Spezialvorlesung Enzyme WS 06-07 1

Enzyme in der organischen Synthese:
Naturstoff- und Wirkstoffsynthese
Wintersemester 2006-2007
Michael Müller
Institut für Pharmazeutische Wissenschaften
Tel. 203-6320
[email protected]
Ziele der Vorlesung:
Eine Grundlage für das Verständnis biokatalytischer Transformationen legen,
um damit chemische und biokatalytische Methoden vergleichen
und beurteilen zu können:
„Was ist sinnvoll machbar mit Enzymen?“
“Everything that is possible tends to occur at least once in the
multifarious world of life.”
Stephen Jay Gould, in The Pandas Thumb
1
Bücher:
Literatur
• Kurt Faber, Biotransformations in Organic Chemistry, Springer, 2004 ( 35,-).
• Fritz Theil, Enzyme in der organischen Synthese, Spektrum, 1997 ( 25,-).
• C. H. Wong, G.M. Whitesides, Enzymes in Synthetic Organic Chemistry,
Pergamon Press, 1994 ($ 94,-).
weiterführende Literatur / Reviews:
• V. Gotor, Enantioselective Enzymatic Desymmetrizations in Organic Synthesis,
Chem. Rev. 2005, 105, 313 - 354.
• B. G. Davis, V. Boyer, Nat. Prod. Rep. 2001, 18, 618 - 640.
• K. Faber, Biotransformations of non-natural compounds, Pure Appl. Chem. 1997,
69, 1613 - 32.
• R. Csuk, B. I. Glänzer, Baker’s yeast mediated transformations in organic chemistry,
Chem. Rev. 1991, 91, 49 - 97.
• S. Servi, Baker’s yeast as a reagent in organic synthesis, Synthesis 1990, 1-25.
• W. Boland, C. Frößl, M. Lorenz, Estereolytic and lipolytic enzymes in
organic synthesis, Synthesis 1991, 1049 -1072.
• F. Theil, Lipase-supported synthesis of biologically active compounds,
Chem. Rev. 1995, 95, 2203 - 2227.
• S. M. Roberts, Preparative biotransformations, J. Chem. Soc., Perkin Trans I,
1998, 157-169; 1999, 1-21; 1999, 611 - 633; 2001, 1475 - 2253.
• E. Santaniello, P. Ferraboschi, P. Grisenti und A. Manzocchi, The Biocatalytic
Approach to the Preparation of Enantiomerically Pure Chiral Building Blocks,
Chem. Rev. 1992, 92, 1071.
weiterführende Literatur / Bücher:
• K. Drauz, H. Waldmann, Enzyme catalysis in organic synthesis, VCH, 2002 ( 595,-).
• K. Buchholz, V. Kasche, U. Borscheuer, Biocatalysts and Enzyme Technology,
VCH, 2005 ( 73,-).
• R. B. Silverman, The organic Chemistry of Enzyme-Catalyzed Reactions,
Academic Press, 2000.
• S. M. Roberts, Biocatalysis for Fine chemicals Synthesis, Wiley, 1999.
• R. Patel (Ed.), Stereoselective Biocatalysis, Marcel Dekker, New York, 2000.
• U. Bornscheuer, R. D. Kazlauskas, Hydrolases in Organic Synthesis, VCH, 2005.
2
Beispiel für Hintergrundwissen A
Was sind technische Preise?
1 kg Aldrich-Preis x 0.1 = techn. Preis
Faustregel bulk-chemicals:
O
Cl
OMe
+
O
1. 1 Äq. LiH
2. 1 Äq. BuLi
O
THF, -60°C
OtBu
O
O
O
Cl
OtBu
(Aldrich-) Katalogpreis 1 kg
‚technischer’ Preis
1 kg
Acetessigsäure-tert-butylester 97 %
“
170,8 - 9,- (to)
(Aldrich) Katalogpreis 1 kg
Chloressigsäuremethylester 99 %
43,80
‚technischer’ Preis
1 kg
“
3 - 4,- (to)
Katalogpreise n-BuLi
(Aldrich) Katalogpreis 20 L
Aldrich
Butyllithium-Lösung (10 M)
4.930,-
1 Mol
BuLi
(100 ml)
84,-
1 Mol
BuLi
( 20 l )
25,-
1 kg
BuLi
( 20 l )
385,-
Chemetall 1 kg
BuLi
(
1 kg)
500,-
1 kg
BuLi
( 10 kg)
70,-
1 kg
BuLi
(100 kg)
50,-
Preise 2005
Preise 2001
Chemikalien (Edukte, Cofaktoren, (Bio) Katalysatoren) nicht zwingend;
preislimitierende Betriebskosten (Lösungsmittel, Temp. (< - 20°C (fl. N2),
> 100°C) Druck, Abfall, Anlagen) bestimmen den Preis eines Produktes.
Biokatalysatoren (Enzyme) können besonders vorteilhaft sein
technische Preise:
Wirkstoffe
Beispiel Preise Wirkstoffe: Katalogpreise Taxol
10 mg Paclitaxel
100 g
Paclitaxel
100,- (Sigma)
28.000,-
10 mg =
2,80
3
Alternative chemoenzymatische Synthese zu Cerivastatin (Lipobay)
F
O
O
Cl
O
OH
recLBADH
M: 234
O Bu
M: 236
NADP
O
OH
O
ONa
O Bu
H3C
O
N
OH
recLBADH
ADH:
LBADH:
recLBADH:
E. coli:
OH O
t
+
NADPH
O
Cl
t
Cerivastatin (Lipobay)
Alkoholdehydrogenase
Lactobacillus brevis ADH (NADP+-abhängig)
rekombinante LBADH (Expression in rekombinanten E. coli)
Escherichia coli
Sigma
„technische Preise“
NAD+
1g
27,-
1 kg
< 1.000,-
NADH
1g
84,-
1 kg
< 2.500,-
NADP+
1g
285,-
1 kg
≈ 10.000,- (1 g = 10,-)
NADPH
1g
950,-
1 kg
≈ 30.000,- (1 g = 30,-)
ohne Cofaktorregenerierung
1 kg Produkt = 4 mol
=>
4 mol NADPH werden benötigt
=>
3.2 kg NADPH =
100.000,- (Sigma-Preise)
mit Cofaktorregenerierung
1) NADP+ statt NADPH
2) ttn (total turnover number) 1000 (durchgeführt) (ttn ≥12.000 aus Literatur bekannt)
pro mol Produkt / 1 mmol NADP+
pro kg Produkt (4 mol) / 4 mmol NADP+ = 3.2 g =
32,- (Sigma 3.2 g NADP+ =
900,-)
4
Beispiel für Hintergrundwissen B
Stereoselektive Synthese
Chemoenzymatische Synthese nicht als Konkurrenz sondern Ergänzung
zur „klassischen“ stereoselektiven Synthese.
Vergleich Enzyme mit katalytischer asymmetrischer Synthese:
Dave Evans, Eric Carreira,
Clayton Heathcock
Aldol – Reaktionen
Enolat – Chemie
Barry Sharpless
„Oxidationen“
Epoxidierung (Katzuki)
Asymmetrische Dihydroxylierung (AD)
Asymmetrische Aminohydroxylierung (AA)
Barry Trost
Übergangsmetalle (Pd)
Eric Jacobsen
Epoxidierung
Epoxidöffnung
R. Noyori
Hydrierung
E: J. Corey
Retrosynthese, Synthese, CBS-Reduktion
C. H. Wong, H. Whitesides
Chemoenzymatische Synthese
Welche Vor- und Nachteile besitzen chemische Katalysatoren?
Welche Vor- und Nachteile besitzen Bio-Katalysatoren?
Beispiele für Nachteile der chem. Synthese:
Sharpless-Epoxidierung nur Allylalkohole
AD, AA nur E-konfigurierte Doppelbindungen
Noyori: hohe Drücke oder hohe Katalysatorkonzentration oder niedrige ee / de
I. Ojima, Catalytic Asymmetric Synthesis, VCH, 2000 (2. Auflage).
Blaser und Schmidt, Asymmetric Catalysis on Industrial Scale, Wiley-VCH, 2004.
5
Enzyme als Katalysatoren
•
•
•
•
•
Sehr effiziente Katalysatoren
Erhöhung Reaktionsgeschwindigkeit kcat/knon 108 – 1014 (teilweise bis 1017)
Chem. Katalysatoren
0.1 – 1 mol %
Enzyme
10-3 – 10-4 mol %
Umweltverträglich
Keine Schwermetallsalze (→ chem. Katalysatoren)
Komplett biologisch abbaubar
milde Bedingungen: pH 5 – 8, 20 – 40 °C
breites Substratspektrum
+ Lösungsmitteltoleranz (teilw.)
+ mögliche Immobilisierung
=> breite Anwendbarkeit
breites Reaktionsspektrum
teilweise Reaktionen, die mit chem. Methoden (noch) nicht möglich sind,
z.B. selektive Oxidation nicht aktivierter C-H’s
CH3
R
CH3
CH3
R
CH3
CH2OH
CH3
R
CH3
CHO
R
CH3
CH3
CO2H
CH3
• sehr selektive Katalysatoren:
Chemoselektivität
Regio- und Diastereoselektivität
Enantioselektivität
• Bevorzugtes Lösungsmittel: H2O
• Enzyme sind chiral (L-Aminosäuren [L-AA])
Wirkstoffe:
Eutomer (höher aktives Enantiomer)
Distomer (weniger aktiv oder unerwünschte Wirkung)
„Eudismic ratio“
Aktivität E
Aktivität D
Nachteile Enzyme
• Enzyme sind chiral (nur L-AA)
chem. Katalysatoren lassen sich in aller Regel einfacher in beiden
enantiomeren Formen darstellen
• milde Bedingungen
-78 °C, 180 °C, pH 1, pH 14 => nicht möglich mit Enzymen
(Stabilitäts- oder Reaktivitätsverlust)
aber: 200 bar: möglich!
• bevorzugtes Lösungsmittel: H2O (geringe Löslichkeit vieler organischer
Substanzen in H2O)
• können empfindlich auf Inhibition reagieren
• mögliche Allergene / biol. Wirkstoffe
z.B. Prionen-Problem:
Famulok et al, Angew. Chemie 1997, 109, 1748-1769.
6
Beispiel für Hintergrundwissen C
Thesen und Antithesen
Was ist ein Biokatalysator?
Enzym = Protein (Protein: Peptid, Enzym: aktive Form)
aber auch:
- katalytische Antikörper
(abzymes)
- katalytische RNA
(Ribozymes)
- katalytische DNA
(Deoxyribozymes)
M. Famulok und P. Burgstaller, Synthetic Ribozymes and Deoxyribozymes,
Organic Synthesis Highlights III. Seite 173 - 184.
Ein Enzym = ein (Bio)katalyseschritt?
Ein (Bio)katalyseschritt = ein Enzym
gilt nur teilweise
Beispiel:
- Polyketidsynthasen
- oxidative Phenolkupplung (Radikal)
- „Diels-Alderasen“
vgl. Chemie: früher ebenfalls Einschrittreaktionen; heute: Dominoreaktionen
Nachr. Chem. Tech. 2000, 3, 264-269.
Ein Enzym
ein Enantiomer als Produkt bevorzugt gebildet
gilt fast immer, es gibt aber auch Ausnahmen:
Thermoanaerobium brokii ADH (TB-ADH)
Zeikus et al, Enzyme Microb. Technol. 1981, 3, 144.
Thermoanaerobacter ethanolicus ADH (99 % Sequenzidentität mit TB-ADH)
„racemic temperature“ (in diesem Fall 26°C)
Phillips et al, Tetrahedron: Asymmetry 1991, 2, 343.
Grund: bei unterschiedlichen Temperaturen unterschiedliche Beiträge
von ∆H (Enthalpie) und ∆S (Entropie)
7
Ein Metabolit = ein Biosyntheseweg
gilt nur teilweise
z.B.
- Shikimat – Biosyntheseweg
3 DAHP-Synthase – Isoenzyme in E. coli (Eingangsenzym)
- Shikimat + Aminoshikimat – Biosynthesewege
(parallel nebeneinander existierend)
- Mevalonat und – non-mevalonic-(MEP) pathway (M. Rhomer, D. Arigoni)
Sequenzinformation von Enzymen/Proteinen in DNA-Sequenz festgelegt
DNA
Transcription
mRNA
Translation
Protein
gilt uneingeschränkt nur teilweise
DNA
Introns
DNA
Transcription
mRNA
Protein
Introns (z.B. in Eukaryonten)
Transcription
mRNA
Beispiel für Posttranslationale Modifikation:
Protein-Spleißen
Translation
Inteine
Translation
Protein
posttranslationale
Modifikation:
Protein-Spleißen
Exteine
Enzym
8
Sequenzinformation von Enzymen/Proteinen in DNA-Sequenz festgelegt
Perler et al., Angew. Chemie 2000, 112, 458-476.
weiteres Beispiel für posttranslationale Modifikation :
Glycosylierung! (häufig in Eukaryonten)
siehe z. B.
Walsh et al, Angew. Chemie 2005, 117, 7508-7539.
Drei Basenpaare = ein Codon = 1 AA
ja, aber 4 Basenpaare = 1 unnatürliche AA: Sisido et al., JACS 1999, 112, 12358.
genetische Information
DNA (+ RNA)
ja, aber wäre es auch denkbar dass?
DNA => mRNA => Protein (Selbstreplikation)
=> Protein
=> Protein
=> Protein
Ghadiri et al, Nature 1997, 382, 525.
S. Hoffmann, Artificial Replication Systems, in Organic Synthesis Highlights III,
VCH 1998.
9
Natürliche AA:
alle L ?
z.B. D-Ala beteiligt an der Zellwandbiosynthese von Mikroorgansimen
- proteinoge AA:
20 (?)
21 (?) Selenocystein (Selen als Spurenelement)
22 (?) Pyrrolysin (Archaae)
- natürliche Zucker:
alle D (?)
- chirale Naturstoffe:
enantiomerenrein (?)
von racemisch bis > 99.9 % ee alles vertreten
D-Proteine:
Merrifield Synthese (99 AA)
- Synthese L-Protein
- Synthese D-Protein
Kent et al., Science 1992, 256, 1445 (D-Protein)
Ergebnis: Proteine sind in allem (Primär-, Sekundär-, Tertiär-Struktur, Aktivität)
absolut spiegelbildlich
C. B. Anfinsen, Science 1973, 181, 223
weshalb D-Proteine:- spiegelbildliche Aktivität
- stabil gegen Proteasen (weil L-Proteasen)
- Peptidantibiotika enthalten auch D-AA => Orale Wirksamkeit
G. Jung, Angew. Chemie 1992, 104, 11
Ein Enzym = ein Protein (absolut identische Sequenz) ?
z.B.
Pig liver esterase PLE, Schweineleber Esterase: Besteht aus 5 Isoenzymen
(sehr ähnliche aber nicht identische Enzyme) unterscheiden sich in Substratspektrum,
Aktivität, Selektivität
Untersuchung isolierter Enzyme (einzelne Proteinmoleküle)
einzelne Enzyme unterscheiden sich um Faktor 4 – 23 in ihrer Aktivität
Sequenz alleine bestimmt nicht zwangsläufig Struktur und Aktivität
Gründe: - unterschiedliche Faltungen
- posttranslationale Modifikation
Q. Xue, E. S. Yeung, Nature, 1995, 373, 681.
Dorichi et al, JACS, 1996, 118, 5245 – 53.
D. B. Craig, N. J. Dovichi, Can. J. Chem. 1998, 76, 623 – 26.
vgl.hierzu: Famulok et al., Angew. Chem. 1997, 109, 1748 – 69.
vgl. Yan et al., JACS 2006, 128, 11008 – 11009 (Einschluß einzelner Proteine).
10
Zitat:
Prion-Krankheiten werden wahrscheinlich durch einen von Nucleinsäuren
unabhängigen Erreger hervorgerufen. Nach dem gegenwärtigen Stand der
Wissenschaft wird als Erreger eine strukturelle Isoform des Prion-Proteins
angesehen, die Scrapie-Form PrPSc. Diese unterscheidet sich von der
normalen zellulären Isoform PrPSc nicht in der Aminosäuresequenz,
vermutlich aber in der Raumstruktur. Nach einer weithin akzeptierten
Hypothese wird die normale Isoform des Proteins bei Kontakt mit der
Scrapie-Isoform in einer Art autokatalytischem Prozeß ebenfalls in die
Scrapie-Form umgewandelt. PrPSc ist bezüglich der Aminosäuresequenz
und der Ladungsverteilung identisch mit der nichtinfektiösen Isoform dieses
Proteins, dem zellulären Prion-Protein PrPSc.
Zum tieferen Verständnis von Biokatalysatoren benötigte Grundlagen:
•
•
•
•
•
•
•
•
Biosynthese
Biochemie
Katalyse-Mechanismus
Natürliche Substrate / Produkte (nicht immer logisch)
Stereochemie
Unnatürliche Substrate / Org. Synthese
Technische Chemie
3D-Struktur / Theoretische Chemie
Interdisziplinarität Voraussetzung
Regelmäßigkeiten erkennen => Ausnahmen generieren
mit - genetic engineering (enzyme engineering)
- substrate engineering
- reaction engineering
z.B. BAL
- 2 Enantiomere
- 1 Mutation im Vgl. zu BFD im active site
(Mutation umkehrbar)
- C-C-Verknüpfung + C-C-Spaltung
11
2. Vorlesungsstunde
Enzyme als Katalysatoren
•
•
•
•
•
Sehr effiziente Katalysatoren
Erhöhung Reaktionsgeschwindigkeit kcat/knon 108 – 1014 (teilweise bis 1017)
Chem. Katalysatoren
0.1 – 1 mol %
Enzyme
10-3 – 10-4 mol %
Umweltverträglich
Keine Schwermetallsalze (→ chem. Katalysatoren)
Komplett biologisch abbaubar
milde Bedingungen: pH 5 – 8, 20 – 40 °C
breites Substratspektrum
+ Lösungsmitteltoleranz (teilw.)
+ mögliche Immobilisierung
=> breite Anwendbarkeit
breites Reaktionsspektrum
teilweise Reaktionen, die mit chem. Methoden (noch) nicht möglich sind,
z.B. selektive Oxidation nicht aktivierter C-H’s
CH3
R
CH3
CH3
R
CH3
CH2OH
CH3
R
CH3
CHO
R
CH3
CH3
CO2H
CH3
• sehr selektive Katalysatoren:
Chemoselektivität
Regio- und Diastereoselektivität
Enantioselektivität
• Bevorzugtes Lösungsmittel: H2O
• Enzyme sind chiral (L-Aminosäuren [L-AA])
Wirkstoffe:
Eutomer (höher aktives Enantiomer)
Distomer (weniger aktiv oder unerwünschte Wirkung)
„Eudismic ratio“
Aktivität E
Aktivität D
12
Enzyme als Katalysatoren
Allgemein:
Enzymes function by lowering transition-state energies and
energetic intermediates and by raising the ground state energy.
Aber:
Mindestens 21 verschiedene Hypothesen (Stand 2000)
Mechanistische Aspekte:
Katalysator (ganz allgemein):
Stabilisierung des Übergangszustandes gegenüber Grundzustand
→ Abnahme der Aktivierungsenergie
→ dies führt zu rate acceleration
Values for kcat/Km at 25 °C
from the literature.
Wolfenden and Snider, Acc. Chem. Res. 2001, 34, 938 – 945.
13
Logarithmic scale of kcat and
knon values for some
representative reactions at
25 °C. The length of each
vertical bar represents the rate
enhancement by ADC =
arginine decarboxylase; ODC
= orotidine 5'
-phosphate
decarboxylase; STN =
staphylococcal nuclease; GLU
= sweet potato -amylase;
FUM = fumarase; MAN =
mandelate racemase; PEP =
carboxypeptidase B; CDA = E.
coli cytidine deaminase; KSI =
ketosteroid isomerase; CMU =
chorismate mutase; CAN =
carbonic anhydrase.
Wolfenden and Snider, Acc. Chem. Res. 2001, 34, 938 – 945.
Figure 6 Logarithmic scale of
kcat/Km and knon values for
some representative reactions
at 25 °C. The length of each
vertical bar represents
transition-state affinity or
catalytic proficiency (its
reciprocal).
Wolfenden and Snider, Acc. Chem. Res. 2001, 34, 938 – 945.
14
Enzymmodelle:
1. Schlüssel-Schloß-Prinzip (lock and key)
E. Fischer, Berichte dtsch. Chem. Gesellschaft 1894, 27, 2985.
Voraussetzung: „feste“ (rigide) Enzymstruktur zu stark vereinfachend, bei
Schlüssel-Schloß-Prinzip fehlt z.B., dass Substanzen die geringeren räumlichen Anspruch
haben als die Substrate und den Substraten ähnlich sind, trotzdem oft nicht als solche
akzeptiert werden (und umgekehrt!).
2. Induced-Fit Mechanismus
Koshland und Neet, Ann. Rev. Biochem. 1968, 37, 359.
Hand – Handschuh
Substrat – Enzym
Enzym ändert durch die Anbindung des (eines) Substrats seine Form → Aktivität.
Flexibilität von Enzymen wurde schon früher von Linus Pauling als wichtiges Merkmal
der Enzymkatalyse postuliert.
Chem. Eng. News 1946, 24, 1375.
Am. Sci. 1948, 36, 51.
Vgl.
3. Desolvation- und Solvation-Substitution-Prinzinp
M. J. S. Dewar, Enzyme 1986, 38, 8.
Creighton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1989, 86, 520.
Wasser innerhalb active site wird durch Substrat ersetzt → formale Gas-Phasen-Reaktion.
Wasserhülle um Substrat wird ersetzt (energetisch ungünstig) → Destabilisierung des
Grundzustandes.
Zur Zeit (2000) 21 verschiedene Modelle für Emzymkatalyse;
allen gemeinsam:
alle Enzymreaktionen werden initiiert durch
die Bildung eines Enzym-Substrat-Komplexes (ES).
Bindungskräfte, die in ES-Komplex-Bildung involviert sind:
Kovalente-Bindung
(-40 bis -110 kcal/mol)
Ionen-Paar-Bindung (elektrostatisch)
(bis -5 kcal/mol)
Ion-Dipol oder Dipol-Dipol-Bindung
Wasserstoffbrücken
(-1 -bis -3 kcal/mol)
Charge-Transfer Komplex
(z.B. π-π-stacking, edge-to face)
Hydrophobe Wechselwirkungen
(-0.5 kcal/mol)
van-der-Waals-Kräfte
(-0.5 kcal/mol)
(Werte bezogen auf ∆G°)
wichtig: viele kleine Kräfte können zusammen einen starken Effekt bewirken
15
Anmerkung zur Wasserstoffbrückenbindung:
z.B. bei thermophilen Enzymen werden wesentlich mehr (>100) Wasserstoffbrückenbindungen als bei psychrophilen Enzymen gebildet.
Hydrophobe Wechselwirkungen:
Nicht van-der-Waals-Wechselwirkungen, sondern Abnahme der freien Energie
durch zunehmende Entropie der Wassermoleküle, die die beiden hydrophoben
Gruppen umgeben.
Bindung ist wichtig bei hohen kcat kann aber „release“ geschwindigkeitsbestimmend werden → Reaktion wird diffusionslimitierend.
Lösung:
Enzyme binden Übergangszustand ca. 1012 mal stärker als
das Substrat oder Produkt!
→ nach Reaktion (Bindungsknüpfung oder Spaltung) keine starke
Wechselwirkungen in active site mit Produkt
→ „release“ des Produktes sogar durch Abstoßung möglich.
Den Trick, den Enzyme vollführen müssen, ist die unstabile ÜbergangszustandsStruktur stark zu binden (mit einer „lifetime“ einer Bindungsschwingung) und
nicht das Substrat oder Produkt.
Enzym-Mechanismen
Eyring-Gleichung:
Enthalpie:
Änderung in Bindungsenergie (dominiert)
Entropie:
Orientierung, Rotation, Translation, Konzentrations- und
Lösungsmittel-Effekte
1. Annäherung
in die räumliche Nähe bringen von (zwei) Reaktanten
→ Verlust an konformationeller Freiheitsgrade, fest vorgegebene Orientierung
→ Reaktion wird erster Ordnung statt zweiter Ordnung in Lösung
≅ Erhöhung der effektiven Konzentration der Reaktanten
2. Kovalente Katalyse
vor allem bei proteolytischen Enzymen
z.B. nukleophile Katalyse (entspricht dem anchimeren Effekt in der chemischen
Katalyse) Beispiel: Serin-Protease (Serin als Nukleophil)
16
3. Allgemeine Säure/Base-Katalyse
z.B. Serin-Protease
R-OH schlechtes Nukleophil, R-O- wesentlich besseres Nukleophil
Katalytische Triade: Aspartat (Asp)-Histidin (His)-Serin (Ser)
pka-Werte in Lösung unterscheiden sich deutlich von pka in active site (zum Teil
wegen der niedrigeren Polarität innerhalb der Enzymtasche)
→ pka steigt (Säure)
→ pka sinkt (Base)
Niedrigere Polarität innerhalb der Enzymtasche entspricht eher Benzol als Wasser
(Dielektrizitäts-Konstante innerhalb Proteinen ca. 2-3;
im Vergleich dazu: Benzol: 2.28, Wasser: 78.5)
Eigentlich ist es nicht möglich, mit einem Carboxylat (Asp-CO2-) (pka 3.9)
Histidin (Imidazol) zu deprotonieren (pka 6.1); ebenso kann Histidin Serin (pka 14)
nicht deprotonieren.
Dies gilt aber nur in (wässriger) Lösung.
Aufgrund der pka-Werte wäre Enzymkatalyse nicht möglich.
Aber: Protonen-Transfer-Schritte nicht einzeln betrachten. Gleichzeitiger Angriff
von von SerO- an Carboxylgruppe → dadurch wird Gleichgewicht verschoben.
Beispiel für selektive Säure-Base-Katalyse:
Enzyme können gleichzeitig mit Säure und Base aktivieren.
Kann man diese Effekte addieren?
Chemische Katalysatoren: resultieren immer bei pH 7 = Neutralisation
Ausnahme: neue Katalysatorsysteme : Lewis-Säure + Base gleichzeitig.
Shibasaki et al. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 2641.
Beispiel: Enolisierung von Mandelsäure (Mandelat Racemase)
Durch Säure-Katalyse wird pka soweit erhöht, dass eine Base deprotonieren kann
(vgl. Benzyl-methylketon-Problem) s. Silvermann S. 24
Vgl. Esterhydrolyse, katalysiert durch Säure (Erhöhung der Elektrophilie)
oder Basen (Erhöhung der Nucleophilie)
17
4. Low-barrier-hydrogen-bond
Schwache H-Brücken-Bindung wird im Übergangszustand zu einer starken
H-Brücken-Bindung. Übergangszustand wird durch 4-20 kcal/mol stabilisiert
(vgl. normale H-Brücken bis zu –3 (-5) kcal/mol).
Cleland et al. J. Biol. Chem. 1998, 273, 25529, Science 1995, 269, 104.
5. Elektrostatische Lösung
z.B. Serin-Protease
Asp
His
Ser
Ala
Ala
Ala
rate acceleration
109
103 (im Vgl. zur unkatalysierten Reaktion)
Mutante: D32A, H64A, S221A
→ neben nukleophiler Katalyse, general base catalysis, elektrostatische Katalyse
Dies ist ein wichtiges Beispiel dafür, dass das gesamte Enzym benötigt wird um
die Katalse durchzuführen. Räumliche Annäherung des Substrats an Serin ist
genauso wichtig wie die katalytische Triade!
Carter and Wells, Nature 1988, 332, 564 – 568.
6. Desolvation und Solvation-Substitutionsprinzip
Entfernen von Wassermolekülen von geladenen Gruppen im active site
durch Substrat.
→ Destabilisierung des Grundzustandes.
z.B. Rucker und Byers J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 8365.
Beitrag von Desolvation eines Dianions resultiert in
105-facher Reaktionsbeschleunigung.
Desolvation monoanionischer Nukleophile resultiert nur in
100-facher Beschleunigung.
Bei neutralen Nukleophilen kann Desolvation (z.B. Ersatz von Wasser-Hülle
durch DMSO) inhibitorische Wirkung haben.
18
7. (Ring)-Spannung und „distortion“
am Enzym → hoch energetischer Zustand
am Substrat → Erhöhung der Energie des Grundzustandes durch
Destabilisierung. Dies führt zu einer höheren Reaktivität
vgl. Ether – Epoxide, Epoxide sind deutlich reaktiver als andere Ether.
Ringspannung und „distortion“ bezieht sich auf Substrat und Enzym.
Vgl. induced-fit-Mechanismus bei Koshland → Enzym kann in einen
hoch energetischen Zustand überführt werden.
8. Negative Katalyse (Reaktionsselektivität)
Review: J. Rétey Angew. Chem. 1990, 102, 373.
Zitat: Die Selektivität solcher Reaktionen wird daher eher durch das
Verhindern unerwünschter Reaktionen als durch die Förderung der
eigentlichen Zielreaktion bedingt.
Zusammenfassung
Für „rate-enhancement“ sind verschiedene Faktoren zuständig.
Der jeweilige Beitrag der verschiedenen Mechanismen hängt stark von
der Natur der zu katalysierenden Reaktion (Substrate, Intermediate, Produkte,
basisch, nukleophil ...) ab.
→ allgemeine Erklärung nicht einfach möglich.
Bindungsenergie führt zu einer Stabilisierung des Übergangszustandes (ÜZ),
aber Grundzustand (ES bzw. EP) wird auch abgesenkt
→ Destabilisierung ist notwendig.
z.B. durch
- strain
- distortion
- Entropie-Verlust
Stabilisierung des Übergangszustandes (ÜZ) wichtiger als Destabilisierung
des Grundzustandes.
19
Enzyme
No Enzyme
+ Binding Energy
+ Binding Energy
+ Destabilization
S
P
E+S
E+P
E+S
ES
EP
E+P
∆GD
-T∆S
ES
A
EP
B
C
X. Zhang, K. N. Houk et al., Acc. Chem. Res. 2005, 38, 379 - 385.
Beitrag der kovalenten Katalyse für effiziente
Enzymkatalyse vermutlich bedeutend.
Wolfenden and Snider, Acc. Chem. Res. 2001, 34, 938 – 945.
20
3. Vorlesungsstunde
Zusammenfassung 2. Vorlesung (Gründe für Aktivität)
Für „rate enhancement“ sind verschieden Faktoren zuständig.
Der jeweilige Beitrag der verschiedenen Mechanismen hängt
stark von der Natur der zu katalysierenden Reaktion ab.
(Substrate, Intermediate, Produkte, Basisch, Nucleophil, …)
allgemeine Erklärung nicht einfach möglich
Gründe für Selektivität
Drei-Punkte-Regel (stark vereinfachend, gilt zum Teil nicht)
- Chiralitätszentrum
D
A'
D
A' A
A
B
C
B'
optimaler fit
C'
C
B
C'
B'
nicht bevorzugt
Enantiotopic discrimination: (Enantiotope Diskriminierung)
21
Gründe für Selektivität
- Prochiralität
pro S
pro R
A
A
A' A
A
A'
B
C
C'
B
C
C'
B'
B'
optimaler fit
nicht bevorzugt
A ersetzen durch A*, A* > A > B > C
R: A ist pro R
S: A Ist pro S
Enantioface discrimination
(Enantiofaciale Diskriminierung)
Re-face
Si-face
A' A
A' B
x
C
B
B'
optimaler fit
x
C'
C
C'
A
B'
nicht bevorzugt
22
Enantioface Discrimination
(Enantiofaciale Diskriminierung)
z.B. prochivales Molekül
H3C
OH
∧
=
HO
Beispiel für meso-Verbindung
CH3
H3C
CH3
* *
H3CO2C
H3CO2C
CO2CH3
H3CO2C
PLE
H3C
CO2CH3
HO
H3C
CH3
* *
H3CO2C
CO2CH3
CO2CH3
PLE
PLE
OH
∧
=
CH3
H3C
CH3
* *
H3CO2C
CO2H
H3CO2C
CO2H
HO2C
CO2CH3
Kinetische Gründe für Selektivität
E: Enzym
A: Substrat
B: Substrat (Stereoisomer von A)
A
EA
E + P1
B
EB
E + P2
E
EB
∆G
EA
∆∆G++
E + A,B
E + P2
E + P1
23
G++ sein für ee 99%?
Wie groß muß
G++ =
G++ - T ·
G++ = - RT ln
S++
K1
K2
G++ (kcal/mol)
ee
K1/K2
10
1.22
0.118
50
3
0.651
90
19
1.74
95
39
2.17
99
199
3.14
99.9
1999
4.50
Stereoselektivität E =
k cat
Km
L
k cat
Km
D
ee =
P1 − P2
⋅ 100
P2 + P2
Kinetik
Michaelis-Menten
v = vmax
[E]
E ++ [S]
S
K1
K -1
[ES]
ES
[EP]
EP
K2
[E]++P[P]
E
[S]
Km + [S]
vmax = K2 [E]
Annahme: K1 >> K2,
v = K2
[E] [S]
Km + [S]
K2 = kcat (turnover number) (first order)
Km: Michaelis-Menten Konstante (bei ½ vmax)
(Dissoziationskonstante des ES-Komlexes)
v
vmax
1v
max
2
Km
[S]
(M)
24
Km:
ist unabhängig von der Enzymkonzentration
üblich: 10-6 – 10-2 M
vmax:
max. Reaktionsgeschwindigkeit
wenn jedes Enzym mit Substrat gesättigt ist (Substrat-Sättigung)
üblich: 103 – 104 sec-1
katalytische Aktivität: 1U ≅ katalysiert die Umsetzung von 1 mol/min
bei spez. Bedingungen (pH, Temp.)
unkatalysiert
Energie
kcat
+
[ES]+
Km
kcat
E+S
E+P
ES
EP
k cat
Km
= spezifische Konstante bezieht
sich auf Reactions rate von
freiem Enzym und Substrat
für obiges Beispiel:
kcat
K ⋅K
= 1 2
Km K−1 + K−2
(second order)
dient dazu, verschiedene Substrate
auf Effizienz hin zu vergleichen
Bestimmung der kinetischen Konstante dient dazu, optimale
Reaktionsbedingungen zu generieren (Produktivität, Selektivität)
Durchführung:
Anfangsreaktionsgeschwindigkeit in Abh. von [S]
bei konstantem pH, [E], …
Verschiedene Möglichkeiten der Auftragung:
- Michaelis-Menten
- Lineweaver-Burk
-...
25
- Lineweaver-Burk
- plot
- procedure
(häufig benutzt)
1
Km
1
=
+
v vmax ⋅ [S] vmax
Nachteil: Werte für hohe [S] fallen in engen Bereich
1
1
Plot : gegen
v
[S]
1
v
Km
Steigung = v
max
vmax
1
- Km
1
[S]
0
v = v max
v
Plot : v gegen
v
+v
[S]
v
− Km
[S]
v max = K m
- Eadie- Hofstee
vmax
Steigung = - Km
v
[S]
vmax
Km
v
[S]
genauer als Linewear-Burk, aber historisch seltener benutzt
Problem: v auf beiden Achsen → Fehler bei Messungen verstärken sich
heute PC-Programme zur Bestimmung kinetischer Konstanten
26
Enzym-Inhibierung
Definition:
Abnahme der enzymatischen Aktivität aufgrund
geänderter Reaktionsparameter
A: Reversible Inhibierungen
1) competitive
2) noncompetitive
3) uncompetitive
4) mix 1-3
v
ohne Inhibitor
vmax
nonspecific
inactivation
competitive
noncompetitive
[S]
Enzym-Inhibierung
1. competitive Bindung eines Inhibitors nahe oder in active site
Substrate und Inhibitor konkurrieren
vmax bleibt gleich, Km wird größer mit zunehmender Konz. Inhibitors [I]
1
v
zunehmende Konz. [I]
1
vmax
1
- Km
[I] = O
1
[S]
27
Enzym-Inhibierung
2. noncompetitive
Inhibitor und Substrat greifen nicht an gleicher Seite des Enzyms an
Erklärung: Inhibitor bindet gleich gut an Enzym und ES-Komplex
zunehmend
1
v
[I] = O
1
[S]
Enzym-Inhibierung
3. uncompetitive
Inhibitor greift ES-Komplex, aber nicht freies Enzym an
1
v
zunehmend
[I] = O
1
[S]
28
Enzym-Inhibierung
4. mixed Inhibition
Inhibitor bindet unterschiedlich gut an freies Enzym und ES-Komplex
1
v
1
v
zunehmend
[I] = O
[I] = O
1
[S]
1
[S]
Enzym-Inhibierung
B: Irreversible Inhibierungen
1) Affinity labeling
zuerst E · I -Komplex, anschließend kovalente Bindung mit active site
2) Mechanismus-basierende Inaktivierung
E + I → E · I → E · I’
↓
E + I‘
Enzym und Inhibitor führen zunächst Reaktion durch
anschließend wirkt I‘ als Inhibitor
29
Enzym-Inhibierung
C: Substrat Inhibierung
v
1
v
partielle Substrat
Inhibierung
komplette
Verlauf ohne
Inhibierung
partielle
komplett
[S]
1
[S]
Erklärung: Bildung von E • S • S
Problem: besprochene Kinetiken gelten für Ein-Substrat-Enzym (z.B. Lyasen);
für Multi-Substrat-Systeme wesentlich komplexer
z.B. Ping-Pong -Mechanismus
E+A
E.A
E'. P
E'+ P
.
.
E+Q
E'+ B
E' B
E Q
(gilt z. B. für Gruppen-Transfer)
1
v
[B]
zunehmend
1
[S]
30
4.- 5. Vorlesungsstunde
Einführung in präparative Biotransformation
Allosterischer Effekt (heterotropisch)
vor allem regulatorische Effekte in Biosynthese
E.B+A
E+B
E.B.A
E+B+P
Enzym ist erst jetzt aktiv oder besonders aktiv
(Änderung der Konformation des Enzyms)
Cooperativität (homotropisch)
wenn B = A, d.h. Effektor ist gleichzeitig Substrat
positive oder negative Cooperativität möglich
v
keine Cooperativität
positive Cooperativität
negative Cooperativität
(noncompetative Inhibierung)
[S]
31
Welche verschiedenen grundsätzlichen Reaktortypen gibt es?
[S]0
[P]
t0
[S]1
Batch:
t1
[S]e
[S]
te
x
t
Strömungsrohr:
[S]0
[P]
x0
[S]1
x1
dx
[S]e
[S]
xe
x
t
Kontinuierlich betriebener
Rührkessel (CSTR):
[P]
[P]
[S]
[S]
x
t
Problemstellung: enantioselektive Reduktion von Benzyl-methylketonen
(Acetophenon-Derivate)
Beispiel 1
(Beispiel für Ganzzell-Biotransformation)
Problemstellung:
OMe O
OMe O
OR
O
O
MeO
Me
MeO
Me
(Dihydroisocumarin)
K. Krohn et al., Phytochemistry 1997, 45, 313-320.
Aufgabenstellung:
- Bestimmung der absoluten Konfiguration
durch Synthese
- Synthese beider Enantiomeren!
versuchte Reduktion mit: - chemischen Katalysatoren < 62% ee
- isolierte ADH’s: keine Aktivität
32
Versuch Krohn et al.:
• 50 g BY
• 1 L 100 mM Tris-puffer (pH 6.8) + 10 g Glucose
• 254 mg Substrat (1 mmol)
• 42 d schütteln (nicht rühren); jeden 4. Tag + 10 g Glucose
110 g Glucose
Aufarbeitung:
Zentrifugation (zum Abtrennen störender Zellbestandteile, z.B. DNA,
Protein, Zellwand)
4 x 200 ml Et2O
Resultat:
OMe O
OMe O
O
MeO
OH
O
+
Me
MeO
Me
100 mg Säure
55 mg Produkt
(25% Ausbeute)
Vorteil:
ee > 99 % (R)
Säure bildet sich aufgrund von Nebenaktivitäten
Nachteil:
- lange Reaktionszeit, geringe Ausbeute
- umständliche Aufarbeitung (800 ml Et20
55 mg Produkt)
- Nebenreaktion (Esterhydrolyse durch Lipasen / Esterasen)
- nur ein Enantiomer zugänglich
Ausweg:
1. chemische Reduktion:
Übersicht Keton-Reduktion
E. J. Corey, C. J. Helal, Angewandte Chemie, 1998, 110, 2092-2118.
S. Itsumo, Organic Rections, Vol 52, 1998.
(sehr gute, umfassende Übersicht)
Problem:
O
Katalysatoren
Me
OH
Me
Phenylaceton
Phenylaceton:
als Substrat sehr gut untersucht, sehr gute
Katalysatoren bekannt (chem. und biol.)
Aber:
o-substituierte Benzyl-methylketone
•sehr wenige Beispiele aus Literatur
•sterische Effekte! (+ elektrische Effekte)
•mögliche Keto-Enol-Tautomisierung
33
gleiche Probleme wie bei chemischen Reduktionen
2. isolierte Enzyme
vergleiche Biosynthese
(aus dem Wissen der Biosynthese heraus das passende Enzym auswählen?)
O
O
O
SCoA
+ 4
Acetyl-CoA
SCoA
CO 2H
O
O
O
SCoA
O
O
Malonyl-CoA
O
OH
SCoA
OH
O
O
O
HO
O
Me
Polyketid
(Pentaketid)
Biosynthese:
Staunton et al., J. C. S. Chem. Comm., 1987, 586-87.
JCS Perkin Trans 1, 1981, 1397-1400.
kein Enzym, was Benzyl-methylketon als natürliches Substrat akzeptiert
in diesem Fall macht eine biomimetische Synthese keinen Sinn
versuchte Ganzzellbiotransformation mit BY
Beispiel 2
Synthese von (S)-8-O-Methylmellein
Müller et al., Synthesis, 1999, 2045 - 48. (Beispiel für substrate
engineering) Screening nach isolierten ADH
R
O
R
ADH
OH
Me
R=
A-valuee
Me
Er
H
Es
Aktivität CPCR
0
100
CO2CH3
1.2
17
≅ -1.5
0
F
0.25
2.7
- 0.46
100
OCH3
0.75
31
- 0.55
30
CN
0.2
4.7
- 0.51
21
(CPCR: Carbonyl Reduktase aus Candida parapsilosis)
CN als „Carboxyl-mimik“ sehr gut geeignet
34
1. n-BuLi
2.
H3CO
1. NaNO2
NH2
+
2. Cu /CN
H3CO
N
CN
_
63 %
CH3
2
O
CH3
3
OCH3
4 CH
3
H3CO
CN
O
72 %
5i
NADH
90 %
CPCR
CO2
FDH
NAD+
H3CO
H3CO
O
O
H3CO
+
C NH
OH
_
HCO2
CN
OH
HCl/MeOH
100 %
1 (ee > 99.5 %)
6
Gesamtausbeute 41 %
kürzeste und effizienteste bislang publizierte stereoselektive
Dihydroisocumarin-Synthese
Vorteil:
Nachteil:
- ee > 99,5 % (Nachweisgrenze)
- hohe Ausbeute, einfache Aufarbeitung
- keine Nebenreaktion durch störende Enzymaktivitäten
- Enzymquelle? (nicht käuflich)
jetzt: bei Julich Chiral Solutions erhältlich
5. Vorlesungsstunde
Einführung in präparative Biotransformation II
35
Ganzzell-Biotransformation mit Fest-Phasen Extraktion
Beispiel 3
Anderson et al., JACS 1995, 175, 12358-59.
Me
O
O
O
O
Biokat
Me
O
OH
O
N
N
O
O
Me
Me
H2N
LY 300164
(2,3-benzodiazepine)
Probleme:
„Benzyl-methylketon“
BY (und andere): unselektiv
Zygosaccharomyces rouxii: > 99.9% ee
aber: Substrat und Produkt toxisch für Z. rouxii wenn
Ausweg:
6 g/L
Fest-Flüssig-zwei-Phasen Reaktion
Substrat an XAD7 – Harz (∅ 500 µm) µm (Mikrometer)
(Zellen ∅ 5 µm)
Konzentration:
80 g/L Fermentationsmedium (gebunden an Harz!)
Konzentration in Lösung: ≤ 2 g/L Substrat und Produkt
Aufarbeitung:
Filtration (Ausschluß 150 µm)
Ausbeute:
96 % (im kg-Maßstab)
>99.9% ee
Solid phase extraction in Biocatalysis
Witholt et al., Bioworld 1999, 3 - 9.
Wubbolts et al., Biotech. Bioeng. 1999, 62, 641 - 48.
Servi et al., Tetrahedron: Asymmetry 1999, 10, 3931 - 37.
36
Ganzzell-Biotransformation
(Beispiel für reaction engineering)
Beispiel 4
O
O
O
Cl
BY
O
-60°C
n BuLi
(70% isoliert)
O
Cl
+
O
O Me
3-4
/ kg
Problem:
OH
O
O
Cl
O
ee 90% - 94%
Ausbeute bei klassischer
Aufarbeitung
<< 20%
O
O
8-9
/ kg
Nebenreaktionen
– Furanonbildung
O
O
O
O
– Bildung von Dimeren
O
O
O
H
O
O
O
O
O
vgl. Biosynthese Polyketide!
z.B. Mellein
37
Durchführung:
______ g Substrate
______ g Harz (mesh ______)
______ g BY
______ H2O
By
Substrat
Gleichgewicht
Produkt
Harz +
Substrat
24 h leicht schütteln
abfiltrieren (Glasfritte 0), waschen,
Produkt von Harz eluieren
Gleichgewicht
Ausbeute: > 55%
- Nebenreaktionen fast vollständig unterdrückt aufgrund
- niedriger Substrat-Kontentration in Lösung
Vorteil:
- einfache Aufarbeitung
- Cofaktorregenerierung erfolgt intrazellulär
- 100 % Umsatz wird nur nach langer Verweilzeit
erreicht
Nachteil:
- in diesem Fall:
hoher Umsatz Voraussetzung für Folgechemie
chem. Red.
O
Cl
O
O
BY
O
OH
Cl
O
O
OH
OH
O
Cl
O
O
OH
Cl
OH
O
O
Reste Diketon führen zu einer Erniedrigung des ee’s im Diol
38
Beispiel 6
Kaluzna et al. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 2002, 17, 101-105.
Wolberg et al, Tetrahedron: Asymmetry 2004, 15, 2825-2828.
Verwendung von Enzym-Bibliothek aus BY, Einsatz rekombinanter Enzyme
heterolog expremiert in E. coli.
Beispiel 7
Chartrain et al. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 2000, 8, 285-88.
O
OH
O
O
OCH3
OCH3
Bisarylketon
310 verschiedene Stämme
Bisarylalkohol
8 zeigten Aktivität
Präparative Synthese:
- Rhodotorula ribimanae (ATCC 32762)
- 23 l Fermenter (16 l Medium)
- 1.6 kg Bisarylketon
- 48 h
- 16 l EtOAc
- nach Chromatographie: 92 g Alkohol (ee > 96 % S) (< 10 % yield)
39
Vergleich Ganzzellbiotransformation – isolierte Enzyme – chemische Katalyse
Seelbach und Bachmann, Helv. Chim. Acta 1998, 81, 2430.
Schmidt et al. in Microbial Reagents in Organic Synthesis (Ed.: S. Serri), 1992,
Kluver Academic Publishers, S. 377-388.
Kragl et al., Tetrahedron: Asymmetry 1999,10, 923-28.
Beurteilung eines Katalyseschrittes erfordert die Einbeziehung
verschiedener Kriterien.
Ergebnis kann im Einzelfall sehr unterschiedlich ausfallen, je nachdem,
welches Kriterium entscheidend ist.
- ee
- Immobilisierung des Katalysators möglich?
- Preis
- Cofaktorregenerierung benötigt?
- Raum-Zeit-Ausbeute
- Katalysatorverfügbarkeit
Ganzzellbiotransformation
Enzymatische Katalyse
Availability
gut
++
oft limitierend
+/–
Bedingungen
mild
++
mild
++
Chemische Katalyse
homogen / heterogen
+/–
oft drastisch
(+) / –
Reproduzierbarkeit
variabel
–
konstant
++
konstant
++
Nebenaktivitäten
hoch
–
keine
++
keine
++
Permeabilitätsprobleme
limitierend
–
keine
++
keine
++
Cofaktorregenerierung
intrazellulär
+
Katalysatorkonzentration
unbekannt
limitierend
(+) / –
keine
++
niedrig (10-3-10-4)
+
hoch (0,1-1 %)
–
TTN
unbekannt
hoch
++
niedrig
–
TOF (turn over frequency)
unbekannt
hoch
++
niedrig
–
Preis Katalysator
niedrig
+
mittel
+/–
mittel - hoch
(+ ) / –
Substratkonzentration
niedrig
–
mittel
+/–
hoch
++
Produktrecovery
schwierig
–
einfach
+
einfach
+
ee
mittel - hoch
+/–
hoch
++
mittel - hoch
+/–
Produktivität
(Atomökonomie)
niedrig
–
hoch
+
mittel
(+) / –
Raum-Zeit-Ausbeute
(space time yield)
niedrig - mittel
(+) / –
niedrig - mittel
(+) / –
hoch
++
40