Aus der Klinik für Dermatologie, Venerologie und Allergologie

Aus der Klinik für Dermatologie, Venerologie und
Allergologie der Medizinischen Fakultät der
Charité – Universitätsmedizin Berlin
DISSERTATION
In vitro Charakterisierung autologer Aktivierung und
Klonierung von T-Lymphozyten aus psoriatischen Plaques
Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)
vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité
Universitätsmedizin Berlin
Von
Wiebke Dorothea Urban
aus Böblingen
Dekan: Prof. Dr. med. Martin Paul
Gutachter:
1. Prof. Dr. Wolfram Sterry
2. Prof. Dr. Walter Lechner
3. Prof. Dr. Arturo Zychlinsky
Datum der Promotion: 20.06.05
2
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
AK
Antikörper
APC
Antigen presenting cell(s)
APC
Allophycocyanin
BCIP
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-Phosphat
BSA
Bovine serum albumin
CD
Differenzierungsantigen (Cluster of differentiation)
DMSO
Dimethyl Sulfoxid
DN
Doppelt negativ (CD4-CD8-)
EDTA
Ethylendiamintetraacylacid
FACS
Flourescence activated cell sorting
FCS
Fetal calf serum
FITC
Floureszeinthiocyanat
Gy
Gray
ICAM
Intercellular adhesion molecule
IFN
Interferon
IL
Interleukin
LFA
Leukocyte function-associated antigen
MACS
Magnetic activated cell sorting
NBT
Nitroblautetrazoliumchlorid
PBMC
Peripheral blood mononuclear cell(s)
PBS
Phosphate-buffered saline
PCR
Polymerase chain reaktion
PE
Phycoerythin
PerCP
Peridinin-chlorophyll-protein
PS-SCL
Positional Scanning Synthetic Combinatorial Libraries
RT
Raumtemperatur
SA-AP
Streptavidin-alkalische-Phosphatase-Konjugat
SCID
Severe combined immunodeficient
TCR
T-Zell-Rezeptor
VCAM
Vascular cell adhesion molecule
VLA
Very late antigen
3
INHALTSVERZEICHNIS
1. Einleitung ........................................................................................................... 6
1.1.
Psoriasis........................................................................................................................... 6
1.2.
Immunpathogenese.......................................................................................................... 7
1.2.1.
Die Rolle der T-Lymphozyten ................................................................................ 7
1.2.2.
Zytokine, Botenstoffe zwischen den “Hauptakteuren” ........................................... 9
1.2.3.
Streptokokken-assoziierte Pathogenese ................................................................ 10
1.2.4.
oliklonaler TCR und Antigen(e) ........................................................................... 11
1.3.
Ansatz zur Identifizierung der T-Zellspezifitäten ......................................................... 12
2. Fragestellung .................................................................................................... 14
3. Material und Methoden .................................................................................... 15
3.1.
Material ......................................................................................................................... 15
3.1.1.
Biopsien................................................................................................................. 15
3.1.2.
Verwendete Stoffe und Lösungen ......................................................................... 15
3.2.
Methoden....................................................................................................................... 18
3.2.1.
Isolierung und Kultivierung der Lymphozyten..................................................... 18
3.2.2.
Isolierung und Verwahrung der Stimulatorzellen ................................................. 18
3.2.3.
Isolierung von PBMC und autologem Blutserum ................................................. 18
3.2.4.
γ- Interferon-Elispot-Assay ................................................................................... 19
3.2.5.
Bestimmung des Phänotyps der in vitro kultivierten Lymphozyten ..................... 20
3.2.6.
Sortierung der Lymphozyten mit MACS .............................................................. 21
3.2.7.
Klonierung von T-Zellen mittels Einzelzell-Verdünnung .................................... 22
4. Resultate ........................................................................................................... 24
4.1.
Etablierung des γ -Interferon-Elispot-Assays................................................................ 24
4.1.1.
4.2.
Herstellung optimaler Bedingungen für den Meßbereich:.................................... 24
Polyklonale T-Zell-Linien............................................................................................. 24
4.2.1.
Etablierung polyklonaler T-Zell-Linien aus psoriatischen Plaques ...................... 24
4.2.2.
Phänotypisierung per FACS.................................................................................. 25
4.3.
γ-Interferon-Elispot-Assay der polyklonalen T-Zell-Linien ......................................... 26
4.3.1.
Phänotypisierung der ausgewanderten Zellen....................................................... 26
4.3.2.
Restimulierbarkeit polyklonaler T-Zell-Linien durch autologe Plaquezellen.......28
4
4.3.3.
4.4.
Stimulierbarkeit polyklonaler T-Zell-Linien durch autologe PBMC.................... 32
Isolation von T-Zell-Klonen aus psoriatischen Plaques................................................ 32
4.4.1.
Optimierung der Methode ..................................................................................... 32
4.4.2.
Restimulation der Klone eines Probanden durch autologe Plaquezellen.............. 35
5. Diskussion ........................................................................................................ 37
5.1.
γ-Interferon-Elispot-Assay ............................................................................................ 38
5.2.
Klonierung..................................................................................................................... 40
6. Zusammenfassung ............................................................................................ 41
7. Literatur ............................................................................................................... 42
7.1. Quellenverzeichnis ........................................................................................... 42
7.2. Publikation........................................................................................................ 51
8. Anhang................................................................................................................. 52
Abbildungsübersicht................................................................................................ 52
Tabellenübersicht..................................................................................................... 52
5
1.
Einleitung
1.1. Psoriasis
Psoriasis (Schuppenflechte) ist eine sehr häufige Hauterkrankung mit einer Prävalenz von ca.
2-3 % in kaukasischen Populationen, wobei Frauen und Männer gleichermaßen betroffen sind.
Man geht davon aus, daß es sich um eine Krankheit handelt, die polygen und multifaktoriell
vererbt wird, d.h. sowohl die genetische Disposition, als auch verschiedene Umwelteinflüsse
tragen dazu bei, daß die Krankheit zum ersten Mal auftritt und in Schüben immer wieder
aufflammen kann.
Bisher konnte keines der Risiko-Gene identifiziert werden (Elder et al, 2001). Jedoch konnte
eine Risiko-Assoziation zu bestimmten HLA-Merkmalen hergestellt werden. Diese sind
insbesondere HLA-DR7 und HLA-Cw6, aber auch HLA-DR4,-B13,-B17,-B39,-B57 und -Cw7
(Elder et al, 1994).
HLA-Merkmale sind Zellmembranantigene, die wichtig für die
Immunantwort in verschiedensten Bereichen sind. Sie sind auf dem kurzen Arm des
Chromosoms 6 lokalisiert. HLA-A, HLA-B und HLA-C (MHC-Klasse I) finden sich in den
Zellmembranen fast aller kernhaltigen Körperzellen, in höchster Konzentration auf
Lymphozyten und Makrophagen. Die durch D/ DR kodierten Antigene (MHC-Klasse II) werden
dagegen nur in B-Zellen, in aktivierten T-Zellen, in Makrophagen, Endothelzellen, LangerhansZellen der Epidermis und in Spermatozyten gefunden.
Im Zusammenspiel zwischen genetischer Disposition und Umweltfaktoren sind mechanische,
infektiöse, chemische und psychosomatische Auslöser bekannt. So kann z.B. das sogenannte
Köbner-Phänomen, d.h. mechanische Manipulation, bei Psoriatikern an nicht betroffenen
Hautarealen die für die Psoriasis typischen Hautirritationen auslösen (Powles et al, 1990; Weiss
G et al, 2002). Ein weiterer wichtiger Trigger-Faktor sind Streptokokken-Infektionen, besonders
der oberen Atemwege, die die sogenannte Guttata-Form der Psoriasis hervorrufen können (Baker
et al, 1993; s.u. Abschnitt 1.2.3).
Psoriasis befällt v.a. die Haut, aber auch Gelenke und Nägel können mitbetroffen sein. Die
typischen Effloreszenzen stellen sich als scharf, oft unregelmäßig begrenzte, streckseitig betonte
erythrosquamöse Plaques dar. Charakteristisch für die zugrundeliegende Histologie ist eine
6
epidermale Hyperplasie durch erhöhten Zellumsatz der Keratinozyten. Histologisch findet man
eine starke Akanthose durch zehnfach gesteigerte mitotische Aktivität der Basalzellen, eine
erhöhte DNA-Synthese, einen verkürzten Zellzyklus und eine verkürzte Transitzeit der
Keratinozyten. Außerderm zeichnet sich die Psoriasis durch eine Hyper- und Parakeratose, v.a.
bei akuten Veränderungen, mit eingeschlossenen neutrophilen Granulozyten (sog. Munro-MikroAbzesse) und Mastzellen aus. Es besteht eine Dilatation und korkenzieherartige Anordnung der
papillären Gefäße mit einem lymphohistiozytären Infiltrat im oberen Korium (Nickoloff et al,
2001). Die Aktivität von Endothelzellen, Lymphozyten, Keratinozyten und neutrophilen
Granulozyten in den betroffenen Arealen ist gesteigert (Norris et al, 1997).
1.2. Immunpathogenese
T-Lymphozyten, dendritische Zellen und ihre Botenstoffe spielen eine entscheidende Rolle in
der Pathophysiologie der Psoriasis. Je mehr man über die Schlüsselmechanismen und Interaktion
der Zellen weiß, desto wahrscheinlicher läßt sich eine gezielte und wirkungsvolle Therapie der
Erkrankung entwickeln.
1.2.1. Die Rolle der T-Lymphozyten
Heute geht man davon aus, daß T-Lymphozyten eine zentrale Rolle in der Pathogenese
übernehmen. Klinisch erfolgreiche Blockaden der T-Zell Funktion sowohl mit Cyclosporin A
(Mueller et al, 1976), FK506 (Michel et al, 1996), anti-CD3 und -CD4, dem lymphotoxisch
wirkenden Methotrexat und mit DAB389-IL-2 (Bos et al, 1999; Gottlieb et al, 1995), als auch
die Behandlung mit PUVA (Ultraviolett-Licht- aktiviertes Methoxypsoralen) (Valdimarsson et
al, 1986) und Knochenmark-Tansplantationen (Eedy et al, 1990) machen deutlich, daß es sich
bei der Psoriasis um ein immunologisches Geschehen handelt, das durch mehr oder weniger
gezielte Suppression der T-Lymphozyten unterbrochen werden kann.
Die pathologische
Relevanz der T-Zellen zeigt sich sowohl in vivo (Bata-Csorgo et al, 1995), als auch in vitro
(Prinz et al, 1994). Sie steigern nachweislich die Proliferation von Keratinozyten und die
Akkumulation von Neutrophilen und Mastzellen (Vollmer et al, 1994).
Bei der Transplantation sowohl nicht-läsionaler Haut von Psoriatikern, als auch gesunder Haut
auf immundefiziente Empfängermäuse und anschließender Injektion von PBMC von
Psoriatikern reagierte nur die Haut der Psoriatiker mit den typischen Zeichen eines psoriatischen
7
Infiltrates (Wrone-Smith et al, 1996). Dies läßt darauf schließen, daß auch den Immunozyten im
Blut der Erkrankten eine wichtige Funktion in der sekundären Krankheitsentwicklung
zuzurechnen ist, und daß auch in der Haut die Prädispostion existiert, durch Stimulation dieser
Zellen pathologisch zu reagieren. Während sich auch PBMC, sowohl von Psoriatikern, als auch
von gesunden Probanden, durch autologe bzw. allogene Extrakte aus der Haut stimulieren lassen
(Hales et al, 1998), lieferten Boyman und seine Mitarbeiter hingegen jüngst Hinweise, daß
ausschließlich den lokalen T-Zellen in der Haut eine Schlüsselfunktion in der Pathogenese
zukommt. Sie transplantierten symptomlose psoriatische Haut auf Mäuse, denen die Rezeptoren
für Alpha- und Gamma-Interferon, sowie funktionell aktive T-Zellen fehlten. Etwa 90 % der
Mäuse entwickelten innerhalb von 6-8 Wochen spontan psoriatische Hauterscheinungen mit
entsprechenden histologischen Infiltraten. Das Fehlen der Interferon-Rezeptoren bei den
Empfängermäusen läßt darauf schließen, daß alle pathogenen Faktoren, die zur Entstehung eines
psoriatischen Phänotyps führen, aus dem transplantierten Plaque stammten. Die Autoren
schlossen damit eine Beteiligung exogener Zellen und Faktoren aus (Boyman et al, 2004).
Unklar bleibt allerdings, welcher Phänotyp den dominierenden Faktor der Erkrankung darstellt.
Man nimmt an, daß sowohl den CD4-(T-Helferzellen), als auch den CD8-(T-Supressorzellen)
Zellen eine wichtige Rolle bei der Pathogenese und Aufrechterhaltung der Krankheit zukommt.
Dabei sind in der Dermis überwiegend CD4-, in der Epidermis v.a. CD8-Zellen zu finden. Die
Arbeitsgruppe von Nickoloff beobachtete, daß die Injektion von T-Lymphozyten in nichtaktivierte psoriatische Haut, die auf immun-defiziente sog. SCID Mäuse transplantiert wurde,
eine gesteigerte T-Zell-Aktivierung, eine Akkumulation von Neutrophilen, sowie das Entstehen
von psoriatischen Plaques provozierte (Nickoloff et al, 1999). Hier wäre zu vermerken, daß die
Injektion von CD4-Zellen diese Reaktion bewirkte, die von CD8-Zellen jedoch nicht.
Für eine tragende Rolle der CD8-Zellen wiederum spricht, daß Psoriasis im Stadium IV bei HIV
mitunter verschlimmert wird bzw. ausbricht (Mallon et al, 2000). Zudem ist die sogenannte
PSORS1-Mutation möglicherweise direkt im HLA-C Gen lokalisiert (The International Psoriasis
Genetic Consortium, 2003). Diese Mutation spräche für eine Pathogenese in der Interaktion
zwischen MHC der Klasse 1 und CD8-Zellen.
Am wahrscheinlichsten scheint eine Interaktion beider Zellarten, wobei die CD8-Zellen
funktionell von den CD4-Zellen abhängig zu sein scheinen. Die T-Helferzellen wiederum
scheinen durch Interaktion mit HLA-DR+ dendritischen Zellen aktiviert zu werden (Baker et al,
1984).
8
Auch bei Koebner-initiierten und spontan entstehenden psoriatischen Plaques sind zuerst CD4Zellen in der Epidermis anzutreffen. In der späten Plaque-Phase akkumulieren überwiegend
CD8-Zellen (Baker et al, 1984+1988). Diese CD8-Zellen sind nachweislich aktiviert, was sich
durch hohe Aktivität ihrer MHC II-Moleküle und ihrer CD25-Oberflächenmoleküle (Interleukin
II-Rezeptoren) ersehen läßt (Gottlieb et al, 1986).
Eine mögliche Theorie für die komplexen Interaktionen lautet, daß die CD4-Zellen mit
Unterstützung aktivierter Antigen-präsentierenden dendritischen Zellen (APC) und deren
Oberflächenmolekülen (CD40, CD80(B7-1), CD86(B7-2) und CD28) ein “Help”-Signal senden,
welches ruhende CD8-Zellen aktiviert. Unterstützt wird diese Theorie durch die Beobachtung,
daß die Applikation eines Fusions-Proteins (CTLA4Ig), welches die Interaktion zwischen CD28
und CTLA-4 (CD152) auf T-Zellen und B7 (CD80 und CD86) auf APC spezifisch blockiert,
klinisch eine anti-psoriatische Wirkung hat. Dies zeigt sich sowohl in einer Reduktion der
zellulären Aktivität von läsionalen T-Zellen, Keratinozyten, dendritischen Zellen und dem
vaskulären Endothel, als auch in einer Verminderung der Infiltrate neutrophiler Granulozyten
(Abrams et al, 2000; Nickoloff et al, 1999). Bei der Interaktion zwischen T-Zellen und APC,
welche das Zentrum bei der Entstehung und des Fortbestehens der Erkrankung bildet, spielen
außer T-Zellrezeptoren und MHC-Molekülen noch eine ganze Reihe an Co-Stimulatoren eine
Rolle (LFA-1/ ICAM-1, CD2 /LFA-3, VLA-4/ VCAM-1).
Durch HLA-DR-Antikörper läßt sich die Reaktion von T-Zellen und PBMC auf Hautextrakte
abschwächen. Dies läßt vermuten, daß die HLA-DR-Moleküle einen essentiellen Faktor für die
Antigen-Antikörper-Reaktion darstellen, und daß ein Antigen oder Superantigen an diesem
Prozeß beteiligt ist (Hales et al, 1998).
1.2.2. Zytokine, Botenstoffe zwischen den “Hauptakteuren”
Zytokine sind körpereigene Substanzen, die von aktivierten T-Zellen und anderen Zellen
während der natürlichen und spezifischen Immunantwort freigesetzt werden (Asadullah et al,
1997). Sie haben vielfältige, v.a. proinflammatorische, immunregulatorische und die Hämatopoese steuernde Funktionen. Sie sind wichtig für Reparaturmechanismen von Gewebeschäden
und wirken für viele Zellen als Wachstumsfaktoren. Die Zytokine sind essentiell für die
Interaktion zwischen T-Zellen und Keratinozyten, eine der zentralen pathogenen Mechanismen
bei der Psoriasis (Baker et al, 1992).
9
Anhand des Zytokinmusters, welches in läsionaler Haut bestimmt wurde (Vollmer et al, 1994),
zeigten sich vermehrt proinflammatorische Zytokine: Keratinozytenproliferation (IL-3, IL-6,
IL-19, GM-CSF und IFN-γ), Akkumulation von Granulozyten (IL-8) und Mastzellen (IL-3 und
IL-5).
Die CD4-Zellen aus psoriatischer Haut weisen hierbei ein sog. T-Helfer-Typ-1 Profil auf, d.h.
man findet in der Epidermis die für diesen Subtypen charakteristischen Zytokine IFN-γ, IL 12
(Nickoloff et al, 1991+1999), TNF-α (oder β) (Kelso et al, 1995; Uyemura et al, 1993) und IL-2,
aber nicht das für T-Helfer-Typ-2-spezifische Bild mit IL-4, IL-5 und IL-10 (Horrocks et al,
1997; Schlaak et al, 1994; Friedrich et al, 2000).
In Biopsien und Sekreten aus psoriatischen Plaques findet man weitaus höhere Konzentrationen
an IFN-γ als in der Haut gesunder Probanden (Bjerke et al, 1983). IFN-γ spielt eine
Schlüsselrolle bei der Induktion der Keratinozyten-Proliferation (Ovigne et al, 2001; Szabo et al,
1998; Prinz et al, 1994). Dies wird durch die Beobachtung bestätigt, daß die Injektion von
rekombinantem IFN-γ in läsionsfreie Haut von Psoriatikern eine Läsion setzt, die von einer
idiopathischen weder klinisch noch histologisch zu unterscheiden ist (Fierlbeck et al, 1988;
Griffiths et al, 1989). Dies führt zu der Annahme, daß in vivo IFN-γ deshalb wachstumsfördernd
auf die Keratinozyten wirkt, weil diese auch mit den anderen Zytokinen (IL-3, IL-6, GM-CSF)
interagieren (Krueger et al, 1990).
1.2.3. Streptokokken-assoziierte Pathogenese
Halsentzündungen mit Streptococcus pyogenes (Streptokokken der Gruppe A nach Lancefield)
treten häufig mit der sogenannten Guttata-Form der Psoriasis, einer gutartig verlaufenden und
sich oft selbst limitierenden Form der Erkrankung, auf (White et al, 1964). Da die
Streptokokkenantigene M auf Aminosäurebasis homologe Strukturen mit dem Keratin, welches
im Zytoskelett der Keratinozyten enthalten ist, teilen, kann es zu Kreuzreaktionen (sog.
“Molecular Mimicry”) kommen, so daß Streptokokken-spezifische T-Zellen in der Haut
expandieren (Valdimarsson et al, 1995+1997; Robinson et al, 1992).
Aus Plaques isolierte T-Zellen reagieren in vitro mit einer IFN-γ-Sekretion, wenn sie mit
Streptokokkenantigenen der Gruppe A stimuliert werden (Brown et al, 2000). Man findet
überdies während des aktiven Krankheitsgeschehens im Serum erhöhte Anti-Keratin-Antikörper
(Aoki et al, 1989).
10
Die Beobachtung, daß Streptokokken-Antigene ein Trigger für den Ausbruch der Erkrankung
darstellen, hat die Frage aufgeworfen, ob Superantigene oder (Auto-) Antigene der Haut den
Hauptstimulus für die darauf folgende pathologische Kaskade liefern. Superantigene, mikrobielle
Toxine, die antigenunabhängig mit HLA-Molekülen reagieren, aktivieren T-Zellen und
verursachen eine polyklonale T-Zellpopulation.
Für die Superantigen-Theorie spricht, daß ,durch Streptokokkenantigene in der Haut provoziert,
eine polyklonale Expansion von einer Unterfamilie von T-Zell-Rezeptoren (der BVβ2 Familie)
(s.u. 1.2.4), aufzufinden ist (Leung et al, 1995). Nun lassen sich diese superantigenassoziierten
Entzündungen durch antibiotische Behandlung heilen. Psoriatische Hautreaktionen hingegen, die
sich gewöhnlich erst Wochen nach der Infektion mit Streptokokken ausbilden, lassen sich nicht
durch Antibiotika beeinflussen. Trotzdem könnten Superantigene bei der Psoriasis dahingehend
eine Rolle spielen, indem sie den aktivierten T-Lymphozyten die Einwanderung in die Haut
erleichtern.
1.2.4. oliklonaler TCR und Antigen(e)
Der am häufigsten exprimierte T-Zell-Rezeptor (TCR) ist ein Heterodimer, welcher aus einer
alpha-(TCRA) und einer beta-(TCRB) Kette besteht. Die CD2-Region auf der α-und β-Kette
interagiert mit MHC-Molekülen, die CD3-Region und in geringerem Maße die CD1-Region mit
den MHC-gebundenen Peptiden der Antigene. Die CD3-Region auf dem variablen Teil der
β-Kette ist der potenteste und wandelbarste Teil des Rezeptors, und somit von besonderem
Interesse, wenn man die Interaktion zwischen Antigen und Lymphozyt ergründen will. Diese
Region erhält ihre Vielfältigkeit dadurch, daß sie durch Rekombination multipler variabler (BV),
zweier diversity (BD) und einiger joining (BJ) Gene zusammengesetzt ist. Diese Variabilität, die
normalerweise für 9 bis 11 Aminosäuren kodiert, wird durch mögliche Additionen bzw.
Deletionen noch erhöht. Die sehr große Vielfalt, die dadurch entsteht, macht es
unwahrscheinlich, daß T-Zellen, die sich in der Reifungsphase befinden, zufällig identische
TCR entwickeln. So kann man davon ausgehen, daß Lymphozyten mit identischen TCR-BVBD-Bj-Anordnungen klonal durch antigenspezifische Aktivierung entstanden sind (Prinz, 2001).
Durch PCR-Analyse der variablen β-Kette des T-Zell-Rezeptors (TCR-BV) aus der Haut von
Gesunden und Psoriatikern, fand sich eine Überexprimierung von BVβ2 und BVβ6 bzw.
weniger ausgeprägt BVβ3 und BVβ13.1 (Menssen et al, 1995; Chang et al, 1994, 1997; Lewis
et al, 1993).
11
Den Unterschied bedingt, daß in gesunder Haut die TCR in der β-Kette heterogen, in chronisch
psoriatischer hingegen nachweislich oligoklonal sind. Dies läßt bei letzteren auf hochgradig
repetitive TCR-BV-BD-Bj-Anordnungen schließen, welche auf einer Antigen-getriggerten
Expansion beruhen. Auch weitere Biopsien zu einem späteren Zeitpunkt (nach 18 Monaten) bei
denselben Patienten ergab, daß die gleichen T-Zell-Rearrangements wie zum früheren Zeitpunkt
dominierten (Menssen et al, 1995).
In anderen Studien konnten diese Beobachtungen nicht belegt werden, obwohl eine oliklonale TZell-Expansion in psoriatischen Läsionen gefunden wurde (Lin et al, 2001). Diese
Beobachtungen unterstützen, trotz ihrer unterschiedlichen Resultate, die Annahme, daß es sich,
sowohl bei den verschiedenen Patienten, als auch bei den einzelnen Patienten, im Verlauf der
Erkrankung, um das- oder dieselbe(n) Antigen(e) und reagierende(n) T-Zell-Population(en)
handelt (Vollmer et al, 2001). Welcher Art diese Antigene sind, bleibt weiterhin unklar (Prinz,
1999).
1.3. Ansatz zur Identifizierung der T-Zellspezifitäten
Ein Ansatz, um den potentiellen Antigenen auf zellulärer Ebene auf die Spur zu kommen,
besteht darin, T-Zell-Populationen aus psoriatischer Haut zu expandieren, spezifische
Subpopulationen zu identifizieren und spezifisch zu restimulieren. Dabei muß beachtet werden,
daß man in den jeweiligen Kulturen keine spezifischen Wachstumsstimuli verwendet, weil diese
das spezifische T-Zell-Muster der Haut verfälschen würden. So eignen sich z.B. IL-2, anti-CD3
und inaktivierte autologe PBMC.
Die Arbeitsgruppe von Horrocks isolierte 4 T-Zell-Linien, welche mit Hilfe unspezifischer
Stimulation mit Interleukin-2, anti-CD3 und inaktivierten autologen PBMC proliferierten, sich
aber weder durch Extrakte aus psoriatischem Stratum Corneum, normaler Epidermis, noch einer
epidermalen Keratin-Präperation stimulieren ließen (Horrocks et al, 1997). Dies verdeutlicht, wie
schwierig es ist, T-Zellen in vitro zu restimulieren.
Als eine andere hilfreiche Methode, spezifische Peptide zu bestimmen, die durch
T-Lymphozyten erkannt werden und deren Proliferation stimulieren, hat sich in letzter Zeit die
Verwendung kombinatorischer Peptidbanken, sog. Positional Scanning Synthetic Combinatorial
Libraries (PS-SCL), bewährt. Dabei lassen sich auch potentiell kreuzreagierende Sequenzen
(Epitope), sowohl körpereigenen, als auch pathogenen Ursprungs identifizieren (Hemmer et al,
1999; Rubio-Godoy et al, 2002; Boggiano et al, 2003; Sospedra et al, 2003).
12
Bei dieser Methode ist nicht vorrausgesetzt, daß man Näheres über die zu untersuchenden TZell-Klone weiß, weder ihre Spezifität noch ihre MHC-Eigenschaft (Borràs et al, 2002). Ein
weiterer Vorteil besteht im Vergleich zu früheren Methoden darin, daß sie weit weniger
zeitlichen und materiellen Aufwand erfordern (Gundlach et al, 1995).
Das Prinzip der PS-SCL besteht darin, daß man in verschiedenen Ansätzen jeder Aminosäure auf
einer Peptidsequenz (sinnvollerweise 8 bis 10 Peptide (MHC I) oder 12 bis 16 Peptide (MHC
II)) (Zhao et al, 2001) einen bestimmten Platz zuweist, und den Rest des Peptides aus einer
Mischung aller 19 natürlichen Aminosäuren auffüllt. Dadurch ergeben sich Millionen von
Peptidzusammensetzungen, die, nach Höhe ihrer Stimulation aufgelistet, Aussagen über die
Epitope, die die T-Zell-Klone erkennen, ermöglichen (Zhao et al, 2001). Die Aktivierung der TZellen durch diese Mischungen sollte man sowohl qualitativ, als auch quantitativ erfassen
können. Dazu eignen sich z.B. 3H-Thymidin- und 51Cr-Messungen und die Erfassung der
Zytokinproduktion (Borràs et al, 2002).
Vorraussetzung dieser Methode ist zum einen, daß man Klone isoliert und expandiert hat, zum
anderen, daß die pathogenetische Relevanz der Zellen in vitro durch autologe Reaktivität belegt
ist. Diese technischen Voraussetzungen sind bis dato für die Erforschung der Psoriasis nicht
gegeben. Die vorliegende Arbeit will hierzu methodisch beitragen.
13
2.
Fragestellung
Aufgrund der bisherigen Forschungsergebnisse hat sich gezeigt, daß den T-Zellen eine
bedeutende Rolle in der Entstehung und Aufrechterhaltung der Psoriasis zukommt. Die
vorliegende Arbeit will einen experimentellen Beitrag zur Isolation und Charakterisierung
pathogenetisch relevanter T-Zellen leisten. Hierzu werden folgende methodische Leitfragen
gestellt:
•
welches ist die effizienteste Methode zur Isolation von T-Zellen aus psoriatischen Plaques
für nachfolgende funktionelle Charakterisierungen?
•
lassen sich T-Zell-Kulturen spezifisch mit Antigen-präsentierenden Zellen (APC) aus
demselben Biopsat aktivieren?
•
lassen sich aus Biopsaten T-Zell Klone anzüchten, die ebenfalls spezifisch mit den Antigenpräsentierenden Zellen reagieren?
14
3.
Material und Methoden
3.1. Material
3.1.1. Biopsien
3.1.1.1.
Patienten
Bei den verwendeten Proben handelte es sich um spindelförmige Hautbiopsien und 100 ml
heparinisiertes Venenblut von 22 Patienten (Altersdurchschnitt 57 Jahre; von 26-77 Jahren; 64
% davon männlich) mit einer klinisch gesicherten, voll-stationärer Therapie bedürftiger Psoriasis
vulgaris, welche zum Zeitpunkt der Probenentnahme mindestens 4 Wochen nicht systemisch,
sowie mindestens 2 Wochen nicht lokal extern therapiert worden war.
3.1.1.2.
Probengewinnung
Unmittelbar nach Entnahme der Hautproben wurden diese steril in PBS (auf Eis) aufgenommen,
die Erythrozyten mit PBS abgespült, das Unterhautfettgewebe mit einem Skalpell entfernt und
anschließend in Stücke mit einem Durchmesser von 2 mm zerteilt und umgehend in 2 ml AIMV+(40) Medium in 12-Well-Mikrotiterplatten im Inkubator verwahrt. Das Venenblut wurde noch
am selben Tag zur Gewinnung von PBMC und autologem Serum verarbeitet.
3.1.2. Verwendete Stoffe und Lösungen
3.1.2.1.
Zellkultur und Elispot-Assay
AIM-V-Medium_____________________ Invitrogen/ GIBCOTM (Karlsruhe)
Bovine serum albumin ________________ Fluka (Taufkirchen)
Concanavalin
SIGMA-Aldrich (Deisenhofen)
A_____________________
Ficoll (Ficool-PagueTM Plus)__________ AmershamBiosciences (Freiburg)
5% Fetal Bovine Serum_______________ Invitrogen/ GIBCOTM (Karlsruhe)
5% Humanserum (converted)___________ PANBiotech (Aidenbach)
Interleukin 2 (Proleucin-S)_____________ Chiron Corporation (CA, USA)
Mercapto-Ethanol)___________________ SIGMA-Aldrich (Deisenhofen)
PBS Dulbecco´s_____________________ Invitrogen/ GIBCOTM (Karlsruhe)
Propidiumjodid______________________ SIGMA-Aldrich (Deisenhofen)
Streptavidin-alkalische-Phosphatase_____
Boehringer (Ingelheim)
Substrat BCIP/NBT__________________ Dunn (Asbach)
15
3.1.2.2.
Antikörper
Bindungs-Antikörper_________________ Biozol (M-701-B, Lot.Nr. 016862)
Nachweis-Antikörper ________________
Biozol (M-700 A-E, Lot.Nr. 017738)
CD1a (batch no.0599)________________
Mouse anti human CD1a: Biotin, Serotec (U.K.)
CD3-PerCP (batch No 0900)___________ Mouse anti human CD3: APC, Serotec (U.K.)
anti-CD3 (KlonHIT3a)_______________
BD Pharmingen (Heidelberg)
CD3-APC__________________________ Serotec (Düsseldorf)
CD4-FITC_________________________
Dako Cytomation (Hamburg)
CD4-PerCP_________________________ BD Pharmingen (Heidelberg)
CD8-PE___________________________
Caltag (Hamburg)
CD14-FITC________________________
Serotec (Düsseldorf)
CD15-PE__________________________
BD Pharmingen (Heidelberg)
CD25-FITC________________________
Dako Cytomation (Hamburg)
anti-CD28__________________________ Biosource (Nivelles, Belgien)
CD45RA-FITC______________________ BD Pharmingen (Heidelberg)
CD45RO-PE________________________ Dako Cytomation (Hamburg)
CD69-PE__________________________
BD Pharmingen (Heidelberg)
MHCII-APC DR_____________________ BD Pharmingen (Heidelberg)
3.1.2.3.
Zellsortierung
MACS
CD1a Miltenyl Biotec (Bergisch Gladbach)
Microbeads_____________
MACS Secretion Assay for Human Cells
(IFN-γ Catch Reagent,
IFN-γ Detection-Antibody (PE),
Anti-Pe Microbeads) _________________ Miltenyl Biotec (Bergisch Gladbach)
MS Säulen_________________________
Miltenyil Biotec (Bergisch Gladbach)
MACS Cell Isolation Kit
(Hapten Antibody Cocktail,
MACSAnti-HaptenMicrobeads)________
Miltenyl Biotec (Bergisch Gladbach)
16
3.1.2.4.
Zusammensetzung von Lösungen
AIM-V+
AIM-V
+ 5 % Humanserum
+ 5 % FCS
+ 1,75 µl Mercapto-Ethanol
AIM-V+ (40)
40 Einheiten/ ml IL2
in AIM-V+
AIM-V+ (100)
100 Einheiten/ ml IL2
in AIM-V+
DMSO-Lösung
FCS
+ 10 % DMSO
FACS-Puffer
500 ml PBS
+ Na-Acid
+ BSA
+ Na-EDTA
3.1.2.5.
Verbrauchsmaterialien und verwendete Geräte
Durchflußzytometer__________________ Becton Dickinson (FACS Calibur)
Laminar air flow_____________________ Heraeus Instruments (Berlin)
Medimaschine______________________
Dako Cytomation (Hamburg)
Mikro-Titer-Platten (96 rund)__________
BD Pharmingen (Heidelberg)
Mikro-Titer-Platten (96 flach)__________ BD Pharmingen (Heidelberg)
Mikro-Titer-Platten
(48 BD Pharmingen (Heidelberg)
flach)__________
Mikro-Titer-Platten (24 flach)__________ BD Pharmingen (Heidelberg)
Mikro-Titer-Platten (12 flach)__________ TPP (Trasadingen, Schweiz)
MAIPS 4510-Platten_________________
Millipore (Besfort, USA)
Zentrifuge (Avanti J-25)_______________ Beckman Instruments (München)
17
3.2. Methoden
3.2.1. Isolierung und Kultivierung der Lymphozyten
Nach 2-3 Tagen wurden die aus dem Haut-Bioptat (siehe 3.1.1.3.) ausgewanderten Zellen
aufgenommen und in kleinem Volumen (200 µl) AIM-V+ (100) in eine 96-wellRundbodenplatte umgesetzt. Je nach Dichte der Lymphozyten bzw. Proliferationsbereitschaft
der Kultur wurden die Zellen auf Platten mit größeren Wells umgesetzt. Falls die Zellen
unzureichend proliferierten, wurden sie mit anti-CD3 (1:5000) und anti-CD28 (1:2000)
stimuliert. Wenn eine Stimulation mit anti-CD3 und anti-CD28 erfolgte, wurde mindestens 14
Tage abgewartet, bevor ein Elispot-Assay angesetzt wurde. Sobald die Zellen gut proliferierten,
wurde die IL-2 Konzentration im Medium auf 40 Einheiten/ ml reduziert.
3.2.2. Isolierung und Verwahrung der Stimulatorzellen
Das Biopsat wurde nach Abnahme der ausgewanderten Lymphozyten, in AIM-V+ Medium
inkubiert. Alle 2 bis 3 Tage wurde das Medium der Bioptate ersetzt, bzw. bei ausreichender
Zelldichte,
diese
abgenommen,
abzentrifugiert
und
in
Einfriermedium
bei
–146°C
kryopreserviert. Nach 4 bis 6 Wochen wurden die Biopsien verworfen. Die ausgewanderten
Zellen wurden wieder aufgetaut, gepoolt und anschließend mit 30 Gy bestrahlt. Danach wurden
sie gezählt und krypreseviert, bis sie als Stimulatorzellen im Elispot-Assay benötigt wurden.
3.2.3. Isolierung von PBMC und autologem Blutserum
Das heparinisierte Venenblut (50 ml pro Patient) wurde zu gleichen Anteilen auf 4 Reaktionsgefäße mit je 18 ml Ficoll (37 °C) verteilt, so daß sich 2 Phasen bildeten, wobei das Blut die
oberste Phase ergab. Anschließend wurden die Proben 15 min mit 2200 Umdrehungen / min
ohne Bremse zentrifugiert. Es bildeten sich 4 Phasen. Das Serum, welches die oberste Phase
darstellte, wurde abgenommen und 45 min bei 55 °C denaturiert, danach 15 min mit 3000
Umdrehungen / min (G-Zahl) ohne Bremse zentrifugiert, der Überstand abgenommen und bei
20 °C gelagert. Die PBMC in der Interphase wurden 1:1 mit PBS verdünnt, abzentrifugiert und
5-6 mal mit PBS zur Abtrennung von Thrombozyten und Erythrozyten gewaschen, mit der
Zählkammer unter dem Mikroskop gezählt, anschließend mit 30 Gray bestrahlt und in
Einfriermedium erst 24 h bei –80 °C, dann bei –146 °C kryopreserviert.
18
3.2.4. γ- Interferon-Elispot-Assay
3.2.4.1.
Prinzip
Durch den γ-Interferon-Elispot-Assay sollte die in psoriatischen Plaques in vivo beobachtete
T-Zell-Stimulation in vitro rekonstruiert werden, um die spezifische Stimulation durch autologe
APC nachzuweisen. Die polyklonalen T-Zellen aus der Haut wurden mit in vitro emigrierten
Zellen aus der Haut restimuliert. Als Positiv-Kontrolle wurde mit aktivierendem CD3-Antikörper
stimuliert, die Negativ-Kontrolle mit reinem Medium. Bei 3 Patienten wurde zusätzlich eine
Kontrolle mit autologen PBMC hinzugenommen.
3.2.4.2.
Durchführung
Der Assay war auf einen Zeitraum von 3 Tagen angesetzt. Am ersten Tag wurde die PVDFbeschichtete Mikrotiterplatte mit 0,192 µg Bindungsantikörpern in 100 µl PBS/ Well beschichtet
und bei RT aufbewahrt. Die Lymphozyten wurden 24 h in AIM-V+ ohne IL2 verwahrt. Nach 24
Stunden wurden 100 µl PBS pro Well auf die Milliporeplatte gegeben und die Lösung steril
abgesaugt. Pro Well wurden 5x104 Lymphozyten in 100 µl AIM-V+ (40) gegeben. Dazu je
100 µl AIM-V+ mit 0,001 µg anti-CD3, 2x103 bis 3x104 Stimulatorzellen bzw. 5x103 bis
1x104 PBMC. Jeder Reaktionsansatz wurde 4 fach pro Versuch angesetzt. Die Milliporeplatte
wurde anschließend
24 h in den Inkubator (37 °C) gestellt. Am letzten Tag wurde die
Milliporeplatte, unter Verwendung einer Multipipette mit einem Volumen von 200 µl, 5 bis 6
mal unsteril mit PBS gespült. Anschließend wurden auf die noch mit PBS benetzten Membranen
0,25 µg Nachweisantikörper in 100 µl 4 % BSA-PBS pro Well hinzugegeben und 2 h bei RT
stehen gelassen. Dann erfolgte erneutes Spülen (3mal). Auf die noch benetzten Membranen
wurde dann je 0,1 µl SA-AP (in 100 µl 4% BSA-PBS) pro Well gegeben. Die Platten wurden
daraufhin 1h bei RT inkubiert. Dann erfolgte wiederum Spülen mit PBS (3mal). Im Anschluß
wurde 100 µl Substrat pro Well zugegeben und die Platte für 70-120 min bei 37 °C inkubiert.
Danach wurden die blau gefärbten Spots unter Zuhilfenahme eines Netzgitters ausgezählt.
19
1.Tag
0,192 µg Bindungsantikörper in 100 µl PBS/ Well
steril spülen
5x104 Lymphozyten in 100 µl AIM-V+ (40)
+100 µl AIM-V+ mit 0,001 µg anti-CD3
2.Tag
bzw.
+2x103 bis 3x104 Stimulatorzellen
bzw.
+5x103 bis 1x104 PBMC
unsteril spülen
+0,25 µg Nachweisantiköper in 100 µl 4% BSA-PBS
unsteril spülen
3.Tag
+0,1 µl SA-AP in 100 µl 4% BSA-PBS
unsteril spülen
+100 µl Substrat
3.2.5. Bestimmung des Phänotyps der in vitro kultivierten Lymphozyten
Die zu untersuchenden Lymphozyten wurden aus der Kultur abgenommen und in 500 µl FACSPuffer resuspendiert. Je 30 µl der Suspension wurden in FACS-Röhrchen gegeben (4 Proben)
und anschließend mit je 2 µl der FACS-Antikörper beladen. Es handelte sich um CD3-, CD4-,
CD8-, CD25-, CD69-, CD45RO- und CD45RA-Antikörper. Nach Inkubation der Proben im
Dunklen (10 min bei RT), wurden diese mit 2 ml FACS-Puffer aufgefüllt und zentrifugiert.
Anschließend wurde der Überstand abgegossen, die Röhrchen ausgeklopft und wiederum 500 µl
FACS-Puffer hinzugegeben. Nun erfolgte die Messung der Proben mittels Durchflußzytometer
(FACS).
20
3.2.6. Sortierung der Lymphozyten mit MACS
3.2.6.1.
Prinzip und Ansatz
Bei den aus den Biopsien ausgewanderten Zellen handelt es sich sowohl um ein Gemisch
verschiedener Zellarten, als auch um Lymphozyten mit unterschiedlicher Aktivität bzw.
Relevanz im Bezug auf die Ausbildung von psoriatischen Plaques. Um eine effiziente
Klonierung zu gewährleisten, wurde versucht, die T-Lymphozyten vor der Klonierung so zu
sortieren, daß eine möglicht hohe Ausbeute an aktivierten T-Zellen erlangt wurde. Die T-Zellen
sollten zum einen noch aktiviert sein, d.h. möglichst früh aus der Haut isoliert werden, zum
anderen schonend sortiert werden, um eine weitere Proliferation nicht zu gefährden. Außerdem
mußte eine Methode gewählt werden, mit welcher auch bei relativ geringer Zellzahl effektiv
gearbeitet werden konnte.
Dazu eignete sich das MACS-System, bestehend aus MS Trennsäulen und einer Mini-MACS
Separations-Einheit. Das System basiert auf Magnetismus, d.h. Zellen werden mit magnetischen
Microbeads markiert. Gibt man nun das Zellgemisch, welches je nach Antikörper aus markierten
und unmarkierten Zellen besteht, durch die Magnetsäule, bleiben die markierten Zellen in der
Säule haften.
Zur Vorbehandlung der Biopsate wurden verschiedene Verfahren angewendet. Zum einen wurde
mit Kollagenase 1A vorbehandelt, um die Lymphozyten schneller aus der Haut zu isolieren, zum
anderen wurde versucht, mit Hilfe der sog. Medimaschine durch mechanische Disruption eine
für die Zellen schonendere Desaggregation zu etablieren.
Bei der dritten Variante verwahrte man die Biopsate mehrere Tage im Inkubator in AIM-V+, und
ließ dort die T-Zellen selbständig auswandern.
In allen drei Fällen wurde die gewonne Zellsuspension ohne Vorbehandlung und Druck durch
eine Magnetsäule gegeben, um diese von Zell-und Gewebsresten zu befreien. Danach kamen
wiederum verschiedene Verfahren zum Einsatz. Die Lymphozyten wurden durch verschiedene
Floureszenz-Antikörper markiert (siehe 4.4.1.). Anschließend erfolgte die Bindung an
floureszenz-positive Micro-Beads.
21
3.2.6.2.
Durchführung der T-Zellisolierung
Die zu sortierenden Zellen wurden nach 7 Tagen samt Medium abgenommen und durch eine
Magnetsäule gegeben, um größere Fremdkörper zu entfernen. Der Säulendurchlauf wurde
abzentrifugiert, das enstandene Zellpellet in 100 µl Medium aufgenommen und in ein 50 ml
Reaktionsgefäß überführt. 5 µl der Suspension wurden abgenommen und als FACS-Kontrolle
auf Eis gestellt. Zu der Zellsuspension in dem 50 ml Reaktionsgefäß wurden 10 µl anti-25-Fitc
gegeben und anschließend 10 min bei RT im Dunklen inkubiert. Danach wurde mit 5 ml
Medium resuspendiert und abzentrifugiert. Zu dem Zellpellet wurden dann 80 µl Medium
gegeben, resuspendiert und 4 µl als FACS-Kontrolle abgenommen. Zu der Zellsuspension
wurden nun 25 µl anti-FITC-micro-beads gegeben und der Ansatz danach 15 min im
Kühlschrank inkubiert. Anschließend wurde das Pellet mit 5 ml Medium gewaschen,
abzentrifugiert und in 2 ml FACS-Puffer aufgenommen.
Nach Äquilibrierung einer zweiten Magnetsäule mit 3 ml FACS-Puffer, wurde die
Zellsuspension durch die Säule gegeben, danach mit Hilfe eines 3-Wege-Hahns die Säule von
beiden Richtungen mit FACS-Puffer gespült. Die aufgefangene Suspension bildete die NegativFraktion, von welcher 5% als FACS-Kontolle abgenommen wurden. Beide Proben wurden auf
Eis gelagert. Danach wurde die Säule aus dem Magneten entfernt und abermals gespült, diesmal
mit Druck, wir erhielten dadurch die Positiv-Fraktion. Wieder wurden 5 % der Zellsuspension
zur FACS-Kontrolle abgenommen.
Die 4 FACS-Proben wurden mit Propidium-Jodid (als Vitalfärbung) CD3-APC, CD8-PE, CD25FITC angefärbt und zur Kontrolle und Dokumentation der erreichten Reinheit gemessen.
3.2.7. Klonierung von T-Zellen mittels Einzelzell-Verdünnung
3.2.7.1.
Prinzip
Die sortierten T-Zellen sollten so ausverdünnt und auf 96-Well-Mikrotiterplatten aufgebracht
werden, daß theoretisch auf jedes dritte Well eine einzelne T-Zelle kommt, die dann monoklonal
expandieren kann (sog. “Limiting Dilution”). Es wurde auf 5 Platten ausplattiert. Zur
Stimulierung der Proliferation wurden die autologen PBMC mit je einer von 4 Peptidbanken
beladen, eine Platte wurde zur Kontrolle mit CON A stimuliert.
22
3.2.7.2.
Durchführung
Für den Ansatz von 5 Platten wurde eine Suspension aus 50 ml AIM-V, 2,5 ml autologem
inaktiviertem Serum, 100 Einheiten / ml IL 2 und 150 T-Zellen hergestellt. Je 5x106 inaktivierte
PBMC wurden mit je 1 µl Peptidlösung beladen bzw. mit 5 µl CON A, anschlißend 30 min bei
RT inkubiert. Anschließend wurden die beladenen PBMC mit je 10 ml der Suspension vermischt
und mittels Multipipette (100 µl pro Well) auf die Platten aufgetragen. Die Platten wurden mit
Alufolie luftdicht verschlossen und 14 bis 21 Tage bei 37 °C steril inkubiert.
23
4.
Resultate
4.1. Etablierung des γ -Interferon-Elispot-Assays
4.1.1. Herstellung optimaler Bedingungen für den Meßbereich:
Um ein verwertbares bzw. optimales Ergebnis bei dem γ-IFN-Elispot-Assay zu erzielen, wurden
Elispot-Platten mit PVDF (Polyvinyldifluorid) -Beschichtung verwendet. Es wurde getestet, ob
eine Vorbehandlung mit Äthanol sinnvoll ist, was sich nicht bestätigte, da ein zu intensiver
Hintergrund auf den Platten entstand. Die optimale Lymphozytenzahl belief sich auf 5x104
Lymphozyten pro Well, da bei dieser Menge die entstehenden Spots am optimalsten ausgezählt
werden konnten. Außerdem produzierten die Lymphozyten die am besten zählbaren Spots, wenn
sie 24 h vor der Messung ohne IL-2 kultiviert worden waren, da sonst eine zu große Produktion
an IFN-γ entstand, welche die Auswertung der Platten erschwerte. Die Zahl der verwendeten
ausgewanderten Zellen variierte von 103 bis 105 Zellen pro Well. Außerdem wurde die
Konzentration der Bindungs- und Nachweis-Antikörper optimiert. Optimale Bedingungen lagen
bei Verwendung von 0,192 µg Bindungs-AK in 100 µl PBS/ Well und 0,25 µg Nachweis-AK in
100 µl 4 % BSA-PBS/ Well. Die optimale Inkubationszeit reichte von 75 bis 120 min.
4.2. Polyklonale T-Zell-Linien
4.2.1. Etablierung polyklonaler T-Zell-Linien aus psoriatischen Plaques
12 gut proliferierende Kulturen aus 23 Biopsien (Alter der Patienten zwischen 26 und 81 Jahren,
mittleres Alter 55 Jahre ± 14,5; 14 davon männlich) konnten etabliert werden, welche sich
einfrieren und nach Wiederauftauen weiter expandieren ließen. 2 Kulturen mußten aufgrund von
Kontaminationen, 9 wegen ungenügender Proliferation verworfen werden. Mit 10 dieser T-ZellKulturen ließ sich letztendlich eine Elispot-Assay-Versuchsreihe mit ausreichenden Durchläufen
durchführen (Alter der Patienten zwischen 26 und 81 Jahren, mittleres Alter 52,6 Jahre ± 19,3;
6 davon männlich).
24
4.2.2. Phänotypisierung per FACS
Obwohl die T-Zellen in vitro unspezifisch stimuliert wurden (mit Interleukin-2, anti CD3 und
gegebenenfalls CON A) zeigte sich im Verlauf, daß sich die relative Frequenz der CD4- und
CD8-Zellen bedeutend veränderte (Abbildung 1). So war der Anteil der CD4-Zellen in der
frühen Phase der Kultur (im Mittel nach 41 Tagen in vitro) um 56 % höher als der der CD8Zellen. Nach 100 Tagen in vitro zeigte sich ein ganz anderes Bild: der Anteil der CD8-Zellen
war nun 3 mal höher als der der CD4-Zellen. Dies ergab die FACS-Analyse von 6 T-Zell-Linien
über einen Zeitraum von etwa 3 Monaten.
.
Abbildung 1 : Darstellung der prozentualen Anteile von CD4- bzw. CD8-Zellen in Kultur (bei n= 6 Patienten), erste
Messung im Mittel nach 40,8 ± 25,2, zweite Messung nach weiteren 57,8 ± 42,9 Tagen.
Alle 10 bei dem Elispot-Assay verwendeten T-Zell-Linien wurden zum Zeitpunkt des Assays
mittels FACS-Analyse phänotypisiert. Davor waren diese im Mittel 34 Tage (zwischen 21 und
85 Tagen) in Kultur gewesen. Es wurden die Oberflächenmolküle CD3, CD4, CD8 und CD69
markiert. Die Kulturen unterschieden sich beträchtlich in den gemessenen PhänotypZusammensetzungen (siehe Abbildung
2 und Tabelle 1 unter 4.3.2). Auffallend war
insbesondere der relativ hohe Anteil an sog. “doppelt negativen” (d.h. CD4- CD8-) T-Zellen.
25
Abbildung 2: FACS-Phänotyp von psoriatischen T-Zell-Linien im Mittel nach 34 Tagen ( 21-85 Tagen) in Kultur.
Das Diagramm zeigt die gemittelten Daten von 10 Patienten.
4.3. γ-Interferon-Elispot-Assay der polyklonalen T-Zell-Linien
4.3.1. Phänotypisierung der ausgewanderten Zellen
Die zur autologen Stimulation vorgesehenen Zellen, emigriert aus demselben Plaque - dem die
expandierten T-Zell-Linien entstammten - wurden mittels FACS phänotypisiert, um die zelluläre
Zusammensetzung
dieser
Population
näher
zu
bestimmen.
Dabei
wurden
die
Oberflächenmoleküle CD1a, CD19, CD3, CD4, CD8 und MHC-II (= HLA-DR) markiert, um die
Langerhans-Zellen, B- und T-Zellen, die wichtig für die Antigen-Präsentation sind, zu erfassen.
Die ausgewanderten Zellen wurden jeweils aus Zellen gepoolt, die in einem Zeitraum von 3
Wochen aus der Hautprobe ausgewandert waren. Abbildung 3 zeigt die Verteilung der
Oberflächenmarker. Bemerkenswert ist, gerade im Hinblick auf die große Heterogenität der
T-Zell Linien (s.o.), daß die interindividuelle Varianz der aus den Plaques ausgewanderten
Zellen relativ gering war, d.h. bei fünf unterschiedlichen Spendern waren ca. 20 % der
emigrierten Zellen Langerhans-Zellen (Abbildung 3).
26
Abbildung 3 : FACS-Phänotypisierung der ausgewanderten autologen Zellen, die in einem Zeitraum von 3 Wochen
aus dem Plaque wanderten und zur Restimulation der T-Zell-Linien dienten. Alle ausgewanderten Zellen eines
Patienten wurden gepoolt. Die gezeigten Daten entsprechen Mittelwert ± Standardabweichung von n = 5 Patienten.
Abbildung 4 zeigt weiterhin, daß, wiederum mit geringer interindividueller Variabilität, die
Langerhans-Zellen zu etwa gleichen Teilen inaktiv bzw. aktiviert waren; jeweils 10 % der
CD45+ Leukozytenpopulationen waren HLA-DR+ bzw. HLA-DR-.
Abbildung 4 : Aus dem Biopsat ausgewanderte Zellen wurden über einen Zeitraum von 3 Wochen zwei - bis
dreimal die Woche gesammelt und bestrahlt, um primär als Stimulatorzellen für die Elispot-Assays zu dienen. Die
Daten zeigen die autologen Zellen von 5 verschiedenen Patienten, gemesen in einem Multiparameter-FACS.
Lymphozyten wurden mit forward-sideward-scater gegatet, Leukozyten mittels Eingrenzung auf CD45+ Zellen.
27
4.3.2. Restimulierbarkeit polyklonaler T-Zell-Linien durch autologe Plaquezellen
Mit jeder der 10 T-Zell-Linien wurden jeweils 3 Elispot-Assay-Serien durchgeführt. Dabei
wurde mittels Erfassung der IFN-γ-Sekretion durch Auszählen der entstandenen Spots, die basale
Aktivität und die Aktivität durch Stimulation durch anti-CD3 und inaktivierter autologer
Plaquezellen gemessen. Es ergab sich hierbei keine Korrelation zwischen dem Phänotyp der
T-Zellen (CD4, CD8), ihrem Aktivierungszustand (CD69) und ihrer Aktivität im Elispot-Assay
(graphisch nicht dargestellt). Trotz der hohen intraindividuellen Variabilität der absoluten SpotZahlen (Tabelle 1) war die relative Stimulierbarkeit deutlich reproduzierbarer.
Tabelle 1: Gegenüberstellung der Ergebnisse des γ-Interferon-Elispot-Assay und der Auswertung der FACSAnalyse bei 10 Patienten. Gezeigt wird (linke Tabellenhälfte) Mittelwerte ± Standardabweichung von jeweils drei
unabhängigen Experimenten pro Patient, sowie (rechte Tabellenhälfte) die FACS-Phänotypisierung der für die
Stimulationsversuche verwendeten T-Zell-Linien.
Spots / 5x104 Lymphozyten
Patient basal
Phänotypverteilung der T-Zellen
stimuliert anti-CD3 CD4+ CD8+ DN DP
1
32
±
32,5
2
144
±
3
41
4
37
CD69+ CD8/CD4
40,3 ± 32
93 ±
73
65
31
1,6
1,9
48
2,1
119
160
± 140
171 ± 146
43
53
3,3
0,8
41
1,2
±
31
41
±
22
355 ± 159
13,7
65
21
0,3
65
4,7
±
23
58
±
43
522 ± 192
7,3
53
40
0
27
7,3
4,1 ±
2
18 ±
4
7,8
11
81
0
16
1,4
5
2,1 ±
,0
6
68
±
95
115
± 161
165 ± 184
0,4
43
56
0,3
53
108
7
93
±
67
74
±
38
262 ± 162
42
44
12
1,3
24
1,0
8
10
±
6
26
±
9
35 ±
15
9
89
1
1,2
37
9,9
9
7
±
5
12
±
5
420 ± 195
82
15
1,5
0,6
26
0,2
10
22
±
9
36
±
14
886 ± 313
15
78
6,3
0,5
42
5,3
Weiterhin zeigt sich, daß die Stimulation der T-Zell-Linien durch autologe Zellen nur einen
Bruchteil der maximalen, durch direkte Stimulation des T-Zell-Rezeptors auslösbaren, IFN-γSekretion bewirkte (Abbildung 5 und Tabelle 2). Außerdem variierte die individuelle
Restimulierbarkeit
durch
autologe
Plaquezellen
der
10
T-Zell-Linien
stark.
Zur
Veranschaulichung stellen wir die prozentuale Stimulation, relativ zur Stimulation durch antiCD3, dar (Tabelle 2). Hier zeigt sich eine Spanne von 3,2 % bis hin zu 119,3 %.
28
Tabelle 2 : Gegenüberstellung der fach-Stimulation durch autologe Zellen bzw. anti-CD3 bezogen auf die basale
Aktivität im γ-Interferon-Elispot-Assay (jeweils drei unabhängige Experimente pro Patient) bei 10 Patienten.
fach-Stimulation
% der CD3-Stimulation
Patient
autologe Zellen
1
1,5 ± 0,4
3,2 ±
2,5
60,8
2
1,4 ± 0,6
1,2 ±
0,1
119,3
3
1,1 ± 0,4
10,8 ±
6,2
12,6
4
1,6 ± 0,4
19,0 ± 12,1
11,9
5
2,5 ± 1,3
10,9 ±
5,4
24,9
6
2,0 ± 0,5
11,2 ±
7,6
22,3
7
0,9 ± 0,2
3,0 ±
0,9
30,2
8
3,0 ± 1,4
4,9 ±
4,1
87,9
9
1,8 ± 0,4
82,9 ± 73,7
3,2
10
1,6 ± 0,1
43,4 ± 15,6
4,1
anti-CD3
29
Abbildung 5 : Darstellung der gemittelten fach-Stimulationen der Elispot-Assay-Versuche (3 pro Patient) der 10 TZell-Linien. Durch die logarithmische Skalierung wird die viel höhere Stimulierbarkeit durch anti-CD3 (rechts), im
Gegensatz zu der durch autologe Zellen (links) deutlich.
Abbildung 5 verdeutlicht mittels der logarithmischen Skalierung, wie breit die Spanne der
Restimulierbarkeit durch anti-CD3 ist. Die Stimulierbarkeit durch die autologen Zellen ist weit
weniger breit gestreut (siehe auch Tabelle 2).
Sowohl die basale Aktivität, als auch die Aktivität durch anti-CD3-Stimulation (gemessen durch
IFN-γ-Sekretion) variieren bei den 10 T-Zell-Linien erheblich. Um etwaige Trends besser
identifizieren zu können, wurden die Linien daraufhin in 2 Gruppen unterteilt: in sog. “HighResponder” und “Low-Responder” (Tabelle 3). Den High-Respondern wurden die T-Zell-Linien
zugeordnet, deren Aktivität durch anti-CD3-Stimulation sich in mehr als 250 Spots pro 5 x104
Zellen zeigte. Dies traf genau auf die Hälfte der Linien zu.
Diese Art der Auswertung verdeutlicht, daß bei ähnlich hoher basaler Aktivität die
Stimulierbarkeit durch anti-CD3 bei den sog. High Responder-Linien ca. 7-fach höher war, als
bei den Low Responder-Linien.
30
Tabelle 3: Einteilung der 10 T-Zell-Linien in High- und Low- Responder. Die Daten
repräsentieren die Mittelwerte ± Standartabweichung der Anzahl der Spots von jeweils drei
unabhängigen Experimenten pro Patient.
Spots pro 5x104 Lymphozyten
n
basal
Plaquezellen
anti-CD3
alle
10
46 ± 45
57 ± 48
293 ± 266
High-Responder
5
40 ± 33
44 ± 24
489 ± 241
Low-Responder
5
51 ± 57
69 ± 66
96 ± 71
Nachdem die T-Zell-Linien in 2 Gruppen unterteilt waren, fiel auf, daß die Low-Responder, d.h.
die T-Zellen, die schwach auf anti-CD3 reagierten, eine weitaus höhere Akivität gegenüber den
autologen Zellen zeigten, als es die High-Responder taten (Abbildung 6a und 6b).
Abbildung 6a: Mittelwerte und Standardabweichung der fach-Stimulation im Vergleich zur basalen Aktivität von
T-Zellinien stimuliert durch autologe Plaquezellen (linke Ordinate) oder anti-CD3 (rechte Ordinate). Die Daten
repräsentieren die Ergebnisse aller 10 Patienten, eingeteilt in je 5 High- bzw. Low- Responder mit jeweils drei
unabhängigen Experimenten pro Individuum.
Abbildung 6b : Mittelwerte der prozentualen Stimulierbarkeit der T-Zellen durch autologe Plaquezellen, bezogen
auf die Aktivität bedingt durch anti-CD3. (Einzelheiten s. Legende zu Abbildung 6a).
31
4.3.3. Stimulierbarkeit polyklonaler T-Zell-Linien durch autologe PBMC
Die T-Zell-Linien wurden bei 3 Patienten sowohl mit autologen Plaquezellen als auch mit
autologen PBMC restimuliert. Die Restimulierbarkeit durch autologe PBMC war sowohl im
Vergleich der fach-Stimulation (um ca. 25 %), als auch des prozentualen Anteils, bezogen auf
die anti-CD3-Stimulation (über 100 %) deutlich höher (Abbildung 7).
Abbildung 7 : Ergebnisse von γ-IFN-Assays bei denen psoriatische T-Zell-Linien durch autologe Plaquezellen
bzw. autologe PBMC restimuliert wurden. Links ist die fach-Stimulation (bez. auf die basale Aktivität)
graphisch dargestellt, rechts das prozentuale Verhältnis zur anti-CD3-Stimulation. Es wurden sechs unabhängige
Experimente mit Zellen von 3 verschiedenen Patienten durchgeführt.
4.4. Isolation von T-Zell-Klonen aus psoriatischen Plaques
4.4.1. Optimierung der Methode
Anfangs wurden die aus der Biopsie ausgewanderten Zellen CD3-positiv sortiert (MACS: s.
Methodenteil). Es bildeten sich bei der nachfolgenden Klonierung mittels limitierender
Verdünnung (siehe Methodenteil) jedoch keine Klone. Um die Lymphozyten schneller aus
der Haut zu isolieren, wurden die Biopsien in weiteren Vorversuchen mit Kollagenase 1A
vorbehandelt, und anschließend CD3-negativ sortiert, um die T-Zellrezeptoren nicht zu
blockieren. Auch mit dieser Methode wuchsen keine Klone. Daraufhin wurde eine Biopsie
mittels einer sog. Medimaschine mechanisch desaggregiert und anschließend die Zellen CD3negativ sortiert, um den T-Zell-Rezeptor nicht für die nachfolgenden Stimulation zu
32
blockieren. Die Negativ-Sortierung erfolgte mittels einer Antikörper-Mischung aus CD1-,
CD19-, CD56- Antikörpern. Die Ausbeute an Klonen hierbei war allerdings ebenfalls sehr
gering. Als nächstes wurde zur Isolierung aktivierter Zellen eine Sortierung mittels
intrazellulärer IFN-γ Markierung versucht, die jedoch eine zu geringe Anreicherung
hervorbrachte.
Schlußendlich stellte sich heraus, daß die Variante, CD25-positiv zu sortieren, sowohl für die
erreichbare Reinheit, als auch für das Klonierungsergebnis die bis dahin effizienteste Methode
darstellte. Die hierbei erreichte Anreicherung wurde per FACS ermittelt und ist exemplarisch
in Abbildung 8 dargestellt. Durchschnittlich erreichten wir ein Aneicherungsrate von CD25+
Zellen von über 70 %. Funktionell gesehen wurde durch die Sortierung über CD25
(Interleukin-2 Rezeptor alpha Kette) auch gleichzeitig eine Anreicherung der aktivierten TZellen erreicht.
33
Abbildung 8 : FACS-Auswertung der T-Zellen von 3 Patienten vor und nach Sortierung durch magnetische
Markierung mittels CD25. Die Markierung umgrenzt diejenigen T-Zellen, die relevant für die Klonierung
(CD25+ = aktiviert ) waren. Die rechts angegebenen Faktoren ergeben sich aus der relativen Anreicherung der
T-Zellen nach der Sortierung.
34
4.4.2. Restimulation der Klone eines Probanden durch autologe Plaquezellen
Die Klone, die durch Limiting Dilution aus einer T-Zell-Linie isoliert wurden, ließen sich
durch anti-CD3 und autologe Zellen restimulieren (dargestellt in Abbildung 9a und 9b).
Abbildung 9a : Mittelwerte der Interferon-γ-Elispot-Assays mit den 3 Klonen eines Patienten (jeweils
durchgeführt in Triplikaten). Dargestellt sind die basale Aktivität und die absolute Stimulation der Klone durch
autologe Plaquezellen und durch anti-CD3.
Abbildung 9b : Mittelwerte der Ergebnisse der Elispot-Assays mit den 3 Klonen eines Patienten (jeweils
durchgeführt in Triplikaten). Dargestellt ist fach-Stimulation durch autologe Zellen und anti-CD3 bezogen auf
die basale Aktivität der T-Zellen der Klone.
35
Im Vergleich zu den polyklonalen T-Zell-Linien, zeigten die Klone eine 6 mal höhere
Aktivität auf autologe Plaquezellen, bezogen auf die Stimulation durch anti-CD3 und eine
um den Faktor 1,8 höhere Aktivität, bezogen auf die basale IFN-γ-Sekretion (Tabelle 4).
Tabelle 4: Gegenüberstellung der fach-Stimulation der Mittelwerte der Ergebnisse des IFN-γ-Elispot-Assays
(jeweils 3 Experimente pro Patient) von 10 T-Zell-Linien im Veleich zu den Ergebnissen dreier T-Zell-Klone
eines Patienten.
fach-Stimulation bezogen auf basale Aktivität
T-Zell-Linien
T-Zell-Klone
anti-CD3
6,4 ± 3,7
1,9 ± 1,3
autologe Plaquezellen
1,2 ± 1,2
2,2 ± 1,5
36
5.
Diskussion
In den letzten Jahren haben sich die Hinweise für eine tragende Rolle der T-Lymphozyten bei
der Entstehung und Aufrechterhaltung der Psoriasis verdichtet. Viele Autoren beschäftigen
sich mit der Frage, ob es sich bei den Antigenen, die für die Proliferation und Aktivität der TZellen verantwortlich sind, um Superantigene oder endogene Antigene handelt (Leung et al,
1995; Prinz, 2001; Baker et al, 1993; Hales et al, 1999; Norris et al, 1997). Hinweise darauf
kann zum Beispiel die Zeit geben, die das stimulierende Antigen benötigt, um
Immunreaktionen in seiner Umgebung auszulösen. Diese Untersuchung ergab bei einer der
Forschungsgruppen, daß die Reaktionszeit, die das Immunsystem benötigt, um aktiv zu
werden, eher für einen Prozeß spricht, der durch endogene Antigene ausgelöst wird (Hales et
al, 1999).
Die Spezifität von T-Zell-stimulierenden Antigenen bei Psoriasis ist unbekannt. Daher ist
ebenfalls nicht nachgewiesen, ob die relevanten Antigene über die Zeit hinweg und zwischen
Individuen identisch sind. Hinweise darauf, daß T-Zell-Klone interindividuell und über einen
gewissen Zeitraum klonalen Ursprungs sind, wurden in einigen Studien, die den T-ZellRezeptor mittels PCR untersuchten, gefunden (Menssen et al, 1995; Lin et al, 2001; Chang et
al, 1994, 1997; Lewis et al, 1993; Vollmer et al, 2001; Pinz, 1999).
Wir nähern uns in dieser Arbeit der Identifizierung der relevanten Antigene von Seiten der TZellen, d.h. wir versuchen Vorraussetzungen dafür zu schaffen, daß die Epitope, die der TZell-Rezeptor erkennt, identifiziert werden können. Eine Methode, die T-Zell-RezeptorSpezifität(en) zu bestimmen, besteht darin, kombinatorische Peptidbibliotheken (PS-SCL)
anzuwenden. Dies erfordert die vorherige Isolation von T-Zell-Klonen aus psoriatischen
Plaques, die in vitro getestet werden können. Sobald Klone isoliert und die TCR-Spezifitäten
bestimmt wären, ließe sich die biologische Relevanz der identifizierten T-Zellen für die
Pathogenese der Psoriasis ersehen.
Jedes mögliche Peptid, das relevant für die T-Zell
Aktivität in psoriatischen Plaques ist, sollte hinsichtlich des Ausmaßes seiner Aktivität
testbar, und seine biologische Relevanz bei verschiedenen Individuen und unabhängig vom
Zeitpunkt nachweisbar sein.
Der ultimative Beweis für die pathogenetische Wichtigkeit wäre hierbei die Beendigung der
Krankheit durch TCR-spezifische Intervention. Dies kann man jedoch weder am Patienten
testen, noch gibt es derzeit passende Tiermodelle, die einen hohen Durchlauf an Peptid-Tests
erlauben.
37
Daher haben wir einen alternativen Ansatz gewählt, um Peptide in vitro nach
pathogenetischer Relevanz zu screenen. Wir nahmen hierfür die γ-Interferon-Sekretion
aktivierter T-Zellen als Marker für deren Aktivität bzw. Reaktivierung durch autologe Zellen.
5.1. γ-Interferon-Elispot-Assay
Als ersten Schritt etablierten wir einen hochsensiblen Elispot-Assay, der dafür verwendet
werden kann, die Stimulation von psoriatischen T-Zellen durch autologe Zellen, die in vitro
aus den Plaques gewandert sind, nachzuweisen.
Um die Häufigkeit von aktivierten T-Zellen durch ihre γ-Interferon-Sekretion zu
quantifizieren, ist eine sehr sensible Methode nötig. Mit ELISA wäre es nicht möglich, die
Aktivität von T-Zellen, die aus psoriatischen Plaques gewonnen wurden, so differenziert zu
quantifizieren.
Wir expandierten T-Zell-Linien aus Hautbiopsien, die aus Plaques von psoriatisch betroffener
Haut gewonnen wurden. Um T-Zell-Kulturen heranzuzüchten, isolierten wir diejenigen
Zellen, die in den ersten Tagen aus dem Plaque wanderten, und stimulierten diese T-Zellspezifisch mit IL-2. Da die T-Zellen der verschiedenen Patienten unteschiedlich gut
proliferierten, mußten wir bei manchen Kulturen zusätzlich mit anti-CD3 und CON A
stimulieren, damit sich Kulturen bilden konnten. Die unterschiedliche Proliferationsfähigkeit
der 10 verschiedenen T-Zell-Linien kann zum einen durch unterschiedliche Aktivität der
Erkrankung bei dem jeweiligen Patienten, welche sich klinisch nicht immer unterscheiden
ließ, zum anderen an biologischen Faktoren liegen, die wir in der artifiziellen Umgebung in
vitro nicht erfassen konnten. Das unterschiedliche Millieu, dem die T-Zellen entstammten,
zeigt auch die Analyse mittels Durchflußzytometer, da die T-Zell-Linien der 10 Patienten
bezüglich ihres Phänotyps sehr variieren.
Die autologen Plaquezellen, die wir dem Plaque nach Isolierung der T-Zellen über einen
Zeitraum von Wochen entnahmen, wurden gepoolt, damit diese repräsentativ für die in der
Haut anzufindenden Zellen sind. Wir konnten nicht ausschließen, daß die Auswanderungsgeschwindigkeit interindividuell variiert, und somit das Ergebnis verfälschen würde, falls die
Proben aufgrund zeitlicher Faktoren unterschiedliche Zellarten enthalten.
Wir können in der vorgelegten Arbeit zeigen, daß der Assay dafür eingesetzt werden kann,
die Stimulation von psoriatischen T-Zellen durch autologe Zellen quantitativ nachzuweisen.
Allerdings ist die Reaktivität durch autologe Plaquezellen, die wir mittels γ-InterferonSekretion erfaßt haben, zum einen von niedriger Größenordnung (im Vergleich zu anti-CD3)
und hohen interindividuellen Schwankungen unterworfen, zum anderen zeigt sich eine
38
quantitativ ebenso hohe Reaktion auf autologe PBMC. Eine mögliche Erklärung für die
Stimulierbarkeit durch PBMC wäre, daß die Antigene, die für die vermehrte Häufigkeit von
IFN-γ sezernierenden Zellen verantwortlich sind, endogen sind und nicht auf die Haut
reduziert, sondern ebenso auf Blutzellen exprimiert sein könnten. Eine andere Ursache wäre,
daß autologe Plaquezellen und PBMC verschiedene Klone der polyklonalen T-Zell-Linien im
Ansatz des Assays aktivieren könnten.
Die niedrige spezifische Reaktion und hohe individuelle Schwankung der psoriatischen TZell-Linien auf die autologen Plaquezellen mag durch die Abwesenheit bzw. niedrige
Konzentration an relevanten Antigenen, einem Mangel an Co-Stimulatoren, einem Mangel an
Antigen-spezifischer T-Zell-Klone oder einer Kombination dieser Faktoren im Ansatz des
Elispot-Assay herrühren. Man weiß weder, ob die relevanten Antigene generell in der Haut
aufzufinden sind, noch ob und welche spezielle immunologische Konstellation nötig ist, daß
sie als solche erkannt werden (Menssen et al, 1995). Daher scheint es möglich, daß die
Erfassung hoch-spezifischer T-Zell-Autoreaktivität in vitro eine hohe Anreicherung der
relevanten Antigene, APC, Co-Stimulations-Signalen oder allem zusammen erfordert. Auch
andere Autoren beschreiben eine hohe interindividuelle Schwankung der IFN-γ-Sekretion von
T-Zell-Linien verschiedener Patienten, ohne daß eine
Korrelation zu dem Ausmaß der
klinischen Hauterscheinigung zu finden ist (Ovigne et al, 2001).
Die interindividuellen Schwankungen der γ-Interferon-Sekretion der T-Zellen zeigen keine
(oder eine sehr geringe) Korrelation zu ihrer CD4- oder CD8-Expression, bzw. ihrem
jeweiligen Aktivierungszustand. Daher muß man davon ausgehen, daß entweder große
biologische Schwankungen innerhalb der 10 T-Zell-Linien bestanden, oder aber Faktoren an
der Interaktion der T-Zellen mit den Antigenen beteiligt sind, die wir in unserem
Reaktionsansatz nicht bedacht hatten oder die noch nicht als solche erkannt worden sind.
Wir stellen zudem fest, daß sich in vitro das Verhältnis der Exprimierung von CD4 und CD8
zugunsten von CD8 verschiebt. In den T-Zell-Kulturen fanden wir bei der ersten Messung
über 50 % mehr CD4 als CD8 exprimiert; bei der zweiten Messung im Mittel nach 58 Tagen
war nun 3 mal mehr CD8 als CD4 als Oberflächenmarker aufzufinden. Dieses Ergebnis steht
in Analogie zu dem Befund, daß in frühen psoriatischen Läsionen vermehrt CD4-Zellen, in
späten, abheilenden dagegen ein von CD8-Zellen dominiertes Bild vorherrscht (Baker et al,
1984; Friedrich et al,
2000). Es ist zudem nicht auszuschließen, daß die CD8-Zellen
speziellen, nur in vitro phänotypischen Veränderungen unterliegen. Welche Konsequenz sich
daraus für unsere Ergebnisse im Assay ergeben, ist nicht abzuschätzen.
39
Die Analyse mittels Durchflußzytometer ergab einen hohen Anteil (über 20 %) sog. doppeltnegativer Zellen (CD4- CD8-). Man findet bei Gesunden nur eine kleine Anzahl von doppelt
negativen (DN) Zellen (Crosbie et al, 1998). Bei Patienten mit lymphoproliferativen
Störungen, Abstoßungsreaktionen nach Transplantationen und Autoimmunkrankheiten
beobachtet man hingegen eine deutliche Zunahme dieser Zellen (Chandy et al, 1990; Masuda
et al, 1991; Hamad et al, 2001). Die DN Zellen, die nicht durch antigenpräsentierende APC
aktiviert werden, zeigen eine normale Reaktion auf anti-CD3 und anti- CD28 (Blank et al,
2003). Obwohl die Funktion der DN Zellen noch nicht geklärt ist (Ford et al, 2002), könnten
diese Zellen als Marker für Störungen des Immunsystems dienen (Devi et al, 1998). Diese
Überlegung können wir mit unseren Ergebnissen bestärken.
5.2. Klonierung
Als zweiten Schritt beschreiben wir eine Methode, die zeigt, wie man einzelne Klone aus
psoriatischen Plaques isolieren kann, welche sowohl aktiviert und in vitro expandierbar, als
auch durch autologe Zellen restimulierbar sind.
Wir isolierten hierfür aktivierte T-
Lymphozyten mittels Markierung der Zellen am CD25-Rezeptor aus psoriatischen Plaques.
Die Anreicherungsrate dieser aktiven Zellen belief sich im Durchschnitt auf das über 70fache. Diese Zellen klonierten wir dabei mittels Einzel-Zell-Verdünnung. Unsere Ergebnisse
weisen indirekt daraufhin, daß es sich bei diesen CD25+ Zellen nicht um sog. SuppressorZellen handelt (welche ebenfalls CD25+ sind).
Die Klone, die sich als expandierbar zeigten, restimulierten wir unter den gleichen
Bedingungen wie die polyklonalen T-Zell-Linien mit anti-CD3 und autologen Plaquezellen.
Die Ergebnisse zeigen, daß die Klone viel ausgeprägter auf die autologen Zellen reagieren, als
es die polyklonalen Zellen tun. Bezogen auf die anti-CD3-Stimulation zeigten die Klone, die
durch autologe Plaquezellen stimuliert wurden, eine 6fach höhere Aktivität als die unsortieren
polyklonalen T-Zellen. Bezogen auf die basale Aktivität findet sich eine um den Faktor 1,8
erhöhte Stimulation.
Da die Klone aus Zellen enstanden, die mittels CD25 - einem Marker, der einen hohen
Aktivitätszustand anzeigt - isoliert wurden, entsprechen diese Ergebnisse den Erwartungen.
Es scheint sich um Klone zu handeln, die eine weit ausgeprägtere Reaktion auf die
spezifischen Bedingungen in der psoriatischen Haut zeigen. Dies zeigt, daß die Grundlage für
die Anwendung der kombinatorischen Peptidbanken durchaus gegeben ist. Allerdings führten
wir den Versuch nur bei einem einzigen Patienten durch. Um weitreichendere Aussagen
treffen zu können, sind weitere Versuchsreihen notwendig.
40
6.
Zusammenfassung
Bei der Entstehung der Psoriasis (Schuppenflechte) wird nach dem heutigen Kenntnisstand
den T-Lymphozyten eine tragende Rolle zugeschrieben, welche wahrscheinlich auf noch nicht
identifizierte Antigene in der Haut reagieren. Könnte man die T-Zell-Spezifitäten und somit
die Antigene, die die Kaskade der Entzündungsreaktion initiieren, identifizieren, wäre es
möglich, eine gezielte Therapie zu entwickeln. Diese Arbeit soll einen weiteren Schritt auf
diesem Weg ermöglichen.
Ein Ziel dieser Arbeit war, die autologe Restimulation von T-Zellen aus psoriatischen Plaques
in vitro qualitativ und quantitativ zu rekonstruieren. Hierzu wurden T-Zell-Linien expandiert,
die sich autolog restimulieren ließen. Die T-Zell-Aktivierung wurde mittels Messung der
Interferon-γ-Sekretion quantitativ erfaßt. Außerdem konnten wir den Phänotyp der T-ZellLinien und der ausgewanderten Plaquezellen darstellen und mit den Ergebnissen des ElispotAssay vergleichen. Es ergab sich hierbei keine bzw. nur eine geringe Korrelation. Dies zeigt,
daß nicht alleine der Phänotyp der T-Zellen deren Aktivität bedingt. Wir vermuten daher, daß
noch weitere Faktoren an der Aktivierung der T-Zellen beteiligt sind, die wir bei unserer
Arbeit nicht erfassen konnten. Wir zeigen, daß sich der von uns etablierte Assay eignet, um in
vitro die Aktivität von psoriatischen T-Zell-Linien zu messen.
Ein weiteres Ziel dieser Arbeit bestand darin, aus psoriatischen Plaques T-Zell-Klone zu
isolieren, die relevant für das Entzündungsgeschehen bei der Erkrankung sind. Wir konnten
mittels Markierung und Sortierung der T-Zellen am CD25-Rezeptor aktive T-Zellen aus
psoriatischen Plaques isolieren. Schließlich ließen sich mittels Einzel-Zellverdünnung T-Zell
Klone expandieren, die durch autologe Plaque-Zellen restimulierbar waren.
Die hier
vorgelegten Ergebnisse können als eine Grundlage dienen, um die Antigene, die bei der
Pathogenese der Erkrankung maßgeblich beteiligt sind, eingehender zu charakterisieren.
41
7. Literatur
7.1. Quellenverzeichnis
Abrams JR, Kelley SL, Hayes E, Kikuchi T, Brown Mj, Kang S, Lebwohl MG, Guzzo CA,
Jegasothy BV, Linsley PS, Krueger JG: Blockade of T-lymphocyte costimulation with
cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4-immunoglobulin (CTLA4Ig) reverses the
cellular pathology of psoriatic plaques, including the activation of keratinocytes, dendritic
cells, and endothelial cells. J Exp Med, Sept 2000, 192(5) p681-693
Aoki S, Yaoita H, Kitajima Y : An elevated level of autoantibodies against 48-50-kd keratins
in the serum of patients with psoriasis. J Invest Dermatol, 1989, 92 p179-183
Asadullah K, Doecke WD, Reinke P, Sterry, Volk HD: Cytokine determination. Diagnostic
significance from the clinical and immunological viewpoint. Dtsch Med Wochenschr
(Germany), Nov 14 1997, 122(46) p1424-1431
Baker BS, Swain AF, Valdimarsson H, Fry L: T-cell subpopulations in the blood and skin of
patients with psoriasis. Br J Dermatol (England), Jan 1984, 110(1) p37-44
Baker BS, Swain AF, Fry L, Valdimarsson H: Epidermal T lymphocytes and HLA-DR
expression in psoriasis. Br J Dermatol (England), May 1984, 110(5), p555-564
Baker BS, Powles AV, Lambert S, Valdimarsson H, Fry L: A prospective study of the
Koebner reaction and T lymphocytes in uninvolved psoriatic skin. Acta Derm Venereol, 1988,
68(5) p430-434
Baker BS, Fry l: The immunology of psoriasis. BR J Dermatol, 1992, 126(1) p1-9
42
Baker BS, Brent L, Valdimarsson H, Powles AV, Al-Imara L, Walker M, Fry L: Is epidermal
cell proliferation in psoriatic skin grafts on nude mice driven by T-cell derived cytokines? Br
J Dermatol (England), Feb 1992, 126(2) p105-110
Baker BS, Bokth S, Powles A, Garioch JJ, Lewis H, Valdimarsson H, Fry L: Group A
streptococcal antigen-specific T lymphocytes in guttate psoriatic lesions. Br J Dermatol
(England), May 1993, 128(5) p493-499
Bata-Csorgo Z, Hammerberg C, Voorhees JJ: Kinetics and regulation of human keratinocyte
stem cell growth in short-term primary ex vivo culture. Cooperative growth factors from
psoriatic lesional T lymphocytes stimulate proliferation among psoriatric uninvolved, but not
normal, stem keratinocytes. J Clin Invest, 1995, 95 p317-327
Bjerke JR, Livden JK, Degre M, Matre R: Interferon in suction blister fluid from psoriatric
lesions. Br J Dermatol, 1983,108(3) p295-299
Blank C, Brown I, Marks R, Nishimura H, Honjo T, Gajewski TF: Absence of programmed
death receptor 1 alters thymic development and enhances generation of CD4/CD8 doublenegative TCR-transgenic T cells. J Immunol, Nov 2003, 171 p 4574-4581
Boggiano C, Reixach N, Pinilla C, Blondelle SE: Successful identification of novel agents to
control infectious diseases from screening mixture-based peptide combinatorial libraries in
complex cell-based bioassays. Biopolymers, 2003, 71(2) p103-116
Borras E, Martin R, Judkowski V, Shukaliak J, Zhao Y, Rubio-Godoy V, Valmori D, Wilson
D, Simon R, Houghten R, Pinilla C: Findings on T cell specifity revealed by synthetic
combinatorial libraries. Journal of Immunological Methods, 2002, 267, p79-97
43
Bos JD, De Rie MA: The pathogenesis of psoriasis: Immunological facts and speculations.
Immunol Today (England), Jan 1999, 20(1) p40-46
Boyman O, Hefti HP, Conrad C, Nickoloff BJ, Suter M, Nestle FO: Spontaneous
development of psoriasis in a new animal model shows an essential role for resident T cells
and tumor necrosis factor-alpha. J Exp Med, Mar 2004, 199(5) p731-736
Brown DW, Baker BS, Ovigne JM, Hardman C, Powles AV, Fry L: Skin CD4+ T cells
produce interferon-gamma in vitro in response to streptococcal antigens in chronic plaque
psoriasis. J Invest Dermatol (United States), Mar 2000, 114(3) p576-580
Chandy KG, Cahalan MD, Grissmer S: Autoimmune diseases linked to abnormal K+ channel
expression in double-negative CD4-CD8- T cells. Eur J Immunol, Apr 1990, 20(4) p747-751
Chang JC, Smith LR, Froning KJ,Schwabe BJ, Laxer JA, Caralli LL, Kurland HH, Karasek
MA, Wilkinson DI, Carlo DJ: CD8+ T cells in psoriatic lesions preferentially use T-cell
receptor V beta 3 and/ or V beta 13.1 genes. Proc Natl Acad Sci USA (United States), Sep 27
1994, 91(20) p9282-9286
Chang JC, Smith LR: Persistence of T-cell clones in psoriatic lesions. Arch Dermatol, 1997,
133 p703-708
Crosbie OM, Costello PJ, O'Farrelly C, Hegarty JE: Changes in peripheral blood doublenegative T-lymphocyte (CD3+ CD4- CD8-) populations associated with acute cellular
rejection after liver transplantation. Liver Transpl Surg, Mar 1998, 4 p141-145
Devi BS, Van Noordin S, Krausz T, Davies KA: Peripheral blood lymphocytes in SLE-hyperexpression of CD154 on T and B lymphocytes and increased number of double negative
T cells. J Autoimmun, Oct 1998, 11(5) p471-475
44
Eedy DJ, Burrows D, Bridges JM, Jones FG: Clearance of severe psoriasis after allogenic
bone marrow transplantation. BMJ, Apr 1990, 300(6729) p908
Elder JT ,Henseler T, Christophers E, Voorhees JJ, Nair RP: Of genes and antigenes: The
inheritance of psoriasis. J Invest Dermatol, Nov 1994, 103(5) p150-153
Elder JT, Nair RP, Henseler T, Jenisch S, Stuart P, Chia N, Christophers E, Voorhees JJ: The
genetics of psoriasis: the odyssey continues. Arch Dermatol, 2001, Vol137 p1447-1454
Fierlbeck G, Rasser G: Psoriasis induced at the injection site of recombinant interferon
gamma. Arch Dermatol, 1988, 124 p1811-1815
Fitzpatrick TB: Photochemotherapy of psoriasis. Acta Derm Venereol Suppl (Stockh), 1984,
112 p29-35
Ford MS, Young KJ, Zhang Z, Ohashi PS, Zhang L: The immune regulatory function of
lymphoproliferative double negative T cells in vitro and in vivo. J Exp Med, Jul 2002, 196(2)
p261-267
Friedrich M, Krammig S, Henze M, Docke WD, Sterry W, Asadullah K: Flow cytometric
characterization of lesional T cells in psoriasis: intracellular cytokine and surface antigen
expression indicates an activated, memory/effector type 1 immunophenotype. Arch Dermatol
Res (Germany), Oct 2000, 292(10) p519-521
Gottlieb AB, Lifshitz B, Fu SM, Staiano-Coico L, Wang CY, Carter DM: Expression of
HLA-DR molecules by keratinocytes and presence of Langerhans cells in the dermal iniltrate
of active psoriatic plaques. J Exp Med, 1986, 164 p1013-1028
45
Gottlieb SL, Gilleaudeau P, Johnson R, Estes L, Woodworth TG, Gottlieb AB, Krueger JG:
Response of psoriasis to a lymphozyte-selective toxin(DAB389-IL-2) suggests a primary
immune, but not keratinozyte, pathogenetic basics. Nature Medicine, 1995, 1(5) p442-447
Griffiths CE, Voorhees JJ, Nickoloff BJ: Characterization of intercellular adhesion molecule1 and HLA-DR expression in normal and inflamed skin: Modulation by recombinant gamma
interferon and tumor necrosis factor. J Am Acad Dermatol (United States), Apr 1989, 20(4)
p617-629
Gundlach BR, Wiesmüller KH, Junt T, Kienle S, Jung G, Walden P: Determination of T cell
epitopes with random peptide libraries. Journal of Immunological Methods, 1996, 192 p149155
Hales JM, Camp RD: Potent T cell stimulatory material with antigenic properties in stratum
corneum of normal human skin. J Invest Dermatol (United States), May 1998, 110(5) p725729
Hales JM, Camp RD: T-cell stimulating stratum corneum antigens: characterization by
chromatography and electrophoresis indicates limited diversity. J Invest Dermatol (United
States), Sep 1999, 113(3) p355-363
Hamad AR, Srikrishnan A, Mirmonsef P, Broeren CP, June CH, Pardoll D, Schneck JP: Lack
of coreceptor allows survival of chronically stimulated double-negative alpha/ beta T cells:
Implications for autoimmunity. J Exp Med, May 2001, 193 p1113-1121
Hemmer B, Gran B, Zhao Y, Marques A, Pascal J, Tzou A, Kondo T, Cortese I, Bielekova B,
Straus SE, McFarland HF, Houghten R, Simon R, Pinilla C, Martin R: Identification of
candidate T-cell epitopes and molecular mimics in chronic Lyme disease. Nature (America),
46
1999, Nat Med, Dec 1999 , 5(12) p1375-1382
Horrocks C, Holder JE, Berth-Jones J, Camp R: Antigen-independent expansion of T cells
from psoriatic skin lesions: phenotypic characterization and antigen reactivity. Br J Dermatol
(England), Sep 1997, 137(3) p331-338
Kelso A: Th1 and Th2 subsets: Paradigms lost? Immunol Today (England), Aug 1995, 16(8)
p374-379
Krueger JG, Krane JF, Carter DM, Gottlieb AB: Role of growth factors, cytokines, and their
receptors in the pathogenesis of psoriasis. J Invest Dermatol (United States), Jun 1990, 94(6)
p135-140
Leung DYM, Travers JB, Giorno R, Norris DA, Skinner R, Aelion J, Kazemi LV, Kim MH,
Trumble AE, Kotb M: Evidence for a streptococcal superantigen-driven process in acute
gutate psoriasis. J Clin Invest, 1995, 96 p2106-2112
Lewis HM, Baker BS, Bokth S, Powles AV, Garioch JJ, Valdimarsson H, Fry L: Restricted
T-cell receptor V beta gene usage in the skin of patients with guttate and chronic plaque
psoriasis. Br J Dermatol, Nov 1993, 129(5) p514-520
Lin WJ, Norris DA, Achziger M, Kotzin BL, Tomkinson B: Oligoclonal expansion of
intraepidermal T cells in psoriasis skin lesions. J Invest Dermatol (United States), Dec 2001,
117(6) p1546-1553
Mallon E, Bunker CB: HIV-associated psoriasis. AIDS Patient Care STDS, Mar 2000, 14(5),
p239-246
47
Masuda T, Ohteki T, Abo T, Seki S, Nose S, Nagura H, Kumagai K: Expansion of the
population of double negative CD4-8- T alpha beta-cells in the liver is a common feature of
autoimmune mice. J Immunol, Nov 1991,147 p2907-2912
Menssen A, Trommler P, Vollmer S, Schendel D, Albert E, Gurtler L, Riethmuller G, Prinz
JC: Evidence for an antigen-specific cellular immune response in skin lesions of patients with
psoriasis vulgaris. J Immunol (United States), Oct 1995, 155(8) p4078-4083
Michel G, Kemény L, Homey B, Ruzicka T: FK506 in the treatment of inflammatory skin
disease: promises and perspectives. Immunol Today, 1996,17 p106-108
Mueller W, Hermann B: CyclosporinA for Psoriasis. N Engl J Med, 1976, 301 p355
Nickoloff BJ, Wrone-Smith: Injection of Pre-Psoriatic skin with CD4+T-Cells induces
psoriasis. Am J Pathol , Jul 1999, 155(1) p145-158
Nickoloff BJ: Creation of psoriatic plaques: the ultimate tumor suppressor pathway. A new
model for an ancient T-cell-mediated skin disease. Viewpoint. J Cutan Pathol (Denmark), Feb
2001, 28(2) p57-64,
Nickoloff BJ: The cytokine network in psoriasis. Arch Dermatol (United States), Jun 1991,
127(6) p871-884
Nickoloff BJ: The immunologic and genetic basis of psoriasis. Arch Dermatol (United
States), Sep 1999, 135(9) p1104-1110
Norris DA, Travers JB, Leung DY: Lymphocyte activation in the pathogenesis of psoriasis.
J Invest Dermatol (United States), Jul 1997, 109(1) p1-4
48
Ovigne JM, Baker BS, Brown DW, Powles AV, Fry L: Epidermal CD8+ T cells in chronic
plaque psoriasis are Tc1 cells producing heterogeneous levels of interferon-gamma. Exp
Dermatol (Denmark), Jun 2001, 10(3) p168-174
Powles AV, Baker BS, Rutman AJ, McFadden JP, Valdimarsson H, Fry L: Epidermal rupture
is the initiating factor for the Koebner response in psoriasis. Acta Derm Venereol (Sweden),
1990, 70 p35-38
Prinz JC, Gross B, Vollmer S, Trommler P, Strobel I, Meurer M, Plewig G: T cell clones
from psoriasis skin lesions can promote keratinocyte proliferation in vitro via secreted
products. Eur J Immunol, 1994, 24(3 )p593-598
Prinz JC: Psoriasis vulgaris-a sterile antibacterial skin reaction mediated by cross-reactive T
cells? An immunological view of the pathophysiology of psoriasis. Clin Exp Dermatol
(England), Jun 2001, 26(4) p326-332
Prinz JC: Which T cells cause psoriasis? Clin Exp Dermatol (England), Jul 1999, 24(4) p291295
Robinson JH, Kehoe MA: Group A streptococcal M proteins:virulence factors and protective
antigens. Immunol Today, 1992, 13 p362-367
Rubio-Godoy V, Dutoit V, Zhao Y, Simon R, Guillaume P, Houghten R, Romero P, Cerottini
J, Pinilla C, Valmori D: Positional scanning-synthetic peptide library-based analysis of selfand pathogen-derived peptide cross-reactivity with tumor-reactive Melan-A-specific CTL.
J Immunol, Nov 2002, 169(10) p5696-5707
Schlaak JF, Buslau M, Jochum W, Hermann E, Girndt M, Gallati H, Meyer zum
49
Buschenfelde KH, Fleischer B: T cells involved in psoriasis vulgaris belong to the Th1 subset.
J Invest Dermatol (United States), Feb 1994, 102(2) p145-149
Sospedra M, Pinilla C, Martin R: Use of combinatorial peptide libraries for T-cell epitope
mapping. Methods, 2003, 29(3) p236-247
Szabo SK, Hammerberg C, Yoshida Y, Bata-Csorgo Z, Cooper KD: Identification and
quantitation of interferon-gamma producing T cells in psoriatic lesions: localization to both
CD4+ and CD8+ subsets. J Invest Dermatol (United States), Dec 1998, 111(6) p1072-1078
The International Psoriasis Genetics Study: Assessing Linkage to 14 Candidate Susceptibility
Loci in a Cohort of 942 Affected Sib Pairs. Am J Hum Genet, 2003, 73 p430-437
Uyemura K, Yamamura M, Fivenson DF, Modlin RL, Nickoloff BJ: The cytokine network in
lesional and lesion-free psoriatic skin is characterized by a T-helper type 1 cell-mediated
response. J Invest Dermatol (United States), Nov 1993, 101(5) p701-705
Valdimarsson H, Baker BS, Jonsdottir I, Fry L: Psoriasis: A disease of abnormal keratinocyte
proliferation induced by T-lymphocytes superantigens? Immunol Today (England), 1995, 7(9)
p256-259
Valdimarsson H, Sigmundsdottir H, Jonsdottir I: Is psoriasis induced by streptococcal
superantigens and maintained by M-protein-specific T cells that cross-react with keratin? Clin
Exp Immunol (England), Jan 1997, 107 Suppl 1 p21-24
Vollmer S, Menssen A, Prinz JC: Dominant lesional T cell receptor rearrangements persist in
relapsing psoriasis but are absent from nonlesional skin: evidence for a stable antigen-specific
pathogenic T cell response in psoriasis vulgaris. J Invest Dermatol (United States), Nov 2001,
117(5) p1296-1301
50
Vollmer S, Menssen A, Trommler P. Schendel D, Prinz JC: T lymphocytes derived from skin
lesions of patients with psoriasis vulgaris express a novel cytokine pattern that is distinct from
that of T helper type 1 and T helper type 2 cells. Eur J Immunol (Germany), Oct 1994, 24(10)
p2377-2382
Weiss G, Shemer A,Trau H: The Koebner phenomenon: Review of the literature. J Eur Acad
Dermatol Venereol, May 2002, 16(3) p241-248
Whyte Hj, Baughman RD: Acute guttate psoriasis and streptococcal infection. Arch
Dermatol, 1964, 89 p350-356
Wrone-Smith T, Nickoloff BJ: Dermal injection of immunocytes induces psoriasis. J Clin
Invest, Oct 1996, 98(8) p1878-1887
7.2. Publikation
Teile der hier vorgelegten Arbeit wurden in folgender Arbeit publiziert:
Kohlman WM, Urban W, Sterry W, Foerster J: Correlation of psoriasis activity with
abundance of CD25+CD8+ T cells: Conditions for cloning T cells from psoriatic plaques. Exp
Dermat, Oct 2004, 13 p 607-612
51
8. Anhang
Abbildungsübersicht
Abbildung 1:
Phänotypisierung der T-Zell-Linien per FACS (CD4 und CD8)................. 25
Abbildung 2:
Phänotypisierung der T-Zell-Linien per FACS (CD4 CD8 CD69)............. 26
Abbildung 3:
Phänotypisierung der autologen Plaquezellen per FACS............................ 27
Abbildung 4:
Phänotypisierung der autologen Plaquezellen per FACS (gegatet)............. 27
Abbildung 5:
Darstellung der Ergebnisse des Elispot-Assay bei 10 Patienten................. 29
Abbildung 6a:
Darstellung der fach-Stimulation von High- und Low-Respondern............ 31
Abbildung 6b: Darstellung der prozentualen Stimulierbarkeit von High- und
Low-Respondern........................................................................................
Abbildung 7:
31
Darstellung der fach-Stimulation der prozentualen Stimulierbarkeit
der T-Zell-Linien durch autologe Zellen und PBMC................................ 33
Abbildung 8:
FACS-Analyse von T-Zellen dreier Patienten vor und nach
Sortierung durch MACS............................................................................
Abbildung 9a:
35
Darstellung der absoluten Stimulation der Klone eines Patienten............... 36
Abbildung 9b: Darstellung der fach-Stimulation der Klone eines Patienten....................... 36
Tabellenübersicht
Tabelle 1
:
Gegenüberstellung der Ergebnisse von Elispot-Assay
und FACS Analyse.....................................................................................
Tabelle 2
: Gegenüberstellung der fach-Stimulation der T-Zell-Linien
durch autologe Zellen bzw. anti-CD3........................................................
Tabelle 3
29
: Gegenüberstellung der Ergebnisse des Elispot-Assay von
High-bzw.Low-Respondern.......................................................................
Tabelle 4
28
31
: Gegenüberstellung der Ergebnisse des Elispot-Assay
von T- Zell-Linien bzw. T-Zell-Klonen....................................................
52
37
Danksagung
mein Dank gilt:
•
Prof. Dr. Wolfram Sterry für die Möglichkeit an diesem Projekt beteiligt zu sein und die
Überlassung des Themas
•
Dr. John Foerster für die Chance an diesem Projekt zu arbeiten, für die rasche
Einarbeitung und die Möglichkeit in weiten Teilen eigenständig arbeiten zu können, für
seine allgegenwärtige Unterstützung, für seine große Geduld, immer wieder Korrektur zu
lesen
•
Apik Ndeshdan für ihre freundliche Hilfe und Unterstützung, dafür, daß sie mir ihre
reichhaltige Erfahrung mit Zellkulturen zur Verfügung stellte
•
Claudia Ehlert, Katja Spaar, Wajahn Kohlmann, Judith Junge für die
freundschaftliche Zusammenarbeit, das gute Klima in der Arbeitsgruppe und moralische
und tatkräftige Unterstützung
•
der AG Walden für die freundliche Aufnahme in die Laborgemeinschaft, für die
Mitbenutzung AG-eigener Geräte
•
Kilian Schuler die unersetzliche Hilfe bei allen Problemen der Durchflußzytometrie
•
Tumenjargal Sherev für die Beratung über Antikörper
•
Rodion Demine für seine Hilfe bei Computerproblemen
•
meiner Schwester und meinen Freunden, die mich auch in stressigen Zeiten unterstützt und
aufgemuntert haben
•
meinen Eltern für ihre moralische und finanzielle Unterstützung
53