Affinitätschromatographie

Biochemisches
Grund
Grundpraktikum
Versuch Nummer GG-06:
06:
Affinitätschromatographie und
Charakterisierung von ImmungloImmunglobulinen
Versuch Nummer G-06
BC-Grundpraktikum
Gliederung:
I.
Das Immunsystem.............................................................................................. 2
a)
b)
c)
Einleitung .................................................................................................................... 2
Humorale Abwehr ....................................................................................................... 2
Zelluläre Abwehr ......................................................................................................... 3
II. Ammoniumsulfatfällung .................................................................................... 3
a)
b)
c)
Theoretische Grundlagen............................................................................................ 3
Versuchsziele, Aufgaben............................................................................................. 3
Versuchsdurchführung ................................................................................................ 3
III. Gelfiltration ......................................................................................................... 4
a)
b)
c)
d)
Theoretische Grundlagen............................................................................................ 4
Versuchsziele, Aufgaben............................................................................................. 4
Versuchsdurchführung ................................................................................................ 4
Beobachtungen........................................................................................................... 4
IV. Affinitätschromatographie................................................................................. 4
a)
b)
c)
d)
e)
Theoretische Grundlagen............................................................................................ 4
Versuchsziele, Aufgaben............................................................................................. 5
Versuchsdurchführung ................................................................................................ 5
Meßergebnisse und Beobachtungen........................................................................... 5
Auswertung und Diskussion ........................................................................................ 5
V. Titerbestimmung nach OUCHTERLONY ............................................................... 6
a)
b)
c)
d)
e)
Theoretische Grundlagen............................................................................................ 6
Versuchsziele, Aufgaben............................................................................................. 6
Versuchsdurchführung ................................................................................................ 6
Meßergebnisse und Beobachtungen........................................................................... 7
Auswertung und Diskussion ........................................................................................ 7
VI. SDS-Gelelektrophorese ..................................................................................... 7
a)
Auswertung und Diskussion ........................................................................................ 7
-1-
Versuch Nummer G-06
I.
BC-Grundpraktikum
Das Immunsystem
a) Einleitung
Damit sich ein Organismus gegen die Einflüsse von außen schützen kann, hat sich in
vielen Lebewesen eine effektive Abwehr aufgebaut. Die Hauptaufgabe dieses Immunsystems ist es, zwischen fremd und eigen zu unterscheiden. Zum einen gibt es die
unspezifische Resistenz, zum anderen die spezifische Immunität. Bei Wirbeltieren ist
letzere sehr stark ausgeprägt; deshalb wird im folgenden Text Bezug auf das menschliche Immunsystem genommen. Besonders wichtig sind seine Fähigkeiten, spezifisch
zu arbeiten und sich zu erinnern. Dafür stehen zwei unterschiedliche aber in Verbindung stehende Wege: Die humorale und die zelluläre Abwehr.
b) Humorale Abwehr
Zu dieser Immunantwort zählen lösliche Proteine, die Antikörper, die von Plasmazellen
bereitgestellt werden. Sie sind in unvorstellbar hoher Anzahl (ca. 1020) im Körper
vorhanden. Nur ein Bruchteil von ihnen ist (zufällig) identisch, denn der Organismus
stellt sie willkürlich her. Trotzdem findet sich zu nahezu allen Fremdstoffen (Antigenen) ein passender Antikörper.
Die Strukturen, die von einem Antikörper erkannt werden, heißen Epitope. Es sind Regionen auf großen Molekülen wie z.B. Proteinen,
Kohlenhydraten und Nukleinsäuren. Sie sind
oft klein (bei Proteinen reichen 10 Aminosäuren), aber geringe Veränderungen können
durch Antikörper erkannt werden.
Der Antikörper an sich ist ebenfalls ein Proteinmolekül. Er besteht aus ca. 20.000 Atomen
und baut sich aus vier Polypeptidketten auf:
Zwei identische leichte und zwei identische
schwere Ketten (siehe Abb. I-1). Bis auf rund
50 variable Positionen unter den ersten
110 Aminosäuren gleichen sich die AntikörAbb. I-1 : Modell eines Antikörpers1
permoleküle. Durch diese Positionsunterschiede
entstehen die variablen Regionen, die für die spezifische Bindung verantwortlich sind.
An der Spitze jedes variablen Anschnitts befindet sich eine konkav geformte Bindungsstelle, deren dreidimensionale Struktur ein komplementäres Epitop erkennen
und fest binden kann. Orte mit besonders hoher Variabilität nennt man hot spots; hier
ist die Mutationsrate am höchsten.
Die schweren und die leichten Ketten werden durch interchenäre Disulfidbrücken
verkettet. Die einzelnen Ketten sind intrachenär ebenfalls durch Disulfidbrücken stabilisiert. Antikörper können auf verschiedene Weisen in ihre Untereinheiten gespalten werden (siehe Abb. I-2, nächste Seite). Die antigenbindenden Regionen (FAB) können durch Papain abgetrennt werden, so daß man zwei identische Fragmente und das
an Rezeptoren bindende Teilstück FC erhält. Soll die Fähigkeit zur Präzipitation uns
Agglutination erhalten bleiben, kann mit Pepsin gespalten werden. Dadurch bleiben
die FAB-Regionen als Funktionseinheit erhalten und lediglich das FC-Fragment wird
hydrolysiert.
1
Quelle: Spektrum der Wissenschaft: Immunsystem
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Versuch Nummer G-06
BC-Grundpraktikum
Abb. I-2: Enzymatische Spaltung von Antikörpern
c) Zelluläre Abwehr
Der zweite Teil des Abwehrmechanismus besteht, wie der Name vermuten läßt, aus
Zellen. Die wichtigsten Zelltypen sind die Leukozyten. Je nach Herkunft unterscheide
man zwischen T- und B-Lymphozyten. Das T stehe für thymus, das B für bonemarrow,
also das Knochenmark. Weitere Unterscheidungen werden durch die Funktionen der
Zellen gegeben. So gibt es T-Helferzellen, T-Killerzellen und T-Gedächtniszellen. Auf ihnen befinden sich hochspezifische Rezeptoren, mit denen sie gebundene (präsentierte)
Antigene erkennen können.
Die B-Lymphozyten produzieren Antikörper, die sie auf ihrer Zelloberfläche präsentieren. Plasmazellen entstehen durch die induzierte Zellteilung und nachfolgende Differenzierung zu ER-reichen, ihr Antikörper-Protein synthetisierenden und sezernierenden Effektorzellen.
II.
Ammoniumsulfatfällung
a) Theoretische Grundlagen
Die Löslichkeit des Proteins wird durch Ammoniumsulfat ((NH4)2SO4) so stark vermindert, daß es ausfällt.
b) Versuchsziele, Aufgaben
Das anti-BSA-Protein soll mit Ammoniumsulfat ausgefällt werden.
c) Versuchsdurchführung
In einem Eppendorfgefäß werden 200 µl des anti-BSA-Serums mit 200 µl der ausstehenden Ammoniumsulfatlösung (418 mg in 1 ml Wasser) versetzt und gut vermischt
(Whirl-Mix). Durch zweiminütiges Zentrifugieren bei 5000 U⋅min-1 erhält man das
Protein als Sediment; der Überstand wird vorsichtig abpipettiert. Das Sediment wird
in 200 µl PBS (phosphate buffered saline) gelöst (ebenfalls mit Hilfe des Whirl-Mix). Davon entnimmt man 20 µl und pipettiert sie in ein anderes Eppendorfgefäß. Den Rest
der Lösung versetzt man mit wenig Hämoglobin, um eine Rotfärbung zu erhalten.
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Versuch Nummer G-06
III.
BC-Grundpraktikum
Gelfiltration
a) Theoretische Grundlagen
Bei der Gelfiltration werden Moleküle nach ihrer Größe getrennt. Das Prinzip ist folgendes: Die Polymere des Gels bilden ein Netzwerk mit unterschiedlich großen Poren
aus. Kleine Moleküle können sich dort einlagern, während die großen daran vorbei
diffundieren. Aus diesem Grund bleiben die kleinen Moleküle länger in der Säule zurück.
b) Versuchsziele, Aufgaben
Durch die Gelchromatographie soll eine erste Reinigung der Proteinlösung erfolgen.
Vor allem noch enthaltenes Ammoniumsulfat wird abgetrennt.
c) Versuchsdurchführung
Zuerst wird die Säule mit ca. 5 ml der Sephadex® 50-Suspension gefüllt und nach
dem Absetzen zweimal mit ca. 10 ml PBS äquilibriert, wodurch sich ein gleichmäßiges Gel absetzt. Nachdem fast der gesamte Überstand abgelassen worden ist, werden
vorsichtig die 180 µl angefärbte Probe aufgetragen und ins Gelbett einlaufen gelassen.
Die Probe wird mit ca. 11 – 12 ml PBS eluiert und das Eluat zu 1 ml in numerierten
Eppendorfgefäßen aufgefangen. Die am stärksten gefärbte Fraktion wird für die Affinitätschromatographie aufbewahrt.
d) Beobachtungen
Von den eluierten Fraktionen sind bis auf vier alle nicht sichtbar gefärbt. Die stärkste
Färbung weist die dritte Fraktion auf; sie wurde für den nächsten Versuch verwendet.
IV.
Affinitätschromatographie
a) Theoretische Grundlagen
Mit dieser Methode hat die Biochemie eines ihrer effektivsten Trennverfahren gewonnen. Die Grundlagen der Affinitätschromatographie liegen in spezifischen Wechselwirkungen zwischen (Makro)Molekülen. Besonders wichtig sind hierbei Antikörper – Antigen, Protein – Substrat, Hormon – Rezeptor, Kohlenhydrat – Lectin und
komplementäre Nukleinsäuren.
Wie bei allen chromatographischen Verfahren gibt es auch hier eine stationäre und
eine mobile Phase. Die stationäre Phase besteht häufig aus hochmolekularen Biopolymeren wie Polysacchariden. An diese sind die Effektoren gebunden, die für die spezifische Affinität verantwortlich sind. An den Träger der stationären Phase werden
eine Menge Anforderungen gestellt, u.a. chemische Resistenz, keine Wechselwirkungen und definierte Porengröße. Kompliziert ist daher die Bindung der Effektors an
den Träger und zwar in der Weise, daß die funktionelle Einheit frei zugänglich bleibt.
Eine Methode für Agarosegele ist die Aktivierung durch Bromcyan (siehe Skript,
G-05 Seite 5).
Die Effektivität der Trennung ist durch die Dissoziationskonstante des gebildeten
Komplexes aus Effektor und Substrat gegeben. Je geringer sie ist, desto besser ist die
Affinität und damit die Trennleistung. Zum Ablösen des Substrats muß man die Bedingungen häufig drastisch ändern (z.B. pH-Wert oder Ionenstärke).
Als Effektor in diesem Versuch wird ein 46 kDa Protein (Protein A) aus staphyllococcus
aureus verwendet, das in seiner Membran vorkommt. Es kann spezifisch mit den FcRegionen der IgG Molekülen interagieren und auf diese Weise zwei Antikörper
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Versuch Nummer G-06
BC-Grundpraktikum
gleichzeitig binden. Für die Bindung von 25 mg IgG sind 2 mg des Protein A notwendig.
Die photometrische Messung beruht auf der Absorption zweier Aminosäuren (Tryptophan und Tyrosin) bei dieser Wellenlänge. Sie unterliegt allerdings großen
Schwankungen.
b) Versuchsziele, Aufgaben
Durch die Affinitätschromatographie soll das anti-BSA von den übrigen Proteinen getrennt werden. Die erhaltenen Fraktionen werden in einem UV-Photometer auf ihren
Proteingehalt untersucht.
c) Versuchsdurchführung
Die ausgegebene Sepharose®-4Cl-Protein-A-Säule wird mit PBS dreimal gewaschen.
Dann gibt man die zuvor aufbewahrte Proteinfraktion auf, läßt diese einsinken und
eluiert mit PBS solange, bis das Eluat farblos ist. Damit wird erreicht, das die mit
Hämoglobin markierten Proteine entfernt wurden. Um die an Protein-A gebundenen
anti-BSA-Moleküle freizusetzen, eluiert man mit dem Elutionspuffer, der einen pHWert von 2.5 hat. Damit die Proteine sich wieder regenerieren können legt man in die
Eppendorfgefäße je 5µl einer 1 M Na2HPO4-Lösung vor; die Lösung erhält so einen
pH-Wert von ca. 7.4. Es werden ca. 10 Fraktionen zu 1 ml gesammelt, von denen bei
280 nm die Extinktion (gegen den Elutionspuffer als Referenzwert) gemessen wird.
d) Meßergebnisse und Beobachtungen
Bis das Eluat farblos ist, werden ca. 6 ml PBS benötigt. Die photometrische Bestimmung lieferte folgende Extinktionen:
Fraktion
Die Messung wurde nach der fünften Fraktion eingestellt, da dieser Wert bereits null
war.
E280
1
2
3
4
5
0.140
0.555
0.056
0.002
0.000
e) Auswertung und Diskussion
Aufgrund der Extinktionen erkennt man deutlich, daß die Ablösung der Proteine
schnell erfolgt. Schon nach der zweiten Fraktion ist kaum noch Protein in der Lösung
enthalten. wie man anhand der graphischen Darstellung (Diagramm IV-1, nächste
Seite) sieht, setzt sich der Peak der zweiten Fraktion sich klar von den übrigen Werten
ab, so daß diese Fraktion eindeutig die größte Menge an Protein enthält.
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Versuch Nummer G-06
BC-Grundpraktikum
Elutionsdiagramm
0.600
0.555
0.500
Extinktion
0.400
0.300
0.200
0.140
0.100
0.056
0.002
0.000
4
5
0.000
1
2
3
Fraktionszahl
Diagramm IV-1 : Elutionsdiagramm
V.
Titerbestimmung nach OUCHTERLONY
a) Theoretische Grundlagen
Zur Feststellung der Konzentration einer Antikörperlösung kann die Doppeldiffusions-Methode nach OUCHTERLONY eingesetzt werden. Das Prinzip beruht auf der Bildung von sichtbaren (opaken) Banden in einem Agarosegel In dem Gel können die
Antikörper frei gegen ihre Antigene diffundieren und bilden am Äquivalenzpunkt
eine Präzipitatlinie aus. Je nach Konzentration der zu untersuchenden Lösung liegt
diese Linie in der Nähe der Auftragungsstelle der Antikörper oder der der Antigene.
Mit geeigneten Substratkonzentration kann man daher die enthaltene Menge abschätzen.
b) Versuchsziele, Aufgaben
Die isoliert IgG-Fraktion aus IV wird dem Doppeldiffusionstest nach OUCHTERLONY
unterzogen.
c) Versuchsdurchführung
In eine kleine Petrischale wird die heiße Agaroselösung gegossen und bis zum Erstarren stehengelassen. Mit Hilfe einer Stanze werden sieben Vertiefungen markiert, die
mit einer Pipettenspitze abgesaugt werden. Dabei ist darauf zu achten, daß die Vertiefungen nicht bis auf den Glasboden reichen. In die Taschen werden folgende Lösungen (nächste Seite) aufgetragen:
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Versuch Nummer G-06
BC-Grundpraktikum
Reagenzglas, Verdünnung
Tasche
1
Stammlösung
2
1:1
3
1:2
4
1:4
5
1:8
6
1:16
7
1:32
Konzentration
in mg/ml
2
1
0.5
0.25
0.125
0.068
0.034
Die Verdünnungsreihe erhält man, indem man von der Stammlösung 40 µl in ein
kleine Reagenzglas füllt, davon 20 µl entnimmt und in ein mit 20 µl PBS beschicktes
Reagenzglas füllt. Davon entnimmt man wiederum 20 µl und verfährt wie zuvor.
Die fertige Petrischale wird abgedeckt für vier Stunden in einer feuchten Kammer inkubiert.
d) Meßergebnisse und Beobachtungen
Es waren keinerlei Banden oder Veränderungen erkennbar.
e) Auswertung und Diskussion
Als Erklärung des Mißlingens kann eine zu hohe Verdünnung angegeben werden.
Die untersuchte Fraktion enthält wahrscheinlich zu wenige Antikörper, da nur die
stärksten Fraktionen aus zwei Säulenchromatographien verwendet wurden. Hinzu
kamen Pipettierfehler, die bei so kleinen Mengen einen großen Einfluß auf die Ergebnisse haben.
VI.
SDS-Gelelektrophorese
a) Auswertung und Diskussion
Die Banden (6 und 7) der SDS-Page sind nur sehr undeutlich zu erkennen. Eine davon kommt durch die schweren Ketten mit ca. 50 kDa, die andere durch die leichten
Ketten mit ca. 25 kDa zustande. Da bei der Elektrophorese die größeren (schwereren)
Proteine weniger weit wandern, handelt es sich bei der ersten Bande um die 50 kDaKetten, bei der zweiten um die 25 kDa.
Wie schon bei der Titerbestimmung nach OUCHTERLONY, sind hier die zu große Verdünnung und Pipettierfehler als Ursachen für die zu schwache Färbung anzusehen.
Selbst bei der ungereinigten Fraktion ist keine deutliche Bandenbildung zu sehen.
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