Bestimmung der Frequenz TGF-β-produzierender T

Aus der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin
des St. Josef-Hospital Bochum
- Universitätsklinik der Ruhr-Universität Bochum
Ärztlicher Direktor: Professor Dr. med. E. Hamelmann
Bestimmung der Frequenz TGF-β-produzierender
T-Lymphozyten gesunder Kinder verschiedener Altersklassen
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung des
Doktorgrades der Medizin
einer Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Lars Hendrik Beck
aus
Frankfurt am Main
2009
Dekan:
Prof. Dr. med. G. Muhr
Referent:
Prof. Dr. med. U. Schauer
Korreferent: Prof. Dr. med. A. Bufe
Tag der mündlichen Prüfung: 16.06.2009
Inhaltsverzeichnis
1.
EINLEITUNG ................................................................................................- 1 -
1.1.
TOLERANZINDUKTION IM IMMUNSYSTEM .............................................. - 1 -
1.1.1. Zentrale Toleranzinduktion..................................................................- 2 1.1.2. Periphere Toleranzinduktion................................................................- 3 1.2.
REGULATORISCHE T-ZELLEN................................................................. - 4 -
1.2.1. CD4pos-CD25pos-T-Regulatorzellen .....................................................- 6 1.2.2. Typ1-regulatorische Zellen (Tr1).........................................................- 8 1.2.3. Th3-Zellen............................................................................................- 9 1.2.4. Sonstige regulatorische Zellen ...........................................................- 10 1.3.
DIE TGF-Β-SUPER-FAMILIE ................................................................. - 11 -
1.3.1. Transformierender Wachstumsfaktor β (TGF-β)..............................- 13 1.4.
TGF-Β IM IMMUNSYSTEM ..................................................................... - 17 -
1.4.1. TGF-β-vermittelt periphere Toleranzinduktion .................................- 17 1.4.2. TGF-β-Interaktion im T-Regulatorzellsystem ...................................- 18 1.5.
REIFUNGSPROZESSE IM T-ZELL-SYSTEM............................................. - 21 -
2.
FRAGESTELLUNG ....................................................................................- 23 -
3.
PROBANDEN, MATERIAL UND METHODEN ....................................- 24 -
3.1.
PROBANDEN ........................................................................................... - 24 -
3.1.1. Einschlusskriterien .............................................................................- 24 3.1.2. Ausschlusskriterien ............................................................................- 25 -
I
3.1.3. Geschlechtsverteilung ........................................................................- 26 3.1.4. Altersstruktur .....................................................................................- 26 3.2.
MATERIAL.............................................................................................. - 27 -
3.2.1. Geräte .................................................................................................- 27 3.2.2. Software .............................................................................................- 27 3.2.3. Hilfsmittel und Verbrauchsmaterialien ..............................................- 28 3.2.4. Stimulanzien.......................................................................................- 28 3.2.5. Chemikalien, Puffer und Zellmedien .................................................- 29 3.2.6. Lösungen ............................................................................................- 29 3.2.7. Antikörper (IgG1-Maus-anti-human-Antikörper)..............................- 30 3.3.
METHODEN ............................................................................................ - 31 -
3.3.1. Analytische Durchflusszytometrie .....................................................- 31 3.3.2. Isolation mononukleärer Zellen des peripheren Blutes (PBMC) als
Versuchsmaterial................................................................................- 43 3.3.3. Reinigung und Aufbereitung der mononukleären Zellen...................- 46 3.3.4. FACS-Analyse der T-Zell-Fraktionen vor Stimulation .....................- 48 3.3.5. Aktivierung und Vorbehandlung der mononukleären Zellen ............- 53 3.3.6. Messung der TGF-β-Produktion unter Stimulation ...........................- 56 3.3.7. Darstellung und statistische Analyse der Ergebnisse.........................- 64 3.3.8. Qualitätskontrolle...............................................................................- 64 3.3.9. FACS-Messungen nach magnetischer Zellsortierung........................- 65 -
4.
ERGEBNISSE ..............................................................................................- 68 -
4.1.
VORVERSUCHE ...................................................................................... - 68 -
4.1.1. Lagerungszeit der Blutproben ............................................................- 68 4.1.2. Durchflusszytometrische Messungen ................................................- 68 4.2.
ANALYSE DER ZELLFRAKTIONEN ......................................................... - 70 -
4.2.1. Leukozyten-/Lymphozytenfraktionen mit charakteristischen
Altersabhängigkeiten..........................................................................- 70 II
4.2.2. Anteil der CD4pos-Lymphozyten unabhängig vom Probandenalter...- 72 4.2.3. CD45RA Isoform Expression abhängig vom Alter der Probanden ...- 73 4.2.4. Negative Korrelation zwischen dem Anteil an CD4-exprimierenden
Lymphozyten und Größe der CD4pos-CD25pos-CD45RAneg-Fraktion
............................................................................................................- 74 4.3.
ANALYSE DER TGF-Β-SYNTHESE ......................................................... - 76 -
4.3.1. TGF-β-Synthesekapazität der Lymphozyten abhängig vom
Probandenalter....................................................................................- 76 4.3.2. Lymphozytäre TGF-β-Synthesekapazität korreliert mit dem Anteil an
CD45RAneg-Lymphozyten .................................................................- 79 4.3.3. T-lymphozytäre (CD3pos) TGF-ß-Synthesekapazität ohne signifikante
Korrelation zum Anteil an reifen Tregs (CD4pos-CD25pos-CD45RAneg
Zellen) ................................................................................................- 80 4.3.4. CD4pos-CD25pos Tregs ohne relevanten Anteil TGF-ßpos-Zellen nach
Stimulation .........................................................................................- 81 4.3.5. Der Anteil an T-Helferzellen (CD4pos-Lymphozyten) nimmt mit
steigender T-lymphozytärer (CD3pos) TGF-β-Synthesekapazität ab .- 82 -
5.
DISKUSSION ...............................................................................................- 83 -
5.1.
ALTERSABHÄNGIGKEIT DER TGF-Β-SYNTHESE .................................. - 83 -
5.1.1. Altersabhängigkeit der TGF-β-Synthese, ein Indiz relevanter
Reifungsprozesse im System der T-Regulatorzellen .........................- 84 5.1.2. Induktionsmechanismen TGF-βs im regulatorischen System ...........- 85 5.1.3. Hinweise auf klinische Relevanz der hier erstmalig dargestellten
Reifungsprozesse im TGF-β-System .................................................- 88 5.1.4. Mangelhafte Reifungsprozesse als (auto-) immunogene
Pathomechanismen.............................................................................- 90 5.2.
URSPRUNG DES GEMESSENEN TGF-Β ................................................... - 91 -
5.2.1. Reife (CD45RAneg), CD4pos-CD25pos regulatorische T-Zellen
(konstitutive Tregs) ............................................................................- 91 III
5.2.2. TGF-β-Synthese außerhalb des T-lymphozytären Systems...............- 92 5.3.
HINWEISE AUF REGULATORISCHE EINFLÜSSE AUSGEHEND
VON
CD3POS-
TGF-ΒPOS-T-LYMPHOZYTEN ................................................................. - 94 5.4.
ÜBERTRAGBARKEIT DER MESSERGEBNISSE ......................................... - 96 -
5.4.1. Stimulation in vitro ............................................................................- 96 5.4.2. Wahl des Versuchsmaterials ..............................................................- 96 5.4.3. Wahl der Messmethodik ....................................................................- 97 5.4.4. Wahl der Auswertung ........................................................................- 98 5.5.
PERSPEKTIVEN..................................................................................... - 100 -
6.
ZUSAMMENFASSUNG ...........................................................................- 101 -
7.
LITERATURVERZEICHNIS ..................................................................- 103 -
8.
ANHANG ....................................................................................................- 117 -
8.1.
STUDIEN-INFORMATIONEN.................................................................. - 117 -
IV
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Schema der thymalen Selektion und Auswanderung
spezifischer regulatorisch-aktiver konstitutiver Tregs ..................- 7 Abbildung 2: Schema der peripheren Konversion über FOXP3 Induktion in
Tr1-Zellen. ....................................................................................- 8 Abbildung 3:
Schema der an orale Antigene gekoppelten TGF-β Sekretion
einer peripheren Th3-Zelle............................................................- 9 -
Abbildung 4: Schematische Darstellung der 3D-Struktur des maturen
TGF-β1........................................................................................- 14 Abbildung 5: Darstellung der TGF-β-vermittelten Signaltransduktion.............- 16 Abbildung 6: Mögliche Wirkmechanismen TGF-βs, im Sinne eines Effektormoleküls ausgehend von regulatorisch aktiven T-Zellen............- 19 Abbildung 7: Darstellung der Altersverteilung des Probandenkollektivs. ........- 26 Abbildung 8:
Illustration des Prinzips der hydrodynamischen Fokussierung
im Flüssigkeitssystem eines Durchflusszytometers. ...................- 33 -
Abbildung 9: Schema des Flüssigkeitssystems eines Durchflusszytometers. ...- 33 Abbildung 10: Schema des optischen Systems eines Durchflusszytometers. ....- 35 Abbildung 11: Fluoreszenzspektren von Phycoerythrin (PE) und Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) mit spektraler Überlappung. .....................- 39 -
V
Abbildung 12: Prinzip der Histogrammdarstellung............................................- 41 Abbildung 13: Schema der korrelierten Zweiparameterdarstellung (Dot-Plot)..- 42 Abbildung 14: Prinzip der Schichtbildung im Rahmen der präparativen
Dichtegradientenzentrifugation...................................................- 46 Abbildung 15: Analysefenster R1 für unstimulierte Lymphozyten im DotPlot-Diagramm SSC über FSC. ..................................................- 51 Abbildung 16: A - Histogrammdarstellung der Isotypenkontrolle zur Festlegung des Intensitäts-Schwellenwertes des Analysefensters
R2. B - Darstellung der während der Messung innerhalb dieser
Region detektierten CD4pos-Lymphozyten. ...............................- 52 Abbildung 17: Dot-Plot-Diagramm der Kanäle FL2 (CD25) über FL3
(CD45RA) aus dem Analysefenster R2 (CD4pos). ......................- 52 Abbildung 18: Intrazelluläre Signalkaskaden des T-Zell-Antigenrezeptors und
die Bedeutung der Calciummobilisierung für die
Lymphozyten-Proliferation. ........................................................- 54 Abbildung 19: Schematische Illustration des Funktionsprinzips der Fixierung
mononukleärer Zellen durch irreversible Vernetzung der
Proteine und deren Seitenketten mittels Formalin. .....................- 59 Abbildung 20: Schematische Illustration des Funktionsprinzips der Zellpermeabilisierung mononukleärer Zellen mittels Saponin. ........- 59 Abbildung 21: Analysefenster R1 für stimulierte Lymphozyten im Dot-PlotDiagramm....................................................................................- 62 Abbildung 22: Dot-Plot-Diagramm der Kanäle FL2 (TGF-β) über FL3 (CD3)
ohne und mit Analysefenster R2 (CD3pos) und R3 (CD3neg). .....- 62 VI
Abbildung 23: Dot-Plot-Diagramm der TGF-β-Isotypenkontrolle zur Festlegung des Intensitäts-Schwellenwertes beider Analysefenster
(CD3neg , R5) und (CD3pos, R4)...................................................- 63 Abbildung 24: Dot-Plot-Diagramme der Messansätze mit TGF-βpos-Zellen der
beiden Analysefenster (R2, CD3pos; R3, CD3neg) unter Zuhilfenahme der Isotypenkontrolle.......................................................- 63 Abbildung 25: Schematische Illustration des Funktionsprinzips der
magnetischen Zellseparierung.....................................................- 67 Abbildung 26: Abhängigkeit der Leukozyten- (A) und Lymphozytenzahl (B)
vom Probandenalter. ...................................................................- 71 Abbildung 27: Anteil an Lymphozyten der Gesamtleukozytenpopulation
aufgetragen gegen das Probandenalter........................................- 71 Abbildung 28: Anteil an CD4pos-Lymphozyten der Lymphozytenpopulation
abhängig vom Alter der Probanden. ...........................................- 72 Abbildung 29: Anteil an unreifen CD45RApos-Lymphozyten der
Lymphozytenpopulation in Beziehung zum Alter der
Probanden....................................................................................- 73 Abbildung 30: Anteil an CD4pos-T-Zellen der Lymphozytenpopulation
abhängig von der Größe der reifen CD4pos-CD25posCD45RAneg- (A) und unreifen CD4pos-CD25pos-CD45RApos(B) T-Zell-Fraktion. ....................................................................- 75 Abbildung 31: Anteil an TGF-βpos-Lymphozyten der gesamten Lymphozytenfraktion in Abhängigkeit des Alters der Probanden....................- 77 -
VII
Abbildung 32: Beziehung des Anteils an CD3pos-TGF-βpos-Zellen zum
Probandenalter.............................................................................- 78 Abbildung 33: Anteil an (A) TGF-βpos bzw. (B) CD3pos-TGF-βposLymphozyten der Lymphozytenfraktion in Abhängigkeit zur
relativen Größe der CD45RAneg-Lymphozyten-Fraktion ...........- 79 Abbildung 34: Beziehung des Anteils der CD3pos-TGF-βpos-Lymphozyten zur
Größe der reifen CD4pos-CD25pos-CD45RAnegRegulatorzellfraktion...................................................................- 80 Abbildung 35: Histogrammdarstellung des Anteils TGF-βpos-Zellen am
Gesamtzellpool der CD4pos-CD25pos-Lymphozyten, nach
vorheriger Isolation im MACS®-Cell Sorter...............................- 81 Abbildung 36: Anteil an CD4pos-T-Zellen der Lymphozytenpopulation in
Abhängigkeit der Größe der (A) CD3pos-TGF-βpos- bzw. (B)
CD3neg-TGF-βpos-Lymphozytenfraktion .....................................- 82 Abbildung 37: Schematische Darstellung eines möglichen Mechanismus
peripherer Toleranzinduktion…………………………………..- 87 -
VIII
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Einige Mitglieder der TGF-β-Super-Familie mit ihren alternativen
Bezeichnungen und einer kurzen Beschreibung ihrer Funktion ........- 12 Tabelle 2: Zustände, die zu einem Ausschluss aus der Studie führten. ..............- 25 Tabelle 3: Die Fluoreszenzkanäle mit ihren entsprechenden Wellenlängen,
den verwendeten Fluoreszenzfarbstoffen mit ihren
Emissionsmaxima gegenübergestellt .................................................- 37 Tabelle 4: Schema der Antikörperfärbung, FACS-Analyse der T-ZellFraktionen vor Stimulation ................................................................- 49 Tabelle 5: Messeinstellungen der Fotodetektoren, FACS-Analyse der T-ZellFraktionen vor Stimulation ................................................................- 50 Tabelle 6: Kompensation der Fluoreszenzkanäle, FACS-Analyse der T-ZellFraktionen vor Stimulation ................................................................- 50 Tabelle 7: Schema der Antikörperfärbung, FACS-Analyse des intrazellulär
fixierten TGF-β ..................................................................................- 60 Tabelle 8: Messeinstellungen der Fotodetektoren, FACS-Analyse des
intrazellulär fixierten TGF-β ..............................................................- 61 Tabelle 9: Kompensation der Fluoreszenzkanäle, FACS-Analyse des
intrazellulär fixierten TGF-β ..............................................................- 61 -
IX
Abkürzungsverzeichnis
Abb.
Abbildung
AK
Antikörper
BMP
bone morphogenetic proteins
bzw.
beziehungsweise
ca.
circa
CD
Cluster of differentiation
Co-Smads
kooperative Smad-Proteine
CrP
C-reaktives-Protein
CTLA-4
Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4
DAG
1,2-Diacylglycerol
DNA
desoxyribonucleic acid
et al.
und andere
FACS
fluorescence activated cell sorting
FAST
forkhead activin signal transducer
FCS
fetales Kälberserum
FITC
Fluoresceinisothiocyanat
FL
fluorescence channel
FOXP3
Transkriptions-Regulator-Proteins forkhead box P3
FSC
foreward scatter channel
g
Gravitationskonstante
GDF
growth and differentiation factors
ggf.
gegebenenfalls
GITR
glucocorticoid-induced TNF receptor
GVHD
graft versus host disease
Hepes
N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-Ethansulfonsäure
IFN
Interferon
IL
Interleukin
Instr.
Instruments
IP3
Inositol-Triphosphat
I-Smads
inhibitorische Smad-Proteine
X
Kap.
Kapitel
Kontr.
Kontrolle
Lab.
Laboratory
Lsg.
Lösung
MACS
magnetic cell sorter
MBP
Myelin basic protein
MHC
major histocompatibility complex
MIF
macrophage migration inhibitory factor
ml
Milliliter
mRNA
messenger ribonucleic acid
MS
Multiple Sklerose
mW
Megawatt
nm
Nanometer
neg.
negativ
NF-AT
Nuclear Factor of Activated T cells
NF κB
Nuclear Factor κB
NnTregs
natural naive regulatorische T-Zellen
Nr.
Nummer
o.g.
oben genannte
PBMC
peripheral blood mononuclear cells
PE
Phycoerythrin
PerCP
Peridin Chlorophyll Protein
PIP2
Phosphatidylinositol-4,5-biphosphat
PKC
Protein Kinase C
PMT
Photomulitplier
pos.
positiv
PMA
Phorbol-12-myrisat-13-acetat
R
Region
RNA
ribonucleic acid
rpm
rounds per minute
R-Smads
Rezeptor-Smad-Proteine
SARA
smad anchor for receptor activation
s.g.
so genannte
SSC
side scatter channel
XI
Tab.
Tabelle
TGF-β
Transforming-Growth-Factor-β
Tregs
regulatorische T-Zellen
u.a.
unter anderem
v.a.
vor allem
z.B.
zum Beispiel
µl
Mikroliter
µg
Mikrogramm
XII
1.
Einleitung
1.1. Toleranzinduktion im Immunsystem
Grundvoraussetzung des Erhalts zellulärer Integrität der Gewebsverbände eines
Organismus stellt die Identifizierung und anschließende Eliminierung belebter wie
unbelebter Fremdstrukturen dar. In diesem Prozess spielt nicht nur die Entfernung
der von außen in das System eingedrungenen Noxen, wie z.B. Bakterien, Viren und
Parasiten, sondern auch die Kontrolle der im Organismus entstandenen potenziellen
Pathogene, wie z.B. entarteten Zellen, eine entscheidende Rolle. Die besondere
Effizienz der adaptiven Immunmechanismen beruht auf dem Prinzip, körperfremde
Antigenstrukturen spezifisch zu erkennen, und damit auf zellulärer Ebene zwischen
apathogenen
körpereigenen
differenzieren
zu
weitreichenden
können.
und
Da
Informationen
potenziell
die
über
hierbei
die
pathogenen
beteiligten
Gesamtheit
der
Fremdstrukturen
Zellsysteme
in
der
keine
Umwelt
vorkommenden Antigenstrukturen besitzen können, muss sich die Fähigkeit zur
Diskriminierung zwischen pathogen und apathogen anhand von Selektionsprozessen
vor dem Hintergrund der körpereigenen Antigenstrukturen vollziehen. Die Synthese
einer großen Anzahl zufällig generierter T-Zell-Rezeptoren mit anschließender
Beseitigung oder Kontrolle der hierbei entstandenen autoreaktiven T-Zell-Klone
bildet die Grundlage hierfür.
Unter dem Begriff der „Toleranz” versteht man alle aktiven wie passiven
Mechanismen des Immunsystems, die eine Reaktion gegen apathogene Strukturen
verhindern oder kontrollieren. Die komplexen Prozesse im Rahmen der zentralen und
peripheren Toleranzinduktion sichern so die Entwicklung und Aufrechterhaltung
eines regelhaft funktionierenden adaptiven Immunsystems.
-1-
1.1.1. Zentrale Toleranzinduktion
Ein interessanter Hinweis auf relevante Selektions- und damit Reduktionsprozesse
ergibt sich schon aus der Tatsache, dass von den im Rahmen der somatischen
Rekombination theoretisch zu erwartenden 1015 differenten T-Zell-Rezeptoren [18] im
peripheren humanen Immunsystem nur ca. 1012 verschiedene T-Zell-Rezeptor-Klone
präsent sind [5].
Dem Grundprinzip der Auswahl zufällig rekombinierter T-Zell-Rezeptoren folgend,
beschreibt das allgemein bekannte Konzept der „zentralen Toleranzinduktion” einen
in jungen Jahren im Thymus stattfindenden Selektionsprozess, bei welchem die
unreifen Vorläuferlymphozyten in Abhängigkeit ihrer Rezeptoreigenschaften
entweder
zu
funktionsfähigen
T-Lymphozyten
heranreifen
oder
über
Apoptoseinduktion eliminiert werden. Dieser Vorgang wird in der Literatur auch als
„zentrale Deletion” bezeichnet.
Im ersten Entwicklungsschritt werden dabei die unreifen Thymozyten im Kortex des
Thymus
zunächst
anhand
ihrer
Affinität
zum
MHC-Komplex
(major
histocompatibility complex) selektiert. Im Rahmen diesen Schrittes, der „positiven
Selektion”, überleben vornehmlich die T-Rezeptor-Klone, die eine vorhandene, aber
geringfügige Affinität zum MHC-Komplex besitzen. Diese sind später in der Lage,
antigene
Strukturen
im
Kontext
des
präsentierenden
MHC-Moleküls
zu
identifizieren, ohne dabei autoreaktive Tendenzen gegenüber den körpereigenen
MHC-Strukturen zu entwickeln
[62]
. Nach Migration in die Medulla des Thymus
erfolgt in einem zweiten Selektionsprozess, der „negativen Selektion”, die
Entfernung der potenziell autoreaktiven T-Zell-Klone. Währenddessen kommt es
zum Kontakt der unreifen T-Zellen mit von Thymusepithelzellen und dendritischen
Zellen präsentierten Auto-Antigenen und zur gezielten Eliminierung der hierbei
hochaffinen T-Zell-Klone [45, 74]. Die T-Lymphozyten, die beide Selektionsvorgänge
passieren, gelangen zur weiteren Ausreifung, verlassen schließlich als naive T-Zellen
den Thymus und wandern in die sekundär lymphatischen Organe ein.
-2-
1.1.2. Periphere Toleranzinduktion
Es ist bekannt, dass trotz regelhafter zentraler Toleranzinduktion im Kindesalter eine
deutliche autoreaktive Potenz des gesunden reifen Immunsystems existiert [107].
Mehrere Studien haben inzwischen die Anwesenheit hochaffiner autoimmunogener
T-Zell-Klone im peripheren Blut gesunder Individuen nachgewiesen, deren Existenz
damit nicht als grundlegend pathologisch angesehen werden darf
[3, 25, 36]
. Einen
denkbaren Ursprung einer unvollkommenen Elimination hochaffiner autoreaktiver TZell-Klone könnte die mangelnde Präsenz verschiedener Autoantigene zu Zeiten
frühkindlicher thymaler Selektionsprozesse darstellen [2].
Ein weiteres Indiz der Existenz peripherer, kontrollierender Mechanismen stellt die
klinische Beobachtung einer so genannten autologen GVHD (graft versus host
disease) dar. Hierbei kommt es nach Transplantation eines körpereigenen (autologen)
Gewebes unter gleichzeitiger generalisierter Immunsuppression zu einer milden, aber
gut quantifizierbaren Abstoßungsreaktion des autologen Transplantats. Die unter
diesen Bedingungen beobachteten Immunreaktionen gegen körpereigenes Gewebe
werden als weiterer Hinweis auf eine auch im gesunden Individuum existierende
autoreaktive Dynamik gewertet und legen die Vermutung eines in dieser Situation
durch die Immunsupressiva aus dem Gleichgewicht geratenen peripheren
regulatorischen Systems nahe [70, 71].
In den letzten Jahren nimmt das Bild eines komplex aufgebauten peripheren
Regulationssystems
zur
Unterdrückung
fehlgeleiteter,
autoreaktiver
und
überschießender Immunreaktionen immer konkretere Formen an. Mittlerweile sind
die regulatorischen T-Zellen und deren Botenstoffe als wichtige Schaltstellen der
peripheren Immunkontrolle identifiziert worden.
Im Folgenden soll das regulatorische T-Zell-System mit seinen Subtypen kurz
vorgestellt werden.
-3-
1.2. Regulatorische T-Zellen
Bereits 1971 wurde in einer Publikation von Gershon et al. die Existenz einer
suppressorischen T-Zell-Population postuliert
[31]
. Erste Hinweise auf aktive
Toleranzinduktion einer spezifischen Zellgruppe lieferten Hall et al. 1990, die durch
den Transfer von CD4pos-CD25pos-T-Zellen in herztransplantierte Mäuse eine
vormals starke Abstoßungsreaktion in den transplantierten Geweben milderten.
Schließlich beschrieb eine Arbeitsgruppe um Sakaguchi 1995 erstmals die
entscheidende Rolle von CD4pos-CD25pos-T-Zellen in der Kontrolle pathogener
Immunreaktionen gegenüber bekannten Autoantigenen [85].
Zum jetzigen Zeitpunkt haben Forschungen v.a. an Tiermodellen erwiesen, dass TRegulatorzellen
in-vivo
Immunreaktionen
kontrollieren
und
hierbei
die
Eigenschaften besitzen, immunpathologische Antworten sowohl gegenüber Selbstals auch Fremdantigenen supprimieren zu können [59].
In in-vitro Co-Kulturexperimenten wurde der Einfluss regulatorischer T-Zellen auf
konkrete Zellgruppen geprüft. T-Regulatorzellen (sog. Tregs) scheinen dabei ihre
supprimierenden Fähigkeiten auf eine Vielzahl unterschiedlicher Zellpopulationen zu
entfalten. Es wurden hierbei zuvor aktivierte CD4pos-CD25neg-T-Zellen, CD8pos-TZellen als auch B-Lymphozyten in ihrer Proliferation und Funktion effektiv
inhibiert [72, 94].
Studien der letzten Jahre versuchen die einzelnen regulatorischen Zellpopulationen
mit ihren spezifischen Eigenschaften immer detaillierter zu beschreiben, um so eine
möglichst exakte Abgrenzung gegenüber anderen Zellgruppen zu ermöglichen. Der
Großteil der regulatorischen T-Zellen ist dabei nach heutigem Erkenntnisstand der
CD4pos Population zuzurechnen, obgleich auch bei CD8pos-T-Zellen sowie BLymphozyten regulatorische Fähigkeiten nachgewiesen wurden.
Als ein für die Identifizierung wichtiges Kennzeichen vieler regulatorischer
Lymphozyten gilt die Expression des Interleukin-2-Rezeptors, dessen α-Kette den
Oberflächenmarker CD25 darstellt
[85]
. Da CD25 auch von aktivierten T-Zellen
anderer Subtypen exprimiert werden kann, erlaubt der alleinige Nachweis von CD25
keine exakte Abgrenzung dieser Zellpopulation. Neben immunphänotypischen
Oberflächenmerkmalen besitzen manche regulatorischen T-Zellen ein für sie
-4-
typisches Zytokinprofil. Einige T-Regulatorzellen zeichnen sich durch die
ausgeprägte Freisetzung von Interleukin 10 (IL-10) aus, für andere ist die
Freisetzung der löslichen Form des transforming growth factors β 1 (TGF-β1) nach
Stimulation charakteristisch [33].
In der Literatur werden die verschiedensten Interaktionsmodelle regulatorischer TZellen beschrieben, wobei auch Erkenntnisse neuerer Arbeiten keinen eindeutigen
Suppressionmechanismus
erkennen
lassen
[95]
.
In-vitro-Daten
aus
Co-
Kulturexperimenten legen eine Suppression über hauptsächlich zellkontaktabhängige
Mechanismen nahe, wohingegen die supprimierende Wirkung in in-vivo-Modellen
auch über lösliche Mediatoren vermittelt wird [8, 95]. Membranständige Moleküle wie
CTLA-4, GITR und membranständiges TGF-β1 scheinen in der kontaktabhängigen
Suppression genauso eine Rolle zu spielen wie auch die häufig sezernierten
inhibitorischen Zytokine IL-10, IL-4 und das lösliche TGF-β1 in der über
Botenstoffe getragenen Regulation [80, 95, 101].
Auch die Veränderungen der Effektorzelle nach Interaktion mit Tregs im Rahmen
der Toleranzentwicklung können vielfältig und komplex sein. Inhibition der
Zytokinsekretion, eine Herabregulierung von Adhäsions- und co-stimulatorischen
Molekülen, sind genauso beschrieben wie eine Proliferationsinhibition, die Induktion
von Anergie und die Einleitung der Apoptose oder der Konversion in einen
regulatorischen Zelltyp [59].
Es
ist
anzunehmen,
dass
die
teilweise
widersprüchlichen
Daten
der
Interaktionsmechanismen und -effekte Ausdruck der Heterogenität einer, mit den
bisherigen Markern, vermutlich nur unzureichend untergliederten Gesamtheit an
regulatorisch wirkenden Zellpopulationen ist. Bis jetzt noch nicht differenzierbare
Subpopulationen
könnten
sich
durch
unterschiedliche
Entwicklung
und
Wirkungsweise dabei deutlich voneinander unterscheiden.
Aufgrund der noch fehlenden Kenntnisse im Bereich der regulatorisch aktiven TLymphozyten beschäftigten sich immer mehr Arbeitsgruppen mit der Erforschung
peripherer Regulationsmechanismen und den dort beteiligten Zellsystemen, sodass
man mittlerweile mehrere Untergruppen regulatorischer T-Zellen zu differenzieren
versucht, wobei die Frage, ob und inwieweit diese Zellen auseinander hervorgehen
oder ineinander übergehen können, weiterhin unbeantwortet bleibt
[82]
. Einzelne
Charakteristika der bisher differenzierten Hauptgruppen regulatorisch aktiver TZellen sollen im Folgenden kurz dargestellt werden.
-5-
1.2.1. CD4pos-CD25pos-T-Regulatorzellen
Die Untergruppe der CD4pos-CD25pos-T-Regulatorzellen, der „natürlichen” oder auch
„konstitutiven” Tregs, wird nach der steten und damit vom Reifungs- und
Aktivitätsgrad unabhängigen CD25-Expression benannt. 5–10 % der im peripheren
Blut, in der Milz und in den Lymphknoten vorkommenden CD4pos-Zellen besitzen
konstitutiv CD25 auf ihrer Zelloberfläche
[85]
. Als ein weiteres und für die
Identifizierung dieser Regulatorzellgruppe entscheidendes Merkmal gilt die
Expression des Transkriptions-Regulator-Proteins forkhead box P3 (FOXP3 oder
Scurfin), einem Transkriptionsfaktor der “forkhead”-Familie. Es gibt gewichtige
Hinweise, dass FOXP3 essenziell an der Entwicklung der regulatorischen
Eigenschaften dieser Zellen beteiligt sein könnte, da seine Expression mit der
suppressiven Aktivität dieser Suppressorzellen korreliert und ein mutationsbedingter
Funktionsverlust des entsprechenden FOXP3-Gens sowohl beim Menschen als auch
im Tiermodell mit Autoimmunerkrankungen assoziiert ist
[37, 49]
. Im Vergleich zu
CD4pos-CD25neg-Zellen konnten diesbezüglich um den Faktor 100 erhöhte FOXP3mRNA Level in stimulierten CD4pos-CD25pos-Tregs gemessen werden [49]. Weitere
Oberflächenmoleküle, die auf diesen T-Zellen gefunden und zur Differenzierung
gegenüber anderen Zellpopulationen genutzt werden, sind das CTL-associated
protein 4 (CTLA-4) sowie der glucocorticoid-induced TNF receptor (GITR), denen
zudem eine wichtige Funktion in der supprimierenden Eigenschaft dieser TRegulatorzellen zugeschrieben wird [49, 80, 101].
Als Ursprungsort der konstitutiven CD4pos-CD25pos-T-Regulatorzellen wird der
Thymus angenommen, da dort, neben anderen peripheren Effektorzellen, auch eine
Thymozyten-Population mit der für diese regulatorische Zellen typischen CD3-CD4CD25-CD62L-Expression identifiziert werden konnte [43].
Ähnlich den Vorstellungen zur zentralen Toleranzinduktion peripherer TLymphozyten könnten die regulatorischen T-Zellen von dort aus, nach einem
Entwicklungs-, Selektions- und Differenzierungsprozess, durch Präsentation von
Autoantigenen über das Thymusepithel in die Peripherie auswandern
[34, 43, 83]
(siehe
Abb. 1).
-6-
Studien, die bei Ratten das Auftreten von Autoimmunerkrankungen wie Gastritis,
Thyroditis und Diabetes nach Entfernung des Thymus und damit der CD4posCD25pos-regulatorischen T-Zellen am dritten neonatalen Tag beschreiben, stützen
dieses Konzept [28, 90].
Den Regulationsmechanismus betreffend, sprechen viele Indizien für eine eher
zellkontaktabhängige Interaktion dieser Treg-Subpopulation mit den entsprechenden
Effektorzellen. Membrangebundenes TGF-β1, aber auch CTLA-4, scheinen als
Oberflächenmoleküle einen entscheidenden Beitrag zur Suppression zu leisten
[4, 80]
.
Hierfür spricht auch die Tatsache, dass ein in Studien über blockierende Antikörper
provozierter Funktionsausfall von CTLA-4 einen Verlust der suppressiven Aktivität
untersuchter CD4pos-CD25pos-Zellen zur Folge hatte [80, 101].
Abbildung 1: Schema der thymalen Selektion und Auswanderung spezifischer regulatorischaktiver, konstitutiver Tregs
-7-
1.2.2. Typ1-regulatorische Zellen (Tr1)
Unter Einfluss von IL-10/IFN-alpha bzw. IL-10/IL-4 lassen sich in-vitro die nach
diesem
Phänomen
benannten
„induzierbaren”
Typ1-T-Regulatorzellen
generieren [56].
Diese und andere Ergebnisse weisen auf einen weiteren Mechanismus der
Entstehung regulatorischer T-Zellen hin. Es wird vermutet, dass sich Typ1regulatorische Zellen im Organismus aus einer in der Peripherie stattfindenden
Konversion
naiver
CD4pos-CD25neg-T-Lymphozyten
entwickeln.
Die
„thymusunabhängige” Entstehung könnte dabei eine periphere Toleranz gegenüber
(Auto-)Antigenen ermöglichen, welche zuvor nicht in adäquaten Mengen im Thymus
angeboten wurden. Es gibt Hinweise, dass das Zytokin TGF-β1, über die von ihm
vermittelte Induktion von FOXP3, an der peripheren Konversion der Tr1-Zellen
entscheidend beteiligt sei [14] (siehe Abb.2). Inzwischen ist das Auftreten sekretorisch
aktiver Tr1-Zellen auch in-vivo, in der frühen Phase der Hyposensibilisierung
nachgewiesen worden. Hohe Allergendosen mit den daraus resultierenden starken
Immunreaktionen könnten hierbei zur Induktion diesen Zelltyps geführt haben [47, 73].
Ein weiteres typisches Kennzeichen des Tr1-Zelltyps ist seine Eigenschaft, große
Mengen an Interleukin-10 zu produzieren und freizusetzen, sodass man bei diesen
regulatorischen Zellen von einem von inhibitorischen Zytokinen getragenen
Suppressionsmechanismus ausgeht [33, 56].
Abbildung 2: Schema der peripheren Konversion über FOXP3-Induktion in Tr1-Zellen
-8-
1.2.3. Th3-Zellen
Th3-Zellen
werden
durch
das
von
ihnen
sezernierte
Zytokinprofil,
mit
überwiegendem Anteil an löslichem TGF-β, charakterisiert [82].
In Studien zur Induktion regulatorischer T-Zellen gelang es, TGF-β-produzierende,
antigenspezifische Regulatorzellen gegen ein zuvor oral angebotenes Autoantigen
aus Lymphknoten und Milzen von Mäusen zu isolieren [67].
Einige Jahre später identifizierte die Arbeitsgruppe um Fukaura et al. spezifische, in
ausgeprägtem Maße TGF-β-sezernierende Th3-Zellen nach oraler Gabe des MSAutoantigen MBP (Myelin basic protein) im peripheren Blut von Multiple-SklerosePatienten MBP
[30]
(siehe Abb.3). Da sich in späteren Mausmodellen die Induktion
der Th3-Zellen durch Anwesenheit von TGF-β, IL-4, IL-10 und anti-IL-12 noch
deutlich steigern ließ, ist hierbei von einer komplexen Modulation durch
verschiedene, im Kontext der Reaktionen freigesetzte Zytokine auszugehen [105].
Abbildung 3: Schema der an orale Antigene gekoppelten TGF-β Sekretion einer peripheren Th3Zelle
-9-
1.2.4. Sonstige regulatorische Zellen
Neben den genannten werden in der jüngeren Literatur noch verschiedene andere TZell-Gruppen mit regulatorischen Eigenschaften beschrieben. Es finden sich immer
mehr Hinweise, dass auch CD8pos-Zellpopulationen mit regulatorischem Einfluss auf
CD4pos-Zellen und Endothelzellen existieren [39, 61].
- 10 -
1.3. Die TGF-β-Super-Familie
De Larco und Torado et al. beschrieben und benannten 1980 erstmals den
transformierenden Wachstumsfaktor β (TGF-β), den Prototypen einer bis heute stetig
wachsenden Familie aus Polypeptidwachstumsfaktoren. Sie beobachteten ein
Zytokin, welches in Fibroblasten von Nagetieren einen transformierten Phänotyp
erzeugte [19].
Seit dieser Entdeckung werden inzwischen mehr als 35 Botenstoffe der TGF-βSuper-Familie zugeordnet. Dabei handelt es sich um ubiquitär vorkommende,
strukturell ähnlich aufgebaute Polypeptide, die aufgrund ihrer Sequenzhomologien in
vier verschiedene Untergruppen eingeteilt werden können. Dies sind zum einen die
eigentlichen TGF-β-Zytokin-Varianten, die Gruppe der Aktivine/Inhibine, die
Familie der BMP und GDF (bone morphogenetic proteins/growth and differentiation
factors) und zum anderen eine heterogene Fraktion, zu der unter anderem der MIF
(Macrophage Migration Inhibitory Factor) und das zur Herzentwicklung essenzielle
Protein NODAL zählen [50]. Als zumeist parakrin wirkende Mediatoren sind die
Mitglieder der TGF-β-Super-Familie an der Vermittlung einer Vielzahl von
physiologischen wie pathophysiologischen Prozessen unterschiedlicher Gewebs- und
Organsysteme beteiligt. Hierzu zählt neben der Kontrolle von Proliferation,
Differenzierung und Apoptoseinduktion verschiedenster Zelltypen auch die
Beeinflussung komplexer Interaktionen im Rahmen der Geweberegeneration,
Tumorsuppression und Immunregulation [63].
Allen Signalmolekülen der TGF-β-Familie ist das generelle Wirkprinzip gemein, das
durch Bindung spezifischer Glycoprotein-Transmembranrezeptoren und einer
nachfolgenden Aktivierung so genannter Smad-Proteine (S = small body size, Mad =
Mother against decapentaplegic) charakterisiert ist. Die vom jeweiligen Zytokin
induzierte Zellantwort wird dabei durch ein komplexes regulatorisches Netzwerk in
Abhängigkeit von der gegebenen Rezeptorkombination, der hierdurch determinierten
Smad-Beteiligung
und
der
Rekrutierung
weiterer
modulierender
Proteine
bestimmt [20].
- 11 -
Tabelle 1: Einige Mitglieder der TGF-ß-Super-Familie mit ihren alternativen
Bezeichnungen und einer kurzen Beschreibung ihrer Funktion
Bezeichnung
Synonyme
Funktionen
TGF-β1
TGF-β; TGFB; TGF-beta
Proliferation und Differenzierung
TGF-β2
TGF-beta 2
TGF-β3
TGF-beta 3
Gaumen- und Lungenentwicklung
BMP1
Procollagen C Proteinase
embryonale Musterbildung
supprimiert Interleukin-2-abhängiges TZell-Wachstum
knocheninduktiv,
BMP2
BMP2a
Osteoblastendifferenzierung,
Apoptose, Extremitätenentwicklung
BMP3
--
BMP4
BMP2b
GDF1
inhibiert die Osteogenese
Mesoderm-Induktion, Zahn-,
Augen-, Lungenentwicklung
Links-rechts-Asymmetrie
GDF2
BMP9
Nervensystem
GDF3
ECAT9; VGR2
BMP-Inhibitor
GDF15
PLAB; PDF; MIC1
INHIBIN-βA
INHIBIN-βB
MIF
Inhibin-β-1; EDF;
FSH Releasing Protein;
reduziert Wachstum von Granulozyten
und Makrophagen
Inhibition hypophysärer FSH-Sekretion
Inhibin β-2; Activin β-β
Stimulation hypophysärer FSH-
Activin β
Sekretion
MMIF – Macrophage
MIF wird von Makrophagen und T-
Migration Inhibitory
Zellen nach Stimulation mit
Factor
Glukokortikoiden sezerniert
- 12 -
1.3.1. Transformierender Wachstumsfaktor β (TGF-β)
Das von vielen Zellsystemen freigesetzte TGF-β stellt selbst einen Botenstoff mit
pleiotroper Wirkung dar. In enger Abhängigkeit von Zelltyp, Entwicklungsstadium,
Differenzierungsstatus und Zyklusposition entwickelt TGF-β seine mannigfaltigen
und teilweise gegenläufigen Wirkungen auf die jeweiligen Zielzellen. Es scheint
hierdurch eine wichtige Rolle unter anderem in der Embryo- und Angiogenese,
Proliferation
und
extrazellulären
Differenzierung
Matrixsynthese
von
durch
Mesenchymzellen,
Fibroblasten
und
Stimulation
der
Modulation
der
Immunantwort zu spielen [63, 22].
Dementsprechend vielgestaltige Hinweise ergeben sich in Bezug auf mögliche
pathogenetische Zusammenhänge unter Beteiligung TGF-βs. Eine gestörte TGF-βExpression wird z.B. im Rahmen der Genese verschiedener Tumoren, der
Entwicklung hyperproliferativer Erkrankungen, der Ausbildung von Atherosklerose
sowie Organfibrosen und in der Entstehung von Autoimmunmechanismen
diskutiert [1, 12, 22].
Mittlerweile
werden
drei
TGF-β-Isoformen
(TGF-β1,
TGF-β2,
TGF-β3)
unterschieden, die in biologisch aktiver Form jeweils als Homodimere vorliegen und
aus drei größtenteils homologen Precurser-Polypeptiden synthetisiert werden
[68]
(siehe Abb. 4). Die Isoformen unterscheiden sich dabei hauptsächlich in ihrer
Expression, weniger in ihrer Funktion. Eine mRNA-Analyse einzelner Zelltypen
lässt eine charakteristische Syntheseverteilung der TGF-β-Isoformen erkennen. TGFβ1 lässt sich v.a. in Bindegewebszellen, Endothelzellen und Zellen des Blutes, TGFβ2 in Epithel- sowie neuronalen Zellen und TGF-β3 primär in mesenchymalen
Zellen nachweisen [22].
Die genauen Mechanismen, über die die einzelnen TGF-β-Isoformen ihre komplexen
modulierenden und regulierenden Effekte entfalten, sind noch nicht vollständig
aufgeklärt. Die meisten Daten der Literatur zeigen jedoch, dass hierbei sowohl
membranständiges, nach Zell-Zell-Kontakt, als auch das lösliche TGF-β1, nach
Sekretion, zu Effekten in den jeweiligen Zielzellen führen können. Die
grundlegenden Charakteristika der transmembranösen Signalwege werden im
Folgenden kurz dargestellt.
- 13 -
Abbildung 4: Schematische Darstellung der 3D-Struktur des maturen TGF-β1 (Dimer); PDB:
1KLC (Hinck et al., 1996)
1.3.1.1.
TGF-β Rezeptoren
Die Effekte aller Signalmoleküle der TGF-β-Super-Familie werden durch die
parallele Aktivierung zweier spezifischer membranständiger Glycoproteinrezeptoren,
der so genannten Typ-I und Typ-II Rezeptoren, vermittelt. Der Typ-II-Rezeptor ist in
der Lage, den jeweiligen Liganden zu binden, während der Typ-I-Rezeptor für die
eigentliche Signaltransduktion, die Signalweiterleitung in die Zelle, unentbehrlich ist.
Es wurden bis zum jetzigen Zeitpunkt insgesamt sieben verschiedene Typ-I- und fünf
verschiedene Typ-II-Rezeptoren identifiziert, die alle über eine Serin-ThreoninKinase-Aktivität verfügen und für die verschiedenen Mitglieder der TGF-β-SuperFamilie spezifisch sind. Transmembrane Signalweiterleitung findet dabei nur statt,
wenn sich beide Rezeptoren zu einem aktivierten Komplex aus Hetero- bzw.
Homodimeren zusammenlagern [22, 58].
Diesem Grundprinzip folgend, bindet das TGF-β zunächst den TGF-β-Typ-IIRezeptor, ermöglicht so seine Annäherung an den Typ-I-Rezeptor und damit die
Bildung des tetrameren aktivierten Rezeptor-Komplexes. Das intrazelluläre, zuvor
- 14 -
blockierte
katalytische
Zentrum
des
TGF-β-Typ-I-Rezeptors
wird
nach
Phosphorylierung durch den Typ II Rezeptor freigegeben und steht nun der
Anlagerung der Smad-Proteine zur Verfügung, die die Signalweiterleitung in den
Zellkern realisieren [58] (siehe Abb. 5).
1.3.1.2.
Signaltransduktion
Smad-Proteine, deren Namen sich von den kodierenden Genen ableiten, als deren
Produkt sie zuerst identifiziert wurden, dem Drosophila MAD-Gen und dem C.
elegans SMA-Gen, liegen in ihrer unphosphorylierten Form als monomere Proteine
im Zytoplasma der Zielzellen vor. Aufgrund ihrer Struktur und Funktion werden sie
in drei Untergruppen, die so genannten Rezeptor-Smad-, die kooperativen Smad- und
die inhibitorischen Smad-Proteine, unterteilt.
Die Rezeptor-Smad-Proteine (R-Smads) stellen das eigentliche Substrat des TGF-βRezeptors Typ-I dar. Die katalysierte Phosphorylierung der R-Smads führt zu deren
Konformationsänderung, und ermöglicht die Bildung oligomerer Komplexe durch
Anlagerung weiterer R-Smads bzw. kooperativer Smad-Proteine (Co-Smads).
Nach Eintritt in den Zellkern und unter Mitwirkung verschiedener Cofaktoren und
Coaktivatoren kommt es zur Bindung der R/Co-Smad-Komplexe an die Promotoren
spezifischer DNA-Sequenzen und hierdurch zur eigentlichen Transkriptionsinitiierung der Zielgene [20, 58].
Die Regulation der über TGF-β vermittelten Signaltransduktion wird durch ein
komplexes Netzwerk unterschiedlicher Moleküle realisiert, die ihrerseits wiederum
in verschiedene Signalwege eingebettet sind. Hierzu zählt neben Gerüstproteinen,
wie z.B. SARA (Smad anchor for receptor activation), Cofaktoren wie z.B. FAST
(forkhead activin signal transducer) und DNA-Bindungsproteinen, auch die Gruppe
der inhibitorischen Smad-Proteine (I-Smads). Es handelt sich hierbei um die
kompetitiven Antagonisten der TGF-β-vermittelten Signaltransduktion, welche als
blockierendes Substrat sowohl mit den R-Smads als auch mit den Co-Smads um
deren Bindungsstellen konkurrieren. Im Sinne eines negativen Feedbacks wird die ISmads-Aktivität dabei durch den TGF-β-Signalweg induziert [20].
- 15 -
Abbildung 5: Schematische Darstellung der TGF-β-vermittelten Signaltransduktion
In Abhängigkeit der Cofaktoren, Coaktivatoren bzw. Repressoren der Zielzelle kann
es anhand dieser Regelmechanismen zu sehr unterschiedlichen Genantworten bei
ansonsten identischen Zellen kommen. Die komplexe TGF-β-Signaltransduktionskette ist stark vereinfacht in Abbildung 5 dargestellt.
- 16 -
1.4. TGF-β im Immunsystem
Schon frühe Studien an Knock-out-Mäusen weisen auf eine zentrale Position des
Mediators TGF-β1 in der Aufrechterhaltung des peripheren immunologischen
Gleichgewichtes
hin.
TGF-β1-defizitäre
Mäuse
entwickelten
nach
kurzer
Lebensdauer entzündliche Läsionen in verschiedensten Organen und verstarben unter
starkem Gewichtsverlust innerhalb nur weniger Wochen
[53, 55, 96]
. Die rasch
auftretenden inflammatorischen Prozesse der transgenen Mäuse wurden dabei
überwiegend von stimulierten Lymphozyten, und unter diesen v.a. von aktivierten
CD4pos T-Zellen, vermittelt [21].
1.4.1. TGF-β-vermittelt periphere Toleranzinduktion
Seit den ersten Hinweisen haben sich viele Studien mit der Erforschung TGF-βs und
seiner Einbettung in die Vorgänge der peripheren Toleranzinduktion beschäftigt.
Aufgrund der komplexen intrazellulären Signalwege (siehe Kap. 1.3.1.1.), deren
mannigfaltigen Modulationsmöglichkeiten (siehe Kap. 1.3.1.2.) und den ebenso
vielfältigen extrazellulären Zusammenhängen beschränken sich die bisherigen
Erkenntnisse auf das Verständnis einzelner messbarer Effekte, die in den
angewandten Versuchsmodellen unter reproduzierbaren Bedingungen analysierbar
waren. So existieren valide Daten, die eine modulierende Wirkung TGF-βs, im
Rahmen der Transkription, Sekretion und Signaltransduktion vieler an der
Immunantwort beteiligter Interleukine nahelegen. Aufgrund ihrer bedeutsamen
Stellung innerhalb immunologisch-lymphozytärer Reaktionen sind hier vor allem die
von CD4pos-Helferzellen sezernierten Zytokine, das Interleukin 2, der INF-γ sowie
das Interleukin 12 zu nennen, über deren Inhibition die Akquisition von T-HelferzellFunktionen und damit zumindest ein Teil der antiproliferativen supprimierenden
Effekte vermittelt werden könnten [11, 48].
Neben den Wechselwirkungen an den „zellulären Schaltstellen” immunologischer
Reaktionen, den T-Helferzellen, finden sich auch Hinweise auf eine direkte
Einflussnahme immunologischer Effektorzellen. Die von TGF-β vermittelten
- 17 -
Signalwege
scheinen
hierbei
u.a.
die
Produktion
zytolytisch
wirksamer
Effektormoleküle in CD8pos-T-Zellen zu unterdrücken und so deren Entwicklung zu
zytotoxisch aktiven T-Zellen zu verhindern [97, 102].
In den letzten Jahren vermutete man TGF-β-Funktionen in der CTLA-4-vermittelten
Inhibition aktivierter T-Zellen zu finden, da große Übereinstimmungen in der Klinik
CTLA-4- bzw. TGF-β-defizitärer Knock-out-Mäuse existieren [53,
96]
. Ergebnisse
aktueller Studien unter Verwendung neutralisierender Antikörper sprechen hingegen
für die Unabhängigkeit CTLA-4-vermittelter Effekte [99].
Ein wichtiger zusätzlich modulierender Faktor TGF-βs in-vitro scheint die
Aktivierung des auf T-Zellen exprimierten CD28-Rezeptors zu sein. In Abwesenheit
der CD28-Costimulation führt TGF-β1 zu einer deutlichen Suppression stimulierter
naiver T-Zellen. Gleichzeitige Signale über den CD28-Rezeptor bewirken jedoch
eine Apoptoseinhibition und signifikant gesteigerte Proliferation aktivierter T-Zellen
und damit eine nahezu gegenläufige Zellantwort [100].
1.4.2. TGF-β Interaktion im T-Regulatorzell-System
TGF-β wird von sehr vielen unterschiedlichen Zellsystemen synthetisiert. Eine
hierbei wichtige Zellpopulation stellen die in Kapitel 1.2. näher dargestellten
regulatorischen T-Zellen dar. Vor allem die Th3-Zellen zeichnen sich durch ihre
besonders ausgeprägte TGF-β-Synthese nach entsprechender Stimulation aus, sodass
eine funktionstragende Stellung in dieser Zellgruppe vermutet werden darf.
Jüngere Maus-Versuchsmodelle zur Erforschung genauerer Wechselwirkungen
zwischen TGF-β und regulatorischen T-Zellen in-vivo lassen noch keinen
eindeutigen Zusammenhang zwischen suppressiver Potenz regulatorischer T-Zellen
und den von TGF-β realisierten Effekten erkennen. Huber S. et al. lieferten
diesbezüglich klare Hinweise auf die bedeutsame Position TGF-β-vermittelter
Signale in der Entfaltung der suppressiven Eigenschaften und Expansion CD4posCD25pos-regulatorischer T-Zellen in-vivo
[40]
, wohingegen die Ergebnisse der
Arbeitsgruppen Mamura et al. und Godfrey et al. auf eine eher untergeordnete Rolle
- 18 -
TGF-βs in der Funktion suppressiver regulatorischer T-Zellen in-vitro sowie in-vivo
schließen lassen [32, 60].
Eine weitere interessante Perspektive stellt die Beobachtung einer in Anwesenheit
von TGF-β1 expandierenden Subpopulation aus regulatorischen Zellen in-vivo
dar [76]. Wie bereits in Kapitel 1.2.2. erwähnt, wird hierbei eine von TGF-β
vermittelte
regulatorisch
Konversion
aktive
peripherer
naiver
CD4pos-CD25neg-Zellen
CD4pos-CD25pos-Zellpopulation
durch
in
eine
Induktion
des
Transkriptions-Regulator-Proteins "scurfin" (bei gleichzeitig auftretenen T-ZellRezeptorsignalen) angenommen
[14, 78]
. Die codierende Sequenz FOXP3 soll dabei
die Rolle des entscheidenden Schlüssel-Gens in der Entwicklung regulatorischer TZellen einnehmen [49, 37].
Abbildung 6: Mögliche Wirkmechanismen TGF-βs, im Sinne eines Effektormoleküls ausgehend
von regulatorisch aktiven T-Zellen
Das Konzept einer von TGF-β vermittelten Akquisition peripherer regulatorischer TZellen wird durch neuere Daten der FOXP-3 Expression späterer Studiengruppen
gestärkt.
- 19 -
Die Arbeitsgruppe um S. Fu präsentierte 2004, dass T-Zellrezeptor-stimulierte
CD4pos-CD25pos-Zellen unter Zusatz von TGF-β nach einigen Tagen einen
signifikant höheren FOXP3-Level aufweisen als Kontrollpopulationen ohne TGF-β,
wohingegen ein gestörter TGF-β-Signalweg die FOXP-3-Expression zu reduzieren
scheint [29,
88]
. Diese Ergebnisse stützen die Vermutung, dass TGF-β seine
supprimierenden und inhibierenden Effekte im Kontext regulatorisch aktiver
Lymphozyten entwickelt, wobei TGF-β sowohl funktionstragender Mediator
ausgehend von Treg-Zellen sein als auch autokrines bzw. parakrines Effektormolekül
für Treg-Zellen darstellen könnte.
Bedeutende Fragen, wie die nach dem Zusammenspiel beteiligter Zellsysteme oder
den übergeordneten Mechanismen einer von TGF-β vermittelten Regulation, können
bisher nur sehr bruchstückhaft beantwortet werden. Ein daraus ableitbares,
schlüssiges Konzept, welches die bisherigen Erkenntnisse in einen größeren Kontext
zusammenzufassen versucht, fehlt bis zum jetzigen Zeitpunkt. Es wird inzwischen
kaum mehr bestritten, dass TGF-β entscheidende Funktionen im Rahmen der
Entwicklung und Aufrechterhaltung von immunologischer Toleranz erfüllt, und
dieses vermutlich durch seinen besonderen Einfluss auf die Proliferation, die Ausund Weiterdifferenzierung, sowie Apoptoseinduktion von T-Zellen realisiert [57, 75].
- 20 -
1.5. Reifungsprozesse im T-Zell-System
Es ist bekannt, dass das adaptive Immunsystem zum Zeitpunkt der Geburt noch keine
vollständige Funktionalität besitzt. Erst nach umfassendem Antigenkontakt und den
daraus resultierenden Reifungs- und "Lern"-Prozessen innerhalb der ersten
Lebensjahre entwickelt sich die vollständige Kompetenz der antigenspezifischen
Immunmechanismen.
Als Ausdruck der im T-Zell-System ablaufenden Reifungsschritte ist es möglich,
weitestgehend undifferenzierte, zelltypspezifische Vorläuferzellen im peripheren
Blut zu identifizieren. Diese weisen Oberflächenmerkmale ihrer Zelllinie auf
(Zelllinienmarker),
ohne
weitere
immunphänotypische
Eigenschaften
der
differenzierten Endzellen (Differenzierungsmarker) zu besitzen. Mit zunehmendem
Alter und damit Reifungsgrad des zellulären Immunsystems entwickeln diese Zellen
in immer ausgeprägterem Maße ihre spezifischen Fähigkeiten, die sich anhand von
Oberflächenmarkern oder der Zytokinproduktion erkennen lassen.
Ein gemeinsames Oberflächenmerkmal aller T-Zell-Linien stellt die altersabhängige
Verteilung der Isoformen des Markers CD45RA/RO dar (siehe Kap. 3.3.4.1.).
Unreife, naive und ruhende T-Zell-Populationen exprimieren überwiegend CD45RA
auf ihrer Zelloberfläche, welches nach Aktivierung und Reifung der Zelle durch die
überwiegende Synthese der CD45RO-Isoform verdrängt wird [23, 77].
Mittlerweile kann auch innerhalb des regulatorischen T-Zell-Systems eine mit
zunehmendem
Alter
abnehmende
unreife
Fraktion
an
regulatorischen
Vorläuferzellen differenziert werden. So definierten Valmori et al. 2005 die so
genannten
natural
naive
Tregs
(NnTregs),
einen
überwiegend
CD45RA
exprimierenden, antigenunerfahrenen und damit unreifen Vorgänger der natürlichen,
konstitutiven Treg-Subpopulation (naturally occurring Tregs, siehe Kap. 1.5. sowie
Kap. 1.2.1.). NnTregs besitzen neben den Merkmalen unreifer, naiver T-Zellen
(CD45RApos, CD45ROneg, CCR7neg, hohe Telomerenlänge) schon die typischen
Charakteristika regulatorischer T-Zellen (FOXP3-Expression, CTLA-4, CD25pos)
- 21 -
und konnten hierüber eindeutig von den übrigen unreifen Zellpopulationen des
peripheren Blutes abgegrenzt werden.
Bei
entsprechender
Stimulation
(T-Zell-Rezeptor-Signal
in
Interleukin-2-
Anwesenheit) entwickeln NnTregs ein im Vergleich zu ausgereiften Tregs erhöhtes
proliferatives Potenzial, was Ausdruck ihrer im unreifen Zustand gesteigerten
Reaktivität gegenüber autoreaktiven antigenpräsentierenden Zellen sein könnte [104].
Weitere, genauere Daten über mögliche bei der Ausreifung der Treg-Zellen beteiligte
Faktoren, oder Merkmale, die Ausdruck einer Ausreifung sein könnten, fehlen
zurzeit hingegen noch.
Die ungenügende Ausreifung des T-Regulatorzell-Systems könnte eine besonders
bedeutungsvolle Rolle in der Ätiologie fehlregulierter Immunreaktionen im Rahmen
autoimmuner Erkrankungen einnehmen.
Auch die Frage ob, und inwieweit periphere Toleranzmechanismen in einem
fehlregulierten autoreaktiv reagierenden Immunsystem zu einem späteren Zeitpunkt
umsetzbar sind, bleibt bislang unklar. Einigen Studien ist es mittlerweile gelungen,
TGF-β-produzierende,
antigenspezifische Th3-Zellen gegen ein zuvor oral
angebotenes Autoantigen zu isolieren
[30]
. Diese Ergebnisse weisen auf eine
möglicherweise auch in späteren Jahren vorhandene Plastizität regulatorischer
Immunkomponenten hin.
.
- 22 -
2.
Fragestellung
Zelluläre Reifungsprozesse ermöglichen vermutlich auch bei regulatorisch aktiven
Immunkomponenten die Ausbildung ihrer vollen antigenen Kompetenz und hierüber
die Entwicklung einer suffizienten peripheren Toleranzinduktion zum Schutz vor
(auto-)immunogenen Fehlreaktionen.
Um detailliertere Einblicke in die regelrechte Entwicklung regulatorisch bedeutsamer
Immunkomponenten gewinnen zu können, wurden in der vorliegenden Arbeit
zytokine wie zelluläre Zusammenhänge gesunder heranwachsender Kinder und
Jugendlicher analysiert.
Es sollen hierdurch folgende Fragen beantwortet werden:
1.
Existiert eine Altersabhängigkeit der T-lymphozytären TGF-β-Synthese?
2.
Existieren Hinweise auf den Ursprung des gemessenen TGF-βs im
Zellsystem der reifen CD4pos-CD25pos-CD45RAneg-regulatorischen TZellen (konstitutiven Tregs)?
3.
Existieren Hinweise auf den Einfluss CD3pos-TGF-βpos-T-Lymphozyten
auf andere Effektorzellgruppen im Sinne einer Proliferationskontrolle?
- 23 -
3.
Probanden, Material und Methoden
3.1. Probanden
Die in der Studie verwendeten Blutproben stammen von Kindern, Jugendlichen und
jungen Erwachsenen im Alter von einem Monat bis zum 30. Lebensjahr, denen im
Zeitraum
vom
Februar
bis
Juli
2007,
nach
schriftlicher
Erteilung
des
Einverständnisses (bei Minderjährigkeit durch die Erziehungsberechtigten), fünf
Milliliter venöses Blut entnommen wurde. Die Proben wurden allesamt im Verlauf
elektiver
kinderchirurgischer
kinderchirurgischen
Praxis
Operationen
Dr.
Standke
im
in
Marienhospital
Herne,
der
Bochum-Wattenscheidt,
der
anästhesiologischen Praxis Dr. Thöns in Witten sowie bei Blutentnahmen zur
Vaterschaftstestung in der Kinderklinik des St. Josef-Hospital in Bochum gewonnen.
Alle personenbezogenen Informationen der Probanden (Alter, biometrische und
anamnestische Daten) wurden vor der Blutentnahme protokolliert und in einem
Studienordner gesammelt.
Nach Prüfung der Eignung von über 200 Patienten, wurden 147 den Ein- bzw.
Ausschlusskriterien entsprechend als geeignet beurteilt. Hiervon willigten 126
gesunde Probanden der unterschiedlichen Altersgruppen ein, an der klinischen Studie
teilzunehmen. 17 Datensätze konnten aufgrund von labormethodischen Fehlern nicht
in die Auswertung einbezogen werden. Die Daten von 9 Probanden mussten
aufgrund fehlender personenbezogener Angaben noch vor Auswertung aus dem
Datenkollektiv entfernt weden. Abschließend ergab sich somit ein in die Auswertung
eingeschlossenes Datenvolumen von 100 Kindern, Jugendlichen und jungen
Erwachsenen.
3.1.1. Einschlusskriterien
Als Einschlusskriterien galten das Probandenalter (ein Monat bis 30. Lebensjahr)
sowie die schriftliche Einverständniserklärung (bei Minderjährigkeit durch die
Erziehungsberechtigten).
- 24 -
3.1.2. Ausschlusskriterien
Um die Validität der gewonnenen TGF-β-Werte als abhängige Variable der Studie zu
gewährleisten, wurden potenzielle Einflüsse, die unkontrolliert Wirkung auf die
Ergebnisse der Messungen hatten (so genannte Störvariablen), mithilfe vorher
festgelegter Ausschlusskriterien minimiert.
Als Ausschlusskriterien galten alle Einflüsse bzw. Zustände, bei denen von einem
veränderten Immunstatus bzw. stimulierten Immunsystem auszugehen war. Hierzu
zählten neben verschiedenen Grunderkrankungen, wie allen akut bis chronisch, lokal
bis systemisch entzündlichen Beschwerden, Erkrankungen des atopischen und
rheumatischen Formenkreises, wie auch systemische Arzneimitteltherapien mit
potenziellem Einfluss auf das Immunsystem (siehe Tab. 2).
Tabelle 2: Zustände, die zu einem Ausschluss aus der Studie führten
Ausschlusskriterien
Alle
Erkrankungen
mit
primär
oder
sekundär
entzündlichen
Prozessen
(lokal/systemisch)
Erkrankungen des atopischen Formenkreises:
- Allergien (nachgewiesen im RAST bzw. Kutantest)
- Asthma bronchiale
- Neurodermitis (Atopische Dermatitis)
Erkrankungen mit vermuteten Autoimmunmechanismen:
- rheumatoide Arthritiden
- Kollagenosen
- Vaskulitiden
- Diabetes mellitus Typ I etc.
Immundefekt-Erkrankungen (zellulär/humoral)
Erkrankungen mit konsekutiver Veränderung des weißen Blutbildes
Arzneimitteltherapie mit potenziellem Einfluss auf das Immunsystem bzw. Blutbild
innerhalb der letzten 6 Wochen (NSAR, Glukokortikoide, Antihistaminika etc.)
- 25 -
3.1.3. Geschlechtsverteilung
Die Blutproben wurden im Verlauf elektiver kinderchirurgischer Operationen bei den
verschiedenen
Kooperationspartnern
der
Studie
gewonnen.
Aufgrund
der
Knabenwendigkeit einiger für die Studie als geeignet bewerteter Erkrankungen bzw.
Operationsindikationen, z.B. der operativen Korrektur einer nichtentzündlichen
Phimose, enstand im Probandenkollektiv
ein leichtgradig knabenwendiges
Geschlechterverhältnis von 65 männlichen zu 35 weiblichen Probanden.
3.1.4. Altersstruktur
Zur Darstellung der in dieser Studie untersuchten Altersabhängigkeit TGF-βs wurde
vor allem auf eine ausreichende und homogen verteilte Probandenzahl im Bereich
der ersten 10 Lebensjahre Wert gelegt. Mit 18 Säuglingen unter einem Lebensjahr,
32 Kleinkindern im Vorschulalter, 29 Kindern und Jugendlichen im Schulalter sowie
21 jungen Erwachsenen konnte eine repräsentative Teilnehmerzahl jeder
Altersgruppe realisiert werden.
n 16
15
14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
1- 3
4-6
[Monate]
7 - 12
1- 2
3-4
5-6
7-9
10 - 15
[Jahre]
16 - 20
21- 25
26 - 30
Abbildung 7: Darstellung der Altersverteilung des Probandenkollektivs
- 26 -
3.2. Material
3.2.1. Geräte
Produkt
Hersteller
Arbeitsbank Heraeus Tamin Air
Heraeus Instr., Düsseldorf
Durchlichtmikroskop
Zeiss, Jena
Durchflusscytometer FACScan®
Becton Dickinson, Heidelberg
MACS® Cell-Seperator
Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach
Kühlschrank
Liebherr GmbH, Ochsenhausen
Gefrierschrank
Liebherr GmbH, Ochsenhausen
Gefriertruhe (-88°C)
Profiline, National Lab., Mölln
Vortex Schüttler
IKA®-Labortechnik, Staufen
Zentrifuge Omnifuge 2.0 RS
Heraeus Instr., Düsseldorf
Brutschrank (CO2 Inkubator)
Heraeus Instr., Düsseldorf
Magnetrührer Combimag RCT
IKA®-Labortechnik, Staufen
Waage 1419
Sartorius, Gießen
Pipettierhilfe Pipetus®
Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt
3.2.2. Software
Produkt
Hersteller
CellQuest
Becton Dickinson, Heidelberg
Lysis II Softwarepaket
Becton Dickinson, Heidelberg
- 27 -
3.2.3. Hilfsmittel und Verbrauchsmaterialien
Produkt
Hersteller
Katalog-Nr.
1,5-ml-Reaktionsgefäß
Eppendorf, Hamburg
30102002
10-ml-serologische Pipette, steril
Falcon/BD, Heidelberg
7530
12-ml-Polystyrol Reagenzglas
Kabe Labor, Nümbrecht
050001
15-ml-Röhrchen (Blue MaxTMJr.)
Falcon/BD, Heidelberg
2096
50-ml-Röhrchen (Blue MaxTM)
Falcon/BD, Heidelberg
2070
FACS-Röhrchen
Falcon/BD, Heidelberg
2052
MultiwellTM-24-Loch Kulturplatte
Falcon/BD, Heidelberg
3047
Eppendorf Reference® 10-µl-Pipette
Eppendorf, Hamburg
-
Eppendorf Reference® 20-µl-Pipette
Eppendorf, Hamburg
-
Eppendorf Reference® 200-µl-Pipette
Eppendorf, Hamburg
-
4500 (200–1000 µl) Finnpipette®
Labsystems, Quickborn
-
Pipett-Spitzen (10 µl, 200 µl, 1000 µl)
Eppendorf, Hamburg
-
Zählkammer nach Neubauer
PM, Lauda-Königshofen
-
Deckgläser, plan geschliffen
Langenb., Emmendingen
-
3.2.4. Stimulanzien
Produkt
Hersteller
Katalog-Nr.
Phorbol-12-myristate-13-acetat
Sigma Aldrich, Deisenhofen
P-8134
Ionomycin
Sigma Aldrich, Deisenhofen
I-0643
- 28 -
3.2.5. Chemikalien, Puffer und Zellmedien
Produkt
Hersteller
KatalogNr.
Heparin-Natrium 10.000 I.E./ml
Braun AG, Melsungen
2042053
Biocoll Trennlösung (1077 g/ml)
Biochrom AG, Berlin
L-6115
PBS-Dulbecco, steril
Biochrom AG, Berlin
L-1825
VLE-RPMI 1640-Flüssigmedium
Biochrom AG, Berlin
F-1415
Monensin
Sigma Aldrich, Deisenhofen
M-5273
Türk´sche Lösung
Fluka Chemie, Schweiz
93770
Saponin, Pulver
Riedel-de Haen AG, Seelze
16109
HEPES-Puffer
Biochrom AG, Berlin
L-1613
FCS (fetal clone serum)
Biochrom AG, Berlin
S-0115
Natriumazid (NaN3), Pulver
Merck, Darmstadt
6688
Paraformaldehyd, Pulver
Riedel-de Haen AG, Seelze
16005
3.2.6. Lösungen
Produkt
Herstellung
0,4 g Paraformaldehyd-Pulver mit 10 ml
4% Formaldehyd-Lösung
PBS-Dulbecco versehen und auf dem
Heizrührer unter Hitze ca. 30 Minuten in
Lösung bringen.
- 29 -
500
µl
einer
10%
Saponin-Lsg.
zusammen mit 500 µl des Hepes-Puffers
0,1% Saponin-Lösung
und 500 µl des FCS (fetal clone serum)
in einem 50-ml-Röhrchen vermengen
und mit PBS-0,1% Azid-Lösung auf ein
Endvolumen von 50 ml auffüllen.
PBS-0,1%-Azid-Lösung
0,5 g Natriumazid-Pulver in 500 ml
PBS-Dulbecco lösen.
3.2.7. Antikörper (IgG1-Maus-anti-human-Antikörper)
Antikörper - Fluoreszenz
Hersteller
Katalog-Nr.
Anti-CD45RA-AK – FITC
Pharmingen/BD, Heidelberg
555488
Anti-CD25-AK – PE
Pharmingen/BD, Heidelberg
555432
Anti-CD4-AK – PerCP
Pharmingen/BD, Heidelberg
345770
Anti-TGF-β-AK – PE
IQ Products, Groningen NL
IQP-169R
Anti-CD3-AK – Tricolor
Caltag Lab., Burlingame USA
D0306
IgG1-Isotypkontrolle – Tricolor
Pharmingen/BD, Heidelberg
349054
IgG1-Isotypkontrolle – FITC
Pharmingen/BD, Heidelberg
345815
IgG1-Isotypkontrolle – PerCP
Pharmingen/BD, Heidelberg
349054
Pharmingen/BD, Heidelberg
345816
Pharmingen/BD, Heidelberg
554680
Miltenyi Biotech, Berg. Gladb.
130-091-301
IgG1-Isotypkontrolle– PE
(Extrazellulär)
IgG1-Isotypkontrolle – PE
(Intrazellulär)
CD4pos-CD25pos Regulatory T
Cell Isolation Kit (human)
- 30 -
3.3. Methoden
3.3.1. Analytische Durchflusszytometrie
3.3.1.1.
Grundlagen der Durchflusszytometrie
Das Verfahren der fluoreszenzaktivierten Durchflusszytometrie (Fluorescence
Activated Cell Sorting, FACS), wie wir es heute kennen, wurde 1975 von Crissman
et al. entwickelt und ermöglicht die simultane Messung physikalischer und
molekularer Eigenschaften von Zellen und Partikeln [16].
Die zu untersuchenden Zellen werden hierbei mit hoher Geschwindigkeit in einem
Flüssigkeitsstrom fließend an einem Laserstrahl vorbeigeführt und so hintereinander
anhand des gestreuten sowie emittierten Lichtes durch verschiedene Fotodetektoren
charakterisiert.
Der Einsatz dieses Messsystems erfolgt in Kombination mit monoklonalen
fluoreszenzmarkierten Antikörpern, die jeweils spezifisch für das zu quantifizierende
Antigen gewählt werden. Hierbei erfolgt die Differenzierung der verschiedenen
Antigen-Antikörper-Komplexe
über
unterschiedliche
Emissionsmaxima
der
Antikörper-Fluoreszenzfarbstoff-Konjugate, sodass eine simultane Analyse mehrerer
extra- und intrazellulärer Stoffe in einer Messung ermöglicht wird. Die Anzahl der
unterschiedlichen, parallel quantifizierbaren Moleküle ist abhängig von der Anzahl
der unterschiedlichen Fotodetektoren, die durch Vorschaltung eines so genannten
Bandpass-Filters jeweils nur für das Emissionsspektrum eines der gekoppelten
Fluoreszenzfarbstoffe durchlässig sind.
Moderne Instrumente erlauben hierdurch die Prüfung von bis zu 20 000 Zellen pro
Sekunde, wobei bis zu 7 Parameter pro Zelle gleichzeitig analysiert und verarbeitet
werden können [93].
- 31 -
3.3.1.2.
Grundaufbau des Durchflusszytometers
Bei dieser Studie wurde im FACScan®-Durchflusszytometer der Firma Becton
Dickinson aus Heidelberg gearbeitet, welches im Arbeitsprinzip und Grundaufbau
gängigen Durchflusszytometern entspricht.
Flüssigkeitssystem
Nach dem Starten der Messung wird die zu untersuchende Einzelzellsuspension in
einer Konzentration von 0,5 bis 20 x 106 Zellen pro Milliliter mittels Überdruck aus
einem Reagenzröhrchen über eine Stahlkapillare in eine aus Quarzglas bestehende
Messküvette befördert. Mit Eintritt in die Messkammer umspült die Probe ein
zugeleiteter Hüllstrom aus isotonischer Trägerlösung und beschleunigt diese
Richtung Messpunkt. Dieser umliegende laminare Trägerflüssigkeitsstrom führt zu
einer Verengung und Auftrennung der Probenflüssigkeit, sodass die Zellen
hintereinander, perlschnurartig, den Laserstrahl im Analysepunkt der Messküvette
durchwandern (Prinzip der hydrodynamischen Fokussierung, siehe Abb. 8 und
Abb. 9).
Zellen und „feste” Probenbestandteile ab einer Größe von ca. 0,5 µm Durchmesser,
die den Laserstrahl im Analysepunkt kreuzen, werden im Bruchteil einer Sekunde
anhand ihrer physikalisch-optischen Eigenschaften über die fünf Fotodetektoren des
FACScan®-Gerätes simultan registriert. Diese Eigenschaften werden in elektronische
Signale entsprechender Pulshöhe übersetzt. Zusammen mit der Trägerlösung werden
die analysierten Zellen nach Austritt aus der Messküvette über ein Schlauchsystem
einem Abfallbehälter zugeführt [79].
In der hier beschriebenen Versuchsreihe wurden bei jeder durchflusszytometrischen
Messung um die 80 000 T-Lymphozyten mit einem Zelldurchsatz von 1 000 bis
2 000 Zellen pro Sekunde analysiert.
- 32 -
Abbildung 8: Illustration des Prinzips der hydrodynamischen Fokussierung im Flüssigkeitssystem
eines Durchflusszytometers
Abbildung 9: Schema des Flüssigkeitssystems eines Durchflusszytometers
- 33 -
Optisches System
Bei dem Laser des verwendeten FACScan®-Durchflusszytometers handelt es sich um
einen 15 mW Argon-Ionen-Laser mit einer Wellenlänge von 488 nm, der durch
Ionisieren eines inerten Argongases in einer Laser-Plasmaröhre entsteht, und nach
prismatischer Filterung als monochromatischer Laserstrahl in die Messküvette
eingespiegelt wird.
Zur Analyse der strukturellen Zellmerkmale wird das Licht des Lasers in zwei
Streulichtkanälen gemessen, dem Vorwärtsstreulicht-Kanal (engl. foreward scatter
(FSC)) und Seitwärtsstreulicht-Kanal (engl. side scatter (SSC)).
Das ausgeprägte Vorwärtsstreulicht wird in Verlängerung der Richtung des
Laserstrahls von einer relativ unempfindlichen Fotodiode detektiert, die Parameter
des schwächeren Seitwärtsstreulichtkanals dagegen als unpolarisiertes kurzwelliges
Licht im rechten Winkel zur Achse des Laserstrahls. Dieses durchläuft zunächst
einen dichroitischen Spiegel, der selektiv Wellenlängenbereiche oberhalb von 560
nm reflektiert, und wird nach späterer Spiegelung an einem Beam-Splitter, welcher
das einfallende Licht in polarisierte und unpolarisierte Anteile aufspaltet, an einer
empfindlichen Fotoröhre gemessen.
Neben den Streulichtkanälen verfügt das FACScan®-Durchflusszytometer zur
Auswertung des emittierten Lichtes über drei Fluoreszenzkanäle (FL 1-3), die, wie
das SSC, aus dem schwächeren Seitwärtsstreulicht bestimmt werden (siehe Abb.10).
FL1
Das Licht des ersten Fluoreszenzkanals (FL1) passiert als relativ kurzwelliges Licht
den dichroitischen Spiegel und fällt nach Polarisierung im Beam-Splitter auf den FL1-Bandpass-Filter, der nur für Licht der Wellenlänge 530 +/- 15 nm durchlässig ist.
FL2
Die Signale des zweiten Fluoreszenzkanals (FL2) werden am dichroitischen Spiegel
rechtwinklig reflektiert und treffen auf einen für 585 +/- 21 nm durchlässigen Filter,
bevor sie vom Detektor für die Fluoreszenz 2 analysiert werden.
- 34 -
FL3
Die Wellenlängen des dritten Fluoreszenzkanals (FL3) werden am dichroitischen
Spiegel rechtwinklig reflektiert und erreichen nach Spiegelung und Durchtritt des
speziellen Bandpass-Filters, durchlässig für alle Wellenlängen oberhalb von 650 nm,
die Fotoröhre für die Fluoreszenz 3.
Abbildung 10: Schema des optischen Systems eines Durchflusszytometers
3.3.1.3.
Analyseparameter
Über die fünf Fotodetektoren des FACScan®-Gerätes werden die Laserstreuung
sowie die Fluoreszenz jeder Zelle simultan registriert.
- 35 -
Messung der Laserstreuung
Das physikalische Phänomen der Lichtstreuung beschreibt die Richtungsänderung
des einfallenden Laserstrahls durch Reflexion an inneren und äußeren Oberflächen
der Zellen oder Partikel, ohne dass sich hierbei die Wellenlänge des Lichtes
verändert.
Die Analyse der Streuung des Laserstrahls an bzw. in den Zellen ermöglicht deren
Einteilung anhand strukturell-morphologischer Merkmale. Hierbei dient das
Vorwärtsstreulicht (FSC) als Maß der Zellgröße, das Seitwärtsstreulicht (SSC) als
Maß der Dichte der Zellbinnenstrukturen (Granularität des Zytoplasmas, Größe und
Beschaffenheit des Zellkerns).
Messung von emittiertem Licht (Fluoreszenz)
Fluoreszenz beschreibt die Eigenschaft bestimmter chemischer Verbindungen,
nachdem sie durch Anregung (z.B. mittels eines Lasers) auf ein höheres
Energieniveau gehoben worden sind, bei ihrem Übergang in den Grundzustand einen
diskreten Teil des Energieunterschiedes in Form von Licht auszusenden. Nach der
Anregung springen die Elektronen unter Abgabe von Energie (in Form von
Photonen)
auf
ihr
Ursprungsniveau
zurück,
wobei
die
dabei
emittierte
Photonenkonzentration proportional zur Menge des Fluoreszenzfarbstoffes ist. Die
gemessene Fluoreszenzintensität kann somit als relatives Maß für die Anzahl an
Antigen-Antikörper-Komplexen pro Zelle verwendet werden.
Eine gleichzeitige FACS-Messung mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen ist
möglich, weil sich die eingesetzten Farbstoffe zwar bei ähnlichen Wellenlängen
anregen lassen, aber über unterschiedliche, für den jeweiligen Farbstoff
charakteristische Emmissionsspektren verfügen, und somit getrennt voneinander
über wellenlängenspezifische Fotodetektoren gemessen werden können.
Um eine Trennung der Fluoreszenzen zu ermöglichen, müssen sich die
Emissionsmaxima der Fluoreszenzfarbstoffe allerdings deutlich voneinander
unterscheiden [79].
Für die durchflusszytometrischen Messungen dieser Studie wurden im Rahmen von
Vorversuchen die geeigneten Fluoreszenzfarbstoff-Kombinationen der drei oben
beschriebenen Fluoreszenzkanäle (FL1-3) bestimmt, um eine möglichst exakte
Analyse zu ermöglichen.
- 36 -
Im Fluoreszenzkanal-1 (530/30) wurde ein FITC (Fluoresceinisothiocyanat)gekoppelter Antikörper mit einem Emissionsmaximum von 530 nm, für den
Fluoreszenzkanal-2 (585/42) ein PE (Phycoerythrin)-gekoppelter Antikörper mit
einem Emissionsmaximum von 575 nm und im Fluoreszenzkanal-3 (>650) sowohl
PerCP (Peridin Chlorophyll Protein) mit einem Emissionsmaximum von 677 nm als
auch das Tandemkonjugat aus Phycoerythrin und Cyan-5, das so genannte Tricolor,
mit einem Emissionsmaximum von 665 nm verwendet (siehe Tab. 3).
Tabelle 3: Die Fluoreszenzkanäle mit ihren entsprechenden Wellenlängen, den
verwendeten Fluoreszenzfarbstoffen mit ihren Emissionsmaxima gegenübergestellt
FL-Kanal (Wellenlängenband)
Fluoreszenzfarbstoff (Emissionsmaximum)
FL -1
(530 +/- 15 nm)
FITC
(530 nm)
FL -2
(585 +/ - 21 nm)
PE
(575 nm)
FL -3
(> 650 nm)
PerCP
(677 nm) / Tricolor (665 nm)
3.3.1.4.
Signalverarbeitung/elektronisches System
Fotodiode
Das Vorwärtsstreulicht wird, da es im Vergleich zum Seitwärtsstreulicht um mehrere
Größenordnungen stärker ist, von einer relativ unempfindlichen Fotodiode detektiert.
Für jedes optische Signal entsteht so ein analoger, proportionaler elektrischer Impuls.
Fotoröhren (eng. photomultiplier, PMT)
Für die Parameter des Seitwärtsstreulichtes (SSC, FL1, FL2, FL3) werden die
optischen Signale von den Fotoröhren in analoge, elektrische Signale umgewandelt
und den Geräteeinstellungen entsprechend, variabel für jeden Kanal, um ein
Vielfaches verstärkt (siehe Kap. 3.3.1.5.).
- 37 -
Die generierten elektrischen Signale der Fotodetektoren werden in einem so
genannten Wandler digitalisiert und können mithilfe eines angeschlossenen
Computers gespeichert und unmittelbar oder auch später ausgewertet werden.
3.3.1.5.
Geräteeinstellungen
Vor der eigentlichen Messung an einem fluoreszenzaktivierten Durchflusszytometer
müssen die Geräteeinstellungen den zu analysierenden Parametern sowie den
verwendeten Fluoreszenzfarbstoffen angepasst werden.
Schwellenwert (threshold)
Der Schwellenwert gibt die Signalintensität an, die eine Einzelmessung erreichen
muss, um als Messung gespeichert zu werden. So können zum Beispiel, durch eine
entsprechende Schwellenwerteinstellung des FSC schon während der Messung zu
kleine Partikel (Zelldebris) von der Messung ausgeschlossen werden.
Signalverstärkung (amplifier)
Das gemessene Signal des schwächeren Seitwärtsstreulichtes wird durch ein
Spannungsfeld in den Fotoröhren verstärkt, um die Auflösung des Messsystems zu
erhöhen und auch kleinste Intensitätsunterschiede der elektrischen Impulse (optische
Signale) differenzierbar zu machen. Man unterscheidet hierbei grundlegend die
lineare Verstärkung; hier ist die Ausgangsspannung des Verstärkers der
Eingangsspannung direkt proportional, von der logarithmischen Verstärkung, bei der
das
Ausgangssignal
sich
proportional
zu
dem
Zehnerlogarithmus
des
Eingangssignals verhält [92].
In dieser Studie wurden wie allgemein üblich die Fluoreszenzkanäle 1-3
logarithmisch und der Seitwärtsstreulichtkanal (SSC) linear verstärkt.
Kompensation
Fluoreszenzfarbstoffe
emittieren
nicht
Licht
streng
einer
Wellenlänge
(monochromatisches Licht), sondern haben ein für den jeweiligen Farbstoff
charakteristisches Spektrum von Wellenlängen (Emissionsspektrum), die sie je nach
Anregung in unterschiedlicher Intensität aussenden.
- 38 -
Trotz Vorschaltung entsprechender Bandpass-Transmissions-Filter (siehe Kap.
3.3.1.2.),
überlappen
die
Emissionsspektren
zweier
parallel
eingesetzter
Fluoreszenzfarbstoffe häufig geringfügig, sodass das Fluoreszenzsignal eines
Farbstoffs nicht nur in den dafür vorgesehenen Kanal bzw. Detektor gelangt, sondern
auch in dem überlappenden Kanal einen schwächeren, aber messbaren Impuls
verursacht. Diese Tatsache beeinträchtigt die Beurteilung der Ergebnisse, da man bei
Mehrfarbanalysen nicht exakt differenzieren kann, welcher Fluoreszenzfarbstoff, und
damit welches gekoppelte Antigen, für welches Signal des Detektors ursächlich ist.
Der Vorgang der Kompensation beschreibt die elektronisch-rechnerische Korrektur
dieses Phänomens, bei der genau der Teil der Emission aus dem „fremden” Kanal
subtrahiert wird, der in den Wellenlängen dem Überlappungsbereich entspricht
(siehe Abb. 11) [79].
Abbildung 11: Fluoreszenzspektren von Phycoerythrin (PE) und Fluoreszeinisothiocyanat
(FITC) mit spektraler Überlappung
Um die genaue Kompensationen und Verstärkungen dieser Versuchsreihe
festzulegen, und damit die Güte der gemessenen Daten zu sichern, wurden im
Rahmen von Vorversuchen die Signale der verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe
zunächst getrennt voneinander und anschließend nach Zusammenführung der Proben
gemeinsam
gemessen.
Die
Abwesenheit
doppelpositiver
Signale
in
den
- 39 -
Vorversuchen ermöglichte eine korrekte Geräteeinstellung des FACScan®Durchflusszytometers.
3.3.1.6.
Grafische Datenauswertung
Je nach Anzahl der zu korrelierenden Parameter sowie Softwareausstattung des
Durchflusszytometers
stehen
verschiedene
Möglichkeiten
der
grafischen
Datendarstellung zur Verfügung. Die gängigsten Grafiken zur Beurteilung der Daten
sind das Histogramm und die korrelierte Zweiparameterdarstellung (Dot-Plot), die
beide auch für die Auswertung der in dieser Studie gewonnenen Daten Anwendung
finden.
Histogramm
Das Histogramm dient als grafisches Mittel zur Abbildung der Häufigkeitsverteilung
eines Merkmals in einer Grundgesamtheit, da die rein numerische Darstellung einer
Verteilung sehr unübersichtlich ist. Die gemessene Parameterverteilung der
Zellpopulation wird hierbei als Balkenreihe abgebildet, deren jeweilige Höhe die
Häufigkeit des Wertes widerspiegelt (siehe Abb. 12).
In den erstellten Histogrammen dieser Versuchsreihe stellt die vertikale Y-Achse die
Anzahl der Zellen der auf der horizontalen X-Achse dargestellten Signalintensität
dar.
Korrelierte Zweiparameterdarstellung (Dot-Plot)
Sollen zwei der gemessenen Merkmale zueinander in Beziehung gebracht werden,
wird häufig die Darstellung in einer Punkt-Wolken-Matrix gewählt. Bei dieser Form
der Abbildung werden die Intensitätsachsen der zwei Parameter gegeneinander
aufgetragen und dort ein Punkt generiert, an der sich die Intensitätswerte der
einzelnen Zellen schneiden (siehe Abb. 13). Aus den Dot-Plot-Diagrammen lassen
sich zudem, sowohl während als auch nach der Messung, einzelne Bereiche
elektronisch
selektieren
und
damit
nur
die
Eigenschaften
einzelner
Zellsubpopulationen untersuchen, sodass nach der Vorauswahl nur ein Teil der
Messereignisse zur Auswertung herangezogen wird.
- 40 -
Das Herausgreifen einzelner Zellgruppen anhand bestimmter Eigenschaften zur
weiteren selektiven Analyse wird als „Gating” bezeichnet.
Das verwendete Durchflusszytometer FACScan® war in der Lage, bis zu fünf
Eigenschaften pro Zelle simultan zu messen und diese für jede Zelle einzeln in der so
genannten 5-Parameter LIST-MODE-Datenaufnahme zu speichern.
Diese Art der Datenspeicherung gestattet die Darstellung der Assoziation beliebiger
Merkmale in späteren Auswertungen, da die Korrelation aller gemessenen Parameter
erhalten bleibt.
Abbildung 12: Prinzip der Histogrammdarstellung
- 41 -
Abbildung 13: Schema der korrelierten Zweiparameterdarstellung (Dot-Plot). Jeder dargestellte
Punkt entspricht dem Messwert von mindestens einer Zelle
3.3.1.7.
Datenbewertung/Datenklassifikation
Störgrößen
Viele der analysierten Zellen weisen in der Durchflusszytometrie aufgrund einiger
Störfaktoren ein messbares Signal in den Fluoreszenzkanälen (FL1-3) auf, obgleich
das nachzuweisende Merkmal bei ihnen nicht oder nur sehr schwach ausgebildet ist.
Bei den zwei wichtigsten Störfaktoren handelt es sich um die Autofluoreszenz sowie
die unspezifische Antikörperbindung.
Autofluoreszenz
Fast alle Zellen besitzen eine geringfügige Autofluoreszenz und emittieren nach
Anregung durch Laserbestrahlung allein aufgrund ihrer chemischen Verbindungen
Licht verschiedener Wellenlängen. Das aufgrund der Autofluoreszenz emittierte
Licht verursacht ein schwaches, aber messbares Signal in den Fluoreszenzkanälen.
- 42 -
Unspezifische Antikörperbindungen
Die fluoreszenzgekoppelten Antikörper binden nicht ausschließlich an die passenden
Antigene (Paratop/Epitop), sondern besitzen auch eine geringe Affinität zu
unspezifischen zellulären Molekülen.
Um die Qualität der Daten zu sichern und aus den relativen Messwerten der
Durchflusszytometrie (semi-)quantitative Aussagen ableiten zu können, müssen die
Fluoreszenzmerkmale bei der Auswertung mithilfe der Isotypenkontrolle in „positiv”
(vorhanden) und „negativ” (nicht vorhanden) klassifiziert werden.
Isotypenkontrolle
Bei der Isotypenkontrolle handelt es sich um einen Zellansatz, der parallel zu den
jeweiligen Messansätzen mit unspezifischen Antikörpern gleicher Klasse, Subklasse
und gebundenem Fluoreszenzfarbstoff wie den in der Messung verwendeten
spezifischen Antikörpern inkubiert wird und so die höchste Fluoreszenz bestimmt,
die eine für das Merkmal negative Zelle noch generieren darf. Die Isotypkontrolle
erfasst dabei die Möglichkeit einer unspezifischen Bindung des Primärantikörpers.
In der hier beschriebenen Versuchsreihe wurde bei jeder durchflusszytometrischen
Untersuchung, für jeden zu untersuchenden Zellansatz, eine Isotypenkontrolle unter
o.g. Vorgehen erstellt. Die Messungen, deren Intensität über den Werten der
Isotypenkontrolle lag, galten dann für diesen Zellansatz als positiv.
3.3.2. Isolation mononukleärer Zellen des peripheren Blutes
(PBMC) als Versuchsmaterial
3.3.2.1.
Abnahme des venösen Blutes
Gesunden Kindern und Jugendlichen verschiedener Altersklassen wurden 5 ml
venöses Vollblut in ein vorher mit 200 µl Heparin-Natrium befülltes Blue MaxTM-Jr.Röhrchen steril abgenommen.
- 43 -
Die Blutentnahmen wurden nur nach vorausgegangener Aufklärung sowie
schriftlicher
Erteilung
des
Einverständnisses
von
den
verschiedenen
Kooperationspartnern der Studie (siehe Kap. 3.1.) durchgeführt.
3.3.2.2.
Transport des Blutes
Im Anschluss an die Blutentnahme erfolgte der unmittelbare Transport der Proben in
das immunologische Labor der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin der RuhrUniversität Bochum im St. Josef-Hospital. Um Temperaturschwankungen zu
vermeiden, vollzog sich der Transport in einer thermoisolierten Transportbox.
3.3.2.3.
Anforderung eines manuellen Differenzialblutbildes
Da die in der FACS-Analyse gewonnenen, prozentualen Messwerte auf absolute
Zellzahlen bezogen werden sollten, wurden von den 5 ml heparinisiertem Vollblut,
300 µl Blut unter der sterilen Arbeitsbank mit einer 200–1000-µl-Finnpipette
entnommen, in ein 1,5-ml-Eppendorfröhrchen überführt und anschließend zur
Erstellung eines manuellen Differenzialblutbildes in das Zentrallabor des St. JosefHospitals übersandt.
3.3.2.4.
Präparative Dichtegradientenzentrifugation
Durch Zentrifugationstechniken lassen sich Bestandteile einer Lösung aufgrund ihrer
unterschiedlichen Sedimentationseigenschaften physikalisch voneinander trennen.
Die Sedimentationsgeschwindigkeit eines Teilchens ist neben den wirkenden
Zentrifugalkräften und dem umgebenden Medium im Wesentlichen von drei
Partikeleigenschaften abhängig: der Partikelmasse, der Partikeldichte (Quotient aus
Masse und Volumen) sowie der Partikelform.
Eine besondere Möglichkeit dieses Trennverfahrens stellt die präparative
Dichtegradientenzentrifugation dar, bei der Zellen ähnlicher Gestalt und Größe
- 44 -
aufgrund geringer Dichteunterschiede voneinander separiert werden können. Die
heterogene Zelllösung wird hierbei vor Zentrifugation mit einer Saccharose- bzw.
Salzlösung unterschichtet, deren Dichte höher als die der zu isolierenden und
niedriger als die der übrigen Zellen ist. Bei der anschließenden Zentrifugation
sedimentieren die einzelnen Zellpopulationen im Zentrifugalfeld so lange, bis die
Dichte der umgebenen Trennlösung ihre eigene überschreitet [9].
Zur Isolation einer möglichst reinen lymphozytären Zellfraktion wurde bei den hier
beschriebenen Versuchen die polysaccharidhaltige Trennlösung Biocoll verwendet.
Diese weist mit 1 077 g/l eine höhere Dichte als Lymphozyten und Monozyten, aber
eine geringere Dichte als Erythrozyten, Granulozyten und tote Zellen auf.
Unter der sterilen Arbeitsbank wurden zunächst die verbleibenden 4,7 ml Blut
mithilfe der Pipettierhilfe und einer serologischen 10-ml-Pipette in ein 50 ml Blue
MaxTM-Röhrchen überführt und zur Verdünnung 15 ml steriles PBS-Dulbecco
hinzugefügt.
Unter das Vollblut-PBS-Gemisch wurden nun langsam ca. 15 ml oben genannter
Biocoll-Trennlösung unter Zuhilfenahme der Pipettierhilfe und einer serologischen
10-ml-Pipette geschichtet und die so erstellte zweiphasige Probe zur Trennung der
Zellbestandteile über dem Dichtegradienten mit 1800 rpm (~ 550 g) für 20 Minuten
in der Omnifuge zentrifugiert. Die Zellen der entstandenen Interphase zwischen
Serum und Biocoll-Trennlösung bestehen zum weit überwiegenden Teil aus
Lymphozyten sowie einigen Monozyten und Granulozyten (10–20%). Sie werden als
periphere mononukleäre Zellen (engl. peripheral blood mononuclear cells, PBMC)
bezeichnet (siehe Abb. 14).
Der entstandene Zellsaum aus PBMCs wurde unter der sterilen Arbeitsbank mit der
Pipettierhilfe und einer serologischen 10-ml-Pipette vorsichtig abpipettiert und in ein
neues 50-ml-Blue-MaxTM-Röhrchen überführt.
- 45 -
Abbildung 14: Prinzip der Schichtbildung im Rahmen der präparativen Dichtegradientenzentrifugation
3.3.3. Reinigung und Aufbereitung der mononukleären Zellen
3.3.3.1.
Neben
Waschschritte
der
mononukleären
Zellfraktion
gelangen
auch
nicht
zelluläre
Blutbestandteile, Lipide und Proteine des Serums in die gewonnene PBMC-Lösung,
die in nachfolgenden Zentrifugations- und Resuspensionsschritten entfernt werden
müssen.
In unserer Versuchsreihe erfolgten hierzu zwei Waschschritte, bei welchen die
mononukleären Zellen unter der sterilen Arbeitsbank mit sterilem PBS-Dulbecco auf
50 ml verdünnt und bei 1300 rpm (~ 350 g) für 10 Minuten sowie 1000 rpm
(~ 300 g) für 15 Minuten in der Omnifuge zentrifugiert wurden. Der jeweils
anfallende wässrige Überstand wurde nach den einzelnen Waschschritten dekantiert
und das am Röhrchenboden liegende Zellpellet durch Aufschütteln resuspendiert.
- 46 -
3.3.3.2.
Zellzahlbestimmung und Einstellung einer definierten
Zellkonzentration im Nährmedium
Nach
Isolation
und
Reinigung
erfolgt
die
Zellzahlbestimmung,
um
die
mononukleären Zellen in eine für die Stimulation geeignete und für jeden Probanden
identische Zellkonzentration zu bringen.
Zu diesem Zweck wurden die mononukleären Zellen unter der sterilen Arbeitsbank
zunächst mit sterilem PBS-Dulbecco unter Zuhilfenahme der Pipettierhilfe und einer
serologischen 10-ml-Pipette auf ein Volumen von 5 ml verdünnt und von dieser
Zelllösung mit einer 2 – 20-µl-Eppendorf-Pipette 10 µl entnommen.
Die 10 µl Zelllösung wurde zu 90 µl Türk'scher Lösung in ein 1,5 ml Eppendorf
Röhrchen gegeben und nach Vermengung auf dem Vortex Schüttler unter dem ZeissDurchlichtmikroskop in der Neubauer-Zählkammer gezählt.
Die absolute Zellzahl der gewonnenen mononukleären Zellen errechnete sich hierbei
mit folgender Formel:
[n (Zellen) = Mittelwert der 4 Zählkammern x 105 x 5 ]
Während des Zählvorgangs wurden die mononukleären Zellen im 50-ml-BlueMaxTM-Röhrchen nochmals nach Verdünnung mit sterilem PBS-Dulbecco auf 25 ml
bei 1300 rpm (~ 350 g) für 10 Minuten, wie oben geschildert, gewaschen und
resuspendiert.
Zu den so aufbereiteten mononukleären Zellen wurde im folgenden Schritt mithilfe
der Pipettierhilfe und einer serologischen 10-ml-Pipette so viel VLE-RPMI-1640Flüssigmedium pipettiert, dass eine Zellkonzentration von 2 x 106 Zellen/ml
Nährmedium entstand. Das zuzufügende Volumen errechnete sich hierbei gemäß der
Formel:
[ v = n (Zellen) / 2 x 106 (Zellen/ml)]
- 47 -
3.3.4. FACS-Analyse der T-Zell-Fraktionen vor Stimulation
Die poststimulatorisch ermittelten TGF-β-Werte werden in der Auswertung der
Messergebnisse auf die jeweilige zelluläre Zusammensetzung der unstimulierten
mononukleären
Zellen
bezogen.
Hierbei
ist
aufgrund
der
bisherigen
Studienergebnisse eine Subpopulation der T-Helfer-Zell-Fraktion, die so genannten
T-Regulatorzellen (siehe Kap. 1.2.), von besonderem Interesse und wird daher als
solche vor Stimulation anhand charakteristischer Oberflächenantigene identifiziert.
3.3.4.1.
Cluster of differentiation
Nach der Entwicklung von Hybridomzelllinien durch Zellfusion von BLymphozyten und Myelomzellen durch César Milstein und Georges Köhler
[52]
bestand 1975 die Möglichkeit zur Herstellung monoklonaler Antikörper definierter
Spezifität und damit der Bedarf einer standardisierten Bezeichnung der über diese
Methode differenzierbaren Zelloberflächenmoleküle.
Die immunphänotypischen Oberflächenmerkmale von Zellen werden daher seit 1982
im so genannten CD-System (engl. Cluster of differentiation) eingeteilt, einer
Nomenklatur, in welcher die gefundenen Zelloberflächenantigene in fortlaufender
Reihenfolge durchnummeriert werden. Die Zahl der verschiedenen CD-Moleküle ist
seitdem auf über 300 gestiegen, wobei es sich in der Regel um membrangebundene,
teilweise zellspezifische Glykoproteine mit unterschiedlichen Funktionen handelt [81].
CD4
CD4 ist ein auf der Zellmembran von T-Helferzellen, T-Regulatorzellen und
Monozyten (Makrophagen) identifizierbares Glykoprotein, welches als Co-Rezeptor
die Bindung der jeweiligen Antigenrezeptoren an die MHC-II-Moleküle (engl. Major
Histocompatibility Complex II) der antigenpräsentierenden Zellen ermöglicht [81].
CD25
Bei dem Oberflächenmolekül CD25 handelt es sich um die α-Kette des
membranständigen Interleukin-2-Rezeptors. Interleukin 2 ist ein Aktivierungs- bzw.
- 48 -
Wachstumsfaktor und wird von den T-Helferzellen nach antigener Stimulation über
den T-Zell-Rezeptor zusammen mit den spezifischen IL-2 Rezeptoren synthetisiert.
Nach Freisetzung vermittelt es autokrin über die eigenen und parakrin über die IL-2Rezeptoren
der
umliegenden
T-Zellen,
B-Zellen
und
Monozyten
einen
Proliferations- und Differenzierungsreiz.
Auf einigen regulatorischen CD4pos-T-Zellen wird CD25 konstitutiv exprimiert,
sodass es in Kombination mit CD4 Verwendung als Oberflächenmarker zur
Differenzierung regulatorischer T-Zell-Fraktionen findet (siehe Kap. 1.2.) [81].
CD45
Das membranständige Glykoprotein CD45 ist eine in verschiedenen Isoformen
vorkommende Tyrosinphosphatase, die auf fast allen kernhaltigen hämatopoetischen
Zellen zu finden ist. Als Phosphatase ist es über Dephosphorylierung
nachgeschalteter Kinasen an der Signaltransduktion zur Aktivierung von T- und BLymphozyten beteiligt. Durch Nachweis der Isoformen lassen sich bei den TLymphozyten Rückschlüsse auf den Funktionszustand der Zelle ziehen. Naive und
ruhende T-Zell-Populationen exprimieren überwiegend CD45RA auf ihrer
Zelloberfläche, welches nach Aktivierung durch die überwiegende Synthese der
CD45RO-Isoform verdrängt wird [77].
Zur quantitativen Analyse der einzelnen T-Zell-Fraktionen vor Stimulation wurden
mithilfe der 50–200-µl-Eppendorf-Pipette 2 x 100 µl aus der Zell-Nährlösung in
jeweils ein FACS-Röhrchen überführt und darauffolgend über die 0,5–10-µlEppendorf-Pipette die fluoreszenzmarkierten Antikörper anhand eines festen
Schemas den zwei Ansätzen zugegeben (siehe Tab. 4).
Tabelle 4: Schema der Antikörperfärbung, FACS-Analyse der T-Zell-Fraktionen vor
Stimulation
FITC-gekoppelt
PE-gekoppelt
PerCP-gekoppelt
Mess-Ansatz
5 µl - CD45 RA
10 µl - CD25
5 µl - CD4
Kontroll-Ansatz
5 µl - Isotyp-Kontr.
5 µl - Isotyp-Kontr.
5 µl - Isotyp-Kontr.
- 49 -
Zur homogenen Antikörperanlagerung wurden die FACS-Röhrchen bei 4 °C für 15
Minuten im dunklen Liebherr-Kühlschrank gelagert und anschließend mit jeweils
1 ml PBS-0,1%-Azid bei 1000 rpm (~ 300 g) für 5 Minuten in der Omnifuge
gewaschen. Nach Resuspension der Zellpellets und Hinzugabe von jeweils 250 µl
PBS-0,1%-Azid konnten die Proben im Durchflusscytometer FACScan® unter den in
Vorversuchen festgelegten Geräteeinstellungen (siehe Kap. 3.3.1.5.) gemessen
werden (siehe Tab. 5 und Tab. 6).
Tabelle 5: Messeinstellungen der Fotodetektoren, FACS-Analyse der T-ZellFraktionen vor Stimulation
FSC
SSC
FL1
FL2
FL3
Verstärkungsspannung
-
380 Volt
620 Volt
625 Volt
788 Volt
Verstärkungsmodus
linear
linear
Schwellenwert
150
52
logarithmisch logarithmisch logarithmisch
52
52
52
Tabelle 6: Kompensation der Fluoreszenzkanäle, FACS-Analyse der T-ZellFraktionen vor Stimulation
Kompensationsrichtung FL1 → FL2
0,5 %
Kompensationsstärke
FL2 → FL1
FL2 → FL3
FL3 → FL2
28,1 %
0,3 %
25,4 %
Während der durchflusszytometrischen Messungen der mononukleären Zellen beider
Ansätze wurde in der korrelierten Zweiparameterdarstellung (Dot-Plot) anhand der
Scattereigenschaften
(FSC,
SSC)
die
für
unstimulierte
Lymphozyten
- 50 -
charakteristische Region (R1) herausgegriffen (Live-Gating, 2.3.1.6.) und isoliert aus
dieser Region die fünf FACS-Parameter von jeweils 80 000 Zellen gemessen
(siehe Abb. 15).
Abbildung 15: Analysefenster R1 für unstimulierte Lymphozyten im Dot-Plot-Diagramm SSC
über FSC
Auswertung
Zur Auswertung der Listenmodus-Daten des Analysefensters für unstimulierte
Lymphozyten
(R1)
wurde
zunächst
mithilfe
der
Isotypenkontrollen
der
neg
Kontrollansätze die Signalintensität festgelegt, die CD4 -Zellen über unspezifische
Antikörperbindung
und
Autofluoreszenz
maximal
generieren
können
(Isotypenkontrolle 2.3.1.7.). Diese Signalintensität galt im nächsten Schritt als
Schwellenwert zur Differenzierung zwischen der CD4pos und der CD4neg-Zellfraktion
(siehe Abb. 16).
Die Listenmodus-Daten der vor unserer Fragestellung relevanten unstimulierten
CD4pos-Zellen wurden zur weiteren Auswertung mittels eines nachgeschalteten
Analysefensters, der Region 2 (R2 aus R1), herausgegriffen und in einem weiteren
Schritt in einem Dot-Plot-Diagramm FL2 (CD25) über FL3 (CD45RA) dargestellt.
Die Isotypenkontrolle gestattete nach Übernahme der Intensitäts-Schwellenwerte die
Differenzierung der CD45RApos- von CD45RAneg-CD25pos-R2-Zellfraktion (siehe
Abb. 17).
- 51 -
A
B
Abbildung 16: A – Histogrammdarstellung der Isotypenkontrolle zur Festlegung des IntensitätsSchwellenwertes des Analysefensters R2. B – Darstellung der während der Messung innerhalb
dieser Region detektierten CD4pos-Lymphozyten
Abbildung 17: Dot-Plot-Diagramm der Kanäle FL2 (CD25) über FL3 (CD45RA) aus dem
Analysefenster R2 (CD4pos)
Die zur Auswertung verwendete Software ermöglichte die Umwandlung der
dargestellten Verhältnisse in Zahlenwerte, die zur weiteren statistischen Auswertung
probandenbezogen im Studienordner festgehalten wurden.
- 52 -
3.3.5. Aktivierung und Vorbehandlung der mononukleären
Zellen
Um die Kapazität der TGF-β-Synthese jeder einzelnen Zelle in der nachfolgenden
FACS-Analyse quantifizieren zu können, müssen die mononukleären Zellen der
Zell-Nährlösung zur Produktion ihrer spezifischen Zytokinmuster angeregt und
parallel zum Erhalt des Zellbezugs der Export synthetisierter Proteine in den
Extrazellulärraum inhibiert werden.
3.3.5.1.
Stimulation der mononukleären Zellen
Neben der in-vivo ablaufenden antigenspezifischen Stimulation können TLymphozyten in-vitro unter Kostimulation mit Phorbol-12-Myristat-13-Acetat
(PMA) und Ionomycin aktiviert werden.
Hierbei wird der Großteil des Signalwegs, ausgehend vom T-Zell-RezeptorKomplex, umgangen und intrazellulär die Endstrecke der Signalkaskade direkt
beeinflusst
[103]
. Im Vergleich zur physiologischen, rezeptorgekoppelten Stimulation
kommt es dabei zu einer maximalen Lymphozytenaktivierung und einer gezielten
Modulation der aktivierten Signalwege [89].
Ionomycin
Bei Ionomycin handelt es sich um ein aus dem Bakterium Streptomyces conglobatus
isoliertes Calcium-Ionophor, das Calcium im Komplex 1:1 bindet und so einen
Transport über lipophile, biologische Membranen ermöglicht. Der über diesen
Mechanismus realisierte Einstrom an Calciumionen führt, neben der Öffnung von
calciumabhängigen Calciumkanälen in der Plasmamembran und damit Verstärkung
des Signals [65], zu einer Aktivierung calciumsensitiver Proteine, wie der
Serin/Threonin-Phosphatase Calcineurin
und
der Proteinkinasen
der PKC-
Familie [6, 15] .
- 53 -
Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA)
Als Phorbolester ähnelt PMA in seiner Struktur dem Signalmolekül 1,2Diacylglycerol (DAG), welches in der Signalkaskade als Nebenprodukt der
Freisetzung von Inositol-Triphosphat (IP3) aus dem gemeinsamen Precursors
Phosphatidylinositol-4,5-biphosphat (PIP2) entsteht. Wie unter physiologischen
Bedingungen 1,2-Diacylglycerol, so induziert das Strukturanalogon PMA unter der
Anwesenheit von Calciumionen die Aktivierung der Proteinkinase C [6].
Die über PMA und Ionomycin in-vitro aktivierten Kinase-Systeme führen ihrerseits
zur
enzymatischen
Aktivierung
nachgeschalteter
Proteine
und
damit
zur
Mobilisierung unterschiedlicher Transkriptionsfaktoren, wie beispielsweise NF-AT
(Nuclear Factor of Activated T cells) oder NF-κB (Nuclear Factor κB), die dann über
die von ihnen vermittelte Transkription diverser Gene im Zellkern die ersten Schritte
der Proteinbiosynthese realisieren [6, 15] (siehe Abb.18).
Abbildung 18: Intrazelluläre Signalkaskaden des T-Zell-Antigenrezeptors und die Bedeutung der
Calciummobilisierung für die Lymphozyten-Proliferation (modifiziert nach Berridge et al., 2000)
- 54 -
In der hier beschriebenen Versuchsreihe wurde 1 ml der Zell-Nährlösung (2 x 106
Zellen/ml) unter der sterilen Arbeitsbank mithilfe der 200–1000-µl-innpipette in ein
„Well” der MultiwellTM-24-Loch-Kulturplatte überführt und anschließend, unter
Zuhilfenahme der 2–20-µl-Eppendorf-Pipette, mit
- 20 µl einer 1-µg/ml-PMA-Lsg. und
- 10 µl einer 25-µg/ml-Ionomycin-Lsg. versehen.
3.3.5.2.
Blockade des Proteintransports der mononukleären Zellen
In Anlehnung an die von T. Jung et al. 1993 beschriebene Methode
[46]
wurde der
intrazelluläre Proteintransport auf Höhe des Golgiapparats in Gegenwart des
Natrium-Ionophors Monensin blockiert und so, neben der Verbesserung des
Signal/Rausch-Verhältnisses, auch die Beurteilung der Syntheseleistung jeder
einzelnen Zelle in der folgenden FACS-Analyse ermöglicht.
Monensin
Wie bei Ionomycin, so handelt es sich auch bei Monensin um ein von Bakterien
synthetisiertes Ionophor, ein Molekül, das geladene Ionen durch lipophile
Membranen
transportiert.
Monensin
wird
vom
Bakterium
Streptomyces
cinnamonensis gebildet, bindet als Natrium-Ionophor Na+-Ionen in einem
fettlöslichen Komplex und ermöglicht deren Transport über biologische Membranen.
Durch den irregulären Kationenaustausch kommt es zur Veränderung der an den
Membranen vorherrschenden Ionengradienten und somit zur Beeinträchtigung der
Membranfunktionen. Die Ionenverschiebungen führen u.a. im Golgiapparat zu einer
Störung der Membranverschmelzung und damit zur Blockade des Proteintransports
der synthetisierten Proteine zur Zellmembran, ohne dass es dabei zu einer Störung
der „de novo” Proteinbiosynthese kommt
[84]
. Die intrazelluläre Akkumulation der
nach Stimulation fortlaufend synthetisierten Proteine ermöglicht deren zellbezogenen
Nachweis in der fluoreszenzaktivierten Durchflusszytometrie.
- 55 -
Zur Hemmung des Golgiapparats und damit des Proteintransports wurde unter der
sterilen Arbeitsbank einem Milliliter der mit Stimulanzien versehenen ZellNährlösung, mithilfe der 2–20-µl-Eppendorf Pipette
- 10 µl einer 176-µg/ml-Monensin-Lsg. beigefügt.
Die behandelten Zellen wurden nach sicherem Verschluss der MultiwellTM-24-LochKulturplatte bei 37 °C, einem CO2-Gehalt von 8 % und einer Luftfeuchtigkeit von
100 % für einen Zeitraum von 24 Stunden im Brutschrank inkubiert.
Unter Anwendung der 200–1000-µl-Finnpipette erfolgte nach Ablauf der 24 Stunden
die Überführung der Zell-Nährlösung in ein 12-ml-Polystyrol-Reagenzglas, wobei
vor der Entnahme die am Boden liegenden Zellen ausgiebig vermischt wurden.
Nach Verdünnung des Gemisches mit PBS-Dulbecco auf ein Gesamtvolumen von 10
ml wurden in einem weiteren Waschschritt, bei 1300 rpm (~ 350 g) für 10 Minuten,
sowie anschließendem Dekantieren des Überstandes, die stimulierten Zellen von
verbrauchten Nährlösungsbestandteilen getrennt.
3.3.6. Messung der TGF-β-Produktion unter Stimulation
Der
zellbezogene
durchflusszytometrische
Nachweis
des
im
Golgiapparat
akkumulierten TGF-β erfordert den intrazellulären Eintritt von TGF-β-spezifischen,
fluoreszenzmarkierten Antikörpern, ohne dass es hierbei zur Veränderung der
Scattereigenschaften bzw. Oberflächenantigenität durch Zerstörung der Zellmembran
oder Austritt von Zellbestandteilen kommt [44].
Der von Sander et al.
[87]
1991 beschriebenen Methodik folgend, gelang der
Nachweis des intrazellulär gespeicherten TGF-β nach Fixierung der Zellstrukturen
mit Paraformaldehyd und anschließender Permeabilisierung der Zellmembranen mit
Saponin (siehe Abb. 19 und Abb. 20).
- 56 -
3.3.6.1.
Fixierung der stimulierten mononukleären Zellen
Vor Permeabilisierung der Zellmembranen bedarf es einer Fixierung der
Zellbestandteile, um die Zellstrukturen über eine chemische Polymerisation zu
stabilisieren und hierdurch die Zelllyse und den Verlust der Zellbestandteile zu
verhindern.
Paraformaldehyd
Unter Hitze spaltet sich das pulverförmige kurzkettige Polymer Paraformaldehyd in
hydrophiles Methanal auf, das so genannte Formaldehyd, welches in wässrigen
Lösungen zu annähernd 100 % als Aldehydhydrat (Formalin) vorliegt.
Formalin führt über die irreversible Vernetzung der Proteine und deren Seitenketten
zur Denaturierung und Stabilisierung der eiweißhaltigen biologischen Strukturen.
Lösliche Proteine wie die zu untersuchenden Zytokine präzipitieren bei dieser
Reaktion größtenteils und werden über die Verkettung mit anderen Proteinen
immobilisiert. Der Antigenverlust nach Permeabilisierung wird durch die Fixierung
mit
Formalin
auf
ein
Minimum
reduziert
[51]
.
Rein
lipid-
und/oder
kohlenhydrathaltige Moleküle bleiben von der Formalinwirkung unbeeinflusst.
Zur Fixierung der mononukleären Zellen wurde das am Boden liegende Zellpellet
nach Zugabe von 500 µl gekühlter Formaldehyd-Lösung mithilfe der 200–1000-µlFinnpipette intensiv vermengt und anschließend bei Raumtemperatur für 10 Minuten
inkubiert. Die Polymerisationsreaktion wurde durch Verdünnung mit PBS-Dulbecco
auf 10 ml gestoppt und das überschüssige Formalin in einem weiteren Waschschritt
bei 1300 rpm (~ 350 g) für 10 Minuten und durch Dekantieren des Überstandes
entfernt.
3.3.6.2.
Permeabilisierung der stimulierten und fixierten
mononukleären Zellen
Phospholipid-Membranen, die alle Kompartimente einer Zelle abgrenzen, sind nur
für Gase und sehr kleine ungeladene lipophile Moleküle permeabel.
- 57 -
Ohne entsprechende Vorbehandlung wären daher intrazelluläre Antigene für
markierende Antikörper nicht zugänglich, da die Zellmembranen eine für
Makromoleküle unüberwindbare Barriere darstellen. Mithilfe spezieller chemischer
Detergenzien können Lipidmembranen für solche Moleküle durchlässig gemacht
werden.
Saponin
Bei dem steroidbasierten Detergens Saponin handelt es sich um ein von höheren
Pflanzen synthetisiertes Glykosid, das sich aufgrund seiner hohen Affinität zu
Cholesterin in die Phospholipiddoppelschicht von Zellmembranen einfügt und dort
zu einer reversiblen Erhöhung der Durchlässigkeit für größere Moleküle führt
Saponinvermittelt entstehen reversible Perforationen im
[87]
.
Lipid-Bilayer, die
elektronenmikroskopisch als ringförmige Komplexe mit einer 8 nm großen zentralen
Öffnung erkennbar sind, und zur Einschleusung von Antikörpern in die Zelle genutzt
werden können [91].
Die Behandlung mit Saponin hat dabei keine Veränderung der Scattereigenschaften
oder
der
Oberflächenantigenität
zur
Folge,
was
für
die
simultane
durchflusszytometrische Messung von membranständigen und intrazellulären
Antigenen von entscheidender Bedeutung ist
[44]
. Abb.13 verdeutlicht schematisch
die Permeabilisierung der stimulierten und fixierten mononukleären Zellen.
Zur Permeabilisierung der stimulierten und fixierten mononukleären Zellen wurde
dem Ansatz mithilfe der 200–1000-µl-Finnpipette 1,5 ml Saponin-Lösung
hinzugegeben und kurz bei Raumtemperatur inkubiert.
Es folgte ein weiterer Waschschritt nach Verdünnung mit PBS-Dulbecco auf 10 ml
und Zentrifugation bei 1000 rpm (~ 300 g) für 5 Minuten sowie Dekantieren des
Überstandes. Schließlich wurde das frische Zellpellet unter Zuhilfenahme der 200–
1000-µl-Finnpipette erneut in 500 µl Saponin-Lsg. aufgenommen und resuspendiert.
- 58 -
Abbildung 19: Schematische Illustration des Funktionsprinzips der Fixierung mononukleärer
Zellen durch irreversible Vernetzung der Proteine und deren Seitenketten mittels Formalin
Abbildung 20: Schematische Illustration des Funktionsprinzips der Zellpermeabilisierung
mononukleärer Zellen mittels Saponin
3.3.6.3
Neben
FACS-Analyse des intrazellulär fixierten TGF-β
der
Messung
Durchflusszytometrie
des
die
intrazellulär
Fraktion
der
fixierten
TGF-β
T-Lymphozyten
wird
anhand
in
der
ihrer
Oberflächenantigenität (siehe Kap. 3.3.4.1.) identifiziert.
CD3
Bei dem Immunmarker CD3, einem auf allen T-Lymphozyten vorkommenden
Oberflächenantigen, handelt es sich um einen Protein-Komplex aus den
- 59 -
membranständigen Heterodimeren CD3ε:CD3δ und CD3ε:CD3γ, die in Assoziation
mit
einem
zytoplasmatisch
gerichteten
Homodimer
ζ:ζ
die
Zellmembran
durchspannen. Zusammen mit dem T-Zell-Rezeptor bilden die Polypeptidketten des
CD3-Komplexes den so genannten T-Zell-Rezeptorkomplex (TCR-CD3-Komplex),
der in-vivo, nach Bindung des spezifischen Antigens am passenden T-Zell-Rezeptor,
die intrazellulär gerichtete Signaltransduktion realisiert
[26, 106]
. Im Gegensatz zum
hochvariablen T-Zell-Rezeptor ist die Antigenstruktur des Oberflächenmerkmals
CD3 konstant und kann daher zur immunphänotypischen Identifizierung von
T-Lymphozyten verwendet werden.
Zur quantitativen Analyse der TGF-β-Synthese und Identifizierung der T-Zellen
unter Stimulation wurden mithilfe der 50–200-µl-Eppendorf-Pipette 3 x 100 µl aus
dem Probenröhrchen in jeweils ein FACS-Röhrchen überführt und darauffolgend
mittels der 0,5–10-µl-Eppendorf-Pipette die fluoreszenzmarkierten Antikörper nach
einem festen Schema zugegeben (siehe Tab. 7).
Zur homogenen intrazellulären Antikörperanlagerung wurden die FACS-Röhrchen
bei 4 °C für 15 Minuten im dunklen Liebherr-Kühlschrank gelagert und
anschließend, zur Entfernung der ungebundenen überschüssigen Antikörper, mit
jeweils 1,5 ml Saponin-Lsg. bei 1000 rpm (~ 300 g), für 5 Minuten in der Omnifuge
gewaschen.
Tabelle 7: Schema der Antikörperfärbung, FACS-Analyse des intrazellulär fixierten
TGF-β
PE-gekoppelt
PerCP-gekoppelt
Mess-Ansatz
10 µl - TGF-β
3,5 µl - CD3
Kontroll-Ansatz I
10 µl - Isotyp-Kontr.
3,5 µl - CD3
Kontroll-Ansatz II
10 µl - Isotyp-Kontr.
5 µl - Isotyp-Kontr.
- 60 -
Nach Resuspension der Zellpellets und Hinzugabe von jeweils 250 µl PBS-0,1%Azid konnten die Proben im Durchflusszytometer FACScan® unter den in
Vorversuchen festgelegten Geräteeinstellungen (siehe Kap. 3.3.1.5.) gemessen
werden (siehe Tab. 8 und Tab. 9).
Tabelle 8: Messeinstellungen der Fotodetektoren, FACS-Analyse des intrazellulär
fixierten TGF-β.
FSC
SSC
FL2
FL3
Verstärkungsspannung
-
380 Volt
522 Volt
570 Volt
Verstärkungsmodus
linear
linear
logarithmisch
logarithmisch
Schwellenwert
180
52
52
52
Tabelle 9: Kompensation der Fluoreszenzkanäle, FACS-Analyse des intrazellulär
fixierten TGF-βs
Kompensationsrichtung
FL2 → FL3
FL3 → FL2
Kompensationsstärke
1,6 %
12,0 %
Während der durchflusszytometrischen Messungen der mononukleären Zellen aller
Ansätze wurde anhand der Scattereigenschaften (FSC, SSC) die für stimulierte
Lymphozyten charakteristische Region (Region 1) herausgegriffen (Live-Gating,
siehe Kap. 3.3.1.6.) und isoliert aus dieser Region die FACS-Parameter von jeweils
80 000 Zellen gemessen (siehe Abb. 21).
- 61 -
Abbildung 21: Analysefenster R1 für stimulierte Lymphozyten im Dot-Plot-Diagramm
Auswertung
Bei der Auswertung der Listenmodus-Daten des Analysefensters für stimulierte
Lymphozyten wurden zunächst die gewonnenen Werte der Region 1 des
Messansatzes in einem Dot-Plot-Diagramm FL2 (TGF-β) über FL3 (CD3)
dargestellt. Mithilfe der CD3-Isotypenkontrolle (siehe Tab. 7) konnte im nächsten
Schritt die Signalintensität festgelegt werden, die CD3neg-Zellen über unspezifische
Antikörperbindung und Autofluoreszenz maximal generieren können (nicht
dargestellt, siehe Kap. 3.3.1.7.) und so der CD3pos- und CD3neg-Zellfraktion ein
Analysefenster zugeordnet werden, Region 2 (R1 + R2) für CD3pos- und Region 3
(R1 + R3) für CD3neg-Zellen (siehe Abb. 22).
Abbildung 22: Dot-Plot-Diagramm der Kanäle FL2 (TGF-β) über FL3 (CD3) ohne und mit
Analysefenster R2 (CD3pos) und R3 (CD3neg)
- 62 -
Mithilfe der TGF-β-Isotypenkontrolle (siehe Tab. 7) konnte nun die Signalintensität
festgelegt werden, die CD3neg- und CD3pos-Zellen über Bindung unspezifischer PEgekoppelter Antikörper und Autofluoreszenz im FL Kanal 2 maximal generieren
können (siehe Abb.23).
Abbildung 23: Dot-Plot-Diagramm der TGF-β-Isotypenkontrolle zur Festlegung des IntensitätsSchwellenwertes beider Analysefenster (CD3neg , R5) und (CD3pos, R4)
Der ermittelte Intensitäts-Schwellenwert konnte nun in die Darstellung des
Messansatzes übernommen werden und gestattete eine Differenzierung zwischen der
TGF-βpos- und TGF-βneg-Zellfraktion beider Analysefenster (siehe Abb. 24).
Abbildung 24: Dot-Plot-Diagramme der Messansätze mit TGF-βpos-Zellen der beiden
Analysefenster (R2, CD3pos; R3, CD3neg) unter Zuhilfenahme der Isotypenkontrolle
- 63 -
Die zur Auswertung verwendete Software ermöglichte die Umwandlung der
dargestellten Verhältnisse in Zahlenwerte, die zur weiteren statistischen Auswertung
probandenbezogen im Studienordner festgehalten wurden.
3.3.7. Darstellung und statistische Analyse der Ergebnisse
Die bei den Versuchen gewonnenen Daten wurden im Anschluss anonymisiert und
personenbezogen digital gespeichert. Zur weiteren Auswertung wurde die StatistikSoftware GraphPad prism 4.0 (GraphPad prism, GraphPad Software, San Diego,
CA) verwandt. Prism ist eine Software zur wissenschaftlichen Datenanalyse,
Präsentation, Kurvenanpassung und Erstellung von wissenschaftlichen Grafiken.
Die Software erlaubte die grafische Auftragung sowie eine genaue statistische
Analyse mit Berechnung aller statistischer Standardparameter, wie Slope, Yintercept, X-intercept, 1/slope, 95% Confidence Intervals, r², F, DFn, DFd und P
value. Als statistisch signifikant wurden p-Werte von p ≤ 0,05 angenommen.
Die grafische Darstellung aller Ergebnisse wurde ebenfalls mit GraphPad Prism 4
vorgenommen.
3.3.8. Qualitätskontrolle
Ausschluss ungeeigneter Probanden:
Nach Prüfung der Eignung von über 200 Kindern und Jugendlichen eines
chirurgischen Patientenkollektivs mit primär nicht-entzündlichen Krankheitsbildern,
konnten insgesamt 147 Probanden, den Ausschlusskriterien entsprechend, als
geeignet beurteilt werden. 53 Probanden mussten, zumeist aufgrund entzündlicher
Blutbildveränderungen (Leukozytose/CrP-Anstieg), aber häufig auch aufgrund
atopischer Belastung oder familiärer Vorbelastung aus der Gruppe der geeigneten
Probanden
entfernt
werden.
Nach
Aufklärung
erfolgte
die
schriftliche
Einverständniserklärung von 126 der 147 als geeignet bewerteten Probanden.
- 64 -
Ausschluss ungeeigneter Proben:
Die Proben von 126 Probanden konnten zur weiteren Analyse in die
Laborexperimente überführt werden. Im Rahmen der Verarbeitung mussten
insgesamt 17 Proben aufgrund akzidenteller Abweichungen vom Laborprotokoll
verworfen werden.
Ausschluss ungeeigneter/unzureichender Daten:
Bei abschließender Sichtung der 109 gewonnenen Datensätze mussten die Daten von
insgesamt
9
Probanden
aufgrund
unvollständiger
bzw.
nicht
eindeutiger
anamnestischer Angaben aus dem Datenkollektiv, noch vor der Auswertung, entfernt
werden.
Die Daten von insgesamt 100 Probanden konnten nach diesem Prozedere der
statistischen Auswertung zugeführt werden und liegen den hier aufgeführten
Ergebnissen zu Grunde.
3.3.9. FACS-Messungen nach magnetischer Zellsortierung
Vor den Erkenntnissen der letzten Jahre erscheint ein hoher Anteil TGF-βpos-Zellen
in der Fraktion der CD4pos-CD25pos-regulatorischen T-Zellen plausibel (siehe Kap.
1.2.2.). Zur näheren Beantwortung der Frage des Ursprunges des in den oben
genannten Versuchsreihen gemessenen TGF-βs wurde eine separate Versuchsreihe
mit einer der FACS-Analyse vorangestellten Isolierung der CD4pos-CD25posregulatorischen T-Zellen unter Zuhilfenahme eines Magnetic Cell-Sorters (MACS®)
durchgeführt.
Als Material dieser Versuchsreihe wurden eine Blutprobe aus Nabelschnurblut eines
gesunden Neugeborenen und eine venöse Blutprobe eines gesunden Erwachsenen
verwandt.
- 65 -
3.3.8.1
Grundlagen der magnetischen Zellsortierung
Auf Grundlage der von Melville im Jahre 1975 beschriebenen Methode lassen sich
einzelne
Zellpopulationen
einer
heterogenen
Zellsuspension
anhand
ihrer
Oberflächenmoleküle (Cluster of differentiation, CD) effektiv voneinander
separieren [66].
Das Prinzip der Zelltrennung beruht auf der Markierung der zu gewinnenden
Zellpopulation
mit
hochspezifischen,
gegen
die
CD-Oberflächenmoleküle
gerichteten, monoklonalen Antikörpern, welche zur anschließenden Isolation mit
superparamagnetischen Partikeln gekoppelt sind. Wird eine Zellsuspension mit den
jeweiligen magnetisierten Antikörpern inkubiert, durch eine mit Stahlwolle gefüllte
Säule geführt und ein Magnetfeld angelegt, so werden die markierten, gebundenen
Zellen in der Säule festgehalten, während nicht markierte hindurchfließen. Die
Zellsortierung kann, bei Markierung der Zielpopulation, als so genannte
"Anreicherung" sowie auch, bei Markierung aller uninteressanten Zellpopulationen,
als so genannte "Depletion" durchgeführt werden. In Abbildung 25 ist das Prinzip
der Methode schematisch dargestellt.
3.3.8.2
Isolation der CD4pos-CD25pos-Regulatorzellen im MACS®
Die Isolation der CD4pos-CD25pos-Regulatorzellen dieser Versuchsreihe wurde mit
einem MACS®-Gerät der Firma Miltenyi Biotech aus Bergisch Gladbach
durchgeführt.
Die Versuchsdurchführung entsprach der beiliegenden Versuchsanleitung des
"human CD4pos-CD25pos Regulator T-Cell Isolation Kit" der Firma Milentyi Biotech.
- 66 -
Abbildung 25: Schematische Illustration des Funktionsprinzips der magnetischen Zellseparierung.
I) Das Zellgemisch wird mit magnetgekoppelten Antikörpern inkubiert. Die Antikörper binden
spezifisch an das gesuchte Antigen. II) Die Zellen werden in der Säule einem Magnetfeld
ausgesetzt. Markierte Zellen werden vom Magnetfeld zurückgehalten, nicht markierte Zellen
fließen hindurch. III) Die zurückgehaltenen Zellen können nach Entfernen des Magnetfelds aus
der Säule eluiert werden
3.3.8.3
Stimulation, Permeabilisierung und FACS-Messung der
CD4pos-CD25pos-Regulatorzellen
Die nach Isolation der CD4pos-CD25pos-Regulatorzellen durchgeführte Stimulation,
Fixierung, Permeabilisierung und durchflusszytometrische Messung des Anteils
TGF-βpos-Zellen erfolgte entsprechend der ab Kapitel 3.3.5. beschriebenen
Versuchsanleitung. Die zur Auswertung verwendete Software ermöglichte die
Umwandlung der dargestellten Verhältnisse in Zahlenwerte, die zur weiteren
statistischen Auswertung probandenbezogen im Studienordner festgehalten wurden.
- 67 -
4.
Ergebnisse
4.1. Vorversuche
Zur Sicherung der Vergleichbarkeit und damit der Validität der gewonnenen Daten
wurde vor Beginn der Experimente ein umfassendes Laborprotokoll entworfen. In
diesem wurde die zeitliche wie praktische Abfolge aller laborexperimenteller
Einzelschritte detailliert vorgegeben. Zur Erstellung des Laborprotokolls bedurfte es
einiger methodischer Überlegungen sowie Vorversuche.
4.1.1. Lagerungszeit der Blutproben
Aus praktischen Gründen galt es zunächst die maximale Lagerungszeit des venösen
Blutes
und
damit
den
erforderlichen
Zeitpunkt
der
laborexperimentellen
Weiterverarbeitung zu definieren. Durch Aufteilung vorab gewonnener venöser
Blutproben und separate Weiterverarbeitung einer jeden Probe zu den Zeitpunkten: 1
Stunde, 4 Stunden, 8 Stunden, 12 Stunden, 16 Stunden, 24 Stunden, 48 Stunden nach
Blutentnahme konnte eine maximale Lagerungszeit bis zur Beeinträchtigung der
Messergebnisse bestimmt weden. Obschon sich Veränderungen durch abweichende
Messergebnisse erst bei einer Lagerungszeit von ca. 48 Stunden bemerkbar machten,
wurde die maximal tolerable Lagerungszeit der venösen Blutproben in unseren
Versuchen auf 12 Stunden definiert.
4.1.2. Durchflusszytometrische Messungen
Der Fragestellung entsprechend wurden im Rahmen der Vorversuche zunächst die
mit dem hier verwendeten FACScan®-Durchflusszytometer parallel analysierbaren
Oberflächenmarker
sowie
entsprechenden
Antikörper-
und
Fluoreszenz-
farbstoffkombinationen definiert. Es konnten zufrieden stellende durchflusszytometrische Messergebnisse sowohl für alle gewünschten Oberfächenmarker
- 68 -
(CD3, CD4, CD25, CD45RA) als auch für TGF-β mit den gewählten
Fluoreszensfarbstoffen erreicht werden (siehe Tab. 4 sowie Tab. 7).
Vor dem Hintergrund der gewünschten Identifizierung der TGF-βpos- (CD4posCD25pos-) T-Regulatorzellen wurde versucht, diese nach Stimulation mit
PMA/Ionomycin im Zellpool durchflusszytometrisch abzugrenzen. Dies erwies sich
aus messmethodischen Gründen in unseren Vorversuchen als nicht valide. Die
unspezifische Aktivierung aller peripheren mononukleären Zellen durch Stimulation
führte zu einer zusätzlichen Expression von CD25 auch auf „nicht-regulatorischen”
Zelltypen (siehe Kap. 1.2.) und verhinderte so eine exakte durchflusszytometrische
Abgrenzung einer CD4pos-CD25pos-regulatorischen Zellfraktion.
Die Durchführung einer der FACS-Analyse vorgeschalteten Isolation der CD4posCD25pos-regulatorischen Zellen mittels MACS®-Separation erwies sich vor dem
angestrebten Probandenumfang als nicht finanzierbar.
Eine elegante Lösung stellt die von uns angewandte Zweiteilung der Messungen in je
eine durchflusszytometrische Analyse vor und nach Stimulation dar. Dabei wurde
der relative Anteil an reifen CD4pos-CD25pos-CD45RAneg-T-Regulatorzellen vor
Stimulation mit der jeweiligen Anzahl an TGF-βpos-T-Lymphozyten nach
Stimulation verglichen.
Zur zusätzlichen Bestätigung der Validität der hierbei gewonnenen Daten führten wir
eine separate Versuchsreihe, mit einer der FACS-Analyse vorangestellten Isolation
der CD4pos-CD25pos-regulatorischen T-Zellen im Magnetic Cell-Sorter (MACS®),
mit insgesamt zwei Blutproben durch (siehe Kap. 3.3.9.).
- 69 -
4.2. Analyse der Zellfraktionen
Das manuelle Differenzialblutbild in Kombination mit der vor Stimulation
durchgeführten
FACS-Analyse
einiger
Oberflächenmarker
der
peripheren
mononukleären Zellen (siehe Kap. 3.3.4.) ermöglichte die Erfassung wichtiger
Zellpopulationen.
4.2.1. Leukozyten-/Lymphozytenfraktionen mit
charakteristischen Altersabhängigkeiten
Aus der 300-µl-Probe des heparinisierten Vollbluts eines jeden Probanden erfolgte
die Bestimmung der Leukozyten- bzw. Lymphozytenzahlen durch mikroskopische
Differenzierung und Auszählung nach Färbung gemäß Pappenheim (May-GrünwaldGiemsa, siehe Kap. 3.3.2.3.).
Die Zahl der Leukozyten und Lymphozyten ließ, genauso wie der prozentuale Anteil
an Lymphozyten der Leukozytenfraktion, eine für sie typische Altersabhängigkeit
erkennen. Alle Messwerte befanden sich im Referenzbereich der jeweiligen
Altersgruppe.
Die Darstellungen in Abb. 26 demonstrieren den signifikanten Abfall der absoluten
Zahl an Leukozyten und Lymphozyten zum Probandenalter. Die Zellzahlen sinken
dabei vor allem in den ersten Lebensmonaten stark ab und stabilisieren sich etwa um
das zehnte Lebensjahr im Niveau der Erwachsenenwerte.
Abb. 27 stellt den prozentualen Anteil der Lymphozyten innerhalb der
Leukozytenfraktion über dem Probandenalter dar. Mit den Lebensjahren sinkt der
Anteil der Lymphozyten am Leukozytenpool, wobei die Reduktion auch hier in den
ersten Lebensmonaten/-jahren am deutlichsten ist.
- 70 -
A
B
14000
8000
12000
7000
Lymphozyten /µl
Leukozyten /µl
6000
10000
8000
6000
5000
4000
3000
2000
4000
1000
2000
0
10
20
Le be nsjahre
30
0
0
10
20
Le bensjahre
30
Abbildung 26: Abhängigkeit der Leukozyten- (A) und Lymphozytenzahl (B) vom Probandenalter.
Signifikant negative Korrelation der absoluten Anzahl an Leukozyten (A; P = 0.0306,
r² = 0,04729) sowie eine hochsignifikant negative Korrelation der absoluten Anzahl an
Lymphozyten (B; P < 0.0001, r² = 0,2282)
90
Lymphozyten (%Leukozyten)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
5
10
15
20
Le b e n s ja h r e
25
30
Abbildung 27: Anteil an Lymphozyten der Gesamtleukozytenpopulation aufgetragen gegen das
Probandenalter. Hochsignifikant negative Korrelation (P < 0.0001, r² = 0,2548) der Größe des
lymphozytären Anteils zum Alter der Probanden
- 71 -
4.2.2. Anteil der CD4pos-Lymphozyten unabhängig vom
Probandenalter
Zur Erfassung der einzelnen T-Zell-Subpopulationen vor Stimulation wurden die zur
Bestimmung
relevanten
Oberflächenmoleküle
in
der
fluoreszenzaktivierten
Durchflusszytometrie analysiert (siehe Kap. 3.3.4).
Im Gegensatz zur absoluten und relativen Lymphozytenzahl erwies sich der
prozentuale Anteil an CD4pos-Lymphozyten innerhalb der Lymphozytenpopulation
als weitestgehend unabhängig vom Alter der Probanden. Abb. 28 illustriert die
Messwerte in einem unabhängig vom Alter relativ konstanten Niveau.
70
CD4+ (% Lymphozyten)
60
50
40
30
0
5
10
15
20
25
30
Lebensjahre
Abbildung 28: Anteil an CD4
pos
-Lymphozyten der Lymphozytenpopulation abhängig vom
Alter der Probanden. Kein Nachweis einer statistischen Signifikanz (P = 0.1275, r² = 0,02354)
- 72 -
4.2.3. CD45RA-Isoform Expression abhängig vom Alter der
Probanden
Mit zunehmendem Alter der Probanden nahm der Anteil der unreifen, CD45RA
exprimierenden Lymphozyten unseren Datenkollektivs signifikant ab (siehe
Abb. 29).
Die Analyse des Glykoproteins CD45 bestätigte damit die schon seit Längerem
bekannte Altersabhängigkeit der in verschiedenen Isoformen vorkommenden
membranständigen Tyrosinphosphatase (siehe Kap. 3.3.4.1.). Unreife, naive und
ruhende T-Zell-Populationen exprimieren überwiegend CD45RA auf ihrer
Zelloberfläche, welches nach Aktivierung und Reifung der Zelle durch die
überwiegende Synthese der CD45RO-Isoform verdrängt wird [23, 77].
CD45RA+ (%Lymphozyten)
100
90
80
70
60
0
5
10
15
20
Lebensjahre
25
30
Abbildung 29: Anteil an unreifen CD45RApos-Lymphozyten der Lymphozytenpopulation in
Beziehung zum Alter der Probanden. Hochsignifikant negative Korrelation (P < 0.0001,
r² = 0,5037) der Größe des Anteils an unreifen CD45RApos-Lymphozyten zum Probandenalter
- 73 -
4.2.4. Negative Korrelation zwischen dem Anteil an CD4
exprimierenden Lymphozyten und Größe der CD4posCD25pos-CD45RAneg-Fraktion
Die durchgeführte FACS-Analyse gestattete neben der Identifizierung der CD4pos-TLymphozyten eine Erfassung der CD4pos-CD25pos-T-Regulatorzell-Fraktion bei
gleichzeitiger
Differenzierung
zwischen
reifen
(CD45RAneg)
und
unreifen
(CD45RApos) Anteilen (siehe Kap. 3.3.4). Abb. 30 stellt die Beziehung des Anteils
an CD4pos-T-Lymphozyten zur Größe der Fraktion an reifen CD4pos-CD25posCD45RAneg bzw. unreifen CD4pos-CD25pos-CD45RApos-Zellen dar.
Erkennbar ist, dass die Größe der CD4pos-T-Helferzell-Fraktion weder zur
Gesamtpopulation an T-Regulatorzellen (CD4pos-CD25pos, nicht dargestellt), noch
zum Anteil an unreifen regulatorischen T-Zellen (CD4pos-CD25pos-CD45RApos) eine
statistisch signifikante Abhängigkeit aufweist (siehe Abb. 30 B).
Im klaren Gegensatz hierzu steht die Fraktion der reifen, CD4pos-CD25posCD45RAneg-T-Zellen des CD4pos-CD25pos-Zellpools in einem ein hochsignifikant
negativen Zusammenhang zur relativen Größe der CD4pos-Zellfraktion.
Mit der Größe des Anteils an reifen regulatorischen T-Zellen (CD4pos-CD25posCD45RAneg-T-Zellen, siehe Kap. 1.2.) reduzierte sich damit statistisch betrachtet der
Anteil an CD4pos-T-Helferzellen in unserem Probandenkollektiv (siehe Abb. 30 A).
- 74 -
B
70
70
60
60
CD4+ (%Lymphozyten)
CD4+ (%Lymphozyten)
A
50
40
30
50
40
30
0
1
2
3
4
5
6
7
CD4+ CD25+ CD45RA - (% CD4+)
0
5
10
15
CD4+ CD25+ CD45RA+ (% CD4+)
Abbildung 30: Anteil an CD4pos-T-Zellen der Lymphozytenpopulation abhängig von der Größe
der reifen CD4pos-CD25pos-CD45RAneg- (A) und unreifen CD4pos-CD25pos-CD45RApos- (B) T-ZellFraktion. Die Auswertung ergab eine statistisch hochsignifikant negative Korrelation
(A; P < 0,0001, r² = 0,1424) des Anteils an CD4pos-Lymphozyten zur Größe der reifen
CD4pos-CD25pos-CD45RAneg-T-Zellfraktion. Es konnte kein signifikanter Zusammenhang des
Anteils an CD4pos-T-Zellen mit der Größe der unreifen CD4pos-CD25pos-CD45RApos-T-ZellFraktion nachgewiesen werden (B; P = 0.7823, r² = 0,0007831)
- 75 -
4.3. Analyse der TGF-β-Synthese
4.3.1. TGF-β-Synthesekapazität der Lymphozyten abhängig
vom Probandenalter
Die Bestimmung der TGF-β-Synthese erfolgte unter den in Kap. 3.3.6.3.
beschriebenen Einstellungen in der FACS-Analyse nach Stimulation mit Phorbol-12Myristat-13-Acetat (PMA) und Ionomycin. Neben der Messung des intrazellulär
fixierten
TGF-β
wurde
die
Fraktion
der
T-Lymphozyten
anhand
des
Oberflächenantigens CD3 identifiziert.
Sowohl in der CD3pos Zellgruppe der T-Lymphozyten als auch in der überwiegend
aus B-Lymphozyten und NK-Zellen (Natürliche Killer-Zellen) bestehenden CD3negLymphozyten-Fraktion ließ sich eine TGF-β-Produktion unter Stimulation mit PMA
und Ionomycin nachweisen.
Mit zunehmendem Alter der Probanden stieg in unseren Messungen der Anteil an
TGF-βpos-Zellen in der Zellgruppe der Lymphozyten.
Abb. 31 demonstriert die hochsignifikant positive Abhängigkeit der TGF-βSynthesekapazität aller Lymphozyten zum Probandenalter.
Für beide der während der FACS-Analyse differenzierbaren Untergruppen der
Lymphozytenpopulation,
den
CD3pos-T-Lymphozyten
sowie
den
CD3neg-B-
Lymphozyten bzw. NK-Zellen, ließ sich nach statistischer Auswertung ein deutlich
positiver Zusammenhang der TGF-β-Synthesekapazität zum Alter der Probanden
nachweisen.
- 76 -
15.0
TGF beta + (%Lymphozyten)
12.5
10.0
7.5
5.0
2.5
0.0
0
Abbildung
31:
5
Prozentualer
10
15
20
Lebensjahre
Anteil
an
25
TGF-βpos-Lymphozyten
30
der
gesamten
Lymphozytenfraktion in Abhängigkeit des Alters der Probanden. Die statistische Auswertung
ergab eine hochsignifikant positive Korrelation (P < 0,0001, r² = 0,1882) des Anteils zum
Probandenalter
- 77 -
Abb. 32 stellt die signifikant positive Korrelation der TGF-β-Synthesekapazität der
CD3pos-T-Lymphozyten zum Probandenalter dar. Deutlich erkennbar ist eine
verminderte TGF-β-Synthesekapazität in den ersten Lebensjahren.
CD3+ TGF beta + (% CD3+)
4
3
2
1
0
0
5
10
15
20
Lebensjahre
Abbildung 32: Beziehung des Anteils an
25
30
CD3pos-TGF-βpos-Zellen zum Probandenalter.
Signifikant positive Korrelation der TGF-β-Synthesekapazität der CD3pos-T-Lymphozyten
(P = 0.0015, r² = 0,09816) zum Alter der Probanden
- 78 -
4.3.2. Lymphozytäre TGF-β-Synthesekapazität korreliert mit
dem Anteil an CD45RAneg-Lymphozyten
Die
durchflusszytometrischen
Messungen
ermöglichten
den
Vergleich
der
gewonnenen TGF-β-Daten mit der Größe einzelner Lymphozytenfraktionen vor
Stimulation. Die Überprüfung des Zusammenhangs zwischen lymphozytärer TGF-βSynthesekapazität und Isoformexpression des Oberflächenmarkers CD45RA ergab
eine statistisch signifikante Beziehung. Die Anzahl der aktivierten reifen
CD45RAneg-Lymphozyten stand in unserem Probandenkollektiv mit der Anzahl der
TGF-βpos-Lymphozyten in einem engen positiven Zusammenhang.
Diese Abhängigkeit ließ sich sowohl für CD3pos-T-Lymphozyten als auch für die
CD3neg-Lymphozytenpopulation (nicht dargestellt) nachweisen (siehe Abb. 33).
A
B
7
CD3 + TGF beta + (% CD3+)
TGF beta + (% Lymphozyten)
15
10
5
0
6
5
4
3
2
1
0
0
25
50
CD45RA - (% Lymphozyten)
0
15
30
45
60
CD45RA - (% Lymphozyten)
Abbildung 33: Anteil an (A) TGF-βpos- bzw. (B) CD3pos-TGF-βpos-Lymphozyten der
Lymphozytenfraktion in Abhängigkeit zur relativen Größe der CD45RAneg-LymphozytenFraktion. Die statistische Auswertung ergab eine hochsignifikant positive Korrelation sowohl
der TGF-βpos-Lymphozyten (A; P < 0.0001, r² = 0,1509), als auch der CD3pos-TGF-βposLymphozyten (T-Lymphozyten) (B; P = 0.0022, r² = 0,09140) zur Größe der CD45RAnegLymphozyten-Fraktion
- 79 -
4.3.3. T-lymphozytäre (CD3pos) TGF-ß-Synthesekapazität
ohne signifikante Korrelation zum Anteil an reifen Tregs
(CD4pos-CD25pos-CD45RAneg -Zellen)
In dem von uns untersuchten Probandenkollektiv konnte kein statistisch signifikanter
Zusammenhang
zwischen
dem
Anteil
an
CD4pos-CD25pos-CD45RAneg-T-
Regulatorzellen des CD4pos T-Helferzellpools und dem Anteil an TGF-βpos-Zellen
der T-Lymphozyten nachgewiesen werden. Obwohl die Abb. 34 eine leichte
Tendenz erkennen lässt, konnte in der statistischen Analyse kein signifikanter
Zusammenhang der beiden Zellgruppen nachgewiesen werden.
7
CD3 + TGF beta + (% CD3 +)
6
5
4
3
2
1
0
0
1
2
3
4
5
CD4+ CD25+ CD45RA - (% CD4+)
6
7
Abbildung 34: Beziehung des Anteils der CD3pos-TGF-βpos-Lymphozyten zur Größe der
reifen CD4pos-CD25pos-CD45RAneg-Regulatorzellfraktion. Nach Auswertung konnte keine
statistische Signifikanz (P = 0.1291, r² = 0,02334) der dargestellten positiven Abhängigkeit
zwischen T-lymphozytärer
TGF-β-Synthesekapazität
und
dem
Anteil an reifen T-
Regulatorzellen nachgewiesen werden
- 80 -
4.3.4. CD4pos-CD25pos Tregs ohne relevanten Anteil TGF-ßposZellen nach Stimulation
Unter
Zuhilfenahme
eines
Magnetic
Cell-Sorters
(MACS®)
wurde
eine
Versuchsreihe mit einer der FACS-Analyse vorangegangene Isolation der CD4posCD25pos-regulatorischen T-Zellen durchgeführt.
Es konnte dabei weder in der adulten Blutprobe (siehe Abb. 35), noch im
Nabelschnurblut eines Neugeborenen (nicht dargestellt), ein relevanter Anteil
TGF-βpos Zellen nach Stimulation der CD4pos-CD25pos Lymphozyten gemessen
werden. Abbildung 35 verdeutlicht den Anteil TGF-βpos Zellen der adulten Blutprobe
vor und nach Stimulation.
A
B
Abbildung 35: Histogrammdarstellung des Anteils TGF-βpos-Zellen am Gesamtzellpool der
CD4pos-CD25pos-Lymphozyten, nach vorheriger Isolation im MACS®-Cell Sorter.
A - Isotypenkontrolle zur Festlegung des Intensitäts-Schwellenwertes des Analysefensters M1.
B - Der Anteil TGF-βpos Zellen nach Stimualtion der CD4pos-CD25pos-Lymphozyten blieb <
0,001%
- 81 -
4.3.5. Der Anteil an T-Helferzellen (CD4pos-Lymphozyten)
nimmt mit steigender T-lymphozytärer (CD3pos) TGF-βSynthesekapazität ab
In den von uns erhobenen Daten konnte eine signifikant negative Korrelation des
Anteils an CD4pos T-Zellen im Lymphozytenpool, zur T-lymphozytären TGF-βSynthesekapazität nachgewiesen werden (siehe Abb. 36 A).
Die produktive Kompetenz der CD3neg Lymphozyten-Fraktion, B-Lymphozyten
bzw. NK-Zellen, steht in keinem statistisch signifikanten Zusammenhang mit der
Population der CD4pos T-Helferzellen (siehe Abb. 36 B).
B
A
60
CD4 + (% Lymphozyten)
CD4 + (% Lymphozyten)
60
50
40
30
0.0
2.5
5.0
7.5
CD3+ TGFbeta+ (% CD3+)
50
40
30
0
10
20
30
CD3- TGFbeta+ (% CD3-)
Abbildung 36: Anteil an CD4pos-T-Zellen der Lymphozytenpopulation in Abhängigkeit von der
Größe der
(A)
CD3pos-TGF-βpos- bzw.
(B)
CD3neg-TGF-βpos-Lymphozytenfraktion des
Lymphozytenpools. In der statistischen Auswertung konnte in Bezug auf (A) die T-lymphozytäre
(CD3pos) TGF-β-Synthesekapazität eine signifikant positive Korrelation (A; P = 0.028,
r² = 0,04822) nachgewiesen werden. Ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen
produktiver Kompetenz der (B) CD3neg-Lymphozyten für TGF-β-Synthesekapazität und dem
Anteil an CD4pos-T-Zellen konnte nicht festgestellt werden (B; P = 0.1046, r² = 0,02665)
- 82 -
5.
Diskussion
5.1. Altersabhängigkeit der TGF-β-Synthese
Existiert eine Altersabhängigkeit der T-lymphozytären TGF-β Synthese?
Das Wirkprinzip der adaptiven Immunmechanismen beruht auf einer Selektion von
Fremdstrukturen durch identifizierende T-Zellklone. Hierbei spielen neben der
zentralen Selektion im Thymus
[45]
(siehe Kap. 1.1.1.) periphere Selektionsprozesse
nach ausreichendem Kontakt des jungen Immunsystems mit in der Umwelt
vorkommenden Antigenen eine entscheidende Rolle. Erst nach umfassendem
Antigenkontakt und den daraus resultierenden Entwicklungs- und Reifungsprozessen
erwirbt das adaptive Immunsystem seine vollständige antigenspezifische Kompetenz.
Seit Etablierung der fluoreszenzaktivierten Durchflusszytometrie Mitte der siebziger
Jahre
[16]
wurden in zahlreichen groß angelegten Studien die altersabhängigen
Veränderungen
immunphänotypischer
Oberflächenmerkmale
Zellkompartimente des adaptiven Immunsystems dargestellt
[23, 24, 41]
verschiedener
.
Die Ergebnisse unserer Studie stellen erstmalig eine hochsignifikant (P < 0,001)
positive Korrelation der TGF-β-Synthese humaner, mit PMA/Ionomycin aktivierter
Lymphozyten zum Probandenalter dar (siehe Abb. 31).
Für beide Fraktionen, die CD3pos-T-Lymphozyten sowie die CD3neg-B-Lymphozyten
bzw.
NK-Zellen,
ließ
sich
ein
positiver
Zusammenhang
der
TGF-β-
Synthesekapazität zum Alter der Probanden nachweisen (siehe Abb. 32).
- 83 -
5.1.1. Altersabhängigkeit der TGF-β-Synthese, ein Indiz
relevanter Reifungsprozesse im System der TRegulatorzellen
Die Ergebnisse unserer Studie demonstrieren erstmalig die wachsende Kompetenz
des T-lymphozytären Systems zur Produktion des löslichen Zytokins TGF-β.
Dieser Tatsache liegt ein mit dem Alter ansteigender Anteil TGF-β-produzierender
Zellen des T-lymphozytären Zellpools zugrunde. Der wachsende Anteil TGF-βproduzierender Zellen wird von uns als Ausdruck der Reifung im Sinne der
funktionellen Entwicklung effizienter T-Zell-Klone interpretiert.
Die hierbei demonstrierten altersabhängigen Veränderungen der Zelleigenschaften,
Zytokinmuster und der Expression von Oberflächenmolekülen reflektieren die
außerordentliche Dynamik einer frühen funktionellen Entwicklung der adaptiven
Immunkomponenten. Das bisherige Verständnis für immunregulatorische Prozesse
legt auch für die Subpopulationen der induzierbaren T-Regulatorzellen (siehe Kap.
1.2.2.), eine auf selektiven Reifungsschritten beruhende funktionelle Entwicklung
antigenaffiner T-Zell-Klone nahe [104].
Indiz einer kausalen Verknüpfung der mit dem Alter zunehmenden lymphozytären
TGF-β-Synthesekapazität und der Reife der Lymphozytenpopulation ist die in
unseren Versuchen hochsignifikant positive Korrelation zur Größe der Fraktion an
CD45RAneg-Lymphozyten
(siehe
Abb.
33B).
Die
Isoform-Expression
des
Glykoproteins CD45 stellt dabei einen bedeutenden Marker der Zellreife des
adaptiven Immunsystems dar. Bei CD45RApos-Zellen handelt es sich um größtenteils
naive ruhende T-Zellpopulationen, wohingegen die vorwiegende Expression der
CD45RO-Isoform,
hier
repräsentiert
durch
die
CD45RAneg-Fraktion,
Zellaktivierung mit nachfolgender Differenzierung voraussetzt
[77]
eine
. Eine vom
Aktivitätszustand der Zellen abweichende TGF-β-Kompetenz wäre bei Annahme
eines divergenten altersabhängigen Induktionsmechanismus oder Regelkreises, wie
z.B. die Induktion über hormonelle Faktoren, durchaus vorstellbar.
- 84 -
5.1.2. Induktionsmechanismen TGF-βs im regulatorischen
System
Die neuen Erkenntnisse im Bereich der regulatorischen Einflüsse TGF-βs im Umfeld
regulatorischer T-Zellen lassen die bisher bekannten Induktionsmechanismen der
TGF-β-Synthese sowie die Rolle TGF-βs als Induktor von Reifungsprozessen und
damit auch der hier demonstrierten Altersabhängigkeit interessant erscheinen.
Eine selektive Heranreifung TGF-β-produzierender antigenspezifischer induzierbarer
regulatorischer Th3-Zellen könnte den steigenden Anteil TGF-β-kompetenter TLymphozyten unserer Studie erklären.
Es wird immer wahrscheinlicher, dass sich die in in-vivo Modellen nachgewiesene
bedeutsame
Stellung
Toleranzinduktion
TGF-βs
[53, 55, 96]
innerhalb
der
peripheren
regulatorischen
zum Großteil durch die mannigfaltigen Einflüsse im
Rahmen der Proliferation sowie der Aus- und Weiterdifferenzierung der so
genannten induzierbaren T-Regulatorzellen erklärt. Diese wurden anhand von
Ergebnissen aus in-vitro Versuchen, bei denen unter Einfluss verschiedener
Interleukine (TGF-β/IL-10/IFN-alpha bzw. IL-10/IL-4) regulatorisch aktive T-Zellen
generiert
werden
konnten,
als
die
so
genannten
induzierbaren
Typ1-T-
Regulatorzellen definiert (siehe Kap. 1.2.2.) [56].
Als ein möglicher Induktionsmechanismus der TGF-β-Synthese wird eine
überwiegend orale Antigenstimulation diskutiert. Der Arbeitsgruppe um Fukaura et
al. gelang es, nach oraler Gabe des MS-Autoantigens MBP (Myelin basic protein) im
peripheren Blut von Multiple-Sklerose-Patienten MBP spezifische, in ausgeprägtem
Maße TGF-β-sezernierende so genannte Th3-Zellen zu identifizieren [30].
Da sich in späteren Mausmodellen die Induktion der Th3-Zellen durch Anwesenheit
von TGF-β, IL-4, IL-10 und anti-IL-12 noch deutlich steigern ließ, ist hierbei von
einer komplexen Modulation durch verschiedene, im Kontext der Reaktionen
freigesetzte Zytokine auszugehen [105].
- 85 -
In einer jüngst von Carrier Y. et al. veröffentlichten Studie gelang es, die
Erkenntnisse um diese beiden bedeutsamsten Vertreter der induzierbaren TRegulatorzellen in einer neuen Versuchsreihe in Beziehung zueinander zu setzen.
Hierbei wird den TGF-β-produzierenden Th3-Zellen eine Schlüsselposition in der
Konversion
der
induzierbare
Typ1-T-Regulatorzelle
zugeschrieben
(siehe
Kap. 1.2.3.).
Dem hierbei entwickelten Modell folgend, sollen sich die induzierbaren regulatorisch
aktiven Typ1 T-Regulatorzellen erst in Anwesenheit TGF-β-sezenerierender Th3Zellen über die Konversion inaktiver, naiver CD4pos-CD25neg-T-Lymphozyten in
antigenspezifische CD4pos-CD25pos Typ1-T-Lymphozyten entwickeln [13].
Neben den T-Zell-Rezeptorsignalen scheint der entscheidende Mechanismus hierbei
die schon seit Längerem vermutete von TGF-β vermittelte Induktion des für die
Entwicklung
regulatorischer
Eigenschaften
essenziellen
FOXP3-Gens
zu
sein [14, 37, 49, 78]. Die aktivierten induzierbaren Typ1-T-Regulatorzellen, die ihrerseits
relevante Mengen an IL-10 synthetisieren, könnten über parakrin-zytokine
Rückkopplung die Konversion weiterer Typ1-T-Regulatorzellen verstärken (die
Induktion der Th3-Zellen ließ sich in den Versuchen von Weiner, H.L. 2001 durch
Anwesenheit von TGF-β noch deutlich steigern, s.o.) und so ein die periphere
Toleranzinduktion "verstärkendes" Milieu bilden.
In Anlehnung an dieses Konzept wäre es auch in Bezug auf unsere Ergebnisse
schlüssig, dass die Konfrontation des heranwachsenden Immunsystems mit exogenen
und endogenen Antigen-Strukturen einen zunehmenden Kontakt induzierbarer TRegulatorzellen mit den für sie spezifischen (Auto-) Antigenen ermöglicht. Eine
hierüber stattfindene Induktion TGF-β-sezernierender Th3-Zellen könnte in der
Funktion
„zytokiner
Schaltstellen”
eine
periphere
Konversion
weiterer
antigenstimulierter induzierbarer Regulatorzellen, z.B. der Typ1-T-Regulatorzellen,
vermitteln. Abb. 37 illustriert schematisch die potenzielle Schlüsselposition TGF-βproduzierender Th3-Zellen in der Konversion induzierbarer Typ1-T-Regulatorzellen.
- 86 -
Abbildung 37: Schematische Darstellung eines möglichen Mechanismus peripherer
Toleranzinduktion. Konfrontation induzierbarer regulatorischer Th3-Zellen mit spezifischen
enteralen Antigenen führt über eine ausgeprägte TGF-β-Sekretion zu einer peripheren Konversion
weiterer, zuvor über spezifische Antigene stimulierter, induzierbarer Typ1-T-Regulatorzellen
Die antigengekoppelte periphere selektive Heranreifung spezifischer induzierbarer
regulatorischer
Th3-Zellen
stellt
eine
plausible
Erklärung
des
mit
dem
Probandenalter steigenden Anteils TGF-β-kompetenter T-Lymphozyten in unserer
Studie dar.
- 87 -
5.1.3. Hinweise auf klinische Relevanz der hier erstmalig
dargestellten Reifungsprozesse im TGF-β-System
Die in unserer Studie demonstrierte Altersabhängigkeit lymphozytärer TGF-βSynthese gestattet einen interessanten Ansatz zur Erklärung klinisch häufig
beobachteter spontaner Toleranzinduktionen im Kindesalter.
Ein plausibles Modell der häufig beobachteten oralen Toleranzentwicklung im
Rahmen der Spontanremission einiger Nahrungsmittelallergien könnte die in unserer
Studie dargestellte, mit dem Alter zunehmende Induktion des TGF-β-Systems und
seiner Zellsysteme darstellen.
Die höchsten Prävalenzraten nachgewiesener Nahrungsmittelallergien finden sich
mit bis zu 6–8% im Säuglings- und Kleinkindsalter. Nach den ersten Lebensjahren
sinkt die Erkrankungshäufigkeit im Schulalter auf 1–2% und verbleibt den Rest des
Lebens relativ konstant (1–4% Erwachsenbevölkerung) [86].
Welche Nahrungsmittel hierbei in der Auslösung der Allergien eine Rolle spielen,
hängt von den Ernährungsgewohnheiten sowie dem Zeitpunkt und der Reihenfolge
des Einführens in den Speiseplan ab. In den Industrieländern sind Reaktionen gegen
Kuhmilch, Ei, Soja, Weizen, Nüsse und Fisch die häufigsten [35].
Zu den vermuteten Ursachen der frühen Sensibilisierung zählen v.a. Faktoren einer
in dieser Phase noch nicht abgeschlossenen gastrointestinalen Reifung. Hierbei
könnten sowohl eine unvollkommene Schleimhautbarriere, durch veränderte
Antigenbindungs- sowie Transporteigenschaften, als auch eine unreife Darmflora,
über die verminderte Fähigkeit, potenzielle Allergene aufzuspalten, relevante
Pathomechanismen darstellen [10, 42, 54].
Interessant ist, dass es sich im Gegensatz zu Nahrungsmittelallergien im
Erwachsenenalter bei Erkrankung in jungen Jahren häufig um temporäre
Beschwerden handelt, deren klinische Relevanz in bis zu 50 % der Fällen im Laufe
einiger Zeit wieder verschwindet.
- 88 -
Arbeiten zu diesem Thema bewiesen, dass v.a. die Symptome kindlicher Kuhmilchund Hühnereiweiß-Allergien in bis zu 50–80 % der untersuchten Kinder bis zum
Schulalter verschwanden oder sich stark abmilderten [7, 17, 27, 38].
Genaue Mechanismen, die eine orale Toleranzinduktion in dieser Phase erklären,
sind bis jetzt unbekannt. Der Nachweis einer Antigenaufnahme, -verarbeitung und
-präsentation
auf
MHC-II-Molekülen
intestinaler
Epithelzellen
macht
die
umfangreiche Auseinandersetzung mit im Darmlumen vorkommenden Antigenen
und eine komplexe Zell-Zell-Komunikation im Rahmen der Antigenpräsentation
innerhalb der Darmwand wahrscheinlich [64].
In diesem Zusammenhang wäre es denkbar, dass die orale Antigenbelastung
heranwachsender Kinder einen intensiven Antigenkontakt naiver CD4pos-T-Zellen
und damit eine mit den Jahren zunehmende Konversion und Ausreifung spezifischer
induzierbarer T-Regulatorzellen vom Th3-Zelltyp in den Schleimhäuten des
Verdauungstraktes zur Folge hat. Die von den Th3-Zellen ausgehende TGF-βSynthese könnte einen wichtigen zytokinen Faktor zur Konversion weiterer
antigenspezifischer induzierbarer Tr1-Zellen über eine FOXP3-Induktion innerhalb
der Darmwand darstellen.
Parakrin sezerniertes TGF-β könnte eine entscheidende Rolle in der vollständigen
anitgengetriggerten Ausreifung immunregulatorischer T-Zellen und damit in der
peripheren Toleranzentwicklung gegen zuvor intolerante orale Antigene spielen. Die
zunehmende TGF-β-Synthese würde so eine zelluläre periphere Toleranzinduktion
der entsprechenden Antigene realisieren, den Aufbau eines regulatorischen
Gleichgewichts und hierüber den Rückgang der klinischen Symptomatik der vormals
relevanten immunogenen Reaktionen ermöglichen.
- 89 -
5.1.4. Mangelhafte Reifungsprozesse als (auto-) immunogene
Pathomechanismen
Mangelhafte
antigengekoppelte
Reifungsprozesse
und
damit
eine
erhöhte
autoimmune Reaktionsbereitschaft könnten sich u.a. in einer verminderten TGF-βSynthesekapazität des T-Regulatorzellsystems ausdrücken.
Die von D. P. Strachnan 1989 formulierte Hygienehypothese, bei der ein
Zusammenhang zwischen einer zunehmend keim- und infektarmen Lebensumwelt
und der Zunahme allergischer Erkrankungen formuliert wurde [98], fordert einen
Reifungsprozess der Immunkomponenten nach ausreichendem Kontakt mit den für
den
Organismus
relevanten
Antigenen
zur
Entwicklung
eines
regelhaft
funktionierenden Immunsystems. Der Gedanke einer unzureichenden Ausreifung der
an der peripheren Toleranzinduktion beteiligten Immunkomponenten, z.B. aufgrund
einer unzureichenden (Auto-) Antigenexposition, könnte ein wichtiger Faktor in der
Entwicklung von (Auto-) Immunerkrankungen sein.
Dem Konzept der antigengetriggerten Ausreifung folgend, könnte ein mangelhafter
Antigenkontakt der beteiligten Zellsysteme eine positive Selektion der peripheren
antigenspezifischen regulatorischen Zellen erschweren und so die Ausreifung der
Regulatorzellen zu funktionsfähigen Induktoren peripherer Toleranz vermindern. Die
ungenügende Interaktion spezifischer Regulatorzellen mit ihren entsprechenden
Antigenen könnte Grundlage für überschießende, fehlregulierte Immunantworten im
Rahmen späterer Kontakte mit (Auto-) Antigenen sein und so einen entscheidenden
Faktor
für
die
Entwicklung
bzw.
Entfaltung
(auto-)
immunogener
Pathomechanismen darstellen. Bezogen auf TGF-β wäre es vorstellbar, dass sich
mangelhafte antigengekoppelte Reifungsprozesse u.a. in einer verminderten
produktiven Kompetenz der beteiligten Zellsysteme für das regulatorisch bedeutsame
(Effektor-) Zytokin TGF-β äußern.
- 90 -
5.2. Ursprung des gemessenen TGF-β
Existieren Hinweise auf den Ursprung des gemessenen TGF-βs im Zellsystem
der reifen CD4pos-CD25pos-CD45RAneg-regulatorischer T-Zellen (konstitutiver
Tregs)?
Untersuchungen haben erwiesen, dass TGF-β-Funktionen im Rahmen der
Entstehung und Aufrechterhaltung peripherer immunologischer Toleranz und damit
eines regelrecht funktionierenden Immunsystems erfüllt [21, 53, 55, 96].
Neuere Arbeiten vermuten die immunmodulatorischen Wirkungen TGF-βs vor allem
im direkten Kontext regulatorischer T-Zellen
[14, 40, 76]
, wobei TGF-β-vermittelte
Effekte dabei sowohl im Reifungs- und Differenzierungsprozess regulatorischer TZellen [49, 37, 14, 76] als auch in Form von supprimierenden bzw. modulierenden TGFβ-Impulsen ausgehend von regulatorisch aktiven T-Zellen
[11, 48, 97, 102]
beschrieben
wurden.
5.2.1. Reife (CD45RAneg), CD4pos-CD25pos-regulatorische TZellen (konstitutive Tregs)
Die Ergebnisse vieler Arbeitsgruppen der letzten Jahre haben aufgezeigt, dass TGF-β
seine immunmodulatorischen Wirkungen im Kontext vieler regulatorisch aktiver TZellen entfaltet
[14, 40, 76]
und sich einige Subtypen der T-Regulatorzellen durch eine
besonders ausgeprägte TGF-β-Synthese auszeichnen (siehe Kap. 1.2.2.) [13, 33, 56, 105].
Vor diesen Erkenntnissen scheint ein hoher Anteil TGF-βpos-Zellen in der hier
idenifizierten Fraktion der CD4pos-CD25pos-CD45RAneg-regulatorischen T-Zellen
(konstitutiven Tregs) plausibel. Es entstünde diesbezüglich ein Zusammenhang der
T-lymphozytären TGF-β-Synthesekapazität und der Größe der Gruppe an
konstitutiven Tregs.
Wie in Kap. 4.3.3. Abb. 33 zu erkennen, existieren in den von uns ermittelten
Messdaten keinerlei Hinweise auf eine hervorstechende TGF-β-Synthesekapazität im
Kompartiment der reifen CD4pos-CD25pos-CD45RAneg-regulatorischen T-Zellen.
- 91 -
Auch in der Versuchsreihe mit einer der FACS-Analyse vorangestellten Isolierung
der CD4pos-CD25pos-T-Zellen unter Zuhilfenahme eines Magnetic Cell-Sorters
(MACS®) ließ sich keine relevante TGF-β-Synthesekapazität im Pool der CD4posCD25pos-regulatorischen T-Zellen darstellen.
Damit decken sich unsere Daten mit den Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen, u.a.
der um Mamura et al. und Godfrey et al., die auf eine eher untergeordnete Rolle
löslichen TGF-βs in der Funktion suppressiver, konstitutiver CD4pos-CD25posregulatorischer T-Zellen in-vitro sowie in-vivo schließen lassen [32,
60]
. Einige
Arbeiten entwickelten ein Modell, dass es sich bei dem Regulationsmechanismus der
konstitutiven CD4pos-CD25pos-CD45RAneg-Tregs um eine eher zellkontaktabhängige
Interaktion handelt. Vor allem membrangebundenes TGF-β, welches sich aus
messmethodischen Gründen nicht in unseren Ergebnissen widerspiegelt (siehe Kap.
5.4.), sowie CTLA-4 könnten als Oberflächenmoleküle einen entscheidenden Beitrag
zur Suppression zu leisten
[4, 80]
. Diesem Gedanken folgend gelang es einigen
Studien, über spezifische Antikörper CTLA-4-Moleküle auf der Zelloberfläche der
CD4pos-CD25pos-T-Zell-Regulatorgruppe zu blockieren und so einen Verlust der
suppressiven
Aktivität
der
untersuchten
CD4pos-CD25pos-Zellen
zu
provozieren [80, 101].
5.2.2. TGF-β-Synthese außerhalb des (CD3pos)
T-lymphozytären Systems
Sowohl bei den CD3pos-T-Lymphozyten (siehe Kap. 3.3.6.3.) als auch in der
überwiegend
aus
B-Lymphozyten
und
NK-Zellen
bestehenden
CD3neg-
Lymphozyten-Fraktion wurden TGF-βpos-Zellen nachgewiesen.
Unsere Messergebnisse stimmen hierbei mit den Daten voriger Arbeitsgruppen
überein, welche herausarbeiteten, dass TGF-β in seinen Isoformen von sehr vielen
Zelltypen synthetisiert wird (siehe Kap. 1.4.1.), in Differenzierungsprozessen
unterschiedlicher Zelllinien dem jeweiligen geweblichen Umfeld entsprechend
Wirkungen entfaltet [22,
63]
und dort nach intrazellulärer Modifikation
[20, 58]
verschiedenste Zellreaktionen hervorrufen kann.
- 92 -
Bei genauerer Betrachtung der TFG-β-Relationen fällt auf, dass die Zellgruppe der
CD3pos-T-Lymphozyten, die mit den T-Regulatorzellen den im Bezug auf
regulatorische
Prozesse
potenziell
bedeutsamsten
TFG-β-Produzenten
des
neg
Immunsystems stellen, einen im Vergleich zur CD3 -Fraktion prozentual deutlich
geringeren Anteil an TGF-βpos-Zellen besitzt. Hierbei muss allerdings bedacht
werden, dass die in unserer Auswertung gewählte Darstellung der Messungen keine
Aussage über die Ausprägung der TFG-β-Synthese zulässt, sondern lediglich den
Anteil an TGF-βpos-Zellen in einem Zellkompartiment widerspiegelt (siehe Kap.
5.4.).
Einen wegweisenden Ansatz zur Untersuchung des genauen zellulären Ursprungs
TGF-βs könnte eine erneute Untersuchung mit vorangestellter Sortierung der zu
untersuchenden Zellpopulationen unter Zuhilfenahme eines Magnetic Cell-Sorters
darstellen. Eine nachfolgende Aktivierung und Messung ergäbe innerhalb der vorher
getrennten
Zelltypen
aussagekräftigere
Daten
bezüglich
der
TGF-β-
Synthesekapazität der einzelnen Zellgruppen.
- 93 -
5.3. Hinweise auf regulatorische Einflüsse ausgehend
von CD3pos-TGF-βpos-T-Lymphozyten
Existieren Hinweise auf den Einfluss CD3pos-TGF-βpos-T-Lymphozyten auf
andere Effektorzellgruppen im Sinne einer Proliferationskontrolle?
In den von uns erhobenen Daten konnte eine signifikant negative Korrelation des
Anteils an CD4pos-T-Zellen im Lymphozytenpool, zur T-lymphozytären TGF-βSynthesekapazität nachgewiesen werden (siehe Abb. 36 A).
Mit dem Anteil TGF-βpos T-Lymphozyten nahm in unserem Probandenkollektiv der
Anteil CD4pos T-Zellen im Lymphozytenpool signifikant ab.
Diesbezüglich sind zwei weitere Tatsachen hervorzuheben. Zum einen, dass, im
Gegensatz zu den TGF-βpos T-Lymphozyten, der Anteil der TGF-βpos-CD3neg
Lymphozyten-Fraktion, die der B-Lymphozyten bzw. NK-Zellen, in keinerlei
Zusammenhang zur Größe der CD4pos-T-Helferzellgruppe steht (siehe Abb. 36B).
Zum anderen, dass der prozentuale Anteil an CD4pos-T-Helferzellen der
Lymphozytenfraktion unseres Probandenkollektivs, unabhängig vom Probandenalter,
relativ konstant war (siehe Abb. 28).
Die CD4pos-T-Helferzellen nehmen aufgrund ihrer zentralen Position in der
Vermittlung und Initiierung lymphozytärer Effektor-Reaktionen eine besondere
Stellung ein. Eine Modulation gerade dieser Zellgruppe, sei es durch Regulation
verschiedener Helferzellfunktionen, oder auch Supression der proliferativen
Eigenschaften, scheint in diesem Zusammenhang sehr plausibel.
Vor diesem Hintergrund erscheint der in unseren Daten gefundene, signifikant
negative Zusammenhang zwischen dem Anteil der regulatorisch aktiven CD3posTGF-βpos-T-Lymphozyten des CD4pos-Zellpools und der relativen Größe der CD4posZellfraktion überaus interessant (siehe Abb. 36A).
- 94 -
Der
negative
Zusammenhang
zwischen
der
T-lymphozytären
TGF-β-
Synthesekapazität und dem relativen Anteil an CD4pos-T-Helferzellen könnte als
Ausdruck einer relevanten Position TGF-β im Rahmen der Interaktions- und damit
Proliferationsregulation dieser Zellgruppe interpretiert werden.
Mit der steigenden Zahl an reifen regulatorischen T-Zellen könnte die Potenz einer
suffizienten Regulation der „Schaltstellen” des Immunsystems im Sinne eines
kontrollierenden, antiproliferativen Effektes steigen. Die T-lymphozytäre TGF-βSynthesekapazität könnte auch einen wichtigen direkter zytokinen Faktor in der
Kontrolle der T-Helferzell-Fraktion darstellen.
Dieser Hypothese nach würde mit zunehmender produktiver Kompetenz der TLymphozyten für das Zytokin TGF-β die Potenz einer suffizienten Regulation des
Immunsystems im Sinne eines kontrollierenden antiproliferativen Effekts steigen.
Als zellulärer Ursprung einer denkbaren über TGF-β-vermittelten Kontrolle
autoreaktiv oder unverhältnismäßig reagierender T-Helferzellen sind vor allem die in
Kapitel 1.2.2. dargestellten induzierbaren Th3-Regulatorzellen zu nennen.
- 95 -
5.4. Übertragbarkeit der Messergebnisse
Neben der Interpretation der hier in-vitro gewonnenen Messwerte soll nun die
Übertragbarkeit auf in-vivo-Prozesse erörtert weden.
5.4.1. Stimulation in-vitro
Die analysierten Lymphozyten unserer Versuche wurden unter Kostimulation mit
Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) und Ionomycin aktiviert, wobei der Großteil
des Signalwegs, ausgehend vom T-Zell-Rezeptor-Komplex, umgangen und
intrazellulär die Endstrecke der Signalkaskade direkt beeinflusst wird
diesen
Bedingungen
kommt
es,
anders
als
bei
einer
[103]
. Unter
physiologischen,
rezeptorgekoppelten Stimulation, zu einer vollständigen, von regulatorischen
Einflüssen abgekoppelten Zellaktivierung mit maximaler Synthese des jeweiligen
Zytokinmusters.
Bei Interpretation aller in-vitro Analysen muss die Abwesenheit des physiologischen
Umfeldes und damit die mögliche Unvollständigkeit komplexer Wechselwirkungen
mit unbekannten Faktoren beachtet werden.
Die in-vitro gewonnenen Daten unserer Versuche sind daher kein Abbild der
lymphozytären TGF-β-Produktion in-vivo, sondern gelten hierbei vielmehr als Maß
der maximalen lymphozytären TGF-β-Synthesekapazität.
Das mit einer hohen TGF-β-Synthesekapazität auch eine hohe TGF-β-Synthese invivo
einhergeht
scheint
schlüssig,
doch
können
komplexe
intrazelluläre
Regelmechanismen, die in-vivo entscheidenden Einfluss auf das aktuelle
Zytokinmuster besitzen könnten, hierbei nicht berücksichtigt werden.
5.4.2. Wahl des Versuchsmaterials
Es ist bekannt, dass einige Subtypen der T-Regulatorzellen in-vivo eine besonders
ausgeprägte TGF-β-Synthesekapazität besitzen (siehe Kap. 1.2.) [13,
33, 56, 105]
. Ein
Großteil dieser Erkenntnisse beruht auf Ergebnissen aus in-vivo Mausmodellen, bei
denen spezifische T-Regulatorzellen aus entsprechenden peripheren Geweben, meist
im Rahmen entzündlicher Reaktionen, entnommen wurden.
- 96 -
Die Wahl des Versuchsmaterials stellt einen wichtigen Faktor zur Interpretation der
Messergebnisse dar. In welchem Maße Lymphozytenpopulationen aus venösen
Blutproben die o.g. Eigenschaften teilen, oder ob die TGF-β-Synthese eine zytokine
Antwort eines spezifischen entzündlichen Kontexts nach Migration in Zielgewebe
darstellt, bleibt bislang unklar.
5.4.3. Wahl der Messmethodik
Zellbezug
Zunächst ist grundlegend anzumerken, dass ohne einen direkten, zellbezogenen
Nachweis die TGF-β-Synthese einer Zellfraktion nur vermutet werden kann.
Die naheliegende Vorstellung einer direkten immunphänotypischen Identifizierung
TGF-βpos (-CD4pos-CD25pos-) T-Regulatorzellen nach Stimulation erwies sich aus
messmethodischen Gründen in unseren Vorversuchen als nicht valide. Die
unspezifische
Aktivierung
der
peripheren
mononukleären
Zellen
mit
PMA/Ionomycin führt zu einer zusätzlichen CD25-Expression auch auf „nichtregulatorischen” Zelltypen (siehe Kap. 1.2.) und verhindert so eine exakte
durchflusszytometrische
Abgrenzung
einer
CD4pos-CD25pos-regulatorischen
Zellfraktion.
Die Messungen unserer Versuchsreihen gliederten sich daher in je eine
durchflusszytometrische Analyse vor und nach Stimulation, wobei der relative Anteil
an reifen CD4pos-CD25pos-CD45RAneg-T-Regulatorzellen vor Stimulation mit der
jeweiligen Anzahl an TGF-βpos-T-Lymphozyten nach Stimulation verglichen wurde.
Hierbei kann ein Zusammenhang zwischen einer hohen TGF-β-Kompetenz,
ausgedrückt in der Anzahl TGF-βpos-Zellen, und einer ausgeprägten TGF-β-Synthese
unter physiologischen Bedingungen nur vermutet werden.
Wie oben erwähnt, könnten vorangestellte Sortierungen der zu untersuchenden
Zellpopulationen, unter Zuhilfenahme eines Magnetic Cell-Sorter, ein geeignetes
Setting zur weiteren Analyse der einzelnen TGF-β-Synthesekapazitäten darstellen.
- 97 -
Zytokinform
Einen weiteren methodischen Aspekt vor dem Hintergrund der Gültigkeit stellt die
Frage nach der „Form” des gemessenen TGF-β dar. TGF-β kommt als
zellmembranständiges sowie als lösliches, sezerniertes Signalmolekül vor
[69]
. Da
membrangebundenes TGF-β im Vergleich zur löslichen, zytokinen Form in
quantitativ zu geringem Maß exprimiert wird, um in der fluoreszenzaktivierten
Durchflusszytometrie Signale detektierbarer Stärke zu erzeugen, ist davon
auszugehen, dass es sich bei den von uns gemessenen TGF-β-Signalen nur um die im
Golgiapparat akkumulierte, lösliche Form des TGF-β handelt. Aussagen über die
TGF-β-Synthesekapazität des zellmembranständigen Signalmoleküls TGF-β können
hier nicht gemacht werden.
5.4.4. Wahl der Auswertung
Anzahl TGF-βpos-T-Lymphozyten als Ausdruck der TGF-β-Synthesekapazität
In dieser Arbeit wurde die Anzahl an TGF-βpos-T-Lymphozyten gemessen, ohne in
der Auswertung eine Aussage über die jeweilige Höhe der TGF-β-Synthesekapazität
zu machen. So ist es denkbar, dass sich die Fraktion der T-Regulatorzellen nicht
durch einen überproportional hohen Anteil an TGF-βpos-Zellen, sondern durch eine
besonders ausgeprägte TGF-β-Kompetenz bzw. Synthese der vorhandenen positiven
Zellen auszeichnet.
Die absolute Höhe der TGF-β-Produktion innerhalb der positiven Zellen wurde in
unserer Auswertung nicht berücksichtigt.
Darstellung der Daten in relativen Größen
Die in den durchflusszytometrischen Messungen gewonnenen Daten wurden in
unseren Auswertungen zum überwiegenden Teil als prozentuale, also relative
Größen angegeben. Alternativ hierzu wäre eine Darstellung der absoluten Zellzahlen
vorstellbar. Aus vornehmlich zwei Gründen denken wir, dass eine Darstellung in
absoluten Zahlen zu weniger gültigen Aussagen geführt hätte.
Es handelt sich bei den hier abzubildenen Daten um die Größe und Charakterisierung
verschiedener T-Zell-Subpopulationen in verschiedenen Altersklassen.
- 98 -
Die absolute Anzahl der Leukozyten sowie Lymphozyten als Grundgesamtheit
unterliegt jedoch selbst einer deutlichen Altersabhängigkeit (siehe Kap. 4.2.1.) und
zudem großen interindividuellen Schwankungen, was bei Darstellung in absoluten
Zahlen die Auswertung deutlich erschwert hätte.
Ein zweiter Aspekt besteht in der Tatsache, dass in unseren Ergebnissen eine
mögliche Interaktion der einzelnen Subpopulationen abgebildet werden soll. Die
statistische Erfassung der Interaktion einzelner Subpopulationen fordert vor dem
interindividuellen Vergleich verschiedener Altersklassen die Darstellung der
gewonnenen Daten in relativen Größen.
Unter Beachtung dieser methodischen Einschränkungen gelten unsere
Ergebnisse als eindeutiger Hinweis für eine mit zunehmendem Lebensalter
ansteigende produktive Kompetenz des humanen T-lymphozytären Systems für
die lösliche Form des Zytokins TGF-β.
- 99 -
5.5. Perspektiven
In der vorliegenden Arbeit konnte anhand von in-vitro Experimenten erstmalig die
Altersabhängigkeit humaner T-lymphozytärer TGF-β-Synthesekapazität gesunder
Probanden dargestellt werden.
Ein interessanter Ansatzpunkt zur weiteren Untersuchung des heranreifenden
regulatorischen Systems sowie der Rolle TGF-βs innerhalb dieses Systems ergäbe
sich aus dem Vergleich der hier erhobenen TGF-β Daten mit den Daten eines
nachweislich (auto-) immunogen erkrankten Patientenkollektivs.
Eine gleichartige Studie mit einer Probandengruppe von Atopikern unterschiedlicher
Altersklassen, könnte hier aufschlussreiche Vergleichswerte liefern.
- 100 -
6.
Zusammenfassung
Einleitung / Problemstellung:
Es ist bekannt, dass das adaptive Immunsystem zum Zeitpunkt der Geburt noch keine
vollständige Funktionalität besitzt. Erst nach umfassendem Antigenkontakt und den
daraus resultierenden Reifungs- und "Lern"-Prozessen innerhalb der ersten
Lebensjahre entwickelt sich die vollständige Kompetenz der antigenspezifischen
Immunmechanismen
[23, 77]
. Mittlerweile können auch innerhalb des so genannten
regulatorisch-aktiven-T-Zell-Systems (T-Regulatorzellen, Tregs), einem komplex
aufgebauten peripheren Regulationssystem zur Unterdrückung fehlgeleiteter,
autoreaktiver und überschießender Immunreaktionen, unreife Vorläuferzellen
identifiziert werden
[104]
. Genauere Daten über mögliche bei der Ausreifung der
Treg-Zellen beteiligte Faktoren, oder Merkmale, die Ausdruck einer Ausreifung sein
könnten, fehlen zurzeit hingegen, genauso wie ein daraus ableitbares, schlüssiges
Konzept, welches die bisherigen Erkenntnisse in einen größeren Kontext
zusammenzufassen versucht. Schon frühe Studien an Knock-out-Mäusen wiesen auf
eine
zentrale
Position
des
Mediators
TGF-β
in
der
Vermittlung
und
Aufrechterhaltung des peripheren immunologischen Gleichgewichtes, ausgehend von
regulatorischen T-Zellen hin
[53, 55, 96]
. Um detailliertere Einblicke in die regelrechte
Entwicklung regulatorisch bedeutsamer Immunkomponenten gewinnen zu können,
wurden in der vorliegenden Arbeit erstmals die Frequenz und der Charakter TGF-βproduzierender T-Lymphozyten gesunder Kinder verschiedener Altersklassen
analysiert.
Methodik:
Es wurden durchflusszytometrische Analysen aufbereiteter und stimulierter T-ZellSubpopulationen venöser Blutproben von über 100 gesunden Säuglingen, Kindern
und Jugendlichen verschiedener Altersklassen durchgeführt. Die Messungen
gliederten sich jeweils in eine FACScan®
Messung vor und nach in-vitro
Stimulation mit Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) und Ionomycin. In einer
separaten
Versuchsreihe
zur
Validierung
pos
wurde
eine
der
FACS-Analyse
pos
vorangegangene Isolation der CD4 -CD25 -regulatorischen T-Zellen unter
Zuhilfenahme eines Magnetic Cell-Sorters (MACS®) realisiert.
- 101 -
Ergebnisse:
Die Ergebnisse der vorliegenden Studie demonstrieren erstmalig eine mit dem Alter
wachsende Kompetenz des T-lymphozytären Systems zur Produktion des löslichen
Zytokins TGF-β. Bezüglich des Ursprungs konnte gezeigt werden, dass keine
Hinweise auf eine hervorstechende TGF-β-Synthesekapazität im Kompartiment der
reifen CD4pos-CD25pos-CD45RAneg-regulatorischen T-Zellen existiert.
Diskussion:
Der wachsende Anteil TGF-β-produzierender Zellen wird von uns als Ausdruck der
Reifung im Sinne der funktionellen Entwicklung effizienter T-Zell-Klone
interpretiert. In Anlehnung an dieses Konzept wäre es auch in Bezug auf unsere
Ergebnisse schlüssig, dass die Konfrontation des heranwachsenden Immunsystems
mit exogenen und endogenen Antigen-Strukturen einen zunehmenden Kontakt
induzierbarer T-Regulatorzellen mit den für sie spezifischen (Auto-) Antigenen
ermöglicht. Eine hierüber stattfindene Induktion TGF-β-sezernierender Th3-Zellen
könnte in der Funktion „zytokiner Schaltstellen” eine periphere Konversion weiterer
antigenstimulierter induzierbarer Regulatorzellen, z.B. der Typ1-T-Regulatorzellen,
vermitteln. Eine selektive Heranreifung TGF-β-produzierender antigenspezifischer
induzierbarer regulatorischer Th3-Zellen könnte den steigenden Anteil TGF-βkompetenter T-Lymphozyten unserer Studie erklären. Die zunehmende TGF-βSynthese würde so eine zelluläre periphere Toleranzinduktion der entsprechenden
Antigene realisieren, den Aufbau eines regulatorischen Gleichgewichts und hierüber
den Rückgang der klinischen Symptomatik der vormals relevanten immunogenen
Reaktionen ermöglichen. Hierüber entsteht ein plausibles Modell der häufig
beobachteten oralen Toleranzentwicklung im Rahmen der Spontanremission einiger
Nahrungsmittelallergien im Kindes- und Jugendalter. Im Umkehrschluss wäre es
vorstellbar, dass sich mangelhafte antigengekoppelte Reifungsprozesse u.a. in einer
verminderten produktiven Kompetenz der beteiligten Zellsysteme für das
regulatorisch bedeutsame (Effektor-) Zytokin TGF-β äußern. Der Gedanke einer
unzureichenden Ausreifung der an der peripheren Toleranzinduktion beteiligten
Immunkomponenten,
z.B.
aufgrund
einer
unzureichenden
(Auto-)
Antigenexposition, könnte ein wichtiger Faktor in der Entwicklung von (Auto-)
Immunerkrankungen sein.
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role for transforming growth
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large T cell pool recognizing a self-peptide in humans. J. Exp. Med. 195 (4),
485-494
- 116 -
8.
Anhang
8.1. Studien-Informationen
Elterninformation zur Teilnahme an der klinischen Studie
„Bestimmung der Frequenz TGF-β-produzierender T-Lymphozyten bei
gesunden Kindern verschiedener Altersklassen.“
Sehr geehrte Eltern,
seit einigen Jahren stellt die steigende Anzahl der Kinder und Jugendlichen mit
Allergien, Neurodermitis, Asthma bronchiale und rheumatischen Erkrankungen eine
zunehmende Herausforderung in der Kinderheilkunde dar. In der Entstehung dieser
Leiden sind in erster Linie abnorme Reaktionen des Immunsystems und seiner Zellen
von Bedeutung.
Die Universitäts-Kinderklinik Bochum beschäftigt sich seit Jahren intensiv mit der
Erforschung des normalen sowie des gestörten Immunsystems, um hieraus
Erkenntnisse zur Behandlung und Linderung dieser Krankheitsbilder ableiten zu
können.
Sie können uns bei der weiteren Erforschung des kindlichen Immunsystems helfen,
indem Sie uns die Möglichkeit geben, wichtige Daten über die beteiligten Zellen,
auch aus einer Blutprobe Ihres Kindes, zu gewinnen.
Hierfür wäre eine Blutprobe von 5 ml ausreichend, die wir, um Ihr Kind nicht
zusätzlich zu belasten, während einer anderweitig geplanten Blutabnahme entnehmen
würden.
Die Teilnahme an dieser klinischen Studie beschränkt sich auf die einmalige
Abnahme von 5 ml venösem Blut.
- 117 -
Unverzichtbare Voraussetzung für die Durchführung einer klinischen Studie ist, dass
Sie Ihr Einverständnis zur Teilnahme schriftlich erklären.
Die Teilnahme an einer klinischen Studie ist immer freiwillig und kann jederzeit
ohne Angabe von Gründen durch Sie beendet werden, ohne dass Ihrem Kind
hierdurch Nachteile in seiner medizinischen Betreuung entstehen.
Bitte lesen Sie den folgenden Text als Ergänzung zum Informationsgespräch
sorgfältig durch und zögern Sie nicht, Fragen zu stellen.
Bitte unterschreiben Sie die Einwilligungserklärung, wenn Sie
-
Art und Ablauf der klinischen Studie vollständig verstanden haben,
-
bereit sind, der Teilnahme zuzustimmen,
-
und sich über Ihre Rechte als Teilnehmer an dieser klinischen Studie im Klaren sind.
1.
Was ist der Sinn dieser klinischen Studie?
Die weißen Blutkörperchen, als zellulärer Träger des Immunsystems, können anhand
ihrer Eigenschaften und Fähigkeiten in eine Vielzahl von Untergruppen eingeteilt
werden. Das korrekte Zusammenspiel dieser Untergruppen und ihrer Botenstoffe ist
Voraussetzung für eine funktionierende Immunantwort. Einer der identifizierten
Botenstoffe weißer Blutkörperchen ist das so genannte TGF-β (transforming growth
factor), dem eine Schlüsselstellung in der regelhaften Ausreifung des Immunsystems
zugeschrieben wird. Ziel unserer Untersuchungen ist es, erste Daten für diesen von
den Immunzellen produzierten Botenstoff zu gewinnen.
2.
Worin liegt der Nutzen einer Teilnahme an dieser klinischen Studie?
Es ist nicht zu erwarten, dass Ihr Kind durch die Teilnahme an dieser klinischen
Studie einen direkten Nutzen haben wird. Die aus den Untersuchungen gewonnenen
Daten könnten in Zukunft zu neuen wissenschaftlichen Erkenntnissen auf dem
Gebiet der Immunologie führen und so helfen, neue diagnostische und therapeutische
- 118 -
Konzepte zur Behandlung, unter anderem der oben genannten Krankheitsbilder zu
entwickeln.
3.
Wie läuft diese klinische Studie ab?
Diese klinische Studie wird ausgehend von der Universitäts-Kinderklinik Bochum in
Zusammenarbeit mit der kinderchirurgischen Klinik des Marienhospital-Herne und
verschiedenen niedergelassenen Kooperationspartnern durchgeführt. Im Rahmen
einer bereits geplanten diagnostischen Blutabnahme werden Ihrem Kind zusätzlich 5
ml venöses Blut für die Zwecke der Studie entnommen. Die Blutentnahme erfolgt
durch den schon bestehenden venösen Zugang, sodass kein erneuter Einstich in die
Vene nötig ist, und wird von Ihrem betreuenden Arzt, mit dem Sie zusammen an
dieser Studie teilnehmen, durchgeführt. Die Blutprobe wird nach Blutentnahme noch
am selben Tag in das immunologische Labor der Universitäts-Kinderklinik Bochum
transportiert und dort nach einem festgelegten Laborprotokoll analysiert. Mögliche
Restmengen werden den Richtlinien entsprechend entsorgt. Die gewonnenen Daten
werden gespeichert.
4.
In welcher Weise werden die im Rahmen dieser klinischen Studie
gesammelten Daten verwendet?
Sofern gesetzlich nicht anders vorgesehen, haben nur der Doktorand, sein Betreuer
und deren Mitarbeiter Zugang zu den personenbezogenen Daten. Diese Personen
unterliegen der Schweigepflicht. Die personenbezogenen Daten werden im Rahmen
der Studie nicht veröffentlicht, sondern gehen anonym in die Auswertungsergebnisse
ein.
Beim
Umgang
mit
allen
Daten
werden
die
Bestimmungen
des
Datenschutzgesetzes beachtet. Um die Richtigkeit der Datenaufzeichnung zu
überprüfen, dürfen Beauftragte der zuständigen Behörden beim Studienarzt Einblick
in die personenbezogenen Daten nehmen.
5.
Gibt es Risiken, Beschwerden oder Begleiterscheinungen?
Die zusätzliche Blutentnahme von 5 ml ist für Ihr Kind ungefährlich und
unbedenklich. In manchen Fällen kann es nach einer Blutentnahme an der
- 119 -
Einstichstelle zu einem kleinen Bluterguss kommen, der sich aber ohne Zutun in den
kommenden Tagen wieder zurückbildet. Es entstehen durch die Teilnahme an dieser
klinischen Studie keine zusätzlichen Beschwerden, Begleiterscheinungen oder
Risiken für Ihr Kind.
6.
Ergeben sich aus der Teilnahme an dieser klinischen Studie
irgendwelche Verpflichtungen?
Die Teilnahme an dieser klinischen Studie beschränkt sich auf die einmalige Abgabe
von 5 ml venösem Blut. Es entstehen keinerlei zusätzliche Verpflichtungen seitens
der Eltern.
7.
Entstehen für die Teilnehmer Kosten? Gibt es eine Kostenerstattung
oder eine Vergütung?
Durch die Teilnahme Ihres Kindes an dieser klinischen Studie entstehen für Sie keine
zusätzlichen Kosten. Für die Teilnahme Ihres Kindes an dieser klinischen Studie
erhalten Sie keine Vergütung.
8.
Möglichkeit zur Diskussion weiterer Fragen:
Für weitere Fragen im Zusammenhang mit dieser klinischen Studie stehen Ihnen der
Doktorand und der Studienleiter gern zur Verfügung.
Doktorand: L. H. Beck
Studienleiter:
Prof. Dr. U. Schauer
- 120 -
Kinderinformation zur Teilnahme an dieser klinischen Studie
„Bestimmung der Frequenz TGF-β produzierender T-Lymphozyten bei
gesunden Kindern verschiedener Altersklassen.“
Hallo,
bevor Du Dich entschließt, bei dieser klinischen Studie mitzumachen, wird Dir Dein
Doktor ganz genau erklären, warum diese Studie gemacht wird. Er wird Dir auch
erzählen, was mit Dir passieren wird und was die guten und die schlechten Dinge an
der Studie sind. Bitte sei nicht zu schüchtern, Deinem Doktor Fragen zu stellen.
Du kannst ihn alles fragen was Du nicht verstehst und er wird es Dir dann gerne
erklären.
1. Warum wird diese Studie gemacht?
Die Studie wird gemacht, um festzustellen, was Deine weißen Blutzellen so alles
können. Wir werden uns die weißen Blutkörper aus Deinem Blut dabei im Labor
ganz genau anschauen und einige Tests mit ihnen durchführen. Alle weißen
Blutkörperchen können verschiedene Stoffe im Blut produzieren. Uns interessiert
dabei vor allem ein bestimmter Stoff, der den komischen Namen "TGF-beta" trägt.
Wir untersuchen dabei ob, und wie viel dieses "TGF-beta" Deine weißen Blutzellen
herstellen. Wenn wir dann wissen, wie viel Deine weiße Blutzellen schaffen, schauen
wir, ob das bei den vielen anderen untersuchten Kindern genauso ist.
2. Was wird Dir während der Studie passieren?
Wenn Du damit einverstanden bist, nimmt der Doktor Dir ein bisschen Blut ab. Dazu
muss er Dich mit einer dünnen Nadel einmal kurz pieksen. Wenn Du möchtest,
kannst Du vorher ein Pflaster bekommen, dann spürst Du fast nichts von dem Pieks.
Ganz selten mal kannst Du einen kleinen blauen Fleck an der Stelle bekommen, wo
der Doktor das Blut abgenommen hat. Die Abnahme ist aber ungefährlich für Dich.
- 121 -
3. Was sind die schlechten Dinge an der Studie?
Die Blutabnahme kann etwas wehtun, aber nur für eine kurze Zeit. Es kann auch
passieren, dass Du einen blauen Fleck an der Stelle bekommst oder eine kleine
Schwellung, die aber schnell wieder weggeht.
4. Was sind die guten Dinge an der Studie?
Gut ist, dass Du uns hilfst, ein bisschen mehr über diese weißen Blutkörperchen zu
erfahren. Vielleicht kann dann einmal Kindern, die Krankheiten haben, besser
geholfen werden.
5. Kannst Du selber entscheiden, ob Du an der Studie teilnimmst?
Du musst nicht an der klinischen Studie teilnehmen, wenn Du das nicht möchtest.
Selbst wenn Du jetzt ja sagst, kannst Du immer, auch nachdem die Studie begonnen
hat, Deine Meinung ändern und aufhören. Niemand wird auf Dich böse sein und
Dein Doktor wird sich auch dann noch weiter um Dich kümmern.
- 122 -
Danksagung
Wie die allermeisten Dinge im Leben, so wäre auch die vorliegende Dissertation
nicht ohne breite Unterstützung und Hilfe zustande gekommen.
An erster Stelle gilt mein herzlichster Dank meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr.
med. Uwe Schauer, der mit der Überlassung des Themas, seiner ständigen
Gesprächsbereitschaft und einer intensiven Betreuung weit über das übliche Maß
hinaus wesentlich zum Gelingen dieser Arbeit beitrug.
Weiterhin möchte ich herzlich den Mitarbeiterinnen des immunologischen Labors
der Universitätskinderklinik Bochum danken, Frau Veronika Baumeister und Frau
Angelika Michels, die mich nicht nur mit viel Geduld in die Labormethodik
einarbeiteten, sondern mir während der gesamten Zeit eine wissenschaftliche und
praktische Unterstützung waren.
Ferner danke ich allen Kooperationspartnern der Studie, den Mitarbeitern der
kinderchirurgischen Abteilung des Marienhospitals Herne, der kinderchirurgischen
Praxis Dr. med. Standke in Bochum-Wattenscheidt sowie der anästhesiologischen
Gemeinschaftspraxis Dres. med. Thöns und Müller-Berge in Witten, für die
unkomplizierte und effiziente Mitarbeit.
Ebenso danken möchte ich meinen Freunden und meiner Familie für die stete
moralische Unterstützung und den Zuspruch in dunkleren Tagen.
Curriculum vitae
KONTAKTDATEN____________________________________________________
Name:
Lars Hendrik Beck
PERSÖNLICHE ANGABEN____________________________________________
Geburtsdatum:
11.08.1977
Geburtsort:
Frankfurt am Main
Familienstand:
ledig
Staatsangehörigkeit: deutsch
SCHULISCHE AUSBILDUNG __________________________________________
1984 – 1988
Grundschule Brenschen-Schule, Witten-Bommern
1988 – 1997
Abitur Schiller-Gymnasium, Witten
UNIVERSITÄRE AUSBILDUNG________________________________________
10/1999
Beginn des Humanmedizinstudiums
Ruhr-Universität Bochum
09/2001
Ärztliche Vorprüfung
08/2002
1. Teil Ärztl. Prüfung
03/2005
2. Teil Ärztl. Prüfung
05/2006
3. Teil Ärztl. Prüfung
05/2006
Abschluss des Humanmedizinstudiums
Ruhr-Universität Bochum
06/2006
Approbation als Arzt
KLINISCHE AUSBILDUNG____________________________________________
02/2003
einmonatige Famulatur – Innere Medizin
Marienhospital Herne
Klinikum der Ruhr-Universität Bochum
08/2003
einmonatige Famulatur – Intensivmedizin
Marienhospital Herne
Klinikum der Ruhr-Universität Bochum
09/2003
einmonatige Praxisfamulatur – Gynäkologie
Dr. Ordibeheschti, Hamburg
03/2004
einmonatige Famulatur – Innere Medizin/Kardiologie
Klinikum der Philipps Universität Marburg
04/2005
1. Tertial des Praktischen Jahres – Chirurgie
Augusta-Kranken-Anstalt Bochum
Klinikum der Ruhr-Universität Bochum
08/2005
2. Tertial des Praktischen Jahres – Innere Medizin
Augusta-Kranken-Anstalt Bochum
Klinikum der Ruhr-Universität Bochum
11/2005
3. Tertial des Praktischen Jahres – Pädiatrie
St. Josef-Hospital Bochum
Klinikum der Ruhr-Universität Bochum
AUSZEICHNUNGEN__________________________________________________
2002
Fakultätspreis der Ruhr-Universität Bochum
für herausragende Studienleistungen
BERUFLICHER WERDEGANG_________________________________________
09/2006
Assistenzarzt, Klinik für Kardiologie, Pneumologie und
Angiologie
Universitätsklinikum Düsseldorf
07/2007
Assistenzarzt, Fachbereich Pädiatrie
St. Josef-Hospital Bochum
Klinikum der Ruhr-Universität Bochum