Dr. Borgmann, Labordiagnostik bei Infektion
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Stefan Borgmann Labordiagnostik bei Infektion Klinikum Ingolstadt Klinische Infektiologie & Hygiene Labordiagnostik bei Infektionen Serologische Marker - CRP - Prokalzitonin (PCT) Mikrobiologische Diagnostik - Direktkultur - Abstriche - Bunte Reihen - MALDI-TOF - PCR Klinische Infektiologie & Hygiene 2 CRP & PCT als Infektmarker 3 Hinweis auf Infektion? CRP Prokalzitonin (PCT) Klinische Infektiologie & Hygiene IL-6 CRP & PCT als Infektmarker CRP Synthese: IL-6 CRP Klinische Infektiologie & Hygiene Leber Entzündung: - Tumor - Trauma - Infektion - Autoimmun 4 Fettzellen Makrophagen IL-6 CRP & PCT als Infektmarker CRP Synthese: 5 Fettzellen Makrophagen Leber MΦ CRP IL-6 CRP Zelltrümmer CRP Phosphocholin O Klinische Infektiologie & Hygiene N+ O P OH OH IL-6 CRP & PCT als Infektmarker CRP Synthese: 6 Fettzellen Makrophagen Leber MΦ CRP IL-6 CRP Zelltrümmer CRP Phosphocholin O Klinische Infektiologie & Hygiene N+ O P OH OH IL-6 CRP & PCT als Infektmarker CRP Synthese: 7 Fettzellen Makrophagen Leber CRP IL-6 CRP CRP Phosphocholin O Klinische Infektiologie & Hygiene N+ O P OH OH CRP & PCT als Infektmarker PCT Syntheseort: Neuroendokrine Zellen ??? PCT Gen(e) CALC 1: CGRP* / Kalzitonin / Katakalzin CALC 2: CGRP*-2 CALC 3: ??? CALC 4: Amylin CGRP: Calcitonin gene related peptide* Klinische Infektiologie & Hygiene CRP & PCT als Infektmarker Splicen mRNA PCT Gen(e) CALC 1: CGRP* / Kalzitonin / Katakalzin Prozessierung Aminosäuren CGRP: Calcitonin gene related peptide* Klinische Infektiologie & Hygiene CRP & PCT als Infektmarker PCT Syntheseort: Neuroendokrine Zellen ??? PCT Gen(e) CALC 1: Kalzitonin Synthese - Kompliziert Wissenschaftliche Überraschungen möglich Klinische Infektiologie & Hygiene CRP & PCT als Infektmarker PCT Syntheseort: Neuroendokrine Zellen ??? PCT Gen CALC 1: Prä-Pro-Kalzitonin Pro-Kalzitonin C-Zellen Schilddrüse Klinische Infektiologie & Hygiene Kalzitonin CRP & PCT als Infektmarker PCT Syntheseort: Neuroendokrine Zellen ??? PCT Gen CALC 1: Prä-Pro-Kalzitonin Pro-Kalzitonin ? Niere = Darm > Lunge >>> Rest = Kein PCT PCT = Systemische Infektion Klinische Infektiologie & Hygiene CRP & PCT als Infektmarker Bakterielle Infektion PCT Anstieg / Peak 6-8h Abtötung Bakterien HWZ 25 - 30 h PCT [ng/ml] 100 80 100% - 30% Rückgang 25 - 35% pro 24 h 30 – 40% 60 40 10 – 15% 20 0 0,68 ng/ml Klinische 3 4 5 6& Hygiene 7 8 9 0 1 2 Infektiologie 10 11 12 13 14 Verlauf [Tagen] CRP & PCT als Infektmarker Bakterielle Infektion PCT CRP 6-8h 6 - 12 h HWZ 25 - 30 h HWZ 25 - 30 h Rückgang 25 - 35% pro 24 h Rückgang langsamer abhängig vom Ausmaß Schädigung Gewebe 3 - 4 Tage Anstieg / Peak Abtötung Bakterien PCT [ng/ml] 100 80 100% - 30% 30 – 40% 60 40 10 – 15% 20 0 0,68 ng/ml Klinische 3 4 5 6& Hygiene 7 8 9 0 1 2 Infektiologie 10 11 12 13 14 Verlauf [Tagen] Zusammenfassung I [CRP] : Ausmaß der Entzündung / Schädigung CRP : Unspezifisch, verschiedene Entzündungen [PCT] : Ausmaß der Infektion & Lokalisation PCT : Bakterielle Infektionen (Ausnahmen !!!) Nicht bei Infektionen der Extremitäten Beteiligung neuroendokrine Zellen Klinische Infektiologie & Hygiene Untersuchungsmaterialien 16 ? ? ? ? ? Klinische Infektiologie & Hygiene ? Untersuchungsmaterialien Klinische Infektiologie & Hygiene 17 Untersuchungsmaterialien Klinische Infektiologie & Hygiene 18 FlüssigMedium Untersuchungsmaterialien Klinische Infektiologie & Hygiene 19 FlüssigMedium Untersuchungsmaterialien 20 FlüssigMedium 10 ml* Klinische Infektiologie & Hygiene FlüssigMedium *http://www.foodtech-shop.ch Untersuchungsmaterialien Klinische Infektiologie & Hygiene 21 Flüssigmedium Untersuchungsmaterialien Klinische Infektiologie & Hygiene Proben-Röhrchen: 22 Beschickung durch Chirurgin Flüssigmedium Untersuchungsmaterialien 4 cm 23 250 ml Klinische Infektiologie & Hygiene Flüssigmedium Untersuchungsmaterialien 24 Abstrich Klinische Infektiologie & Hygiene 3-Ösenausstrich 25 Abstrichtupfer mit Bakterien 2. FlüssigMedium Klinische Infektiologie & Hygiene 1. 3-Ösenausstrich 3-Ösenausstrich 26 3. Sterile Öse FlüssigMedium Klinische Infektiologie & Hygiene 3-Ösenausstrich 3-Ösenausstrich 27 4. Frische Öse FlüssigMedium Klinische Infektiologie & Hygiene 3-Ösenausstrich 3-Ösenausstrich 28 37°C 20%O2 Beimpfte Kulturplatte Aerobe Bakterien FlüssigMedium Klinische Infektiologie & Hygiene 37°C 0%O2 Anaerobe Bakterien 3-Ösenausstrich 3-Ösenausstrich 29 37°C 20%O2 Beimpfte Kulturplatte Aerobe Bakterien Klinische Infektiologie & Hygiene 37°C 0%O2 Anaerobe Bakterien 3-Ösenausstrich Getrübte Bouillon Klinische Infektiologie & Hygiene 30 Konfluierendes Bakterienwachstum Bakterienkolonie 3-Ösenausstrich 31 +++ ++ + Klinische Infektiologie & Hygiene Nach Anreicherung Kein Wachstum Semiquantitative Beurteilung der Bakterienmenge 3-Ösenausstrich 32 Nach Anreicherung +++ Kein Wachstum ++ Punktat + Blutkulturflasche Klinische Infektiologie & Hygiene 3-Ösenausstrich 33 +++ ++ Nach Anreicherung Kein Wachstum Nach Anreicherung + Klinische Infektiologie & Hygiene 3-Ösenausstrich 34 +++ ++ Nach Anreicherung Kein Wachstum Nach Anreicherung + Bakterien +++ + Klinische Infektiologie & Hygiene Gramfärbung 35 Aerob / Anaerob Gram positiv GramFärbung Gram negativ Stäbe 1. Anfärben, blaue Farbe Kokken 2. Entfärbung, Alkohol 3. Gegenfärben, rote Farbe Stäbe Kokken Klinische Infektiologie & Hygiene Stäbe Kokken Bakterielle Zellwand 36 Zytoplasma Plasmamembran Gram positiv Periplasmatischer Raum Peptidoglykan Gram negativ Äußere Membran Antibiotika-Resistenz - Aztreonam - - Vancomycin* - Linezolid - Clindamycin - Teicoplanin* - Klinische Infektiologie & Hygiene Bakterielle Zellwand 37 Zytoplasma Plasmamembran Gram positiv Periplasmatischer Raum Peptidoglykan Gram negativ Entzündungsreaktion Gram positiv Klinische Infektiologie & Hygiene <<< Gram negativ Äußere Membran Bakterien - Identifizierung Gattung Spezies Staphylococcus aureus Vorname Nachnahme 38 - Mikroskopisches Präparat (Gram, Ziehl Neelsen, etc.) - Direktanzucht (Kulturplatten, Selektivplatten) - Identifizierung : -- Stoffwechselleistungen (bunte Reihen) -- (Gaschromatographie - Anaerobier) Klinische Infektiologie & Hygiene Bakterien - Identifizierung Gattung Spezies Staphylococcus aureus Vorname Nachnahme 39 - Mikroskopisches Präparat (Gram, Ziehl Neelsen, etc.) - Direktanzucht (Kulturplatten, Selektivplatten) - Identifizierung : Kligler -- Stoffwechselleistungen (bunte Reihen) -- Gaschromatographie (Anaerobier) Klinische Infektiologie & Hygiene API System Bakterien - Identifizierung Gattung Spezies Staphylococcus aureus Vorname Nachnahme Stoffwechselleistungen (bunte Reihen): Über Nacht Kulturen - Zeit-intensiv Klinische Infektiologie & Hygiene API System 40 Kligler MALDI-TOF - Identifizierung Data acquisition41 + I m1+ Optics m2+ m3+ N2-Laser MALDI target plate m/z Variable-voltage grid Field free drift region Ground grid Linear detector Source chamber Klinische Infektiologie & Hygiene MALDI-TOF - Identifizierung Data acquisition42 + Optics I m1+ m2+ m3+ N2-Laser MALDI target plate m/z Variable-voltage grid Ground grid Source chamber Klinische Infektiologie & Hygiene Dauer pro Messung: 1 min Linear detector MALDI-TOF - Identifizierung C. difficile : 3 verschiedene Stämme (A –C) Klinische Infektiologie & Hygiene 43 Polymerase Kettenreaktion - PCR Spezifisches Gen ? Spezies / Resistenz Kolonie Chromosom Klinische Infektiologie & Hygiene 44 PCR: Extraktion DNA 45 Spezifisches Gen ? Spezies / Resistenz Temperatur Kolonie Chromosom Klinische Infektiologie & Hygiene Thermocycler Zeit PCR - Amplifikation 46 Spezifisches Gen amplifiziert Behälter Kolonie Gel Chromosom Thermocycler Salzlösung Klinische Infektiologie & Hygiene PCR - Amplifikation 47 Spezifisches Gen amplifiziert - Kolonie Chromosom Klinische Infektiologie & Hygiene Thermocycler + PCR - Amplifikation 48 - Größenstandard Positiv Negativ + Klinische Infektiologie & Hygiene PCR - Amplifikation MRSA PCR - + 49 neg. Klinische Infektiologie & Hygiene positiv neg. positiv neg. PCR 50 G C A T Temperatur 37°C Zeit Klinische Infektiologie & Hygiene PCR: Schmelzen DNA G 51 C A T Temperatur 96°C Zeit „Melting“ Klinische Infektiologie & Hygiene PCR: Anlagern der Primer G C 52 A T Temperatur 60°C Primer Zeit Primer lagern sich an „Annealing“ Klinische Infektiologie & Hygiene PCR: Anlagern der Primer G C 53 A T Temperatur 60°C Primer Primer Zeit Primer lagern sich an „annealing“ Klinische Infektiologie & Hygiene PCR: Verlängerung der Primer G C A 54 T Temperatur 72°C Primer Polymerase Zeit Polymerase verlängert Primer „Elongation“ Klinische Infektiologie & Hygiene PCR: Verlängerung der Primer G C A 55 T Temperatur 72°C Primer Zeit Polymerase verlängert Primer „Elongation“ Klinische Infektiologie & Hygiene PCR: Verlängerung der Primer G Temperatur Zeit Klinische Infektiologie & Hygiene C A 56 T PCR: Verlängerung der Primer G Klinische Infektiologie & Hygiene C A 57 T PCR 58 G 96°C C 60°C A T 72°C 96°C…. Vervielfältigung Zielsequenz Klinische Infektiologie & Hygiene Universelle PCR Thermozykler Sequenzierautomat 59 Konserviertes Gen: Alle Bakterien Chromosom Klinische Infektiologie & Hygiene Universelle PCR Thermozykler Sequenzierautomat 60 Konserviertes Gen 16S rRNA: Alle Bakterien Primer binden bei allen Bakterien Chromosom Klinische Infektiologie & Hygiene Universelle PCR Thermozykler Sequenzierautomat Klinische Infektiologie & Hygiene 61 Konserviertes Gen 16S rRNA: Alle Bakterien Primer binden bei allen Bakterien PCR Produkte identisch Universelle PCR Thermozykler Sequenzierautomat 62 Konserviertes Gen 16S rRNA: Alle Bakterien Primer binden bei allen Bakterien PCR Produkte FAST identisch E. coli P. aeruginosa S. aureus Klinische Infektiologie & Hygiene Universelle PCR 63 10 Patienten: TEP Lockerung 5 “ : Infektion 5 “ : Keine Infektion Kultur Klinische Infektiologie & Hygiene Dempsey et al, Arthr Res Therap 2007, 9:R46 Universelle PCR 64 10 Patienten: TEP Lockerung 5 “ : Infektion 5 “ : Keine Infektion Kultur Plastikbeutel Klinische Infektiologie & Hygiene Dempsey et al, Arthr Res Therap 2007, 9:R46 Universelle PCR 65 10 Patienten: TEP Lockerung 5 “ : Infektion 5 “ : Keine Infektion Kultur Ultraschallbad Klinische Infektiologie & Hygiene Dempsey et al, Arthr Res Therap 2007, 9:R46 Universelle PCR 66 10 Patienten: TEP Lockerung 5 “ : Infektion 5 “ : Keine Infektion Kultur Ultraschallbad Klinische Infektiologie & Hygiene Dempsey et al, Arthr Res Therap 2007, 9:R46 Universelle PCR 67 10 Patienten: TEP Lockerung 5 “ : Infektion 5 “ : Keine Infektion Kultur Ultraschallbad Klinische Infektiologie & Hygiene Dempsey et al, Arthr Res Therap 2007, 9:R46 Universelle PCR 68 10 Patienten: TEP Lockerung 5 “ : Infektion 5 “ : Keine Infektion Kultur Biofilm Klinische Infektiologie & Hygiene Dempsey et al, Arthr Res Therap 2007, 9:R46 Ultraschallbad Universelle PCR 69 10 Patienten: TEP Lockerung 5 “ : Infektion 5 “ : Keine Infektion Kultur Biofilm Ultraschallbad Kultur & eubakterielle PCR Klinische Infektiologie & Hygiene Dempsey et al, Arthr Res Therap 2007, 9:R46 Universelle PCR 70 10 Patienten: TEP Lockerung 5 “ : Infektion 5 “ : Keine Infektion Kultur Kultur & eubakterielle PCR Klinische Infektiologie & Hygiene Dempsey et al, Arthr Res Therap 2007, 9:R46 Universelle PCR 71 10 Patienten: TEP Lockerung 5 “ : Infektion 5 “ : Keine Infektion Kultur Proteus mirabilis N=1 Staphylokokken Koagulase neg. N=2 Klinische Infektiologie & Hygiene V.a. Infektion N=5 Dempsey et al, Arthr Res Therap 2007, 9:R46 Kein V.a. Infektion N=5 Steril N=7 Universelle PCR 72 10 Patienten: TEP Lockerung 5 “ : Infektion 5 “ : Keine Infektion Kultur vom Biofilm Klinische Infektiologie & Hygiene 10 Patienten: Bakterielles Wachstum Insgesamt 46 Isolate Leifsonia N = 25 (54,3%) Staphylococcus N = 10 (21,7%) Proteus N = 4 (8,7%) Brevundimonas N = 3 (6,5%) Dempsey et al, Arthr Res Therap 2007, 9:R46 Universelle PCR 73 10 Patienten: TEP Lockerung 5 “ : Infektion 5 “ : Keine Infektion Eubakterielle PCR vom Biofilm Klinische Infektiologie & Hygiene 10 Patienten: Bakterieller Nachweis Insgesamt 512 Klone 118 sequenziert Lysobacter N = 52 (44,1%) γ Proteobacterium N = 8 (6,8%) Stenotrophomonas N = 9 (7,6%) Methylobacterium N = 3 (6,5%) Dempsey et al, Arthr Res Therap 2007, 9:R46 Universelle PCR Riggio et al, EJCMID 2010, 29: 823-34 5 Patienten. mRNA cDNA 16S rRNA 234 Klone; Lysobacter häufigste Spezies (N = 74; 31,6%) Achermann et al, J Clin Microbiol 2010, 48: 1208-14 - Bis 43 Tage nach Beginn Antibiose: PCR positiv Bjerkan et al, J Med Microbiol 2012, 61:572-81 - Sensitivität: Kultur > PCR Esteban et al, Acta Orthopaedica 2012, 83:299-304 - Infektionen: PCR erhöht Ausbeute um 10% - Nur PCR pos: Zurück haltende Interpretation Klinische Infektiologie & Hygiene 74 Zusammenfassung II 75 Direktmaterial besser als Abstrich - Sensitivität bei großer Probenmenge - Kann große Probenmenge im Labor aufgearbeitet werden? - Chirurg: Abfüllen Direktmaterial in Probenröhrchen MALDI-TOF MS: Beschleunigung / Erweiterung mikrobieller Diagnostik Stellenwert (universelle) PCR: Work in progress Klinische Infektiologie & Hygiene Stefan Borgmann Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit Klinische Infektiologie & Hygiene
