Funktionelle Charakterisierung der Interaktion
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Aus der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover Funktionelle Charakterisierung der Interaktion zwischen bakteriellen Superantigenen und bovinen neutrophilen Granulozyten INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Corinna Krüger aus Hannover Hannover 2001 Wissenschaftliche Betreuung: PD Dr. med. vet. H.-J. Schuberth 1. Gutachter: PD Dr. med. vet. H.-J. Schuberth 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. P. Valentin-Weigand Tag der mündlichen Prüfung: 29.05.2001 Meinen Eltern in Liebe und Dankbarkeit Inhaltsverzeichnis Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen ............................................................................. 8 1 Einleitung und Zielsetzung ................................................................................................ 13 2 Literaturübersicht............................................................................................................... 15 2.1 Bakterielle Superantigene.......................................................................................................15 2.1.1 Klassifikation und Struktur ................................................................................... 16 2.1.2 Bindungsmechanismen an Immunzellen............................................................... 18 2.1.3 Konsequenzen der Superantigenbindung an MHC-Klasse-II-Moleküle und den T-Zellrezeptor................................................................................................. 19 2.1.4 Superantigene bei Staphylokokken-Infektionen der Haustiere ............................. 21 2.2 Weitere zytotoxische Virulenzfaktoren von Staphylococcus aureus ..................................24 2.3 Polymorphkernige neutrophile Granulozyten......................................................................25 2.3.1 Morphologische und phänotypische Eigenschaften von neutrophilen Granulozyten ......................................................................................................... 25 2.3.2 Aufgaben der Granulozyten im Rahmen der Infektionsabwehr............................ 27 2.4 Apoptose...................................................................................................................................30 2.4.1 2.4.2 2.4.3 2.4.4 Zellmorphologie und zeitliche Abfolge der Apoptose .......................................... 32 Regulation der Apoptose ....................................................................................... 35 Apoptose bei neutrophilen Granulozyten.............................................................. 37 Caspasen und Caspase-Inhibitoren........................................................................ 39 3 Geräte, Material und Methoden......................................................................................... 42 3.1 Geräte .......................................................................................................................................42 3.2 Material ....................................................................................................................................43 3.2.1 3.2.2 3.2.3 3.2.4 Verbrauchsmaterialien........................................................................................... 43 Reagenzien ............................................................................................................ 44 Antikörper und Nachweisreagenzien .................................................................... 45 Kulturmedien, Puffer und Lösungen ..................................................................... 47 3.2.5 Staphylococcus aureus Isolate............................................................................... 53 3.2.6 Tiere und humane Probanden................................................................................ 54 3.3 Methoden .................................................................................................................................54 3.3.1 Isolierung mononukleärer und polymorphkerniger Zellen aus gerinnungsgehemmtem Blut ..................................................................................54 3.3.2 Vitalitätsbestimmung von Zellen ...........................................................................58 3.3.3 Durchflußzytometrie ..............................................................................................59 3.3.4 Zellkultivierungen in vitro .....................................................................................65 3.3.5 Indirekte Membranimmunfluoreszenz (MIF) ........................................................67 3.3.6 Statistische Verfahren ............................................................................................69 4 Ergebnisse ...........................................................................................................................70 4.1 Charakteristika des Absterbens boviner neutrophiler Granulozyten in vitro..................70 4.1.1 Einfluß von Superantigenen auf reine PMN..........................................................70 4.1.2 Einfluß von Superantigenen auf neutrophile Granulozyten in Kokulturen von PMN und MNC...............................................................................................72 4.1.3 Einfluß von Kulturüberständen Superantigen-stimulierter mononukleärer Zellen auf neutrophile Granulozyten .....................................................................78 4.1.4 Der Einfluß mononukleärer Mediatoren auf die Regulation der in vitro Reaktionen boviner Zellen auf bakterielle Superantigene .....................................80 4.2 Untersuchungen zur modulatorischen Bedeutung von Caspasen ......................................87 4.2.1 Einfluß von Caspase-Inhibitoren auf die Vitalität reiner neutrophiler Granulozyten in vitro .............................................................................................87 4.2.2 Einfluß von Caspase-Inhibitoren auf die Vitalität neutrophiler Granulozyten in Kokultur mit mononukleären Zellen..................................................................88 4.2.3 Einfluß von Caspase-Inhibitoren auf die Superantigen-induzierte Proliferation boviner mononukleärer Zellen..........................................................91 4.3 Untersuchungen über die Häufigkeit des Auftretens Superantigen- bzw. Leukotoxin-produzierender Staphylococcus aureus Stämme .....................................................94 4.3.1 Unterschiede zwischen Leukotoxin- und Superantigen-produzierenden Staphylococcus aureus Isolaten .............................................................................94 4.3.2 Frequenz und Eigenschaften von Leukotoxin-enthaltenden Kulturüberständen von Staphylococcus aureus .....................................................96 4.3.3 Frequenz und Eigenschaften von Superantigen-enthaltenden Kulturüberständen von Staphylococcus aureus .....................................................97 4.3.4 Häufigkeit des Auftretens von Leukotoxin- und Superantigenproduzierenden Staphylococcus aureus Isolaten in Fällen von klinischen und subklinischen Mastitiden..................................................................................... 102 5 Diskussion......................................................................................................................... 105 5.1.1 5.1.2 5.1.3 5.1.4 Methodischer Ansatz ........................................................................................... 105 Die Interaktion zwischen Superantigenen und neutrophilen Granulozyten ........ 107 Die modulatorische Bedeutung von Caspase-Inhibitoren ................................... 111 Charakterisierung von Staphylococcus aureus Isolaten ...................................... 115 6 Zusammenfassung............................................................................................................ 119 7 Summary ........................................................................................................................... 122 8 Literaturverzeichnis.......................................................................................................... 125 Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen Abb. Abbildung Aqua tridest. Aqua tridestillata (dreifach destilliertes Wasser) BoCD bovine cluster of differentiation, Bezeichnung für bovine Homologe zu humanen Differenzierungsantigenen mit CD-Nomenklatur BoLA bovine cluster of differentiation, Bezeichnung für den Haupthistokompatibilitätskomplex des Rindes BSA bovines Serumalbumin bspw. beispielsweise bzw. beziehungsweise c1 Caspase-1-Inhibitor (Z-VAD-FMK) c2 Caspase-2-Inhibitor (Ac-VDVAD-CHO) c8 Caspase-8-Inhibitor (Z-IETD-FMK) C5a aktiviertes Fragment der Komplementkomponente C5 ca. zirka CD Cluster of Differentiation (System zur Bezeichnung von Differenzierungsantigenen) CD4+ Zellen, die das Differenzierungsantigen CD4 an der Oberfläche exprimieren CD8+ Zellen, die das Differenzierungsantigen CD8 an der Oberfläche exprimieren cMed Überstände mononukleärer Zellen, die für 24h in Medium inkubiert wurden CR complement receptor (Komplementrezeptor) cSEA Überstände mononukleärer Zellen, die für 24h mit SEA (1 ng/ml) stimuliert wurden d dies (lateinisch: Tag); d0 = Ausgangsmessung vor einem Versuch, d5, d6 = 5 bzw. 6 Tage nach Versuchsbeginn DNA Desoxyribonukleinsäure E. coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamintetraacetat EGZ FACScan Eosinophile Granulozyten ® Fluorescence Activated Cell Scanner (Fluoreszenzaktiviertes Zellmeßgerät der Firma Becton Dickinson, Heidelberg) FADD Fas-associated death domain protein (Fas-assoziiertes Protein, das eine Todesdomäne enthält) FasL Fas-Ligand FCM Flow Cytometer (Durchflußzytometer) FCS Fetal Calf Serum (Fetales Kälberserum) fg Femtogramm (x 10-15) FITC Fluoreszeinisothiocyanat FL1, 2, 3 Meßkanäle des Durchflußzytometers für emittierte Fluoreszenz FL1 = Grünfluoreszenz, 530 ± 15 nm; FL2 = Orangefluoreszenz, 585 ± 21 nm; FL3 = Rotfluoreszenz, >650 nm) FMLP N-Formyl-Methionyl-L-Leucyl-L-Phenylalanin FSC forward scatter (Vorwärtsstreulicht), Meßparameter des FACScan® g Gramm G-CSF granulocyte-colony stimulating factor (Granulozyten-Wachstumsfaktor) GM-CSF granulocyte-macrophage-colony stimulating factor (GranulozytenMakrophagen-Wachstumsfaktor) h hora (lateinisch: Stunde) IAP inhibitor of apoptosis (Apoptose-hemmende Proteinfamilie) ICAM intercellular adhesion molecule (interzelluläres Adhäsionsmolekül) ICE Interleukin-1 β-converting enzyme i.d.R. in der Regel I10F Iscové-Medium mit 10% FCS IFN Interferon Ig Immunglobulin IL Interleukin kD Kilodalton (x 103 Dalton) l Liter LFA-1 Leukozyten-Funktions-assoziiertes-Antigen-1 LPS Lipopolysaccharid LTB4 Leukotrien B4 LT-SN(s) Leukotoxin-enthaltende Überstände von S. aureus Isolaten von Kühen mit Mastitis µ mikro (x 10-6) m milli (x 10-3) mAK monoklonale(r) Antikörper MAM Mykoplasma arthritidis Mitogen MAS Mykoplasma arthritidis Superantigen MHC Major Histocompatibility Complex (Haupthistokompatibilitätskomplex) MIF Membranimmunfluoreszenz min Minute(n) MNC Mononuclear Cells (mononukleäre Zellen, hier: des Blutes) MMTV Mouse Mammary Tumor Virus MW arithmetischer Mittelwert n bei Berechnung des Mittelwertes die Anzahl der Einzelbeobachtungen NaCl Natriumchlorid n.d. not done (nicht durchgeführt) ng Nanogramm (x 10-9) NMLA NG-Monomethyl-L-Arginin NO nitric oxide (Stickstoffmonoxid) Nr. Nummer p Irrtumswahrscheinlichkeit bei der Analyse der Ähnlichkeit zweier Datengruppen PAF platelet-activating factor (Thrombozyten-aktivierender Faktor) PARP Poly-(ADP-Ribose)-Polymerase PCD programmierter Zelltod pg Picogramm (x 10-12) PBS Phosphate Buffered Saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) PECAM platelet endothelial cell adhesion molecule Pellet Bodensatz; hier: durch Zentrifugation sedimentierte Zellen PGE2 Prostaglandin E2 PI Propidiumiodid PMN Polymorphonuclear leukocytes (Granulozyten) PS Phosphatidylserin r Korrelationskoeffizient rhTNF-α rekombinantes humanes TNF-α RIP receptor interacting protein (interagiert mit dem Rezeptor: TNF-R1) RAIDD RIP-associated ICH-1/Ced-3 homologous death domain protein (mit RIP assoziiertes Protein, das eine Todesdomäne enthält) RT Raumtemperatur s Standardabweichung s. siehe s.S. siehe Seite S. aureus Staphylococcus aureus SAg-SN(s) Superantigen-enthaltende Überstände von S. aureus Isolaten von Kühen mit Mastitis Sc. Streptococcus SDCC Superantigen Dependent Cellular Cytotoxicity (Superantigen-abhängige zelluläre Zytotoxizität) SE Staphylokokken-Enterotoxine SEA, B, ... Staphylococcus aureus Enterotoxin A, B, … sek Sekunde(n) sog. sogenannte(r) SSC Side Scatter (Seitwärtsstreulicht), Meßparameter des FACScan® Tab. Tabelle TCR T cell receptor (T-Zellrezeptor) TNF Tumornekrosefaktor TRADD TNF receptor-associated death domain protein (mit dem TNF-Rezeptor assoziiertes Protein, das eine Todesdomäne enthält) TSST-1 Toxic Shock Syndrome Toxin 1 (toxischer Schock-Toxin-1) u.a. unter anderem vgl. vergleiche xg multipliziert mit der Erdbeschleunigung (9,81 m/s2) z.B. zum Beispiel z.T. zum Teil 13 1 Einleitung und Zielsetzung Bakterielle Superantigene sind Proteine, die in typischer Weise mit Zellen des Immunsystems interagieren. Sie können T-Zellen unabhängig von ihrer Antigenspezifität durch Bindung an MHC-Klasse-II-Produkte antigenpräsentierender Zellen einerseits und den T-Zellrezeptor andererseits polyklonal stimulieren. In Folge der Aktivierung der verschiedenen Zellarten kommt es zu einer massiven Ausschüttung unterschiedlicher Mediatoren, die wiederum zur Aktivierung, zur Ausdifferenzierung und zum Absterben funktionell unterschiedlicher Zellsubpopulationen beitragen können. Auf diese Weise kann eine fein regulierte Immunantwort empfindlich gestört werden. Aus dieser Dysregulation der Immunantwort ergibt sich die pathogenetische Bedeutung der Superantigene. Dies gilt sowohl für Infektionserkrankungen, an denen Superantigen-Bildner beteiligt sind als auch für Autoimmunerkrankungen, die durch Superantigene induziert oder in ihrem Verlauf beeinflußt werden können. Während den klassischen Wirkungen von Superantigenen auf humane und murine B-Zellen und T-Zellen sehr viel Aufmerksamkeit geschenkt wurde, fanden mögliche Effekte auf andere Zelltypen bisher eher wenig Beachtung. Zudem sind die Kenntnisse über die Wirkungsweisen von Superantigenen auf Immunzellen veterinärmedizinisch relevanter Spezies noch relativ begrenzt. Wichtig wären solche Informationen bspw. für den Hund, wo der Superantigen-Bildner Staphylococcus intermedius ursächlich für z.T. schwer therapierbare Pyodermien ist. Beim Rind verursacht der Superantigen-Bildner Staphylococcus aureus klinisch sehr variable Formen der Mastitis. Hieraus ergaben sich für die vorgestellte Arbeit verschiedene Fragenkomplexe. Zum einen sollte geprüft werden, ob bakterielle Superantigene einen direkten oder indirekten Einfluß auf bovine neutrophile Granulozyten nehmen. Grundlage für diese Hypothese waren Studien, die eine Expression von MHC-Klasse-II-Molekülen auf aktivierten humanen eosinophilen und neutrophilen Granulozyten zeigten (GOSSELIN et al. 1993, WELLER et al. 1993, GUIDA et al. 1994). Mithin sind Granulozyten prinzipiell in der Lage, den Liganden für Superantigene auszuprägen und sie zu binden. Überdies wäre eine Beeinflussung von neutrophilen Granulozyten in der Frühphase einer Infektion aus Sicht des Erregers durchaus sinnvoll. Zum anderen fokussieren sich die in dieser Arbeit vorgestellten Untersuchungen auf die Superantigen-vermittelte Modulation der Vitalität boviner Granulozyten. Besondere Aufmerksamkeit wird der Charakterisierung der beteiligten Mechanismen gewidmet: 14 Es soll geprüft werden, welche Relevanz bestimmten Mediatoren, Zytokinen, ZellZellinteraktionen oder intrazellulären Vermittlern des induzierten Zelltodes (der Apoptose) bei den beobachteten Phänomenen zukommt. Grundlage für diese Studien sind durchflußzytometrische Verfahren zur qualitativen und quantitativen Zellanalyse. Es wird gezeigt werden, daß Superantigene von Staphylococcus aureus bovine neutrophile Granulozyten in charakteristischer Weise negativ in ihrer Vitalität beeinflussen. Der Mechanismus des leukozytotoxischen Effektes von Superantigenen unterscheidet sich deutlich von dem, der durch andere Virulenzfaktoren von S. aureus, den sog. „Leukotoxinen“ (oder „Leukozidinen“), vermittelt wird. Beiden Faktorengruppen wird in der Pathogenese der bovinen Mastitis eine tragende Rolle zugemessen (LOEFFLER et al. 1988, FERENS et al. 1998). Der in dieser Arbeit entwickelte durchflußzytometrische Ansatz, Superantigene und Leukotoxine auf Grund ihres charakteristischen granulozytotoxischen Verhaltens zu identifizieren, wird im zweiten Teil der Arbeit daher auf die Frage angewendet, ob und in welcher Häufigkeit S. aureus Isolate von subklinisch und klinisch an Mastitis erkrankten Rindern Leukotoxine, Superantigene oder beide Faktorengruppen gleichzeitig produzieren. 15 2 Literaturübersicht S. aureus ist ein weitverbreiteter Erreger, der in vielen verschiedenen Wirten unterschiedliche Krankheiten hervorruft. Die Fähigkeit dieses Bakteriums, in Wirtsorganismen häufig persistieren zu können, beruht hauptsächlich auf einer hohen Anzahl von Virulenzfaktoren. Diese vermitteln u.a. die Adhäsion an Wirtsgewebe, den Erwerb von Nährstoffen und den Schutz vor der immunologischen Abwehrreaktion des Wirtes (MONDAY & BOHACH 1999a). Besondere Aufmerksamkeit haben in den letzten Jahren die von S. aureus produzierten Enterotoxine (oder Superantigene) erregt (s. 2.1), da sie an Zelloberflächenstrukturen binden, die bei der normalen Antigenpräsentation und -erkennung an zentraler Stelle stehen. Andere Virulenzfaktoren, die Immunzellen direkt beeinflussen, sind schon länger bekannt. Einige von ihnen, die Leukotoxine, töten direkt polymorphkernige Granulozyten (s. 2.2). Eine Beeinflussung dieser Zellen des Antigen-unspezifischen Immunsystems (s. 2.3) scheint aus Sicht des Erregers ein sinnvolles und wichtiges Ereignis zu sein. Dies war mit einer der Gründe, in dieser Arbeit nach der Regulation der Apoptose (s. 2.4) polymorphkerniger Granulozyten durch Superantigene zu fahnden. 2.1 Bakterielle Superantigene Der Begriff „Superantigene“ bezeichnet eine heterogene Gruppe von Proteinmolekülen, die mit Antigen-präsentierenden Zellen und T-Lymphozyten interagieren. Hierzu ist nicht die intrazelluläre Prozessierung, die üblicherweise für ein Antigen typisch ist, erforderlich (FLEISCHER & SCHREZENMEIER 1988), sondern die Aktivierung erfolgt nach Assoziation mit dem MHC-Klasse-II-Molekül der Antigen-präsentierenden Zelle und der Vβ-Region des T-Zellrezeptors von T-Lymphozyten (GASCOIGNE 1993). Durch diese Interaktion sind Superantigene in der Lage, eine deutlich höhere Prozentzahl des T-Zellreservoirs des Wirtes zu aktivieren als durch die Präsentation eines, auf herkömmliche Weise prozessierten, Antigens erfolgt. In Abhängigkeit vom jeweiligen Superantigen und der Frequenz von „passenden“ variablen Rezeptorsegmenten führt diese Interaktion zur initialen Proliferation von bis zu 25% des individuellen T-Zellrepertoires, während die Reaktionshäufigkeit bei der normalen Antigenpräsentation unter 0,1% der Zellen liegt (IRWIN & GASCOIGNE 1993). 16 Die Konsequenzen dieser Art von Interaktion sind vielfältig. Auf der Seite der T-Zellen kann dies zu polyklonaler Proliferation, zur Induktion von Apoptose und/oder Anergie der Zellen führen (HERMAN et al. 1991, HUANG & CRISPE 1993). Ähnliche Beobachtungen konnten auch bei Superantigen-präsentierenden Zellen (MHC-KlasseII-positiven Makrophagen und deren Varianten; B-Zellen) gemacht werden (AOUDJIT et al. 1995): Auch diese Zellen können nach Superantigenkontakt aktiviert oder getötet werden. 2.1.1 Klassifikation und Struktur Superantigene sind Proteine viralen, vor allem aber bakteriellen Ursprungs. Zwei Kategorien von Superantigenen wurden bislang beschrieben (Übersicht bei SCHERER et al. 1993). Die löslichen Exotoxine grampositiver Bakterien (S. aureus, Sc. pyogenes) sind typisch für die Gruppe der bakteriellen Superantigene. Die Prototypen der viralen Superantigene sind Produkte endogener Retroviren der Maus (Mouse Mammary Tumor Virus, MMTV). Zu den viralen Superantigenen gehören außer den Produkten des MMTV potentielle Superantigene von dem Cytomegalievirus (CMV) und dem EpsteinBarr Virus (EBV) (FRASER et al. 2000). Des weiteren sind zu der Gruppe der Superantigene das von Mycoplasma arthritidis produzierte Superantigen MAS (Mycoplasma arthritidis superantigen) zu rechnen, ebenso wie ein von Yersinia pseudotuberculosis produziertes Superantigen, das YPM (Yersinia pseudotuberculosisderived mitogen) (CARNOY et al. 2000). Zur Zeit sind 20 bakterielle Superantigene, die von Staphylokokken und Streptokokken produziert werden, bekannt. Superantigene von S. aureus sind dessen pyrogene Exotoxine (Staphylokokken-Enterotoxine (s.u.), Toxic-Shock-SyndromeToxin-1, TSST-1). Zu den Superantigenen, die von Sc. pyogenes produziert werden, zählen die pyrogenen (erythrogenen) Exotoxine SPEA, SPEB, SPEC, SPEG, SPEH und SPEJ (BOHACH et al. 1990, PROFT et al. 1999), das sog. Streptokokken-Superantigen (SSA) und die zwei zur Zeit bekannten mitogenen Exotoxine Z (SMEZ, SMEZ-2, streptococcal mitogenic exotoxin z) (ARCUS et al. 2000). Die Staphylokokken-Enterotoxine (SE) umfassen eine Gruppe sehr hitzebeständiger, nicht glykosylierter, globulärer Proteine mit einer Größe von 228 bis 239 Aminosäuren und einem Molekulargewicht von 26,4 bis 28,4 kD. Sie bestehen alle aus einer einfachen Polypeptidkette, die eine einzelne Disulfid-Schleife enthält. Sie lassen sich 17 serologisch differenzieren. Bis vor kurzem waren neun verschiedene Hauptantigentypen von SEs bekannt (SEA, SEB, SEC1-3, SED, SEE, SEG, SEH, SEI und SEJ) (MONDAY & BOHACH 1999b), inzwischen wurde ein weiteres Superantigen (SEK) identifiziert (ORWIN et al. 2001). Unterschiede von nur drei Aminosäuren erlauben eine Unterteilung von SEC in die Subtypen SEC1, SEC2 und SEC3, des weiteren lassen sich SECbovine und SECovine unterscheiden. Die beiden letzteren werden ebenso wie TSSTovine von S. aureus speziesabhängig exprimiert (MURRAY et al. 1994, SU & WONG 1995, MUNSON et al. 1998, ZHANG et al. 1998, MONDAY & BOHACH 1999b). Die Subtypen werden auf der Basis von geringen antigenen Differenzen und dem Wirtstier klassifiziert (MARR et al. 1993). Die Sequenzhomologien der Toxine untereinander sowie die Expressionscharakteristika legen eine Gruppierung der Staphylokokken-Superantigene in SEA, SED, SEE, SEH einerseits und SEB, SEC1-3, SEG andererseits nahe. Innerhalb der Gruppen besteht eine Homologie von 71-92%, zwischen den Gruppen eine von maximal 59%. Die Mitglieder der ersten Gruppe werden während der logarithmischen Wachstumsphase der Bakterien in relativ kleinen Mengen produziert, während die der zweiten Gruppe beim Übergang in die stationäre Phase in größeren Mengen produziert werden (MICUSAN & THIBODEAU 1993). Das TSST-1 ist ein ca. 22 kD Protein mit einer geringen Homologie zu den SEs, dem zudem die charakteristische DisulfidSchleife und die emetischen Eigenschaften fehlen. Viele der diese Toxine kodierenden Gene befinden sich auf mobilen genetischen Elementen. Dies begründet möglicherweise ihre Präsenz in zwei verschiedenen grampositiven Bakterienspezies. Manche Streptokokken-Superantigene sind den Staphylokokken-Enterotoxinen tatsächlich näher verwandt als diese untereinander (MICUSAN & THIBODEAU 1993). In den letzten Jahren wurden immer wieder weitere dieser Superantigene entdeckt, und es ist wahrscheinlich, daß noch mehr Mitglieder dieser Gruppe in Zukunft entdeckt werden (MONDAY & BOHACH 1999b). 18 2.1.2 Bindungsmechanismen an Immunzellen Bindung an MHC-Klasse-II-Moleküle Die Bindung an MHC-Klasse-II-Moleküle ist unabdingbar für Superantigen-induzierte zelluläre Reaktionen. Untersuchungen mit Staphylokokken-Superantigenen konnten die direkte Bindung an Regionen des Klasse-II-Moleküls außerhalb der Antigenbindungsstelle demonstrieren (DELLABONA et al. 1990). Im Gegensatz zu konventionellen Antigenen müssen Superantigene nicht erst prozessiert werden, um über MHC-KlasseII-Moleküle den T-Zellen präsentiert werden zu können (FLEISCHER & SCHREZENMEIER 1988). Die Bindung der Superantigene an Regionen außerhalb der Antigenbindungsstelle ermöglicht zudem ein breites Spektrum an Bindungsspezifität für verschiedene allele Formen von MHC-Klasse-II-Molekülen, da sich die variablen Sequenzen der MHC-Klasse-II-Allele vorwiegend im Bereich der Antigenbindungsgrube finden. In Abhängigkeit von der Art des Toxins werden unterschiedliche Bindungsstellen besetzt. Während z.B. SEA und SEE zwei unterschiedliche Bindungsstellen auf dem Klasse-II-Molekül aufweisen, existiert für SEB und TSST-1 nur je eine Stelle, die im ersten Fall auf eine Domäne der α-Kette beschränkt ist, sich im zweiten Fall jedoch über beide Ketten des MHC-Klasse-II-Moleküls erstreckt. Verschiedene Superantigene unterscheiden sich zudem in ihrer Affinität, an MHC-Klasse-II-Moleküle zu binden (CHINTAGUMPALA et al. 1991, LABREQUE et al. 1993). Bindung an den T-Zellrezeptor Strukturell liegen der Antigenspezifität eines αβT-Zellrezeptors drei hypervariable Regionen innerhalb der variablen Elemente von α- und β-Kette zugrunde. Superantigene binden außerhalb der Antigenbindungsstelle an polymorphe Sequenzen der β-Kette (Vβ-Regionen). Damit überwinden Superantigene die Antigenspezifität der verschiedenen T-Zellrezeptoren, indem sie an eine exponierte und nicht direkt an der Antigenerkennung beteiligte Stelle im variablen Bereich der β-Kette des Rezeptors binden. 19 2.1.3 Konsequenzen der Superantigenbindung an MHC-Klasse-IIMoleküle und den T-Zellrezeptor Im physiologischen Fall werden durch konventionelle Antigene zwischen 0,001% und 0,01% der T-Zellen aktiviert. Superantigene hingegen stimulieren bis zu 25% aller T-Zellen (HERMAN et al. 1991). Die Frequenz Superantigen-reaktiver T-Zellen hängt von der Vβ-Spezifität des jeweiligen Superantigens und von dessen Konzentration ab (FLEISCHER et al. 1991, MOLLICK et al. 1991, IRWIN & GASCOIGNE 1993, SCHUBERTH 1997). Die in vivo Wirkungen von Superantigenen wurden im wesentlichen - anhand von Injektionen unterschiedlicher Dosen von Superantigenen - in Mäusen untersucht. Dabei stellte die Modulation bestimmter Zelloberflächenantigene, wie L-Selektin, IL-2- und Transferrin-Rezeptoren, die zuerst erkennbare Veränderung der reaktiven T-Zellfraktion dar (MIETHKE et al. 1993). Die Aktivierung führt in vivo und in vitro zunächst zu einer Expansion reaktiver T-Zellen. Aktivierte T-Zellen können anergisch werden (Reaktionslosigkeit nach erneutem Antigenkontakt) oder eliminiert werden (Induktion von Apoptose) (HERMAN et al. 1991, HUANG & CRISPE 1993). Eine polyklonale Aktivierung vieler Vβ-reaktiver T-Zellen durch Superantigene führt unter Umständen zur Expansion autoreaktiver T-Zellklone. Ein begrenztes Vβ-Spektrum autoreaktiver T-Zellen bzw. eine selektive Expansion bestimmter T-Zellen wurde in der Tat bei einigen Autoaggressionserkrankungen (z.B. der Rheumatoiden Arthritis und dem Typ I Diabetes mellitus) beobachtet (CONARD et al. 1994, GORONZY et al. 1994). Dies läßt die Beteiligung von Superantigenen in der Pathogenese solcher Erkrankungen zumindest nicht unwahrscheinlich erscheinen. In Folge der T-Zellaktivierung kommt es zur Produktion und Freisetzung einer Reihe von Zytokinen, die wiederum kaskadenartig zur Aktiverung und Ausdifferenzierung funktionell unterschiedlicher Zellsubpopulationen beitragen. So können bspw. zytotoxische T-Zellen ausdifferenzieren, die in der Lage sind, MHC-Klasse-II-positive Zielzellen in Anwesenheit von Superantigenen zu töten. Diese sehr potente Superantigen-abhängige zelluläre Zytotoxizität (SDCC) wird von einem großen Teil CD4+ und CD8+ T-Zellen ausgeübt. Die bereits von ruhenden T-Zellen ausgeführte Zytotoxizität, läßt sich durch Vorinkubation mit Superantigenen noch potenzieren und erstreckt sich u.a. auch auf autologe B-Zellen, Monozyten und aktivierte MHC-KlasseII-positive T-Lymphozyten (HEDLUND et al. 1990). 20 Bei B-Lymphozyten kann die durch Superantigen-vermittelte Interaktion mit T-Zellen zu Proliferation und Differenzierung in Immunglobulin-sezernierende Zellen, aber auch zum Tod führen (MOURAD et al. 1989). HENDRICKS (1998) fand diese dichotome Reaktionsweise ebenfalls bei bovinen B-Zellen; entscheidend für das Schicksal der B-Zellen war dabei die eingesetzte Konzentration der Superantigene, wobei interessanterweise keine lineare Dosisabhängigkeit bestand. Die Zytokin-induzierende Potenz verschiedener Superantigene, sowie das Spektrum induzierter Zytokine in vivo und in vitro, wurde von verschiedener Seite für Mensch und Maus gezeigt. Allerdings sind die Berichte schwer vergleichbar und kaum zu generalisieren. Zum Teil wurden die Daten nach systemischer Verabreichung von Superantigenen in vivo gewonnen (BETTE et al. 1993, LITTON et al. 1994) oder die Daten beziehen sich selektiv auf einzelne Antigen-präsentierende Zellen (PALKAMA & HURME 1993, CHAPES et al. 1994) oder T-Zellen (KRISTENSON et al. 1992, DAMLE et al. 1993, LAGOO et al. 1994). Bei menschlichen Monozyten können Superantigene z.B. die Funktion von LFA-1 (MOURAD et al. 1990) sowie die Produktion verschiedener Monokine, z.B. IL-1β und TNF-α (TREDE et al. 1991) heraufregulieren. Für das Rind gibt es Berichte über die Induktion von IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IFN-γ und TNF-α in Superantigen-stimulierten monoukleären Zellen des Blutes (YOKOMIZO et al. 1995, SCHUBERTH 1997). In anderen Untersuchungen konnte als Folge der Bindung von Superantigenen an MHCKlasse-II-Moleküle die Synthese von Stickstoffmonoxid (FAST et al. 1991, CUNHA et al. 1993, HAUSCHILDT et al. 1993, HENDRICKS 1998) ebenso wie die Induktion Cyclooxigenase-abhängiger Arachidonsäure-Metaboliten wie PGE2 (MEHINDATE et al. 1995, HENDRICKS 1998) demonstriert werden. Im Unterschied zu den immunologischen Konsequenzen von systemisch wirkenden Superantigenen, wurden die Effekte nach lokalem Kontakt mit Superantigenen bisher erst wenig untersucht. HERZ et al. (1999) studierten die Wirkung von inhaliertem SEB auf die Atemwegsschleimhaut von Mäusen. Niedrig dosiertes SEB provozierte einen Influx von Lymphozyten, eosinophilen und neutrophilen Granulozyten, sowie meßbare Konzentrationen von IL-4, aber nicht IFN-γ, in der bronchialen Lavageflüssigkeit. Diese Ergebnisse lassen u.a. vermuten, daß nach lokalem Kontakt der Mukosa mit Superantigenen, eine entzündliche Immunantwort ausgelöst wird, die dem nichtallergischen Asthma gleicht (HERZ et al. 1999). 21 2.1.4 Superantigene bei Staphylokokken-Infektionen der Haustiere S. aureus ist ein wichtiger pathogener Erreger für Rinder. Er ist Ursache für variable Formen der klinischen und subklinischen Mastitis. Bereits frühere Studien deuten auf eine mögliche Rolle von Superantigenen in der Pathogenese der bovinen Mastitis durch S. aureus Infektionen hin. NISKANEN et al. (1978) provozierten durch Injektion von SEA in das Euter gesunder Tiere entzündliche Reaktionen, die denen einer klinischen Mastitis sehr ähnlich waren. Die Bedeutung von TSST-1 und SEC für die Pathogenese der perakut verlaufenden Mastitis diskutierten MATSUNAGA et al. (1993). Die spezifische Art der Interaktion von Superantigenen mit den Zellen des Immunsystems (s. 2.1.2) findet zumindest beim Rind genauso statt wie bei Mensch und Maus (SCHMALTZ et al. 1995, YOKOMIZO et al. 1995, SCHUBERTH et al. 1996, 1998, FERENS et al. 1998, HENDRICKS et al. 2000). Das Rind stellt bisher die einzige Haustierspezies dar, in der grundlegende Superantigen-vermittelte Mechanismen detaillierter untersucht wurden. FERENS et al. (1998) fanden heraus, daß die Aktivierung boviner Zellen des Blutes mit Staphylococcus Enterotoxin C (SEC) zur Expression eines neu identifizierten Aktivierungsmoleküls (ACT3) auf CD8+ T-Zellen führt. Außerdem konnten sie beobachten, daß vermehrt IL-4 und IL-10 produziert wurde, was wiederum zu einer zeitweiligen Hemmung (Tag 0-4) der proliferativen Antwort der T-Zellen führte, zu sehen anhand der sinkenden Zahl CD4-positiver T-Zellen und der nur leicht ansteigenden Zahl CD8-positiver T-Zellen. Zwischen Tag 4 und 7 kommt es zu einer starken und präferentiellen Proliferation der CD8-positiven T-Zellen. Im bovinen System können Superantigene wahrscheinlich durch Induktion von sog. TH2-Zytokinen (IL-4, IL-10) eine schützende Immunantwort verhindern. Die Ergebnisse stimmen mit der Hypothese überein, daß Superantigene an Immunsuppression und immunmodulatorischen Mechanismen beteiligt sind. Weitere Studien befassten sich intensiv mit der Frage nach Superantigen-induzierten, immunmodulatorischen Mediatoren auf Seite der Superantigen-präsentierenden Zellen. SCHUBERTH et al. (1998) und HENDRICKS et al. (2000) zeigten, daß Superantigene die Produktion von Prostaglandin E2 (PGE2) und Stickstoffmonoxid (NO) in bovinen mononukleären Zellen induzieren. Obgleich NO zytotoxische Eigenschaften aufweist und in anderen Systemen als immunmodulatorisch beschrieben wurde - u.a. die Regulation bestimmter T-Zellfunktionen betreffend (NATHANS 1992, MARCINKIEWICZ & CHAIN 1993, BARNES & LIEW 1995), wurde festgestellt, daß 22 Superantigen-induziertes NO das Proliferationsverhalten und vor allem die Zusammensetzung der zellulären Subpopulationen (CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten, B-Lymphozyten) unter den bovinen Blasten nicht beeinflußte. Dies steht in großem Gegensatz zum Proliferations-hemmenden Effekt von NO im Nagersystem nach allogener, mitogener und superantigener Stimulation (FAST et al. 1991, CUNHA et al. 1993, HAUSCHILD et al. 1993, UPHAM et al. 1995). Daher scheint die Vermutung nahe zu liegen, daß die NO-Produktion im bovinen System nur ein Phänomen der zellulären Situation darstellt und keine Konsequenzen für die Proliferationsreaktion in vitro oder für die Zelldifferenzierung hat (HENDRICKS 1998). Prostaglandin E2 (PGE2) ist ein wesentliches Produkt des Arachidonsäuremetabolismus und wird hauptsächlich von aktivierten Monozyten und Makrophagen gebildet. Es ist prinzipiell bekannt, daß die Signaltransduktion über MHC-Klasse-IIMoleküle nach Kreuzvernetzung durch Superantigene zur Induktion Cyclooxigenaseabhängiger Arachidonsäure-Metaboliten wie PGE2 führt (MEHINDATE et al. 1995). Beim Rind ergab sich eine starke individuelle Heterogenität der durch Superantigene induzierbaren PGE2-Synthese (HENDRICKS 1998). Dies könnte zur individuellen Reaktivität auf Superantigene beitragen, da gezeigt wurde, daß PGE2 die Proliferationsreaktion boviner mononukleärer Zellen in höheren Konzentrationen hemmen kann. Allerdings bezog sich diese Hemmung im wesentlichen auf beide HauptT-Zellpopulationen (CD4+, CD8+). HENDRICKS (1998) schloß daraus, daß PGE2 nicht der verantwortliche Mediator für die beim Rind so hervorstechende präferentielle Proliferation von CD8+ T-Zellen nach Superantigenstimulation ist. Weitere Informationen über die regulative Bedeutung des induzierten PGE2 nach Superantigenstimulation existieren kaum (MEHINDATE et al. 1995) oder nur sehr indirekt (FERNANDEZ et al. 1996). Ob und in welcher Weise die jeweiligen Superantigene die PGE2-Produktion steuern ist unklar. Denkbar wäre, daß durch die bakteriellen Superantigene in Abhängigkeit von ihrer Avidität zu den exprimierten allelen MHCKlasse-II-Produkten jeweils bestimmte Arachidonsäureprodukte oder unterschiedliche Verhältnisse dieser Metaboliten induziert werden. Unterschiedliche Verhältnisse einzelner Eicosanoide können insofern von Bedeutung sein, als sie zum Teil gegenläufige immunmodulatorische Wirkungen aufweisen. Dies wurde für LTB4 und PGE2 (ANTONELLI et al. 1990, SNIJDEWINT et al. 1993) oder Thromboxan A2 und PGE2 (GOETZL et al. 1995) beschrieben. 23 PGE2 besitzt überdies ein eindrucksvolles immunregulatorisches Potential. Es fördert bspw. die Proliferation von Colon-Karzinomzellen (QIAO et al. 1995, HANIF et al. 1996), während die Proliferation von T-Zellen normalerweise gehemmt wird (YU et al. 1993, PICA et al. 1996). In Abhängigkeit vom Thymozyten-Differenzierungsstadium führte dieser Arachidonsäuremetabolit zur Ausdifferenzierung oder zur Apoptose (JUZAN et al. 1992, SAIAGH et al. 1994). Inwieweit die beschriebenen Mediatoren NO und PGE2 die Apoptose von neutrophilen Granulozyten fördern oder hemmen, wird in der Literatur interessanterweise kontrovers beurteilt (ROSSI et al. 1995, BANNO et al. 1997, KOLLER et al. 1997, WALKER et al. 1997, FORTENBERRY et al. 1998) (s. Tab. 1, s. 2.4.3). Die Produktion von Superantigenen oder die Anwesenheit von Genen, die für Superantigene kodieren, ist fast immer auf einen Teil aller möglichen Enterotoxine beschränkt (HIROOKA et al. 1988, KANG et al. 1991, MATSUNAGA et al. 1993, BECKER et al. 1998). Dies mag das Fehlen von klaren epidemiologischen Daten bezüglich der Rolle von Superantigenen in der Pathogenese von bestimmten Krankheiten, z.B. der Mastitis der Rinder erklären. Die Frequenz Superantigen-bildender S. aureus Stämme beim Rind reicht je nach Untersuchung und Nachweisverfahren von 0-76%. Abhängig von der jeweiligen Studie wurden, z. B. in Isolaten von an Mastitis erkrankten Rindern, entweder keine Superantigen-produzierenden Stämme gefunden (LEE et al. 1998) oder die Frequenz erreicht 50% (ADESIYUN et al. 1998) oder sogar 76% (KANG et al. 1991). STEPHAN et al. (1999) stellten bei insgesamt 63 S. aureus Isolaten aus Milchproben von Kühen mit Mastitis in 34 Fällen (54%) eine Produktion von Superantigenen fest. Davon produzierten sieben Stämme jeweils 2 verschiedene Enterotoxine, die meisten jedoch SEC (21 Isolate). Beim Hund produzierten 25-50% der S. intermedius- und der S. aureus Isolate aus infektiösen Erkrankungen Enterotoxine (FUKUDA et al. 1984, ALMAZAN et al. 1987, HIROOKA et al. 1988). Auf die mögliche Beteiligung von Superantigenen bei der caninen juvenilen Polyarthritis und der steril eitrigen Meningitis-Arteriitis weisen TIPOLD et al. (1996 a, b) hin. S. intermedius spielt außerdem eine wichtige Rolle bei der Pyodermie der Hunde (BURKETT & FRANK 1998). 24 2.2 Weitere zytotoxische Virulenzfaktoren von Staphylococcus aureus S. aureus ist in der Lage, eine hohe Zahl an Virulenzfaktoren zu produzieren, deren Anteil an der Pathogenese einer Infektion nicht immer geklärt ist, da sie meist zusammenwirken. Ausnahmen stellen Syndrome oder Erkrankungen dar, die durch ein (Haupt-) Toxin verursacht werden: Lebensmittelvergiftungen durch Enterotoxine; das Toxic Shock Syndrome durch TSST-1; das Scalded Skin Syndrome des Menschen und das nässende Ekzem der Ferkel durch exfoliative Toxine von S. aureus bzw. S. hyicus (FREER 1988). Die Virulenzfaktoren von Staphylokokken kann man in extrazelluläre und zelluläre Faktoren einteilen. Während zu den zellulären Faktoren u.a. Schleim, der Clumping factor und das Protein A gehören, werden zu den wichtigen extrazellulären Virulenzfaktoren außer den Enterotoxinen u.a. die exfoliativen Toxine, die Hämolysine und die Leukotoxine gezählt (CIBOROWSKI & JELJASZEWICZ 1985). AlphaHämolysine werden auf der Oberfläche von Zielzellen von einem wasserlöslichen Monomer zu einem membrangebundenen Heptamer und bilden wassergefüllte Kanäle, die zu Zelltod und Lyse führen (GOUAUX et al. 1997). Die von S. aureus produzierten gamma-Hämolysine sind Zwei-Komponenten-Toxine. Die Komponenten fügen sich nacheinander in die Membranen empfindlicher Zellen ein und bilden dort Poren, wodurch sie die Erythrozyten und die Phagozyten schädigen (FERRERAS et al. 1998, SZMIGIELSKI et al. 1999). Abhängig von der Kombination der Komponenten verursachen diese Toxine z.T. ernste Entzündungsreaktionen durch die massive Ausschüttung von Entzündungsmediatoren (KONIG et al. 1997, SIQUEIRA et al. 1997). Exfoliative Toxine von S. aureus sind als Virulenzfaktoren entscheidend an der Pathogenese des Staphylococcal Scaled Skin Syndrome (SSSS) des Menschen beteiligt. Diese generalisierte exfoliative Hauterkrankung betrifft hauptsächlich Kinder. Etwa 6% der S. aureus Stämme aus klinischem Untersuchungsmaterial unterschiedlicher Herkunft sind Exfoliatin-Bildner. Von diesen Stämmen bilden 88% Exfoliatin A. Der Anteil an exfoliatives-Toxin-bildenden S. aureus Isolaten aus exfoliativen Hautveränderungen liegt bei 70%. Exfoliatin A allein wird von 46%, Exfoliatin B allein von 16% und Exfoliatin A und B zusammen werden von 38% der Toxinbildner produziert (DE AZAVEDO & ARBUTHNOTT 1981). Der Hund hat sich experimentell als unempfindlich gegenüber dem exfoliativen Toxin von S. aureus (ELIAS et al. 1976) 25 bzw. S. hyicus (SATO et al. 1991) erwiesen, aber gerade der Vergleich der Exfoliatine dieser beiden Staphylokokken-Spezies hat gezeigt, daß funktionell ähnliche Proteine unterschiedliche Wirtsspezifitäten haben können. Viele Staphylokokken-Isolate aus nekrotischen Hautläsionen und Furunkeln produzieren Leukotoxine (SZMIGIELSKI et al. 1999). Neben den Superantigenen scheinen die Leukotoxine eine entscheidende Rolle bei dem Beginn und dem Verlauf einer durch S. aureus hervorgerufenen Erkrankung zu spielen. Die in der Literatur berichteten Frequenzen von Leukotoxin-produzierenden S. aureus Isolaten schwanken in weiten Bereichen. LOEFFLER et al. (1988) fanden, daß nur 2 von 27 S. aureusinfizierten Milchproben von Kühen mit chronischer Mastitis Leukotoxine produzierten. Hingegen stellten SIQUIERA et al. (1997) fest, daß die meisten S. aureus Stämme zwei oder sogar sechs verschiedene Leukotoxine produzierten. Trotz der andauernden Diskussion über die Bedeutung von Superantigenen oder Leukotoxinen für die Pathogenese der bovinen S. aureus-verursachten Mastitis existieren bislang keine Studien über die simultane Expression dieser beiden Virulenzfaktorengruppen bei S. aureus Isolaten. 2.3 Polymorphkernige neutrophile Granulozyten 2.3.1 Morphologische und phänotypische Eigenschaften von neutrophilen Granulozyten Die Granulozyten erhielten ihre Bezeichnung auf Grund der deutlichen Granula im Zytoplasma; wegen ihres unregelmäßig geformten Zellkerns nennt man sie auch polymorphkernige Granulozyten (PMN). Neben dem mehrfach gelappten Kern zählen die lichtmikroskopisch neutralen (azurophilen, primären) Granula zu den charakteristischen morphologischen Merkmalen ausgereifter neutrophiler Granulozyten. Ihre primären Granula sind reich an mikrobiziden Enzymen wie Hydrolasen, Lysozym, Myeloperoxidasen, Proteinasen, sauren Hydrolasen, Histaminase und kationischen Proteinen. Sekundäre Granula enthalten zudem noch Lactoferrin und Kollagenasen (GEMSA et al. 1991, KLEIN 1991). 26 Neutrophile Granulozyten repräsentieren den Hauptanteil der zirkulierenden Granulozyten (GEMSA et al. 1991). Mit einem Durchmesser von ca. 10-14 µm bilden sie bei Pferd, Hund und Katze mit 55-70% den größten Anteil der Leukozyten, während bei anderen Tierarten Lymphozyten vorherrschen. Im bovinen Differentialblutbild stellen die neutrophilen Granulozyten mit 25-45%, neben den Lymphozyten mit 45-65%, die zweitstärkste Leukozytenfraktion dar. Der Anteil eosinophiler Granulozyten an den Blutleukozyten liegt bei gesunden Rindern bei 1-10%, die Anteile basophiler Granulozyten bei 0-2% und die der stabkernigen neutrophilen Granulozyten bei 0-3% (HOFMANN 1992). Bovine neutrophile Granulozyten zeigen einige Besonderheiten. Bemerkenswert ist das Vorhandensein einer dritten Art von Granula im Zytoplasma. Diese Granula sind größer als die anderen Granula und enthalten kationische antibakterielle Proteine, wie z.B. Bactenecin (ROMEO et al. 1988), Indolicin und β-Defensin (SELSTED et al. 1992, 1993). Die kationischen bakteriziden Proteine in den Granula unterscheiden sich von denen, die für andere Spezies beschrieben werden. Sie sind bakterizid nur für bestimmte Bakterien. Für die von SELSTED et al. (1992, 1993) beschriebenen kationischen bakteriziden Proteine wird eine antimikrobielle Wirkung gegenüber S. aureus und E. coli genannt. In den azurophilen und den spezifischen Granula sind viele der Enzyme enthalten, die auch bei humanen Neutrophilen oder denen anderer Spezies gefunden werden. Bemerkenswerterweise fehlt den bovinen Granulozyten das Lysozym, welches eine Hauptkomponente der humanen azurophilen Granula ist (PASTORET et al. 1998). Im Knochenmark entwickeln sich aus Stammzellen unter der koordinierten Wirkung hämatopoetischer Wachstumsfaktoren (wie Granulozyten-Makrophagen-Koloniestimulierender Faktor, GM-CSF, Interleukin-3, IL-3 und Granulozyten-Koloniestimulierender Faktor, G-CSF) über mehrere Entwicklungsstufen (Myeloblasten, Promyelozyten, Myelozyten und Metamyelozyten) die jugendliche Zellform der stabkernigen neutrophilen Granulozyten. Ihr länglicher Kern ist noch nicht segmentiert. Erst mit zunehmender Alterung der Zelle zerfällt er in mehrere, über Chromatinstege verbundene, Segmente (LIEBICH 1993). Nach der Freisetzung aus dem Knochenmark zirkulieren die PMN im Blutstrom, wobei sie besonders im Kapillargebiet engen Kontakt zum Endothel haben. Dieser Kontakt zu Endothelzellen wird über Adhäsionsmoleküle vermittelt. 27 2.3.2 Aufgaben der Granulozyten im Rahmen der Infektionsabwehr Granulozyten gehören mit zu den Immunzellen, die als erste am Ort eines Infektionsgeschehens erscheinen. Entzündungsmediatoren (u.a. Interleukin-8, Leukotrien B4, C5a) wirken zum einen chemotaktisch auf neutrophile Granulozyten und induzieren zum anderen auf Endothelzellen die Expression von Adhäsionsmolekülen. Innerhalb weniger Minuten wird das adhäsive P-Selektin exprimiert, ein zweites Selektin, das E-Selektin, erscheint erst einige Stunden nach Aktivierung. Diese Selektine erkennen Kohlenhydratepitope verschiedener Glykoproteine auf Leukozyten. Das auf der Seite der Leukozyten exprimierte L-Selektin unterstützt das „Rollen“ der Zellen entlang der Gefäßwand. Diese Wechselwirkungen führen zu einer reversiblen Anheftung der Neutrophilen an die Gefäßwand. Im Wirkungsgebiet von Entzündungsmediatoren wird somit die Geschwindigkeit der PMN im Blutstrom bei der Annäherung an aktiviertes Endothel abgebremst (Margination). Diese Form der Adhäsion ermöglicht die folgenden, stärkeren Interaktionen, welche letztlich zur Extravasation der Granulozyten führen. Der Prozeß der Extravasation setzt eine hochkoordinierte und dynamische Interaktion zwischen verschiedenen Adhäsionsmolekülen von PMN und den Zellen des Gefäßendothels voraus (SMITH & ANDERSON 1991). Dieser Schritt ist abhängig von Wechselwirkungen zwischen den Leukozyten-Integrinen LFA-1 (Leukozyten-Funktions-assoziiertes-Antigen-1, CD11a/ CD18) und CR3 (Complementrezeptor-3, CD11b/CD18, auch MAC-1 genannt) und interzellulären Zelladhäsionsmolekülen (intercellular cell adhesion molecule, ICAM-1) auf Endothelzellen. Die Verbindung von LFA-1 und CR3 mit ihren Liganden ist physiologischerweise nur schwach. Das von Endothelzellen und Immunzellen im Entzündungsbereich sezernierte IL-8 bewirkt jedoch auf Leukozyten eine Konformationsänderung des LFA-1 und des CR3, was die Affinität dieser Moleküle für ihre Liganden deutlich erhöht. Als Folge davon werden die Zellen an dieser Stelle des Endothels immobilisiert. Weitere adhäsive Wechselwirkungen werden über das immunglobulinähnliche Molekül CD31 (auch PECAM: platelet endothelial cell adhesion molecule) vermittelt, das sowohl auf Leukozyten als auch an den Verbindungsstellen zwischen den Endothelzellen exprimiert wird (JANEWAY & TRAVERS 1997). Die folgende Transmigration findet bevorzugt zwischen den Kontaktstellen von drei Endothelzellen („tricellular corners“) statt. Tight junctions (zona occludens) scheinen hierbei eine geringere Rolle zu spielen (BURNS et al. 1997). Die PMN durchstoßen die Basalmembran mit Hilfe proteolytischer Enzyme, transmigrieren und gelangen entlang eines Konzentrationsgradienten von Entzündungsmediatoren in das betroffene Gewebe. 28 Granulozyten phagozytieren Erreger und Zelldetritus abgestorbener Gewebezellen. Inaktiviert werden Pathogene mit Hilfe reaktiver Sauerstoffmetabolite und bakterizider lysosomaler Enzyme / Polypeptide nach Verschmelzung der Phagosomen mit den Lysosomen zu Phagolysosomen (DJEU & BLANCHARD 1987, JACKSON et al. 1995, CASSATELLA 1996, BELAAOUAJ et al. 1998). Ein namhafter Teil der von Granulozyten gebildeten Metaboliten / Enzyme gelangt durch Exozytose auch in das umliegende Gewebe, wodurch es zur Schädigung der dort gelegenen Zellen kommt. Abgestorbene Granulozyten werden aus dem Gewebe durch die Phagozytose von residenten Makrophagen entfernt (COX et al. 1995). Während einer Infektion steigt die tägliche Produktion der Granulozyten im Knochenmark etwa um das zehnfache. Für Granulozyten ist beim Mensch (ZINK 1990) und bei der Ratte (ROITT et al. 1991) nur eine Lebensdauer von 2-3 Tagen beschrieben. Durch die Wirkung lokal produzierter Zytokine im Entzündungsgebiet verlängert sich die Lebenszeit dieser relativ kurzlebigen Zellen (BLISS et al. 1999). WATSON et al. (1997) fanden eine verzögerte spontane Apoptose bei Neutrophilen, die durch eine Transmigration in ein Entzündungsgebiet aktiviert wurden. PMN erweisen sich nicht nur als reine „Entsorger“ von Fremdorganismen. Nach LLOYD & OPPENHEIM (1992) werden PMN durch verschiedene Mediatoren (Lipopolysaccharide (LPS), IL-1, IL-2, Tumornekrosefaktor (TNF) oder GM-CSF) zur Produktion und Freisetzung von Zytokinen stimuliert. In der Vergangenheit wurde gezeigt, daß Granulozyten eine Vielzahl an Zytokinen und Chemokinen nach Stimulation mit mikrobiellen Produkten, wie z.B. dem bakteriellen LPS, produzieren können (CASSATELLA 1995, DUBRAVEC et al. 1990, HAZIOT et al. 1993). Über diese Fähigkeit, aktivierungsabhängig Zytokine und Chemokine zu sezernieren, beeinflussen PMN unmittelbar auch Mechanismen der adaptiven Immunantwort (CASSATELLA 1999). Interaktion von Superantigenen mit neutrophilen Granulozyten Berichte über direkte Interaktionen von Superantigenen mit Neutrophilen sind selten. BERGER et al. (1988) fanden, daß zwar Toxic shock syndrome toxin-1 (TSST-1), aber nicht SEA und SEB zu einer Abnahme der bakteriziden Aktivität von humanen Neutrophilen in vitro führen. TSST-1 konnte ebenfalls heat shock proteins (hsp70, hsp72) in isolierten humanen Granulozyten induzieren (HENSLER et al. 1991) und die 29 FMLP-induzierte LTB4-Bildung von humanen Granulozyten steigern (HENSLER et al. 1993). Zumindest TSST-1 kann die Signaltransduktionswege humaner Granulozyten deutlich beeinflussen. Vor kurzem wurde berichtet, daß SEA, SEB und TSST-1 keinen direkten Effekt auf die Apoptose von humanen Neutrophilen haben (MOULDING et al. 1999). Beweise für Effekte von Superantigenen auf die Eigenschaften neutrophiler Granulozyten sind meist indirekt. Für TSST-1 wurde ein migrationshemmender Effekt gezeigt, der durch stimulierte mononukleäre Zellen vermittelt wurde (FAST et al. 1988). Auf der anderen Seite wirkte intravenös verabreichtes SEA migrationsfördernd (MILLER et al. 1996). Andere berichten von einer gestiegenen Sensitivität von Granulozyten gegenüber TNF-α-vermittelten Signalen nach systemischen T-Zellabhängigen Antworten auf SEB oder phasische Veränderungen in der Expression von CD11a und CD11b auf Neutrophilen nach Induktion von letaler Sepsis mit Enterotoxinproduzierenden Staphylokokken (NEUMANN et al. 1997). Es ist bekannt, daß Neutrophile und Eosinophile MHC-Klasse-II-Moleküle exprimieren können, besonders nach Aktivierung durch IFN-γ, GM-CSF, IL-3 und IL-5 (GOSSELIN et al. 1993, WELLER et al. 1993, GUIDA et al. 1994). Obwohl die Expressionsdichte der MHC-Klasse-II-Moleküle niedrig war, konnte gezeigt werden, daß die Granulozyten in der Lage waren, den T-Zellen Superantigene zu präsentieren, und daß dies zu einer Aktivierung und Proliferation der T-Zellen führt (GASCOIGNE 1993). Die Expression von MHC-Klasse-II-Molekülen auf Granulozyten kann also einen Mechanismus darstellen, durch den Granulozyten und T-Zellen in engen Kontakt treten. Eine Konsequenz dieser Interaktion könnte das beschleunigte Absterben der Granulozyten sein, ein Phänomen, das als SDCC (superantigen-dependent cellular cytotoxicity) bekannt ist und für die Elimination von autologen B-Zellen, Monozyten und aktivierten, MHC-Klasse-II-positiven T-Zellen beschrieben wird (HEDLUND et al. 1990). 30 2.4 Apoptose Der Begriff Apoptose kommt aus dem Griechischen und beschreibt eine Blume, die ihre Blütenblätter verliert oder einen Baum, der seine Blätter abwirft. Dies gleicht dem Abschnüren von Membranvesikeln, was bei einer besonderen Form des Zelltodes auftritt; deshalb wurde der Begriff Apoptose für diese Art des Todes übernommen. Apoptose oder auch programmierter Zelltod ist ein Vorgang, der physiologischerweise im Körper vorkommt. JACOBSON et al. (1997) teilen die Aufgaben der Apoptose in fünf Gruppen ein: Erstens das Formen von Gewebsstrukturen, zweitens das Zerstören von nicht benötigten Gewebsstrukturen, drittens die Kontrolle der Zellzahl, viertens die Elimination von nicht normalen, nicht funktionierenden oder potentiell schädlichen Zellen bzw. von Zellen, die am falschen Ort sind und fünftens die Produktion von differenzierten Zellen ohne Organellen (z.B. Kerationzyten, Linsenepithel). Als Beispiel für die vierte Funktion kann die Kontrolle sich entwickelnder T- und B-Lymphozyten dienen, von denen die potentiell gefährlichen (autoreaktiven) eliminiert werden müssen (JACOBSON et al. 1997). Die Apoptose ist ein fein regulierter, komplizierter Mechanismus, was auf die große Bedeutung dieses Prozesses für den Organismus schließen läßt. Im Rahmen der Apoptose wird - im Gegensatz zur Nekrose - kein Inhalt der sterbenden Zelle freigesetzt, was z.B. bei der Elimination von im Gewebe befindlichen Neutrophilen sehr wichtig ist, damit es durch die Vielzahl der in ihnen enthaltenden Enzyme nicht zu einer unnötigen Schädigung des umliegenden Gewebes kommt (COHEN 1993) (s. 2.3.2). Der Zelltod ist ein wichtiger Bestandteil in der Entwicklung von Lebewesen. Er tritt in vielen sich entwickelnden Geweben von Invertebraten und Vertebraten auf (Übersicht bei: GLUCKSMANN 1951, CLARKE & CLARKE 1996). Der Begriff „programmierter Zelltod“ wurde zunächst benutzt, um einen Zelltod zu beschreiben, der an vorhersagbaren Orten und zu vorhersagbaren Zeiten während der Entwicklung auftrat, um zu verdeutlichen, daß der Tod zum programmierten Entwicklungsplan von Organismen gehört (LOCKSHIN & WILLIAMS 1964). Es war ebenfalls bekannt, daß ein Teil dieser Zelltode durch von anderen Geweben produzierte Substanzen verhindert werden kann. Daraus kann man schließen, daß der Tod nicht unabdingbar ist und durch Signale von anderen Zellen unterdrückt werden kann (Übersicht bei: SAUNDERS 1966). 31 Wenn Zellen während der normalen Entwicklung, der Gewebehomöostase oder in der Peripherie von akuten Läsionen sterben, verkleinern sie sich, kondensieren, und die Organellen und die Plasmamembranen behalten ihre Integrität. Diesen Prozeß betitelten KERR et al. (1972) als Apoptose. Die toten Zellen oder ihre Fragmente werden schnell von residenten Makrophagen phagozytiert, bevor Zellinhalte austreten können. Damit werden Entzündungsreaktionen vermieden. Auf Grund der Tatsache, daß die Morphologie apoptotischer Zellen in allen Geweben und bei allen Tieren sehr ähnlich ist, behaupteten KERR et al. (1972), daß dieser Tod das Spiegelbild eines aktiven, intrazellulären Todesprogramms sei, das durch eine Vielzahl physiologischer oder pathologischer Stimuli induziert oder verhindert werden kann. Heutzutage ist mit dem Begriff Apoptose jeder Zelltod gemeint, der durch ein intrazelluläres „Todesprogramm“ vermittelt wird, unabhängig davon, wodurch der Tod induziert wird und ob alle charakteristischen Anzeichen der Apoptose gezeigt werden (JACOBSON et al. 1997). Eine Zelle, die dem programmierten Zelltod anheim fällt, wird so schnell entfernt (häufig in einer Stunde oder weniger), daß sogar bei hohen Sterberaten nur wenige tote Zellen zu sehen sind (JACOBSON et al. 1997). Der programmierte Zelltod kann in allen kernhaltigen Zellen ablaufen, beginnend mit der Zygote (WEIL et al. 1996). Durch genetische Studien, besonders in dem Nematoden Caenorhabditis elegans, kam es zur Identifizierung von Genen, die dem Todesprogramm und seiner Kontrolle gewidmet sind (HORWITZ et al. 1982, ELLIS & HORWITZ 1986), später auch zu der Erkenntnis, daß einige dieser Gene homolog zu denen von Säugetieren sind (YUAN et al. 1993, HENGARTNER & HORWITZ 1994). Das zuerst identifizierte, sog. ced-3 Gen, kodiert für eine Cystein-Protease, die homolog zu dem Interleukin-1β-converting enzyme (ICE) ist (YUAN et al. 1993). Das ICE ist eine Cystein-Protease bei Säugetieren, die aus Vorstufen das proinflammatorische Zytokin IL-1β produziert wird. Inzwischen sind mehrere dieser Proteasen identifiziert, und sie werden auf Grund ihrer Spaltungsstelle heute einheitlich als Caspasen bezeichnet (s. 2.4.4). Da spezifische Proteine oder Caspase-Inhibitoren die Apoptose verhindern können, scheint klar zu sein, daß Caspasen der zentrale Teil des Todesprogramms sind, obwohl einige von ihnen, so wie der Prototyp dieser Familie, IL-1β-converting enzyme (ICE), auch noch andere Funktionen wahrnehmen (JACOBSON et al. 1997, s. 2.4.4). 32 2.4.1 Zellmorphologie und zeitliche Abfolge der Apoptose Apoptotische Zellen zeigen kardinale morphologische Veränderungen: Das sog. „membrane blebbing“ (Bläschenbildung und Ausstoß von Membranvesikeln bei noch intakter Integrität der Zellmembran), ein Schrumpfen der Zelle, die Kondensation des Chromatins und die Fragmentierung der DNA. Was im Durchflußzytometer an morphologischen Veränderungen beurteilt werden kann, tritt in den Stadien der Apoptose erst relativ spät auf. In Abb. 1 wird am Beispiel der - in einer humanen Zellinie durch FasFas-Ligand-Interaktion - induzierten Apoptose der zeitliche Ablauf biochemischer und morphologischer Veränderungen verdeutlicht: Aktivierung von ICE-Proteasen Æ PARP-Proteolyse Æ PS-Externalisierung Æ DNA-Fragmentierung Æ morphologische Änderungen Æ Plasmamembranschädigung Æ 0 2 4 6 8 10 Stunden Abb. 1 Stadien der Apoptose zu unterschiedlichen Zeiten nach anti-FasInduktion in Jurkat-Zellen. In Jurkat-Zellen (humane T-Leukämiezellen) wurde durch Inkubation mit einem Antikörper gegen das Fas-Molekül die Apoptose induziert. Gezeigt wird die zeitliche Abfolge nachweisbarer biochemischer und morphologischer Veränderungen auf zellulärer Ebene. Die Aktivierung der Caspasen erfolgt in einem Zeitraum zwischen 0-2 Stunden. Diese Aktivierung ist zusammen mit der Proteolyse des Enzyms PARP (Poly-(ADP-Ribose)-Polymerase) die erste Reaktion der Zelle auf das Todessignal. Erst ca. 2 Stunden später kommt es zur Externalisierung von Phosphatidylserin (PS) an die äußere Zellmembran. Morphologische Änderungen bzw. der Nachweis der Plasmamembranschädigung lassen sich im Fall der verwendeten Zellinie erst relativ spät feststellen. ICE: Interleukin-1 converting enzyme = Caspasen (s.2.4.4); DNA: Desoxyribonukleinsäure. 33 Apoptotische Zellen im Thymus, der Milz und den Lymphknoten werden von Makrophagen vor Ihrer Lyse internalisiert, was zu der Vermutung veranlaßt, daß Makrophagen eine für den Vorgang der Apoptose spezifische Veränderung der Oberflächenstruktur erkennen. Es ist bekannt, daß die Plasmamembranen von normalen Blutzellen eine signifikante Phospholipidasymmetrie aufweisen, wobei sich Phosphatidylcholin und Sphingomyelin hauptsächlich an der äußeren Seite der Membran und Phosphatidylethanolamin fast ausschließlich auf der Innenseite der Plasmamembran befinden. Das anionische Phospholipid, Phosphatidylserin, ist in normalen Zellen an der Innenseite der Plasmamembran lokalisiert. Es konnte beobachtet werden, daß ein Verlust dieser Plasmamembranasymmetrie zu einer verstärkten Bindung und einem Anstieg der Phagozytose dieser Zellen durch Makrophagen führt (MC EVOY et al. 1986). Die Gruppe um V.A. FADOK (1992) untersuchte, ob ein Verlust der Membranasymmetrie im Verlauf der Apoptose auftritt. Makrophagen könnten dann apoptotische Zellen auf Grund ihrer hydrophoben Oberfläche bzw. ihrer negativen Ladung oder sogar spezifisch Phosphatidylserin erkennen. Sie kommen zu dem Schluß, daß die Externalisierung von Phosphatidylserin eine universelle Veränderung der Oberflächenstruktur ist, die vermutlich allen apoptotischen Zellen, unabhängig von der Herkunft der Zellen bzw. dem „Auslöser“ der Apoptose, eigen ist. Bei der Induktion von Apoptose haben sog. „Todesrezeptoren“ eine sehr wichtige Funktion. Die Rezeptoren besitzen intrazelluläre Todesdomänen, welche für die Transmission des zytotoxischen Signals erforderlich sind. Zur Zeit sind fünf verschiedene dieser Todesrezeptoren bekannt (Übersicht bei: SCHULZE-OSTHOFF et al. 1998): der TNF-Rezeptor-1, das TNF-receptor-related-apoptosis-mediating protein (TRAMP), der TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) receptor 1, der TNFrelated apoptosis-inducing ligand (TRAIL) receptor 2 und das CD95 (alt: Fas oder APO-1). Viele Zelloberflächen-Rezeptoren sind in der Lage nach Ligation, zytotoxische Signale in das Zytoplasma weiterzugeben. In den meisten Fällen haben sie jedoch noch weitere Funktionen. Ob die Signale nach Rezeptoraktivierung zu Zellaktivierung, Zelldifferenzierung oder Zelltod führen, ist stark abhängig vom Zelltyp und während der Differenzierung streng reguliert (SCHULZE-OSTHOFF et al. 1998). Die Wege, wie diese Rezeptoren die Apoptose induzieren, sind ziemlich ähnlich. Durch die Bindung des Liganden kommt es zur Oligomerisation des Rezeptors und daraufhin zu der Bindung eines Adapterproteins an die Todesdomäne. 34 Das Adapterprotein bindet dann eine proximale (initiierende) Caspase, wodurch das für Apoptose verantwortliche Rezeptorsignal an distale (ausführende) Caspasen weitergegeben wird (vgl. Abb. 1). Es gibt jedoch auch Kreuzvernetzungen zwischen den Kaskaden (NAGATA 1997, MONNEY et al. 1998). Abb. 2 Vereinfachte schematische Darstellung der Aktivierung der „Todesrezeptoren“ CD95 und TNF-R1. Durch die Bindung des Liganden (z.B. Fas-Ligand oder TNF-α) kommt es zur Oligomerisation der Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptoren (TNF-RI) oder der FAS-Moleküle, und daraufhin zur Bindung eines Adapterproteins (FADD, TRADD) an die Todesdomäne. Das Adapterprotein bindet dann eine proximale (initiierende) Caspase (TNF-R1: Caspase-2; Fas: Caspase-8), wodurch das für Apoptose verantwortliche Rezeptorsignal an distale (ausführende) Caspasen (u.a. Caspase-3, -6, -7) weitergegeben wird. FADD: Fas-associated death domain protein; TRADD: TNF receptor-associated death domain protein; RIP: receptor interacting protein; RAIDD: RIP-associated ICH-1/Ced-3 homologous death domain protein (modifiziert nach Biosource International, Apoptosis Applications & Glossary). 35 2.4.2 Regulation der Apoptose Der Vorgang der Apoptose muß streng geregelt sein, weil ansonsten unerwünschte Zellen überleben oder notwendige Zellen sterben würden. Entgleisungen dieses Systems resultieren häufig in der Entstehung von Tumoren, Autoimmunerkrankungen und degenerativen Erkrankungen des zentralen Nervensystems (THOMPSON 1995). Die Caspasen können durch verschiedene Stimuli aktiviert werden und spielen eine zentrale Rolle in der Ausführung der Apoptose (SALVESEN & DIXIT 1997). Die Aktivität der Caspasen und ihre Gegenregulation durch Apoptose-hemmende Proteine wie die der Bcl-2 Familie und die der Apoptose-hemmenden Proteinfamilie (IAP) sind entscheidend für die molekularen Mechanismen der Apoptose (KOBAYASHI et al. 1999). Der Begriff des programmierten Zelltodes (PCD) impliziert eine Existenz von Genen, die für eine Kaskade von Proteinen kodieren, die ihrerseits den Untergang der Zelle einleiten können. Für eukaryote Zellsysteme konnten verschiedene Gene identifiziert werden, die direkt oder indirekt an der Induktion der Apoptose beteiligt sind. Als Beispiel für die sog. „death genes“ sei das p53 Gen genannt. Es kodiert für einen multifunktionellen Transkriptionsfaktor, der über die genetische Stabilität der Zelle wacht. Gene, die für die Regulation der Apoptose verantwortlich sind, stehen im Gleichgewicht mit Genen, die für die Zellproliferation bedeutsam sind (GSCHWEND 1996). Zumindest ein intrazellulärer Mechanismus, der den Zelltod kontrolliert, ist im Laufe der Evolution erhalten geblieben. Das ced-9 Gen, das in dem Nematoden Caenorhabditis elegans den programmierten Zelltod verhindert, ist homolog zu dem bcl-2 Gen, das die Apoptose in Zellen von Säugetieren verhindert (VAUX et al. 1988, Übersicht bei: KORSMEYER 1995). Eine ganze Reihe von Strukturen, die zu dieser Familie gehören, konnte bei Säugetieren identifiziert werden. Die Bcl-2 Familie setzt sich zusammen aus Inhibitoren des Zelltodes, wie Bcl-2 und Bcl-XL, und Promotoren des Zelltodes, wie Bax und Bak. Die Frage, wie diese Regulatoren funktionieren und zusammenspielen, wird immer noch kontrovers diskutiert. Interessanterweise können Mitglieder dieser Familie Homodimere und Heterodimere formen. Es wurde ursprünglich angenommen, daß Bax und wahr-scheinlich Bak die Todesmaschinerie direkt beeinflussen, wohingegen Bcl-2 und Bcl-XL diese Interaktion nur antagonisieren. Diese Vermutung wird durch die Beobachtung unterstützt, daß 36 mutante Formen von Bcl-2, die nicht mehr mit Bax und Bak heterodimerisieren können, ihre Fähigkeit, die Apoptose dieser Zellen zu verhindern, einbüßen (Übersicht bei: CHINNAIYAN & DIXIT 1996). Vor kurzem identifizierten jedoch CHENG et al. (1996) eine mutante Form von Bcl-XL, die trotz ihrer fehlenden Fähigkeit mit Bax und Bak zu interagieren, immer noch todesverhindernde Aktivität zeigt. Dies spricht für die Existenz eines Bax und Bak unabhängigen Todespfades. Diese neueren Erkenntnisse unterstützen ein Modell, in dem Bax und Bak den Zelltod induzieren, indem sie die Bindung der negativen Regulatoren, Bcl-2 und Bcl-XL, und damit die Inhibition ihrer beabsichtigten Ziele verhindern. Es scheint, daß die Mitglieder der Bcl-2 Familie, anstatt zu heterodimerisieren, kompetitiv um einen gemeinsamen Bindungspartner konkurrieren (SCHULZE-OSTHOFF et al. 1998). Andere negative Regulatoren des Zelltodes wurden im Verlauf der Forschung an Viren entdeckt. Dies überrascht nicht, denn es ist plausibel, daß die Viren die Zellen, die für ihre Vermehrung notwendig sind, am Leben erhalten wollen. Das Verhältnis von Aktivatoren zu Inhibitoren bestimmt wahrscheinlich die Tendenz der Zelle apoptotisch zu werden (KORSMEYER 1995), obwohl die Aktivität einiger dieser Proteine auch durch Phosphorylierung geregelt werden kann (Übersicht bei: GAJEWSKI & THOMPSON 1996). Es ist bisher nicht bekannt, wie diese Proteine funktionieren. Obwohl die meisten Zellen Signale zum Überleben in Kultur von anderen Zellen bekommen, gibt es auch welche, die diese Signale für sich selber produzieren. Für das lange Überleben in Kultur ist eine Kombination verschiedener Signalmoleküle für die meisten Zellen nötig. Diese Moleküle können löslich, an die Plasmamembran oder an die extrazelluläre Matrix gebunden sein. CHINNAIYAN & DIXIT (1996) stellten sich die Frage, wo in der Zelle die Caspasekaskade lokalisiert ist. Enukleierte Zellen zeigten nach verschiedenen Todesstimuli morphologische Veränderungen, die mit apoptotischen Veränderungen assoziiert waren. Dies führte zu der Vermutung, daß die Todesmaschinerie außerhalb des Nukleus lokalisiert ist. 37 2.4.3 Apoptose bei neutrophilen Granulozyten Durch bestimmte in vivo Mechanismen wird einerseits in einer normalen, nicht pathogenetischen, Situation die Schädigung des Gewebes durch Neutrophile verhindert, andererseits wird die Aktivität der Neutrophilen, in einer Situation, wie einer bakteriellen Infektion, gestärkt (TSUCHIDA et al. 1995). Wenn die Apoptose von Neutrophilen als ein Weg angesehen wird, ungewollte Zellen zu eliminieren, wie im Thymus oder bei der Entwicklung von Nervengewebe, so können Neutrophile auf diesem Weg daran gehindert werden, normalem Gewebe durch die Produktion von aktiven Sauerstoffradikalen und proteolytischen Enzymen zu schaden. Auf der anderen Seite mag es sinnvoll sein, daß Neutrophile bei bakteriellen Infektionen in den Entzündungsbereichen lange genug überleben, um Bakterien zu phagozytieren und zu töten. In der Summe wird mittlerweile die Apoptose als Kontrollmechanismus zur Regulation der Aktivität von neutrophilen Granulozyten angesehen (FANNING et al. 1999). Zytokine wie das TNF-α induzieren, andere Zytokine (GM-CSF, IL-1, IL-8 und IFN-γ) verhindern in vitro die Apoptose von humanen neutrophilen Granulozyten. Diese Ergebnisse legen den Schluß nahe, daß die Apoptose der Neutrophilen zum Großteil über Zytokine und Chemokine gesteuert wird (TSUCHIDA et al. 1995). Allerdings ist auch ein autokriner Tod der Neutrophilen durch ihre konstitutive CoExpression von CD95 (Fas) und Fas-Ligand auf ihrer Zelloberfläche beschrieben (LILES et al. 1996). Neutrophile sind hochempfindlich gegenüber einer Induktion einer Fas-vermittelten Apoptose in vitro nach Stimulation mit einem Antikörper gegen Fas. Allerdings kann die Fas-vermittelte Apoptose auch durch Inkubation mit z.B. G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, TNF-α oder Dexamethason unterdrückt werden (LILES et al. 1996). In vitro wurde bei Neutrophilen eine dramatische Hemmung der Apoptose beobachtet, wenn Thrombozyten anwesend waren. Der dafür verantwortliche Mechanismus konnte jedoch nicht definiert werden (ANDONEGUI et al. 1997). WHYTE et al. (1993) zeigten, daß apoptotische neutrophile Granulozyten eine verminderte Phagozytose, eine verminderte Degranulation und eine Reduktion der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies aufwiesen. Da die Abgabe von toxischen Produkten durch aktivierte Neutrophile zu Gewebeschädigung und zu chronischen Entzündungen führen kann, belegen diese Befunde den entzündungshemmenden Effekt einer Apoptoseinduktion in neutrophilen Granulozyten. 38 Die folgende Tabelle (s. Tab. 1) enthält eine Übersicht über verschiedene Stoffe, für die in der Literatur eine Wirkung auf die Apoptose von Neutrophilen beschrieben wird. Erstaunlicherweise wird den meisten Stoffen eine eher anti-apoptotische Wirkung zugeschrieben. Für die im Rahmen der vorliegenden Arbeit durchgeführten Versuche wurde ein Hauptaugenmerk auf die Substanzen gelegt, für die eine pro-apoptotische Wirkung beschrieben ist. Tab. 1 Übersicht über die Wirkung verschiedener Mediatoren, Substanzen und Mechanismen auf die Apoptose neutrophiler Granulozyten. Anti-apoptotisch a) Pro-apoptotisch Sonderfälle IL-4, IL-6, IL-8, IL-15, IL-10 (16, 7) anti-apoptotisch (6,7) TNF-α pro-apoptotisch (21) kein Effekt (8) GM-CSF, G-CSF (4, 5, 6, 7, 8) ROS (17, 18) PGE2 anti-apoptotisch (9) pro-apoptotisch (22) LTB4 , PAF, LPS (6, 7, 9, 10) Cycloheximide (8, 20) NO anti-apoptotisch (23) pro-apoptotisch (19) Na-Butyrat, Dexamethason, Antioxidantien (5, 11, 12, 13) L-Selektin-Kreuzvernetzung FMLP anti-apoptotisch (6) (14) pro-apoptotisch (3, 10) IFN-γ (1, 2, 3, 7) CD11a/11b- oder CD18Kreuzvernetzung (14, 15) IL-13 kein Effekt (1) a) in Klammern: Zitate: 1) GIRARD et al. 1996; 2) BIFFL et al. 1996; 3) KETTRITZ et al. 1998; 4) HU & YASUI 1997; 5) MOULDING et al. 1996; 6) MURRAY et al. 1997; 7) KEEL et al. 1997; 8) SULLIVAN et al. 1996; 9) KOLLER et al. 1997; 10) HEBERT et al. 1996; 11) STRINGER et al. 1996; 12) MEAGHER et al. 1996; 13) WATSON et al. 1996; 14) WATSON et al. 1997; 15) GINIS & FALLER 1997; 16) COX 1996 ; 17) KASAHARA et al. 1997; 18) LUNDQVIST-GUASTAFSSON & BENGTSSON 1999; 19) FORTENBERRY et al. 1988; 20) WHYTE et al. 1997; 21) GON et al. 1996; 22) WALKER et al. 1997; 23) BANNO et al. 1997. KOLLER et al. (1997) fanden heraus, daß Arachidonsäure und verschiedene Arachidonsäure-Metaboliten an der Regulation der Apoptose neutrophiler Granulozyten beteiligt sind. Dabei führte ein Zusatz von Arachidonsäure zu einem Anstieg der Apoptose, wohingegen Leukotriene und die Hemmung der Prostaglandin-Synthese die Apoptose eher verhinderten. WALKER et al. (1997) konnten dagegen einen 39 anti-apoptotischen Effekt von PGE2 auf neutrophile Granulozyten beobachten. Für NO sind verschiedene Effekte für unterschiedliche Spezies beschrieben (ADLER et al. 1995). FORTENBERRY et al. (1998) weisen NO einen pro-apoptotischen Effekt auf humane Granulozyten zu. 2.4.4 Caspasen und Caspase-Inhibitoren Mitglieder der ICE-Proteasen werden nach neuerer Nomenklatur als Caspasen bezeichnet (ALNEMRI et al. 1996). Das Wort Caspase ist ein Akronym und setzt sich zusammen aus dem C für ein Cystein im aktiven Zentrum und dem asp für die Schnittstelle des aktiven Enzyms (Caspasen schneiden immer hinter einer Asparaginsäure) und dem ase als Zeichen dafür, daß es sich hierbei um ein Enzym handelt. Caspasen spielen eine zentrale Rolle bei der Apoptose von Zellen. Bereits kurz nach dem Signal, das die Apoptose einleitet, kommt es zur Aktivierung der Caspasen. Für eine humane T-Zellinie, die Jurkat-Zellinie, sind auch konkrete Zeiten (s. Abb. 1 in 2.4.1) beschrieben. Die Fas-vermittelte Aktivierung der Caspasen erfolgt bei diesen Zellen in einem Zeitraum zwischen 0-2 Stunden. Einer der zuerst beschriebenen Caspasen, dem Interleukin-1β converting enzyme, das nach neuer Nomenklatur Caspase-1 genannt wird, wird eine wichtige Funktion für das Überleben von neutrophilen Granulozyten zugewiesen, da das Enzym für die Umwandlung der inaktiven Vorstufe des Interleukin-1β in seine aktive Form verantwortlich ist. Interleukin-1β verlängert die Überlebensspanne von neutrophilen Granulozyten (BLISS et al. 1999). Dazu paßt die Beobachtung, daß eine Hemmung der Caspase-1 durch einen Caspase-1-Inhibitor zu einem schnelleren Absterben der Zellen führt (WILLIAM et al. 1998). Das zeigt, daß Caspasen nicht immer und unmittelbar am Prozeß der Apoptose beteiligt sein müssen. Andererseits blockieren Inhibitoren der Caspase-1 oder -3 die Fas- und TNF-induzierte Apoptose, was vermuten läßt, daß beide Proteasen in die Fas- und TNF-R1-vermittelte Apoptose involviert sind (ENARI et al. 1995, LOS et al. 1995, TEWARI & DIXIT 1995, ENARI et al. 1996). Zur Zeit sind 14 verschiedene Caspasen bekannt. Für die meisten existieren außer der fortlaufenden Numerierung mit der Bezeichnung Caspase 1-14 noch weitere Namen, die z.T. auch noch in Gebrauch sind. Besonders häufig findet man in der Literatur die Bezeichnung CPP32 für die Caspase-3 und MACH oder FLICE für die Caspase-8. 40 Caspasen können auf Grund von phylogenetischen Analysen in drei Gruppen eingeteilt werden (SCHULZE-OSTHOFF et al. 1998). Die erste Gruppe, die ICE-ähnlichen Proteasen, enthält die Caspasen 1, 4, 5, 11, 12 und 13; die zweite Gruppe, die Ced-3 Familie, wird gebildet von den Caspasen 3, 6, 7, 8 und 10; die dritte Gruppe der Caspasen besteht aus den Caspasen 2, 9 und 14. Eine andere Möglichkeit, die Caspasen zu gruppieren, ist ihre Einteilung in initiierende (proximale) und ausführende (distale) Caspasen (3, 6, 7, 14); dies geschieht auf der Grundlage ihrer Struktur und der Position in Vermittlung des Todespfades. So ist z.B Caspase-8 die am weitesten proximal zu findende Caspase nach Aktivierung des CD95 (Fas) Moleküls. Daraufhin werden von der aktiven Caspase-8 weitere Caspasen, wie die Caspasen 2, 4, 7, 9, 10 gespalten, die wiederum zu einer Aktivierung der Caspasen 2 und 6 führen können. Die exakte Reihenfolge der Kaskade bei der Durchführung des Todespfades ist bis heute noch nicht vollständig geklärt (SCHULZE-OSTHOFF et al. 1998). Die Kaskade verläuft außerdem unterschiedlich in Abhängigkeit von dem auslösenden Stimulus. Zumindest in vitro können einige Caspasen sich selber und einige auch andere Caspasen aktivieren, so daß Caspasen in der Art einer proteolytischen Kaskade wirken (NAGATA 1997). Caspasen vermitteln die Apoptose durch die Spaltung bestimmter intrazellulärer Proteine, eingeschlossen Proteine des Zellkerns, der Kernmembran, des Zytoskeletts, des endoplasmatischen Retikulums und des Zytosols. Einige dieser gespaltenen Proteine aktivieren ihrerseits andere destruktive Prozesse in der Zelle und helfen so, die Zellen koordiniert und schnell zu töten (CHINNAIYAN & DIXIT 1996). Verschiedene reversible und irreversible Inhibitoren sind für Caspasen beschrieben. Die besten Inhibitoren enthalten bekannte Sequenzen der Caspasesubstrate, die für die Erkennung wichtig sind (NICHOLSON & THORNBERRY 1997). Sie imitieren sie und dienen somit selbst als Substrat. Caspase-Inhibitoren, die in Zellkulturen wirken sollen, müssen membrangängig sein. Angegeben werden die Aminosäuresequenzen der Inhibitoren in dem allgemeingültigen Einbuchstabencode für Aminosäuren. Der in dieser Arbeit eingesetzte Inhibitor für Caspase-1-ähnliche Caspasen hat folgenden Code: Z-VAD-FMK. Hierbei steht das z für eine Benzyloxycarbonyl-Gruppe (GONZALES-MUNIZ et al. 1990), die Sequenz VAD gibt die enthaltenen Aminosäuren an, in diesem Fall V für Valin, A für Alanin und D für Asparaginsäure. Das Kürzel FMK steht für Fluoromethylketon. Inhibitoren, die halogenierte Ketone (z.B. FMK) als endständige Gruppe haben, sind generell irreversibel (NICHOLSON & THORNBERRY 1997). 41 Neben den synthetischen Inhibitoren werden andere, natürlich vorkommende Protein-Inhibitoren beschrieben. CrmA (cytokine response modifier A) ist ein Serpin von einem Kuhpocken-Virus, das die virale Infektion durch die Hemmung der WirtsImmunantwort und durch die Hemmung der Apoptose fördert (RAY et al. 1995). Ein anderes virales Genprodukt ist ein Protein des Baculovirus, das ebenfalls die Apoptose durch Hemmung von Caspasen abschwächt (XUE & HORWITZ 1995, BUMP et al. 1995). Die Familie der IAP (inhibitor of apoptosis) enthält eine dritte Gruppe von Polypeptiden, die ebenfalls den Zelltod verhindern. Diese Familie der Inhibitoren gehört zu den endogenen Suppressoren des Zelltodes von Säugerzellen (ROY et al. 1995). Ein weiterer wichtiger Inhibitor des Zelltodes ist die Bcl-2 Familie (s. 2.4.2). 42 3 Geräte, Material und Methoden 3.1 Geräte Aqua dest. Aufbereitungsanlage Umkehr-Osmose Anlage, Kloos, Langenhagen / Hannover Aqua tridest. Aufbereitungsanlage Millipore ZWSO 050 FO, MilliRO4, Milli-Q I Reagent Grade Water System, D 202923084, Fa. Millipore, Eschborn Taunus Autoklav Typ GE406 Getinge AB, Getinge, Schweden Brutschrank mit CO2-Begasung, Baureihe 5060 Heraeus, Hanau Bunsenbrenner mit automatischer Zündung Tecnomara, Fernwald Eismaschine Typ UBE 30-10 Ziegra, Isernhagen Fluoreszenz-Durchflußzytometer, Modell FACScan® , mit angeschlossener Computereinheit Becton Dickinson, Heidelberg Fluoreszenzmikroskop mit Ploemilluminator und Phasenkontrasteinrichtung Zeiss, Oberkochen Heißluftsterilisator Typ ST5050 Heraeus, Hanau Kühlzentrifuge Varifuge K mit Tragwinkelrotor, Hochgeschwindigkeitsaufsatz und Mikrotiterplattenrotor Heraeus, Osterode Laborwaage L310 Sartorius GmbH, Göttingen Magnetrührer mit Heizplatte Janke und Kunkel, Staufen Mikroskop mit Phasenkontrast- und Fluoreszenzeinrichtung Zeiss, Oberkochen Pipetten, einstellbar von 100-1000 µl, 20-200 µl, 10-100 µl, Abimed, Langenfeld 1-20 µl Reinwerkbank Laminair HL 2448 Heraeus, Hanau Röhrchen-Schüttler Typ Reamix ASID, Unterschleißheim Röhrchen-Schwenker Typ Automix ASID, Unterschleißheim Rotationsschüttler für Mikrotiterplatten (IKA Schüttler MTS 4) IKA-Werk, Staufen SG Reinstwassersystem RS 90-4UF SG Barsbüttel 43 Staukette nach Witte Eikemeyer, Tuttlingen Wasserbad mit Temperaturregelung Typ 1003 GFL Hannover Zellzählkammer nach Bürker K.Hecht, Sontheim / Röhn 3.2 Material 3.2.1 Verbrauchsmaterialien Combitips Biopur 2,5 ml, 1,25 ml Renner (13017), Darmstadt Eppendorf-Reaktionsgefäß 1,5 ml Greiner (616201), Frickenhausen Kanülen 0,9 x 40 mm, steril Becton Dickinson (301300450), Heidelberg Perfusionsbesteck mit Flügel (0,8 x 19 mm) Becton Dickinson (38161024), Heidelberg Laborflaschen mit Gewinde, 500 ml Jürgens (9072995), Hannover Mikrotiterplatten, 96-Loch, Rundboden Nunc (439454), Wiesbaden Pasteurpipetten 150 ml Jürgens (9141015), Hannover PD-10 Säulen (Sephadex G-25) Pharmacia Biotech (17085101), Freiburg Pipettenspitzen, gelb und blau Greiner (685290 und 686290), Frickenhausen Röhrchen, 15 ml, Polypropylen Greiner (188261), Frickenhausen Röhrchen, 15 ml, Polypropylen Greiner (227261), Frickenhausen Röhrchen für die Durchflußzytometrie, 5 ml Becton Dickinson (2008), Heidelberg Rundboden-Mikrotiterplatten, 96 Vertiefungen, steril Nunc (163320), Wiesbaden Sterilfilter, 0,22 µm Porenweite Renner (06001), Darmstadt Vacutainer Brand Luer Adapters Becton Dickinson (367300), Heidelberg Vacutainerröhrchen, 10 ml, Heparin beschichtet Becton Dickinson (368480), Heidelberg Vacutainerröhrchen, 10 ml, EDTA beschichtet Becton Dickinson (368457), Heidelberg Zellkulturflaschen, 260 ml Nunc (147589), Wiesbaden 44 3.2.2 Reagenzien Akridinorange Fluka (01662), Neu Ulm Albumin, bovine, Fraktion V, 98% pulverisiert Roth (80762), Karlsruhe (BSA, bovines Serumalbumin) Brefeldin A (Eupenicillium brefeldianum) Calbiochem-Novabiochem (203729), Bad Soden Caspase-1-Inhibitor (Z-VAD-FMK) Calbiochem-Novabiochem (627610), Bad Soden Caspase-2-Inhibitor (AC-VDVAD-CHO) Alexis (260058M001), Grünberg Caspase-8-Inhibitor (Z-IETD-FMK) Calbiochem-Novabiochem (218759), Bad Soden Dimethylsulfoxid (DMSO) Baker (7157), Deventer, Holland Ethanol, absolut Riedel-de Häen (32205), Seelze Ethidiumbromid Sigma-Aldrich (E87A51), Deisenhofen Fetales Kälberserum, Virus und Mykoplasmen Biochrom (S0115), Berlin getestet Ficoll, isoton, Dichte 1,077 g/ml Biochrom (L6115), Berlin Fluoreszein Isothiocyanate (FITC) Sigma (F7250), St. Louis, USA Indomethacin Sigma (I7378), Deisenhofen Iscove-Medium Biochrom (T04610), Berlin Methanol Baker (8045), Deventer, Holland Natriumchlorid Roth (9265), Karlsruhe NG-Monomethyl-L-Arginin (Monoacetat) Calbiochem (475886), Bad Soden Paraformaldehyd Sigma (P6148), Deisenhofen Penicillin/Streptomycin Biochrom (A2210), Berlin Percoll (spezifisches Gewicht: 1,130 g/ml) Pharmacia (17089101), Freiburg Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, ohne Ca++ Biochrom (L18210), Berlin /Mg++ Propidiumiodid Calbiochem (537059), Bad Soden Prostaglandin E2 Sigma (P4172), Deisenhofen Staphylokokken-Enterotoxin A, lyophilisiert Boehringer Ingelheim (AT101), Heidelberg Staphylokokken-Enterotoxin B, lyophilisiert Boehringer Ingelheim (BT202), Heidelberg 45 Staphylokokken-Enterotoxin E, lyophilisiert Boehringer Ingelheim (ET404), Heidelberg TNF-α, human, rekombinant Alexis (522008C050), Grünberg Trypsin-EDTA Pan-Biotech (P10024100), Aidenbach 3.2.3 Antikörper und Nachweisreagenzien Antikörper für den Einsatz in der Membranimmunfluoreszenz Monoklonale Antikörper Die Hybridome, welche die murinen monoklonalen Antikörper (mAk) Bo116 (IgM), Bo139 (IgG3κ) und Bo1 (IgG1κ) produzieren, wurden in der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover nach der Immunisierung von Mäusen mit bovinen lymphoblastoiden Zellen des Rindes (nach Transformation mit Theileria annulata) hergestellt (REBESKI 1990, VON DER OSTEN 1990, RÖNSCH 1992). Der mAk Bo139 ist spezifisch für BoLA-DR-Produkte (LANGE 1995). Der mAk Bo1 erkennt bovine MHC-Klasse-I-Moleküle (SCHUBERTH et al. 1992). Eine Zusammenstellung der in der Membranimmunfluoreszenz eingesetzten primären monoklonalen Antikörper, sowie deren Isotypen und Spezifitäten findet sich in der folgenden Tab. 2. Verdünnungen der verwendeten primären Antikörper wurden mit MIF-Puffer (s.S. 52) durchgeführt. 46 Tab. 2 Verwendete monoklonale Antikörper zur Charakterisierung von zellulären Oberflächenstrukturen in der Membranimmunfluoreszenz. mAk Donor / Isotyp Verdünnung Spezifität Bo139 1) Maus IgG3 Zellkulturüberstand unverdünnt bovine MHC-Klasse-II (BoLA-DR) Bo116 2) Maus IgM Zellkulturüberstand unverdünnt neutrophile Granulozyten* Bo1 3) Maus IgG1 Zellkulturüberstand unverdünnt bovine MHC-Klasse-I CC63 4) Maus IgG2a Aszites 1:1000 BoCD8 IL-A11 5) Maus IgG2a Aszites 1:4000 BoCD4 * Das erkannte Molekül auf der Zelloberfläche ist noch nicht charakterisiert. Referenzen: 1) VON DER OSTEN 1990; 2) ZERBE et al. 2000, NAESSENS & HOPKINS 1996; 3) REBESKI 1990; 4) HOWARD et al. 1991; 5) HOWARD et al. 1991, HOWARD & NAESSENS 1993. Nachweisantikörper Als Sekundärantikörper für die indirekte Membranimmunfluoreszenz dienten Ziegeanti-Maus IgG und IgM (schwere und leichte Ketten), affinitätschromatographisch gereinigte, polyklonale Antikörper, absorbiert gegen Human-, Rinder- und Pferdeserumproteine, konjugiert mit Fluoreszeinisothiocyanat (Dianova (115015068), Hamburg, 1,5 mg/ml). Die eingesetzte Verdünnung betrug in der Regel 1:100 (in MIFPuffer, s.S. 52). Zur Herstellung von Referenzzellen (s.S. 61) wurde der Antikörper 1:40 verdünnt. Antikörper zum Einsatz in der Zellkultur Monoklonaler Antikörper gegen humanes TNF-α (blockierend) Es wurde ein muriner monoklonaler Antikörper (IgG1κ) eingesetzt, der in der Lage ist, die Bindung von freiem TNF-α an zelluläre Rezeptoren zu blockieren (anti-humanTNF-α, „TNF-D“, Alexis (804199C100), Grünberg). Dieser Antikörper wurde eingesetzt, um die Rolle von TNF-α für das Superantigen-induzierte selektive 47 Absterben neutrophiler Granulozyten zu untersuchen. Da der Antikörper spezifisch für humanes TNF-α war, wurden diese Untersuchungen im humanen System durchgeführt (s.S. 82). Die vorhandene Lösung (1 mg/ml) wurde zunächst mit PBS verdünnt (100 µg/ml) und bei -28 °C gelagert. Vor dem Einsatz in der Zellkultur wurde diese Lösung mit Kulturmedium (s.S. 48) verdünnt (7 µg/ml) um nach Zugabe von 25 µl zu 150 µl Zellsuspension (pro Vertiefung einer Rundboden-Mikrotiterplatte) auf die benötigte Endkonzentration von 1 µg/ml zu kommen. Monoklonaler Antikörper gegen humanes Fas (blockierend) Es wurde ein muriner monoklonaler Antikörper (IgG2b) gegen humanes Fas (CD95) eingesetzt (anti-human-Fas, mAb SM 1/23, Alexis (805010C100), Grünberg), der in der Lage ist, nach Bindung an das CD95 die Fas-vermittelte Apoptose zu blockieren. Ziel des Einsatzes war die Prüfung der Rolle Fas-vermittelter Prozesse für das Superantigeninduzierte selektive Absterben neutrophiler Granulozyten. (s.S. 83, s. Tab. 4). Die vorhandene Antikörperlösung (1 mg/ml) wurde mit PBS verdünnt (100 µg/ml) und bei -28°C gelagert. Vor dem Einsatz in der Zellkultur wurde diese Lösung mit Kulturmedium (s.S. 48) verdünnt (7 µg/ml) um nach Zugabe von 25 µl zu 150 µl Zellsuspension (pro Vertiefung einer Rundboden-Mikrotiterplatte) auf die benötigte Endkonzentration von 1 µg/ml zu kommen. 3.2.4 Kulturmedien, Puffer und Lösungen Alle Kulturmedien, Puffer und Lösungen wurden, wenn nicht anders angegeben, in Aqua tridest. angesetzt. Zellkulturmedien und Zusätze Die Grundmedien wurden als Trockenmedien bezogen, in Aqua tridest. gelöst und steril filtriert (0,22 µm Porenweite). Das fetale Kälberserum (FCS), als Mediumzusatz, wurde für 1 Stunde bei 56°C inkubiert, um Komplementaktivität zu zerstören und eventuell vorhandene Mykoplasmen abzutöten. Die Kulturmedien wurden bei -28°C gelagert. 48 I10F Medium Dem ISCOVE Grundmedium (mit 584 µg/ml L-Glutamin und 15 µg/ml Phenolrot) wurden folgende Substanzen zugesetzt: NaHCO3 FCS 35,7 µmol/ml 100 µl/ml Trypsin-EDTA Lösung Trypsin-EDTA wurde zum Ablösen in der Mikrotiterplatte verbliebener, adhärenter Zellen eingesetzt. Das als Festsubstanz gelieferte Trypsin-EDTA (s. 3.2.2) wurde zunächst in PBS (s.S. 52) gelöst, dann mit PBS auf das 10-fache der Endkonzentration (0,5 µg/ml) verdünnt, aliquotiert und bei –28°C gelagert. Vor dem Gebrauch wurde ein Aliquot dieser Stocklösung 1:10 mit PBS verdünnt; es wurden 50 µl (50 ng/ml) der Lösung pro Vertiefung einer Rundbodenmikrotiterplatte eingesetzt. Stammlösungen der Superantigene Für die Lymphozytenstimulation und Modulation der neutrophilen Granulozyten wurden die Superantigene SEA, SEB und SEE als 7-fach konzentrierte Lösungen bei -28°C vorrätig gehalten. Hierzu wurden die lyophilisierten Proteine in I10F-Medium auf Konzentrationen von 700 ng/ml bis 7 x 10-7 ng/ml (SEA und SEE) bzw. von 700 ng/ml bis 7 x 10-5 ng/ml (SEB) rekonstituiert und verdünnt. Von den jeweiligen Verdünnungen wurden 25 µl pro Vertiefung einer RundbodenMikrotiterplatte eingesetzt. Bei einem Endvolumen von 175 µl/Rundbodenvertiefung betrug die Endkonzentration somit jeweils 1/7 der eingesetzten Stammlösungen. Stammlösung von NG-Monomethyl-L-Arginin (NMLA) NMLA wurde zur Hemmung der endogenen, induzierbaren NO-Synthese eingesetzt. Die Festsubstanz wurde in Kulturmedium (s.S. 48) gelöst, sterilfiltriert (0,22 µm Porenweite), mit Kulturmedium auf das 7-fache der Endkonzentration verdünnt (7 x 10-3 mmol/ml) und in aliquoten Teilen bei -28°C vorrätig gehalten. Von dem 7-fach Konzentrat wurden 25 µl pro Vertiefung einer Rundboden-Mikrotiterplatte eingesetzt. 49 Stammlösungen von Indomethacin und Ethanol Indomethacin wurde zur Hemmung der PGE2-Synthese (durch Hemmung der Cyclooxigenase-2) eingesetzt. Indomethacin wurde als 7 x 10-3 mmol/ml Lösung in Ethanol 96% angesetzt. Diese Lösung wurde mit Kulturmedium (s.S. 48) 1:100 verdünnt, so daß ein 7-fach Konzentrat der Endkonzentration (7 x 10-5 mmol/ml) vorlag. Für den Einsatz als Lösungsmittelkontrolle wurde Ethanol 96% ebenfalls mit Kulturmedium 1:100 verdünnt. Beide Lösungen wurden in aliquoten Teilen bei -28°C vorrätig gehalten und davon je 25 µl pro Vertiefung einer Rundboden-Mikrotiterplatte eingesetzt. Stammlösung von Prostaglandin E2 Prostaglandin E2 wurde zu 1 mg/ml in Ethanol 96% gelöst und mit Kulturmedium (s.S. 48) auf 2,47 µg/ml oder 7 x 10-6 mmol/ml verdünnt bei -28°C gelagert, um vor dem Einsatz in der Zellkultur mit Medium auf das 7-fache der Endkonzentration verdünnt zu werden. Von der Stammlösung wurden 25 µl pro Vertiefung einer Rundboden-Mikrotiterplatte eingesetzt. Für den Einsatz als Lösungsmittelkontrolle wurde Ethanol 96% ebenfalls mit Kulturmedium 1:100 verdünnt. Stammlösung von Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) Humanes rekombinantes TNF-α wurde zunächst in PBS gelöst, mit Kulturmedium (s.S. 48) auf 5 µg/ml verdünnt und bei -28°C eingefroren. Vor dem Einsatz in der Zellkultur wurde diese Stammlösung nochmals mit dem Zellkulturmedium bis auf das 7-fache der benötigten Endkonzentration von 5 ng/ml verdünnt. Stammlösung von Brefeldin A Brefeldin A wurde zur Hemmung der Sekretion einer Vielzahl von Zytokinen - durch Hemmung der Transportprozesse über den Golgi-Apparat - eingesetzt. Brefeldin wurde zu 10 mg/ml in Methanol gelöst und mit Kulturmedium (s.S. 48) auf eine Konzentration von 0,5 mg/ml verdünnt, aliquotiert und bei -28°C eingefroren. Für den Einsatz in der Zellkultur wurde die Lösung mit Kulturmedium 1:1000 verdünnt, so daß ein 7-fach Konzentrat der Endkonzentration (0,5 µg/ml) vorlag, von dem je 25 µl pro Vertiefung einer Rundboden-Mikrotiterplatte eingesetzt wurden. Für den Einsatz als Lösungsmittelkontrolle wurde Methanol entsprechend mit Kulturmedium verdünnt, so daß ein 7-fach Konzentrat von Methanol (0,005%) vorlag. 50 Dialyse von Brefeldin A-enthaltenden Überständen Die Dialyse von Überständen boviner mononukleärer Zellen, die zuvor für 24h mit SEA (1 ng/ml) in der Anwesenheit bzw. Abwesenheit von Brefeldin stimuliert wurden, erfolgte über PD-10 Säulen (Sephadex G-25) (s. 3.2.1). Zunächst wurden die Säulen mit Kulturmedium (s.S. 48) equilibriert, dann wurden die Überstände nach Angaben des Herstellers aufgetragen und dialysiert. Auf Grund der Methode führte dies zu einer Verdünnung der Überstände (1:1,4). Um die Ergebnisse vergleichen zu können, wurden die als Kontrolle eingesetzten, nicht dialysierten, Überstände entsprechend verdünnt. Caspase-Inhibitoren Die als Festsubstanz gelieferten Caspase-Inhibitoren (vgl. Tab. 3) wurden zunächst in 50 µl DMSO gelöst. Im Anschluß daran wurden sie mit PBS auf eine Konzentrationen von 7 µmol/ml verdünnt, aliquotiert und bei -28°C gelagert. Ein Aliquot dieser Stocklösungen wurde im Bedarfsfall mit Kulturmedium (s.S. 48) auf das 7-fache der benötigten Finalkonzentration verdünnt (350 nmol/ml). Die Caspase-Inhibitoren 1 und 8 sind irreversible Inhibitoren; der Caspase-2-Inhibitor ist ein reversibler Inhibitor. Es wurden 25 µl der Kulturmedium-verdünnten Lösung pro Vertiefung einer RundbodenMikrotiterplatte eingesetzt. Die Endkonzentration eines jeden Inhibitors betrug 50 nmol/ml. Für den Einsatz als Lösungsmittelkontrolle wurde DMSO entsprechend in Kulturmedium verdünnt und jeweils in der höchsten Konzentration 0,9% - in den Ansätzen mit einem equimolaren Gemisch der Caspase-Inhibitoren (c1 + c2) eingesetzt. DMSO hatte in allen Untersuchungen keinen Effekt auf die Morphologie und die Zahl vitaler Granulozyten (Daten nicht gezeigt). 51 Tab. 3 Übersicht über die eingesetzten Caspase-Inhibitoren, ihre Aminosäuresequenz und ihre Spezifität. Caspase- EinbuchstabenInhibitor Code Spezifität Aminosäuresequenz Caspase-1-ähnliche Proteasen (c1, 3, 4, 7) Valin-Alanin-Aspararaginsäure 1 Z-VAD-FMK 2 Ac-VDVAD-CHO Caspase-2 Valin-Asparaginsäure-Valin-AlaninAsparaginsäure 8 Z-IETD-FMK Isoleucin-Glutaminsäure-ThreoninAsparaginsäure Caspase-8, Granzym B Die Zellpermeabilität der Inhibitoren wird durch die hydrophoben Eigenschaften ihrer Seitenketten bestimmt (z: Benzyloxycarbonyl-; Ac: Acetyl-). Inhibitoren mit einer z-Gruppe sind besser zellpermeabel als solche mit einer Ac-Gruppe. Charakteristischerweise haben irreversible Inhibitoren halogenierte Ketone (-FMK: Fluoromethylketon) und reversible Inhibitoren Aldehyde (-CHO) als endständige Gruppe. Material für die Separation von Zellen Ficoll Ficoll (s. 3.2.2) ist eine isotone, wäßrige Lösung eines hochmolekularen Zuckers mit einem Zusatz des Röntgenkontrastmittels Isopaque, das bei 10°C eine Dichte von 1,077 g/ml besitzt. Ficoll wurde unverdünnt verwendet. Percoll Das synthetische Sol Percoll (s. 3.2.2) besteht aus Polyvinyl-Pyrrolidon-beschichteten Silikatpartikeln. Bei 20°C liegt das spezifische Gewicht bei 1,130 g/ml. Die Isotonie der Percoll- Ausgangslösung wurde durch die Zugabe von 0,67% NaCl erreicht. Diese Lösung wird als 100%iges Percoll bezeichnet. Durch Zugabe von 0,9%iger Natriumchloridlösung wurde das 100% Percoll® auf 70% verdünnt. 52 Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) Hierzu wurde die PBS-Trockensubstanz (s. 3.2.2) in Aqua tridest. gelöst. Der Puffer hatte einen pH-Wert von 7,4. Die Konzentrationen der Bestandteile waren: NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 137,0 2,7 8,1 1,12 µmol/ml µmol/ml µmol/ml µmol/ml Bei der doppelt konzentrierten Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung (2 x PBS) wurde doppelt soviel Trockensubstanz pro Volumen Aqua tridest. eingesetzt. Lösungen zum Fixieren und Auszählen von bovinen Zellen Paraformaldehydlösung zum Fixieren von Referenzzellen (s.S. 61) Paraformaldehyd 40 mg/ml gelöst in PBS, gelagert bei 4°C Akridinorange-Ethidiumbromid-Lösung für die lichtmikroskopische Zellzählung Akridinorange 2,5 mg/ml Ethidiumbromid 2,5 mg/ml gelöst in PBS, gelagert bei 4°C Wasch- und Verdünnungspuffer für die Membranimmunfluoreszenz (MIF-Puffer) BSA 5 mg/ml 0,1 mg/ml NaN3 gelöst in 500 ml PBS, aufbewahrt bei 4°C Lösungen für die Durchflußzytometrie Trägerflüssigkeit (Sheath fluid) Als Trägerflüssigkeit für die durchflußzytometrische Messung wurde sterilfiltriertes (0,2 µm) PBS (s.S. 52) mit 0,1 mg/ml NaN3 (Natriumazid) verwendet. 53 Propidiumiodidstammlösung Propidiumiodid 100 µg/ml gelöst in Trägerflüssigkeit Die Stammlösung wurde in aliquoten Teilen bei –28°C gelagert. Zum Anfärben toter Zellen wurden der Trägerflüssigkeit 20 µl Propidiumiodidstammlösung pro ml zugesetzt (Endkonzentration 2 µg/ml). 3.2.5 Staphylococcus aureus Isolate Milchproben von Kühen mit Mastitis wurden in der Klinik für Gynäkologie und Geburtshilfe des Rindes mikrobiologisch untersucht (freundlicherweise von Frau Dr. Bleckmann durchgeführt). Die Proben wurden auf Blutagarplatten ausgestrichen und für 24h bei 37°C kultiviert. Die S. aureus-positiven Proben wurden auf Penicillin-Resistenz, Koagulase und Clumping Faktor untersucht. Der Nachweis der Koagulase erfolgte durch Einreiben einer Kolonie in 0,5 ml 1:3 verdünnten Citratplasmas vom Kaninchen; die Probe wurde für 24h bei 37°C inkubiert. Bei positivem Ergebnis war die Mischung koaguliert. Die Untersuchung auf den Clumping Faktor wurde mit Hilfe des Staphylase Test Kits (Oxoid, DR595, Hampshire, England) durchgeführt. Der Test weist die Anwesenheit des Clumping Faktors durch die Agglutination von an Schaf-Erythrozyten gekoppeltem Kaninchen-Fibrinogen nach. Zellkulturüberstände von Staphylococcus aureus Jeweils eine Kolonie-bildende Einheit wurde in 7 ml gepufferte Bouillon (mit 1% Fleischpepton, 1% Trockenfleischextrakt, 1% Dextrose, pH 7,4; Merck) überführt und für 24h bei 37°C inkubiert. Im Anschluß daran wurden die Ansätze bei 8000 xg zentrifugiert, die Überstände abgenommen, steril filtriert, aliquotiert und bis zum weiteren Verbrauch bei –100°C eingefroren. Sie wurden in Abhängigkeit vom Versuchsansatz unverdünnt oder in Verdünnungen bis zu 1 x 10-6 eingesetzt. Von den jeweiligen Verdünnungen wurden 25 µl pro Vertiefung einer RundbodenMikrotiterplatte eingesetzt. Für einige Experimente wurden die Überstände Hitze-inaktiviert, indem ein Aliquot (1 ml) jedes Überstandes, enthalten in 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäßen (s. 3.2.1), für 30 Minuten im Wasserbad bei 60°C gehalten wurde. 54 3.2.6 Tiere und humane Probanden Bei allen Tieren, denen Blut zur Zellgewinnung entnommen wurde, handelte es sich um „Deutsche Schwarzbunte“, Typ Holstein-Friesian. Das Alter lag zwischen 1,5 und 12 Jahren. Die klinisch gesunden Rinder stammten aus der Klinik für Geburtshilfe und Gynäkologie des Rindes, der Klinik für Rinderkrankheiten und der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Für die Gewinnung von humanem Blut standen freiwillige, männliche und weibliche, Mitarbeiter (Alter zwischen 20 und 40 Jahre) der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule zur Verfügung. 3.3 Methoden 3.3.1 Isolierung mononukleärer und polymorphkerniger Zellen aus gerinnungsgehemmtem Blut Vollblut vom Rind wurde durch Punktion der Vena jugularis in sterilen Heparin- oder EDTA-enthaltenden Blutentnahmeröhrchen (Vacutainersystem, s. 3.2.1) gewonnen. Von Menschen wurde das Vollblut durch Punktion der in der Armbeuge gelegenen Venen, V. cephalica, V. mediana antebrachii oder V. cubitalis medica, in sterilen EDTA-enthaltenden Blutentnahmeröhrchen (Vacutainersystem, s. 3.2.1) gewonnen. Danach wurde eine von zwei unterschiedlichen Zellseparationstechniken, bei denen es sich in beiden Fällen um eine Dichtegradientenzentrifugation handelte, durchgeführt. Zur Gewinnung von hochreinen neutrophilen Granulozyten wurde beim Rind die Separation über Percoll, ansonsten wurde die Separation über Ficoll durchgeführt. Aus humanem Blut wurden Granulozyten und mononukleäre Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation über Ficoll gewonnen. Separation mittels Ficoll Zur Isolierung der Zellen wurde das Blut zunächst 1:2 mit PBS verdünnt. In einem Zentrifugenröhrchen (50 ml) wurden 15 ml Ficoll-Isopaque-Lösung (spezifische Dichte 1,077 g/ml, 10°C) vorgelegt, dann 30 ml verdünntes Vollblut darüber 55 geschichtet und zentrifugiert (30 min, 10°C; Rind: 1100 xg, Mensch: 700 xg). Auf Grund der spezifischen Dichte der mononukleären Zellen sammelten sie sich zusammen mit Thrombozyten, als sogenannte Interphase, zwischen Plasma und Ficoll, während Erythrozyten und Granulozyten sich als Pellet am Röhrchenboden absetzten. Gewinnung der mononukleären Zellen aus der Ficoll-Separation Die Interphase wurde vorsichtig abgesaugt und in ein weiteres Zentrifugenröhrchen (50 ml) überführt. Durch dreimaliges Zentrifugieren mit absteigenden g-Zahlen (430 xg, 250 xg, 80 xg, jeweils 10 min bei RT) wurden die mononukleären Zellen gewaschen und ein großer Teil der Thrombozyten entfernt. Die Ausbeute an mononukleären Blutzellen betrug bei diesem Verfahren 1 bis 2 x 106 pro ml Vollblut. Nach dem letzten Waschschritt wurde das Pellet der mononukleären Zellen in Zellkulturmedium aufgenommen. Im Durchflußzytometer (s. 3.1 und 3.3.3) wurde die Vitalität der Blutzellen und die Reinheit der separierten Zellpopulation beurteilt. anhand der durchflußzytometrischen Charakteristika wurde sowohl der Anteil mononukleärer Zellen an der separierten Zellpopulation als auch der Anteil lebender, also propidiumiodidnegativer Zellen, bestimmt. Er betrug immer über 90%. Nach einer Färbung mit Akridinorange und Ethidiumbromid wurde mit dem Fluoreszenzmikroskop in der Bürkerkammmer die Zahl vitaler Zellen bestimmt (s.S. 58) und die Zellsuspension auf eine Konzentration von 2 x 106/ml eingestellt. Der in der Zellsuspension mononukleärer Zellen enthaltene Anteil an Thrombozyten schwankte in einem weiten Bereich (16% bis 88%, s. Abb. 11). 56 Seitwärtsstreulicht (SSC) A) B) R1 R2 Rgesamt Vorwärtsstreulicht (FSC) Abb. 3 Durchflußzytometrische Darstellung der Population mononukleärer Zellen und Thrombozyten nach Separation über einen Dichtegradienten. Bovine mononukleäre Zellen wurden durch Dichtegradientenzentrifugation aus gerinnungsgehemmten Vollblut isoliert (s.S. 55). Die Prüfung auf Reinheit und Zusammensetzung erfolgte nach durchflußzytometrischer Erfassung und korrelierter Darstellung von Vorwärtsstreulicht (FSC) gegen Seitwärtsstreulicht (SSC). A) Erfassung von FSC und SSC im linearen Modus. B) Erfassung von FSC und SSC im logarithmischen Modus zur gleichzeitigen Darstellung von Thrombozyten (Region 2, R2) und leukozytären Zellen (Region 1, R1). Der Anteil der Thrombozyten an der Gesamtheit (Rgesamt) der dargestellten Ereignisse liegt in dem gezeigten Beispiel bei 80%. Gewinnung der Granulozyten nach der Separation über Ficoll Das Zellpellet unter dem Ficoll® setzt sich zusammen aus Granulozyten und Erythrozyten. Die Erythrozyten wurden durch hypotone Lyse entfernt. Dazu wurden 20 ml Aqua tridest. zu dem Zellpellet in das Röhrchen gegeben und dieses für 20 Sekunden geschwenkt. Die Isotonie wurde mit 20 ml doppelt konzentrierter PBS (2 x PBS, s.S. 52) wieder hergestellt. Im Anschluß wurden die Zellen bei 100 xg zentrifugiert (8 min, 4°C). Um die Erythrozyten vollständig zu entfernen, wurde die Prozedur nach Entfernung des Überstands und Resuspension des Pellets wiederholt. Die erhaltene Granulozytenpopulation, zusammengesetzt aus eosinophilen und neutrophilen Granulozyten, war maximal mit 10% mononukleären Zellen verunreinigt. Eine Trennung zwischen neutrophilen und eosinophilen Granulozyten konnte bei der Separation über Ficoll nicht erreicht werden. Die eosinophilen Granulozyten können im Durchflußzytometer anhand ihrer höheren Autofluoreszenz (s. Abb. 4) oder nach indirekter Membranimmunfluoreszenz mit dem mAk Bo116 (s. Tab. 2) eindeutig von diesen differenziert werden (s. Abb. 10). 57 Separation mittels Percoll Für die Gewinnung hochreiner PMN war die Ficoll-Separation nicht geeignet, da - je nach Individuum - der Anteil kontaminierender MNC bis 10% betragen konnte. Um eine hoch reine Population von bovinen neutrophilen Granulozyten zu erhalten, wurde daher die Separation über Percoll durchgeführt. Das durch EDTA gerinnungsgehemmte Blut wurde in Zentrifugenröhrchen (50 ml) gegeben und für 5 Minuten bei 1500 xg und 4°C mit Bremse zentrifugiert. Danach wurde die obere Phase, Plasma, abgesaugt und verworfen. Die Erythrozyten wurden durch hypotone Lyse entfernt. Dazu wurden 20 ml Aqua tridest. zu dem Zellpellet in das Röhrchen gegeben und dieses für 20 Sekunden geschwenkt. Die Isotonie wurde mit 20 ml doppelt konzentrierter PBS (2 x PBS, s.S. 52) wieder hergestellt. Im Anschluß wurden die Zellen bei 100 xg zentrifugiert (8 min, 4°C). Um die Erythrozyten vollständig zu entfernen, wurde die Prozedur nach Entfernung des Überstands und Resuspension des Pellets wiederholt. Im Anschluß wurden die Zellen in ca. 10 ml PBS resuspendiert und in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen über ein Volumen von 4 ml einer 70%igen Percoll-Lösung geschichtet. Die Röhrchen wurden bei 750 xg und 20°C für 25 Minuten ohne Bremse zentrifugiert. Die neutrophilen Granulozyten wanderten dabei durch das Percoll auf den Röhrchenboden, während sich MNC und eosinophile Granulozyten in der Interphase zwischen Percoll und PBS sammelten. War die Population der neutrophilen Granulozyten dennoch mit MNC oder eosinophilen Granulozyten verunreinigt, wurde die Percoll-Separation 2-3x durchgeführt. Bereits nach dem zweiten Durchgang waren keine mononukleären Zellen mehr in dem Zellpellet zu finden, und nach dem dritten war die Population auch frei von eosinophilen Granulozyten. Zuletzt wurden die Zellen noch zweimal mit PBS gewaschen (100 xg, 4°C, 8 min, dekantieren und resuspendieren in frischem PBS) und im Anschluß daran in Kulturmedium resuspendiert. Die unterschiedlichen Reinheitsgrade der gewonnenen neutrophilen Granulozyten nach Ficoll- oder PercollSeparation verdeutlicht die folgende Abb. 4. 58 Seitwärtsstreulicht (SSC) Ficoll Percoll EGZ MNC Grün-Fluoreszenz 1(FL1) Abb. 4 Durchflußzytometrische Analyse der Reinheit von Granulozytenpopulationen nach Separation über zwei verschiedenen Dichtegradienten. Die Separation von bovinen Granulozyten aus gerinnungsgehemmten Vollblut erfolgte entweder über Ficoll oder über Percoll (s.S. 54 und S. 57). Die Konturplots stellen die Grünfluoreszenz (FL1) gegen das Seitwärtsstreulicht dar. Nach Separation über Ficoll (linke Darstellung) lassen sich in der Zellpopulation sowohl mononukleäre Zellen (MNC) als auch neutrophile und eosinophile Granulozyten (EGZ) identifizieren. EGZ lassen sich, bei ähnlichen SSC-Werten, auf Grund ihrer stärkeren Autofluoreszenz von neutrophilen Granulozyten unterscheiden. Nach Separation über Percoll (rechte Darstellung) lassen sich reine neutrophile Granulozyten separieren. 3.3.2 Vitalitätsbestimmung von Zellen Mikroskopie nach Akridinorange/Ethidiumbromid-Färbung Die zu untersuchende Zellsuspension wurde mit einer Akridinorange-EthidiumbromidLösung (s.S. 52) zu gleichen Teilen gemischt. Nach 3 Minuten wurden die Zellen in einer Bürker-Zählkammer (s. 3.1) mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops (s. 3.1) untersucht. Diese Färbemethode stellt eine Kombination zwischen Vitalitätsmessung und morphologischer Differenzierung der Zellen dar. Akridinorange (grünfluoreszierend; s.S. 52) dringt in alle Zellen ein und fluoresziert, nach Interkalierung mit der doppelsträngigen DNA, grün. Dies erlaubt eine grobe Differenzierung der Zellen nach ihrer Kernform. Ethidiumbromid (rotfluoreszierend; s.S. 52) dringt nur in membrangeschädigte Zellen ein und interkaliert dann mit der DNA im Kern. Eine Rotfluoreszenz kennzeichnet mithin tote Zellen. Die Akridinorange-bedingte Grünfluoreszenz wird von der Rotfluoreszenz des Ethidiumbromids überlagert. 59 Durchflußzytometrische Beurteilung der Zellvitalität Geschädigte Zellen zeigen Veränderungen in Größe und Komplexität (s.u.). Außerdem lassen sich Membranintegritätsverluste durch Zugabe des Fluorochroms Propidiumiodid (PI; s. 3.2.2) nachweisen. Nur durch Plasmamembrandefekte gelangt PI ins Zellinnere und interkaliert dort mit der DNA-Doppelhelix. PI-positive Zellen liefern Fluoreszenzsignale in den Detektoren FL2 und FL3 (s. 3.3.3) und unterscheiden sich so von Zellen mit einer intakten Membran. Mit dieser Methode können jedoch tote Zellen, deren zelluläre Struktur soweit zerstört wurde (Zellbruchstücke), daß sie keine DNAReste mehr enthalten, nicht detektiert werden. Somit kann anhand von PI nur über kernbzw. ausreichend DNA-haltige tote Zellen eine Aussage getroffen werden. 3.3.3 Durchflußzytometrie Das Prinzip der Durchflußzytometrie beruht darauf, daß Zellen aus einer Suspension über ein Probenführungssystem vereinzelt werden und dann hintereinander einen Laserstrahl kreuzen. Das dabei gestreute Licht des eingesetzten Lasers mit unveränderlicher Wellenlänge wird in Richtung des Strahls (Vorwärtsstreulicht, Forward Scatter, FSC) und im 90° Winkel dazu (Seitwärtsstreulicht, Side Scatter, SSC) aufgefangen und als elektronisches Signal an den angeschlossenen Computer weitergeleitet. Das Ausmaß der Streuung ist beim Vorwärtsstreulicht abhängig von der Größe und dem Refraktionsindex des Partikels, beim Seitwärtsstreulicht von seiner Komplexität (Oberflächenbeschaffenheit und Granularität). Das hier verwendete FACScan-Durchflußzytometer (Becton Dickinson, Heidelberg) arbeitet mit einem Argonlaser, der Licht einer Wellenlänge von 488 nm erzeugt. Zusätzlich zu den Streulichtdetektoren registriert das Gerät Fluoreszenzlichtemissionen jedes Partikels in drei unterschiedlichen Wellenlängenbereichen. Der Detektor „FL1“ registriert Wellenlängen von 515-545 nm (Grünfluoreszenz). Orangefluoreszenz wird vom Detektor „FL2“ im Bereich 564-606 nm und Wellenlängen >650 nm im roten Spektralbereich werden vom Detektor „FL3“ gemessen. Somit werden pro gemessenem Partikel Werte für fünf verschiedene Parameter (FSC, SSC, FL1, FL2, FL3) erfaßt. Jeder den Laserstrahl passierende Partikel liefert somit bei einer bestimmten Geräteeinstellung entsprechend seiner optischen Eigenschaften ein Datenmuster, das ihn als Meßereignis definiert. Über die angeschlossene Computereinheit werden die Geräteeinstellungen kontrolliert, Meßergebnisse erfaßt und gespeichert (ORMEROD 1990, RADBRUCH 1992). 60 Die computergestützte Auswertung der Daten erfolgte mit dem Programm „WinMDI Version 2.8“ (TROTTER 1999). Es erlaubt die Darstellung eines Parameters gegen die Zahl der gemessenen Ereignisse in Form eines Histogramms oder die Darstellung verschiedener Parameter gegeneinander. Letztere kann u.a. als Konturdiagramm, Punktediagramm oder Dichtediagramm erfolgen. Die Lage der Meßereignisse innerhalb dieser Darstellungen wird durch die Einstellungen des Durchflußzytometers bestimmt. Um eine Vergleichbarkeit der gewonnenen Daten gewährleisten zu können, wurde stets bei gleichen Geräteeinstellungen gemessen. Es lassen sich Untergruppen von Meßereignissen einzeln analysieren, indem innerhalb von Zwei-Parameter-Diagrammen elektonische „Fenster“ (gates) gesetzt werden. Es können mehrere Fenster gleichzeitig gesetzt und auch logisch miteinander verknüpft werden. Auf diese Weise lassen sich auch die Anzahl bestimmter Meßereignisse und der prozentuale Anteil einer Untergruppe an Meßereignissen an der Gesamtereignismenge, sowie der mittlere Wert eines Parameters für eine Ereignisgruppe, ermitteln. Morphologisch ähnliche Zellpopulationen stellen sich in einem korrelierten Diagramm, in dem für jede Zelle der FSC- gegen den SSC-Wert aufgetragen wird, als homogene Wolke dar. Lymphoblasten lassen sich auf diese Weise von ruhenden Lymphozyten auf Grund ihres höheren FSC (und auch SSC) Wertes unterscheiden. In einer korrelierten Darstellung von FSC gegen SSC läßt sich nur eine Granulozytenpopulation erkennen. Eine Unterscheidung von eosinophilen und neutrophilen Granulozyten ist erst nach einer Korrelation von SSC und FL1 möglich. Eosinophile stellen sich auf Grund ihrer höheren Autofluoreszenz in FL1 deutlich weiter rechts, positiver dar (s. 3.3.5, s. Abb. 4 und Abb. 10). Bei der durchflußzytometrischen Messung der verschiedenen Populationen direkt nach der Separation wurden die Daten der Proben sowohl linear als auch logarithmisch aufgezeichnet. In der logarithmischen Darstellung des Seitwärts- und Vorwärtsstreulichtes lassen sich auch die Thrombozyten differenzieren (s. Abb. 3). In der Literatur ist beschrieben, daß Thrombozyten einen Einfluß auf die Apoptose neutrophiler Granulozyten haben. Deshalb sollte der Einfluß der Thrombozyten auf die in dieser Arbeit beschriebenen Effekte untersucht werden. Die aus der Separation gewonnene Population der Granulozyten war immer nahezu frei von Thrombozyten, wohingegen in der Population der mononukleären Zellen zwischen 16% und 88% Thrombozyten enthalten waren. 61 Durchflußzytometrische Quantifizierung der Zahl vitaler Zellen (Referenzzellmethode): Ein Teil der in vitro eingesäten Zellen stirbt im Laufe der Inkubation unter dem Einfluß der Kulturbedingungen und der stimulierenden Signale ab. Daraus resultiert eine unbekannte Zahl vitaler Zellen in Suspension, die dadurch bestimmt werden kann, daß der Zellprobe eine bekannte Anzahl anderer Partikel, in diesem Fall Zellen, zugesetzt wird, die sich in mindestens einem Parameter von den zu messenden Zellen unterscheidet, aber mit den gleichen Geräteeinstellungen gemessen werden kann (Referenzzellen). Setzt man die Zahl der gemessenen, als Referenzzellen identifizierten, mit denen als vitale Zellen identifizierten Zellen ins Verhältnis, so kann auf den absoluten Gehalt vitaler Zellen geschlossen werden. Als Referenzzellen für die Bestimmung der Zahl vitaler Zellen dienten bovine mononukleäre Zellen des Blutes, die mit einem monoklonalen Antikörper gegen bovine MHC-Klasse-I-Moleküle (mAk Bo1, s. Tab. 2) markiert und indirekt mit einem fluorochromgekoppelten Ziege-anti-Maus Antikörper (s.S. 46) gefärbt wurden, so daß sie von den unmarkierten Zellen der Probe im Durchflußzytometer zu unterscheiden waren. Herstellung von Referenzzellen Die Referenzzellen wurden in größeren Mengen markiert, mit Paraformaldehyd fixiert und bei 4°C lichtgeschützt vorrätig gehalten. Dazu wurden je 2 x 107 frisch separierte bovine mononukleäre Zellen des Blutes in einem 15 ml Röhrchen abzentrifugiert (5 min, 80 xg, 4°C), der Überstand dekantiert und das Zellpellet in 100 µl PBS resuspendiert. Die Zellen wurden sodann mit 100 µl des unverdünnten mAk Bo1 (s. Tab. 2) für 15 Minuten bei 4°C inkubiert. Der Inkubation folgte ein Waschen der Zellen (Abzentrifugieren für 7 min, 80 xg, 4°C, Dekantieren des Überstandes) in 5 ml MIF-Puffer (s.S. 52) mit Resuspension des Zellpellets in 100 µl MIF-Puffer. Anschließend wurden die Zellen mit 100 µl FITCkonjugiertem Ziege-anti-Maus Antikörper (s.S. 46) 1:40 in MIF-Puffer verdünnt für 20 Minuten bei 4°C lichtgeschützt inkubiert. 62 Nach einem weiteren Waschschritt mit anschließender Resuspension der Zellen in 5 ml PBS wurde der Inhalt aller Röhrchen in 50 ml Zentrifugenröhrchen überführt, mit PBS auf 50 ml aufgefüllt und abzentrifugiert (15 min, 80 xg, 4°C). Das Zellpellet wurde dann in 30 ml einer 4%igen Paraformaldehyd-Lösung (s.S. 52) resuspendiert und bei 4°C, lichtgeschützt, für 24h inkubiert. Diese Suspension wurde sodann 15 min bei Raumtemperatur abzentrifugiert, der Überstand dekantiert und ein zweites mal mit PBS gewaschen. Das letzte Zellpellet wurde in Trägerflüssigkeit (s.S. 52) mit Propidiumiodid (2 µg/ml, s.S. 53) resuspendiert und auf eine Zellzahl von 4 x 105/ml eingestellt. Vor dem Einsatz der Referenzzellen wurde die Suspension auf die Konzentration der Zellen überprüft und gegebenenfalls korrigiert. Vorbereitung der Proben für die Messung Nach dem Ende der Inkubationszeit wurden die Mikrotiterplatten mit kultivierten Zellen aus dem Brutschrank genommen und für 15 Minuten auf Eis gestellt, um adhärierte Zellen abzulösen. Der Inhalt jeder einzelnen Vertiefung wurde mit dem Volumen einer Pipette durchmischt und komplett in ein 5 ml Röhrchen für die Durchflußzytometrie (s. 3.2.1) überführt. Jeder Probe wurden dann 150 µl einer Lösung aus Trägerflüssigkeit und Propidiumiodid (Endkonzentration des Propidiumiodid 2 µg/ml, s.S. 53) zugesetzt. In Vorversuchen wurde untersucht, ob es nach Stimulation mit Superantigenen zu einer verstärkten Adhärenz von Zellen und somit einem Verbleiben der Zellen in der Platte kommt. Dazu wurden nach dem Herauspipettieren der Zellsuspension, 50 µl Trypsin-EDTA (50 ng/ml) in die Vertiefungen gegeben und für eine Minute bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden 100µl Medium (s.S. 48) hinzugegeben. Der Inhalt wurde ebenfalls in ein für die Durchflußzytometrie vorbereitetes Röhrchen gegeben (s. 3.2.1); zuletzt wurden noch 50 µl der Referenzzellsuspension (s.S. 61) zugesetzt. Nach gründlicher Durchmischung der Proben wurde sie im Durchflußzytometer gemessen. Ermittlung der Zahl vitaler Zellen Für jede Probe wurden 10.000 Meßereignisse erfaßt. Nach der Fixierung der Referenzzellen blieb deren Morphologie weitgehend erhalten, so daß sie im Vorwärtsund Seitwärtsstreulicht die gleichen Charakteristika aufwiesen wie frisch separierte oder kultivierte, vitale bovine mononukleäre Zellen. Das Prinzip der Bestimmung vitaler, kultivierter Zellen ist in Abb. 5 dargestellt und erläutert. Das Prinzip beruht darauf, in verschiedenen Darstellungen derselben Messung eines Gemischs aus Kulturzellen und 63 Referenzzellen, die einzelnen Zellpopulationen durch Setzen von Fenstern (gates) zu identifizieren und die jeweilige Zahl der Meßereignisse (events, E) zu registrieren. Da die eingesetzte Menge an Referenzzellen (ZREF) bekannt ist, ergibt sich die Zahl vitaler Kulturzellen (ZVIT) nach Erfassung der Meßereignisse für vitale Kulturzellen (EVIT) und der Meßereignisse für Referenzzellen (EREF) aus folgender Formel: ZVIT = EVIT x ZREF EREF Für die Angabe des Parameters Zahl vitaler Zellen (ZVIT) wurden die ermittelten Zahlen vitaler Zellen von Dreifachansätzen jeweils gemittelt. 64 R1 B) SSC SSC A) R4 FL3 FL1 R2 D) SSC SSC C) R3 FSC Abb. 5 FSC Durchflußzytometrische Bestimmung der Zahl vitaler Kulturzellen. Bovine Granulozyten (1 x 105) wurden gemeinsam mit mononukleären Zellen (1 x 105) für 24h in vitro inkubiert. Für die quantitative, durchflußzytometrische Analyse wurde dem Ansatz eine definierte Zahl an Referenzzellen sowie Propidiumiodid zugesetzt. In A-D sind unterschiedlich korrelierte Konturplots derselben Messung dargestellt, um die für die Analyse relevanten Zellpopulationen identifizieren zu können. A) Darstellung aller Ereignisse im FL1/SSC Konturplot zur Identifizierung der grünmarkierten Referenzzellen (rechter unterer Quadrant, R4, Region 4). B) Identifizierung der vitalen, Propidiumiodid-negativen Ereignisse (FL3-negativ, R1, Region 1). C) Darstellung aller Ereignisse aus R1 („vitale Zellen“) und Identifizierung von vitalen Granulozyten (R2, Region 2) und vitalen mononukleären Zellen (R3, Region 3). Ereignisse, die links der R3-Zellen liegen, stellen mit hoher Wahrscheinlichkeit apoptotische Zellen dar, die von der Analyse ausgeschlossen wurden. D) Darstellung von Ereignissen, welche die logische Bedingung „R1 und (R2 oder R3)“ erfüllen. Durch Setzen eines Quadranten läßt sich die Anzahl der Meßereignisse für die Populationen mononukleärer Zellen und die der Granulozyten bestimmen. Da zur Messung eine bekannte Zahl an Referenzzellen (R4) zugesetzt wurde, ist es möglich, anhand der im Text erläuterten Formel, die Zahlen vitaler Granulozyten und mononukleärer Zellen zu bestimmen. FSC: Forward Scatter (Vorwärtsstreulicht); SSC: Side Scatter (Seitwärtsstreulicht). 65 3.3.4 Zellkultivierungen in vitro Alle Inkubationen erfolgten in Rundboden-Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen. Als Kulturmedium diente Iscové mit Zusatz von 10% fetalem Kälberserum und 100 I.E./ml Penicillin sowie 100 µg/ml Streptomycin (I10F+, s.S. 48 und 0). Die Gesamtzahl eingesäter Zellen (MNC oder PMN) pro Vertiefung betrug immer 2 x 105 Zellen (s. 3.2.6 und 3.3.1). Wurden Kokulturen von mononukleären Zellen und Granulozyten angesetzt, so wurden pro Zellsuspension 1 x 105 Zellen gewählt. Einzelne Abweichungen von diesem Prinzip werden an entsprechender Stelle im Text erwähnt. Alle individuellen Ansätze erfolgten mindestens in Triplikaten. Prinzipiell betrug das Gesamtvolumen pro Vertiefung einer Platte 175 µl. Dies setzte sich wie folgt zusammen: 100 µl Zellsuspension + 25 µl Superantigen-Stammlösung + 25 µl der gewählten Zusätze + 25 µl Kulturmedium. In Kontrollansätzen wurden fehlende Superantigenlösungen oder fehlende Zusätze durch das gleiche Volumen Kulturmedium ersetzt. Alle Ansätze wurden im Brutschrank (37°C und 5% CO2) zwischen 30 min und 48h inkubiert. Um einen Flüssigkeitsverlust in den Vertiefungen der Platten zur vermeiden standen die Mikrotiterplatten auf einem Aufsatz in Behältnissen mit gesättigter Kupfersulfatlösung. Die Behältnisse waren mit einem durchlöcherten Deckel abgedeckt. Kultivierung von neutrophilen Granulozyten in vitro Ansätze unter Beteiligung von Granulozyten wurden zwischen 30 min und 48h inkubiert. Für die Bestimmung der Zahl mononukleärer Zellen, die zur Induktion des Superantigen-vermittelten Absterbens von neutrophilen Granulozyten notwendig ist, wurden zu 1 x 105 PMN /Vertiefung unterschiedliche Mengen mononukleärer Zellen (2, 4, 6, 8, und 10 x 104) hinzugegeben. Die Modulation der Überlebensrate neutrophiler Granulozyten wurde durch Zugabe von Stammlösungen der StaphylokokkenEnterotoxine A oder B in die Vertiefungen erreicht. Die eingesetzten, finalen Konzentrationen der Superantigene bewegten sich für SEA im Bereich 0,01 fg/ml bis 10 ng/ml, für SEB im Bereich 1 fg/ml bis 1 µg/ml. Ansätze, in denen Zellen nur in Medium, d.h. ohne den Zusatz von Superantigenen inkubiert wurden, dienten als Kontrollansätze für die Bestimmung des spontanen, nicht induzierten Absterbens der Zellen in Kultur. Der Einfluß verschiedener Zusätze auf die Modulation der Überlebensrate wurde durch Zugabe von Stammlösungen der entsprechenden Zusätze zu dem vorgelegten Kulturmedium mit Stimulans untersucht. 66 Kultivierung von Lymphozyten in vitro Im Lymphozytenstimulationstest wurde die Aktivierung boviner mononukleärer Zellen Lymphozyten durch verschiedene Superantigene, sowie die Beeinflussung der Reaktion durch unterschiedliche Zusätze quantifiziert. Die Zellen wurden zwischen 2 und 6 Tagen in vitro kultiviert. Die eingesetzten Superantigenkonzentrationen bewegten sich für SEA im Bereich 0,01 ng/ml bis 100 ng/ml und für SEB zwischen 1 ng/ml und 100 ng/ml. Ansätze mit Zellen in Medium ohne Zusatz von Stimulanzien wurden benutzt, um die Basisstimulation ohne Superantigen festzustellen. Die Ansätze wurden durchgeführt, um den Einfluß von Caspase-Inhibitoren auf die Proliferationsreaktion mononukleärer Zellen zu untersuchen (s. 4.2.3). Überdies wurden die MNC in vitro kultiviert/stimuliert um lösliche Kulturüberstände zu produzieren. Dazu wurden parallele Mehrfachansätze vom MNC zwischen 30 min und 24h inkubiert. Die Überstände einzelner Vertiefungen wurden nach Ende der jeweiligen Zeitspanne gewonnen und bei 4°C bis zu ihrem Einsatz gelagert. Solche Überstände wurden später Granulozytenkulturen zugesetzt, um ihre modulatorische Kapazität für das Überleben von PMN in vitro zu prüfen (s. 4.1.3). Die Aktivierung von Lymphozyten läßt diese aus dem Ruhezustand in den Zellzyklus eintreten. Die Zellen durchlaufen die verschiedenen Phasen des Zellzyklus, in dessen Verlauf es zu einer starken Vergrößerung des Zellvolumens und zur Verdopplung des DNA-Gehaltes der Zelle kommt. Die Gesamtheit der damit einhergehenden Veränderungen wird auch als blastische Transformation bezeichnet. Diese Vorgänge können morphologisch anhand einer Größenzunahme der Zellen bzw. einer Erhöhung des FSC-Wertes im Durchflußzytometer gemessen werden. Die sich an die blastische Transformation anschließende Zellteilung kann zu einer Vermehrung der aktiven Zellen führen. Das Prinzip ist in Abb. 6 dargestellt. Generell wurde dieses Prinzip der Aktivierungsmessung mit der Bestimmung absoluter Zahlen an Zyten und Blasten mit Hilfe der Referenzzellmethode (s.S. 61) kombiniert. Seitwärtsstreulicht (SSC) 67 Zyten Blasten 7% Zyten Blasten 37% Vorwärtsstreulicht (FSC) Abb. 6 Prinzip der durchflußzytometrischen Erfassung der Blastogenese mononukleärer Zellen. Mononukleäre Zellen eines Rindes wurden 6 Tage in vitro ohne Stimulans (linke Abbildung) oder mit dem Superantigen SEE (1 ng/l) (rechte Abbildung) stimuliert. Dargestellt sind korrelierte Dotplots (FSC/SSC). Blastisch transfomierte Zellen lassen sich über die Zunahme der Zellgröße (höherer FSC-Wert) und der Komplexität (höherer SSC-Wert) von kleinen lymphoiden Zellen unterscheiden. 3.3.5 Indirekte Membranimmunfluoreszenz (MIF) Bei dieser Methode werden Oberflächenstrukturen von Zellen von einem für die Struktur spezifischen Antikörper erkannt (s. Tab. 2), der dann wiederum von einem zweiten, fluorochrommarkierten Antikörper (s.S. 46) gebunden wird. Durchführung der Membranimmunfluoreszenz Für die Membranimmunfluoreszenz wurden frisch separierte oder in vitro kultivierte bovine Zellen eingesetzt. Im Fall von frisch separierten Zellen wurden 2 x 105 Zellen pro Vertiefung einer Rundbodenmikrotiterplatte eingesetzt. Wurde der Test an bereits kultivierten Zellen durchgeführt, wurden die Mikrotiterplatten für 15 min auf Eis gestellt, um adhärente Zellen zu lösen. In beiden Fällen wurden die Platte danach abzentrifugiert, der Überstand dekantiert, die Platte kurz aufgerüttelt und die Zellen in den einzelnen Vertiefungen durch Zugabe von 150 µl MIF-Puffer gewaschen (Abzentrifugieren 4 min, 200 xg, 4°C, Dekantieren des Überstands, Platte aufrütteln). 68 Dann wurden 25 µl eines spezifischen monoklonalen Antikörpers aus der Maus (s.S. 45, s. Tab. 2) zu den Zellen pipettiert und für 30 min auf Eis inkubiert. Anschließend erfolgte ein zweimaliges Waschen (Abzentrifugieren 4 min, 200 xg, 4°C, Dekantieren des Überstands, Platte aufrütteln) mit jeweils 150 µl MIF-Puffer (s.S. 52). Zwischen den Zentrifugationsschritten wurde das Zellpellet in den Platten aufgerüttelt. Im Anschluß daran wurde die Platte erneut aufgerüttelt und 25 µl FITC-konjugierter Ziege-anti-Maus-Antikörper (s.S. 46) hinzupipettiert. Die Proben wurden dann lichtgeschützt bei 4°C für 30 min inkubiert. Um die unspezifische Bindung des Sekundärantikörpers auf den Zellen einschätzen zu können, wurden anstelle des ersten Antikörpers 25 µl PBS eingesetzt. Nach weiteren zwei Waschschritten wurden die Zellen in 150 µl Trägerflüssigkeit aufgenommen. Die Trägerflüssigkeit enthielt Propidiumiodid (2 µg/ml, s.S. 53) - zur Identifizierung und zum Ausschluß toter Zellen nach durchflußzytometrischer Analyse. Im Durchflußzytometer wurden für jede Probe mindestens 10.000 Ereignisse erfaßt. Durchflußzytometrische Auswertung der Membranimmunfluoreszenz Das eingesetzte Fluorochrom Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) ist bei 488 nm anregbar (Wellenlänge des FCM-Lasers) und emittiert im Bereich des Fluoreszenzdetektors FL1. Die Messung der Membranfluoreszenz erfolgte im Durchflußzytometer mit stets vergleichbaren Geräteeinstellungen für die einzelnen Fragestellungen. Tote Zellen, die anhand ihrer positiven Rotfluoreszenz (propidiumiodidpositiv, FL3 positiv) zu differenzieren sind, wurden durch das Setzen eines Fensters von der Auswertung ausgeschlossen. Die Analyse erfolgte immer im Vergleich mit der Negativkontrolle in einem korrelierten FL1/SSC Dichtediagramm mit Hilfe einer Quadrantenanalyse. Bestimmt wurden der prozentuale Anteil fluoreszenzpositiver Zellen an der jeweils untersuchten Zellpopulation oder deren mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) (s. Abb. 10). Die Absolutzahl fluoreszenzpositiver Zellen ergab sich aus der in parallelen Kulturen ermittelten Zahl vitaler Zellen (Mittelwert/Referenzzellmethode) multipliziert mit den prozentualen Anteilen Membranfluoreszenz-positiver Zellen. 69 3.3.6 Statistische Verfahren Zur Abschätzung der Wahrscheinlichkeit von Differenzen zwischen Datengruppen wurden der zweiseitige Student´s t-Test oder der gepaarte t-Test (STEEL & TORRIE 1980) eingesetzt. Der bei der Auswertung der absoluten Zahl vitaler Zellen nach Inkubation mit Hitzeinaktivierten Überstände von S. aureus verwendete Median halbiert die nach Größe geordnete Folge der Einzelwerte, so daß gleich viele Meßwerte unterhalb und oberhalb dieses Mittelwertes liegen (KÖHLER et al. 1984). Um festzustellen, inwiefern ein Merkmal von einem anderen abhängig ist (z.B. die Abnahme der Zahl vitaler Zellen von der Größenveränderung mononukleärer Zellen), wurde der Korrelationskoeffizient r berechnet. Vier-Feldertafeln wurden mit dem Chi²Test ausgewertet (STEEL & TORRIE 1980). Die Interassayvarianz ist ein Maß für die Streuung der Meßwerte eines Parameters in zeitlich verschiedenen Untersuchungen. Sie ist ein wichtiger Hinweis auf die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse von Test zu Test. Für ein biologisches System, dessen Reaktionslage in Abhängigkeit von vielen Faktoren prinzipiell inter- und intraindividuell zu Schwankungen neigt, war eine gute Reproduzierbarkeit der Werte für die einzelnen Parameter unterschiedlicher Tests nicht zu erwarten. Daher wurden in dieser Arbeit Interassayvarianzen nicht bestimmt. Die Intraassayvarianz innerhalb einer Untersuchung ist ein Maß für die Streuung der Meßwerte innerhalb desselben Probenansatzes. Dabei wird untersucht, wie stark die Meßwerte bei mehrfacher Messung eines Parameters derselben Probe in Parallelansätzen voneinander abweichen. Für die mit der Referenzzellmethode ermittelte Gesamtzahl vitaler Zellen (s.S. 61) ergab sich für die Einzelansätze von Triplikaten innerhalb eines Ansatzes ein Varianzkoeffizient zwischen 2-10%. Dies gilt sowohl für die Zahl vitaler Zellen in Versuchen, in denen das Superantigen-induzierte Absterben der neutrophilen Granulozyten untersucht wurde, als auch für die in den Stimulationsversuchen erhaltenen Zahlen kleiner oder blastisch transformierter Lymphozyten. 70 4 Ergebnisse Untersuchungen zur Charakterisierung der Interaktion von bovinen neutrophilen Granulozyten und bakteriellen, von S. aureus produzierten, Superantigenen wurden im Rahmen dieser Arbeit durchgeführt. Hierbei galt die besondere Aufmerksamkeit der Modulation der Vitalität neutrophiler Granulozyten und der Beeinflußbarkeit dieses Parameters durch verschiedene Mediatoren. 4.1 Charakteristika des Absterbens boviner neutrophiler Granulozyten in vitro 4.1.1 Einfluß von Superantigenen auf reine PMN Um den direkten Einfluß von Superantigenen auf die Vitalität reiner neutrophiler Granulozyten beurteilen zu können wurden Percoll-separierte Neutrophile (≤ 0,1% MNC, ≤ 2% Eosinophile) (s.S. 57) zwischen 30 Minuten und 48 Stunden in vitro kultiviert. Nach einem Vergleich der nur in Kulturmedium kultivierten Zellen mit denen, die in Anwesenheit von Superantigenen (SEA, SEB) inkubiert wurden, ließ sich kein Unterschied feststellen (s. Abb. 7). Insgesamt blieb die Zahl vitaler Granulozyten zwischen 30 min und 24h weitgehend konstant. Im gezeigten Beispiel sank sie von den nominell eingesetzten 2 x 105 Zellen auf etwa 1,8 x 105 (s. Abb. 7), um nach 48h auf ca. 1 x 105 abzusinken. Obwohl die Zahl überlebender neutrophiler Granulozyten an den gemessenen Zeitpunkten eine starke intra- und interindividuelle Variabilität aufwies (Daten nicht gezeigt) galt auch hierfür, daß die gewählten Superantigene (in einem weiten Konzentrationsbereich) keinen Einfluß auf die Überlebensrate reiner Granulozyten in vitro hatten (vgl. auch Abb. 9A). Ähnliche Beobachtungen wurden ebenso unter Verwendung weniger reiner, Ficoll-separierter Granulozyten gemacht (3% - 5% MNC, 11% -30% Eosinophile, s. Abb. 4) (Daten nicht gezeigt). 71 Inkubationszeiten 30 min 3h 24 h 48 h 200 vitale PMN (x103) 175 150 125 100 75 50 25 1 n SEB g/ m l l 10 SE 0n B g/ m 0,0 SE 1n A g/ m l S 1 n EA g/ m l M ed iu m 0 Abb. 7 Einfluß der Inkubationszeit in vitro und unterschiedlicher Superantigene auf die Zahl vitaler neutrophiler Granulozyten. Percoll®-separierte, hochreine Granulozyten (2x105/Vertiefung) wurden für die angegebenen Zeiten in vitro inkubiert. Parallelansätze enthielten die Superantigene SEA oder SEB in den angegebenen Konzentrationen. Ansätze mit Medium dienten als Kontrolle. Am Ende der jeweiligen Inkubationszeit wurden die Zahlen vitaler Granulozyten durchflußzytometrisch quantifiziert (s.S. 61) (Mittelwerte und Standardabweichungen von Triplikaten). Gezeigt sind die repräsentativen Daten eines Tieres. Die in Abb. 7 gezeigte Abnahme der Zahl vitaler Neutrophiler um 20 x 103 Zellen - bereits nach 30 min Inkubationszeit in vitro - konnte auf einer verstärkten PlastikAdhärenz eines Teils der Zellen beruhen. Daher wurden mit einer Trypsin-EDTALösung (s.S. 62) adhärente Zellen von der Plastikoberfläche abgelöst und durchflußzytometrisch quantifiziert. Hierbei ergaben sich Werte zwischen 1 x 103 und 9 x 103 Zellen pro Ansatz. (Median: 3 x 103 Zellen). Die in den Superantigen-stimulierten Ansätzen durchschnittlich gemessenen Zahlen zusätzlich abgelöster Zellen unterschieden sich nicht von den Zellzahlen aus den unstimulierten Ansätzen. 72 4.1.2 Einfluß von Superantigenen auf neutrophile Granulozyten in Kokulturen von PMN und MNC Nachdem keine direkte Beeinflussung der Vitalität neutrophiler Granulozyten durch Superantigene beobachtet werden konnte, sollte untersucht werden, ob in Kokulturen mit mononukleären Zellen eine Modulation der Granulozytenvitalität zu beobachten ist. Dazu wurden zunächst Ficoll-separierte Granulozyten in Gegenwart variabler Mengen mononukleärer Zellen und einem Superantigen (SEA) inkubiert. Nach 24h konnte beobachtet werden, daß allein die Anwesenheit von MNC im Mittel keinen Einfluß auf die Zahlen vitaler Granulozyten hatten (s. Abb. 8, offene Quadrate). Jedoch reduzierte die zusätzliche Anwesenheit von SEA die Vitalität der Granulozyten deutlich. Ab einem Anteil von etwa 15% MNC an der Mischkultur, sank im gezeigten Beispiel (s. Abb. 8, geschlossene Quadrate) die Zahl überlebender Granulozyten von etwa 100 x 103 auf 30 x 103. Ab einem Anteil von 20% MNC blieb diese Reduktion - um 70% - weitgehend konstant. Somit entscheidet die Anwesenheit mononukleärer Zellen über das Superantigeninduzierte Absterbeverhalten von Granulozyten in vitro. Da diese Ergebnisse mit Granulozytenpopulationen erzielt wurden, die noch einen erheblichen Anteil an eosinophilen Granulozyten enthielten, wurde nun geprüft ob sich der Superantigen-induzierte, Vitalitäts-mindernde Effekt auf neutrophile und/oder eosionophile Granulozyten erstreckt. Überdies wurde gefragt, mit welcher Potenz einzelne Superantigene diesen Effekt in Kokulturen (PMN/MNC) induzieren. In Abb. 9 sind die wesentlichen Resultate zusammengefaßt dargestellt. Wie bereits in Abb. 7 für eine SEA-Konzentration dargelegt, führten weder SEA noch SEB zu einem Vitalitätsverlust reiner Granulozyten in vitro (Abb. 9A). Dies galt über einen weiten Konzentrationsbereich. Ebenso unterschieden sich SEA und SEB nicht prinzipiell in ihrer Fähigkeit, die Vitalität neutrophiler Granulozyten, die in Kokulturen mit MNC inkubiert wurden, negativ zu beeinflussen (Abb. 9B). Die beiden eingesetzten Superantigene zeigten ihre Wirkung allerdings in unterschiedlichen Konzentrationsbereichen. SEA zeigte schon eine deutliche, negative Beeinflussung der Vitalität der Neutrophilen ab einer Konzentration von 10-4 ng/ml. SEB führte erst ab einer Konzentration von 10-1 ng/ml zu einem Absterben der Neutrophilen. 73 vitale PMN (x103) 120 90 60 30 0 0 10 20 30 40 50 60 Anteil der MNC an der eingesetzten Mischkultur (%) SEA Mediumkontrolle Abb. 8 Das beschleunigte Absterben der Neutrophilen in Kokulturen von PMN und MNC. Ficoll-separierte bovine Granulozyten (1 x 105) wurden gemeinsam mit separierten mononukleären Zellen (MNC) desselben Tieres in vitro für 24h inkubiert. Die Anteile an MNC an den Mischkulturen wurde auf 4% bis 54% eingestellt (bzw. kurz vor Inkubationsbeginn durchflußzytometrisch verifiziert). Jede individuelle Kombination aus Granulozyten und MNC wurde in Parallelansätzen mit SEA (0,01 ng/ml) stimuliert. Ansätze mit Medium dienten als Kontrolle. Zahlen vitaler Granulozyten wurden nach Versuchsende durchflußzytometrisch quantifiziert. Dargestellt sind exemplarisch die Daten eines Tieres (Mittelwerte und Standardabweichungen von Triplikaten). Zu beachten ist das Abfallen der Zahlen vitaler Granulozyten in Ansätzen mit SEA ab einer Präsenz von etwa 15% MNC. Die Konzentration, ab der eine negative Beeinflussung der Vitalität neutrophiler Granulozyten auftrat, war individuell verschieden (s. Abb. 9B). So unterschied sich bspw. die SEA-Konzentration, ab der Effekte auf das Neutrophilensterben zu beobachten war, zwischen den beiden gezeigten Tieren um eine Zehnerpotenz (10-4 versus 10-5 ng/ml). 74 160 A) 120 hochreine Neutrophile 80 40 0 50 B) 40 vitale Zellen (x103) 30 Neutrophile Granulozyten 20 10 30 25 Eosinophile Granulozyten 20 15 90 75 Mononukleäre Zellen 60 45 Tier #1 Tier #2 - -4 -3 -2 -1 0 1 2 - -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 SEB log (ng/ml) SEA log (ng/ml) Abb. 9, Legende siehe nächste Seite 75 Abb. 9 Der Effekt der Induktion des Zelltodes durch Superantigene ist sensitiv und selektiv für neutrophile Granulozyten. Bovine neutrophile Granulozyten wurden entweder alleine (2 x 105/Ansatz) oder in Kokulturen mit mononukleären Zellen (je 1 x 105/Ansatz) entweder mit verschiedenen Superantigenen (SEA, SEB) in unterschiedlichen Konzentrationen oder ohne Stimulation für 24h inkubiert. SEA wurde in einem Konzentrationsbereich von 1fg/ml bis 1ng/ml, SEB in einem Bereich von 100 fg/ml bis 100 ng/ml eingesetzt. Dargestellt sind exemplarisch die für zwei Tiere ermittelten Werte aus Kulturen von gereinigten Granulozyten (A) oder Kokulturen von PMN und MNC (B). Die eosinophilen Granulozyten wurden anhand durchflußzytometrisch ermittelter Daten in einer Darstellungen von SSC/FL1 auf Grund ihrer höheren Autofluoreszenz identifiziert (s. 3.3.5). Die Superantigene führten in Abhängigkeit von dem untersuchten Tier, dem eingesetzten Superantigen und seiner Konzentration zum selektiven Absterben der neutrophilen Granulozyten in Kokulturen von PMN und MNC. Die Vitalität der Populationen der eosinophilen Granulozyten und der mononukleären Zellen blieb - ebenso wie die Vitalität alleine inkubierter, reiner Neutrophiler - unbeeinträchtigt von dem Einsatz der Superantigene. Der Einsatz von Ficoll-separierten Granulozyten mit einem größeren Anteil eosinophiler Granulozyten unter den PMN zeigte ebenfalls, daß der granulozytotoxische Effekt von Superantigenen einzig auf die Population der neutrophilen Granulozyten beschränkt war. Die Zahl vitaler eosinophiler Granulozyten sowie die Zahl vitaler MNC blieb nach 24h in vitro über weite Konzentrationsbereiche von SEA und SEB relativ konstant (Abb. 9B). Die Unterscheidung zwischen eosinophilen und neutrophilen Granulozyten erfolgte bis hier auf ihrer unterschiedlichen Eigenfluoreszenz im FL1-Detektor des Durchflußzytometers. Um die Aussage einer selektiven Neutrophilen-Beeinflussung durch Superantigene zu verifizieren wurde nach 3-stündiger und 24-stündiger Kokultur von Granulozyten mit MNC eine indirekte Membranimmunfluoreszenz (s. 3.3.5) mit dem - für Neutrophile spezifischen mAk - Bo116 durchgeführt (s. Abb. 10). Diese Analyse zeigte deutlich, daß nach 24h selektiv die neutrophilen Granulozyten starben, wohingegen die Vitalität der eosinophilen Granulozyten annähernd gleich blieb (s. Abb. 9, Abb. 10). Nach 24h lag der Prozentsatz vitaler neutrophiler Granulozyten (mAk Bo116-positiv) in den Superantigen-stimulierten Ansätzen bei 17%, während er in den Mediumkontrollen bei 48% lag (s. Abb. 10). Diese Analyse läßt ebenso erkennen, daß das Superantigen-induzierte, beschleunigte Sterben neutrophiler Granulozyten nicht sofort einsetzt, sondern erst in einem Zeitraum ab 3h nach Ansatz der Kokultur zwischen PMN und MNC. 76 Medium SEA Seitwärtsstreulicht (SSC) 52% 52% 3h 48% 17% 24h mAk Bo116 Abb. 10 Das Superantigen-abhängige, selektive Absterben neutrophiler Granulozyten in Kokulturen mit mononukleären Zellen. Ficoll-separierte bovine Granulozyten eines Tieres (1 x 105) wurden zusammen mit autologen mononukleären Zellen (1 x 105) für 3h bzw. 24h in Anwesenheit und Abwesenheit von SEA (1 ng/ml) inkubiert. Im Anschluß daran erfolgte eine indirekte Membranimmunfluoreszenz mit dem mAk Bo116 (spezifisch für neutrophile Granulozyten und eine Subpopulation der Monozyten), die durchflußzytometrisch analysiert wurde (dargestellt sind Dichteplots der Grünfluoreszenz versus Seitwärtsstreulicht, nach Ausschluß Propidiumiodid-positiver Ereignisse). Neutrophile Granulozyten befinden sich im oberen rechten Quadranten, eosinophile Granulozyten im oberen linken Quadranten. Mononukleäre Zellen stellen sich im linken unteren Quadranten dar. Der Pfeil im rechten unteren Dichteplot deutet auf eine Population, bei der es sich mit hoher Wahrscheinlichkeit um apoptotische Zellen handelt. Die folgenden Untersuchungen beschäftigten sich mit der Frage, auf welchem Mechanismus der Superantigen-induzierte Effekt des Neutrophilen-Sterbens beruht bzw. welche Faktoren ihn beeinflussen. Zunächst wurde geprüft, welchen Einfluß der variable Anteil an Thrombozyten an den Mischkulturen auf das Neutrophilen-Sterben besitzt (s. Abb. 11, vgl. 2.4.3). Wie bereits auf S. 55 und unter Punkt 3.3.3 erwähnt, konnten Thrombozyten nach Separation der MNC über Ficoll einen Anteil zwischen 16% und 88% an den Zellen haben. 77 Vitale neutrophile Granulozyten (%) (Mediumkontrolle = 100%) 100 80 60 40 20 r = 0,4 (p = 0,002) 0 0 20 40 60 80 100 Anteil der Thrombozyten (%) Abb. 11 Einfluß von Thrombozyten auf die Superantigen-induzierte Reduktion der Zahl vitaler neutrophiler Granulozyten in Kokultur mit mononukleären Zellen. Bovine Granulozyten (1 x 105) wurden in Anwesenheit autologer mononukleärer Zellen (1 x 105) für 24h in Anwesenheit von SEA (1 ng/ml) oder Medium in vitro kultiviert (n = 57). Vor den Ansätzen wurde durchflußzytometrisch der Anteil an Thrombozyten an den eingesetzten Zellsuspensionen ermittelt (x-Achse). Nach 24h wurden die Zahlen vitaler neutrophiler Granulozyten durchflußzytometrisch erfasst und als prozentualer Wert im Vergleich zur Mediumkontrolle auf der y-Achse aufgetragen. Setzte man die jeweils vorhandenen Thrombozytenanteile (16% bis 88%) mit den SEAinduzierten Effekten auf die Neutrophilen-Vitalität in Kokulturen (PMN/MNC) in Bezug zueinander (s. Abb. 11), so zeigte sich eine signifikante, jedoch schwache positive Korrelation (r = 0,4; p = 0,002). So konnte es bei einem Anteil von 16% Thrombozyten zu einer Abnahme der Zahl vitaler neutrophiler Granulozyten auf 23% oder nur auf 62% der Mediumkontrolle kommen. Umgekehrt schwankten die Thrombozytenanteile - bei einer Abnahme der Zahl vitaler Granulozyten auf ca. 60% der Mediumkontrolle - zwischen 16% und 80% (s. Abb. 11). Somit scheint die Anwesenheit von Thrombozyten in den Kokulturen (PMN/MNC) nicht hauptverantwortlich für den Effekt des selektiven, Superantigen-induzierten Absterbens der neutrophilen Granulozyten zu sein. 78 4.1.3 Einfluß von Kulturüberständen Superantigen-stimulierter mononukleärer Zellen auf neutrophile Granulozyten Um zu überprüfen, ob für das Superantigen-induzierte Absterben neutrophiler Granulozyten ein direkter Zell-Zell-Kontakt zwischen mononukleären Zellen und Granulozyten nötig ist, oder ob der Effekt durch lösliche Produkte stimulierter mononukleärer Zellen vermittelt wird, wurden bovine mononukleäre Zellen über verschiedene Zeiträume (30min, 2,5h, 15h, 24h, 120h) mit SEA oder SEB stimuliert. Diese Überstände werden im folgenden als „Superantigen-, SEA- oder SEBkonditionierte“ Überstände bezeichnet. Überstände von MNC, die über einen gleichen Zeitraum nur in Medium kultiviert wurden, werden als „Medium-konditioniert“ bezeichnet. Nach Inkubation hochreiner Granulozyten für 24h in Anwesenheit von SEA- oder SEB-konditionierten Überständen konnte ein deutlicher Verlust der 24h-Überlebensrate neutrophiler Granulozyten beobachtet werden (s. Abb. 12). Bei Tier 1 konnten solche Effekte mit Superantigen-konditionierten Überständen beobachtet werden, die nach 15-stündiger Inkubation der MNC mit Superantigenen induziert wurden (vgl. Abb. 12, SEB 10 ng/ml). Bei Tier 2 führten erst die konditionierten Überstände, die nach 24h gewonnen wurden, zu einem Effekt, der sich von den Medium-konditionierten Überständen unterschied (vgl. Abb. 12, SEB 10 ng/ml). Die unterschiedliche Potenz von SEA und SEB mononukleäre Zellen zu stimulieren, so daß sie granulozytotoxische Faktoren sezernieren, zeigte sich auch in diesem Versuch. Während eine SEB-Konzentration von 10 ng/ml bereits nach 15h solche Faktoren induzierte, konnte dies mit 0,1 ng/ml SEB erst nach >24h erreicht werden (vgl. Abb. 12, Tier 1, SEB). Im Gegensatz dazu wiesen die beiden SEA-Konzentrationen (0,1 und 10 ng/ml) eine vergleichbare Potenz auf. Eine Langzeitinkubation unstimulierter mononukleärer Zellen für 120h resultierte ebenfalls in konditionierten Überständen, welche die Vitalität der neutrophilen Granulozyten reduzieren konnte (z.B. von 140 x 103 auf 110 x 103, Abb. 12, Tier 1, offene Quadrate). 79 Tier #1 Tier #2 180 160 Überstände 140 nicht-konditioniert vitale nPMN (x103) 120 SEA-konditioniert 0.1 ng/ml 10 ng/ml 100 80 60 180 160 140 nicht-konditioniert 120 SEB-konditioniert 0.1 ng/ml 10 ng/ml 100 80 60 0.5 2.5 15 24 120 0.5 2.5 15 24 120 Stunden Abb. 12 Der beschleunigte Tod von neutrophilen Granulozyten kann durch Überstände von Superantigen-stimulierten MNC induziert werden. Mononukleäre Zellen (MNC) eines Tieres wurden für verschiedene, auf der x-Achse dargestellte, Zeiten mit zwei verschiedenen Konzentrationen von SEA (obere Reihe) oder SEB (untere Reihe) inkubiert und die Kulturüberstände gewonnen („konditionierte Überstände“, geschlossene Quadrate). Für jeden Zeitpunkt und jede SEA- und SEB-Konzentration wurden parallele MNC-Kulturen angesetzt. Überstände von nicht stimulierten MNC-Kulturen dienten als Kontrolle („nicht-konditionierte“ Überstände, in der Abbildung durch offene Symbole gekennzeichnet). Hochreine neutrophile Granulozyten zweier Tiere wurden für 24 Stunden in Anwesenheit der MNC-Überstände inkubiert und im Anschluß die Zahl vitaler Zellen durchflußzytometrisch quantifiziert (Mittelwerte und Standardabweichungen der Triplikate). 80 Damit ist der Zeitpunkt des beginnenden Absterbens neutrophiler Granulozyten sowohl vom Spender-Individuum der geprüften Granulozyten als auch von der für die Stimulation eingesetzten Superantigen-Konzentration abhängig. Der früheste Zeitpunkt, an dem genügend granulozytotoxische Faktoren nach Superantigen-Stimulation mononukleärer Zellen freigesetzt werden, lag zwischen 2,5 und 15h (vgl. Abb. 12, Tier 1, 10 ng/ml SEB). Kontrolluntersuchungen zeigten, daß keine Unterschiede zwischen konditionierten Überständen autologer oder allogener Superantigenstimulierter MNC bestanden (Daten nicht gezeigt). In der Summe lassen diese Ergebnisse den Schluß zu, daß der Superantigenvermittelte beschleunigte Zelltod neutrophiler Granulozyten nicht von einer Zell-ZellInteraktion zwischen Granulozyten und mononukleären Zellen abhängt, sondern durch lösliche Produkte mononukleärer Zellen vermittelt wird. 4.1.4 Der Einfluß mononukleärer Mediatoren auf die Regulation der in vitro Reaktionen boviner Zellen auf bakterielle Superantigene Da die Überstände Superantigen-stimulierter mononukleärer Zellen zu einem selektiven Absterben der Neutrophilen führen, dieser Vorgang also durch lösliche Produkte vermittelt wird, stellte sich die Frage, welcher Mediator oder welche Mediatoren verantwortlich für diese Reaktion sein könnten. Ausgewählt wurden Prostaglandin E2 (PGE2) und NO, sowie das Zytokin TNF-α und der Fas-Ligand. Die gewählten Mediatoren zeigten zumindest in anderen System eine pro-apoptotische Wirkung auf Granulozyten (s. Tab. 1, vgl. S. 38). Überdies war von PGE2, NO und TNF-α aus früheren Untersuchungen bekannt, daß sie von bovinen mononukleären Zellen nach Superantigen-Stimulation produziert werden (SCHUBERTH 1997, HENDRICKS 1998, SCHUBERTH et al. 1999). Der Einfluß von Prostaglandin E2 (PGE2) und Stickoxid (NO) PGE2 oder Indomethacin, das durch Hemmung der Cyclooxigenase-2 u.a. die endogene Produktion von PGE2 hemmt (s. 2.1.4) oder NMLA, das durch Hemmung der NOSynthetase die endogene Produktion von NO hemmt (s. 2.1.4), wurden zu Kokulturen von Granulozyten und mononukleären Zellen hinzugegeben und für 24h in Anwesenheit bzw. Abwesenheit von SEA inkubiert. Die Ergebnisse sind anhand von zwei repräsentativen Tieren in Abb. 13 als Mittelwerte mit dazugehörigen Standardabweichungen dargestellt. 81 Tier #1 70 Tier #2 vitale PMN (x103) 60 50 40 30 20 SEA (ng/ml) 0 0,01 E 2 PG et ha ci n LA om In d - N M E 2 - PG 0 N M LA In do m et ha ci n 10 Abb. 13 Effekte von Inhibitoren der Stickstoffmonoxid- und der PGE2-Synthese und Effekte exogener PGE2-Zugabe zu Kokulturen von bovinen PMN und MNC. Kokulturen von PMN und MNC (je 1 x 105 Zellen pro Ansatz) wurden mit SEA stimuliert und in der Abwesenheit oder der Anwesenheit von NMLA (1 µmol/ml), einem Hemmer der endogenen NO-Synthese, Indomethacin (10 nmol/ml), welches die endogene PGE2 Synthese hemmt, oder exogen hinzugegebenem PGE2 (100 nmol/ml) für 24h inkubiert. Die Zahl vitaler Neutrophiler wurde durchflußzytometrisch bestimmt. Dargestellt sind die repräsentativen Daten von zwei Tieren. Die Vitalität der neutrophilen Granulozyten wird zwar z.T. moduliert (erhöht bei PGE2-Zugabe und Hemmung der NO-Synthese, erniedrigt bei der Hemmung der PGE2Produktion), aber das Superantigen-induzierte selektive Absterben der Neutrophilen kann nicht aufgehoben werden. Die exogene Zugabe von PGE2 zu unstimulierten Kokulturen (PMN/MNC) steigerte die Zahl vitaler Granulozyten nach 24h in vitro (s. Abb. 13). Dies konnte bei den Granulozyten mehrerer Tiere beobachtet werden. In Abb. 13 sind hierfür 2 Beispiele gezeigt. Damit kann PGE2 im bovinen System prinzipiell anti-apoptotisch für Granulozyten wirken. Der Vitalitäts-mindernde Effekt auf Granulozyten in SEA-stimulierten Kokulturen (PMN/MNC) konnte durch PGE2 jedoch nur teilweise aufgehoben werden: Bei einem Tier (s. Abb. 13, Tier 1) resultierte der Zusatz von PGE2 zu SEA-enthaltenden Ansätzen in 38 x 103 vitalen Granulozyten (ohne PGE2-Zusatz: 20 x 103), bei anderen Tieren (s. Abb. 13, Tier 2) führte die PGE2-Zugabe nicht zu einer Modulation des SEA-induzierten Granulozytensterbens. 82 Die Hemmung der endogenen PGE2-Synthese durch Indomethacin zeigte einen deutlichen Effekt in unstimulierten Kokulturen: Beispielhaft sank die Zahl vitaler Granulozyten bei einem Tier von 38 x 103 auf 18 x 103 Zellen (s. Abb. 13, Tier 2). Dem gegenüber führte der Einsatz von Indomethacin kaum zu einem verstärkten Sterben der Granulozyten nach SEA-Stimulation der Kokulturen (s. Abb. 13). Die Hemmung der endogenen Stickoxid-Bildung durch NMLA (s.S. 48) konnte den Superantigen-vermittelten Vitalitätsverlust der Granulozyten nicht aufheben (s. Abb. 13). Bisweilen führte der Zusatz von NMLA zu einer Erhöhung der Vitalität in den unstimulierten Kokulturen; dies war jedoch kein generelles Phänomen, sondern wurde nur bei einzelnen Tieren beobachtet (vgl. Abb. 13, Tier 1 und Tier 2). Somit erscheint es unwahrscheinlich, daß PGE2 oder NO maßgeblich an der Regulation oder Modulation des Superantigen-induzierten Zelltodes der neutrophilen Granulozyten beteiligt sind. Der Einfluß von Tumor-Nekrose-Faktor-α α (TNF-α α) Für das bovine System spezifische Reagenzien waren zum Zeitpunkt der Untersuchungen nicht zugänglich. Deshalb wurde die Rolle von TNF-α für das Absterben der neutrophilen Granulozyten im humanen System untersucht. Ebenso wie im bovinen System, führten Superantigen-konditionierte Überstände humaner mononukleärer Zellen zum beschleunigten Absterben der humanen neutrophilen Granulozyten. Im Vergleich zur Mediumkontrolle (100%) blieben nach Superantigen-Stimulation 59% der Zellen vital (s. Tab. 4). Humanes rekombinantes TNF-α führte ebenso wie die konditionierten SEAÜberstände zu einer Reduktion der Zahl vitaler Granulozyten nach 24h in vitro (auf 59% der Mediumkontrollen, s. Tab. 4). Die Effekte von TNF-α und SEAkonditionierten Überständen waren nicht additiv: In Kulturen, denen beides zugesetzt wurde, blieben 51% der Granulozyten (im Vergleich zur Mediumkontrolle) vital. Der Einsatz eines blockierenden monoklonalen Antikörpers gegen humanes TNF-α konnte das durch rekombinantes humanes TNF-α (rhTNF-α) induzierte Absterben der neutrophilen Granulozyten nahezu vollständig aufheben: Im Vergleich zur Kontrolle blieben 94% der Granulozyten vital (s. Tab. 4). Die Zugabe dieses Antikörpers zu Kulturen mit SEA-konditionierten Überständen führte nur zu einem partiellen, nicht signifikanten Aufheben des SEA-induzierten Granulozytentodes (von 59% auf 71%; s. Tab. 4). 83 Die Granulozyten der verschiedenen geprüften Individuen reagierten z.T. unterschiedlich auf rhTNF-α und SEA-konditionierte Überstände. So konnte es sein, daß die Zellen durch die SEA-konditionierten Überstände nur schwach, durch rhTNF-α hingegen stark in ihrer Vitalität beeinflußt wurden. Gleiches galt im umgekehrten Sinn. Dies äußerte sich in der großen Streubreite der Ergebnisse (s. Tab. 4). Eine Korrelation zwischen TNF-α- und SEA-konditionierten Überstand-Effekten ergab nur eine schwach positive (r = 0,42) und zudem nicht signifikante (p > 0,2) Beziehung zwischen diesen beiden Parametern. Zusammengenommen wirkten sowohl TNF-α, als auch die SEA-konditionierten Überstände Vitalitäts-mindernd für humane Granulozyten. TNF-α stellt aber nicht das dominante zytotoxische Prinzip in SEA-konditionierten Überständen dar. Einfluß eines monoklonalen Antikörpers gegen humanes Fas Da keine monoklonalen Antikörper gegen bovines Fas zur Verfügung standen, wurden diese Untersuchungen im humanen System durchgeführt. Der Antikörper (anti-Fas (human) MAb (SM 1/23), Alexis (805010C100), Grünberg) hatte die Eigenschaft nach Bindung an Fas die Fas-Fas-Ligand vermittelte Apoptose zu blockieren (s.S. 47). Auf Granulozyten, die in Kulturmedium kultiviert wurden, hatte die Zugabe dieses Antikörpers keinen Einfluß (101% vitale Granulozyten relativ zu den Mediumkontrollen, s. Tab. 4). Ebenso konnte kein modulierender Einfluß des Antikörpers auf den Vitalitäts-mindernden Effekt der SEA-konditionierten Überstände festgestellt werden (vgl. Tab. 4, cSEA: 59% versus cSEA + anti-Fas: 58%). Somit scheint die Sekretion von löslichem Fas-Ligand durch Superantigenstimulierte mononukleäre Zellen nicht die Ursache für das verstärkte Absterben der Neutrophilen zu sein. 84 Tab. 4 Der Effekt von TNF-α α, anti-TNF-α α und anti-Fas auf den Superantigen- vermittelten Zelltod humaner neutrophiler Granulozyten. vitale PMN (x103) Medium 180 ± 25 a 1 in Prozent n 100 11 +TNF-α 105 ± 43 b 59 ± 24 11 +anti-TNF-α 182 ± 35 a 102 ± 5 7 +TNF-α+anti-TNF-α 169 ± 49 b 94 ± 18 7 +anti-Fas 183 ± 29 a 101 ± 10 7 214 ± 26 a 120 ± 16 11 +TNF-α 136 ± 44 b 77 ± 26 7 +anti-TNF-α 190 ± 49 a 109 ± 35 8 cMed +anti-Fas n.d. n.d. 102 ± 31 a 59 ± 24 11 88 ± 27 b 51 ± 20 7 +anti-TNF-α 125 ± 51 a 71 ± 29 11 +anti-Fas 104 ± 28 a 58 ± 16 7 cSEA +TNF-α Humane Granulozyten (PMN) wurden für 24h in Medium oder in konditionierten ZellkulturÜberständen inkubiert. Die Überstände wurden von MNC gewonnen, die zuvor für 24h entweder nur in Medium (cMed) kultiviert oder in Gegenwart von SEA (1 ng/ml, cSEA) stimuliert worden waren. Parallele Kulturen enthielten entweder rekombinantes humanes TNF-α (5 µg/ml), einen monoklonalen Antikörper gegen humanes TNF-α (anti-TNF-α, 1 µg/ml), die Kombination aus TNF-α und anti-TNF-α oder einen monoklonalen Antikörper gegen das Fas-Moleküle (anti-Fas, 1 µg/ml). Zahlen vitaler PMN wurden nach 24h durchflußzytometrisch quantifiziert (s.S. 61). Um individuelle Variationen auszugleichen wurden zudem die Zahlen vitaler PMN, die nach 24h in den Mediumkontrollen ermittelt wurden - für jedes Individuum einzeln - gleich 100% gesetzt und die Zahlen der anderen Ansätze darauf bezogen. 1) Für jeden Block (Medium, cMed, cSEA) wurden die Signifikanzen der Differenzen zu den Mediumansätzen ohne TNF-α, anti-TNF-α und anti-Fas mit dem gepaarten t-test ermittelt. a: p > 0,05, b: p < 0,01). 85 Der Einfluß „Brefeldin-sensitiver“ Mediatoren Brefeldin verhindert die Transportprozesse über den Golgi-Apparat und somit letztlich die Sekretion einer Vielzahl von Zytokinen. Brefeldin wurde eingesetzt, um die Freisetzung der Vitalitäts-mindernden Mediatoren für Granulozyten aus Superantigenstimulierten MNC zu verhindern. Dazu wurden den MNC-Kulturen, die in Medium oder im Beisein von SEA kultviert wurden, Brefeldin zugesetzt. Die so konditionierten Überstände wurden daraufhin dialysiert (PD-10 Säule mit Sephadex G-25, s. 3.2.1) (s.S. 50), da sich in Vorversuchen gezeigt hatte, daß Brefeldin selbst toxisch für Granulozyten war (vgl. auch Abb. 14). Durch die Dialyse wurde die Brefeldin-Toxizität der konditionierten Überstände vollständig aufgehoben. Beispielsweise reduzierte ein Medium-konditionierter Überstand, der in Anwesenheit von Brefeldin erzeugt wurde, die Vitalität der Granulozyten um etwa 45% (cMed, Abb. 14, zweiter Balken). Nach Dialyse der Überstände, war dieser Effekt nicht mehr zu beobachten (cMed, Abb. 14, dritter Balken von links). Im Gegensatz dazu konnte die Dialyse der SEAkonditionierten Überstände, die im Beisein von Brefeldin erzeugt wurden, die Sekretion der granulozytotoxischen Produkte durch die MNC nicht blockieren. Die Ansätzen, in denen Brefeldin enthalten war, sind in Abb. 14 durch ein + in der oberen Reihe und ein – in der unteren Reihe der x-Achsen-Beschriftung gekennzeichnet. Die Dialyse von „normalen“ SEA-konditionierten Überständen minderte leicht den granulozytotoxischen Effekt (s. Abb. 14, cSEA, zweiter Balken von links). Die Anwesenheit von Brefeldin bei der Generierung der cSEA-Überstände führte zu einer Verstärkung des granulozytotoxischen Effektes (s. Abb. 14, cSEA, zweiter Balken von rechts). Jedoch induzierten dialysierte cSEA-Überstände, in denen ursprünglich Brefeldin enthalten war, immer noch das beschleunigte Absterben der Neutrophilen (s. Abb. 14, cSEA, letzter Balken). Da Brefeldin das Superantigen-induzierte Absterben der neutrophilen Granulozyten nicht verhindern konnte, sind vermutlich Brefeldin-sensitive Zytokine nicht für diesen Effekt verantwortlich. 86 cSEA % vitale Neutrophile cMed 100 80 60 40 20 0 - + - + + - + + - + + in Anwesenheit von Brefeldin A mit dialysierten Überständen Abb. 14 Brefeldin A ist nicht in der Lage, die SEA-induzierte Freisetzung von granulozytotoxischen MNC-Mediatoren zu hemmen. Mononukleäre Zellen wurden mit bzw. ohne SEA (1 ng/ml) für 24h in vitro kultiviert und danach konditionierte Überstände gewonnen (cMed, cSEA). Einige Kulturen enthielten Brefeldin A (70 ng/ml; siehe x-Achsenbeschriftung, erste Zeile). Hochreine Granulozyten (2 x 105/ Vertiefung) wurden in der Anwesenheit dieser Überstände für 24h inkubiert und im Anschluß daran die Zahl vitaler Granulozyten durchflußzytometrisch quantifiziert (s.S. 61, Mittelwerte und Standardabweichungen der Triplikate). Parallelansätze der Granulozyten wurden in Anwesenheit dialysierter MNC-Überstände inkubiert (siehe x-Achsenbeschriftung, zweite Zeile). Die Dialyse wurde durchgeführt, um das granulozytotoxische Brefeldin A zu entfernen (s.S. 50). Die Zahl vitaler neutrophiler Granulozyten wurde jeweils auf die Zahl bezogen (in Prozent), die in Ansätzen mit cMed erreicht wurden (ohne Zusatz von Brefeldin A zu den MNC-Kulturen und ohne Dialyse der Überstände; cMed linke Säule). Dargestellt sind die Daten eines repräsentativen Tieres. 87 4.2 Untersuchungen zur modulatorischen Bedeutung von Caspasen Weder die von mononukleären Zellen nach Stimulation mit Superantigenen produzierten Mediatoren (PGE2, NO, TNF-α), noch ein Fas-Fas-Ligand-vermittelter Mechanismus oder Brefeldin-sensitive Zytokine waren verantwortlich für das akzelerierte, Superantigen-induzierte Absterben der neutrophilen Granulozyten. Unter der Hypothese, daß apoptotische, Caspase-vermittelte Vorgänge eine maßgebliche Rolle spielen, wurde im folgenden versucht, das beschleunigte Sterben der Neutrophilen durch den Einsatz von Caspase-Inhibitoren zu modulieren (s. Tab. 5). Die Inhibitoren für Caspase-1-ähnliche Caspasen, für Caspase-2 und Caspase-8 werden im folgenden mit c1, c2 und c8 abgekürzt. 4.2.1 Einfluß von Caspase-Inhibitoren auf die Vitalität reiner neutrophiler Granulozyten in vitro Wurden hochreine PMN für 24h in vitro kultiviert, so führte die Anwesenheit des Caspase-1-Inhibitors, verglichen mit der Mediumkontrolle zu einem marginalen Anstieg der Zahl vitaler Zellen (110% ± 10%; n = 9; p > 0,05). Der Caspase-2-Inhibitor zeigte einen ähnlichen Effekt (104% ± 9%; n = 9, p > 0,05). Ebenso konnte der kombinierte, equimolare Einsatz der Inhibitoren für Caspase-1 und -2 die Zahl vitaler PMN gegenüber den Kontrollansätzen ohne Inhibitoren nicht signifikant erhöhen (104% ± 5; n = 5; p > 0,05). Damit schienen die beiden Caspase-Inhibitoren keinen Einfluß auf die konstitutive Absterberate von bovinen neutrophilen Granulozyten zu haben. Wurden hochreine PMN in Gegenwart konditionierter Überstände (s. 4.1.3) von unstimulierten oder SEA-stimulierten MNC inkubiert, so hatten zugesetzte CaspaseInhibitoren keinen signifikanten Effekt auf die Vitalität der PMN nach 24h in vitro (s. Tab. 5). In diesen Versuchen wurde ebenfalls ein Inhibitor der Caspase-8 eingesetzt, um begleitend zu den Studien unter 4.1.4 (s.S. 83, vgl. Tab. 4) eventuelle Fas-FasLInteraktionen zu modulieren. Interessanterweise führte der Caspase-8-Inhibitor eher zu einer Reduktion der Vitalität von PMN, die in Anwesenheit SEA-konditionierter MNCÜberstände kultiviert wurden: Der Abfall vitaler Zellen von 72% (± 12%) auf 60% (± 10%) (s. Tab. 5) war jedoch statistisch nicht signifikant. 88 Tab. 5 Beeinflussung der Zahl vitaler neutrophiler Granulozyten durch Caspase-Inhibitoren nach Inkubation in Anwesenheit konditionierter Überstände von mononukleären Zellen in vitro. cMed vitale PMN (%) cSEA vitale PMN (%) - 100 (11) 1 - 72 ± 12 (13) a c1 112 ± 15 (8) a c1 69 ± 21 (11) a c2 103 ± 11 (8) a c2 67 ± 15 (11) a c1+c2 114 ± 17 (8) a c1+c2 80 ± 25 (11) a c8 90 ± 9 (4) c8 60 ± 10 (6) a2 a a Hochreine PMN verschiedener Tiere wurden im Beisein konditionierter Überstände (s. 4.1.3) von Medium-kultivierten MNC (cMed) oder SEA-stimulierten MNC (1 ng/ml; cSEA) für 24h in vitro inkubiert. Parallele Ansätze enthielten die Inhibitoren der Caspase 1 (c1), der Caspase-2 (c2), der Caspase-8 (c8), ein equimolares Gemisch des Caspase-1- und des Caspase-2-Inhibitors (c1 + c2) oder Medium (-). Die durchflußzytometrisch ermittelte Zahl vitaler Granulozyten der verschiedenen Ansätze wurde - für jedes Individuum einzeln - auf die in den Ansätzen mit cMed ohne Zusatz ermittelte Zahl bezogen (= 100%). 1) In Klammern: Anzahl der Untersuchungen. 2) Unterschiede zwischen Ansätzen innerhalb der Medium- oder SEA-Ansätze mit gleichen Kleinbuchstaben waren statistisch nicht signifikant (p > 0,05). 4.2.2 Einfluß von Caspase-Inhibitoren auf die Vitalität neutrophiler Granulozyten in Kokultur mit mononukleären Zellen In Kokulturen von PMN und MNC konnte der Caspase-1-Inhibitor und ein equimolares Gemisch aus Caspase-1- und Caspase-2-Inhibitor, den Anteil Propidiumiodid-positiver (PI+, toter) Zellen nach 24h in vitro reduzieren (s. Abb. 15). Dies galt insbesondere für SEA-stimulierte Kulturen. Beispielsweise sank der Anteil erkennbarer toter Zellen nach gleichzeitigem Einsatz des Caspase-1- und Caspase-2-Inhibitors auf insgesamt 11% der Ereignisse (von insgesamt 23% ohne Inhibitoren, vgl. Abb. 15). Der Caspase-2Inhibitor allein hatte keinen Effekt. Ähnliche, wenn auch weniger stark ausgeprägte Effekte zeigte der Caspase-1-Inhibitor in unstimulierten Kokulturen aus PMN und MNC (s. Abb. 15, Medium). 89 SEA (1 ng/ml) Medium 46 2 15 3 Caspase-Inhibitor - Seitwärtsstreulicht (SSC) 11 41 1 20 21 11 7 39 1 20 15 47 1 2 3 18 42 c1 c2 1 c1 + c2 8 10 Propidiumiodid Abb. 15 Einfluß von Capase-Inhibitoren auf den Anteil Propidiumiodid-positiver (toter) Zellen nach In-vitro-Kultur. Kokulturen boviner neutrophiler Granulozyten und mononukleärer Zellen (je 1 x 105 pro Vertiefung) wurden für 24h entweder in Medium oder unter Anwesenheit von SEA (1 ng/ml) in vitro kultiviert. Parallele Ansätze enthielten den Inhibitor der Caspase-1 (c1), den Caspase-2Inhibitor (c2) oder ein equimolares (50 nmol/ml) Gemisch des Caspase-1- und Caspase-2Inhibitors (c1+c2). Dargestellt sind Konturplots (Propidiumiodid-Färbung in Detektor FL3 versus Seitwärtsstreulicht) nach durchflußzytometrischer Analyse. 90 Die beobachtete Reduktion des Anteils Propidiumiodid-positiver Ereignisse nach durchflußzytometrischer Analyse spiegelte sich jedoch nicht in höheren absoluten Zahlen vitaler Granulozyten nach Kokultur wieder. In unstimulierten Kokulturen waren zwar nach 24h bis zu 127% der PMN (im Vergleich zu den Kontrollansätzen vital (vgl. Tab. 6, Medium, c1 + c2); allerdings waren diese Steigerungen nicht signifikant. Der Caspase-1-Inhibitor sowie der Caspase-2-Inhibitor allein vermochten auch nicht die Zahl vitaler Zellen nach SEA-Stimulation von Kokulturen zu steigern (s. Tab. 6, SEA, von 47% auf 59% bzw. 53%). Nur in Ansätzen, die ein equimolares Gemisch der beiden Caspase-Inhibitoren enthielten, wurde ein signifkanter Ansteig der Zahl vitaler Granulozyten beobachtet (s. Tab. 6, SEA, von 47% auf 78%). Tab. 6 Beeinflussung der Zahl vitaler neutrophiler Granulozyten durch Caspase-Inhibitoren in vitro. Medium vitale PMN (%) SEA vitale PMN (%) - 100 (11) 1 - 47 ± 15 (11) a c1 111 ± 18 (11) a c1 59 ± 20 (11) a c2 109 ± 27 (9) a c2 53 ± 22 (9) a c1+c2 127 ± 26 (9) a c1+c2 78 ± 31 (9) b a2 Kokulturen boviner neutrophiler Granulozyten (PMN) und mononukleärer Zellen (je 1 x 105/Vertiefung) wurden für 24h entweder in Kulturmedium (linke Hälfte) oder unter Anwesenheit von SEA (1 ng/ml) (rechte Hälfte) in vitro kultiviert. Parallele Ansätze enthielten jeweils den Inhibitor der Caspase-1 (c1), der Caspase-2 (c2) (je 50 nmol/ml), ein equimolares (50 nmol/ml) Gemisch der beiden Inhibitoren (c1+c2) oder Medium (-). Die durchflußzytometrisch ermittelte Zahl vitaler Granulozyten in Ansätzen wurde auf diejenigen in den entsprechenden Mediumkontrollansätzen (= 100%) bezogen. 1) In Klammern: Anzahl der Untersuchungen. 2) Unterschiede zwischen Ansätzen innerhalb der Medium- oder SEA-Ansätze mit gleichen Kleinbuchstaben waren statistisch nicht signifikant (p > 0,05); unterschiedliche Kleinbuchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede (p < 0,01). 91 4.2.3 Einfluß von Caspase-Inhibitoren auf die Superantigeninduzierte Proliferation boviner mononukleärer Zellen Da die geprüften Caspase-Inhibitoren nur in Kokulturen einen erkennbaren Effekt auf die Vitalität der Granulozyten hatten, wurde im folgenden untersucht, welche modulatorische Kapazität die Inhibitoren für die SEA-induzierte Blastogenese boviner mononukleärer Zellen haben. SEA führte nach 6-tägiger Inkubation mononukleärer Zellen zur Blastogenese (s. Abb. 16, 37% blastisch transformierte Zellen). In Anwesenheit der Caspase-1- oder Caspase-2-Inhibitoren reduzierte sich dieser Anteil auf 20-23% (s. Abb. 16). Ein equimolares Gemisch der beiden Inhibitoren reduzierte diesen Anteil weiter auf 16%. Seitwärtsstreulicht Medium Caspase-1-Inhibitor 37% Caspase-2-Inhibitor 20% Caspase-1-Inhibitor + Caspase-2-Inhibitor 23% 16% Vorwärtsstreulicht Abb. 16 Einfluß von Caspase-Inhibitoren auf die Superantigen-induzierte Proliferation mononukleärer Zellen. Bovine mononukleäre Zellen wurden für 6 Tage in vitro mit SEA (1 ng/ml) stimuliert. Parallele Kulturen enthielten keine weiteren Zusätze („Medium“) oder den Caspase-1-Inhibitor, den Caspase-2-Inhibitor oder ein equimolares Gemisch der beiden Inhibitoren (jeweils 50 nmol/ml). Dargestellt sind Konturplots nach durchflußzytometrischer Analyse (Vorwärts- gegen Seitwärtsstreulicht) - nach Ausschluß aller Propidiumiodid-positiven Ereignisse. Um näher zu analysieren, ob sich diese Reduktion der proliferativen Antwort auf einzelne oder mehrere Subpopulationen boviner mononukleärer Zellen erstreckte, wurde zunächst eine quantitative Bestimmung der Zahl vitaler Zellen nach In-vitroStimulation boviner MNC mit SEA durchgeführt und mittels Membranimmunfluoreszenz die Anteile an CD4+ und CD8+ Zellen unter den Blasten und den kleinen Lymphozyten bestimmt (s. Tab. 7). 92 Bei zwei Rindern, deren CD4+/CD8+ Verhältnisse sich unter den mononukleären Zellen deutlich unterschieden (0,8 und 3,7; Tab. 7, kleine Lymphozyten, kein Zusatz von Inhibitoren) führte der Einsatz des Caspase-1- und Caspase-2-Inhibitors nur zu einer marginalen Steigerung der Zahl CD4+ Zellen (Tab. 7, z.B. Tier 1 von 39 x 103 auf 45 x 103). Die Zahl vitaler CD8+ Zellen - wie auch die der „nicht-T-Zellen“ - blieb bei beiden Tieren konstant (s. Tab. 7). Nach SEA-Stimulation sank das CD4+/CD8+ Verhältnis besonders deutlich in der Population blastisch transformierter Zellen. Dies war Ausdruck der bereits von HENDRICKS et al. (1998) beschriebenen präferentiellen Proliferation von bovinen CD8+ T-Zellen gegenüber CD4+ T-Zellen. Dies galt hier für die stark proliferierenden Zellen des Tieres 1 (64 x 103 Blasten: Summe aus CD4+, CD8+ und nicht-T-Zellblasten, Tab. 7) und die schwächer proliferierenden Zellen des Tieres 2 (34 x 103 Blasten, Tab. 7). Der Einsatz der Caspase-Inhibitoren führte auch hier zu einer Reduktion der Gesamtzahl an Blasten, besonders ausgeprägt bei Tier 1 (s. Tab. 7). Diese Reduktion zeigte sich besonders unter den CD8+ Blasten, was sich ebenso in einem Anstieg des CD4+/CD8+ Verhältnisses unter den Blasten ausdrückte: Bei Tier 1 stieg das Verhältnis von 0,3 auf 0,7; bei Tier 2 von 1,2 auf 1,8 (Tab. 7, Caspase-2-Inhibitor). Die Zahl der „nicht-T-Zellen“ unter den Blasten blieb nach Einsatz der Caspase-Inhibitoren nahezu konstant oder stieg sogar leicht an (vgl. Tab. 7). In den SEA-stimulierten MNCKulturen blieben unter den kleinen Lymphozyten die Zahlen der identifizierten Subpopulationen nach Einsatz der Caspase-Inhibitoren nahezu unverändert gegenüber den Ansätzen ohne Inhibitoren (s. Tab. 7). Nach 6-tägiger In-vitro-Stimulation konnte keiner der eingesetzten CaspaseInhibitoren die absolute Zahl vitaler Zellen anheben. Waren nach SEA-Stimulation bei Tier 1 insgesamt 164 x 103 vitale Zellen (Summe der Subpopulationen unter den kleinen Lymphozyten und den Blasten, Tab. 7) nachweisbar, so resultierte der Einsatz des Caspase-1-Inhibitors in 122 x 103 vitalen Zellen, der Einsatz des Caspase-2-Inhibitors in 140 x 103 vitalen Zellen und der kombinierte Einsatz beider Caspase-Inhibitoren in 119 x 103 vitalen Zellen. 93 Tab. 7 Effekte der Caspase-1- und Caspase-2-Inhibitoren auf die Zahl vitaler CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten in vitro. Tier #1 kleine Lymphozyten (MediumKontrolle) kleine Lymphozyten (SEA) Blasten (SEA) Tier #2 Inhibitor1 CD4+ 2 CD8+ CD4/8 nicht-T3 CD4+ CD8+ CD4/8 nicht-T c1 39 45 48 48 0,8 0,9 58 62 56 61 15 14 3,7 4,4 33 36 c2 45 48 0,9 57 63 16 4,0 37 c1+c2 42 48 0,9 62 64 16 4,0 36 - 24 53 0,5 27 23 10 2,3 18 c1 20 48 0,4 26 22 10 2,2 18 c2 23 51 0,4 29 26 12 2,2 16 c1+c2 19 51 0,4 25 24 11 2,2 16 - 15 45 0,3 4 14 11 1,2 9 c1 7 17 0,4 4 12 7 1,7 9 c2 11 17 0,7 9 16 9 1,8 11 c1+c2 6 12 0,5 6 12 6 1,8 8 Bovine mononukleäre Zellen zweier Tiere wurden 6 Tage in vitro ohne Stimulation (Mediumkontrolle) oder in Anwesenheit von SEA (1 ng/ml) kultiviert. 1) Parallele Kulturen enthielten die Inhibitoren der Caspase-1 (c1), der Caspase-2 (c2) (jweils 50 nmol/ml), ein equimolares Gemisch der beiden Inhibitoren (c1+c2) oder keinen Inhibitor (-). 2) Die absolute Zahl vitaler kleiner Lymphozyten und blastisch transformierter Zellen wurde durchflußzytometrisch quantifiziert (s.S. 61). Über die in der indirekten Membranimmunfluoreszenz bestimmten prozentualen Anteile von CD4+ und CD8+ Zellen an den kleinen Lymphozyten und den blastisch transformierten Zellen wurde dann deren Absolutzahl berechnet (alle Zahlen x 103) (s.S. 68). CD4/8: das Verhältnis der CD4+ zu CD8+ Zellen in der entsprechenden Population. 3) Als „nicht-T-Zellen“ wurden diejenigen definiert, die sich aus der Differenz der Zahl vitaler Zellen und der Summe aus CD4+ und CD8+ Zellen ergaben. Da beide Inhibitoren gleichermaßen die SEA-induzierte Blastogenese (vorwiegend der CD8+ T-Zellen) hemmten (s. Abb. 16, Tab. 7), jedoch nur die Kombination aus Caspase-1- und Caspase-2-Inhibitor die Vitalität von neutrophilen Granulozyten in SEA-stimulierten Kokulturen (PMN/MNC) positiv beeinflußten (s. Tab. 6), läßt sich folgern, daß die beiden gehemmten Caspase (-gruppen) eine differentielle Bedeutung für die MNC-Sekretion Vitalitäts-mindernder Faktoren für neutrophile Granulozyten und die Proliferation boviner MNC besitzen. 94 4.3 Untersuchungen über die Häufigkeit des Auftretens Superantigen- bzw. Leukotoxin-produzierender Staphylococcus aureus Stämme Zwei Gruppen von Virulenzfaktoren (Superantigene und Leukotoxine) spielen vermutlich eine wichtige Rolle in der Pathogenese von Mastitiden, die durch S. aureus hervorgerufen werden. Über die Frequenz Superantigen- und Leukotoxin-bildender S. aureus Isolate ist bisher erst wenig und zudem widersprüchliches bekannt (s. 2.1.4, 2.2). Im folgenden sollte versucht werden, unter Einsatz des beschriebenen quantitativen durchflußzytometrischen Verfahrens, funktionell aktive Superantigene und Leukotoxine in Überständen kultivierter S. aureus Isolate (s. 3.2.5) gleichzeitig nachzuweisen. 4.3.1 Unterschiede zwischen Leukotoxin- und Superantigenproduzierenden Staphylococcus aureus Isolaten Kultivierte man die Überstände von S. aureus Isolaten mit reinen PMN oder mit Kokulturen von PMN und MNC, so konnten unterschiedliche Reaktionsmuster beobachtet werden. Ein Teil der Überstände zeigte keine leukozytotoxische Aktivität. Isolate, die leukozytotoxische Faktoren produzierten, konnten in zwei Gruppen unterteilt werden. Die erste Gruppe enthielt Überstände, die zur Reduktion der Zahl vitaler Granulozyten, sowohl in Kulturen von gereinigten PMN als auch in Kokulturen von PMN und MNC führten (s. Abb. 17, Zeile „LT-SN“): Das Absterben der PMN war nahezu vollständig. Diese Überstände werden im folgenden Leukotoxin-enthaltende Überstände (LT-SNs) genannt. Die zweite Gruppe zeigte ein Reaktionsmuster in Kulturen von PMN und Kokulturen von PMN und MNC, wie es auch bei dem Einsatz von reinem Superantigen beobachtet werden konnte (s. Abb. 17, Zeilen SEA und SAg-SN): Diese Überstände führten zum selektiven Absterben der neutrophilen Granulozyten in Kokulturen von PMN und MNC nach 24 Stunden In-vitro-Kultivierung. In den Ansätzen, in denen PMN alleine mit den Überständen inkubiert wurden, konnte keine Änderung der Zahl vitaler Granulozyten festgestellt werden. Da diese Gruppe dieselben Effekte zeigte wie gereinigte Superantigene, wurden die Überstände operationell Superantigen-enthaltende Überstände (SAg-SNs) genannt. 95 PMN PMN/MNC 81% 43% Seitwärtsstreulicht (SSC) 16% 81% 35% 22% Medium Kontrolle 25% 16% 82% 45% 30% SEA (1ng/ml) 24% SAg-SN 16% 0,7% 40% 36% 0,3% LT-SN 95% 56% 43% FITC-Fluoreszenz Abb. 17 Effekte von S. aureus Überständen auf bovine neutrophile Granulozyten. Hochreine Granulozyten (PMN) wurden entweder alleine (linke Spalte) oder in Kokulturen mit mononukleären Zellen (PMN/MNC, rechte Spalte) für 24h in vitro kultiviert. Die Kulturen enthielten entweder SEA, Überstände von vermutlich Superantigen-produzierenden S. aureus Isolaten („SAg-SN“) oder Überstände von potentiell Leukotoxin-produzierenden S. aureus Isolaten („LT-SN“). Nach 24h wurden die Zellen durchflußzytometrisch, in Anwesenheit von FITC-markierten, fixierten Referenzzellen (s.S. 61), hier im jeweils unteren rechten Quadranten), gemessen. PMN sind in den Abbildungen in den oberen linken Quadranten, MNC in den unteren linken Quadranten dargestellt. Dargestellt sind Dichteplots (Detektor FL1 versus Seitwärtsstreulicht) nach logischer Verknüpfung der Bedingungen: Referenzzellen und vitale, Propidiumiodid-negative Kulturzellen. Für diese Ereignisse sind die Prozentsätze pro Dichteplot angegeben. 96 4.3.2 Frequenz und Eigenschaften von Leukotoxin-enthaltenden Kulturüberständen von Staphylococcus aureus Zweiunddreißig von insgesamt 68 S. aureus Isolaten (47,1%) wurden anhand des oben dargestellten Reaktionsmusters als LT-SNs klassifiziert. Die mediane Verdünnung, bei der weniger als 60% der Neutrophilen im Vergleich zur Mediumkontrolle vital blieben, lag bei 1:7. In Kokulturen (PMN/MNC) lag die mediane Verdünnung bei 1:70 (s. Tab. 8). In wenigen Fällen (3/32) zerstörten LT-SNs auch lymphoide Zellen (Tab. 8): Sie reduzierten die Zahl vitaler Lymphozyten auf ca. 70% der Mediumkontrolle (Daten nicht gezeigt). Leukotoxine konnten im Unterschied zu Superantigenen (s. 4.2.3), mit Ausnahme von 2 Fällen (s. Tab. 8), keine Zunahme der Größe lymphoider Zelle im Vorwärtsstreulicht induzieren (s. Abb. 6). Tab. 8 Zwei Gruppen leukotoxischer Überstände von S. aureus können auf Grund ihres unterschiedlichen Effektes auf die Vitalität neutrophiler Granulozyten identifiziert werden. LT-SN (n=32) A) beeinflußte Zellpopulation n mediane Verdünnung SAg-SN (n=20) n mediane Verdünnung PMN a PMN aus PMN/MNC b Lymphozyten aus PMN/MNC b 32 32 3 1: 1: 1: 7 70 7 0 20 0 1 : 70.000 B) Größenveränderung der Lymphozyten c 2 1: 7 20 1 : 7.000 Überstände kultivierter S. aureus Isolate (n = 68) wurden in finalen Verdünnungen von 1:7 bis 1:7.000.000 zu a) reinen Granulozyten (2 x 105) oder b) Kokulturen von PMN (1 x 105) und MNC (1 x 105) hinzugegeben. A) Die Zahlen vitaler Zellen wurden nach 24h in vitro durchflußzytometrisch bestimmt. Das Abtöten der Neutrophilen oder Lymphozyten wurde als signifikant angesehen, wenn weniger als 60% der in den Mediumkontrollen ermittelten Zellzahlen vital blieben. c) Ein Anstieg um 15 Einheiten (1-1024) im Vorwärtsstreulicht von vitalen Lymphozyten im Vergleich zur Mediumkontrolle wurde als signifikant angesehen. Sechzehn Isolate zeigten weder Leukotoxin- noch Superantigen-ähnliche Eigenschaften. 97 Das LT-SN-induzierte Absterben der PMN konnte bereits kurz nach Beginn der Invitro-Kultur beobachtet werden. Nach 30 Minuten, dem ersten Meßzeitpunkt, waren nur noch 10% ± 7% der PMN vital, nach 2h noch 4% ± 3% (Daten nicht gezeigt). Eine Hitze-Inaktivierung der Überstände (vgl. Abb. 20, 3.2.5) zerstörte das zytotoxische Potential der LT-SNs vollständig (111% ± 4% vitale PMN nach 30 min; 108% ± 3% nach 2h). 4.3.3 Frequenz und Eigenschaften von Superantigen-enthaltenden Kulturüberständen von Staphylococcus aureus Zwanzig der 68 Isolate von S. aureus (29,4%) zeigten ein Superantigen-ähnliches Verhalten. Die mediane Verdünnung, in der die Überstände in vitro noch wirksam waren, lag mit 1:70.000 im Vergleich zu den LT-SNs deutlich höher (s. Tab. 8). Die granulozytotoxische Wirkung auf PMN in Kokulturen mit MNC folgte bei allen getesteten SAg-SNs einer sigmoidalen, dosisabhängigen Kurve, die parallel zu einer dosisabhängigen Kurve verläuft, die man mit gereinigtem SEA erhielt (s. Abb. 18). Gereinigte Superantigene (SEA, SEB) bewirkten nach 24h in vitro - im Vergleich zur Mediumkontrolle - immer einen Anstieg des mittleren Vorwärtsstreulichtes der lymphoiden Zellen (s. Abb. 19A, 4.2.3). Dieser Anstieg war dosisabhängig und hatte individuelle und vom eingesetzten Superantigen abhängige Maximalwerte. Bei Tier 2 erreichte die mittlere Größenzunahme nach Stimulation mit SEA erst bei einer höheren Konzentration (0,1 ng/ml) ein Plateau, als bei Tier 1 (0,001 ng/ml). Diese Superantigeninduzierte Größenzunahme der lymphoiden Zellen nach 24h in vitro wurde ebenfalls bei allen getesteten SAg-SNs beobachtet (s. Tab. 8), und sie korrelierte stark mit zwei wichtigen funktionellen Resultaten. Zum einen mit der Zahl an blastisch transformierten MNC nach 5 Tagen in vitro (s. Abb. 19B, untere Hälfte). Zum anderen korrelierte die Zunahme des Vorwärtsstreulichtes lymphoider Zellen mit der Abnahme der Zahl vitaler neutrophiler Granulozyten nach Kokultur mit MNC in vitro (s. Abb. 19B, obere Reihe). Die Korrelationskoeffizienten dieser Beziehungen konnten bei Verwendung von Zellen verschiedener Tiere schwanken (vgl. Abb. 19B), sie waren jedoch immer hoch signifikant. 98 vitale PMN (% der Mediumkontrolle) 100 80 60 40 20 0 3 2 1 0 -1 -2 -3 -4 SEA log (ng/ml) -1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 SAg-SN log (Verdünnung) Abb. 18 Superantigen-ähnliche Überstände von S. aureus verhalten sich in Kokulturen wie Staphylococcus Enterotoxin A. Kokulturen von bovinen Granulozyten (PMN) und mononukleären Zellen (MNC) (je 1 x 105) wurden für 24h in der Anwesenheit verschiedener S. aureus Überstände (SAg-SN,.n = 7) oder SEA, in den auf der x-Achse angegebenen Konzentrationen, kultiviert. Vitale PMN wurden durchflußzytometrisch quantifiziert. Die Ergebnisse sind als Prozent vitaler PMN im Vergleich zur Mediumkontrolle (100%) dargestellt. Die sigmoidalen Kurven wurden nach Computergestützter Anpassung an die Originaldaten erhalten. Überstände von S. aureus, die zu einem Superantigen-ähnlichen verstärkten Absterben der Neutrophilen in Kokulturen von PMN und MNC führten, zeigten dabei die gleiche Konzentrationsabhängigkeit wie SEA. Damit konnte gezeigt werden, daß SAg-SNs sowohl Proliferations-induzierend wirken, als auch neutrophile Granulozyten in vitro beschleunigt absterben lassen. Diese beiden funktionellen Eigenschaften korrelieren mit der nach 24h in vitro zu beobachtenden Größenzunahme lymphoider Zellen. 99 mean Vorwärtstreulicht der Lymphozyten A) 470 460 Tier #1 Tier #2 450 - vitale PMN (% der Kontrolle) -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 SEB SEA log (ng/ml) log (ng/ml) Tier #1 B) Blasten (x103) (nach 5 Tagen in vitro) - -4 -3 -2 -1 0 1 2 Tier #2 120 120 100 100 80 80 60 chi2: 196 60 chi2: 199 40 40 20 20 0 0 100 100 80 80 60 60 40 40 20 20 r=0,90; n=51; p<0,0001 0 360 370 380 390 400 0 410 370 r=0,71; n=62; p<0,0001 380 390 mittleres Vorwärtsstreulicht der Lymphozyten (nach 24h in vitro) Abb. 19, Legende siehe nächste Seite 400 410 100 Abb. 19 Die durch Superantigen-enthaltende Überstände induzierte Größenzunahme mononukleärer Zellen korreliert mit dem Absterben der neutrophilen Granulozyten und der späten Blastogenese in vitro. A) Bovine MNC von zwei Rindern wurden in der Anwesenheit von SEA oder SEB für 24h in vitro kultiviert. Die mittlere Größe der Zellen (FSC, nach durchflußzytometrischer Messung) wurde gegen die Superantigen-Konzentration aufgetragen. B) Die Zellen von zwei Tieren wurden mit Superantigen-enthaltenden Überständen in verschiedenen Verdünnungen für 24h in vitro kultiviert. In der oberen Reihe sind die Daten aus Kokulturen von PMN und MNC (je 1 x 105/Ansatz) und in der unteren Reihe aus Kulturen von MNC (2 x 105/Ansatz) dargestellt. Nach 24h wurde die mittlere Größe der MNC (FSC, durchflußzytometrisch gemessen) in Korrelation zu der verbleibenden Zahl vitaler PMN (verglichen mit der Mediumkontrolle) gesetzt (obere zwei Diagramme). Die Kurven wurden nach Computergestützter Anpassung an die Originaldaten erhalten. Nach 5 Tagen In-vitro-Kultur wurde die absolute Zahl blastisch transformierter mononukleärer Zellen durchflußzytometrisch bestimmt und in einem Diagramm gegen die mittlere Größe von 24h inkubierten MNC aufgetragen (untere zwei Diagramme, lineare Korrelation). Leukotoxin-enthaltende Überstände von S. aureus beinhalten keine Superantigene Im Gegensatz zu den SAg-SNs induzieren die Leukotoxin-enthaltenden Überstände nur selten (2 von 32) (s. Tab. 8) eine (schwache) Größenänderung der lymphoiden Zellen. Um zu überprüfen, ob die Präsenz von Leukotoxinen die Wirkung von evtl. vorhandenen Superantigenen maskiert, wurde zunächst zu verschiedenen LT-SNs gereinigtes Superantigen hinzutitriert und diese Überstände für 24h mit mononukleären Zellen inkubiert. Im Anschluß daran wurden die Zellen im Durchflußzytometer gemessen. Das mittlere Vorwärtsstreulicht der MNC, die in Anwesenheit von SEA kultiviert wurden, lag bei 395 (Mediumkontrolle: 370). Die LT-SNs (2/32) führten zu einem leichten Anstieg des FSC-Wertes (378 ± 2,5). Die induzierten Vorwärtsstreulicht-Werte durch LT-SNs, denen Superantigen hinzutitriert wurde, lagen bei (395 ± 4,5). Daraus kann gefolgert werden, daß LT-SNs offensichtlich nicht die Aktivität der Superantigene maskieren oder hemmen. Um zu verifizieren, daß tatsächlich keine Superantigene in LT-SNs vorhanden waren, wurden LT-SNs und SAg-SNs für 30 min einer Temperatur von 60°C ausgesetzt (s. 3.2.5). Solcherart behandelte Überstände wurden zu Kulturen von mononukleären Zellen gegeben, die daraufhin 5 Tage in vitro kultiviert wurden. In Abb. 20A ist zu 101 sehen, daß Hitze-behandelte SAg-SNs immer noch ein Proliferations-induzierendes Potential haben. Nach 5 Tagen In-vitro-Kultur lag der Anteil blastisch transfomierter Zellen an der Gesamtheit vitaler MNC zwischen 35% und 50%. Die Hitze-behandelten LT-SNs zeigten keinen Blastogenese-induzierenden Effekt. Dies lag nicht an einem verstärkten Absterben der lymphoiden Zellen durch Hitze-behandelte LT-SNs, da sich die Zahl vitaler Zellen im gleichen Bereich wie die der entsprechenden Mediumkontrollen bewegte (s. Abb. 20B). Das fehlende Blastogenese-induzierende Potential der LT-SNs kann somit als das Fehlen einer nachweisbaren Superantigen-Aktivität gewertet werden. A) B) p > 0,05 200 60 vitale Zellen (% der Medium Kontrolle) blastisch transformierte Zellen (% der vitalen Zellen) p < 0,0001 50 30 20 10 150 100 50 0 0 SAg-SN (n=5) LT-SN (n=5) SAg-SN (n=5) LT-SN (n=5) Medium Kontrolle Abb. 20 Hitze-inaktivierte Leukotoxin-enthaltende Überstände von S. aureus zeigen kein Blastogenese-induzierendes Potential. Bovine mononukleäre Zellen (2 x 105) wurden in Anwesenheit Hitze-inaktivierter, Superantigen- (SAg-SN) oder Leukotoxin-enthaltender Überstände (LT-SN), von je 5 S. aureus Isolaten (finale Verdünnung 1:10), 5 Tage in vitro inkubiert. Prozentsätze blastisch transformierter Zellen an den vitalen Zellen und absolute Zahlen vitaler Zellen wurden durchflußzytometrisch bestimmt (s.S. 61). A) Prozentualer Anteil blastisch transformierter MNC unter den vitalen Zellen. B) Relative Zahl vitaler Zellen im Vergleich zur Mediumkontrolle (= 100%; ohne Zusatz von S. aureus Überständen). Die Ergebnisse sind als Box-Plots dargestellt. Die horizontalen Linien der Box kennzeichnen die 25%, 50% und 75% Percentile der Daten. Obere und untere Begrenzungen der Streubreiten kennzeichnen die 5% und 95% Percentile. 102 4.3.4 Häufigkeit des Auftretens von Leukotoxin- und Superantigenproduzierenden Staphylococcus aureus Isolaten in Fällen von klinischen und subklinischen Mastitiden Die 68 S. aureus Isolate stammten in 39 Fällen von Kühen mit subklinischer und in 29 Fällen von Kühen mit klinischer Mastitis (s. Tab. 9, LT-SN + SAg-SN + Negative). S. aureus Isolate, die Leukotoxin produzierten, waren in den Fällen von subklinischer (41,0%) und klinischer (55,2%) Mastitis annähernd gleich verteilt; dies galt auch für die Superantigen-produzierenden Isolate (30,8% bei subklinischen Mastitiden, 27,6% bei klinischen Mastitiden). Im Gegensatz dazu waren die Frequenzen von LT-SNs sowohl bei den Isolaten aus klinischen als auch bei denen aus subklinischen Mastitiden höher als die der SAg-SNs. Allerdings erwies sich die annähernd doppelt so hohe Frequenz von LT-SNs (55,2%) im Vergleich zu den SAg-SNs (27,6%) bei klinischen Mastitiden (s. Tab. 9) als statistisch nicht signifikant (chi² = 0,49). Tab. 9 Frequenz von Leukotoxin- und Superantigen-produzierenden S. aureus Isolaten in Fällen von klinischen und subklinischen Mastitiden bei Rindern Charakterisierung der Isolate (n) Mastitis LT-SN SAg-SN Negative Σ (LT-SN+ SAg-SN) subklinisch klinisch 41% (16) 30,8% (12) 28,2% (11) 71,8% (28) 55,2% (16) 27,6% (8) 17,2% (5) 77,6% (24) Die Diagnosestellung „subklinische“ oder „klinische“ Mastitis erfolgte von Tierärzten, die Milchproben der Tiere an die Klinik für Geburtshilfe und Gynäkologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover eingeschickt haben. Die Diagnose „subklinische“ Mastitis basierte auf einer erhöhten somatischen Zellzahl in der Milch (> 400.000 Leukozyten/ml). Kulturüberstände der einzelnen S. aureus Isolate wurden auf Grund ihrer differentiellen, funktionellen Effekte auf bovine neutrophile Granulozyten und mononukleäre Zellen als Leukotoxin- (LT-SN) oder Superantigen- (SAg-SN) enthaltende Überstände klassifiziert (s. 4.3.1, Abb. 17). n: Anzahl der Fälle. 103 Die verschiedenen Isolate wurden von der Klinik für Gynäkologie und Geburtshilfe des Rindes der Tierärztlichen Hochschule Hannover auf das Vorhandensein weiterer Virulenzfaktoren geprüft. Ungefähr die Hälfte der Isolate war Clumping Faktor-positiv (51,5%). Die SAg-SN-produzierenden Isolate wiesen z.T. eine höhere Frequenz an Clumping Faktor-negativen als die LT-SN-produzierenden Isolate (s. Tab. 10) auf. Diese Unterscheide waren jedoch statistisch nicht signifikant (chi2 = 2,23). Das gleiche galt für die Frequenz Koagulase-positiver Isolate. Die Mehrzahl der Isolate war Koagulase-positiv (92,6%), lediglich fünf der getesteten Isolate, alle von subklinischen Mastitiden, waren Koagulase-negativ (s. Tab. 10). Die Mehrzahl aller Isolate war Penicillin-sensitiv (89,7%), ohne daß Unterschiede zwischen Leukotoxin- und Superantigen-produzierenden Isolaten erkennbar waren (s. Tab. 10). 104 Tab. 10 Charakteristika von Leukotoxin- und Superantigen-produzierenden Staphylokokken Isolaten in Fällen von klinischer und subklinischer boviner Mastitis. Mastitis Charakterisierung der Isolate (n) LT-SN SAg-SN negativ Subklinisch Clumping Faktor Penicillin Koagulase 16 12 11 + - 7 9 5 7 8 3 R 1 1 3 S 15 11 8 + 14 11 9 - 2 1 2 16 8 5 + 10 2 3 - 6 6 2 R S 0 16 2 6 0 5 + 16 8 5 - 0 0 0 Klinisch Clumping Faktor Penicillin Koagulase Die Einteilung in klinische und subklinische Mastitiden wurde von den Tierärzten, die die Milchproben eingeschickt haben, vorgenommen (s. Tab. 9). Die Einteilung in SAg-SNs und LT-SNs erfolgte anhand eines durchflußzytometrischen Tests (s. 4.3.1). Alle Isolate wurden auf die Produktion von Clumping Faktor, Koagulase (+: positiv, -: negativ) und auf Penicillinresistenz (R: resistent; S: sensibel) getestet. 105 5 Diskussion Bakterielle Exotoxine, die als Superantigene bezeichnet werden, waren in den letzten Jahren Gegenstand intensiver Forschung, weil sie das Immunsystem über einen MHCKlasse-II-vermittelten Mechanismus beeinflussen, der dem der klassischen Antigenpräsentation sehr ähnlich ist. Die Kreuzvernetzung von MHC-Klasse-II-Molekülen auf Antigen-präsentierenden Zellen mit T-Zellrezeptoren auf CD4+ und CD8+ T-Zellen durch Superantigene war das dominierende Thema der Forschung auf diesem Gebiet in den letzten 10 Jahren (FLEISCHER & SCHREZENMEIER 1988, HERMAN et al. 1991, GASCOIGNE 1993, HUANG & CRISPE 1993). Relativ wenige Studien befaßten sich gezielt mit Konsequenzen für andere Zellen, mit denen Superantigene unmittelbar oder mittelbar in Kontakt treten. Hier setzte die vorliegende Arbeit an, in der gefragt wurde, ob bovine Granulozyten von bakteriellen Superantigenen beeinflußt werden. Diese Zellen sind maßgeblich an der Elimination von Superantigen-Bildnern (wie S. aureus) beteiligt und müßten eigentlich aus Sicht des Erregers negativ beeinflußt werden. Daß S. aureus hierfür wirksame Virulenzfaktoren besitzt, zeigt allein schon die Existenz anderer potenter granulozytotoxischer Toxine, der Leukotoxine (s. 2.2, vgl. 5.1.4). Ob allerdings Superantigene eine ähnliche Wirkungsweise für Granulozyten besitzen, war bisher unbekannt. Die Frage nach der Vitalitätsbeeinflussung boviner Granulozyten durch Superantigene - und den dabei beteiligten Mechanismen - war daher zunächst primäres Thema der hier vorgestellten Untersuchungen (s. 5.1.2). Da sowohl den Leukotoxinen, als auch den Superantigenen in der Pathogenese der bovinen, S. aureus-induzierten Mastitis eine tragende Rolle beigemessen wird (FERENS et al. 1998, LOEFFLER et al. 1988), wurde im zweiten Teil der hier vorgestellten Arbeit untersucht, wie häufig Isolate von S. aureus, aus der Milch Mastitis-kranker Kühe, funktionell aktive Superantigene und/oder Leukotoxine produzieren (s. 5.1.4). 5.1.1 Methodischer Ansatz Wie beurteilt man am zuverlässigsten Vitalitäts-mindernde Effekte von Toxinen, Superantigenen oder zellulären Mediatoren auf Zellen in vitro? Unterstellt man, daß in der überwiegenden Mehrzahl der Fälle die Apoptose von Zellen induziert oder gehemmt wird, so könnte der positive Nachweis apoptotischer Merkmale von Zellen (vgl. Abb. 1) 106 ausreichend erscheinen. So wird in Untersuchungen anderer Arbeitsgruppen sehr häufig die Bindung von Fluorochrom-markiertem Annexin V an das Phosphatidylserin in der Membran apoptotischer Zellen verwendet (s. 2.4.1, FADOK et al. 1992). Die Induktion der Apoptose wurde auch durch den Nachweis der Caspase-Aktivitäten mit Hilfe Fluorochrom-markierter Caspase-Substrate durchflußzytometrisch gemessen (ALAM et al. 1999). LUNDQVIST-GUSTAFSSON & BENGTSSON (1999) identifizierten Apoptose in ihrer Arbeit anhand einer durchflußzytometrisch bestimmten Größenabnahme (geringerer FSC) der Zellen. Der Grund, in dieser Arbeit von einem direkten Apoptose-Nachweis abzusehen, lag in der Beobachtung, daß apoptotische Zellen in vitro relativ schnell sekundär nekrotisch werden können (WALSH et al. 1998), was somit den Nachweis einer primären Apoptose-Induktion erschwert hätte. Zudem sind die Zeitfenster, in dem Unterschiede in der Apoptose - in den verschiedenen Ansätzen - in vitro nachweisbar sind, oft sehr kurz, und bergen (bei falscher Wahl der Meßzeitpunkte oder unterschiedlichen Apoptose-Kinetiken) die Gefahr von Fehlinterpretationen. Sekundär nekrotische Zellen stellen sich nach durchflußzytometrischer Analyse als Propidiumiodid-positiv dar (vgl. auch Abb. 5). Solche, noch als Zellen zu identifizierende, Ereignisse desintegrieren jedoch sehr rasch (Membran-, Kernfragmente), so daß auch dieser Parameter nur bedingt zum Nachweis eines induzierten Zelltodes geeignet schien. Dies wurde durch eigene Beobachtung gestützt, wonach in Ansätzen, in denen die absolute Zahl vitaler Granulozyten innerhalb der ersten 24 Stunden deutlich gesunken war, der Anteil Propidiumiodid-positiver Meßereignisse selten sehr hoch lag (Daten nicht gezeigt). Auf diesen Überlegungen basierte die Auswahl des dargestellten quantitativen durchflußzytometrischen Verfahrens zur Prüfung der Modulation der Zellvitalität. Prinzipiell wurden die, nach bestimmten Zeiten in vitro noch nachweisbaren, vitalen Zellen gezählt und als verläßlichster Parameter der Zellvitalität in vitro angesehen. Es kann aus den dargelegten Gründen nicht mit Bestimmtheit festgelegt werden, ob das im folgenden beschriebene beschleunigte Absterben der neutrophilen Granulozyten auf der Induktion von Apoptose oder der Nekrose beruht, oder ob eventuell sogar beide Mechanismen des Zelltodes daran beteiligt sind. Allerdings wird für den spontanen und den induzierten Zelltod polymorphkerniger Granulozyten in vivo und in vitro generell die Induktion der Apoptose verantwortlich gemacht (HASLETT et al. 1985, PAYNE et al. 1994, GASMI et al. 1996, WALZOG et al. 1997, HANNAH et al. 1998), obgleich über die einzelnen, regulierenden Kontrollmechanismen immer noch wenig bekannt ist (WALZOG et al. 1997, TSUCHIDA et al. 1995). 107 5.1.2 Die Interaktion zwischen Superantigenen und neutrophilen Granulozyten Superantigene haben keinen Vitalitäts-modulierenden Effekt auf reine neutrophile Granulozyten Weder SEA noch SEB beeinflußten die Absterbekinetik von gereinigten bovinen Granulozyten (s. Abb. 7). Dies galt sowohl für neutrophile als auch für eosinophile Granulozyten. Dieses eindeutige Resultat schließt nicht aus, daß Superantigene dennoch Liganden auf der Zelloberfläche dieser Zellen besetzten, sie kreuzvernetzen und die Zellen darüber in anderen Funktionen modulieren. Obwohl im humanen System gezeigt werden konnte, daß Neutrophile und Eosinophile nach Stimulation MHC-Klasse-IIMoleküle exprimieren können (GOSSELIN et al. 1993, WELLER et al. 1993, GUIDA et al. 1994) und über diese sogar Superantigene präsentieren, gelang bisher kein Nachweis einer konstitutiven oder Aktivierungs-induzierten MHC-Klasse-II-Expression auf bovinen Granulozyten (SCHUBERTH, persönliche Mitteilung). Ob bovine Granulozyten dennoch MHC-Klasse-II-Produkte exprimieren können, wenn auch nur unterhalb der durchflußzytometrischen Nachweisgrenze, muß derzeit noch offen bleiben. Superantigene mindern die Vitalität von Granulozyten im Beisein von mononukleären Zellen Die Kokultivierung von bovinen Granulozyten und mononukleären Zellen führte im Beisein von Superantigenen nach 24 in vitro zu einem beschleunigten Absterben der neutrophilen Granulozyten. Dieser Vitalitäts-mindernde Effekt war selektiv und betraf nicht die eosinophilen Granulozyten und die mononukleären Zellen (s. Abb. 9). Die einzige vergleichbare Studie im humanen System kam zu exakt gegenteiligen Resultaten. Dort hemmte SEB in Kokulturen von PMN und MNC die Apoptose von Granulozyten (MOULDING et al. 1999). Ohne die präsentierten Daten als solche in Zweifel zu ziehen, könnte der Grund für diese Diskrepanz im Analyseverfahren zu finden sein: Dort wurde mikroskopisch der Anteil an Zellen mit apoptotischer Morphologie beurteilt, während hier die Zahl vitaler Zellen bestimmt wurde. Aus den unter 5.1.1 genannten Gründen (u.a. Sekundärnekrose von Granulozyten in vitro und schnelle Desintegration nekrotischer Zellen) könnte somit der von MOULDING et al. (1999) 108 beschriebene Anteil an apoptotischen Zellen fälschlicherweise zu niedrig liegen. Der hier beim Rind zu beobachtende Effekt einer Vitalitätsminderung, auf Grund reduzierter Zahlen, könnte darauf beruhen, daß in vitro aktivierte Zellen stark an die Plastikoberfläche der Mikrotiterplatten adhärieren. Allerdings konnte dies mit Hilfe von Kontrolluntersuchungen ausgeschlossen werden. Zwar adhärierten durchaus Zellen an der Plattenoberfläche, jedoch blieb das Faktum einer insgesamt verringerten Zahl vitaler Granulozyten nach Kokultur mit mononukleären Zellen im Beisein von Superantigenen. Da zudem sowohl im bovinen System, als auch unter Verwendung humaner Zellen (s.S. 82 und 83) dieselben Effekte beobachtet wurden, schließt dies mögliche Speziesrestringierte Mechanismen weitestgehend aus. Der Effekt beruht auf löslichen Faktoren von mononukleären Zellen Da lösliche Überstände von Superantigen-stimulierten mononukleären Zellen ebenfalls den beschleunigten Tod von Neutrophilen induzierten (s. 4.1.3), schließt dies die absolute Notwendigkeit von Zell-Zellkontakten zwischen Neutrophilen und mononukleären Zellen aus. Denkbare, den Effekt verstärkende Kontakte, würden wiederum die Expression von Liganden (MHC-Klasse-II-Moleküle) auf Neutrophilen voraussetzen, die - wie oben ausgeführt - auf bovinen Granulozyten bisher nicht nachweisbar war. Die Effektivität von Superantigen-konditionierten MNC-Überständen schließt zudem das Abtöten der Neutrophilen durch eine T-Zell-vermittelte Superantigen-abhängige zelluläre Zytotoxizität (SDCC) aus, wie sie für die Eliminierung von humanen und bovinen B-Zellen beschrieben wurde (HEDLUND et al. 1990, HENDRICKS 1998). Außerdem sind für solche zytotoxische Mechanismen deutlich höhere Superantigen-Konzentrationen in vitro erforderlich, als sie hier eingesetzt wurden: Effekte auf Neutrophile wurden bereits zwischen 10-100 fg/ml (SEA) oder 0,1-10 pg/ml (SEB) beobachtet (vgl. Abb. 9). Die Natur des oder der verantwortlichen Faktoren bleibt unklar Überraschenderweise sind die meisten in der Literatur erwähnten Zytokine, Mediatoren oder Substanzen, welche die Vitalität der Neutrophilen beeinflussen, anti-apoptotisch (vgl. Tab. 1). Da jetzt nach pro-apoptotischen Mediatoren gefahndet werden sollte, blieben nur wenige bislang beschriebene Möglichkeiten: Das Stickoxid-Radikal (NO, FORTENBERRY et al. 1998), der Tumor Nekrose Faktor-α (TNF-α), das Prostaglandin E2 (PGE2) und Fas-FasL-Interaktionen (LILES et al. 1996). Für TNF-α und PGE2 wurden allerdings sowohl pro- als auch anti-apoptotische Effekte beschrieben (s. Tab. 1, s.u.). 109 Die Zugabe von rekombinantem humanen TNF-α (rhTNF-α) zu Kulturen von gereinigten humanen Granulozyten, resultierte in einem beschleunigten Absterben der humanen Zellen. Dieser induzierte Tod konnte durch einen für humanes TNF-α spezifischen Antikörper vollständig verhindert werden (s.S. 82, Tab. 4). Im Gegensatz dazu konnte dieser Antikörper das Superantigen-induzierte Absterben der humanen neutrophilen Granulozyten nur zu einem Teil verhindern. Daraus kann gefolgert werden, daß TNF-α nicht hauptverantwortlich für den Tod der Granulozyten ist. Dies wurde durch eine weitere Beobachtung gestützt: Die Neutrophilen verschiedener Individuen erweisen sich als unterschiedlich sensitiv gegenüber TNF-α und Superantigen-konditionierten Überständen mononukleärer Zellen. Allerdings bestand nur eine schwache und nicht signifikante Korrelation zwischen den „Sensitivitäten“. Wäre TNF-α in den konditionierten Überständen das dominante Prinzip gewesen, hätte diese Korrelation deutlicher stärker sein müssen. Außerdem hatte auch eine Superantigen-Stimulation boviner mononukleärer Zellen in der Anwesenheit von Brefeldin A keine Auswirkungen auf die Freisetzung der zum beschleunigten Absterben der Neutrophilen führenden Faktoren. Brefeldin A, ein Inhibitor der Vesikelbildung und des Transportes im Golgi-Apparat, wurde schon wiederholt und erfolgreich als Inhibitor der Freisetzung verschiedener Zytokine - einschließlich TNF-α - beschrieben (BAUMGARTNER et al. 1996, SOLOMON et al. 1997). Zusammenfassend kann man folgern, daß, obwohl die freigesetzten Zytokine nicht gemessen wurden, TNF-α nicht das verantwortliche Zytokin für das beschleunigte Absterben der neutrophilen Granulozyten ist. Diese Ergebnisse lassen sich durchaus mit anderen Berichten vereinbaren, in denen TNF-α entweder keine (SULLIVAN et al. 1996) oder sogar eine anti-apoptotische Wirkung auf humane Neutrophile zugeschrieben wurde (LILES et al. 1996, MURRAY et al. 1997, SWEENEY et al. 1998). Allerdings kann nicht die Möglichkeit ausgeschlossen werden, daß beim Rind in vivo Superantigen-induziertes TNF-α an dem beschleunigten Absterben der bovinen Granulozyten beteiligt ist, wie es z.B. für das humane System beschrieben ist (MURRAY et al. 1997, GON et al. 1996). In früheren Untersuchungen konnte gezeigt werden, daß PGE2 von mononukleären Zellen nach Superantigen-Stimulation produziert wird (HENDRICKS et al. 2000). Bezüglich der Rolle von PGE2 für das Überleben von neutrophilen Granulozyten sind die verfügbaren Daten immer noch sehr begrenzt und widersprüchlich in Anbetracht der zahlreichen und vielfältigen Wirkungen von Arachidonsäure-Metaboliten auf das Immunsystem (SNIJDEWINT et al. 1993). 110 Untersuchungen von KOLLER et al. (1997) lieferten Hinweise, daß Arachidonsäure-Metaboliten an der Regulation der Apoptose von Granulozyten beteiligt sind: Die Zugabe von Arachidonsäure führte signifikanten Anstieg der Apoptose. Während Leukotriene anti-apoptotisch schienen, führten Prostaglandinen zu einer Steigerung der Apoptoserate. bestimmte humanen zu einem zu wirken Hier im bovinen System wurde jedoch das Gegenteil beobachtet. Exogen zu Kokulturen hinzugefügtes Prostaglandin E2 führte zu einem deutlichen Anstieg der Zahl vitaler Zellen (s. Abb. 13, vgl. S. 80). Analog dazu sank die Zahl vitaler boviner Granulozyten nach Hemmung der endogenen PGE2-Synthese durch Indomethacin (s.S. 49). Somit stimmen diese Beobachtungen mit denen von WALKER et al. (1997) überein, die einen anti-apoptotischen Effekt von PGE2 für humane Neutrophile zeigten. Zudem vermochte weder die Zugabe von PGE2 noch die Hemmung der endogenen Synthese, den Superantigen-vermittelten Effekt in Kokulturen (PMN/MNC) aufzuheben (s.S. 80). Auf Grund seines anti-apoptotischen Effektes ist das Superantigen-induzierte PGE2 in bovinen Zellen nicht ursächlich für das beschleunigte Absterben von bovinen neutrophilen Granulozyten. Die in der Literatur für das Stickoxid-Radikal (NO) beschriebene pro-apoptotische Wirkung für humane Granulozyten (FORTENBERRY et al. 1998) konnte hier indirekt auch für bovine Granulozyten bestätigt werden. Die Hemmung der endogenen NOProduktion, durch Hemmung der induzierbaren NO-Synthetase mit NMLA (s.S. 48), führte zu einer geringgradigen Erhöhung der Zahl vitaler Neutrophiler - sowohl in den unstimulierten Kontrollen als auch (individuell unterschiedlich, vgl. Abb. 13) in den Superantigen-stimulierten Ansätzen. Die Hemmung der NO-Synthetase führte allerdings nie zu einem kompletten Aufheben der Superantigen-induzierten Effekte. Obgleich hier nicht geprüft, lag dies nicht an einer zu niedrigen Konzentration des Inhibitors der NO-Synthetase. Die gleiche Konzentration inhibierte in früheren Studien die NO-Produktion in bovinen mononukleären Zellen komplett (SCHUBERTH et al. 1998). Damit schied auch das Stickoxid als möglicher Effektormediator des Superantigen-induzierten beschleunigten Zellsterbens boviner Granulozyten aus. Ein hypothetisch möglicher Mechanismus für den abtötenden Effekt Superantigenkonditionierter Überstände von mononukleären Zellen hätte auf dem Zusammenwirken der freigesetzten Mediatoren/Zytokine und den noch in den Überständen enthaltenen Superantigenen beruhen können. In vorläufigen Versuchen wurden daher mononukleäre Zellen mit Agarose-immobilisierten Superantigenen stimuliert. Die zentrifugierten 111 Überstände (nominell frei von löslichen Superantigenen) zeigten immer noch das beschleunigte Abtöten boviner neutrophiler Granulozyten. Daraus könnte man folgern, daß lediglich die von Superantigenen induzierten Mediatoren/Zytokine für den beobachteten Effekt verantwortlich waren. Allerdings war ein Einsatz dieser Agaroseimmobilisierten Superantigene zur Bestimmung der Zahl vitaler Neutrophiler in der Kokultur nicht möglich, da die Agarose-Kügelchen zu groß für eine Messung im Durchflußzytometer waren. Ebenso konnte ein Nachweis dafür, daß alle Superantigene an Agarose gekoppelt, und somit nicht mehr in den Überständen enthalten sind, nicht mit ausreichender Klarheit erbracht werden. Daher wurden diese Daten auch nicht in der Arbeit präsentiert. Die in den Präparationen mononukleärer Zellen vorhandenen Thrombozyten, deren Anteil an der Gesamtpopulation stark schwanken konnte, hätte ursächlich für die individuell doch variable Reaktion der Granulozyten auf Superantigen-induzierte MNCMediatoren sein können. So wiesen ANDONEGUI et al. (1997) eine dramatische Hemmung der Apoptose von kultivierten Neutrophilen nach, wenn diese in Anwesenheit von Thrombozyten kultiviert wurden. Allerdings schien dies hier mit den bovinen Zellpräparationen, nicht oder kaum der Fall zu sein, da die gemessenen Thrombozytenanteile nur schwach mit der Abnahme der Zahl vitaler neutrophiler Granulozyten korrelierten (s. Abb. 11). 5.1.3 Die modulatorische Bedeutung von Caspase-Inhibitoren Die für das Absterben der Neutrophilen verantwortlichen Faktoren konnten bis zum heutigen Zeitpunkt noch nicht identifiziert werden. Mit der Frage nach der eventuellen modulatorischen Bedeutung von Caspasen, sollte sich dem Problem von der anderen Seite genähert werden. Grundlage hierfür war die Prämisse, daß die beobachteten Effekte auf der Caspasen-regulierten Apoptose von bovinen Neutrophilen beruhen. Konsequenterweise wurde daher versucht, durch den Einsatz von Caspase-Inhibitoren, die Apoptose von Neutrophilen zu hemmen. Diese Vorgehensweise wurde hier zum ersten Mal im bovinen System gewählt. Die Regulation der Apoptose blieb im Verlauf der Evolution hochkonserviert (VAUX et al. 1994), deshalb war es wahrscheinlich, daß die Caspase-Inhibitoren (s. Tab. 3) auch im bovinen System wirken. Belege dafür, daß sie tatsächlich wirken, finden sich an verschiedenen Stellen der vorliegenden Arbeit (vgl. auch Abb. 15 und Abb. 16). Die 112 Auswahl der Inhibitoren erfolgte z.T. komplementär zu den oben diskutierten Mediatoren. So zählt die Caspase-2 zu den am weitesten proximal aktivierten Caspasen bei der Aktivierung des TNF-Rezeptors 1 (TNF-R1) (vgl. auch Abb. 2). Die Hemmung der proximalen Caspase-8 sollte zur Klärung der Frage beitragen, ob mögliche Fas-FasL-Interaktionen bestehen. Neutrophile wurden als hochempfindlich gegenüber einer Fas-vermittelten Apoptose in vitro nach Stimulation mit einem Antikörper gegen Fas beschrieben (LILES et al. 1996). Dies könnte im vorliegenden Fall durch lösliche, von aktivierten MNC freigesetzte, Fas-Liganden vermittelt worden sein. Gegen diese Annahme sprachen jedoch zwei Resultate: Weder hemmte ein blockierender monoklonaler Antikörper gegen das Fas-Molekül den pro-apoptotischen Effekt Superantigen-induzierter MNC-Mediatoren (s. Tab. 4), noch konnte der eingesetzte Caspase-8-Inhibitor die Vitalität von Granulozyten in Kokultur mit Superantigen-stimulierten MNC steigern: Im Gegenteil, der Inhibitor führte in diesen Fällen sogar zu einer geringeren Vitalität. Dies läßt vermuten, das Superantigene - hier im humanen in vitro System -, nicht zu einer gesteigerten Freisetzung von löslichen Fas-Liganden durch aktivierte mononukleäre Zellen führten. Interessanterweise wurden reine bovine Granulozyten durch die Caspase-Inhibitoren nicht in ihrer Vitalität beeinflußt: Weder sank die Zahl vitaler Zellen, noch stieg sie (s. 4.2.1). Dies verwunderte besonders nach Einsatz des Caspase-1-Inhibitors. Der Caspase-1 wird eine wichtige Funktion für das Überleben von neutrophilen Granulozyten beigemessen, da das Enzym für die Umwandlung der inaktiven Vorstufe des Interleukin-1β in seine aktive Form verantwortlich ist. Interleukin-1β wirkt in autokriner Weise auf neutrophile Granulozyten in Lebens-verlängernder Weise (BLISS et al. 1999); entsprechend konnten WILLIAM et al. 1998 nach Hemmung der Caspase-1 durch einen Caspase-1-Inhibitor ein schnelles Sterben der Zellen beobachten. Die Aufgaben der Caspase-1 beleuchten die oft dichotome oder multiple Rolle dieser Enzyme in einer Zelle. Die Caspasen müssen nicht immer und unmittelbar am Prozeß der Apoptose beteiligt sein. Andererseits blockierten Inhibitoren der Caspase-1 und –3 die Fas- und TNF-induzierte Apoptose, was eine Beteiligung der Caspase-1 bei diesen Mechanismen vermuten läßt (ENARI et al. 1995, LOS et al. 1995, TEWARI & DIXIT 1995, ENARI et al. 1996). Die hier beobachtete fehlende Beeinflussung der konstitutiven Apoptoserate boviner neutrophiler Granulozyten durch den Caspase-1Inhibitor könnte ein Nettoresultat der pro-apoptotischen (durch Hemmung der antiapoptotischen Wirkung der IL-1ß-Bildung) und der anti-apoptotischen Wirkung sein. 113 Apoptoseinhibitoren führen auch nicht immer automatisch zu einem längeren Überleben der Zellen (LEMAIRE et al. 1998). Zum Teil weicht die Zelle auf andere Apoptose-vermittelnde biochemische Pfade aus, zumal die exakte Reihenfolge der Kaskade nach Aktivierung der Todesrezeptoren bis heute noch nicht geklärt ist und außerdem die Kaskaden auch unterschiedlich in Abhängigkeit von dem auslösenden Stimulus verlaufen (SCHULZE-OSTHOFF et al. 1998). Bisweilen schalten die Zellen bei gehemmter Apoptose auf den nekrotischen Zelltod um (LEMAIRE et al. 1998). Ein signifikanter Effekt der Caspase-Inhibitoren konnte nur in Superantigenstimulierten Kokulturen von Granulozyten und mononukleären Zellen beobachtet werden. Interessanterweise führte auch nur die Kombination des Caspase-1-Inhibitors und des Caspase-2-Inhibitors zu einer Steigerung der Zahl vitaler Granulozyten, mithin zu einer Hemmung deren Apoptoserate (s. Tab. 6). Dies war kein einfaches quantitatives Phänomen, da sich die Spezifitäten der Inhibitoren deutlich unterschieden. Der „Caspase-1-Inhibitor“ hemmt eine Kombination verschiedener Initiator- und EffektorCaspasen (Caspase 1, -3-, -4 und -7), während der Caspase-2-Inhibitor einzig die Caspase-2 hemmt. Im Kern bedeutet dies, daß nur durch die Hemmung von insgesamt 5 Caspasen die indirekte, Superantigen-induzierte Neutrophilen-Apoptose (wenn auch nicht komplett) gehemmt werden konnte. Die Wirkungsebene der Caspase-Inhibitoren lag dabei offensichtlich nicht auf der Seite der Granulozyten, da die Inhibitoren keinen Einfluß auf das Absterben hochreiner Neutrophiler durch Superantigen-konditionierte Überstände aktivierter mononukleärer Zellen hatten (s. Tab. 5). Der Einfluß von Caspase-Inhibitoren auf die Superantigen-induzierte Proliferationsreaktion boviner mononukleärer Zellen in vitro Mithin mußten die Inhibitoren auf der Ebene Superantigen-stimulierter mononukleärer Zellen gewirkt haben, und dies war tatsächlich der Fall. Alle eingesetzten Inhibitoren führten zu einer partiellen Hemmung der Blastogenese (vgl. Abb. 16). Dies war nicht nur bei den Tieren zu beobachten, deren Zellen deutlich und stark durch SEA stimuliert wurden, sondern auch bei solchen, die nur eine schwache Blastogenese aufwiesen (s. Tab. 7). Interessanterweise führte der kombinierte Einsatz des Caspase-1- und des Caspase-2-Inhibitors zu keinem additiven Effekt; die Blastogenese wurde gegenüber den Einzelwirkungen nur marginal weiter reduziert. Partiell kamen ALAM et al. (1999) im humanen System zu ähnlichen Ergebnissen. Sie beschreiben eine Verminderung der Proliferation durch Inhibitoren der Caspasen-1, -8 und -3. 114 Überdies wurden die Gesamtzahlen vitaler boviner MNC in vitro durch den Einsatz der Caspase-Inhibitoren nicht gesteigert, was hier im bovinen System den Schluß nahe legt, daß die modulatorische Bedeutung der Caspasen eher auf der Ebene der Aktivierungs- und Proliferationsreaktion zu suchen war. Neuere Ergebnisse aus anderen Systemen stützen diese Annahme. ALAM et al. (1999) beschreiben, daß sowohl die Stimulation des T-Zellrezeptors, als auch die Aktivierung der „Todesrezeptoren“ zur Aktivierung von Caspasen führen. Nach Bindung von Fas-Ligand an den Fas-Rezeptor kommt es im Normalfall zur Rekrutierung (Bindung) von FADD und nachfolgender Aktivierung der Caspase-8. Im Rahmen der resultierenden Kaskade wird auch Caspase-3 aktiviert, was möglicherweise zur Apoptose führt, aber die Spaltung von Caspase-3 wird ebenfalls während der T-Zellstimulation, also in Abwesenheit von Apoptose, beschrieben (MIOSSEC et al. 1997, WILHELM et al. 1998). So zeigen z.B. FADD knock out Mäuse keine Proliferation der T-Zellen nach Stimulation des T-Zellrezeptors (KENNEDY et al. 1999). Die physiologische Bedeutung dieses Vorganges ist bisher unklar (ALAM et al. 1999), was aber wiederum belegt, daß die Wirkung von Caspasen nicht allein auf der Ebene der Apoptose zu suchen ist. Tendentiell sind im bovinen System eher aktivierte CD8+ Zellen von der CaspaseInhibition betroffen, was sich durch ein Anheben des CD4+/CD8+-Verhältnisses unter den blastisch transformierten Zellen ausdrückte (s. Tab. 7). Dies verwundert nicht allzu sehr, da bereits HENDRICKS (1998) zeigte, daß die Superantigen-Stimulation bovine CD8+ Zellen präferentiell gegenüber CD4+ Zellen proliferieren läßt. Interessanter war dagegen der Befund, daß die Zahl der proliferierenden „nicht-T-Zellen“ (bei bovinen mononukleären Zellen überwiegend B-Zellen, HENDRICKS 1998) durch die CaspaseInhibitoren nicht beeinflußt wurde. Dies steht im Kontrast zu Befunden von ALAM et al. (1999), die keine präferentielle Beeinflussung der humanen T-Zell-Subpopulationen (CD4+, CD8+) und der B-Zellen nach anti-CD3-induzierter Proliferation durch die Caspase-Inhibitoren feststellten. Denkbar wäre, daß für die Unterschiede zu den hier beschriebenen Befunden, die unterschiedlichen Stimuli (Superantigene versus anti-CD3-Antikörper) verantwortlich waren. Dies könnte auch erklären, warum in dieser Arbeit der Caspase-2-Inhibitor zu einer Hemmung der Blastogenese führte, während ALAM et al. (1999) in ihrem System keine Caspase-2-Aktivierung feststellen konnten. Da Inhibitoren auch zu einer Hemmung anderer Caspasen führen (TALANIAN et al. 1997), könnte eine mögliche Erklärung für die Proliferations-hemmende Wirkung des Caspase-2-Inhibitors auch dessen Einfluß auf andere Caspasen sein. 115 Obwohl der Caspase-1-Inhibitor und der Caspase-2-Inhibitor die Blastogenese vergleichbar hemmten, führte nur die Kombination beider Inhibitoren zu einer Reduktion der Neutrophilen-Apoptose in Kokulturen (PMN/MNC). Dies könnte auf der kombinierten Wirkung der beteiligten Caspasen auf bestimmte Zytokine/Mediatoren beruhen, deren Induktion und Sekretion scheinbar über andere Caspase-Pfade reguliert wird als die Blastogenese- und Proliferationsreaktion. 5.1.4 Charakterisierung von Staphylococcus aureus Isolaten Superantigene und Leukotoxine unterscheiden sich deutlich in der Art und Weise, wie sie mit dem Immunsystem des Wirtes interagieren. Dies erklärt wahrscheinlich, warum diese zwei Gruppen von Virulenzfaktoren bisher immer separat untersucht wurden, obwohl beiden Gruppen gleichermaßen eine Rolle in der Pathogenese der bovinen Mastitis zugeschrieben wurde (FERENS et al. 1998, LOEFFLER et al. 1988). Das größte Nachweisproblem liegt in der Verschiedenheit ihrer Gruppenmitglieder. Bis vor kurzem waren 11 S. aureus Superantigene beschrieben (MONDAY & BOHACH 1999b); inzwischen wurde ein weiteres Superantigen (SEK) identifiziert (ORWIN et al. 2001), und es ist wahrscheinlich, daß noch mehr Mitglieder dieser Gruppe in Zukunft entdeckt werden. Das Fehlen von spezifischen Reagenzien (Antikörper oder Primer) für den Nachweis jedes einzelnen Superantigens macht es schwer zu entscheiden, ob ein Isolat Superantigene produziert oder nicht. Diese Situation wird noch komplizierter, dadurch daß S. aureus auch Spezies-spezifische Superantigene produziert (z.B. SECbovine, MURRAY et al. 1994). Die derzeit kommerziell erhältlichen Testkits sind nicht in der Lage, alle bisher bekannten und weitere vermutliche Superantigene nachzuweisen. Deshalb verlassen sich einige Gruppen auf den Nachweis von Superantigen durch entsprechende Gene in der PCR (MONDAY & BOHACH 1999b). Das Fehlen von Genen schließt allerdings nicht aus, daß andere Gene für bisher unentdeckte Superantigene bei den S. aureus Isolaten vorhanden sind, und ihr Nachweis ist kein Beleg für die Sekretion eines biologisch aktiven Proteins, obwohl BECKER et al. (1998) eine exzellente Korrelation zwischen dem Genotyp und dem Phänotyp der verschiedenen Isolate beschreiben. Um die genannten Probleme zu umgehen und um Superantigene sowie Leukotoxine gleichzeitig nachweisen zu können, wurde das in dieser Arbeit beschriebene Phänomen des beschleunigten Sterbens boviner Granulozyten in Superantigen-stimulierter Kokultur (PMN/MNC) in einem funktionellen, durchflußzytometrischen Testverfahren eingesetzt. 116 Leukotoxine konnten relativ einfach nachgewiesen werden: Sie führten zu einem vollständigen Tod der neutrophilen Granulozyten und der monozytären Zellen nach 24h in Kultur (s. Abb. 17). Dies bestätigte frühere, ebenfalls durchflußzytometrische Untersuchungen von MEUNIER et al. (1995). Wichtig war, daß dies bereits mit gereinigten Granulozyten zu beobachten war. Anders als bei den Superantigenen mußten für die granulozytotoxischer Wirkung von Leukotoxinen keine mononukleären Zellen anwesend sein. Manche Überstände, die zu einem Verlust von Granulozyten nur im Beisein von mononukleären Zellen führten, erinnerten stark an das oben beschriebene, Superantigen-vermittelten Phänomen. Daraus ergaben sich für die Validierung folgende Fragen: Sind hierfür tatsächlich Superantigene in den S. aureus Überständen verantwortlich? Hinweise dafür lieferte die Aktivierung von mononukleären Zellen im Vorwärtsstreulicht (FSC) und die Blastogenese-induzierende Potenz die auch nach HitzeBehandlung der Überstände erhalten blieb (s. Abb. 19, Abb. 20). Die FSC-Veränderungen korrelierten überdies sehr gut mit der von den vermutlich Superantigenenthaltenden Überständen induzierten Blastogenese und dem Absterben von Neutrophilen in Kokulturen. Können mit diesem durchflußzytometrischen Verfahren alle Superantigene nachgewiesen werden? Die Fähigkeit MNC zu aktivieren scheint eine Gemeinsamkeit von allen Superantigenen zu sein, obwohl Studien im bovinen System bisher nur einen Teil von ihnen abdeckten: SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEE (SCHMALTZ et al. 1995, YOKIMOZO et al. 1995, SCHUBERTH et al. 1996, 1998, FERENS et al. 1998, HENDRICKS et al. 2000). In der Arbeit wurde zudem für zwei unterschiedliche Superantigene (SEA, SEB: geringe Aminosäure-Homologie, unterschiedliche Affinität für MHC-Klasse-II-Produkte, unterschiedliche TCR-Vβ-Spezifität und verschiedene Potenz der Blastogenese-Induktion) gezeigt, daß sie in der Lage sind, den beschleunigten Tod der Neutrophilen in vitro zu induzieren. Insofern scheint es gerechtfertigt, zu vermuten, daß diese Eigenschaft allen bisher bekannten und den vermuteten Superantigenen gemeinsam ist, und daß der beschriebene funktionelle Test in der Lage ist alle biologisch aktiven Superantigene von S. aureus Isolaten zu entdecken. Dies wird unterstützt durch den Befund, daß die Konzentrations-abhängige Absterbekinetik von Neutrophilen, die durch bestimmte Kulturüberstände von S. aureus induziert wurde, immer parallel zu der verlief, die durch gereinigtes Superantigen (SEA) erzielt wurde (s. Abb. 18). 117 Enthalten Überstände mit Leukotoxinen Superantigene? Leukotoxin-enthaltende Überstände führten kaum zu einem Anstieg im Vorwärtsstreulicht der mononukleären Zellen. Dieser funktionelle Mangel hätte auf einer selektiven Elimination von Superantigen-präsentierenden Zellen (Monozyten) durch Leukotoxine beruhen können, was die Aktivität von Superantigenen quasi „maskiert“ haben würde. Der stärkste Hinweis auf das Fehlen von Superantigenen in Leukotoxin-enthaltenden Überständen war jedoch das fehlende Blastogenese-induzierende Potenzial in Hitze-inaktivierten Überständen (s. Abb. 20). Zusammengenommen suggerieren diese Daten, daß S. aureus Isolate, die Superantigen produzieren, kein Leukotoxin produzieren und umgekehrt. Dieses Phänomen wurde bisher noch nicht beschrieben. Die Tatsache, daß entweder Superantigene oder Leukotoxine ex vivo von S. aureus Isolaten produziert werden können, spricht zumindest gegen eine - in vitro durch die Kulturbedingungen vermittelte - Hemmung der Produktion einer dieser Faktoren. Es besteht weiterhin die Möglichkeit, daß bei einem einzelnen Isolat von S. aureus, das die Gene für Leukotoxin und Superantigen besitzt, die Transkription und Produktion einer Klasse von Virulenzfaktoren die Transkription des anderen unterdrückt. Dies ist natürlich Spekulation und bedarf weiterer Untersuchungen. Beruhend auf diesen Ergebnissen war die Frequenz von Leukotoxin- oder Superantigen-produzierenden S. aureus Isolaten zwischen Kühen mit klinischer oder subklinischer Mastitis annähernd gleich. Es gab eine leichte, wenn auch nicht signifikante Tendenz zu mehr Leukotoxin-produzierenden Isolaten in Fällen von klinischer Mastitis (vgl. Tab. 9). Vergleiche der hier bestimmten Frequenzen mit Angaben in der Literatur sind schwerlich aussagekräftig: Die Unterschiede im methodischen Ansatz sind z.T. sehr groß. LOEFFLER et al. (1988) konnten in nur 2 von 27 S. aureus-infizierten Milchproben von Kühen mit chronischer S. aureus Leukotoxine nachweisen. BURRIEL & DAGNALL (1997) untersuchten die Leukotoxinbildung beim Schaf und stellten fest, daß alle Koagulase-negativen S. aureus Stämme von subklinischen Mastitiden schwach Leukotoxine produzierten, während die fünf untersuchten Koagulase-positiven Stämme von klinischen Mastitiden stark Leukotoxine produzierten. Eine solche Abhängigkeit konnte hier für Rinder-Isolate nicht festgestellt werden (s. Tab. 10). CRIBIER et al. (1992) beobachtete eine hohe Frequenz von Leukotoxin-Produzenten in Fällen von Hautinfektionen beim Mensch (12 von 43) während nur einer von 49 Stämmen aus Blutkulturen diese Faktoren bildete. 118 Ein anderes Extrem stellen Befunde von SIQUIERA et al. (1997) dar: Sie stellten fest, daß die meisten S. aureus Stämme zwei oder sogar sechs Leukotoxine produzierten. Eine ähnliche Variabilität der Frequenzen zeigt sich, wenn man die Literatur bezüglich des Vorkommens von Superantigenen untersucht. Abhängig von der Studie wurden entweder keine Superantigen-produzierenden Stämme gefunden (LEE et al. 1998) oder die Frequenz erreicht 50% (ADESIYUN et al. 1998) oder sogar 76% (KANG et al. 1991). Wenn man die hier gemachten Beobachtungen einer fakultativen Bildung von Leukotoxinen oder Superantigenen durch individuelle Isolate als korrekt erachtet, dann relativiert dies die Bedeutung der einzelnen Virulenzfaktoren von pathogenen S. aureus Stämmen für die Induktion oder den Verlauf der Rindermastitis. Die gemeinsame Eigenschaft von Leukotoxinen und Superantigenen scheint ihre negative Wirkung auf neutrophile Granulozyten zu sein. Summiert man die hier bestimmten Frequenzen von Leukotoxin- und Superantigen-Bildnern, dann wird bei der subklinischen Mastitis eine Frequenz von 71,8% und bei der klinischen Mastitis eine Frequenz von 82,8% erreicht . Ob in den übrigen Fällen andere Virulenzfaktoren eine Rolle spielen, oder ob einige S. aureus-Stämme nur in vivo und nicht in vitro Leukotoxin oder Superantigen produzieren, muß die Aufgabe weiterführender Untersuchungen bleiben. Interessanterweise scheint bei Infektionen des Kuheuters mit potentiell Superantigenproduzierenden Stämmen von S. aureus die Zahl der Granulozyten in der Milch des betroffenen Euterviertels im Vergleich zu Infektionen mit anderen gram-positiven Keimen deutlich geringer zu sein (ZERBE, persönliche Mitteilung). Es ist möglich, daß dem Superantigen-induzierten beschleunigten Absterben der Neutrophilen hierbei eine Rolle zukommt. Dies zeigte sich ebenso in früheren Beobachtungen in vivo, wonach humane Infektionen von Operationswunden mit TSST-1-produzierenden S. aureus Stämmen gewöhnlich keine eitrige Immunantwort des Wirtes auslösten (FAST et al. 1988). Es kann die Vermutung aufgestellt werden, daß die in einigen Fällen schlechte Elimination Superantigen-produzierender Staphylokokken zum Teil durch die Hemmung der Migration von Granulozyten zu Orten des Infektionsgeschehens und zusätzlich durch die Induktion des beschleunigten Zelltodes hervorgerufen wird. Zumindest eröffnet der gezeigte indirekte, negative Effekt von Superantigenen auf die Vitalität von bovinen neutrophilen Granulozyten neue Einsichten in wichtige pathogenetische Mechanismen, durch die Superantigene das Immunsystem des Wirtes modulieren. 119 6 Zusammenfassung Bakterielle Superantigene sind Proteine, die in typischer Weise mit Zellen des Immunsystems interagieren. Sie können T-Zellen unabhängig von ihrer Antigenspezifität durch Bindung an MHC-Klasse-II-Moleküle Antigen-präsentierender Zellen einerseits und T-Zellrezeptoren andererseits polyklonal stimulieren. Aus der folgenden Dysregulation der Immunantwort ergibt sich die pathogenetische Bedeutung der Superantigene. Während den klassischen Wirkungen von Superantigenen auf humane und murine B- und T-Zellen sehr viel Aufmerksamkeit geschenkt wurde, fanden mögliche Effekte auf andere Zelltypen bisher eher wenig Beachtung. Hieraus ergab sich für die vorgestellte Arbeit zunächst die Frage, inwieweit Superantigene von S. aureus in direkter oder indirekter Weise die Vitalität von bovinen neutrophilen Granulozyten beeinflussen. Diese Studien basierten auf durchflußzytometrischen Verfahren zur qualitativen und quantitativen Zellanalyse. Die geprüften Superantigene (SEA, SEB) hatten keinen Einfluß auf die Vitalität reiner Granulozyten (PMN, neutrophile und eosinophile). In Kokultur mit mononukleären Zellen (MNC) führten die Superantigene jedoch zu einem beschleunigten Absterben der neutrophilen Granulozyten: Verglichen mit den Mediumkontrollansätzen überlebten nach 24h in vitro nur etwa 10-50% der Neutrophilen. Die Vitalität von eosinophilen Granulozyten und mononukleären Zellen blieb hingegen unbeeinflußt. Für den Superantigen-induzierten, beschleunigten Tod der Neutrophilen waren über 10% mononukleäre Zellen an der Gesamtpopulation erforderlich. Die minimal erforderlichen Superantigen-Konzentrationen lagen für SEA bei 10-100 fg/ml und für SEB bei 0,1-10 pg/ml. Dieser Effekt wurde ebenso durch Kulturüberstände von Superantigen-stimulierten MNC induziert, was die absolute Notwendigkeit von direkten Zell-Zellinteraktionen zwischen Granulozyten und mononukleären Zellen ausschloß. Um die potentiell verantwortlichen löslichen Faktoren/ Mediatoren und Mechanismen zu bestimmen, wurden verschiedene Strategien gewählt. Der Einsatz blockierender Antikörper gegen den Tumor Nekrose Faktor-α (TNF-α) oder das Fas-Molekül konnte die Absterberate der Neutrophilen nicht hemmen. Selbst Brefeldin A, ein Inhibitor des Golgi-Transports und der Sekretion einer Vielzahl an Zytokinen, konnte das beschleunigte Absterben der Granulozyten nicht verhindern. Die Hemmung der Stimulations-abhängigen Stickoxid-Synthetase oder der Prostaglandin E2-Synthese von monozytären Zellen war ebenfalls nicht in der Lage, das Superantigen-induzierte Töten boviner Neutrophiler zu modulieren. 120 Daher wurde erstmals im bovinen System geprüft, ob und in welcher Weise Inhibitoren von Caspasen (Enzyme der intrazellulären Apoptosekaskade) das MNCabhängige Töten der Neutrophilen beeinflussen. Ein Caspase-1-Inhibitor (Z-VADFMK, blockiert die Caspase-1, -3, -4 und -7), und zwei selektive Inhibitoren - für die Capase-2 (Ac-VDVAD-CHO) und die Caspase -8 (Z-IETD-FMK) - hatten keinen Effekt auf die konstitutive Absterberate reiner PMN und konnten, jeweils allein eingesetzt, das Superantigen-induzierte Absterben neutrophiler Granulozyten in Kokulturen (PMN/MNC) nicht hemmen. Jedoch führte eine equimolare Kombination des Caspase-1- und des Caspase-2-Inhibitors zu einer reduzierten Absterberate - allerdings nur in Kokulturen und nicht bei Granulozyten, die in Gegenwart von Kulturüberständen Superantigen-aktivierter MNC kultiviert wurden. Alle geprüften Caspase-Inhibitoren führten nicht zu einer Erhöhung der Zahl vitaler mononukleärer Zellen nach 6 Tagen in vitro, aber sie reduzierten die SEA-induzierte Proliferation um etwa 50%. CD8+ Zellen wurden etwas mehr beeinflußt als CD4+ T-Zellen. Zusammengenommen scheinen Superantigen-induzierte, lösliche Faktoren von mononukleären Zellen, die Sterberate boviner neutrophiler Granulozyten zu erhöhen. Die Freisetzung ist abhängig von der kombinierten Aktion von Caspase-1-ähnlichen Caspasen und der Caspase-2. S. aureus ist ein wichtiger pathogener Erreger, der variable Formen von subklinischen und klinischen Mastitiden beim Rind verursacht. Seinen Virulenzfaktoren - „Leukotoxine” und „Superantigene” - wird eine bedeutende Rolle in der Pathogenese dieser Erkrankung beigemessen. Um alle bekannten und putativen Mitglieder von Leukotoxinen und Superantigenen zu erfassen, wurde im zweiten Teil der Arbeit der hier entwickelte durchflußzytometrische Ansatz verwendet. Es sollte geprüft werden, in welcher Häufigkeit S. aureus Isolate von subklinisch und klinisch an Mastitis erkrankten Rindern Leukotoxine, Superantigene oder beide Faktorengruppen gleichzeitig produzieren. Die S. aureus Isolate stammten von 68 Kühen aus unterschiedlichen Betrieben. Einzelne S. aureus Kulturen wurden für 24h in Bouillon kultiviert und die zellfreien Überstände mit gereinigten PMN oder mit Kombinationen aus PMN und MNC koinkubiert. Die Zahl vitaler PMN in den einzelnen Ansätzen, die Aktivierung der MNC (basierend auf ihrer Größenzunahme) und das Blastogenese-induzierende Potential der Überstände wurden durchflußzytometrisch erfaßt. Basierend auf diesen Kriterien fielen die Überstände der einzelnen Isolate in 3 Gruppen. 121 Die erste Gruppe (n = 32), operativ als “Leukotoxin- Überstände” bezeichnet, töteten bereits gereinigte Granulozyten (Neutrophile und Eosinophile) in vitro. Die zweite Gruppe (n = 20), operativ als “Superantigen-Überstände” bezeichnet, aktivierten die MNC und deren Blastogenese und depletierten nur in Gegenwart von MNC neutrophile Granulozyten nach 24h in vitro. Die dritte Gruppe (n = 16) enthielt weder Leukotoxinnoch Superantigen-Aktivität. Die Abwesenheit von Superantigen-Aktivitäten in Leukotoxin-Überständen wurde durch deren Hitze-Behandlung bestätigt, welche die leukozytotoxische Aktivität entfernte und kein MNC-aktivierendes Potenzial erkennen ließ. Dies deutet darauf hin, daß pathogene S. aureus Isolate entweder Leukotoxine oder Superantigene produzieren, und daß beide Virulenzfaktorengruppen durch das beschriebene funktionelle Testverfahren einfach bestimmt werden können. Die Prävalenz Leukotoxin- oder Superantigen-produzierender Isolate war bei Rindern mit subklinischer Mastitis vergleichbar (Leukotoxin = 41%; Superantigen = 30,8%). Die höhere Frequenz von Leukotoxin-produzierenden Isolaten in Fällen von klinischer Mastitis (Leukotoxin = 55,2%; Superantigen = 27,6%) war statistisch nicht signifikant. Diese Ergebnisse sprechen zwar gegen eine dominante Bedeutung von Superantigenen oder Leukotoxinen für die S. aureus-induzierte bovine Mastitis, es bleibt jedoch zu prüfen, ob diese Virulenzfaktoren in vivo anders exprimiert werden als in vitro. S. aureus verwendet seine Leukotoxine dazu, um die Vitalität von bovinen neutrophilen Granulozyten herabzusetzen. Eine Beeinflussung dieser Zellen scheint aus Sicht des Erregers in der Frühphase einer Infektion durchaus sinnvoll zu sein. Der hier beschriebene indirekte, negative Effekt von Superantigenen für bovine neutrophile Granulozyten eröffnet neue Einsichten in wichtige pathogenetische Mechanismen durch die Superantigene das Immunsystem des Wirtes modulieren können. 122 7 Summary Corinna Krüger: Functional characterization of the interaction between bacterial superantigens and bovine neutrophilic granulocytes. Bacterial superantigens are proteins which interact with cells of the immune system in a rather typical manner. They crosslink MHC class II molecules on antigen-presenting cells with T cell receptors on T cells irrespective of their antigenic specificity and resulting in a polyclonal T cell activation. The pathogenic importance of superantigens is the following dysregulation of the immune response. While classical interactions of bacterial superantigens with human and murine B or T cells have been studied intensively, the potential interactions of superantigens with other cell types have gained much less attention. Thus, in the first part, this thesis addressed the question whether superantigens of S. aureus have any direct or indirect influence on the viability of bovine neutrophilic granulocytes in vitro. The studies were based on qualitative and quantitative flow cytometric methods. The superantigens tested (SEA, SEB) had no apparent direct effect on the viability of pure granulocytes (PMN, neutrophils and eosinophils). However, in the presence of blood mononuclear cells (MNC), superantigens led to an accelerated death of neutrophils but not of eosinophils or mononuclear cells. Compared to medium controls, in superantigen-stimulated cultures only about 10-50% of the neutrophils survived after 24 hours in vitro. Accelerated death of neutrophils required the presence of at least 10% MNC. Minimal effective SEA concentrations ranged between 10-100 fg/ml (SEB 0.1-10 pg/ml). The effect could be mimicked by culture supernatants of superantigen-stimulated MNCs, suggesting that direct cell-cell interactions are not required for the killing. In order to determine the responsible factors or mediators, different strategies were chosen. Blocking monoclonal antibodies specific for tumor necrosis factor-α (TNF-α) or the Fas molecule were unable to inhibit the killing of neutrophils. Even Brefeldin A, an inhibitor of golgi transport and cytokine secretion, did not abolish the accelerated killing of neutrophils. Blocking of nitric oxide generation or PGE2 synthesis of monocytoid cells also could not alter the superantigen-induced killing of bovine neutrophils. For these reasons it was asked whether inhibitors of caspases (enzymes of the intracellular apoptosis cascade) are able to abolish or modify this MNC-dependent killing of neutrophils. A caspase-1-inhibitor (Z-VAD-FMK, inhibits caspase-1, -3, -4 123 and -7) and two selective inhibitors, for the capase-2 (Ac-VDVAD-CHO) and the caspase -8 (Z-IETD-FMK), displayed no effect on the constitutive apoptosis rate of pure neutrophils. They were also unable to block the superantigen-induced killing when used alone either in cocultures of MNC and neutrophils or when introduced in neutrophil cultures treated with superantigen-conditioned MNC supernatants. However, an equimolar combination of caspase-1 and caspase-2-inhibitor resulted in a reduced superantigen-induced killing of neutrophils in MNC/neutrophil cocultures. This effect was less pronounced with neutrophils incubated with superantigen-conditioned MNC supernatants. All tested caspase inhibitors did not increase the numbers of viable MNC after 6 days in vitro, but each inhibitor blocked the SEA-induced MNC proliferation by about 50%. CD8+ cells were slightly more affected than CD4+ T cells. Taken together, superantigen-induced, released factors of activated mononuclear cells seem to kill bovine neutrophilic granulocytes and the release is sensitive to the combined action of caspase-1-like caspases and caspase-2. S. aureus is a major pathogen for cattle, causing varying forms of subclinical and clinical mastitis. Two groups of S. aureus virulence factors (leukotoxins and superantigens) are supposed to play an important role in the pathogenesis of this disease. In order to detect all known and putative members of leukotoxins and superantigens, the above described flow cytometric approach was utilized to check whether S. aureus isolates of cows with mastitis produce leukotoxins, superantigens or both virulence factor groups. Isolates were sampled from 68 cows of different farms and cultured for 24h in vitro. Supernatants were then coincubated with purified polymorphonuclear granulocytes (PMN) or combinations of blood mononuclear cells (MNC) and PMN. Numbers of viable PMN, the activation of MNC (based on their increase in size) and the blastogenesis-inducing potential of the supernatants were recorded flow cytometrically. Based on these criteria, the supernatants of S. aureus isolates fell in three groups. The first group (n = 32), operatively termed “leukotoxin supernatants”, killed already purified granulocytes (neutrophils and eosinophils) in vitro. The second group (n = 20), operatively termed “superantigen supernatants”, induced activation and proliferation of mononuclear cells (MNC) and, only in the presence of MNC, resulted in a selective depletion of neutrophils after 24h in vitro. The third group of supernatants (n = 16) contained neither leukotoxin nor superantigen activity. The absence of superantigen activities in leukotoxin supernatants was confirmed by heat treatment which destroyed 124 the leukocytotoxic activity but did not reveal any MNC-activating potential. This suggests, that pathogenic S. aureus isolates either produce leukotoxins or superantigens and that both groups of virulence factors can be easily detected by the functional assay described. The prevalence of leukotoxin- or superantigen-producing isolates was comparable among cattle with subclinical mastitis (leukotoxin = 41%; superantigen = 30.8%). The higher frequency of leukotoxin-producing isolates in cases of clinical mastitis (leukotoxin = 55.2%; superantigen = 27.6%) was not significant. These findings argue against the dominant role of superantigens or leukotoxins in the cause or the course of S. aureus-induced bovine mastitis. However, it remains to be clarified whether these virulence factors are expressed differentially in vitro as compared to the in vivo situation. S. aureus utilizes leukotoxins to reduce the numbers of viable neutrophils. An influence on these cells during the early infection phase seems to make sense from the pathogens point of view. The described indirect and negative effect of superantigens for bovine neutrophils may provide new insights in pathogenic mechanisms by which superantigens modulate the hosts immune response. 125 8 Literaturverzeichnis ADESIYUN, A.A., L.A. WEBB & H.T. ROMAIN (1998) Prevalence and characteristics of Staphylococcus aureus strains isolated from bulk and composite milk and cattle handlers. J. Food Prot. 61, 629-632 ADLER, H., B. FRECH, M. THONY, H. PFISTER, E. PETERHANS & T.W. JUNGI (1995) Inducible nitric oxide synthase in cattle. Differential cytokine regulation of nitric oxide synthase in bovine and murine macrophages. J. Immunol. 154, 4710-4718 ALAM, A., L.Y. COHEN, S. AOUAD & R.-P. 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Immunobiology, 200: 744-745 (Abstrakt). Schuberth, H.J., C. Krueger, A. Hendricks & W. Leibold (1999). Inhibitors of caspases modulate the proliferative reaction of bovine mononuclear cells and the killing of neutrophils in vitro. Immunobiology, 200: 744 (Abstrakt). Schuberth, H.J., C. Krueger, A. Hendricks, D. Bimczok, &. W. Leibold (2000). Superantigen-dependent accelerated death of bovine neutrophilic granulocytes in vitro is mediated by blood mononuclear cells. Immunobiology, 202: 493-507. Krueger, C., H. Zerbe, E. Bleckmann, W. Leibold & H.J. Schuberth (2000). Functional characterization of leukocytotoxic and superantigen-like factors produced by Staphylococcus aureus isolates from milk of cows with mastitis. Immunobiology, 203: 154-155 (Abstrakt). 151 Erklärung Hiermit erkläre ich, daß ich die Dissertation mit dem Titel „Funktionelle Charakterisierung der Interaktion zwischen bakteriellen Superantigenen und bovinen neutrophilen Granulozyten“ selbständig verfaßt habe. Zur Anfertigung dieser Dissertation wurden folgende Hilfsmittel und Hilfen Dritter in Anspruch genommen: − Materialien und Geräte wurden von der Arbeitsgruppe Immunologie zur Verfügung gestellt. − Die Zubereitung der Zellkulturmedien erfolgte durch Frau Silke Schöneberg und Herrn Hans-Udo Rabe. − Die Identifizierung, die kulturelle Reinisolierung und die Produktion von Überständen von Staphylococcus aureus wurden freundlicherweise von Frau Dr. E. Bleckmann, Klinik für Gynäkologie und Geburtshilfe des Rindes, Tierärztliche Hochschule Hannover durchgeführt. Ich habe die Dissertation an folgender wissenschaftlichen Einrichtung angefertigt: Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht. Ich versichere, daß ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der Wahrheit entsprechend gemacht habe. _____________________________________ (Corinna Krüger) Hannover, 27.02.2001 152 Danksagung Herrn PD Dr. H.-J. Schuberth möchte ich für die Überlassung des Themas und ganz besonders für seine engagierte, zuverlässige und einfühlsame Betreuung danken. Seine sowohl einfallsreichen als auch effektiven Anleitungen und Erklärungen, die motivierenden Gespräche und anregenden Diskussionen, sowie sein trockener Humor haben meine Zeit in diesem Institut fröhlich, erfreulich und produktiv werden lassen. Darüberhinaus sei ihm aber auch für die zügige - manchmal im Zeitraffer gegebene Einarbeitung in die Geheimnisse des Computers gedankt, ohne die ich heute nicht auf so freundschaftlicher Ebene mit meinem Computer kommunizieren würde. Herrn Prof. Dr. W. Leibold danke ich herzlich für die Bereitstellung eines Arbeitsplatzes. Allen derzeitigen und ehemaligen Mitarbeitern und Doktoranden der Arbeitsgruppe Immunologie möchte ich für die freundliche Arbeitsatmosphäre meinen Dank aussprechen. Gute Nerven und unendliche Hilfbereitschaft bewiesen dabei insbesondere Udo Rabe, Silke Schöneberg und Regina Carlson. Mein besonderer Dank gilt auch Anna, Babs und Emma, die mir meine Arbeit durch ihre regelmäßigen mehr oder weniger freiwilligen Blutspenden sehr erleichtert haben, nun jedoch von irdischen Pflichten erlöst sind. Ebenso danke ich allen zweibeinigen Blutspendern für ihre freiwillige Mitarbeit und ihr Vertrauen in mein „tierärztliches Können“. Meine Eltern haben mir ermöglicht, meinen Weg zu gehen und damit den Grundstein für diese Arbeit und vieles mehr gelegt. Ihrer moralischen Unterstützung konnte ich mir in guten wie in schlechten Zeiten sicher sein. Nicht zuletzt möchte ich mich ganz herzlich bei all denjenigen bedanken, die mich während der Zeit motiviert, erfreut und abgelenkt haben. Besonders erwähnen möchte ich in diesem Zusammenhang meine Lieblingsmitbewohnerin Anja, sowie natürlich Tina, Markus, Ole und das dynamische Duo, Beule und Elsa.
