Der transzelluläre Substrattransport durch Exosomen ist notwendig

Der transzelluläre Substrattransport durch Exosomen ist notwendig für die
Immunantwort bei der bakteriellen Pneumonie
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J. Rossaint,1 A. Stadtmann,1 H. Van Aken,1 A. Zarbock1
Klinik für Anästhesiologie, operative Intensivmedizin und Schmerztherapie,
Universitätsklinikum Münster
Fragestellung: Im Rahmen der Pneumonie kommt es zur Aktivierung des
Immunsystems und nachfolgend zu einer Interaktion zwischen polymorphkernigen
neutrophilen Granulozyten (PMNs) und Thrombozyten [1]. Diese Interaktion ist
notwendig für die vollständige Aktivierung von PMNs und die effektive Bekämpfung
von Bakterien. Im Rahmen der Interaktion von Thrombozyten mit Leukozyten kommt
es zu einem transzellulären Substrattransport zwischen den Zellen, der für die
effektive Prostaglandin-Synthese, wie z.B. Thromboxan A2 (TxA2), notwendig ist [2].
Diese Mediatoren sind an der PMN-Rekrutierung in inflammatorisches Gewebe
beteiligt. Exosomen sind exkretorische Zellvesikel, welche Moleküle und Substrate
zwischen verschiedenen Zellen transportieren können. Die Rolle des exosomalen
Transports zwischen PMNs und Thrombozyten und die zugrunde liegenden
molekularen Mechanismen sind jedoch bis jetzt unbekannt. Ziel dieser Studie war es
die Bedeutung und den molekularen Mechanismus des exosomalen Transports im
Rahmen der Thrombozyten-PMN-Interaktion sowie die funktionale Bedeutung für die
Immunfunktion zur Bekämpfung der bakteriellen Pneumonie zu untersuchen.
Methodik: Eine Pneumonie wurde in Mäusen durch Instillation von E. coli induziert
[3]. Nach 24 Stunden wurde die Anzahl der PMNs in der bronchoalveolären Lavage
(BAL) sowie die Anzahl der Bakterien in der BAL, Lunge und Milz quantifiziert (n=4).
Des Weiteren wurde die Anzahl zirkulierender Thrombozyten-PMN-Aggregate
analysiert. Exosomen wurden mit Hilfe kommerzieller Kits (SystemBio) isoliert und
quantifiziert. Zur Darstellung der Exosomenaufnahme in Thrombozyten wurde eine
Immunfluoreszenzfärbung benutzt. Um den transzellulären Metabolismus in vitro zu
untersuchen wurden PMNs mit C14-markierter Arachidonsäure beladen und mit
Thrombozyten inkubiert. Nach Stimulation mit ADP und fMLP wurde C14-TxB2
(stabiler Metabolit von C14-TxA2) detektiert. Caveolin-1, Clathrin und Mac-1 in
isolierten Exosomen wurden mit Hilfe des Western Blots nachgewiesen. Die
statistische
Signifikanz-Bestimmung
erfolgte
mittels
One-way
ANOVA
und
anschließendem Student-Newman-Keuls-Test oder t-Test. Das Signifikanz-Niveau
wurde
bei
p<0,05
festgesetzt.
Tierschutzkommission genehmigt.
Alle
Tierversuche
wurden
von
der
Ergebnisse: Zunächst zeigten wir, dass die Inkubation von Thrombozyten mit PMNs
die Exosomenfreisetzung aus PMNs signifikant steigert und dass dieser Prozess vom
thrombozytären Adhäsionsmolekül GPIbα vermittelt wird. In den aus PMNs
freigesetzten Exosomen war die Konzentration von Arachidonsäure stark erhöht.
Biochemisch konnten wir zeigen, dass PMN-Exosomen den endosomalen Marker
Caveolin-1 exprimieren, was auf eine gerichtete Freisetzung aus PMNs per
Exozytose hinweist. Die Inhibition der Exozytose aus PMNs durch BAPTA-AM (10
µg/ml)
verminderte
die
Exosomen-Freisetzung
signifikant.
Mittels
Immunofluoreszenzfärbung konnten wir zeigen, dass Exosomen in Thrombozyten
aufgenommen werden und dort mit thrombozytärer Cox1 kolokalisieren (Abb.1). Wir
konnten weiterhin zeigen, dass Exosomen Clathrin und Mac-1 exprimieren und dass
sowohl die Inhibition von Clathrin mittels Chlorpromazin (5 µg/ml) als auch die
Blockade von Mac-1 mit einem Antikörper die TxA2Produktion durch Thrombozyten stark vermindert.
Funktionell
verminderte
die
Blockade
des
Adhäsionsmoleküls GPIbα die PMN-Thrombozyten
Interaktion, die PMN-Rekrutierung in die Lunge und
erhöhte die Bakterienanzahl in der BAL, Lunge und
Milz 24h nach E. coli Instillation. Des Weiteren
Abb. 1. Exosomen kolokalisieren nach Aufnahme in Thrombozyten mit Cox1. PMNs grün, Thrombozyten rot, Exosomen gelb, Cox1 lila. konnte eine Rekonstitution von GPIbα-behandelten Mäusen mit isolierten Exosomen
die Mortalität nach Pneumonie-Induktion verringern, während die gleichzeitige Mac-1
Blockade auf isolierten Exosomen vor Rekonstitution die Mortalität verschlechterte.
Interpretation: Die Ergebnisse zeigen, dass Arachidonsäure-haltige Exosomen aus
PMNs nach PMN-Thrombozyten Interaktion GPIbα-abhängig exozytiert und Mac-1und Clathrin-abhängig in Thrombozyten internalisiert werden. Die TxA2-Synthese aus
PMN-ständiger Arachidonsäure nach exosomalem, transzellulären Transport aus
PMNs in Thrombozyten ist für eine effektive Bakterienbekämpfung im Rahmen
bakterieller Pneumonien notwendig.
Literatur:
1. Rossaint J, Zarbock A. Platelets in leucocyte recruitment and function. Cardiovasc Res. 2015; 107:
386-95.
2. Maugeri N, Evangelista V, Piccardoni P, Dell'Elba G, Celardo A, de Gaetano G, et al. Transcellular
metabolism of arachidonic acid: increased platelet thromboxane generation in the presence of
activated polymorphonuclear leukocytes. Blood. 1992; 80: 447-51.
3. Ittner A, Block H, Reichel CA, Varjosalo M, Gehart H, Sumara G, et al. Regulation of PTEN activity
by p38delta-PKD1 signaling in neutrophils confers inflammatory responses in the lung. J Exp Med.
2012; 209: 2229-46.