Enzyme in der organischen Synthese

Enzyme in der organischen Synthese
Wintersemester 2006-2007
Michael Müller
Institut für Pharmazeutische Wissenschaften
Tel. 203-6320
[email protected]
Ziel der Vorlesung:
Eine Grundlage für das Verständnis biokatalytischer Transformationen legen.
1. Grundlagen der Biokatalyse (3-4 Wochen)
2. Biosynthese (1 Woche)
3. Verwendung von Hydrolasen (2 Wochen)
4. Verwendung von Oxidoreduktasen (2-3 Wochen)
5. C-C-Bindungsknüpfung (2-3 Wochen)
6. Glycosyl-Transferasen (1 Woche)
7. Radikalreaktionen (1-2 Wochen)
8. State of the art und spezielle Aspekte der Biokatalyse (1-2 Wochen)
1
Enzyme als Katalysatoren
•
•
•
•
•
Sehr effiziente Katalysatoren
Erhöhung Reaktionsgeschwindigkeit kcat/knon 108 – 1014 (teilweise bis 1017)
Chem. Katalysatoren
0.1 – 1 mol %
Enzyme
10-3 – 10-4 mol %
Umweltverträglich
Keine Schwermetallsalze (→ chem. Katalysatoren)
Komplett biologisch abbaubar
milde Bedingungen: pH 5 – 8, 20 – 40°C
breites Substratspektrum
+ Lösungsmitteltoleranz (teilw.)
+ mögliche Immobilisierung
=> breite Anwendbarkeit
breites Reaktionsspektrum
teilweise Reaktionen, die mit chem. Methoden (noch) nicht möglich sind,
z.B. selektive Oxidation nicht aktivierter C-H’s
CH3
R
CH3
CH3
R
CH3
CH2OH
CH3
R
CH3
CHO
R
CH3
CH3
CO2H
CH3
• sehr selektive Katalysatoren:
Chemoselektivität
Regio- und Diastereoselektivität
Enantioselektivität
• Bevorzugtes Lösungsmittel: H2O
• Enzyme sind chiral (L-Aminosäuren [L-AA])
Wirkstoffe:
Eutomer (höher aktives Enantiomer)
Distomer (weniger aktiv oder unerwünschte Wirkung)
„Eudismic ratio“
Aktivität E
Aktivität D
Nachteile Enzyme
• Enzyme sind chiral (nur L-AA)
chem. Katalysatoren lassen sich in aller Regel einfacher in beiden
enantiomeren Formen darstellen
• milde Bedingungen
-78°C, 180°C, pH1, pH14 => nicht möglich mit Enzymen
(Stabilitäts- oder Reaktivitätsverlust) 200 bar: möglich!
• bevorzugtes Lösungsmittel: H2O (geringe Löslichkeit vieler organischer
Substanzen in H2O)
• können empfindlich auf Inhibition reagieren
mögliche Allergene / biol. Wirkstoffe
z.B. Prionen-Problem:
Famulok et al, Angew. Chemie 1997, 109, 1748-1769.
2
Was ist ein Biokatalysator?
Enzym = Protein (Protein: Peptid, Enzym: aktive Form)
aber auch:
- katalytische Antikörper
(abzymes)
- katalytische RNA
(Ribozymes)
- katalytische DNA
(Deoxyribozymes)
M. Famulok und P. Burgstaller, Synthetic Ribozymes and Deoxyribozymes,
Organic Synthesis Highlights III. Seite 173 - 184.
Sequenzinformation von Enzymen/Proteinen in DNA-Sequenz festgelegt
DNA
Transcription
mRNA
Translation
Protein
gilt uneingeschränkt nur teilweise
DNA
Introns
Transcription
mRNA
Translation
Protein
Introns (z.B. in Eukaryonten)
Beispiel für Posttranslationale Modifikation: Protein-Spleißen
DNA
Transcription
mRNA
Inteine
Translation
Protein
posttranslationale
Modifikation:
Protein-Spleißen
Exteine
Enzym
3
Ein Enzym = ein Protein (absolut identische Sequenz) ?
z.B.
Pig liver esterase PLE, Schweineleber Esterase: Besteht aus 5 Isoenzymen
(sehr ähnliche aber nicht identische Enzyme) unterscheiden sich in Substratspektrum,
Aktivität, Selektivität
Untersuchung isolierter Enzyme (einzelne Proteinmoleküle)
einzelne Enzyme unterscheiden sich bis zu Faktor 4 – 23 in ihrer Aktivität
Sequenz alleine bestimmt nicht zwangsläufig Struktur und Aktivität
Gründe: - unterschiedliche Faltungen
- posttranslationale Modifikation
Q. Xue, E. S. Yeung, Nature, 1995, 373, 681.
Dorichi et al, JACS, 1996, 118, 5245 – 53.
D. B. Craig, N. J. Dovichi, Can. J. Chem. 1998, 76, 623 – 26.
vgl.hierzu: Famulok et al., Angew. Chem. 1997, 109, 1748 – 69.
Zum tieferen Verständnis von Biokatalysatoren benötigte Grundlagen:
•
•
•
•
•
•
•
•
Biosynthese
Biochemie
Katalyse-Mechanismus
Natürliche Substrate / Produkte (nicht immer logisch)
Stereochemie
Unnatürliche Substrate / Org. Synthese
Technische Chemie
3D-Struktur / Theoretische Chemie
Interdisziplinarität Voraussetzung
Regelmäßigkeiten erkennen => Ausnahmen generieren
mit - genetic engineering (enzyme engineering)
- substrate engineering
- reaction engineering
z.B. BAL
- 2 Enantiomere
- 1 Mutation im Vgl. zu BFD im active site
( Mutation umkehrbar)
- C-C-Verknüpfung + C-C-Spaltung
4
Enzyme als Katalysatoren
Allgemein:
Enzymes function by lowering transition-state energies and
energetic intermediates and by raising the ground state energy.
Aber:
Mindestens 21 verschiedene Hypothesen (Stand 2000)
Mechanistische Aspekte:
Katalysator (ganz allgemein):
Stabilisierung des Übergangszustandes gegenüber Grundzustand
→ Abnahme der Aktivierungsenergie
→ dies führt zu rate accelaration
Enzymmodelle:
1. Schlüssel-Schloß-Prinzip (lock and key)
E. Fischer, Berichte dtsch. Chem. Gesellschaft 1894, 27, 2985.
Voraussetzung: „feste“ (rigide) Enzymstruktur zu stark vereinfachend, bei
Schlüssel-Schloß-Prinzip fehlt z.B. dass Substanzen die geringeren räumlichen Anspruch
haben als die Substrate und den Substraten ähnlich sind, trotzdem nicht als solche
akzeptiert werden (und umgekehrt!).
2. Induced-Fit Mechanismus
Koshland und Neet, Ann. Rev. Biochem. 1968, 37, 359.
Hand – Handschuh
Substrat – Enzym
Enzym ändert durch die Anbindung des (eines) Substrats seine Form →Aktivität.
Flexibilität von Enzymen wurden schon früher von Linus Pauling als wichtiges Merkmal
der Enzymkatalyse postuliert.
Chem. Eng. News 1946, 24, 1375.
Am. Sci. 1948, 36, 51.
Vgl.
3. Desolvation- und Solvation-Substitution-Prinzinp
M. J. S. Dewar, Enzyme 1986, 38, 8.
Creighton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1989, 86, 520.
Wasser innerhalb active site wird durch Substrat ersetzt → formale Gas-Phasen-Reaktion.
Wasserhülle um Substrat wird ersetzt (energetisch ungünstig) → Destabilisierung des
Grundzustandes.
5
Zur Zeit (2000) 21 verschiedene Modelle für Emzymkatalyse;
alle Enzymreaktionen werden initiiert durch
allen gemeinsam:
die Bildung eines Enzym-Substrat-Komplexes (ES).
Bindungskräfte involviert in ES-Komplex-Bildung
Kovalente-Bindung
(-40 - -110 kcal/mol)
Ionen-Paar-Bindung (elektrostatisch)
(bis –5 kcal/mol)
Ion-Dipol oder Dipol-Dipol-Bindung
Wasserstoffbrücken
(-1 - -3 kcal/mol)
Charge-Transfer Komplex
(z.B. π-π-stacking, edge-to face)
Hydrophobe Wechselwirkungen
(-0.5 kcal/mol)
van-der-Waals-Kräfte
(-0.5 kcal/mol)
(Werte bezogen auf ∆G°)
wichtig: viele kleine Kräfte können zusammen einen starken Effekt bewirken
R. B. Silverman, The organic Chemistry of Enzyme-Catalyzed Reactions,
Academic Press, 2000, S. 7.
6
Enzym-Mechanismen
Enthalpie:
Entropie:
Änderung in Bindungsenergie (dominiert)
Orientierung, Rotation, Translation, Konzentrations- und
Lösungsmittel-Effekte
1. Annäherung
in die räumliche Nähe bringen von (zwei) Reaktanten
→ Verlust an konformationeller Freiheitsgrade, fest vorgegebene Orientierung
→ Reaktion wird erster Ordnung statt zweiter Ordnung in Lösung
≅ Erhöhung der effektiven Konzentration der Reaktanten
2. Kovalente Katalyse
vor allem bei proteolytischen Enzymen
z.B. nukleophile Katalyse (entspricht dem anchimeren Effekt in der chemischen
Katalyse) Beispiel: Serin-Protease (Serin als Nukleophil)
3. Allgemeine Säure/Base-Katalyse
z.B. Serin-Protease
R-OH schlechtes Nukleophil R-O- wesentlich besseres Nukleophil
Katalytische Triade: Aspartat (Asp)-Histidin (His)-Serin (Ser)
pka-Werte in Lösung unterscheiden sich deutlich von pka in active site (zum Teil
wegen der niedrigeren Polarität innerhalb der Enzymtasche)
→ pka steigt (Säure)
→ pka sinkt (Base)
Niedrigere Polarität innerhalb der Enzymtasche entspricht eher Benzol als Wasser
(Dieleketrizitäts-Konstante innerhalb Proteinen ca. 2-3; im Vergleich dazu
Benzol: 2.28, Wasser: 78.5)
Eigentlich ist es nicht möglich, mit einem Carboxylat (Asp-CO2-) (pka 3.9)
Histidin (Imidazol) zu deprotonieren (pka 6.1); ebenso kann Histidin Serin (pka 14)
nicht deprotonieren.
Dies gilt aber nur in Lösung.
Aufgrund der pka-Werte wäre Enzymkatalyse nicht möglich.
Aber: Protonen-Transfer-Schritte nicht einzeln betrachten. Gleichzeitiger Angriff
von von SerO- an Carboxylgruppe → dadurch wird Gleichgewicht verschoben.
7
Beispiel für selektive Säure-Base-Katalyse:
Enzyme können gleichzeitig mit Säure und Base aktivieren. Kann man
diese Effekte addieren?
Chemische Katalysatoren: resultieren immer bei pH 7 = Neutralisation
Ausnahme: neue Katalysatorsysteme : Lewis-Säure + Base gleichzeitig.
Schibasaki et al. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 2641.
4. Low-barrier-hydrogen-bond
Schwache H-Brücken-Bindung wird im Übergangszustand zu einer starken
H-Brücken-Bindung. Übergangszustand wird durch 4-20 kcal/mol stabilisiert
(vgl. normale H-Brücken bis zu –3 (-5) kcal/mol).
Cleland et al. J. Biol. Chem. 1998, 273, 25529, Science 1995, 269, 104.
5. Elektrostatische Wechselwirkung
z.B. Serin-Protease
rate Acceleration
Asp
His
Ser
109
Ala
Ala
Ala
103 (im Vgl. zur unkatalysierten Reaktion)
Mutante: D32A, H64A, S221A
→ neben nukleophiler Katalyse, general base catalysis, elektrostatische Katalyse
Dies ist ein wichtiges Beispiel dafür, dass das gesamte Enzym benötigt wird um
die Katalse durchzuführen. Räumliche Annäherung des Substrats an Serin ist
genauso wichtig, wie die katalytische Triade!
8
6. Desolvation und Solvation-Substitutionsprinzip
Entfernen von Wassermolekülen von geladenen Gruppen im active site
durch Substrat.
→ Destabilisierung des Grundzustandes.
z.B. Rucker und Byers J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 8365.
Beitrag von Desolvation eines Dianions resultiert in
105-fache Reaktionsbeschleunigung.
Desolvation nonoanionischer Nukleophile resultiert nur in
100-facher Beschleunigung.
Bei neutralen Nukleophilen kann Desolvation (z.B. Ersatz von Wasser-Hülle
durch DMSO) inhibitorische Wirkung haben.
7. (Ring)-Spannung und „distortion“
am Enzym → hoch energetischer Zustand
am Substrat → Erhöhung der Energie des Grundzustandes durch
Destabilisierung. Dies führt zu einer höheren Reaktivität
vgl. Ether – Epoxide, Epoxide sind deutlich reaktiver als andere Ether.
Ringspannung und „distortion“ bezieht sich auf Substrat und Enzym.
Vgl. induced-fit-Mechanismus bei Koshland → Enzym kann in einen
hoch energetischen Zustand überführt werden.
8. Negative Katalyse (Reaktionsselektivität)
Review: J. Rétey Angew. Chem. 1990, 102, 373.
Zitat: Die Selektivität solcher Reaktionen wird daher eher durch das
Verhindern unerwünschter Reaktionen als durch die Förderung der
eigentlichen Zielreaktion bedingt.
9
Zusammenfassung
Für „rate-enhancement“ sind verschiedene Faktoren zuständig.
Der jeweilige Beitrag der verschiedenen Mechanismen hängt stark von
der Natur der zu katalysierenden Reaktion (Substrate, Intermediate, Produkte,
basisch, nukleophil ...) ab.
→ allgemeine Erklärung nicht einfach möglich.
Bindungsenergie führt zu einer Stabilisierung des Übergangszustandes (ÜZ),
aber Grundzustand (ES bzw. EP) wird auch abgesenkt
→ Destabilisierung ist notwendig.
z.B. durch
- strain
- distortion
- Entropie-Verlust
Stabilisierung des Übergangszustandes (ÜZ) wichtiger als Destabilisierung
des Grundzustandes.
Enzyme
No Enzyme
S
P
+ Binding Energy
+ Destabilization
+ Binding Energy
E+S
E+P
E+S
ES
EP
E+P
∆GD
-T∆S
ES
A
EP
B
C
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Gründe für Selektivität
Drei-Punkte-Regel (stark vereinfachend, gilt zum Teil nicht)
- Chiralitätszentrum
D
A'
D
A' A
A
C
B
B
C
C'
B'
C'
B'
nicht bevorzugt
optimaler fit
Enantiotopic discrimination: (Enantiotope Diskriminierung)
Gründe für Selektivität
- Prochiralität
pro S
pro R
A
A'
A
A' A
A
B
C
C'
B'
optimaler fit
C
B
C'
B'
nicht bevorzugt
A ersetzen durch A*, A* > A > B > C
R: A ist pro R
S: A Ist pro S
11
Enantioface discrimination
(Enantiofaciale Diskriminierung)
Re-face
Si-face
A' A
A' B
x
C
x
C'
B
C
C'
A
B'
B'
nicht bevorzugt
optimaler fit
Enantioface Discrimination
(Enantiofaciale Diskriminierung)
z.B. prochivales Molekül
H3C
OH
∧
=
HO
Beispiel für meso-Verbindung
CH3
H3C
CH3
* *
H3CO2C
H3CO2C
CO2CH3
H3CO2C
PLE
H3C
OH
CO2CH3
H3C
CH3
* *
H3CO2C
CO2CH3
CO2CH3
PLE
PLE
HO
∧
=
CH3
H3C
CH3
* *
H3CO2C
CO2H
H3CO2C
CO2H
HO2C
CO2CH3
12
Kinetische Gründe für Selektivität
E: Enzym
A: Substrat
B: Substrat (Stereoisomer von A)
A
EA
E + P1
B
EB
E + P2
E
EB
∆G
∆∆G++
EA
E + A,B
E + P2
E + P1
G++ sein für ee 99%?
Wie groß muß
G++ =
G++ - T ·
G++ = - RT ln
S++
K1
K2
G++ (kcal/mol)
ee
K1/K2
10
1.22
0.118
50
3
0.651
90
19
1.74
95
39
2.17
99
199
3.14
99.9
1999
4.50
Stereoselektivität E =
k cat
Km
L
k cat
Km
D
ee =
P1 − P2
⋅ 100
P2 + P2
13
Kinetik
Michaelis-Menten
[E]
E ++ [S]
S
K1
K -1
[ES]
ES
[EP]
EP
K2
[E]++P[P]
E
[S]
v = vmax
Km + [S]
vmax = K2 [E]
Annahme: K1 >> K2,
v = K2
[E] [S]
Km + [S]
K2 = kcat (turnover number) (first order)
Km: Michaelis-Menten Konstante (bei ½ vmax)
(Dissoziationskonstante des ES-Komlexes)
v
vmax
1v
max
2
[S]
Km
(M)
Km:
ist unabhängig von der Enzymkonzentration
üblich: 10-6 – 10-2 M
vmax:
max. Reaktionsgeschwindigkeit
wenn jedes Enzym mit Substrat gesättigt ist (Substrat-Sättigung)
üblich: 103 – 104 sec-1
katalytische Aktivität: 1U ≅ katalysiert die Umsetzung von 1 mol/min
bei spez. Bedingungen (pH, Temp.)
unkatalysiert
Energie
kcat
+
[ES]+
Km
kcat
E+S
E+P
ES
EP
k cat
Km
= spezifische Konstante bezieht
sich auf Reactions rate von
freiem Enzym und Substrat
für obiges Beispiel:
kcat
K ⋅K
= 1 2
Km K−1 + K−2
(second order)
dient dazu, verschiedene Substrate
auf Effizienz hin zu vergleichen
14
Bestimmung der kinetischen Konstante dient dazu, optimale
Reaktionsbedingungen zu generieren (Produktivität, Selektivität)
Durchführung:
Anfangsreaktionsgeschwindigkeit in Abh. von [S]
bei konstantem pH, [E], …
Verschiedene Möglichkeiten der Auftragung:
- Michaelis-Menten
- Lineweaver-Burk
- plot
- procedure
(häufig benutzt)
1
Km
1
=
+
v vmax ⋅ [S] vmax
Nachteil: Werte für hohe [S] fallen in engen Bereich
1
1
Plot : gegen
v
[S]
1
v
Steigung =
Km
vmax
vmax
1
- Km
0
1
[S]
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Enzym-Inhibierung
Definition:
Abnahme der enzymatischen Aktivität aufgrund
geänderter Reaktionsparameter
A: Reversible Inhibierungen
1) competitive
2) noncompetitive
3) uncompetitive
4) mix 1-3
v
ohne Inhibitor
vmax
nonspecific
inactivation
competitive
noncompetitive
[S]
Ganzzellbiotransformation
Enzymatische Katalyse
Chemische Katalyse
homogen / heterogen
Availability
gut
++
oft limitierend
+/–
Bedingungen
mild
++
mild
++
oft drastisch
(+) / –
+/–
Reproduzierbarkeit
variabel
–
konstant
++
konstant
++
Nebenaktivitäten
hoch
–
keine
++
keine
++
Permeabilitätsprobleme
limitierend
–
keine
++
keine
++
Cofaktorregenerierung
intrazellulär
+
Katalysatorkonzentration
unbekannt
limitierend
(+) / –
keine
++
niedrig (10-3-10-4)
+
hoch (0,1-1 %)
–
TTN
unbekannt
hoch
++
niedrig
–
TOF (turn over frequency)
unbekannt
hoch
++
niedrig
–
Preis Katalysator
niedrig
+
mittel
+/–
mittel - hoch
(+ ) / –
Substratkonzentration
niedrig
–
mittel
+/–
hoch
++
Produktrecovery
schwierig
–
einfach
+
einfach
+
ee
mittel - hoch
+/–
hoch
++
mittel - hoch
+/–
Produktivität
(Atomökonomie)
niedrig
–
hoch
+
mittel
(+) / –
Raum-Zeit-Ausbeute
(space time yield)
niedrig - mittel
(+) / –
niedrig - mittel
(+) / –
hoch
++
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