grundlagen der enzymologie - Ruhr

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GRUNDLAGEN DER ENZYMOLOGIE:
AKTIVITÄTS- UND SUBSTRATBESTIMMUNGEN
BIOCHEMISCHE GRUNDLAGEN
In lebenden Organismen katalysieren Enzyme chemische Stoffumwandlungen. Ein Enzym
wird durch seine katalytische Aktivität charakterisiert; d. h. durch seine Fähigkeit, die
Umsetzung eines oder mehrerer Substrate in einer spezifischen Reaktion zu definierten
Produkten zu beschleunigen. Enzyme sind im Allgemeinen Proteine. Enzymproteine weisen
eine spezifische Struktur auf, d. h. eine spezifische Primär-, Sekundär- und Tertiärstruktur
sowie, falls das Enzym aus mehreren Untereinheiten zusammengesetzt ist, eine bestimmte
Quartärstruktur. Die Anordnung der Atome in einer definierten Struktur wird durch den pH
der Lösung, Temperatur, Ionenstärke etc. beeinflusst. Deshalb haben diese Faktoren einen
entscheidenden Einfluss auf die katalytische Aktivität eines Enzyms.
Mit Hilfe enzymatisch katalysierter Reaktionen kann zum einen die Menge eines Enzyms,
zum anderen die Konzentration von Substraten bestimmt werden. Beides wird klinisch zur
Diagnose und Charakterisierung von Stoffwechselerkrankungen angewandt.
BESTIMMUNG DER KATALYTISCHEN AKTIVITÄT
Zur Bestimmung der Aktivität eines Enzyms wird die Menge an verbrauchtem Substrat pro
Zeit oder die Menge an entstehendem Produkt pro Zeit gemessen. Die Aktivität eines
Enzyms wird in der Regel bei maximaler Geschwindigkeit, d. h. im Bereich der Substratsättigung, bei optimalen Cosubstrat- und Effektorkonzentrationen, bei optimalem pH und bei
einer willkürlich festgesetzten Temperatur (meist 37°C) bestimmt.
Die Einheit der Aktivität, "Unit" (abgekürzt U), ist definiert als Umsatz von 1 µmol Substrat
pro Minute.
1 U = 1 µmol x min-1
Eine andere weniger gebräuchliche Einheit ist das Katal (kat):
1 kat = 1 mol x sec-1; 1 nkat = 1 nmol x sec-1 (n = nano = 10-9)
Im klinisch-chemischen Labor ist es üblich, die Aktivität pro Volumen zu bestimmen und in
der Einheit U/l anzugeben. Auch die Normalwerte werden meistens in U/l angegeben.
56
Die Einheit U/l ist gleich 1 µmol x l-1 x min-1. Bei der Aktivität pro Volumen handelt es sich
also um die Änderung einer Konzentration (µmol/l) pro Zeit (min) oder um die Reaktionsgeschwindigkeit. Entsprechend werden Aktivitäten pro Volumen durch Bestimmungen der
Anfangsgeschwindigkeit der katalysierten Reaktion gemessen. Dabei misst man entweder
die Abnahme der Konzentration eines Substrates (-d[S]/dt) oder die Zunahme der Konzentration eines Produktes (d[P]/dt) unter genau definierten Testbedingungen (pH, Ionenstärke,
Temperatur).
Als spezifische Enzymaktivität bezeichnet man die Aktivität bezogen auf eine definierte
Menge Enzymprotein: U/mg = µmol x min-1 x mg-1 oder kat/kg = µkat/mg
BESTIMMUNG VON SUBSTRATKONZENTRATIONEN
Aufgrund der hohen Spezifität eines Enzyms für das Substrat kann dessen Konzentration
mittels eines Enzyms auch in einem Gemisch bestimmt werden. In diesem Fall arbeitet man
mit hohen Enzymkonzentrationen. Man bestimmt den Anfangszustand des Testsystems und
setzt das Enzym dann in so hoher Konzentration zu, das die gewünschte katalysierte
Reaktion in kurzer Zeit praktisch vollständig abläuft. Aus der Differenz zwischen Anfangsund Endzustand wird die umgesetzte Substratmenge bestimmt. Aufgrund des Gleichgewichts zwischen Hin- und Rückreaktion wird ein Teil des Substrats nicht restlos in Produkt
umgewandelt. Um eine weitgehend irreversible Umwandlung zu erreichen, muss in der
Regel eines der Reaktionsprodukte aus der Testmischung entfernt werden. Das lässt sich
zum Beispiel durch eine weitere praktisch irreversible Reaktion, die von einem Hilfsenzym
katalysiert wird, oder durch chemische Umsetzung eines Produktes erreichen. Wenn z. B.
bei einer Reaktion H+-Ionen entstehen, können diese durch Neutralisation, d. h. indem ein
hoher pH-Wert eingestellt wird, entfernt werden.
Enzymatische Bestimmungen von Metaboliten sind in der Regel genauer und wesentlich
spezifischer als Bestimmungen mit chemischen Methoden. Eine häufig angewandte chemische Methode zur Bestimmung von Pyruvat im Serum beruht auf der Bildung des Hydrazons
mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin. Aber andere im Serum, physiologisch und pathologisch,
vorkommende Ketosäuren (-Ketoglutarat, Acetoacetat und Oxalacetat) reagieren ebenfalls
und täuschen eine zu hohe Pyruvatkonzentration vor. Spezifisch kann hingegen Pyruvat mit
Hilfe des Enzyms Lactatdehydrogenase (LDH) bestimmt werden. Bevor auf Einzelheiten
dieser Bestimmung eingegangen wird, sollen einige generelle Überlegungen angestellt
werden.
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Jede chemische Reaktion erreicht einen Gleichgewichtszustand. In der Schreibweise
A+B
C+D
zeigt der Doppelpfeil an, dass die Reaktion in beiden Richtungen, vorwärts und rückwärts,
verläuft. Wenn die Reaktion mit einer Mischung von A und B beginnt, so wird die Bildung von
C und D, die Hinreaktion, zunächst relativ schnell verlaufen. Mit der Anhäufung von C und D
setzt nun aber auch die Rückreaktion ein, die umso schneller wird, je mehr C und D gebildet
sind. Proportional wird die Hinreaktion langsamer werden, je mehr A und B verbraucht sind.
Im Gleichgewichtszustand laufen Hin- und Rückreaktion mit gleicher Geschwindigkeit ab.
Die Gleichgewichtslage einer Reaktion wird durch das Massenwirkungsgesetz ausgedrückt.
Die Geschwindigkeit einer Reaktion ist das dem Produkt der Konzentrationen der Reaktionsteilnehmer proportional, d. h. für die oben genannte Reaktion:
vhin = k1 [A] . [B] und vrück = k2 [C] . [D]
wobei k1 und k2 die Geschwindigkeitskonstanten und vhin und vrück die Geschwindigkeiten
der Vorwärts- und Rückwärts-Reaktion bedeuten.
Im Gleichgewichtszustand ist
vhin = vrück und damit
k [A] . [B] = k [C] . [D]
1
2
Daraus folgt:
k1
k2
K 
C    D 
 A  B 
Das Verhältnis der Geschwindigkeitskonstanten wird als Gleichgewichtskonstante K definiert; sie gibt an, in welchem Konzentrationsverhältnis die Reaktanten im Gleichgewichtszustand vorliegen.
Als Anwendungsbeispiel soll Pyruvat mit Hilfe der Lactatdehydrogenase (LDH) bestimmt
werden. LDH katalysiert die folgende Reaktion:
LDH
Lactat + NAD+
Pyruvat + NADH + H+
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Mit Hilfe des Massenwirkungsgesetzes soll berechnet werden, unter welchen Bedingungen
die Reaktion von Pyruvat zu Lactat quantitativ abläuft. Die Gleichgewichtskonstante K' hängt
vom pH-Wert und von der Temperatur ab. Bei pH 7.0 und 25°C beträgt sie:
K' 
 Pyruvat    NADH 
 2 , 3  10 5

 Lactat   NAD 
K' ist die "scheinbare" Gleichgewichtskonstante, die sich von der pH-unabhängigen
thermodynamischen Gleichgewichtskonstante K unterscheidet. Für die LDH-Reaktion ist
K 
 Pyruvat    NADH   H 
 Lactat   NAD  
  2 , 3 10  12 mol / l
Um die pH-abhängige Konstante K' für ein gegebenes pH zu berechnen, wird K durch die
gegebene Wasserstoffionenkonzentration dividiert.
bei pH 7:
H    10 7 mol / l ; K ' pH 7 , 0  2 , 3 107
12
 2 , 3  10 5
10
 12
bei pH 8:
H    10 8 mol / l ; K ' pH  8 , 0  2 ,3 10 8
 2 , 3  10  4
10
bei pH 9:
H    10
9
mol / l ; K '
pH  9 , 0

2 , 3  10 12
10
9
 2 , 3  10 3
und so weiter.
Da die enzymatische Metabolitbestimmung in gepufferter Lösung ausgeführt wird und die
Wasserstoffionenkonzentration praktisch konstant bleibt, genügt K' zur Charakterisierung der
Reaktion.
Im menschlichen Blut beträgt die Pyruvatkonzentration ungefähr 5·10-5 mol/l. Nachdem Blut
enteiweißt und ein aliquoter Teil des Überstandes mit Puffer, NADH und LDH in der
Messküvette gemischt worden ist, beträgt die Pyruvatkonzentration 2·10-5 mol/l. Die
Lactatkonzentration im Blut beträgt ungefähr 1 10-3 mol/l, d. h. die Konzentration im Bestimmungsansatz beträgt 4 10-4 mol/l.
59
Das Ergebnis der Pyruvatbestimmung wäre zufrieden stellend, wenn 99% des Pyruvats zu
Lactat reduziert würden; d. h. die Pyruvatkonzentration sollte von 2.10-5 mol/l auf 0,02 10-5
mol/l oder um 1,98 10-5 mol/l abfallen. Zu Beginn des Tests liegen folgende Konzentrationen
vor:
Pyruvat
=
2

10-5 mol/l
NADH
= 10

10-5 mol/l
Lactat
= 40

10-5 mol/l
NAD+
=
0
Für jedes mol Pyruvat, das reduziert wird, wird ein mol NADH oxydiert, und es werden 1 mol
Lactat und 1 mol NAD+ gebildet. Nachdem 99% oder 1,98 10-5 mol/l Pyruvat reduziert
worden sind, sind folgende Konzentrationen im Reaktionsansatz vorhanden:
Pyruvat
=
NADH =
2

10-5

1,98

10-5
=
0,02
10-5
mol/l
10

10-5

1,98

10-5
=
8,02
10-5
mol/l
mol/l
Lactat =
40

10-5
+
1,98

10-5
=
41,98 10-5
NAD+ =
10- 5+
1,98

10-5
=
1,98
10-5
mol/l
In die Gleichung für das Massenwirkungsgesetz eingesetzt errechnet sich:
 Pyruvat    NADH  0 ,02 10 5  8 ,02 10 5

 Lactat   NAD   41 ,98 10 5 1 , 98 10 5
 1 , 92  10 3
Das Resultat zeigt, dass nach einem Umsatz von 99% der Quotient immer noch größer als
-5
K' = 2,3. 10 ist, d. h. die Reaktion wird weiterlaufen, bis nahezu 100% des Pyruvats
reduziert worden sind. Diese Berechnung zeigt, dass die Bestimmung von Pyruvat in einem
Gemisch mit der LDH möglich ist.
ALLGEMEINE FRAGESTELLUNGEN
Isoenzyme: Definition, Vorkommen und molekulare Grundlagen der Isoenzymentstehung;
LDH, ihre Rolle im Stoffwechsel und in der Klinik;
Glykolyse, Gluconeogenese, Cori-Zyklus;
Grundbegriffe der enzymatischen Katalyse;
Definition der Enzymaktivität, der Enzymaktivität pro Volumen (Reaktionsgeschwindigkeit)
und der spezifischen Aktivität;
Prinzip der Substratbestimmung und Aktivitätsbestimmung.
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ZIELSETZUNG DER EXPERIMENTE
Eine Reihe von physikalischen und chemischen Methoden steht zur Verfügung, um die
Geschwindigkeit enzymkatalysierter Reaktionen zu bestimmen. Besonders günstig sind aber
die Methoden, bei denen nicht von außen in die Reaktion eingegriffen werden muss, sondern
bei denen z. B. während der Reaktion die Änderung eines optisch messbaren Parameters
erfolgt. Auf diesem Prinzip kann die Aktivität von Oxidoreduktasen bestimmt werden, die
NAD+ oder NADP+ als Cosubstrat umsetzen. Die entstandenen NADH oder NADPH haben
eine zusätzliche Absorptionsbande bei 340 nm; d. h. die Zunahme der Extinktion während
der Reaktion ist ein Maß für den Umsatz der Cosubstrate. Die entsprechenden Konzentrationsänderungen werden dann mit Hilfe des Lambert-Beerschen Gesetzes berechnet (für
weitere Einzelheiten siehe Versuch "Grundlagen der Enzymkinetik").
Substratbestimmung
und
Aktivitätsbestimmung
werden
anhand
der
von
LDH
katalysierten Reaktion durchgeführt.
CH3

+
C = 0 + NADH + H

COO
Pyruvat
LDH
CH3

+
CH-OH + NAD

COO
L(+)Lactat
LDH kommt praktisch in allen Geweben vor. Hohe Aktivitäten lassen sich im Herzmuskel, in
der Leber, im Skelettmuskel, in Erythrozyten und Thrombozyten nachweisen.
GEWEBSVERTEILUNG DER LDH-ISOENZYME
Viele Enzyme sind aus mehreren identischen oder nicht-identischen Untereinheiten aufgebaut. Vielfach sind diese Enzyme nur aktiv, wenn sie die richtige Quartärstruktur aufweisen.
Austausch der Untereinheiten ergibt eine Familie von Enzymen innerhalb eines einzigen
Organismus, die alle die gleiche Reaktion katalysieren. Diese so genannten Isoenzyme
unterscheiden sich in ihren physikalischen Eigenschaften (Molekulargewicht, isoelektrischer
Punkt, Denaturierungstemperatur) wie auch in ihren katalytischen Eigenschaften (KM, pHOptimum, Wechselzahl). Da diese Untereinheiten vielfach Genprodukte von dublizierten
Genen sind, die aus einem einzigen Präkursor entstanden sind, haben sie noch viele
gemeinsame Eigenschaften. In den vorliegenden Übungen sollen die Isoenzyme der LDH
studiert werden. Anschließend wird die Bedeutung der Isoenzyme als diagnostisches Mittel
in der Klinik diskutiert.
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FUNKTIONEN DER LDH-ISOENZYME
Isoenzyme werden von Pro- und Eukaryonten produziert, um den metabolischen Fluss zu
einer gegebenen Zeit den besonderen Bedingungen der Umgebung anzupassen. Die katalytischen Eigenschaften dieser Isoenzyme können leicht geändert werden, indem ein Typ einer
Untereinheit in der Syntheserate verändert wird, was leichter gelingt, als die Synthese eines
gesamten neuen Enzyms. In Säugern prädominieren bestimmte Isoenzyme häufig entweder
in bestimmten Geweben oder in einem Gewebe zu einer bestimmten Entwicklungszeit. Die
LDH ist aus vier Untereinheiten aufgebaut, die entweder dem Typ M (Muskeltyp) oder dem
Typ H (Herztyp) entsprechen. Diese Untereinheiten werden durch nicht-kovalente Bindungen
zusammengehalten. Die Kombination dieser beiden Untereinheiten zu einem Tetramer in
unterschiedlichen Relationen ergibt fünf Isoenzyme: H4, H3M, H2M2, HM3 und M4, die man
auch als LDH 1, 2, 3, 4 und 5 bezeichnet. Die Anteile der fünf LDH-Isoenzyme im Cytosol
sind von Gewebe zu Gewebe unterschiedlich, innerhalb eines Organs jedoch relativ
konstant.
Die Verteilung der LDH-Isoenzmye in den verschiedenen Organen weist eine Korrelation zu
deren O2-Versorgung auf. Das H4-Isoenzym arbeitet relativ langsam und wird durch einen
Überschuss an Pyruvat gehemmt. Das M4-Enzym hat dagegen eine wesentlich höhere
Wechselzahl und wird kaum durch Pyruvat gehemmt (Tabelle I).
Tabelle I:
Eigenschaften der LDH-Isoenzyme
Isoenzym
Wechselzahl
Km(Pyr)
Hemmung durch Pyruvat von
physiologischen Konzentrationen
-1
H4(LDH 1)
45.000 sec
M4(LDH 5)
100.000 sec-1
1 . 10-4 M
ja
3 . 10-5 M
nein
Die Zelle gewinnt viel mehr ATP durch die Verstoffwechselung des Pyruvats im
Citronensäurezyklus als durch Umsetzung zu Lactat. Dazu ist allerdings Sauerstoff nötig, um
das produzierte NADH reoxydieren zu können und damit in der Atmungskettenphosphorylierung ATP zu synthetisieren. In einem aeroben Gewebe, wie im Herzen, steht Sauerstoff
immer in genügenden Mengen zur Verfügung, so dass jede Umwandlung von Pyruvat zu
Lactat, d. h. Abzug dieses Metaboliten vom Citronensäurezyklus, einen Energieverlust
darstellen würde. Deshalb dominieren in diesem Gewebe die Isoenzyme H4 und H3M, deren
Aktivität Pyruvat bei physiologischen Konzentrationen hemmt. Dementsprechend wird
Pyruvat nicht zu Lactat umgesetzt, sondern im Citronensäurezyklus verstoffwechselt. In
anaeroben Geweben mit limitiertem Sauerstoffangebot, wie z. B. in kontrahierenden
62
Skelettmuskeln, wird ATP unabhängig von der Verfügbarkeit von Sauerstoff während der
Umwandlung von Glucose in Pyruvat produziert. Wenn die ATP-Konzentration sinkt, steigt
der Fluss der Glykolyse um ein vielfaches an, um die notwendige Menge ATP zu
+
synthetisieren. Unter diesen Bedingungen muss NADH schnell in NAD überführt werden,
+
weil es sonst zum Stopp der Glykolyse kommen würde. NAD kann aber durch die LDHReaktion schnell regeneriert werden. Deshalb herrscht in solchen anaeroben Geweben das
4
Isoenzym M mit hoher Wechselzahl vor, dessen Aktivität Pyruvat nicht hemmt. Als Produkt
der Reaktion akkumuliert Lactat, was schließlich im Cori-Zyklus zur Gluconeogenese benutzt
werden kann.
Die metabolische Funktion der LDH ist in der nächsten Abbildung zusammengefasst:
NACHWEIS VON LDH-ISOENZYMEN
Aufgrund der hohen Proteinkonzentrationen des Serums ist der Nachweis der LDH-Isoenzyme im Serum nicht einfach. Mit Hilfe einer spezifischen Färbemethode, die die Substratspezifität der LDH-Isoenzyme ausnutzt, können die einzelnen Isoenzyme dargestellt
werden. Dazu ist eine Trennung der LDH-Isoenzyme aus verschiedenen Gewebeextrakten
durch Elektrophorese auf Zelluloseacetat notwendig. Nach der elektrophoretischen Trennung
werden die Zellulose-Acetatstreifen in einer alkalischen Färbelösung inkubiert, die NAD, das
Lactat und zwei Redox-Farbstoffe enthält. An den Stellen, an denen sich LDH-Isoenzyme
+
+
befinden, werden von Lactat und NAD Pyruvat, NADH und H gebildet. Der Wasserstoff des
NADH wird über Phenacin-Methosulfat (PMS) durch zwei Redoxsysteme auf farbloses
Tetrazoliumchlorid übertragen. Das durch die Reduktion des Tetrazoliumsalzes entstandene
blauviolette Formazan lokalisiert die Stellen mit LDH-Aktivität auf der Folie.
63
Durch Hybridisierung von M4 und H4 können alle Isoenzyme erzeugt werden. Diese
Hybridisierung kann durch langsames Einfrieren und Wiederauftauen erreicht werden, da die
Quartärstruktur der LDH im Eisgitter nicht stabil ist. Bei der Renaturierung zum quartären
Enzym bilden sich dann alle fünf Isoenzyme. Nach Trennung und Färbung können die
gebildeten Mengen der fünf Isoenzyme durch Densitometrie ermittelt werden, wenn man
annimmt, dass die Intensität der Färbung der Enzymaktivität proportional ist.
Alternativ kann die Isoenzymmenge an M4 auch durch milde Denaturierung ermittelt werden.
Die H-Untereinheit ist gegen Denaturierung in Harnstoff oder Hitze stabiler als die MUntereinheit. M4 kann deshalb durch Inkubation in Harnstoff oder durch Erhitzen auf 60°C
inaktiviert werden, wonach die Menge an H4 im Serum gemessen und anschließend
berechnet werden kann.
KLINISCHE ANWENDUNG
Die Identifizierung von Isoenzymen der LDH beruht auf ihrer schnellen elektrophoretischen
Trennung und bildet damit die Basis für verschiedene klinische Anwendungen, die sowohl
die Gewebeart als auch deren Zerstörungsgrad definieren können. Dazu wird sehr häufig
das Isoenzymmuster der LDH in Serum bestimmt. Normalerweise ist der LDH-Aktivitätsspiegel in Serum sehr niedrig.
Im pathologischen Fall werden die Zellmembranen des geschädigten Organs meist permeabel für Enzyme und andere Makromoleküle, die dann in den extrazellulären Raum austreten
können. Gelangen sie in ausreichender Konzentration in den Intravasalraum, so können sie
quantitativ im Blutplasma bestimmt werden, was Rückschlüsse auf Ausmaß und Umfang der
Beschädigung zulässt.
Die im Serum messbare LDH-Aktivität stellt eine Summe der aus verschiedenen Organen
stammenden Isoenzyme dar. Deswegen kann aus einer einfachen Aktivitätsmessung nicht
unbedingt auf die Organherkunft des Enzyms geschlossen werden. Da aber im Falle der
LDH das Verhältnis der einzelnen Isoenzyme von Organ zu Organ unterschiedlich ist, spiegelt sich die Schädigung eines bestimmten Gewebes auch als typisches Isoenzymmuster im
Serum wider. Eine solche Differenzierung der LDH-Isoenzyme nach Organen ist mit Elektrophorese möglich. Auf diese Weise lässt sich z. B. unterscheiden, ob eine Erhöhung der
LDH-Aktivität im Serum auf eine Schädigung des Herzmuskels oder der Leberzelle zurückzuführen ist.
64
Elektrophoretische Auftrennung von LDH-Isoenzymen aus menschlichen Seren
65
VERSUCHSDURCHFÜHRUNG UND VERSUCHSPROTOKOLL
Hilfsmittel die mitzubringen sind:
-
Kittel
-
Lineal
-
Taschenrechner
ALLGEMEINE HINWEISE:
-
die Proben/Reagenzien müssen vor dem Einsatz komplett aufgetaut sein
-
die Proben/Reagenzien müssen vor dem Pipettieren durchmischt werden
-
Enzyme sind während des Versuchs auf Eis zu lagern
-
pro Versuch soll nur eine Person pipettieren (Ausschluss von Pipettierfehlern)
-
die Ansätze werden grundsätzlich nacheinander pipettiert und gemessen
-
Auswertung Versuch 2: das Steigungsdreieck nicht innerhalb der ersten 15 Sek
einzeichnen 66
BESTIMMUNG VON PYRUVAT IM OPTISCHEN TEST NACH WARBURG MIT LDH ALS
BEISPIEL EINER SUBSTRATKONZENTRATIONSBESTIMMUNG
Drei Küvetten werden wie im Pipettierplan angegeben angesetzt. Die Abnahme der
Extinktion bei 366 nm wird nach Zugabe der LDH bis zu einem konstanten Wert verfolgt.
Vor Beginn der Messung wird das Photometer bei 366 nm gegen eine mit Phosphatpuffer
gefüllte Küvette geeicht. Diese Eichung wird von Zeit zu Zeit überprüft.
Pipettierplan
Ansatz 1
Ansatz 2
Ansatz 3
ml
Na-Phosphat-Puffer (0,1 mol/l, pH 7.4)
1,50
1,50
1,50
ml
NADH (0,01 mol/l)
0,05
0,05
0,05
ml
Na-Pyruvat
0,05
0,10
0,15
ml
H2O
0,38
0,33
0,28
Der Küvetteninhalt wird durch dreimaliges Umdrehen der Küvette (bitte vorher mit Parafilm
verschließen) gründlich gemischt und die Anfangsextinktion (E0) gemessen. Nach 30 sec
wird überprüft, ob E0 unverändert bleibt. Die Küvette wird aus dem Photometer
herausgenommen. Das Enzym (jeweils 0,02 ml) wird in die Küvette pipettiert. Der
Küvetteninhalt wird sofort mit Parafilm verschlossen und erneut gemischt. Nach Entfernen
des Parafilms wird die Küvette in das Photometer eingesetzt. In Abständen von 1 min wird
die Extinktion abgelesen, bis keine Änderung mehr registriert wird.
Messplan
abgeleseneExtinktion
Zeit
Ansatz 1
Ansatz 2
Eo
30 sek
Start durch Zugabe von LDH (0,02 ml/Küvette; mischen)
1 min
2 min
3 min
4 min
5 min
6 min
Ansatz 3
67
AUSWERTUNG UND FEHLERDISKUSSION
Zu Versuch 1 – Lambert-Beer’sche Gesetz
Berechnen Sie aus der Differenz der Anfangsextinktion und der Extinktion nach Ende der
Reaktion mit Hilfe des Lambert-Beer'schen Gesetzes die Konzentration der Pyruvat-Lösung.
68
2A
Bestimmung der Aktivität pro Volumen von H4 und M4 bzw. der LDH im
Normalserum und im Serum von Herzinfarktpatienten
Vier Küvetten werden wie im Pipettierplan angegeben nacheinander angesetzt und
nacheinander gemessen. Die Abnahme der Extinktion bei 366 nm wird nach Zugabe der
LDH bis zu einem konstanten Wert verfolgt.
Vor Beginn der Messung wird das Photometer bei 366 nm gegen eine mit Phosphatpuffer
gefüllte Küvette geeicht. Diese Eichung wird von Zeit zu Zeit überprüft.
Pipettierplan – 2A
H4
M4
Normal-
Infarkt-
Serum
Serum
ml
Phosphatpuffer (0,1 mol/l, pH 7.4)
1,50
1,50
1,50
1,50
ml
NADH (0,01 mol/l)
0,05
0,05
0,05
0,05
ml
H 2O
1,30
1,30
0,95
1,25
ml
H4 (20 µg/ml)
0,05
0
0
0
ml
M4 (12,5 µg/ml)
0
0,05
0
0
ml
Normalserum
0
0
0,40
0
ml
Herzinfarktserum
0
0
0
0,10
Der Küvetteninhalt wird wie im Versuch 1 durchgemischt und die Anfangsextinktion (E0)
abgelesen. Nach 30 sec wird überprüft, ob E0 unverändert bleibt.
Im weiteren Verlauf muss darauf geachtet werden, dass die exakten Zeitabstände zwischen
den Extinktionsablesungen einhalten werden.
Die Reaktion wird durch Zugabe von 0,1 ml Pyruvatlösung (0,01 mol/l) pro Küvette gestartet.
Nach Zugabe von Pyruvat wird gründlich gemischt.
Die Extinktion soll 15 sec nach dem Mischen und danach in den angegebenen Abständen
(genau!) abgelesen werden. Die Daten werden im Messplan 2A notiert.
69
Messplan – 2A
abgelesene Extinktion
Zeit in sek
H4
Eo
30
Start durch Zugabe von Pyruvat (0,1 ml/Küvette)
15
30
60
90
120
150
180
210
240
270
300
M4
Normal-
Infarkt-
Serum
Serum
70
2B
Abschätzung der Menge H4 in normal und Herzinfarkt-Seren durch HarnstoffStabilitätstest
Vier Küvetten werden wie im Pipettierplan angegeben nacheinander angesetzt und
nacheinander gemessen. Die Abnahme der Extinktion bei 366 nm wird nach Zugabe der
LDH bis zu einem konstanten Wert verfolgt.
Vor Beginn der Messung wird das Photometer bei 366 nm gegen eine mit Harnstoffpuffer
gefüllte Küvette geeicht. Diese Eichung wird von Zeit zu Zeit überprüft.
Pipettierplan – 2B
H4
ml
Harnstoff (6 mol/l) in Phosphatpuffer
(0,1 mol/l, pH 7.4)
M4
Normal-
Infarkt-
Serum
Serum
1,50
1,50
1,50
1,50
ml
NADH (0,01 mol/l)
0,05
0,05
0,05
0,05
ml
H2O
1,30
1,30
0,95
1,25
ml
H4 (20 µg/ml)
0,05
0
0
0
ml
M4 (12,5 µg/ml)
0
0,05
0
0
ml
Normalserum
0
0
0,40
0
ml
Herzinfarktserum
0
0
0
0,10
Die Proben werden gut gemischt und bei Raumtemperatur für 1,5 Minuten stehen
gelassen. Anschließend wird die LDH-Aktivität pro Volumen, wie im Teil A beschrieben,
bestimmt.
Im weiteren Verlauf muss darauf geachtet werden, dass die exakten Zeitabstände zwischen
den Extinktionsablesungen einhalten werden.
Die Reaktion wird durch Zugabe von 0,1 ml Pyruvatlösung (0,01 mol/l) pro Küvette gestartet.
Nach Zugabe von Pyruvat wird gründlich gemischt.
Die Extinktion soll 15 sec nach dem Mischen und danach in den angegebenen Abständen
(genau!) abgelesen werden. Die Daten werden im Messplan 2B notiert.
71
Messplan – 2B
abgelesene Extinktion
Zeit in sek
H4
Eo
30
Start durch Zugabe von Pyruvat (0,1 ml/Küvette)
15
30
60
90
120
150
180
210
240
270
300
M4
Normal-
Infarkt-
Serum
Serum
72
AUSWERTUNG UND FEHLERDISKUSSION
Allgemeines zu den Grafiken
Es sollen 2 getrennte Grafiken der Extinktionswerte auf Millimeterpapier (im Querformat)
erstellt werden.
1. Grafik: H4, M4 (aus 2A) und H4 + Harnstoff, M4 + Harnstoff (aus 2B)
2. Grafik: Normalserum, Infarktserum (aus 2A) und Normalserum + Harnstoff, Infarktserum + Harnstoff (aus 2B) Wichtig: das Steigungsdreieck nicht innerhalb der ersten 15 Sek. einzeichnen.
Zu Versuch 2A/B
Für jede Küvette (A und B) soll der gemessene Extinktionswert in Abhängigkeit von der Zeit
graphisch dargestellt werden. Für jeden Ansatz soll aus dem linearen Teil der Darstellung die
Abnahme der Extinktion pro Zeit (E/min) ermittelt werden und daraus die Aktivitäten der
-1
LDH pro Volumen (µmol . min . ml-1) in den einzelnen Ansätzen berechnet werden.
73
Übersichtstabelle der berechneten Daten – 2A/B
Probe
∆E/min
F*
Aktivität (U/ml)
H4
M4
Normalserum
Herzinfarktserum
H4 + Harnstoff
M4 + Harnstoff
Normalserum + Harnstoff
Herzinfarktserum + Harnstoff
*F = Verdünnungsfaktor
Aus den berechneten Aktivitätswerten soll der Anteil an denaturierter H4 in der gereinigten
H4-Probe errechnet werden. M4 dürfte vollständig denaturiert worden sein. So kann angenommen werden, dass die verbleibende Aktivität im Harnstoff behandelter Seren
ausschließlich auf H4-Aktivität zurückzuführen ist.
Übersichtstabelle der berechneten Daten
LDH-Aktivität pro Volumen
Probe
H4
M4
Normalserum
Herzinfarktserum
mit Harnstoff (U/ml)
ohne Harnstoff (U/ml)
Verlust
%
74
Rechenhilfe
Verlust (in%) = Akt. ohne Harnstoff – Akt. mit Harnstoff • 100
Akt. ohne Harnstoff
Der Verlust an H4-Aktivität wird mit dem oben bestimmten Anteil an H4-Denaturierung
korrigiert. Bei der Berechnung der Aktivitätswerte der Seren wird dieser prozentuale
H4-Verlust während der Harnstoffbehandlung berücksichtigt.
Anteile in %
H4
nicht H4
Normalserum
Herzinfarktserum
Rechenhilfe
% H4/Serum = Akt. H4 (ohne Harnstoff) • Akt. Serum mit Harnstoff • 1 00
Akt. Serum (ohne Harnstoff) • Akt. H4 (mit Harnstoff)