Charakterisierung Granzym B produzierender B

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Universitätsklinikum Ulm
!!!!!!!!!!!!!!!Institut für Naturheilkunde und klinische Pharmakologie
Prof. Dr. Thomas Simmet
Charakterisierung Granzym B-sezernierender B-Zellen
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin
der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm
von Elisabeth Schwesinger
Geboren in Bobingen
2011
Amtierender Dekan: Prof. Dr. Thomas Wirth
1. Berichterstatter: PD Dr. med. Bernd Jahrsdörfer
2. Berichterstatter: Prof. Dr. med. Thomas Barth
Tag der Promotion: 12.01.2012
Meinen Eltern
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
1.1 Grundlagen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.2 Ziele der Arbeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2 Material und Methoden
2.1 Probengewinnung und Zellkultur
2.2 Reagenzien . . . . . . . . . . . .
2.3 Durchflusszytometrie . . . . . . .
2.4 Granzym B-Sekretions-Assay . .
2.5 ELISpot . . . . . . . . . . . . . .
2.6 Statistische Auswertung . . . . .
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3 Ergebnisse
3.1 Differenzierung von B-Zellen zu Granzym B-sezernierenden Zellen . . .
3.1.1 Differenzierung von B-Zellen zu Granzym B-sezernierenden Zellen nach Stimulation mit IL-21 . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.1.2 Induktion von Granzym B in B-Zellen durch die Zytokinkombination IL-4 und IL-10 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.1.3 Aktive Sekretion von Granzym B durch B-Zellen . . . . . . . .
3.2 Phänotyp, Viabilität und Proliferation Granzym B-sezernierender gesunder B-Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.1 Naive B-Zellen produzieren größere Mengen an Granzym B als
Memory B-Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.2 Oberflächenphänotypisierung von Granzym B-produzierenden BZellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
I
1
1
4
5
5
6
8
9
10
11
12
12
12
17
20
22
22
24
3.2.3
3.3
Proliferation von B-Zellen unter Granzym B-induzierenden Stimuli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.4 Viabilität von Granzym B-sezernierenden B-Zellen . . . . . . . .
Wirkung von IL-21 auf maligne B-Zellen von Patienten mit chronisch
lymphatischer Leukämie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.3.1 Granzym B-Produktion in malignen B-Zellen der chronisch lymphatischen Leukämie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.3.2 Expression von humanem MIG in Zellen der chronisch lymphatischen B-Zellleukämie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
28
30
34
34
37
4 Diskussion
39
4.1 Einordung der Ergebnisse aus den Experimenten mit gesunden B-Zellen
in die aktuelle Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
4.2 Ergebnisanalyse der Experimente mit malignen B-Zellen der chronisch
lymphatischen Leukämie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
4.3 Mögliche physiologische Bedeutung Granzym B-produzierender B-Zellen 48
5 Zusammenfassung
49
6 Literaturverzeichnis
51
II
Abkürzungsverzeichnis
APC
APZ
BCIP/ NBT
Allophycocyanine
Antigen-präsentierende Zelle
5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-Phosphate/
Nitro Blue Tetrazolium
B-Zellrezeptor
Bovines Serum-Albumin
Cluster of Differentiation
Carboxyfluorescein-Succinimidylester
Chronisch lymphatische Leukämie
Cytosin-phosphatidyl-Guanin
Colony-Stimulating Factor
Cytotoxic T Lymphocyte
CXC-Chemokinrezeptor
Ethylendiamintetraessigsäure
Endkonzentration
Enzyme-Linked Immuno-Spot
Sulfosuccinimidyl-6-(biotinamido)Hexanoat
Fluoresence-Activated Cell Sorting
Fas-Ligand
Fluoresceine Isothiocyanate
Frühsommer-Meningoenzephalitis
Granzym B
Interferon
BCR
BSA
CD
CFSE
CLL
CpG
CSF
CTL
CXCR
EDTA
EK
ELISpot
EZ-Link
FACS
FasL
FITC
FSME
GrB
IFN
III
Ig
IL
LIF
MHC
MIG
MIP
NK-Zellen
NKT-Zellen
ODN
PBS
PE
PE-Cy5
PHA
PRR
PVDF
RANTES
Immunglobulin
Interleukin
Leukemia-Inhibiting Factor
Major Histocompatibility Complex
Monokine-Induced by IFN-γ
Macrophage Inflammatory Protein
Natürliche Killerzellen
Natürliche Killer-T-Zellen
Oligodesoxynukleotid
Phosphate-Buffered Saline
Phycoerythrin
Phycoerythrin-Cychrom 5
Phytohämagglutinin
Pattern Recognition Receptor
Polyvinylidenfluorid
Regulated upon Activation, Normal T Cell
Expressed, and Secreted
T-Helferzelle
Toll-like-Rezeptor
Tumor Necrosis Factor
Tumor Necrosis Factor-Related
Apoptosis-Inducing Ligand
TH
TLR
TNF
TRAIL
IV
1 Einleitung
1.1 Grundlagen
Lymphozyten gelten als die wichtigsten Protagonisten in den Abläufen des erworbenen
Immunsystems. Sowohl die T- als auch die B-Zellen entwickeln sich aus gemeinsamen lymphoiden Progenitorzellen im Knochenmark. Während die T-Zellen jedoch im
Thymus heranreifen, vollzieht sich bei B-Zellen dieser Prozess im Knochenmark. Die
reifen Lymphozyten zirkulieren im Blut zwischen den lymphatischen Organen, wo sie
in Kontakt mit Antigen kommen [26]. In den Primärfollikeln der peripheren lymphatischen Organe wird der Grundstein der Antikörper-vermittelten Immunabwehr gelegt, indem naive Lymphozyten einwandern und Proliferationsinseln, die sogenannten
Keimzentren, bilden. Die Keimzentrumsreaktion beginnt mit der Aktivierung der BZelle durch Stimulation ihrer Antigen-Rezeptoren und durch kostimulatiorische Signale
von Helferzellen. Die naive B-Zelle differenziert daraufhin zum stark proliferierenden
Zentroblasten, der sich durch eine verminderte Anzahl an Oberflächenimmunglobulinen auszeichnet und sich in einer aufgrund der hohen Zelldichte dunkel erscheinenden
Zone des Keimzentrums ansiedelt. In dieser Phase werden die Antigenrezeptoren des
Zentroblasten durch somatische Hypermutation der Ig-V-Genregion so verändert, dass
sie höhere oder niedrigere Affinität zum jeweiligen Antigen aufweisen. Hieraufhin entwickeln sie sich weiter zu Zentrozyten, wobei sich die Proliferationsrate verringert,
dafür aber wieder mehr Immunglobulin auf der Oberfläche exprimiert wird. Zentrozyten befinden sich in der hellen Zone des Keimzentrums. In diesem Stadium werden
die Zellen gemäß ihrer Fähigkeit, das jeweilige Antigen zu binden, mit Hilfe von follikulären dendritischen Zellen und T-Zellen selektiert (sogenannte Affinitätsreifung).
Ein Großteil der B-Zellen wird im Rahmen dieses Selektionsprozesses aussortiert und
1
1 Einleitung
kontrolliert abgetötet. B-Zellen jedoch, die eine Antikörpervariante mit hoher Affinität
zum Antigen aufweisen, differenzieren daraufhin zu langlebigen Memory-B-Zellen oder
Antikörper-produzierenden Plasmazellen [31, 26].
Naive T-Zellen entwickeln sich zu Effektorzellen, verantwortlich für die zellvermittelte
Immunabwehr. Hier sind zunächst die CD4+ T-Zellen zu erwähnen. Diese lassen sich
unterteilen in die Untergruppe der TH 1-Helferzellen, die vor allem im Rahmen von bakteriellen Infektionen Makrophagen anlocken und aktivieren oder für die virale Abwehr
wichtige Zytokine produzieren, während die Untergruppe der TH 2-Helferzellen insbesondere bei der Interaktion mit B-Zellen eine große Rolle spielt. Die Differenzierung
in die jeweilige Untergruppe hängt dabei vor allem von der Anwesenheit bestimmter Zytokine während der Proliferationsphase der T-Zellaktivierung ab. Nach erfolgter
Virusinfektion beispielsweise, sezernieren Makrophagen und dendritische Zellen hohe
Level an Chemokinen wie MIP-1α, MIP-1β oder RANTES. Diese wiederum binden
an ihre jeweiligen Rezeptoren, z. B. auf dendritischen Zellen, und induzieren die Freisetzung von IL-12. IL-12 und IFN-γ sind die vorherrschenden Zytokine während der
frühen Phase viraler Infektionen und bewirken u. a. die Differenzierung naiver CD4+
T-Zellen zu TH 1-Helferzellen. Deren Aufgabe besteht in diesem Zusammenhang vor
allem in der Produktion von Zytokinen wie IL-2 oder IFN-γ, die die Proliferation und
Funktionsfähigkeit von CD8+ T-Zellen (CTL) fördern [26].
CD8+ T-Zellen, die zweite wichtige T-Zellgruppe, erkennen virale Peptide, die im Zellplasma der befallenen Körperzelle prozessiert und auf deren Zelloberfläche präsentiert
werden, durch ihren spezifischen T-Zellrezeptor. Um die Replikation der Viruspartikel
zu unterbinden, sind sie in der Lage, in befallenen Zielzellen durch Freisetzung zytotoxischer Proteine und anderer löslicher anti-viraler Faktoren aus lytischen Granula
Apoptose, den programmierten Zelltod, auszulösen. Ähnliche Fähigkeiten haben auch
die natürlichen Killerzellen (NK-Zellen), die ebenfalls von lymphoiden Vorläuferzellen abstammen, jedoch zum angeborenen Immunsystem gehören, zu jenen Zellen, die
unmittelbar und schnell den Körper vor Angriffen durch Krankheitserreger schützen
[26, 28]. Ein Schlüsselmechanismus ist dabei die Sekretion zytotoxischer Granula in die
sogenannte sekretorische Synapse zwischen Effektorzelle und Zielzelle [3, 54]. Ein wichtiger Bestandteil dieser Granula ist unter anderem Granzym B (GrB), eine Serinprotease, die im synaptischen Spalt von Cathepsin C aktiviert wird und durch Pinozytose
2
1 Einleitung
oder einen Mannose-6-Phosphat-Rezeptor-vermittelten Vorgang endozytotisch in die
Zielzelle aufgenommen wird [61]. Dort kann es in Anwesenheit von Perforin oder eines
anderen endosomolytischen Agens (beispielsweise adenoviraler Proteine oder bakterieller Streptolysine) aus den Granula freigesetzt werden und, entweder durch Auslösung
der klassischen Caspase-Kaskade oder über das zytosolische, pro-apoptotische Protein
Bid, den programmierten Zelltod der Zielzelle auslösen [12, 61, 4]. Bis in das Jahr 2006
waren lediglich CD8+ T-Zellen und NK-Zellen als lymphozytäre Produzenten von GrB
bekannt.
In diesem Zusammenhang spielt auch das im Jahr 2000 neu entdeckte Zytokin Interleukin 21 (IL-21) eine wichtige Rolle. Es gehört zur IL-2 Zytokinfamilie und wird
insbesondere von NKT-Zellen und CD4+ T-Zellen produziert [6]. An seinen Zielzellen
(vor allem Zellen des lymphohämatopoetischen Systems, aber auch Keratinozyten und
Fibroblasten) bindet es an den IL-21-Rezeptor und induziert dort die Aktivierung von
Januskinase 1 und 3 und der Transkriptionsfaktoren STAT 1, 3 und 5 [10]. Es gilt als
potenter Stimulator der zytolytischen Aktivität von CD8+ T-Zellen und NK-Zellen [44],
indem es die Gentranskription für Granzym A und Granzym B induziert. Außerdem
scheint es eine Rolle zu spielen im Zusammenhang mit einigen Autoimmunerkrankungen wie dem systemischen Lupus erythematodes oder der rheumatoiden Arthritis [10].
Hinsichtlich seiner Wirkung auf B-Zellen ist bekannt, dass es zusammen mit IL-4 die
Antikörperproduktion steigern und zusammen mit CD40 die B-Zellproliferation positiv
beeinflussen kann [15]. Jahrsdörfer und Kollegen zeigten im Jahre 2006, dass auch Leukämiezellen der chronisch lymphatischen B-Zellleukämie (B-CLL) in der Lage sind, GrB
in Reaktion auf Stimulation mit IL-21 in Kombination mit dem immunstimulatorischen
CpG ODN oder Antikörpern gegen den B-Zellrezeptor (anti-BCR) zu produzieren und
dadurch in malignen Bystander-B-Zellen GrB-abhängig Apoptose zu induzieren [22].
Unmethylierte CpG-Dinukleotide sind relativ häufig im Genom vieler Bakterien und
einiger DNA-Viren zu finden, sie sind jedoch nicht Bestandteil von Säugetier-DNA. Im
menschlichen Körper können sie daher von eigener DNA unterschieden und von einem
bestimmten Rezeptor des angeborenen Immunsystems erkannt werden, dem sogenannten Toll-like-Rezeptor 9 (TLR9), der zu den Pattern Recognition Receptors (PRR) des
angeborenen Immunsystems gehört. Auf ruhenden menschlichen Immunzellen findet
sich dieser Rezeptor vor allem auf plasmazytoiden dendritischen Zellen und B-Zellen.
3
1 Einleitung
CpG DNA gilt als potenter Verstärker der humoralen Immunantwort von B-Zellen, der
zu einem frühen Zeitpunkt der Infektion und unmittelbar an B-Zellen angreifen kann
[36, 35, 27].
Abbildung 1: Die Granzym B-sezernierende B-Zelle und beteiligte Stimuli
1.2 Ziele der Arbeit
Ausgehend von den oben beschriebenen Ergebnissen beschäftigt sich meine Arbeit mit
der Frage, in welchem Ausmaß auch in B-Zellen gesunder Individuen GrB induziert
werden kann. Um zudem die physiologische Rolle dieser Zellen näher zu beleuchten,
prüft die Arbeit insbesondere die phänotypischen Eigenschaften dieser Zellen sowie
ihre Fähigkeit zur GrB-Produktion unter verschiedenen Stimuli, ihre Viabilität und
ihre Proliferationsfähigkeit. Außerdem beschäftigt sich die Arbeit anknüpfend an die
Ergebnisse von Jahrsdörfer et al. auch mit B-CLL-Zellen. Dabei sollten diese weiterführend phänotypisch charakterisiert werden. Zudem war von Interesse, ob die gezeigten
zytotoxischen Effekte auf maligne Nachbarzellen koordiniert werden können. Zu diesem Zweck wurden Experimente durchgeführt, die die Expression des chemotaktisch
wirksamen MIG auf malignen Zellen unter GrB-induzierenden Stimuli zeigen sollten.
4
2 Material und Methoden
2.1 Probengewinnung und Zellkultur
Die Gewinnung der Probenmaterialien wurde von der Ethikkommission der Universität Ulm genehmigt. Die Finanzierung des Forschungsprojektes trugen die Deutsche
Forschungsgemeinschaft (Grant JA 1769/1-1), die Deutsche José Carreras LeukämieStiftung (Grant SP 07/10), und der Deutsche Akademische Austauschdienst (Grant
D/08/11870). Peripheres Blut von gesunden Probanden und Patienten mit chronisch
lymphatischer Leukämie aus der hämatologischen Ambulanz des Universitätsklinikums
Ulm wurde nach Aufklärung und Zustimmung der Probanden abgenommen. Mononukleäre Zellen aus etwa 150 ml peripherem Blut wurden mittels Ficoll-Dichtezentrifugation unmittelbar nach der Blutabnahme gewonnen. Für die Blutabnahme wurden
Heparin-beschichtete 10 ml-Vacutainer (Becton Dickinson, San Jose, USA) verwendet.
Nach 2 : 1 Verdünnung des Vollblutes mit PBS (10 x; Invitrogen Gibco) schichteten wir1 es auf zuvor auf 37 °C erwärmtes Biocoll (Biochrom AG) und trennten die
Bestandteile durch 15-minütige Dichtegradientenzentrifugation bei 1000 g und 20 °C.
Hiernach entnahmen wir die Zellen des Buffy Coats und reinigten sie durch erneute
Verdünnung mit PBS und Zentrifugation (10 Minuten; 520 g; 4 °C). Im Anschluss
lysierten wir die verbliebenen Erythrozyten mittels 4 ml Lysepuffer für 5 Minuten.
Die Reaktion wurde mit PBS gestoppt, der Lysepuffer in einem weiteren Waschschritt
entfernt und die Zellen unter Zuhilfenahme einer Neubauer-Zählkammer (Brand, Wertheim) und Trypanblau (Biochrom AG, Berlin) gezählt. Für die meisten Experimente
wurden CD19+ B-Zellen mittels des B-Zell-Isolationskits II der Firma Miltenyi Biotec
1
Sämtliche Vorgehensweisen entsprechen den Protokollen des Labors unter der Leitung von Priv.Doz. Dr. med. Bernd Jahrsdörfer.
5
2 Material und Methoden
(Bergisch Gladbach) nach Anleitung des Herstellers isoliert. Hierfür lösten wir die Zellen zunächst in MACS Puffer und fügten Biotin-Antikörper-Cocktail des Herstellers in
entsprechender Menge hinzu. Nach 10-minütiger Inkubation bei 4 °C behandelten wir
die Zellen mit zugehörigen Anti-Biotin-Microbeads für 15 Minuten. Nach dem Waschen
der Zellen konnten B-Zellen über magnetischen Säulen isoliert werden. Um möglichst
reine B-Zellen zu erhalten, wurden zwei magnetische Säulen nacheinander geschaltet.
Dabei wurden stets Reinheiten von über 99 % erreicht. Durch negative magnetische
Selektion erhielten wir so B-Zellen ohne Markierung ihrer Oberfläche mit Antikörpern.
Die Fraktion der T- und NK-Zellen diente bei einigen Experimenten als Kontrolle.
Wir überprüften stets die Reinheit der B-Zellen durch FACS-Analyse. Die Gewinnung
von CD19+ /CD5+ Leukämiezellen erfolgte analog mittels B-Zell-Isolationskit I. Einige
Experimente erforderten die Sortierung der Zellen nach Expression ihrer Oberflächenmarker wie CD27 und IgD mittels eines FACSAria (Becton Dickinson, San Jose, USA).
Während der in-vitro-Inkubation wurden die Zellen in AIM-V Medium (Gibco BRL,
Grand Island, NY) suspendiert und auf einer 96-well-Platte in der Konzentration von
1 x 106 Zellen/ml und 200 µl/well bei 37 °C und 5 % CO2 -Gehalt der Umgebungsluft
mit verschiedenen Reagenzien inkubiert.
2.2 Reagenzien
Humanes IL-21 wurde von BioSource (Camarillo, USA) erworben und, soweit nicht
anders angegeben, in einer Endkonzentration (EK) von 50 ng/ml verwendet. Humanes IL-1β (EK 100 ng/ml), IL-2 (EK 500 U/ml), IL-3 (EK 100 ng/ml), IL-4 (EK 500
U/ml), IL-6 (EK 200 ng/ml), IL-7 (EK 25 ng/ml), IL-8 (EK 50 ng/ml), IL-9 (EK 25
ng/ml), IL-10 (EK 25 ng/ml), IL-11 (EK 200 ng/ml), IL-12 (EK 50 ng/ml), IL-15 (EK
50 ng/ml), GM-CSF (EK 500 U/ml), G-CSF (EK 1500 U/ml), M-CSF (EK 10 ng/ml)
und TNF-α (EK 200 ng/ml) wurden bei PeproTech GmbH in Hamburg gekauft. IL-23
(EK 50 ng/ml) stammt aus dem Sortiment der Firma BD Biosciences aus Heidelberg.
IL-18 (EK 40 ng/ml) wurde bei MBL International (Woburn, USA), IFN-α (EK 100
U/ml) und IFN-γ (EK 100 U/ml) wurden bei PBL Interferon Source (Piscataway,
USA) erworben. Humanes IL-22 (EK 100 ng/ml) wurde von RDI Research Diagnostics
6
2 Material und Methoden
Inc. (Concord, USA), Leukemia inhibiting factor (LIF; EK 10 ng/ml) bei AbDSerotec (Raleigh, USA) gekauft. Für eine Antigen-unabhängige B-Zellrezeptorstimulation
(anti-BCR) nutzten wir die Affinität aufgereinigter Kaninchen-F(ab’)2-Fragmente an
humane IgA/IgG/IgM (heavy und light chains) -Antikörper der Firma Jackson ImmunoResearch Laboratories (USA) in einer Konzentration von 6,5 µg/ml, soweit nicht
anders angegeben. CpG ODN 2216 (= CpG A), CpG ODN 2006 (= CpG B) und
CpG ODN 2395 (= CpG C) stammen von der Firma Coley Pharmaceutical Group
(Wellesley, USA), CFSE (EK 1 µM) von Molecular Probes (Carlsbad, USA). Die
nachfolgende Tabelle gibt einen Überblick über die verwendeten Pufferlösungen. Dabei stammen die einzelnen Lösungen von folgenden Firmen: Bovines Serum-Albumin
(BSA) von Carl ROTH GmbH & Co KG (Karlsruhe), Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) von Fluka Biochemika (Buchs, Schweiz), Fixationspuffer und Permeabilisationspuffer von ADG, Bio Research (Kaumberg, Österreich), 4-(2-hydroxyethyl)1-Piperazineethansulfonsäure (HEPES) von Invitrogen (Carlsbad, USA), Paraformaldehyd von Merck (Darmstadt), Milli Q von Millipore (Bedford, USA), Saponin von
AppliChem (Darmstadt), Sterofundin von Braun (Melsungen) und Tween von Sigma
Laborchemikalien GmbH (München).
Tabelle 1: Puffer
7
2 Material und Methoden
2.3 Durchflusszytometrie
Die kultivierten Zellen wurden zu den angegebenen Zeitpunkten geerntet und mit gekühltem PBS gewaschen. Für die Oberflächenfärbung verwendeten wir Antikörper,
die mit fluoreszierenden Markern gekoppelt waren. Mit FITC, PE, PE-Cy5, PE-Cy7
oder APC markierte Antikörper gegen CD19, CD20, CD27, CD38, IgD, MHC I, MHC
II, CD69, CD54, CD80, IFN-γ und CD86 stammen von der Firma Becton Dickinson
(Heidelberg). Antikörper gegen Perforin, Granulysin, TRAIL und FasL wurden bei
eBiosciences in San Diego (USA) erworben. Mit PE oder APC markierte Granzym
B-Antikörper (Klon GB12) und die zugehörigen Isotyp-Kontrollen wurden bei Caltag Laboratories (Buckingham, UK) erworben. Um Granzym B intrazellulär mittels
Durchflusszytometrie darzustellen, wurden die Zellen zunächst für 16 Stunden kultiviert. Nach Zugabe von Brefeldin A (Epicentre Technologies, Madison, USA) in einer Endkonzentration von 1 µg/ml inkubierten wir die Zellen für weitere 4 Stunden.
Für Oberflächenfärbungen wurden die Zellen in FACS-Röhrchen (BD Biosciences, Heidelberg) transferiert, für 15 Minuten bei ca. 20 °C mit den jeweiligen Antikörpern
gefärbt und danach mit PBS gewaschen. Die Intrazellulärfärbungen erfolgten unter
Verwendung von Fixations- und Permeabilisationspuffer (ADG, Bio Research GmbH,
Österreich). Hierfür wurden die mit PBS gewaschenen Zellen, zum Teil nach erfolgter
Oberflächenfärbung, zunächst mit jeweils 100 µl Fixationspuffer resuspendiert und für
15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach erneutem Waschen mit PBS wurden
die Zellen mit 100 µl Permeabilisationspuffer sowie anti-Granzym B bzw. der IsotypKontrolle behandelt und für weitere 15 Minuten inkubiert. Um apoptotische Zellen
mittels Durchflusszytometrie darzustellen, färbten wir die Zellen mit Annexin V (BD
Biosciences, Heidelberg) für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Propidiumiodid (Sigma
Laborchemikalien GmbH, Steinheim) wurde unmittelbar vor der FACS-Analyse in einer Konzentration von 1 µg/ml zugegeben. Zur Standardisierung erhielten die Proben
zusätzlich eine definierte Anzahl an Calibration Beads (BD Biosciences, Heidelberg).
Für die Messung der Proben nutzten wir Geräte vom Typ FACScan und FACSCalibur
(Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, USA). Die Auswertung der
Daten erfolgte mittels FlowJo Software (Version 8.7.1, Tree Star, Stanford, USA).
8
2 Material und Methoden
2.4 Granzym B-Sekretions-Assay
Um sezerniertes GrB durchflusszytometrisch darzustellen, entwickelten wir einen auf
Biotin-Neutravidin-Bindung basierenden GrB-Sekretions-Assay. Hierzu wurden 3 µl
von 1 M Dithiothreitol (Pierce, Rockford, USA) zu 1 mg menschlichem GrB-Antikörper
(KlonGB10, Mabtech Inc., Mariemont, USA), gelöst in 500 µl PBS/10 mM EDTA, hinzugegeben. Nach einstündiger Inkubation bei 4 °C entfernten wir überschüssiges Dithiothreitol mittels Gelchromatographie (Sephadex G25, Pharmacia). Anschließend gaben wir 0,5 mg Neutravidin in 200 µl PBS zu 50 µg Succinimidyl-4-(N-Maleimidomethyl)1-Carboxylat (Thermo Scientific, Rockford, USA), gelöst in 20 µl Dimethylsulfoxid,
hinzu und inkubierten die Reagenzien für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Das aktivierte Neutravidin wurde mittels Sephadex G25 gereinigt und in PBS/EDTA gelöst. GrB-Antikörper und aktiviertes Neutravidin wurden im Verhältnis 2 : 1 gemischt.
Nach einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur stoppten wir die Reaktion durch
Zugabe von N-Ethylmaleimid (Pierce, Rockford, USA) in einer Konzentration von 10
µg/ml. Im nächsten Schritt wurden B-Zellen gesunder Probanden isoliert. Diese wurden in 10-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur durch Zugabe von 200 µl EZ-Link
(Sulfosuccinimidyl-6-(biotinamido)-Hexanoat in einer Konzentration von 1mg/ml, bei
pH: 8,4) der Firma Pierce (Rockford, USA) biotinyliert. Die Zellen wurden hierauf
zweimalig mit 50 ml PBS/0,5 % BSA gewaschen, gezählt und in 4 ml PBS/0,5 % BSA
resuspendiert. Nach einem dritten Waschschritt inkubierten wir die Zellen für 20 Minuten mit dem anti-GrB-Antikörper-Neutravidin-Konjugat bei Raumtemperatur und
stoppten die Reaktion mittels Zugabe von PBS/0,5 % BSA und durch einen weiteren
Waschschritt. Anschließend resuspendierten wir die Zellen in AIM-V Medium (Gibco
BRL, Grand Island, NY, USA) und inkubierten die Zellen 48 Stunden lang auf einer 96well-Platte in einer Konzentration von 1 x 106 Zellen/ml und 200 µl/well bei 37 °C und
5 % CO2 -Gehalt der Umgebungsluft mit IL-21 (50 ng/ml) und anti-BCR (6,5 µg/ml).
Im Anschluss ernteten wir die Zellen, färbten sie mit einem PE-markierten Antikörper
gegen humanes GrB (Klon GB12, Caltag Laboratories, Buckingham, UK) und werteten die Proben mittels FACS-Analyse aus. Einen Überblick über die Vorgehensweise
gibt Abbildung 2.
9
2 Material und Methoden
Abbildung 2: Reaktionsschritte beim Granzym B (GrB)-Sekretions-Assay
2.5 ELISpot
Zur Anwendung kamen ein GrB-ELISpot-Kit der Firma Cell Sciences (Canton, USA)
sowie ein MIG-EliSpot-Kit der Firma R&D Systems (Minneapolis, USA). Wir verwendeten 96-well-PVDF-beschichtete Platten von Millipore (Bedford, USA). Alle ELISpots
wurden nach Anleitung der Hersteller durchgeführt. Hierzu aktivierten wir die Platten
zunächst 30 Sekunden lang mit 70 % Ethanol. Nach einem Waschschritt beschichteten wir die Platten über Nacht mit Capture-Antikörpern und blockten am nächsten
Tag mit in PBS gelöstem Magermilchpulver. Die zuvor isolierten B-Zellen wurden in
AIM-V Medium resuspendiert und in einer Konzentration von 1 x 105 Zellen in 100
µl bei 37 °C und 5 % CO2 -Gehalt der Umgebungsluft mit verschieden Reagenzien
15-20 Stunden lang inkubiert. Nach der Kulturzeit entfernten wir die Zellen durch 3maliges Waschen der Platten mit 0,1 % Tween 20 und beschichteten die Platten mit
Detection-Antikörpern für 1,5 Stunden. Durch Inkubation mit Streptavidin-AlkalinePhosphatase für eine Stunde und nachfolgendem Einwirken von BCIP/NBT-Puffer für
10 Minuten bei Raumtemperatur entwickelten sich Farbspots. Nach dem Trocknen der
Platten konnten diese mit Hilfe eines Immunospot Series 1 Analyzer und Immunospot
3 Software (beide von CTL Cellular Technology, Cleveland, USA) ausgewertet werden.
10
2 Material und Methoden
2.6 Statistische Auswertung
Die im Folgenden dargestellten Werte sind Mittelwerte, angegeben mit der jeweiligen
Standardabweichung der Mittelwerte. Um statistische Unterschiede zwischen zwei Datenerhebungen herauszuarbeiten, wendeten wir den t-Test für gepaarte Stichproben an.
Die statistische Signifikanz der Ergebnisse wurde durch Angabe der p-Werte kenntlich
gemacht. Für die Auswertungen der ELISpot-Experimente errechneten wir zuerst die
Prozentwerte der jeweiligen maximal gezählten Punktzahl und multiplizierten diese
mit dem Mittelwert der maximalen Punktzahlen, um Vergleichbarkeit der einzelnen
Experimente zu erreichen.
11
3 Ergebnisse
3.1 Differenzierung von B-Zellen zu Granzym
B-sezernierenden Zellen
3.1.1 Differenzierung von B-Zellen zu Granzym
B-sezernierenden Zellen nach Stimulation mit IL-21
Ein wichtiges Ziel dieser Arbeit bestand darin, GrB-produzierende B-Zellen hinsichtlich ihrer auslösenden Stimuli, ihrer Viabilität und der Art ihrer Oberflächenmarker
zu charakterisieren. Zunächst wurden unfraktionierte B-Zellen gesunder Spender im
Verband mit anderen peripheren mononukleären Zellen und isolierte B-Zellen hoher
Reinheit verglichen. Abbildung 3 zeigt, dass beide Gruppen in der Lage sind, GrB zu
produzieren. Dies legt die Vermutung nahe, dass Granzym B von B-Zellen gesunder
Individuen produziert werden kann und keine anderen Zellen Teil dieses Prozesses sein
müssen, solange IL-21 und B-Zellrezeptorstimulation vorliegen.
12
3 Ergebnisse
Abbildung 3: In B-Zellen im Verband mit unfraktionierten mononukleären Zellen und
isolierten B-Zellen konnte gleichermaßen Induktion von Granzym B (GrB) nachgewiesen werden. Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) und isolierte B-Zellen von gesunden Spendern wurden für 24 Stunden mit oder ohne Interleukin (IL) 21 (50 ng/ml)
und B-Zellrezeptorantikörper (anti-BCR) (6,5 µg/ml) kultiviert und anschließend mit
anti-GrB PE (Phycoerythrin) (PBMC zusätzlich mit anti-CD19 Cychrom 5) gefärbt.
Gezeigt werden Dot-Plots, wobei jeder Punkt einer mit fluoreszierendem Farbstoff markierten Zelle entspricht. In der oberen Reihe (PBMC) entsprechen die rechten oberen
Quadranten den GrB-enthaltenden B-Zellen, in der unteren Reihe markiert das Gate
selbige.
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3 Ergebnisse
Abbildung 4: B-Zellen werden durch Interleukin (IL) 21 angeregt, Granzym B (GrB)
zu produzieren. Dieser Effekt wird durch B-Zellrezeptorstimulation verstärkt. B-Zellen
von einem gesunden Spender wurden für 24 Stunden mit IL-21 (50 ng/ml), BZellrezeptorantikörper (anti-BCR) (6,5 µg/ml) oder beidem zusammen kultiviert und
anschließend mit anti-GrB PE (Phycoerythrin) gefärbt. Das Gate im Dot-Plot markiert
den Prozentsatz der GrB-produzierenden Zellen.
Weiterhin konnte belegt werden, dass auch IL-21 alleine die Induktion von GrB in BZellen hervorrufen kann (Abbildung 4). Ein Vergleich mit zusätzlich durch anti-BCR
stimulierten Zellen zeigt jedoch, dass dieser Effekt noch verstärkt werden kann. Dies
legt nahe, dass die Aktivierung des B-Zellrezeptors eine entscheidende Rolle bei der
GrB-Produktion spielt. Um weiterhin zu prüfen, welche Konzentrationen an Reagenzien nötig sind, damit optimale Induktion der GrB-Produktion erreicht werden kann,
wurden Experimente mit Konzentrationsreihen durchgeführt. Gezeigt wird in Abbildung 5 ein ELISpot, der die maximale Anzahl an Punkten, repräsentativ für GrBproduzierende Zellen, bei einer Konzentration von 25 ng IL-21 und 1,625 bis 6,5 µg
anti-BCR angibt. Die Differenzierung von B-Zellen in GrB-produzierende Zellen spielt
sich in der Mehrheit aller stimulierten Zellen ab. Abbildung 6 zeigt die GrB-Induktion
nach Stimulation mit IL-21 und anti-BCR verglichen mit Zellen in Medium nach 6, 12,
24 und 48 Stunden, wobei der Anteil der GrB-produzierenden Zellen nach 48 Stunden
über 63 % lag.
14
3 Ergebnisse
5.
15
3 Ergebnisse
Abbildung 5: Interleukin (IL) 21 und B-Zellrezeptorantikörper (anti-BCR) induzieren
Granzym B (GrB) in B-Zellen am stärksten, wenn in Konzentrationen von 25 ng IL-21
und 1,625 µg anti-BCR verwendet. Isolierte B-Zellen hoher Reinheit (99,9 %) von einem
gesunden Spender wurden in 1 x 105 Zellen pro100 µl und well mit verschiedenen Konzentrationen von anti-BCR und IL-21 über Nacht auf einer ELISpot (Enzyme-Linked
Immuno-Spot) -Platte inkubiert. Jede Kombination wurde in Duplikaten pipettiert.
Als Negativkontrollen wurden unstimulierte Zellen in Medium, als Positivkontrolle TZellen/ Natürliche Killer (NK) Zellen stimuliert mit Phytohämagglutinin (PHA) (10
µg/ml) herangezogen. Der ELISpot wurde wie im Material- und Methodenteil beschrieben entwickelt und ausgewertet.
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3 Ergebnisse
Abbildung 6: Die Granzym B (GrB) -Produktion durch B-Zellen nimmt in den ersten 48 Stunden nach Stimulation stetig zu. Isolierte B-Zellen von gesundem Spender
wurden für 6, 12, 24 und 48 Stunden mit Interleukin (IL) 21 (50 ng/ml) und BZellrezeptorantikörper (anti-BCR) (6,5 µg/ml) kultiviert und anschließend mit antiGrB PE (Phycoerythrin) gefärbt. Das Gate im Dot-Plot markiert den Prozentsatz der
GrB-produzierenden Zellen.
3.1.2 Induktion von Granzym B in B-Zellen durch die
Zytokinkombination IL-4 und IL-10
Wie schon gezeigt ist IL-21, welches der IL-2-Zytokinfamilie angehört, ein potenter
Stimulator der GrB-Produktion in B-Zellen. Um zu überprüfen, ob auch andere Zytokine aus dieser Gruppe oder auch andere Zytokingruppen ähnliche Effekte haben,
wurden ELISpots mit verschiedenen Zytokinen bzw. Zytokinkombinationen durchgeführt. Sämtliche Proben wurden zusätzlich mit anti-BCR behandelt. Als Positivkontrolle dienten T- und NK-Zellen stimuliert mit PHA, als Negativkontrollen mit antiBCR behandelte B-Zellen. Abbildung 7.1 zeigt exemplarisch einen ELISpot mit einigen getesteten Zytokinen. Die oberste Reihe stellt dabei den GrB-induzierenden Effekt
der einzelnen Zytokine dar, alle anderen Proben enthalten die jeweils am Rand angegebenen Zytokinkombinationen. 7.2 bis 7.3 beschreiben eine Zusammenfassung der
17
3 Ergebnisse
GrB-Produktion durch B-Zellen nach Stimulation mit allen verwendeten Zytokinen
und deren Zusammenwirken. Die Experimente legen nahe, dass die meisten Zytokine
keinen mit IL-21 vergleichbaren Effekt aufweisen. Lediglich die Kombination von IL4 und IL-10 zeigte bei der statistischen Auswertung aller Experimente ebenfalls eine
signifikante Induktion von GrB in B-Zellen.
7.1
18
3 Ergebnisse
7.2
7.3
Abbildung 7: Granzym B (GrB) wird vor allem nach Stimulation mit Interleukin (IL)
21 produziert, doch auch die Kombination von IL-4 und IL-10 zeigt die Fähigkeit, GrB
in B-Zellen zu induzieren. 7.1: Isolierte B-Zellen hoher Reinheit (99,5 %) von einem
gesunden Spender wurden in 1 x 105 Zellen pro 100 µl und well mit verschiedenen Konzentrationen von Zytokinen und Zytokinkombinationen (für Konzentrationsangaben s.
Material und Methoden) über Nacht auf einer GrB-ELISpot (Enzyme-Linked ImmunoSpot) -Platte inkubiert. Alle Proben erhielten zusätzlich B-Zellrezeptorantikörper (antiBCR). Als Negativkontrolle wurden mit anti-BCR stimulierte Zellen in Medium, als
Positivkontrolle T-Zellen stimuliert mit PHA (Phytohämagglutinin) (10 µg/ml) herangezogen. 7.2: B-Zellen wurden mit einzelnen Zytokinen wie beschrieben kultiviert.
Die Säulendiagramme stehen für die mittlere gezählte Zellzahl. Die gezeigten Daten
sind repräsentativ für bis zu 5 unabhängige Experimente. 7.3: B-Zellen wurden mit
den einzelnen Zytokinen in Kombination mit IL-4 wie beschrieben kultiviert. Die Säulendiagramme stehen für die mittlere gezählte Zellzahl. Die gezeigten Daten sind repräsentativ für bis zu 5 unabhängige Experimente. Erstveröffentlichung in Hagn et al.
[17].
19
3 Ergebnisse
3.1.3 Aktive Sekretion von Granzym B durch B-Zellen
Um zu überprüfen, ob GrB im Inneren der B-Zellen verbleibt oder aktiv in die Umgebung sezerniert wird, wurde zusätzlich zu den gezeigten ELISpot-Experimenten ein
FACS-basiertes GrB-Sekretionsprotokoll entwickelt. Die Vorgehensweise ist im Materialund Methodenteil detailliert beschrieben. Abbildung 8.1 belegt, dass nach 48-stündiger
Inkubation bei bis zu 50 % der IL-21-stimulierten B-Zellen GrB auf der Oberfläche
nachgewiesen werden konnte, also von der Zelle sezerniert wurde. Eine Zusammenfassung der FACS-GrB-Sekretionsexperimente gibt Abbildung 8.2.
20
3 Ergebnisse
8.1
8.2
Abbildung 8: Das von B-Zellen produzierte Granzym B (GrB) kann aktiv sezerniert
werden. Isolierte B-Zellen von gesunden Spendern wurden biotinyliert und mit einem
Neutravidin-GrB-Konjugat (= Capture Antibody) versehen (s. Material und Methoden). Die Zellen wurden daraufhin mit oder ohne Interleukin (IL) 21 (50 ng/ml)
und B-Zellrezeptorantikörper (anti-BCR) (6,5 µg/ml) für 48 Stunden inkubiert. Das
sezernierte GrB wurde an der Oberfläche vom Capture Antibody abgefangen und
durch Fluoreszenz-markierten GrB-Antikörper mittels Durchflusszytometrie sichtbar
gemacht. 8.1: Zu sehen sind Dot-Plots mit und ohne Stimulation, sowie die zugehörige
Isotyp-Kontrolle unter Stimulation. Die Gates umschließen GrB-sezernierende Zellen.
8.2: Die Säulendiagramme repräsentieren die GrB-Sekretion von drei unabhängigen
Experimenten. Erstveröffentlichung in Hagn et al. [17].
21
3 Ergebnisse
3.2 Phänotyp, Viabilität und Proliferation Granzym
B-sezernierender gesunder B-Zellen
3.2.1 Naive B-Zellen produzieren größere Mengen an Granzym
B als Memory B-Zellen
B-Zellen können grob in zwei Hauptgruppen unterteilt werden. B-Zellen, die noch nicht
in Kontakt mit Antigen getreten sind, exprimieren auf ihrer Oberfläche IgD, jedoch
keine CD27-Moleküle. Diese Gruppe nennt man naive B-Zellen. Kommen B-Zellen in
Kontakt mit Antigen, differenzieren sie zu Memory-B-Zellen. Diese weisen keine IgDOberflächenmoleküle mehr auf, exprimieren jedoch CD27. Um zu überprüfen, ob GrBproduzierende B-Zellen phänotypisch einer dieser Gruppen zugeordnet werden können,
wurden isolierte B-Zellen mittels Zellsorter in naive und Memory-B-Zellen getrennt
und mit IL-21 und anti-BCR kultiviert. Abbildung 9.1 zeigt zunächst die getrennten
B-Zellfraktionen, Abbildung 9.2 fasst die durchgeführten Experimente zusammen und
belegt, dass beide Gruppen in der Lage sind, GrB zu produzieren, naive B-Zellen dies
jedoch in signifikant höherem Maße können als Memory-B-Zellen.
22
3 Ergebnisse
9.1
9.2
Abbildung 9: Naive B-Zellen produzieren größere Mengen an Granzym B (GrB) als
Memory-B-Zellen. Isolierte B-Zellen von gesunden Spendern wurden mit IgD und CD27
gefärbt, mittels Durchflusszytometrie nach Zellgruppen sortiert und über Nacht mit
oder ohne Interleukin (IL) 21 (50 ng/ml) und B-Zellrezeptorantikörper (anti-BCR)
(6,5 µg/ml) inkubiert. 9.1: Zu sehen ist das Gating am FACSsort vor dem Sortieren (links) und die einzelnen Zellfraktionen nach dem Sortiervorgang (rechts). 9.2:
Die Säulendiagramme stehen für die GrB-Sekretion, repräsentativ für 3 Experimente.
Erstveröffentlichung in Hagn et al. [17].
23
3 Ergebnisse
3.2.2 Oberflächenphänotypisierung von Granzym
B-produzierenden B-Zellen
In einem weiteren Teil der Arbeit wurden GrB-produzierende Zellen auf ihre Expression
von Oberflächenmarkern hin mittels FACS-Analyse untersucht, um Rückschlüsse auf
etwaige Funktionen zu ziehen und Ähnlichkeiten mit anderen Immunzellen zu detektieren. Dabei zeigte sich (Abbildung 10), dass bei GrB-produzierenden Zellen sowohl
IgD als auch CD27, das als Marker für Memory-B-Zellen gilt, herunterreguliert werden, während die Expression von CD19 nahezu gleich bleibt. Für CD20 zeigte sich im
Vergleich zu Medium eine leichte Zunahme der Oberflächenmoleküle, während CD38
herunterreguliert wurde. Außerdem wurde verglichen, ob GrB-produzierende Zellen im
Vergleich zu GrB-negativen Zellen und unstimulierten Zellen Oberflächenmoleküle aufweisen, die Auskunft über mögliche Bindung an bzw. Stimulation durch andere Zellen
geben könnten.
Abbildung 10: Interleukin (IL) 21-stimulierte B-Zellen zeigen einen
CD19+ CD20+ CD27¯IgD¯CD38¯ Phänotyp. Isolierte B-Zellen wurden mit oder
ohne B-Zellrezeptorantikörper (anti-BCR) (6,5 µg/ml) und IL-21 (50 ng/ml) für 72
Stunden inkubiert. Gezeigt ist die Expression von CD19, CD20, CD27, CD38 und IgD
als Histogramm und Balkendiagramm. Letzteres ist repräsentativ für 3-5 unabhängige
Experimente. Erstveröffentlichung in Hagn et al. [17].
24
3 Ergebnisse
Abbildung 11 zeigt eine Auswahl der getesteten Oberflächenmoleküle. Insbesondere
das antigenpräsentierende Molekül MHC II, das Zellädhäsionsmolekül CD54, der frühe
Aktivierungsmarker CD69 und die für die T-Zellaktivierung wichtigen kostimulatorischen Moleküle CD80 und CD86 weisen bedeutend stärkere Oberflächenexpression auf
als unstimulierte Zellen. Weiterhin wurden die Zellen auch auf Expression von intrazellulären Markern und anderen zytotoxischen Molekülen hin überprüft. Dabei zeigte
sich eine geringe, teilweise jedoch statistisch signifikante, Zunahme der Expression des
zytolytischen Moleküls Perforin, des pro-apoptotisch wirksamen Moleküls Granulysin,
der Apoptose-induzierenden Liganden TRAIL und FasL und des anti-viral wirksamen
Botenstoffs IFN-γ. Da dies allesamt Moleküle sind, die typischerweise in zytotoxischen
T-Zellen gefunden werden, könnte dies zusammen mit den GrB-Befunden auf eine mögliche Existenz zytotoxischer B-Zellen hinweisen. Um die phagozytotischen Eigenschaften vom GrB-produzierenden Zellen zu überprüfen, wurden Zellen neben der üblichen
Stimulation mit IL-21 und anti-BCR zusätzlich mit FITC-markiertem Dextran über
Nacht inkubiert. Auch hier zeigte sich eine verstärkte Aufnahme der stimulierten Zellen gegenüber Medium (Abbildung 12), wobei insbesondere die Granzym B-positiven
B-Zellen eine signifikant höhere Dextranaufnahme aufwiesen als GrB-negative oder
unstimulierte B-Zellen.
25
3 Ergebnisse
11.1
11.2
26
3 Ergebnisse
11.3
Abbildung 11: Granzym B (GrB) -produzierende Zellen regulieren für die B- und TZellinteraktion wichtige Moleküle herauf und zeigen erhöhte Expression von anderen zytotoxischen Molekülen. Isolierte B-Zellen von gesunden Spendern wurden mit oder ohne
B-Zellrezeptorantikörper (anti-BCR) (6,5 µg/ml) und Interleukin (IL) 21 (50 ng/ml)
für 72 Stunden inkubiert und mittels Durchflusszytometrie analysiert. 11.1: Exemplarisches Gating der Zellen. 11.2: Gezeigt wird in den Abbildungen die Expression von
MHC I, MHC II, CD69, CD54, CD80 und CD86 auf Medium, GrB-positiven und GrBnegativen Zellen. Die Balkendiagramme sind repräsentativ für 3-5 unabhängige Experimente. Erstveröffentlichung in Hagn et al. [17]. 11.3 : Gezeigt wird die Expression von
Perforin, Granulysin, Interferon (IFN) -γ, Fas-Ligand und TRAIL (Tumor Necrosis
Factor-Related Apoptosis-Inducing Ligand) auf B-Zellen in Medium und stimulierten
B-Zellen. Die Balkendiagramme sind repräsentativ für 2-3 unabhängige Experimente.
27
3 Ergebnisse
Abbildung 12: GrB-positive B-Zellen zeigen vermehrte phagozytotische Aktivität. Isolierte B-Zellen von gesunden Spendern wurden mit oder ohne B-Zellrezeptorantikörper
(anti-BCR) (6,5 µg/ml) und Interleukin (IL) 21 (50 ng/ml) über Nacht zusammen
mit Fluoresceine Isothiocyanate (FITC) -markiertem Dextran inkubiert und mittels
Durchflusszytometrie analysiert. Die Säulendiagramme repräsentieren die Aufnahme
von Dextran in die Zellen und damit die phagozytotische Aktivität der Zellen. Sie
stehen für 3 unabhängige Experimente.
3.2.3 Proliferation von B-Zellen unter Granzym
B-induzierenden Stimuli
Um mögliche Einflüsse von IL-21 auf die Proliferationsrate stimulierter B-Zellen zu untersuchen, wurden Zellen am Tag 0 mit CFSE (Carboxyfluorescein-Succinimidylester)
gefärbt. CFSE bindet unspezifisch an intrazelluläre Proteine und verteilt sich bei Teilung der Zelle gleichmäßig auf die Tochterzellen. Auf diese Weise kann durch Abnahme
der CFSE-Konzentration auf Proliferation der Zellen geschlossen werden. Die Zellteilung wurde unter Stimulation mit verschiedenen Reagenzien fünf Tage lang verfolgt.
Dabei zeigte sich kaum Proliferation bei Inkubation in Medium, Stimulation mit antiBCR, IL-21 oder Kombination aus anti-BCR und IL-21. War hingegen CpG ODN der
Probe beigefügt worden, proliferierten bis zu 70 % der Zellen (Abbildung 13.1). Auch
hier wurde untersucht, ob GrB-positive B-Zellen sich hinsichtlich ihrer Proliferation
von Zellen, die kein GrB produzieren, unterscheiden. Abbildung 13.2 zeigt eine höhe-
28
3 Ergebnisse
re Proliferationsrate bei Granzym B-positiven Zellen unter Stimulation mit IL-21 und
CpG ODN.
13.1
29
3 Ergebnisse
13.2
Abbildung 13: Granzym B (GrB) -produzierende B-Zellen proliferieren insbesondere unter der Einwirkung von CpG ODN (Cytosin-phosphatidyl-Guanin Oligodesoxynekleotid). Isolierte B-Zellen von gesunden Spendern wurden zunächst mit CFSE
(Carboxyfluorescein-Succinimidylester) gefärbt, wobei die vollständige Anfärbung der
Zellen am Tag 0 überprüft wurde. Es folgte die Kultur der Zellen ohne Stimulus, mit
B-Zellrezeptorantikörper (anti-BCR) (6,5 µg/ml) und Interleukin (IL) 21 (50 ng/ml)
einzeln oder zusammen, mit oder ohne CpG ODN 2006 (2,5 µg/ml) über 2, 3 oder 5
Tage. 13.1: Gezeigt werden die Proliferationsraten unter den angegebenen Stimuli verglichen mit Medium am Tag 5. Die Linksverschiebung der Kurve, gekennzeichnet durch
den Querbalken, repräsentiert die Proliferation der Zellen. 13.2: Gezeigt wird eine Zusammenfassung über das Proliferationsverhalten unter verschiedenen Stimuli und deren
Kombination an drei unterschiedlichen Zeitpunkten. Die Daten sind repräsentativ für
3 unabhängige Experimente.
3.2.4 Viabilität von Granzym B-sezernierenden B-Zellen
Ähnliches wurde auch bei Prüfung der Viabilität der B-Zellen beobachtet. Zur Abgrenzung von lebenden gegenüber apoptotischen Zellen wurde eine Färbung mit Annexin
V und Propidiumiodid verwendet. Annexin V bindet an Phosphatidylserin, einen sich
in der Zelle befindlichen Phospholipidbestandteil, der bei Apoptose an die Außenseite transloziert wird. Zusätzlich wurden die Proben kurz vor der FACS-Analyse mit
30
3 Ergebnisse
Propidiumiodid behandelt, um zusätzlich nekrotische Zellen abzugrenzen. Die nicht
markierte Zellfraktion stellt somit den Anteil der lebenden Zellen dar. Zur Objektivierung der Messergebnisse wurde zusätzlich eine definierte Menge an Calibration Beads
in jede Probe pipettiert. Abbildung 14.1 zeigt exemplarisch das Gating dieser Proben.
Ähnlich wie bei der Untersuchung der Proliferation überlebten vor allem mit CpG ODN
stimulierte Zellen länger. Auch Zellen, die mit IL-21 und anti-BCR inkubiert wurden,
zeigten trotz der Expression von GrB mehr viable Zellen als Medium alleine (Abbildung
14.2). Ein Vergleich GrB-positiver und -negativer Zellen wies auf einen signifikanten
Unterschied hinsichtlich des Überlebens am Tag 3 zugunsten der GrB-produzierenden
Zellen hin, wie in Abbildung 14.3 dargestellt.
31
3 Ergebnisse
14.1
14.2
32
3 Ergebnisse
14.3
Abbildung 14: Mit Interleukin (IL) 21 und B-Zellrezeptorantikörper (anti-BCR) stimulierte B-Zellen überleben signifikant besser als unstimulierte Zellen. Isolierte B-Zellen
von gesunden Spendern wurden mit oder ohne anti-BCR (6,5 µg/ml), IL-21 (50 ng/ml)
und CpG ODN ( Cytosin-phosphatidyl-Guanin Oligodesoxynekleotid) 2006 (2,5 µg/ml)
über 1, 2 oder 3 Tage inkubiert und dann entweder mit anti-Granzym B (GrB) Antikörper oder Annexin V/ Propidiumiodid gefärbt. 14.1: Gezeigt wird das Gating
bei der Lebendfärbung. Die Probe wurde mit anti-BCR und IL-21 stimuliert und zeigt
die lebenden Zellen an Tag 3. 14.2: Das Säulendiagramm stellt die Überlebensraten und
GrB-Produktion bei verschiedenen Stimuli an Tag 3 dar. Die Daten sind repräsentativ
für 3 unabhängige Experimente. 14.3: Intrazelluläre GrB-Färbung und Lebendfärbungen können aufgrund der Verwendung von Fixations- und Permeabilisationspuffer, und
somit der Abtötung der Zellen bei der GrB-Färbung, nicht in einer Probe erfolgen. Die
Daten dieser Abbildung wurden durch morphologische Kriterien (sog. Back-Gating)
gewonnen und repräsentieren die Ergebnisse von 3 unabhängigen Experimenten.
33
3 Ergebnisse
3.3 Wirkung von IL-21 auf maligne B-Zellen von
Patienten mit chronisch lymphatischer Leukämie
3.3.1 Granzym B-Produktion in malignen B-Zellen der
chronisch lymphatischen Leukämie
Wie bereits erwähnt, wurde GrB-Produktion schon früher in malignen B-Zellen der
chronisch lymphatischen B-Zellleukämie entdeckt. Um nachzuvollziehen, ob die bisher
gewonnenen Ergebnisse aus den Experimenten mit gesunden B-Zellen in ähnlicher Weise auch für diese Tumorzellen gelten, wurden weitere Experimente durchgeführt. Zunächst wurde geprüft, ob in CLL-Zellen ähnlich viel GrB induziert werden kann. Dazu
wurden zunächst C19+ /CD5+ Tumorzellen durch negative magnetische Selektion isoliert und mit verschiedenen Reagenzien kultiviert. In einigen wenigen Patientenproben
wurde eine schwache spontane Sekretion von GrB ohne jegliche vorherige Stimulation
beobachtet (keine Abbildung). Obwohl dieser Effekt nicht bei allen CLL-Proben zu
finden war, könnte er darauf hindeuten, dass GrB-produzierende B-Zellen eine Rolle
in der Tumorphysiologie von CLL-Patienten spielen könnten. Wurden CLL-Zellen mit
anti-BCR und IL-21 stimuliert, zeigte sich eine geringe Induktion von GrB. Die stärkste
Reaktion zeigte sich nach Stimulation mit IL-21 und CpG ODN. Die Werte blieben aber
allesamt deutlich unter den bei gesunden B-Zellen beobachteten Effekten. In den meisten Experimenten lagen die Prozentsätze von GrB-produzierenden B-CLL-Zellen lediglich zwischen 1 und 2 Prozentpunkten (Abbildung 15.1). Um die Oberflächenmoleküle
der Tumorzellen genauer zu charakterisieren, wurden ähnliche FACS-Experimente wie
bei gesunden B-Zellen durchgeführt. Die Resultate hierzu ergaben jedoch sehr inkonsistente Ergebnisse. Lediglich eine signifikante Herunterregulierung von CD27 konnte
bei stimulierten B-CLL-Zellen nachgewiesen werden (Abbildung 15.2).
34
3 Ergebnisse
15.1
35
3 Ergebnisse
15.2
Abbildung 15: Chronisch lymphatische Leukämie (CLL) Zellen produzieren geringe
Mengen an Granzym B (GrB) unter Stimulation mit Interleukin (IL) 21 und entweder
B-Zellrezeptorantikörper (anti-BCR) oder CpG ODN (Cytosin-phosphatidyl-Guanin
Oligodesoxynekleotid) und zeigen einen CD27- Phänotyp. Isolierte CD19+ /CD5+ BCLL-Zellen von Ambulanzpatienten der Universitätsklinik Ulm wurden mit oder ohne
anti-BCR (6,5 µg/ml), IL-21 (50 ng/ml) und CpG ODN 2006 (2,5 µg/ml) kultiviert
und mit GrB-Produktion mittels Durchflusszytometrie untersucht. 15.1: Gezeigt werden isolierte B-Zellen gesunder Spender im Vergleich mit B-CLL-Tumorzellen unter angegebener Stimulation. Die Balkendiagramme repräsentieren die GrB-Produktion von
bis zu 25 unterschiedlichen Proben jeweils der gleichen Spender. 15.2: Gezeigt wird die
Expression von Major Histocompatibility Complex (MHC) I, MHC II, CD38, CD27,
IgD, CD80 und CD86 auf B-CLL-Zellen in Medium und nach 48 Stunden Stimulation.
Die Balkendiagramme sind repräsentativ für bis zu 3 unabhängige Experimente.
36
3 Ergebnisse
3.3.2 Expression von humanem MIG in Zellen der chronisch
lymphatischen B-Zellleukämie
Um weitere Einsicht in die Tumorbiologie von CLL-Zellen zu gewinnen und insbesondere die Seite der immunologischen Tumorabwehr zu beleuchten, wurden einige Experimente bezüglich des Chemokins MIG (CXCL9) durchgeführt. Dabei stimulierten
wir isolierte CLL-Zellen mit verschiedenen Reagenzien (Abbildung 16.1). Interessanterweise reagierten die Zellen nicht nur auf Stimulation mit IFN-γ, sondern sezernierten
größere Mengen des Chemokins auch unter Stimulation mit CpG ODN und IL-21, der
Kombination, die, wie vorher gezeigt, auch die höchste GrB-Induktion bewirkte. Neu
ist außerdem, dass durch Zugabe von CpG B oder C zu IFN-γ die MIG-Sekretion
im Vergleich zu B-Zellrezeptorstimulation und IFN-γ stark gesteigert werden konnte (Abbildung 16.2). Ähnliche Versuche wurden auch mit B-Zellen gesunder Spender
duchgeführt (keine Abbildung). Hierbei zeigten sich ebenfalls synergistische Effekte bei
Stimulation von IFN-γ in Kombination mit CpG B oder C. Die Kombination IL-21 plus
CpG ODN wies deutlich weniger MIG-Expression auf als in malignen Zellen.
16.1
37
3 Ergebnisse
16.2
Abbildung 16: Humanes MIG (Monokine-Induced by Interferon-γ) wird von B-CLL
(chronisch lymphatische Leukämie) Zellen nach Stimulation durch Interleukin (IL) 21
und CpG ODN (Cytosin-phosphatidyl-Guanin Oligodesoxynekleotid) exprimiert. 16.1:
Isolierte CD19+ /CD5+ B-CLL-Zellen (Reinheit 99,3 %) von Ambulanzpatienten der
Universitätsklinik Ulm wurden in Konzentrationen von 1 x 105 Zellen pro 100 µl und
well mit verschieden Stimuli (Konzentrationen siehe Material und Methoden) über
Nacht auf MIG-ELISpot (Enzyme-Linked Immuno-Spot) -Platten inkubiert und nach
Anweisung des Herstellers entwickelt. Als Positivkontrollen fungierten T-Zellen + PHA
(Phytohämagglutinin), als Negativkontrollen B-CLL-Zellen + PHA. 16.2: B-CLLZellen wurden mit IL-21 oder IFN (Interferon) -γ und jeweils B-Zellrezeptorantikörper
(anti-BCR) oder CpG B oder C (je 2,5 µg/ml) auf MIG-ELISpot-Platten wie beschrieben kultiviert. Die Säulendiagramme stehen für die mittlere gezählte, korrigierte
Punktzahl. Die Daten sind repräsentativ für 3 Experimente.
38
4 Diskussion
4.1 Einordung der Ergebnisse aus den Experimenten
mit gesunden B-Zellen in die aktuelle Literatur
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass B-Zellen junger, gesunder Spender in der Lage
sind, große Mengen der Apoptose-induzierenden Serinprotease GrB herzustellen. Aus
der Tatsache, dass nicht nur B-Zellen im Verband mit anderen mononukleären Zellen,
sondern auch isolierte B-Zellen hoher Reinheit GrB produzieren können, ist abzuleiten,
dass außer IL-21 und B-Zellrezeptorstimulation keine weiteren Stimuli von eventuell
nicht-identifizierten Zellen nötig sind, um GrB-Induktion in B-Zellen auszulösen. Die
obligatorische Anwesenheit von IL-21 weist darauf hin, dass CD4+ T-Zellen am Prozess
der Stimulation beteiligt sind. Insbesondere die Untergruppe der TH 17-Zellen, die IL21 neben IL-17 und IL-22 in hohen Mengen produziert, könnte hier eine Rolle spielen.
Bisher sind diese als pro-inflammatorische Effektor-T-Zellen bekannt und mit einer
Reihe von Autoimmunkrankheiten assoziiert [34, 42]. Zudem zeigte sich, dass TH 17Zellen in der Lage sind, in B-Zellen stark proliferative Effekte zu induzieren und u. a.
die Antikörperproduktion zu triggern [42].
Die B-Zellrezeptorstimulation kann in vivo durch vielerlei Antigene ausgelöst werden,
vorzugsweise aber durch oligomerische Proteine. Sie benötigt normalerweise sowohl
eine Bindung von Antigen durch das B-Zelloberflächenimmunglobulin, also den BZellrezeptor, als auch die Interaktion der B-Zelle mit einer antigenspezifischen HelferT-Zelle. Diese stimulieren die B-Zelle durch die Bindung von CD40-Ligand auf der
T-Zelle an CD40 auf der B-Zelle, durch die Interaktion von anderen TNF-LigandRezeptorpaaren und durch die Freisetzung von Zytokinen. Es gibt aber auch mikrobielle
39
4 Diskussion
Antigene, die B-Zellen ohne die Hilfe von T-Zellen aktivieren können (sog. Thymusunabhängige Antigene). Dies geschieht beispielsweise durch direktes Binden eines Teils
des Antigens an einen Rezeptor des angeborenen Immunsystems (beispielsweise einen
Toll-like-Rezeptor) oder durch extensives Quervernetzen des Membran-IgMs mittels
eines polymeren Antigens [26]. Letzteren Mechanismus nutzten wir für die in-vitroExperimente. Rückschließend bedeutet das, dass die gesehenen verstärkenden Effekte von anti-BCR nicht notwendigerweise Teil eines antigen-spezifischen Vorgang sein
müssen, sondern durchaus im Rahmen der angeborenen Immunität eine Rolle spielen
könnten.
Die Ergebnisse aus den Konzentrationsversuchen zeigen optimale Konzentrationen von
anti-BCR im Bereich von 1,65 µg/ml bis 6,5 µg/ml und liegen damit unter oder im Bereich dessen, was auch in anderen Forschungsarbeiten an Konzentrationen angewendet
wurde [21]. Für die Aktivierung zytotoxischer T-Zellen durch IL-21 wurden bei etwa
30 ng/ml optimale Ergebnisse festgestellt [39, 40], was sich ebenfalls mit den oben
dargestellten Ergebnissen deckt. Dies weist darauf hin, dass die von uns verwendeten
Konzentrationen in vivo erreicht und wirksam werden können. Abbildung 6 zeigt weiterhin, dass ein Großteil der stimulierten Zellen fähig ist, GrB zu produzieren und zwar
innerhalb einer relativ kurzen Zeitspanne, ein weiterer Hinweis dafür, dass diese Zellen einen Teil der schnellen Immunabwehr darstellen können. Zudem zeigte ich durch
ELISpot-Experimente und die Etablierung des Sekretions-Assays, dass GrB nicht in der
Zelle verbleibt, sondern aktiv sezerniert wird. Ob die Wirkung des freigesetzten GrB in
Reaktion auf endokrine oder parakrine Mechanismen erfolgt, bleibt jedoch noch offen.
Naive B-Zellen von gesunden Spendern zeigen ein höheres Potential für GrB-Expression
als Memory-B-Zellen. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, dass naive B-Zellen generell eine höhere Expression des IL-21-Rezeptors an ihrer Oberfläche aufweisen [13].
Möglicherweise spielt aber auch die vorausgegangene Stimulation der Memory-Zellen
durch Anwesenheit eines Antigens im Sinne einer Spezialisierung dieser Zellen eine
Rolle. Die Entwicklung funktioneller, Antigen-spezifischer Memory-B-Zellen ist auf die
Aktivierung durch Helfer-T-Zellen angewiesen. Daraufhin treten sie in eine Phase der
Proliferation und Selektion im lymphatischen Gewebe ein. Erst nach etwa einer Woche
sind die ersten Memory-B-Zellen funktionsfähig, das höchste Level ist ca. einen Monat
nach Immunisierung erreicht [26]. Meine Ergebnisse deuten somit darauf hin, dass B-
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4 Diskussion
Zellen in einer frühen Phase ihrer Entwicklung und damit möglicherweise im Rahmen
der schnellen Immunantwort eine Rolle spielen können. Vor allem zeigen die Befunde, dass die GrB-Produktion der B-Zellen nicht nur in Anwesenheit ihres jeweiligen
spezifischen Antigens, sondern auch in Zellen induziert werden kann, die noch keinen
Antigen-Kontakt hatten.
Die Experimente zur Erfassung aller Zytokine, die GrB in B-Zellen induzieren können, zeigten neben der Stimulation durch IL-21 eine signifikante Produktion an GrB
unter der Stimulation mit IL-4 und IL-10. IL-4 gehört wie IL-21 zur HämatopoetinZytokinfamilie und wird insbesondere von TH 2-Zellen, aber auch Mastzellen produziert.
Zu seinen Aufgaben gehören neben der Aktivierung von B-Zellen die Differenzierung
von naiven T-Zellen in TH 2-Zellen [26]. Hinsichtlich seiner Wirkung auf zytotoxische
T-Zellen wird berichtet, dass diese zwar unter dem Einfluss von IL-4 proliferieren, ihre
Fähigkeit zur Hochregulation von GrB jedoch verlieren [47]. IL-10 wird ebenfalls u.
a. von TH 2-Zellen sezerniert und gilt als potenter Suppressor von Makrophagen [26].
Des Weiteren wurde es als Inhibitor der NK-Zell-stimulierenden IL-12-Produktion in
PBMC beschrieben [7]. Kürzlich wurde es jedoch auch in der Umgebung von aktivierten, GrB-produzierenden peripheren dendritischen Zellen entdeckt [23]. Sowohl IL-10
als auch IL-4 inhibieren die Produktion pro-inflammatorischer Zytokine und gelten somit als anti-inflammatorisch [59]. Von beiden weiß man, dass sie bei der Verhinderung
von TH 1-vermittelten Autoimmunkrankheiten eine Rolle spielen, wie beispielsweise der
experimentellen Encephalomyelitis, eines Mausmodells der Multiplen Sklerose [2]. Es
stellt sich also die Frage, ob Granzym B-produzierende B-Zellen möglicherweise ebenfalls autoimmune Zellen bekämpfen können und somit immunsuppressive Funktionen
haben. Fest steht, dass alle Zytokine, die eine Induktion von GrB hervorrufen, von
TH 2-Zellen produziert werden können.
Möglich erschien zu einem frühen Zeitpunkt der Arbeit auch die These, dass die Produktion von GrB in B-Zellen autoregulativen Zwecken dient, d. h., dass B-Zellen, die GrB
exprimieren, dadurch selbst apoptotisch werden [20, 9]. Meine Experimente zeigten jedoch, dass mit anti-BCR und IL-21 stimulierte Zellen besser als unstimulierte überleben
und dass GrB-produzierende Zellen einen Überlebensvorteil gegenüber GrB-negativen
Zellen besitzen. Hieraus lässt sich schließen, dass die GrB-Produktion in B-Zellen zumindest keine autoregulative Funktion hat. Die Zellen überlebten insbesondere dann
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4 Diskussion
vermehrt, wenn sie zusätzlich mit CpG ODN, synthetisch hergestellten Nukleotiden,
stimuliert wurden. Es ist bekannt, dass B-Zellen nach Stimulation mit CpG ODN eine vermehrte Expression kostimulatorischer Moleküle wie CD80, CD86 und MHC II,
Sekretion von IL-6 und IL-10 sowie starke Proliferation und Differenzierung von naiven B-Zellen in IgM-produzierende Plasmazellen zeigen, während CpG ODN bezüglich
der Generierung von Memory-B-Zellen ohne Wirkung bleibt. Des Weiteren konnten
anti-apoptotische Effekte nachgewiesen werden [36, 35, 27]. In meinen Experimenten
prüfte ich deshalb einen möglichen Effekt auf GrB-sezernierende B-Zellen. CpG ODN
alleine wies keine GrB-Induktion in B-Zellen auf und auch bei zusätzlicher Stimulation mit IL-21 und anti-BCR gegenüber alleiniger Stimulation mit IL-21 und anti-BCR
konnte die GrB-Produktion nur unwesentlich gesteigert werden. Ich fand jedoch, dass
Stimulation mit CpG ODN die Viabilität der durch IL-21 und anti-BCR schon besser
überlebenden GrB-sezernierenden B-Zellen nochmals signifikant heraufsetzt. Dies lässt
darauf schließen, dass das Auftreten von CpG-DNA im Rahmen von Infektionen GrBsezernierende B-Zellen zusätzlich aktiviert. Es unterstreicht somit deren Rolle in der
frühen Immunabwehr.
Ähnliche Resultate fand ich auch hinsichtlich der Proliferation von B-Zellen. Mit IL-21
und anti-BCR stimulierte Zellen besaßen keine wesentlich höheren Proliferationsraten
als Zellen in Medium. Wurde jedoch zusätzlich mit CpG ODN stimuliert, proliferierten
die Zellen stark, wobei GrB-produzierende Zellen unter der Stimulation CpG ODN und
IL-21 höhere Proliferationsraten aufwiesen als GrB-negative Zellen unter der gleichen
Stimulation, möglicherweise ein Zeichen ihrer hohen Aktivierungsstufe.
Ein weiterer wichtiger Befundbaustein der vorliegenden Arbeit besteht in der Charakterisierung der Oberflächenmoleküle GrB-produzierender B-Zellen. Nach Stimulation
mit IL-21 und anti-BCR zeigte sich ein CD19+ CD20+ CD27¯IgD¯CD38¯ Phänotyp.
Wie erwartet fand sich auf GrB-produzierenden Zellen der Oberflächenmarker CD19,
ein typischer B-Zellmarker, der schon auf frühen B-Zellvorstufen zu finden ist. Er ist Teil
des Korezeptorkomplexes für B-Zellen zusammen mit CD21 und CD81. Bindung des BZellrezeptors mit diesem Komplex erhöht seine Signaltransduktion um ein Vielfaches.
CD19 ist essenziell für die Immunantwort von B-Zellen auf membranständige Antigene.
Seine Bedeutung wird insbesondere dadurch offenkundig, dass Mutationen im Gen für
CD19 die Antikörperantwort des Körpers dramatisch herabsetzten [57, 8]. Auch CD20
42
4 Diskussion
fand sich auf der Oberfläche von IL-21-stimulierten B-Zellen. Es gilt als typischer Marker auf B-Zellen und ist wie CD19 auf Vorläufer-B-Zellen und reifen B-Zellen, nicht
aber auf Plasmazellen zu finden. Seine Funktion besteht in der Regulation der Aktivierung und Differenzierung der B-Zelle durch Bildung von Kalzium-Kanälen [52]. Die
GrB-produzierende B-Zelle ist demnach eine frühe, aber reife B-Zelle, die sich klar von
Plasmazellen abgrenzen lässt. CD27 und IgD wurden nach Stimulation mit IL-21 und
anti-BCR im Vergleich zur unstimulierten Probe herunterreguliert. CD27 kennzeichnet
periphere B-Zellen, die Antigenkontakt hatten, also Memory-B-Zellen oder Plasmazellen. Dieses Molekül wird während der letzten Phasen im Keimzentrum heraufreguliert
und besitzt u. a. kostimulatorische Funktionen für T-Zellen [45]. IgD existiert auf der
Oberfläche von nahezu allen reifen B-Zellen, seine Funktion ist jedoch ungenügend erforscht. Aktivierung der B-Zelle führt zur Abnahme des IgD auf der Zelloberfläche [26],
wie auch in meinen Experimenten gezeigt. IgD+ CD27¯ Zellen kennzeichnen die Gruppe der naiven B-Zellen [30]. Auch die Konzentration von CD38 nimmt im Vergleich
zu Medium unter Stimulation eher ab. Dieser Marker ist stark auf Plasmazellen aber
auch unreifen B-Zellen exprimiert, jedoch auf naiven und Memory B-Zellen kaum vorhanden [45]. Zusammenfassend ähnelt der gefundene CD19+ CD20+ CD27¯IgD¯CD38¯
Phänotyp am ehesten dem der naiven B-Zelle, wobei die Herunterregulation des IgDOberflächenmoleküles auf eine Aktivierung der Zelle schließen lässt.
Weiterhin untersuchte ich die Expression von MHC I und MHC II. Dies sind Proteinkomplexe, die Peptidfragmente von Antigenen auf der Zelloberfläche exprimieren, um
sie T-Zellen zu präsentieren. MHC I kommt auf so gut wie allen peripheren Blutzellen vor und präsentiert neben zelleigenen Peptiden vorwiegend Teile viraler Proteine,
die im Zytosol der infizierten Zellen synthetisiert werden und nach Bindung an MHC
I im endoplasmatischen Retikulum an die Oberfläche der befallenen Zellen gelangen.
Somit können diese Zellen von zytotoxischen T-Zellen erkannt und abgetötet werden
[26]. Ich fand, dass MHC I auf GrB-positiven Zellen im Vergleich zu GrB-negativen
Zellen und Zellen in Medium sich kaum verändert, ein Hinweis darauf, dass die GrBproduzierenden B-Zellen in gleichem Maße wie unstimulierte Zellen eigene oder virale
Antigene präsentieren, welche dann von CD8+ zytotoxischen T-Zellen erkannt werden.
MHC II hingegen fand sich auf GrB-sezernierenden B-Zellen im Vergleich zu Medium
signifikant vermehrt. Es ist ein Molekül, das sich auf Antigen-präsentierenden Zellen
43
4 Diskussion
(APZ) wie dendritischen Zellen und auch B-Zellen findet, die durch phagozytotische
Aktivität Pathogene (z.B. Bakterien) in Endosomen aufnehmen, um sie dann CD4+
Helfer-T-Zellen zu präsentieren. Diese wiederum aktivieren die APZ bei Erkennung
ihres spezifischen Antigens auf deren Oberfläche und helfen Makrophagen so bei der
Abtötung der Keime. Mit ihrer Hilfe können auch B-Zellen proliferieren und sich in
Plasmazellen differenzieren [26]. Die Aufregulation des MHC II Komplexes in meinen Experimenten deutet demnach auf erhöhte Kompetenz zur Antigenpräsentation in
GrB-produzierenden B-Zellen hin. In ähnlichem Zusammenhang kann auch die erhöhte
Aufnahme von Dextran in Granzym B-positive Zellen gedeutet werden.
Auch der Aktivierungsmarker CD69 ist auf GrB-positiven B-Zellen vermehrt exprimiert. Dabei handelt es sich um einen Membranrezeptor, der auf fast allen aus dem
Knochenmark stammenden Zellen in einer frühen Phase lymphozytärer Aktivierung zu
finden ist. Die Rolle des Rezeptors sowie seines Liganden sind zur Zeit noch unzureichend erforscht; CD69-Aktivierung scheint aber sowohl eine pro-inflammatorische als
auch eine immunregulative Komponente zu besitzen [49].
Die starke Expression von CD54 (ICAM-1), einem interzellulären Adhäsionsmolekül,
auf GrB-produzierenden Zellen macht es diesen möglich, sich an andere Zellen oder
Matrix zu binden, und erfüllt damit eine wichtige Voraussetzung für die Migration der
Zellen in Infektionsgebiete und die Anheftung an T-Zellen und deren Aktivierung [48].
Möglicherweise vermittelt die Adhäsion durch CD54 auch einen zusätzlichen Überlebensvorteil, da sie die Zelle vor Apoptose schützt [33].
Die Heraufregulation von CD80 und CD86 auf GrB-positiven Zellen deutet auf die
verbesserte Fähigkeit dieser Zellen zur Kostimulation von T-Zellen hin. Diese Marker
finden sich schon relativ kurze Zeit nach Aktivierung auf Lymphozyten, Makrophagen
sowie dendritischen Zellen und induzieren Proliferation und Zytokin-Produktion von
T-Zellen, fördern die Entwicklung zytotoxischer T-Lymphozyten und verbessern somit
die T-Zellimmunantwort [38].
Neben den genannten Oberflächenmarkern fand ich in meinen Experimenten auch Unterschiede in der Expression von intrazellulären Molekülen zwischen mit IL-21 und
anti-BCR stimulierten und unstimulierten B-Zellen. Dabei wurden insbesondere weitere mit der Induktion von Apoptose assoziierte Moleküle untersucht. Vor allem prüfte
44
4 Diskussion
ich die Anwesenheit von Perforin, einem Molekül, das wie GrB in großen Mengen in
den Granula von NK-Zellen und zytotoxischen T-Zellen vorkommt und Transmembranporen in die Zellmembranen von Zielzellen einbaut, möglicherweise, um anderen
zytotoxischen Substanzen wie Granzymen den Eintritt in die Zielzelle zu erleichtern.
Perforin ist außerdem wichtig für die Freisetzung von in Endosomen befindlichem Granzym in das Zytosol der Zielzellen und damit für seine apoptotische Wirksamkeit [26].
Meine Experimente zeigen, dass stimulierte B-Zellen zwar geringe Mengen an Perforin enthalten, jedoch in wesentlich niedrigerem Ausmaß als NK-Zellen oder CTL. In
letzter Zeit gab es allerdings vermehrt Hinweise darauf, dass GrB-vermittelte Apoptose nicht unbedingt auf die Anwesenheit von Perforin angewiesen ist [37, 12, 14]. Die
GrB-Aufnahme in die Zielzelle erfolgt via Mannose-6-Phosphat-Rezeptor oder Pinozytose und auch die Freisetzung von GrB aus Endosomen kann durch bestimmte virale
Moleküle, die von der Zelle im Rahmen einer Infektion aufgenommen wurden, gefördert werden [43, 50]. Granulysin ist ebenfalls ein Protein, das in den Granula von CTL
gespeichert wird, in Zielzellen Apoptose induzieren kann und außerdem direkte antimikrobielle Effekte gegen Bakterien, Parasiten und Pilze zeigt [51]. Wie bei Perforin
kommt es in GrB-produzierenden B-Zellen jedoch kaum vor. Gleiches gilt für IFN-γ,
ein Zytokin mit anti-proliferativen Effekten, das u. a. auch die Expression von Fas und
Fas-Ligand in Tumorzellen steigert und somit zu deren Zelltod führen kann [46, 62].
Auch deren Expression wurde in meinen Experimenten untersucht, da Fas-Ligand,
ein Molekül, das von CTL exprimiert wird, neben dem Perforin-Granzym-induzierten
Apoptose-Prozess, als wichtigster Killing-Mechanismus von CTL gilt. Bindet dabei
Fas-Ligand CD95 (Fas) auf der Zelloberfläche einer Zielzelle, kommt es durch Aktivierung der Caspase-Kaskade zum programmierten Tod der Zielzelle [26, 41]. Dies könnte
auch bei GrB-produzierenden B-Zellen der Fall sein, da Fas-Ligand auf der Oberfläche
von stimulierten B-Zellen zwar schwach, aber dennoch signifikant hochreguliert wird.
Ebenso fand ich auch TRAIL (tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand),
einen Liganden, der ebenfalls durch Induktion von Apoptose eine Rolle in der CTLund NK-Zell-vermittelten Tumorabwehr und viralen Immunabwehr spielt [60], auf GrBproduzierenden B-Zellen leicht erhöht. Trotz der von mir gefundenen Heraufregulation
dieser zytotoxischen Moleküle muss festgehalten werden, dass sie in ihrer Ausprägung
nicht an CTL oder NK-Zellen heranreichen. Die GrB-Produktion in B-Zellen scheint
somit ein eher isoliertes Phänomen zytotoxischer Aktivität dieser Zellen zu sein, eine
45
4 Diskussion
Tatsache, die jedoch ihre Funktionsfähigkeit nicht einschränken muss.
4.2 Ergebnisanalyse der Experimente mit malignen
B-Zellen der chronisch lymphatischen Leukämie
Meine Experimente mit Zellen der chronisch lymphatischen B-Zellleukämie (B-CLL)
bestätigten, dass auch in diesen GrB induziert werden kann. Die B-CLL zählt zu der
Gruppe der Non-Hodgkin-Lymphome. Sie gilt bis heute als unheilbar, zeigt jedoch meistens einen eher langsamen Verlauf. Insbesondere erkranken ältere Menschen, Männer
häufiger als Frauen. Die B-CLL zeichnet sich vor allem durch maligne Entartung eines
B-Zellklones und dessen unkontrollierter Proliferation aus, was Lymphknotenschwellungen und Abwehrschwäche durch Verdrängung von immunkompetenten Zellen nach
sich zieht [1].
Meine Ergebnisse hinsichtlich B-CLL-Zellen zeigten insgesamt eher inkonsistente und
heterogene Ergebnisse. Dies ist eventuell darauf zurückzuführen, dass CLL-Patienten
verschiedener Stadien, Krankheitsausprägungen und mit unterschiedlichem zytogenetischen Status eingeschlossen wurden. Gemeinsam war ihnen lediglich eine bestehende
Lymphozytose zum Zeitpunkt der Blutabnahme und der CD19+ /CD5+ Phänotyp. Ich
fand in einigen dieser Proben spontane GrB-Sekretion, möglicherweise ein Hinweis auf
eine autoregulative Tumorabwehr der CLL-Zellen. Zu steigern war die Produktion an
GrB insbesondere durch Stimulation mit CpG ODN plus IL-21.
Von CpG ODN ist schon länger bekannt, dass es in CLL-Zellen Apoptose auslösen kann
[25]. Jahrsdörfer et al. fanden, dass insbesondere die Kombination von IL-21 und CpG
ODN einen zytotoxischen Effekt auf B-CLL hat und stimulierte Zellen unbehandelte
Bystander-CLL-Zellen abzutöten in der Lage sind, ein Effekt, der zumindest zum Teil
GrB-abhängig ist [22]. Darüber hinaus stellte ich fest, dass auch die Kombination aus
IL-21 und anti-BCR kleine Mengen an GrB in CLL-Zellen induzieren kann, allerdings
in geringerem Maße als in der Kombination mit CpG ODN, wobei die GrB-Produktion
jedoch immer unter den Ergebnissen von B-Zellen gesunder Spender blieb. Dass CpG
plus IL-21 - im Gegensatz zu den Ergebnissen bei gesunden Spendern - einen stärkeren
46
4 Diskussion
Effekt aufwies als eine Stimulation mit IL-21 und anti-BCR, hängt unter Umständen
mit dem starken pro-apoptotischen Effekt des CpGs auf B-CLL zusammen [25], wenn
man die Möglichkeit eines autoregulativen Prozesses durch parakrine Sekretion von
GrB in Betracht zieht. Auf gesunde B-Zellen dagegen zeigte die Kombination von CpG
ODN und IL-21 einen pro-proliferativen, anti-apoptotischen Effekt.
Die Untersuchung der Oberflächenmarker auf CLL-Zellen ergab ebenfalls sehr disparate Ergebnisse in den einzelnen Experimenten und die Expression der Oberflächenmarker verhielt sich nicht immer wie auf B-Zellen gesunder Spender. Lediglich der
Memory-Marker CD27 fand sich vermehrt auf nicht stimulierten Zellen analog zu den
B-Zellexperimenten. Der Vergleich von CLL-Zellen und normalen B-Zellen weist auf
eine stärkere Verwandtschaft der malignen Zellen zu Memory-B-Zellen als zu naiven
B-Zellen hin [32]. Vielleicht ist dies auch ein Grund dafür, dass B-CLL-Zellen im Allgemeinen weniger GrB produzieren.
Bei NK-Zellen und CTL wird ein parakriner Funktionsmechanismus für die Apoptoseinduzierende Wirkung von Granzym B angenommen, d. h., Zielzelle und Effektorzelle müssen zusammen eine sekretorische Synapse bilden [3]. Um sich jedoch in der
Blutbahn zu finden, sind chemotaktische Signale nötig. Ich untersuchte deshalb die
Expression von humanem MIG auf unterschiedlich stimulierten B-CLL-Zellen. Dieses
Chemokin wurde erstmals in Monozyten gefunden, induziert in Reaktion auf die Stimulation mit IFN-γ, um gezielt aktivierte Lymphozyten anzulocken. Studien zeigten,
dass MIG u. a. einen inhibierenden Effekt auf Neovaskularisierung hat und eine Rolle in
der Tumorabwehr spielen kann [11]. Trentin et al. bewiesen zudem, dass der Rezeptor
für dieses Chemokin, CXCR3, auch auf malignen B-Zellen zu finden ist, diese also von
MIG angelockt werden können [56]. Die von mir gefundene Expression von MIG zeigte
sich interessanterweise nicht nur in Reaktion auf Stimulation durch IFN-γ, sondern,
wenn auch etwas geringer, bei Stimulation mit CpG ODN und IL-21, also der Stimuli,
die auch die GrB-Produktion am meisten anregen. Es ist schon länger bekannt, dass
CpG ODN CXCR3-Chemokine in B-Zellen induziert [29], ich bestätigte dies nun jedoch auch für maligne B-Zellen und zeigte, dass ihre Induktion durch IL-21 deutlich
gesteigert werden kann. Durch die Sekretion von MIG durch GrB-sezernierende CLLZellen werden diese somit theoretisch in die Lage versetzt, andere CXCR3-tragende
Bystander-CLL-Zellen anzulocken und diese mittels Sekretion ihrer zytotoxischen Mo-
47
4 Diskussion
leküle abzutöten.
4.3 Mögliche physiologische Bedeutung Granzym
B-produzierender B-Zellen
Ausgehend von meinen Ergebnissen postuliere ich für GrB-sezernierende gesunde und
maligne B-Zellen verschiedene Funktionen in vivo. Die Tatsache, dass IL-21, der wohl
wichtigste GrB-Stimulus, vor allem in der akuten Phase viraler Infektionen von T-Zellen
sezerniert wird [19], gibt einen wichtigen Hinweis auf eine mögliche Rolle von GrBproduzierenden B-Zellen in der frühen Virusabwehr. Zudem ist bekannt, dass gerade
in der frühen Phase verschiedener Viruserkrankungen erhöhte GrB-Spiegel im Serum
zu finden sind [5, 53]. Möglicherweise schließen GrB-produzierende B-Zellen die Lücke
zwischen Infektion und der vollen Aktivierung von virusspezifischen CTL, die zunächst
durch antigenpräsentierende Zellen aktiviert werden müssen, was einige Tage dauern
kann, und somit dem Virus Zeit für nahezu ungestörte Replikation lässt [55]. B-Zellen
sind im Gegensatz dazu in der Lage, eine Vielzahl von Antigenen direkt zu erkennen,
und können somit schneller reagieren [58]. In Bestätigung dieser Theorie fand unsere
Arbeitsgruppe kürzlich, dass durch Impfungen gegen das FSME-Virus von gesunden
Probanden virale Antigene die GrB-Induktion von mit IL-21 und anti-BCR stimulierten
Zellen deutlich steigern konnten [17]. Die Aufgabe von GrB-sezernierenden B-Zellen
könnte also in der zellulären Immunantwort gegen frühe virale Replikation liegen.
Aus der GrB-Produktion maligner B-Zellen und ihrer pro-apoptotischen Wirkung auf
Bystander-CLL-Zellen hingegen könnten sich zukünftig neue Therapiemöglichkeiten
ergeben. Erste vielversprechende Resultate in der Tumortherapie lieferten präklinische
und klinische Studien sowohl für IL-21 [18] als auch für CpG ODN [24]. Es bleibt
abzuwarten, ob die hier demonstrierten Ergebnisse Anstoß für eine Studie geben, die
eine mögliche Kombination von IL-21 mit CpG ODN untersucht.
48
5 Zusammenfassung
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Frage, in welchem Ausmaß in B-Zellen
gesunder Individuen Granzym B induziert werden kann. Sie soll Aufschluss über deren
phänotypische Eigenschaften, Viabilität und Proliferationsfähigkeit geben. Ein weiteres
Ziel besteht in der genauen Untersuchung Granzym B-sezernierender Leukämiezellen.
Hier interessierte insbesondere, ob die in anderen Studien gezeigten zytotoxischen Effekte auf maligne Nachbarzellen koordiniert werden können. Zu diesem Zweck wurden
Experimente durchgeführt, die die Expression des chemotaktisch wirksamen MonokineInduced by IFN-γ (MIG) auf malignen Zellen unter Granzym B-induzierenden Stimuli
zeigen sollten.
Neben der Isolation peripherer mononukleärer Blutzellen und ihrer Aufreinigung in
hochreine B-Zellfraktionen bediente ich mich vor allem durchflusszytometrischer Verfahren und Enzyme-Linked Immuno-Spot (ELISpot) -Analysen. Zudem wurde im Rahmen dieser Arbeit ein auf Durchflusszytometrie basierender Granzym B-SekretionsAssay etabliert.
Meine Ergebnisse zeigen, dass B-Zellen gesunder Spender in Reaktion auf B-Zellrezeptorstimulation und Interleukin 21 (IL-21) beträchtliche Mengen an biologisch wirksamem
Granzym B produzieren und auch aktiv sezernieren können. Dies ist sowohl im Verband mit anderen mononukleären Zellen des peripheren Blutes als auch in hochisolierten B-Zellen möglich, was darauf hinweist, dass keine Stimuli von anderen Zellen
außer den genannten zur Granzym B-Induktion nötig sind. IL-21 ist zudem auch allein in der Lage, Granzym in B-Zellen zu induzieren, seine Wirkung wird jedoch durch
B-Zellrezeptorstimulation stark gesteigert. Mehr als 60 % der B-Zellen weisen unter
dieser Stimulation nach 48 Stunden Granzym B-Produktion auf. Außer IL-21 sind
49
5 Zusammenfassung
auch IL-4 und IL-10 in der Lage, zusammen mit B-Zellrezeptorstimulation Granzym
zu induzieren. Die Produktion von Granzym B ist vor allem in naiven B-Zellen zu
beobachten, aber auch Memory-B-Zellen scheinen in gewissem Ausmaß dazu befähigt
zu sein. Granzym B-produzierende Zellen zeigten sich resistenter gegenüber Apoptose als unstimulierte Zellen und wiesen im allgemeinen eine höhere Vitalität auf, was
darauf schließen lässt, dass das Granzym B in ihnen keinem autoregulativen Zweck
dient. Ihre Differenzierung war mit einem CD19+ CD20+ CD27¯IgD¯CD38¯ Phänotyp,
erhöhter Phagozytoseaktivität und einer starken Expression von Zelladhäsionsmolekülen (CD54), antigenpräsentierenden Molekülen (Major Histocompatibility Complex II )
und kostimulatorischen Molekülen (CD80, CD86) assoziiert.
Im Gegensatz hierzu konnten maligne Zellen der chronisch lymphatischen B-Zellleukämie
vor allem durch CpG ODN (Cytosin-phosphatidyl-Guanin Oligodesoxynekleotid) und
IL-21 zur Granzym B-Produktion angeregt werden. Dabei zeigten sich heterogene Ergebnisse im Hinblick auf das Ausmaß ihrer Granzym-Sekretion sowie in Bezug auf die
Expression von Oberflächenmarkern. Möglicherweise ist dies unterschiedlichen Stadien oder genotypischen Ausprägungen der verschiedenen Patientenproben geschuldet.
Ich konnte weiterhin zeigen, dass mit IL-21 und CpG ODN stimulierte Zellen das
Chemokin MIG produzieren, was als ein Weg für Granzym B-produzierende Leukämiezellen interpretiert werden kann, mit Bystander-Zellen als möglichen Zielzellen in
Kontakt zu treten. Weitere Untersuchungen in diese Richtung sind wünschenswert und
könnten einen neuen Therapieansatz für die Behandlung der chronisch lymphatischen
B-Zellleukämie aufweisen.
Meine Ergebnisse zeigen, dass die Differenzierung Granzym B-sezernierender B-Zellen
der Interaktion mit anderen Zellen und nicht primär autoregulativen Zwecken dient.
Aufgrund der bekannten Aufgaben von IL-21 und zusätzlichen Erkenntnissen unserer
Forschungsgruppe kann von einer Funktion in der frühen zellulären Immunantwort gegen virale Infektionen ausgegangen werden. Weitere Studien sind jedoch notwendig,
um insbesondere zu beleuchten, ob das von B-Zellen produzierte Granzym B strukturell dem von natürlichen Killerzellen und CD8+ T-Zellen entspricht, ob es klassische
zytotoxische Aufgaben erfüllt oder möglicherweise eine Zytokin-ähnliche Rolle im Immunsystem übernimmt.
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Danksagung Ich danke Herrn Dr. M. Rojewski vom Institut für Transfusionsmedizin
für seine Hilfe beim Zell-Sorting, Prof. H. R. Rodewald vom Institut für Immunologie
für die Erlaubnis zur Benutzung des FACSAria, Prof. B. Böhm für die Erlaubnis zur
Nutzung des ELISpot Readers und Herrn B. Büchele für die Hilfe bei der AntikörperStreptavidin-Konjugation. Außerdem danke ich meinem Betreuer Herrn PD Dr. B.
Jahrsdörfer, sowie Frau Dr. M. Hagn, Frau V. Ebel und Frau T. Beyer für Anleitung und
kritische Anregungen während meiner Labortätigkeit und schließlich meiner Familie
und meinem Freund für ihre Unterstützung.
Veröffentlichungen Diese Doktorarbeit enthält Abbildungen und Inhalte, die zum
Teil an anderer Stelle veröffentlicht wurden: [17, 16]
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