Mäuseantikörper) arithmetischer Mittelwert bei Berechnung des Mittelwertes die Anzahl der Einzelbeobachtungen oder Probanden Bei Mittelwerten mehrerer Probanden die Anzahl der Einzelbeobachtungen je Proband nano (x 10-9) Natriumchlorid Not Named (nicht benannt) Nummer Non Specific Binding (unspezifische Bindung im RIA) Wahrscheinlichkeit mit der die Hypothese nicht zutrifft Pathogen Associated Molecular Pattern (Molekulare Muster von Erregern) Phosphate Buffered Saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) PBL PE Pellet PI oder PJ PMN Px RIA RT s. s.c. SD sek SEM SIT sog. spezifische Sensibilisierung SPT SSC Superbridging Tab. TCR TNF u.a. UV vgl. v/v well z.B. z.T. Peripheral Blood Leucocytes (periphere Blutleukozyten) Phycoerythrin Bodensatz; hier: durch Zentrifugation sedimentierte Zellen Propidiumiodid Polymorphonuclear Leukocytes (hier Granulozyten inklusive Basophile und Eosinophile) Peroxidase Radio Immunosorbent Assay (Radio Immunadsorptionstest) Raumtemperatur siehe sub cutan Standard Deviation (Standardabweichung) Sekunde(n) Standard error of mean (Standardfehler) Specific Immunotherapy (spezifische Immuntherapie) So genannte(r) Sensibilisierung basophiler Granulozyten durch membranständige allergenspezifische Antikörper Skin Prick Test (Hauttest auf Allergie) Side Scatter (Seitwärtsstreulicht), Messparameter des FACScan® Kreuzvernetzen sekundärer Antikörper auf der Oberfläche Basophiler Tabelle T Cell Receptor (T-Zellrezeptor) Tumornekrosefaktor unter anderem Ultraviolett vergleiche Volumen pro Volumen Vertiefung einer Mikrotiterplatte zum Beispiel zum Teil Einleitung und Zielsetzung 1 Einleitung und Zielsetzung 1.1 Das Sommerekzem des Pferdes - eine Typ I Allergie Unter den bei Mensch und Tier zunehmenden allergischen Erkrankungen stellt die „Sofortreaktion“ vom Typ I ein besonderes Problem dar: Zwar kennt man die zentralen Mechanismen dieser Überempfindlichkeit beim Menschen. Die bevorzugt durch Antikörper vermittelte und durch Allergen ausgelöste Aktivierung basophiler Granulozyten (Basophiler) und Mastzellen ist auch für das equine System bekannt, doch ist eine kausale oder zentral eingreifende, dauerhafte Therapie nicht in Sicht. Auch die gelegentlich wirksame Hyposensibilisierung bleibt in ihren beteiligten Mechanismen weitgehend unverstanden. Zur langsamen Entwicklung auf diesem Gebiet trägt bei, dass kaum gut definierte Tiermodelle für die Typ I Allergie zur Verfügung stehen. Im Gegensatz zur Maus, bei der bisher keine natürlicherweise auftretende IgE vermittelte Überempfindlichkeit beschrieben ist, findet man bei Pferden regelmäßig Krankheitsbilder, welche die Vermutung nahe legen, es handle sich um eine allergische Reaktion. Als eines der klassischen könnte sich das Sommerekzem der Pferde herausstellen, dass gleichzeitig ein gravierendes Problem für Pferde und Pferdehalter ist. Ihm steht die Veterinärmedizin derzeit noch ebenso hilflos gegenüber wie die Humanmedizin zahlreichen Typ I Allergieformen beim Menschen. 1.2 Defizite der veterinärmedizinischen Forschung bei der Typ I Allergie Der Vorteil des Sommerekzems ist seine relativ klare Pathogenese: Pferde werden saisonal in den Sommermonaten bevorzugt von bestimmten Gnitzenarten (häufig Culicoides species) an charakteristischen Körperstellen gestochen. Mit dem Speichel dieser Gnitzen werden Substanzen „appliziert“, auf die zahlreiche Pferde mit klinischen und histopathologischen Symptomen reagieren, die in Verlauf und Ausprägung charakteristisch für eine Typ I Allergie sind. Der Nutzung dieser klaren Erkrankung bei Pferden zur Klärung zentraler Typ IAllergiemechanismen steht der Mangel an hinreichenden Grundkenntnissen und geeigneten Reagenzien entgegen: 11 Einleitung und Zielsetzung Vom Culicoides-Allergen ist derzeit nur eine relativ grobe Präparation bestimmter Culicoidesarten zugänglich. Eine informative Mechanismusanalyse ist mit definierten Antigenen, bevorzugt Haptenen, jedoch weit besser möglich. Zwar weiß man um die zentrale Bedeutung von Mastzellen und Basophilen beim Sommerekzem, doch ist mangels geeigneter Reagenzien bisher nicht zuverlässig dokumentiert, welche Immunglobulinisotypen auf welchen Fc-Rezeptoren (FcR) dieser Zellen binden und eine Aktivierung vermitteln oder verhindern können. Zudem ist beim Pferd unbekannt, ob und welche Zytokine oder Chemokine die Reaktionsfähigkeit von Basophilen und Mastzellen beeinflussen können. Bei besser untersuchten Spezies (Mensch, Maus, Ratte) sind Basophile und Mastzellen konstitutiv mit einem FcεRI ausgestattet. Er ist so hochaffin für den Fc-Teil von IgE, dass er es in freier Form binden und damit diese Zellen für die vom spezifischen Bindungsteil (Paratop) dieser Antikörper erkannten Determinaten (Epitope) auf Antigenen sensibilisiert. Zumindest für Mastzellen der Ratte wurde gezeigt, dass der FcεRI auch einen bestimmten IgG-Isotypen (IgG2a) binden kann, wenn auch mit geringerer Affinität als das IgE (BENHAMOU et al. 1994). Werden auf Mastzellen und Basophilen zusätzlich verschiedene Formen von FcγRII gefunden, so können sie erheblich modulatorische fördernde wie hemmende Wirkung auf das Reaktionsverhalten dieser Zellen haben, sobald beide Rezeptoren, der FcεRI und der FcγRII, durch ein an Antigen gebundenes IgE und IgG überbrückt werden (DAERON et al. 1995). Neben der Modulation des Reaktionsverhaltens von Basophilen und Mastzellen durch verschiedene Immunglobulinisotypen, kann die Expression des FcεRI in weiten Bereichen (zwischen wenigen hundert bis 106 Rezeptoren / Basophilem) durch die Menge an freiem IgE quantitativ moduliert werden (LANTZ et al. 1997, MAC GLASHAN, Jr. et al. 1997). Insgesamt kann das Reaktionsverhalten von Basophilen und Mastzellen von mehreren Einflüssen abhängen: Der Anzahl exprimierter FcεRI, der Anzahl gebundener IgE-Moleküle pro Antigen und deren Affinität zum Antigen (COLLINS et al. 1995 & 1996), der antagonistischen oder unterstützenden Bindung von geeigneten IgG-Isotypen und den modulierenden Einwirkungen von Chemo- und Zytokinen (KUNA et al. 1993; YAMAGUCHI et al. 1996). 12 Einleitung und Zielsetzung 1.3 Schwerpunkte dieser Arbeit In ihrer Dissertationsarbeit ist es Frau Dr. KAUL gelungen, einen sensitiven funktionellen in vitro-Nachweis zu entwickeln, mit dem die in vivo-Sensibilisierung equiner Basophiler qualitativ und quantitativ erfasst werden kann (KAUL 1998). Dieser funktionelle in vitro-Test (FIT) wurde bisher unter anderem für die Sensibilisierung gegen Culicoides nubeculosus, einem der Allergenspender für Pferde mit Sommerekzem, zur diagnostischen Reife etabliert. Damit ist es nun möglich, Tiere zu identifizieren und in ihrem Sensibilisierungsgrad gegen Culicoides nubeculosus zu differenzieren, unabhängig vom Grad der klinischen Ausprägung an Sommerekzemsymptomen – sensibilisierte Pferde, die zum Zeitpunkt der Untersuchung frei von Symptomen sind, werden im FIT als sensibilisiert „erkannt“ . Zum anderen ermöglicht dieses Verfahren, die funktionelle Aktivierung der Basophilen selektiv an der Menge des freigesetzten Histamins zu quantifizieren. In der Allergiediagnostik beim Menschen wird der Allergiestatus häufig über die Bestimmung von Gesamt-IgE im Serum (RIST: radio-immuno-sorbent-test) oder von allergenspezifischem IgE (RAST: radio-allergen-sorbent-test) ermittelt. Damit wird freies, in vivo nicht immunkomplexiertes IgE gemessen. In wie weit diese Testverfahren eine Diagnostik der Typ I Allergie unterstützen können, wird kontrovers diskutiert (DOLEN 2003). In diesen Testverfahren werden regelmäßig Probanden ermittelt, bei denen ein positiver ex vivo Test keine klinische Entsprechung findet. Im Gegensatz bietet eine Bestimmung der Antikörper, die auf den Basophilen so gebunden haben, dass sie die Zellen zu aktivieren vermögen (im FIT zur Freigabe von Histamin), eine hohe Übereinstimmung zur klinischen Ausprägung der Allergie. Trotz eines positiven FIT-Ergebnisses (Reaktion der Basophilen muss also stattgefunden haben) findet sich auch in diesem Testsystem das gleiche Paradoxon: Es werden Tiere ermittelt, die trotz bestehender Sensibilisierung keine klinischen Zeichen einer Allergie entwickeln. Es stellt sich die Frage, wie und auf welcher Ebene eine Modulation der immunologischen Reaktion stattfindet. Zu beachten ist hier, dass bisher kein Trennungsverfahren für Basophile des Pferdes vorliegt. Eine Möglichkeit der Interaktion verschiedener Zelltypen ist nicht auszuschließen. Um eine Beteiligung anderer Zellen zu erfassen, wird markiertes IgE eingesetzt, um im FCM (Flow Cytometry) Zellen, die IgE binden zu detektieren. Diese Zellen können dann mit magnetischen Kügelchen gekoppelt werden und in einem elektrostatischen Feld von unmarkierten getrennt werden (MACS), um sie anzureichern, zu charakterisieren und zu kultivieren. 13 Einleitung und Zielsetzung Somit stellen sich für die Analyse verantwortlicher Mechanismen bei Pferden mit Sommerekzem folgende vordringliche Fragen: • Bindet IgE vom Pferd (eqIgE) an Basophile und Mastzellen in freier Form (spräche für einen FcεRI) oder nur nach vorheriger Bindung an ein Antigen, also in immunkomplexierter Form (IC-IgE)? • Welche Leukozyten des peripheren Blutes sind in der Lage, eqIgE zu binden? • Kann an Basophile oder Mastzellen gebundenes IgE diese aktivieren, sobald ein monoklonaler Antikörper gegen IgE oder ein geeignetes Antigen sie überbrückt (bridging)? • Kann die klinische Diagnose Typ I Allergie durch diese Aktivierung reproduzierbar bestätigt werden? • Können weitere Isotypen gefunden werden, die equine Basophile neben IgE sensibilisieren? • Wenn equine Basophile durch verschiedene Isotypen sensibilisert werden, unterscheidet sich deren aktivierendes oder inhibierendes Potenzial? • Unterscheidet sich die Sensibiliserung von Basophilen durch verschiedene Isotypen zwischen allergischen und gesunden Pferden? • Wird die Reaktion Basophiler durch gleichzeitiges Kreuzvernetzen sensibilisierender Antikörper unterschiedlichen Isotyps moduliert? Derartige Untersuchungen waren bisher beim Pferd nicht möglich, da keine spezifischen Nachweisreagenzien für den Besatz Basophiler mit Immunglobulinisotypen zur Verfügung standen. Aus Blut oder anderen Körperflüssigkeiten vom Pferd aufgereinigte IgE Präparationen enthielten einen zu großen Anteil anderer, nicht eindeutig definierbarer IgIsotypen (SUTER & FEY, 1981 & 1983), als dass Immunnisierungen von Mäusen zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen equines IgE Erfolg versprechend gewesen wären. Ähnliches gilt für 3 der 6 (7) equinen IgG Isotypen. 14 Literaturübersicht 2 Literaturübersicht 2.1 Immunglobuline Die Grundform (Monomer) funktionsfähiger Immunglobuline besteht aus vier Polypeptidketten, zwei identischen schweren (H-Ketten) und zwei identischen leichten (L-) Ketten, die durch Disulfidbrücken kovalent miteinander verbunden sind. Diese Disulfidbrücken sorgen für die Stabilität des Immunglobulins. Das Molekulargewicht (MG) der schweren Ketten liegt dabei zwischen 50 000 – 75 000 Dalton, während die leichten Ketten ein Molekulargewicht von ca. 25 000 Dalton beitzen (JANEWAY & TRAVERS 2002). Sowohl die schweren als auch die leichten Ketten setzen sich aus unterschiedlichen Domänen zusammen. Die leichten Ketten besitzen dabei eine variable und eine konstante Region, während die schweren Ketten neben der variablen Domäne je nach Isotyp 3 (IgG, IgA, IgD) bzw. 4 (IgM und IgE) konstante Domänen und für die Immunglobuline mit 3 konstanten Domänen eine Hinge-Region besitzen. Die Hinge-Region ermöglicht den Antigen bindenden Bereichen (Fab), unterschiedliche Winkelungen einzunehmen, ohne die Antigenspezifität durch Konformationsänderung zu verlieren. Durch enzymatische Spaltung mit Papain können Antikörpermoleküle in drei Fragmente gespalten werden: zwei identische Fragmente, die die Antigenbindungsfähigkeit besitzen (Fab-Fragmente; Fragment antigen binding) und ein nicht antigenbindendes Fragment, das sich leicht kristallisieren lässt (Fc-Fragment; Fragment crystallizable). Die Antigenbindungsstelle ergibt sich aus der dreidimensionalen Struktur der Fab-Region, die durch ihre Aminosäuresequenz bestimmt wird. Da die Bindung des Antigens an den Antikörper auf der Ausbildung heteropolarer, nicht-kovalenter Bindungen beruht, ist eine enge strukturelle Übereinstimmung von Epitop (Bindungsbereich des Antigens) und Paratop (Bindungsbereich des Antikörpers) notwendig. Die einzelnen an der Bindung beteiligten Kräfte, Wasserstoffbrückenbindungen, Van der Waals Kräfte, hydrophobe Interaktionen, sowie elektrostatische Kräfte, sind alle reversibel, und einzeln genommen nur sehr schwache Bindungen. Nur die Summe dieser Kräfte, sowie die Eigenschaft der Immunglobuline, mindestens zwei identische Bindungsstellen zu besitzen, erklärt deren hohe Affinität zu ihrem Bindungspartner und somit ihre biologische Kompetenz, geringe Antigenmengen selektiv zu binden. 15 Literaturübersicht Die Vielfältigkeit der Antigenbindungsstelle wird v.a. durch die drei (sechs im gesamten Paratop) so genannten complementarity determining regions (CDR) gebildet, die auch als hypervariable Bereiche bezeichnet werden. Die Fc-Region bestimmt die Sekundärfunktionen des Antikörpers, z.B. Komplementbindung und Interaktionen mit spezifischen Rezeptoren (Fc-Rezeptoren), zumeist erst nach Antigenbindung. Aufgrund biochemischer Parameter unterscheidet man fünf Klassen an Immunglobulinen: IgM, IgG, IgD, IgE und IgA und Subklassen wie IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 bzw. IgA1 und IgA2 (JANEWAY & TRAVERS 2002). Die Ig-Klasse bzw. Subklasse wird durch die Aminosäuresequenz der konstanten Domäne der schweren Ketten bestimmt. Nach serologischen und funktionellen Parametern spricht man statt von Klassen und Subklassen nur von Immunglobulin-Isotypen, die durch die Antigenität dieser Moleküle bestimmt werden. Bei den leichten Ketten werden zwei Typen unterschieden, die als lambda (λ) oder kappa (κ) bezeichnet werden. Das Verhältnis von λ- zu κ- Ketten beträgt beim Menschen 2:3. Auch beim Pferd konnten entsprechende lambda und kappa Ketten gefunden werden (MONTGOMERY 1973), deren Verhältnis bei 12:1 liegt (GIBSON 1974, HOME et al. 1992, FORD et al. 1994). Im Rahmen der Arbeiten von Frau Dr. Wagner zum Ig-System des Pferdes (OVERESCH et al. 1998; WAGNER et al. 1995, 1997 & 1998) ist es gelungen, erstmals den konstanten Bereich der schweren Kette des equinen IgE vollständig und monoklonal zu exprimieren und zwar in Form eines spezifischen Antikörpers gegen ein Hapten (NIP = Nitrophenol). Somit steht ein monoklonales eqIgE mit definierter Haptenspezifität zur Verfügung. Unter Verwendung der gleichen Methode entwickelt Frau Wege die bisher fehlenden equinen IgG Isotypen. Auf Grund der beteiligten murinen Ketten, welche die Spezifität der equimurinen Antikörper bestimmen, detektieren auch diese Isotypen NIP. Ein aktualisiertes Bild der equinen Antikörperklassen steht somit zur Verfügung: 16 Literaturübersicht 2.1.1 Immunglobulinsystem des Pferdes Erste Untersuchungen zum Immunglobulinsystem des Pferdes wurden Mitte der sechziger bis Anfang der siebziger Jahre des 20. Jahrhunderts durchgeführt. Zu dieser Zeit galt das Interesse allerdings nicht dem Pferd an sich. In der Humanmedizin dienten Pferdeseren als Antikörperquelle zur passiven Immunisierung (Hyperimmunseren), beinhalteten aber das Risiko der „Serumkrankheit“, einer Allergie vom Typ III gegen Proteinbestandteile des equinen Serums bei wiederholter Applikation. Ziel war es daher, Antikörper möglichst von solchen Serumbestandteilen reinigen zu können. Anhand der Serumelektrophorese zeigte sich, dass sich das „Gesamtimmunglobulin“ in verschiedene Fraktionen auftrennen ließ. So konnten bereits IgM (ROCKEY et al. 1964; HILL & CEBRA 1965), IgA ( VAERMANN et al 1971, MC GUIRE et al. 1973), sowie vier IgG-Isotypen (IgGa, IgGb, IgGc, IgG(T)) (ROCKEY et al. 1964; MONTGOMERY 1973; MC GUIRE et al. 1973) differenziert werden. SUTER & FREY präparierten 1983 equines IgE aus Serum endoparasitisch stark infizierter Fohlen und gaben dessen Reinheitsgrad mit 83% an. Antiseren aus mit dieser IgE-haltigen Präparation immunisierten Kaninchen zeigten Kreuzreaktionen mit humanem, murinem und Ratten IgE. Die ersten Forschungsarbeiten, die sich mit equinen Immunglobulinen beschäftigten, basierten auf serologischen und biochemischen Parametern. Dabei wurden unterschiedliche Aufreinigungsverfahren angewandt, wie zum Beispiel die DEAE- CelluloseSäulenchromatografie aus der γ-Globulinfraktion aus Pferdeserum (HELMS & ALLEN 1970), die Ionenaustauschchromatographie (WIDDERS et al. 1986) oder aber Aufreinigung über die unterschiedliche Protein A und G Bindung (SHIMAZAKI & NAKAJIMA 1987). Bei diesen Verfahren trat wiederholt das Problem der Kontaminationen mit anderen Immunglobulin-Isotypen auf. Mitte der neunziger Jahre erwachte neues Interesse an den Immunglobulin-Isotypen des Pferdes. Die Analyse der Organisation der Gensegmente für die konstanten Regionen der schweren Ketten (cH-Gene) der equinen Immunglobuline (WAGNER et al. 1998) ergab, dass das Pferd neben je einem IgM, IgE und IgA die genetische Information für mindestens sechs IgG Subtypen besitzt. Damit hat das Pferd nach dem Schwein die größte Anzahl an cγ Genen aller bisher untersuchten Säugetierspezies. Für jeden dieser Genabschnitte konnten ebenso korrespondierende Switch Regionen nachgewiesen werden, deren Nukleotidsequenz es nahelegt, dass alle exprimiert werden (können). Drei der IgG-Isotypen (IgG1 (bisher bezeichnet als IgGa), IgG3 (IgGT) und IgG4 (IgGb)) konnten in equi-murinen HeteroHybridoma-Zellen exprimiert werden, indem equine Lymphozyten mit Maus-Myelomzellen 17 Literaturübersicht fusioniert wurden. Die übrigen, fehlenden IgG-Isotypen (IgG2, IgG5, IgG6) können seit kurzem in einem Säugetierexpressionssystem produziert werden. Dafür wurde das System mit den konstanten schweren Ketten der fehlenden Immunglobulinisotypen des Pferdes transfiziert. Die murine Ursprungszelle stellt die variable Domäne der Schweren Kette sowie die leichte Kette her. Das entstehende Konstrukt ist also ein zusammengesetztes Immunglobulin mit murinen leichten Ketten sowie der variablen Domäne der schweren Ketten, die übrigen Anteile der schweren Kette stammen aus dem Pferdegenom. Da die gesamte für die Antigenbindung verantwortlichen Bereiche aus der Maus stammen, ist das Paratop dieser drei Produkte identisch. Es determiniert für die Bindung von 4-(hydroxy-3nitro-phenyl)acetyl (NP). Die so gewonnenen Isotypen stehen somit erstmalig zur Verfügung um monoklonale anti-Isotyp Antikörper zu generieren und funktionelle Effektorfunktionen im equinen System zu bestimmen. Historische Bezeichnung der Immunglobulinisotypen des Pferdes auf Grund serologischer bzw. biochemischer Untersuchungen IgM - IgGa - IgG(T) IgA - IgGb - IgG(B) IgE - IgGc IgGa, b, c: Diese Unterteilung erfolgte schon 1964 durch ROCKEY, der ihre unterschiedliche elektrophoretische Mobilität feststellte. IgG(T): Dieser IgG-Isotyp wurde erstmals im Serum von Pferden gefunden, die mit Tetanustoxoid immunisiert worden waren, weshalb es ursprünglich als IgT bezeichnet wurde (VAN DER SCHEER & WYKHOFF 1940). Erst später haben WEIR et al. (1966) es als ein IgG identifiziert und es in IgG(T) umbenannt 18 Literaturübersicht IgG(B) oder AI: Die Zuordnung des von ROCKEY et al. (1964) beschriebenen Globulins wurde ebenfalls kontrovers diskutiert. Es wurde auch als „atypisches Makroglobulin“ (SANDOR et al. 1964) oder „aggregating immunoglobulin“ (AI) (ZOLLA & GOODMAN 1968) bezeichnet. Serologische (HELMS & ALLEN 1970) sowie strukturelle Eigenschaften dieses Immunglobulins (SEIDE et al. 1987) zeigten allerdings seine Zugehörigkeit zur Klasse der IgGs. So konnten insgesamt fünf equine IgG-Isotypen (IgGa, IgGb, IgGc, IgG(T) und IgG(B)) mit Hilfe serologischer und biochemischer Verfahren definiert werden (MC GUIRE et al. 1973; WIDDERS et al. 1986). Ein IgD konnte bisher beim Pferd weder auf genetischer Ebene, noch im Serum zuverlässig nachgewiesen werden. Jüngste unveröffentlichte Studien werden diese Lücke jedoch bald hinreichend füllen (persönliche Kommunikation WEGE). Bei Mensch und Maus kommt dem Immunglobulin-Isotyp IgE eine zentrale Bedeutung in der Allergie vom Typ I zu: IgE bindet über einen hochaffinen Rezeptor (FcεRI) bereits unkomplexiert an die dominierenden Typ I Effektorzellen (Mastzellen, basophile Granulozyten). Spezifische Antigenbindung an die zellständigen IgE-Moleküle führt, sofern diese in ausreichender Dichte vorhanden sind, zu einer Kreuzvernetzung der Immunglobuline und Zusammenlagerung der Fcε-Rezeptoren. Hierdurch wird die Zelle aktiviert und es erfolgt die Degranulation präformierter Entzündungsmediatoren sowie die Neusynthese und Freisetzung weiterer Mediatoren. Anzahl und Anordnung der IGH-Gene beim Equiden Die frühen serologischen und biochemischen Differenzierungen der Pferdeimmunglobuline wurden in den letzten Jahren durch die Untersuchung der Gene ergänzt, die für die Pferdeimmunglobuline codieren. Dabei konnten die unterschiedlichen Immunglobulin-Isotypen ihrem entsprechenden Gen zugeordnet werden (WAGNER et al. 1998). Zur Vereinfachung wurde auf dem Immunoglobulin und Fc-Rezeptor Workshop in Uppsala, Schweden 2001 eine neue Nomenklatur festgelegt. 19 Literaturübersicht Tab. 1 Nomenklatur des equinen Immunglobulinsystems Ig-isotypen alte Nomenklatur Ig-isotypen neue Nomenklatur(a) IGH Gene (b) GenBank accession number IgM IgM IGHM L49414 IgGa IgG1 IGHG1 AJ302055 IgG2 IGHG2 AJ302056 IgG(T) IgG3 IGHG3 AJ312379 IgGb IgG4 IGHG4 AJ302057 IgG5 IGHG5 AJ312380 IgG6 IGHG6 AJ312381 IgE IgE IGHE AJ305046 IgA IgA IGHA nt IgG(T) IgGc (c) (c) (a) Die neue Nomenklatur wurde im Immunoglobulin und Fc-receptor Workshop in Uppsala, Schweden 2001 festgelegt (http://medicine.uiowa.edu/CigW). (b) Die offizielle IGH Nomenklatur, festgelegt auf der internationalen ImMunoGeneTics database (IMGT) (http://imgt.cines.fr). (c) konnte auf Grund der in der Doktorarbeit von Anja Wege hergestellten rekombinanten Imunglobulin G Isotypen zugeordnet werden Bei der Untersuchung der Anordnung der unterschiedlichen IGHG-Gene, konnte folgende Reihenfolge festgestellt werden: 5´ VDJ- IGHM - IGHG1 – IGHG2 - IGHG3 - IGHG4 - IGHG5 - IGHG6 - IGHE - IGHA 3´ (WAGNER et al. 1997 u. 1998) Die Benennung der IGHG-Gene erfolgt hier nach der Reihenfolge im Genom. Für alle sechs IGHG-Gene konnte eine S-Region (switch-region; für den Klassenwechsel essentiell) nachgewiesen werden (OVERESCH et al. 1998). Es steht zu vermuten, dass die sechs IGHGGene des Pferdes auch in vivo exprimiert werden. Inzwischen wird ein siebtes IGHG-Gen untersucht, zum Zeitpunkt dieser Dissertation bezieht sich diese Aussage nur auf persönliche Kommunikation (WAGNER, WEGE) Dass bisher nur 5 unterschiedliche IgG`s mit biochemischen und serologischen Verfahren im Serum von Pferden nachgewiesen werden konnten, liegt vermutlich an der seltenen Expression und daher an den geringen Mengen einiger Isotypen im peripheren Blut. Eine 20 Literaturübersicht andere Erklärung wäre auch eine große Homologie innerhalb der unterschiedlichen Isotypen und daraus resultierend ähnliche biochemische Eigenschaften, so dass es z.B. in der Elektrophorese nicht zu einer Auftrennung kommen kann. Für diese Annahme sprechen auch die Forschungsarbeiten von SHEORAN & HOLMES (1998), die IgG(T) in 2 Fraktionen aufteilen konnten, indem sie eine Aufreinigung über Protein A und G vornahmen. Eine Fraktion zeigte dabei eine hohe Bindungsaffinität an Protein A, während die andere Fraktion nur schwach daran binden konnte. Demnach dürfte das Pferd tatsächlich über mindestens sechs unterschiedliche als vollständige Antikörper exprimierte IgG-Isotypen verfügen. Sequenzen der unterschiedlichen IGHG Gene beim Pferd Bei allen sechs IGHG-Genen zeigt sich eine große Homologie innerhalb der einzelnen CHDomänen, die zwischen 58% (zwischen der CH1 Domäne von IgG3 und IgG5) und 94% (zwischen der CH1 Domäne von IgG4 und IgG6) liegen. Die größte Variabilität innerhalb der IGHG-Gene findet sich in der Hinge-Region der Immunglobuline. Sie liegt zwischen 8% (IgG4 zu IgG3) und 53% (IgG4 zu IgG5 und IgG6) (Wagner et al. 2002). Tab. 2 Homologie zwischen den einzelnen IgG Isotypen des Menschen bzw. des Pferdes Anzahl der IgG Isotypen Homologie der Ch Domänen der IGHG Mensch 4 - 95% Pferd 6 (7) 58-94% 2.1.2 Homologie innerhalb der Hinge-Region 8-53% Sekundärfunktionen von Antikörpern IgG ist der häufigste Isotyp im Blut fast aller Säuger und kommt in hohen Konzentrationen im Serum und anderen extrazellulären Flüssigkeiten sowie auch auf Schleimhautepithelien im Darm und im respiratorischen Trakt vor. Damit können sie wichtige Aufgaben insbesondere durch die Interaktion mit unterschiedlichen Fc gamma (Fcγ)-Rezeptoren (DOMBROWICZ et al. 1997; DAERON 1997) ausüben. Dazu gehören u.a. die Opsonierung von Pathogenen für die Aufnahme von Phagozyten, Neutralisation von Toxinen, Sensibilisierung von Mastzellen, die Aktivierung von B-Zellen zur Antikörperproduktion (RAVETCH & KINET 1991) und die Aktivierung des Komplementsystems (DUNCAN & WINTER 1988). Welche IgG21 Literaturübersicht Isotypen welche Funktionen übernehmen können und an welche Rezeptoren diese binden, ist für den Menschen und für die Maus bereits nachgewiesen (JANEWAY & TRAVERS 2002). Für andere Tierarten, inklusive der Equiden, liegen nur wenige oder gar keine Untersuchungen vor. Die unterschiedlichen IgG-Isotypen dienen auch zur gegenseitigen Regulation, indem sie entweder durch Bindung an unterschiedliche Rezeptoren und Zielzellen wirken oder aber über den so genannten negativen Rückkopplungsmechanismus die weitere Expression von Antikörpern inhibieren. Dabei bewirkt eine große Anzahl löslicher Antikörper eine Suppression der Immunglobulin produzierenden B-Zellen. Durch eine hohe Konzentration von freien Antikörpern werden die Epitope der Antigene abgedeckt und verhindern damit die weitere Bindung von Epitopen an B-Zell-Rezeptoren. Zusätzlich kann ein immunkomplexiertes Antigen über inhibitorische Fcγ-Rezeptoren und den BCR selektiv zu einer Hemmung der B-Zelle führen. Damit werden diese Zellen nicht weiter aktiviert und stellen die Produktion neuer freier Antikörper ein. Komplementsystem-Aktivierung Beim Menschen gehören IgG1 und IgG3 zu den Hauptaktivatoren des Komplementsystems (DILLMAN et al. 1995), während bei der Maus auch das IgG2a (DUNCAN et al. 1988, RAJNAVOLGYI et al. 1995) diese Funktion besitzt. Die Effektivität der Aktivierung ist dabei abhängig von der Aminosäuresequenz und der Glykolisierung der CH2-Domäne (THOMMESEN et al. 2000). Beim Pferd konnte die Aktivierung durch IgGa, b, c nicht aber durch IgG(T) und IgGc nachgewiesen werden (MCGUIRE et al. 1973). Die Aktivierung der Komplementkaskade löst verschiedene Funktionen aus, wie zum Beispiel die Lyse der Zielzelle, die Aktivierung von Makrophagen oder die Opsonierung von Antigenen durch die Anlagerung von C3b und C4b, die damit die Phagozytose erleichtern. Auch bei der Beseitigung von Immunkomplexen (Antikörper gekoppelt an Toxine oder Reste von toten Mikroorganismen) spielen aktivierte Komplementkomponenten eine wichtige Rolle, da durch ihre Bindung an die Immunkomplexe diese an Erythrozyten gekoppelt werden können (CR1 oder CD35: complement receptor 1). Die so beladenen Erythrozyten gelangen dann zu Milz und Leber. Dort entfernen und phagozytieren Makrophagen die Komplexe von der Oberfläche der Erythrozyten ohne diese zu beschädigen. 22 Literaturübersicht Fc Rezeptor-Bindung Besonders wichtig für die Funktion der IgG Isotypen ist ihre Fähigkeit, an Fc-Rezeptoren binden zu können. Unter anderem können IgG Isotypen nachdem sie an ein freies Antigen (z.B. Viruspartikel) gebunden haben, Bindung mit Fcγ-Rezeptoren auf phagozytierenden Zellen eingehen und diese dadurch aktivieren. Auch das Erkennen von Antigen auf infizierten Zellen erfolgt über die Bindung von Immunglobulinen, die dann an Fc-Rezeptoren auf Natürlichen Killerzellen binden können. Diese als ADCC (antibody dependent cellular cytotoxity) bezeichnete Reaktion führt entweder durch Apoptoseinduktion z.B. über Fas/Fas-Ligand-Interaktion oder durch Freisetzung toxischer Stoffe (Perforin, Granzyme) zum Abtöten der infizierten Zelle. Da diese Aktivierung auch eine entzündliche Reaktion und damit auch Gewebeschäden auslösen kann, ist es notwendig, dass die Fc-Rezeptoren auf diesen Zellen Antikörper, die an ein Pathogen gebunden haben, von der großen Zahl der ungebundenen IgG`s unterscheiden können. Bei den IgG Isotypen erfolgt nach der Bindung an ein Antigen eine Konformationsänderung im Fc-Teil und erst dadurch wird es ihnen ermöglicht, an die FcγRezeptoren der Phagozyten zu binden. Je nach Immunglobulin-Isotyp konnten bei Maus und Mensch unterschiedliche FcRezeptoren nachgewiesen werden (FcαR, FcγR, FcµR, FcεR). Diese werden auf unterschiedlichen Zellen exprimiert und weisen große Unterschiede in ihrer Funktion und Bindungsaffinität auf. Bei Maus und Mensch konnten drei Fcγ-Rezeptor-Typen nachgewiesen werden (UNKELESS et al. 1988; RAVETCH & KINET 1991), die eine unterschiedliche Affinität zu den einzelnen IgG-Isotypen aufweisen (VAN DE WINKEL & CAPEL 1993). FcγRI (CD64): Der FcγRI gehört zu den hochaffin bindenden Rezeptoren und wird auf Monozyten und Makrophagen exprimiert. Auf neutrophilen Granulozyten und Mastzellen kann er durch IFN-γ induziert werden (OKAYAMA et al. 2000). Er besitzt beim Menschen eine hohe Affinität zu IgG1 und IgG3 und bei der Maus für IgG2a, IgG3 und IgG1. Im equinen System wurde bisher kein äquivalenter Rezeptor beschrieben. 23 Literaturübersicht FcγRII (CD32): FcγRIIa und FcγRIIb gehören zu den niederaffinen Rezeptoren, die auf Makrophagen, Neutrophilen, Eosinophilen, Thrombozyten, Basophilen und B-Lymphozyten exprimiert werden und alle humanen IgG-Isotypen aber nur die murinen IgG1 und IgG2b binden können. Sie unterscheiden sich auch im Aufbau von den anderen Fcγ-Rezeptoren, da sie monomer sind und entweder aktivierend (FcγRIIa) oder hemmend (FcγRIIb) auf die Zellen wirken (RAVETCH & CLYNES 1998). In einer Veröffentlichung von AGGARWAL wurden zwei monoklonale Antikörper beschrieben, die in Analogie zum humanen System Fc-Rezeptoren des Pferdes binden - eine Zuordnung, ob CD32 oder CD16 entsprechende Strukturen gebunden wurden, fehlt zur Zeit (AGGARWAL et al. 2000). FcγRIII (CD16): Er wird auf natürlichen Killerzellen, Neutrophilen, Eosinophilen und Makrophagen exprimiert und zeichnet sich ebenfalls durch eine niedrige Affinität aus. Beim Menschen kann er IgG1 und IgG3, bei der Maus IgG2a und IgG2b binden. (RAVETCH & KINET 1991). FcεRI : Dieser Immunglobulinrezeptor hat die höchste bisher beschriebene Affinität zu seinem Liganden (IgE) mit 1010 M-1. Auf Grund der hohen Bindungsstärke lagert sic bereits freies IgE an diesen Rezeptor an und sensibilisiert so Zellen, die diesen Rezeptor exprimieren. Obligat wird er von Basophilen und Mastzellen gebildet. Nach Aktivierung sind aber auch Eosinophile, Neutrophile, dendritischen Zellen sowie deren Vorläufer, die Monozyten in der Lage, den FcεRI zu exprimieren (Sihra et al. 1997). Der funktionelle membranständige FcεRI besteht aus 3 verschiedenen Ketten. Die α-Kette ist der eigentliche Rezeptor für das Fc-Fragment des IgE. Weiterhin findet man eine β-Kette mit vier transmembranösen Schleifen, wobei die Carboxy- und Amino-terminalen Aminosäuren intracytosolisch liegen. Zur Signaltransduktion dient ein Homodimer der γ-Kette, deren intracytosolischer Bereich jeweils eine ITAM-Sequenz aufweist (immunoreceptor tyrosinebased activation motif). Inzwischen wird bereits der Bindung von monomerem IgE eine Signalwirkung zugeordnet, da die Expressionsdichte von FcεRI sowie das Überleben von Mastzellen von der Anwesenheit bzw. Bindung von IgE an diesen Rezeptor abhängt (MACGLASHAN et al, 1999, KITAURA et al, 2003). Beim Pferd wurde die Sequenz der αKette durch MCALEESE et al. im Jahr 2000 publiziert, 2003 konnte die gleiche Arbeitsgruppe die cDNA für die β- und γ-Kette des Rezeptors sequenzieren (MCALEESE et al. 2000; MCALEESE & MILLER 2003) 24 Literaturübersicht FcεRII (CD23): Dieser niederaffine Rezeptor für IgE ist der einzige Fc-Rezeptor, der nicht zur Superfamilie der Immunglobulin-Gene gehört. Seine Struktur ähnelt Typ 2 Lektinen, das carboxyterminale Ende liegt extrazellulär (C-type lectins). Seine Fähigkeit zur Polymerisation ermöglicht erst die Bindung von IgE, Monomere zeigen eine zu geringe Affinität. Dieser Rezeptor wird von einer Reihe von Zellen inklusive Monozyten, Makrophagen, Eosinophilen, Basophilen, TZellen und als Bestandteil des B-Zell-Rezeptor-Komplexes auch von B-Zellen exprimiert (DIERKS et al, 1993). Bei letzteren ist er wichtig für die Aufnahme löslicher Antigene und deren Präsentation an CD4+ T-Zellen (GROSJEAN et al, 1994). Bei den übrigen Zellen kann durch ihn die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies, die Pinosowie die Phagozytose induziert werden. Das extracytosolische Spaltprodukt wird auch als IgE-binding factor (IgE-BF) in der Literatur gefunden (YODOI et al, 1989). Wie wichtig die Fc-Rezeptorbindung für die Immunkompetenz eines Individuums ist, zeigten Studien an Mäusen, denen die genetische Information für die gamma Einheit des FcRezeptors fehlte. Diese wiesen eine starke Immunsuppression mit reduzierter Effektivität der natürlichen Killerzellen, der Makrophagen, der Phagozyten und auch der Mastzellen auf (TAKAI et al. 1994). Auch die Erforschung der equinen Fc-Rezeptorbindung wird unter anderem durch die Entwicklung monoklonaler Antikörper gegen bestimmte Rezeptoren weiter vorangetrieben (AGGARWAL et al. 2000). Dabei konnten zwei Fcγ-Rezeptoren, die äquivalent zu den bei Maus und Mensch gefundenen FcγRII und FcγRIII sind, beim Pferd nachgewiesen werden. Durch die Verwendung dieser mAK konnte die Fcγ-Rezeptor abhängige Rosettenbildung zwischen Schaferythrozyten und equinen PBMC`s inhibiert und damit die Spezifität der Antikörper nachgewiesen werden. Vergleichende Untersuchungen der Aminosäuresequenz von IgG Isotypen bei Mensch und Pferd lassen vermuten, dass IgG1, IgG3 und IgG6 an Fcγ Rezeptoren binden können (WAGNER et al. 2002b) und damit wichtige Funktionen in der Immunantwort spielen. Für das humane IgG1 konnten 17 Aminosäuren in der CH2 Domäne bestimmt werden, die für die Bindung an Fcγ-Rezeptoren wichtig sind (SONDERMANN et al. 2000). 16 dieser Aminosäuren fand man auch in der CH2 Domäne des equinen IgG1 und 15 in der CH2 Domäne des IgG3. Besonders wichtig für die Bindungsaffinität an die Fcγ-Rezeptoren scheint hierbei das Leucin (235) zu sein, das, wenn es Glu235 ersetzt, die Affinität des murinen IgG2b um das 100fache steigern konnte (DUNCAN et al. 1988). Dieses Leucin findet sich nur beim equinen IgG1, IgG3 und IgG6, nicht allerdings bei den anderen drei IgG Isotypen (WAGNER et al. 2002b). 25 Literaturübersicht 2.2 Allergie 2.2.1 Physiologische Immunmechanismen als Grundlage der überschießenden Reaktionen bei Allergien Sämtliche Immunmechanismen, aus denen sich nach heutigem Verständnis das klinische Bild einer Allergie entwickeln kann, finden im Rahmen physiologischer Prozesse ihre Entsprechung. Die Initiation der jeweiligen Immunmechanismen ist immer Bestandteil einer adaptiven Immunantwort, während die reaktiven, häufig inflammatorischen Prozesse eher dem angeborenen Ast des Immunsystems angehören. Immunmechanismen, die sich, entgegen ihrer eigentlichen Bestimmung, inadäquat, oft in überschießendem Maße gegen Antigene richten und so zur Erkrankung des Individuums führen, bezeichnet man daher als Allergien. Sie sind somit Hypersensibilitäts- oder Überempfindlichkeitsreaktionen. Die vom Immunsystem mit einer solchen überschießenden Reaktion beantworteten Antigene werden als „Allergene“ bezeichnet. Diese Allergene sind zumeist exogene Antigene, deren Herkunft pflanzlicher, tierischer oder, im Einzelfall anorganischer Natur sein kann. Wenn sich die Antwort des Immunsystems gegen körpereigene Antigene richtet, grenzt man die Allergie (exogene Antigene) gegen die Autoagression ab (endogene Antigene). GELL und COOMBS (1968) teilten die Allergien in vier Typen ein und unterschieden dabei grob Antikörper vermittelte Immunreaktionen (Typen I bis III) von Antikörper unabhängigen, Zell vermittelten (Typ IV). Diese Formen von Immunmechanismen haben primär wichtige physiologische Bedeutungen. Aus weitgehend noch unbekannten Gründen können diese lebens- und funktionserhaltenden Mechanismen „überschießend“ ausgeführt und so zu Pathomechanismen werden. Eine Typ V Allergie, deren Antikörper abhängiger Pathomechanismus sich deutlich von den anderen Typen unterscheidet, hat bisher noch keinen allgemein gültigen Eingang ins Schrifttum gefunden. Typ I-Allergien sind die Allergien vom Soforttyp, bei denen die klinischen Symptome in der Regel sehr schnell, meist innerhalb von Minuten (selten Stunden) nach dem Allergenkontakt auftreten. Diesem Mechanismus können protektive, regulatorische aber auch überschießende immunologische Reaktionen zugeordnet werden (COSTA et al. 1997). Im Rahmen der immunologischen Antwort eines Individuums gegen ein Antigen synthetisieren B-Zellen, unter Einfluss von TH2-Zellen und deren Signalmolekülen (Interleukinen) allergenspezifisches IgE. Dieses IgE wird, im Gegensatz zu anderen Immunglobulinen, schon in unkomplexierter Form über den hochaffinen Fcε-Rezeptor I 26 Literaturübersicht (FcεRI) auf der Oberfläche von v.a. Mastzellen und basophilen Granulozyten gebunden. Diese zwei Zelltypen exprimieren diesen Rezeptor obligatorisch, während er auf einigen anderen Zellen induziert werden kann (FROESE 1984). Freies Serum-IgE hat eine Halbwertszeit von wenigen Tagen. Ungebunden liegt IgE im Vergleich zu anderen Immunglobulin-Isotypen in sehr geringen Konzentrationen im Serum vor. Allerdings ergeben sich hier tierartliche Unterschiede in stärkerem Maße, als bisher vermutet. (IgE Spiegel aus WAGNER et al. 2002) Ein wesentlicher Grund für den niedrigen IgE Spiegel ist die Bindung an FcεRI, denn frei verfügbares IgE induziert diesen Rezeptor (FURUICHI et al. 1985; KUBO et al. 2001). Durch die Expression neuer Rezeptoren für IgE wird der Serumspiegel an IgE gesenkt. In letzter Zeit konnten verschiedene Arbeitsgruppen zeigen, dass bereits die Bindung von freiem IgE an seinen Rezeptor eine Signaltransduktion hervorruft (CHARLES et al. 2004). Bereits diese Bindung trägt zur Aktivierung, der Rezeptorexpression sowie zum Überleben der allergischen Effektorzellen bei (KITAURA et al. 2003). Dieser autokrine Verstärkungsmechanismus der FcεRI Expression ist initial nur vom Isotyp, also dem IgE abhängig. Eine fortgesetzte Präsenz des Antigens (Allergens) kann aber eine positive Rückkopplung des Typ I Immunmechanismus bewirken, indem allergenspezifische B-Zellen iterativ aktiviert werden. Die notwendigen Zytokine werden von Basophilen und/oder Mastzellen selbst zur Verfügung gestellt (GAUCHAT et al. 1993; YANAGIHARA et al. 1998). Als Folge dominieren jene IgE-Idiotypen den Serumpool, deren B-Zellen wiederholt oder dauerhaft aktiviert werden. Kommt es im weiteren zu einem erneuten Kontakt des Individuums mit dem Allergen, so führt dessen Bindung an die spezifischen zellständigen IgE-Moleküle der sensibilisierten Mastzellen oder Basophilen zu einer Kreuzvernetzung dieser Immunglobuline, sofern sie auf der Zelloberfläche in ausreichender Dichte vorhanden sind. Die so herbeigeführte Zusammenlagerung der Fcε-Rezeptoren aktiviert die Zelle, die zum einen innerhalb von Sekunden mit Degranulation präformierter Entzündungsmediatoren (u.a. Histamin, Proteoglykane, Proteasen) aus zytoplasmatischen Granula reagiert (Sofortreaktion). Zudem werden Arachidonsäuremetaboliten, wie bestimmte Leukotriene (Lipoxygenasemetaboliten; v.a. LTC4, LTD4, LTE4) und Prostaglandine (Cyclooxygenasemetaboliten; v.a. PGD2), aber auch Zytokine (u.a. IL4, TNFα) neu synthetisiert und ausgeschüttet. Diese erhalten die Entzündungsreaktion über Stunden aufrecht (Spätreaktion). Im gesunden Individuum besiedeln die Mastzellen die Lamina propria der Schleimhäute sowie die Subcutis der Epidermis. Wie auch der Basophile entstehen die Mastzellen im Knochenmark. Während ihres Aufenthaltes im peripheren Blut beladen sich die Zellen mit 27 Literaturübersicht monomerem IgE und verlassen derart sensibilisiert die Blutbahn. Dementsprechend werden die Fcε Rezeptoren mit einem zum Zeitpunkt der Beladung repräsentativem Querschnitt aller IgE - Idiotypen im Serum ausgestattet .Im Gewebe können diese Zellen dann bei erneutem Kontakt zu einem Antigen, gegen das sie spezifische Immunglobuline gebunden haben, degranulieren. Mastzellen stellen somit einen wesentlichen Anteil der „first line of defense“ dar. Die freigesetzten Mediatoren bewirken im Gewebe eine lokale Begrenzung der Antigenverteilung, indem sich der Blutfluss im irritierten Bereich verlangsamt und die Exsudation von Plasma sich erhöht. Es kommt zur Ödembildung. Im Folgenden werden weitere Leukozyten chemotaktisch angelockt. Es etabliert sich eine Entzündung. Seine physiologische Bedeutung hat dieser Mechanismus v.a. im Zuge der Immunantwort auf parasitäre Infektionen (Helminthen). Er ist aber auch bei der Abwehr anderer Pathogene, inklusive bakterieller, beteiligt. Kommt es zur Ausprägung pathologischer Hypersensibilitätsreaktionen unter diesem Mechanismus können diese lokal beschränkt, aber auch systemisch ablaufen. Beispiele für Typ I Allergien des Menschen sind die allergische Rhinitis (Heuschnupfen), das Asthma, aber auch die systemische Anaphylaxie bis hin zum allergischen Schock. Eine Aktivierung der Zellen zur Mediatorfreisetzung ist allerdings nicht alleine auf eine IgEVermittlung beschränkt. Auch andere Substanzen sind über spezifische Rezeptoren, z.B. IgG über FcγRI, IIa und III, in der Lage, eine Degranulation sowie die Neusynthese der Mediatoren auszulösen. Untersuchungen bei allergischen Reaktionen haben bei Maus und Mensch gezeigt, dass hier verschiedene IgG-Isotypen beteiligt sind. Entsprechende Fcγ-Rezeptoren, die die Bindung von IgG-Isotypen auf Mastzellen ermöglichen, konnten auf humanen Mastzellen nachgewiesen werden (OKAYAMA et al. 2000 & 2003). Weitere Untersuchungen haben gezeigt, dass bei der Maus das IgG1 (DOMBROWICZ et al. 1997) und beim Mensch das IgG4 (KIEKENS et al. 2000) eine modulatorische Rolle bei der Aktivierung der Effektorzellen der Typ I Allergie (Mastzellen, basophile Granulozyten) und damit bei der Freisetzung der allergischen Symptome auslösenden Mediatoren wie z.B. dem Histamin spielt. Nachgewiesen werden konnte dies im Mausmodell: Mäusen, denen das IGHE Gen fehlt und die somit nicht in der Lage sind, IgE zu produzieren, zeigten dennoch anaphylaktische Reaktionen und nachgewiesene Mediatorfreisetzung aus Mastzellen (OETTGEN et al. 1994). Im Mausmodell ebenfalls nachgewiesen, ist die inhibitorische Wirkung auf die IgE vermittelten allergischen Reaktionen durch bestimmte FcγRIIbRezeptoren nach der Bindung von IgG (UJIKE et al. 1999; KATZ et al. 2002). 28 Literaturübersicht Bei Typ II Mechanismen dagegen handelt es sich um durch Antikörper vom IgG- und IgMIsotyp vermittelte Immunmechanismen. Auf der Oberfläche partikulärer Antigene gebundenes IgG (Antigen-Antikörper-Komplex) kann Phagozyten über deren Fcγ-Rezeptoren dazu aktivieren, diese opsonisierten Antigene per Phagozytose zu eliminieren. Auf Zelloberflächen gebundenes IgG kann von NK-Zellen, die den FcγRIII exprimieren, erkannt werden, woraufhin diese die antikörpermarkierten Zielzellen zytotoxisch zerstören (antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC)). Ein dritter IgG-vermittelter Mechanismus ist die Aktivierung des klassischen Weges der Komplementkaskade über die Bindung von antigengebundenem IgG, und effektiver noch IgM, an C1q, einem von drei Proteinen im C1-Komplex. Die Aktivierung von C1q durch IgG erfordert jedoch eine ausreichend hohe Epitop- und Immunglobulindichte auf dem Pathogen, da dieser Komplementfaktor hierzu an mindestens zwei aktivierten Fc-Teilen komplementbindender Immunglobulinmoleküle binden muss. Im Rahmen dieser Allergie sind die Antikörper gegen zellassoziierte Antigene gerichtet und lösen entweder über Phagozyten und NK-Zellen oder über das Komplementsystem die charakteristischen Effektormechanismen aus. Ein Beispiel aus der Humanmedizin hierfür sind die Überempfindlichkeitsreaktionen gegen Penicillin, Methyldopa oder Chinidin. Diese Medikamente binden auf der Zelloberfläche von Erythrozyten oder Thrombozyten. Existieren spezifische Antikörper, die diese Medikamente erkennen, binden diese und lösen eine Komplementaktivierung aus, die zur Entfernung der betroffenen Blutzellen und somit zur immunhämolytischen Anämie bzw. Thrombozytopenie führt. Antikörper können ebenso gegen körpereigene Zell- oder Matrixantigene gebildet werden und sind unter dem Typ II-Mechanismus so die Ursache für Autoimmunerkrankungen, wie die autoimmune hämolytische Anämie, thrombozytopenische Purpura, Goodpasture-Syndrom, oder Pemphigus vulgaris. Auch bei Immunmechanismen vom Typ III sind Antikörper beteiligt. Im Gegensatz zu Typ II-Mechanismen sind die Antikörper jedoch gegen lösliche Antigene gerichtet, mit denen sie primär lösliche Immunkomplexe bilden. Die im Verlauf der physiologischen Immunreaktion gebildeten Antigen-AntikörperKomplexe aktivieren – wenn komplementbindende Isotypen beteiligt sind - das Komplementsystem (klassischer Weg), werden mit dessen Hilfe über den Komplementfaktor C3b an Erythrozyten angelagert (Komplementrezeptor 1) und zur Milz und Leber transportiert, wo sie von Makrophagen phagozytiert werden. Bei der Typ III-Allergie entstehen durch Antigenüberschuss relativ kleine Aggregate von Antigen-Antikörper-Komplexen. Durch diese wird das Komplementsystem schlechter aktiviert (mangels komplementbindender Antikörperisotypen) und deshalb werden diese 29 Literaturübersicht Immunkomplexe schlechter oder gar nicht an Erythrozyten gebunden, da diese zwar den Komplementrezeptor CR1, jedoch keine Fc-Rezeptoren haben. Dies führt zu einem verminderten Abbau kleiner Immunkomplexe. Diese freien Komplexe neigen dazu, sich an den Basalmembranen kleiner Gefäße abzulagern. Mastzellen können solche Komplexe binden (über FcγRIII) und dadurch aktiviert werden. Die TNFα-Freisetzung durch so aktivierte Mastzellen gilt als Hauptursache für die folgenden Entzündungsreaktionen (WATANABE et al. 1999; BAUMANN et al. 2001), da hierdurch Leukozyten in das Entzündungsgebiet gelockt werden. Über eine Verknüpfung von Fc-Rezeptoren und Komplementrezeptoren auf Leukozyten werden diese aktiviert und lösen im Folgenden eine Schädigung des umliegenden Gewebes aus. Ein klassisches Beispiel für die Typ III-Allergie ist die so genannte „Serumkrankheit“, die heute noch bei der Anti-Venin-Behandlung eine Rolle spielt. Serum von Pferden, die zuvor mit Schlangengift immunisiert wurden, dient dabei als Quelle für neutralisierende Antikörper bei der Behandlung von Schlangenbissen beim Menschen. Injizierte Bestandteile, insbesondere die Antikörper aus dem Pferdeserum, lösen eine adaptive Immunantwort des Empfängers mit Bildung anti equiner Antikörper aus, die bei wiederholter Applikation eines solchen Serums zur Immunkomplexbildung mit den zirkulierenden Antigenen führt. Diese massive Bildung von Immunkomplexen führt zu deren Ablagerung in Gefäßen, Nieren und Gelenken und somit zu autoagressiven Vasculitiden, Glomerulonephritis und Arthritiden. Auch Autoimmunerkrankungen können nach diesem Mechanismus ablaufen, z.B. bei der gemischten essentiellen Kryoglobulinämie (Antikörper gegen körpereigene Immunglobuline) oder dem systemischen Lupus erythematodes mit Bildung von ANA´s (Anti Nukleäre Antikörper: Antikörper gegen u.a. körpereigene Zellkernbestandteile wie DNS, Histonen oder anderen Nukleoproteinen). Letztlich besteht noch die Möglichkeit, dass Antikörper, ohne Beteiligung von Fcvermittelten Sekundärreaktionen allein durch ihre spezifische Bindung zur Erkrankung führen (Typ V-Reaktionen). Unter physiologischen Umständen erfüllen Antikörper neben ihrer vermittelnden Rolle im Rahmen der Opsonisierung und Komplementaktivierung auch ohne Beteiligung weiterer Faktoren, bestimmte Funktionen. So sind sie wichtig zur Neutralisation z.B. von Toxinen, oder beeinflussen über ihre Bindung an zellständige Rezeptoren z.B. die Produktion von weiteren Antikörpern. Bei einer Typ V Allergie können die im Rahmen von Infektionen gebildeten Antikörper mit körpereigenen Strukturen, z.B. Rezeptoren kreuzreagieren und diese z.B. stimulieren (TSHRezeptoren bei Basedow-Krankheit) oder blockieren (Acetylcholinrezeptoren bei Myasthenia gravis). 30 Literaturübersicht Auch in der Zell vermittelten Immunantwort (Typ IV Immunmechanismus) kann es, ohne Beteiligung von Immunglobulinen, zu Störungen im Sinne von Allergie oder Autoaggression kommen. Wird ein Antigen von den antigenpräsentierenden Zellen hierbei über MHCKlasse II an der Zelloberfläche gezeigt, werden dadurch CD-4-T-Zellen (T-Helferzellen) angesprochen. Pathogen- und milieuabhängig können sich die CD-4-Zellen daraufhin in mindestens zwei Richtungen, TH1 oder TH2, differenzieren und im Weiteren anhand der Sekretion charakteristischer Zytokine und Chemokine z.B. Makrophagen aktivieren und BZellen zur IgG-Produktion anregen (TH1) oder z.B. durch Einfluss auf die Differenzierung antigenaktivierter B-Zellen eine v.a. antikörpervermittelte Immunantwort auslösen (TH2). Im Verlauf von Überempfindlichkeitsreaktionen vom Typ IV erfolgt die Differenzierung der T-Helferzellen zu TH1-Zellen, bei Typ I-Allergien zu TH2. Altbekanntes Beispiel einer TZell vermittelten Allergie ist die Tuberkulinreaktion, aber auch Kontaktallergien, z.B. auf Pentadecacatechol, einer Substanz aus den Blättern des Gift-Sumach oder Metallionen, wie Nickel und Chrom fallen unter diese Kategorie. Eine Autoimmunerkrankung, die diesem Mechanismus folgt ist z.B. die gegen das basische Myelinprotein (MBP) gerichtete autoaggressive Reaktion, die zur multiplen Sklerose führt. Wird ein Antigen über MHC-Klasse I präsentiert, reagieren darauf CD-8-Zellen und differenzieren unter dem regulierenden Einfluss von T-Helferzellen zu zytotoxischen T-Zellen aus. Diese töten zum einen diese antigenpräsentierenden Zellen ab, können aber auch Zytokine sezernieren, die u.a. Makrophagen anlocken und aktivieren (IFNγ, TNFα, TNFβ). Lipidlösliche Allergene, wie Pentadecacatechol können über diesen Weg eine Gewebsschädigung verursachen, da sie die Zellmembran durchqueren können und Proteine im Zellinneren verändern. Als Peptide gelangen diese dann über das endoplasmatische Reticulum und MHC-Klasse I-Moleküle an die Zelloberfläche, wo sie von CD-8-Zellen erkannt werden. (JANEWAY und TRAVERS 2002) Diese hier beschriebene Klassifikation der Immunmechanismen (Typ I-V) wurde in die Veterinärmedizin übernommen, obwohl sie sich größtenteils auf Untersuchungen im humanen und murinen System stützt. In wie weit sich die zu Grunde liegenden Immunmechanismen auf andere Spezies, insbesondere auf das Pferd, in allen Einzelaspekten transponieren lassen, ist heute in weiten Teilen noch ungeklärt. 31 Literaturübersicht 2.2.2 Die saisonal rekurrierende atopische Dermatitis des Pferdes – das Sommerekzem Das Interesse an der Typ I Allergie wuchs, als die Häufigkeit dieser Erkrankung beim Menschen zunahm. Lange bevor die immunologichen Grundlagen einer Typ I Allergie erkannt wurden, berichteten französische Pferdehalter um 1840 von einer saisonal auftretenden Dermatitis (Lecoq 1842/43, Ref. in: UNKEL 1985). Zu dieser Zeit war das Sommerekzem in Indien ebenfalls bereits bekannt (DATTA, 1939, Ref. in: UNKEL 1985). Mittlerweile liegen vergleichbare symptomatische Beschreibungen aus allen Teilen der Welt vor, wenn auch mit den verschiedensten Bezeichnungen versehen (sweet itch, queensland itch, ardeurs, dermite estivale recidivante, Kasen). Dabei wird von erkrankten Pferden der verschiedensten Rassen berichtet. Araber scheinen ebenso betroffen zu sein, wie z.B. Quarter Horse, englische Vollblüter, deutsches Kaltblut, Haflinger oder Islandpferde. Sogar bei Eseln und Maultieren wird das Sommerekzem beschrieben. Eine eindeutige Rassendisposition besteht dabei nicht. Islandpferde stellen jedoch in Deutschland eine der stärker betroffenen Rassen dar. Die Erkrankungshäufigkeit dieser Rasse wird in verschiedenen Untersuchungen zwischen 15% und 20%, für aus Island exportiere Tiere auf fast 25% geschätzt (UNKEL 1985). Andere berichten von bis zu 60-70% Erkrankungsrate exportierter Tiere (RÜSBÜLDT 2001 sowie persönliche Mitteilungen isländischer Pferdezüchter). Dies erklärt die enorme wirtschaftliche Bedeutung des Sommerekzems speziell für die isländische Landwirtschaft, deren Exportquoten seit Mitte der achtziger Jahre, nach bekannt werden dieser Zusammenhänge, dramatisch sanken. (UNKEL 1985, HECK 1991) Durch eine Studie an Islandpferden im Rheinland konnte gezeigt werden, dass das Sommerekzem multifaktoriell vererbt wird. Dabei wird allerdings eine Heritabilität von nur etwa 10% angenommen, wobei der Einfluss der Stute hier unerklärlicherweise größer zu sein scheint, als der des Hengstes. Eine Disposition bezüglich Fellfarbe oder Geschlecht, wie von anderen Autoren vormals postuliert, konnte hier nicht nachgewiesen werden (UNKEL 1985). Dass es sich beim Sommerekzem um eine allergische Reaktion auf Stiche bestimmter Blut saugender Insekten handelt, wurde schon 1954 von RIECK aufgrund von Untersuchungen in Australien geschlossen. Heute gilt es als gesichert, dass insbesondere Culicoides spp. (Gnitzen) weltweit als die bevorzugten Auslöser anzusehen sind. Aber auch anderen Insektenarten wird eine gewisse Bedeutung zugewiesen, z.B. Stomoxis calcitrans und Simuliden spp. (HECK 1991). So wiesen BAKER und QUINN (1978) nach, dass auf die intradermale Applikation von Extrakten aus Culicoides, Stomoxis calcitrans bzw. Tabanidae alle sieben untersuchten Pferde bei Culicoides und drei der Tiere ebenfalls bei Stomoxis 32 Literaturübersicht calcitrans mit einem subepidermalen Ödem und begrenzter Eosinophilie reagieren, ähnlich dem histopathologischen Bild des Sommerekzems. Der Versuch, die für das Sommerekzem verantwortlichen Allergene von Culicoides genauer zu identifizieren, indem aufgetrennte Fraktionen für intradermale Hauttests eingesetzt wurden, gelang nicht (MORROW et al. 1986). QUINN et al. (1983) konnten die Reaktionsbereitschaft der Haut auf Culicoides Extrakte über das Serum erkrankter Tiere auf gesunde Pferde übertragen. Dies bestärkte den Verdacht, dass es sich beim Sommerekzem um eine Typ I Allergie handelt. Dies folgerten auch STROTHMANN-LÜERSSEN et al. (1992), die, in Übereinstimmung zur Flohbissallergie des Hundes und der saisonalen allergischen Dermatitis des Schafes, bei histologischen und biochemischen Untersuchungen von an Sommerekzem erkrankten Pferden sowohl eine Infiltration von eosinophilen Granulozyten, als auch einen Anstieg von entzündungs- und allergiespezifischen Leukotrienen in den veränderten Hautbereichen fanden. Die Ansammlung eosinophiler und neutrophiler Granulozyten und die Ödembildung nach intradermaler Applikation von Culicoides Extrakt kann zudem durch die Histamin-1Rezeptor Antagonisten Chlorphenamin und Mepyramin gehemmt werden (FOSTER et al. 1997). Zudem konnte in vitro gezeigt werden, dass auch bei Equiden eine phänotypische Differenzierung von TH1 und TH2 Zellen möglich ist, also entsprechend dem humanen System eine Immundeviation mittels Zytokinen auch in vivo als möglich gelten darf (AGGARWAL & HOLMES 2000; AGGARWAL und HOLMES 1999). Anhand des von ihr entwickelten funktionellen in-vitro Testes gelang es KAUL (1998), eine spezifische Histaminausschüttung basophiler Granulozyten auf eine Stimulation mit Culicoides nubeculosus in Blutproben vorberichtlich Sommerekzem positiver Pferde nachweisen, während Blutproben von Pferden ohne Sommerekzem nicht reagierten. Diese Ergebnisse konnten von KOBELT (2001) bestätigt werden. KOBELT wies zudem nach, dass die spezifische Sensibilisierung basophiler Granulozyten gegen Culicoides auch im Winter, außerhalb der klinischen Periode, erhalten bleibt. Untersuchungen von WILSON et al. (2001) zeigten, dass Pferde, die Culicoides-Bissen ausgesetzt waren, im Gegensatz zu naiven Pferden (in Island; aufgrund der klimatischen Bedingungen kommen Culicoides spp. dort nicht vor) Antikörper gegen Speicheldrüsenbestandteile gebildet hatten. Dabei konnten bei allen exponierten Pferden Immunglobuline vom Isotyp IgG nachgewiesen werden, IgE jedoch nur bei Pferden mit klinischen Symptomen des Sommerekzems. Zur klinischen Ausprägung des Ekzems kommt es nach UNKEL (1985) bei über 80% der untersuchten Islandpferde innerhalb der ersten drei Lebensjahre, 94% der späteren Sommerekzemer entwickeln bis zur Vollendung ihres vierten Lebensjahres erstmals Symptome. Fohlen allerdings zeigen nahezu nie Anzeichen der Erkrankung, obwohl z.T. 33 Literaturübersicht schon bei Fohlen und Jährlingen eine Sensibilisierung basophiler Granulozyten nachgewiesen werden konnte (KOBELT, 2001). Bei isländischen Importpferden kommt es nach Untersuchungen aus Norwegen frühestens im zweiten Sommer nach Import, im Durchschnitt nach etwa vier Jahren, zu ersten klinischen Ausprägungen (HALLDORSDOTTIR & LARSEN 1991). Im Laufe der Erkrankung werden fünf Stadien unterschieden: Das Prodromalstadium wird gefolgt vom papulösen Stadium, gekennzeichnet durch stecknadelkopf- bis maximal drei Zentimeter im Durchmesser große Papeln, die einen lokalen Juckreiz auslösen, auf den die Pferde mit Unruhe und mehr oder weniger starkem Scheuern reagieren. Das Langhaar von Mähne und Schweif wird dabei bis zur Alopezie abgescheuert. Folgend kommt es im Exkoriationsstadium zuerst zu oberflächlichen Hautabschürfungen und in folge weiterer Automutilation später zu tieferen, die Cutis durchtrennenden Verletzungen. Es kann sich das sekundär infizierte oder ulcerierende Stadium anschließen. Letztendlich, mit Nachlassen der Allergenexposition, erfolgt im Regenerationsstadium eine Abheilung der Hautveränderungen. Aufgrund des chronischen Verlaufs wird durch die permanente Reizung die Epidermis und Dermis jedoch stark zerstört. Es kommt, v.a. am Mähnenkamm und der Schweifrübe zur Pachydermie und andauernder Alopezie. Die vorgeschädigte Haut neigt auch außerhalb der Sommerekzemperiode, insbesondere in den luftabgeschlossenen Falten der pachydermen Bereiche, zu bakteriellen und mykotischen Infektionen. (RÜSBÜLDT 2001). Der jahreszeitliche Verlauf der Symptomausprägung ist dabei indirekt an die herrschenden Klima-, bzw. Wetterbedingungen gekoppelt, da diese das Insektenaufkommen maßgeblich steuern. Mit dem Auftreten der ersten Erkrankungsstadien muss im Allgemeinen ab April / Mai gerechnet werden. In der Zeit um Oktober und November klingen die Symptome ab und die Regeneration erfolgt. (HECK 1991) Der Grad der klinischen Ausprägung des Sommerekzems ist starken inter- und intraindividuellen Schwankungen unterworfen. Neben der Standortund witterungsabhängigen Insektenbelastung sollen Faktoren, wie verzögerter Haarwechsel, Vorschädigung der Haut (Borken, Schuppen aus der vorhergehenden Saison, Pyodermien, Dermatomykosen, parasitäre Infektionen), hormonelle Imbalancen und sogar die psychische Ausgeglichenheit bzw. Stressbelastung des Einzeltiers eine nicht unerhebliche Rolle spielen. (RÜSBÜLDT 2001). Eine kausale Therapie des Sommerekzems und damit der Typ I Allergie existiert bisher nicht. Versuche zur Hyposensibilisierung Culicoides-allergischer Pferde scheinen Erfolg versprechend (ANDERSON et al. 1996). Da das Allergen bisher nicht in aufgereinigter Form vorliegt und die Major Allergens erst bestimmt werden müssen, wird hierzu ein grober Gesamtextrakt der Mücke verwendet. Dieser birgt jedoch das Risiko, dass Immunreaktionen, 34 Literaturübersicht insbesondere Allergien gegen andere als die spezifischen allergenen Bestandteile des Extraktes durch die Behandlung ausgelöst werden. Zieht man zudem in Betracht, dass ein großer Teil der Allergiker gegen mehr als nur ein Allergen sensibilisiert ist und somit prinzipiell gegen eine Reihe von Allergenen hyposensibilisiert werden müsste, werden die praktischen Grenzen dieser Therapieform deutlich. Einen weiten Überblick über die von Tierärzten und Patientenbesitzern verwendeten (symptomatischen) Therapeutika gibt RÜSBÜLDT (2001): So werden neben der äußerlichen Anwendung verschiedenster Fette und Öle und Insektenrepellents, u. a. Cortikoide oder Antihistamininka zur Immunsuppression eingesetzt, aber auch Homöopathika, Eigenblutbehandlungen und ihre Variationen, Bioresonanz oder biologisch aktive Peptide. BRÜNNLEIN (2001) konnte in ihren Untersuchungen zum Sommerekzem keinen dauerhaften und zuverlässigen Einfluss der weit verbreiteten Therapien mit Ökozon, Allergostop® I (Gegensensibilisierung nach Theurer) oder Insol®Dermatophyton auf die generelle oder Culicoides-spezifische Sensibilisierung nachweisen. Erfolg versprechend bleibt bisher alleine eine möglichst weitreichende Allergenkarenz (Ekzemerdecken, Verbringen der Tiere in mückenfreie, bzw. arme Umgebung). Allerdings bedeutet auch dies keine Heilung der Allergie, sondern nur ein Verhindern der klinischen Symptome. Selbst nach bis zu fünfzehn Jahren Symptomfreiheit, erreicht durch Verbringen von sommerekzemkranken Tiere auf die Nordseeinsel Spiekeroog -die Gnitzen sind auf den ostfriesischen Inseln auf Grund der ganzjährigen Westwinddrift nicht endemisch-, blieb die spezifische Sensibilisierung deutlich bestehen (KOBELT 2001). Auch nach dieser langen Zeit hätte also ein erneuter Allergenkontakt den klinischen Ausbruch des Sommerekzems zur Folge. 35 Literaturübersicht 2.2.3 Immunglobulin-Isotypen und ihre potentielle Bedeutung für die Typ I-Allergie des Pferdes Aus Untersuchungen in vornehmlich humanen und murinen Systemen ist bekannt, dass auch Immunglobuline des Isotyps IgG an Mastzellen binden können. Die IgG-bindenden Rezeptoren FcγRI, FcγRII und FcγRIII konnten auf der Zelloberfläche humaner Mastzellen nachgewiesen werden (OKAYAMA et al. 2000). Über den hochaffinen Rezeptor FcγRI, wie auch über den Rezeptor FcγRIII kann eine Degranulation der Zelle herbeigeführt werden (OKAYAMA et al. 2001; MIYAJIMA et al: 1997), während der niederaffine Rezeptor FcγRIIB in der Lage ist, die durch FcεRI vermittelte Aktivierung der Zellen zu hemmen, wenn beide Rezeptortypen durch den selben multivalenten Liganden gebunden werden (DAERON et al. 1995). (s. 2.3.3.2) Ob und mit welcher Funktion diese Rezeptortypen auch auf equinen Mastzellen oder Basophilen exprimiert werden, ist bislang nicht untersucht. Bei besser untersuchten Spezies (Mensch, Maus, Ratte) sind Basophile und Mastzellen konstitutiv mit einem FcεRI ausgestattet. Er ist so hochaffin für den Fc-Teil von IgE ist, dass er es in freier Form binden und damit diese Zellen für die vom spezifischen Bindungsteil (Paratop) dieser Antikörper erkannten Determinaten (Epitope) auf Antigenen sensibilisiert. Zumindest für Mastzellen der Ratte wurde gezeigt, dass der FcεRI auch einen bestimmten IgG-Isotypen (IgG2a) binden kann, wenn auch mit geringerer Affinität als das IgE (BENHAMOU et al. 1994). Werden auf Mastzellen und Basophilen zusätzlich verschiedene Formen von FcγRII gefunden, so können sie erheblich modulatorische fördernde wie hemmende Wirkung auf das Reaktionsverhalten dieser Zellen haben, sobald beide Rezeptoren, der FcεRI und der FcγRII, durch ein an Antigen gebundenes IgE und IgG überbrückt werden (DAERON et al. 1995). Ein solches „Heterobridging“ verschiedener Isotypen kann bisher auf Grund der zumeist unbekannten Spezifität von originär equinen Immunglobulinen nicht untersucht werden. Zusammenfassend dürfte es von großem Interesse sein, welche (regulatorische) Rolle das IgE sowie die verschiedenen IgG-Isotypen des Pferdes in Bezug auf die Degranulation allergischer Effektorzellen spielen. 36 Literaturübersicht 2.3 Immunmodulation 2.3.1 Definitionen und Einsatzmöglichkeiten Das Konzept der Immunstimulation erstellte Dr. William B. Coley 1907. Er bemerkte spontane Tumorregressionen bei einigen seiner Patienten nach Septikämie. Aus dieser Beobachtung heraus entwickelte er ein Gemisch von Bakterientoxinen (Coley´s Toxin), welches er zur Krebstherapie einsetzte. (RUSH 2001) A. MAYR (ROLLE & MAYER 1993) führte den Begriff der „Paramunisierung“ ein. Damit bezeichnete er zunächst begleitende, Antigen unspezifische Wirkungen von Schutzimpfungen, deren funktionelle Mechanismen er fast durchweg den angeborenen Immunmechanismen (Phagozytose, ADCC, Bildung von Interferon, Aktivierung des Komplementsystems, hormonelle Interaktionen) zurechnete. Die „Paramunisierung“ sei allerdings auf die „noch vorhandene Funktionsfähigkeit des Immunsystems und seiner Zellen angewiesen“. Es soll durch die Paramunität ein schnell einsetzender (wenige Stunden), aber nur kurz anhaltender (einige Tage) Schutz des Individuums erreicht werden; ein Boostereffekt soll nicht zustande kommen. TIZARD (1993) definiert Immunstimulantien durch ihre Fähigkeit, nicht-antigenspezifische humorale und auch zellvermittelte Abwehrmechanismen zu fördern. Dies wird seiner Ansicht nach durch Makrophagen vermittelt, die durch die Phagozytose der Immunstimulanspartikel aktiviert werden und daraufhin bestimmte Zytokine (Interferon, Interleukin 1, Tumornekrosefaktor und/oder Interleukin 6) freisetzten und so zu einer Steigerung der Phagozytoseaktivität, der Antikörperproduktion und der Zytotoxizität führen. RUSH (2001) postuliert, dass immunstimulatorische Therapien v.a. bei chronischen oder rezidivierenden Infektionen wirken, da hier eine Immunsuppression oder –toleranz vorläge. Für wenig sinnvoll hält er ihren Einsatz bei akuten Infektionen, da dort das Immunsystem schon maximal stimuliert sei. 37 Literaturübersicht 2.3.2 Immunmodulation der Typ I-Allergie Modulation der TH1 / TH2-Balance Das Hautpangriffsziel der Immunmodulationsversuche im Rahmen der Therapie IgE vermittelter Typ I-Allergien (s. 1.1.1) ist die TH1 / TH2-Balance. Dies stützt sich auf die Hypothese, dass die Bildung von Antikörpern des Isotyps IgE durch B-Zellen eine Folge der Dominanz von TH2-Helferzellen und der von diesen Zellen ausgeschütteten Zytokine (IL-4, IL-13) zum Zeitpunkt der Antigenerkennung darstellt. 1986 beschreiben MOSMANN et al. bei der Maus zwei verschiedene T-Helferzell-Klone, die er an Hand ihrer Zytokinsekretionsmuster unterscheidet: TH1-Zellen (IFN-γ, IL-2, TNF-β) und TH2-Zellen (IL-4, IL-5). Diese entwickeln sich aus naiven T-Helferzellen (TH0-Zellen). Entscheidend, ob sich die naiven T-Helferzellen zu TH1- oder TH2-Zellen differenzieren, ist das zum Zeitpunkt der Antigenpräsentation herrschende Zytokinmilieu. Dabei wird Interleukin-4 eine entscheidende Rolle für die Differenzierung zu TH2-Zellen zugeschrieben. Aber auch andere Zytokine (IL-1, IL-6 und IL-10, IL-13 sowie TGF-beta) favorisieren die TH2-Entwicklung. Interleukin-4 ist zudem in der Lage, die Expression von Interleukin-12Rezeptoren auf Antigen aktivierten T-Helferzellen zu unterdrücken. Dies ist deshalb von Bedeutung, da Interleukin-12 die Entstehung des TH1-Phänotyps fördert. Eine weitere Rolle in der Regulation spielt Interferon-γ, das über einen auf TH2-Zellen, nicht aber auf TH1Zellen, exprimierten Rezeptor binden kann, welcher antiproliferative Signale auf die TH2Zelle überträgt und so die Differenzierung hin zu TH1-Zellen unterstützt. (HAAS et al. 1999) Eine Beeinflussung der TH1 / TH2-Balance ist zudem durch Chemokine, eine Unterfamilie der Zytokine, möglich (HAYGLASS et al. 2000). Als Chemokine wird eine Gruppe kleiner Proteine bezeichnet, die sich durch stark konservierte strukturelle Motive basierend auf einem Cystein-Gerüst auszeichnen. Diese Chemokine (chemotactic cytokines) und ihre Rezeptoren spielen zum einen eine Schlüsselrolle bei der Leukozytenmigration. Das Chemokin Eotaxin zum Beispiel, welches von Epithelzellen und Phagozyten gebildet wird, wirkt sehr selektiv auf basophile und eosinophile Granulozyten. Es besteht zudem der Verdacht, dass Chemokine eine differenzierte Rekrutierung von TH1- oder TH2-Zellen in ein Entzündungsgebiet bewirken können. (Bei TH2-Zellen konnte z.B. die Expression des Eotaxin-Rezeptors nachgewiesen werden) (HAYGLASS et al. 2000). Neben ihrer chemotaktischen Fähigkeit wird den Chemokinen aber noch eine Beteiligung bei weiteren immunologischen Funktionen zugeschrieben, z.B. bei der Hemmung der T-Zell- 38 Literaturübersicht Proliferation, der Aktivität zytotoxischer T-Zellen und NK-Zellen und, insbesondere hier von Interesse, der Förderung eines TH1-Zytokinmilieus und einer TH1-Immunantwort. So exprimieren TH1- und TH2-Zellen z.T. verschiedene Chemokinrezeptoren auf ihren Oberflächen, oder aber bestimmte Rezeptoren in unterschiedlicher Dichte. Weitere Untersuchungen sprechen dafür, dass auch die initiale Differenzierung der naiven T-Zellen mit durch Chemokine gesteuert wird. Die Effekte von Chemokinen scheinen außerdem nicht nur auf T-Zell-Funktionen beschränkt zu sein. Bei atopischen Patienten konnte z.B. eine direkte Stimulation von B-Zellen durch Chemokine zur IgE- und IgG4-Synthese nachgewiesen werden. (HAYGLASS et al. 2000; SIEVEKE & HAMANN 1998; CHENG et al. 2001) Das Zytokin-/ Chemokinmilieu unterliegt einer komplexen Regelung durch eine Vielzahl endogener und exogener Faktoren. Dabei sind u.a. auch die Art des Pathogens, die Antigenmenge, die physikalische Form und die Eintrittspforte des Antigens von Bedeutung. Bakterien-, Protozoen- und Virenantigene scheinen über ein Triggering von Makrophagen und dendritischen Zellen bevorzugt zur Interleukin-12-Freisetzung und somit zur TH1dominierenden Immunantwort zu führen, wohingegen Wurmparasiten und als Allergene fungierende Antigene über Interleukin-4 und Interleukin-13 aus basophilen Granulozyten eine TH2-Antwort favorisieren. (HAAS et al. 1999) Auch Speichelextrakt der Zecke Ixodes ricinus soll eine TH2-dominante Immunantwort auslösen (KOVAR et al. 2001). Es kann damit hier die Hypothese aufgestellt werden, dass auch Speichel von anderen Blut saugenden Insekten, insbesondere Culicoides, ebenfalls diese Reaktion auszulösen vermag, was für die Ätiologie des Sommerekzems von Bedeutung wäre. Ein Ziel der Immunmodulation im Zuge der Allergie vom Typ I ist nun eine Umlenkung von einer TH2- zu einer TH1-gerichteten Immunantwort und somit weg von einer IgE vermittelten zu einer Zell-, bzw. IgG-vermittelten Reaktion. Die hierzu verwendeten Immunmodulatoren können in folgende Kategorien eingeteilt werden: TH1-fördernde Zytokine (z.B. IFN-γ), Immunsuppressoren oder Inhibitoren der Zytokintranskription (z.B. Cyclosporin A, Tacrolimus) und TH2-Zell-Inhibitoren (Suplatast). Weitere, nicht etablierte, Therapien basieren auf monoklonalen Antikörpern gegen T-Zellen oder gegen Zytokine oder auf Zytokinrezeptor-Antagonisten (TOKURA et al. 2001). Neuere Untersuchungen beschäftigen sich mit der Möglichkeit einer TH1-Induktion durch abgetötete Bakterien oder deren Bestandteile, CpG Oligodesoxynucleotiden oder PlasmidDNS. (WOHLLEBEN & Erb 2001) CpG-DNS soll über die Aktivierung von Monozyten, Makrophagen und dendritischen Zellen die Bildung TH1-artiger Zytokine (z.B. IL-12) 39 Literaturübersicht stimulieren und über die Aktivierung von NK-Zellen die Freisetzung des TH2-hemmenden IFN-γ fördern (KRIEG 1999). Modulation von Effektorzellen Ist der Klassenwechsel unter Einfluss von TH2-Zellen erfolgt und produzieren B-Zellen nun IgE-Antikörper, werden diese über den hochaffinen Fcε-Rezeptor I (FcεRI) v.a. an der Oberfläche von Mastzellen und basophilen Granulozyten gebunden. Binden spezifische Antigene bzw. Allergene an zellständige IgE-Moleküle, können sie diese, wenn in ausreichender Menge vorhanden, kreuzvernetzen und die Fcε-Rezeptoren somit zusammenlagern, was zur Aktivierung der Zelle führt. Versuche, die Rezeptoren durch IgEAnaloga oder Anti-FcεRI–Antikörper kompetitiv zu hemmen, führten i.d.R. zur Aktivierung und Degranulation der Zellen. Von einer erfolgreichen Blockade des FcεRI, ohne Stimulierung der Zellen, berichten HAAK-FRENDSCHO et al. (1993). Durch ein FcεRI-IgGImmunoadhäsin gelang es ihnen, in vitro und in vivo im murinen System IgE-vermittelte anaphylaktische Reaktionen zu hemmen. Die Expression von FcεRI auf der Zelloberfläche ist positiv an den Serum-IgE-Spiegel gekoppelt. Erhöhte IgE-Gehalte im Serum führten im murinen und humanen System zur Heraufregulierung der Rezeptorexpression bei Mastzellen und basophilen Granulozyten, wohingegen eine Behandlung mit Antikörpern gegen IgE eine verminderte Expression auf Basophilen zur Folge hat (COSTA et al. 1997). Anti-FcεRI-Antikörper werden bereits erfolgreich als Therapeutikum bei allergischem Asthma eingesetzt (CHANG 2000). Ebenso kommen rekombinante humanisierte Antikörper gegen das Fc-Fragment von humanem IgE zur klinischen Anwendung - wobei das Prinzip hier eher eine verhinderte Sensibilisierung der allergischen Effektorzellen mit allergenspezifischem IgE darstellt, die auf Grund von Immunkomplexbildung im Plasma stattfindet (SHIELD et al 1995). In der Depletion von IgE, unabhängig von seiner Spezifität, sehen einige Autoren jedoch eine Gefahr, die den Nutzen einer vorübergehenden klinischen Verbesserung der Typ I Allergie gegenübersteht (MACGLASHAN 2002). Die Tatsache, dass physiologisch Autoantikörper gegen IgE vorkommen, führte zu Versuchen, eine im Rahmen der Allergiebehandlung nützliche anti-IgE-Autoimmunantwort durch Vakzinierung zu erhalten, was beim Affen bereits gelang (STADLER et al. 2001). Neben dem Fcε-Rezeptor I werden auch andere Fc-Rezeptoren auf der Zelloberfläche von Mastzellen und basophilen Granulozyten exprimiert, so IgG-bindende Rezeptoren (FcγRI, 40 Literaturübersicht FcγRII und FcγRIII) und, zumindest nach Vorbehandlung mit IL-3, IL-5 oder GM-CSF, ein Rezeptor, der sekretorisches IgA bindet (GALLI 2000). Einer dieser Rezeptoren, der niederaffine Rezeptor FcγRIIB, ist in der Lage, die durch FcεRI vermittelte Aktivierung der Zellen zu hemmen, wenn beide Rezeptortypen durch den selben multivalenten Liganden gebunden werden (DAERON et al. 1995). Eine solche Bindung kann zustande kommen, wenn ein Antigen/Allergen an zellständiges IgE bindet, das bereits an anderen Epitopen IgG gebunden hat. Das IgG seinerseits kann dann über den Fc-Teil den Fcγ-Rezeptor binden (OTT et al. 2002). ZHU et al. (2002) entwickelten aus diesem Ansatz heraus ein Protein, welches gleichzeitig FcεRI und FcγRII binden kann. In vitro konnte durch dieses Protein eine Hemmung der IgE vermittelten Histaminausschüttung bewirkt sowie im murinen Modell in vivo anaphylaktische Reaktionen verhindert werden. Das therapeutische Potenzial solcher Substanzen in der Behandlung von Typ I-Allergien ist noch unerforscht. Sowohl Mastzellen, als auch basophile Granulozyten können durch eine Reihe von Substanzen unabhängig vom FcεRI aktiviert werden. Dazu gehören Bakterien- und Parasitenprodukte (z.B. Lipopolysaccharide, Adhäsine), Chemokine sowie Komplementfaktoren (C5a, und geringer C3a). Einige dieser Substanzen sind in der Lage die Mediatorfreisetzung zu modulieren, d.h. nur bestimmte Mediatoren freizusetzen oder diese nur in geringen Mengen oder aber sehr langsam auszuschütten. (GALLI 2000; HAYGLASS et al. 2000). Im Zuge der Degranulation von Mastzellen und basophilen Granulozyten werden präformierte Mediatoren ausgeschüttet sowie andere neu synthetisiert und freigesetzt (s. 2.1.1). Mastzellen können dabei TNF-α freisetzen (aus Granula oder neu gebildet), welches eine bedeutende Rolle in der Leukozytenrekrutierung im Entzündungsgebiet spielt. So konnte zum einen an mastzelldefizienten Mäusen gezeigt werden, das Mastzellen notwendig für die Leukozyteninfiltration sind, zum zweiten konnte fast 50% der IgE- und Mastzellen abhängigen Einwanderung von neutrophilen Granulozyten und mononukleären Zellen durch einen Antikörper gegen TNF-α gehemmt werden (GALLI 2000). Die so rekrutierten Leukozyten scheinen in der Spätphase der allergischen Reaktion, nach ca. acht Stunden, hauptverantwortlich für die klinisch bedeutsamen Entzündungssymptome zu sein (COSTA et al. 1997). In Untersuchungen an Mäusen konnte gezeigt werden, dass Glucocorticoide oder Cyclosporine in vitro in der Lage sind, die Zytokinproduktion von Mastzellen zu hemmen und in vivo Mastzell- und TNF-α abhängige allergische Entzündungen zu unterdrücken. Dies wird als Hauptwirkungsmechanismus jener Medikamente bei allergischem Asthma angesehen (COSTA et al. 1997). 41 Literaturübersicht Die gezielte Immunmodulation im Rahmen der Therapie von Typ-I-Allergien gestaltet sich schwierig, da die Regelmechanismen des Immunsystems und ihre Interaktionen zur Zeit nur bruchstückhaft bekannt sind. Ein Eingreifen in diese fein abgestimmten Regelkreise hat i.d.R. schwer zu überschauende und manchmal überraschende Folgen. Zum anderen muss man sich hier vor Augen halten, dass es sich bei den unter der Allergie ablaufenden Vorgängen um prinzipiell notwendige Mechanismen des Immunsystems handelt. Der Versuch, die pathologische Situation zu beeinflussen, kann u.U. relevante Immunfunktionen beeinträchtigen und so zu unerwünschten Nebenwirkungen führen bis hin zur Exazerbation des allergischen Leidens. Zusätzlich basieren die aufgeführten Erkenntnisse auf dem humanen oder murinen System – eine Projektion auf equine Allergiemechanismen kann also nur richtungsweisend verstanden werden. 2.3.3 Immunmodulation durch allergenspezifische Antikörper anderer Isotypen als IgE Mit zunehmender Etablierung des TH1/TH2 Dogmas enstehen wiederholt Schwierigkeiten, in vivo Phänomene der einen oder anderen Reaktionslage im Individuum zuzuordnen. (ALLEN und MAIZELS 1997; MARTIN und LEW 1998; ZHAI et al. 1999; LIU 2000; MAGNAN et al. 2001; ROMAGNANI 2004). Einige Autoren verweisen dementsprechend auf einen Typ 1 oder Typ 2 assoziierten Immunstatus, wobei keine einheitliche funktionelle Trennung beteiligter Zellen erfolgt. Insbesondere auf der Ebene der Makrophagen, ehemals klassische Effektorzellen einer Typ I Immunantwort, wird zwischen Typ 1 und Typ 2 assoziierten Phänotypen unterschieden (STOUT & SUTTLES 2004). Aber auch auf der Ebene der T-Zellen findet man Sekreteionsmuster von Zytokinen, die der Dichotomie in TH1/TH2 Reaktionslagen in vivo entgegenstehen (INAOKI et al. 2003). Dementsprechend werden in jüngerer Zeit vermehrt regulatorische T-Zellen für die Feinabstimmung der TH1/TH2-Immunantwort verantwortlich gemacht (STASSEN et al. 2004). Über die zu Grunde liegenden Mechanismen einer regulatorischen Toleranzinduktion gegen Allergene (schadlose Antigene) herrscht in so weit Einigkeit, als dass in vivo insbesondere humorale Komponenten wie IL10 oder TGF-ß verantwortlich sind. Eine genaue mechanistische Analyse steht zur Zeit noch aus (RONCAROLO et al. 2003; NOURI et al. 2004) Die verschiedenen Isotypen der Antikörper entstehen als Folge des vorherrschenden 42 Literaturübersicht Zytokinmillieus während des B-Zell-Switches. Im humanen System ist bekannt, dass neben IgE als klassisches Immunglobulin der Typ 2 Polarisierung auch IgG4 induziert wird (LUNDGREN et al. 1989). Dementsprechend wurde diesem Isotyp eine erhebliche modulatorische Potenz im Rahmen der Typ I Allergie zugesprochen, da durch einen aktivierenden Stimulus allergenspezifische Antikörper verschiedener Isotypklassen induziert werden können (JABARA et al. 1993). IgG4 zeigt nur eine schwache Affinität zu Fc Rezeptoren. Obwohl bekannt ist, dass im Rahmen der spezifischen Immuntherapie (SIT) zur Hyposensibilisierung von Allergikern der allergenspezifische Isotyp IgG4 vermehrt gebildet wird, wird seine Bedeutung für die Allergie kontrovers diskutiert. BOLUDA et al weisen darauf hin, es könne sich um ein Epiphenomen der hohen Allergenexposition handeln, ohne dass eine Immundeviation stattfindet. Eventuell könnte sogar dieser Isotyp für anaphylaktische Reaktionen bei Allergikern verantwortlich sein (BOLUDA et al. 1997). Das Zytokinspektrum der TH2 Antwort (insbesondere IL4 und IL13) kann keine Erklärung für eine regulatorische Expression von IgE und/oder IgG4 liefern (VERCELLI et al. 1998). Allerdings konnte in einer epidemiologischen Studie an europäischen Kindern gezeigt werden, dass Allergene zwar zu einer TH2 vermittelten IgG4 und/oder IgE Antwort führen. Der Anteil allergischer Kinder war aber in den Gruppen die nur IgE oder IgE und nur geringe Mengen IgG4 gebildet hatten, sehr gering. Dramatisch höher war der Prozentsatz bei Individuen, die eine hohe IgG4 und IgE Antwort zeigten (STERN et al. 2004). Partiell verantwortlich für diese Entwicklung kann die Frequenz des Allergenkontaktes sein. So wurde bei Kindern, die in einem Haushalt mit Katzen lebten, zwar eine TH2 Antwort auf Fel d 1 (Hauptkatzenallergen 1) gefunden, mit vornehmlicher Expression von IgG4. Der Anteil allergischer Kinder war jedoch vergleichsweise niedriger als bei Kindern, die ohne Katzen im Haushalt aufwachsen. Eine modifizierte TH2 Antwort wird von den Autoren als ursächlich angegeben (PLATTS-MILLS et al. 2004). In einer Studie, die Hauttests (skin prick test: SPT) mit serologischen Untersuchungen auf allergenspezifische Immunglobulinisotypen verglichen, konnte kein Korrelat eines allergenspezifischen Isotyps mit der klinischen Symptomatik abgeleitet werden. Allerdings wurden hier Individuen identifiziert, deren SPT mit der Klinik übereinstimmte, obwohl kein allergenspezifisches IgE serologisch nachgewiesen werden konnte (NIEDERBERGER et al. 2001). Bei der Untersuchung von Familien mit gehäuftem Auftreten Typ I allergischer Erkrankungen (atopischen Familien) konnte ebenso kein Korrelat des allergenspezifischen IgE zum Ergebnis 43 Literaturübersicht des parallel durchgeführten SPT gefunden werden. Unabhängig von diesem Ergebnis ließ sich aber ein gehäuftes Auftreten von allergenspezifischem IgG4 sowie IgG1 nachweisen (JACKOLA et al. 2004). Der Vergleich der Expressionsstärke dieser zwei Isotypen wurde von GEHLHAR et al im Forschungszentrum Borstel zum Monitoring der SIT verwendet. Sie konnten aufzeigen, dass der klinische Score der Allergie korrelierte mit dem Verhältnis – und nur dem Verhältnis!von IgG4 zu IgG1 - im Gegensatz zu IgG2 oder IgE oder einem einzelnen Isotyptiter (GEHLHAR et al. 1999). Dies kann hypothetisch für eine konkurrierende Bindung an das Allergen aufgefasst werden. Insbesondere für die Isotypen IgG1 und IgG4 konnte gezeigt werden, dass sie, abhängig von dem sensibilisierenden Allergen, zu hochaffinen Antikörpern reifen, ähnlich der Größenordnung die im atopischen Individuum für allergenspezifisches IgE gefunden wird (BOLUDA et al. 1996). Damit stünde quantitativ weniger Allergen für die IgE vermittelte Aktivierung allergischer Effektorzellen zur Verfügung. In dieser Folge konnte gezeigt werden, dass sensibilisierte aber klinisch gesunde Individuen im Vergleich zu Allergikern allergenspezifisches IgG4 mit wesentlich höherer Affinität entwickelt hatten (2-3 log Stufen) (JACKOLA et al. 2002). Zusätzlich steigt die Bindungsaffinität immunkomplexierter IgG Isotypen an Fc Rezeptoren stark an. Insbeondere die inhibitorischen FcγRIIb1/2 weisen eine hohe Affinität für IgG1 und, in geringerem Maße auch für IgG4 auf. Somit ist auch eine qualitative Modulation auf Ebene der Effektorzellen nicht auszuschließen. Letztlich gilt für die Human- wie Veterinärmedizin, dass der Einfluss allergenspezifischer IgG Isotypen auf die klinische Ausprägung der Typ I Allergie in der Summe noch unverstanden bleibt (WACHHOLZ und DURHAM 2004; FRASER et al. 2003; FOSTER et al. 2003). 44 Material und Methode 3 Geräte, Material und Methoden 3.1 Geräte Aqua dest. Aufbereitungsanlage Umkehr-Osmose Anlage, „Typ RO 50/14SMB TypI“ (Wasser und Regenerierstation, Barsbüttel Aqua tridest. Aufbereitungsanlage „SG Reinstwasser System Typ SG-RS90-4 UF“ (Wasser und Regenerierstation, Barsbüttel Autoklav Typ GE406 (Getinge AB, Getinge/Schweden) Brutschrank mit CO2-Begasung, Baureihe 5060 (Heraeus, Hanau) Bunsenbrenner mit automatischer Zündung (Wartewig (6.001.000), Göttingen) ® Centricon 3 – Filtrationssystem (Amicon, Beverly/MA, USA) CO2-Flasche zur Sterilfiltration (Kohlensäurewerke Hannover, Hannover) Druckbehälter zur Sterilfiltration „stainless steel pressure vessel“ (Alloy Products (XX670053)) Einfrierbehälter Nalgene TM Cryo Freezing Container (Nalge Company, Rochester/USA) Eismaschine Typ UBE 30-10 (Ziegra, Isernhagen) ® Fluoreszenz-Durchflusszytometer, Modell FACScan , mit angeschlossener Computereinheit (Becton Dickenson, Heidelberg) Fluoreszenzmikroskop mit Ploemilluminator und Phasenkontrasteinrichtung (Zeiss (476250-9901), Oberkochen) Folienschweißgerät „Polystar® 100GE“ (Rische und Herfurth, Hamburg) Heißluftsterilisator „Typ ST5050“ (Heraeus, Hanau) Invertmikroskop (Zeiss, Oberkochen) Kochtopf (Einzelhandel) Kühlschrank mit Gefrierfach (-20°C) (Einzelhandel) Kühlzentrifuge Varifuge K mit Tragwinkelrotor, Hochgeschwindigkeitsaufsatz und Mikrotiterplattenrotor (Heraeus instruments, Osterode) Laborfeinwaage „B6“ (Mettler, Zürich/Schweiz) Labor-pH-Meter „766 Calimatic“ (Knick, Berlin) Laborwaage „BL310“ (Sartorius GmbH, Göttingen) LKB Wallac 1272 Clinigamma (Gamma-Counter) (Wallac Oy, Turku, Finnland, Perkin Elme Instruments, Rodgau) Magnetrührer mit Heizplatte (Janke und Kunkel, Staufen) Mikrotiterplatten-Filterphotometer ELISA-Reader Dynatech (Dynatech, Denkendorf 5000 Kontakt: Dynex Technologies, USA) Pinzette, gebogen, anatomisch (Eickemeyer (170710), Tuttlingen) ® Pipette, einstellbar „Transferpette “ (2-20 µl) (Brand (09U2539), Wertheim) Pipetten, einstellbar „pipetman“ (1-20 µl, 10-100 µl, 20-200 µl, 100-1000 µl) (Gilson, Villers Le Bel/Frankreich) 45 Material und Methode Pipettierhilfe „accu-jet®“ (Brand (26404), Wertheim) Plastikbox mit Gittereinsatz (Einzelhandel) Plattenzentrifuge mit Plattenrotor (UJ II KS) (Heraeus-Christ. Osterode) Reinwerkbank Laminair HL2448 (Heraeus-Christ, Hanau) Röhrchen-Schüttler „Typ Reamix“ (ASID, Unterschleißheim) Röhrchen-Schwenker „Typ Automix“ (ASID, Unterschleißheim) Rüttler für Mikrotiterplatten „AM69 Microshaker“ (Dynatec, Zug/Schweiz) Schere, rostfrei (Fisher Scientific (9204013), Schwerte) Schlauchpumpe zum Absaugen von Flüssigkeiten „Rumo100“ (Heidolph (52100), Schwabach) Tischzentrifuge „Chemico“ mit Winkelmotor (Wifug (10209), Bradford/England) Tischzentrifuge „Hermle Z230M“ (Hermle, Gosheim) Wasserbad mit Temperaturregelung „Typ 1003“ (GFL, Hannover) WinMDI, Auswertungsprogramm für Durchflusszytometerdaten, Version 2.8 (TROTTER 1997, 1999) Zählkammer nach Bürker (Brand, Wertheim) Zentrifuge „Megafuge 1.0R“ (Heraeus instruments, Osterode) Zyto-System mit Zyto Container, Slide Carrier (Objektträgerhalterung) und Stützeinsatz (Heraeus Sepatech, Osterode) 3.2 Material 3.2.1 Klinikbedarf Einmalspritzen Luer steril 5 mL (AMEFA (302010), Limburg) Einmalspritzen Luer steril 10 mL (AMEFA (302020), Limburg) ® Einmalspritzen Luer steril 50 mL „Plastipak “ Einmal-Untersuchungs-Handschuhe „Gentle Skin sensitive“ (Becton Dickinson (300865), Drogheda/Irland) ® (Meditrade® (1221R), Kiefersfelden) Li-Heparin-Röhrchen (10 mL) (Sarstedt (26369), Nürnbrecht) Staukette nach Witte (Eickemeyer (442015), Tuttlingen) Vacutainer Brand Luer Adapters (Becton Dickinson (367300), Heidelberg) Vacutainerröhrchen, 10 mL, ohne Zusatz (Becton Dickinson (368430), Heidelberg) Vacutainerröhrchen, 10 mL, EDTA-K2 (18 mg) (Becton Dickinson (367525), Heidelberg) Vacutainerröhrchen, 10 mL, Heparin (170 IU) (Becton Dickinson (368480), Heidelberg) 46 Material und Methode 3.2.2 Laborbedarf Combitips 1,25 mL (Eppendorf (0030069.420), Hamburg) Combitips 2,5 mL (Eppendorf (0030069.447), Hamburg) Einmal-Filter (Sterilfilter), 0,2µm (Renner (26146040), Hanau) Einmal-Pasteurpipetten aus Pe-Ld (Merck (612F1767), Darmstadt) Eppendorf-Reaktionsgefäß 0,5 mL (Sarstedt (72699), Nürnbrecht) Eppendorf-Reaktionsgefäß 1,5 mL (Greiner (616201), Frickenhausen) Flachboden–Mikrotiterplatten mit Abdeckung, 24 Vertiefungen (Corning (3524), Wiesbaden) Flachboden–Mikrotiterplatten mit Abdeckung, 96 Vertiefungen (Biochrom (P92960), Berlin) Flachboden-Zellkultur-Makroplatte mit Abdeckplatte, 4 (Greiner (657160), Frickhausen) Vertiefungen Laborflaschen mit Gewinde, 500 mL (VWR international (215L1516), Hannover) Objektträger (76 x 26 mm) (Omnilab (9161151), Bremen) Pasteurpipetten, 22,5 mm aus Glas (Brand (747720), Wertheim) PD-10 Columns (Amersham Biosciences (17085101), Uppsala/Schweden) Petrischale (Durchmesser 94 mm) (Greiner (633171), Frickenhausen) Pipettenspitzen, gelb und blau (Sarstedt (70/762002) (70/760002), Frickenhausen) Kryoröhrchen, 1,8 mL (Nunc (379189), Wiesbaden) Nylon preseperation Filter 30 µm (Myltenyi Biotech, Bergisch Gladbach) Mini & MidiMACS Starting Kit (Myltenyi Biotech (130042501), Bergisch Gladbach) Molekularsieb Konzentratoren (Vivascience (VS2022), Hannover) Rundboden-Mikrotiterplatten mit Abdeckung; steril, 96 (Gechno Plastic Products TPP®, Trasadingen/Schweiz) Vertiefungen Röhrchen, 15 mL, Polypropylen Greiner (Corning (430791), New York, USA) Röhrchen für die Durchflusszytometrie, 5 mL (Becton Dickinson (352008), Heidelberg) Saugpipetten (10 mL) (Sarstedt (86.1254.01), Nürnbrecht) Tesafilm-Klebeband (Einzelhandel) Tiegelzange 400 mm (Fisher Scientific (9310240), Schwerte) Zentrifugenröhrchen, 15 mL aus Polypropylen (Falcons, steril) (Corning (430XXX), Wiesbaden) Zentrifugenröhrchen, 50 mL aus Polypropylen (Falcons, steril) (Corning (430829), Wiesbaden) Zellkulturflaschen, 200 mL (Nunc (156499), Wiesbaden) Zellkulturflaschen, 75 mL (Nunc (136196), Wiesbaden) 47 Material und Methode 3.2.3 Reagenzien Accustain® (Färbelösung nach Wright, modifiziert) (Sigma (WS16), Steinheim) Acridin-Orange (Sigma (A6014), Steinheim) Adjuvans zur Immunisierung von Ziegen (Veterinary Vaccine Adjuvant) (Gerbu (3002), Gaiberg) Adjuvans zur Immunisierung von Mäusen (Gerbu (3001), Gaiberg) Albumin, bovin, Fraktion V, 98% pulverisiert (BSA, bovines Serumalbumin) (PAA (K41-001-100), Linz/Österreich) Ammoniumchlorid (NH4Cl) (Sigma (A4514), Taufkirchen) Calciumchlorid (CaCl2 x 2 H2O) (Sigma (C-3881), Deisenhofen) Dimethylsulfoxid (DMSO) p.a. (J.T. Baker (7033), Groß-Gerau) D(+)-Glucose (wasserfrei) (Fluka (49140), Buchs/Schweiz) Ethanol 641, absolut, vergällt (CG Chemikalien, Laatzen) Ethanol absolut (Baker (8228), Deventer/Holland) Ethidiumbromid (Sigma-Aldrich (E87A51), Steinheim) Ethylendiamine-Tetraacetic Acid (EDTA) (Sigma-Aldrich (ED2SS), Steinheim) Fetales Kälberserum (FCS) (Biochrom (S0 113/431B), Berlin) Fluoreszein Isothiocyanate (FITC) (Sigma-Aldrich (F7250), Steinheim) ® Formaldehyd 37%, p.a., ACS, Rotiuran (Roth (49794.1), Karlsruhe) Histamin, freie Base (Sigma (H-7125) Deisenhofen) ® Iscové -Trockenmedium (Biochrom (T04610), Berlin) 125 LDN Nordhorn, < 130 kBq, 1 Flasche Lyophilisat gelöst in 5,5 mL A. dest. Jod-Histamin-Tracer Kaliumchlorid (KCl), kristallin (Biochrom (T046-10), Berlin) Kaliumhydrogencarbonat reinst (KHCO3) (Merck (3852), Darmstadt) Kupfer(II)-sulfat-5-hydrat (Roth (8174.1), Karlsruhe) L-Glutamin (Biochrom (K0283), Berlin) Lymphozytenseparationsmedium (PAA Laboratories (J15-004), Linz/Austria) 2-Mercaptoethanol (J. T. Baker (8683), Groß Gerau) Magnesiumchlorid (MgCl2 x 6 H2O) (Sigma (M-0250) Deisenhofen) Natriumazid (NaN3), 10%ig (Sigma-Aldrich (S-2002), Steinheim) Natriumchlorid (NaCl) (Roth (9265.2), Karlsruhe) Natriumcarbonat (Na2CO3 wasserfrei) (Sigma (S-2127) Deisenhofen) Natriumdihydrogenphosphat (NaH2PO4 x 2 H2O) (Riedel-DeHaen AG (04269)) Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3) (Merck (6329) Darmstadt) Natriumhydroxyd-Pellets, wasserfrei (Sigma-Adrich (S-5881), Steinheim) N-Hydroxysuccinimido-Biotin (NHS-Biotin) (LDN Nordhorn) N-(1-Naphthyl-)Ethylendiamin-Dihydrochlorid (Sigma-Aldrich (N9125), Steinheim) Paraformaldehyd (Sigma-Aldrich (P6148), Steinheim) 48 Material und Methode Penicillin(-G)-Streptomycin Percoll TM (Biochrom (A2213), Berlin) (spezifisches Gewicht: 1,130 g/mL bei 4°C) (Pharmacia (17089101), Freiburg) Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) Dulbecco, (Biochrom (L18210), Berlin) ohne Ca2+/Mg2+ Phycoerythrin (PE) (Dianova (115015068), Hamburg) Polyethylenglycol (PEG) 8000 (Sigma (P-2139) Deisenhofen) Piceatannol (Merck Biosciences Ltd (527498) Beeston /UK) Propidiumiodid (PI) (Calbiochem (537059), Bad Soden) Salzsäure (HCl), konzentriert (37%) (Baker (6081), Deventer/Holland) Staphylokokken-Enterotoxin A (SEA), lyophilisiert (Sigma-Aldrich (S-9399), Steinheim) Saponin (Sigma-Aldrich (S-2149), Steinheim) SFM Gibco (Invitrogen (12045-076) Carlsbad, California) Streptavidin-FITC (Fluoreszeinisothiocyanat) (Dianova (016-090-084), Hamburg) Streptavidin-PE (Phycoerythrin) (DAKO (R0438), Denmark) Streptomycin (-Sulfat) (Biochrom (A331-27), Berlin) Tetramethylbenzidin (TMB) (Sigma-Aldrich (T-2885), Steinheim) Tri-Natriumcitrat (2xH2O) (Sigma-Aldrich (S-4641), Steinheim) Tris: Trisma Base (Tris[hydroxymethyl]aminomethan) (Sigma-Aldrich (T-1503), Steinheim) Türk Lösung (Essigsäure-Gentiana-Violettlösung) (Merck (9277), Darmstadt) Tween 20 (Polyoxyethylensorbitanmonolaurat) (Sigma-Aldrich (P-1379), Steinheim) 3.2.4 Puffer, Lösungen und Medien Puffer und Lösungen Akridinorange-EthidiumbromidStocklösung Acridinorange Ethidiumbromid PBS ELISA-Puffer A-Puffer (Coating buffer) 250 mg 250 mg ad 100 mL Na2CO3 NaHCO3 15 mM 35 mM pH 9,6 B-Puffer (Washing buffer) NaH2PO4 Na2HPO4 NaCl Tween 20 2,5 mM 7,5 mM 145 mM 0,1% pH 7,2 C-Puffer (Substrate buffer) Citrat Na2HPO4 33,3 mM 66,7 mM pH 5,0 49 Material und Methode MIF-Puffer: ad 0,5 g 0,01 g 100 mL ad 8,77 g 1.000 mL ad ad 1,5 mL 500 mL pH 7,3-7,35 NaCl Na2HPO4 x H2O KH2PO4 KCl Aqua tridest. HCl / NaOH ad ad 8g 1,24 g 0,2 g 0,2 g 1.000 mL pH 7,4 HCl / NaOH ad pH 7,4 ad 6,42 g 0,373 g 7,56 g 1,6 g 100 mL Pipes A-Puffer-Konzentrat Aqua tridest CaCl2 1 mol/L MgCl2 2 mol/L ad HCl / NaOH 5 mL 45 mL 100 µL 50 µL pH 7,2 Tris Tween 20 A. tridest HCl (37%) Aqua tridest. 30 g 0,1 mL 380 mL pH 8,5 500 mL BSA NaN3 PBS (s. Phosphatpuffer) Natriumchloridlösung 0,9%: NaCl Aqua tridest. PBS-EDTA: EDTA (0,1 mol/L pH 8) PBS (s. Phosphatpuffer) HCl / NaOH Phosphatpuffer (PBS): (aus Trockensubstanz Dulbecco PBS, s. 3.2.3) Phosphatpuffer, doppelt konz. (2xPBS): Herstellung unter Verwendung der zweifachen Menge Trockensubstanz wie in PBS. Pipes A-Puffer-Konzentrat (10x): (Die Lösung wurde bei –20°C NaCl gelagert, vor dem Versuch KCl aufgetaut, 1:10 mit Aqua tridest. Pipes NaOH verdünnt) Aqua tridest. Pipes B-Puffer: . Tris-Puffer 0,5 M: (Weitere Molaritäten des Puffers (insbesondere 0,15 M Tris-Puffer) wurden durch Zugabevon Aqua tridest. und Kontrolle des pH hergestellt.) ad ad Die ELISA-Puffer, Pipes A, Pipes B und Tris-Puffer wurden nicht sterilisiert. Alle übrigen Puffer wurden steril filtriert (Porenweite 0,2µm, s. 3.2.2) oder autoklaviert (120°C für mindestens 20 min). So weit nicht anders erwähnt, wurden sämtliche Puffer bei 4°C gelagert. 50 Material und Methode Medien für Zellkulturen Fetales Kälberserum (FCS) (s. 3.2.3) FCS wurde bei 56°C für 60 Minuten im Wasserbad komplement- und mykoplasmeninaktiviert. Die Lagerung von sterilen aliquoten Teilen erfolgte bei -20°C. Zellkulturmedium I10FStrep Iscove-Grundlösung (Iscove-Trocken-medium [s. 3.2.3] nach Herstellerangaben in 10 L Aqua tridest. gelöst) mit L-Glutamin 4 mmol/L, hitzebehandelten (s. oben) FCS 10% (v/v) und mit Zusatz von Streptomycin (100 µg Streptomycin/mL Medium) Zellkulturmedium I10FH+ I10FStrep mit Zusatz von HEPES-Puffer (15 mmol/L Medium final) und Penicillin (50 IU/mL Medium) Zellkulturmedium R0- RPMI-Grundlösung (104,3 g RPMI 1640-Medium-Trockensubstanz [s. 3.2.3] in 10 L Aqua tridest. gelöst) mit HEPES-Puffer 15 mmol/L, L-Glutamin 2 mmol/L, NaHCO3 18 mmol/L, ohne Zusatz von Antibiotika Zellkulturmedium R10F+ R0- mit hitzebehandeltem (s. oben) FCS 10% (v/v) und mit Zusatz von Penicillin-Streptomycin (100 IU G-Penicillin/mL R0-, 100 µg Streptomycin/mL R0-) SFM® (serum free media) Serumfreies kommerzielles Komplettmedium zur Kultivierung von Hybridomzellen (3.2.3) 51 Material und Methode 3.2.5 Allergene Baumpollenmischung Acer saccharum (Zuckerahorn) Betula nigra (Schwarzbirke) Carya ovata (Schindelborkige Hickorynuß) Fraxinus americana (Amerikanische Esche) Fagus americana (Amerikanische Buche) Jugulans niger (Schwarze Walnuss) Platanus occidentalis (Platane) Populus deltoideus (Schwarzpappel) Quercus rubra (Roteiche) Salix nigra (Schwarzweide) Ulmus americana (Amerikanische Weißulme) Greer-Laboratories, USA, Aufreinigung über PD 10, eingestellter Proteingehalt: 1600 µg/mL Culicidae (Stechmücken) Greer-Laboratories, USA, Aufreinigung über PD 10, Proteingehalt: 2700 µg/mL Culicoides nubeculosus (Gnitze) Greer-Laboratories, USA, Aufreinigung über PD 10, Proteingehalt: 1.300 µg/mL bzw. 1.900 µg/mL Ephemeroptera (Eintagsfliege) Greer-Laboratories, USA, Aufreinigung über PD 10, Proteingehalt: 2400 µg/mL Gräsermischung, Agrostis alba (Weißes Staußgras) Anthoxantum odoratum (Wiesenruchgras) Dactylis glomerata (Gemeines Knäulgras) Festuca elatior (Schwingelgras) Lolium perenne (Deutsches Weidelgras) Phleum pratense (Wiesenlieschgras) Poa pratensis (Wiesenrispengras) Greer-Laboratories, USA, Aufreinigung über PD 10, Proteingehalt: 1200 µg/mL Heterocera (Motten) Greer-Laboratories, USA, Aufreinigung über PD 10, Proteingehalt: 2000 µg/mL Musca domestica (Hausfliege) Greer-Laboratories, USA, Aufreinigung über PD 10, Proteingehalt: 800 µg/mL Spätblüher-Mischung Amaranthus hybridus (Grünähriger Fuchsschwanz) Artemisia vulgaris (Gemeiner Beifuß) Chenopodium ambrosianum (Mexikanisches Teekraut) Iva ciliata (Weidenröschen) Xanthium commune (Spitzklette) Greer-Laboratories, USA, Aufreinigung über PD 10, Proteingehalt: 720 µg/mL Stomoxis calcitrans (Wadenstecher) Greer-Laboratories, USA, Aufreinigung über PD 10, Proteingehalt: 75 µg/mL Tabanus spp. (Pferdebremse) Greer-Laboratories, USA, Aufreinigung über PD 10, Proteingehalt: 2000 µg/mL 52 Material und Methode 3.2.6 Antikörper und Seren Donkey-anti-goat (Esel-anti-Ziege) IgG, Antiserum Scantibodies, (3AD497) Grade (Präzipitationsserum) Konzentration: nicht bestimmt Goat-anti-Acylhistamin (Ziege-anti-Acylhistamin), Serum, Ig-Fraktion, affinitätsgereinigt (AffiniPure) AG Immunologie, TiHo Hannover, verdünntes, Hyperimmunserum (s. 3.3.11) Goat-anti-horse (Ziege-anti-Pferd) IgG (H&L) Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., (108-005-003), Lot: 49512 Konzentration: 2,4 mg/mL Goat-anti-horse (Ziege-anti-Pferd) IgG (H&L), Peroxidase-conjugated AffiniPure Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., (108-035-003), Lot: 33371 Konzentration: 0,8 mg/mL Goat-anti-mouse (Ziege-anti-Maus) IgG + IgM (H+L), Peroxidase-conjugated AffiniPure Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., (115-035-044), Lot: 32608 Konzentration: 0,8 mg/mL Goat-anti-mouse (Ziege-anti-Maus) IgG + Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., IgM (H&L), F(ab´)2, adsorbiert gegen Pferdeserum (115-006-068), Lot: 53654 Proteine Konzentration: 1,3 mg/mL Goat-anti-mouse IgG + IgM konjugiert mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., (115-015-068), Lot: unbekannt Goat-anti-mouse IgG + IgM konjugiert mit Phycoerythrin (PE) Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., (115-116-146), Lot: unbekannt Mouse-anti-EqIgA (Maus-anti-EqIgA) (KlonA), mAK freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Paul Lunn, USA Mouse-anti-EqIgE (muAB-anti-eqIgE 134) (m(γ1)αEqIgE), mAK Immunologie, TiHo Hannover Konzentration: 10 µg/mL oder Zellkulturüberstand Mouse-anti-EqIgE (muAB-anti-eqIgE 176) (m(γ1)αEqIgE), mAK Immunologie, TiHo Hannover Zellkulturüberstand Mouse-anti-EqIgG1(Maus-anti-EqIgG1) (mαEqG3-47), mAK Immunologie, TiHo Hannover Mouse-anti-EqIgG1(Maus-anti-EqIgG1) (CVS45), mAK freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Paul Lunn, USA Mouse anti EqIgG2, mAK Freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Anja Wege, ITH Hannover Mouse-anti-EqIgG3 (Maus-anti-EqIgGa3) (CVS 40), freundlicherweise zur Verfügung gestellt von mAK Paul Lunn, USA Mouse-anti-EqIgG4 (Maus-anti-EqIgG4) (CVS 39), freundlicherweise zur Verfügung gestellt von mAK Paul Lunn, USA Mouse-anti-EqIgM (mαEqM1-141), mAK Immunologie, TiHo Hannover Zellkulturüberstand Rat-anti-mouse IgG1 MicroBeads, mAK Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, s. 3.2.2 53 Material und Methode Tab. 3 Verwendete monoklonale Antikörper zur Charakterisierung zellulärer Oberflächenstrukturen Name Spezifität Donor/ Isotyp Finale Referenz Verdünnung mAK 134, 176 anti eqIgE Maus/IgG1 1:4 WAGNER et al (2001) Bo 139 anti boMHC-KLASSE-IMaus/IgG3 1:1 Von der Osten (1990) CVS41 mAK anti eqIgG1 Maus/IgG2b 1:4 SHEORAN et al (1998) 11D62.1.11.4a mAK anti eqIgG2 Maus/IgM 1:4 WEGE et al. 2004 CVS39 mAK anti eqIgG4 Maus/IgG1 1:4 SHEORAN et al 1998 CVS40 mAK anti eqIgG5 Maus/IgG1 1:4 SHEORAN et al 1998 Isotyp-Kontrollen Anti-bovine workshop Maus/s. o. AB/irrelevante Epitope (3W-096, 3W-046, 3W-244) 1:2 bis 1:4 n.n. Bo 1 1:1 Schuberth (1991) anti MHC-I Maus/IgG1 Nachweisantikörper Als Sekundärantikörper für die indirekte Membranimmunfluoreszenz dienten affinitätschromatographisch gereinigte, polyklonale Antikörperpräparationen: Ziege-anti-Maus IgG und IgM (schwere und leichte Ketten) konjugiert mit Fluoreszeinisothiocyanat oder Phycoerythrin (PE) (s. S.53 und 3.3.13). Beide Sekundärantikörper waren gegen Human-, Rinder- und Pferdeserumproteine absorbiert. Die eingesetzte Verdünnung betrug für den FITC konjugierten Ziege-anti-Maus-Antikörper in der Regel 1:100 (in MIF-Puffer, s. 3.2.4), zur Herstellung von Referenzzellen (s. S. 58) wurde der Antikörper 1:40 verdünnt. 54 Material und Methode 3.2.7 Lösungen für die Durchflusszytometrie und Dichtegradientenzentrifugation Zur Reinigung des Gerätes wurde das Messkanalsystem nach den Messungen mit steril filtriertem Aqua tridest. (Porenweite 0,2 µm, s. 3.2.2) und 1%-iger NatriumhypochloritLösung (s. 3.2.3) gespült. Trägerflüssigkeit (Sheath fluid) Als Trägerflüssigkeit für die durchflusszytometrische Messung wurde steril filtriertes (0,2 µm) PBS (s. 3.2.4) mit 0,1 mg/mL NaN3 (Natriumazid, s. 3.2.3) verwendet. Propidiumiodidstammlösung Propidiumiodid (s. 3.2.3): 100 µg/mL gelöst in Trägerflüssigkeit Die Stammlösung wurde in aliquoten Teilen bei -20°C gelagert. Zum Anfärben toter Zellen wurden der Trägerflüssigkeit Propidiumiodidlösung zugesetzt (Endkonzentration 2 µg/mL). Percoll® Dabei handelt es sich um ein hypotones Sol aus Silikapartikeln, die mit Polyvinyl-Pyrrolidon beschichtet sind (s. 3.2.3). Percoll® hat ein spezifisches Gewicht von 1,130 g/mL bei 20°C. Die Herstellung einer isotonen Percoll®-Lösung erfolgte durch Zusatz von 840 mg NaCl zu 100 mL Percoll®. Mit steriler 0,9%iger NaCl-Lösung (s. 3.2.4) wurden eine 55%ige und eine 78%ige Percoll®-Lösung hergestellt. 3.2.8 Tiere Für die Untersuchungen steht neben Einsendungen von Blutproben von Patientenbesitzern eine Herde aus 37 Isländerstuten im Alter zwischen 3 und 11 Jahren zur Verfügung. Unter gleichen Haltungsbedingungen sind 14 an Sommerekzem erkrankte, 9 gesunde und 3 Jungtiere mit noch unbekanntem Status untergebracht (Datenerhebung: Besitzerinformation und FIT, s. 3.3.9). An den Probanden wird eine Beurteilung der klinischen Symptome und deren Entwicklung im Jahresverlauf vorgenommen. Zu den Arbeiten am Tier gehören die Herdenkontrolle des Gesundheitszustandes, sowie die regelmäßige Entnahme von Blutproben. Diese Gruppe möglichst homogener Patienten ermöglicht es, die in vivo Beurteilung mit den Ergebnissen aus dem FIT zu vergleichen. Zusätzlich kann auf die Daten der Blutprobeneinsendung von Besitzern zurückgegriffen werden, da der FIT als diagnostische Dienstleistung von der AG Immunologie angeboten wird. 55 Material und Methode 3.3 Methoden 3.3.1 Blutentnahme Die Blutentnahme zur Gewinnung und Untersuchung von Leukozyten in vitro erfolgte unter keimarmen Bedingungen mit einem Vacutainersystem (s. 3.2.1) durch Punktion der rechten oder linken Vena jugularis. Das Blut wurde in Ka-EDTA Vacutainerröhrchen aufgenommen und bis zur Verarbeitung, die maximal 24 Stunden nach Entnahme erfolgte, bei Raumtemperatur gelagert. 3.3.2 Serumgewinnung Für die Serumgewinnung wurde Vollblut in Vacutainerröhrchen ohne Zusatz eines Gerinnungshemmers gewonnen. Dieses wurde bis zur vollständigen Gerinnung und Retraktion des Blutkuchens bei Zimmertemperatur gelagert und daraufhin zentrifugiert (1.500 xg, 20 min, 20°C). Das Serum wurde abgesaugt, ein weiteres Mal zentrifugiert (s. oben) und abschließend zusammengeführt. Zur Herstellung von Komplement-inaktiviertem Serum wurde natives Serum für 30 min bei 56°C im Wasserbad erwärmt. Die Seren (natives - und Komplement-inaktiviertes Serum) wurden in aliquoten Teilen (1 mL in 1,5 mL Reaktionsgefäßen, s. 3.2.2) bei -20°C gelagert. 3.3.3 Zellzahl und Vitalitätsbestimmung Zellzählung aus Vollblut Um den Gesamtleukozytengehalt im Blut der Versuchstiere zu bestimmen wurde gerinnungsgehemmtes Vollblut 1:10 mit Türk Lösung (s. 3.2.3) inkubiert. Nach erfolgter Erythrozytolyse durch die enthaltene Essigsäure (erkennbar an dem Umschlag zu einer lackartigen Färbung) konnten die Proben mittels der Bürker-Kammer (s. 3.1) ausgezählt werden. Die Kerne der Leukozyten waren durch das eingelagerte Gentianaviolett von evtl. vorhandenen Erythrozyten oder Thrombozyten gut abzugrenzen. Vitalitätsbestimmung Sollte überprüft werden, wie viele der kernhaltigen Zellen aus den Blutproben lebendig waren, wurde eine Inkubation mit Acridinorange-Ethidiumbromid angesetzt. De bei 4°C 56 Material und Methode gelagerte Stocklösung enthielt 2,5 g Acridinorange und 2,5 g Ethidiumbromid pro Liter PBS. Zum Schutz vor mikrobiellem Verderb der Lösung war eine Endkonzentration von 0,02% (v/v) Natriumazid zugesetzt (s. 3.2.3). Diese Färbung ermöglicht eine gleichzeitige Vitalitätsbeurteilung und morphologische Differenzierung am Fluoreszenzmikroskop. Acridinorange bewirkt nach Eintritt in den Zellkern und Interkalation mit dsDNA eine Grünfluoreszenz nach Anregung durch UV-Licht. Die Form des Zellkerns wird sichtbar. Das rot fluoreszeierende Ethidiumbromid hingegen lagert sich im Zellplasma und, bei toten Zellen mit defekter Zellkernmembran, auch im Kern ein. Rot erscheinende Zellen werden als nicht vital beurteilt. 3.3.4 Anfertigen von Blutausstrichen und Leukozytendifferenzierung Zur Differenzierung von Leukozyten oder magnetisch sortierten Zellen wurden Blutausstriche bzw. Zytospins (s. 3.3.5) angefertigt. Auf einen entfetteten und gesäuberten Objektträger (s. 3.2.2) wurde ein Tropfen EDTA-Blut aufgetragen, mit einem angeschliffenen zweiten Objektträger mit einer fließenden Bewegung ausgestrichen und anschließend an der Luft getrocknet. Bei Zytospins wurden die getrockneten Objektträger mit einem Tropfen verdünntem autologen Plasma (1:10 in PBS, s. 3.2.4) befeuchtet, es schloss sich eine erneute Lufttrocknung an. Danach erfolgte eine modifizierte Färbung nach Wright (Accustain®, s. 3.2.3). Dazu wurden die Objektträger für 60 Sekunden mit 1 mL Accustain® bedeckt, danach reichlich 1 mL Aqua dest. hinzugegeben. Nach weiteren 90 Sekunden wurde der gesamte Objektträger mit Aqua dest. oder unter fließendem Wasser abgespült und an der Luft getrocknet. Differenzierung sowie Auszählung erfolgten lichtmikroskopisch mit einem Ölimmersionsobjektiv unter Berücksichtigung von mindestens 200 kernhaltigen Zellen (Vergrößerung 1000fach). 3.3.5 Anfertigung von Zytospins Basophile Granulozyten gehören zu einer der kleinsten Fraktionen kernhaltiger Zellen im peripheren Blut unserer Haussäugetiere. Im Ausstrich von Vollblut kommt es bei regulärer Bestimmung des Differentialblutbildes häufig zu negativen Befunden (0% Basophile Granulozyten). Bei gewaschenen, separierten oder magnetisch sortierten Zellfraktionen wurden zur Differenzierung deshalb Zytospins angefertigt. Dabei wurde ein spezielles ZytoSystem von Heraeus verwendet (s. 3.1). Die Zellen werden in konischen 0,5 mL Reaktionsgefäßen (s. 3.2.2) in die zylindrischen Bohrungen des Zyto Containers eingehängt. In den Boden des Einsatzes wird mit einer Kanüle ein Loch gebohrt. Anschließend wird die Zellsuspension auf einen unter dem Zyto Container eingebrachten Objektträger zentrifugiert. 57 Material und Methode Zwischen dem Objektträger und dem Container befinden sich gestanzte Filterpapiere, die die flüssige Phase der Zellsuspension während des Zentrifugierens aufnehmen, die zellulären Komponenten werden zentral unter der Bohrung im Reaktionsgefäß auf dem Objektträger angereichert. Für die Anfertigung der Zytospins wurden die Zellsuspensionen in maximal 200 µL aufgenommen. Das gesamte Zyto System mit eingebrachtem Objektträger wurde auf 4°C abgekühlt, anschließend das Reaktionsgefäß eingehängt, um dann für 5 Minuten bei 60 xg bis 80 xg zentrifugiert zu werden. Nach Ausbau und Lufttrocknung der Objektträger wurden diese wie unter 3.3.4 beschrieben mit Accustain® gefärbt. 3.3.6 Quantifizierung der Zahl vitaler Zellen mit Hilfe des Durchflusszytometers (Referenzzellmethode): Durch eine Färbung der toten Zellen mit Propidiumiodid (Fluoreszenz in der FL-3 des Durchflusszytometers, s. 3.1 und 3.3.13) ist es möglich, diese von lebenden Zellen zu unterscheiden. Eine bestimmten Anzahl Partikel, die sich von den zu untersuchenden Zellen unterscheiden, aber dennoch mit den gleichen Geräteeinstellungen zu messen sind, werden den Proben zugegeben. Anhand dieser kann eine Bestimmung der lebenden Zellen vorgenommen werden. In diesem Fall wurden bovine Zellen (Referenzzellen) zugesetzt. Werden die gemessenen Referenzzellen und die vitalen Zellen ins Verhältnis gesetzt, kann die absolute Zellzahl ermittelt werden. Um die verwendeten bovinen mononukleären Referenzzellen von den in Kultur befindlichen Zellen eindeutig unterscheiden zu können, erfolgte eine Markierung mit einem monoklonalen Antikörper gegen bovine MHC-Klasse-I-Moleküle (mAK Bo1, s. 3.2.6) und anschließend mit einem fluorochromgekoppelten Ziege-anti-Maus-Antikörper (s. 3.2.6 FITC gekoppelt). Eine längere Lagerung konnte durch eine Fixation mittels Paraformaldehyd ermöglicht werden. Die toten und fixierten Zellen fluoreszieren nach Zugabe von Propidiumiodid (s. S. 55) in der FL-1 und in der FL-3. Herstellung von Referenzzellen Referenzzellen wurden immer in größeren Mengen hergestellt und nach Fixation bei 4°C unter Lichtabschluss gelagert. Zur Färbung wurden jeweils 2 x 107 frisch separierte bovine mononukleäre Zellen des Blutes in ein 15 mL Röhrchen gegeben und bei 80 xg für 5 min und 4°C abzentrifugiert. Nach dem Abgießen des Überstandes wurde das Zellpellet in 100 µl PBS resuspendiert und mit 58 Material und Methode demselben Volumen des unverdünnten monoklonalen AKs Bo1 (s. 3.2.6) für 15 min bei 4°C inkubiert. Anschließend erfolgte ein Waschschritt mit 5 mL MIF-Puffer (s. 3.2.4) Zentrifugation über 7 min bei 80 xg und 4°C, Abgießen des Überstandes. Das resuspendierte Zellpellet wurde nun mit 100 µl des 1:40 verdünnten FITC-konjugierten Ziege-Anti-Maus Antikörpers (s. S. 53) versetzt und über 20 min unter Lichtabschluss bei 4°C inkubiert. Es schloss sich ein weiterer Waschschritt mit Resuspension der Zellen in 5 mL PBS an. Nach der Überführung der Zellsuspension in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen, wurde das Zentrifugenröhrchen mit PBS auf 50 mL aufgefüllt und die Zellen erneut abzentrifugiert (100 xg). Die Fixation des Zellpellets erfolgte in 30 mL einer 4%-igen ParaformaldehydLösung. Die Zellen inkubierten nach Resuspension 24 h bei 4°C unter Lichtabschluss. Anschließend wurden die Zellen 15 min bei Raumtemperatur abzentrifugiert (100 xg), dekantiert und ein zweites Mal in PBS gewaschen. Dieses nun gewonnene Zellpellet wurde in der PI-haltigen Trägerflüssigkeit aufgenommen und auf 4 x 105 Zellen/mL eingestellt. (Die Konzentration wurde vor Einsatz kontrolliert und gegebenenfalls korrigiert). 3.3.7 Gewinnung und Isolierung von Leukozyten aus dem Blut Elimination der Erythrozyten durch Waschen der Zellsuspension Gerinnungsgehemmtes Pferdeblut in 10 mL Vacutainerröhrchen wurde für 20 Minuten bei Raumtemperatur aufrecht gelagert. Auf Grund der schnellen Sedimentation von Pferdeblut sammelt sich bereits in dieser Zeit der Pool von Leukozyten als gräulich-weiße Schicht auf dem unterliegenden Erythrozytenkissen. Durch vorsichtiges Kippen des Röhrchens und Absaugen dieser Schicht gewinnt man das leukozytenreiche Plasma (LRP). Diese angereicherte Fraktion enthält nur noch wenige Erythrozyten. Im Folgenden wird das LRP in einen 50 mL Falcon aufgenommen, mit 50 mL PBS aufgefüllt und bei 200 xg für 10 Minuten zentrifugiert. Intakte Erythrozten kompaktieren sich dann als unterste Schicht des Sediments oder Pellets. Die ihnen aufgelagerten Leukozyten können durch vorsichtiges Schwenken mobilisiert werden, um sie dann erneut abzuhebern. Dieser Vorgang wird bis zur erwünschten Reinheit der Leukozyten wiederholt. Elimination der Erythrozyten durch hypotone Lyse Bei der Gewinnung von LRP (s. oben) kann es passieren, dass Zellen mit einem hohen spezifischen Gewicht anteilig verloren gehen. Alternativ zu dieser Methode können die Erythrozyten durch eine hyposmolare Lösung desintegriert werden. Dazu werden 10 mL 59 Material und Methode gerinnungsgehemmtes Vollblut in ein 50 mL Polypropylenröhrchen (Falcon, s. 3.2.2) überführt. Anschließend werden 20 mL Aqua dest. (4°C) hinzugegeben. Unter leichtem Schwenken des Röhrchens achtet man auf einen Umschlag der Färbung. Aus der Suspension wird eine lackartig rote „Lösung“. Sollte dies nach 20 Sekunden nicht eintreten, wird unabhängig davon das Falcon mit 20 mL doppelt konzentriertem PBS aufgefüllt, um die Isotonie wieder herzustellen. Anschließend wird die Zellsuspension bei 200 xg für 10 Minuten zentrifugiert. Am Boden des Falcons kann nun die Effizienz der hypotonen Lyse beurteilt werden: Befindet sich unter den weiß erscheinenden Leukozyten ein dunkelrotes Pellet, sind noch intakte Erythrozyten vorhanden. Nach Absaugen des Überstandes wird der Prozess dann wiederholt, bis die erwünschte Reinheit der Leukozyten erreicht ist. Isolation einzelner Populationen aus PBL mittels Dichtegradientenzentrifugation Zur Auftrennung der peripheren Blutleukozyten beim Pferd folgte der ErythrozytenSedimentation eine Percoll®-Dichtegradienten-Zentrifugation. In einem 50-mL-Falcon wurden Percoll®-Lagen (20°C) unterschiedlicher Dichte (55 und 78%; s. 3.2.7) übereinander geschichtet: Zunächst wurden ca. 10 mL des 55%igen Percolls® in das Röhrchen gegeben. Diese Lage wurde mit Hilfe einer auf einer Spritze aufgesetzten Nadel (0,9 x 60 mm) durchstochen und mit dem 78%igen Percoll® behutsam unterschichtet. Anschließend wurde vorsichtig der leukozytenreiche Überstand über die obere Percoll®-Lage geschichtet und das Röhrchen zentrifugiert (1000 xg, 20 min, 20°C). Der Überstand mit den mononukleären Zellen (am Übergang zur ersten Phase) wurde abpipettiert, bevor die PMN-haltige Interphase zwischen den zwei Percoll®-Schichten gewonnen wurde. Geerntete Zellen wurden zweimal in PBS gewaschen (1. Zentrifugation: 220 xg, 10 min, 4°C; 2. Zentrifugation: 140 xg, 8 min, 4°C). Nach dieser Separation lagen PMN und MNC in einer Reinheit von >95% vor. 3.3.8 Magnetisches Sortieren (MACS) von IgE+ Zellen Bei dieser Trennmethode werden die Zellen über monoklonale Antikörper direkt oder indirekt mit magnetischen Mikropartikeln (Durchmesser ca. 100 nm) markiert. Die Zellsuspension mit spezifisch markierten Zellen und unmarkierten Zellen wird über eine Trennsäule gegeben, die sich in einem Permanentmagnetfeld befindet. Die Trennsäulen besitzen eine Matrix aus Stahlwolle oder eisenmagnetischen Kugeln. Die unmarkierten Zellen durchlaufen die Säule im Hochgradientenfeld, die markierten Zellen bleiben an der Trennsäule hängen und können anschließend außerhalb des Magnetfeldes eluiert werden. Das MACS System kann zur Anreicherung oder zum Ausschluss (Depletion) einer Zellpopulation aus einer Gesamtpopulation eingesetzt werden. 60 Material und Methode Für die Isolierung einer Fraktion IgE positiver Zellen mittels magnetischer Korpuskel wurden mindestens 140 mL gerinnungsgehemmtes Blut (Heparin oder EDTA, s. 3.2.1) verwendet. Initial wurde eine hypotone Lyse (s. 3.3.7) durchgeführt. Anschließend wurde die Zellzahl bestimmt (s. 3.3.3). Die Markierung und das Sortieren der Zellen bei 4°C wurden mit mindestens 5x108 kernhaltigen, vitalen Zellen begonnen. Nach der Inkubation mit dem mAK anti eq IgE 134 (s. 3.2.6) in einem 15 mL Polypropylenröhrchen (3.2.2) wurden die Zellen einmalig mit PBS/BSA (s. 3.2.4) gewaschen. Anschließend wurden 100 µL Ratte anti Maus IgG1MicroBeads (s. 3.2.6) zu dem möglichst trockenen Zellpellet gegeben und für weitere 20 min auf Eis inkubiert. Ohne einen weiteren Waschschritt wurde dann ein Phycoerythringekoppelter anti Maus Sekundärantikörper (s. 3.2.6) in einer 1:100 Verdünnung in PBS hinzugegeben. Nach 15 min Inkubation folgte ein weiterer Waschschritt (s.o.) mit anschließender Resuspension der Zellen in 8 mL PBS/BSA und eine erste durchflusszytometrische Kontrolle auf den Erfolg der Membranimmunfluoreszenz (s. 3.3.14). Die Säulen zur Trennung der Fraktionen wurden mit gekühltem PBS/BSA vorbereitet (mindestens 3x Säulenvolumen zum Spülen) und in das magnetische Feld eines midiMacs (s. 3.2.2) verbracht. Die Zellen wurden über einen Nylon Gaze-Filter auf die Säule aufgetragen, um Zellaggregate vor der Säule zurück zu halten. Anschließend wurde PBS/BSA zum Auswaschen nicht markierter Zellen aufgetragen (mindestens 2x Säulenvolumen). Bei konstanter Durchflussrate, kontrolliert durch die Größe der Auslassöffnung (0,9 mm) sowie die Tropfrate (2-3 Tropfen pro Sekunde), wurde das Eluat wiederholt durchflusszytometrisch kontrolliert, bis keine Zellen mehr von der Säule kamen. Dann wurde die Säule aus dem magnetischen Feld entfernt, die aufgesetzte Kanüle verworfen, nochmals PBS/BSA auf die Säule gegeben und mittels eines mitgelieferten Stempels das Residualvolumen (1x Säulenvolumen, hier 5 mL) eluiert. Anschließend erfolgte eine durchflusszytometrische Analyse der über den mAK gegen IgE angereicherten Zellen. Je nach gewünschtem Reinheitsgrad der Zellen wurde die Prozedur wiederholt, oder mit den gewonnenen Zellen weitergearbeitet. 61 Material und Methode 3.3.9 Funktioneller in vitro-Test (FIT) zur Bestimmung des Sensibilisierungsgrades basophiler Granulozyten Als funktionelle Messgröße der ex vivo Diagnostik einer Sensibilisierung equiner Basophiler Granulozyten wurde 1999 von KAUL der FIT entwickelt. Dieser Test quantifiziert Histamin (RIA, s. 3.3.10), welches durch Provokation in gewaschenem Vollblut freigesetzt wird (FIT). Dabei kann man drei grundsätzlich verschiedene „Provokationen“ unterscheiden: 1. physikalische Freisetzung (thermische Behandlung) 2. Provokation durch die generelle Sensibilisierung basophiler Granulozyten (Antikörper vermittelte, Allergen-/Antigen-unabhängige Degranulation) 3. Provokation durch allergenspezifisch) die spezifische Sensibilisierung (Antikörper vermittelt, Histamin-Freisetzung Um störende Serumbestandteile, wie freies Histamin und nicht zellgebundene Antikörper, möglichst zu entfernen, wurden die EDTA-Blutproben vor der eigentlichen HistaminFreisetzung zweimal mit PBS (s. 3.2.4) gewaschen. Dazu wurden je Tier 7 mL EDTA-Blut in ein steriles 50 mL Zentrifugenröhrchen (s. 3.2.2) gegeben, mit PBS auf 50 mL Gesamtvolumen aufgefüllt und sorgfältig gemischt. Dann wurde die Probe bei 400 xg und Raumtemperatur für 10 min. ohne Bremse zentrifugiert. Der Überstand wurde mittels einer weitlumigen Absaugpipette bis auf 7,5 mL abgehoben und verworfen. Die Probe wurde gründlich resuspendiert, erneut mit PBS auf 50 mL aufgefüllt und sorgsam durchmischt. Noch einmal wurde die Probe unter den oben genannten Bedingungen zentrifugiert. Der Überstand wurde diesmal bis auf das ursprüngliche Probenvolumen von 7,0 mL abgehoben und verworfen. Die so gewaschenen Blutzellen wurden abermals sorgfältig resuspendiert, bevor sie auf die unterschiedlichen Ansätze verteilt wurden. Zur Histaminfreisetzung (Release) aus den basophilen Granulozyten wurden folgende Ansätze hergestellt: a) Spontan-Freisetzung: 250 µl Suspension der gewaschenen Blutzellen wurden 250 µl Freisetzungspuffer Pipes B (3.2.4) zugesetzt. Die spontane Freisetzung dient als Kontrolle dafür, wie viel Histamin von den basophilen 62 Material und Methode Granulozyten alleine als Folge der mechanischen Behandlung oder auf Grund einer Vorschädigung der Zellen, ohne den Einfluss von Induktoren, freigesetzt wird. b) physikalische Freisetzung (Kochen des Blutes): 200 µl Zellsuspension wurden mit 800 µl Pipes B versetzt und für 10 min. im Wasserbad gekocht. Um Überdruck und dadurch ein Aufplatzen des Reaktionsgefäßes zu vermeiden, wurde zuvor in den Deckel des Eppendorf-Cups mit Hilfe einer Kanüle ein Loch gestochen. Nach dem Kochen wurden die Proben bei 8.000 xg für 3 min. zentrifugiert und so der zellfreie Überstand gewonnen. In der Koch-Freisetzung werden die Zellen nicht mit Induktoren inkubiert, sondern durch Hitzeeinwirkung zerstört und so das in ihnen enthaltene Histamin physikalisch freigesetzt. c) Antikörper induzierte Freisetzung (generelle Sensibilisierung) 250 µl Zellsuspension wurden 250 µl in Pipes B gelöste Antikörper zugesetzt. Hierzu wurden zwei unterschiedliche Antikörper verwendet: Zum einen war dies ein polyklonales goat-anti-horse IgG (H+L) Immunserum (s. 3.2.6), das in einer Endkonzentration von 60 µg/mL und 20 µg/mL eingesetzt wurde. Durch diese Antikörper werden Immunglobuline, die über Fc-Rezeptoren auf der Oberfläche von basophilen Granulozyten gebunden sind, kreuzvernetzt und so, über die betroffenen FcRezeptoren, die Zellen aktiviert. Durch Fc-Rezeptor vermittelte Signaltransduktion kommt es zur Ausschüttung von Histamin aus den Granula dieser Zellen. Dieses polyklonale Serum wurde zur Freisetzung von Histamin genutzt, als noch kein monoklonaler AK gegen equines IgE zur Verfügung stand, hat sich aber auf Grund einer hohen Verlässlichkeit sowie Reproduzierbarkeit der Messergebnisse auch bis heute als unverzichtbar für die Auswertung des FIT erwiesen. Zudem bietet diese Freisetzung qualitativ andere Informationen, als die Freisetzung über equines IgE (s. 4.3) Der zweite verwendete Antikörper ist ein institutseigener monoklonaler Antikörper gegen Pferde-IgE (mouse-anti-eqIgE, s. 3.2.6). Der Überstand aus den serumfreien HybridomaZellkulturen wird in ausreichender Konzentration direkt eingesetzt, normalerweise in einer Verdünnung von 1:4 in Pipes B. Dieser Antikörper überbrückt membranständige IgE Moleküle, und führt so zu einer Allergen unabhängigen, Fcε-Rezeptor vermittelten Aktivierung und Degranulation der Basophilen Granulozyten. d) Allergen induzierte Freisetzung (spezifische Sensibilisierung): 250 µl Zellsuspension wurden 250 µl in Pipes B gelöstem Allergen (s. 3.2.5) zugesetzt. Die verschiedenen Allergen-Präparationen kamen hier in den folgenden Endkonzentrationen zum Einsatz (vgl. 3.3.6.3 b): 63 Material und Methode Culicoides nubeculosus: 15 µg/mL, 5 µg/mL, 0,5 µg/mL sowie 0,05 µg/mL Culicidae spp.: 50 µg/mL, 5 µg/mL Ephemeroptera: 50 µg/mL, 5 µg/mL Heterocera: 15 µg/mL, 5 µg/mL Musca domestica: 50 µg/mL, 5 µg/mL Solenopsis invicta: 50 µg/mL, 5 µg/mL Stomoxys calcitrans: 35 µg/mL, 5 µg/mL Tabanus spp.: 50 µg/mL, 5 µg/mL Gräsermischung: 50 µg/mL, 5 µg/mL Baummischung: 50 µg/mL, 5 µg/mL Spätblüher-Mischung: 50 µg/mL, 5 µg/mL Alle eingesetzten Allergenpräparationen waren in Vorversuchen dahingehend überprüft und auf entsprechende Konzentrationen eingestellt worden, dass sie keine unspezifische Zellaktivierung bei Pferden bewirken. Zusätzlich wurden die Allergenstocklösungen über PD10 Säulen (s. 3.2.2) eluiert, um etwaige originäre Kontaminationen durch Histamin zu entfernen. Die Größe des Histamins und damit einhergehend die längere Retentionszeit in der Säule sollte in einem Bereich liegen, in dem keine potentiellen Antigene/Allergene verloren gehen. In diesen Ansätzen sollte untersucht werden, inwieweit das Allergen von membranständigen, an Fc-Rezeptoren gebundenen Antikörpern erkannt wird und so, über Fc-RezeptorÜberbrückung zur Aktivierung der basophilen Granulozyten und Histaminausschüttung führt. Die Histaminfreisetzung findet unter Zugabe von Pipes B in Eppendorf-Cups statt. Die in diesem Puffer enthaltenen Ca2+- und Mg2+-Ionen ersetzen das zuvor durch das EDTA komplexierte Calcium und Magnesium des Blutes, sodass nun wieder Bedingungen vorliegen, die es den Basophilen Granulozyten ermöglichen, zu degranulieren. Dazu soll den Zellen eine Endkonzentration von 1 mM Ca2+ und 1 mM Mg2+ zur Verfügung stehen. Nach Zugabe der Induktoren wurden die Ansätze gemischt und, ausgenommen der KochFreisetzungsansatz (s.o.), für 60 min. bei einer Temperatur von 37°C im Wärmeschrank inkubiert. Wenn eine abweichende Inkubationsdauer verwendet wurde, wird im Text gesondert darauf hingewiesen. Um die Reaktion zu stoppen, wurden die Ansätze danach für 20 min. auf Eis gestellt und anschließend bei 700 xg bei Raumtemperatur für 10 min. zentrifugiert. Die zellfreien Überstände wurden vorsichtig abgenommen und bei einer Temperatur von -20°C bis zur Weiterverarbeitung im RIA (Nachweis des Histamingehaltes) aufbewahrt. 64 Material und Methode 3.3.10 Kompetitiver Histamin-Radio-Immuno-Assay (RIA) Zur Bestimmung des Histamingehaltes der Überstände wurde hier ein kompetitiver RIA eingesetzt. In diesem System konkurrieren ein radioaktiv markiertes Histamin (Jod125Histamin-Tracer (s. 3.2.3)) und das Probenhistamin um die limitierte Anzahl von AntikörperBindungsstellen. Histamin ist im Pflanzen- und Tierreich weit verbreitet und strukturidentisch, so dass es nicht möglich ist, Antikörper gegen Histamin selbst zu erzeugen. Zum einen ist es als Molekül zu klein, um intrazytosolisch prozessiert und anschließend präsentiert zu werden (Hapten), zum anderen wäre bei einer erfolgreichen Immunantwort die normale Autoimmuntoleranz überwunden – mit nicht absehbaren Folgen für den Impfling. Dieses Problem wurde mit Hilfe der Acylierung des Histamins gelöst: Die Antikörper des hier eingesetzten Ziegenserums (goat anti Ach, s. 3.2.6) sind spezifisch gegen N-Acyl-Histamin gerichtet. Das Probenhistamin muss folglich vor der Kompetition acyliert werden. Bei dem Tracer-Histamin handelt es sich auf Grund der Jodierung bereits um ein acyliertes Histamin. Die Bindung von Antigen und Antikörper im kompetitiven RIA unterliegt dem Massenwirkungsgesetz und endet mit der Einstellung eines dynamischen Gleichgewichtes. Hat sich dieses Gleichgewicht eingestellt, werden die Antigen-Antikörperkomplexe mittels eines präzipitierenden Antikörpers (s. 3.2.6) gefällt, der Überstand verworfen und die Radioaktivität des Präzipitates gemessen. Aufgrund der Kompetition verhält sich dabei die Höhe der Radioaktivität umgekehrt proportional zur Histaminkonzentration der Probe. Die Berechnung des Probenhistamingehalts erfolgte anhand einer mitgeführten Standardreihe. Acylierung des Probenhistamins: Für den RIA wurden folgende Proben im Doppelansatz in Polystyrol-Röhrchen (s. 3.2.2) vorgelegt: - Histamin-Standards: je 50 µl Standardlösung in 0,1 N HCl + 50 µl Pipes B (s. 3.2.4) - histaminfreie Probe (B0): 50 µl 0,1 N HCL + 50 µl Pipes B - Probe für nichtspezifische Bindung (NSB): 50 µl 0,1 N HCL + 50 µl Pipes B - Freisetzungs-Überstände: 100 µl Überstand 65 Material und Methode Zu all diesen Proben wurden jeweils 50 µl Tris-Puffer (s. 3.2.3 u. 3.2.4) sowie 50 µl Acylierungsreagenz (NHS-Biotin) gegeben und die Ansätze für 30 min. bei Raumtemperatur inkubiert. Radio Immuno Assay (RIA): Zu jeder Probe und zur Tracer-Kontrolle in zwei weitere Röhrchen wurden 50 µl 125JodHistamin-Tracer (s. 3.2.3) pipettiert. Danach wurde zu jedem Ansatz, nicht jedoch zur TracerKontrolle und der NSB-Probe, 50 µl Ziege-anti-Acylhistamin Serum (s. 3.2.6) gegeben, die Proben gemischt und bei 4°C über Nacht (16-24 h) inkubiert. Nun wurde jeder Probe, außer der Tracer-Kontrolle, 1 mL Präzipitationsserum (3.2.6) zugesetzt, die Proben gemischt und für 15 min. bei 4°C inkubiert, bevor sie bei 1500 xg für 15 min. bei Raumtemperatur zentrifugiert wurden. Die Überstände (außer Tracer-Kontrollen) wurden vollständig abgegossen. Messung und Auswertung Die Radioaktivität der Proben wurden im Gamma-Counter (LKB Wallac 1272 Clinigamma (s. 3.1)) gemessen und die Ergebnisse als Zählimpulse pro Minute (counts per minute, cpm) angegeben. Von den Doppelansätzen wurden zuerst die Mittelwerte berechnet und davon der Mittelwert der NSB-Probe abgezogen. Anschließend wurden alle Probenwerte in Prozent zum B0-Wert ausgedrückt (B/B0%-Wert). 66 Material und Methode 100 obere Asymptote B/B0 (%) 80 sigmoidale Anpassungsfunktion 60 40 20 0 untere Asymptote 1 10 100 Histamin [ng/mL] Abb. 1 Graphische Darstellung der Histamindetektion nach sigmoidaler Anpassung im kompetitiven RIA Zur Erstellung der Standardkurve wurde die bekannte Histaminkonzentration der Standardlösungen (s. 3.3.9) auf der logarithmisch eingeteilten Abszisse aufgetragen und die zugehörigen B/B0-Werte auf der linearen Ordinate (B=Probenwert, B0=Histamin freie Probe). Anhand einer approximativen sigmoidalen Anpassungsfunktion (s. unten) wurden die B/B0-Wert der Proben in die Histaminkonzentration umgerechnet. Die Gleichung zur Erstellung der sigmoidalen Anpassungsfunktion lautet: f(x)=(A1-A2/1+(x/x0)p)+A2 mit A1: x0: x: obere Asymptote Wendepunkt Histaminkonzentration A2: p: f(x): untere Asymptote Potenz B/B0%-Wert Nach KAUL (1998) wurde der Histamingehalt der Maximalfreisetzung jedes Tieres (Kochfreisetzung oder Antikörperfreisetzung goat-anti-horse IgG (H+L) 60 µg/mL) gleich 100% gesetzt. Die Histamingehalte der weiteren Proben dieses Pferdes wurden dann in Prozent von der Maximalfreisetzung ausgedrückt. 67 Material und Methode Zur Auswertung wurden nur solche Proben herangezogen, deren Spontanfreisetzung unter 6% der Maximalfreisetzung betrugen. (Diese Grenze ergibt sich aus den Untersuchungen von KAUL und beruht auf dem Mittelwert aller von ihr gemessenen Spontanfreisetzungen zuzüglich der 3-fachen Standardabweichung.) Beträgt der Histamingehalt eines Allergen-Ansatzes mindestens 10% der Maximalfreisetzung, gilt dieser Ansatz als positiv. (Dieser Wert beruht ebenfalls auf dem Mittelwert aller von KAUL gemessenen Spontanfreisetzungen zuzüglich der 6-fachen Standardabweichung.) Je nach dem, in wie vielen der zwei bzw. vier Allergenkonzentrationsstufen der Histamingehalt diese Grenze überschreitet, wird der Sensibilisierungsgrad der basophilen Granulozyten entsprechend mit 0 (keine Sensibilisierung), 1 (sensibilisiert), 2 (stark sensibilisiert), 3 (hochgradig sensibilisiert) oder 4 (höchstgradig sensibilisiert) angegeben. 3.3.11 Immunisierung von Ziegen zur Gewinnung von polyklonalem goat anti Acylhistamin Antiserum Zur kompetitiven Detektion von acyliertem Histamin im RIA (s. 3.3.10) wurde ein polyklonales Antiserum gegen Acylhistamin eingesetzt. Zur Gewinnung dieses Antiserums wurden 5 weibliche Ziegen (Deutsche Edelziege) gegen Acylhistamin immunisiert. Um eine möglichst gute Immunantwort zu erreichen, wurde das Histamin mit dem gleichen Spacer, der in der Biotinylierung des Probenhistamins verwendet wird (NHS-Biotin s. 3.2.3, N-hydroxySuccinimid Ester) an verschiedene Trägerproteine gebunden (R. Lösel, Heidelberg): Zur Immunisierung wurden Thyreoglobulin und Soja-Trypsin-Inhibitor verwendet. Zum Nachweis der Antikörperbindung im ELISA wurde bovines Serumalbumin (BSA, s. 3.2.3) genutzt. Als Adjuvans wurde Veterinary Vaccine Adjuvant (s. 3.2.3) von GERBU® verwendet. Die Ziegen wurden nach folgendem Schema immunisiert: Tab. 4 Immunisierungsschema bei 5 Ziegen gegen Acylhistamin Ziege 1 Rübe 2 Frau Müller 3 Paula 4 Ratz 5 Else Menge Antigen 500 µg abs. 500 µg abs. 50 µg abs. 50 µg abs. 5 µg abs. 1. Tag 28. Tag Ad 4 mL Gerbu ® Ad 4 mL Gerbu ® Ad 4 mL Gerbu ® ® Ad 4 mL Gerbu ® Ad 4 mL Gerbu 68 42. Tag Ad 4 mL Gerbu ® -- Ad 4 mL Gerbu ® -- Ad 4 mL Gerbu ® -- Ad 4 mL Gerbu ® -- Ad 4 mL Gerbu ® -- Material und Methode optische Dichte 2500 0 prae vacc. post 1. vacc. 24.09.2003 post 2. vacc. 21.10.2003 Frau Müller 04.11.2003 Rübe Else Ratz prae 3. vacc. 12.11.2003 Paula Abb. 2 Titerentwicklung gegen acyliertes Histamin bei 5 Deutschen Edelziegen Die Tiere wurden nach dem in Tab. 4 dargestellten Schema immunisiert. Nach der Überprüfung der Titer im ELISA wurden Rübe und Paula ausgesucht, um die optimale Verdünnung für den RIA (s. 3.3.10) zu bestimmen. Das Antigen wurde unter sterilen Kautelen in das Adjuvans aufgenommen und spätestens 30 Minuten danach an 4 Körperstellen der Ziegen je ein Viertel (1 mL) subkutan injiziert. Vor den drei aufgeführten Zeitpunkten wurde jeweils Serum gewonnen und auf den Gehalt Acylhistaminspezifischer Antikörper in einem ELISA getestet. Das Immunisierungsschema wurde nach GERBU® modifiziert, da bereits nach der ersten Boosterung, also vor dem 42. Tag bei den zwei Ziegen, die die hohe Antigendosis erhalten hatten, eine Gegenregulation im Sinne von niedrigeren Antikörpertitern beobachtet werden konnte. 3.3.12 Vitalitätsbestimmung von Zellen mittels Fluorochromen Mikroskopische Vitalitätsbeurteilung nach Akridinorange/Ethidiumbromid-Färbung Zellsuspensionen wurden zu gleichen Teilen mit einer Akridinorange/EthidiumbromidLösung (s. 3.2.4) versetzt, in einer Bürker-Zählkammer gezählt und deren Vitalität beurteilt. Akridinorange dringt in die Zelle ein und interkaliert mit der doppelsträngigen DNA. Der Kern erscheint unter Zuhilfenahme eines Fluoreszenzmikroskops (s. 3.1) mit UV-Anregung grün fluoreszierend. Das rot fluoreszierende Ethidiumbromid kann nur in Zellen mit geschädigter Membran eindringen, wo es dann ebenfalls mit der DNA interkaliert. Die 69 Material und Methode Rotfluoreszenz des Ethidiumbromids überlagert in toten Zellen die Grünfluoreszenz des Akridinorange. Beurteilung der Zellvitalität mit der Durchflusszytometrie Weist die Zellmembran Schädigungen auf, so kann das Fluorochrom PI in die Zelle eindringen und mit der DNA interkalieren. Tote Zellen sind nach durchflusszytometrischer Analyse im FL-3-Kanal (Rotfluoreszenz) erfassbar und können dadurch von ungeschädigten Zellen unterschieden werden (s. 3.3.13 und 3.3.13). Zellen nach Separation oder Zellen nach Kultivierung wurden in Durchflusszytometerröhrchen überführt in denen Sheath mit PJ (2 µg/mL final) vorgelegt war (s. 3.2.7). 3.3.13 Durchflusszytometrie In einem Durchflusszytometer werden Einzelzellen in einem Probenführungssystem an einem Laserstrahl vorbei geleitet. Gestreutes Licht einer Wellenlänge (hier 488 nm) wird in Richtung des Strahls als so genanntes Vorwärtsstreulicht (Forward Scatter, FSC) oder im 90° Winkel dazu, als Seitwärtsstreulicht (Side Scatter, SSC) erfasst. Durch die Vorwärtsstreuung werden die Größe des Partikels und dessen Refraktionsindex, durch die Seitwärtsstreuung die Komplexität (Oberflächenbeschaffenheit und Granularität) charakterisiert. Die Signale werden aufgefangen und an den angeschlossenen Computer weitergeleitet. Mit Hilfe dieses Computers werden die Geräteeinstellungen kontrolliert, Messereignisse erfasst und gespeichert. Bei dem für diese Versuche verwendeten Durchflusszytometer handelt es sich um ein FACScan® (s. 3.1) mit einem Argonlaser, der Licht einer Wellenlänge von 488 nm erzeugt. Das Gerät erfasst mit entsprechenden Detektoren (FL-1, FL-2, FL-3) Fluoreszenzlichtemissionen in drei verschiedenen Wellenlängenbereichen (Grünfluoreszenz: 515-545 nm; Orangefluoreszenz: 564-606 nm; Rotfluoreszenz: >650 nm). Jede Zelle oder jedes Partikel wird folglich durch fünf verschiedene Parameter (FSC, SSC, FL-1, FL-2, FL-3) charakterisiert und als ein Messereignis festgehalten. Mit Hilfe der Software „WinMDI Version 2.8“ (TROTTER 1999) erfolgte die computergestützte Auswertung der Daten. Ergebnisse wurden einparametrisch als Histogramm oder mehrparametrisch als korrelierte Punkte-, Dichte- oder Konturdiagramme dargestellt. Da die Werte einzelner Parameter stark von den Einstellungen für die FSC, SSC und Fluoreszenzdetektoren abhängen, wurden nur solche Messungen miteinander verglichen, die mit identischen Geräteeinstellungen erfasst wurden. 70 Material und Methode Durchflusszytometrische Leukozytendifferenzierung Die einzelnen Leukozyzenpopulationen unterscheiden sich in ihrer Größe und Komplexität. Die im peripheren Blut vorliegenden monozytoiden Zellen sowie deren Vorläufer erscheinen im Durchflusszytometer als die größten Zellen (höchster Wert im FSC). Demgegenüber nehmen Lymphozyten und Granulozyten einen ähnlichen Wert im FSC an. Diese beiden Populationen kann man über die innere Beschaffenheit der Zellen, also ihre Komplexität oder Diversität, gemessen im SSC, voneinander abgrenzen (s. Abb. 3) Abb. 3 Leukozytendifferenzierung mit dem Durchflusszytometer: Darstellung equiner Leukozyten als Punktdiagramm („Dot Plot“) und Konturdiagramm („Contour Plot“) In den hier gewählten Darstellungen werden die morphologischen Eigenschaften einer gemischten Leukozytenpopulation dargestellt. Der forward scatter (FSC) Wert ist ein (relatives) Maß für die Zellgröße, der side scatter (SSC) entspricht dem Grad der Zellkomplexität (äußere sowie innere Strukturvielfalt). Die Größe der Werte wird mit height angegeben und ist einheitslos. In der linken Abbildung werden die Zellen als Punktdiagramm dargestellt. Die Wolke mit dem höchsten Wert für SSC entspricht polymorphkernigen Granulozyten (PMN), diejeinge mit dem höchsten Wert für FSC den monozytoiden Zellen (Monos) (vgl. Abb. 6). Unten links in der Darstellung befinden sich lymphoide, mononukleäre Zellen (MNC). Jeder Punkt im Diagramm entspricht einem Messereignis im Durchflusszytometer. Die rechte Abbildung zeigt ein Konturdiagramm der identischen Leukozytenpopulation. Jede Linie umfasst einen Bereich definierter, farblich codierter Zelldichte. Zur Definition einzelner Untergruppen der Messereignisse („Events“) wurden nach der Messung software-gestützt elektronische „Fenster“ (so genannte „Gates“) gesetzt und zum 71 Material und Methode Teil mehrere Fenster logisch miteinander verknüpft. So wurden bspw. in Mischungen aus PMN und MNC die PMN anhand ihrer charakteristischen Morphologie im FSC/SSCPunktediagramm identifiziert (R1: Region 1) und im FL-3/SSC-Punktediagramm die vitalen Zellen (R2: Region 2). Eine Verknüpfung von R1 und R2 bot somit ein „Fenster“ auf vitale PMN (s. Abb. 4). Abb. 4 Region 1 lebende Zellen logisch verknüpft R1 R2 vitale PMN Logische Verknüpfung durchflusszytometrischer Daten am Beispiel vitaler equiner PMN Im ersten Fenster links sind die morphologisch trennbaren Populationen kernhaltiger Zellen aus dem peripheren Blut von Pferden dargestellt (s. 3.3.7). Über eine software-gestützte Markierung werden in diesem Beispiel nur die PMN ausgewählt. Das mittlere Bild differenziert zwischen Zellen, deren DNA Propidiumjodid eingelagert haben (membrandefekte Zellen, rechter Rand des mittleren Bildes) und vitalen Zellen. Im Fenster rechts werden nur noch die lebenden PMN morphologisch dargstellt. 3.3.14 Indirekte Membranimmunfluoreszenz (MIF) Die indirekte Membranimmunfluoreszenz ist ein Verfahren zum Nachweis der Expression von Oberflächenstrukturen auf Zellen. Hierbei binden spezifische Antikörper (s. 3.2.6) an Strukturen, die ihrerseits von einem zweiten, Fluorochrom markierten Antikörper sichtbar gemacht werden. 72 Material und Methode Durchführung der Membranimmunfluoreszenz Pro Vertiefung einer 96-Well-Rundbodenmikrotiterplatte wurden 2 x 105 Zellen frisch separierter oder in vitro kultivierter Zellen pipettiert. Platten mit kultivierten Zellen wurden 10 min auf Eis inkubiert, um adhärente Zellen leichter herauspipettieren zu können. Die Zellen wurden zentrifugiert (200 xg; 4 min, 4°C) und die Überstände dekantiert. Anschließend wurden die Zellen in 175 µl MIF-Puffer (s. 3.2.4) gewaschen – erneute Resuspension, Zentrifugation wie zuvor, Abschlagen der Überstände, Resuspension des Bodensatzes. Nach Zugabe von 25 µl des verdünnten spezifischen primären Antikörpers (s. 3.2.6) erfolgte eine 20-minütige Inkubation (4°C). Danach wurden die Zellen zwei Mal mit 175 µl MIF-Puffer gewaschen, mit 25 µl des sekundären FITC- oder PE-konjugierten Ziege-anti-Maus-Antikörpers versetzt und unter Lichtabschluss bei 4°C für 20 min inkubiert. Nach zweimaligem Waschen wurden die Zellen in 150 µl Trägerflüssigkeit (2 µg/mL Propidiumiodid, s. 3.2.7) aufgenommen, in Röhrchen für die Durchflusszytometrie überführt und durchflusszytometrisch erfasst. Da es zu unspezifischen Bindungen des sekundären Antikörpers kommen kann, wurden sowohl Konjugat- als auch Isotypkontrollen durchgeführt, bei denen Anstelle des ersten Antikörpers 25 µl MIF-Puffer bzw. ein irrelevanter monoklonaler Antikörper des gleichen Isotyps wie der spezifische mAk den Zellen zugesetzt wurden. Auswertung der Membranimmunfluoreszenz nach durchflusszytometrischer Messung Für die Messungen einer zusammengehörenden Versuchsreihe wurden immer identische Geräteeinstellungen gewählt. Tote Zellen wurden anhand ihrer Fluoreszenzintensität im FL-3Kanal (durch Aufnahme von PI) mittels eines Fensters aus der Auswertung ausgeschlossen. Phycoerythrin (PE) war bei einer Emmissionswellenlänge von 564-606 nm in FL-2-Kanal und Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) bei 515-545 nm Emmissionswellenlänge im FL-1-Kanal erfassbar. Zur Auswertung einfacher Fluoreszenzen wurden immer korrelierte Darstellungen mit den Parametern FL-1 (oder FL-2) gegen SSC verwendet, in denen eine Quadrantenanalyse durchgeführt wurde. Ausgewertet wurde das Verhältnis Fluoreszenz positiver zu Fluoreszenz negativen Zellen sowie die mittlere Fluoreszenzintensität. 73 Material und Methode 3.3.15 Statistische Verfahren Zur Abschätzung der Wahrscheinlichkeit von Differenzen zwischen Datengruppen wurden der zweiseitige Student´s t-Test oder der gepaarte t-Test (STEEL & TORRIE 1980) eingesetzt. Wenn nicht normal verteilte Populationen analysiert wurden, wird dort gesondert im Text darauf hingewiesen. Die Inter-assay-varianz ist ein Maß für die Streuung der Messwerte eines Parameters in zeitlich verschiedenen Untersuchungen und beschreibt die Wiederholbarkeit der Ergebnisse von Test zu Test. Für ein biologisches System, dessen Reaktionslage in Abhängigkeit von vielen Faktoren prinzipiell inter- und intraindividuell zu Schwankungen neigt, war eine gute Reproduzierbarkeit der Werte für die einzelnen Parameter unterschiedlicher Tests nicht zu erwarten. Dennoch werden in dieser Arbeit Datensätze gezeigt, die einen Zeitraum von 7 Monaten bis zu 2 Jahren umfassen. Die dort angegebenen Fehlerbalken entsprechen dem SEM (standard error of mean). Die Intra-assay-varianz innerhalb einer Untersuchung ist ein Maß für die Streuung der Messwerte innerhalb desselben Probenansatzes. Dabei wird untersucht, wie stark die Messwerte bei mehrfacher Messung eines Parameters derselben Probe in Parallelansätzen voneinander abweichen. Statistische Darstellung als Box Chart Im Ergebnisteil werden einige Daten in Form von Box Charts dargestellt. Der Box Chart dient der Darstellung statistischer Auswertungen der Verteilung von Messwerten (SACHS 1997). In Abb. 5 ist ein symbolischer Box Chart zur Erläuterung dargestellt. Auf der linken Seite der Abbildung sind die Einzelwerte dargestellt, die in dem Box Chart zusammengefasst sind. Der Stern unter dem Box Chart zeigt den minimalen Messwert, die untere horizontale Linie die 5% Grenze. In der Box selbst liegen 50% aller Messwerte. Zusätzlich kann an der Box das arithmetische Mittel aller Messwerte abgelesen werden (kleines Quadrat in der Box). Das obere Ende der vertikalen Linie entspricht der Grenze, die 95% aller Ereignisse beinhaltet. Der obere Stern entspricht schließlich dem maximalen Messwert. Anhand der 50% Linie kann bereits abgeschätzt werden, ob sich die Population normal verteilt (50% Marke liegt mittig in der Box), oder ob eine Schiefe zu erwarten ist (symbolisch dargestellt ist eine Rechtsschiefe in der Population). 74 Material und Methode 100 Funktionswerte des Ereignisses zu den einzelnen Freiheitsgraden 90 80 95% 75% 70 50% 60 25% 50 40 5% 30 20 10 Ereignis Ereignisstrahl Abb. 5 Symbolischer Aufbau eines Box Charts Dargestellt ist die Form eines Box Charts sowie die statistischen Angaben, die ihm zu entnehmen sind (s. Erläuterungen im Text unten). 3.3.16 Zellkultur Auftauen und Kultivieren von x63-Ag8.653-Zellen, mAK 134 und 176 sowie mAK anti AcH Die Mausmyelomzelllinie x63-AG8.653 wird seit 30 Jahren genutzt, um nach einer Verschmelzung mit murinen Milzzellen selektive monoklonale Antikörper zu generieren (KÖHLER & MILSTEIN 1975). Sie stehen als permanente Zelllinie seit geraumer Zeit dem Institut zur Verfügung. Zur Verwendung wird ein Aliquot, das bei -100°C gelagert wurde, entnommen und kontrolliert aufgetaut, um eine möglichst hohe Vitalität der Zellen zu erreichen. Dazu wurden die Zellen initial in ein Wasserbad von ca. 39°C getaucht und unter 75 Material und Methode leichtem Schwenken so weit angetaut, bis sich das Medium im gesamten Mantelbereich des Kryoröhrchens (s. 3.2.2) verflüssigt hat. Anschließend wurde bei 4°C weitergearbeitet, damit das als Einfrierschutz zugefügte, zytotoxische DMSO möglichst ohne Schädigung der Zellen durch wiederholtes Waschen, Zentrifugieren und Dekantieren des Überstandes entfernt werden konnte (max. 100 xg). Die aufgetauten Zellen wurden in SFM Medium (s. 3.2.4) aufgenommen und anschließend im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Kryokonservierung von Zelllinien Um Zelllinien für eine spätere Verwendung aufzubewahren, wurden diese bei -85°C bis -120°C gelagert. Dazu wurden ca 10 mL Zellsuspension einer dicht bewachsenen, aber vitalen Kultur entnommen und bei 100 xg für 10 Minuten zentrifugiert. Nach Resuspension in frischem SFM Medium wurde die Zelldichte auf ca 1 x 107 / mL Medium eingestellt und dann je 1 mL in ein Kryoröhrchen überführt. Anschließend wurden die Röhrchen auf 4°C gekühlt, um die Stoffwechselvorgänge zu reduzieren. Um den eutektischen Punkt zu erniedrigen, (bzw. den peritektischen Bereich zu verbreitern) wurde den Zellen nun bis zu 10% DMSO hinzugefügt. Anschließend erfolgte ein sukzessiver Einfrierprozess in IsopropanolEinfrierboxen (s. 3.1) 76 Ergebnisse 4 Ergebnisse 4.1 Phänotypische Charakterisierung IgE positiver Zellen im peripheren Blut des Pferdes Um die Basophilen des Pferdes genauer zu charakterisieren, wurde versucht, diese isoliert vorliegen zu haben. Humane basophile Granulozyten lassen sich nach Dextransedimentation und Dichtegradientenzentrifugation anreichern. Wiederholte Versuche, mittels eines Dichtegradienten die gewünschte Fraktion beim Pferd anzureichern, erwiesen sich als unzureichend: Nach Aufspaltung der Leukozyten in MNC und PMN enthielten beide Fraktionen ähnliche Gehalte an Histamin speichernden Zellen, gemessen im FIT (s. 3.3.9). Selbst unter Verwendung einer reinen MNC Fraktion, die im FIT deutlich positiv war, gelang es nicht, diese noch weiter mittels Dichtegradientenzentrifugation aufzutrennen (Daten nicht gezeigt). Welche Morphologie wiesen also equine Basophile auf, dass sie sich gleichermaßen in den dichten, stark granulierten Zellen der PMN Fraktion wie auch in den homogenen, leichteren MNC verbargen? In einer Zwei-Parameter-Darstellung FSC/SSC lassen sich morphologisch ähnliche Zellpopulationen, wie zum Beispiel eosinophile, basophile und neutrophile Granulozyten durchflusszytometrisch nicht voneinander unterscheiden. In Analogie zu Mensch und Maus können die Basophilen Granulozyten, die weder morphologisch noch auf Grund einer höheren Autofluoreszenz, wie sie bei Eosinophilen gefunden wird, nur unter zu Hilfe nahme weiterer Unterscheidungskriterien erfasst werden. Um dies zu ermöglichen müssen diese Zellen anhand anderer phänotypischer Merkmale voneinander abgegrenzt werden. Oberflächenmoleküle, die nur oder vermehrt von einer Subpopulation exprimiert werden, können mittels spezifischer, zumeist monoklonaler Antikörper markiert werden, wenn an diese Fluorochrome gebunden sind. Im equinen System stehen monoklonale Antikörper gegen Basophilen spezifische Strukturen nicht zur Verfügung. Auf Grund der hohen Affinität des FcεRI wird dieser bereits in vivo mit freiem IgE beladen. Die hier im Haus entwickelten murinen anti IgE Antikörper bestimmen somit die Wahl des Markers, nach der im Folgenden der Basophile im peripheren Blut detektiert werden soll. 77 Ergebnisse Dazu werden die Zellen mit anti IgE Antikörpern (mAK 134 oder mAK 176, s. 3.2.6) bei 4°C inkubiert. Die niedrige Temperatur ist notwendig, um eine Degranulation durch Kreuzvernetzung membranständiger IgE-Moleküle zu vermeiden. Anschließend wird mit einem Phycoerythrin gekoppeltem AK (Ziege anti Maus PE, s. 3.2.6) der gebundene Anteil des ersten AK für die durchflusszytometrische Analyse markiert. Abb. 6 Differenzierung leukozytärer Zellpopulationen des equinen Blutes durch morphologische und anti-IgE-Fluoreszenz Charakteristika nach durchflusszytometrischer Analyse Dargestellt sind Punktediagramme nach Erfassung von 10.000 Ereignissen im Durchflusszytometer (s. Abb. 3 und 3.3.13 sowie 3.3.14). Linkes Diagramm: Darstellung der Morphologie (Größe (FSC) gegen Komplexität (SSC)), PMN: Granulozyten mit größerer Komplexität (SSC) sind von mononukleären Zellen (MNC) zu unterscheiden. Im Bereich der MNC sind zusätzlich lymphoide Zellen und monozytoiden Zellen gegeneinander abgrenzbar. Rechtes Diagramm: Unterscheidung IgE positiver Zellen von negativen Granulozyten oder mononukleären Zellen auf Grund der Fluoreszenz, gemessen im Kanal FL-2 (Orange-fluoreszenz, s. 3.3.13). 78 Ergebnisse Der Anteil IgE positiver Zellen im peripheren Blut der Pferde ist in Analogie zum Menschen vermutlich direkt abhängig von der Anzahl exprimierter, hochaffiner Rezeptoren für IgE. Konstitutiv wird dieser Rezeptor im humanen System innerhalb der Blutleukozyten nur von basophilen Granulozyten exprimiert. Nach Aktivierung sind auch eine Reihe anderer Zellen in der Lage den FcεRI zu exprimieren, allerdings nicht in gleicher Dichte wie auf Basophilen im Blut. Weiterhin können Zellen, die mit dem niederaffinen Rezeptor für IgE ausgestattet sind (FcεRII oder CD23), in die Kategorie IgE positiver Zellen fallen. Immunkomplexiertes IgE, das in vivo an diese Rezeptoren gebunden hat, dürfte in Anzahl und Verweildauer auf der Oberfläche jedoch kaum ins Gewicht fallen, da diese Bindung ein aktivierendes Signal zur Pinoyzytose (in Kombination mit IFNγ auch Phagozytose) in diesen Zellen hervorruft. Eine dritte Form von IgE auf den Zellen des peripheren Blutes findet man als B-Zell Antigenrezeptor der IgE exprimierende Gedächtniszellen. Allerdings dürfte auch diese Population nur gering sein, da der Serumspiegel an IgE beim Pferd zwar deutlich höher ist als beim Menschen, aber verglichen mit den IgG Isotypen dennoch als niedrig einzustufen ist (WAGNER et al. 2002). Der Anteil IgE positiver Zellen ist dementsprechend erwartungsgemäß klein. In Analogie zum Gehalt an Basophilen im Blut dürfte der Anteil zwischen 0 und 2% liegen. Unser Bestreben war es, vornehmlich basophile Granulozyten zu detektieren, um eine geeignete Strategie zu entwickeln, diese anzureichern. 79 Ergebnisse 4.1.1 Verteilung IgE positiver Zellen im peripheren Blut des Pferdes Das Markieren einer kleinen Zellpopulation birgt insbesondere bei der durchflußzytometrischen Analyse einen hohen Unsicherheitsfaktor. Zum einen überlagern sich die Emissionsspektren der verwendeten Fluorochrome (Propidiumjodid (PI) und Phycoerythrin (PE)) anteilig. Durch Kompensation können schwach gefärbte Events, sowie wenige positive Zellen verloren gehen. Zum anderen unterliegt die Erfassung der „Events“ einer systemeigenen Streuung: Auch in den Kontrollansätzen finden sich „positive events“ in der erwarteten Region für IgE tragende Zellen. Erste Interpretationen zur Spezifität der Membranimmunfluoreszenz (MIF) -Ergebnisse (s. 4.2.1) konnten funktionell gestützt werden, da der verwendete mAK anti eqIgE (mAK 134) eindeutig zu einer Histaminfreisetzung führte, wenn die Zellen bei 37°C und in Anwesenheit von divalenten Ionen (Mg2+ und Ca2+) inkubiert wurden. Allerdings fiel in diesem Zusammenhang auf, dass nicht alle Probanden in gleichem Maße auf eine Inkubation mit mAK 134 und somit einer Histaminfreisetzung reagierten. Neben Tieren, die mit einer hochgradigen Freisetzung teilweise über dem physikalischen Release reagierten, fanden sich andere Probanden, die im gleichen Test am gleichen Tag nur knapp über dem Spontanrelease lagen. Zudem ließ die Auswertung der indirekten Membranimmunfluoreszenz (MIF) wiederholt den Schluss zu, dass in allen morphologisch trennbaren Populationen IgE positive Zellen zu finden waren (s. Abb. 6). Die Bestimmung einzelner Populationen im FSC/SSC Diagramm obliegt dem Benutzer, da die Grenzen manuell festgelegt werden. Wie in Abb. 6 zu sehen ist, überschneiden sich die Regionen im zweidimensionalen Raum nicht. Bei Betrachtung der einzelnen Parameter finden sich aber für die Monozytenfraktion Überschneidungen im SSC mit beiden anderen Fraktionen (PMN und lymphoide MNC). Für die PMN-Fraktion gilt das gleiche in Bezug auf das Vorwärtsstreulicht (FSC). Um die Fehlerwahrscheinlichkeit bei der Wahl der einzelnen Regionen für die Fraktionen PMN, Monozyten und MNC zu minimieren, wurden 9 Pferde unter gleichen Einstellungen am Durchflusszytometer untersucht. Parallel zur Messung des Vorwärts- und Seitwärtsstreulichtes wurden die IgE positiven Zellen in dem FL2-Kanal (orange, Phycoerythrin) bestimmt. Anschließend wurden die Mittelwerte der einzelnen Populationen in Bezug auf das FSC/SSC Erscheinungsbild gebildet und mit den für IgE positiven Zellen in Verbindung gesetzt. Überraschenderweise hoben sich die mittleren Werte der einzelnen Populationen auch in den sich überschneidenden Parametern signifikant voneinander ab. 80 Ergebnisse Abb. 7 Relative Häufigkeit IgE-positiver Leukozytenpopulationen im peripheren Blut des Pferdes (N=9). Die einzelnen Leukozyten-populationen im peripheren Blut der Pferde sind hier als Kugeldiagramm IgE-positiver Events anteilig an der Gesamtpopulation dieser Zellen dargestellt. Es wurden nur vitale Zellen einbezogen; (PJ negative Events, s. 3.3.6 und 3.3.12). Innerhalb der Kugeln finden sich die Fehlerbalken für FSC und SSC. Die Population der MNC ist aufgeteilt in Monozyten und übrige mononukleäre Zellen (Lymphozyten). Es gilt: PMN: FSC: 490+/-38, SSC: 480+/-90. Monozyten: FSC: 689+/-51, SSC: 351+/-25. MNC (Lymphozyten): FSC: 436+/-7, SSC: 159+/-10. Die numerischen Angaben hinter der Bezeichnung stellen den Mittelwert IgE positiver Zellen von je 9 Tieren dar, bezogen auf alle Zellen dieser Morphologie (s. 3.3.13). Jede Population wurde bezüglich ihrer Größe (FSC) und Granularität (SSC) miteinander verglichen. Folgende Signifikanzniveaus wurden erreicht: SSC Monozyten zu PMN p =1,2 x 10-7 FSC Monozyten zu PMN p =5,6 x 10-8 Monozyten zu MNC p =1,2 x 10-4 Monozyten zu MNC p =7,0 x 10-10 -8 PMN zu MNC p =4,0 x 10 PMN zu MNC p =4,9 x 10-6 *, unterschiedlich mit p <0,05; **, unterschiedlich mit p ≤0,01; ***, unterschiedlich mit p≤0,001. Die Fehlerbalken repäsentieren den SEM. Die Analyse IgE positiver Leukozytenpopulationen nach der Membranimmunfluoreszenz ergab eine hohe Sicherheit in Bezug auf die Zuordnung zu morphologisch trennbaren Zelltypen des peripheren Blutes. Im vorgestellten Test wurden die Ergebnisse von 9 Tieren 81 Ergebnisse zusammengefasst, unabhängig von ihrem Allergie-/Sensibilisierungsstatus. Die durchschnittliche Anzahl IgE positiver Zellen in Bezug auf alle isolierten, vitalen Leukozyten der 9 Tiere lag bei 1,39%+/-0,36%. In der Gesamtzahl IgE positiver Zellen lag dieser Wert im erwarteten Rahmen. Nur die Verteilung unter den einzelnen Populationen war unerwartet. So waren durchschnittlich nur 0,9% der PMN, 0,2% der MNC ohne Monozytoide Zellen, aber 8,2% der monozytoiden Zellen positiv für IgE (s. Abb. 7). Die mittlere Fluoreszenzintensität (mfl) der equinen, IgE positiven Zellen, die in Abb. 7 dargestellt sind: (N (Anzahl der Tiere) =9, n (Anzahl der Bestimmungen) =2) MNC (lymph.) IgE negativ : MNC (lymph.) IgE positiv : Monozytoide IgE negativ : Monozytoide IgE positiv : PMN IgE negativ : PMN IgE positiv : 2,3 +/- 0,6 726,2 +/- 228,5 4,2 +/- 1,7 1006,1 +/- 187,6 1,6 +/- 0,3 770,1 +/- 368,4 mfl mfl mfl mfl mfl mfl Die mittlere Fluoreszenz wurde festgestellt, indem die gleichen Regionen benutzt wurden, wie zur Feststellung der morphologischen Erscheinung in der FSC/SSC-Darstellung (s. Abb. 6), die Auswertung jedoch die Wertezuordnung des FL2-Kanals (Phycoerythrin) erfasste. Die Einstellungen (settings) am Durchflusszytometer wurden für alle folgenden IgEMembranfärbungen beibehalten, um eine Vergleichbarkeit zeitlich versetzter Messungen zu ermöglichen. Auf Grund der geringen Fluoreszenz der Negativpopulationen (s. 4.1, Abb. 6) wurde darauf verzichtet, die Hintergrundfluoreszenz von den IgE-positiven Messereignissen zu subtrahieren. Dieser hohe Fluoreszenzunterschied zwischen IgE positiven und IgE negativen Zellen (Faktor 366+/-195 für MNC, 336+/-181 für Monozyten und 543+/-332 für PMN) könnte eine methodische Erklärung für die einerseits verhältnismäßig niedrige Anzahl IgE positiver Zellen absolut, sowie die fehlenden Unterschiede zwischen allergischen und gesunden Pferden darstellen. Insbesondere niedrige Expressionsmuster IgE bindender Strukturen werden bei den vorliegenden durchflusszytometrischen Einstellungen nicht berücksichtigt. Die höchste Anzahl an Rezeptoren für IgE sollte laut Literatur auf basophilen Granulozyten erwartet werden. In Analogie zu den durchflusszytometrischen Analysen im humanen System liegen die Basophilen im morphologischen Fenster der PMN. Sie weisen eine geringere Dichte als neutrophile Granulozyten auf, weswegen man sie gemeinsam mit der MNCFraktion anreichern kann – aber sie erreichen nicht die Größe der Monozyten. 82 Ergebnisse Die vergleichende Betrachtung von Ergebnissen der indirekten Membranimmunfluoreszenz für IgE, die zeitlich sowie von der Herkunft des Blutes (Rasse, Geschlecht, Alter sowie Sensibilisierungsstatus der untersuchten Pferde) deutlich zu unterscheiden waren, unterstrich die zuvor ermittelte Verteilung IgE positiver Zellen in den einzelnen Populationen: Prozent IgE Positiver Zellen 10 1 0,1 PMN Monozyten MNC Populationen nach FSC/SSC Analyse Abb. 8 Verteilung der IgE positiven Zellen nach durchflusszytometrischer Analyse aller IgE positiven Events im peripheren Blut der Pferde (N=25). Diese zusammenfassende Darstellung zeigt die Verteilung IgE positiver Zellen aus dem peripheren Blut der Pferde. Dargestellt sind Box Chart Diagramme mit den zugehörigen Punktwolken (s. 3.3.15). Die Ordinate gibt den prozentualen Wert IgE positiver Zellen nach anti IgE Membranimmunfluoreszenz Färbung an (s. 3.3.14). Die Darstellung ist dekadisch logarithmiert. Die prozentuale Angabe bezieht sich jeweils auf alle vitalen Zellen einer morphologisch differenzierbaren Population (s. 3.3.6). Der Terminus MNC steht für lymphoide MNC, die Monozyten werden als gesonderte Population aufgeführt. Hier wurden MIF Ergebnisse von 25 Pferden (N=25) aus einem Zeitraum von 3 Jahren (2001, 2002 & 2003) zusammengefasst (s. 3.3.14). Das mittlere Verhältnis (Mean) IgE positiver Zellen lag bei: PMN: 0,43% (sd=0,43); Monozyten: 9,03% (sd=3,52); MNC: 0,26% (sd=0,25) (sd = standard deviation of mean). 83 80 75 Anzahl vitaler IgE+ Zellen von 20.000 equinen PBL Verhältnis der Populationen aus PBL von 9 untersuchten Pferden Ergebnisse 50 25 0 60 40 20 0 MNC Diagramm A) Abb. 9 MNC IgE+ abs. Monozytoide IgE+ abs. PMN IgE+ abs. Monozytoide PMN Diagramm B) A) Verteilung der Leukozytenpopulationen im peripheren Blut der Pferde B) absolute Anzahl IgE+ Zellen in den Populationen. Von den in Abb. 7 untersuchten Pferden (N=9) wurden die PBL differenziert und das relative Verhältnis aller kernhaltigen Zellen bestimmt (A) (s. 3.3.13). In B) wurde die absolute Anzahl IgE positiver Zellen (s. 3.3.14) innerhalb der Regionen, die in Abb. 6 definiert wurden, von den gleichen 9 Pferden ermittelt. Der Terminus MNC steht für lymphoide MNC, die Monozyten werden als gesonderte Population aufgeführt. Die Verhältnisse IgE positiver Populationen im peripheren Blut der Pferde ähnelte sich bei den untersuchten Individuen. Relativ gesehen wiesen die monozytoiden Zellen 21 mal so viele IgE positive Zellen auf wie die PMN. Für die lymphoiden MNC betrug dieser Faktor 35 (Monozytoide MNC zu übrigen MNC). So stellten die monozytoiden Zellen nach Untersuchung der in diesem Kapitel untersuchten Probanden 5,62%+/-1,4% aller kernhaltigen, vitalen Zellen. Dementsprechend waren die monozytoiden Zellen auch absolut die größte Fraktion IgE+ Zellen im peripheren Blut der Pferde (s. Abb. 8) 84 Ergebnisse 4.1.2 Anreicherung von IgE positiven Zellen im magnetischen Feld (MACS sorting) Auf Grund der funktionellen Eigenschaft des monoklonalen Antikörpers gegen equines IgE im FIT (s. 4.2.2) Histamin freizusetzen, sowie der starken Bindung an eine relativ kleine Subpopulation von equinen PBL in der Membranimmunfluoreszenz (s. Abb. 7), sollte versucht werden, diese IgE positiven Zellen anzureichern, und dann zu überprüfen, ob die angereicherten IgE positiven Zellen ihrer Morphologie im FSC/SSC Scatter entsprechend zu den in Abb. 6 vorgestellten Subpopulationen der PBL gehörten. Nach dem ersten Entfernen der gebundenen, also IgE positiven Zellen aus dem magnetischen Feld zeigte sich ein deutlich verschobenes Bild im FSC/SSC Scatter: Die zuvor dominierende Population am linken Berich des Histogramms (s. Abb. 10-1a) war deutlich vermindert, der Anteil größerer Zellen stieg an. Der Anteil IgE positiver Zellen vor dem ersten Sortieren betrug 1,2% (s. Abb. 10-1c &1d). Nach dem ersten Sortierschritt waren dies bereits 34,2% aller PJ negativen Events (s. Abb. 10-2c &2d). Nach der ersten Elution sind in der Zweiparameterdarstellung (FL-2/SSC) vier abgrenzbare Populationen zu erkennen (s. Abb. 10-2c). Die anteilsmäßige Verteilung von ungefärbten, eluierten Zellen wird im Histogramm deutlich (2d). Der hohe Anteil IgE negativer Events (mittlere Intensität in der Fluoreszenz geringer als 300, gemessen im Kanal 2 (FL2) des Durchflusszytometers, hier 65,8% aller erfassten Zellen) erforderte ein zweites Sortieren der Zellen. Nach dem zweiten Sortiervorgang im magnetischen Feld unter den gleichen Bedingungen wie zuvor stellte sich die Morphologie der Zellen noch weiter verschoben dar. Zu Beginn der Aufreinigung war die zweigipflige Verteilung der Zellen deutlich größer auf der linken Seite des Histogramms (Vergleiche Teildarstellung 1b und 3b der Abb. 10). Nach dem zweiten Sortiervorgang wurde eine Reinheit IgE positiver Events von über 93% erreicht (mittlere Intensität in der Fluoreszenz höher als 300, gemessen im Kanal 2 (FL2) des Durchflusszytometers), die sich auch durch erneutes Auftragen auf eine MACS– Säule nicht mehr erhöhen ließ. Es konnten in Bezug auf die Morphologie sowie die mittlere Fluoreszenzintensität (s. Abb. 10-1c im Vergleich zu 3c) zwei deutlich abgrenzbare Populationen angereichert werden. Der linke Gipfel im Histogramm 3d korreliert dabei mit der kreisförmigen Punktewolke in der Zweiparameterdarstellung 3c (Region 2 in Abb. 11). In der Darstellung der Morphologie der angereicherten Zellen entspricht diese Population den monozytoiden Zellen des Blutes. Sie umfasst knapp 44% aller PJ negativen Events. Die zweite Population, die sich im Seitwärtsstreulicht bereits deutlich von den monozytoiden Zellen abgrenzt, findet in Bezug auf die in Abb. 6 definierten Subpopulationen im peripheren Blut der Pferde am ehesten eine Entsprechung in der Zuordnung zu den PMN (Region 1 in Abb. 11). 85 Ergebnisse zu Beginn nach der ersten Elution 2a 3a Morphologie SSC 1a nach der zweiten Elution FSC Punktwolken (dot plot) der Morphologie 2b 3b Relative Zellzahl 1b FSC Histogramme der relativen Größe 2c 3c Fluoreszenz SSC 1c 0 102 10 103 104 0 102 10 103 104 0 102 10 103 FL2 Punktwolken (dot plots) der Fluoreszenzintensität (FL2) 2d 3d Relative Zellzahl 1d 0 10 102 103 104 0 10 102 103 104 0 FL2 Histogramme der Fluoreszenzintensität 86 10 102 103 104 104 Ergebnisse Abb. 10 Verlauf des magnetischen Sortierens von equinen, IgE positiven Zellen unter Berücksichtigung der Morphologie und Fluoreszenzintensität. 1 a-d) Ausgangsituation 2 a-d) erster Anreicherungsschritt 3 a-d) zweite Anreicherung Exemplarische Darstellung des magnetischen Sortierens IgE positiver Zellen aus PBL (s. 3.3.8) nach hypotoner Lyse des Vollblutes (s. 3.3.7). Die einzelnen Leukozytenpopulationen (s. Abb. 6) sind im FSC/SSC Scatter gut abzugrenzen. Bei Betrachtung eines Parameters wie in Abb. 10-1b sind nur die monozytoiden Zellen am rechten Rand des Histogramms von den übrigen Populationen abzugrenzen. Die Zellen wurden initial mit dem murinen Ak anti equines IgE (134) inkubiert und anschließend mit Ratten-IgG anti Mäuse IgG (H&L) gekoppelten Microbeads versetzt (s. 3.2.6). Die Inkubation erfolgte bei 4°C in PBS mit Zusatz von BSA (s. 3.2.4). Anschließend wurde als Sekundärantikörper Ziege anti Maus PE (s. 3.2.6) hinzugegeben und die Basisgröße IgE positiver Zellen ermittelt (s. 3.3.14). Der Anteil IgE positiver Zellen betrug vor dem Sortieren 1,2% aller PJ negativen Events (s. 3.3.12). Das Histogramm 10-1d zeigt die Fluoreszenzintensitäten der Ausgangspopulationen vor Beginn des magnetischen Sortierens, die Verteilung IgE positiver Zellen entspricht der in vivo Situation. Abb. 10 2a zeigt die morphologische Darstellung equiner PBL nach der ersten magnetischen Aufreinigung. Insbesondere die Population der PMN ist deutlich kleiner als zu Anfang der Separation. Der Anteil großer, granulierter Zellen hat zugenommen.Die Fluoreszenzintensitäten der Ausgangspopulation vor Beginn des zweiten magnetischen Sortierens sind in 2c & 2d dargestellt.. Im Histogramm (2d) sind nun zwei Populationen IgE positiver Zellen erkennbar. Die dritte Reihe der Abbildung zeigt das Ergebnis nach zweifacher magnetischer Aufreinigung. Die Populationen der Ausgangssituation (Teildarstellung 1a der Abb. 10) lassen sich jetzt nicht mehr darstellen. Nur die Monozytoiden Zellen lassen sich noch zuordnen. Über der Wolke der Monozyten (Teildarstellung 3a der Abb. 10) finden sich weitere große Zellen, die selektiv durch die Anreicherung IgE positiver Zellen zugenommen haben. Fluoreszenzintensität der angereicherten Zellen nach zweifacher Selektion auf IgE positive Zellen im magnetischen Feld. 87 Ergebnisse Region 1 Region 2 Region 3 Abb. 11 Vergleich der Morphologie vor und nach der zweifachen magnetischen Anreicherung IgE+ Zellen des Pferdes A) FSC/SSC vor der Sortierung B) FSC/SSC nach dem Sortieren Die morphologische Erscheinung der unter 4.1.2 angereicherten Zellen erschien heterogen. Die durchflusszytometrische Erfassung der FSC/SSC Daten wies zwei gut differenzierbare Populationen auf (s. 3.3.13 und 3.3.14). Folgende Wertepaare konnten den einzelnen Populationen nach der magnetischen Aufreinigung zugeordnet werden (siehe auch Tabelle in 4.1.1 Vergleich der relativen Größe): Region 1: vorher 490/480 FSC/SSC nachher 679/531 FSC/SSC Region 2: 689/351 FSC/SSC 699/382 FSC/SSC (Region 3: 436/159 FSC/SSC 429/156 FSC/SSC) Während die Zellen der Region 1 eine deutliche Zunahme der Werte für ihre relative Größe (FSC) sowie Komplexität (SSC) zeigen, bleiben die übrigen Populationen nahezu unverändert. Im Folgenden wurden die eluierten Zellen lichtmikroskopisch differenziert. Weiterhin wurden die Zellen in serumfreiem Zellkulturmedium aufgenommen, um ihre Reaktionsbereitschaft sowie Überlebensdauer ex vivo zu bestimmen. 88 Ergebnisse 4.1.3 Lichtmikroskopische Darstellung IgE positiver Zellen des Pferdes Die morphologische Erscheinung der unter 4.1.2 angereicherten Zellen erschien heterogen. Die durchflusszytometrische Erfassung der FSC/SSC Daten wies zwei gut differenzierbare Populationen auf. Um diese beiden Populationen voneinander abzugrenzen, wurden von 6 Pferden IgE+ Zellen des peripheren Blutes angereichert und anschließend Zytospins angefertigt. Sie zeigten in allen Fällen eine selektive Anreicherung von Basophilen und Monozyten. So wurden durchschnittlich 52,33%+/-10,48% Monozyten oder große Lymphozyten und 41,78%+/-12,41% basophile Granulozyten gefunden. Um zu verifizieren, in welcher der in Abb. 11 definierten Regionen sich die Basophilen befinden, wurden die durchflusszytometrisch erfassten Populationen der einzelnen Individuen mit den Ergebnissen der Zellzählung und Differenzierung der Zytospins verglichen. Zusammenfassend konnte festgestellt werden, dass sich in der in Abb. 11 definierten Region 1 die Basophilen befanden. Die Monozyten oder großen lymphoiden Zellen konnten nicht eindeutig einer Region zugeordnet werden, da die Bestimmung ihres Anteils nach lichtmikroskopischer Auswertung der Zytospins bei allen 6 Pferden höher war, als die zugehörigen in der Region 2 (s. Abb. 11) befindlichen Zellen. 89 Ergebnisse Monocyte Abb. 12 Übersichtsdarstellung eines Zytospins IgE+ Zellen aus equinem peripheren Blut. Im Trockensystem (Vergrößerung 10x Okular, 20x Objektiv) wurden von 6 Pferden mindestens 10 Blickfelder ausgezählt und die vorkommenden Zellen differenziert (s. 3.3.4, 3.3.5 und 3.3.7). Zwei dominierende Populationen konnten bei allen Individuen gefunden werden: granuläre, basophil anfärbbare Zellen mit einem keulenförmigen Zellkern (23% - 59% je nach Individuum), sowie homogene Zellen mit einem großen euchromatischen Nukleus (31% - 66%). Die an 100% fehlenden Zellen waren bei den untersuchten Individuen sehr unterschiedlich verteilt. So wurden bei 5 von 6 Pferden 0,1 - 1% eosinophile Granulozyten gefunden, bei dem sechsten Individuum dagegen 14%. Vereinzelt konnten kleine mononukleäre Zellen (Lymphozyten) sowie neutrophile Granulozyten differenziert werden. Allerdings zeigte sich bei der Auszählung eine selektive Anreicherung basophiler Granulozyten in Bezug auf die in Abb. 7 definierten absoluten Verhältnisse IgE+ Zellen im peripheren Blut der Pferde. Von initial 22%+/-4% aller IgE+ Zellen im morphologischen Fenster der PMN (s. Abb. 9 B) steigerte sich der Anteil nach der Anreicherung auf 42%+/12%. Basophile ließen sich also präferentiell anreichern. Die höhere Fluoreszenzintensität im FL2 Kanal der basophilen Granulozyten (s. Abb. 10 L) im Vergleich zu den monozytoiden Zellen erklärt eine potentiell stärkere Bindung der Microbeads. Dadurch werden besonders diese Zellen während des Sortierens im magnetischen Feld angereichert. 90 Ergebnisse Pferd Nr.11 Neutrophil Pferd Nr.9 Pferd Nr.1 Eosinophil Lymphocyte Basophils Monocyte Monocyte large Lymphocyte Basophil Abb. 13 Kontaminierende Leukozyten nach MACS Anreicherung IgE+ Zellen Neben basophilen Granulozyten und Monozyten wurden bei den IgE+ Zellen von sechs Pferden (s. 3.3.14) weitere Leukozyten in variierenden Anteilen gefunden (s. 3.3.4). Im linken oberen Bild ist ein jugendlicher neutrophiler Granulozyt zu sehen. Dieser Zelltyp wurde mit unter 1% bei sechs Pferden am seltensten gefunden. Die mittlere Darstellung zeigt neben schwach gefärbten, degranulierten Basophilen und Monozyten eosinophile Granulozyten. Es gelang nur in einem Individuum diesen Zelltyp selektiv anzureichern (14%). Im rechten Bild sind ein kompakter Lymphozyt sowie ein Monozyt zu erkennen, die von Basophilen umgeben sind. In diesem Bild ist der Größenunterschied zwischen Lymphozyten und Basophilen besonders deutlich. Das untere Bild zeigt zusätzlich einen großen Lymphozyten. Dieser Zelltyp war bei der Differenzierung der Zytospins nur mit hoher Unsicherheit von den monozytoiden Zellen abzugrenzen. Es wurde nicht bestimmt, ob diese vereinzelten Leukozyten auf Grund von membranständigem IgE selektiv angereichert wurden oder zufällig in der eluierten Fraktion nach magnetischer Anreicherung auftauchten. Das mittlere, das rechte Bild sowie das untere Bild wurden aufgenommen, nachdem die Zellen für 24 Stunden in Kulturmedium ohne Serumzusatz bei 37°C inkubiert wurden. (Vergrößerung Ölimmersion 10x Okular, 100x Objektiv). 91 Ergebnisse Bei der Auswertung der Zytospins konnten die basophilen Granulozyten auf Grund ihrer starken basophilen Anfärbarkeit gut gegen die übrigen Leukozyten abgegrenzt werden. Auffällig war, dass bei allen untersuchten Individuen die Basophilen mikroskopisch gleich groß oder größer erschienen als die Monozyten. Dies entspricht auch den Befunden aus der durchflusszytometrischen Analyse (s. Abb. 11). Abb. 14 Größenvergleich basophiler Granulozyten mit Monozyten des Pferdes. Die in diesem Foto eines Zytospins (s. 3.3.5) dargestellten IgE+ Zellen (s. 3.3.14) nach MACS Anreicherung (s. 3.3.8) sollen das Größenverhältnis von Basophilen und Monozyten vergleichend darstellen. Dazu wurden größenidentische Klammern an ausgewählte Zellen angelegt. Die dunklen stark granulierten Zellen stellen basophile Granulozyten dar, die homogenen Zellen mit großem Nukleus sind monozytoide Zellen oder große Lymphozyten. Die Anreicherung über membrangebundenes IgE bewirkte einen Basophilen aktivierenden Mechanismus. Während der Anreicherung wurden Bedingungen gewählt, die ein Degranulieren der Basophilen verhinderten. Wurden die Zellen anschließend in 37°C warmes Kulturmedium aufgenommen, degranulierten die angereicherten Basophilen. 92 Ergebnisse Abb. 15 Degranulierende und degranulierte Basophile Durch Wärmeeinwirkung degranulierte basophile Granulozyten des Pferdes in Zellkulturmedium. Die Zellen wurden direkt im Anschluss an den Zytospin (s. 3.3.5) fixiert und gefärbt (s. 3.3.4). Partiell degranulierte Basophile nach Kultivierung in Serum freien Medium (SFM) 93 Ergebnisse Aktivierte monozytoide Zellen aus den kultivierten Ansätzen (Megakaryozyten?) Nach 72 Stunden in der Kultur fanden sich zunehmend Zellen, deren Nukleus radspeichenartig angeordnet war. Auf dem rechten Bild ist zusätzlich ein degranulierter Basophiler (oben rechts) zu erkennen. Eine Resynthese von Granula konnte in den Kulturansätzen nicht gefunden werden. Anschließende Histaminfreisetzungen aus der Kultur dieser Zellen ergaben Werte, die im Bereich des spontan freigesetzten Histamins lagen. Eine Regeneration der IgE+ Zellen wurde mit den gewählten Kulturbedingungen nicht erreicht. Die Aufreinigung IgE+ Zellen des Pferdes führte zu einer selektiven Anreicherung von basophilen Granulozyten. Abschließend kann der hohe Anteil IgE+ nicht granulierter monozytoider Zellen als Phänomen festgestellt werden, dass bei allen untersuchten Pferden auftrat. Da nur bei einem Individuum selektiv Eosinophile angereichert wurden, scheint auch beim Pferd dieser Zelltyp fakultativ in der Lage zu sein, nach Aktivierung IgE hochaffin zu binden. Dementsprechend kann für 5 der untersuchten Pferde postuliert werden, dass eine Voraktivierung der eosinophilen Granulozyten in vivo nicht stattgefunden hatte. 94 Ergebnisse 4.2 Methodische Vorarbeiten 4.2.1 Spezifität der eingesetzten monoklonalen Antikörper und Seren zur Überprüfung der generellen Sensibilisierung im FIT Nach der Entwicklung eines monoklonalen Antikörpers gegen equines IgE (WAGNER 2002) wurde der FIT um eine zusätzliche funktionelle Kontrolle der allergischen Effektorzellen erweitert. Initial sollte dieser monoklonale Antikörper das bisher eingesetzte polyklonale Ziegenserum gegen Pferdeimmunglobuline ersetzen. Um die Spezifität dieser beiden Stimuli zur Überprüfung einer in vivo stattgefundenen Beladung Basophiler mit Immunglobulinen fest zu stellen, wurden beide in einem indirekten Sandwich-ELISA zum Nachweis von equinem IgE eingesetzt. Dazu wurden hochadsorbierende 96-well Mikrotiterplatten mit dem mAk 176 gegen equines IgE und alternativ mit dem polyklonalen Ziegenserum (goat-anti-horse IgG (H+L)) ausgekleidet. Anschließend wurde natives Pferdeserum oder aufgereinigte IgE Fraktionen in bis zu sieben Verdünnungsstufen aufgetragen. Für die anschließende Detektion des potentiell gebundenen IgE wurden der mAk 134 gegen equines IgE oder ein polyklonales biotinyliertes Ziegenserum gegen equines IgE verwendet. Der enzymgekoppelte Nachweis wurde bei dem Aufbau mit mAk 176 über das biotinylierte Antiserum und Sterpavidinperoxidase durchgeführt. Der Ansatz, dem das polyklonale Ziegenserum zu Grunde lag, wurde ebenfalls mit dem biotinylierten Antikörper und Streptavidinperoxidase oder über den mAk 134 und anschließend einem Peroxidase gekoppelten anti Maus Antikörper (s. 3.2.6) inkubiert. 95 Ergebnisse Serum IgE Detektion mit mAK anti equines IgE Serum IgE Detektion mit anti IgG Ziegenserum 2,0 1,8 Optische Dichte 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 1: 10 .0 00 1: 30 .0 00 1: 10 0. 00 0 bla nk 1:3 .0 00 1: 1. 00 0 1: 30 0 Serumverdünnung 1: 10 0 0,0 Abb. 16 Vergleich der Detektion von equinem Serum IgE mit Ziegenserum gegen equine IgG Isotypen sowie dem mAK 176 gegen equines IgE im indirekten Sachwich-ELISA. Um den Gehalt kreuzreaktiver, IgE bindender Antikörper in dem polyklonalen Ziegenserum gegen equine IgG Isotypen (s. 3.2.6) zu bestimmen, wurden hier ein monoklonaler Antikörper gegen equines IgE (s. 3.2.6) sowie das Ziegenserum gegen IgG mit Serumverdünnungen eines Pferdes inkubiert. Die Bestimmung im indirekten Sancwich-ELISA (s. 4.2.1) erfolgte in Duplikaten, die Fehlerbalken sind allerdings nur in den zwei kleinsten Serumverdünnungen der Detektion mittels mAK 176 (s. 3.2.6) zu erkennen. Das Ziegenserum gegen IgG detektierte in keiner der gewählten Verdünnungen IgE. Die ELISA-Ergebnisse zeigten, dass die eingesetzten Antikörper zur Überprüfung der generellen Sensibilisierung keine detektierbare Kreuzreaktivität aufwiesen. Schlussfolgernd konnte die Aktivierung basophiler Granulozyten mittels des mAK gegen equines IgE nicht den gleichen Mechanismus nutzen, wie das polyklonale goat anti equine IgG Serum. Damit beinhalteten die bisher im FIT bestimmten Histaminfreisetzungen zur Überprüfung der generellen Sensibilisierung (s. 3.3.9) zwei inhaltlich unterschiedliche Qualitäten: equine Basophile degranulieren in gewaschenem Vollblut durch Zugabe von anti-IgE sowie von antiIgG spezifischen Antikörpern. Um eine Modulation über verschiedene membranständige Antikörperisotypen im Hinblick auf die Kreuzvernetzung der Antikörper und Degranulation basophiler Granulozyten zu erfassen, musste im Vorfeld belegt werden, dass die verwendeten anti Immunglobulin Antikörper keine Kreuzreaktivität zeigen. 96 Ergebnisse 3,0 Optische Dichte 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 Kontrollen: mAK Anti equines IgE anti IgG blank Detektion von monoklonalem equinem IgG2 Abb. 17 Positivkontrolle des polyklonalen Ziegenserums gegen equine IgG Isotypen im indirekten Sandwich-ELISA Im gleichen Testansatz wie die Daten aus Abb. 16 erfolgte ein Kontrollansatz zur Überprüfung der Funktionalität des eingesetzten Ziegenserums gegen equines IgG (s. 3.2.6). Statt der Serumverdünnung wurde hier Zellkulturüberstand eines monoklonalen equinen IgG2 zugegeben (s. 3.2.6 und WEGE 2004). Die Detektion erfolgte über einen monoklonalen anti IgG2 Antikörper und einen Peroxidase gekoppelten Ziege anti Maus Antikörper (s. 3.2.6). Von links nach rechts sind dargestellt: Kontrolle des mAK gegen IgE auf Bindung von equinem IgG2, Positivreferenz des eingesetzten Ziegenserums gegen equine IgG Isotypen, sowie die Hintergrundreaktion des Peroxidase gekoppelten Nachweissystems (s. 4.2.1). 4.2.2 Intraindividuelle Reproduzierbarkeit des FIT und Konfidenz der Überprüfung der generellen Sensibilisierung Die Diagnose einer Typ I Allergie in der Veterinärmedizin basiert meist auf einer rein klinischen Befundung. Chronischer Husten, rezidivierende Rhinitiden oder Konjuktivitiden sowie Hautveränderungen unbekannter Ätiogenese werden, wenn ein infektiöses Agens ausgeschlossen werden konnte, der Gruppendiagnose allergische Erkrankung zugeordnet. Als weiterführende Diagnostik bietet der Prick Haut Test die Methode der Wahl zusätzlich zur klinischen Symptomatik das oder die relevanten Allergen(e) zu bestimmen – mit dem Nachteil, dass nicht oder wenig behaarte Körperstellen bei unseren Haustieren selten sind sowie nur wenige Allergenpräparationen in reiner Form für die Veterinärmedizin zur Verfügung stehen. 97 Ergebnisse Der in der Immunologie der TiHo Hannover entwickelte FIT (s. 3.3.9) bietet seit inzwischen 4 Jahren die Möglichkeit, eine Sensibilisierung im Blut des Pferdes nachzuweisen. In einer über 2 Jahre verfolgten Verlaufsstudie (GEIBEN 2003) konnten die Zuverlässigkeit sowie Reproduzierbarkeit des FIT dokumentiert werden. Abb. 18 Erfassung der Culicoides nubeculosus Reproduzierbarkeit des FIT in einer Weidesaison Sensibilisierung und In diesem Säulendiagramm sind FIT Ergebnisse (s. 3.3.9) von 4 allergischen Pferden exemplarisch dargestellt. Von links nach rechts ordnen sich an: Spontanrelease, die Kontrolle, ob der Test für das einzelne Tier am einzelnen Testzeitpunkt auswertbar ist (zusätzlich wurde bei 7% des Maximalreleases eine Hilfslinie eingezogen, sie definiert hier den Schwellenwert einer positiven Reaktion). Maximalrelease, eine durch thermische Einwirkung bedingte, komplette Desintegration aller Zellen. Goat anti equine IgG release (mit 60 und 20 µg/mL, s. 3.2.6), eine funktionelle Überprüfung der Beladung von equinen Zellen mit Immunglobulinen, sowie ein monoklonaler AK anti equines IgE (mAK anti IgE 134, s. 3.2.6) zum Kreuzvernetzen von membranständigem IgE (generelle Sensibilisierung), Allergenrelease in 4 Konzentrationen (Culicoides nubeculosus mit 15, 5, 0,5 u. 0,05 µg/mL). Pferd 1, 3 und 4 zeigen über die gesamte Dauer des Versuches deutliche Histaminfreisetzungen in den drei hohen Allergenkonzentrationen, Pferd 2 in den zwei höchsten. Dargestellt sind Mittelwerte von 11 Meßzeitpunkten (Start: 20. März 2001; Ende: 9. Oktober 2001). Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler SEM. Aus Abb. 18 wird ersichtlich, dass die Beurteilung der Reproduzierbarkeit unserer funktionellen in vitro Allergiediagnostik differenziert betrachtet werden muss: Während bei den versuchsinternen Kontrollen (Spontanrelease, Überprüfung der generellen Reaktionsbereitschaft (s. 3.3.9) mittels anti Isotyp Kreuzvernetzung) die Wiederfindung des freigesetzten Histamins kaum schwankte, war bei den Allergen induzierten Freisetzungen 98 Ergebnisse eine starke Schwankungsbreite festzustellen. Die Aussagekraft, ob und wie stark ein Pferd gegen sein relevantes Allergen sensibilisiert war, blieb unter Anwendung des institutseigenen Auswertungsschlüssels unbeeinflusst (s. 3.3.10). Bei den gezeigten Pferden (s. Abb. 18) war festzustellen, dass zu allen Zeitpunkten die IgG vermittelte Freisetzung (>IgG 60) hoch signifikant über der IgE vermittelten (mAK>IgE) lag (p< 0,0003). 4.3 Diskordante Dominanz der IgG oder IgE vermittelten Freisetzung von Histamin aus basophilen Granulozyten 4.3.1 Erfassung verschiedener Reaktionsmuster bei der Überprüfung der generellen Sensibilisierung innerhalb einer Pferdepopulation. Die Messung von Histamin im FIT (s. 3.3.9 und 3.3.10) basiert auf der Degranulation basophiler Granulozyten des Pferdes durch geeignete Stimuli, die gewaschenem Vollblut zugegeben werden. Dementsprechend wird eine resultierende Histaminmenge bestimmt, die auf Grund der direkten Interaktion des Stimulus mit den basophilen Granulozyten freigesetzt wird oder die nach Stimulation anderer Zellen zur indirekten Aktivierung und damit ggf. Degranulation der Basophilen führt. Zudem ist bisher nicht zweifelsfrei bekannt, welche membranständigen Immunglobulinisotypen an Basophile des Pferdes binden, und welche aktivierende oder inhibierende Potenz sie besitzen. Um dem Rechnung zu tragen, wird im FIT die generelle Fähigkeit basophiler Granulozyten nach Kreuzvernetzung membranständiger Immunglobuline zu degranulieren (s. 3.3.9), seit 2001 stets mit anti IgE Antikörpern (monoklonal) und anti IgG Antikörpern (polyklonal) durchgeführt. Diese doppelte Prüfung der generellen Sensibilisierung von Basophilen in vivo zeigt Reaktionsmuster auf, die sich diametral unterscheiden. Während der Großteil der überprüften Pferdepopulation auf beide Stimuli der generellen Sensibilisierung reagieren (86,3% von 307 Pferden, die im FIT auf ihre generelle Sensibilisierung getestet wurden), finden sich Individuen, die fast ausschließlich auf die IgE vermittelte Provokation reagieren (8,5% von 307 Individuen). Denen stehen 5,2% von 307 untersuchten Pferden mit einem entgegengesetzten Reaktionsmuster gegenüber: Ausschließliche Histaminfreisetzung über anti IgG Antikörper. Es sind keine wiederholten Messungen eines Individuums inbegriffen. 99 Ergebnisse Histaminfreisetzung in %von phys. Release 100 Pferd A Pferd B Pferd C 75 50 25 anti IgG 60 µg/mL anti IgG 20 µg/mL anti IgE Allergen Abb. 19 Unterschiedliche Reaktionsmuster allergischer Pferde im funktionellen in vitro Test (FIT) Drei Pferde wurden in einem Testansatz dem FIT (s. 3.3.9) unterzogen. Dargestellt sind die Ansätze zur Überprüfung der generellen Sensibilisierung (anti IgG und anti IgE), sowie die Allergen vermittelte Freisetzung von Histamin in Prozent vom physikalischen Release. Die Ordinate zeigt nur Ereignisse, die über 7% des physikalischen Release (100%) hervorriefen. Bei allen drei Pferden wurden durch das Allergen vergleichbare Mengen Histamin freigesetzt. Pferd A zeigte eine IgG sowie eine starke IgE vermittelte Freisetzung. Pferd B setzt nur in der hohen Konzentration von anti IgG sowie durch IgE detektierbare Mengen von Histamin frei. Pferd C zeigt eine starke IgG vermittelte Freisetzung in beiden getesteten Konzentrationen, aber keine IgE vermittelte Ausschüttung von Histamin. Die in Abb. 19 aufgeführten Reaktionsmuster wurden in der Diagnostik zur Bestimmung des Sensibilisierungsgrades gegen Culicoides nubeculosus (Allergen) gefunden. Da diese drei Individuen an einem Termin im FIT (s. 3.3.9) getestet wurden und alle drei gegen eine identische Allergenpräparation positiv reagierten, somit sensibilisiert waren, wurde die Hypothese aufgestellt: Basophile des Pferdes können durch mehr als einen Isotyp spezifisch sensibilisiert werden. 100 Ergebnisse "Bronco" "Desiree" "Brad Pit" [ng Acylhistamin / mL] 50 25.01.2002 20.06.2002 20.02.2002 40 30 20 10 0 Spontanrelease Maximalrelease anti IgG anti IgE Abb. 20 FIT Ergebnisse von 3 Tieren mit klinischem Allergieverdacht Die Histaminfreisetzung ist in diesem Diagramm absolut (in ng Acylhistamin/mL Blut) angegeben und nicht in Prozent vom Maximalrelease (s. 3.3.9). In der Reihenfolge von links nach rechts sind angegeben: Spontanrelease der drei Pferde, Maximalrelease durch Kochen der Proben, anti IgG vermittelte Freisetzung und anti IgE vermittelte Freisetzung (s. 3.3.9). Die drei vorgestellten Pferde stehen stellvertretend für eine Minderheit der untersuchten Tiere: Die IgE vermittelte Freisetzung von Histamin liegt deutlich über der IgG vermittelten (s. 3.2.6). Das Blut der Pferde wurde zu unterschiedlichen Jahreszeiten untersucht, die Probanden zeigten unterschiedliche Herkunft, Rasse sowie Geschlecht. “Brad Pit“ war zusätzlich im FIT deutlich sensibilisiert für Pferdebremsen, „Desiree“ reagierte auf fast alle getesteten Insektenallergene, inklusive Culicoides nubeculosus (Daten nicht gezeigt). In Abb. 20 sind die FIT Ergebnisse von drei Untersuchungen exemplarisch für den IgE dominierten Reaktionstyp vorgestellt. 101 Ergebnisse "Hamlet" 50 5.12.2002 [ng Acylhistamin / mL] "no name” 4.06.2003 40 30 20 10 0 Spontanrelease Abb. 21 Darstellung der Allergieverdacht FIT Maximalrelease Ergebnisse anti IgG von drei anti IgE Pferden mit klinischem Die Histaminfreisetzung ist in diesem Diagramm absolut angegeben (in ng Acylhistamin/mL Blut) (s. 3.3.9). In der Reihenfolge von links nach rechts finden sich: Spontanrelease, Maximalrelease durch Kochen der Proben, anti IgG vermittelte Freisetzung und anti IgE vermittelte Freisetzung (s. 3.3.9). Kontrovers zu Abb. 20 wurden diese Tiere präsentiert, um einen weiteren Reaktionstyp vorzustellen: Die durch anti IgG verursachte Freisetzung von Histamin liegt deutlich über der IgE vermittelten (s. 3.2.6). „Hamlet“ war zum Zeitpunkt der Untersuchung hochgradig gegen Culicoides nubeculosus sowie weitere Insektenallergene sensibilisiert, „Nick“ zeigte im FIT auf keines der überprüften Allergene eine Reaktion, während „no name“ ebenfalls gegen alle getesteten Insektenallergene reagierte, jedoch nicht so stark wie „Hamlet“ (Daten im Detail nicht gezeigt, s. 3.2.5). Die Abb. 21 zeigt drei Individuen, deren Reaktionspotenzial Histaminfreisetzung im FIT präferentiell von IgG vermittelt erscheint. bezüglich einer Die individuelle Konstanz oder Variabilität einer Dominanz der IgG- bzw. der IgEvermittelten Basophilendegranulation sollten zunächst durch wiederholte Bestimmungen der generellen Sensibilisierung an identischen Individuen geprüft werden. 102 Ergebnisse 4.3.2 Individuelle Reaktionsverläufe der generellen Sensibilisierung innerhalb einer Herde An einer gut kontrollierten Herde von Islandpferden unter identischen Haltungs- und Fütterungsbedingungen sollte geprüft werden, ob die Art der generellen Sensibilisierung im Verlauf der Zeit eine für das Individuum kennzeichnende Größe darstellte oder starken intraindividuellen Schwankungen unterliegt.. Ferner sollte überprüft werden, ob das Verhältnis der IgG vermittelten Freisetzung zur IgE vermittelten Histaminfreisetzung für das Einzeltier oder sogar die gesamte Gruppe eher stabil oder stark schwankend war. Dazu wurden 37 Pferde einbezogen und an mindestens 10 Terminen der Verlauf der generellen Sensibilisierung in Abhängigkeit von der Zeit erfasst. Exemplarisch werden hier 8 Probanden näher vorgestellt, die sich in ihrer klinischen Symptomatik einerseits und ihrer Sensibilisierung gegenüber einem natürlichen Allergen (Culicoides nubeculosus) andererseits unterscheiden. Die Bezeichnung atopische Pferde oder Atopiker wird im Folgenden für sensibilisierte Individuen mit klinischer Ausprägung einer Typ I allergischen Dermatitis verwendet. Die vorgestellten Pferde wurden jeweils am gleichen Tag beprobt und untersucht. Weiterhin wurden die Provokatoren der Histaminfreisetzung am Anfang der Versuchsreihe als einheitliche Stocklösung angesetzt und in aliquotierten Portionen bei -20°C gelagert (gilt für anti IgE sowie Allergene, nicht das anti IgG, da dies ein käufliches Antiserum einer Charge war, Lagerung bei 4°C). Abb. 22 (a-h) Verlauf der generellen Sensibilisierung innerhalb eines Sommerhalbjahres – individuelle Reaktionsbereitschaft verschiedener Pferde unter identischen Haltungs- und Fütterungsbedingungen. Zusammenfassende Darstellung von FIT Ergebnissen eines Tieres im zeitlichen Verlauf. Die Datensätze wurden auf die Ansätze zur Überprüfung der generellen Sensibilisierung reduziert. Die Ordinate gibt die Histaminfreisetzung in Bezug auf den Maximalrelease (Max) an. Es wurden nur Datensätze verwendet, in denen der Spontanrelease unter 6% des Maximalreleases lag (s. KAUL 1998). Die gestrichelte Linie gibt den Verlauf der IgE vermittelten Freisetzung an, die durchgezogene Linie repräsentiert die durch anti IgG induzierte Histaminliberation (s. 3.2.6). Die im Folgenden vorgestellten Probanden wurden jeweils zeitgleich beprobt und unter Verwendung identischer Stocklösungen an den jeweiligen Terminen innerhalb eines Testansatzes dem FIT (funktionellen in vitro Test, s. 3.3.9) unterzogen. Pferd Nr. 14 ist ein gegen Culicoides nubeculosus (s. 3.2.5) sensibilisiertes Tier (Modalwert aus 10 Bestimmungen nach Institutsschlüssel: 2+ (stark sensibilisiert, s. 3.3.10) mit atopischer Dermatitis (Sommerekzem). 103 Ergebnisse a) Individuelle generelle Sensibilisierung Pferd Nr. 14 ist ein gegen Culicoides nubeculosus (s. 3.2.5) sensibilisiertes Tier (Modalwert aus 10 Bestimmungen nach Institutsschlüssel: 2+ (stark sensibilisiert, s. 3.3.10) mit atopischer Dermatitis (Sommerekzem). b) Individuelle generelle Sensibilisierung Ergänzend zur Legende bei Abb. 22 a: Pferd Nr. 8 ist ein gegen Culicoides nubeculosus sensibilisiertes Tier (Modalwert nach Institutsschlüssel 3+ (hochgradig sensibilisiert, s. 3.3.10)) mit atopischer Dermatitis (Sommerekzem). 104 Ergebnisse c) Individuelle generelle Sensibilisierung Ergänzend zur Legende bei Abb. 22 a: Pferd Nr. 6 ist ein gegen Culicoides nubeculosus sensibilisiertes Tier (Modalwert nach Institutsschlüssel 3+ (hochgradig sensibilisiert, s. 3.3.10)) mit atopischer Dermatitis. d) Individuelle generelle Sensibilisierung Ergänzend zur Legende bei Abb. 22 a: Pferd Nr. 16 ist ein gegen Culicoides nubeculosus sensibilisiertes Tier (Modalwert nach Institutsschlüssel 2+ (stark sensibilisiert, s. 3.3.10)) ohne klinische Anzeichen einer allergischen Erkrankung. 105 Ergebnisse e) Individuelle generelle Sensibilisierung Ergänzend zur Legende bei Abb. 22 a: Pferd Nr. 18 ist ein klinisch gesundes, gegen Culicoides nubeculosus sensibilisiertes Tier (Modalwert nach Institutsschlüssel 1+ (sensibilisiert, s. 3.3.10)). f) Individuelle generelle Sensibilisierung Ergänzend zur Legende bei Abb. 22 a: Pferd Nr. 30 ist nicht nachweislich gegen Culicoides nubeculosus sensibilisiert (Modalwert nach Institutsschlüssel 0 (s. 3.3.10)) ohne klinische Anzeichen einer allergischen Erkrankung. 106 Ergebnisse g) Individuelle generelle Sensibilisierung Ergänzend zur Legende bei Abb. 22 a: Pferd Nr. 38 ist ein gegen Culicoides nubeculosus sensibilisiertes Tier (Modalwert nach Institutsschlüssel 3+ (hochgradig sensibilisiert, s. 3.3.10). Zum Beginn der Untersuchungsperiode zeigte das Pferd klinische Symptome einer atopischen Dermatitis, die im Verlauf des Jahres langsam ausklangen. Zurzeit ist das Tier klinisch gesund. h) Individuelle generelle Sensibilisierung Ergänzend zur Legende bei Abb. 22 a: Pferd Nr. 15 ist ein gegen Culicoides nubeculosus sensibilisiertes Tier (Modalwert nach Institutsschlüssel 3+ im Jahr 2000 (hochgradig sensibilisiert, s. 3.3.10), im Jahr 2001 verminderte sich die Sensibilisierung auf 2+. Zum Beginn der Untersuchungsperiode zeigte das Pferd klinische Symptome einer atopischen Dermatitis. Die höchste allergenspezifische Sensibilisierung (3+) im Jahr 2001 erstreckte sich von Juni bis August, anschließend wurde das Tier im FIT mehrfach negativ (0+) gegen Culicoides nubeculosus getestet. 107 Ergebnisse Die Diagramme a) & b) der Abb. 22 zeigen den Verlauf der generellen Sensibilisierung von zwei an Sommerekzem leidenden Pferden. Das Pferd Nr.14 ist im Vergleich zu Pferd Nr.8 in der dritten Verdünnungstufe von Culicoides nubeculosus negativ im FIT (s. 3.3.9). Das im Mittel über die 10 Bestimmungen im Maximalrelease freigesetzte Histamin lag für Pferd Nr.14 bei 22,1+/-6,7 ng/mL Vollblut und für Pferd Nr.8 bei 38,8+/-7,1 ng/mL Vollblut. Bei beiden Individuen ist zu erkennen, dass die prozentuale Freisetzung der Stimuli zur Überprüfung der generellen Sensibilisierung in Bezug auf den Maximalrelease einen Wellencharakter aufweist, der im späten Frühjahr sowie im Hochsommer maximale Werte erreichte. Der Maximalrelease an den korrespondierenden Bestimmungen lag für Pferd Nr.14 im Mai 2001 bei 19,8 ng Histamin / mL und im September bei 20,3 ng/mL. Bei Pferd Nr.8 wurden im Mai 33,0 ng/mL und im August 41,8 ng/mL Histamin aus dem Blut freigesetzt. Zusätzlich fällt auf, dass in der Zeit zwischen diesen Maxima die Kurven auf sehr niedrige Werte im Verlauf der gesamten Messperiode absanken. Die Gesamthistamingehalte im Blut, bestimmt über thermische Freisetzung und Bestimmung im RIA, lagen an diesem Termin (Anfang Juni) für Pferd Nr.14 bei 20,7 ng/mL und für Pferd Nr.8 bei 28,5 ng/mL. Bei ähnlicher Gesamtmenge an Histamin im Vollblut wurde die Freisetzung über die generelle Sensibilisierung im Verlauf der Zeit moduliert. Ferner verlaufen die zwei Kurven der generellen Sensibilisierung bei beiden Tieren zu einem hohen Anteil des erfassten Zeitfensters parallel zueinander. Die Pferde Nr.14 und Nr.8 zeigten eine vergleichbare Sensibilisierung gegen Culicoides nubeculosus sowie eine ähnliche klinische Symptomatik. Die absolute durch die Überprüfung der generellen Sensibilisierung freigesetzte Histaminmenge zeigte dagegen keine Gemeinsamkeiten (s. Abb. 23). 108 Freigesetztes Histamin [ng/mL] Ergebnisse 30 20 10 0 Nr.14 anti IgG Nr.14b anti IgE Nr.8 anti IgG Nr.8b anti IgE Abb. 23 Absolute Histaminfreisetzung nach IgG oder IgE vermittelter Provokation bei zwei Pferden mit Typ I allergischer Dermatitis (Nr.14 u. Nr.8). Die gestrichelten Box Charts (s. 3.3.15) geben jeweils die IgE vermittelte, die kompakten die IgG vermittelte Freisetzung an (s. 3.2.6 und 3.3.9). Je Box sind 10 Bestimmungen zusammengefasst. Während die Einzelbestimmungen teilweise sehr weit divergieren, finden sich für beide Tiere im Mittel der Bestimmungen Bereiche, in denen eine Häufung der Ereignisse zu finden ist. Die IgG vermittelte Freisetzung liegt bei beiden Tieren über der IgE vermittelten. In den Diagrammen c) & d) der Abb. 22 sind zwei gegen Culicoides nubeculosus stark bis hochgradig sensibilisierte Pferde dargestellt. Pferd Nr. 6 zeigte neben der Sensibilisierung das klinische Bild einer atopischen Dermatitis. Pferd Nr. 16 war dagegen trotz der starken Sensibilisierung klinisch gesund. Wie bei den zuvor beschriebenen Pferden Nr. 8 & Nr. 14 (Abb. 22 a & b) verlaufen die beiden Kurven der generellen Sensibilisierung in weiten Teilen parallel zueinander. Auffällig ist beim Vergleich dieser beiden Tiere, dass trotz gleicher Freisetzungsstimuli (identische Stocklösung) der Abstand der Kurven zueinander deutlich unterschiedlich ausfällt. Während Proband Nr.6 nahezu gleiche Mengen Histamin bei der IgE und IgG vermittelten Freisetzung aufweist, kann bei Pferd Nr.16 nur durch die Überprüfung der IgG vermittelten generellen Sensibilisierung eine ähnliche Dimension der Freisetzung erreicht werden, während die IgE-vermittelte erheblich schwächer ausfällt. 109 Freigesetztes Histamin [ng/mL] Ergebnisse 30 20 10 0 Nr.6 anti IgG Nr.6b anti IgE Nr.16 anti IgG Nr.16b anti IgE Abb. 24 Histaminliberation durch Überprüfung der generellen Sensibilisierung bei Pferden mit (Nr.6) und ohne (Nr.16) klinische Ausprägung einer Typ I allergischen Dermatitis. Die gestrichelten Box Charts (s. 3.3.15) geben jeweils die IgE vermittelte, die kompakten die IgG vermittelte Freisetzung an (s. 3.2.6 und 3.3.9). Je Box sind 10 Bestimmungen zusammengefasst. Bei den hier vorgestellten Pferden wiederholt sich das Bild aus Abb. 23: die IgG vermittelte Freisetzung liegt über der IgE vermittelten. Bei dem klinisch gesunden Probanden (Nr.16) ist dieser Unterschied deutlicher ausgeprägt. Die durch die vertikalen Linien angedeuteten Schwankungen der einzelnen Bestimmungen sowie die Breite Höhe der Boxen weisen auf eine starke Streuung der Messergebnisse hin (besonders die IgG vermittelte Freisetzung). Bei der Betrachtung der Histaminfreisetzungen der Pferde Nr.6 und Nr.16 (s. Abb. 22 c) & d)) fallen deutliche saisonal bedingte Maxima und Minima der IgG und IgE vermittelten Freisetzung auf. Die Kurven eines Tieres verlaufen annähernd parallel. Der Quotient aus IgE und IgG vermittelter Freisetzung könnte also eine individuell charakteristich sein, stellt aber keine für Allergiker spezifische Reaktionsform dar. Die Pferde zeigen zusammenfassend relativ (Abb. 22 a), b), c)) sowie absolut einen individuellen Verlauf der generellen Sensibilisierung. Bei Betrachtung zusammengehörender Wertepaare aus IgE und IgG vermittelter Freisetzung von einem Bestimmungstermin verändert sich dieses Bild. Bei dem Pfert Nr.16 lag am 17.04.2001 die maximal freisetzbare Histaminmenge bei 11,2 ng/mL Vollblut, über IgE wurden 0,8 ng/mL und über IgG 5,7 ng/mL ausgeschüttet. Im 110 Ergebnisse Gegensatz dazu lag der Maximalrelease am 9.10.2001 bei 51,6 ng/mL, IgE vermittelt bei 6,2 ng/mL und IgG bedingt bei 31,6 ng/mL. Das Verhältnis von IgE zu IgG bedingter Freisetzung lag am ersten Termin bei IgE/IgG = 0,14 und am zweiten Termin bei IgE/IgG = 0,19. Damit kann beispielhaft für das Verhältnis eine wesentlich geringere Schwankung gezeigt werden als für die absoluten oder relativen Werte der generellen Sensibilisierung Im Folgenden wurden zwei gesunde Individuen ausgewählt (Pferd Nr. 18 und Nr. 30), um eine eventuelle Abgrenzung der klinisch gesunden Pferde zu den Allergikern ableiten zu können. Die basophilen Granulozyten der gesunden Pferde zeigten im gleichen Maße wie die atopischen Individuen eine deutliche Reaktionsbereitschaft auf die Stimuli der Überprüfung einer generellen Sensibilisierung. Der IgG vermittelte Release erwies sich bei den überprüften Individuen als erheblich stärker als der IgE vermittelte. Weiterhin konnte auch bei den gesunden Pferden der parallele Kurvenverlauf der zwei Stimuli gefunden werden. Der relative Abstand der Kurven zueinander lag für diese Tiere in dem Bereich, der auch bei dem Pferd Nr.16 (ohne klinische Ausprägung einer Dermatitis) gefunden wurde. In diesem Kriterium grenzten sich die gesunden Individuen (Pferd Nr. 16, 18 und 30; für die Quotienten von IgG zu IgG siehe Tab. 5) von den vorgestellten Pferden (Nr. 6, 8 und 14, s. auch Tab. 5) mit Sommerekzem ab (Abb. 22, Diagramme a), b), c) mit Sommerekzem, d), e), und f) klinisch gesund). Auf Grund ihrer besonderen Stellung in Bezug auf ihre Krankengeschichte werden zwei weitere Pferde vorgestellt. Pferd Nr. 38 wurde mit der klassischen Symptomatik eines Sommerekzemers in den Versuch aufgenommen. Nach der Hälfte des Untersuchungszeitraumes waren die klinischen Befunde fast vollständig abgeklungen. Hinweislich ist im Verlauf der zwei Kurven zu erkennen, dass diese im Anfangsabschnitt nahezu deckungsgleich verlaufen, um sich dann in den folgenden Bestimmungen weiter voneinander zu entfernen – die IgG vermittelte Freisetzung steigt an, während die IgE vermittelte auf einer Höhe bleibt. Pferd Nr. 15 zeigte zu Beginn des Versuchs 2001 eine nachweisliche Sensibilisierung (1+) gegen Culicoides nubeculosus. In den Sommermonaten steigerte sich diese auf 3+ (s. 3.3.10). Ab August 2001 verschwand dann für einen Zeitraum von mehreren Monaten jegliche, durch den FIT nachweisbare Sensibilisierung gegen Culicoides nubeculosus. Gerade der Bereich von Juni bis September im Diagramm Abb. 22 h) zeigt ein starkes Ansteigen des IgG vermittelten Release. Zum Ende des Untersuchungszeitraumes verließ der Patient die Herde. Der Besitzer des Pferdes teilte mit, dass mit der Umstallung die atopische Dermatitis wieder ausbrach. FIT Ergebnisse liegen dazu nicht vor. Schlussfolgernd sollte überprüft werden, ob das Verhältnis der beiden Wege, IgE und IgG vermittelt die generelle Sensibilisierung basophiler Granulozyten des Pferdes zu überprüfen, eine neue Qualität der Beurteilung ihres atopischen Status erlaubt. 111 Ergebnisse 4.3.3 Analyse des bifunktionellen Nachweises der generellen Sensibilisierung Trotz erheblicher Schwankungen in der absoluten Histaminmessungen (vgl. 1.2.2) konnte gezeigt werden, dass der Vergleich der IgE vermittelten im Verhältnis zur IgG vermittelten Histaminfreisetzung bei einem zusammengehörigen Wertepaar weit geringeren Schwankungen unterlag, erkennbar an den parallelen Kurvenverläufen in der Abb. 22a)-h). Deshalb galt es, folgende Hypothese zu prüfen: Das Verhältnis von IgE zu IgG vermittelter Freisetzung ist eine individuelle Größe, die für das untersuchte Tier weitgehend charakteristisch ist. In Folge dessen wurde der Quotient der zwei antikörpervermittelten Freisetzungen über eine Sommerperiode für die ganze Herde gebildet. Dazu wurde das Verhältnis der IgE zu IgG vermittelten Freisetzung für jede einzelne Bestimmung ermittelt, und anschließend wurde der Mittelwert gebildet. Die Ergebnisse dieser Analyse finden sich in Abb. 25. 1,1 Verhältnis der IgE zu IgG induzierten Freisetzung von Histamin 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 Probanden (sortiert) Abb. 25 Verteilung der IgE/IgG Quotienten innerhalb einer Herde von 37 Pferden. Diese Abbildung zeigt das Verhältnis der Histaminausschüttung (s. 3.3.9) der beiden Testansätze zur Überprüfung der generellen Sensibilisierung (anti IgE vermittelte Freisetzung zu anti IgG vermittelter Freisetzung, in der Abbildung als Verhältniszahl auf der Ordinate). Gezeigt werden 37 Pferde unter identischen Haltungsbedingungen (s. 3.2.8), die jeweils zeitgleich auf ihren Allergiestatus getestet wurden. Die Vierecke symbolisieren die Mittelwerte aus 10 Bestimmungen, die Fehlerbalken stellen den SEM dar (standard error of mean). Das individuelle Verhältnis des Reaktionsspektrums variiert zwischen 0,17+/-0,09 (Pferd Nr. 16) bis 0,87+/-0,10 (Pferd No. 6). 112 Ergebnisse In Abb. 25 kann gezeigt werden, dass der Quotient von IgE zu IgG vermittelter Histaminfreisetzung als Kenngröße für ein Individuum zu verwenden ist. So schwankt der Quotient zwischen dem Pferd am linken Ende des Strahls bis zum Pferd am rechten Ende der Abbildung um den Faktor 5. Weiterhin ist zu erkennen, dass für einige Individuen der Quotient um den Faktor 2 bis 3 intraindividuell schwanken kann, erkennbar an den lang ausgezogenen Fehlerbalken. Dies galt insbesondere für die Positionen 12 (Pferd Nr.36), 21 (Nr.19), 30 (Nr.33), 34 (Nr.37) und 36 (Nr.9). Bei Betrachtung der Häufung der Werte im Box Chart (Abb. 26, siehe auch Abb. 23 und Abb. 24) ist zu erkennen, dass die 50% Boxen bei den vorgestellten Pferden Nr.36 und 37 (Position 12 und 34) sehr schmal ausfallen. Zusätzlich zeigen beide Individuen kaum Schwankungen, die unter der Box liegen. Somit kann resumiert werden, dass für diese beiden Individuen 75% der erfassten Werte eine relativ kleine Streuung zeigen. Bei den übrigen drei Tieren bleibt zu überlegen, ob die Schwankungen eine biologische Entsprechung haben - auf individueller Ebene wird die Sensibilisierung der Basophilen über Aktualisierung der membrangebundenen Immunglobuline in Abhängigkeit des Serumspiegels verschiedener Immunglobulin-Isotypen verändert. Verhältnis IgE zu IgG verm ittelter Histaminfreisetzung 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 Pos. 36 Pos. 21 Pos. 30 Pos. 12 Pos. 34 Pferd Nr. 9 Pferd Nr. 19 Pferd Nr. 33 Pferd Nr. 36 Pferd Nr. 37 Das Verhältnis der durch anti IgE Antikörper freigesetzten Histaminmenge zu der anti IgG vermittelten (s. 3.3.9 und 3.2.6), dargestellt auf der Abszisse dieses Box Charts (n=10, s. 3.3.15) zeigt bei diesen 4 Pferden eine weite Streuung der Werte. Nur für die Individuen Nr.36 und 37 finden sich 75% der Werte (untere Grenze des Box Charts bis zum Ende der Box) noch in einem eng umschriebenen Areal. Nr 33 ist das älteste untersuchte Tier. Zum Zeitpunkt der Untersuchung war dieser Wallach 32 Jahre alt. Nr.19 ist eine 1993 geborene Stute ohne Anzeichen einer Allergie, während Nr. 9 ein hochgradig sensibilisiertes Tier mit atopischer Dermatitis verkörpert. Abb. 26 Verteilung der individuellen Quotienten für IgE/IgG bei vier Individuen mit extremer intraindividueller Streuung Obwohl die verhältnismäßige Auswertung der generellen Sensibilisierung durch individuelle Schwankungen gekennzeichnet war, sollte ein zusätzliches Merkmal, der atopische Status, in die Auswertung miteinbezogen werden. Dementsprechend wurden die Individuen zuerst nach 113 Ergebnisse ihrer Sensibilisierung gegen Culicoides nubeculosus gruppiert, um anschließend das Verhältnis der generellen Sensibilisierung zu vergleichen. Das Ergebnis der Gruppierung der generellen Sensibilisierung mit IgE und/oder IgG (s. Abb. 27) gibt Hinweise auf eine pathologisch übersteigerte Reaktionsbereitschaft der Basophilen von Atopikern, ohne dass eine Allergen spezifische Freisetzung in die Darstellung mit einfließt: Die nicht gegen Culicoides nubeculosus sensibilisierten Pferde zeigten eine niedrigere Verhältniszahl von IgE zu IgG als die nachweislich gegen Culicoides nubeculosus sensibilisierten. Zwei Ursachen können für dieses Phänomen verantwortlich sein: 1) Allergiker setzen verhältnismäßig mehr Histamin auf einen IgE vermittelten Stimulus frei. 2) Gesunde Individuen zeigen eine stärkere Bereitschaft, IgG vermittelt Histamin auszuschütten. Verhältnis IgEzuIgG vermittelter Histaminfreisetzung 1 Allergische Pferde klinisch gesunde Pferde Individuen (sortiert) Abb. 27 Das Verhältnis der IgE/IgG Freisetzung unter Berücksichtigung des atopischen Status. Wie in Abb. 25 wird hier der Verhältniswert der generellen Sensibilisierung gezeigt (Ordinate). Dargestellt sind Mittelwerte aus 10 Bestimmungen (s. 3.2.6 und 3.3.9). Im Gegensatz zur Abb. 25 wurden hier erst klinische Gruppen (Pferde mit atopischer Dermatitis sowie klinisch gesunde Pferde, von denen 3 in vitro wiederholt eine Sensibilisierung gegen Culicoides nubeculosus zeigten, s. 3.2.5). In den einzelnen Gruppen wurden die Pferde zur übersichtlichen Darstellung nach der Größe des Verhältniswertes sortiert. Die Gruppe klinisch gesunder Pferde weist wiederholt niedrigere Verhältniswerte auf als die Gruppe klinisch erkrankter Tiere. Die Fehlerbalken repräsentieren den SEM (standard error of mean; N=37). 114 Ergebnisse Um eine Zuordnung der einzelnen Indices in den Abb. 22, Abb. 25 und Abb. 27 zu den untersuchten Pferden zu erleichtern, wird im Folgenden für die einzelnen Tiere aufsteigend sortiert nach dem Index mit Standardabweichung und Pferdenummer tabellarisch zusammengefasst. Tab. 5 Verhältniswerte IgE/IgG vermittelte Histaminfreisetzung aller in 4.3.3 untersuchten Tiere Mittelwert (mean) sd Pferd No. Mittelwert (mean) sd Pferd No. 0,17 0,10 16 0,49 0,18 24 0,22 0,11 18 0,49 0,17 8 0,26 0,13 11 0,50 0,25 19 0,37 0,12 21 0,50 0,12 31 0,39 0,12 17 0,51 0,09 38 0,43 0,10 22 0,51 0,10 7 0,44 0,09 13 0,51 0,14 39 0,44 0,10 29 0,53 0,10 4 0,44 0,10 32 0,54 0,19 35 0,44 0,10 30 0,57 0,16 34 0,45 0,13 23 0,58 0,15 1 0,45 0,20 36 0,62 0,29 33 0,46 0,12 28 0,62 0,22 14 0,46 0,08 25 0,63 0,09 2 0,46 0,11 10 0,64 0,08 12 0,48 0,12 20 0,68 0,22 37 0,48 0,17 27 0,72 0,09 5 0,48 0,19 15 0,76 0,26 9 0,88 0,10 6 Über einen Zeitraum von 8 Monaten wurden Pferde regelmäßig in dem FIT (s. 3.3.9) auf ihre generelle Sensibilisierung sowie ihre Sensibilisierung gegen Culicoides nubeculosus (s. 3.2.5) getestet. Von jedem Termin wurde das Verhältnis der IgE vermittelten Freisetzung zur IgG vermittelten gebildet (s. 3.2.6). Die Mittelwerte und Standardabweichungen sind hier dargestellt. (Abk.: sd = Standardabweichung) Die Diskriminierung von atopischen und gesunden Pferden über das Verhältnis der Antikörper vermittelten Ausschüttung von Histamin sollte nun auf Grund der individuellen 115 Ergebnisse Schwankungen sowie wegen des fließenden Übergangs der Gruppen statistisch evaluiert werden. Dazu wurden die Gruppen zuerst in einem Box Chart dargestellt (s. Abb. 28), um die Verteilung der einzelnen Probanden zu charakterisieren. Während die Quotienten der gesamten untersuchten Herde sich als normal verteilt darstellen, finden wir bei den gesunden Individuen eine Rechtsschiefe in der Verteilung innerhalb der Population sowie eine Linksschiefe bei den Atopikern. Verhältnis IgE zu IgG vermittelter Histaminfreisetzung 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 NA klinisch gesunde Probanden A Sommerekzemer Abb. 28 Diskriminierung atopischer Pferde durch die Überprüfung des Verhältnisses der generellen Sensibilisierung Zur einfacheren Visualisierung der in Abb. 27 gebildeten Gruppen wurde hier ein Box Diagramm (s. 3.3.15) der Verhältniswerte aus IgE zu IgG (s. 3.2.6 )bedingter Histaminfreisetzung (s. 3.3.9) in den Gruppen klinisch gesunde Pferde (linke Box) (Abk. NA = nicht atopische; N=13) sowie an atopischer Dermatitis (rechte Box) (Sommerekzemer; Abk. A = Atopiker; N=24) erkrankter Pferde erstellt. Jeder der Punkte neben den Boxen steht für einen der Mittelwerte der in Abb. 27 gezeigten Verhältnisse von IgE zu IgG eines Pferdes. Auf Grund der Verteilung der Daten wurde hier ein two-tailed Mann Whitney Test (Mann-Whitney U =16,5) angewandt. Das ermittelte Signifikanzniveau lag bei p<0,0001. (Wilcoxon signed rank test p<0,0002) Die Signifikanzniveaus wurden festgelegt:p>0,05 (-) nicht bedeutend unterschiedlich; p<0,05 (*) unterschiedlich; p<0,01 (**) bedeutend unterschiedlich; p<0,001 (***) hoch signifikant unterschiedlich. 116 Ergebnisse 4.3.4 Überprüfung der Hypothese Basophile von atopischen Pferden seien IgE reagibler als die gesunder Individuen IgE vermittelte Histaminliberation [ng/mL] In dem Kapitel 4.3.3 wurden atopische Pferde auf Grund des Quotienten der Ansätze zur Überprüfung der generellen Sensibilisierung von gesunden Individuen diskriminiert. Ob dies Spiegel einer vermehrten Freisetzung von Histamin über IgE bei den atopischen Pferden war, sollte nun überprüft werden. Dazu wurden die absoluten Mengen durch IgE freigesetzten Histamins in Abhängigkeit zum Sensibilisierungsgrad der Tiere im FIT (s. 3.3.9) gegen Culicoides nubeculous bestimmt und verglichen. 30 *** ** 25 20 15 10 5 0 N= 9 N = 102 4 40 13 127 11 117 Institutsschlüssel 0 1+ 2+ 3+ Sensibilisierung gegen Culicoides nubeculosus Abb. 29 Histaminfreisetzung durch mAK anti equine IgE in Abhängigkeit vom spezifischen Sensibilisierungsgrad gegen Culicoides nubeculosus Diese Darstellung zeigt die Mittelwerte von bis zu 12 Bestimmungen je Pferd der IgE (s. 3.2.6) vermittelten Histaminfreisetzung (Summe der Bestimmungen in einer Sensibilisierungsklasse = n). Die Tiere wurden nach ihrem Sensibilisierungsgrad gegen Culicoides nubeculosus gruppiert (s. 3.2.5, 3.3.9 und 3.3.10) (Summe der Pferde in einer Gruppe = N). Die Anzahl an Individuen je Sensibilisierungsgrad ist in der Grafik in den zugehörigen Balken angegeben. Die statistische Analyse mit dem one way ANOVA Test (Kruskal-Wallis Test für die Gruppen (KW statistic 21,95; p<0,0001), Dunn´s Multiple Comparison test für den Vergleich der Gruppen) ergab keine signifikante Abweichung der Mittelwerte unter den Gruppen Cn0 und Cn1+. Tendenziell ist bei den Tieren in der Gruppe Cn2+ (N=13) eine höhere freigesetzte Histaminmenge zu erkennen. Statistisch signifikant grenzt sich allerdings nur die Gruppe Cn3+ gegen Cn0 (p<0,001) und Cn1+ (p<0,01) ab. Die Signifikanzniveaus wurden festgelegt:p>0,05 (-) nicht bedeutend unterschiedlich; p<0,05 (*) unterschiedlich; p<0,01 (**) bedeutend unterschiedlich; p<0,001 (***) hoch signifikant unterschiedlich. 117 Ergebnisse IgE vermittelter Release IgG vermittelter Release ( * ) , p=0,039 Histaminfreisetzung [ng/mL] 50 40 30 ( - ) , p=0,171 20 10 0 gesunde Pferde atopische Pferde Abb. 30 Histaminfreisetzung durch die Überprüfung der generellen Sensibilisierung in Abhängigkeit von der klinischen Diagnose Sommerekzem Die klinischen Erhebungen am Tier stellten in Ergänzung zu den FIT Ergebnissen (s. 3.3.9) sicher, ob ein Pferd neben der Sensibilisierung gegen sein relevantes Allergen (hier Culicoides nubeculosus, s. 3.2.5) die Diagnose der atopischen Dermatitis erhielt. In dieser Darstellung sind absolute Histaminfreisetzungen angegeben. Überprüft wurden die Ansätze der generellen Sensibilisierung. Links sind die gesunden Individuen zusammengefasst, rechts die Pferde mit der Diagnose Sommerekzem. Reduziert man die vorliegenden Daten aus Abb. 29 auf die Beurteilung des klinischen Status der atopischen Dermatitis und berücksichtigt, dass einige der vorgestellten Probanden bei vorliegender Sensibilisierung gegen Culicoides nubeculosus keine Anzeichen von Sommerekzem aufweisen, verändert sich die Aussage von 4.3.4. Es ergibt sich eine signifikant höhere IgG vermittelte Freisetzung in der Gruppe der Allergiker. Um dennoch die in 4.3.3 definierte Diskriminierung erklären zu können, muss ein verhältnismäßig höherer IgE vermittelter Release in der Gruppe der Atopiker postuliert werden - auch wenn die Analyse des absoluten Histamingehaltes keine signifikante Trennung dieser Gruppen zulässt (p=0,171). Erklärend können hier die hohen Standardabweichungen in der Gruppe der Atopiker genannt werden (s. Abb. 27 und Abb. 28). Wie in 4.3.2 bereits dargestellt, kann die 118 Ergebnisse Sensibilisierung der Basophilen durch membranständige Antikörper unterschiedlichen Isotyps nur im Verhältnis zueinander und für einen Zeitpunkt bestimmt werden. 4.3.5 Freisetzung von Histamin durch verschiedene Konzentrationen des monoklonalen Antikörpers gegen equines IgE Die Ergebnisse in 4.3.3 und 4.3.4 wurden erst durch die rückblickende Betrachtung der verschiedenen Messzeitpunkte möglich. In dem erfassten Zeitfenster wurden zur Überprüfung der generellen Sensibilisierung normierte Freisetzungsstimuli verwendet. Für die IgG vermittelte Freisetzung wurde ein käufliches, polyklonales Antiserum verwendet. Für die Freisetzung im FIT (s. 3.3.9) wurden definierte Mengen des Antiserums in zwei Konzentrationen eingesetzt – eine optimale und eine suboptimale Konzentration, die nicht in der Lage ist, eine maximale/vollständige Degranulation hervorzurufen. Die IgE vermittelte Freisetzung basierte auf der Verwendung eines Zellkulturüberstandes, der in einem Vorversuch auf seine Fähigkeit überprüft worden war, Histamin aus Zellen des peripheren Blutes der Pferde freizusetzen (Daten nicht gezeigt). Möglicherweise waren die vorgestellten Phänomene (s. 4.3.1) Spiegel einer suboptimalen Konzentration von anti equinen Antikörpern in den nativen Zellkulturüberständen. Um dies zu überprüfen, wurde der monoklonale Antikörper aufgereinigt und aufkonzentriert, um mit verschiedenen Konzentrationen die Histaminfreisetzung aus basophilen Granulozyten von acht Pferden an einem Tag zu erfassen (Abb. 31). Die höchste überprüfte Konzentration enthielt 6 mal so viele funktionelle Antikörper wie der üblicherweise im FIT eingesetzte Überstand, die geringste Konzentration 1/6 davon. Als Referenz wurde eine Verdünnung gewählt, die dem sonst eingesetzten Überstand entsprach. Die einzelnen Konzentrationen wurden in einem indirekten Sandwich-ELISA (Aufbau wie in 4.2.1) bestimmt. 119 Ergebnisse ( *** ; p=0,000002) ( - ; p=0,41) ( * ; p=0,02) % von anti IgE Freisetzung (hohe Konzentration) 120 100 80 60 40 20 0 1 2 3 6x konz. Anti IgE 1x konz. Anti IgE 1/6x konz. Anti IgE Abb. 31 IgE vermittelte Freisetzung von Histamin in Abhängigkeit von der Konzentration des eingesetzten mAK anti IgE 134 (N=8) Von acht Pferden wurde am selben Tag im FIT (s. 3.3.9) die durch Kreuzvernetzen von IgE (s. 3.2.6) freisetzbare Menge Histamin bestimmt. Um die Individuen vergleichen zu können, wurde die durch die höchste Konzentration an anti IgE freigesetzte Menge Histamin gleich 100% gesetzt und die zwei darunter liegenden Konzentrationen in Prozent dieses Wertes dargestellt. Die Fehlerbalken stellen den SEM dar (standard error of mean). Die erste Säule zeigt keine Fehlerbalken, da sie als Bezugsgröße definiert wurde. Die Mittelwerte der Histaminfreisetzung durch die hohe Konzentration von anti IgE (6x) unterscheidet sich nicht signifikant von der einfachen, üblicherweise im FIT eingesetzten Konzentration. Die übrigen Kombinationen unterscheiden sich signifikant. Die Signifikanzniveaus wurden festgelegt:p<0,05 (-) nicht bedeutend unterschiedlich; p>0,05 (*) unterschiedlich; p>0,01 (**) bedeutend unterschiedlich; p>0,001 (***) hoch signifikant unterschiedlich. (Abk. konz.: konzentrierter Zellkulturüberstand) 120 Ergebnisse Es zeigte sich, dass die üblicherweise verwendete Verdünnung des Zellkulturüberstandes mit dem mAK anti equines IgE 134 sich nicht signifikant von der sechsfachen Konzentration unterscheidet, während eine weitere Verdünnung signifikant geringere Histaminfreisetzungen bewirkt. Die in 4.3.3 dargestellten Unterschiede in der Histaminfreisetzung durch die Überprüfung der generellen Sensibilisierung einerseits sowie die tendenzielle Einteilung in Atopiker und gesunde Pferde andererseits ist kein Konzentrationsphänomen der eingesetzten Antikörper. Nun war zu überprüfen, ob die IgE und/oder die IgG vermittelte Freisetzung von Histamin den gleichen Mechanismus nutzt, wie ein Allergen. 4.3.6 Modulation der Histaminfreisetzung über die kombinierte Aktivierung der generellen und der spezifischen Sensibilisierung Nr.2 Nr.5 Nr.15 160 140 120 100 80 60 40 20 121 Cul. Nub. 5 Cul. Nub. 15 anti IgE 1/4 anti IgG 20 anti IgG 60 Max 0 Spontan Histaminfreisetzung in Prozent von Max Ausgehend von der Beobachtung, dass Pferde individuell auf die Provokation einer IgE oder einer IgG vermittelten Degranulation von Basophilen reagieren und dass das Verhältnis dieser Reaktionsbereitschaft sich zwischen Atopikern und Nicht-Atopikern unterscheidet, sollte überprüft werden, ob die kombinierten Stimuli einen additiven oder auch inhibierenden Effekt auf die Histaminfreisetzung ausüben. Dazu wurden initial drei Pferde untersucht, die das klinische Bild des Sommerekzems zeigten und nachweislich im FIT gegen Culicoides nubeculosus sensibilisiert waren. Ergebnisse Abb. 32 Basiswerte für die FIT Ergebnisse von drei allergischen Pferden Die FIT Ergebnisse (s. 3.3.9) dieses Diagramms beziehen sich auf die Freisetzung von Histamin bei 3 nachweislich gegen Culicoides nubeculosus (s. 3.2.5) sensibilisierten und an Sommerekzem erkrankten Individuen. Zur besseren Vergleichbarkeit wurden alle Freisetzungen in Prozent des „Maximalreleases“ (physikalischer Release) angegeben. Von links nach rechts finden sich der Spontanrelease, der Maximalrelease, anti IgG Freisetzung mit 60 und 20 µg/mL, anti IgE vermittelte Degranulation mit final vierfach verdünntem Zellkulturüberstand (muriner IgG1-mAK anti equines IgG 134, s. 3.2.6), Allergen vermittelte Freisetzung (s. 3.2.5) mit 15 und 5 µg/mL, sowie eine Isotypkontrolle: murines IgG1 anti bovine MNC Subpopulation. Bei den gewählten Konzentrationen der Provokatoren anti IgG sowie Culicoides nubeculosus finden sich z.T. Werte, die über die 100% des physikalischen Release hinausgehen. Dieses Phänomen beruht auf einem anteiligen Verlust von Histamin beim Kochen der Zellen (KAUL 1999). Nach der Überprüfung der versuchsinternen Kontrollparameter (s. Abb. 32) sollte untersucht werden, ob eine kombinierte Inkubation mit einem der Stimuli zur Überprüfung der generellen Sensibilisierung und dem Allergen aus Culicoides nubeculosus einen Einfluss auf die resultierende Menge freigesetzten Histamins habe. Als eine Vorraussetzung dieses Tests ist die richtige Wahl der Konzentrationen zur Überprüfung der generellen Sensibilisierung zu erwähnen. Nur wenn suboptimale Konzentrationen zur Überprüfung der generellen Sensibilisierung verwendet werden, kann eine zusätzliche Aktivierung durch das Allergen bestimmt werden. Im umgekehrten Fall kann eine Inhibition eines stimulierenden Reizes quantitativ am besten erfasst werden, wenn der aktivierende Stimulus möglichst viele aktivierende Rezeptoren der Signaltransduktion anspricht. Dementsprechend wurden für diesen Versuch folgende Verdünnungen/Konzentrationen ausgewählt: Für die Stimuli der generellen Sensibilisierung: anti IgG 20 µg/mL und anti IgE als vierfach verdünnten Überstand aus der Zellkultur; für die Allergen vermittelte Freisetzung wurde die Konzentration von 5 µg/mL gewählt. 122 Nr.2 Nr.5 Nr.15 140 120 100 80 60 40 20 an ti Ig G + C ul .N ub . an ti Ig E + C ul .N ub . an ti Ig G 20 µg /m L an ti Ig E C ul .n ub . 1/ 4 0 5µ g/ m L HistaminliberationinProzent vonphysikalischemRelease Ergebnisse Abb. 33 Ergebnisse der kombinierten Stimulation mittels der generellen und der spezifischen Sensibilisierung In dieser Abbildung wird die einfache Stimulation der Basophilen des Pferdes zur Freisetzung von Histamin sowie die kombinierte Freisetzung mit zwei verschiedenen Provokatoren verglichen (s. 3.3.9). Von links nach rechts sind dargestellt: Allergenfreisetzung mit 5 µg/mL Culicoides nubeculosus Extrakt (s. 3.3.9), IgE vermittelte Freisetzung mit 1 : 4 verdünntem Zellkulturüberstand (s. 3.2.6), IgG vermittelte Freisetzung mit 20 µg/mL polyklonalem anti IgG (s. 3.2.6). Rechts davon befinden sich die kombinierten Ansätze in den gleichen Endkonzentrationen, zuerst Allergen plus anti IgE, dann Allergen plus anti IgG. Zum besseren Vergleich der Freisetzungen wurde eine zusätzliche Linie eingezeichnet, die den 100% Wert angibt (Freisetzung von Histamin durch Kochen der Zellen, Pferd Nr.2: Max = 24,0 ng/mL, Nr.5: Max = 34,8 ng/mL, Nr.15: Max = 16,4 ng/mL). Die Koinkubation von anti IgE und Allergen zeigte keine Steigerung der Freisetzung von Histamin, die Werte liegen absolut sogar alle knapp unter den einzelnen Stimuli der Allergen vermittelten Freisetzung. Im Gegensatz dazu zeigte sich bei der Koinkubation mit anti IgG und Allergen eine deutliche Steigerung der Histaminliberation im Vergleich zu den Einzelstimuli. Die Koinkubation von einem der generellen Stimuli (s. 3.3.9) mit dem Allergen zeigte nur bei der IgG vermittelten Freisetzung eine erhöhte Histaminfreisetzung. Bei der Koinkubation mit anti IgE war festzustellen, dass das Ergebnis der Allergen bedingten Freisetzung die IgE vermittelte überlagerte. Das Ergebnis glich der Allergen vermittelten Freisetzung auch bei Pferd Nr.15: Obwohl bei diesem Tier die IgE Freisetzung (13,7 ng/mL) höher war als die Allergen vermittelte (10,0 ng/mL), lag das Gesamtergebnis der Koinkubation (9,3 ng/mL) bei 123 Ergebnisse dem Wert für das Allergen allein. Um zu prüfen ob beim Pferd durch anti IgE-Antikörper eine Minderung und durch anti IgGAntikörper eine Steigerung der allergeninduzierten Histaminfreisetzung möglich ist, wurden weitere Pferde mit den kombinierten Stimuli inkubiert. In Abweichung zum vorherigen Test sollte der anti IgE vermittelte Release diesmal gestaffelt in fünf verschiedenen Verdünnungen mit und ohne Allergen überprüft werden. Zusätzlich wurden 2 Konzentrationen der anti IgG vermittelten Freisetzung getestet. Tab. 6 Basiswerte für die verwendeten Stimuli allein, geprüft bei 3 Pferden Pferd Nr. Stimulus Nr.4 Spontan Maximal Nr.6 [ng Histamin/mL] Nr.12 1,2 24,2 1,7 13,5 2,2 23,8 anti IgE 10x 5x 2x 1x 0,5x 8,6 9,5 6,9 8,9 9,0 16,0 13,9 11,8 7,2 6,5 23,2 23,1 24,5 19,2 17,6 anti IgG 60 µg/mL 20 µg/mL 19,9 11,7 18,4 7,1 38,8 23,7 Culicoides nub. 10 µg/mL 36,3 11,3 21,1 Die drei Pferde reagierten individuell unterschiedlich auf den gestaffelten anti IgE Release. Während Pferd Nr.4 für alle verwendeten Konzentrationen (Angaben in Bezug auf Standardverdünnung im FIT, s. 3.3.9) ein Plateau im Histaminrelease aufwies, zeigte Pferd Nr. 6 eine Dosis abhängige Freisetzung von Histamin. Pferd Nr. 12 reagierte nur in den zwei geringsten Konzentrationen von anti IgE mit einer Verringerung der Histaminfreisetzung. Der IgG vermittelte Release zeigte bei allen Tieren einen Dosiseffekt, lag aber stets über dem IgERelease. Interessanterweise zeigte Pferd Nr.4, welches am geringsten auf die IgE vermittelte Degranulation reagierte, den höchsten Wert bei der Allergen vermittelten Freisetzung. 124 Ergebnisse Tab. 7 Histaminfreisetzung von 3 Pferden nach Koinkubation mit Culicoides nubeculosus plus anti IgE oder anti IgG Antikörper Pferd Nr. Stimulus Nr.4 Nr.6 Nr.12 [ng Histamin/mL] Culicoides nub. 10 µg/mL 36,3 11,3 21,1 anti IgE 10x 5x 2x 1x 0,5x 16,4 21,4 19,5 27,0 32,6 17,4 17,7 15,9 14,0 12,8 26,9 23,2 32,4 23,5 21,5 anti IgG 60 µg/mL 20 µg/mL 42,1 34,6 22,2 19,8 39,2 29,7 Die Koinkubation von Allergen (Culicoides nubeculosus) mit den Ansätzen zur Überprüfung der generellen Sensibilisierung (anit IgE oder anti IgG) bestätigte und erweiterte die bereits in der Abb. 33 angedeuteten Phänomene. Bei den Probanden Nr.6 und Nr.12 zeigte durch Koinkubation mit hohen anti IgE Antikörperkonzentrationen eine sich gesteigerte Histaminfreisetzung über die hinaus, die allein durch das Allergen erzielt werden konnte. Mit zunehmender Ausverdünnung der anti IgE Antikörper ging diese Steigerung weitgehend (Pferd Nr. 6) oder vollständig zurück (Pferd Nr. 12) auf den Allergen induzierten Release. Vergleicht man die durch Koinkubation erzielten Histaminfreisetzungen mit denen der Stimuli (Allergen, Antikörper) alleine (Abb. 34), so bewirkt die Koinkubation von Allergen und anti IgE Antikörper bestenfalls eine Steigerung um 50%. Bei Pferd Nr.4 hingegen bewirkt die Zugabe von anti IgE zum Allergen dosisabhängig eine deutlich verminderte Histaminfreisetzung, die mit abnehmender anti IgE Konzentration wieder auf den Allergen induzierten Ausgangswert ansteigt (Tab. 3 und Abb. 34). Wurden im gleichen Untersuchungsansatz statt anti IgE anti IgG Antikörper eingesetzt, so konnte bei allen drei Pferden durch die Koinkubation mit Allergen keine Minderung der Histaminfreisetzung sondern eher eine Steigerung (bis um 100% bei Pferd Nr. 6) beobachtet werden. 125 Ergebnisse % vom Allergen induzierten Release Modulation der allergeninduzierte Histaminfreisetzung durch anti IgE oder anti IgG Antikörper 200,0 150,0 100,0 50,0 0,0 C. n. & >IgE & >IgE 5x & >IgE 2x & >IgE 1x & >IgE 10x 0,5x Nr. 4 Nr. 6 & >IgG 60 & >IgG 20 Nr. 12 Abb. 34 Relative Darstellung der anti IgE bzw. anti IgG modulierten Allergen induzierten Histaminfreisetzung aus basophilen Granulozyten von 3 Pferden mit Sommerekzem. Drei atopische Pferde wurden im funktionellen in vitro Test (FIT, s. 3.3.9) auf ihre Histaminfreisetzung mit Allergen allein (C.n. Culicoides nubeculosus, s. 3.3.9) oder in Koinkubation mit den Stimuli zur Überprüfung der generellen Sensibilisierung (anti IgE sowie anti IgG) getestet. Pferd Nr.4 zeigt eine IgE vermittelte, konzentrationsabhängige Inhibition des Allergenrelease, Pferd Nr.12 zeigt keinen auswertbaren Einfluss der zusätzlichen Inkubation mit anti IgE, Pferd Nr. 6 zeigt einen glockenförmigen Anstieg des Histaminreleases mit einem Maximum (150% des Allergen vermittelten Release) bei der doppelten Konzentration des üblicherweise eingesetzten anti IgE Zellkulturüberstandes. Die Koinkubation mit anti IgG zeigte bei allen drei Tieren eine Steigerung der Histaminfreisetzung. Diese Ergebnisse weisen u. a. auf eine IgE vermittelte inhibitorische Potenz hin. Um zu überprüfen, ob das Phänomen einer geringeren IgE vermittelten Histaminfreisetzung im Verhältnis zur IgG induzierten für Pferd Nr. 4 charakterisierend sei, wurde auf die in Abb. 27 und Abb. 28 vorgestellten Daten zurückgegriffen. Aus der Betrachtung des Verlaufes der generellen Sensibilisierung ergab sich für diese drei an Sommerekzem erkrankten Tiere ein unterschiedliches Bild. Während Tier Nr.12 und deutlicher noch Tier Nr.6 einen hohen Quotienten von IgE zu IgG vermittelter Freisetzung aufwiesen, zeigte sich bei Tier Nr.4 ein ausgewogenes Reaktionsmuster, der Quotient lag am oberen Bereich der Werte für Nichtatopiker (s. Abb. 27). 126 Ergebnisse Verhältnis der IgE zu IgG vermittelten Histaminliberation 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 Pferd Nr.4 Pferd Nr.6 Pferd Nr.12 Abb. 35 Überprüfung der individuellen Streuung der IgE vermittelten Histaminfreisetzung im Verhältnis zur IgG bedingten Histaminfreisetzung bei 3 Pferden mit Sommerekzem. Dargestellt sind die Quotienten von IgE zu IgG vemittelter Histaminfreisetzung (s. 3.2.6 und 3.3.9) von 10 Bestimmungen (s. 4.3.2). Der Mittelwert des Box Chart (s. 3.3.15) für das Tier Nr.4 lag bei 0,53+/-0,1 SEM, für das Pferd Nr.6 bei 0,88+/-0,1 SEM und 0,64+/-0,08 bei Pferd Nr.12. Die Verhältnisse dieser drei Individuen unterscheiden sich signifikant. (Pferd Nr.4 zu Pferd Nr. 6 p<0,001, zu Pferd Nr.12 p<0,05, Pferd Nr. 6 zu Pferd Nr. 12 p<0,001; one way ANOVA wiederholter Messungen mit Vergleich der Individuen durch Tukey Post test.) 4.4 Funktionelle Überprüfung monoklonaler anti equiner Immunglobulinisotypen Antikörper im FIT 4.4.1 Überprüfung der Histamin freisetzenden Potenz equiner IgG Isotypen nach Kreuzvernetzung Auf Grund der sich wiederholenden Hinweise auf eine nicht IgE vermittelte, generelle sowie spezifische Sensibilisierung von basophilen Granulozyten des Pferdes sollte überprüft werden, ob die vorhandenen Antikörper gegen unterschiedliche equine Immunglobulin- 127 Ergebnisse Isotypen in der Lage sind, die induzierte Histaminfreisetzung aus gewaschenem Vollblut des Pferdes zu beeinflussen. Zum Zeitpunkt der Untersuchung standen neben monoklonalen Antikörpern gegen equines IgE monoklonale Antikörper gegen vier der sieben equinen IgG Subtypen zur Verfügung. Nach der neuen Nomenklatur waren dies murine Antikörper gegen equine IgG1, IgG2, IgG4 sowie IgG5. Der murine mAK anti equines IgG2 steht erst seit dem Jahr 2004 zur Verfügung (A. Wege, 2004). Funktionelle Tests in Bezug auf die Fähigkeit, Fc-Rezeptor gebundene Antikörper zu binden und überbrückend eine Signaltransduktion hervorzurufen, liegen für keinen dieser Isotyp spezifischen Antikörper vor. In einem Vorversuch sollte überprüft werden, ob diese Antikörper alleine in der Lage sind, eine Histaminausschüttung aus Basophilen des Pferdes hervorzurufen. Dazu wurde von drei Pferden Blut gewonnen und im FIT getestet. Freisetzungsbedingung Pferd Nr.9 Pferd Nr.8 Pferd Nr.1 anti IgE anti IgG4 anti IgG5 anti IgG2 anti IgG1 phys. Spontan 0 5 10 15 70 80 90 100 Histaminfreisetzung in % der physikalischen Freisetzung Abb. 36 Überprüfung einer Immunglobulin G Isotypen vermittelten Freisetzung von Histamin aus basophilen Granulozyten des Pferdes Peripheres Blut von drei Pferde wurde hier auf sein Reaktionsverhalten nach Provokation mittels Ig isotypspezifischer mAK getestet (s. 3.2.6 und 3.3.9). Alle Daten sind in Prozent der physikalischen Freisetzung (Kochen der Zellen) angegeben. Die einzelnen Stimuli stehen rechts neben den Balkengruppen. Die IgE sowie die IgG vermittelte Freisetzung dienen als Kontrolle der Funktionalität der Zellen. Die überprüften monoklonalen Antikörper gegen equine IgG Isotypen konnten bei keinem der Pferde zu einer über der spontanen Freisetzung liegenden Histaminausschüttung führen. 128 Ergebnisse Das Ergebnis des Vortests ließ den Schluss zu, dass eine aktivierende, zur Degranulation Basophiler führende Kreuzvernetzung membranständiger Immunglobuline der hier geprüften IgG Isotypen nicht nachzuweisen war. 4.4.2 Überprüfung einer inhibitorischen Potenz equiner IgG Isotypen nach Kreuzvernetzung Nun mehr stellte sich die Frage, ob durch diese anti Isotyp Antikörper eine inhibitorische Potenz ausgeübt werden könnte. Da das Messsystem (FIT) nur eine resultierende Darstellung freigesetzten Histamins als Summe aktivierender und inhibitorischer Reize erlaubt, sollte auf den bereits zuvor angewandten kombinierten Ansatz (s. 4.3.6) zurückgegriffen werden. Die IgE vermittelte Aktivierung der Basophilen sollte daraufhin untersucht werden, ob die anti equinen IgG-Isotyp spezifischen monoklonalen Antikörper diese modulieren oder inhibieren können. Dazu wurden die Zellen mit Antikörpern gegen IgE und IgG (beide aus der Maus, s. 3.2.6) inkubiert. Nachdem diese monoklonalen Antikörper an ihre Zielstruktur (also equines IgE oder IgG) gebunden haben, werden diese unterschiedlichen monoklonalen Antikörper in einem nächsten Schritt miteinander vernetzt. Dadurch sollte überprüft werden, ob ein hetero-bridging, also das Kreuzvernetzen von membrangebundenem IgE mit IgG Isotypen eine modulatorische Potenz besäße. (Superbridging ist im Folgenden das Kreuzvernetzen identischer Immunglobulin-Isotypen). Dazu wurden in einer gestaffelten Inkubation primär aktivierende und potenziell inhibitorische murinen mAK zu den PBL von 3 Pferden gegeben, und nach einer 15 minütigen Inkubation wurden polyklonale anti Maus IgG u. IgM spezifische F(ab´)2 Fragmente zu den Ansätzen pipettiert (finale Konzentration 5 µg/mL). Die gesamte Inkubationsdauer bei 37° C wurde von 60 Minuten auf 75 Minuten erhöht (s. 3.3.9). Die kombinierten Stimuli zur Überprüfung der generellen Sensibilisierung (anti IgE und anti IgG) wurden in drei verschiedenen Konzentrationsverhältnissen eingesetzt. Die höchste Konzentration lag dabei um den Faktor 16 über der niedrigsten, alternierend für beide Stimuli. 129 1) 1) Pferd 1 8) 8) Pferd 8 9) 9) Pferd 9 Ergebnisse Histaminfreisetzung in % der physikalischen Freisetzung 130 Histaminfreisetzung in % der physikalischen Freisetzung 131 8) 8) 9) 9) Die Ergebnisse der Histaminfreisetzung in Prozent des physikalischen Release von 3 Pferden (1, 8 & 9) mit anti IgG1, G2, G5, sowie G4 allein oder in Kombination mit anti IgE (134) (in der Abb. als IgE vermerkt) sind jeweils übereinander dargestellt. Die Kreissymbole deuten eine gestaffelte Inkubation mit Zugabe von Ziege anti Maus F(ab´)2 (s. 3.2.6) an. Die obere gestrichelte Linie stellt den individuellen Wert der Inkubation mit anti IgE (134) und dem F(ab´)2 dar (anti IgE in der höchsten, eingesetzten Verdünnung, entspricht ¼ konzentriertem Zellkulturüberstand), die untere die reine IgE vermittelte Freisetzung. Innerhalb der Diagramme findet man die Beschriftung der Reihe links. Antikörpern. Abb. 37 Überprüfung der modulierenden Kapazität durch Inkubation equiner PBL mit monoklonalen anti IgG Isotypen- 1) ) Ergebnisse Ergebnisse Wiederum konnte gezeigt werden, dass die überprüften monoklonalen anti IgG Isotyp Antikörper bei keinem der Pferde eigenständig oder nach Superbridging zur Freisetzung von Histamin führten. Weiterhin konnte bei allen Pferden durch das Superbridging bei der IgE vermittelten Freisetzung eine geringe Steigerung der allein durch anti IgE hervorgerufenen Histaminfreisetzung erzielt werden (Pferd Nr.1, 8 und 9). Für das Tier Nr. 1 war sogar eine deutliche Steigerung zu sehen. Bei Pferd Nr. 8 konnte das Superbridging nicht die Werte erreichen, die durch die vierfache Konzentration des anti IgE Release hervorgerufen wurde. Die Ansätze zur Überprüfung einer kombinierten Stimulation zeigten bei der einfachen sowie vierfachen Konzentration des mAK gegen IgE keine ersichtliche modulatorische Kompetenz der anti equinen IgG Isotypen Antikörper. Bei der Ausverdünnung des mAK gegen IgE sank die Histaminfreisetzung ab. Allerdings lagen die Referenzwerte freigesetzten Histamins für diese anti IgE-Verdünnung (gestrichelte Linie in den Diagrammen Abb. 36) deutlich über den kombinierten Ansätzen. Eine Inhibition durch die zugegebenen anti IgG Antikörper konnte vermutet werden. Bei den zusätzlichen Ansätzen zur Erfassung des hetero-bridgings (Zugabe von anti Maus F(ab´)2) konnten inhibierende Auswirkungen für zwei der gewählten Verhältnisse von anti IgE und anti IgG Antikörpern bei allen drei Tieren festgestellt werden (Reihen 2 und 4, Abb. 33). In dem Ansatz mit dem mAK anti IgE in der hohen Konzentration (4 x IgE, ¼ anti IgGx) ließen sich diese Effekte nicht mehr einheitlich für alle Tiere zeigen. Zusätzlich konnte festgestellt werden, dass alle vier verwendeten anti equinen IgG Isotypen Antikörper eine ähnliche, inhibierende Wirkung auf die Histaminfreisetzung ausübten. Um diese Befunde zu überprüfen und eine unspezifische Interaktion nicht membranständiger Immunglobuline auszuschließen, wurde das Experiment modifiziert. Da die vier eingesetzten mAK gegen equine IgG Subtypen sich in ihrer modulatorischen Potenz nicht unterschieden, den IgE vermittelten Release zu inhibieren, wäre eine Immunkomplexbildung des mAK 134 anti IgE mit den anti IgG Antikörpern als Erklärung der beobachteten Phänomene postulierbar. Die Menge aktivierender anti IgE Antikörper würde demnach reduziert, die resultierende Histaminfreisetzung moduliert. Primäre Fragestellung des nächsten Experiments sollte sein, ob diese inhibitorischen Effekte bei allergischen Individuen wiederholbar seien. Zusätzlich sollte untersucht werden, ob die anti IgG Antikörper auch in der Lage wären, eine Allergen bedingte Freisetzung zu modulieren. Weiterhin sollte die kombinierte Inkubation von zwei aktivierenden Stimuli mit einfließen (s. Tab. 7). 132 Ergebnisse Allergen Histaminfreisetzung in Prozent von physikalischem Release Anti IgE Allergen Anti IgE Anti IgE Allergen Abb. 38 Kombinierte Inkubation der Stimuli zur Überprüfung der generellen Sensibilisierung mit Allergen (Culicoides nubeculosus (Cn)) PBL von drei Pferden wurden im FIT (s. 3.3.9) auf modulierende Einflüsse von anti equinen IgG Isotypen (s. 3.2.6) im Hinblick auf die resultierende Histaminfreisetzung überprüft. Dazu wurden die stimulierenden Ansätze mit anti IgE und Allergen (s. 3.2.5) 15 Minuten zeitversetzt mit den anti IgG Antikörpern koinkubiert. Die eingefügten Linien (anti IgE & Cn) sollen den Vergleich zwischen den rein aktivierenden Stimuli mit den Koinkubationen erleichtern. 133 Ergebnisse Aus dem modifizierten Ansatz zur Bestimmung der inhibitorischen Kompetenz der anti IgG Antikörper wurde ersichtlich, dass die eingesetzten monoklonalen Antikörper nicht nur die IgE vermittelte Freisetzung partiell inhibieren konnten, sondern auch bei allen drei Tieren die Allergen vermittelte Histaminliberation senkten. Im Weiteren wurden die zuvor vorgestellten Ansätze der kombinierten Inkubation auch noch mit dem goat anti mouse F(ab´)2 inkubiert. Die in Abb. 33 dargestellte Inhibition bestätigte sich wiederum. Allerdings verstärkte sich die Inhibition nur noch geringradig, weswegen auf die zusätzliche Darstellung hier verzichtet wird. Parallel wurden in Kontrollansätzen irrelevante monoklonalw Antikörper gegen bovine Strukturen mit den Isotypen IgG1, IgG2a sowie IgM inkubiert. Diese monoklonalen Antikörper waren nicht in der Lage, eine Reduktion der Histaminfreisetzung zu erzielen. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass eine inhibitorische Potenz der monoklonalen Antikörper gegen equine IgG Subtypen festgestellt werden konnte. Die Kapazität des polyklonalen Ziegenserums gegen equines IgG Histamin freizusetzen konnte nicht auf einen Isotyp begrenzt werden. Im Gegenteil zeigten alle überprüften Isotypen einen deminuierenden Effekt auf die resultierend freigesetzte Menge an Histamin. In wie weit die Modulation auf der Ebene der Basophilen oder auf Grund weiterer Immunglobulin tragender Zellen stattfand, konnte mit dem vorliegenden Versuchsaufbau nicht beantwortet werden. 134 Diskussion 5 Diskussion Überempfindlichkeitsreaktionen vom Typ I zeigen beim Pferd vergleichbare klinische Erscheinungen wie beim Menschen. Die Erfolgsorgane Haut, Bindehäute, Schleimhäute des Respirations- wie Digestionstrakts stellen im equinen System die Orte der Manifestation Typ I allergischer Reaktionen. Auch anaphylaktische Reaktionen sowie perivaskuläre Entzündungsreaktionen, deren Ursachen zwar im Detail noch unklar bleiben, finden sich beim Pferd. Die wohl häufigste Lokalisation für pathologische Typ I Reaktionen ist die äußere Haut mit dem klinischen Bild der atopischen Dermatitis, deren Verlauf und Ursache auf der Ebene der Effektorzellen Schwerpunkt dieser Arbeit darstellen. Ohne den pathophysiologischen Ablauf dieser Erkrankung am Tier zu manipulieren, sollten in dieser Arbeit die sensibilisierenden Antikörper, sowie, wenn mehrere funktionell unterschiedliche Isotypen beteiligt sind, deren gegenseitige Beeinflussung untersucht werden. 5.1 Untersuchungen zur Histaminfreisetzung über Antikörper gegen equine Immunglobulin Isotypen In den letzten Jahren wurden entscheidende Fortschritte im Immunglobulinsystem des Pferdes erreicht. Die Erkenntnisse über die Genloci für die schweren Ketten der Immunglobuline hat einen Grad an Vollständigkeit erlangt, der zu einer neuen Nomenklatur der einzelnen Isotypen geführt hat (s. Immunoglobulin und Fc-receptor workshop in Uppsala, 2001). Allerdings ist noch immer nicht bekannt, welche funktionellen Bedeutungen die einzelnen Isotypen des Pferdes haben können. Bei der Entwicklung des funktionellen in vitro Tests (FIT, s. 3.3.9) waren monoklonale (und polyklonale) Antikörper gegen equines IgE nicht verfügbar. Um dennoch einen Nachweis der funktionellen Sensibilisierung durch Antikörper auf der Oberfläche allergischer Effektorzellen zur Verfügung zu haben, wurden verschiedene polyklonale Seren gegen equine Immuglobuline auf ihre Fähigkeit untersucht, eine Histaminfreisetzung aus gewaschenen Pferdeleukozyten hervorzurufen (Kaul 1998). Dies gelang mit einem kommerziellen Ziegenserum gegen schwere und leichte Ketten von Pferdeimmunglobulinen vom Isotyp G (s 3.2.6). Auf Grund der zumindest partiell identischen leichten Ketten zwischen IgG und IgE wurde postuliert, dass durch dieses Serum möglichst viele Isotypen (und damit auch andere als IgG) auf der Oberfläche basophiler Granulozyten kreuzvernetzt werden können. Im Jahr 2001 wurde von der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover das erste Mal ein monoklonaler Antikörper gegen equines IgE erzeugt (WAGNER et al. 2003). 135 Diskussion Dieser Antikörper hatte wie auch das polyklonale Serum die Fähigkeit, Histamin aus den Zellen des gewaschenen Pferdeblutes frei zu setzen. Bei der parallelen Erfassung der Histaminfreisetzung durch diese zwei Stimuli konnte gezeigt werden, dass fast 90% der untersuchten Pferde auf beide anti Isotyp Antikörper reagierten. 5.2 Membranimmunfluoreszenz gegen equines IgE Die relevanten Effektorzellen der Typ I Allergie im Blut der Pferde sind die Basophilen. Anhand ihrer Reaktionsbereitschaft wird im funktionellen in vitro Test (FIT s. 3.3.9) der Grad der Sensibilisierung mittels verschiedener Antikörper sowie gegenüber unterschiedlichen Allergenen erfasst. Da der FIT in gewaschenem Vollblut stattfindet, also nur das Plasma entfernt wurde, können auch andere Zellen das Ergebnis des FIT beeinflussen (WHITE et al. 1988, BEAUVAIS et al. 1990). Die Messgröße des FIT ist eine resultierende Menge freigesetzten Histamins, wobei die Gruppe der histamine releasing factors (HRF, KLEINE BUDDE & AALBERSE 2003) heterogen ist. Unser Bestreben war es, bezüglich der Freisetzung von Histamin, Antikörper unabhängige Freisetzungen möglichst auszuschließen. Dazu sollte in erster Linie gezeigt werden, welche Leukozyten des Pferdes mit Antikörpern sensibilisiert werden, und zweitens eine selektive Anreicherung von allergischen Effektorzellen vorgenommen werden. In Analogie zu Mensch und Maus können die basophilen Granulozyten weder morphologisch noch auf Grund einer höheren Autofluoreszenz, wie sie bei Eosinophilen gefunden wird, von anderen polymorphkernigen Zellen unterschieden werden. Nur unter zu Hilfe nahme weiterer Unterscheidungskriterien im Durchflusszytometer können Basophile selektiv erfasst werden. Um dies zu ermöglichen müssen diese Zellen anhand anderer phänotypischer Merkmale voneinander abgegrenzt werden. Die basophile Anfärbbarkeit der gespeicherten Mediatoren erlaubt eine morphologische Trennung nur an fixierten Zellen; diese stehen dann aber nicht mehr für funktionelle Untersuchungen zur Verfügung. Eine Anreicherung über Dichtegradienten ist zur Zeit noch nicht geglückt, beim Pferd finden sich in allen physikalisch aufgetrennten Fraktionen Histamin speichernde Zellen in variierenden, aber stets größeren Anteilen (KAUL 1998) Oberflächenmoleküle, die nur oder vermehrt von einer Subpopulation exprimiert werden, können mittels spezifischer, zumeist monoklonaler Antikörper markiert werden, wenn an 136 Diskussion diese Fluorochrome (FITC oder PE) gebunden sind. In der Literatur findet man verschiedene Oberflächenstrukturen, die als Basophilen-Marker in Frage kommen: - Bsp 1 (basophil specific protein) (BODGER et al. 1987) - FcεRI (hohe Expressionsdichte obligat) (MALVEAUX et al. 1978) - CD 63 (activation marker) (KNOL et al. 1991; FUREDER et al. 1994) - Basogranulin (unique secretory product) (MCEUEN et al. 2001) - E-NPP3 (CD203c) (Ectonukleotid-phosphodiesterase) (BUHRING et al. 2004) Nur Mastzellen teilen einige dieser Oberflächenmarker, können aber auf Grund ihrer in Bezug auf die Allergie verwandten Funktion sowie in Ermangelung der exklusiven, phänotypischen Nachweismöglichkeit im equinen peripheren Blut hier vernachlässigt werden. Sollten die Mastzellen miterfasst werden, so gelten die im Folgenden getroffenen Aussagen über phänotypische Erfassung und die Freisetzung von Histamin aus PBL für Basophile und Mastzellen. Besonderes Interesse an diesen Markern, insbesondere CD63 sowie CD203c, entwickelte sich auf Grund einer relativ neuen Technik des Typ I Allergienachweises beim Menschen (SAINTE-LAUDY et al. 1998; SANZ et al. 2001): der durchflusszytometrischen Erfassung von in vitro degranulierten oder aktivierten Basophilen nach Allergenzugabe (flow-cytometric allergen stimulation test (FAST); im Handel als Flow CAST ®(Buhlmann Laboratories) oder BASOTEST ® (Beckton-Dickinson)). Grundlage für die Entwicklung neuer Testverfahren ist auch hier das Bestreben, eine in vitro Diagnostik nutzen zu können, deren Aussagekraft verlässlicher ist, als die Bestimmung von IgE-Serumspiegeln. Als Vergleichsmethode wird in den meisten Fällen der HRT (histamine releasing test) auf Basis eines kompetitiven RIA´s angegeben. Der ursprüngliche durchflusszytometrische Nachweis einer Basophilenaktivierung beruhte auf der vermehrten Oberflächenexpression von CD63. Neuere Veröffentlichungen utilisieren CD203c (BOUMIZA et al. 2003), um eine höhere Sensitivität des FAST zu erreichen; allerdings geben BOUMIZA et al. (2003) für ihre eigenen Ergebnisse nur den Vergleich zu Latex spezifischem IgE an. EBO et al. weisen darauf hin, dass gerade bei der Latex Allergie die Aussagekraft des IgE-Spiegels auf Grund hoher Kreuzreaktivitäten zu Antigenen aus tropischen Früchten als eher gering einzustufen ist (EBO et al. 2003a, EBO et al 2003b). In wie weit sich also die durchflusszytometrische Diagnostik der Typ I Allergie neben dem Prick-Test oder dem Histaminnachweis etabliert, bleibt abzuwarten (EBO et al. 2004). 137 Diskussion Im equinen System stehen monoklonale Antikörper gegen basophilen-spezifische Strukturen nicht zur Verfügung. Auf Grund der hohen Affinität des FcεRI auf den Basophilen wird dieser bereits in vivo mit freiem IgE beladen. Die hier im Haus entwickelten murinen anti eqIgE Antikörper bestimmen somit die Wahl des Markers, nach der im Folgenden der Basophile im peripheren Blut detektiert werden soll. Dazu werden die Zellen mit anti IgE Antikörpern (mAK 134 oder mAK 176, s. 3.2.6) bei 4°C inkubiert (s. 3.3.14). Der Anteil IgE positiver Zellen im peripheren Blut der Pferde ist in Analogie zum Menschen vermutlich direkt abhängig von der Anzahl exprimierter, hochaffiner Rezeptoren für IgE (MacGLASHAN et al. 1997(a & b) & 1999, SAINI et al. 1999, BORKOWSKI et al. 2001). Obligat wird dieser Rezeptor nur von basophilen Granulozyten und Mastzellen exprimiert. Nach Aktivierung sind auch eine Reihe anderer Zellen in der Lage, den FcεRI zu exprimieren, allerdings niemals in gleicher Dichte wie auf Basophilen im Blut (s. 2.3.2). Weiterhin können Zellen, die mit dem niederaffinen Rezeptor für IgE ausgestattet sind (FcεRII oder CD23), in die Kategorie IgE positiver Zellen fallen. Immunkomplexiertes IgE, das in vivo an diese Rezeptoren gebunden hat, dürfte in Anzahl und Verweildauer auf der Oberfläche jedoch kaum ins Gewicht fallen, da diese Bindung ein aktivierendes Signal zur Pinozytose (in Kombination mit IFNγ auch Phagozytose) in diesen Zellen hervorruft (YOKOTA et al, 1992). Eine dritte Form von IgE auf den Zellen des peripheren Blutes findet man als B-Zell Rezeptor der IgE produzierenden Gedächtniszellen. Allerdings dürfte auch diese Population nur gering sein, da der Serumspiegel an IgE beim Pferd zwar deutlich höher ist als beim Menschen, aber verglichen mit den IgG Isotypen dennoch als relativ niedrig einzustufen ist (WAGNER et al. 2003). Der Anteil IgE positiver Zellen ist dementsprechend erwartungsgemäß klein. Unser Bestreben war es, vornehmlich basophile Granulozyten zu detektieren, um eine geeignete Strategie zu entwickeln, diese anzureichern. Die durchschnittliche Anzahl IgE positiver Zellen in Bezug auf alle isolierten, vitalen Leukozyten der hier untersuchten 9 Tiere lag bei 1,39%+/-0,36%. In der Gesamtzahl IgE positiver Zellen lag dieser Wert im erwarteten Rahmen. Nur die Verteilung unter den einzelnen Populationen war unerwartet. So waren durchschnittlich nur 0,43% der PMN, 0,26% der lymphoiden MNC (ohne monozytoide Zellen), aber 9,03% der monozytoiden Zellen positiv für IgE (s. Abb. 8). Die Verteilung IgE+ Zellen im peripheren Blut von gesunden und allergischen Pferden unterscheidet sich bei der hier angewandten Methode nicht. Beim Menschen finden wir im Bereich der lymphoiden Zellen knapp 1% IgE positive Zellen, von denen 99% als B-Zellen identifiziert wurden (SIEGELBERG 1987). Für die PMN des Menschen ist beschrieben, dass sie alle 3 bisher bekannten, zell-assoziierten IgE bindenden 138 Diskussion Strukturen exprimieren können: den FcεRII (CD23), Galectin-3 sowie den FcεRI (GOUNNI et al. 2001). Im ruhenden Zustand jedoch binden PMN nur in sehr geringem Maße IgE. PMN von Asthmatikern hingegen haben nach GOUNNIs Angaben mit 38%+/-30% verhältnismäßig häufig IgE gebunden. GOUNNI beschreibt weiterhin in einer Studie mit monoklonalen Antikörpern gegen die α-Kette des FcεRI, welche den Rezeptor für eine Bindung von IgE blockieren, dass Oberflächen IgE auf PMN hauptsächlich über den hochaffinen Rezeptor gebunden sein muss. Als positiv definiert die Gruppe um GOUNNI Zellen, deren Fluoreszenzintensität um den Faktor 3,2+/-2 über der Negativkontrolle lag. Für Monozyten (REISCHL et al. 1996) und eosinophile Granulozyten (CAPRON et al. 1995) ist bekannt, dass sie in der Lage sind, den hochaffinen Rezeptor für IgE zu bilden, und das der Grad positiver Zellen in atopischen Individuen höher ist, als bei gesunden Menschen – bei beiden Gruppen aber in einer wesentlich geringeren Dichte, als auf basophilen Granulozyten (SIHRA et al. 1997). Zusätzlich weisen neuere Publikationen darauf hin, dass in Eosinophilen nach Aktivierung alle drei Ketten des FcεRI auf mRNA Ebene nachgewiesen werden können, zumindest die α−Kette aber nicht auf der Oberfläche der Zellen erscheint (SMITH et al. 2000) – mit der logischen Konsequenz einer ausbleibenden IgE-Bindung, da diese durch die α-Kette vermittelt wird. Nach Inkubation mit IL4 und IgE konnte gezeigt werden, dass die Expressionsstärke des FcεRI bei Eosinophilen bis auf 1% der für Basophile oder Mastzellen typischen Dichte gesteigert werden konnte, allerdings konnte auch in diesem Experiment keine funktionelle Aktivität dieser Rezeptoren nach Kreuzvernetzung nachgewiesen werden (IIKURA et al. 2001) Bei Monozyten soll die Expression des FcεRI bei Atopikern und gesunden Menschen bei durchschnittlich 18% dieser Zellen nachweisbar sein, aber eine funktionelle Bindung von IgE sei Neuraminidase abhängig, sowie von der Höhe des Serum IgE Spiegels (REISCHL et al. 1996). In vivo konnte keine Bindung von IgE an den Rezeptor nachgewiesen werden. Die zugänglichen Daten bezogen sich somit hauptsächlich auf die Rezeptorexpression. Eine Bindung von IgE konnte in den vorliegenden Studien kaum oder gar nicht nachgewiesen werden. Dementsprechend ist ein Homologieschluss Spezies übergreifend vom humanen in das equine System nicht möglich. Um dennoch eine Zuordnung der erfassten IgE positiven Zellen zusätzlich zu ihrer morphologischen Erscheinung im Durchflusszytometer zu ermöglichen, sollten die IgE+ Zellen lichtmikroskopisch nach Anfärbung differenziert werden. Auf Grund der geringen Anzahl IgE+ Zellen im Pool der Leukozyten wurde zuerst eine magnetische Anreicherung dieser Zellen vorgenommen. 139 Diskussion 5.3 Magnetisches Sortieren und lichtmikroskopische Differenzierung IgE tragender Zellen beim Pferd Auf Grund einer guten Abgrenzung IgE+ Zellen von den negativen Ereignissen in der Membranimmunfluoreszens (ca. Faktor 103 MFI, s. 4.1) mit murinen anti eqIgE AK wurde in der vorliegenden Arbeit eine Anreicherung über Microbeads® gegen murines IgG1 (s. 3.3.8) vorgenommen. Da bereits die Inkubation mit dem Mäuseantikörper zu einer Kreuzvernetzung membranständiger IgE Moleküle führt (s. 4.2.2), die eine Degranulation der Basophilen induziert, wurde die gesamte Anreicherung sowie Färbung bei 4°C und in Abwesenheit von extrazellulärem Ca2+ und Mg2+ durchgeführt. Zusammenfassend wurden so durchschnittlich 52,3%+/-10,5% Monozyten oder große Lymphozyten und 41,8%+/-12,4% basophile Granulozyten gefunden. Die angereicherten Zellen unterschieden sich interindividuell. So konnten bei den an 100% fehlenden Zellen teilweise bis zu 14% Eosinophile nachgewiesen werden, bei einem anderen Individuum bis zu 8% Neutrophile. Bei allen Individuen konnte eine Selektion auf Basophile aufgezeigt werden. Vor der magnetischen Anreicherung war der Anteil IgE positiver monozytoider Zellen um den Faktor 10 bis 20 höher als der Anteil der PMN. Nach der Anreicherung fanden sich in etwa gleichen Verhältnissen Monozyten und Basophile, diskriminiert durch ihre färberischen Eigenschaften sowie der lichtmikroskopischen Morphologie. Auffällig war dabei, dass die Größe der angereicherten Basophilen der Größe der Monozyten entsprach. Dementsprechend können zwei Erklärungen für diese Selektion gefunden werden. Zum einen könnte auf Grund einer höheren Beladung der Basophilen mit anti eqIgE AK die resultierende Affinität zu den Microbeads® höher ausfallen, weswegen diese Zellen bevorzugt im magnetischen Feld gehalten werden. Zum anderen könnte die Zuordnung der Basophilen zum morphologischen Fenster der PMN in der durchflusszytometrischen Bestimmung bei Equiden fehlerhaft sein. Eventuell zeigen Basophile des Pferdes morphologische Eigenschaften von Monozyten, wenn diese im Durchflusszytometer bestimmt werden. Dies könnte auch erklären, warum eine Dichtegradientenzentrifugation mit Anreicherung der Basophilen in einer Fraktion zumindest bisher nicht von Erfolg gekrönt war. Die Größe sowie der Grad der Granulierung im Zytoplasma korrelieren beim Menschen mit der Dichte der PMN (BOGAR et al. 2002). Prinzipiell konnte über die magnetische Anreicherung die Spezifität des monoklonalen Antikörpers gegen IgE bestätigt werden – es wurden vorrangig Basophile angereichert. Demgegenüber steht die evtl. spezies-spezifische, hypothetisch obligate FcεRI Expression auf monozytoiden Zellen des Pferdes – unabhängig vom (erfassten) Allergiestatus. Weiterhin konnte das funktionelle Kreuzvernetzen membranständiger Immunglobuline mit 140 Diskussion anschließender Aktivierung der Zellen bestätigt werden – die Kultivierung dieser Zellen in Zellkulturmedium bei 37°C führte zur Degranulation der Zellen sowie zur Proliferation der monozytoiden Zellen. Eine weiter führende funktionelle Analyse der Zellen konnte auf Grund dieser Aktivierung bisher nicht erreicht werden. Weiterführende Versuche, membranständige Antikörper (vor oder nach Kreuzvernetzen) durch ein so genanntes Stripping-Verfahren (ISHIZAKA et al. 1974) von den Basophilen zu entfernen, gelangen nicht. Als ein grundlegender Unterschied zwischen dem bereits 1974 publizierten Verfahren (dort wurde freigesetztes IgE nach dem stripping im Überstand bestimmt), Basophile von IgE zu befreien, muss die Anwesenheit neutrophiler Granulozyten angesehen werden. Im humanen System reichern sich die Basophilen in der Fraktion der MNC an. Stripping-Verfahren werden seit Ende der siebziger Jahre laut Literatur nur mit ebenso angereicherten basophilen Granulozyten durchgeführt (MACGLASHAN et al. 1981). Bei eigenen Versuchen, die Basophilen in Anwesenheit der Neutrophilen von IgE zu „strippen“, wurde in allen Fällen eine irreversible Verklumpung der Zellen induziert, unabhängig vom eingesetzten pH Wert, Temperatur oder Dauer des Stripping-Vorgangs (Daten nicht gezeigt). 5.4 Qualität der funktionellen, generellen Sensibilisierung basophiler Granulozyten über mehr als einen Isotyp Die unter 4.3 beschriebene aktivierende Potenz von anti IgE sowie anti IgG Antikörpern führte quantitativ zu unterschiedlichen Freisetzungen von Histamin bei einem Individuum. So konnten alleinige IgE sowie alleinige IgG responder gefunden werden, die nur durch einen der anti Isotyp Antikörper mit der Degranulation der basophilen Granulozyten reagierten. Freisetzung über anti IgE Antikörper Dem Dogma der Typ I Allergie entsprechend, reagierten über 90% der getesteten Pferde mit einer Histaminfreisetzung nach Zugabe des monoklonalen AK gegen eqIgE. Eine mögliche Erklärung der an 100% fehlenden Patienten könnte in dem Herstellungsprozess des monoklonalen Antikörpers liegen. Dazu wurden Mäuse mit einem chimären Protein aus murinen und equinen Immunglobulin-Domänen immunisiert. Die Technik zur Herstellung dieses Produktes beruht auf der Transfektion einer murinen Myelomzelllinie, die mit einem Plasmid, welches die cDNA von Anteilen der schweren und leichten Ketten des 141 Diskussion Pferdeimmunglobulins enthält. Die equinen Anteile codieren die konstanten Domänen der schweren Kette des cε Genlocus (IGHE) und die konstante Domäne der leichten Kette, während die variablen Anteile der schweren und leichten Ketten von der originären Zelllinie gebildet werden. Allerdings wiesen WAGNER et al. bereits 1997 darauf hin, dass mehr als ein Allotyp für den cε Genort in der Pferdepopulation zu finden seien – immunisiert wurde nur mit einem der bisher gefundenen Allotypen (WAGNER et al. 1997) Hypothetisch könnten die non-responder auf IgE also mit anderen IgE-Allotypen sensibilisiert sein, die nicht von dem eingesetzten mAK gegen eqIgE erkannt werden. Eine weitere Erklärung könnte eine momentane, zu geringe Besatzdichte mit FcεRI sein, wodurch ein multivalentes Allergen zwar in der Lage ist, genügend Rezeptoren anzusprechen, die zwei Bindungsstellen des anti IgE Homodimers hingegen keine Kreuzvernetzung mehr induzieren. Aus der Literatur ist bekannt, dass die Größe des dimeren oder multivalenten Antigens, sowie die Anzahl an relevanten Epitopen entscheidenden Einfluss auf den Grad der Degranulation besitzen (KANE et al. 1988; COLLINS et al. 1995; PAAR et al. 2002, XU et al. 1998). Möglicherweise ist nur die Affinität des anti IgE AK zu gering. TORIGOE et al. (1998) korrelierten den Grad an Aktivierung von Mastzellen über den besetzten FcεRI mit der Affinität an das relevante Antigen. Phänomenologisch konnte die affinitäts-abhängige Degranulation von Mastzellen durch den Vergleich einer SPT-Reaktion mit der Affinität von allergenspezifischem IgE auch in vivo bestätigt werden (PIERSON-MULLANY et al. 2002). In eigenen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass bei Individuen die nur gering auf einen anti IgE vermittelten Stimulus reagierten, durch ein Superbridging, also die Zugabe eines den murinen Antikörper detektierenden Sekundärantikörper, die Histaminfreisetzung deutlich gesteigert werden konnte. Ursächlich hierfür könnte eine geringe Dichte an FcεRI sein, die auf Grund einer räumlichen Trennung erst durch den zweiten Antikörper kreuzvernetzt werden. Da die Signaltransduktion des FcεRI hauptsächlich durch die γ-Kette des Rezeptors vermittelt wird, könnte auch diese für eine geringe Mediatorfreisetzung ursächlich sein. Auch Fcγ Rezeptoren (FcγRI und FcγRIII) nutzen die gleiche limitierende γ-Kette wie der FcεRI. Eine Kompetition dieser Rezeptoren um ihre signaltransduzierende Einheit könnte postuliert werden (DOMBROWICZ et al. 1997; YAMASAKI et al. 2004). Wenn weniger γ-Ketten für den FcεRI zur Verfügung stehen, da sehr viele FcγRI exprimiert wurden, induziert eine durch anti IgE vermittelte Kreuzvernetzung der FcεRI eine geringere Degranulation. Dies kann syntaktisch durch eigene Untersuchungen bekräftigt werden, da wiederholt Individuen im FIT getestet werden, die mit einer Histaminfreisetzung auf Allergene reagieren, 142 Diskussion obwohl entweder die IgE vermittelte oder auch IgG vermittelte Freisetzung nicht messbar ist. Möglicherweise spricht das Allergen Fcε wie Fcγ Rezeptoren an, wodurch eine Aktivierung der Zellen erfolgt. Letztlich könnte auch die Anzahl reaktionsbereiter Basophiler eine mögliche Erklärung einer geringen oder ausbleibenden Degranulation sein. Aus der Humanmedizin ist bekannt, dass in einigen Blutproben trotz optimaler anti IgE Konzentration keine Histaminfreisetzung induziert wird. Dies könnte an einer absolut zu geringen Anzahl Basophiler, einem hohen Anteil bereits degranulierter Zellen oder an einem Defekt der Reaktionsfähigkeit der basophilen Granulozyten liegen (NIELSEN 1995). Schlussfolgernd unterscheidet man in der Humanmedizin zwischen Basophilen, die auf einen anti IgE Stimulus reagieren (releasing basophils) oder nicht aktivierbar sind (nonreleasing basophils) (YAMAGUCHI et al. 1996). Eine in vitro Kultivierung von nonreleasing basophils mit IL3 konvertierte diese innerhalb von einer Woche zu voll funktionstüchtigen Basophilen. Inwieweit diese verschiedenen Basophilen-Populationen beim Pferd auch in vivo vorliegen, ist nicht bekannt. Freisetzung über anti IgG Antikörper Nach dem Ausschluss einer Kreuzreaktivität der zwei Stimuli zur Überprüfung der generellen Sensibilisierung (anti IgG und anti IgE) konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass der Großteil der Basophilen innerhalb der untersuchten Pferdepopulation funktionell auch über IgG-Isotypen sensibilisiert werden kann. Die meisten Pferde, die auf den anti IgG Stimulus reagierten, setzten verhältnismäßig mehr Histamin frei, als durch die anti IgE Stimulation erreicht wurde. Selbst der aufkonzentrierte mAK anti eqIgE steigerte die Freisetzung nicht (s. Abb. 31). Es handelte sich nicht um ein quantitatives Phänomen. Beim Menschen konnte zwar eine Histaminfreisetzung von Basophilen durch ein polyklonales anti IgG Serum erreicht werden, allerdings führten die Autoren dies auf IgEAntigen-IgG Immunkomplexe zurück, die über das IgE an die Basophilen gebunden hatten. Für diese Stimulation wurde das anti IgG Serum in zehnfach höherer Dosierung eingesetzt, als in dieser Arbeit beim Pferd (LICHTENSTEIN et al. 1992). Im humanen System wird allergenspezifisches IgG wesentlich frequenter beim Nachweis eines inhibitorischen Einflusses erwähnt. Dies erklärt sich bereits durch die konstitutive Expression eines inhibitorischen IgG Rezeptors auf humanen Mastzellen (WEDI et al. 1996). Für allergische Effektorzellen des Menschen ist zusätzlich bekannt, dass aktivierende Rezeptoren für IgG Isotypen exprimiert werden können. Inzwischen sind der FcγRI und III (aktivierend) sowie IIb1/2 (inhibierend) auf Mastzellen gefunden worden. Insbesondere IFNγ 143 Diskussion steigert die Expression von FcγRI, während die Expression von FcγRIII von IL3 und SCF (stem cell factor) abhängt (TKACZYK et al. 2004). Weiterhin konnte für humane Mastzellen, die den FcγRI exprimieren, gezeigt werden, dass eine der Kreuzvernetzung von IgE vergleichbare Aktivierung der Zellen in Bezug auf die Degranulation sowie Neusynthese von Mediatoren durch diesen Rezeptor induziert werden konnte (OKAYAMA et al. 2003). Um eine Vergleichbarkeit in der Kinetik der Freisetzung aufzuzeigen, wurden humane Mastzellen mit haptenspezifischen Immunglobulinen beladen, und anschließend mit einem Konstrukt aus BSA und kovalent gebundenen Haptenen inkubiert. Auch bei diesem Experiment konnte die Vergleichbarkeit der beiden Rezeptortypen bestätigt werden (OKAYAMA et al. 2001). Zusammenfassend ergeben sich für den Menschen also bis zu zwei hemmende Rezeptoren, die konstitutiv exprimiert werden, sowie zwei aktivierende Rezeptoren für IgG, von denen einer auf Grund seiner hohen Affinität zu IgG und seiner Signalinduktion mit dem FcεRI vergleichbar ist. Im humanen System ist überdies bekannt, welche IgG Isotypen bevorzugt an Fc-Rezeptoren binden. Insbesondere IgG1 (und geringer IgG3) zeigt eine hohe Affinität an aktivierende wie hemmende Rezeptoren, allerdings findet die Bindung an hemmende Rezeptortypen erst als Immunkomplex statt. Der hier vorgestellte Mechanismus der IgG vermittelten Degranulation wird mittels eines polyklonalen Antiserums gegen equine IgG Isotypen ausgeführt. Aus ELISA Ergebnissen ist bekannt, dass dieses Serum eine unterschiedliche resultierende Affinität zu den bisher zugänglichen equinen IgG Isotypen aufweist (Wege 2004). Weiterhin ist unbekannt, welche IgG Isotypen bevorzugt an Fc-Rezeptoren vom Pferd binden und welche Fcγ Rezeptoren es gibt. Hinweislich kann eine Studie von AGGARWAL et al. (2000) dienen, in der zwei mAK untersucht werden, die einerseits eine Rosettierung von Pferdezellen durch AK-beladene Schaferythrozyten verhindern, andererseits ein Verteilungsmuster bezüglich ihrer Bindung im Pool der PBL aufweisen, die für ein equines Äquivalent der Fcγ Rezeptoren II und III sprechen. In der vorliegenden Arbeit kann weder der relevante sensibilisierende IgG Isotyp noch der korrespondierende Rezeptor eindeutig angesprochen werden. 144 Diskussion 5.5 Interpretation der funktionellen Sensibilisierung allergischer Effektorzellen durch Immunglobuline der Klassen IgE und IgG Unabhängig von der mangelnden Zuordnung eines sensibilisierenden IgG Isotyps konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Qualität der Sensibilisierung durch zwei verschiedene Isotypen intraindividuell wesentlich geringeren Schwankungen unterliegt, als interindividuell. Weiterführend konnte diese duale Sensibilisierung als individual-spezifischer Parameter auch über längere Zeiträume gezeigt werden: Über mehr als ein halbes Jahr zeigten die untersuchten Probanden intraindividuell vergleichbare Verhältnisse der durch anti IgE und anti IgG freigesetzten Mengen an Histamin, selbst wenn die absolut freigesetzten Mengen von Histamin im Verlauf der Untersuchungsperiode stark schwankten (s. 4.3.2). Überdies konnten mit dem Verhältnis der anti IgE/ anti IgG vermittelten Histaminfreisetzung allergische Pferde signifikant von nicht sensibilisierten Pferden diskriminiert werden. Gesunde Pferde zeigten einen niedrigen IgE vermittelten Release im Vergleich zur IgG bedingten Freisetzung, bei den Allergikern wurden durch beide anti Isotyp Freisetzungen ähnliche Mengen an Histamin ausgeschüttet (s. 4.3.3). Epidemiologische Untersuchungen beim Menschen weisen auf, dass die Immunantwort gegen Allergene distinkte spezifische Immunglobulinisotypen induziert. So werden vorrangig IgE, IgG4 sowie IgG1 produziert (s. 2.3.3). Im Rahmen der spezifischen Immuntherapie (SIT oder Hyposensibilisierung) wurden Veränderungen dieser allergenspezifischen Antikörpertiter bestimmt. Es konnte gezeigt werden, dass ein Anstieg von IgG4 nach 5 Jahren Therapie mit der Ausprägung der klinischen Symptomatik korreliert werden konnte (OHASHI et al. 1997a). Allerdings weist die gleiche Arbeitsgruppe darauf hin, dass diese Entwicklung bei der Betrachtung eines Sommerhalbjahres und unter dem Einfluss einer kurzfristigen SIT (shortterm immunotherapy) nicht signifikant im Vergleich zur Kontrollgruppe ausfiel (OHASHI et al. 1997b). Für humanes IgG1 zeigten verschiedene Arbeitsgruppen einen initialen Anstieg unter dem Einfluss einer SIT, allerdings fiel dieses im weiteren Verlauf wieder ab, während der IgG4 Spiegel auf hohem Niveau blieb (NAKAGAWA 1987; MCHUGH et al. 1990; SANCHEZ et al. 1995). Serologisch korrelierte aber weder das allergenspezifische IgE noch das Verhältnis von allergenspezifischem IgE zu IgG4 oder IgG1 mit dem atopischen Status (s. 2.3.3). Wenn 145 Diskussion allerdings die Spiegel der zwei vorrangig induzierten IgG Isotypen (IgG4/IgG1) miteinander korreliert wurden, gelang im humanen System eine Zuordnung dieses Quotienten im Serum zur klinischen Ausprägung einer Typ I Allergie (PENG et al. 1992; OHASHI et al. 1997; GEHLHAR et al. 1999) Die zwei grundlegenden Unterschiede dieses Verhältnisses zu den vorgestellten Beobachtungen am Pferd (s. 4.3.3) bestehen in der Wahl der untersuchten Parameter: Für die Humanmedizin wurden humorale und allergenspezifische Immunglobuline miteinander verglichen, wohingegen hier membranständige Isotypen (IgE und IgG) auf der Oberfläche allergischer Effektorzellen unabhängig von der Spezifität der Antikörper zueinander ins Verhältnis gesetzt wurden. Allerdings wurde auch für humane Basophile bereits 1984 gezeigt, dass die anti IgE vermittelte Degranulation Basophiler bei Allergikern eine parallele, dosisabhängige Freisetzungskinetik zur Allergen induzierten Freisetzung zeigte (TANIZAKI et al. 1984). Ob durch die Überprüfung der Sensibilisierung allergischer Effektorzellen mittels unterschiedlicher Isotypen eine qualitativ vergleichbare Aussage (s.o.) getroffen werden kann, wird hinweislich bei zwei Pferden deutlich. Deren klinische Symptomatik änderte sich im Untersuchungszeitraum. Bei der Betrachtung der Stimuli zur Überprüfung der generellen Sensibilisierung zu dieser Zeit konnte eine dieser Hypothese entsprechende Veränderung des Verhältnisses von anti IgE zu anti IgG bedingter Freisetzung gefunden werden (s. Abb. 22 g) & h)). Die potentielle biologische Bedeutung dieses Phänomens könnte erklärt werden durch eine modulierte TH2 Antwort mit nachfolgend geänderter Expression allergenspezifischer TH2 assoziierter Isotypen (PLATTS-MILLS et al. 2004). Insbesondere bei den Pferden, die eine im FIT determinierbare Sensibilisierung gegen Culicoides nub. zeigen, aber klinisch gesund sind, könnten allergenspezifische Antikörper eines anderen Isotyps als IgE die Effektorzellen sensibilisieren. Wenn diese in ihrer Summe durch das polyklonale anti IgG angesprochen werden, dominieren die aktivierenden Isotypen. 146 Diskussion 5.6 Modulation der Histaminfreisetzung über kombinatorische Inkubationen aktivierender Stimuli Um zu überprüfen, welche membrangebundenen Antikörper für eine allergen-vermittelte Freisetzung von Histamin verantwortlich sind, wurden in vivo sensibilisierte Blutproben von Pferden die gegen Cul. nubeculosus allergisch waren, untersucht. Da weder das relevante Allergen in reiner Form vorliegt, noch equine monoklonale Antikörper mit bekannter Spezifität bisher an Basophile des Pferdes gebunden werden können, sollten die bereits etablierten aktivierenden Stimuli der generellen Sensibilisierung genutzt werden, einen potentiell synergistischen oder antagonistischen Release in Kombination mit dem relevanten Allergen anzuzeigen. Dazu sollte untersucht werden, ob eine Koinkubation von zwei suboptimalen, aktivierenden Stimuli eine messbare Modulation der Histaminfreisetzung induziert. Bei dem durch anti IgE AK induzierten Release konnte durch eine Koinkubation mit Allergen keine Steigerung der Freisetzung gefunden werden. Dies ließe sich begründen durch eine bereits optimale FcεRI vermittelte Signaltransduktion – eine vollständige Degranulation der Basophilen hätte bereits stattgefunden. So konnte in der Humanmedizin gezeigt werden, dass die Expression von FcεRI zwischen wenigen Hundert bis zu 5x105 pro Zelle schwanken kann, für eine optimale Freisetzung jedoch nur ein Bruchteil dieser Rezeptoren vonnöten ist (MacGLASHAN 1993). Unter dem biologischen Bild, dass ein Basophiler oder eine Mastzelle mit einem repräsentativen Querschnitt aller IgE Idiotypen sensibilisiert wird, erklärt sich der verhältnismäßig geringe Anteil notwendiger Rezeptoren für eine optimale Degranulation. Erstaunlicherweise konnte in dieser Arbeit wiederholt eine partiell inhibierende Wirkung entweder von anti IgE allein oder in Koinkubation mit Allergen gezeigt werden (s. Abb. 33 und Tab. 7). Diesem Effekt konnte sogar eine Dosis-Antwort Beziehung zugeordnet werden: je weiter der anti IgE AK ausverdünnt wurde, um so mehr Histamin wurde als Antwort auf den Allergen vermittelten Stimulus freigesetzt (s. Tab. 7). In Einzelfällen wird auch in der Humanmedizin eine inhibierende anti IgE vermittelte Aktivität gefunden. Diese Inhibition ist so dominant, dass eine nachfolgende Inkubation mit fMLP (formyl-Methionyl-LeucylPhenylalanine (fMLP)) die Degranulation im Verhältnis zur nur durch fMLP bedingten Freisetzung um mehr als die Hälfte senkte (KNOL et al. 1992). Eine mögliche Erklärung für dieses Phänomen in der Humanmedizin besteht in der differentiellen Formation des FcεRI auf Basophilen. Dort ist bekannt, dass ein alternatives 147 Diskussion Splicing der β-Kette dieses Rezeptors trotz nachfolgendem Erscheinen an der Oberfläche und Bindung von IgE die Reaktionsfähigkeit dieser Zellen reduziert (DONNADIEU et al. 2003). Zusätzlich kann eine Interaktion mit weiteren, hauptsächlich inhibitorischen Rezeptoren nicht ausgeschlossen werden. BORGES et al. (1997) beschrieben eine neue Familie von Leukozytenrezeptoren, den LIRs (leucocyte immunglobulin like receptors) auf B-Zellen, Monozyten und, in geringerer Stärke auf dendritischen Zellen und NK-Zellen (BORGES et al. 1997). Auf der Ebene allergischer Effektorzellen wurde bei Eosinophilen die Expression von drei inhibitorischen LIRs (LIR1, LIR2, LIR3) sowie eines aktivierenden LIRs (LIR7) nachgewiesen (TEDLA et al. 2003). Auch für Basophile des Menschen konnten inhibitorische LIRs inzwischen nachgewiesen werden, die in der Lage sind eine FcεRI vermittelte Aktivierung zu inhibieren (SLOANE et al. 2004). Allerdings sind die physiologischen Liganden dieser Rezeptoren noch unbekannt, bisher werden mAK gegen LIRs genutzt, um ihre aktivierende oder inhibierende Wirkung zu erfassen. Eine Koinkubation von relevantem Allergen und dem anti IgG führte im Gegensatz zur Koinkubation mit IgE bei allen untersuchten Pferden zu einer additiven Histaminfreisetzung. Wenn allergenspezifische, membranständige Antikörper vom Isotyp IgG und IgE durch das Allergen angesprochen wurden und nur eine zusätzliche Inkubation mit anti IgG die Histaminfreisetzung steigert, lässt sich dies nur über andere stimulierende Rezeptoren als den FcεRI erklären. Als Kritik dieser Methode soll erwähnt sein, dass zur Zeit nicht bekannt ist, ob dies auf der Ebene der Basophilen geschehen muss, oder ob andere während der Inkubation anwesende Zellen aktiviert werden und nachfolgend Substanzen aus der Gruppe der HRF (s. 2.3.2) freisetzten. Unter dem Postulat, andere Zellen seien nicht beteiligt, kann geschlussfolgert werden, dass es beim Pferd IgG Rezeptoren gibt, die dem FcγRI des Menschen funktionell entsprechen. Inhibitorische Koinkubation mittels monoklonaler Antikörper gegen equine IgG Isotypen Vier monoklonale Antikörper gegen IgG Isotypen des Pferdes standen zur Zeit der Anfertigung dieser Studie zur Verfügung (unveröffentlichte Daten, A: Wege). Diese sind durch eine Immunisierung von Mäusen mit einem chimären Protein von murinen und equinen Anteilen der jeweiligen Immunglobulinisotypen gewonnen worden (s. 2.1.1). 148 Diskussion Im Detail wird dies für den anti IgG2 Antikörper bei WEGE et al (2004) ausgeführt. Damit standen für 4 der 7 IgG Isotypen des Pferdes Reagenzien zur Verfügung, um die durch das polyklonale Antiserum induzierte Freisetzung auf den verantwortlichen Isotyp einzugrenzen. Bei einer singulären Inkubation dieser mAK mit PBL des Pferdes konnte keine Histaminfreisetzung induziert werden (s. 4.4.1). Auch in kombinierten Ansätzen mehrerer mAK gegen equine IgG Isotypen konnte keine aktivierende Wirkung gezeigt werden (Daten nicht gezeigt). Möglicherweise könnte dies an den Paratopen liegen, die von den monoklonalen Antikörpern erkannt werden. Nur die konstanten Domänen des chimären Immunisierungsproduktes stammten aus dem Pferd, weswegen zu postulieren ist, dass vorrangig gegen diese Strukturen Antikörper gebildet wurden. Aus Studien beim Menschen ist bekannt, dass monoklonale Antikörper, die den Fc-Teil von IgG4 erkennen, keine Histaminfreisetzung aus Basophilen induzierten, solche gegen Fab-Anteile hingegen schon (JIMENO et al. 1992). Um auszuschließen, dass sterische Gründe eine Aktivierung der Effektorzellen trotz Bindung der mAK gegen equine IgG Isotypen verhindern, wurden die Zellen zusätzlich mit einem polyklonalen Ziege anti Maus IgG (H&L) Serum (s. 3.2.6) inkubiert (superbridging, s. 4.4.2). Auch hier konnte durch keinen der vier überprüften anti Isotyp Antikörper eine Freisetzung hervorgerufen werden, selbst dann nicht, wenn nur der F(ab´)2-Teil dieses Sekundärantikörpers verwandt wurde. Eine mögliche Schlussfolgerung aus diesen Daten könnte sein, dass die Isotypen, die von den mAK erkannt werden, Basophile des Pferdes nicht sensibilisieren - oder dies nur tun, wenn sie in bereits immunkomplexierter Form vorliegen. Für die aktivierenden Fcγ-Rezeptoren des Menschen gilt, unabhängig vom gebundenen immunkomplexierten Isotyp, dass die Rezeptoren ein Signal zur Endo- oder Phagozytose vermitteln. Das gleiche gilt auch für den niederaffinen Rezeptor für IgE (YOKOTA et al. 1992). Beim FcεRI kommt es zum so genannten membrane ruffling und damit einhergehend, zum Abstoßen von Membranvesikeln oder ebenfalls zur Aufnahme des Antigens (TKACZYK et al. 1999). Damit steht dieses IgE für eine ex vivo Diagnostik im FIT nicht mehr zur Verfügung. Schlussfolgernd würden Immunkomplexe erstens ihre aktivierende Potenz bereits in vivo ausgelöst haben und zweitens zu einem hohen Grad nicht mehr als ansprechbare Immunglobuline für eine nachfolgende Detektion in vitro zur Verfügung stehen. Dieses Bild verschiebt sich, wenn man den inhibitorischen Rezeptor FcγRIIb betrachtet. Er kommt in zwei der drei beschriebenen Formen auf der Membran humaner Mastzellen vor, von denen nur einer nach Bindung eines Immunkomplexes zu einer effizienten Endocytose 149 Diskussion des Rezeptor-Antikörper-Antigen Komplexes führt (FcγRIIb2)(VAN DEN HERIK-OUDIJK et al. 1994). Gleiches gilt im murinen System (GESSNER et al. 1998). In eigenen Untersuchungen, bei denen die monoklonalen Antikörper gegen equine IgG Isotypen zusammen mit einem aktivierenden Stimulus inkubiert wurden, konnte bei allen untersuchten Pferden für alle überprüften anti IgG mAK eine Inhibition hervorgerufen werden. Insbesondere für ein gemeinsames Stimulieren des FcεRI mit dem FcγRIIb ist bekannt, dass die inhibitorische Funktion des Rezeptors für IgG dominiert (MALBEC et al. 1998). Diese dominierende Inhibition konnte bereits 1995 in der Zelllinie RBL (rat basophilic leukemia) gezeigt werden (DAERON et al. 1995). In diesem Modell wiesen die Autoren darauf hin, dass dies jedoch nur gelänge, wenn beide Rezeptoren über ein gemeinsames multivalentes Antigen kreuzvernetzt würden. Ein potentieller therapeutischer Nutzen, sowie eine Modulation der Immunantwort in vivo könnte dann nur erreicht werden, wenn verschiedene Isotypen (also IgE und IgG) mit einer Spezifität für Epitope auf dem gleichen Antigen auf der gleichen Zelle in räumlicher Nähe zueinander vorkämen (ZHU et al. 2002). Im Rahmen dieser Modellvorstellung ließe sich die hier beobachtete Inhibition des IgE vermittelten Release nicht erklären (s. 4.3.6). Allerdings können BRAUWEILER et al. (2003) auf der Ebene der B-Zelle nachweisen, dass eine Inhibition durch FcγRIIb unabhängig von der direkten Aktivierung über den gleichen Liganden möglich ist (BRAUWEILER und CAMBIER 2003). Die gezeigte Inhibition über verschiedene anti equine IgG mAK unterschied sich nicht wesentlich für die einzelnen eingesetzten mAK. Dies erstaunt, da im humanen System die Affinität einzelner IgG Isotypen zu den Fcγ Rezeptoren deutlich unterschiedlich ist. Insbesondere im Rahmen der Typ I Allergie wird im humanen System das IgG4 als blockierender oder modulierender Antikörper erwähnt. Beobachtungen, nach denen allergenspezifisches IgG den klinischen Verlauf der Allergie positiv beeinflussen kann, liegen schon geraume Zeit vor. Dieses IgG wurde blocking IgG genannt, da es die Fähigkeit besitzt, kutane anaphylaktische Reaktionen in vivo zu unterbinden, die Interaktion von IgE und Allergen zu inhibieren und damit die Histaminfreisetzung aus Basophilen oder Mastzellen, sowie es auch IgE im Serum daran hindern kann, über Immunkomplexe eine nachfolgende Antigenpräsentation an T-Zellen hervor zu rufen (COOKE et al. 1935; LICHTENSTEIN et al. 150 Diskussion 1968; LEYNADIER et al. 1986; PEQUET et al. 1989; Wittemann et al. 1996; VAN NEERVEN et al. 1999). Die Zuordnung zu IgG4 als favorisierten Isotypen für diese Effekte begründete sich auf die selektive Induktion dieses Isotyps im Rahmen der long term immunotherapy (s. 2.3.3) (DEVEY et al. 1976). Der physiologische Hintergrund wird von PLATTS-MILLS et al. (2004, s. 2.3.3) im Rahmen einer modifizierten TH2-Antwort mit bevorzugter Expression von allergenspezifischem IgG4 unter dem Einfluss von IL10 verstanden. SVENSON et al (2003) konnten in vitro zeigen, dass auch das Serum von unbehandelten Patienten (keine Allergie, keine SIT) in der Lage war, Allergen mit hoher Affinität zu binden. Allerdings beeinträchtigte dies nicht die Bindung von Serum-IgE an das Allergen. Eine reine Kompetition um das Allergen kann also nicht für einen Blocking Effekt der IgG Isotypen verantwortlich gemacht werden (SVENSON et al. 2003). Auch auf der Ebene der Effektorzellen einer Typ I Allergie findet sich ein gleichgesinntes Phänomen. GLEICH et al (1982) konnten sogar eine Histaminfreisetzung aus Zellen von Allergikern blockieren, wenn allergenspezifische IgG Antikörper im Serum der Patienten vorlagen (GLEICH et al. 1982). Es wird allerdings auch in diesen Studien nicht deutlich, ob es eine Beziehung zwischen der eigentlichen Allergenbindung und dem blockierenden Effekt der allergenspezifischen IgG4 Antikörper gibt. In einer Studie von EJRNAES et al. (2004) werden allergenspezifische IgG Antikörper in Bezug auf ihre Bindung einerseits und ihre blockierende Aktivität andererseits verglichen. Es konnte keine speziell durch den Isotyp IgG4 induzierte Blockade festgestellt werden. Auch die anderen IgG Isotypen zeigten eine vergleichbare Hemmung (EJRNAES et al. 2004). Somit bleiben zusammenfassend für das Pferd wie den Mensch der Mechanismus dieser anti IgE und Allergen spezifischen Blockade wie auch die relevanten blockierenden Isotypen unbekannt. 151 Summary 6 Zusammenfassung Jens Rohwer Untersuchungen zur Typ I Allergie des Pferdes: Phänotypische Charakterisierung equiner Typ I Effektorzellen und ihre Antikörper vermittelte Modulation Auf Grund der zunehmenden Inzidenz allergischer Erkrankungen bei Mensch und Tier wird den verantwortlichen Mechanismen, die in vivo zur Ausprägung einer Typ I Allergie führen, vermehrt Beachtung geschenkt. Im humanen System stellt die spezifische Immuntherapie (SIT) die zur Zeit einzige kausale Therapieform dar, ohne dass die beteiligten Mechanismen oder Mediatoren im Detail geklärt sind. Der in der Arbeitsgruppe Immunologie entwickelte funktionale in vitro Test (FIT) zur Erfassung der Reagibilität basophiler Granulozyten mittels der Bestimmung freigesetzten Histamins nach Stimulation erlaubt es, sensibilisierte Individuen von nicht allergischen Pferden zu diskriminieren. Dabei wird die Spezifität (Freisetzung über Allergen), die Menge (Dosis-Antwort des Stimulus) sowie der Isotyp der sensibilisierenden Antikörper (Freisetzung über anti Isotyp-Antikörper), die an Fc-Rezeptoren von Basophilen gebunden haben, bestimmt. Ziel dieser Arbeit war es, die relevanten sensibilisierenden Isotypen sowie die Modulation der Histaminfreisetzung durch diese zu charakterisieren. Ferner sollten die Effektorzellen einer Typ I Allergie im equinen System genauer charakterisiert werden. Folgende Fragestellungen wurden im Rahmen dieser Untersuchungen bearbeitet: 1. Wie reproduzierbar ist der funktionelle in vitro Test zur Bestimmung des Typ I Allergiestatus beim Pferd? Die zur Verfügung gestellte Herde aus 26 Islandpferden ermöglichte es, im Rahmen dieser Arbeit wiederholte Bestimmungen der generellen (Erfassung des Besatzes mit Antikörpern) sowie spezifischen Sensibilisierung (Allergen vermittelt) im FIT unter identischen Haltungsbedingungen vorzunehmen. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Erfassung der generellen Sensibilisierung auf Einzeltierebene nur geringen Schwankungen unterliegt, während die Allergen-induzierte Freisetzung im Jahresverlauf deutlich schwankte. 2. Welche Zellen im peripheren Blut des Pferdes exprimieren Rezeptoren für IgE? Nach einer Inkubation equiner PBL mit einem monoklonalen Antikörper gegen equines IgE (mAK anti eqIgE ) wurden die so markierten Zellen einerseits durchflusszytometrisch erfasst, andererseits durch magnetische Kügelchen, an die ein Ratte anti Maus IgG (H+L) Antikörper 152 Zusammenfassung gekoppelt war, nur solche Zellen angereichert, die zuvor den mAK anti eqIgE gebunden hatten. Anschließend wurden diese Zellen lichtmikroskopisch charakterisiert. Dabei konnte IgE auf Basophilen und monozytoiden Zellen, sowie in geringerem Maße auf lymphoiden Zellen nachgewiesen werden. Im nativen Pool der PBL stellten die monozytoiden Zellen relativ wie absolut den höchsten Anteil IgE+ Zellen. Nach der Anreicherung im magnetischen Feld fanden sich Basophile und monozytoide Zellen in vergleichbarer Verteilung (jeweils knapp 50%), wobei die an hundert fehlenden Zellen sich aus Neutrophilen, Eosinophilen sowie Lymphozyten zusammensetzten (weniger als 10% aller Zellen). 3. Welche Immunglobulin-Isotypen sensibilisieren equine Basophile? Die Überprüfung der generellen Sensibilisierung umfasst einen IgE vermittelten Release, sowie einen IgG vermittelten Release. Zwischen diesen beiden Stimuli konnte mi einem ELISA-System eine Kreuzreaktivität ausgeschlossen werden. Bei der Auswertung von über 300 Pferden konnte gezeigt werden, dass die meisten Pferde auf beide Stimuli reagierten (88,3%). Nur auf IgE zeigten 8,5% eine Reaktion, nur IgG vermittelt reagierten 5,2%. Da die Histaminfreisetzung im Pool der Leukozyten stattfindet, ist hiermit nicht ausgeschlossen, dass andere Zellen als Basophile die Histaminfreisetzung beeinflussen. 4. Unterscheidet sich die Sensibilisierung über mehr als einen Isotyp qualitativ? Bei wiederholter Bestimmung Histaminfreisetzungen über anti Isotyp Antikörper (anti IgE sowie anti IgG) konnte gezeigt werden, dass die Höhe der einzelnen Freisetzungen im zeitlichen Verlauf schwankt. Die interindividuellen Schwankungen waren hingegen stärker als die intraindividuellen. So konnten Pferde als high oder low responder bezüglich der anti IgE Freisetzung eingestuft werden. Die IgG vermittelte Freisetzung war bei den hier untersuchten Tieren immer höher als die IgE vermittelte. 5. Welche Bedeutung hat die Sensibilisierung durch mehr als einen Isotypen? Bei 37 Pferden wurden die Reaktionen auf die anti Isotyp Antikörper für ein Sommerhalbjahr in 2-3 wöchentlichem Abstand im FIT erfasst. Zusätzlich wurden diese zwei Freisetzungen zu einander ins Verhältnis gesetzt (anti IgE zu anti IgG bedingte Histaminfreisetzung) und die Tiere miteinander verglichen. Das Verhältnis innerhalb dieser Population schwankte zwischen 0,17 (anti IgE niedrig, anti IgG hoch) und 0,88. Die gesunden Individuen der Herde hatten einen signifikant niedrigeren Verhältniswert als die Gruppe der Allergiker. Individuen, die innerhalb des untersuchten Zeitraums ihren klinischen Status änderten, zeigten auch einen dementsprechend veränderten Verhältniswert von anti IgE zu anti IgG. 6. Reagieren Basophile von allergischen Pferden stärker auf einen IgE vermittelten Release als die gesunder? 153 Zusammenfassung Um die Diskriminierung allergischer Pferde von gesunden mittels des Verhältnisses der anti Isotyp Antikörper auf einen Isotyp zu begrenzen, wurden die absoluten Histaminfreisetzungen für die zwei Stimuli der generellen Sensibilisierung mit dem klinischen Bild der atopischen Dermatitis ins Verhältnis gesetzt. Dabei konnte keine signifikant höhere Freisetzung durch IgE in der Gruppe klinisch erkrankter Pferde gezeigt werden. 7. Welcher IgG Isotyp ist für die Freisetzung von Histamin durch den IgG vermittelten Release verantwortlich? Die Sensibilisierung der Basophilen mit IgG Antikörpern wird über ein polyklonales Serum gegen eqIgG erfasst. Zur Zeit stehen gegen 4 der 7 IgG Isotypen des Pferdes mAK zur Verfügung (anti IgG1, G2, G4 & G5). Durch keinen dieser mAK gelang es, eine Histaminfreisetzung aus Basophilen zu provozieren. 8. Kann die Histaminfreisetzung durch Koinkubation von anti IgE oder Allergen mit anti IgG Isotypen moduliert werden? Eine Koinkubation der einzelnen mAK anti eqIgG mit mAK anti eqIgE oder Allergen zeigte bei allen untersuchten Pferden für alle eingesetzten mAK eine Inhibition der Histaminfreisetzung um bis zu 50%. Da bisher keine Daten über die Fc-Rezeptoren des Pferdes vorliegen, konnte der relevante Rezeptor für diese Inhibition nicht bestimmt werden. Irrelevante mAK Isotypen, die als Kontrolle eingesetzt wurden, konnten keine Inhibition hervorrufen. Zusammenfassend konnte aufgezeigt werden, dass equine allergische Effektorzellen über mehr als einen Isotyp sensibilisiert werden. Hinweislich kann eine veränderte Reaktionsbereitschaft bezüglich der Sensibilisierung Basophiler durch IgE und IgG von allergischen Pferden gefunden werden. Weiterhin können IgG Isotypen wie im humanen System die Histaminfreisetzung blockieren. Allerdings fehlen beim Pferd wie beim Mensch die Erkenntnisse über die relevanten modulierenden IgG Isotypen sowie den Mechanismus einer IgG bedingten Hemmung. 154 Summary 7 Summary Jens Rohwer Type I allergy in horses: Phenotypic characterization of equine Typ I effector cells and their antibody mediated modulation Growing incidence of immediate hypersensitivities (type I allergies) in man and beast directed an increased attention to the relevant mechanisms, leading to a clinical manifestation of type I hypersensitivities in vivo. In humans the specific immunotherapy (SIT) is the only causative therapy at time, without knowing the contributing mechansims or mediators in detail. In the fields of veterinary medicine the requirements for available therapies become particulary relevant in regard to sweet itch or summer eczema, an atopic dermatitis in horses. The functional in vitro test (FIT, developed in our institute) that determines the reacticity of equine basophil granulocytes quantifying the amount of released histamine after stimulation of the cells, permits a discrimination of allergic and non-allergic horses. We assess the specificity (allergen induced release), the amount (dose-response of the stimuli) as well as the isotype of the sensitizing antibodies (release via anti isotype antibodies), that have bound to Fc-receptors on basophils. The aim of this study was to characterise the relevant sensitizing antibodies and their ability to modulate a histamine release from equine basophils. Following questions were processed in this thesis: 1. How reproducible is the FIT as a tool to determine the allergic state of horses? Having 37 icelandic horses at disposal, cherished under identical conditions, we were enabled to repeatingly assess their general sensitization (antibody isotypes bound to basophils) as well as their specific sensitization (allergen induced). It could be shown, that assessing the general sensitization of one indidvidual there is only limited fluctuation, whereas the allergen-induced release more drastically differs throughout the seasons. 2. Which cells from peripheral blood leucocytes (PBL) express receptors for IgE? After incubating equine PBL with a monoclonal antibody anti equine IgE (mAB anti eqIgE ) the marked cells were determined in a flow cytometer. Furthermore, the marked cells were sorted using magnetic beads coupled to the mAB anti eqIgE. Afterwards theses cells were stainded and investigated using light microscopy. IgE was found on basophils and monocytic cells and, to a lower amount on lymphocytes. In the ex vivo pool of PBL monocytes were found to be relatively and absolutely the largest population positive for IgE. After enriching IgE-bearing cells in the magnetic field, basophils and monocytes were equally distributed, 155 Summary each type counting for almost 50% of the enriched cells, whereas all other leucocytes were only present in traces. 3. Which immunoglobulin isotypes sensitize equine basophils? The assessment of the general sensitization includes an IgE and IgG mediated release. A possible crossreactivity of these stimuli was excluded by means of an indirect ELISA-system. The evaluation of more than 300 horses in the FIT resulted in a majority of horses that reacted upon both stimuli (88,3%). Reacting only to IgE there were 8,5%, only to IgG 5,2% were found. As the FIT is carried out in the presence of all other cells found in PBL, it is not clarified, if other cells than basophils influence the release of histamine. 4. Does the sensitization due to more than one isotype differ in quality? Concerning the repeatability of the two modes to assess the general sensitization it could be shown, that the values might differ in time course, but stay quite constant in their ratio for one individual horse. Thereby we could separate horses into low and high responders upon stimulation with IgE. For all tested horses the IgG mediated release was always higher than the IgE mediated release. 5. Is there a biological impact for a sensitization with more than one isotype? For 37 horses the reaction to the anti isotype antibodies was observed every 2-3 weeks in the FIT for a whole summer period. For each horse the ratio between those two stimuli was generated (IgE to IgG) and the individual quotients were compared. Interestingly, this ratio ranked from 0,17 (low IgE, high IgG) to 0,88. Healthy horses showed significantly lower ratios than allergic horses. Individuals that altered their clinical signs of allergy showed also an alteration in their ratio of IgE to IgG mediated release. 6. Do basophils from allergic horses react stronger to an IgE mediated release than non allergic horses? In order to gain a discrimination of allergic horses from healthy ones only by one anti isotype release, the absolute amounts of released histamine due to the two modes of the general sensitization were solely correlated to clinical signs of atopic dermatitis. No significantly higher IgE mediated release could be found for diseased horses. 7. Which IgG isotype is responsible for the anti IgG driven release? The sensitization of equine basophils via IgG is performed using a polyclonal antiserum against equine IgG. Right now we are at hand of 4 monoclonal antibodies anti equine isotypes out of the seven proposed IgG isotypes of the horse, that are anti IgG1, G2, G4 & G5. None of these alone or in combination were able to provoke a histamine release from equine basophils. 156 Summary 8. Is it possible to modulate the release of histamine by coincubating anti IgE or allergen with anti IgG isotype AB´s? A coincubation of those distinct mAB anti eqIgG isotypes with mAB anti eqIgE or allergen revealed an inhibition of the histamine release for all tested horses and all mAB anti eqIgG isotypes up to 50%, respectively. Irrelevant mAB´s of the same isotype used as controls showed no reduction in the release of histamine. As there are no data available regarding the Fcγ receptors, especially inhibitory receptors, the relevant isotypes or receptors could not be pointed out. Summing up, it was shown that equine allergic effector cells are sensitized by more than one isotype. Evidence is given for a shifted function concerning this dual sensitization in allergic horses. Furthermore, IgG isotypes are capable of blocking the release of histamine, as we know from the human system. Though it remains unclear for man and horse which isotypes or mechanisms take response for the shown IgG mediated blocking. 157 8 Literaturverzeichnis AGGARWAL, N & MA HOLMES (1999) Characterisation of equine T helper cells: demonstration of Th1- and Th2- like cells in longterm cultures. Vet. Sci. 66(3); 277-279 AGGARWAL, N & MA HOLMES (2000) Production and characterisation of two monoclonal antibodies recognising equine IgG Fc receptors. Vet. Immunol. Immunopathol. 73(1); 63-71 ALLEN JE & RM MAIZELS (1997) Th1-Th2: reliable paradigm or dangerous dogma? Immunol. Today 18(8); 387-392 ANDERSON, GS, P BELTON, E JAHREN, H LANGE & N KLEIDER (1996) Immunotherapy trial for horses in British Columbia with Culicoides (Diptera: Ceratopogonidae) hypersensitivity J. Med. Entomol. 33(3); 458-466 BAKER, KP & PJ QUINN (1978) A report on clinical aspects and histopathology of sweet itch. 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