Bedeutung dendritischer Zellen und Makrophagen für die Infektion
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Aus der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover und der Abteilung Rheumatologie der Medizinischen Hochschule Hannover Bedeutung dendritischer Zellen und Makrophagen für die Infektion und Vermehrung von Chlamydophila pneumoniae. Untersuchungen in einem neu entwickelten in vitro Kokulturmodell INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Matthias Peppmüller aus Gelsenkirchen Hannover 2005 Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. W. Leibold 1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. W. Leibold 2. Gutachter: Prof. Dr. N. Baltes Tag der mündlichen Prüfung: 21.11.2005 Die Finanzierung der Arbeit erfolgte im Wesentlichen durch Forschungsmittel der Deutschen Forschungsgemeinschaft WA 747/4-1. Für meine Familie Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 15 2 Literaturübersicht 17 2.1 17 2.1.1 Die Familie der Chlamydiaceae 17 2.1.2 Chlamydophila pneumoniae 19 2.2 Chlamydophila pneumoniae als Pathogen 21 2.2.1 Übertragung und Verbreitung 21 2.2.2 Akute Infektionen 22 2.2.3 Chronische Erkrankungen 22 2.3 In vitro-Verhalten von Chlamydophila pneumoniae 24 2.3.1 Chlamydophila pneumoniae und Makrophagen 24 2.3.2 Chlamydophila pneumoniae und dendritische Zellen 25 2.3.3 Persistenz 26 2.4 3 Chlamydien Kokulturmodelle Material und Methoden 3.1 Geräte und Materialien 29 31 31 3.1.1 Geräte 31 3.1.2 Materialien 32 3.1.3 Zellen und Bakterien 34 3.1.4 Medien und Lösungen 34 3.1.5 Antikörper für die Färbungen (Immunhistochemie und Immunfluoreszenz) 37 3.1.6 Antikörper für die Durchflußzytometrie (FACS) 37 3.1.7 Molekularbiologische Reagenzien 38 3.1.8 Weitere Hilfsmittel 39 3.2 Methoden 40 3.2.1 Kultivierung von HEp-2 Zellen 40 3.2.2 Isolation CD14 positiver mononuklärer Zellen 41 3.2.3 Überprüfung der Reinheit der isolierten CD14+ Zellen 3.2.4 mittels FACS-Analyse 45 Konditionierung der Zellen 46 3.2.4.1 Konditionierung der monozytären Zellen zu Makrophagen 46 3.2.4.1.1Konditionierung der monozytären Zellen zu Makrophagen auf der Membran 3.2.4.2 Konditionierung der monozytären Zellen zu immaturen DC 45 48 3.2.4.2.1Konditionierung der monozytären Zellen zu immaturen DC im unteren Kompartiment des Transwell-Systems 47 3.2.4.2.2Austestung der geeigneten Porengrößen der Transwell-Membranen 50 3.2.4.2.3Austestung verschiedener Serumgehalte auf die Konditionierung 51 3.2.4.3 Konditionierung der monozytären Zellen für die Phänotypisierung mittels FACS-Analyse 51 3.2.4.4 Färbung und Analyse der konditionierten Zellpopulationen 3.2.5 mittels FACS 53 Infektionsversuche im Transwell-Kultursystem 55 3.2.5.1 Empfänglichkeit von Makrophagen für frei verfügbare chlamydiale Partikel 55 3.2.5.2 Infektion der immaturen dendritischen Zellen 56 3.2.5.2.1Infektion der auf Deckgläschen konditionierten DC 58 3.2.5.3 Kokultur der infizierten DC mit Makrophagen und Probenentnahme 58 3.2.5.3.1Kokultur und Probennahme bei geänderter Position der Zellpopulationen 3.2.6 60 Färbung der Präparate aus den Infektionsversuchen zum Nachweis von Chlamydophila pneumoniae 3.2.6.1 Immunhistochemischer Nachweis von Chlamydophila pneumoniae 61 61 3.2.6.2 Immunfluoreszenzfärbung kokultivierter Makrophagen zum Nachweis von Chlamydophila pneumoniae 3.2.7 3.2.8 63 Bestimmung der Zahl infektiöser Chlamydien aus den Überständen und Lysaten im HEp-2 Infektiositätstest 64 Untersuchungen zur chlamydialen Genexpression 66 3.2.8.1 Konditionierung, Infektion und Kokultur der Zellen für die Genexpressionsanalyse 66 3.2.8.2 Entnahme der Proben aus der Kokultur für die Genexpressionsanalyse 67 3.2.8.3 Aufreinigung der Lysate und Isolation der chlamydialen DNA und RNA 68 3.2.8.4 Messung der Menge isolierter chlamydialer DNA und RNA über die Bestimmung der optischen Dichte der Proben 3.2.8.5 DNA-Verdau in den aufgereinigten RNA-Proben 69 70 3.2.8.6 Umschreibung der isolierten RNA in DNA mittels reverser Transkription 71 3.2.8.7 Quantitativer Nachweis chlamydialer DNA und cDNA im TaqMan-System 72 3.2.8.7.1Theoretischer Hintergrund 72 3.2.8.7.2Durchführung der quantitativen real-time PCR im TaqMan-System 73 3.2.8.7.3Auswertung der im TaqMan-System ermittelten Daten 76 4 Ergebnisse 4.1 Ergebnisse der experimentellen Vorarbeiten 4.1.1 79 79 Einfluss der Serumkonzentration auf die Zahl der Makrophagen während der Konditionierungsphase 79 4.1.2 Wahl der geeigneten Porengröße der Membran für die Kultur der DC 81 4.1.3 Nachweis chlamydialer Entwicklung in primär infizierten DC in Anwesenheit kokultivierter Makropagen 4.1.4 83 Empfänglichkeit der Makrophagen für frei im Medium vorhandene Chlamydien 84 4.2 Analyse der Reinheit der isolierten mononuklären Zellen mittels FACS 88 4.3 Ergebnisse der Infektionsversuche 91 4.3.1 Morphologische Unterschiede der Zellpopulationen bei Konditionierung mit verschiedenen Seren 91 4.3.1.1 Morphologie der dendritischen Zellen 91 4.3.1.2 Morphologie der Makrophagen 92 4.3.2 93 Phänotypisierung der konditionierten Zellen mittels FACS-Analyse 4.3.2.1 Oberflächenmoleküle auf dendritischen Zellen 95 4.3.2.2 Oberflächenmoleküle auf Makrophagen 98 4.3.3 Nachweis der Infizierbarkeit dendritischer Zellen auf der Membran mit Darstellung chlamydialer Inklusionen als Zeichen der Entwicklung 4.3.4 Morphologische Veränderungen der primär infizierten DC im Vergleich zu Schein-infizierten Zellen 4.3.5 101 103 Übertragung von Chlp. pneumoniae von infizierten DC auf kokultivierte Makrophagen 105 4.3.5.1 Nachweis der Übertragung mittels immunhistochemischer Färbung 106 4.3.5.2 Nachweis der Übertragung mittels Immunfluoreszenzfärbung 107 4.3.5.3 Nachweis der Übertragung gegen die Schwerkraft vom unteren Kompartiment in das obere Kompartiment 4.3.6 109 Bestimmung der Zahl infektiöser Chlamydien in den Proben der Kokulturexperimente im HEp2-Infektiositätstest 110 4.3.6.1 Infektiosität der mit humanem AB-Serum kultivierten Zellen 110 4.3.6.2 Infektiosität der mit autologem Serum kultivierten Zellen 112 4.3.7 114 Ergebnisse der quantitativen Analyse der chlamydialen Genexpression 4.3.7.1 Chlamydiale Genexpressionsmuster in den Infektionsversuchen mit humanem AB-Serum 114 4.3.7.2 Chlamydiale Genexpressionsmuster in den Infektionsversuchen mit autologem Serum 4.4 Weiterführende Untersuchungen zu inhibitorischen Einflüssen der zur Kultur verwendeten Seren 4.4.1 4.4.2 Diskussion Infizierbarkeit dendritischer Zellen und Makrophagen im Modell 5.1.1 124 125 125 Aufnahme von Chlp. pneumoniae durch Makrophagen und Entwicklung des Erregers 5.2 122 Etablierung einer Infektion mit Chlp. pneumoniae in dendritischen Zellen 5.1.2 120 Überprüfung auf Antikörper gegen Chlp. pneumoniae im hAB-Serum mittels Immunfluoreszenzfärbung 5.1 120 Überprüfung inhibitorischer Effekte des hAB-Serum mit Hilfe der für Chlp. pneumoniae sensitiven HEp-2 Zelle 5 117 127 Übertragung von Chlp. pneumoniae von infizierten DC auf kokultivierte Makrophagen 128 5.3 Charakterisierung der übertragenen Chlamydien in Hinblick auf ihre Infektiosität und ihre Entwicklungsform 129 5.4 Mögliche Beeinflussung der Makrophagen das Serum 131 5.5 Schlussbemerkung 132 6 Zusammenfassung 134 7 Summary 136 8 Literaturverzeichnis 138 9 Anhang 150 9.1 Methodisches Vorgehen der weiterführenden Untersuchungen (Kap. 4.4) 9.1.1 Überprüfung inhibitorischer Effekte des hAB-Serum mit Hilfe der für Chlp. pneumoniae sensitiven HEp-2 Zelle 9.1.2 151 Funktion der bei der FACS-Analyse untersuchten Oberflächenmoleküle 10 150 Überprüfung auf Antikörper gegen Chlp. pneumoniae im hAB-Serum mittels Immunfluoreszenzfärbung 9.1.3 150 Eidesstattliche Erklärung 152 153 Abkürzungsverzeichnis und Glossar (Zahl)xg (Zahl)-faches der Erdbeschleunigung (~ 9,8 Meter/sec²) °C Grad Celsius µ mikro µg Mikrogramm µl Mikroliter Abb. Abbildung AEC 3-Amino-9-Ethylcarbazol AK Antikörper Aliquot einige, ein paar; bezeichnet hier den separat abgefüllten Teil einer Gesamtmenge ATP Adenosintriphosphat autolog zu demselben Individuum gehörig; hier: Zellen und Serum stammen von demselben Spender Aqua dest. Aqua destillata; (destilliertes Wasser) Buffy Coat Leukozyten- und Thrombozytenfraktionen, die nach der Zentrifugation von Vollblut erhalten werden bzw. beziehungsweise C. p. Chlamydophila pneumoniae ca. circa CD cluster of differentiation; Zelloberflächenmolekül, welches durch spezifische monoklonale Antikörper erkannt wird cDNA complementary DNA; zur RNA komplementäre DNA Chlp. pneumoniae Chlamydophila pneumoniae DC dendritic cell(s); (Dendritische Zelle(n)) DNA desoxyribonucleic acid; (Desoxyribonukleinsäure) EDTA Ethylen-Diamin-Tetra-Acetat EK Elementarkörper, die infektiöse Form der Chlamydien et al. et alii; (und andere, auf Autoren bezogen) FACS fluorescence activated cell sorter; (Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierer) Falcon Spitzbodenröhrchen FAM Fluorescein-Addition-Monomer; ein Fluorochrom Fc fragment cristalline; kristallines Fragment von Immunglobulinen FITC Fluoresceinisothiocyanat, ein Fluorochrom FKS Fetales Kälberserum g Gramm hAB-Serum humanes AB Serum HLA human leucocyte antigen (humanes Leukozytenantigen); genetische Bezeichnung für die humanen Haupthistokompatibilitätskomplexe IFU inclusion forming unit; (Inklusionbildende Einheit) Ig Immunglobulin Kap. Kapitel L Liter Mø Makrophage(n) M mol/L MACS® magnetic cell sorting; (magnetische Zellsortierung) mAK monoklonaler Antikörper mg Milligramm MHC major histocompatibility complex (Haupthistokompatibilitätskomplex) min Minute ml Milliliter mmol Millimol MOI multiplicity of infection; Anzahl infektiöser Einheiten pro Zelle mRNA messenger RNA; (Boten-RNA) PBS phosphate buffered saline; (phosphatgepufferte Salzlösung) PCR polymerase chain reaction; (Polymerasekettenreaktion) PE Phycoerythrin, ein Fluorochrom Pellet Zellpellet; gemeint ist hiermit die Ansammlung von Zellen am Boden eines Gefäßes, meist nach Zentrifugation rhGM-CSF rekombinanter humaner granulocyte monocyte colony stimulating factor, (rekombinanter humaner Granulozyten Monozyten Kolonie stimulierender Faktor) rhIL-4 rekombinantes humanes Interleukin 4 RK Retikularkörper; die replikative Form der Chlamydien RNA ribonucleic acid; (Ribonukleinsäure) rRNA ribosomale RNA RT Raumtemperatur RT-PCR Reverse-Transkriptase-PCR sec. Sekunde Tab. Tabelle TAMRA Carboxy-Tetramethyl-Rhodamin; ein Fluorochrom U Unit; (Einheit) well Vertiefung in einer Zellkulturplatte Einleitung 1 15 Einleitung Bakterien der Familie Chlamydiaceae gehören zu den obligat intrazellulären Parasiten eukaryotischer Zellen. Alle Mitglieder dieser Familie zeigen einen komplexen biphasischen Lebenszyklus, der durch eine intrazelluläre, vermehrungsfähige Form sowie eine extrazelluläre, infektiöse Form gekennzeichnet ist. Akute Infektionen äußern sich sowohl beim Menschen als auch beim Tier in einer Vielzahl verschiedener Krankheitskomplexe: Genitale Infektionen mit der Gefahr eines Aborts beim weiblichen Individuum, Entzündungen des Auges und der umgebenden Schleimhäute sowie des gesamten respiratorischen Systems sind hierfür Beispiele. Allerdings können Chlamydien auch bei anderen Erkrankungen mit eher chronischem Verlauf nachgewiesen werden. Bei reaktiven Gelenksentzündungen (TAYLORROBINSON et al. 1992) oder granulomatösen Entzündungen der Gefäße (WAGNER et al. 2000) wird eine ursächliche Beteiligung am Krankheitsgeschehen diskutiert. Ebenso gelang der Nachweis bei Gefäßerkrankungen wie Atherosklerose (KUO et al. 1993; MAZUR et al. 2004), stenosierenden Prozessen der Herzklappen bzw. –gefäße (CAMPBELL et al. 1995) und bei chronischen Erkrankungen des respiratorischen Systems (HAHN et al. 1991; EMRE et al. 1994). Sogar beim Morbus Alzheimer konnte in Gliazellen Chlamydophila pneumoniae dargestellt werden (BALIN et al. 1998). Auch bei Tieren finden sich Chlamydien bei vergleichbaren Krankheitsprozessen (SAKO et al. 2002). Auffällig ist hierbei die teilweise große Entfernung der Nachweisorte im Verhältnis zur Eintrittspforte der Erreger in den Körper. Die Chlamydien müssen also vom Ort der Primärinfektion in andere Bereiche des Organismus gelangen. Da es sich um intrazelluläre Erreger handelt, ist eine solche Streuung nur innerhalb von Zellen möglich. Tatsächlich konnten in peripheren monozytären Zellen Chlamydien sowohl mittels PCR als auch direkt durch Anfärbung nachgewiesen werden (MAASS et al. 2000; HARANAGA et al. 2001). Weiterhin fällt auf, dass die Nachweise bei den chlamydienassoziierten Einleitung 16 chronischen Erkrankungen oft in Makrophagen oder dendritischen Zellen erfolgten, direkten Abkömmlingen solcher peripherer mononuklärer Zellen. Diese Befunde führten zu der Hypothese, dass Chlamydien mononukläre Zellen als Vektor für ihre Ausbreitung im Organismus benutzen. Im Maus- bzw. Kaninchenmodell konnte eine solche Ausbreitung bereits gezeigt werden (YANG et al. 1995; GIEFFERS et al. 2004). Die hierbei verwendete Art Chlamydophila pneumoniae ist mit einer serologischen Prävalenz von über 50% bei Erwachsenen einer der häufigsten Infektionserreger aus der Familie der Chlamydiaceae. Die aerogene Übertragungsmöglichkeit spielt hierbei eine besondere Rolle. Sowohl dendritische Zellen als auch Makrophagen sind für die Aufnahme, Verarbeitung und Präsentation antigener Strukturen im Körper verantwortlich. Bei der Riesenzellarteriitis fanden sich mit Chlp. pneumoniae infizierte DC sogar in unmittelbarer Nachbarschaft zu Makrophagen (WAGNER et al. 2000). Beide Zelltypen sind auch in vitro für eine Infektion mit diesem Erreger empfänglich (GAYDOS et al. 1996). Bei experimentellen viralen Infektionen ist sogar eine Erregerübertragung zwischen diesen beiden Zelltypen demonstriert worden (KACANI et al. 1998). Auch in vivo wäre eine solche Übertragung denkbar und könnte erklären, warum sowohl Makrophagen als auch DC bei chronischen Erkrankungen Träger einer chlamydialen Infektion sind. Um die Möglichkeit einer Infektionsübertragung von Chlp. pneumoniae zwischen dendritischen Zellen und Makrophagen näher zu untersuchen, sollte im Rahmen dieser Arbeit ein Kokulturmodell entwickelt werden. Besondere Schwerpunkte lagen dabei auf folgenden Aspekten: Nachweis der Infizierbarkeit dendritischer Zellen in Kokultur mit Makrophagen Untersuchung einer möglichen Übertragung des Erregers ohne Zell-Zell-Kontakt zwischen den verschiedenen Zellarten Charakterisierung der in den jeweiligen Zellpopulationen gefundenen Chlamydien in Hinblick auf ihre Infektiosität und ihre vorherrschende Entwicklungsform Literaturübersicht 2 Literaturübersicht 2.1 Chlamydien 17 2.1.1 Die Familie der Chlamydiaceae Alle Vertreter der Ordnung Chlamydiales sind, ähnlich wie Rickettsien, obligat intrazelluläre Parasiten. Aufgrund eines defizitären eigenen Energiestoffwechsels sind sie auf die Reserven phosphorylierter Nukleotide (z.b. ATP) ihrer Wirtszelle angewiesen. Dabei findet die Familie der Chlamydiaceae ihr Wirtsspektrum primär bei Vertebraten. Bereits in den Jahren 1929 und 1930 wurde eine der bekanntesten Erkrankungen durch Chlamydien, die Psittakose, beschrieben. Untersuchungen an verendeten Vögeln und erkrankten Menschen ergaben als Verursacher einen intrazellulären Erreger mit bakteriellen Eigenschaften. Dem Entdecker Bedson zu Ehre wurde dieses Bakterium Bedsonia genannt. 1934 erkannte Thygeson Ähnlichkeiten zwischen diesem Erreger und Erregern weiterer Erkrankungen wie dem Trachom und dem Lymphogranulomum venerum und führte sie in einer Gruppe zusammen. Im Jahr 1945 schließlich wurde der Oberbegriff Chlamydia für alle Vertreter dieser Gruppe erstmalig in der Literatur benutzt. Aber erst 20 Jahre später konnte mit Hilfe der Elektronenmikroskopie die Zugehörigkeit zu den Bakterien und die Abgrenzung gegenüber den Viren eindeutig nachgewiesen werden. Durch phylogenetische Analysen ribosomaler Gene (EVERETT et al. 1999) und weitere Untersuchungen chlamydialer Proteine (BUSH u. EVERETT 2001) kam es zu einer Neuordnung der Systematik und zu einer Änderung der Taxonomie. Die heute gebräuchliche Einteilung wird in Abbildung 1 dargestellt. Literaturübersicht Ordnung 18 Familie Gattung Art C. abortus C. psittaci C. felis Chlamydophila C. caviae C. pecorum Chlamydiaceae C. pneumoniae Chlamydiales C. trachomatis Chlamydia C. suis C. muridarum N. hartmanella Parachlamydiacea e P. acanthamoebae Waddliaceae W. chondrophila Simkaniaceae S. negevensis Abb.1: Systematik der Ordnung Chlamydiales modifiziert nach Bush und Everett Literaturübersicht 19 2.1.2 Chlamydophila pneumoniae Im Gegensatz zu anderen Vertretern der Familie Chlamydiaceae existiert für Chlp. pneumoniae nur ein Serovar. Es wurde zuerst 1965 in Taiwan isoliert und mit der Bezeichnung TW-183 versehen (Taiwan isolate number 183). 1983 erfolgte ein weiterer Nachweis mit der Bezeichnung AR-39 (acute respiratory isolate 39). Zu diesem Zeitpunkt wurde der Erreger der Art Chlamydia psittaci zugeordnet, allerdings als „atypisch“ klassifiziert. Entdeckte Gemeinsamkeiten führten dann zu dem zusammengesetzten Begriff der TWAR-Isolate. Erst 1989 wurden diese Isolate als eine eigenständige Art erkannt und unter der Bezeichnung Chlamydia pneumoniae eingeführt (GRAYSTON et al. 1989b). Mit der Neuordnung der Taxonomie 1999 ergab sich die heute Artbezeichnung Chlamydophila pneumoniae. Obwohl bisher nur ein Serovar bekannt ist, so gibt es doch mehrere Biovare. Die Isolierung gelang sowohl beim Koala (JACKSON et al. 1999) als auch bei verschiedenen Froscharten (REED et al. 2000; HOTZEL et al. 2001) und beim Hund (SAKO et al. 2002). Auch bei einem Pferd wurde das Bakterium gefunden, obwohl die genaue Zugehörigkeit in diesem Fall unklar ist (STOREY et al. 1993). Wie alle Mitglieder der Familie Chlamydiaceae zeigt auch Chlamydophila pneumoniae einen komplexen biphasischen Vermehrungszyklus. Dieser ist durch zwei morphologisch und funktionell unterschiedliche Organisationsformen gekennzeichnet: dem infektiösen, nicht reproduktiven Elementarkörper (EK) und dem nicht infektiösen, reproduktiven Retikularkörper (RK) (MIYASHITA et al. 1993). Der Elementarkörper ist um die 0,3 µm groß, metabolisch inaktiv und osmotisch sehr stabil. Dies verleiht ihm die für das extrazelluläre Überleben notwendige Resistenz (HATCH 1996). Der Retikularkörper hingegen ist mit einem Durchmesser von ca. 1 µm deutlich größer und osmotisch fragil. Seine Struktur ist weniger elektronendicht. Beide Formen sind von einer inneren und äußeren Doppelmembran umgeben. Bei Elementarkörpern umschließt die äußere Membran oft einen periplasmatischen Raum, so Literaturübersicht 20 dass der EK eine eher birnenförmige Kontur annimmt (CHI et al. 1987). Der infektiöse EK wird von der Zelle aufgenommen und in ein Phagosom eingeschlossen. Der genaue Mechanismus ist bisher jedoch nicht eindeutig geklärt. Für C. trachomatis wurde ein mikrofilamentabhängiger Phagozytoseprozess beschrieben (WARD u. MURRAY 1984), allerdings ist auch eine von Mikrofilamenten unabhängige Aufnahme im Sinne einer rezeptorvermittelten Endozytose denkbar (HODINKA et al. 1988). Die weitere Entwicklung differiert je nach infizierter Zelle (MAASS u. HARIG 1995), wobei epitheliale Zellen für die Entwicklung von Chlp. pneumoniae besonders geeignet sind. So konnte der Entwicklungsprozess in diesen Zellen genauer untersucht werden. Dabei zeigt sich, dass bis ca. zwei Stunden nach erfolgter Infektion die EK ihre Größe und elektronendichte Struktur beibehalten. Nach acht Stunden beginnt die Dissoziation des Nukleoids, welche mit einer Größenzunahme des Körperchens verbunden ist. Weitere vier Stunden später zeigen die meisten Partikel ein derartiges, für Retikularkörper typisches Aussehen (WOLF et al. 2000). Diese RK beginnen dann mit einer Vermehrung durch Teilung. Dabei kommt es zu einem Zusammenschluss einzelner Phagosomen, wodurch ein größeres Einschlusskörperchen, auch Inklusion genannt, entsteht. Diese Inklusion wird durch die sich ständig teilenden Retikularkörper immer weiter angefüllt. Ab ca. 48 Stunden post infectionem (p. inf.) beginnen einige RK zu kondensieren, was ein deutliches Zeichen für die Rückentwicklung zum infektiösen EK ist. Der Anteil typischer EK in der Inklusion steigt bis zu 72 Stunden p. inf. immer weiter an. Einige Stunden später kommt es zur Lyse der Wirtszelle, wodurch die in der Inklusion enthaltenen Partikel freigesetzt werden. Dabei gelangen primär infektiöse EK in den Extrazellularraum, aber auch verbliebene RK und intermediäre Entwicklungsformen werden dabei freigesetzt. Mehrere Inklusionen in einer Zelle verschmelzen nicht, zeigen aber manchmal eine asynchrone Entwicklung. Hierbei ist unklar, ob es sich um eine zeitlich versetze Entwicklung handelt, oder ob es zwischen den Einschlusskörpern zu einer Konkurrenz um die von der Wirtszelle bereitgestellten Nährstoffe kommt (WOLF et al. 2000). Literaturübersicht 2.2 21 Chlamydophila pneumoniae als Pathogen 2.2.1 Übertragung und Verbreitung Vor der Beschreibung von Chlp. pneumoniae als eigene Art wurden die durch sie ausgelösten Erkrankungen als Ornithosen diagnostiziert. Allerdings erkannte man, dass in vielen Fällen kein Kontakt zu Vögeln bestand. Es musste also zu einer direkten Übertragung des Erregers gekommen sein. Da es sich um respiratorische Erkrankungen handelte, schien eine aerogene Übertragung durch Sekrete des Respirationstraktes wahrscheinlich (BRUU et al. 1991). Weitere Untersuchungen erhärteten diese Annahme (YAMAZAKI et al. 1990), so dass heute die aerogene Übertragung als gesichert gelten kann. Infektionen treten meist endemisch auf, beschränken sich also auf einen begrenzten Regionen- oder Personenkreis. Ausbrüche in Schulen (PETHER et al. 1989) und militärischen Einrichtungen (EKMAN et al. 1993; CSANGO et al. 1997) sind beschrieben worden. Eine saisonale Häufung wurde dabei nicht beobachtet, allerdings unterliegen Ausbrüche je nach Region einer gewissen Zyklik (GRAYSTON et al. 1989a). Serologische Studien haben ergeben, dass weltweit mehr als 50% der Bevölkerung Antikörper gegen Chlp. pneumoniae besitzen. Dabei kommt es zu einem sprunghaften Anstieg bei Personen im Alter zwischen 5 bis 14 Jahren. Ab einem Alter von 20 Jahren steigt die Zahl seropositiver Probanden nur noch leicht an, so dass bei Personen über 60 Jahren zwischen 65% und 75% seropositiv sind. Dabei ist die Prävalenz in tropischen Ländern etwas höher als in nördlichen, entwickelten Ländern (KUO et al. 1995). Auffällig ist hierbei, dass auch gesunde Personen ohne klinische Erscheinungen einer Infektion seropositiv sind, sie stellen sogar den Hauptanteil der Gesamtpopulation (BEN-YAAKOV et al. 2002; PALDANIUS et al. 2005). Dieser Befund legt nahe, dass die meisten Infektionen mit Chlp. pneumoniae asymptomatisch verlaufen, eine Infektionsübertragung aber dadurch nicht ausgeschlossen ist. Literaturübersicht 22 2.2.2 Akute Infektionen Wird eine Infektion mit Chlp. pneumoniae klinisch manifest, so äußert sie sich im Regelfall als Pneumonie oder Bronchitis. Ca. 10% der Pneumonien werden durch dieses Bakterium ausgelöst (GRAYSTON 1992). Diese beginnen meist mit Heiserkeit und einer Entzündung des Kehlkopfes, weiten sich dann aber auf die unteren Atemwege aus. Trockener Husten ist verbreitet, auch begleitende Entzündungen der Nebenhöhlen können auftreten (HASHIGUCCI et al. 1992). Im Regelfall ist der Gesamtverlauf der Erkrankung eher mild und erfordert keine stationäre Behandlung. Allerdings ist die Rekonvaleszenz langwierig, oft ungeachtet einer möglichen antibiotischen Behandlung. So können Husten und Heiserkeit mehrere Wochen anhalten. Zusätzlich kann es auch zu einer Entzündunge des Mittelohres (BLOCK et al. 1997) kommen. Daneben wurde der Erreger auch bei akuten Erkrankungen des Herzens (NORTON et al. 1995; WESSLEN et al. 1996) und der Niere (MARCHANT et al. 1995) nachgewiesen. 2.2.3 Chronische Erkrankungen Neben den akuten Infektionen kommt es im respiratorischen System als dem primären Eintrittsort des Erregers auch zu chronischen Erkrankungen. Wie bereits in der Einleitung angedeutet wird die Beteiligung von Chlp. pneumoniae an reaktiven Luftwegserkrankungen bei Kindern (EMRE et al. 1994) und anderen asthmatischen Krankheitskomplexen beim Erwachsenen (HAHN et al. 1991) diskutiert. Bei chronisch obstruktiven Erkrankungen gelang sogar der direkte Nachweis in über 50% der in der Lunge vorhandenen Makrophagen (WU et al. 2000). Auch mit der Lungensarkoidose wurde der Keim in Verbindung gebracht (PUOLAKKAINEN et al. 1996). Daneben finden sich Hinweise bei neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer und Multipler Sklerose (BALIN et al. 1998; SRIRAM et al. 1999). Literaturübersicht 23 Eine herausragende Stellung nimmt die Rolle einer chronischen Chlp. pneumoniaeInfektion in Zusammenhang mit Herz- und Gefäßerkrankungen ein. Diese Assoziation wurde schon früh durch serologische Untersuchungen herausgestellt (SAIKKU et al. 1988). In dieser Studie wurden bei 68% der Patienten mit einem akuten Myokardinfarkt und bei 50% derer mit koronarer Herzkrankheit erhöhte Antikörpertiter gegen Chlp. pneumoniae detektiert. In der Kontrollgruppe fand sich serologisch nur bei 17% der Probanden durch erhöhte Titerwerte ein Hinweis auf eine frühere Infektion. Mittlerweile wurde das Bakterium mehrfach in verschiedensten Gefäßläsionen direkt nachgewiesen (KUO et al. 1993; WAGNER et al. 2000; MAZUR et al. 2004). Dabei handelt es sich um atherosklerotische Prozesse der Koronararterien, der Aorta bzw. Carotis oder um granulomatöse Entzündungen kleinerer Arterien. Der Nachweis gelang dabei in glatten Muskelzellen, Makrophagen und dendritischen Zellen. Chlp. pneumoniae befällt bei akuter Infektion das respiratorische System und gelangt von dort über Makrophagen (im Tiermodell) in andere Teile des Organismus. In peripheren mononuklären Zellen des Blutes konnte das Bakterium nachgewiesen werden, bei chronischen Lungenerkrankungen auch in Makrophagen und bei anderen chronischen Krankheitsprozessen in Makrophagen und dendritischen Zellen. Daher liegt die Hypothese nahe, dass Chlp. pneumoniae monozytäre Zellen und ihre Abkömmlinge als Vektor für die Verbreitung im Organismus nutzt. Deshalb kommt diesen Zellen bei der Untersuchung chlamydialer Erkrankungen besondere Beachtung zu. Literaturübersicht 2.3 24 In vitro-Verhalten von Chlamydophila pneumoniae Für die Anzucht und Vermehrung in Kultur erwiesen sich epitheliale Zelllinien als sehr geeignet. Besonders HEp-2 Zellen scheinen für Chlp. pneumoniae ein idealer Wirt zu sein (ROBLIN et al. 1992). Eine gezielte Inhibition der eukaryotischen Proteinbiosynthese, beispielsweise mit Cycloheximid, verstärkt zusätzlich noch das chlamydiale Wachstum in diesen Zellen (MAASS u. HARIG 1995). Aber auch Endothelzellen, glatte Muskelzellen und Makrophagen lassen sich mit dem Erreger infizieren (GAYDOS et al. 1996). Dabei bleiben die gebildeten Einschlusskörper allerdings kleiner als in HEp-2 Zellen. 2.3.1 Chlamydophila pneumoniae und Makrophagen Makrophagen nehmen eine zentrale Stellung im Immunsystem ein. Nach einem nur wenige Stunden anhaltenden Aufenthalt in der Blutbahn verlassen Monozyten das Gefäßsystem und dringen in unterschiedliche Gewebe ein. Dort differenzieren sie sich zu Makrophagen. Oft geht damit eine besondere Spezialisierung einher (z. B. Osteoklasten, Mikroglia, Kupffer’ Sternzellen). In anderen Fällen sind Makrophagen mit der Krankheitsabwehr in Verbindung zu bringen. Sie sind mit die erste Zellart, die in den Körper eindringende Pathogene erkennt, aufnimmt und beseitigt. Dabei kommt ihrer Fähigkeit, Zellen des adaptiven Immunsystems prozessierte Teile dieser Pathogene zu präsentieren und somit eine adaptive Immunantwort einzuleiten eine bedeutende Rolle zu. Auf die besondere Bedeutung von Makrophagen in Bezug auf chlamydiale Erkrankungen wurde bereits eingegangen. Experimentell lassen sich sowohl direkt isolierte Makrophagen (REDECKE et al. 1998) als auch aus Monozyten generierte Makrophagen (AIRENNE et al. 2000) mit Chlp. pneumoniae infizieren. Dabei vermehrt sich der Erreger in den infizierten Zellen, die Zahl der infektiösen Nachkommen ist jedoch deutlich geringer als bei Literaturübersicht 25 Infektion epithelialer Zelltypen. Dieser Befund lässt sich auch für Makrophagen tierischer Herkunft bestätigen (HARANAGA et al. 2003). Die Infektion kann bei Makrophagen die Ausbildung von Schaumzellen auslösen, was für die Pathophysiologie der Atherosklerose von Bedeutung ist (KALAYOGLU u. BYRNE 1998). Humane Monozyten als Vorläuferzellen von Makrophagen lassen sich zwar infizieren (GIEFFERS et al. 2001; YAMAGUCHI et al. 2002), bilden aber unter in-vitro Verhältnissen keine infektiösen Nachkommen aus (AIRENNE et al. 1999). Bei einigen monozytären Zelllinien war dieser Befund teilweise schon bekannt (NUMAZAKI et al. 1995). In anderen Linien kommt es dagegen zur Bildung infektiöser Nachkommen (HEINEMANN et al. 1996), wobei die Mechanismen dieses unterschiedlichen Verhaltens abhängig von der infizierten Zellart bis heute nicht aufgeklärt sind. Die unterschiedlichen Stadien in der Entwicklung vom Monozyten zum Makrophagen können hierbei eine Rolle spielen. 2.3.2 Chlamydophila pneumoniae und dendritische Zellen Dendritische Zellen spielen bei der Erkennung, Verarbeitung und Weiterleitung möglicher Pathogene eine entscheidende Rolle. Als unreife, immature Zellen befinden sie sich in verschiedenen Organen und sind dort für die Aufnahme von Antigenen mit verantwortlich. Nach Exposition mit einem solchen Antigen bilden immature DC die für sie namensgebenden Ausläufer zurück, runden sich ab und gelangen über Lymphbahnen zu den T-Zell Regionen der Lymphknoten. Dieser Prozess wird als Reifung (Maturation) bezeichnet. In den Lymphknoten treten sie als professionelle Antigen-präsentierende Zellen mit naiven T-Zellen in Kontakt und spielen so eine wichtige Rolle im Zusammenspiel zwischen angeborener und adaptiver Immunität (AUSTYN 1996). Bisher wurde das Verhalten von Chlp. pneumoniae-infizierten DC in vivo nur in wenigen experimentellen Ansätzen im Labor untersucht. Für murine DC konnte immerhin eine Empfänglichkeit der DC für den Erreger mit anschließender Maturation der Zellen Literaturübersicht 26 beobachtet werden (PREBECK et al. 2001). Auch Mediatoren wie das chlamydiale Hitzeschockprotein, welches bei Infektion von HEp-2 Zellen gebildet wird, führte experimentell zur Stimulation dendritischer Zellen (COSTA et al. 2002). Für andere Arten aus der Familie der Chlamydiaceae gelten ähnliche Befunde, obwohl eine produktive Vermehrung der Chlamydien mit der Bildung von infektiösen Nachkommen teilweise fehlte (OJCIUS et al. 1998), an anderer Stelle jedoch nachgewiesen werden konnte (GERVASSI et al. 2004). In der eigenen Arbeitsgruppe kam es daher zur Entwicklung eines Kulturmodells. In ihm wurden humane DC erfolgreich mit Chlp. pneumoniae infiziert und über einen Zeitraum von mehr als drei Wochen kultiviert. Die Chlamydien vermehrten sich in diesen DC und bildeten infektiöse Elementarkörper aus (WITTKOP et al. 2004). 2.3.3 Persistenz Bei Untersuchungen zur Antibiotikatherapie chlamydialer Erkrankungen ergaben sich Abweichungen im beschriebenen Entwicklungszyklus der Chlamydien. So wird die Kondensation der Retikularkörper zu den infektiösen Elementarkörpern teilweise unterbrochen. Stattdessen bilden sich aus den Retikularkörpern große, in Form und Struktur abweichende Körperchen aus. Kulturell sind diese Chlamydien nicht mehr anzüchtbar. Wird das Antibiotikum wieder entfernt, so setzen in einigen Fällen die Chlamydien ihre Entwicklung fort und produzieren wieder infektiöse, kultivierbare Elementarkörper. Diese aberranten Formen werden auch bei Nährstoffentzug oder Interferon-gamma-Gabe beobachtet (BEATTY et al. 1994). Bei klinischen Studien konnten aus Proben chlamydiale Gentranskripte als Hinweis auf metabolische Aktivität isoliert werden, obwohl auch in diesen Fällen ein kultureller Nachweis nicht möglich war (GERARD et al. 1998a). In infzierten Monozyten wurde ein derart veränderter Entwicklungszyklus ebenfalls beobachtet (GERARD et al. 1998b). Literaturübersicht 27 Dieser Zustand wird als Persistenz bezeichnet. Er ist charakterisiert durch eine Unterbrechung des regulären Entwicklungszyklus mit veränderter Größe der gebildeten Inklusionen, durch eine generelle Abnahme der darin enthaltenen chlamydialen Partikel und durch vergrößerte, vielgestaltige Retikularkörper. Trotzdem sind die Chlamydien stoffwechselaktiv, aber nicht infektiös. Mittlerweile wurden bei nahezu allen Vertretern der Familie persistente Infektionen nachgewiesen. Für Chlp. pneumoniae wurde z. B. Persistenz durch die Gabe von Ampicillin ausgelöst (WOLF et al. 2000). Auch durch Eisenmangel (AL-YOUNES et al. 2001) oder Interferon-gamma (PANTOJA et al. 2001) lässt sich die Infektion mit Chlp. pneumoniae in einen persistenten Status überführen. Um den Zustand der Persistenz besser verstehen zu können, wurden einige Untersuchungen zur chlamydialen Genexpression durchgeführt. Besonders Gene, die für ribosomale Proteine oder Struktur- und Membranproteine kodieren, waren hierfür von Interesse, um Abweichungen im Proteinstoffwechsel oder bei der Differenzierung von Retikular- und Elementarkörpern charakterisieren zu können. Es erwies sich dabei als zweckmäßig, die untersuchten Gene nach ihren jeweiligen Expressionsmaxima im Entwicklungszyklus zu gruppieren. Dabei können zu den frühen Genen diejenigen gezählt werden, die bei der Umbildung vom EK zum RK von Bedeutung sind. Die mittlere Phase ist durch das Wachstum und die Vermehrung der Retikularkörper gekennzeichnet. Die späten Gene kodieren schließlich für die terminale Redifferenzierung der RK zu den infektiösen EK (SHAW et al. 2000). Als eines der frühesten exprimierten Gene konnte euo (early uptake open reading frame) charakterisiert werden. Es kodiert für eine Protease, welche DNA-bindende Histone verdaut (KAUL u. WENMAN 1998). Dadurch erst kann die Dekondensierung des chlamydialen Nukleoids eingeleitet werden und die Umbildung vom EK zum RK beginnen. Die Expression dieses Gens geschieht bereits 1,5 Stunden nach Infektion (WICHLAN u. HATCH 1993). Es ist auch bei Chlp. pneumoniae im Genom vorhanden und sequenziert. Literaturübersicht 28 Ein weiteres Gen, welches schon früh während der chlamydialen Entwicklung exprimiert wird, ist das groEL-Gen. Seine Expression führt zur Bildung eines Hitzeschockproteins, des HSP60 (Hitze-Schock-Protein mit dem Molekulargewicht von 60 Kilo-Dalton). Dieses Protein dient allerdings nicht wie andere Hitzeschockproteine dem Schutz des Organismus vor Hitze oder oxidativem Stress, sondern fungiert als Chaperon. Im Vermehrungszyklus ist die Expression des groEL bereits nach 4 bis 6 Stunden nachgewiesen worden (SLEPENKIN et al. 2003). Allerdings wird eine Beeinflussung der Expression dieses Gens in Falle von Persistenz widersprüchlich diskutiert (HOGAN et al. 2003; SLEPENKIN et al. 2003; HOGAN et al. 2004). Bei Chlamydophila pneumoniae wurden in Zusammenhang mit Persistenz besonders die Gene untersucht, welche für Membranproteine kodieren. Ein Hauptbestandteil der äußeren Membran sowohl beim EK wie auch beim RK ist das MOMP (major outer membrane protein). Es ist das am häufigsten vorhandene transmembranale Protein der Chlamydien und fungiert als Porin. Es stellt somit eine Verbindung zwischen dem Inneren chlamydialer Partikel und der Wirtszelle her und sichert so das Überleben der Chlamydien (HATCH 1996). Das kodierende Gen wird als ompA bezeichnet. MOMP wird in großem Maße während der Vermehrungsphase in der Mitte des Vermehrungszyklus benötigt, da hier die Zahl der Retikularkörper exponentiell ansteigt. Untersuchungen in verschiedenen Persistenzmodellen ergaben eine Heraufregulation der Expression des ompA-Gens in den persistenten Chlamydien (HOGAN et al. 2004). Als Marker für chlamydialen Stoffwechsel wird noch ein weiteres Gen oft untersucht, welches für die 16S Untereinheit der chlamydialen Ribosomen kodiert. Dabei ist die Zahl der 16S rRNA-Transkipte direkt proportional zur Anzahl der lebenden chlamydialen Partikel (MATHEWS et al. 1999). Dadurch ist die Untersuchung dieses Gens gut geeignet, um auch bei fehlender Infektiosität im Fall von Persistenz die Zahl lebender Chlamydien bestimmen zu können. Die Expression dieses Gens bleibt während des gesamten Entwicklungszyklus stabil und wird daher auch als Bezugspunkt für die Expression anderer Gene genutzt, deren Expression sich zeit- oder infektionsabhängig verändert. Literaturübersicht 2.4 29 Kokulturmodelle In-vivo Prozesse sind selten auf eine einzige Zellart beschränkt. Im Körper kommt es ständig zu einer Kommunikation zwischen Zellen und zu einem Austausch von Stoffen und Informationen. Dies gilt besonders für immunologische Prozesse, bei denen die Interaktion zwischen angeborener und erworbener Immunität für eine erfolgreiche Aufrechterhaltung der Norm entscheidend ist. Aus diesem Grund wird auch in-vitro versucht, mehrere Zelltypen in einem System zu kultivieren, um so die in-vivo Verhältnisse besser nachbilden zu können. Allerdings gibt es zwei grundsätzlich verschiedene Ansätze. Die zu untersuchenden Zellarten können in direktem Kontakt miteinander kultiviert werden oder auf Distanz. Eine Kultur mit direktem Kontakt kommt den natürlichen Bedingungen sicherlich am nächsten und erlaubt gerade bei immunologischen Untersuchungen Prozesse, deren Ablauf an Rezeptoren oder Oberflächemoleküle gebunden ist. Allerdings können Effekte von löslichen Botenstoffen nicht separat untersucht werden. Außerdem ist gerade bei Infektionsmodellen nicht ausgeschlossen, dass Zellen ein infektiöses Agens mit Resten anderer Zellen phagozytieren. Eine eigenständige Aufnahme frei verfügbarer Erreger kann davon nicht unterschieden werden. Hierfür bieten sich also Systeme mit räumlich getrennten Zellpopulationen an. Ein weiterer Vorteil einer solchen Trennung besteht darin, dass getrennte Populationen wesentlich einfacherer zu analysieren sind. Die Zellen müssen nicht nach erfolgtem Versuchsablauf wieder getrennt werden, sondern stehen zu jedem Zeitpunkt einer separaten Untersuchung zur Verfügung. In Bezug auf Chlamydien sind beide Systeme bereits mehrfach verwendet worden. So wurde die Übertragung von Chlamydophila pneumoniae zwischen Monozyten und glatten Muskelzellen in einem System mit direktem Zell-Zell-Kontakt demonstriert (PUOLAKKAINEN et al. 2003). Ebenfalls bei direktem Kontakt kam es zur Induktion von Apoptose aktivierter T-Zellen durch Makrophagen, welche mit C. trachomatis infiziert waren (JENDRO et al. 2000). Allerdings war es bei dieser Arbeit nicht möglich, einen Literaturübersicht 30 evtl. beteiligten Botenstoff zu benennen, so dass in einer Anschlussarbeit auch ein Modell mit räumlich getrennt kultivierten Zellen verwendet wurde (JENDRO et al. 2004). Die Trennung erfolgte durch eine poröse Membran. Ein weiteres Membransystem wurde auch schon bei Untersuchungen zum Migrationsverhalten von neutrophilen Granulozyten und Makrophagen bei Infektion von endothelialen Zellen mit Chlp. pneumoniae verwendet (MOLESTINA et al. 1999). Material und Methoden 3 Material und Methoden 3.1 Geräte und Materialien 31 3.1.1 Geräte Durchflusszytometer „FACSCalibur“ BD Biosciences, Heidelberg Fluoreszenzmikroskop „BX60“ Olympus, Hamburg für Objektträger Fluoreszenzmikroskop „IX70“ Olympus, Hamburg für Zellkulturplatten Kühlzentrifuge „Centrifuge 5415 R“ Eppendorf GmbH, Hamburg (für Eppendorfgefäße) Mikroskop Phasenkontrast Olympus, Hamburg „CK40“ mit Kamera „DP50“ Photometer „Ultraspec 2000“ Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg Pipette 10 µl Eppendorf GmbH, Hamburg Pipetten „Pipetman®“ Gilson S.A., Villiers-le-Bel (Frankreich) 20 µl/100 µl/200 µl Pipettierhilfe „Pipettboy plus“ Integra Biosciences, Fernwald Plattenzentrifuge „Rotanta 46 RSC“ Hettich, Lauenau (für Infektion) TaqMan® PCR-Gerät Applied Biosystems, Branchburg (USA) „ABI Prism Sequenze Detector 7700“ Thermocyler „Mastercycler“ Eppendorf GmbH, Hamburg Material und Methoden 32 Tischzentrifuge klein Qualitron Inc. Ultraschallbad „Omnilab 080” Jürgens, Hannover Vortex „Genie 2“ Scientific Industries, Bohemia (USA) Wasserbad Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel Zellkulturschrank (B 5061) Heraeus, Hanau (für nicht-infektiöse Kulturen) Zellkulturschrank (BB 5060) Heraeus, Hanau (für infektiöse Kulturen) Zentrifuge „Centrifuge 5804“ Eppendorf GmbH, Hamburg (mit Platteneinsatz bei Bedarf) Zentrifuge „Labofuge 400e“ Heraeus, Hanau (mit Bechereinsätzen) 3.1.2 Materialien 24-well Zellkulturplatten Nunc GmbH, Wiesbaden „multidish 24 wells“ 6-well Zellkulturplatten Nunc GmbH, Wiesbaden „multidish 6 wells“ 96-well Zellkulturplatten Nunc GmbH, Wiesbaden „TC Microwell F“ Abklebefolie für TaqMan®-Platten ABgene, Epson (Großbritannien) „QPCR Seal“ Deckgläschen eckig, Omnilab GmbH, Braunschweig 18mm x 18mm Deckgläschen rund 13mm Menzel-Gläser, Braunschweig Material und Methoden Eppendorfgefäße RNase-frei 33 peqLab Biotechnologie GmbH, Erlangen „Multi SafeSeal“ 0,5ml/1,5ml FACS-Röhrchen 5 ml BD Biosciences, Bedford (USA) „polystyrene round bottom“ Falcon 15ml (Spitzbodenröhrchen) Greiner GmbH, Frickenhausen Falcon 50 ml (Spitzbodenröhrchen) Greiner GmbH, Frickenhausen Gummischaber Greiner GmbH, Frickenhausen Leukosep® Röhrchen 30 ml Greiner GmbH, Frickenhausen MACS®-Säulen „LS“ Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach Midi MACS® Magnet Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach Objektträger 76mm x 26mm Menzel-Gläser, Braunschweig Pipettenspitzen gestopft Eppendorf GmbH, Hamburg ep TIPS 10 µl Pipettenspitzen gestopft Greiner GmbH, Frickenhausen Filtertips 20 µl/100 µl/200 µl Plastikschalen für Zellkultur Nunc GmbH, Wiesbaden 500 cm² Safe-Lock Eppendorfgefäße Eppendorf GmbH, Hamburg „Safe-Lock Tubes 1,5 ml“ Serologische Pipetten (10 ml, 20 ml) Sarstedt AG & Co., Nümbrecht TaqMan®-Platten ABgene, Epson (Großbritannien) „Thermo-Fast® 96 Detection“ Transwell®-Zellkulturplatten Corning Incorporated, Corning (USA) „Transwell® Clear“ Polyester 0,4 µm oder 3 µm Porendurchmesser 6,5 mm oder 24mm Einsätze Zellkulturflaschen 250 ml, 75cm² Greiner GmbH, Frickenhausen Material und Methoden 34 3.1.3 Zellen und Bakterien Buffy Coats Die verwendeten Buffy Coats fielen bei der Herstellung von Erythrozytenkonzentraten in der Blutbank des Annastifts, Hannover, an. Chlamydophila pneumoniae Isolat eines Patienten, isoliert von Prof. Dr. M. Maass, Med. Universität Lübeck in der Abteilung Rheumatologie der MHH weitergeführt HEp-2 Zellen Zelllinie aus einem humanen American Type Culture Collection Nr. CCL 23, Rockville (USA) Laryngokarzinom 3.1.4 Medien und Lösungen 7-Amino-Actinomycin D BD Biosciences, Bedford (USA) Accutase PAA Laboratories, Linz (Österreich) AEC+ Subtrate Chromogen 15 ml DAKOCytomation, Carpinteria (USA) 3-Amino-9-Ethylcarbazol Corbit Balsam I. Hecht, Kiel-Hassee Cycloheximid (1µg/ml) Sigma-Aldrich, Deisenhofen Ethanol 70% Laborbestand der MHH Material und Methoden Evansblau 35 Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim Evans blue 0,5% (zum Gebrauch 1:1000 in PBS) Fetales Kälberserum SO125 Biochrom KG, Berlin Ficoll®-Isopaque Lösung PAA Laboratories, Linz (Österreich) Lymphozyten-Separationslösung Hämatoxylin Merck, Darmstadt Mayers Hämalaunlösung HANKS-Lösung Zentralapotheke MHH, Hannover modifiziert ohne Calcium humanes AB-Serum PAA Laboratories, Linz (Österreich) „off the clot“ Kulturmedium I 500 ml RPMI 1640 ohne L-Glutamin 50 ml FKS 5 ml L-Glutamin (2mM) Kulturmedium II 500 ml RPMI 1640 ohne L-Glutamin 5 ml L-Glutamin (2mM) L-Glutamin 200mM Biochrom KG, Berlin Methanol absolut Laborbestand MACS®-Puffer 49,75 ml „PBS MHH“ 2mM EDTA 250 µl autologes Serum oder hAB-Serum Monocyte Isolation Kit II FcR-Blocking Reagent Monocyte Biotin-Antibody Cocktail Anti-Biotin MicroBeads Mounting-Medium “Faramount Aqueous” Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach DAKOCytomation, Carpinteria (USA) Material und Methoden 36 Paraformaldehyd rein Serva Electrophoresis, Heidelberg Peroxidase Block Lösung 15 ml DAKOCytomation, Carpinteria (USA) Pferdeserum 20 ml Vector Laboratories, Burlingame (USA) „Normal Horse Serum S-2000“ Phosphatgepufferte Kochsalzlösung „Färbe-PBS” ph 7,4 8,0g NaCl (137mM) Merck, Darmstadt 2,0g KCl (27mM) Merck, Darmstadt 1,15g Na2HPO4 (8mM) Merck, Darmstadt 0,2g KH2PO4 (1,5mM) Merck, Darmstadt in 1000 ml Aqua dest. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung Zentralapotheke MHH „PBS MHH“ Na2HPO4 – 12 H2O (58,8 mM/L) KH2PO4 (17,9 mM/L) NaCl (75 mM/L) rhGM-CSF Novartis Pharma, Nürnberg rhInterleukin 4 R&D Systems, Wiesbaden RNase freies Wasser Invitrogen Ltd., Paisley (UK) „ultraPURE“ destilled water RNase/DNase free RPMI 1640 Medium ohne L-Glutamin Gibco BRL, Eggestein Trypanblau 0,5% Biochrom KG, Berlin Trypsin-EDTA 10x (0,5%/0,2%) Biochrom KG, Berlin -Mercaptoethanol 25 ml Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim Material und Methoden 37 3.1.5 Antikörper für die Färbungen (Immunhistochemie und Immunfloureszenz) Anti-humanes IgA/IgG/IgM Konjugat DAKOCytomation, Glostrup (Dänemark) aus Kaninchenantikörpern F 0200 FITC-markiert anti-MOMP Antikörper Klon RR402 DAKOCytomation, Glostrup (Dänemark) “ -Pneumoniae” IgG FITC-markiert EnVision+ Dual Link System Peroxidase DAKOCytomation, Carpinteria (USA) 3.1.6 Antikörper für die Durchflußzytometrie (FACS) Mouse IgG1 (PE) Klon MOPC-21 BD Biosciences, Bedford (USA) Mouse IgG2a (FITC) Klon G155-178 BD Biosciences, Bedford (USA) Mouse IgG2a HLA-DR (PE) Klon G46-6 BD Biosciences, Bedford (USA) Mouse IgG1 CD1a (FITC) Klon HI149 BD Biosciences, Bedford (USA) Mouse IgG2a CD14 (FITC) Klon M5E2 BD Biosciences, Bedford (USA) Mouse IgG1 CD16 (FITC) Klon NKP15 BD Biosciences, Bedford (USA) Mouse IgG1 CD33 (PE) Klon WM53 BD Biosciences, Bedford (USA) Mouse IgG1 CD80 (PE) Klon L307.4 BD Biosciences, Bedford (USA) Mouse IgG1 CD83 (PE) Klon HB15e BD Biosciences, Bedford (USA) Mouse IgG1 CD86 (PE) Klon 2331 BD Biosciences, Bedford (USA) Alle Antikörper sind Mausantikörper, die gegen die aufgeführten Oberflächenmoleküle (HLA-DR bzw. CD) auf humanen Zellen gerichtet sind. Material und Methoden 38 3.1.7 Molekularbiologische Reagenzien DNA/RNA Isolations-Kit NucleoSpin® RNA II Kit Macherey-Nagel GmbH, Düren NucleoSpin® RNA/DNA Puffer Set Macherey-Nagel GmbH, Düren DNA-Verdau RQ1 RNase-Free DNase Promega Corporation, Madison (USA) Master Mix für TaqMan® qPCR® Core Kit Eurogentec, Seraing (Belgien) Primer/Sonden für die untersuchten chlamydialen Gene Primer/Sonde für 16S DNA/RNA BioTeZ Berlin Buch GmbH, Berlin Primer forward (20µmol/L) 5’ GCA CCT TAC CTG GAC TTG ACA TGT 3’ Primer reverse (10µmol/L) 5’ CCA TGC AGC ACC TGT GTA TCT G 3’ Sonde 16S C.p. (5µmol/L) 6-FAM-TGA CAA CTG TAG AAA TAC AGC TTT CCG CAA GG-TAMRA Primer/Sonde Mix euo-Gen Applied Biosystems, Cheshire (UK) Primer forward 5’ CCT GTG CAG AAG GTC TAC TAT GC 3’ Primer reverse 5’ CCA AGC GGC TCC CTT ACG 3’ Sonde euo C.p. FAM-CTG GTA CGG GAA CCA T-TAMRA Material und Methoden Primer/Sonde Mix groEL-Gen 39 Applied Biosystems, Cheshire (UK) Primer forward 5’ GCA AAT TGC AAG TAA CGC AGG TAA A 3’ Primer reverse 5’ AGC CTT CAT TTG CAG ATC TTG CTA 3’ Sonde groEL C.p. FAM-AAC TTG CTG ACA AAT GAT-TAMRA Primer/Sonde Mix ompA-Gen Applied Biosystems, Cheshire (UK) Primer forward 5’ CGC TGG CGT AGC AAC AG 3’ Primer reverse 5’ GGC TCC TAC TTG CCA TTC ATG ATA A 3’ Sonde ompA C.p. FAM-ATG GTC GCA GAC TTT-TAMRA Reverse Transcription Core Kit Eurogentec, Seraing (Belgien) 3.1.8 Weitere Hilfsmittel Die vorliegende Arbeit wurde mit den Programm Microsoft ® Word 2002 erstellt. Die den Graphiken zugrunde liegenden Berechnungen wurden mit Microsoft® Excel 2002 durchgeführt, die Graphiken selbst mit GraphPad Prism® Version 4 erstellt. Bei der FACSAnalyse wurde die CellQuest Software der Firma Becton Dickinson genutzt. Die Daten des TaqMan® Systems wurden durch die dem Gerät beiliegende SDS-Software ausgegeben. Für die Aufnahme der mikroskopischen Bilder wurde die Soft Imaging System Software genutzt. Material und Methoden 3.2 40 Methoden 3.2.1 Kultivierung von HEp-2 Zellen Die Zellen wurden aus dem Stickstofftank entnommen und mit 1,5 ml Kulturmedium I (3.1.4) durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren aufgetaut. Die Zellsuspension wurde in ein 50 ml Falcon (3.1.2) überführt, auf 10 ml mit Kulturmedium I aufgefüllt und für 10 min bei 250xg und Raumtemperatur (RT) zentrifugiert. Danach wurde der Überstand dekantiert und das Zellpellet erneut in 10 ml Kulturmedium I resuspendiert. Diese Zellsuspension wurde dann in eine 250 ml Zellkulturflasche (3.1.2) überführt und mit weiteren 13 ml Kulturmedium I aufgefüllt. Die Inkubation erfolgte im Wärmeschrank bei 37°C und 5% CO 2 in Luft. Die weitere Entwicklung der Zellen und die Bildung eines Monolayers wurden mikroskopisch kontrolliert. Einem zu dichten Wachstum wurde in regelmäßigen Abständen durch Subkultivieren entgegengetreten. Dabei wurde der Zellrasen mit 10 ml PBS (3.2.4) durch Schwenken der Flasche gewaschen. Das PBS wurde mit einer serologischen Pipette wieder entfernt und der Monolayer mit 2 ml Trypsin/EDTA-Lösung (3.1.4) überschichtet. Die Kulturflasche wurde daraufhin für 5 min im Wärmeschrank gelagert, wieder herausgenommen und die Zellen durch vorsichtiges Klopfen gegen die Flasche abgelöst. Die vollständige Ablösung wurde wiederum mikroskopisch kontrolliert. Die Trypsinlösung wurde mit 10 ml Kulturmedium I durch das darin enthaltene Serum inaktiviert und die Zellen durch Auf- und Abpipettieren resuspendiert. Ca. 2 ml der Zellsuspension wurden in der Flasche belassen, der Rest mit einer serologischen Pipette entfernt und verworfen. Die in der Flasche belassenen Zellen wurden mit 20 ml neuem Kulturmedium I versehen und wieder bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Material und Methoden 41 3.2.2 Isolation CD14 positiver mononuklärer Zellen Die für die Untersuchungen benötigten dendritischen Zellen und Makrophagen wurden aus peripheren mononuklären Zellen des Blutes generiert. Diese Zellen sind unter anderem durch das Vorhandensein eines Oberflächenmoleküls, dem CD14 (Rezeptor für den Komplex aus Lipopolysaccharid und Lipopolysaccharid-bindenden Protein), gekennzeichnet. Sie sind Bestandteil der Leukozytenfraktion im Blut. Die Zellen wurden aus Buffy Coats klinisch gesunder Spender isoliert. Diese Buffy Coats befanden sich in einem Beutel. Vor der Isolation wurden die zu- und abführenden Schläuche mit 70%igem Alkohol desinfiziert. Einer der Schläuche wurde daraufhin mit einer sterilen Skalpellklinge durchtrennt. Die ersten Tropfen Blut wurden verworfen, die restliche Menge in 50 ml Falcons gesammelt. Das enthaltene Serum wurde bei 2500xg für 15 min bei RT abzentrifugiert, in neuen Falcons gepoolt und für 40 min bei 56°C im Wasserbad erhitzt, um die enthaltenen Komplementfaktoren zu inaktivieren. Die Zellen wurden mit 10°C kaltem PBS + 2mM EDTA resuspendiert. Die benötigte Menge 50 ml-Leukosep-Röhrchen (3.1.2) wurde mit 15 ml Ficoll-Isopaque (3.1.4) versehen. Die Röhrchen wurden danach für ca. 30 Sekunden bei 1000xg und RT zentrifugiert, um die Ficoll-Lösung unterhalb der Filterscheibe zu sammeln. Danach wurden 20 ml PBS + 2mM EDTA über die Filterscheibe pipettiert. Hierzu wurden dann je Leukosep-Röhrchen 10 ml der Blut/PBS-Mischung gegeben. Die Leukosep-Röhrchen wurden daraufhin für 15 min bei 800xg und RT zentrifugiert, wobei beim Herunterfahren der Zentrifuge auf eine Abbremsung des Rotors verzichtet wurde, um eine saubere Schichtung zu erhalten. In dieser Schichtung lagen die mononuklären Zellen auf der FicollIsopaque Lösung und wurden vorsichtig mit einer serologischen Pipette abgenommen. Die Zellen wurden in neuen sterilen 50 ml Falcons gepoolt. Um mit abgesaugte Ficoll-Lösung zu entfernen, wurden die Zellen für 10 min bei 300xg abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Die Zellpellets wurde in 5 ml PBS + 2mM EDTA resuspendiert und in einem Falcon zusammengegeben. Mit weiteren 35 ml wurde das Volumen auf 40 ml eingestellt Material und Methoden 42 und das Falcon erneut für 10 min bei 250xg zentrifugiert. Der Überstand wurde wiederum verworfen und der Waschvorgang noch zweimal wiederholt. Danach wurde das Pellet ein letztes Mal mit PBS + 2mM EDTA resuspendiert und die Suspension auf ein Volumen von 40 ml aufgefüllt. Hiervon wurden 10 µl entnommen und mit weiteren 10 µl TrypanblauLösung (3.1.4) durch vorsichtiges Pipettieren vermischt. Das Trypanblau dringt dabei in Zellen ein, deren Membran nicht mehr intakt ist, und färbt diese Zellen blau an. 10 µl wurden dann in eine Zählkammer nach Neubauer gegeben und die nicht gefärbten Zellen ausgezählt. Die Gesamtzahl vitaler Zellen (Zellen mit intakter Membran) in der Gesamtzellsuspension errechnete sich anhand folgender Formel: (Ausgezählte vitale Zellen/0,4 µl) * 2 * 1000 µl * 40ml 0,4 µl: Flüssigkeitsvolumen bei der Auszählung 2: Verdünnungsfaktor Zellsuspension/Trypanblaulösung 1000 µl: Hochrechnung des zur Zählung benutzen Volumens auf 1 ml 40 ml: Gesamtvolumen der Zellsuspension, deren Zellzahl bestimmt werden soll Die so errechnete Zellzahl war Ausgangspunkt für die weiteren Isolationsschritte. Nachfolgend wurde die Zellsuspension wieder für 10 min bei 250xg und RT zentrifugiert. Die sich anschließende Isolation wurde nach dem Protokoll des Monocyte Isolation Kit II der Firma Miltenyi Biotec (3.1.4) durchgeführt. Bei dieser Methode werden vorhandene Lymphozyten mit Antikörpern gegen die Oberflächenmoleküle CD3, CD7, CD16, CD19, CD56, CD123 und Glycophorin A markiert (positive Selektion). Die CD14 positiven Zellen bleiben unmarkiert. Diese Antikörper sind mit metallischen Kügelchen versehen. Eine ebenfalls metallische Säule wird in ein starkes Magnetfeld gesetzt. Die über die Antikörper metallisch markierten Zellen werden an die magnetisierte Säule gebunden, die nichtmarkierten Zellen passieren die Säule ungehindert. Die CD14+ monozytären Zellen werden so negativ selektiert (keine Bindung mit einem Antikörper). Material und Methoden 43 Für die Versuche mit autologem Serum wurde das hitzeinaktivierte Serum (3.2.2) zunächst auf Eis abgekühlt und anschließend für 15 min bei 2500xg zentrifugiert, um das ausgefallene Komplement zu sedimentieren. Die flüssige Phase wurde in neue 50 ml Falcons überführt, die sedimentierten Bestandteile verworfen. Bei Versuchen mit humanem AB-Serum war dieser Schritt nicht nötig und wurde ausgelassen, da das hABSerum bereits bei der Herstellung auf diese Weise behandelt wurde. 250 µl Serum (autologes oder hAB-Serum, je nach Versuchsansatz) wurden mit 49,75 ml PBS + 2mM EDTA versetzt und so eine Pufferlösung (MACS®-Puffer, Kap. 3.1.4)) für die Isolation hergestellt. Ca. 200 ml dieses Puffers wurden angesetzt und auf Eis inkubiert, um eine Temperatur von 4°C zu halten. Die Überstand über den abzentrifugierten Zellen wurde verworfen. Das Pellet wurde dann in MACS®-Puffer resuspendiert. Die benötigte Menge wurde anhand der Zellzahl berechnet und betrug 30 µl Puffer für 107 Zellen. Anschließend wurden 10 µl/107 Zellen des FcR-Blocking Reagent (3.1.4) und die gleiche Menge Biotin-Antibody Cocktail (3.1.4) hinzugefügt, gut mit der Zellsuspension durch vorsichtiges Pipettieren vermischt und das Falcon mit der gesamten Suspension bei 4°C im Kühlraum für 10 min inkubiert. Danach wurden noch einmal 30 µl/107 Zellen des MACS®-Puffers hinzugegeben. Schließlich wurden gemäß Protokoll 20 µl/107 Zellen der Anti-Biotin MicroBeads-Lösung (3.1.4) zugefügt, die gesamte Suspension vorsichtig vermischt und wiederum bei 4°C im Kühlraum für 15 min inkubiert. Danach wurde mit MACS®-Puffer auf 40 ml bis 50 ml aufgefüllt und durch eine anschließende Zentrifugation bei 300xg für 10 min ein Pellet sedimentiert. Der Überstand konnte danach dekantiert werden. In der Zwischenzeit wurden die Säulen für die Isolation vorbereitet. Jeweils eine Säule der Größe „LS“ (3.1.2) ist für 108 markierte Zellen vorgesehen. Da es sich bei dieser Methode um eine negative Selektion handelt, die Zielzellen also unmarkiert bleiben, wurde die Gesamtzellzahl zur Bestimmung der benötigten Anzahl an Säulen benutzt. So war eine Überladung der Säulen ausgeschlossen. Die entsprechende Anzahl der Säulen wurde in die vorgesehenen MACS®-Magnete (3.1.2) eingespannt. Da nur drei Magnete zur Verfügung standen, musste bei größeren Material und Methoden 44 Zellmengen in mehreren Schritten isoliert werden. Jede Säule wurde mit 3 ml MACS®Puffer gespült und das Eluat verworfen. Das nach der Zentrifugation erhaltene Zellpellet wurde in 500 µl MACS®-Puffer je 1x108 Zellen resuspendiert. Je Säule wurde die gleiche Menge Zellsuspension aufgetragen, maximal jedoch 500 µl. Das Eluat jeder Säule wurde in einem sterilen 50 ml Falcon gesammelt. Jede Säule wurde schließlich dreimal mit je 3 ml MACS®-Puffer gewaschen, auch dieses Eluat wurde gesammelt. Die Eluate wurden danach gepoolt, um die isolierten Zellen in einem Falcon zusammenzuführen und mit MACS®-Puffer auf 40 ml aufgefüllt. Hiervon wurden 10 µl wieder mit 10 µl Trypanblau vermischt und die vitalen Zellen ausgezählt (s.o.). Die so erhaltenen CD14 positiven mononuklären Zellen wurden dann den anschließenden Versuchen zugeführt. Material und Methoden 45 3.2.3 Überprüfung der Reinheit der isolierten CD14+ Zellen mittels FACS-Analyse Die für die Versuche benötigten dendritischen Zellen und Makrophagen sollten aus CD14+ mononuklären Zellen generiert werden. Um den Erfolg der beschriebenen Isolation zu prüfen und die Reinheit der so erhaltenen Zellpopulation zu bestimmen, wurde eine Analyse der Zellen mittels FACS (fluorescence activated cell sorting) angestrebt. Bei dieser Methode werden Zellen mit bestimmten Antikörpern markiert. Die Antikörper tragen fluoreszierende Farbstoffe, welche bei Anregung mit Licht definierter Wellenlänge Fluoreszenzlicht aussenden. Die so markierten Zellen werden einzeln durch eine Kapillare geführt und dabei durch Laserlicht einer definierten Wellenlänge bestrahlt. Neben der Streuung des Lichts durch die Struktur der Zellen wird auch das durch die fluorochrommarkierten Antikörper emittierte Fluoreszenzlicht registriert. Es wird durch verschiedene Filter geleitet und nach Wellenlängenbereich getrennt detektiert. Das Gerät zählt neben der Zahl der durch die Kapillare geleiteten Zellen auch die Impulse je Farbe. So lässt sich von einer Gesamtheit von Zellen eine genaue Aufteilung nach Farbsignalen, also nach antikörpermarkierten Molekülen, z.B. Oberflächenmolekülen, erreichen. Die Zellen können anschließend getrennt gesammelt (sortiert) werden. Dieser Schritt war zur Analyse der Zellpopulationen allerdings nicht nötig und wurde hier ausgelassen. Von den isolierten Zellen wurden zwei FACS-Röhrchen (3.1.2) mit je 2,5x105 Zellen versehen. Das eine Röhrchen wurden zur Färbung auf CD14 genutzt, das andere diente als Isotypkontrolle. Diese wird benötigt, um eine eindeutige Abgrenzung markierter von unmarkierten Zellen zu gewährleisten. Die Röhrchen mit der Zellsuspension wurden für 10 min bei 250xg zentrifugiert und der Überstand vorsichtig dekantiert. Die Zellpellets wurden mit 10 µl einer Lösung mit humanem Immunglobulin G (IgG) versehen und 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Dieser Schritt diente zur Blockierung der auf den Zellen vorhandenen Fc-Rezeptoren und verhinderte eine unspezifische Anfärbung durch unspezifische Bindung von Antikörpern. Danach wurden 5 µl des jeweiligen Antikörpers (CD14 oder Isotypkontrolle) hinzugegeben. Material und Methoden 46 Da diese Antikörper fluoreszenzmarkiert waren, erfolgte die Inkubation in einer dunkeln Kammer für 30 min auf Eis, um ein Ausbleichen zu verhindern. Nach der Inkubation wurden die Röhrchen mit 2ml kaltem PBS (3.1.4) aufgefüllt, gut gemischt und die Zellen bei 250xg für 10 min zentrifugiert, um nicht gebundene Antikörper zu entfernen und so eine bessere Unterscheidung von spezifisch markierten und unmarkierten Zellen zu ermöglichen. Der Überstand wurde danach verworfen und die Zellen in 200 µl PBS und 200 µl 4%iger Paraformaldehyd-Lösung (3.1.4) zur Konservierung aufgenommen. Die Analyse erfolgte im Regelfall am nächsten Tag mit dem FACS-Calibur Gerät (3.1.1). Die Auswertung wurde mit der zugehörigen Software Cell-Quest (3.1.8) vorgenommen. 3.2.4 Konditionierung der Zellen 3.2.4.1 Konditionierung der monozytären Zellen zu Makrophagen Die aus der Isolation (3.2.2) gewonnenen Zellen wurden in 24-well Zellkulturplatten (3.1.2) für die Infektionsversuche konditioniert. Dazu wurden die Böden der inneren beiden wellReihen mit runden sterilen Deckgläschen (3.1.2) versehen. Die äußeren beiden Reihen wurden mit PBS gefüllt. Die Zelldichte wurde so eingestellt, dass pro well 3,5x10 5 Zellen in Kultur genommen wurden. Die diese Zellzahl enthaltende Menge wurde aus dem Isolation-Falcon (3.2.2) entnommen und 10 min bei 250xg zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wurde zunächst mit 5 ml Kulturmedium II (3.1.4) resuspendiert. Pro well wurden 500 µl Medium inkl. 10 % Serumzusatz benötigt. Die entsprechende Gesamtmenge an Kulturmedium II und dem entsprechenden Serum (autolog oder hAB, je nach Versuch) wurde zu den resuspendierten Zellen hinzugefügt. Die gesamte Suspension wurde gründlich durch Auf- und Abpipettieren gemischt. Jedes well wurde mit 3,5x105 Zellen in 500 µl versehen, wobei in regelmäßigen Abständen die Zellsuspension erneut gemischt Material und Methoden 47 wurde, um eine unregelmäßige Aussaat der Zellen zu verhindern. Die Zellkulturplatten wurden danach in Plastikschalen (3.1.2) mit lose aufliegendem Deckel gestellt. Zusätzlich wurde ein mit Aqua dest. befeuchtetes Papiertuch in die Schale gegeben, um eine feuchte Atmosphäre zu gewährleisten. Die Schalen mit den Zellkulturplatten wurden bei 37°C und 5% CO2 in Luft inkubiert. An Tag 1 nach Isolation wurden pro well 50 µl (10% der Mediummenge) des jeweils verwendeten Serum zur Versorgung der Zellen hinzugefügt. An Tag 2 wurde ein Teilmediumwechsel vorgenommen, um zelluläre Stoffwechselendprodukte zu entfernen. Zu diesem Zweck wurden 250 µl des Kulturmediums entnommen und in ein steriles 50 ml Falcon überführt. Nicht adherente und damit mit abpipettierte Zellen wurden anschließend bei 250xg für 10 min abzentrifugiert. Der Mediumüberstand wurde verworfen. Das Zellpellet wurde mit neuem Kulturmedium II inkl. 10% des jeweils verwendeten Serums resuspendiert. Die zuvor aus den wells entnommene Menge Medium wurde damit wieder ergänzt. Dieses Vorgehen wurde auch an Tag 6 nach Isolation wiederholt. An Tag 4 wurden zusätzlich noch einmal 50 µl (10% der Mediummenge) des entsprechenden Serums pro well zur Versorgung der Zellen hinzugefügt. Die Entwicklung der Zellen wurde regelmäßig mikroskopisch beobachtet und die Morphologie der Zellen photographisch dokumentiert. 3.2.4.1.1 Konditionierung der monozytären Zellen zu Makrophagen auf der Membran In Vorexperimenten wurden Zellen auch im Transwell-System (3.1.2) auf der Membran zu Makrophagen konditioniert (vgl. 3.2.4.2). Die Membranen wurden gemäß Herstellerangaben vorinkubiert, und zwar mit 100 µl Kulturmedium II (3.1.4) inkl. 10% hABSerums (3.1.4) im oberen Kompartiment und 500 µl des gleichen Mediums im unteren Kompartiment. Am Tag danach wurden die isolierten Zellen (3.2.2) in einer Dichte von 6,1x104 Zellen pro Membraneinsatz hinzugegeben und die Mediummenge im unteren Material und Methoden 48 Kompartiment auf 600 µl inkl. 10% Serumzusatz aufgefüllt. Das weitere Vorgehen entsprach dann dem für die normalen 24-well-Platten beschriebenen Prozedere (3.2.4.1) 3.2.4.2 Konditionierung der monozytären Zellen zu immaturen DC Für die Konditionierung der aus der Isolation (3.2.2) gewonnenen Zellen zu immaturen DC wurde das Transwell-Kultursystem (3.1.2) genutzt. Es besteht aus einer 24-well Zellkulturplatte und 12 Einsätzen, die lediglich auf dem Rand der Platten-wells aufliegen. Der Boden dieser Einsätze wird durch eine Membran mit Poren von 0,4 µm Durchmesser gebildet, wodurch der gesamte Kulturraum in ein oberes und ein unteres Kompartiment unterteilt wird. Aussparungen in der Wand des Einsatzes erlauben einen Zugang in das untere Kompartiment ohne dass der Einsatz entfernt werden muss. Vor der Aussaat der Zellen wurden die Einsätze mit 100 µl Kulturmedium II (3.1.4) im oberen und 600 µl Kulturmedium II im unteren Kompartiment vorbereitet. Das Medium enthielt wie für die Kultur bereits 10% des jeweils für den Versuch verwendeten Serums (autolog oder hAB) (3.1.4). Für die Aussaat der Zellen wurden die 100 µl im oberen Kompartiment wieder entfernt. Die äußeren beiden Reihen der Kulturplatte, welche keine Einsätze trugen, wurden mit je 500ml PBS (3.1.4) versehen, um die Verdunstung aus den Kulturwells zu minimieren. Die isolierten monozytären Zellen wurden in einer Dichte von 6,1x104 Zellen pro Einsatz ausgesät. Dazu wurde die entsprechende Menge an Zellen aus der Isolation (3.2.2) entnommen, bei 250xg für 10 min zentrifugiert und das Pellet in Kulturmedium II resuspendiert. Danach wurde die benötigte Menge an Serum errechnet. Da im unteren Kompartiment bereits das fertige Kulturmedium vorhanden war, mussten lediglich 10 µl Serum je Einsatz (10% des fehlenden Volumens von 100 µl pro Einsatz) hinzugegeben werden. Zusätzlich wurden auch rekombinantes humanes Interleukin 4 (rhIL-4) (3.1.4) und rekombinanter humaner Granulozyten- und Monozyten-Kolonie stimulierender Faktor Material und Methoden 49 (rhGM-CSF) (3.1.4)hinzugegeben. Die Mengen wurden so berechnet, dass die Endkonzentration in den Transwell-Einheiten (700 µl Gesamtvolumen je Einheit) 1000 U rhIL-4 und 500 U rhGM-CSF pro ml betrug. Erst danach wurde das Volumen der Zellsuspension mit Kulturmedium II so aufgefüllt, dass pro Einsatz 100 µl der fertigen ZellMedium-Suspension ausgesät werden konnten. An Tag 1 nach Isolation wurde jede Transwell-Einheit mit dem jeweiligen Serum (10% der Mediummenge von 700 µl je Einheit) und den entsprechenden Mengen rhIL-4 und rhGM-CSF versorgt (1000 U/ml IL-4 und 500 U/ml GM-CSF). Dieses Vorgehen wurde an Tag 4 wiederholt, um eine möglichst konstante Konzentration zu erreichen. An Tag 2 und Tag 6 nach Isolation wurde ein Teilmediumwechsel durchgeführt, um Stoffwechselendprodukte aus dem Kultursystem zu entfernen. Dazu wurden aus dem unteren Kompartiment 350 µl (50% des Gesamtvolumens von 700 µl) entfernt und verworfen. Je Transwell-Einheit wurde die zuvor entnommene Menge ersetzt. Dabei enthielt das zugeführte Kulturmedium II (3.1.4) die für das Gesamtvolumen von 700 µl je Einheit benötigte Menge des jeweiligen Serums und der Zytokine. Die Konditionierung der Zellen wurde regelmäßig mikroskopisch begutachtet und dabei die Morphologie der Zellen fotographisch dokumentiert. 3.2.4.2.1 Konditionierung der monozytären Zellen zu immaturen DC im unteren Kompartiment des Transwell-Systems In Vorexperimenten wurden Zellen auch auf dem Boden normaler Zellkulturwells (3.1.2) ohne Einsätze zu immaturen DC konditioniert. Die wells wurden dazu mit sterilen runden Deckgläschen (3.1.2) versehen. Die ausgesäte Zelldichte betrug 3,5x105 Zellen je well. Die diese Anzahl enthaltende Menge der Zellsuspension nach Isolation (3.2.2) wurde entnommen und durch Zentrifugation bei 250xg für 10 min ein Pellet sedimentiert. Das Isolationsmedium wurde verworfen und das Pellet in 5 ml neuem Kulturmedium II (3.1.4) resuspendiert. Danach wurde die benötigte Menge Serum (10% des Gesamtvolumens von 500 µl je well) hinzugegeben (humanes AB Serum) (3.1.4). Ebenso wurden die Menge an Material und Methoden 50 rhIL-4 und rhGM-CSF (3.1.4) für die Gesamtzahl der wells berechnet und der Zellsuspension beigefügt (Endkonzentrationen: 1000 U/ml IL-4 und 500 U/ml GM-CSF). Mit Kulturmedium II wurde dann die Menge der Zellsuspension so aufgefüllt, dass pro well 500 µl verteilt werden konnten. An Tag 1 und Tag 4 wurden diese Mengen an Serum und Zytokinen erneut zugesetzt, um eine konstante Zytokinkonzentration aufrecht zu erhalten. An Tag 2 und Tag 6 erfolgte ein Teilmediumwechsel, um Stoffwechselendprodukte der Zellen aus dem System zu entfernen. Hierbei wurden 50% der Mediummenge (250 µl) entfernt, für 10 min bei 250xg zentrifugiert und der Überstand danach verworfen. Das zurückbleibende Pellet wurde in neuem Kulturmedium II resuspendiert. Dann wurden Serum und Zytokine hinzugegeben, wobei die Mengen auf das Gesamtvolumen des Kulturmediums (500 µl je well) berechnet waren. Noch fehlende Mengen wurden durch Kulturmedium II ergänzt und die zuvor entfernte Mediummenge je well wieder aufgefüllt. 3.2.4.2.2 Austestung der geeigneten Porengrößen der Transwell-Membranen Vor den eigentlichen Versuchen wurden verschiedene Porengrößen ausgetestet. Da das Vorgehen dem unter Kap. 3.2.4.2 beschriebenen Vorgehen gleicht, allerdings lediglich einen Vorversuch darstellt, wurde dieser Punkt nachgestellt. Die verwendeten Transwell-Membranen (3.1.2) sind mit Porengrößen von 0,4 µm und 3 µm Durchmesser geeignet. In einem Vorexperiment wurden daher die monozytären Zellen auf Membranen mit diesen Porengrößen ausgesät und zu immaturen DC konditioniert (3.2.4.2). Die Entwicklung der Zellen wurde mikroskopisch kontrolliert, wobei sowohl das obere Kompartiment mit den Zellen auf der Membran als auch das untere Kompartiment untersucht wurden. An Tag 7 nach Isolation wurden die Transwell-Membran Zellkulturplatten in einer Plattenzentrifuge (3.1.1) für 45 min bei 751xg und einer Material und Methoden 51 Temperatur von 35°C zentrifugiert, um auch noch das Geschehen während der Infektion zu simulieren (vgl. Kap. 3.2.5.2). 3.2.4.2.3 Austestung verschiedener Serumgehalte auf die Konditionierung Bei den verwendeten Buffy Coats (3.2.2) konnte nicht immer eine ausreichende Menge autologen Serums gewonnen werden. Da der Spender für eine weitere Serumabnahme nicht in jedem Fall zur Verfügung stand, wurde neben dem Einsatz käuflichen hABSerums auch eine Reduktion der zugesetzen Serummenge in Erwägung gezogen. Hierzu wurden ebenfalls Vorversuche unternommen. Das hierbei angewendete Verfahren ist mit den zuvor beschrieben Vorgehensweisen identisch (3.2.4.1 und 3.2.4.2). Lediglich die verwendete Serummenge wurde reduziert. So erfolgte die Konditionierung der Makrophagen in den 24-well Kulturplatten (3.1.2) mit einem 2%igen Zusatz von autologem Serum (vgl. 3.2.4.1). Die denritischen Zellen wurden ebenfalls mit 2% autologem Serumzusatz kultiviert (vgl. 3.2.4.2). Die bei den DC verwendeten Konzentrationen der Zytokine IL-4 und GM-CSF blieben dabei unverändert (Endkonzentrationen: 1000 U/ml IL4 und 500 U/ml GM-CSF). Die verringerten Serummengen wurden durch Kulturmedium II (3.1.4) ausgeglichen. Die Entwicklung beider Zellpopulationen wurde mikroskopisch beobachtet und fotographisch dokumentiert. 3.2.4.3 Konditionierung der monozytären Zellen für die Phänotypisierung mittels FACSAnalyse Zur Kontrolle der Konditionierung sollten sowohl Makrophagen als auch DC mittels FACSAnalyse auf für sie spezifische Oberflächenmoleküle untersucht werden. Material und Methoden 52 Hierzu waren größere Zellmengen notwendig. Da die Zellen nicht für weitere Untersuchungen gebraucht werden konnten, war die Verwendung des Transwell-Systems überflüssig. Daher konnten beide Zellpopulationen in 6-well Zellkulturplatten (3.1.2) konditioniert werden. Für die Konditionierung beider Zellarten wurde die gleiche Zelldichte gewählt. Die mononuklären Zellen wurden gemäß Kap. 3.2.2 isoliert und in einer Dichte von 1,8x10 6 Zellen in 3 ml je well ausgesät. Die Makrophagen wurden wie unter Kap. 3.2.4.1 beschrieben mit 10%igem Serumzusatz zum Kulturmedium II konditioniert, wobei sowohl autologes Serum als auch hAB-Serum verwendet wurde. Die Versorgung der Kulturen mit jeweils neuem Serum an Tag 1 und Tag 4 sowie die beschriebenen Teilmediumwechsel an Tag 2 und Tag 6 wurden ebenfalls in vergleichbarem Maße durchgeführt. Die dendritischen Zellen wurden auch mit 10%igem Serumzusatz (autolog und hAB) zum Kulturmedium II gemäß dem beschriebenen Verfahren (Kap. 3.2.4.2.1) kultiviert. Die zugesetzten Mengen an IL-4 und GM-CSF wurden an das größere Kulturvolumen der 6-well Platten von 3 ml je well angepasst, so dass die Endkonzentration von 1000 U/ml rhIL-4 und 500 U/ml rhGM-CSF im Kulturmedium unverändert blieb. Auch die Zugaben an Tag 1 und Tag 4 wurden entsprechend beibehalten. Die Teilmediumwechsel wurden lediglich dahingehend modifiziert, dass die dabei entnommene Mediummenge für 10 min bei 250xg zentrifugiert wurde, um nicht adhärente Zellen wieder der Kultur zuführen zu können. Das Vorgehen wurde unter Kap. 3.2.4.2.1 bereits beschrieben. Die 6-well Zellkulturplatten wurden in Plastikschalen (3.1.2) mit locker aufliegendem Deckel bei 37°C und 5% CO2 in Luft für 6 Tage inkubiert. Material und Methoden 3.2.4.4 53 Färbung und Analyse der konditionierten Zellpopulationen mittels FACS Die Konditionierung sollte zu einer Differenzierung der isolierten Monozyten zu dendritischen Zellen bzw. Makrophagen führen. Der Erfolg dieser Konditionierung sollte durch Untersuchung auf typische Oberflächenmoleküle dieser Zellen überprüft werden. Zu diesem Zweck wurden die konditionierten Zellen mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gefärbt und mittels FACS ausgewertet. Die in 6-well Kulturplatten konditionierten Zellen (3.2.4.3) mussten zuerst geerntet werden. Das Kulturmedium wurde dazu entfernt, die Zellen mit PBS (3.1.4) gewaschen und mit 1ml Accutase (3.1.4) für 5-10 min inkubiert. Durch vorsichtiges Pipettieren wurden danach noch anhaftende Zellen vom Boden gelöst. Die Zellen wurden nach DC und Makrophagen getrennt in Falcons gepoolt und mit Kulturmedium II (3.1.4) aufgefüllt. Dabei wurden je Färberöhrchen zwei verschiedene Antikörper mit verschiedenen Farbstoffen eingesetzt (Mehrfachfärbung). Bei dem unter Kap. 3.2.3 beschriebene Verfahren wurden also pro Röhrchen zwei Antikörper zugesetzt. Eine Übersicht über die verwendeten Antikörper gibt Tabelle 1. Entsprechend wurden auch die Isotypkontrollen mit den jeweils verwendeten Farbstoffen mehrfachgefärbt. Zusätzlich wurden nach dem Herunterwaschen der Antikörperlösung noch 5 µl 7-Amino-actinomycin D (7-AAD) (3.1.4) zugesetzt. Dieser Farbstoff färbt nur tote Zellen an, da er die intakte Zellmembran einer lebenden Zelle nicht passieren kann. Er wurde für 10 min bei Raumtemperatur in den Röhrchen belassen. Danach wurden 2ml PBS hinzugegeben, die Zellen damit gut gemischt und bei 250xg für 10 min wieder herunter zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, um nicht in Zellen gebundenes 7-AAD aus den Röhrchen zu entfernen. Erst danach kam das Paraformaldehyd-haltige PBS wie beschrieben (3.2.3) hinzu, um die Zellen bis zur Analyse zu konservieren. Die Auswertung erfolgte wieder mit dem FACS-Calibur Gerät (3.1.1) und der Cell-Quest Software (3.1.8). Material und Methoden 54 Markiertes Farbstoffe, mit denen entsprechende Antikörper Oberflächenmolekül konjugiert sind CD1a Fluorescein isothiocyanat (FITC) CD14 Fluorescein isothiocyanat (FITC) CD16 Phycoerythrin (PE) CD33 Phycoerythrin (PE) CD80 Phycoerythrin (PE) CD83 Phycoerythrin (PE) CD86 Phycoerythrin (PE) HLA-DR Phycoerythrin (PE) Tab. 1: Gewählte Oberflächenmoleküle für die FACS-Analyse und dazu verwendete Fluorochrome. Die konditionierten Zellen wurden mit Antikörpern (3.1.6), die gegen die aufgelisteten Oberflächenmoleküle gerichtet sind, markiert (3.2.4.4). Diese Antikörper waren mit angeführten Fluoreszenzfarbstoffen konjugiert. Material und Methoden 55 3.2.5 Infektionsversuche im Transwell-Kultursystem 3.2.5.1 Empfänglichkeit von Makrophagen für frei verfügbare chlamydiale Partikel Um zu untersuchen, ob chlamydiale Partikel in der Lage sind, die Poren der TranswellMembran (3.1.2) zu durchdringen und danach Makrophagen zu infizieren, wurde ein Vorversuch unternommen. Die Makrophagen wurden auf Deckgläschen (3.1.2) für 6 Tage konditioniert (3.2.4.1). An Tag 7 nach Isolation wurde jedes Makrophagen-well mit einem Transwell-Membraneinsatz (3.1.2) versehen. Dieser Einsatz wurde mit 100 µl Kulturmedium II (3.1.4) inkl. 10% autologem Serum (3.2.2) versehen. In das obere Kompartiment des Einsatzes wurde eine Chlamydienpräparation gegeben (3.2.5.2). Die Menge war so bemessen, dass auf jeden Makrophagen 10 infektiöse Chlamydien kamen (MOI 10; multiplicity of infection). Danach wurden die Platten bei 35°C und 5% CO 2 in Luft inkubiert. Zur Erhöhung der Luftfeuchtigkeit wurden sie dazu in Plastikschalen (3.1.2) mit lose aufliegendem Deckel gestellt, welche zusätzlich angefeuchtete Papiertücher enthielten. Jeden Tag wurden zwei Deckgläschen geerntet und die darauf befindlichen Zellen untersucht (3.2.5.3 und 3.2.6.2). Um größere Schwankungen durch einen Mediumwechsel während des Versuchs zu vermeiden, wurde jeden Tag ein Teilmediumwechsel vorgenommen. Dabei wurde ¼ der Mediummenge eines wells (125 µl) abpipettiert und verworfen. Das fehlende Medium wurde mit Kulturmedium II ersetzt, wobei diesem Medium 5% der Gesamtmediummenge autologes Serum zugesetzt war. Somit wurden die Serumgaben und Teilmediumwechsel der Konditionierungsphase (3.2.4.1) auf einen täglichen Rhythmus umgestellt. Material und Methoden 3.2.5.2 56 Infektion der immaturen dendritischen Zellen Die isolierten mononuklären Zellen wurden für 6 Tage in serumhaltigem Medium mit rhIL-4 und rhGM-CSF konditioniert (3.2.4.2). An Tag 7 nach Isolation erfolgte die Infektion mit Chlamydophila pneumoniae (3.1.3). Pro ausgesäter DC sollten 10 infektiöse chlamydiale Partikel eingesetzt werden (MOI 10). Die Chlamydien wurden in 50 µl Aliquots bei -80°C in SafeLock Eppendorfgefäßen (3.1.2) gelagert, wobei die Zahl der infektiösen Einheiten pro Aliquot bekannt war. Entsprechende Aliquotmengen wurden der Tiefkühltruhe entnommen. Zu jedem Aliquot wurden 450 µl Kulturmedium II mit 10%igem Serumzusatz hinzupipettiert. Dabei wurde das Serum verwendet, welches auch schon für die Konditionierung der Zellen genutzt wurde(3.2.4.1 und 3.2.4.2). Die so erhaltenen Infektionssuspensionen in den SafeLock Gefäßen wurden anschließend auf einem Vortex-Gerät (3.1.1) für 15 min und maximaler Einstellung gemischt. Danach wurden alle Eppendorfgefäße in einer Tischzentrifuge (3.1.1) anzentrifugiert, um am Deckel befindliche Tropfen zu lösen. Die Gesamtzahl der infektiösen Chlamydien pro Aliquot war nun in 500 µl Infektionssuspension enthalten. Daraus wurde die für die entsprechende Anzahl dendritischer Zellen benötigte Menge zur Infektion errechnet und in die oberen Kompartimente der Transwell-Einheiten (3.1.2) pipettiert. Die Transwell-Kulturplatten wurden anschließend für 45 min bei 751xg und einer Temperatur von 35°C zentrifugiert. Danach wurden die Platten der Zentrifuge (3.1.1) entnommen und weitere 75 min bei 35°C im Brutschrank inkubiert. Anschließend erfolgte das Waschen der Einsätze mit HANKS-Lösung (3.1.4). Zu diesem Zweck wurden mehrere 24-well Kulturplatten (3.1.2) mit 600 µl HANKS je well vorbereitet, so dass jeder Einsatz hintereinander in drei unterschiedlichen wells gewaschen werden konnte. Das Infektionsmedium in den oberen Kompartimenten wurde mit einer Pipette vorsichtig abgenommen, in einem 50 ml Falcon (3.1.2) gesammelt und für 10 min bei 250xg Material und Methoden 57 zentrifugiert, um mit abpipettierte Zellen nicht zu verlieren. Die Einsätze wurden mit einer sterilen Pinzette in eines der Wasch-wells transferiert. Anschließend wurden in jeden Einsatz ca. 150 µl HANKS gegeben und die gesamte Waschplatte vorsichtig geschwenkt, um noch anhaftende Chlamydien zu entfernen. Der Überstand über den abzentrifugierten Zellen im Falcon wurde verworfen. Nun wurde das HANKS-Medium in den oberen Kompartimenten wieder entfernt und in das Falcon gegeben, welches dann erneut zentrifugiert wurde (10 min bei 250xg), um auch hier mit abpipettierte Zellen zu sedimentieren. Die Einsätze wurden in ein neues well umgesetzt und wieder mit 150 µl HANKS gefüllt. Dieser Waschvorgang wurde noch einmal wiederholt, so dass jeder Einsatz dreimal von außen und innen gewaschen wurde, um extrazelluläre Chlamydien zu entfernen. Nach dem letzten Waschvorgang wurde das HANKS-Medium aus den Einsätzen entfernt und erneut abzentrifugiert. Die nun leeren Einsätze wurden auf die 24well Platten mit den konditionierten Makrophagen übertragen und mit 50 µl Kulturmedium II inkl. 10%igem Serumzusatz gefüllt, um ein Austrocknen der Zellen zu verhindern. Nach der letzten Zentrifugation wurden die im Falcon sedimentierten Zellen mit Kulturmedium II plus 10%igem Serumszusatz resuspendiert. Die Mediummenge wurde dabei so bemessen, dass jeder Einsatz 50 µl Medium erhielt, so dass ein Kulturvolumen von 100 µl je Membraneinsatz gegeben war. Die Mediummenge im unteren Kompartiment wurde mit Kulturmedium II inkl. 10% Serumzusatz von 500 µl auf 600 µl aufgefüllt. Ein Zusatz von Zytokinen wurde nicht mehr vorgenommen, um eine Beeinflussung der nun mit kultivierten Makrophagen zu verhindern. Die Kulturplatten mit den nun kokultivierten Zellen wurden in Plastikschalen mit lose aufliegendem Deckel gestellt und bei 35°C inkubiert. Zur Erhöhung der Luftfeuchtigkeit wurden auch hier angefeuchtete Papiertücher in die Plastikschalen gegeben. Bei allen Versuchen wurde eine Platte mit Schein-infizierten (mock-infizierten) Zellen mitgeführt. Statt der Chlamydiensuspension wurde die gleiche Menge Kulturmedium II hinzugegeben und die Zellen zentrifugiert (s.o.). Das Waschen erfolgte nach beschriebenem Schema, wobei auf eine saubere Trennung der infizierten und der Scheininfizierten Einsätze geachtet wurde. Die Schein-infizierten Einsätze wurden daher in Material und Methoden 58 separaten Waschplatten versorgt und die abgenommenen Waschüberstände in einem eigenen Falcon zentrifugiert. 3.2.5.2.1 Infektion der auf Deckgläschen konditionierten DC In einigen Vorversuchen wurden dendritische Zellen nicht in Transwell-Einsätzen, sondern auf Deckgläschen in 24-well Platten konditioniert (3.2.4.2.1). Die Vorbereitung der Chlamydien und die Infektion durch Zentrifugation geschahen in vergleichbarer Weise (3.2.5.2). Allerdings wurde das Waschen der infizierten DC modifiziert. Die Zellen wurden ebenfalls mit HANKS-Lösung (3.1.4) gewaschen, das gesamte Waschmedium danach wieder entfernt und zentrifugiert (10 min bei 250xg). Dieser Vorgang wurde zweimal wiederholt, so dass auch diese DC insgesamt dreimal gewaschen wurden. Anschließend wurden die wells mit 600 µl Kulturmedium II (3.1.4) mit 10%igem Zusatz von hAB-Serum (3.1.4) aufgefüllt. Die bei diesem Versuch in Transwell-Einsätzen konditionierten Makrophagen (3.2.4.1.1) wurden danach mit ihren Einsätzen in die DC Kulturen eingehängt. 3.2.5.3 Kokultur der infizierten DC mit Makrophagen und Probenentnahme Nach der Infektion (3.2.5.2) wurden die gewaschenen Einsätze mit den infizierten DC in die Makrophagen-wells (3.2.4.1) eingehängt. Die weitere Kultur geschah mit Kulturmedium II inkl. 10% des jeweils verwendeten Serums. IL-4 und GM-CSF wurden nicht weiter zugesetzt. Um Einflüsse auf die Zellen durch den Austausch großer Mediummengen zu minimieren, wurde ein täglicher Teilmediumwechsel eingeführt. Dabei wurden täglich ¼ der Gesamtmediummenge von 700 µl einer Transwelleinheit ausgetauscht. Die so Material und Methoden 59 entfernten 175 µl Medium wurden verworfen. Die fehlende Menge wurde durch neues Kulturmedium II ersetzt. Die dabei zugesetzte Menge des jeweils verwendeten Serums betrug 5% der Gesamtmediummenge einer Transwell-Einheit von 700 µl. Aus dieser Kultur wurden für den Zeitraum von sieben Tagen jeden Tag Proben entnommen. Zuerst wurden dazu die entsprechenden Einsätze auf eine leere 24-well Platte transferiert. Aus zu färbenden Einsätzen wurde das Kulturmedium entfernt und die Zellen direkt mit -20°C kaltem Methanol fixiert. Für die Färbung von Deckgläschen mit den Makrophagen wurden diese mit einer desinfizierten Präpariernadel und einer desinfizierten Pinzette entnommen und auf ein Filterpapier gelegt. Darauf wurde dann sofort -20°C kaltes Methanol pipettiert, um die Makrophagen zu fixieren. Sowohl die Einsätze als auch die Deckgläschen wurden nach dem Trocknen bei 4°C im Kühlraum gelagert. Zellüberstände und Lysate der DC wurden ebenfalls aus den Einsätzen gewonnen. Das Medium der separierten Einsätze wurde in ein SafeLock Eppendorf-Gefäß (3.1.2) pipettiert und für 10 min bei 300xg und einer Temperatur von 4°C zentrifugiert. Die Zellen auf der Membran des Einsatzes wurden mit 200 µl Kulturmedium II versehen und mit einer Pipettenspitze abgeschabt. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand in ein neues Eppendorf-Gefäß überführt und das Medium mit den gelösten Zellen aus dem Einsatz in das zentrifugierte Eppendorf-Gefäß gegeben. So wurde der zellfreie Überstand vom Gesamtlysat der DC getrennt. Überstände und Lysate der Makrophagen wurden aus weiteren wells gewonnen. Hierzu wurde ebenfalls zuerst das Kulturmedium in ein SafeLock Eppendorf-Gefäß gegeben und für 10 min bei 300xg und 4°C zentrifugiert. In die wells wurden 400 µl Kulturmedium II pipettiert und die auf dem Deckgläschen wachsenden Makrophagen mit einem Gummischaber (3.1.2) abgelöst. Der Überstand aus dem Eppendorf-Gefäß wurde in ein neues Gefäß gefüllt und das Zelllysat aus dem well zu dem abzentrifugierten Pellet gegeben. Überstände und Lysate beider Zellpopulationen wurden zunächst für 30 min auf Eis gelagert und dann bei -80°C eingefroren. Das beschriebene Vorgehen fand auch bei den Schein-infizierten Kokulturen in gleicher Weise Verwendung. Material und Methoden 60 3.2.5.3.1 Kokultur und Probennahme bei geänderter Position der Zellpopulationen In Vorversuchen wurden DC auf Deckgläschen konditioniert (3.2.4.2.1) und infiziert (3.2.5.2.1). Die kokultivierten Makrophagen befanden sich dabei auf der Membran der Transwell-Einsätze (3.1.2) oberhalb der DC. Da hier nur die Möglichkeit einer Infektionsübertragung von unten gegen die Schwerkraft nach oben überprüft werden sollte, wurde auf die Abnahme von Überständen und Lysaten verzichtet. Es wurden lediglich Einsätze und Deckgläschen zur Anfärbung der Chlamydien und der Zellen gesammelt. Das Vorgehen entsprach dabei dem unter Kap. 3.2.5.3 beschriebenen Prozedere. Auch hier wurden die Einsätze entnommen, das Medium entfernt und die in diesem Fall darauf befindlichen Makrophagen mit -20°C kaltem Methanol fixiert. Die Deckgläschen mit den infizierten DC wurden wie beschrieben auf Filterpapier gelegt und ebenfalls mit kaltem Methanol fixiert. Auch diese Präparate lagerten nach dem Trocknen bis zur Färbung bei 4°C im Kühlraum. Material und Methoden 61 3.2.6 Färbung der Präparate aus den Infektionsversuchen zum Nachweis von Chlamydophila pneumoniae 3.2.6.1 Immunhistochemischer Nachweis von Chlamydophila pneumoniae Sowohl die Präparate aus den Vorversuchen (3.2.5.3.1) als auch aus den späteren Kokulturexperimenten (3.2.5.3) sollten auf das Vorhandensein von Chlp. pneumoniae sowohl in den primär infizierten DC als auch in den kokultivierten Makrophagen hin untersucht werden. Da eine Auswertung mittels Fluoreszenzmikroskopie durch die Eigenfluoreszenz der Transwell-Membran nicht möglich war, wurde hierfür ein immunhistochemischer Nachweis mittels Peroxidase-Reaktion genutzt. Sowohl die Deckgläschen als auch die Membranen in den Einsätzen wurden zu Beginn der Färbung mit Färbe-PBS (3.1.4) gewaschen. Die Deckgläschen wurden dazu mit einer Pinzette ergriffen und in eine Glasküvette mit dem PBS getaucht, die Membranen wurden durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren des PBS gewaschen. Anschließend wurden auf jedes Deckgläschen und in jeden Einsatz 1-2 Tropfen DAKO Peroxidase Block (3.1.4) gegeben, um endogen vorhandene Peroxidasen zu inaktivieren. Danach wurden sowohl die Einsätze als auch die Deckgläschen mit jeweils 30 µl Blockierungspuffer (Pferdeserum und Färbe-PBS im Verhältnis 1:1) (3.1.4) versehen und in einer feuchten Kammer für 30 min bei Raumtemperatur gelagert. Dieser Schritt sollte freie Bindungsstellen blockieren, um eine unspezifische Anfärbung durch den primären Antikörper zu verhindern. Anschließend wurde das Blockierungsmedium aus den Einsätzen abpipettiert und von den Deckgläschen einfach ablaufen gelassen. Nun wurden 30 µl je Präparat der primären Antikörperlösung hinzugegeben. Diese bestand aus einem FITC-markierten monoklonalen Antikörper, der gegen das MOMP von Chlp. pneumoniae gerichtet ist (3.1.5), und FärbePBS im Verhältnis 1:50. Die Präparate wurden 30 min bei 37°C in einer feuchten Kammer inkubiert. Nach dieser Zeit wurde die Färbelösung abgeklopft oder abpipettiert und jedes Material und Methoden 62 Präparat dreimal mit Färbe-PBS gewaschen. Im Anschluss wurde je 1 Tropfen DAKO EnVision+ (3.1.5) pro Präparat aufgetragen. Dabei handelt es sich um Peroxidasegekoppelte Antikörper der Ziege, die gegen Maus- oder Kaninchen-Antikörper gerichtet sind. Somit markieren diese Peroxidase-gekoppelten Antikörper den primären Antikörper. Das EnVision+ Reagenz wurde 30 min auf den Präparaten belassen (Raumtemperatur und feuchte Kammer). Hieran schloss sich erneut ein dreimaliges Waschen der Präparate in Färbe-PBS an. Im nächsten Färbeschritt wurde jedes Präparat mit einem Tropfen DAKO AEC+ (AEC: 3-Amino-9-Ethylkarbazol) (3.1.4) versehen und weitere 30 min bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer inkubiert. Schließlich wurde das AEC wieder durch dreimaliges Waschen entfernt. Zur Gegenfärbung der Zellkerne wurde jedes Präparat noch für 30 Sekunden in Hämatoxylin (3.1.4) getaucht und anschließend gründlich gewaschen. Die Präparate wurden an der Luft getrocknet. Glasobjektträger (3.1.2) wurden mit einem Tropfen Mounting-Fluid (3.1.4) versehen und die Deckgläschen mit der gefärbten Seite auf diesen Tropfen aufgelegt. Luftblasen wurden durch sanften Druck entfernt und das Präparat mit Corbit-Balsam (3.1.4) umrundet. Zur Darstellung der Membranen mussten diese zunächst aus den Einsätzen entfernt werden. Zu diesem Zweck wurden die Membranen mit einer Skalpellklinge vorsichtig vom Einsatz gelöst und angehoben. Danach wurden auch sie mit der gefärbten Seite auf einen Objektträger mit Mounting-Fluid aufgebracht. Auf die Membran wurde danach ein weiterer Tropfen Mounting-Fluid gegeben und das Präparat durch ein eckiges Glasdeckgläschen abgeschlossen. Dieses wurde ebenfalls mit Corbit-Balsam umrundet. Die mikroskopische Auswertung erfolgte dann bei normalem Weißlicht. Bei jeder Färbung wurden eine Positivkontrolle mit infizierten HEp-2 Zellen und eine Negativkontrolle (Medium statt primärem Antikörper) mitgeführt. Material und Methoden 3.2.6.2 63 Immunfluoreszenzfärbung kokultivierter Makrophagen zum Nachweis von Chlamydophila pneumoniae Das immunhistochemische Färbeverfahren unter Kap. 3.2.6.1 benutzte einen sekundären Antikörper und eine enzymatische Reaktion für den Nachweis chlamydialer Partikel. Um eine möglichst direkte Anfärbung zu erhalten, wurden auf Deckgläschen kultivierte Makrophagen zusätzlich noch einer Immunfluoreszenzfärbung mit einem primär markierten Antikörper unterzogen. Einige der unter Kap. 3.2.5.3 beschriebenen Makrophagenpräparate wurden zu diesem Zweck in Färbe-PBS vorsichtig gewaschen. Danach wurde jedes Präparat mit 30µl Blockierungspuffer (Pferdeserum und Färbe-PBS im Verhältnis 1:1) (3.1.4) bedeckt und für 30 min bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer gelagert. Der Blockierungspuffer wurde danach vorsichtig abgeklopft und jedes Deckgläschen mit 30 µl der primären Antikörperlösung versehen. Hier wurde ebenfalls der FITC-markierte antiMOMP Antikörper (3.1.5) verwendet. Dieser wurde im Verhältnis 1:50 verdünnt eingesetzt. Die restliche Färbelösung bestand aus Färbe-PBS (3.1.4) und EvansblauGebrauchslösung (3.1.4) im Verhältnis 1:1. Der Antikörper wurde 30 min bei 37°C auf den Präparaten belassen. Diese wurden in einer dunklen, feuchten Kammer gelagert, um ein Ausbleichen des Fluorophors zu verhindern. Nach diesem Färbeschritt wurden die Deckgläschen dreimal in Färbe-PBS gewaschen und an der Luft getrocknet. Zuletzt wurden sie mit der gefärbten Seite auf Objektträger mit einem Tropfen Mounting-Fluid (3.1.4) aufgebracht, mit Corbit-Balsam (3.1.4) umrundet und im Fluoreszenzmikroskop ausgewertet. Bei jeder Färbung wurden eine Positivkontrolle mit infizierten HEp-2 Zellen und eine Negativkontrolle (Medium statt primärem Antikörper) mitgeführt. Material und Methoden 64 3.2.7 Bestimmung der Zahl infektiöser Chlamydien aus den Überständen und Lysaten im HEp-2 Infektiositätstest Da sich Chlamydophila pneumoniae in HEp-2 Zellen am besten anzüchten lässt, wurden Überstände und Lysate aus den Kokulturen auf HEp-2 Zellen inkubiert, um die Zahl der darin enthaltenen infektiösen Chlamydien bestimmen zu können. Zu diesem Zweck wurden kultivierte HEp-2 Zellen (3.2.1) in 96-well Mikrotiterplatten (3.1.2) ausgesät. Dazu wurde der HEp-2 Monolayer von Medium befreit, mit PBS gewaschen und die Zellen mit Trypsin/EDTA gelöst (3.2.1). Die so erhaltene Zellsuspension wurde in einem 50 ml Falcon gesammelt, für 10 min bei 250xg zentrifugiert und der Überstand danach verworfen. Das Zellpellet wurde mit 5 ml Kulturmedium I resuspendiert und das Volumen auf 40 ml aufgefüllt. Davon wurden 10 µl mit 10 µl Trypanblau (3.1.4) vermischt und die vitalen Zellen in einer Neubauer-Zählkammer ausgezählt. Die Gesamtzahl ergab sich aus der unter Kap. 3.2.2 beschriebenen Formel: (Zahl vitaler Zellen/0,4) * 2 * 1000 * 40 Pro Mikrotiterwell wurden 3x104 HEp-2 Zellen in je 200 µl Medium benötigt. Die entsprechende Menge Zellsuspension wurde daher entnommen, erneut für 10 min bei 250xg zentrifugiert und das Pellet in der benötigten Menge Kulturmedium I (3.1.4) resuspendiert. Pro well wurden dann die Zellen in 200 µl ausgebracht, wobei die äußeren wells einer Platte mit PBS gefüllt wurden, um eine feuchte Atmosphäre zu schaffen. Die Kulturen wurden danach bei 37°C über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag wurde die Bildung eines Monolayers in den wells mikroskopisch kontrolliert. Daran schloss sich die Aufbereitung der zu überprüfenden Proben an. Die Eppendorf-Gefäße mit den Überständen und Lysaten (3.2.5.3) wurden aus der Tiefkühltruhe entnommen und aufgetaut. Danach wurden alle Eppendorfgefäße für 7 min auf dem Vortex gemischt. Anschließend erfolgte eine Lysierung evtl. noch vorhandener Material und Methoden 65 Zellbestandteile im mit Wasser gefüllten Ultraschallbad (3.1.1) für 2 min, um möglichst alle chlamydialen Partikel frei verfügbar zu machen. Erneut wurden die Proben auf dem Vortex gemischt und anschließend in einer Tischzentrifuge anzentrifugiert, um Tropfen im Deckel zu lösen. Das Kulturmedium in den Mikrotiterplatten wurde komplett entfernt. Die Proben wurden dann mit einer 200 µl Pipette durch Auf- und Abpipettieren vorsichtig gemischt und zwei HEp-2 wells je Probe mit 50 µl Probenvolumen beimpft. So wurde für jeden Überstand und jedes Lysat ein Doppelwert bestimmt. Zwei wells wurden als Positivkontrolle zusätzlich mit einer Chlamydienpräparation versehen, zwei weitere wells erhielten keine Proben sondern nur Kulturmedium I und dienten als Negativkontrolle. Die so präparierten Mikrotiterplatten wurden für eine Stunde bei 1700xg und 35°C zentrifugiert und anschließend eine weitere Stunde bei 35°C im Brutschrank inkubiert. Nun wurde jedes well mit weiteren 150 µl Kulturmedium I aufgefüllt. Dabei wurden dem Medium Cycloheximid (3.1.4) zugesetzt, um eine Konzentration von 1 µg Cycloheximid pro Milliliter Medium in den wells zu erreichen. Die Platten wurden in Plastikschalen mit locker aufliegendem Deckel gestellt und für 72 Stunden bei 35°C bebrütet. Nach 72 Stunden erfolgte die Färbung. Das Medium über den infizierten HEp-2 Zellen wurde entfernt und verworfen. Alle wells wurden mit 200 µl Färbe-PBS (3.1.4) gewaschen und anschließend die Zellen mit 200 µl kaltem Methanol (3.1.4) für 10 min bei -20°C fixiert. Nach Entfernen des Methanol schloss sich ein weiterer Waschschritt mit 200 µl FärbePBS je well an. Danach wurden je well 35 µl der Färbelösung auf die Zellen pipettiert, wobei auf eine vollständige Bedeckung des Monolayers geachtet wurde. Die Färbelösung bestand aus Färbe-PBS und Evansblau Gebrauchslösung (3.1.4) im Verhältnis 1:1 und dem FITC-markierten monoklonalen anti-MOMP Antikörper (3.1.5), der im Verhältnis 1:50 an der Gesamtmenge zugesetzt wurde. Die Platten wurden in einer feuchten Kammer bei 37°C für 30 min unter Lichtausschluss inkubiert. Schließlich wurde die Färbelösung entfernt und jedes well dreimal mit Färbe-PBS gewaschen, getrocknet und danach mit einem Tropfen Mounting-Fluid (3.1.4) versehen. Die mikroskopische Auswertung erfolgte dann mit einem Fluoreszenzmikroskop bei Wellenlängen von 490 nm Material und Methoden 66 (FITC) und 550 nm (Evansblau), wobei die apfelgrün gefärbten chlamydialen Einschlüsse in jedem well ausgezählt wurden. Die Zellen waren mit dem Evansblau rot gegengefärbt. Die Anzahl ausgezählter Inklusionen pro well wurde auf 1 ml hochgerechnet. So ergab sich die Einheit IFU/ml (IFU: inclusion forming units). 3.2.8 Untersuchungen zur chlamydialen Genexpression Neben dem Nachweis chlamydialer Partikel mittels Färbung sollten auch Untersuchungen zur Genexpression durchgeführt werden, um sowohl die Stoffwechselaktivität der Chlamydien nachzuweisen als auch evtl. unterschiedliche Entwicklungsformen charakterisieren zu können. Die kulturellen Bedingungen wurden aus den Infektionsversuchen (3.2.5) abgeleitet. 3.2.8.1 Konditionierung, Infektion und Kokultur der Zellen für die Genexpressionsanalyse Wie für die Infektionsversuche beschrieben wurden die benötigten Zellen aus Buffy Coats klinisch gesunder Spender isoliert (3.2.2). Allerdings war der Bedarf an Zellen für die Untersuchungen zur Genexpression wesentlich höher als bei den Infektionsversuchen, weshalb auf ein größeres Transwell-System mit 6-well Platten (3.1.2) umgestellt werden musste. Dabei handelte es sich jedoch um den gleichen Aufbau, auch das Material und die Porengröße der Membran waren identisch zu den Transwell-Einheiten der Infektionsversuche (3.2.4.2). Lediglich das Kulturraumvolumen war mit insgesamt 4,1 ml (2,6 ml für das untere Kompartiment, 1,5 ml für das obere Kompartiment) größer. Die unter Material und Methoden 67 Kap. 3.2.4.1 beschriebenen Konzentrationen der beiden verwendeten Seren (autolog und hAB) blieben mit 10% am Gesamtkulturmedium ebenso unverändert wie die Konzentrationen der für die Konditionierung der DC benutzten Zytokine IL-4 und GM-CSF (3.2.4.2). Auch die zweitägigen Zugaben von Serum und Zytokinen sowie die Teilmediumwechsel wurden nicht geändert. Die Infektion der DC und der anschließende Waschvorgang wurden nach identischem Vorgehen durchgeführt (3.2.5.2). Die Einsätze mit den infizierten DC wurden nach erfolgtem Waschen auf die konditionierten Makrophagen in den 6-well Platten gegeben. 3.2.8.2 Entnahme der Proben aus der Kokultur für die Genexpressionsanalyse An Tag 1, Tag 3 und Tag 5 nach Infektion der DC wurden die Proben entnommen. Zunächst wurden die Transwell-Einsätze auf eine leere Kulturplatte transferiert. Sowohl aus den Einsätzen (infizierte DC) als auch aus den wells (kokultivierte Makrophagen) wurde je eine Sammelprobe des Kulturüberstandes von 120 µl Volumen in einem SafeLock-Eppendorfgefäß (3.1.2) gepoolt und bei 300xg für 10 min und einer Temperatur von 4°C zentrifugiert. Die so gewonnenen Überstände wurden in neue SafeLockEppendorfgefäße überführt, für 30 min auf Eis inkubiert und danach bei -80°C eingefroren. Die restlichen Überstände aus den wells und den Einsätzen wurden getrennt nach Zelltyp in 50 ml Falcons gesammelt. Danach wurden sowohl die Kulturwells als auch die Membraneinsätze mit je 1 ml Kulturmedium II (3.1.4) versehen und die Zellen mit einem Gummischaber vom Untergrund abgelöst. Von den so erhaltenen Makrophagen- und DCLysaten wurde jeweils eine Sammelprobe von 120 µl Volumen entnommen und in die zuvor zur Zentrifugation benutzten Eppendorfgefäße gegeben. Diese Lysatproben wurden ebenfalls für 30 min auf Eis gelagert und danach bei -80°C eingefroren. Die verbliebenen Lysatmengen wurden zu den entsprechenden bereits gesammelten Kulturüberständen Material und Methoden 68 pipettiert. Die Falcons wurden für 10 min bei 250xg zentrifugiert, um die Gesamtlysate der Makrophagen und der DC am Boden der Falcons zu sedimentieren. Die Überstände wurden verworfen und die beiden Zellpellets der Aufreinigung zur Isolation der DNA und RNA zugeführt (3.2.8.3). Die eingefrorenen Sammelproben der Überstände und Lysate wurden im HEp-2 Infektiositätstest (3.2.7) auf das Vorhandensein infektiöser Chlamydien überprüft. 3.2.8.3 Aufreinigung der Lysate und Isolation der chlamydialen DNA und RNA Die weitere Bearbeitung der Proben wurde mit dem NucleoSpin® RNA II Kit (3.1.7) und dem NucleoSpin® RNA/DNA Puffer Set (3.1.7) der Firma Macherey-Nagel vorgenommen. Das Vorgehen richtete sich nach den zugehörigen Protokollen und wird hier kurz wiedergegeben. Zuerst wurde das Zellpellet mit 350 µl Puffer RA 1 und 3,5 µl Mercaptoethanol auf dem Vortex gut gemischt. Jede Probe wurde danach durch mehrmaliges Aufziehen durch eine sterile 0,9 mm Kanüle homogenisiert und auf eine NucleoSpin® Filtereinheit (Bestandteil des RNA II Kits, 3.1.7) aufgetragen. Bei 11.000xg wurde die Probe 1 min lang zentrifugiert und befand sich danach im Sammelgefäß unterhalb der Filtereinheit. Zu der Probe wurden 350 µl Ethanol 70%ig (3.1.4) gegeben und gut gemischt. Die Probe mit dem Ethanol wurde auf eine Säule gegeben und 30 Sekunden bei 800xg zentrifugiert. Die Säule wurde danach in ein neues Sammelgefäß überführt. An dieser Stelle wurde das NucleoSpin® RNA II Protokoll unterbrochen und mit der Isolation der DNA fortgefahren. Hierzu wurden die Säulen zweimal mit 500 µl DNA wash für 1 min bei 11.000xg gewaschen. Das Eluat wurde verworfen, die Säulen in ein neues Sammelgefäß überführt und 3 min getrocknet. Anschließend wurden 100 µl DNA elute auf die Säule pipettiert, 5 min inkubiert und die DNA danach bei 11.000xg für 1 min mit der elute-Lösung isoliert. Die Säule wurde wieder in ein frisches Sammelgefäß überführt und die DNA sofort bei -80°C eingefroren. Nicht isolierte DNA wurde Material und Methoden 69 anschließend mit der im Kit enthaltenen DNase auf der Säule verdaut (15 min bei Raumtemperatur). Die Säule wurde noch dreimal mit verschiedenen Puffern gewaschen und die RNA danach mit 100 µl RNase-freiem Wasser (Bestandteil des Kits) von der Säule eluiert. Auch die RNA-Proben wurden sofort bei -80°C eingefroren. 3.2.8.4 Messung der Menge isolierter chlamydialer DNA und RNA über die Bestimmung der optischen Dichte der Proben Für die nachfolgenden Schritte war es wichtig, besonders die Menge der isolierten chlamydialen RNA zu kennen. Dies geschah über die Messung der optischen Dichte (ODWert) der Proben. Auch der Gehalt an DNA wurde mit diesem Verfahren mitbestimmt. Die bei der Isolation gewonnenen Proben lagen jeweils in einem Volumen von 100 µl vor (3.2.8.3). Sowohl die DNA als auch die RNA Proben wurden aufgetaut und jeweils 5 µl der Probe entnommen. Die DNA- und RNA-Proben wurden danach sofort wieder eingefroren. Die entnommenen 5 µl wurden mit 95 µl RNase-freiem Wasser auf ein Verhältnis von 1:20 verdünnt. Die optische Dichte dieser Verdünnung wurde dann in einem Photometer bei einer Wellenlänge von 260nm bestimmt. Für die Konzentrationsberechnung musste dieser Wert in folgender Formel eingesetzt werden: Konz. Nukleinsäure[µg/ml] = Wert OD260 * Verdünnungsfaktor * Nukleinsäurenkonstante Für die RNA ergab sich somit die Formel: Konz. RNA[µg/ml] = Wert OD260 * 20 * 40 Material und Methoden 70 Die Konzentration an DNA wurde ebenso ermittelt, wobei die Nukleinsäurenkonstante für doppelsträngige DNA 50 beträgt. Die erhaltenen Werte wurden noch durch 1000 dividiert, um die Menge an DNA bzw. RNA pro µl zu erhalten. Die berechneten Konzentrationen wurden dokumentiert. 3.2.8.5 DNA-Verdau in den aufgereinigten RNA-Proben Da die weiteren Untersuchungsschritte durch Reste chlamydialer DNA in den RNA-Proben verfälscht worden wären und nach der Aufreinigung eine absolute Freiheit der isolierten RNA von DNA nicht gewährleistet war, wurde zusätzlich noch ein Verdau der DNA angestrebt. Dieser erfolgte nach dem Protokoll der RQ1 RNase-freien DNase (3.1.7) der Firma Promega. Das Enzym DNase verdaut dabei sowohl doppelsträngige als auch einzelsträngige DNA. Die RNA-Proben wurden aufgetaut und aliquotiert. In der Zwischenzeit wurden die RQ1Reagenzien aufgetaut. Je µg RNA wurden 1 µl Reaction Buffer und 1 µl der RNase-freien DNase (1 U/µl) in die Aliquots gegeben. Mit RNase freiem Wasser (3.1.4) wurden die Proben auf ein Volumen von 10 µl aufgefüllt und für 30 min bei 37°C in einem Thermocycler (3.1.1) inkubiert. Danach wurde je Aliquot 1 µl der Stop Solution hinzugeben um die Reaktion abzubrechen. Das Enzym selbst wurde anschließend bei 65° für 10 min im Thermocycler inaktiviert. Die meisten Proben wurden danach mittels reverser Transkription in DNA umgeschrieben (3.2.8.6). Einige Aliquots wurden allerdings ohne Umschreibung wieder bei -80°C eingefroren. Die sollten später auf Reste chlamydialer DNA mittels Taqman untersucht werden, um den erfolgreichen DNA-Verdau zu bestätigen (3.2.8.7.2). Material und Methoden 3.2.8.6 71 Umschreibung der isolierten RNA in DNA mittels reverser Transkription Die später verwendete Reaktion zum quantitativen Nachweis der chlamydialen Nukleinsäuren ist nicht in der Lage, einzelsträngige RNA nachzuweisen. Nur DNA kann mit dieser Methode analysiert werden. Daher musste die isolierte RNA in DNA umgeschrieben werden. Dieser Vorgang wird als reverse Transkription bezeichnet. Als Endprodukt erhält man komplementäre DNA, kurz cDNA (complementary DNA). Die Umschreibung wurde mit dem Reverse Transcription Core Kit der Firma Eurogentec (3.1.7) durchgeführt. Dazu wurden RNase-freie 0,5 ml Eppendorfgefäße (3.1.2) beschriftet. Pro Gefäß wurde RNase-freies Wasser (3.1.4) vorgelegt. Die Menge wurde so berechnet, dass sie zusammen mit dem Probenvolumen von 0,6 µg RNA die Menge von 12,15 µl nicht überstieg. Zu dem Wasser wurde der aus den Kit-Komponenten hergestellte Master Mix pipettiert. Die Einzelkomponenten sind in Tab. 2 dargstellt: Komponenten Menge in µl für 0,6 µg RNA 10x Reaction Buffer 3 25mM MgCl2 Lösung 6 2,5mM dNTP Lösung 6 Random Nonamer 1,5 RNase Inhibitor 0,6 EuroScript Reverse Transcriptase 0,75 Tab. 2: Zusammensetzung des Reverse Transcription Core Kit Master Mix für die reverse Transkription. Die angegebenen Volumina beziehen sich auf einen Ansatz mit 0,6 µg RNA. Dieser Master Mix enthielt das Enzym Reverse Transkriptase und die zur Herstellung eines DNA-Doppelstrangs benötigten Basen. Nun wurden je Eppendorfgefäß 0,6 µg RNA in dem entsprechenden Volumen Probe hinzugegeben. Das Gefäße wurde verschlossen und der Inhalt durch vorsichtiges Material und Methoden 72 Schnippen mit dem Finger durchmischt. Anschließend wurden alle Eppendorfgefäße für 10 Sekunden anzentrifugiert, um die gesamte Lösung im unteren Teil zu sammeln. Die Transkriptionsreaktion wurde in einem Thermocylcer (3.1.1) bei 48°C für 30 min durchgeführt, an die sich die Inaktivierung des Enzyms bei 95°C für 5 min anschloss, um die Reaktion zu beenden. Nach dem Abkühlen der Aliquots wurden diese bis zur weiteren Analyse wieder bei -80°C eingefroren. 3.2.8.7 Quantitativer Nachweis chlamydialer DNA und cDNA im TaqMan-System 3.2.8.7.1 Theoretischer Hintergrund Die TaqMan Methode stellt eine erweiterte PCR-Reaktion dar. Bei einer normalen PCR wird ein DNA-Doppelstrang durch Temperaturerhöhung in Einzelstränge geteilt. Durch leichtes Abkühlen lagern sich an diese Einzelstränge an spezifischen Stellen komplementäre Primer an. An diese Primer wiederum bindet das Enzym Polymerase, welches dann von den Primern ausgehend die beiden Einzelstränge mit komplementären Basen zu zwei Doppelsträngen ergänzt. Diese beiden neuen Stränge werden durch erneutes Erhitzen wieder getrennt, die Reaktion wiederholt sich. Somit kommt es bei jedem Zyklus zu einer Verdopplung der durch die Primer vorgegebenen DNA-Abschnitte. Bei der TaqMan Methode wird diese Reaktion durch eine spezifische Sonde ergänzt. Diese Sonde bindet an die von den Primern flankierten Einzelstränge der DNA. Die Sonde ist mit zwei unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Die Anregung des ersten Fluorophors führt zur Emission von Licht einer definierten Wellenlänge, welches das zweite Fluorophor anregt. Somit überwiegt die Emission dieses zweiten Farbstoffs. Bei der Polymerisation stößt nun die Taq-Polymerase an diese Sonde. Dadurch wird eine Exonuklease der Polymerase aktiviert, welche die Sonde degradiert. Durch diesen Material und Methoden 73 Abbauprozess trennen sich die beiden Fluoreszenzfarbstoffe räumlich voneinander. Die Emission des ersten Fluorophors regt nun nicht mehr das zweite an, sondern wird separat detektiert. Nach Degradierung der Sonde wird die Polymerisation ungestört beendet. So werden bis zu 40 Zyklen durchlaufen. Dabei misst das Gerät die Verschiebung im Emissionspektrum jeder Probe. Je mehr DNA in der Ursprungsprobe vorhanden ist, desto früher kommt es zur Anreicherung so vieler PCR-Produkte, dass die Verschiebung des Emissionsspektrums signifikant wird. Somit ist also eine quantitative Messung der Ausgangsmenge an DNA in jeder Probe in Echtzeit möglich. 3.2.8.7.2 Durchführung der quantitativen real-time PCR im TaqMan-System Mit Hilfe der quantitativen real-time PCR sollten die Mengen chlamydialer DNA und in cDNA umgeschriebener RNA aus den Infektionsversuchen bestimmt werden. Dadurch sollte die Expression chlamydialer Gene quantifiziert werden. Folgende Zielgene wurden daher in den Proben der direkt infizierten DC sowie der kokultivierten Makrophagen von Tag 1, Tag 3 und Tag 5 nach Infektion untersucht: Gen Funktion kodiert für die 16S-Untereinheit der chlamydialen Ribosomen; Nachweis 16S rRNA stoffwechselaktiver Erreger und Bezugsgröße für die Expression anderer Gene euo groEL ompA kodiert für ein Enzym, welches die Dekondensation des chlamydialen Erbguts zu Beginn des Entwicklungszyklus einleitet kodiert für ein chlamydiales Hitzeschockprotein mit Chaperon-Funktion kodiert für das chlamydiale Hauptmembranprotein MOMP Material und Methoden 74 Da bei Bakterien keine Introns in der DNA vorhanden sind, entspricht die mRNA der DNA. Somit ist auch die aus RNA gewonnene cDNA mit der DNA identisch. Daher konnten dieselben Sonden für die 16S DNA als auch für die 16S rRNA genutzt werden. Die für die jeweiligen Gene spezifischen Sonden wurden zusammen mit dem qPCR® Core Kit (3.1.7) der Firma Eurogentec eingesetzt. Für die Gene euo, groEL und ompA lagen die Sonden zusammen mit den Primern in einer fertigen Mischung vor, für das 16S Gen (DNA und cDNA) wurden sie einzeln hinzugegeben. Aliquots der DNA- und RNA-Proben wurden aufgetaut und 1:10 mit nukleasefreiem Wasser verdünnt. Dann wurden die 96-well PCR Platten (3.1.2) mit dem zuvor angesetzten Master Mix versehen. Dieser bestand aus folgenden Komponenten: Für den Nachweis der 16S DNA bzw. cDNA Komponenten eingesetztes Volumen in µl je Probe Eurogentec Core Mix 6,125 Primer forward (20 µM) 0,75 (15 pmol) Primer reverse (10 µM) 0,75 (7,5 pmol) Sonde 16S C.p. (5 µM) 1 (5 pmol) nukleasefreies Wasser 6,375 Für den Nachweis der cDNA der anderen Gene Komponenten eingesetztes Volumen in µl je Probe Eurogentec Core Mix 6,125 Sonde/Primer Mix. 1,25 nukleasefreies Wasser 7,625 Material und Methoden 75 Zu diesem Master Mix wurden jeweils 10 µl der mit Wasser verdünnten Proben hinzugegeben. Je Probe wurden 3 Ansätze bestimmt. Zusätzlich wurden mit dem gleichen Verfahren auch nicht umgeschriebene RNA-Proben nach DNA-Verdau (3.2.8.5) untersucht. Da die Sonden nur DNA bzw. cDNA nachweisen können, diente eine negative TaqMan-Reaktion als Nachweis eines erfolgreichen vollständigen Abbaus chlamydialer DNA in den RNA-Proben. Die so präparierten 96-well PCR-Platten wurden mit Folie abgeklebt und in einer Zentrifuge mit Platteneinsatz kurz anzentrifugiert, um alle Reaktionskomponenten am Boden der wells zu sammeln. Die Platte wurde schließlich in einem ABI Prism Sequence Detector (3.1.1) positioniert und die Reaktion gestartet: Profil Zeit und Temperatur Aufwärmphase 2 min; 50°C 1. Zyklus. 10 min; 95°C (aktiviert die Taq-Polymerase) 40 Zyklen 15 sec; 95°C (trennt die DNA-Doppelstränge) 1 min; 60°C (Binden der Primer und Polymeraseaktivität) Die gemessenen Daten wurden durch das Gerät selbst aufgezeichnet und mit der beiliegenden Software ausgewertet. Für eine korrekte Auswertung der gemessenen Daten mussten zusätzlich Standardkurven für jede Primer/Sonde-Kombination erstellt werden. Dafür wurden aus einer Chlamydienpräparation Verdünnungsstufen hergestellt und analog zu den Proben aus den Infektionsversuchen aufgereinigt (3.2.8.3). Die extrahierte RNA wurde ebenso einem DNAVerdau (3.2.8.5) unterzogen, umgeschrieben (3.2.8.6) und der Analyse im TaqMan zugeführt. Durch die bekannten Verdünnungsstufen war es mit der Software möglich, Material und Methoden 76 Standardkurven für die Auswertung der eigentlich zu bestimmenden Proben zu erstellen. Ebenso konnte die Effizienz der Sonden ermittelt werden. 3.2.8.7.3 Auswertung der im TaqMan-System ermittelten Daten Wie unter Kap. 3.2.8.7.1 beschrieben, misst das Gerät in jeder Probe die emittierte Lichtstrahlung. Der Zeitpunkt, bei dem es zu einer signifikanten Verschiebung im Emissionsspektrum kommt, wird als CT-Wert (cycle of treshhold-Wert) gespeichert. Er gibt die Anzahl der PCR-Zyklen an, die nötig waren, um genügend Amplifikat für die detektierte Verschiebung im Emissionsspektrum zu erhalten. Je kleiner also der CT-Wert ist, desto weniger Zyklen waren für die Amplifikation nötig, umso größer war also die Ursprungsmenge an DNA in der Probe. Für jede Probe wird also ein solcher CT-Wert protokolliert und ausgegeben. Da jede Probe dreifach bestimmt wurde, ergaben sich drei CT-Werte, die zu einem Mittelwert zusammengerechnet werden konnten. Die so erhaltenen Messwerte wurden danach mathematisch korrigiert. Bei einer idealen PCR-Reaktion kommt es zu einer Verdopplung des Amplifikats pro Zyklus. In Realität wird dieser Faktor aber oft nicht erreicht, die Effizienz liegt also nicht bei 100%. Die für die TaqMan-Reaktion verwendeten Sonden und Primer wiesen zwar alle eine ähnliche Effizienz auf, allerdings wurde für die Vergleichbarkeit der Daten eine Effizienzkorrektur durchgeführt. Dabei werden die einzelnen Effizienzen auf den idealen Wert von 100% korrigiert. Dadurch werden die CT-Werte der Proben, die mit unterschiedlichen Sonden untersucht wurden, ebenfalls korrigiert und sind so direkt vergleichbar. Zu diesem Zweck wurde zuerst die Effizienz jeder Sonde und ihrer Primer mittels der Standardkurven ermittelt. Material und Methoden 77 Der Betrag der Kurvensteigung floss dabei in folgende Formel ein: CT korrigiert = (CT * ln(10)) / (|slope| * ln(2)) CT korrigiert korrigierter CT-Wert ln: natürlicher Logarithmus |slope| Betrag der Kurvensteigung Mit den so korrigierten CT-Werten für jede Probe wurde dann der Gehalt ursprünglich vorhandener DNA bzw. cDNA errechnet. Dazu wurde neben der Steigung der Standardkurven auch der Schnittpunkt dieser Kurven mit der y-Achse (intercept) benötigt. Beide Werte werden automatisch von der Software (3.1.8) berechnet und bereitgestellt. Der Gehalt ergab sich aus folgender Formel: ((CT-intercept) / slope) Gehalt = 10 intercept Schnittpunkt der Standardkurven der jeweiligen Sonde mit der y-Achse slope Steigung der Standardkurve der jeweiligen Sonde Für die Standardkurven wurden definierte Verdünnungsstufen einer Chlamydienpräparation verwendet. Allerdings war die exakte Menge der darin enthaltenden stoffwechselaktiven Chlamydien nicht bekannt. Es konnte also keine absolute Quantifizierung erfolgen, da hierfür die Standardkurven mit einer genau Material und Methoden 78 definierten Menge RNA der zu untersuchenden Gene hätten erstellt werden müssen. Eine absolute Quantifizierung war bei dieser Untersuchung allerdings auch nicht angestrebt, so dass eine relative Quantifizierung auf Basis der mittels Verdünnung erstellten Standardkurven genutzt wurde. Zu diesem Zweck mussten die korrigierten Gehalte auf die Zahl lebender Chlamydien normalisiert werden, um die Anzahl der RNA-Kopien pro Erreger zu erhalten. Die korrigierten Werte wurden daher durch den entsprechenden Gehalt an 16S RNA dividiert, der als Maßstab für die Zahl der stoffwechselaktiven Chlamydien genutzt wurde. Beispiel: Gehalt RNA euo Tag 1 in inf. DC / Gehalt rRNA 16S Tag 1 inf. DC So wurde für jedes untersuchte Gen zu jedem Zeitpunkt (Tag 1,3,5) und in beiden untersuchten Zellpopulationen (infizierte DC und kokultivierte Makrophagen) verfahren. Da die ribosomale RNA aber wesentlich stabiler ist als mRNA und sowohl die Aufreinigung, Lagerung und weitere Bearbeitung besser übersteht, wird auch wesentlich mehr Menge rRNA detektiert. Daher muss der errechnete Quotient aus mRNA und rRNA mit dem Faktor 1x106 multipliziert werden. Erst nach dieser Korrektur wurden die relativen Kopienzahlen der untersuchten Gene graphisch ausgewertet. Ergebnisse 4 Ergebnisse 4.1 Ergebnisse der experimentellen Vorarbeiten 79 4.1.1 Einfluss der Serumkonzentration auf die Zahl der Makrophagen während der Konditionierungsphase Da aus den für die Zellisolation genutzten Buffy Coats nicht immer eine ausreichende Menge autologen Serums gewonnen werden konnte, wurde für die Zellkultur eine Reduktion der zugesetzten Serummenge in Erwägung gezogen. Der Serumanteil in diesen Vorversuchen betrug nur 2% an der Gesamtmediummenge (Kap. 3.2.4.2.3). Die so konditionierten Makrophagen zeigten allerdings im Vergleich zu denen mit 10% Serum kultivierten Zellen deutliche Unterschiede. Während der gesamten Konditionierungsphase von 6 Tagen nahm die Zellzahl stark ab. Abb. 2 und Abb. 3 zeigen die deutlichen Unterschiede in der Dichte der kultivierten Zellen im Phasenkontrastmikroskop. Die Aufnahmen wurden an Tag 6 nach Isolation gemacht. Deutlich zu erkennen sind die wesentlich geringere Menge der Makrophagen in der Übersichtsvergrößerung (10x) und die auffallend vielen, im Phasenkontrast dunkel erscheinenden Zelltrümmer (20x) bei 2%igem Serumzusatz. Im Vergleich dazu Makrophagen nach 6 Tagen Konditionierung mit 10%igem Zusatz autologen Serums (Abb. 3). Nach diesem Befund wurden alle Versuche mit einem Anteil von 10% Serum durchgeführt. Buffy Coats, bei denen nicht genug Serum zur Verfügung stand, wurden mit hAB-Serum versorgt. Ergebnisse 10x 80 20x Abb. 2: Phasenkontrastaufnahme von Makrophagen Zustand nach 6 Tagen Konditionierung mit 2%igem Zusatz von autologem Serum (3.2.4.2.3). 10x 20x Abb. 3: Phasenkontrastaufnahme von Makrophagen Zustand nach 6 Tagen Konditionierung mit 10%igem Zusatz von autologem Serum (3.2.4.1). Deutlich zu erkennen ist die größere Zelldichte im Vergleich zu Abb. 2. Ergebnisse 81 4.1.2 Wahl der geeigneten Porengröße der Membran für die Kultur der DC Für das verwendete Transwell-Kultursystem (3.1.2) standen zwei Porengrößen zur Auswahl. Porendurchmesser von 3 µm und 0,4 µm. Beide Membrantypen wurden daher mit monozytären Zellen bestückt und diese Zellen dann zu dendritischen Zellen konditioniert (Kap. 3.2.4.2.2). An Tag 7 nach Isolation wurden alle Kulturplatten auch noch zentrifugiert, um den Ablauf während einer Infektion zu simulieren. Abb. 4 zeigt das untere Kompartiment einer Transwell-Einheit mit 3 µm großen Poren vor der Zentrifugation an Tag 7 und danach. Deutlich sind dabei im Phasenkontrast Zellen zu erkennen, die nur durch die Poren in das untere Kompartiment gelangen konnten. Nach der Zentrifugation sind noch wesentlich mehr dendritische Zellen auf dem Boden des unteren Kompartiments vorhanden (gleiche Vergrößerungen). Zum Vergleich wird in Abb. 5 ebenfalls eine Aufnahme von Tag 7 nach Zentrifugation gezeigt. Bei dieser Transwell-Einheit betrug die Porengröße jedoch lediglich 0,4 µm. Es sind keine Zellen auf dem well-Boden vorhanden. Um also eine Vermischung der dendritischen Zellen und Makrophagen während der Versuche zu verhindern, wurden nur Transwell-Membranen mit einem Porendurchmesser von 0,4 µm für die weiteren Versuche verwendet. Ein weiterer Vorteil dieser Größe besteht darin, dass so nur chlamydiale Elementarkörper die Poren passieren können, Retikularkörper sind mit ca. 1 µm Durchmesser zu groß. Ergebnisse 20x 82 20x Abb. 4: Phasenkontrastaufnahme des unteren Kompartiments einer TranswellEinheit mit 3 µm großen Poren (3.1.2). Zustand nach 7 Tagen Konditionierung der DC (3.2.4.3) auf der Membran vor (linke Seite) und nach (rechte Seite) Zentrifugation. Die durch die Poren gedrungenen Zellen sind zu erkennen. Zur besseren Unterscheidung wurde etwas Trypanblau (3.1.4) hinzugesetzt, wodurch Zellen mit nicht-intakter Zellmembran blau erscheinen. Der Großteil der durch die Poren gedrungenen Zellen hat eine intakte Zellmembran und ist daher als vital anzusehen. 20x Abb. 5: Phasenkontrastaufnahme des unteren Kompartiments einer TranswellEinheit mit 0,4 µm großen Poren (3.1.2). Zustand nach 7 Tagen Konditionierung der DC auf der Membran nach Zentrifugation. Im unteren Kompartiment sind keine Zellen zu erkennen. Ergebnisse 83 4.1.3 Nachweis chlamydialer Entwicklung in primär infizierten DC in Anwesenheit kokultivierter Makropagen Die Möglichkeit, dendritische Zellen mit dem Erreger Chlp. pneumoniae zu infizieren war bereits bekannt. Allerdings war nicht geklärt, ob sich der Erreger auch noch in dendritischen Zellen entwickeln kann, wenn diese in Kokultur mit anderen Zellen kultiviert werden. Daher war es wichtig, vor den eigentlichen Infektionsversuchen zu klären, ob kokultivierte Makrophagen die Infizierbarkeit dendritischer Zellen und das weitere chlamydiale Wachstum beeinträchtigen können. Dazu wurden dendritische Zellen auf dem Boden von Zellkultur-wells konditioniert (3.2.4.2.1), infiziert (3.2.5.2.1) und mit Makrophagen auf Transwell-Membranen kokultiviert (3.2.5.3.1). Die erhaltenen Präparate wurden immunhistochemisch gefärbt und lichtmikroskopisch ausgewertet (3.2.6.1). In Abb. 6 sind deutlich die rot angefärbten Einschlüsse in den dendritischen Zellen zu erkennen. Die Einschlüsse befinden sich dabei in unmittelbarer Nähe zum Zellkern (blau angefärbt). Daneben sind auch die teilweise langgestreckten Ausläufer der DC zu sehen. Diese Aufnahmen zeigen, dass die Anwesenheit von Makrophagen die Empfänglichkeit dendritischer Zellen für eine Infektion mit Chlp. pneumoniae nicht verhindert. Ergebnisse 84 Abb. 6: Primär mit Chlp. pneumoniae infizierte dendritische Zellen 4 Tage nach Infektion (p. inf.). Die DC wurden auf Glasplättchen gemäß der Infektionsversuche konditioniert (hAB-Serum, IL-4, GM-CSF)( 3.2.4.2.1), an Tag 7 infiziert (3.2.5.2), mit Makrophagen kokultiviert (3.2.5.3) und an Tag 4 p. inf. (3.2.6.1) gefärbt. Die Färbung erfolgte mit einem C.p.-spezifischen monoklonalen anti-MOMP Antikörper (3.1.5), dem DAKO EnVision+ Kit (3.1.5) und AEC (3.1.4). Die Zellkerne wurden mit Hämatoxylin (3.1.4) gegengefärbt (blau). Die Pfeile markieren die rot gefärbten chlamydialen Einschlüsse (rechts Ausschnittsvergrößerung). 4.1.4 Empfänglichkeit der Makrophagen für frei im Medium vorhandene Chlamydien Um eine sichere Infektion mit Chlp. pneumoniae zu gewährleisten, wird bei in-vitro Untersuchungen im Regefall eine Zentrifugation angewendet, um den Erreger direkt in die zu infizierende Zelle zu verbringen. In dem geplanten Kokulturmodell war es aber nötig, dass die kokultivierten Makrophagen von den infizierten DC ins Medium abgegebene chlamydiale Elementarkörper selbstständig aufnehmen konnten. Da hierzu in der Literatur keine Daten vorlagen, musste zuerst die Infektion der Makrophagen ohne Zentrifugation Ergebnisse 85 nachgewiesen werden. Das Kulturmedium oberhalb der Membran wurde dazu mit einer Chlamydienpräparation versetzt und die Makrophagen im unteren Kompartiment damit inkubiert (Kap. 3.2.5.1). Die aus diesem Versuch gewonnenen Präparate wurden immunfluoreszenztechnisch auf das Vorhandensein chlamydialer Inklusionen hin untersucht (3.2.6.2). Dabei konnten bereits 1 Tag nach Zugabe der Chlamydien einzelne chlamydiale Partikel innerhalb der Makrophagen angefärbt werden (Abb. 7). Im weiteren Zeitverlauf entwickelten sich diese Partikel zu typischen Inklusionen, die eine Größenzunahme aufwiesen (Abb. 7 und Abb. 8). Dabei waren über den gesamten Versuchzeitraum aber auch weiterhin einzelne Partikel geringer Größe anfärbbar, bei denen es sich evtl. um später aufgenommen Chlamydien handeln könnte (Abb. 8). Damit wurde gezeigt, dass Makrophagen auch ohne Zentrifugation infektiöse Formen von Chlp. pneumoniae direkt aus dem Medium aufnehmen können und sich diese Chlamydien innerhalb der Makrophagen entwickeln. Als weiteres ließ sich somit demonstrieren, dass infektiöse Elementarkörper die 0,4 µm großen Poren der Transwell-Membran in sehr kurzer Zeit passieren und in das untere Kompartiment der Transwell-Einheiten gelangen. Ergebnisse Makrophagen Tag 1 p.inf. 86 Makrophagen Tag 3 p.inf. Abb. 7: Empfänglichkeit der Makrophagen für frei verfügbare Chlp. pneumoniae. An Tag 7 nach Isolation (3.2.2) wurden eine Chlamydienpräparation zu den Makrophagen hinzugegeben (MOI 10; keine Zentrifugation) (3.2.5.1). Jeden Tag nach Infektion (p. inf.) wurden Präparate mit einem Chlp. pneumoniae-spezifischen monoklonalen anti-MOMP Antikörper und Evansblau gefärbt (3.2.6.2). Die Auswertung erfolgte mittels Fluoreszenzmikroskopie, wobei die dargestellten Bilder durch Überlagerung eines Rotund eines Grünbildes entstanden. Pfeile markieren chlamydiale Partikel (Tag 1) und Inklusionen (Tag 3). Ergebnisse 87 Makrophagen Tag 5 p. inf. Abb. 8: Darstellung chlamydialer Inklusionen (massive Pfeile) und Partikel (unterbrochener Pfeil) in einem infizierten Makrophagen. Das Präparat wurde wie bei Abb. 6 beschrieben gefärbt und ausgewertet. Deutlich sind mehrere Inklusionen in einer Zelle in verschiedenen Ebenen zu sehen. Daneben finden sich aber auch einzelne kleine Partikel. Zusammenfassung der Ergebnisse der experimentellen Vorarbeiten Die experimentellen Vorarbeiten dienten dazu, die grundlegenden Voraussetzungen zur Entwicklung des geplanten Kokulturmodells zu schaffen. So wurde aufgrund dieser Vorexperimenten die Größe der Poren der verwendeten Transwell-Membranen auf 0,4 µm festgelegt (4.1.2). Der Serumgehalt im Kulturmedium betrug bei allen Hauptversuchen 10%, da sich geringere Gehalte negativ auf die Zellvitalität auswirkten (4.1.1). Außerdem konnte nachgewiesen werden, dass sowohl die dendritischen Zellen als auch die Makrophagen die Bedingungen für das Kokulturmodell erfüllen. Dendritische Zellen lassen sich mit Chlp. pneumoniae infizieren und enthalten auch nach mehreren Tagen der Kokultur zusammen mit Makrophagen noch Inklusionen (4.1.3). Die Makrophagen sind in der Lage, frei im Medium vorhandene infektiöse Chlamydien aufzunehmen. Die Chlamydien entwickeln sich in diesen Zellen ebenfalls weiter und bilden deutliche Einschlüsse aus (4.1.4). Ergebnisse 4.2 88 Analyse der Reinheit der isolierten mononuklären Zellen mittels FACS Als Ausgangspunkt für die Konditionierung dendritischer Zellen und Makrophagen wurden CD14 positive mononukläre Zellen verwendet. Um deren Reinheit nach der Isolation zu überprüfen, wurden die Zellen mit einem fluoreszenzmarkierten Antikörper gefärbt und FACS-analytisch ausgewertet (3.2.3). Dabei erstellt die Software des Gerätes zuerst eine Grafik, in der jedem detektierten Ereignis seine Größe und seine Streuung (als Maß für die innere Granularität) zugeordnet werden. (Abb. 9). So lassen sich einzelne Populationen eingrenzen (Abb. 9). Abb. 9: Darstellung der bei der FACS-Analyse (3.2.3) detektierten Ereignisse durch die CellQuest-Software. Links sind die gezählten Ereignisse nach Größe und Granularität dargestellt. Deutlich hebt sich eine homogene Population als Wolke ab. Diese kann nun markiert werden (grün im rechten Bild) und dient als Basis für die weitere Auswertung. Die Ansammlung im unteren linken Bildbereich stellt Zelltrümmer dar. FSC-Height forward scatter (Vorwärtsstreuung des Lichts), das Maß für die Größe der Zellen SSC-Height sideward scatter (Seitwärtsstreuung des Lichts), das Maß für die Granularität der Zellen Ergebnisse 89 Diese Populationen können nun markiert und einzeln ausgewertet werden. So können zum Beispiel aus einer solchen Population alle fluoreszenzmarkierten Zellen farblich hervorgehoben und separat ausgewertet werden (Abb. 10). Abb. 10: Darstellung aller CD14+ markierten Zellen aus der gewählten Gesamtpopulation (4.2, Abb. 10). Blau dargestellt sind die Zellen, welche sowohl in der ausgewählten Zellpopulation (Abb. 10) vorhanden sind und gleichzeitig CD14 auf ihrer Oberfläche exprimieren (3.2.3). Die schwarz gefärbte Ansammlung im unteren linken Bildbereich stellt Zelltrümmer dar. FSC-Height forward scatter (Vorwärtsstreuung des Lichts), das Maß für die Größe der Zellen SSC-Height sideward scatter (Seitwärtsstreuung des Lichts), das Maß für die Granularität der Zellen Aus der Differenz der Gesamtzellzahl und der fluoreszenzmarkierten Zellen lässt sich die Menge CD14+ Zellen bestimmen. Der Prozentsatz lag im Durchschnitt bei 93% (+/- 1,2 %). Zusätzlich kann auch noch die Reinheit der Zellpopulation analysiert werden. Hierzu wird das Verfahren auch für die Isotypkontrolle (3.2.3) wiederholt. Jedoch wird nun zusätzlich Ergebnisse 90 jedem positiv gezählten Ereignis die Intensität des von ihm ausgesendeten Fluoreszenzlichts zugeordnet (Abb. 11). Je spitzer die Peaks sind, desto homogener ist Zahl der Ereignisse die isolierte Population. Fluoreszenzintensität Abb. 11: Analyse der Reinheit der markierten Zellpopulation. Die blaue Kurve stellt die Population CD14+ Zellen dar, die schwarze Kurve repräsentiert die Isotypkontrolle. Deutlich ist der Unterschied in der Fluoreszenzintensität der beiden Populationen zu erkennen. Die FACS-Analyse der isolierten Zellen ergab eine nahezu reine und einheitliche Zellpopulation als Ausgangspunkt für die Konditionierung dendritischer Zellen und Makrophagen. Ergebnisse 4.3 91 Ergebnisse der Infektionsversuche 4.3.1 Morphologische Unterschiede der Zellpopulationen bei Konditionierung mit verschiedenen Seren 4.3.1.1 Morphologie der dendritischen Zellen Vor der Infektion mit Chlp. pneumoniae mussten die isolierten mononuklären Zellen zu dendritischen Zellen konditioniert werden. Dabei fand bei einigen Versuchen das autologe Serum des Blutspenders Verwendung, bei anderen Versuchen wurde hAB-Serum benutzt. Dabei ergaben sich morphologische Unterschiede, die in Abb. 12 gegenübergestellt sind. Die dendritischen Zellen, welche mit hAB-Serum konditioniert wurden, hatten eine rundere Form. Lange Ausläufer des Zellkörpers waren in der Regel nicht zu erkennen, dagegen bildeten die Zellen viele kleine Auswüchse. Die mit autologem Serum konditionierten DC zeigten dagegen in den meisten Fällen eine deutlich spindelförmige Gestalt, teilweise mit über 50 µm langen Ausläufern. Ergebnisse 10x 92 10x Abb. 12: Morphologische Unterschiede der DC nach 6 Tagen Konditionierung mit verschiedenen Seren (3.2.4.2.3). Beide Zellpopulationen wurden mit der gleichen Menge IL-4 und GM-CSF versorgt. Die Aufnahme links zeigt DC, die mit Zusatz humanen ABSerums kultiviert wurden, recht sind Zellen mit autologem Serumzusatz zu sehen. Der Anteil des Serums betrug in beiden Fällen 10%. 4.3.1.2 Morphologie der Makrophagen Homolog zu den dendritischen Zellen mussten auch die Makrophagen mit verschiedenen Seren konditioniert werden, um die Konstanz in der Zusammensetzung des Mediums für beide Zellpopulationen zu gewährleisten. Auch die Makrophagen zeigten bei den beiden verwendeten Serumarten deutliche morphologische Unterschiede. So blieben die mit hABSerum konditionierten Zellen kleiner und hatten einen schmaleren Zytoplasmasaum. Sie entwickelten oft kleine Ausläufer an gegenüberliegenden Zellpolen. Die mit autologem Serum behandelten Makrophagen waren dagegen deutlich größer und wiesen einen breiten Zytoplasmasaum auf, was sie spiegeleiförmig aussehen ließ. Abb. 13 zeigt zum Vergleich zwei Übersichtsaufnahmen konditionierten Makrophagen an Tag 6 nach Isolation. Ergebnisse 10x 93 10x Abb. 13: Makrophagen nach 6 Tagen Konditionierung mit unterschiedlichen Seren (3.2.4.2.3). Links die Zellen mit Zusatz hAB-Serums, recht Makrophagen, die mit autologem Serum kultiviert wurden. In beiden Fällen betrug der Serumanteil am Kulturmedium 10%. Am auffälligsten ist die differierende Zellgröße. 4.3.2 Phänotypisierung der konditionierten Zellen mittels FACS-Analyse Die in Kapitel 4.3.1 dargestellten morphologischen Unterschiede waren mikroskopisch sehr deutlich. Somit bestand der Verdacht, dass sich die jeweils mit unterschiedlichen Seren konditionierten Zellarten evtl. grundsätzlich voneinander unterscheiden könnten. Um die Vergleichbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten war es daher notwendig, die Zellpopulationen neben den rein morphologischen Gesichtspunkten auch auf ihre Oberflächenmoleküle hin zu untersuchen. Somit sollte unabhängig von der Gestalt der Zellen eine zusätzliche Charakterisierung ihres Funktionszustandes als DC bzw. Makrophagen erfolgen. Sowohl dendritische Zellen als auch Makrophagen wurden jeweils mit hAB-Serum und autologem Serum konditioniert, gefärbt und mittels FACS-Analyse Ergebnisse 94 untersucht. Die unterschiedlichen und untersuchten Oberflächenmarker sind in Tab. 3 zusammengefaßt. CD1a CD14 CD16 CD33 CD80 CD83 CD86 HLA - DR Mø immature DC (10% Serum) (10% Serum, IL-4, GM-CSF) + + + + + + (+) + (+) + + Tab. 3: Erwartete Expression der Oberflächenmoleküle der konditionierten Zellpopulationen. Die Funktion der Moleküle ist im Anhang Kap. 9.2 aufgeführt. + deutlich exprimiertes Oberflächenmolekül (+) Molekül in geringer Menge vorhanden - nicht exprimiertes Oberflächenmolekül Bei der Auswertung wurden die Intensitäten von jeweils zwei Farbstoffen in einer Abbildung gegenübergestellt, um so eine Aussage über die Menge der auf der Oberfläche exprimierten Moleküle zu erhalten. Ergebnisse 95 Intensität Farbstoff 2 Zur Veranschaulichung folgendes Schema: pos. für Farbstoff 2 neg. für beide Farbstoffe pos. für beide Farbstoffe pos. für Farbstoff 1 Intensität Farbstoff 1 4.3.2.1 Oberflächenmoleküle auf dendritischen Zellen Die folgenden Abbildungen zeigen die Analyse der Doppelfärbungen der immaturen DC (3.2.4.4). Dabei sind in Abbildung 14 die Ergebnisse der DC zu sehen, die mit hAB-Serum konditioniert wurden. Hierfür wurde ein separater Versuch ausgewertet. Es zeigen sich dabei die der unter Kap. 4.3.2 angeführten Tabelle entsprechenden Abgrenzungen zu Makrophagen. So fehlt eine erhöhte Intensität für das Oberflächenmolekül CD 14, auch CD 16 und CD 83 werden nicht exprimiert (Abb.14, obere Reihe). Dafür sind deutliche Signale für CD 1a, CD 80 und CD 86 vorhanden (Abb. 14, untere Reihe). Allerdings zeigen nicht alle Zellen diese markierten Oberflächenmoleküle, was an den im unteren linken Quadranten dargstellten Ereignissen zu erkennen ist. Ergebnisse 96 Abb. 14: Ergebnisse der Mehrfachfärbungen der immaturen DC. Zustand nach 6 Tagen Kultur mit hAB-Serum (3.2.4.3). Die Achsen geben für jede untersuchte Zelle die Intensität der von den fluorochrom-konjugierten Antikörpern emittierten Fluoreszenz wieder (3.2.4.4). Je stärker die Intensität, desto mehr Antikörper konnten auf der Zelle binden, desto mehr exprimiert die Zelle das entprechende Molekül (vgl. Schema vorherige Seite). Die obere Reihe zeigt das Fehlen makrophagenspezifischer Oberflächenmoleküle wie CD14 und CD16, die untere Reihe stellt die für immature DC typischen Moleküle dar (4.3.2, Tab. 3). Ergebnisse 97 Auch für die mit autologem Serum konditionierten immaturen DC wurde eine solche Analyse der verschiedenen Oberflächenmoleküle in einem separaten Versuch durchgeführt. Die Ergebnisse zeigt Abbildung 15: Abb. 15: Ergebnisse der Mehrfachfärbung der immaturen DC. Zustand nach 6 Tagen Kultur mit autologem Serum. Die Darstellungsweise entspricht der in Abb. 14. Auch hier fehlen die makrophagentypischen Moleküle CD14 und CD 16 (obere Reihe). Die mit autologem Serum konditionierten DC zeigten ebenfalls keine deutlichen Signale für CD 14 und CD 16 (Abb. 14, obere Reihe). Das Signal für CD 1a war schwächer als bei den mit hAB-Serum konditionierten Zellen, doch überall vorhanden. Die übrigen Moleküle wurden in ähnlichem Maße von den immaturen DC präsentiert. Ergebnisse 4.3.2.2 98 Oberflächenmoleküle auf Makrophagen Wie die immaturen DC, so wurden auch die Makrophagen auf die von ihnen exprimierten Oberflächenmoleküle hin untersucht, und zwar wiederum getrennt nach Konditionierung mit Zusatz hAB-Serums bzw. autologen Serums. Abb. 16 stellt zunächst in Homologie zu den DC die Ergebnisse der FACS-Analyse für die mit hAB-Serum konditionierten Makrophagen dar. Dabei fällt auf, dass die Moleküle CD 14 und CD 16 sehr starke Fluoreszenzsignale verursachen, was für eine klare Expression dieser Moleküle auf den Zellen spricht. Auch das Vorhandensein von CD 33 und CD 86 in Kombination mit CD 14 charakterisiert eine makrophagentypische Oberfläche. Dagegen werden die Moleküle CD 80 und CD 83 kaum exprimiert. Abb. 16: Ergebnisse der Mehrfachfärbung der konditionierten Makrophagen. Zustand nach 6 Tagen Kultur mit Zusatz hAB-Serums. Ergebnisse 99 Die Achsen geben für jede untersuchte Zelle die Intensität der von den fluorochromkonjugierten Antikörpern emittierten Fluoreszenz wieder (3.2.4.4). Je stärker die Intensität, desto mehr Antikörper konnten auf der Zelle binden, desto mehr exprimiert die Zelle das entprechende Molekül (vgl. Schema Kap. 4.3.2). Die obere Reihe zeigt die für Makrophagen typischen Oberflächenmoleküle stark exprimiert. Das Fehlen von CD 80 und CD 83 (untere Reihe) grenzt diese Zellen weiter von immaturen DC ab. Abbildung 17 zeigt die Ergebnisse der Analyse der Makrophagen, die mit autologem Serum konditioniert wurden. Dabei wird zunächst deutlich, dass die Anzahl detektierter Signale insgesamt geringer war als bei den vorangegangenen Analysen. Trotzdem zeigt sich auch hier das aus Abbildung 16 bekannte Muster. Die Kombination der positiv detektierten Moleküle CD 14, CD 16, CD 33, CD 86 und HLA-DR ist makrophagentypisch. Das Fehlen von CD 1a und CD 83 grenzt auch diese Zellpopulation deutlich von immaturen dendritischen Zellen ab. Ergebnisse 100 Abb. 17: Ergebnisse der Mehrfachfärbung der konditionierten Makrophagen. Zustand nach 6 Tagen Kultur mit Zusatz autologen Serums. Die Darstellung entspricht der in Abb. 16. Trotz des insgesamt schwachen Signals (weniger dichte Wolken) bei allen analysierten Molekülen ist das Muster dem aus Abb. 16 vergleichbar. Somit können auch diese Zellen als Makrophagen angesprochen werden. Ergebnisse 101 Mit Hilfe der FACS-Analyse konnten deutliche Unterschiede zwischen den für die Versuche genutzten Zellpopulationen der dendritischen Zellen und Makrophagen dargestellt werden. Dabei schien das Muster der exprimierten Oberflächenmoleküle von der Art des für die Konditionierung verwendeten Serums unabhängig zu sein. Die morphologischen Unterschiede zwischen den immaturen DC und den Makrophagen wurden durch die phänotypische Analyse der Oberflächenmoleküle bestätigt. 4.3.3 Nachweis der Infizierbarkeit dendritischer Zellen auf der Membran mit Darstellung chlamydialer Inklusionen als Zeichen der Entwicklung Im Rahme der Infektionsversuche sollten direkt mit Chlamydophila pneumoniae infizierte DC den Erreger auf kokultivierte Makrophagen übertragen. Dazu wurden die DC in einem Versuch auf Membranen konditioniert und mit dem Bakterium infiziert (3.2.5.2). Die Möglichkeit einer Infektion dendritischer Zellen wurde in einem Vorexperiment bereits bestätigt. Allerdings sollte auch für die auf den Membranen konditionierten und infizierten DC der Nachweis einer erfolgreichen Infektion erbracht werden. Zu diesem Zweck wurden die infizierten DC an Tag 6 nach Infektion gefärbt (3.2.6.1). Die resultierenden Präparate sind in Abb. 18 und Abb. 19 dargestellt. Dabei zeigt Abb. 18 infizierte DC aus einer Kultur mit Zusatz von 10% hAB-Serum. Die rot gefärbten chlamydialen Inklusionen sind zahlreich in der Nähe der Zellkerne zu finden. Die Ausschnittsvergrößerung auf der rechten Bildseite zeigt die mit Pfeilen markierten Einschlüsse. Abb. 19 zeigt ebenfalls direkt infizierte DC 6 Tage nach Infektion, wobei diese Zellen mit autologem Serum versorgt wurden. Auch hier sind fast in jeder Zelle große, runde Inklusionen rot angefärbt. Diese scheinen sogar im Vergleich zu denen aus mit hABSerum kultivierten DC noch größer zu sein. Da es sich um große Inklusionen und nicht um Ergebnisse 102 kleine chlamydiale Partikel handelt, ist es wahrscheinlich, dass sich die aufgenommenen Chlamydien innerhalb der DC entwickelt haben. Kleine Partikel hätten auch von den DC aufgenommen und prozessiert werden können. Das Vorhandensein großer Einschlusskörper weißt jedoch darauf hin, dass die Chlamydien ihren Entwicklungszyklus innerhalb der DC durchführen konnten. In Abb. 19 sieht man auch die als weiße Punkte erscheinenden Poren in der TranswellMembran. 40x 100x Abb. 18: Angefärbte chlamydiale Inklusionen (Pfeile) in DC an Tag 6 nach Infektion. Die Kultur der DC erfolgte mit hAB-Serum (3.2.4.2 und 3.2.5.2). Die Zellen wurden mit Chlp. pneumoniae infiziert (3.2.5.2) und an Tag 6 gefärbt (3.2.6.1) Die Färbung wurde mit einem C.p.-spezifischen anti-MOMP Antikörper (3.1.5), dem DAKO EnVision+ Kit (3.1.5) und AEC (3.1.4) vorgenommen. Rechts Ausschnittsvergrößerung. Ergebnisse 40x 103 100x Abb. 19: Angefärbte chlamydiale Inklusionen in DC an Tag 6 nach Infektion. Die Kultur (3.2.4.2 und 3.2.5.2) erfolgte im Gegensatz zu Abb. 18 mit autologem Serum. Die Präparate wurden identisch gefärbt (3.2.6.1). Die Inklusionen (massive Pfeile) in unmittelbarer Nähe zu den Zellkernen (blau) erscheinen größer als in Abb. 18. Der unterbrochene Pfeil markiert mehrere weiß erscheinende Poren in der TranswellMembran. 4.3.4 Morphologische Veränderungen der primär infizierten DC im Vergleich zu Scheininfizierten Zellen Bei allen Infektionsversuchen wurde als Kontrolle eine Schein-infizierte Kokultur mitgeführt (3.2.5.2). Im Verlauf der Infektion zeigten die infizierten dendritischen Zellen morphologische Veränderungen, die bei den nur Schein-infizierten Zellen nicht beobachtet werden konnten. So bildeten die infizierten dendritischen Zellen vor allem in der Mitte der Transwell-Membranen ein großes Aggregat. Teilweise waren die Abstände zwischen den Zellen mikroskopisch nicht mehr erkennbar (Abb. 20). Eine weitere morphologische Veränderung war das Abrunden der DC. Besonders bei Kultur mit autologem Serum Ergebnisse 104 bildeten die dendritischen Zellen während der Konditionierung sehr lange Ausläufer aus (4.3.1.1). Diese Zellausläufer wurden nach Infektion fast vollständig zurückgebildet und die Zellen erschienen rund (Abb. 21). Dieses Abrunden ist ein typisches Anzeichen für die Reifung (Maturation) einer dendritischen Zelle. Es ermöglicht ihr, nach Antigenaufnahme schnell durch das Gewebe in das nächste Lymphgefäß zu wandern und so in den nächsten Lymphknoten zu gelangen. Die Infektion mit Chlp. pneumoniae konnte also auch in diesem Kokulturmodell eine Veränderung auslösen, die charakteristisch für die Maturation von immaturen DC ist. Als ein weiterer wichtiger Befund ist an dieser Stelle zu nennen, dass die Schein-infizierten DC ihre Morphologie im Verlauf der Infektionsversuche nicht änderten. Sie behielten die bereits gegen Ende der Konditionierung beschriebene äußere Charakteristik bei (4.3.1.1), obwohl sie ja nach Beginn der Infektionsversuche nicht weiter mit Zytokinen versorgt wurden. Eine siebentägige Konditionierungsphase war also ausreichend, um morphologisch stabile Zellpopulationen zu erhalten. 10x 10x Schein-infizierte DC mit C.p. infizierte DC Abb. 20: Vergleich Schein-infizierter mit direkt infizierten DC. Zustand an Tag 7 nach Infektion und Kultur mit 10% hAB-Serum (3.2.5.2 und 3.2.5.3). Deutlich ist die Ansammlung infizierter DC in der Mitte der Membran zu sehen (rechte Seite). Am oberen Bildrand ist noch ein Stück der nun freien Membran zu erkennen. Ergebnisse 105 10x 10x Schein-infizierte DC mit C.p. infizierte DC Abb. 21: Vergleich Schein-infizierter DC mit direkt infizierten DC. Zustand an Tag 6 nach Infektion und Kultur mit 10% autologem Serum (3.2.5.2 und 3.2.5.3). Die selbst nach 6 Tagen ohne Zytokine noch vorhandenen Ausläufer der Schein-infizierten DC (linke Seite) sind bei infizierten Zellen weitgehend zurückgebildet. 4.3.5 Übertragung von Chlp. pneumoniae von infizierten DC auf kokultivierte Makrophagen Ein Hauptziel der Arbeit bestand in der Beantwortung der Frage, ob Chlamydien aus infizierten dendritischen Zellen ohne Zellkontakt auf kokultivierte Makrophagen übertragen werden können. Hierfür wurden auf Membranen mit Chlp. pneumoniae infizierte DC über Makrophagen kultiviert (3.2.5.3). Über sieben Tage hinweg wurden Präparate der so kultivierten Zellen angefertigt. Die kokultivierten Makrophagen wurden gefärbt und mikroskopisch ausgewertet. Ergebnisse 4.3.5.1 106 Nachweis der Übertragung mittels immunhistochemischer Färbung Die kokultivierten Makrophagen wurden in zwei Experimenten mit einem primären Antikörper gegen das MOMP von Chlp. pneumoniae gefärbt (3.2.6.1). In Homologie zur Färbung der dendritischen Zellen wurde zusätzlich noch ein Sekundärantikörper verwendet, der mit einer Peroxidase gekoppelt war. Diese Peroxidase setzte einen Farbstoff um, der chlamydiale Partikel rot einfärbte. Die Präparate wurden dann mikroskopisch ausgewertet. Dabei konnten in den kokultivierten Makrophagen chlamydiale Einschlüsse nachgewiesen werden (Abb. 22 und Abb. 23). Dieser Nachweis war unabhängig von der zur Kultur verwendeten Serumart. Sowohl mit hAB-Serum als auch bei Verwendung des autologen Serums konnten in den Makrophagen Chlamydien angefärbt werden (Abb. 22 und Abb. 23). Lediglich die Größe der Inklusionen war bei den mit hAB-Serum kultivierten Makrophagen unter Beachtung des Maßstabs geringer (Abb. 22), obwohl der Serumanteil in beiden Versuchsansätzen identisch war. 40x 100x Abb. 22: Nachweis chlamydialer Inklusionen in kokultivierten Makrophagen. Zustand 6 Tage nach Infektion der DC, Kultur mit 10%igem Zusatz hAB-Serums. Die Makrophagen wurden separat konditioniert (3.2.4.1) und an Tag 7 nach Isolation mit infizierten DC zusammengebracht (3.2.5.3). Jeden Tag wurden Präparate entnommen und Ergebnisse 107 gefärbt (3.2.6.1). Die Färbung wurde mit einem C.p.-spezifischen anti-MOMP Antikörper (3.1.5), dem DAKO EnVision+ Kit (3.1.5) und AEC (3.1.4) vorgenommen. Im linken Bild sind viele rot gefärbte Inklusionen in den Makrophagen zu erkennen. Rechts eine Ausschnittsvergrößerung mit markierten Inklusionen. 40x 100x Abb. 23: Nachweis chlamydialer Inklusionen in kokultivierten Makrophagen. Zustand ebenfalls 6 Tage nach Infektion der DC, Kultur aber mit 10% autologem Serum. Kultur und Färbung erfolgten wie in Abb. 22 beschrieben. Die Ausschnittsvergrößerung rechts zeigt deutlich die wesentlich größeren (Maßstab) chlamydialen Inklusionen (Pfeile) im Verhältnis zu Abb. 22. Die Zellkerne sind blau eingefärbt. 4.3.5.2 Nachweis der Übertragung mittels Immunfluoreszenzfärbung Als zweite direkte Nachweismethode für eine Übertragung von Chlp. pneumoniae und eine Infektion der Makrophagen wurden die Präparate mit einem markierten primären Antikörper gegen das MOMP von Chlp. pneumoniae gefärbt (3.1.5 und 3.2.6.2). Der Ergebnisse 108 Markerfarbstoff war in diesem Fall FITC, welches bei Anregung mit Licht einer Wellenlänge von ca. 490 nm grünes Licht emittiert. Die Zellen wurden mit Evansblau gegengefärbt, welches bei Anregung mit grünem Licht ein rotes Farbsignal aussendet. Die Präparate wurden also nach der Färbung im Fluoreszenzmikroskop mit Licht verschiedener Wellenlänge ausgewertet und die erhaltenen Farbbilder durch Überlagerung der Einzelbilder generiert. Dabei zeigten sich die bereits immunhistochemisch anfärbbaren Inklusionen in den kokultivierten Makrophagen (Abb. 24). Die Bilder zeigen neben dem direkten Nachweis auch eine Größenzunahme der Inklusionen über die Dauer des Versuchsablaufes. Gemessen an der Größe der sichtbaren Zellkerne und des Maßstabs der Bilder wird dies deutlich. 100x Makrophagen Tag 5 p.inf. der DC 100x Makrophagen Tag 6 100x Makrophagen Tag 7 Abb. 24: Nachweis übertragener Chlamydien in kokultivierten Makrophagen. Die Makrophagen wurden separat konditioniert (3.2.4.1) und an Tag 7 nach Isolation mit infizierten DC zusammengebracht (3.2.5.3). Jeden Tag wurden Präparate entnommen und gefärbt (3.2.6.2). Die Färbung wurde mit einem C.p.-spezifischen anti-MOMP Antikörper (3.1.5) durchgeführt. Die mit dem FITC-konjugierten Antikörper direkt gefärbten Inklusionen (Pfeile) sind deutlich in unmittelbarer Nähe der Zellkerne zu erkennen. Bei Beachtung des Maßstabs zeigt sich die Größenzunahme der Inklusionen über die Dauer des Versuches. Ergebnisse 4.3.5.3 109 Nachweis der Übertragung gegen die Schwerkraft vom unteren Kompartiment in das obere Kompartiment In einem Vorversuch wurde die Möglichkeit chlamydialer Entwicklung in infizierten dendritischen Zellen in Anwesenheit kokultivierter Makrophagen überprüft (3.2.5.3.1). Die infizierten DC befanden sich dabei im unteren Kompartiment einer Transwell-Einheit. Im oberen Kompartiment wurden Makrophagen auf der Membran kokultiviert. Da die DC sich entwickelnde chlamydiale Einschlüsse aufwiesen (4.1.3), wurden auch die Makrophagen auf der Membran auf übertragene Chlamydien untersucht. Zu diesem Zweck wurden die Membranen mit den Zellen immunhistochemisch gefärbt (3.2.6.1) und lichtmikroskopisch ausgewertet. So konnten in den Makrophagen Inklusionen nachgewiesen werden (Abb. 25). Die Übertragung hatte also auch gegen die Schwerkraft vom unteren Kompartiment in das obere Kompartiment stattgefunden. Die dargestellten Einschlüsse waren allerdings nicht so zahlreich wie die unter Kap. 4.3.5.1, Abb. 22 abgebildeten Inklusionen. Auch dieser Versuch wurde mit hAB-Serum durchgeführt. 100x 100x Abb. 25: Inklusionen in kokultivierten Makrophagen im oberen Kompartiment 6 Tage nach Infektion der unten kultivierten DC. Ergebnisse 110 Die Makrophagen wurden separat konditioniert (3.2.4.1.1) und an Tag 7 nach Isolation mit infizierten DC zusammengebracht (3.2.5.2.1). Jeden Tag wurden Präparate entnommen und gefärbt (3.2.6.1). Die Färbung wurde mit einem C.p.-spezifischen anti-MOMP Antikörper (3.1.5), dem DAKO EnVision+ Kit (3.1.5) und AEC (3.1.4) vorgenommen.Die rot gefärbten Einschlüsse sind mit Pfeilen markiert. Dieser Versuch wurde nur mit 10%igem Zusatz hAB-Serums durchgeführt. 4.3.6 Bestimmung der Zahl infektiöser Chlamydien in den Proben der Kokulturexperimente im HEp2-Infektiositätstest 4.3.6.1 Infektiosität der mit humanem AB-Serum kultivierten Zellen Neben der Darstellung chlamydialer Einschlüsse in den Zellen wurde auch die Infektiosität dieser Chlamydien bestimmt. Hierzu wurden Proben der Überstände und Lysate der jeweiligen Zellpopulationen aus dem oberen bzw. unteren Kompartiment im Doppelansatz auf HEp-2 Zellen gegeben (3.2.7). Diese wurden zum Nachweis infektiöser Chlamydien gefärbt und fluoreszenzmikroskopisch ausgewertet (3.2.7). Die Menge der dabei ausgezählten Inklusionen wurde auf ein Volumen von 1 ml hochgerechnet, so dass sich die Einheit IFU pro ml (IFU: inclusion forming units) ergab. Abbildung 26 stellt die an den jeweiligen Kulturtagen in den verschiedenen Proben detektierten Mengen dar. Dabei zeigte sich bei den direkt infizierten DC ein leichter Abfall der enthaltenen infektiösen Chlamydien. Ab Tag 3 stieg die Zahl wieder an, um erneut bis zum Ende des Experiments abzufallen. Auch in den Überständen der infizierten DC konnten infektiöse Chlamydien nachgewiesen werden. Hier fällt die Zahl aber nahezu kontinuierlich ab Tag 2 ab, am letzten Tag (Tag 7 p. inf.) waren keine infektiösen Chlamydien mehr im Überstand des oberen Kompartiments vorhanden. Die kokultivierten Makrophagen wiesen zu keinem Ergebnisse 111 Zeitpunkt und bei keinem der durchgeführten vier Experimente mit vier verschiedenen Spendern Infektiosität auf, obwohl mittels direkter Anfärbung chlamydiale Partikel nachweisbar waren, und obwohl zumindest in den ersten 24 Stunden infektiöse Chlamydien auch im Überstand des unteren Kompartiment vorhanden waren. Die übertragenen Chlamydien verloren also in den Makrophagen ihre Infektiosität. 100000 IFU/ml 10000 1000 100 10 1 0 1 2 3 4 5 Tage nach Infektion 6 7 8 Abb. 26: Verlauf der Zahl infektiöser Chlamydien aus den Überständen und Lysaten der miteinander kultivierten Zellpopulationen (3.2.5.3). Proben der Überstände und Lysate wurden auf HEp-2 Zellen gegeben (3.2.7). Die Zellen wurden nach 72 Stunden mit einem C.p.-spezifischen anti-MOMP Antikörper (3.1.5) angefärbt. Die mit dem FITCkonjugierten Antikörper direkt gefärbten Inklusionen wurden ausgezählt und auf 1 ml hochgerechnet (3.2.7). Dargestellt sind die Mittelwerte aus 4 Experimenten mit vier verschiedenen Spendern. Die Kultur erfolgte mit hAB-Serum. Die Verlängerung der Zeitachse bis Tag 8 dient nur der Übersicht, alle Experimente wurden nach Tag 7 beendet. Ergebnisse IFU/ml 112 inclusion forming unit pro ml Lysate DC inf. Überst. DC inf. Lysate Makrophagen Überst. Makrophagen 4.3.6.2 Infektiosität der mit autologem Serum kultivierten Zellen Das zuvor beschriebene Verfahren (3.2.6.1) wurde auch bei den Proben angewendet, welche aus den Infektionsversuchen stammten, bei denen autologes Serum zur Kultivierung genutzt wurde. Insgesamt wurden so sechs Infektionsversuche mit autologem Serum von sechs verschiedenen Spendern durchgeführt. Die Mittelwerte der Infektiositäten sind in Abbildung 27 dargestellt. Auch hier kommt es innerhalb der ersten zwei Tage zu einer Abnahme der Zahl infektiöser Chlamydien in den DC, die allerdings durch einen Anstieg ab Tag 2 ausgeglichen wird. Im weiteren Verlauf bleibt die Zahl der Chlamydien in den DC relativ konstant. Im Überstand des unteren Kompartiments steigt die Zahl der isolierten Chlamydien stetig an. Bei den Experimenten mit autologem Serum lassen sich nun auch in den kokultivierten Makrophagen infektiöse Chlamydien ab Tag 3 nachweisen. Auch deren Zahl steigt im Verlauf an und erreicht gegen Ende der Experimente an Tag 7 ein Plateau auf dem Niveau der direkt infizierten DC. Die Verläufe legen nahe, dass die Chlamydien sich innerhalb der DC vermehren können und auch bei der Übertragung auf die kokultivierten Makrophagen ihre Infektiosität nicht einbüßen. Diese Ergebnisse ließen sich aber nur in Kultur mit autologem Serum erzielen. Hier zeigen sich entscheidende Unterschiede, die von den Seren (hAB-Serum versus autologem Serum), jedoch nicht von den Zellen (DC bzw. Makrophagen) oder den hier geprüften Chlamydien abhängen. Ergebnisse 113 100000 IFU/ml 10000 1000 100 10 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Tage nach Infektion Abb. 27: Verlauf der Zahl infektiöser Chlamydien aus den Überständen und Lysaten der miteinander kultivierten Zellpopulationen (3.2.5.3). Dargestellt sind die Mittelwerte aus 6 Experimenten mit 6 verschiedenen Spendern. Die Kultur erfolgte mit autologem Serum. Proben der Überstände und Lysate wurden auf HEp-2 Zellen gegeben (3.2.7). Die Zellen wurden nach 72 Stunden mit einem C.p.-spezifischen anti-MOMP Antikörper (3.1.5) angefärbt. Die mit dem FITC-konjugierten Antikörper direkt gefärbten Inklusionen wurden ausgezählt und auf 1 ml hochgerechnet (3.2.7). Die Verlängerung der Zeitachse bis Tag 8 dient nur der Übersicht, alle Experimente wurden nach Tag 7 beendet. IFU/ml inclusion forming unit pro ml Lysate DC inf. Überst. DC inf. Lysate Makrophagen Überst. Makrophagen Ergebnisse 114 4.3.7 Ergebnisse der quantitativen Analyse der chlamydialen Genexpression Um die in den einzelnen Zellpopulationen der verschiedenen Infektionsversuche vorhandenen Chlamydien besser charakterisieren zu können, wurde die Expression einiger ausgewählter Gene mittels TaqMan®-System untersucht. 4.3.7.1 Chlamydiale Genexpressionsmuster in den Infektionsversuchen mit humanem AB-Serum Die Ergebnisse der Infektionsversuche (4.3.6.1) zeigten eine Abnahme infektiöser Chlamydien in den primär infizierten DC und einen totalen Verlust der Infektiosität in den kokultivierten Makrophagen (4.3.6.1, Abb. 26). Trotzdem konnten mikroskopisch Chlamydien nachgewiesen werden (4.3.5). Die Expressionsanalyse sollte nun das Vorhandensein stoffwechselaktiver Chlamydien in den kokultivierten Zellpopulationen zeigen und eine genauere Bestimmung des Funktionszustandes dieser Chlamydien ermöglichen. Für den Nachweis der Stoffwechselaktivität wurde die Expression der 16S ribosomalen RNA untersucht (3.2.8.1 und 3.2.8.7). Abbildung 28 zeigt das Verhältnis der detektierten 16S rRNA im Verhältnis zur isolierten 16S DNA. Sowohl in den primär infizierten DC als auch in den kokultivierten Makrophagen ist zu jedem Zeitpunkt die Menge der RNA höher als die der DNA, was auf eine erhöhte Expression dieses Gens schließen lässt. Zusätzlich lässt sich erkennen, dass die Menge der aus den Makrophagen isolierten DNA über den Kulturzeitraum ansteigt. Die DNA kann hier als Marker für die Zahl der in den Makrophagen vorhandenen Chlamydien (unabhängig von ihrer Stoffwechselaktivität) gesehen werden und beweist so die Übertragung chlamydialer Partikel. In den primär infizierten DC ist ein solcher Anstieg der DNA nicht zu erkennen. Trotzdem sind in beiden Zellpopulationen die Chlamydien stoffwechselaktiv. Ergebnisse 115 16S DNA aus inf. DC 16S DNA aus Makrophagen 16S rRNA aus infizierten DC 16S rRNA aus Makrophagen 10 8 Zahl genomischer Kopien Zahl genomischer Kopien 10 8 10 7 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 1 3 Tage nach Infektion der DC 5 10 7 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 1 3 5 Tage nach Infektion der DC Abb. 28: Nachweis chlamydialer 16S DNA und 16S rRNA in den mit AB-Serum durchgeführten Infektionsversuchen (3.2.8). Aus den infizierten DC und den kokultivierten Makrophagen wurden sowohl chlamydiale DNA als auch RNA isoliert (3.2.8.3). Die RNA wurde in cDNA umgeschrieben (3.2.8.6). DNA und cDNA wurden quantitativ mittels TaqMan®-System im Dreifachansatz untersucht (3.2.8.7.2). Dargstellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen der dreifach bestimmten Mengen an chlamydialer 16S DNA und 16S rRNA der Proben aus den infizierten DC und den kokultivierten Makrophagen eines Experiments. Die höheren Werte für die rRNA zeigen eine erhöhte Expression und damit eine Stoffwechselaktivität der Chlamydien an. Zusätzlich nimmt die Zahl der DNA in den kokultivierten Makrophagen über den Verlauf des Experiments zu. Um diese chlamydialen Partikel noch näher zu charakterisieren, wurde die Expression von Genen untersucht, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Entwicklung von EK und RK benötigt werden (2.3.3). Abbildung 29 zeigt die relative Expression dieser Gene im Verhältnis zur Menge der 16S rRNA zum jeweiligen Untersuchungszeitraum. Somit wurde die Expression auf die zu diesem Zeitpunkt vorhandenen stoffwechselaktiven Chlamydien Ergebnisse 116 normalisiert. Während die Chlamydien in den primär infizierten DC ein gleichmäßiges Expressionsmuster im Verlauf der Infektion aufwiesen, zeigten die Chlamydien in den kokultivierten Makrophagen eine Abnahme des ompA-Gens. Die Expression der frühen Gene (2.3.3) blieb hingegen unverändert. Dies könnte auf eine Unterbrechung des chlamydialen Entwicklungszyklus hindeuten. Kokultivierte Makrophagen 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 10 1 Verhältnis mRNAx106/16S rRNA Verhältnis mRNAx106/16S rRNA Infizierte DC 1 3 Tage nach Infektion der DC 5 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 10 1 1 3 5 Tage nach Infektion der DC Abb. 29: Darstellung der relativen chlamydialen Genexpression in infizierten DC und kokultivierten Makrophagen bei Kultur mit hAB-Serum (3.2.8.1). Aus den infizierten DC und den kokultivierten Makrophagen wurden sowohl chlamydiale DNA als auch RNA isoliert (3.2.8.2 und 3.2.8.3). Die RNA wurde in cDNA umgeschrieben (3.2.8.6). DNA und cDNA wurden quantitativ mittels TaqMan®-System im Dreifachansatz je Probe untersucht (3.2.8.7.2). Die Menge der detektierten mRNA (respektive cDNA) der untersuchten Gene wurde auf die zum jeweiligen Zeitpunkt vorhandene Menge 16S rRNA normalisiert. Der Korrekturfaktor 106 gleicht die höheren Verluste der mRNA im Vergleich zur stabilen rRNA aus. Dargestellt sind die Mittelwerte der dreifach bestimmten Proben aus einem Experiment. Da in diesem Maßstab die Standardabweichungen in der linken Grafik nicht zu erkennen sind, wurde alternativ der Variationskoeffizient berechnet. Er betrug in allen Fällen weniger als 0,8%. Ergebnisse 117 mRNA messenger RNA; direkte Kopie der DNA rRNA ribosomale RNA euo euo-Gen; kodiert für ein Enzym, welches die Dekondensierung der Erbsubstanz ermöglicht groEL groEL-Gen; kodiert für das chlamydiale Hitzeschockprotein 60, in EK und RK exprimiert ompA ompA-Gen; kodiert für das MOMP (major outer membrane protein), wird in erhöhten Mengen bei der exponentiellen Vermehrung der RK benötigt EK Elementarkörper, die infektiöse Form von Chlp. pneumoniae RK Retikularkörper, die replikative Form von Chlp. pneumoniae 4.3.7.2 Chlamydiale Genexpressionsmuster in den Infektionsversuchen mit autologem Serum Die Infektionsversuche mit autologem Serum zeigten abweichende Befunde in Bezug auf das Vorhandensein infektiöser Chlamydien im Vergleich zu den Versuchen mit hABSerum (4.3.6). Mit autologem Serum entwickelten sich sowohl in den primär infizierten DC als auch in den kokultivierten Makrophagen infektiöse Chlamydien. Die Analyse der Genexpression mittel TaqMan®-Sonden wurde in gleicher Weise durchgeführt. Abbildung 30 zeigt zunächst wieder das Verhältnis der 16S DNA und 16S rRNA aus den beiden Zellpopulationen zu den unterschiedlichen Zeitpunkten. Auch hier zeigt der höhere Gehalt an RNA die Stoffwechselaktivität der Chlamydien an. In beiden Zellpopulationen sind also vitale Chlamydien nachweisbar. Ergebnisse 16S DNA aus inf. DC 16S DNA aus Makrophagen 16S rRNA aus infizierten DC 16S rRNA aus Makrophagen 8 10 7 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 10 1 10 0 Zahl genomischer Kopien Zahl genomischer Kopien 10 118 1 3 Tage nach Infektion der DC 5 1 3 5 Tage nach Infektion der DC Abb. 30: Nachweis chlamydialer 16S DNA und 16S rRNA in den mit autologem Serum durchgeführten Infektionsversuchen (3.2.8.1). Das Vorgehen ist unter Kap. 4.3.7.1, Abb. 28 näher beschrieben. Die höheren Werte für die rRNA zeigen eine erhöhte Expression und damit eine Stoffwechselaktivität der Chlamydien an. Dargestellt sind die Mittelwerte aus den dreifach bestimmten Proben eines Experiments. Zusätzlich wurden auch bei diesem Experiment drei der für den Entwicklungszyklus wichtigen Gene (2.3.3) auf ihre Expression untersucht. Die Ergebnisse sind in Abbildung 31 dokumentiert. Dabei wird vor allem in den kokultivierten Makrophagen deutlich, dass gerade die zu einem mittleren bzw. späten Zeitpunkt exprimierten Gene in beiden Zellpopulationen im Verlauf der Infektion ansteigen (Mittelwerte aus dreifach bestimmten Proben eines Experiments mit den Zellen eines Spenders). Besonders ompA zeigt dieses Expressionsmuster. Dies spricht für einen vollständig ablaufenden Entwicklungszyklus in beiden Zellpopulationen, sowohl in den primär infizierten DC als auch in den kokultivierten Makrophagen und stimmt mit der Infektiosität der Makrophagen (4.3.6.2, Abb. 27) überein. Ergebnisse 119 10 10 3 10 2 10 1 Kokultivierte Makrophagen Verhältnis mRNAx106/16S rRNA Verhältnis mRNAx106/16S rRNA Infizierte DC 4 1 3 10 4 10 3 10 2 10 1 5 Tage nach Infektion der DC 1 3 5 Tage nach Infektion der DC Abb. 31: Darstellung der relativen chlamydialen Genexpression in infizierten DC und kokultivierten Makrophagen bei Kultur mit autologem Serum. Aus den infizierten DC und den kokultivierten Makrophagen wurden sowohl chlamydiale DNA als auch RNA isoliert (3.2.8.2 und 3.2.8.3). Die RNA wurde in cDNA umgeschrieben (3.2.8.6). DNA und cDNA wurden quantitativ mittels TaqMan®-Sonden im Dreifachansatz je Probe untersucht (3.2.8.7.2). Die Menge der detektierten mRNA (respektive cDNA) der untersuchten Gene wurde auf die zum jeweiligen Zeitpunkt vorhandene Menge 16S rRNA normalisiert. Der Korrekturfaktor 106 gleicht die höheren Verluste der mRNA im Vergleich zur stabilen rRNA aus. In beiden Zellpopulationen steigt die Expression der zu einem mittleren bzw. späten Zeitpunkt im Entwicklunszyklus benötigten Gene (2.3.3) im Verlauf der Infektion an. mRNA messenger RNA; direkte Kopie der DNA rRNA ribosomale RNA euo euo-Gen; kodiert für ein Enzym, welches die Dekondensierung der Erbsubstanz ermöglicht groEL groEL-Gen; kodiert für das chlamydiale Hitzeschockprotein 60, in EK und RK exprimiert ompA ompA-Gen; kodiert für das MOMP (major outer membrane protein), wird in erhöhten Mengen bei der exponentiellen Vermehrung der RK benötigt EK Elementarkörper, die infektiöse Form von Chlp. pneumoniae RK Retikularkörper, die replikative Form von Chlp. pneumoniae Ergebnisse 4.4 120 Weiterführende Untersuchungen zu inhibitorischen Einflüssen der zur Kultur verwendeten Seren Die unter Kap. 4.3 beschriebenen Ergebnisse ergaben deutliche Unterschiede je nach Art des verwendeten Serums. Diese Befunde waren nicht erwartet worden und somit auch nicht Gegenstand der in diesem Projekt geplanten Arbeiten. Trotzdem sollte abschließend untersucht werden, ob sich Hinweise fänden, die das unterschiedliche Verhalten von Chlp. pneumoniae anhängig vom verwendeten Serum (autologes versus einheitliche Probe an gepooltem humanem AB-Serum) (4.3.6. und 4.3.7) erklären könnten. Hierzu wurden zwei weitere Experimente durchgeführt. Zuerst sollte mittels der für den Nachweis von Chlp. pneumoniae gut geeigneten HEp-2 Zellen überprüft werden, ob durch das hAB-Serum chlamydiales Wachstum inhibiert wird. Zusätzlich wurde mittels Immunfluoreszenzfärbung das hAB-Serum auf evtl. vorhandene Antikörper gegen Chlp. pneumoniae untersucht. Diese Antikörper hätten zur Hemmung der Entwicklung der Bakterien in den Makrophagen beitragen können. Beide Methoden werden im Anhang erläutert, an dieser Stelle sollen nur die Ergebnisse dargstellt werden. 4.4.1 Überprüfung inhibitorischer Effekte des hAB-Serums mit Hilfe der für Chlp. pneumoniae sensitiven HEp-2 Zelle Für den Nachweis infektiöser Chlamydien wurde in dieser Arbeit die HEp-2 Zelle genutzt. Die Kultur erfolgt dabei in der Regel mit dem Zusatz fetalen Kälberserums in einer Konzentration von 10% an der Gesamtmediummenge. Entsprechend einem Infektionsversuch (3.2.7) wurden bei diesem Experiment reine Chlamydienpräparationen auf HEp-2 Zellen gegeben, und zwar in unterschiedlichen Mengen (MOI 0,5; MOI 2; MOI 5). Die HEp-2 Zellen wurden mit Konzentrationen von 3%, 10% und 30% Serum kultiviert, Ergebnisse 121 sowohl mit regulär verwendetem fetalem Serum als auch mit humanem AB-Serum. Dabei zeigte sich in keinem der Versuchsansätze ein signifikanter Unterschied in der Zahl sich entwickelnder Chlamydien. Beispielhaft ist der Ansatz mit einer Serummenge von jeweils 10% dargestellt (Abb. 32), wie sie auch für die Infektionsversuche eingesetzt wurde. Eine Inhibition durch die Verwendung humanen AB-Serums konnte also zumindest in den HEp2 Zellen nicht nachgewiesen werden. 5000 IFU/ml 4000 3000 2000 1000 0 MOI 0,5 MOI 2 MOI 5 Zahl eingesetzter Chlamydien Abb. 32: Vergleich der Anzahl sich entwickelnder Chlamydien bei Verwendung unterschiedlicher Seren. HEp-2 Zellen wurden mit FKS und hAB-Serum (hier 10%) kultiviert und mit Chlp. pneumoniae infiziert (9.1.1). Nach 3 Tagen wurden die Zellen mit einem C.p.-spezifischen anti-MOMP Antikörper (3.1.5) gefärbt. Die mit dem FITCkonjugierten Antikörper direkt gefärbten Inklusionen wurden unter einem Fluoreszenzmikroskop (3.1.1) ausgezählt. Die Zahl der sich entwickelnden Inklusionen zeigt keine Unterschiede. IFU/ml inclusion forming units pro ml; Maß der Infektiosität MOI (Zahl) multiplicity of infection; Infektionsdosis; gibt an, wieviel infektiöse Chlamydien pro kultivierter Zelle bei der Infektion eingesetzt wurden FKS hAB Fetales KälberSerum humanes AB-Serum Ergebnisse 122 4.4.2 Überprüfung auf Antikörper gegen Chlp. pneumoniae im hAB-Serum mittels Immunfluoreszenzfärbung Um das Vorhandensein inhibierender Antikörper im hAB-Serum nachzuweisen, wurde eine modifizierte Immunfluoreszenzfärbung durchgeführt. Eine Chlamydienpräparation wurde direkt auf mehrere Objektträger gegeben und durch Trocknung fixiert. Danach wurden die Präparate mit Pferdeserum versehen, um eine unspezifische Anfärbung zu vermeiden. Anschließend wurde hAB-Serum unverdünnt aufgetropft und für 30 min inkubiert. Evtl. darin enthaltene Antikörper sollten als primäre Antikörper an die Chlamydien binden. Zum Nachweis wurde zuletzt ein FITC-markierter Sekundärantikörper aufgetragen, der gegen humanes Immunglobulin G gerichtet war (3.1.5). Er sollte gebundene Primärantikörper detektieren und sichtbar machen. Die im Fluoreszenzmikroskop erhaltenen Bilder sind in Abbildung 33 zu sehen. Dabei zeigte sich im Vergleich zu einer Positivkontrolle keine Anfärbung chlamydialer Partikel. Der stark grün leuchtende Hintergrund entsteht durch die automatisch maximale Belichtung der Kamera, da ein sich vom Hintergrund abhebendes Fluoreszenzsignal wie im linken Bild fehlt. Somit konnten im Serum enthaltene Antikörper zumindest mit diesem Verfahren nicht nachgewiesen werden. Ergebnisse 123 Abb. 33: Versuch der direkten Anfärbung von Chlp. pneumoniae durch im hABSerum enthaltene Antikörper. Eine Chlamydienpräparation wurde direkt auf Objektträgern getrocknet. hAB-Serum wurde aufgetragen (9.1.2), um evtl. enthaltenen Antikörpern gegen Chlamydien eine Bindung zu ermöglichen. Die Präparate wurden danach mit einem FITC-markierten polyklonalen Antikörper gegen humane Immunglobuline (3.1.5) gefärbt und unter einem Fluoreszenzmikroskop (3.1.1) ausgewertet. Die grünen Punkte im linken Bild zeigen die angefärbten Chlamydien in der 6S DNA aus inf. DC 16S DNA aus Makrophagen 16S rRNA aus Makrophagen 1 3 5 10 2 10 Diskussion 5 124 Diskussion Chlamydophila pneumoniae gehört zu den am weitesten verbreiteten Bakterien der Familie der Chlamydiaceae. Trotz einer sehr hohen Seroprävalenz ist die klinische Bedeutung akuter Infektionen allerdings gering, da diese meist asymptomatisch verlaufen. Umso bedeutsamer sind die Befunde der letzten Jahre, die eine Assoziation von Chlp. pneumoniae mit vielen chronischen Erkrankungen nahe legen. Besonders die mögliche Beteiligung an Gefäßerkrankungen wie Atherosklerose mit ihren teils dramatischen Folgen eines Gefäßverschlusses ließ die Bedeutung der chronischen Chlamydieninfektion in das Interesse der Forschung rücken. So wurde Chlp. pneumoniae direkt in Makrophagen und dendritischen Zellen nachgewiesen, beides Zelltypen, die eigentlich eindringende Bakterien aufnehmen und abbauen sollten. Außerdem sind beide Zelltypen mögliche Kandidaten für eine Ausbreitung des Erregers vom primären Eintrittsort, dem respiratorischen Systems, in andere Teile des Organismus. Im Tiermodell wurde für Makrophagen diese Hypothese bereits experimentell belegt. Da sowohl dendritischen Zellen als auch Makrophagen eine bedeutende Rolle bei einer Infektion mit Chlp. pneumoniae zukommt, sollte im Rahmen der Doktorarbeit das Verhalten dieser beiden Zellarten bei gemeinsamer Kultur in einem Modell untersucht werden. Dabei lagen die Schwerpunkte bei folgenden Fragestellungen: Etabliert sich in dendritischen Zellen bei Anwesenheit von Makrophagen eine Infektion mit Chlamydophila pneumoniae? Kann das Bakterium von dendritischen Zellen auch ohne Zellkontakt auf die kokultivierten Makrophagen übertragen werden? Diskussion 125 Wie verhalten sich die in den beiden Zellarten gefundenen Chlamydien in Hinblick auf ihre Infektiosität und die vorherrschende Entwicklungsform? Die vorgestellten Experimente sollten zur Beantwortung dieser Fragen beitragen. Somit sollten in einem in-vitro Modell Einblicke gewonnen werden, um das Verhalten von Chlp. pneumoniae besser verstehen zu können. 5.1 Infizierbarkeit dendritischer Zellen und Makrophagen im Modell 5.1.1 Etablierung einer Infektion mit Chlp. pneumoniae in dendritischen Zellen Bisher wurde das Verhalten von Chlp. pneumoniae-infizierten DC nur in wenigen experimentellen Ansätzen untersucht. In der eigenen Arbeitsgruppe konnte jedoch ein invitro Modell entwickelt werden, in dem humane DC mit dem Erreger infiziert und über drei Wochen kultiviert wurden. Die Möglichkeit, humane DC mit Chlp. pneumoniae zu infizieren, kann mit den Kokulturexperimenten bestätigt werden. Auf der Transwell-Membran kultivierte DC lassen die Entwicklung chlamydialer Inklusionen zu. Das Vorkommen dieser Inklusionen kann als Zeichen der chlamydialen Entwicklung gewertet werden. Auch die Anwesenheit kokultivierter Makrophagen verhindert den Nachweis dieser Inklusionen nicht (Kap. 4.1.3). Dabei ist hervorzuheben, dass der Nachweis chlamydialer Partikel alleine noch keinen Schluss auf die Entwicklung zulässt. So ließen sich nach Infektion dendritischer Zellen mit C. trachomatis chlamydiale Partikel darstellen, obwohl keine infektiösen Nachkommen ausgebildet wurden (OJCIUS et al. 1998). Die Darstellung größerer Inklusionen jedoch zeigt, dass die intrazellulären Partikel in den Entwicklungszyklus eingetreten sind. Diskussion 126 Doch nicht nur mikroskopisch lässt sich die Entwicklung der Chlamydien innerhalb der DC nachweisen. Auch die Infektionsversuche sprechen für den Ablauf des chlamydialen Entwicklungszyklus. Sowohl in den infizierten DC, die mit hAB-Serum kultiviert wurden, als auch in den mit autologem Serumzusatz kultivierten Zellen lassen sich infektiöse Chlamydien isolieren und auf HEp-2 Zellen nachweisen (Kap. 4.3.6). Dabei kommt es in den ersten zwei Tagen zu einem Rückgang der Zahl infektiöser Chlamydien. Dieser Befund deckt sich mit den Befunden in anderen Zellarten (HARANAGA et al. 2002). Verantwortlich dafür ist die Umbildung der infektiösen EK in die reproduktive Form der RK. Diese lassen sich im Infektionstest nicht mehr nachweisen. An Tag 3 nach Infektion kommt es in den denritischen Zellen wieder zu einem Anstieg der Zahl infektiöser Chlamydien. Gemäß den Beobachtungen des Entwicklungszyklus in epithelialen Zellen fällt dies zeitlich mit der Rekondensierung der gebildeten RK zu infektiösen Elementarkörpern zusammen (WOLF et al. 2000). Da in dem verwendeten Kokulturmodell nur zu Beginn eine definierte Zahl an Chlamydien zugesetzt wurde und chlamydiale Partikel außerhalb von Zellen nicht lange lebensfähig sind, ist es sehr wahrscheinlich, dass der verzeichnete Anstieg durch eine Vermehrung der Chlamydien innerhalb der dendritischen Zellen bedingt ist. Die Infektion der dendritischen Zellen führt zu einer Veränderung ihrer Morphologie. Im Vergleich zum Zustand während der Konditionierung bilden die Zellen ihre Ausläufer zurück und runden sich ab. Diese Veränderung kann nur bei den infizierten DC dokumentiert werden, die Schein-infizierten Zellen behalten die während der Konditionierung angenommenen morphologischen Charakteristika bei. Daher müssen die Veränderungen der Zellgestalt auf die Infektion zurückzuführen sein. Dabei kann der Verlust der Ausläufer als Zeichen der Maturation gedeutet werden. Die dendritischen Zellen reagieren also auf die aufgenommenen Chlamydien wie auf andere internalisierte Antigene. Trotzdem sind sie in dem Modell nicht in der Lage, die Chlamydien abzubauen. Diskussion 127 5.1.2 Aufnahme von Chlp. pneumoniae durch Makrophagen und Entwicklung des Erregers In der Literatur wurde bisher nicht beschrieben, ob aus Monozyten generierte Makrophagen Chlp. pneumoniae ohne zusätzliche Maßnahmen aufnehmen. Die Untersuchungen zum Schicksal des Erregers innerhalb von Makrophagen wurden immer durch Zentrifugation eingeleitet (AIRENNE et al. 2000). In den Voruntersuchungen zu diesem Kokulturmodell zeigte sich, dass Makrophagen innerhalb von einem Tag chlamydiale Partikel aus dem Medium aufnehmen. Diese konnten mittels Immunfluoreszenzfärbung dargestellt werden (Kap. 4.1.4). Zusätzlich entwickelten sich die so aufgenommenen Chlamydien weiter und bildeten innerhalb der Makrophagen Einschlusskörper aus. Diese zeigten während des Infektionsverlaufs eine Größenzunahme. Die Ausbildung von Inklusionen zeigt wie bei den infizierten DC an, dass der Erreger nicht nur aufgenommen wird, sondern sich in den Makrophagen weiterentwickeln kann. Neben Inklusionen finden sich auch kleine chlamydiale Partikel innerhalb der Makrophagen. Es ist denkbar, dass es sich dabei um Chlamydien handelt, die während des Versuchsablaufes ständig neu aus dem Kulturmedium aufgenommen werden. Dies würde bedeuten, dass die Infektion und die Entwicklung der Chlamydien in den Inklusionen keine Reaktion im Makrophagen auslösen, die ihn vor weiterer Infektion schützt. Allerdings könnten die zu einem späteren Zeitpunkt aufgenommene Chlamydien zumindest in ihrer weiteren Entwicklung gehemmt werden. Makrophagen reagieren bei Infektion mit intrazellulären Erregern wie Mycobakterien mit der Synthese und Sekretion von Interferon-gamma (FENTON et al. 1997). Auch bei einer Infektion mit Chlp. pneumoniae zeigen Makrophagen diese Reaktion (ROTHFUCHS et al. 2001). Normalerweise wird dieses Interferon nach Kontakt mit infizierten Makrophagen durch TZellen sezerniert. Es aktiviert die infizierten Makrophagen und löst in ihnen die Bildung radikaler Sauerstoffspezies sowie Stickstoffmonoxyds aus, die beide keimtötend wirken. Das von den Makrophagen selbst gebildete Interferon-gamma scheint über einen Diskussion 128 autokrinen Signalweg die gleiche Funktion zu erfüllen. Es ist also denkbar, dass durch die Aktivierung des Makrophagen zwar die Infektion nicht verhindert, aber die Entwicklung der später aufgenommenen chlamydialen Partikel beeinträchtigt wird. Allerdings muss kritisch darauf verwiesen werden, dass es auch in anderen Zelltypen bei einmaliger Infektion mit Chlp. pneumoniae zur simultanen Ausbildung von Einschlusskörpern und einzelnen chlamydialen Partikeln kommt, wofür als Ursache eine Konkurrenz um bereitgestellte Nährstoffe diskutiert wird (WOLF et al. 2000). 5.2 Übertragung von Chlp. pneumoniae von infizierten DC auf kokultivierte Makrophagen Eines der Hauptziele dieser Arbeit war, die mögliche Übertragung von Chlamydophila pneumoniae zwischen dendritischen Zellen und Makrophagen zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden beide Zellarten in einem Kultursystem zusammengebracht, blieben aber durch eine poröse Membran voneinander getrennt. Wie in Kap. 4.3.5 gezeigt, ließen sich in den kokultivierten Makrophagen aufgenommene Chlamydien anfärben. Dabei wird besonders bei der Auswertung mittels Immunfluoreszenz deutlich, dass es sich aufgrund der Größe der angefärbten Objekte um chlamydiale Inklusionen handelt. Daraus kann abgeleitet werden, dass die aus den infizierten DC stammenden Chlamydien nicht nur von den kokultivierten Makrophagen aufgenommen werden, sondern in ihnen ihren Entwicklungszyklus einleiten. Das bestätigt den für direkt mit Chlp. pneumoniae kultivierten Makrophagen erhobenen Befund (Kap. 5.1.2) und steht in Übereinstimmung mit Untersuchungen anderer Arbeitsgruppen (AIRENNE et al. 2000; HARANAGA et al. 2003). Die Erkenntnis, dass eine solche Übertragung auch gegen die Schwerkraft funktioniert (Kap. 4.3.5.3), erweitert die Einsatzmöglichkeiten des verwendeten Kultursystems. Da sich die Einsätze problemlos zu jeder Zeit entfernen und durch andere ersetzten Diskussion 129 lassen, ist es möglich, die zu untersuchenden Zielzellen im oberen Kompartiment zu kultivieren. Somit lassen sich die Auswirkungen spezieller Konditionierungsverfahren auf die Infizierbarkeit der Zellen austesten. Für Makrophagen konnte zum Beispiel schon gezeigt werden, dass die Gabe von Interferon-gamma die Aufnahme und Entwicklung von Chlp. pneumoniae behindert (AIRENNE et al. 2000). Es ist denkbar, Makrophagen mit unterschiedlichen Konzentrationen dieses Zytokins zu konditionieren und danach mit infizierten DC zu kokultivieren. Somit könnte eine evtl. vorhandene protektive Wirkung des Interferon-gamma weiter untersucht werden. 5.3 Charakterisierung der übertragenen Chlamydien in Hinblick auf ihre Infektiosität und ihre Entwicklungsform Bei der Untersuchung zur Infektiosität der übertragenen Chlamydien im HEp-2 Infektionstest wurden deutliche Unterschiede gefunden. Nur bei den mit autologem Serum konditionierten Zellen entwickelten sich in den Makrophagen infektiöse Chlamydien. Bei Verwendung humanen AB-Serums zeigten die aus den Makrophagen isolierten Chlamydien keine Infektiosität in HEp-2 Zellen. Es ist bekannt, dass Chlp. pneumoniae in unterschiedlichen Makrophagenpopulationen verschieden hohe Anzahlen infektiöser Nachkommen produziert (GAYDOS et al. 1996). Das vollständige Ausbleiben infektiöser Nachkommen bei aus Monozyten generierten Makrophagen, die nur mit unterschiedlichem Serum generiert wurden, ist bisher aber unbekannt. Aufschluss über den Zustand der Chlamydien gab die durchgeführte Analyse der chlamydialen Genexpression. Als Zeichen der Vitalität der in den Makrophagen enthaltenden Chlamydien wurde die Expression der ribosomalen 16S RNA gewertet (MATHEWS et al. 1999; HOGAN et al. 2003). Die von den Makrophagen aufgenommenen Chlamydien produzieren vergleichbare Mengen der 16S rRNA wie die infizierten Diskussion 130 dendritischen Zellen (Kap. 4.3.7.1, Abb. 28). Der Verlust der Infektiosität lässt sich also nicht durch ein Absterben der aufgenommenen Chlamydien erklären. Die fehlende Infektiosität könnte auch ein Hinweis auf eine Unterbrechung des Entwicklungszyklus sein. So lassen sich chlamydiale Retikularkörper nicht in einem Infektiositätstest nachweisen, obwohl sie stoffwechselaktiv sind. In den mit hAB-Serum kultivierten Makrophagen zeigen die Chlamydien tatsächlich ein ungewöhnliches Muster der Expression der untersuchten Gene, die zur Charakterisierung des Entwicklungszyklus untersucht wurden. Wie in Kap. 4.3.7.1, Abb. 29 dargestellt, sank vor allem die Expression des ompA-Gens innerhalb von 5 Tagen stark ab, während es in den infizierten DC keine Reduktion der Expression gab. ompA kodiert für das Hauptmembranprotein MOMP und wird besonders bei der exponentiellen Vermehrung der RK exprimiert. Die sinkende Expressionsrate könnte dadurch bedingt sein, dass der chlamydiale Entwicklungszyklus bei der Vermehrung der Retikularkörper unterbrochen wird. Die Umwandlung vom EK in RK wird noch nicht behindert, was sich an der gleich bleibenden Expression des euo-Gens erkennen lässt, erst die Vermehrung der RK wird gestört. Der Vergleich zu den Chlamydien, die in den mit autologem Serum kultivierten Makrophagen infektiöse Nachkommen bilden, zeigt ebenfalls einen Unterschied bei der Expression des ompA. Dieses Gen wird von den Chlamydien, die infektiöse EK ausbilden, auch an Tag 5 nach Infektion deutlich exprimiert. Die Unterbrechung des Entwicklungszyklus in der Vermehrungsphase der Retikularkörper bei erhaltener Vitalität weist auf den Zustand der Persistenz hin. Allerdings muss angemerkt werden, dass die Expression von ompA bei verschiedenen Modellen zur Persistenz nicht vermindert, sondern erhöht war (HOGAN et al. 2004). Dabei wurde die Persistenz jedoch in epithelialen Zellen durch Gabe von Interferon-gamma oder durch kontinuierliche Kultur künstlich ausgelöst. Die Tatsache, dass in den hier beobachteten Makrophagen die Chlamydien weniger ompA exprimieren, könnte durch das Fehlen eines Stimulus oder die Anwesenheit der kokultivierten DC bedingt sein. Diskussion 131 Natürlich ist es auch denkbar, dass schon die infizierten dendritischen Zellen die Chlamydien verändern und dadurch der Verlust der Infektiosität zu erklären ist. Allerdings zeigen die Erreger in den infizierten DC kein wesentlich unterschiedliches Expressionsmuster ihrer Gene. Sowohl in mit hAB-Serum als auch in mit autologem Serum kultivierten Zellen sind die Chlamydien stoffwechselaktiv und exprimieren die drei untersuchten Gene des Entwicklungszyklus in vergleichbarer Intensität. 5.4 Mögliche Beeinflussung der Makrophagen durch das Serum Die Chlamydien in den mit hAB-Serum kultivierten Makrophagen zeigten einen Verlust der Infektiosität und ein möglicherweise auf Persistenz hinweisendes Expressionsmuster der untersuchten Gene. Daher musste von einer Beeinflussung der Zellen und/oder der Chlamydien durch das hAB-Serum ausgegangen werden. Die Untersuchungen hierzu ergaben jedoch keinen inhibitorischen Effekt des hAB-Serums auf die chlamydiale Entwicklung (Kap. 4.4.1). Auch gegen den Erreger gerichtete Antikörper, die zu einer Markierung der Elementarkörper mit anschließender Aktivierung der Makrophagen im Sinne einer antikörpervermittelten Immunantwort geführt hätten, konnten nicht nachgewiesen werden (Kap. 4.4.2). Neben einer direkten Beeinflussung der Chlamydien ist aber auch ein Effekt des hAB-Serums auf die Makrophagen denkbar. Dabei muss berücksichtigt werden, dass die Makrophagen aus peripheren monozytären Zellen generiert werden. Das beschriebene Verfahren mit 10%igem Serumzusatz kann dabei als standardisiert angesehen werden. Trotzdem ergaben sich bereits während der Konditionierung morphologische Unterschiede der Makrophagen im Vergleich zu mit autologem Serum generierten Zellen. So blieben die mit hAB-Serum kultivierten Zellen kleiner und hatten einen schmaleren Zytoplasmasaum. Diskussion 132 Da für Monozyten bei Infektion mit Chlp. pneumoniae ein Persistenz-ähnlicher Zustand bereits beschrieben wurde (AIRENNE et al. 1999), besteht der Verdacht, dass Unterschiede im Grad der Entwicklung vom Monozyten zum Makrophagen für die unterschiedliche chlamydiale Infektiosität verantwortlich sind. Die durchgeführte Analyse der Oberflächenmoleküle (Kap. 4.3.2.2) ergab allerdings keinen Unterschied zu den mit autologem Serum konditionierten Zellen, in denen sich infektiöse Chlamydien bildeten. Dabei hätten z. B. die Moleküle CD 14 und CD 33 bei Makrophagen schwächer exprimiert werden sollen als bei Zellen, die noch den Charakter von Monozyten aufweisen (ANCUTA et al. 2000). Solche Unterschiede zwischen den beiden Makrophagenpopulationen waren jedoch nicht zu beobachten. Allerdings sind für eine abschließende genaue Charakterisierung der Entwicklungsstufen vom Monozyten zum Makrophagen wesentlich mehr untersuchte Oberflächenmoleküle nötig. Oft werden sogar noch Phagozytoseaktivität oder Lymphozytenstimulationsversuche herangezogen (ALLAVENA et al. 1998; ANCUTA et al. 2000; YAMAGUCHI et al. 2002). Anhand der hier durchgeführten Analysen lassen sich eindeutige Unterschiede nicht nachweisen. Lediglich die Morphologie der mit hABSerum kultivierten Zellen könnte ein Hinweis auf einen Entwicklungsstand sein, der das Entstehen einer persistenten Infektion zulässt. 5.5 Schlussbemerkung Das vorgestellte Kokulturmodell ermöglicht Einblicke in die Interaktionen zwischen dendritischen Zellen, Makrophagen und Chlamydophila pneumoniae. So konnte in diesem Modell die Empfänglichkeit der DC für eine produktive Infektion mit Chlp. pneumoniae bestätigt werden. Die nachgewiesene Übertragung dieser Infektion auf kokultivierte Makrophagen ohne Zellkontakt hat zusätzlich die Bedeutung dieser beiden Zellarten für Diskussion 133 die Pathogenese chlamydialer Erkrankungen unterstrichen. Beide Zellarten sind in gemeinsamer Kultur für den Erreger empfänglich, so dass auch beide Zellarten als potentielle Vektoren für die Ausbreitung von Chlp. pneumoniae vom respiratorischen System in die Peripherie in Betracht zu ziehen sind. Die bisherige Favorisierung der Makrophagen bei dieser Ausbreitung sollte dabei überdacht werden. Dendritische Zellen sind nicht nur zentral wichtige Zellen der Immunüberwachung des respiratorischen Systems und nehmen als professionelle antigenpräsentierende Zellen selbst in einem gesunden Organ aerogene Erreger auf, sie sind auch besonders effizient in der Verteilung im Organismus, insbesondere in den sekundären Immunorganen. Daher sollten sie bei der Diskussion um die Verbreitung der Chlamydien im Organismus bevorzugt berücksichtigt werden. Die Rolle sowohl dendritischer Zellen als auch Makrophagen als Vektoren lässt auch eine Weitergabe des Erregers in der Peripherie möglich erscheinen und könnte erklären, weshalb das Bakterium bei chronischen Krankheitsprozessen sowohl in Makrophagen als auch in dendritischen Zellen nachgewiesen werden konnte. Natürlich ist die Beschränkung auf die beiden Zellarten eine Vereinfachung des in-vivo Zustandes. Dennoch konnte gezeigt werden, dass das verwendete Kultursystem sich gut für Untersuchungen verschiedener Zellpopulationen eignet. Durch die Wahl der experimentellen Ansätze könnte so die Rolle der monozytären Zellen für die Pathogenese der Chlamydieninfektion weiter untersucht werden. Schließlich ließen sich modulatorische Einflüsse durch Botenstoffe und Mediatoren hinzufügen und sogar Zellen des adaptiven Immunsystems wie T-Lymphozyten mit kultivieren. So könnten mit einem derartigen in-vitro Kulturmodell wertvolle Einblicke in die Zusammenhänge in-vivo erlangt werden. Zusammenfassung 6 134 Zusammenfassung Matthias Peppmüller (2005) Bedeutung dendritischer Zellen und Makrophagen für die Infektion und Vermehrung von Chlamydophila pneumoniae. Untersuchungen in einem neu entwickelten in vitro Kokulturmodell. Das intrazelluläre Bakterium Chlamydophila pneumoniae gehört nach Untersuchungen beim Menschen zu den am weitesten verbreiteten Erregern aus der Familie der Chlamydiaceae. Obwohl akute Infektionen nur selten klinisch manifest werden, ist Chlp. pneumoniae doch bei vielen chronischen Krankheitsprozessen nachgewiesen worden. Dazu gehören Gefäßerkrankungen wie die Atherosklerose, Atemwegserkrankungen wie Asthma und neurodegenerative Prozesse wie Morbus Alzheimer. Der Nachweis des Erregers gelang dabei vor allem in Makrophagen und dendritischen Zellen, beides Zellarten, die für die Aufnahme und den Abbau eindringender Pathogene verantwortlich gemacht werden. Um die Bedeutung dieser beiden Zellarten für die Infektion mit Chlp. pneumoniae und ihre Rolle als mögliche Vektoren für eine Ausbreitung des Erregers im Organismus besser zu verstehen, sollten Makrophagen und dendritische Zellen in einem gemeinsamen Kulturmodell bei Infektion mit dem Bakterium untersucht werden. Aus humanen Monozyten wurden sowohl dendritische Zellen als auch Makrophagen generiert. Deren Eignung für die geplanten Untersuchungen wurde zunächst durch separate Infektion mit Chlp. pneumoniae überprüft. Danach erfolgten die Untersuchungen in einem gemeinsamen Kokultursystem, in dem die beiden Zellarten jedoch keinen direkten Kontakt haben können. Die dendritischen Zellen wurden mit Chlp. pneumoniae infiziert, gewaschen und anschließend räumlich getrennt von Makrophagen mit diesen zusammen kultiviert. Eine zellundurchlässige Membran (0,4 µm Porengröße) trennte dabei die Zellarten voneinander. Die Poren in der Membran erlaubten jedoch den Austausch von Zusammenfassung 135 Medium und infektiösen Elementarkörpern der Bakterien. Die Entwicklung der Chlamydien in den beiden Zellpopulationen wurde mittels immunhistochemischen und immunfluoreszenztechnischen Methoden dokumentiert. Zur Überprüfung der Infektiosität wurden Proben aus beiden Zellarten auf HEp-2 Zellen als empfindliche Indikatorzellen gegeben und so die Zahl infektiöser Nachkommen bestimmt. Zusätzlich wurde mit Hilfe der real-time RT-PCR die Expression chlamydialer Gene untersucht, um die Entwicklung von Chlp. pneumoniae in den Zellarten besser charakterisieren zu können. Die Hauptergebnisse dabei sind: 1. Sowohl dendritische Zellen als auch Makrophagen lassen sich mit Chlp. pneumoniae infizieren. Der Erreger kann sich in beiden Zellarten weiterentwickeln. 2. Makrophagen sind in der Lage, den Erreger direkt aus dem umgebenden Medium aufzunehmen. 3. Die Infektion kann von dendritischen Zellen ohne Zellkontakt auf Makrophagen übertragen werden. Dabei sind die übertragenen Chlamydien auch in den Makrophagen weiterhin vital. 4. Die Art des für die Kultur verwendeten Serums kann entscheidenden Einfluss auf die Infektiosität der übertragenen Chlamydien nehmen. 5. Die Genexpressionsanalyse zeigt bei Verwendung humanen AB-Serums eine Unterbrechung des chlamydialen Entwicklungszyklus, der in Anwesenheit von autologem Serum gefördert wird. Die Ergebnisse zeigen, dass das verwendete Kultursystem gut zur Untersuchung zwei verschiedener Zellarten bei Infektion mit Chlp. pneumoniae geeignet ist. Summary 7 136 Summary Matthias Peppmüller (2005) Participation of dendritic cells and macrophages in infection and propagation of Chlamydophila pneumoniae. Studies in a newly developed coculture system in vitro. The intracellular bacterium Chlamydophila pneumoniae is one of the most common pathogens of the family of Chlamydiaceae as studies in humans suggest. Although acute infections seldom manifest themselves clinically, Chlp. pneumoniae has been detected within a lot of chronic diseases. Vascular diseases like atherosclerosis, respiratory ailment like asthma or neurodegenerative processes like Morbus Alzheimer are only examples for this. Detection of the bacterium succeded especially in macrophages and dendritic cells, both cell types, which are held to be responsible for ingestion and degradation of invading pathogens. To understand the importance of these cell types for Chlp. pneumoniae infection and their role as possible vectors for dissemination of the pathogen in the organism in a better way, macrophages and dendritic cells should be studied together in a culture model during chlamydial infection. From human monocytes, dendritic cells as well as macrophages were generated. First their suitability for the intended analysis was verified by separate infection with Chlp. pneumoniae. Then the analysis in a common coculture system, which allows no direct cell contact, followed. Dendritic cells were infected with Chlp. pneumoniae, washed and cultured spatially seperated together with macrophages. A membrane impermeable for cells (0,4 µm pore size) separated both cell types: Pores in the membrane allowed the exchange of medium and infective elementary bodies of the bacterium. Chlamydial development in both cell populations was documented with immunhistochemical methods and immunofluorescence. To verify infectivity, samples from both cell types were transferred on HEp-2 cells as a sensitive indicator cell line to determine the number of Summary 137 infective progeny. Additionally, the expression of chlamydial genes was analysed by realtime RT-PCR to characterize the development of Chlp. pneumoniae inside the cells. The major results are: 1. Dendritic cells as well as macrophages can be infected with Chlp. pneumoniae. The bacterium can develop in both cell types. 2. Macrophages are able to ingest the pathogen directly from the culture medium. 3. The infection can be transmitted without cell contact from dendritic cells to macrophages. The transmitted chlamydia stay viable inside the macrophages. 4. The kind of serum used for cell culture can influence decisively the infectivity of the transmitted chlamydia. 5. Analysis of chlamydial gene expression shows an interruption of the chlamydial growth cycle when human AB-serum is used for culture. Autologous serum supports the chlamydial growth cycle. The results indicate, that the used culture model is suitable to investigate two different cell types during infection with Chlamydophila pneumoniae. Literaturverzeichnis 8 138 Literaturverzeichnis AIRENNE, S., H. M. SURCEL, H. ALAKARPPA, K. LAITINEN, J. PAAVONEN, P. SAIKKU u. A. LAURILA (1999): Chlamydia pneumoniae infection in human monocytes. Infect Immun. 67, 3, 1445-1449 AIRENNE, S., H. M. SURCEL, A. BLOIGU, K. LAITINEN, P. SAIKKU u. A. LAURILA (2000): The resistance of human monocyte-derived macrophages to Chlamydia pneumoniae infection is enhanced by interferon-gamma. Apmis. 108, 2, 139-144 ALLAVENA, P., L. PIEMONTI, D. LONGONI, S. BERNASCONI, A. STOPPACCIARO, L. RUCO u. A. MANTOVANI (1998): IL-10 prevents the differentiation of monocytes to dendritic cells but promotes their maturation to macrophages. Eur J Immunol. 28, 1, 359-369 AL-YOUNES, H. M., T. RUDEL, V. BRINKMANN, A. J. SZCZEPEK u. T. F. MEYER (2001): Low iron availability modulates the course of Chlamydia pneumoniae infection. Cell Microbiol. 3, 6, 427-437 ANCUTA, P., L. WEISS u. N. HAEFFNER-CAVAILLON (2000): CD14+CD16++ cells derived in vitro from peripheral blood monocytes exhibit phenotypic and functional dendritic cell-like characteristics. Eur J Immunol. 30, 7, 1872-1883 AUSTYN, J. M. (1996): New insights into the mobilization and phagocytic activity of dendritic cells. J Exp Med. 183, 4, 1287-1292 Literaturverzeichnis 139 BALIN, B. J., H. C. GERARD, E. J. ARKING, D. M. APPELT, P. J. BRANIGAN, J. T. ABRAMS, J. A. WHITTUM-HUDSON u. A. P. HUDSON (1998): Identification and localization of Chlamydia pneumoniae in the Alzheimer's brain. Med Microbiol Immunol (Berl). 187, 1, 23-42 BEATTY, W. L., R. P. MORRISON u. G. I. BYRNE (1994): Persistent chlamydiae: from cell culture to a paradigm for chlamydial pathogenesis. Microbiol Rev. 58, 4, 686-699 BEN-YAAKOV, M., G. ESHEL, L. ZAKSONSKI, Z. LAZAROVICH u. I. BOLDUR (2002): Prevalence of antibodies to Chlamydia pneumoniae in an Israeli population without clinical evidence of respiratory infection. J Clin Pathol. 55, 5, 355-358 BLOCK, S. L., M. R. HAMMERSCHLAG, J. HEDRICK, R. TYLER, A. SMITH, P. ROBLIN, C. GAYDOS, D. PHAM, T. C. QUINN, R. PALMER u. J. MCCARTY (1997): Chlamydia pneumoniae in acute otitis media. Pediatr Infect Dis J. 16, 9, 858-862 BRUU, A. L., G. HAUKENES, S. AASEN, J. T. GRAYSTON, S. P. WANG, O. G. KLAUSEN, H. MYRMEL u. V. HASSELTVEDT (1991): Chlamydia pneumoniae infections in Norway 1981-87 earlier diagnosed as ornithosis. Scand J Infect Dis. 23, 3, 299-304 BUSH, R. M. u. K. D. EVERETT (2001): Molecular evolution of the Chlamydiaceae. Int J Syst Evol Microbiol. 51, Pt 1, 203-220 CAMPBELL, L. A., E. R. O'BRIEN, A. L. CAPPUCCIO, C. C. KUO, S. P. WANG, D. STEWART, D. L. PATTON, P. K. CUMMINGS u. J. T. GRAYSTON (1995): Detection of Chlamydia pneumoniae TWAR in human coronary atherectomy tissues. J Infect Dis. 172, 2, 585-588 CHI, E. Y., C. C. KUO u. J. T. GRAYSTON (1987): Unique ultrastructure in the elementary body of Chlamydia sp. strain TWAR. J Bacteriol. 169, 8, 3757-3763 Literaturverzeichnis 140 COSTA, C. P., C. J. KIRSCHNING, D. BUSCH, S. DURR, L. JENNEN, U. HEINZMANN, S. PREBECK, H. WAGNER u. T. MIETHKE (2002): Role of chlamydial heat shock protein 60 in the stimulation of innate immune cells by Chlamydia pneumoniae. Eur J Immunol. 32, 9, 2460-2470 CSANGO, P. A., S. HARALDSTAD, J. E. PEDERSEN, G. JAGARS u. I. FORELAND (1997): Respiratory tract infection due to Chlamydia pneumoniae in military personnel. Scand J Infect Dis Suppl. 104, 26-29 EKMAN, M. R., J. T. GRAYSTON, R. VISAKORPI, M. KLEEMOLA, C. C. KUO u. P. SAIKKU (1993): An epidemic of infections due to Chlamydia pneumoniae in military conscripts. Clin Infect Dis. 17, 3, 420-425 EMRE, U., P. M. ROBLIN, M. GELLING, W. DUMORNAY, M. RAO, M. R. HAMMERSCHLAG u. J. SCHACHTER (1994): The association of Chlamydia pneumoniae infection and reactive airway disease in children. Arch Pediatr Adolesc Med. 148, 7, 727-732 EVERETT, K. D., R. M. BUSH u. A. A. ANDERSEN (1999): Emended description of the order Chlamydiales, proposal of Parachlamydiaceae fam. nov. and Simkaniaceae fam. nov., each containing one monotypic genus, revised taxonomy of the family Chlamydiaceae, including a new genus and five new species, and standards for the identification of organisms. Int J Syst Bacteriol. 49 Pt 2, 415-440 FENTON, M. J., M. W. VERMEULEN, S. KIM, M. BURDICK, R. M. STRIETER u. H. KORNFELD (1997): Induction of gamma interferon production in human alveolar macrophages by Mycobacterium tuberculosis. Infect Immun. 65, 12, 5149-5156 Literaturverzeichnis 141 GAYDOS, C. A., J. T. SUMMERSGILL, N. N. SAHNEY, J. A. RAMIREZ u. T. C. QUINN (1996): Replication of Chlamydia pneumoniae in vitro in human macrophages, endothelial cells, and aortic artery smooth muscle cells. Infect Immun. 64, 5, 1614-1620 GERARD, H. C., P. J. BRANIGAN, H. R. SCHUMACHER, JR. u. A. P. HUDSON (1998a): Synovial Chlamydia trachomatis in patients with reactive arthritis/Reiter's syndrome are viable but show aberrant gene expression. J Rheumatol. 25, 4, 734-742 GERARD, H. C., L. KOHLER, P. J. BRANIGAN, H. ZEIDLER, H. R. SCHUMACHER u. A. P. HUDSON (1998b): Viability and gene expression in Chlamydia trachomatis during persistent infection of cultured human monocytes. Med Microbiol Immunol (Berl). 187, 2, 115-120 GERVASSI, A., M. R. ALDERSON, R. SUCHLAND, J. F. MAISONNEUVE, K. H. GRABSTEIN u. P. PROBST (2004): Differential regulation of inflammatory cytokine secretion by human dendritic cells upon Chlamydia trachomatis infection. Infect Immun. 72, 12, 7231-7239 GIEFFERS, J., H. FULLGRAF, J. JAHN, M. KLINGER, K. DALHOFF, H. A. KATUS, W. SOLBACH u. M. MAASS (2001): Chlamydia pneumoniae infection in circulating human monocytes is refractory to antibiotic treatment. Circulation. 103, 3, 351-356 GIEFFERS, J., G. VAN ZANDBERGEN, J. RUPP, F. SAYK, S. KRUGER, S. EHLERS, W. SOLBACH u. M. MAASS (2004): Phagocytes transmit Chlamydia pneumoniae from the lungs to the vasculature. Eur Respir J. 23, 4, 506-510 GRAYSTON, J. T. (1992): Infections caused by Chlamydia pneumoniae strain TWAR. Clin Infect Dis. 15, 5, 757-761 Literaturverzeichnis 142 GRAYSTON, J. T., C. MORDHORST, A. L. BRUU, S. VENE u. S. P. WANG (1989a): Countrywide epidemics of Chlamydia pneumoniae, strain TWAR, in Scandinavia, 19811983. J Infect Dis. 159, 6, 1111-1114 GRAYSTON, J. T., S. P. WANG, C. C. KUO u. L. A. CAMPBELL (1989b): Current knowledge on Chlamydia pneumoniae, strain TWAR, an important cause of pneumonia and other acute respiratory diseases. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 8, 3, 191-202 HAHN, D. L., R. W. DODGE u. R. GOLUBJATNIKOV (1991): Association of Chlamydia pneumoniae (strain TWAR) infection with wheezing, asthmatic bronchitis, and adult-onset asthma. Jama. 266, 2, 225-230 HARANAGA, S., H. IKEJIMA, H. YAMAGUCHI, H. FRIEDMAN u. Y. YAMAMOTO (2002): Analysis of Chlamydia pneumoniae growth in cells by reverse transcription-PCR targeted to bacterial gene transcripts. Clin Diagn Lab Immunol. 9, 2, 313-319 HARANAGA, S., H. YAMAGUCHI, H. IKEJIMA, H. FRIEDMAN u. Y. YAMAMOTO (2003): Chlamydia pneumoniae infection of alveolar macrophages: a model. J Infect Dis. 187, 7, 1107-1115 HARANAGA, S., H. YAMAGUCHI, G. F. LEPARC, H. FRIEDMAN u. Y. YAMAMOTO (2001): Detection of Chlamydia pneumoniae antigenin PBMNCs of healthy blood donors. Transfusion. 41, 9, 1114-1119 HASHIGUCCI, K., H. OGAWA, T. SUZUKI u. Y. KAZUYAMA (1992): Isolation of Chlamydia pneumoniae from the maxillary sinus of a patient with purulent sinusitis. Clin Infect Dis. 15, 3, 570-571 HATCH, T. P. (1996): Disulfide cross-linked envelope proteins: the functional equivalent of peptidoglycan in chlamydiae? J Bacteriol. 178, 1, 1-5 Literaturverzeichnis 143 HEINEMANN, M., M. SUSA, U. SIMNACHER, R. MARRE u. A. ESSIG (1996): Growth of Chlamydia pneumoniae induces cytokine production and expression of CD14 in a human monocytic cell line. Infect Immun. 64, 11, 4872-4875 HODINKA, R. L., C. H. DAVIS, J. CHOONG u. P. B. WYRICK (1988): Ultrastructural study of endocytosis of Chlamydia trachomatis by McCoy cells. Infect Immun. 56, 6, 1456-1463 HOGAN, R. J., S. A. MATHEWS, A. KUTLIN, M. R. HAMMERSCHLAG u. P. TIMMS (2003): Differential expression of genes encoding membrane proteins between acute and continuous Chlamydia pneumoniae infections. Microb Pathog. 34, 1, 11-16 HOGAN, R. J., S. A. MATHEWS, S. MUKHOPADHYAY, J. T. SUMMERSGILL u. P. TIMMS (2004): Chlamydial persistence: beyond the biphasic paradigm. Infect Immun. 72, 4, 1843-1855 HOTZEL, H., E. GROSSMANN, F. MUTSCHMANN u. K. SACHSE (2001): Genetic characterization of a Chlamydophila pneumoniae isolate from an African frog and comparison to currently accepted biovars. Syst Appl Microbiol. 24, 1, 63-66 JACKSON, M., N. WHITE, P. GIFFARD u. P. TIMMS (1999): Epizootiology of Chlamydia infections in two free-range koala populations. Vet Microbiol. 65, 4, 255-264 JENDRO, M. C., T. DEUTSCH, B. KORBER, L. KOHLER, J. G. KUIPERS, B. KRAUSSEOPATZ, J. WESTERMANN, E. RAUM u. H. ZEIDLER (2000): Infection of human monocyte-derived macrophages with Chlamydia trachomatis induces apoptosis of T cells: a potential mechanism for persistent infection. Infect Immun. 68, 12, 6704-6711 Literaturverzeichnis 144 JENDRO, M. C., F. FINGERLE, T. DEUTSCH, A. LIESE, L. KOHLER, J. G. KUIPERS, E. RAUM, M. MARTIN u. H. ZEIDLER (2004): Chlamydia trachomatis-infected macrophages induce apoptosis of activated T cells by secretion of tumor necrosis factor-alpha in vitro. Med Microbiol Immunol (Berl). 193, 1, 45-52 KACANI, L., I. FRANK, M. SPRUTH, M. G. SCHWENDINGER, B. MULLAUER, G. M. SPRINZL, F. STEINDL u. M. P. DIERICH (1998): Dendritic cells transmit human immunodeficiency virus type 1 to monocytes and monocyte-derived macrophages. J Virol. 72, 8, 6671-6677 KALAYOGLU, M. V. u. G. I. BYRNE (1998): Induction of macrophage foam cell formation by Chlamydia pneumoniae. J Infect Dis. 177, 3, 725-729 KAUL, R. u. W. M. WENMAN (1998): Eukaryotic-like histones in Chlamydia. Front Biosci. 3, d300-305 KUO, C. C., A. M. GOWN, E. P. BENDITT u. J. T. GRAYSTON (1993): Detection of Chlamydia pneumoniae in aortic lesions of atherosclerosis by immunocytochemical stain. Arterioscler Thromb. 13, 10, 1501-1504 KUO, C. C., L. A. JACKSON, L. A. CAMPBELL u. J. T. GRAYSTON (1995): Chlamydia pneumoniae (TWAR). Clin Microbiol Rev. 8, 4, 451-461 MAASS, M. u. U. HARIG (1995): Evaluation of culture conditions used for isolation of Chlamydia pneumoniae. Am J Clin Pathol. 103, 2, 141-148 MAASS, M., J. JAHN, J. GIEFFERS, K. DALHOFF, H. A. KATUS u. W. SOLBACH (2000): Detection of Chlamydia pneumoniae within peripheral blood monocytes of patients with unstable angina or myocardial infarction. J Infect Dis. 181 Suppl 3, S449-451 Literaturverzeichnis 145 MARCHANT, A. E., S. BHANDARI u. M. J. FARR (1995): Reversible acute renal failure associated with Chlamydia pneumoniae infection. Nephrol Dial Transplant. 10, 5, 693-695 MATHEWS, S. A., K. M. VOLP u. P. TIMMS (1999): Development of a quantitative gene expression assay for Chlamydia trachomatis identified temporal expression of sigma factors. FEBS Lett. 458, 3, 354-358 MAZUR, E., J. NIEDZWIADEK, A. WOLSKI, Z. SIEZIENIEWSKA-SKOWRONSKA, W. ZYWICK, A. KOROLCZUK, E. KOROBOWICZ u. M. KOZIOL-MONTEWKA (2004): Chlamydia pneumoniae infection in abdominal aortic aneurysm (AAA) patients and its clinical impact. Pol J Pathol. 55, 4, 155-164 MIYASHITA, N., Y. KANAMOTO u. A. MATSUMOTO (1993): The morphology of Chlamydia pneumoniae. J Med Microbiol. 38, 6, 418-425 MOLESTINA, R. E., R. D. MILLER, J. A. RAMIREZ u. J. T. SUMMERSGILL (1999): Infection of human endothelial cells with Chlamydia pneumoniae stimulates transendothelial migration of neutrophils and monocytes. Infect Immun. 67, 3, 1323-1330 NORTON, R., S. SCHEPETIUK u. T. W. KOK (1995): Chlamydia pneumoniae pneumonia with endocarditis. Lancet. 345, 8961, 1376-1377 NUMAZAKI, K., K. SUZUKI u. S. CHIBA (1995): Replication of Chlamydia trachomatis and C. pneumoniae in the human monocytic cell line U-937. J Med Microbiol. 42, 3, 191-195 OJCIUS, D. M., Y. BRAVO DE ALBA, J. M. KANELLOPOULOS, R. A. HAWKINS, K. A. KELLY, R. G. RANK u. A. DAUTRY-VARSAT (1998): Internalization of Chlamydia by dendritic cells and stimulation of Chlamydia-specific T cells. J Immunol. 160, 3, 1297-1303 Literaturverzeichnis 146 PALDANIUS, M., A. BLOIGU, M. ALHO, M. LEINONEN u. P. SAIKKU (2005): Prevalence and persistence of Chlamydia pneumoniae antibodies in healthy laboratory personnel in Finland. Clin Diagn Lab Immunol. 12, 5, 654-659 PANTOJA, L. G., R. D. MILLER, J. A. RAMIREZ, R. E. MOLESTINA u. J. T. SUMMERSGILL (2001): Characterization of Chlamydia pneumoniae persistence in HEp-2 cells treated with gamma interferon. Infect Immun. 69, 12, 7927-7932 PETHER, J. V., S. P. WANG u. J. T. GRAYSTON (1989): Chlamydia pneumoniae, strain TWAR, as the cause of an outbreak in a boys' school previously called psittacosis. Epidemiol Infect. 103, 2, 395-400 PREBECK, S., C. KIRSCHNING, S. DURR, C. DA COSTA, B. DONATH, K. BRAND, V. REDECKE, H. WAGNER u. T. MIETHKE (2001): Predominant role of toll-like receptor 2 versus 4 in Chlamydia pneumoniae-induced activation of dendritic cells. J Immunol. 167, 6, 3316-3323 PUOLAKKAINEN, M., L. A. CAMPBELL, C. C. KUO, M. LEINONEN, C. GRONHAGENRISKA u. P. SAIKKU (1996): Serological response to Chlamydia pneumoniae in patients with sarcoidosis. J Infect. 33, 3, 199-205 PUOLAKKAINEN, M., L. A. CAMPBELL, T. M. LIN, T. RICHARDS, D. L. PATTON u. C. C. KUO (2003): Cell-to-cell contact of human monocytes with infected arterial smooth-muscle cells enhances growth of Chlamydia pneumoniae. J Infect Dis. 187, 3, 435-440 REDECKE, V., K. DALHOFF, S. BOHNET, J. BRAUN u. M. MAASS (1998): Interaction of Chlamydia pneumoniae and human alveolar macrophages: infection and inflammatory response. Am J Respir Cell Mol Biol. 19, 5, 721-727 Literaturverzeichnis 147 REED, K. D., G. R. RUTH, J. A. MEYER u. S. K. SHUKLA (2000): Chlamydia pneumoniae infection in a breeding colony of African clawed frogs (Xenopus tropicalis). Emerg Infect Dis. 6, 2, 196-199 ROBLIN, P. M., W. DUMORNAY u. M. R. HAMMERSCHLAG (1992): Use of HEp-2 cells for improved isolation and passage of Chlamydia pneumoniae. J Clin Microbiol. 30, 8, 1968-1971 ROTHFUCHS, A. G., D. GIGLIOTTI, K. PALMBLAD, U. ANDERSSON, H. WIGZELL u. M. E. ROTTENBERG (2001): IFN-alpha beta-dependent, IFN-gamma secretion by bone marrow-derived macrophages controls an intracellular bacterial infection. J Immunol. 167, 11, 6453-6461 SAIKKU, P., M. LEINONEN, K. MATTILA, M. R. EKMAN, M. S. NIEMINEN, P. H. MAKELA, J. K. HUTTUNEN u. V. VALTONEN (1988): Serological evidence of an association of a novel Chlamydia, TWAR, with chronic coronary heart disease and acute myocardial infarction. Lancet. 2, 8618, 983-986 SAKO, T., T. TAKAHASHI, K. TAKEHANA, E. UCHIDA, T. NAKADE, T. UMEMURA u. H. TANIYAMA (2002): Chlamydial infection in canine atherosclerotic lesions. Atherosclerosis. 162, 2, 253-259 SHAW, E. I., C. A. DOOLEY, E. R. FISCHER, M. A. SCIDMORE, K. A. FIELDS u. T. HACKSTADT (2000): Three temporal classes of gene expression during the Chlamydia trachomatis developmental cycle. Mol Microbiol. 37, 4, 913-925 SLEPENKIN, A., V. MOTIN, L. M. DE LA MAZA u. E. M. PETERSON (2003): Temporal expression of type III secretion genes of Chlamydia pneumoniae. Infect Immun. 71, 5, 2555-2562 Literaturverzeichnis 148 SRIRAM, S., C. W. STRATTON, S. YAO, A. THARP, L. DING, J. D. BANNAN u. W. M. MITCHELL (1999): Chlamydia pneumoniae infection of the central nervous system in multiple sclerosis. Ann Neurol. 46, 1, 6-14 STOREY, C., M. LUSHER, P. YATES u. S. RICHMOND (1993): Evidence for Chlamydia pneumoniae of non-human origin. J Gen Microbiol. 139, 11, 2621-2626 TAYLOR-ROBINSON, D., C. B. GILROY, B. J. THOMAS u. A. C. KEAT (1992): Detection of Chlamydia trachomatis DNA in joints of reactive arthritis patients by polymerase chain reaction. Lancet. 340, 8811, 81-82 WAGNER, A. D., H. C. GERARD, T. FRESEMANN, W. A. SCHMIDT, E. GROMNICAIHLE, A. P. HUDSON u. H. ZEIDLER (2000): Detection of Chlamydia pneumoniae in giant cell vasculitis and correlation with the topographic arrangement of tissue-infiltrating dendritic cells. Arthritis Rheum. 43, 7, 1543-1551 WARD, M. E. u. A. MURRAY (1984): Control mechanisms governing the infectivity of Chlamydia trachomatis for HeLa cells: mechanisms of endocytosis. J Gen Microbiol. 130, 7, 1765-1780 WESSLEN, L., C. PAHLSON, O. LINDQUIST, E. HJELM, J. GNARPE, E. LARSSON, U. BAANDRUP, L. ERIKSSON, J. FOHLMAN, L. ENGSTRAND, T. LINGLOF, C. NYSTROM-ROSANDER, H. GNARPE, L. MAGNIUS, C. ROLF u. G. FRIMAN (1996): An increase in sudden unexpected cardiac deaths among young Swedish orienteers during 1979-1992. Eur Heart J. 17, 6, 902-910 WICHLAN, D. G. u. T. P. HATCH (1993): Identification of an early-stage gene of Chlamydia psittaci 6BC. J Bacteriol. 175, 10, 2936-2942 Literaturverzeichnis 149 WITTKOP, U., M. PEPPMÜLLER, B. KRAUSSE-OPATZ, L. KÖHLER, H. ZEIDLER u. A. D. WAGNER (2004): Long lasting productive Chlamydia pneumoniae infection in human monocyte-derived dendritic cells. Arthritis Rheum. 50, 9, S128 WOLF, K., E. FISCHER u. T. HACKSTADT (2000): Ultrastructural analysis of developmental events in Chlamydia pneumoniae-infected cells. Infect Immun. 68, 4, 2379-2385 WU, L., S. J. SKINNER, N. LAMBIE, J. C. VULETIC, F. BLASI u. P. N. BLACK (2000): Immunohistochemical staining for Chlamydia pneumoniae is increased in lung tissue from subjects with chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med. 162, 3 Pt 1, 1148-1151 YAMAGUCHI, H., S. HARANAGA, R. WIDEN, H. FRIEDMAN u. Y. YAMAMOTO (2002): Chlamydia pneumoniae infection induces differentiation of monocytes into macrophages. Infect Immun. 70, 5, 2392-2398 YAMAZAKI, T., H. NAKADA, N. SAKURAI, C. C. KUO, S. P. WANG u. J. T. GRAYSTON (1990): Transmission of Chlamydia pneumoniae in young children in a Japanese family. J Infect Dis. 162, 6, 1390-1392 YANG, Z. P., C. C. KUO u. J. T. GRAYSTON (1995): Systemic dissemination of Chlamydia pneumoniae following intranasal inoculation in mice. J Infect Dis. 171, 3, 736-738 Anhang 9 Anhang 9.1 Methodisches Vorgehen der weiterführenden Untersuchungen (Kap. 4.4) 150 9.1.1 Überprüfung inhibitorischer Effekte des hAB-Serum mit Hilfe der für Chlp. pneumoniae sensitiven HEp-2 Zelle Die Durchführung entsprach im Wesentlichen dem unter Kap. 3.2.7 beschrieben Vorgehen für HEp-2 Infektiositätstests. HEp-2 Zellen wurden in 96-well Kulturplatten ausgesät. Sowohl für fetales Kälberserum (3.1.4) als auch für hAB-Serum (3.1.4) wurden zwei wells je Serumkonzentration (3%, 10% und 30%) und Menge der Chlamydien (MOI 0,5/MOI 2/MOI 5) (3.1.3) angesetzt. Die Zellen wurden mit den entsprechenden Serumkonzentrationen im Kulturmedium über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag erfolgte die Infektion durch Zugabe der entsprechenden Mengen der Chlamydiensuspension. Die Platten wurden allerdings nicht zentrifugiert, um evtl. im Serum vorhandenen Inhibitoren nicht zu beeinträchtigen. Nach 2 Stunden im Brutschrank bei 35°C wurden die wells auf ihr Endvolumen von 200 µl Medium aufgefüllt (mit der entsprechenden Serumart und Konzentration) und für drei Tage bei 35°C inkubiert. Die Anfärbung erfolgte dann wie unter Kap. 3.2.7 beschrieben. Anhang 151 9.1.2 Überprüfung auf Antikörper gegen Chlp. pneumoniae im hAB-Serum mittels Immunfluoreszenzfärbung Diese Methode sollte dazu dienen, evtl. im hAB-Serum vorhandene Antikörper gegen Chlp. pneumoniae nachzuweisen. Hierzu wurden 20 µl einer Chlamydienpräparation (3.1.3) direkt auf Objektträgern an der Luft getrocknet. Danach wurden unspezifische Bindungsstellen mit 30 µl Blockierungspuffer (Pferdeserum und Färbe-PBS im Verhältnis 1:1) für 30 min bei Raumtemperatur blockiert. Die Lösung wurde vorsichtig von den Objektträgern abgeklopft. Nun wurden wiederum 30 µl des hAB-Serum unverdünnt auf die Präparate gegeben und wiederum 30 min bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer inkubiert. Auch dieses Serum wurde durch vorsichtiges Klopfen von den Objektträgern nach Ablauf der Zeit entfernt. Als Sekundärantikörper wurden FITC-markierte polyklonale Antikörper gegen menschliche Immunglobuline (3.1.5) in einer gemeinsamen Lösung verwendet. 30 µl wurden auf jedes Präparat gegeben und bei 37°C in einer feuchten Kammer für ebenfalls 30 min inkubiert. Die Färbelösung wurde entfernt, die Präparate dreimal sehr vorsichtig in Färbe-PBS (3.1.4) gewaschen und an der Luft getrocknet. Danach wurden jedes Präparat mit einem Tropfen Mounting-Fluid (3.1.4) versehen und die anschließend aufgelegten Deckgläschen mit Corbit-Balsam (3.1.4) abgedichtet. Die Auswertung erfolgte unter dem Fluoreszenzmikroskop (3.1.1) bei einer Wellenlänge von 490 nm. Anhang 152 9.1.3 Funktionen der bei der FACS-Analyse (3.2.4.4) untersuchten Oberflächenmoleküle In Tab. 4 sind die Funktionen der Oberflächenmoleküle kurz dargestellt, die zur Charakterisierung der konditionierten Zellen mittls FACS (3.2.4.4) herangezogen wurden. Untersuchtes Funktion (soweit bekannt) Oberflächenmolekül CD 1a MHC-I ähnliches Molekül; mögliche Bedeutung bei der Antigenpräsentation CD 14 Rezeptor für den Komplex aus Lipopolysaccharid (LPS) und LPS-bindendem Protein CD 16 Bestandteil des Fc unter anderem die Phagozytose CD 33 Molekül, welches die kieselsäure-abhängige Bindung zwischen Zellen vermittelt CD 80 Costimulator bei T-Zell-Aktivierung; Rezeptor für CD28 und CTLA-4 CD 83 nicht genau bekannt; mögliche Rolle bei der Antigenpräsentation CD 86 Costimulator bei T-Zell-Aktivierung; Rezeptor für CD28 und CTLA-4 HLA-DR Molekül der MHC-II Klasse; Rolle bei der Antigenpräsentation Tab. 4: Funktion der untersuchten Oberflächenmoleküle Eidesstattliche Erklärung 153 10 Eidesstattliche Erklärung Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation mit dem Titel: „Bedeutung dendritischer Zellen und Makrophagen für die Infektion und Vermehrung von Chlamydophila pneumoniae. Untersuchungen in einem neu entwickelten in vitro Kokulturmodell“ selbständig verfasst habe. Bei der Anfertigung wurden folgende Hilfen Dritter in Anspruch genommen: keine Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten (Promotionsberater oder anderer Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die in Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen. Die Dissertation wurde in der Abteilung Rheumatologie der Medizinischen Hochschule Hannover angefertigt. Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht. Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der Wahrheit entsprechend vorgenommen habe. Hannover, 28.08.2005 Matthias Peppmüller Liste wissenschaftlicher Veröffentlichungen Teilergebnisse der Dissertation wurden bereits veröffentlicht: WITTKOP, U., M. PEPPMÜLLER, W. LEIBOLD, H. ZEIDLER u. A. D. WAGNER (2005): Dendritic cells transmit infectious Chlamydophila pneumoniae to monocytes/macrophages in coculture without cell-to-cell contact. Ann. Rheum. Dis., Supp., 64, S538 Weitere Veröffentlichungen: WITTKOP, U., M. PEPPMÜLLER, B. KRAUSSE-OPATZ, L. KÖHLER, H. ZEIDLER u. A. D. WAGNER (2004): Long lasting productive Chlamydia pneumoniae infection in human monocyte-derived dendritic cells. Arthritis Rheum., Supp., 50, 9, S128 WAGNER, A. D., X. JU, U. WITTKOP, M. PEPPMÜLLER, A. PRAHST, H. ZEIDLER u. M. ZENKE (2004): Glucocorticoids inhibit apoptosis of peripheral CD1c+ dendritic cells and cause a down-regulation of the chemokine ligands CCL19 and CCL21 in granulomatous infiltrates in temporal arteries from patients with giant cell arteritis. Arthritis Rheum., Supp., 50, 9, S43 Danksagungen Frau Dr. Wagner als meiner Arbeitsgruppenleiterin danke ich herzlich für die Ausarbeitung des Themas und für die Gesamtbetreuung der Arbeit. Zu jeder Zeit hatte sie trotz ihrer vielen Verpflichtungen mindestens ein offenes Ohr für die kleinen und großen Sorgen und hat mit ihren Ideen zu großen Teilen den Erfolg dieser Arbeit ermöglicht. Herrn Prof. Leibold gilt mein Dank für die wissenschaftliche Betreuung. Seine konstruktive Kritik und seine Hilfe waren stets ein guter Impuls für das Projekt. Bedanken möchte ich mich auch bei Herrn Prof. Zeidler, in dessen Abteilung ich die Arbeiten durchführen durfte. Sein reges Interesse und seine ständige Auseinandersetzung mit den Experimenten und der Dissertationsschrift waren immer eine hilfreiche Unterstützung und wurden von mir als große Ehre empfunden. Mein besonderer Dank gilt Frau Wittkop, die mich in die Laborarbeiten eingeführt hat, intensiv an der Planung und Durchführung der Arbeiten beteiligt war und mir jederzeit mit Rat und Tat zur Seite stand. Ohne sie wäre die Verwirklichung der Promotion in der Zeit und mit dem Umfang nicht möglich gewesen. Dem gesamten Laborteam der Abteilung Rheumatologie möchte ich für die freundliche Aufnahme danken. Dies hat die tägliche Arbeit sehr erleichtert. Auf keinen Fall vergessen werde ich die Hilfe, die mir einige hier nicht namentlich erwähnte Personen zukommen ließen. Egal ob bei den Tücken von Computern und Programmen oder bei der Erstellung komplizierter mathematischer Formeln, immer konnte ich auf sie zählen. Auch das hat zum Gelingen der Arbeit beigetragen und soll deshalb an dieser Stelle dankend erwähnt werden. Die Finanzierung der Arbeit erfolgte im Wesentlichen durch Forschungsmittel der Deutschen Forschungsgemeinschaft WA 747/4-1.
