Einfluss von FcrRIIB auf die humorale Toleranz in der humanisierten

Einfluss von FcγγRIIB auf die humorale Toleranz
in der humanisierten Maus
Der naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.
vorgelegt von
Anne Bärenwaldt
aus Rostock
Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung:
13.05.2011
Vorsitzender der Promotionskommission:
Prof. Dr. Rainer Fink
Erstberichterstatter:
Prof. Dr. Falk Nimmerjahn
Zweitberichterstatter:
Prof. Dr. Lars Nitschke
„Ernst zu nehmende Forschung erkennt man daran, daß plötzlich zwei
Probleme existieren, wo es vorher nur eines gegeben hat.“
Thorstein Bunde Veblen
Inhaltsverzeichnis
1
ZUSAMMENFASSUNG ................................................................ 1
2
SUMMARY ................................................................................. 2
3
EINLEITUNG ............................................................................. 3
3.1 Das Immunsystem ....................................................................................... 3
3.2 B-Zell Entwicklung ....................................................................................... 4
3.3 Toleranz ....................................................................................................... 5
3.3.1
Zentrale Toleranz ................................................................................... 6
3.3.2
Periphere Toleranz .................................................................................. 6
3.4 Autoimmunität ............................................................................................. 7
3.5 Fc gamma Rezeptoren .................................................................................. 8
3.6 FcγγRIIB ......................................................................................................... 9
3.7 Regulation von B-Zellen durch FcγγRIIB......................................................... 9
3.8 FcγγRIIB und Autoimmunität........................................................................ 12
3.8.1
Maus Studien........................................................................................12
3.8.2
Humane Studien ...................................................................................12
3.9 RNA Interferenz ......................................................................................... 13
3.10 Das humanisierte Mausmodell................................................................. 15
4
FRAGESTELLUNG..................................................................... 16
5
ERGEBNISSE ........................................................................... 17
5.1 Generierung von humanisierten Mäusen mit natürlich vorkommenden
Polymorphismen im FcγγRIIB Gen ............................................................... 17
5.1.1
Genotypisierung der HSCs ......................................................................17
5.1.2
Rekonstitution von NOD scid gamma (NSG) Mäusen mit
genotypisierten HSCs .............................................................................19
5.1.3
Bestimmung des inhibitorischen Potenzials von FcγRIIB..............................20
5.2 Generierung von humanisierten Mäusen mit shRNA infizierten HSCs ........ 22
5.2.1
Auswahl einer shRNA für die Regulierung der FcγRIIB Expression ................22
5.2.2
Infektion von HSCs................................................................................24
5.2.3
Rekonstitution von NSG Mäusen mit infizierten HSCs .................................25
5.2.4
Regulation von FcγRIIB in infizierten Zellen in vivo.....................................26
Inhaltsverzeichnis
5.3 Charakterisierung des humanen Immunsystems in humanisierten
Mäusen ...................................................................................................... 27
5.3.1
Analyse von humanem Knochenmark und humaner Milz.............................27
5.3.2
Analyse des Immunsystems in humanisierten Mäusen ...............................30
5.4 Architektur in sekundären lymphatischen Organen von humanisierten
Mäusen ...................................................................................................... 34
5.5 B-Zell Toleranz in den humanisierten Mäusen ............................................ 35
5.5.1
Rekonstitution der einzelnen Gruppen ......................................................35
5.5.2
Serum Immunglobuline..........................................................................37
5.5.3
Korrelation zwischen Humanisierungsgrad und Antikörperproduktion ..........38
5.5.4
Produktion von Autoantikörpern in humanisierten Mäusen ..........................41
5.5.5
Detektion von Antikörper-sekretierender Zellen.........................................47
5.6 B-Zell Entwicklung und Reifung in humanisierten Mäusen ......................... 50
5.6.1
Verteilung der Zellpopulationen in Milz und Knochenmark...........................50
5.6.2
B-Zell Entwicklung im Knochenmark ........................................................52
5.6.3
B-Zell Reifung in der Milz........................................................................56
5.7 Regulation von FcγγRIIB auf B-Zellen von humanisierten Mäusen und im
humanen Immunsystem ............................................................................ 61
5.8 Analyse der T-Zell Populationen in Milz und Knochenmark......................... 66
6
DISKUSSION........................................................................... 70
6.1 Generierung humanisierter Mäuse und Charakterisierung des humanen
Immunsystems .......................................................................................... 70
6.2 Produktion von Autoantikörpern in humanisierten Mäusen ........................ 74
6.3 Einfluss von FcγγRIIB auf die B-Zell Entwicklung und Reifung .................... 78
6.4 Einfluss des Transmembranpolymorphismus auf T-Zellen .......................... 83
7
MATERIAL ............................................................................... 85
7.1 Chemikalien, Plasik- und Verbrauchsmaterialien........................................ 85
7.2 Cytokine ..................................................................................................... 85
7.3 Oligonukleotide .......................................................................................... 85
7.4 Kommerzielle Kits ...................................................................................... 85
Inhaltsverzeichnis
7.5 Antikörper und Konjugate für Durchflusszytometrie und
Immunfluoreszenz ..................................................................................... 86
7.6 Material für die Stammzellinjektion............................................................ 87
7.7 Software..................................................................................................... 88
8
METHODEN ............................................................................. 89
8.1 Isolation von humanen CD34+ Stammzellen .............................................. 89
8.2 Isolation genomischer DNA aus Nabelschnurblut ....................................... 89
8.3 Typisierung von Promotorpolymorphismus und
Transmembranpolymorphismus von FcγγRIIB .............................................. 90
8.4 Klonierung.................................................................................................. 91
8.4.1
Herstellung chemisch kompetenter Bakterien............................................91
8.4.2
Transformation von E.Coli TOP10 Bakterien ..............................................91
8.4.3
Isolation von Plasmid DNA aus Bakterien .................................................91
8.4.4
Klonierung der shRNA in den lentiviralen Transfervektor .............................92
8.5 Lentivirale Partikel für RNAi ....................................................................... 93
8.5.1
Elektroporation von LCL1.11 Zellen..........................................................93
8.5.2
Produktion lentiviraler Partikel ................................................................93
8.5.3
Infektion von LCL1.11 Zellen ..................................................................94
8.5.4
Infektion von HSCs................................................................................94
8.6 Rekonstitution von NOD scid gamma Mäusen mit HSCs.............................. 95
8.7 Analyse humanisierter Mäuse..................................................................... 95
8.7.1
Herstellung von Einzelzellsuspensionen ....................................................95
8.7.2
Durchflusszytometrie .............................................................................95
8.7.3
Messung der Kalziumfreisetzung .............................................................96
8.7.4
ELISpot................................................................................................96
8.7.5
Immunfluoreszenz.................................................................................98
8.7.6
Gewinnung von Serum rekonstituierter Mäuse ..........................................98
8.7.7
ELISA ..................................................................................................98
8.8 Antikörper-Markierung ............................................................................. 100
8.9 Zellkultur.................................................................................................. 100
8.10 Versuchstierhaltung .............................................................................. 101
8.11 Statistik................................................................................................. 101
Inhaltsverzeichnis
9
LITERATURVERZEICHNIS...................................................... 102
10 ANHANG ............................................................................... 111
10.1 Abkürzungen ......................................................................................... 111
10.2 Vektorkarten ......................................................................................... 114
10.3 Eigene Publikationen............................................................................. 115
10.3.1
Zeitschriftenartikel ...........................................................................115
10.3.2
Vorträge und Posterpräsentationen.....................................................116
10.4 Lebenslauf............................................................................................. 117
Zusammenfassung
1
Zusammenfassung
Autoimmunerkrankungen wie der Systemische Lupus Erythematodes (SLE) oder die Rheumatoide Arthritis sind charakterisiert durch das Auftreten autoreaktiver Antikörper, die zur
Zerstörung von körpereigenen Geweben und Organen führen. Die Produktion solcher autoreaktiven Antikörper deutet auf einen Verlust der B-Zell Toleranz hin. Die genauen Ursachen
für die Entstehung von Autoimmunerkrankungen sind bis heute nicht identifiziert. In den letzten Jahren konnte durch die FcγRIIB-/- Maus gezeigt werden, das der inhibitorische Fc
gamma Rezeptor IIB (FcγRIIB) für den Erhalt der B-Zell Toleranz im murinen System verantwortlich ist. Auch beim Menschen konnte auf B-Zellen von Autoimmunpatienten eine veränderte Regulation dieses Rezeptors nachgewiesen werden. Zudem sind ein Promotorpolymorphismus und ein Transmembranpolymorphismus im Gen von FcγRIIB mit dem Auftreten
und der Schwere von SLE assoziiert. Diese Daten deuten darauf hin, dass FcγRIIB auch bei
der humanen B-Zell Toleranz von Bedeutung ist. Um die genaue Rolle von FcγRIIB auf die
humorale Toleranz im humanen Immunsystem zu untersuchen, wurde in dieser Arbeit das
Modell der humanisierten Maus verwendet. Hierfür wurden immundefiziente NOD scid gamma Mäuse mit humanen hämatopoetischen Stammzellen rekonstituiert, was zur Ausbildung
eines kompletten humanen Immunsystems in diesen Tieren führt. Mit dieser Methode wurden humanisierte Mäuse mit den beiden SLE-assoziierten Polymorphismen generiert. Zusätzlich wurde mit Hilfe eines lentiviralen Systems eine shRNA in die injizierten Stammzellen
eingeschleust, die zu einer verminderten Expression von FcγRIIB führte. Anschließend wurde
untersucht, ob es in den generierten Mäusen zu einem Verlust von humoraler Toleranz
kommt.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der Transmembranpolymorphismus von
FcγRIIB in den humanisierten Mäusen zur Produktion von autoreaktiven Antikörpern führt.
Dementsprechend konnte eine erhöhte Anzahl an Plasmablasten und Plasmazellen in der
Milz dieser Tiere detektiert werden. Die Analyse von Antikörper-sekretierenden Zellen ergab
zudem eine höhere Anzahl an Autoantikörper-sekretierenden Zellen in Milz und Knochenmark. Somit kommt es in diesen Tieren zu einem Verlust der B-Zell Toleranz. Neben der erhöhten Anzahl dieser reifen B-Zell Stadien konnte aber auch eine verminderte Anzahl von
B-Zellen in Blut, Milz und Knochenmark nachgewiesen werden. Dies könnte auf eine bisher
noch nicht beschriebene Funktion von FcγRIIB bei der zentralen Toleranz im Knochenmark
hindeuten.
1
Summery
2
Summary
Autoimmune diseases like systemic lupus erythematosus (SLE) or rheumatoid arthritis are
characterized by the presence of autoreactive antibodies participating in the destruction of
self tissue and organs. The production of autoreactive antibodies indicates a loss of B cell
tolerance but the factors triggering this breakdown of tolerance are not known so far. Recently, the development of FcγRIIB knockout mice showed the importance of the inhibitory
Fc gamma receptor IIB (FcγRIIB) for maintaining B cell tolerance in the murine system. In
humans, it could be shown that B cells of autoimmune patients show an altered regulation of
this receptor. Furthermore, a promoter polymorphism and a transmembrane polymorphism in
the gene of FcγRIIB are associated with SLE in epidemiological studies. These data indicate
that FcγRIIB may also be crucial for maintaining B cell tolerance in the human system. In this
work a humanized mouse model was used to investigate the role of FcγRIIB in humoral tolerance mechanisms in the human immune system. Therefore, immunodeficient NOD scid
gamma mice were reconstituted with human haematopoietic stem cells, leading to the development of a complete human immune system in these mice. In a first approach, humanized
mice containing the SLE-associated polymorphisms were generated. As a second approach,
human stem cells were transduced by a lentiviral system containing a specific shRNA against
FcγRIIB. These cells were subsequently injected into NOD scid gamma mice, leading to humanized mice with reduced FcγRIIB expression on infected cells. All generated mice were
monitored for a breakdown of B cell tolerance.
In this work it could be shown that in humanized mice the transmembrane polymorphism of
FcγRIIB leads to the production of autoreactive antibodies. According to these data, an increased number of plasmablasts and plasma cells in the spleen and a higher number of
autoantibody-secreting cells in spleen and bone marrow were present in these mice, indicating a loss of B cell tolerance. In addition, a reduced number of B cells could be observed in
blood, spleen and bone marrow. This may indicate a new role of FcγRIIB in central tolerance
mechanisms, which is not described so far.
2
Einleitung
3
Einleitung
3.1
Das Immunsystem
Die Aufgabe des Immunsystems ist es den Organismus vor Bakterien, Viren und anderen
Pathogenen zu schützen. Hierfür haben sich zwei Systeme gebildet, das angeborene und
das adaptive Immunsystem.
Das angeborene Immunsystem hat die Fähigkeit bei einer Infektion eine direkte, schnelle
Immunantwort einzuleiten. Die Erkennung von Pathogenen erfolgt dabei über Keimbahnkodierte pattern recognition receptors, wie z.B. die Toll-like receptors (TLRs) und scavenger
receptors. Diese erkennen Pathogen-assoziierte molekulare Muster, wie beispielsweise
Lipopolysaccharid oder Flagellin, auf der Oberfläche von Bakterien. Durch Bindung an das
Pathogen wird die jeweilige Immunzelle aktiviert und kann ihre spezifische Funktion, wie die
Phagozytose von Bakterien oder die Sekretion von Zytokinen, ausüben [1, 2].
Im Gegensatz zum angeborenen Immunsystem ermöglicht das adaptive Immunsystem eine
spezifische Immunantwort, die effizienter, aber dafür zeitlich verzögert ist. Zudem kann sich
das adaptive Immunsystem anpassen und ein immunologisches Gedächtnis ausbilden. Die
Erkennung von Pathogenen erfolgt im adaptiven Immunsystem über Rezeptoren, die durch
somatische Rekombination von einzelnen Gensegmenten entstehen. Dadurch kann aus einer begrenzten Anzahl von Genen eine Vielzahl von unterschiedlichen Rezeptoren generiert
werden, die sich in ihrer Spezifität und Affinität unterscheiden. Somit tragen die Zellen des
adaptiven Immunsystems einen individuellen Rezeptor, der spezifische Strukturen erkennt.
Dieser hohe Grad an Diversität ermöglicht es dem adaptiven Immunsystem eine Immunreaktion gegen jede erdenkliche Substanz und Struktur auszulösen. Dabei machen T-Zellen eine
Zell-vermittelte Immunantwort, während die B-Zellen eine Antikörper-vermittelte Immunantwort hervorrufen. Letztere wird als humorale Immunität bezeichnet.
Die gebildeten Antikörper verbinden das adaptive mit dem angeborenen Immunsystem. Diese binden mit ihrer konstanten Region an spezielle Rezeptoren auf den Oberflächen von
Zellen des angeborenen Immunsystems, den Fc Rezeptoren (FcR). Dadurch werden
Antikörper-vermittelte Effektorfunktionen ausgelöst und weitere Immunzellen an den Ort der
Infektion rekrutiert [3].
3
Einleitung
3.2
B-Zell Entwicklung
B-Zellen gehören, genau wie T-Zellen, zum adaptiven Immunsystem. Sie entwickeln sich aus
hämatopoetischen Stammzellen (HSCs), die zu frühen Vorläuferzellen (CLP - common
lymphoid progenitor) differenzieren und anschließend zu B-Zell Vorläufern werden. Anschließend durchlaufen sie verschiedene Entwicklungsstufen, bei denen die verschiedenen Gensegmente des Immunglobulin (Ig) Lokus, V (variable), D (diversity) und J (joining), per Zufallsprinzip rekombiniert werden [4, 5]. Neben den verschiedenen Stufen dieses
Rekombinationsprozesses kann man die einzelnen B-Zell Stadien auch anhand spezieller
Oberflächenmoleküle bestimmen. Diese unterscheiden sich zwischen Mensch und Maus.
Während bei der Maus die frühen B-Zell Stadien durch die Expression von c-kit und CD25
charakterisiert sind [6-8], kommen diese Marker auf humanen B-Zellen nicht vor. Stattdessen
werden die frühen Stadien der humanen B-Zell Entwicklung durch die Oberflächenmarker
CD34 und CD10 charakterisiert [9-11]. Bei beiden Spezies kennzeichnet die Anwesenheit
des B-Zell Rezeptors (BCR – B cell receptor) auf der Oberfläche die unreifen B-Zellen. Diese
wandern aus dem Knochenmark in die Peripherie und werden dort zu naiven reifen B-Zellen.
Zu diesem Zeitpunkt exprimieren sie zusätzlich IgD auf der Oberfläche [12]. Nach Aktivierung
der B-Zellen durch ihr spezifisches Antigen können diese zu Antikörper-produzierenden
Plasmazellen differenzieren, die sich durch die Expression von CD138 auszeichnen [13],
oder sie werden zu Gedächtnis-B-Zellen, die im humanen System CD27 exprimieren [14].
Eine Übersicht der einzelnen B-Zell Stadien des menschlichen Immunsystems und die wichtigsten Oberflächenmarker sind in Abb. 1 dargestellt.
Abb. 1: Entwicklung humaner B-Zellen. Dargestellt sind die einzelnen Stadien der humanen
B-Zell Entwicklung und die zugehörigen wichtigsten Oberflächenmarker.
4
Einleitung
3.3
Toleranz
Durch seine hohe Diversität und Spezifität kann das adaptive Immunsystem Pathogene sehr
effektiv bekämpfen. Dabei ist es notwendig, dass keine Immunantwort gegen körpereigene
Strukturen ausgelöst wird, was eine Schädigung von körpereigenen Geweben und Organen
zur Folge hätte. Die Fähigkeit fremde Strukturen von körpereigenen zu unterscheiden wird
als Toleranz bezeichnet. Die Ausbildung von Toleranz gegenüber körpereigenen Strukturen
beginnt bereits während der Entwicklung der Zellen in den primären lymphatischen Organen.
Diese, als zentrale Toleranz bezeichnete, Selektion erfolgt bei B-Zellen im Knochenmark.
Nach der ersten Selektion während der frühen Entwicklung gelangen die Zellen in die Peripherie. Auch hier gibt es Toleranzmechanismen, die die Aktivierung oder die Entstehung
neuer autoreaktiver Zellen verhindern. Die Toleranzinduktion ist in Abb. 2 schematisch dargestellt.
Abb. 2: Toleranzmechanismen in der B-Zell Entwicklung. Während der B-Zell Entwicklung im Knochenmark sorgen die zentralen Toleranzmechanismen dafür, dass keine autoreaktiven B-Zellen entstehen. Neben der Rezeptor Editierung sind Anergie und Deletion die vorherrschenden Mechanismen.
Ein geringer Anteil an autoreaktiven Zellen kann trotzdem in die Peripherie gelangen oder dort durch
somatische Hypermutation (SHM) neu gebildet werden. Hier sorgen periphere Toleranzmechanismen
wie Deletion, Anergie und die Kontrollmechanismen während der B-Zell Reifung für den Erhalt der
Toleranz.
5
Einleitung
3.3.1 Zentrale Toleranz
Da die Ausbildung des B-Zell Rezeptor-Repertoires während der Entwicklung im Knochenmark durch zufälliges Kombinieren von Gensegmenten erfolgt, kommt es auch zur Entstehung von BCR, die körpereigene Strukturen erkennen. Die Entwicklung von autoreaktiven
B-Zellen wird im Knochenmark durch verschiedene Toleranzmechanismen verhindert. Nach
dem erfolgreichen Rearrangieren der schweren und leichten Kette wird der entstandene BCR
auf der Oberfläche der unreifen B-Zellen exprimiert. Dieser wird nun auf seine Bindung an
körpereigene Antigene getestet. B-Zellen mit autoreaktivem BCR haben die Möglichkeit
durch Rezeptor Editierung einen neuen nicht-autoreaktiven BCR zu generieren [15]. Bei diesem Prozess wird der Lokus der leichten Kette erneut rearrangiert. Die neue leichte Kette
wird mit der alten schweren Kette gepaart und auf der Oberfläche präsentiert. Führt dies erneut zur Bildung eines autoreaktiven Rezeptors, hängt das Schicksal der B-Zelle von der Art
des körpereigenen Antigens und der Bindungsstärke daran ab. Wenn membranständige Antigene erkannt werden folgt die klonale Deletion der Zelle [16, 17]. Bei Bindung von löslichen
Antigenen spielt hingegen die Konzentration eine wichtige Rolle. Bei hoher Konzentration
wird die B-Zelle anerg [18], d.h. sie ist funktionell inaktiv. Wenn das Antigen in geringer Konzentration vorliegt gelangt die B-Zelle in die Peripherie und kann dort auch aktiviert werden.
Dieser Zustand wird als klonale Ignoranz bezeichnet [19].
3.3.2 Periphere Toleranz
B-Zellen, deren Rezeptoren seltene oder gewebe-spezifische Antigene erkennen, werden
durch die zentralen Toleranzmechanismen im Knochenmark nicht kontrolliert, sondern gelangen in die Peripherie. Hier verhindern periphere Toleranzmechanismen, dass diese Zellen
zu Autoantikörper-produzierenden Zellen differenzieren. So werden autoreaktive B-Zellen in
der Peripherie, nach Kontakt mit ihrem Antigen, anerg [19] oder sie werden deletiert [20]. Die
genauen Mechanismen sind bisher noch nicht vollständig untersucht. So ist zum Beispiel
unklar, wieso B-Zellen durch Bindung von membranständigen Autoantigenen deletiert werden, während sie durch Bindung von Thymus unabhängigen Antigenen (TI – thymus independent) des Typs 2, meist große Moleküle mit sich wiederholenden Epitopen, aktiviert werden. So wird spekuliert, dass in jüngeren Individuen die B-Zellen eine höhere Sensitivität
gegenüber Toleranzinduktion besitzen, während die B-Zellen von älteren Individuen durch
Kontakt mit Antigen vorwiegend aktiviert werden [21, 22]. Andere vermuten, dass durch eine
Erkennung von Autoantigenen durch inhibitorische Rezeptoren auf B-Zellen eine Aktivierung
verhindert wird, während Pathogene des Typs TI-2 keine solchen negativen Signale vermitteln können und die B-Zelle dadurch aktiviert wird [23]. Bei Thymus-abhängigen (TD – thy6
Einleitung
mus dependent) Antigenen führt die Aktivierung der B-Zellen ohne entsprechende T-Zell Hilfe
zu einem negativen Signal und zur Apoptose. Dagegen können TD aktivierte B-Zellen bei
vorhandener T-Zell Hilfe zusammen mit T-Zellen und follikulären dendritischen Zellen (FDC –
follicular dendritic cell) ein Keimzentrum ausbilden. Hier werden BCR der Antigen-aktivierten
B-Zellen durch somatische Hypermutation (SHM) verändert, um BCR mit verbesserter Affinität zu erhalten. Durch das zufällige Einfügen von Mutationen ist es jedoch möglich, dass
neue autoreaktive B-Zellen entstehen [24-26]. Somit müssen im Keimzentrum periphere Toleranzmechanismen vorhanden sein, die dies verhindern. Die Mechanismen, wie dies bewerkstelligt wird, sind bisher nicht vollständig geklärt.
3.4
Autoimmunität
Wenn Toleranzmechanismen versagen oder unzureichend funktionieren, kommt es zur Entstehung von Autoimmunerkrankungen, bei denen das Immunsystem körpereigene Strukturen
als fremd erkennt und eine Immunantwort gegen diese hervorruft. Dadurch kommt es zu
Entzündungsreaktionen und zur Schädigung von körpereigenen Geweben. Solche Autoimmunerkrankungen sind z.B. die Rheumatoide Arthritis (RA), bei der es zu entzündlichen Erkrankungen der Gelenke kommt, und der Systemische lupus erythematodes (SLE), bei dem
eine Vielzahl von Organen betroffen sein kann. Die Diagnose solcher Erkrankungen erfolgt
meist über den Nachweis autoreaktiver Antikörper in den Seren der Patienten. So kommt es
bei SLE zur Produktion von Antikörpern gegen nukleäre Bestandteile wie Desoxyribonukleinsäure (DNA – desoxribonucleic acid), Ribonukleinsäure (RNA - ribonucleic acid) oder Histone [27-29] und bei RA zur Produktion von Antikörpern gegen Immunglobuline (RF - RheumaFaktor), gegen zyklisch zitrullinierte Peptide (CCP) [30, 31] und Glucose-6-phosphat Isomerase (GPI) [32].
Die Entstehung von Autoimmunerkrankungen ist bisher nicht vollständig geklärt. So werden
bestimmte Komponenten des Komplementsystems [33, 34] oder einzelne human leukocyte
antigen (HLA) Varianten [34, 35], mit dem Auftreten von Autoimmunität in Verbindung gebracht. Die Anwesenheit von autoreaktiven Antikörpern lässt jedoch auf eine Beteiligung von
B-Zellen an der Pathogenese schließen. In Mausmodellen konnte die zentrale Rolle von
B-Zellen bei der Entstehung und dem Verlauf von Autoimmunität bereits gezeigt werden [36,
37]. So konnten Chan und Kollegen zeigen, dass bei MRL lpr/lpr Mäusen, die eine Lupus
ähnliche Erkrankung entwickeln, das Fehlen von B-Zellen den Ausbruch der Krankheit verhindert [37]. Die essentielle Rolle von Antikörpern bei der Entstehung und dem Verlauf von
Autoimmunerkrankungen konnte zudem in verschiedenen Serum-Transfer Modellen [38-40]
sowie durch Injektion von monoklonalen autoreaktiven Antikörpern [41] nachgewiesen wer-
7
Einleitung
den. Dabei führt die Rekrutierung von Effektorzellen des angeborenen Immunsystems, durch
Bindung der Antikörper an FcR, zur Zerstörung von körpereigenen Geweben und Organen.
Wird diese Interaktion von Antikörpern und FcR unterbrochen, wie z.B. in FcR-/- Mäusen
oder durch Veränderung der Glykosylierung der Antikörper, kann das Auftreten von Autoimmunität verhindert oder der Verlauf der Erkrankung verbessert werden [3, 40, 42-44]. Zusätzlich scheinen B-Zellen auch durch direkte Interaktionen in lokalen Entzündungsherden und
durch Präsentation von Antigenen an autoreaktive T-Zellen zur Pathogene von Autoimmunerkrankungen beizutragen [36].
3.5
Fc gamma Rezeptoren
Fc gamma Rezeptoren (FcγR) sind Oberflächenmoleküle, die den konstanten Teil von IgG
Antikörpern binden. Bis auf wenige Ausnahmen, wie z.B. T-Zellen, werden sie auf allen Zellen des Immunsystems exprimiert und verbinden das adaptive mit dem angeborenen Immunsystem. Die Bindung von IgG in Form von Immunkomplexen (IC - immune complex)
führt, je nach Zelltyp, zu speziellen Effektormechanismen, wie der Antikörper-induzierten
zellulären Zytotoxizität, Phagozytose oder Zytokinfreisetzung [45].
In der Maus gibt es vier verschiedene FcγR, FcγRI, IIB, III und IV, die jeweils durch ein einzelnes Gen kodiert werden. Im Menschen ist die Situation komplexer. Hier gibt es drei Klassen von FcγR, die durch insgesamt 8 Gene kodiert werden. Diese sind FcγRI (A, B und C),
FcγRII (A, B und C) und FcγRIII (A und B). Sowohl im Menschen als auch in der Maus gibt es
nur einen hochaffinen Rezeptor, FcγRI. Alle anderen Rezeptoren haben nur eine geringe
oder mittlere Affinität und können IgG nur in Form von IC binden [46]. FcγR bestehen aus 2-3
extrazellulären Ig-ähnlichen Domänen, einer Transmembrandomäne und einem zytoplasmatischen Teil. Die Signalweiterleitung erfolgt bei den aktivierenden FcγR über ein immunoreceptor tyrosine based activating motif (ITAM) [47], das entweder direkt in der α-Kette
(hFcγRIIA, C) oder auf einer assoziierten γ-Kette (mFcγRI, III, IV und hFcγRIA und IIIA) kodiert ist [48]. Der inhibitorische Rezeptor (FcγRIIB in Maus und Mensch) besitzt in seiner
α-Kette ein immunoreceptor tyrosine based inhibitory motif (ITIM) mit dem inhibitorische Signale in die Zelle geleitet werden.
Auf den meisten Immunzellen wie Monozyten/Makrophagen und Granulozyten werden aktivierende FcγR zusammen mit dem inhibitorischen FcγR exprimiert. Die beiden Rezeptortypen fungieren bei Kreuzvernetzung als Gegenspieler und setzen dadurch einen Schwellenwert für die Aktivierung der Zellen. Ausnahmen sind hier NK-Zellen und B-Zellen, die nur eine
8
Einleitung
Rezeptorart exprimieren. Hierbei ist auf NK-Zellen lediglich der aktivierende FcγRIII und auf
B-Zellen nur der inhibitorische FcγRIIB zu finden.
3.6
FcγγRIIB
FcγRIIB ist der einzige inhibitorische Rezeptor in der Familie der FcγR. Aufgrund von alternativem Splicen kommt FcγRIIB in zwei Isoformen vor, FcγRIIB1 und FcγRIIB2 [49, 50].
FcγRIIB1 weist in der zytoplasmatischen Domäne eine Insertion von 47 Aminosäuren (AS) in
der Maus und 19 AS im Menschen auf, die zur Zerstörung eines für die Endozytose notwendigen Motivs führt [51, 52]. Hierdurch wird die Internalisierung durch diesen Rezeptor und die
dadurch vermittelte Antigen-Präsentation verhindert [53]. Beide Isoformen besitzen in der
zytoplasmatischen Region ein inhibitorisches Signalmotiv von 13 Aminosäuren, das notwendig und ausreichend ist um inhibitorische Effekte in den Zellen zu vermitteln [54]. In diesem
Bereich befindet sich auch das ITIM. Durch Bindung von IgG an FcγRIIB wird das Tyrosin im
ITIM phosphoryliert und eine Signalkaskade in Gang gesetzt, die zur Inhibierung von aktivierenden Signalen führt. Während FcγRIIB2 nur auf myeloiden Zellen exprimiert wird, kommt
FcγRIIB1 auch auf Lymphozyten vor. Auf B-Zellen ist er der einzige FcγR und wird in der
Maus schon ab dem prä-B-Zell-Stadium exprimiert [55]. Während er auf reifen B-Zellen die
Aktivierung beeinflusst, ist seine Funktion auf den frühen B-Zellen bisher nicht vollständig
untersucht.
3.7
Regulation von B-Zellen durch FcγγRIIB
Die Aktivierung von B-Zellen erfolgt durch die Bindung des spezifischen Antigens an den
BCR. Hierdurch wird die Tyrosin Kinase Lyn aktiviert, die die ITAMs an der assozierten α und
ß Kette des BCR phosphoryliert. Dadurch wird eine Signalkaskade in Gang gesetzt, die zur
Ausschüttung von Kalzium und zur Proliferation der Zelle führt. Inhibitorische Rezeptoren der
B-Zelle wie CD22, CD72 und FcγRIIB können das Signal des BCR verändern und somit die
Aktivierung der Zelle vermindern oder verhindern [56-58]. Im Falle von FcγRIIB erfolgt diese
Regulation über einen ITIM-abhängigen Signalweg. Bei Kreuzvernetzung von FcγRIIB mit
dem BCR durch IC wird das Tyrosin im ITIM durch Lyn phosphoryliert [54]. Dies führt zur
Rekrutierung von Src-homology-2 domain-containing inositol polyphosphate-5-phosphatase
(SHIP) [59], welche Phosphatidyl-inositol (3,4,5)-trisphosphat (PIP3) dephosphoryliert und
somit die Assoziation von Bruton’s Tyrosin Kinase (Btk) und Phospholipase C gamma (PLCγ)
verhindert. Dies bewirkt einen verringerten Kalzium-Einstrom und eine Verminderung des
Aktivierungssignals der B-Zelle [54]. Die Beeinflussung der B-Zelle durch Immunkomplexe ist
ein wichtiger Bestandteil für die Regulation des humoralen Immunsystems [60]. Die nach
9
Einleitung
einer erfolgreichen Immunantwort produzierten Antikörper bilden mit ihrem Antigen Immunkomplexe und beeinflussen die Aktivierung von anderen B-Zellen. B-Zellen mit hochaffinem
BCR können durch ein starkes aktivierendes Signal über den BCR weiterhin aktiviert werden,
während bei B-Zellen mit niedrigaffinem Rezeptor das aktivierende Signal nicht ausreicht um
den Schwellenwert, den der inhibitorische Rezeptor setzt, zu überwinden. Dadurch werden
niedrigaffine Zellen, die potenziell kreuzreaktiv sein könnten, kontrolliert und hochaffine Zellen selektiert.
Abb. 3: Signalleitung bei Kreuzvernetzung des BCR mit FcγγRIIB. Durch Kreuzvernetzung des
BCR mit dem FcγRIIB über IC kommt es zur Aktivierung der Kinase Lyn. Diese phosphoryliert das
Tyrosin im ITIM Motiv von FcγRIIB. Dadurch kann SHIP binden und PIP3 dephosphorylieren, wodurch
der Kalzium-Einstrom und somit das Aktivierungssignal der B-Zelle vermindert wird.
Neben der ITIM-abhängigen Regulation von B-Zellen kann FcγRIIB auch ein ITIMunabhängiges Signal vermitteln. Die Kreuzvernetzung von FcγRIIB ohne Beteiligung des
BCR führt in B-Zellen zur Induktion eines SHIP-unabhängigen, aber Btk-abhängigen Signalweges, der die Apoptose von B-Zellen bewirkt [61]. Es wird vermutet, dass diese Funktion
vor allem im Keimzentrum von Bedeutung ist, in dem die SHM von aktivierten B-Zellen stattfindet. Bei diesem Prozess werden einzelne Punktmutationen in die variablen Regionen des
BCR eingefügt, um B-Zellen mit hochaffinem BCR zu generieren. Durch die zufällig eingefügten Mutationen entstehen aber auch B-Zellen mit niedrigaffinen Rezeptoren oder B-Zellen,
die die Affinität für das Antigen verloren haben und somit autoreaktiv sein könnten. Die Se-
10
Einleitung
lektion von hochaffinen und die Eliminierung von niedrigaffinen BCR ist somit essentiell für
den Erhalt von Toleranz. Bisher wird angenommen, dass dies durch die Konkurrenz der
B-Zellen um das Antigen und um T-Zell Hilfe erfolgt [62] und niedrigaffine Zellen, die keine
Überlebenssignale erhalten, in Apoptose gehen. Zusätzlich zu diesem Modell gibt es Hinweise, dass FcγRIIB bei dieser Selektion ebenfalls von Bedeutung sein könnte. Antigene werden
im Keimzentrum von FDCs in Form von IC präsentiert. Dadurch kommt es neben der Bindung des BCR an das Antigen auch zu einer Kreuzvernetzung des FcγRIIB. Das Aktivierungssignal, das im Falle eines niedrigaffinen BCR in die Zelle gelangt, reicht nicht aus um
das inhibitorische Signal von FcγRIIB zu überwinden. Dadurch können diese Zellen, trotz
Antigen-Bindung, nicht aktiviert werden. Bei B-Zellen, die ihre Affinität für das Antigen verloren haben, führt die selektive Kreuzvernetzung von FcγRIIB durch IC zur Apoptose (Abb. 4).
Abb. 4: Mögliche Funktion von FcγγRIIB bei der Vermittlung von Toleranz während der somatischen Hypermutation. Im Keimzentrum wird Antigen von FDCs in Form von IC präsentiert. Dadurch
wird in den aktivierten B-Zellen FcγRIIB mit dem BCR kreuzvernetzt. Wenn die SHM zu einer höheren
Affinität führt, erfolgt eine positive Selektion, Expansion und Differenzierung dieser Zellen. Durch die
SHM kann die Bindung an das Antigen aber auch verloren gehen. Da diese Zellen potenziell autoreaktiv sein könnten, müssen sie entfernt werden. Dies geschieht durch das Apoptosesignal, welches
bei Kreuzvernetzung von FcγRIIB mit sich selbst induziert wird.
11
Einleitung
3.8
FcγγRIIB und Autoimmunität
3.8.1 Maus Studien
Die essentielle Bedeutung von FcγRIIB für den Erhalt von Toleranz konnte bereits im Mausmodell nachgewiesen werden. So wurde gezeigt, dass Mausstämme wie BXSB, NZB, MRL
und NOD, die spontan Autoimmunerkrankungen entwickeln, Deletionen in der Promotorregion des FcγRIIB Gens aufweisen [63-65]. Diese führen zu einer veränderten FcγRIIB Regulation [66] und verursachen eine verminderte Expression von FcγRIIB auf Keimzentrums-BZellen [63]. Die Deletion von FcγRIIB führt zu einer erhöhten Anfälligkeit bei induzierten Autoimmunitätsmodellen. So kann in FcγRIIB-/- Mäusen durch Injektion von IC eine Glomerulonephritis [67] oder Alveolitis [68] ausgelöst werden. Nach Immunisierung mit Typ IV Kollagen
aus Rindern entwickeln FcγRIIB-/- Mäuse das Goodpasture-Syndrom und nach Immunisierung mit Kollagen II eine Kollagen-induzierte Arthritis [69]. Zusätzlich wurde gezeigt, dass die
Deletion von FcγRIIB im C57Bl/6 Hintergrund zum spontanen Auftreten einer Lupusähnlichen Erkrankung führt, die durch die Produktion von anti-DNA Antikörpern des IgG Isotyps und das Auftreten von Glomerulonephritis charakterisiert ist [70]. Die retroviralvermittelte Re-expression von FcγRIIB führte in FcγRIIB-/- und autoimmmunanfälligen Mäusen zur Wiederherstellung der Toleranz [71]. Da bei diesem Mausmodell FcγRIIB sowohl auf
B-Zellen als auch auf myeloiden Zellen ausgeschaltet ist, könnte die Entstehung von Autoimmunität durch beide Zelltypen verursacht werden. Brownlie und Kollegen zeigten jedoch
durch zell-spezifische Überexpression von FcγRIIB, dass B-Zellen, nicht aber Makrophagen,
für den Erhalt der Toleranz verantwortlich sind [72].
Es wird vermutet, dass FcγRIIB vor allem in der späten Phase der peripheren Toleranz, während der Keimzentrumsreaktion, von Bedeutung ist. So konnte gezeigt werden, dass die
meisten autoreaktiven B-Zellen in der Milz an der Grenze von T- und B-Zell Zone zu finden
sind und nicht an der Keimzentrumsreaktion teilnehmen [73, 74]. Paul et al. konnten zudem
zeigen, dass dieser follikuläre Ausschluss autoreaktiver B-Zellen von FcγRIIB abhängt [75].
3.8.2 Humane Studien
Im Menschen konnten zwei Polymorphismen im Gen von FcγRIIB mit dem Auftreten und
dem Verlauf von SLE in Verbindung gebracht werden. In der asiatischen Bevölkerung wurde
ein Polymorphismus in der Transmembranregion von FcγRIIB in SLE Patienten mit einer
höheren Frequenz nachgewiesen als in gesunden Kontrollen [76-78]. Dieser Polymorphismus führt zum Austausch von Isoleucin zu Threonin an Position 232 und verursacht eine
12
Einleitung
schlechtere Rekrutierung von FcγRIIB in cholesterinreiche Bereiche der Zellmembran, so
genannte lipid rafts, in denen Signalmoleküle der Zelle organisiert werden. Dadurch kommt
es zu einer verminderten Signalweiterleitung und zu einem erhöhten BCR-induzierten Kalziumsignal [79, 80]. In der europäischen Bevölkerung ist ein Promotorpolymorphismus mit SLE
assoziert [81, 82]. Bei diesem kommt es zu einem Austausch von Guanin zu Cytosin an Position -386. Die Auswirkung dieses Basenaustausches auf das Expressionsniveau von FcγRIIB
ist bisher nicht eindeutig geklärt. Die Verwendung von Luziferase Reporter-Assays in lympoiden als auch in myeloiden Zelllinien führte in einer Studie zu einer erhöhten Expression [82],
in einer anderen Studie konnte eine verminderte Expression dieser Variante detektiert werden [81, 83]. Frisch isolierte periphere B-Zellen mit der -386C/C Variante zeigten keine signifikant verminderte Expression im Vergleich zu -386G/G B-Zellen, während nach in vitro Stimulation dieser Zellen eine verminderte Expression von FcγRIIB auf den -386C/C B-Zellen
beobachtet werden konnte [81].
Die Analyse der B-Zellen von SLE Patienten und von gesunden Spendern zeigte ein höheres
Kalziumsignal bei den B-Zellen der SLE Patienten nach Stimulation mit anti-IgM und anti-IgD
Antikörpern [84]. Die Ursache dafür scheint ein vermindertes inhibitorisches Signal von
FcγRIIB zu sein [85]. Zudem zeigten Gedächtnis-B-Zellen von gesunden Spendern eine
Hochregulation von FcγRIIB, die bei Gedächtnis-B-Zellen von SLE Patienten fehlte [86-88].
Diese veränderte Regulation von FcγRIIB war auch auf Gedächtnis-B-Zellen von Patienten
mit chronisch inflammatorischer demyelinisierender Polyneuropathie (CIDP), einer Autoimmunerkrankung des Nervensystems, zu sehen [89]. Des Weiteren konnte auch in Patienten
mit Rheumatoider Arthritis (RA) eine verminderte Expression von FcγRIIB auf B-Zellen nachgewiesen werden [90, 91].
3.9
RNA Interferenz
Die Methode der RNA Interferenz (RNAi) ist ein Werkzeug, um die Funktionen von Proteinen
in Säugerzellen zu untersuchen. Bei dieser Methode wird mithilfe von künstlich eingeschleusten, kleinen RNAs die Expression von spezifischen Genen vermindert [92]. Das Prinzip der RNAi beruht auf dem zelleigenen System der endogenen mikroRNAs (miRNAs), die
im Genom von Säugetieren kodiert sind und zur Regulation der Translation dienen [93].
Der erste Ansatz der RNAi in Säugerzellen beruhte auf dem Einschleusen von doppelsträngigen small interfering RNAs (siRNAs) in leicht transfizierbare Zellen [94]. Diese Methode
zeigte jedoch einige Beschränkungen. Zum einen war die Regulation nur transient und somit
nicht für Langzeitstudien geeignet, zum anderen konnte die siRNA in den Zellen nicht nach13
Einleitung
gewiesen werden. Um eine nachweisbare Regulation von Zielgenen durch RNAi zu gewährleisten, wurden neue, vektorbasierte Systeme entwickelt. Diese beinhalten ein Gen zur Detektion, z.B. das green fluorescent protein (GFP), und eine kleine RNA unter der Kontrolle
eines Polymerase III (Pol III) Promotors. Hierbei werden neben short hairpin RNAs (shRNAs)
auch miRNA basierte Systeme verwendet. Die Kombination dieser Systeme mit retro- und
lentiviralen Transduktionssystemen ermöglicht die Integration der miRNA- bzw. der shRNA in
die genomische DNA der Zielzellen und gewährleistet eine dauerhafte Regulation des gewünschten Proteins (siehe Abb. 5).
Abb. 5: Stabile Integration und Expression einer shRNA mittels Lentivirus. Zur dauerhaften Regulation von Proteinen mittels RNAi wird eine spezifische shRNA über einen Lentivirus in die Zielzelle
eingeschleust. Nach reverser Transkription der viralen DNA bildet sich ein Integrationskomplex, der
die stabile Integration der shRNA in das Genom der Zielzelle bewirkt [95]. Die shRNA wird mittels
eines Pol III Promotors transkribiert. Die entstandene prä-shRNA wird durch Drosha prozessiert [96]
und über Exportin 5 ins Zytoplasma geschleust [97]. Dort wird die shRNA durch Dicer zur siRNA prozessiert [98]. Durch Abspalten des Leitstranges und Bindung der einzelsträngigen RNA an verschiedene Proteine wird der RNA-induced silencing complex (RISC) gebildet [99]. Die RNA bindet komplementär an ihre Zielsequenz auf der messenger RNA (mRNA) des Zielgens und führt zu deren Abbau.
14
Einleitung
.
3.10 Das humanisierte Mausmodell
Klassische Mausmodelle waren essentiell für das grundlegende Verständnis der komplexen
molekularen und zellulären Mechanismen, die an der Entstehung und Aufrechterhaltung der
humoralen Toleranz beteiligt sind. Aufgrund der genetischen Unterschiede zwischen diesen
Modellsystemen und dem Menschen ist unklar, ob die Ergebnisse der Maus einfach auf das
menschliche System übertragbar sind. Aus diesem Grund hat die Verwendung von humanisierten Mäusen in den letzten Jahren stark zugenommen. Hierbei werden zum einen Modelle
verwendet, bei denen einzelne menschliche Gene in die Maus eingebracht werden. Zum
anderen werden immundefiziente Mausstämme, durch Injektion von humanen hämatopoetischen Stammzellen, mit einem vollständigen humanen Immunsystem ausgestattet. In dieser
Arbeit wird ausschließlich das letztere Modell verwendet.
Mithilfe von humanisierten Mäusen ist es möglich, komplexe Fragestellungen des menschlichen Immunsystems zu untersuchen, die die Interaktion einer Vielzahl von Immunzellen
beinhalten. Dies sind z.B. die Entwicklung des menschlichen Immunsystems [100, 101] oder
die Entstehung und Entwicklung von Autoimmunität [102]. Zudem werden sie für die Erforschung von humanspezifischen Pathogenen, die in konventionellen Maussystemen aufgrund
der Wirtsspezifität nicht beantwortet werden können, eingesetzt. So werden humanspezifische Viren wie das Epstein-Barr Virus [103, 104] oder das humane Immundefizienz-Virus
(HIV) [105-107], aber auch bakterielle Infektionen mit Salmonella eterica serovar Typhi (S.
Thyphi) [108, 109] in humanisierten Mäusen untersucht.
15
Fragestellung
4
Fragestellung
In dieser Arbeit sollte der Einfluss von FcγRIIB auf die humorale Toleranz im humanen Immunsystem untersucht werden. Die Arbeiten mit konventionellen Mausmodellen zeigen, dass
FcγRIIB eine essentielle Rolle beim Erhalt der B-Zell Toleranz im murinen System spielt. Ob
diese Ergebnisse jedoch auf das humane System übertragbar sind, ist nicht geklärt. Humane
Studien deuten zwar darauf hin, dass FcγRIIB auch im menschlichen System wichtig ist um
Toleranz zu erhalten, aber der eindeutige Beweis fehlt bis heute.
Um den Einfluss von FcγRIIB auf die humorale Toleranz im menschlichen Immunsystem zu
untersuchen, sollten in dieser Arbeit humanisierte Mäuse generiert werden, die die natürlich
vorkommenden Polymorphismen im FcγRIIB Gen enthalten oder in denen FcγRIIB mittels
RNAi herunterreguliert wird. Für die Regulation mittels RNAi sollte ein lentivirales System
etabliert werden, um eine spezifische shRNA in den Stammzellen zu integrieren. Anschließend sollten die generierten Tiere auf einen Verlust von B-Zell Toleranz untersucht werden.
16
Ergebnisse
5
Ergebnisse
5.1
Generierung von humanisierten Mäusen mit
natürlich vorkommenden Polymorphismen
im FcγγRIIB Gen
5.1.1 Genotypisierung der HSCs
Anhand der Untersuchungen im murinen System konnte die Bedeutung von FcγRIIB beim
Erhalt von humoraler Toleranz nachgewiesen werden [60, 67-70, 72, 110]. Epidemiologische
Studien konnten FcγRIIB auch im Menschen mit dem Auftreten von Autoimmunität in Verbindung bringen. Hierbei wurde das Gen von FcγRIIB auf Einzelnukleotidpolymorphismen (SNP
- single nucleotide polymorphisms) untersucht. Dabei wurden zwei Polymorphismen identifiziert, die mit SLE assoziiert sind. Zum einen konnte im Promotor von FcγRIIB ein Basenaustausch von Guanin (G) zu Cytosin (C) an Position -386 detektiert werden. Dieser ist gekoppelt mit einem weiteren Nukleotidaustausch von Tyrosin (T) zu Adenin (A) an Position -120
[82]. Der zweite Polymorphismus wurde in der Transmembranregion detektiert. Ein Austausch von Tyrosin zu Cytosin in der DNA führt zu einem Aminosäureaustausch von Isoleucin
(I) zu Threonin (T) an Position 232 des Proteins [76], wodurch die Assoziation dieses Proteins mit lipid rafts vermindert wird [79, 80]. Beide Polymorphismen wurden, im Vergleich zu
gesunden Spendern, mit erhöhter Frequenz in SLE Patienten nachgewiesen [76-78, 81, 82].
Ob diese Polymorphismen direkt an der Entstehung von Autoimmunerkrankungen beteiligt
sind konnte bisher jedoch nicht nachgewiesen werden.
Abb. 6: Strategie zur Genotypisierung des FcγγRIIB Gens. Um die Spezifität der Genotypisierung
für FcγRIIB zu gewährleisten wurde zu Beginn eine 15kb PCR durchgeführt, bei der der antisense
Primer in der FcγRIIB spezifischen Sequenz in Intron 6 bindet. Das 15kb PCR Produkt diente anschließend als Matrize für die nested PCRs zur Amplifikation von Promotor- und Transmembranregion.
Zur Generierung von humanisierten Mäusen mit unterschiedlichen Allelen des FcγRIIB Gens,
wurden die Stammzellproben vor Injektion auf die mit SLE assoziierten SNPs genotypisiert.
17
Ergebnisse
Da sich die Gene von FcγRIIB und FcγRIIC nur in wenigen Nukleotiden in Intron 6 unterscheiden, war es notwendig zu Beginn eine 15kb PCR durchzuführen, um die Spezifität der
Sequenzierung zu gewährleisten. Bei dieser PCR liegt der sense Primer vor der zu untersuchenden Promotorregion und der antisense Primer in der für FcγRIIB spezifischen Sequenz.
Anschließend wurden für die Promotor- und Transmembranregion nested PCRs durchgeführt
und die erhaltenen Produkte sequenziert. Insgesamt wurden 119 Proben typisiert. Für den
Promotor besaßen die meisten Proben die Variante -386G/G (85,7%). Nur 0,8% aller Proben
waren homozygot für das -386C Allel, während 13,4% heterozygot (-386G/C) waren. Die
Transmembranregion lag bei den meisten Proben in der 232I/I Variante vor (79,8%). Der Anteil an homozygoten Proben mit dem SNP (232T/T) lag bei 13,4%, während nur 6,7% heterozygot (232I/T) waren. Die Verteilung der einzelnen Allele wurde mit dem Hardy-WeinbergGesetz der Populationsgenetik bestimmt. Dieses besagt, dass die einzelnen Allele bei einer
idealen, ausreichend großen Bevölkerungsgruppe gleichmäßig verteilt sind. Die Wahrscheinlichkeiten können anhand folgender mathematischer Formel bestimmt werden:
p2+2pq+q2 = 1
Die einzelnen Buchstaben bezeichnen hierbei die jeweiligen Allele, d.h. p2 und q2 stehen für
die beiden homozygoten Varianten und 2pq für das heterozygote Auftreten der Allele. Anhand dieser Formel wurde der Anteil von hetereozygoten Proben bei einer idealen Verteilung
berechnet (2pq erwartet) und mit dem tatsächlichen Anteil (2pq tatsächlich) verglichen (Tab.
1). Während für den Promotorpolymorphismus eine Verteilung nach Hardy-Weinberg nachgewiesen werden konnte, zeigte der Transmembranpolymorphismus einen geringeren Anteil
an heterozygoten Proben.
Tab. 1: Verteilung der Allele nach Hardy-Weinberg.
n=119
Promotor
Transmembranregion
p
0,924
0,832
q
0,076
0,168
2pq erwartet
0,14
0,28
2pq tatsächlich
0,134
0,067
Bei der Kombination beider Genbereiche wies lediglich eine Probe (0,8%) Polymorphismen
in beiden Regionen auf. Diese war homozygot in der Transmembranregion (232T/T), während der Promotor heterozygot vorlag (-386G/C). 66,4% der Proben besaßen keinen der
untersuchten Polymorphismen, während bei allen anderen Proben entweder der SNP im
Promotor oder in der Transmembranregion nachzuweisen war. In Tab. 2 ist die Verteilung der
Allele bei Kombination beider Regionen dargestellt.
18
Ergebnisse
Tab. 2: Statistische Verteilung der einzelnen Allelkombinationen für das FcγγRIIB Gen.
n=119
-386 G/G
-386 G/C
-386 C/C
232 I/I
66,4%
12,6%
0,8%
232 I/T
6,7%
0,0%
0,0%
232T/T
12,6%
0,8%
0,0%
5.1.2 Rekonstitution von NOD scid gamma (NSG) Mäusen mit
genotypisierten HSCs
NSG Mäuse wurden 1-2 Tage nach der Geburt sublethal mit 1 bis 1,3 Gy bestrahlt. 4 bis 6
Stunden nach Bestrahlung wurden mind. 25.000 HSC pro Maus intravenös injiziert. 12-16
Wochen nach Injektion der HSCs wurde die Rekonstitution der Tiere mit humanen Zellen
untersucht. Hierfür wurde den Mäusen retro-orbital Blut entnommen und die peripheren mononukleären Zellen (PBMCs - peripheral blood mononuclear cells) mittels Dichtegradientenzentrifugation isoliert. Anschließend wurde mittels Durchflusszytometrie der Anteil von Mauszellen und der Anteil humaner Zellen bestimmt (Abb. 7A). Die humane Fraktion wurde
zusätzlich auf Zelllinien-spezifische Marker (CD19, CD3, CD33) untersucht (Abb. 7B). Der
Grad der Humanisierung war 16 Wochen nach Injektion der Stammzellen sehr heterogen.
Der Anteil humaner Zellen lag im Mittel bei 48,4% ± 28,1% (Abb. 7C). CD19+ B-Zellen stellten mit durchschnittlich 67,6% ± 20,2% die größte Zellpopulation im Blut. Der Anteil CD3+
T-Zellen lag bei 19,2% ± 18,9% und der Anteil CD33+ myeloider Zellen bei 4,7% ± 4,1%.
Insgesamt wurden mit den genotypisierten HSCs vier unterschiedliche Mausgruppen generiert. Die erste Gruppe wurde mit der am häufigsten vorkommenden Allelkombination
-386G/G 232I/I erzeugt. Diese Gruppe wird im weiteren Verlauf als Wildtyp (WT) Gruppe
bezeichnet. Die zweite Gruppe bildeten Mäuse, die HSCs mit der Allelvariante -386G/C
232I/I erhalten hatten und werden als -386G/C Gruppe bezeichnet. Die dritte Gruppe besaß
Zellen der Allelvariante -386G/G 232I/T. Diese war also heterozygot für den Transmembranpolymorphismus und wird im weiteren Verlauf als 232I/T Gruppe aufgeführt. Die letzte Gruppe ist die als 232T/T Gruppe bezeichnete Mauskohorte. Diese enthielt Zellen mit der Allelvariante -386G/G 232T/T.
19
Ergebnisse
A
C
B
Abb. 7: Rekonstitution von humanisierten Mäusen mit typisierten Stammzellproben. A) Bestimmung des Humanisierungsgrades. Leukozyten des Blutes wurden auf ihre Expression von humanem
CD45 (hCD45) und Maus CD45 (mCD45) untersucht. B) hCD45+ Zellen wurden auf die Expression
der Linien-spezifischen Marker CD19, CD3 und CD33 analysiert. C) Anteil hCD45+ Zellen im Blut von
16 Wochen alten Tieren, die mit typisierten HSCs injiziert wurden.
5.1.3 Bestimmung des inhibitorischen Potenzials von FcγRIIB
Für humane B-Zellen mit dem Transmembranpolymorphismus 232T/T ist, aufgrund einer
verschlechterten Rekrutierung in cholesterinreiche Membrandomänen, den so genannten
lipid rafts, ein vermindertes inhibitorisches Signal beschrieben [79, 80]. Dies führt nach Stimulation mit einem anti-IgM Antikörper zu einem erhöhten Kalzium-Einstrom. Auch eine veränderte Expression von FcγRIIB, wie sie für den Promotorpolymorphismus beschrieben ist
[81, 82], könnte zu einem veränderten inhibitorischen Signal führen. Aus diesem Grund wurden die B-Zellen der verschiedenen humanisierten Mausgruppen stimuliert und das entstandene Kalziumsignal ermittelt. Hierfür wurde den Tieren retro-orbital Blut entnommen, die
PBMCs mittels Dichtegradientenzentrifugation isoliert und mit dem Kalzium-bindenden Farbstoff Indo-1 beladen. Anschließend erfolgte die Stimulation der Zellen mit anti-IgM F(ab)2
oder anti-IgM IgG und die Detektion des Kalzium-Einstroms mittels Durchflusszytometrie.
20
Ergebnisse
Abb. 8: Kalzium-Einstrom in
B-Zellen von humanisierten
Mäusen. Dargestellt ist der
Einstrom von Kalzium nach
Stimulation mit anti-IgM F(ab)2
(rote Linie) und anti-IgM IgG
(blaue Linie).
Durch Bindung von Ca2+ an Indo-1 verändert dieses sein Emissionsspektrum und kann in
einem anderen Kanal detektiert werden als das freie Indo-1. Die Darstellung erfolgt durch
den Quotienten aus den beiden Detektionskanälen (405/485nm). Je mehr Kalzium einströmt,
desto größer ist der Quotient. Wie in Abb. 8 zu sehen ist, zeigten die B-Zellen aus WT Mäusen das erwartete Kalziumprofil, d.h. bei Stimulation mit dem anti-IgM F(ab)2 entsteht das
maximale Signal, während eine Stimulation mit anti-IgM IgG zu einem verminderten Signal
führt. B-Zellen von -386G/C Mäusen und 232I/T Mäusen zeigten eine den WT Zellen äquivalente Aktivierung. Bei den B-Zellen aus 232T/T Mäusen konnte hingegen bei beiden Stimuli
ein ähnlicher Kalzium-Einstrom detektiert werden. Somit konnte für 232T/T Mäuse gezeigt
werden, dass der homozygote Transmembranpolymorphismus zu einer Verminderung des
inhibitorischen Signals führt.
21
Ergebnisse
5.2
Generierung von humanisierten Mäusen mit shRNA
infizierten HSCs
Um die Bedeutung von FcγRIIB bei der B-Zell Toleranz zu untersuchen, wurde neben der
Generierung von humanisierten Mäusen mit natürlich vorkommenden Polymorphismen ein
zweiter experimenteller Ansatz verfolgt. Bei diesem sollte mittels eines lentiviralen Vektorsystems eine short hairpin RNA (shRNA) gegen FcγRIIB in die HSCs eingebracht werden, die
zu einer spezifischen Reduktion von FcγRIIB auf der Oberfläche von infizierten Zellen führen
sollte. Um diese Zellen in vivo detektieren zu können, wurde ein Vektorsystem verwendet,
bei dem neben der shRNA ebenfalls GFP in den infizierten Zellen exprimiert wird.
5.2.1 Auswahl einer shRNA für die Regulierung der FcγRIIB Expression
Zur Regulierung von FcγRIIB wurde das SuperArray „SureSilencingTM shRNA Plasmid for
Human FCGR2B“ Kit (Qiagen, Hilden) verwendet. Die im Kit enthaltenen Plasmide kodierten
je eine shRNA gegen FcγRIIB unter dem U1 Promotor und GFP als Reporter. Die Sequenzen
der einzelnen shRNAs und die Lokalisation der Konsensussequenzen in der mRNA, sind in
Tab. 3 aufgeführt. Die erste shRNA (#1) bindet im offenen Leseraster (ORF – open reading
frame) der mRNA, alle anderen in der 3’ untranslatierten Region (3’UTR).
Tab. 3: Sequenzen der einzelnen shRNAs und Bindungsstelle an der mRNA.
Sequenz (5’ 3')
shRNA
Bindung
#1
CTCCCTGAGAAACCAGCCAAT
ORF
#2
CGTGAGAACAATCATGTAAAT
3'UTR
#3
AGCAACTTGGGAAATGCTTAT
3'UTR
#4
AACCTCTACCAGCACATTAAA
3'UTR
ORF: offener Leseraster, 3’UTR: 3’ untranslatierte Region.
Die vier shRNAs wurden zuerst auf ihre regulatorische Fähigkeit getestet. Hierfür wurde die
B-Zelllinie LCL1.11 mittels Elektroporation mit den shRNA-Plasmiden transfiziert. Als Referenz wurde die im Kit enthaltene Kontroll-shRNA (K-shRNA) verwendet. Die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) von GFP+ Zellen, die mit der K-shRNA transfiziert wurden, wurde als
100% gesetzt und bildete den Bezugspunkt für die verschiedenen spezifischen shRNAs. Die
relative Expression von FcγRIIB der transfizierten Zellen ist in Abb. 9A dargestellt. Die
shRNA #1 führte zu einer um 10% verminderten Expression, shRNA #3 und #4 konnten die
Expression von FcγRIIB um 40% bis 45% reduzieren, während shRNA #2 eine Verminderung
um 60% zeigte.
22
Ergebnisse
A
B
Abb. 9: Regulierung von FcγγRIIB durch shRNA. A) Dargestellt ist die Expression von FcγRIIB in
shRNA transfizierten GFP+ LCL1.11 Zellen im Vergleich zur Expression von K-shRNA transfizierten
GFP+ LCL1.11 Zellen. B) Relative Expression der inhibitorischen Rezeptoren FcγRIIB, CD22 und
CD72 auf GFP+ infizierten LCL1.11 Zellen. Die MFI der einzelnen Rezeptoren von nicht infizierten
GFP- Zellen diente als Bezugspunkt (n=5).
Die shRNA #2 wurde anschließend in den lentiviralen Transfervektor pTRIP-∆U3-EF1α-GFP
(pTRIP) kloniert, der bereits das Gen für GFP unter der Kontrolle eines EF-1α Promotors
enthielt. Die shRNA mit dem U1 Promotor wurde mittels PCR aus dem Ausgangsvektor
amplifiziert und über EcoRI in pTRIP kloniert (pTRIP-2b#2). Dieser Vektor wurde für die Herstellung lentiviraler Partikel mit dem „drei-Plasmid-System“ verwendet [111]. Bei diesem System liegen die genetischen Informationen für den Virus auf drei verschiedenen Plasmiden.
Das hier verwendete System bestand aus dem Transfervektor pTRIP-2b#2, dem Verpackungsplasmid pCMV-dR8.2, das die Gag, Pol und Rev Gene von HIV enthält und pMD2.G,
der das Hüllprotein des Vesikulären Stromatitis Virus (VSV-G) kodiert. HEK293T Zellen wurden transient mit den drei Plasmiden transfiziert und der virushaltige Überstand gewonnen.
Die Funktionalität der Viruspartikel wurde durch Infektion von LCL1.11 Zellen untersucht. Der
Anteil GFP+ Zellen und die Expression von FcγRIIB in GFP- und GFP+ Zellen wurde mittels
Durchflusszytometrie bestimmt. Je nach Viruscharge betrug der Anteil GFP+ Zellen 2% bis
21% (Daten nicht gezeigt). Auf den GFP+ Zellen konnte eine verminderte Expression von
FcγRIIB (21-35%) im Vergleich zu den GFP- Zellen nachgewiesen werden. Um die Spezifität
der shRNA zu überprüfen, wurde auch die Expression der anderen inhibitorischen Rezeptoren der B-Zelle, CD22 und CD72, untersucht. Mit einer relativen Expression von 88,6% 91,7%, im Vergleich zu den GFP- Zellen, wurden diese durch die verwendete shRNA nicht
reguliert (Abb. 9B).
23
Ergebnisse
5.2.2 Infektion von HSCs
Für die Infektion der HSCs wurden Viruspartikel mit zwei unterschiedlichen Hüllproteinen
produziert. Neben VSV-G, welches für die Testinfektionen der B-Zelllinie LCL1.11 verwendet
wurde, sollte auch das Hüllprotein des endogenen Virus RD114 der Katze (RDF) getestet
werden, da für dieses eine hohe Effektivität bei der Infektion von Stammzellen beschrieben
ist [112]. Der Vergleich beider Viren erfolgte durch Infektion von HSCs, die anschließend auf
die Expression von GFP untersucht wurden. Wie Abb. 10 zeigt, konnte mit dem VSV-G Hüllprotein 18,6% der HSCs infiziert werden, während mit RDF nur 0,2% GFP+ Zellen nachgewiesen werden konnten. Für den weiteren Verlauf wurden deswegen Viren mit dem VSV-G
Hüllprotein verwendet. Der durchschnittliche Anteil GFP+ Zellen lag bei 4 Experimenten bei
13,3 ± 4,1 % (Daten nicht gezeigt).
Abb. 10: Infektion von HSCs durch virale Partikel mit unterschiedlichen Hüllproteinen. HSCs
wurden mit verschiedenen Viren infiziert und nach 6 Tagen im Durchflusszytometer auf den Anteil
GFP+ Zellen untersucht.
Für die Generierung von humanisierten Mäusen mit infizierten HSCs wurden diese während
der Infektionsprozedur für 48 h kultiviert. Um zu untersuchen, ob die HSCs in dieser Zeit ihren Stammzellcharakter verlieren, wurden diese vor und nach der Infektion mittels Durchflusszytometrie auf die Expression von CD34 und CD38 untersucht (Abb. 11). CD34+CD38Zellen gelten dabei als Stammzellen, während die Expression von CD38 auf eine beginnende Differenzierung hinweist [113]. An Tag 0 zeigten über 80% der Zellen CD34 auf der Oberfläche, während CD38 nicht detektiert werden konnte. Nach 2 Tagen Kultivierung exprimierten alle Zellen CD34. Von diesen waren 36% CD38-, während 64% der Zellen bereits CD38+
waren. Somit konnte gezeigt werden, dass der Stammzellcharakter, während der Infektion,
bei etwa einem Drittel der Zellen erhalten bleibt.
24
Ergebnisse
A
B
Abb. 11: Bestimmung des Stammzellcharakters von infizierten HSCs nach 2 Tagen Kultivierung
mittels Durchflusszytometrie. A) Expression von CD34 und CD38 vor Infektion. B) Expression von
CD34 und CD38 2 Tage nach Infektion. Für die Infektion wurden die viralen Partikel auf Retronectinbeschichtete Platten zentrifugiert, anschließend wurden die HSCs in frischem Zytokincocktail dazugegeben (siehe 8.5.4).
5.2.3 Rekonstitution von NSG Mäusen mit infizierten HSCs
NSG Mäuse wurden 3 Tage nach der Geburt sublethal mit 1 bis 1,3 Gy bestrahlt. Da aufgrund der Infektionsprozedur ein Teil der Zellen bereits eine beginnende Differenzierung
zeigten (siehe Abb. 11), wurde zum Ausgleich eine höhere Zellzahl in die Mäuse injiziert, als
bei den Tieren die mit nicht infizierten Stammzellen generiert wurden. Dementsprechend
wurden 4-6 h nach Bestrahlung 45.000 infizierte HSCs pro Maus intravenös injiziert. 12-16
Wochen nach Injektion wurde den Mäusen retro-orbital Blut entnommen und der Anteil von
humanen Zellen untersucht. Dieser betrug im Mittel 51,1% ± 17,2% (Abb. 12A). CD19+
B-Zellen machten 64% ± 11,8% der humanen Zellen aus, CD3+ T-Zellen waren mit 24,6% ±
13,5% vertreten und CD33+ myeloide Zellen bildeten mit 3,3% ± 1,5 % den kleinsten Anteil
der Leukozyten (Daten nicht gezeigt).
A
B
Abb. 12: Rekonstitution von NSG Mäusen
mit infizierten HSCs 16 Wochen nach
Transplantation. A) Anteil hCD45+ Zellen im
Blut. B) Anteil GFP+ Zellen in der humanen
Zellpopulation des Blutes.
Der Anteil infizierter GFP+ Zellen im Blut lag im Durchschnitt bei 4,8% ± 4,6%, wobei 12 Tiere 1-4% und 3 Tiere 6-13% GFP+ Zellen besaßen (Abb. 12B). Während in den ersten Wo25
Ergebnisse
chen meist alle GFP+ Zellen CD19+ B-Zellen waren, konnten zu späteren Zeitpunkten auch
CD19- GFP+ Zellen detektiert werden. Bei diesen handelte es sich vorwiegend um CD3+
T-Zellen (Daten nicht gezeigt). Auch in Milz, Knochenmark, Lymphknoten und im Peritoneum
waren GFP+ Zellen zu finden, ihr Anteil war in den Organen jedoch variabel. Die größte Anzahl GFP+ Zellen konnte meist im Knochenmark detektiert werden (Daten nicht gezeigt).
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Repopulationsfähigkeit der HSCs, trotz der Virusinfektion,
erhalten blieb und dass diese Zellen in NSG Mäusen ein vollständiges humanes Immunsystem ausbilden konnten.
5.2.4 Regulation von FcγRIIB in infizierten Zellen in vivo
Um zu überprüfen, ob die shRNA ihre regulatorische Fähigkeit auch nach Transplantation der
HSCs in NSG Mäuse behält, wurden CD19+IgM+ B-Zellen der humanisierten Mäuse mittels
Durchflusszytometrie auf die Expression von FcγRIIB untersucht. Hierfür wurde die MFI von
FcγRIIB auf nicht-infizierten GFP- Zellen und infizierten GFP+ Zellen verglichen.
A
B
C
D
Abb. 13: Regulation von FcγγRIIB durch die shRNA in vivo. A) FcγRIIB Expression in GFP+ infizierten- und GFP- nicht-infizierten CD19+IgM+ B-Zellen im Blut. B) Quantifizierung der FcγRIIB Expression im Blut (n=12). C) FcγRIIB Expression in GFP+ infizierten- und GFP- nicht-infizierten CD19+IgM+
B-Zellen in Milz und Knochenmark einer 20 Wochen alten Maus. D) Quantifizierung der FcγRIIB Expression in Milz und Knochenmark für die in C gezeigte Maus.
26
Ergebnisse
Abb. 13A zeigt beispielhaft die Expression von FcγRIIB auf CD19+IgM+ B-Zellen im Blut.
Eine verringerte Expression von FcγRIIB auf der GFP+ Population ist deutlich zu sehen. Die
Quantifizierung (Abb. 13B) zeigte eine signifikant verminderte Expression von FcγRIIB in
GFP+ B-Zellen des Blutes. Die relative Expression der GFP+ Zellen lag bei 39,6% ± 14,2%
im Vergleich zu den nicht-infizierten GFP- B-Zellen. Die Wirksamkeit der eingeschleusten
shRNA wurde auch in den Organen Milz und Knochenmark überprüft. Abb. 13C zeigt exemplarisch die FcγRIIB Expression auf GFP+ und GFP- B-Zellen in diesen Organen. Die GFP+
B-Zellen der Milz zeigten 58,6% der FcγRIIB Expression von GFP- B-Zellen, die GFP+
B-Zellen im Knochenmark hatte 53,4% der Rezeptorexpression von GFP- B-Zellen (Abb.
13D). Somit führte die shRNA in Blut, Milz und Knochenmark zu einer verminderten FcγRIIB
Expression.
5.3
Charakterisierung des humanen Immunsystems
in humanisierten Mäusen
Zu Beginn der Arbeit sollte das humane Immunsystem in den rekonstituierten Tieren auf die
Anwesenheit von unterschiedlichen Immunzellen und die Expression von FcγRIIB auf
B-Zellen untersucht werden. Hierfür wurden humanisierte Mäuse verschiedenen Alters untersucht. Zum einen wurden die Zellpopulationen der unterschiedlichen Organe mittels
Durchflusszytometrie analysiert, zum anderen wurde die Anwesenheit von humanen Zellen
in Gewebeschnitten mittels Immunfluoreszenzfärbung untersucht. Weiterhin wurden auch
humane Knochenmarks- und Milzproben untersucht, um das menschliche Immunsystem mit
dem der humanisierten Mäuse vergleichen zu können.
5.3.1 Analyse von humanem Knochenmark und humaner Milz
Zum Vergleich des Immunsystems der humanisierten Mäuse mit dem menschlichen Immunsystem wurden die Zellen von drei humanen Knochenmarksproben und von drei humanen
Milzproben untersucht. Diese wurden freundlicherweise von Prof. Dr. Diana Dudziak (Labor
für Biologie dendritischer Zellen, Erlangen) zur Verfügung gestellt. Bei den drei Knochenmarksproben (Patient 1, 2 und 3) handelte es sich um Material von Lymphom-Erstdiagnosen,
während die Spender der drei Milzproben (Patient 4, 5 und 6) unterschiedliche Diagnosen
aufwiesen (Patient 4: Karzinom, Patient 5: Polytrauma, Patient 6: idiopathische Thrombozytopenie). Die B-Zell Population wurde mit Hilfe der Oberflächenmarker CD19, IgM, CD20,
27
Ergebnisse
CD10 und CD38 charakterisiert. CD38 ist ein früher Marker, der ab dem allgemeinen
lymphoiden Vorläufer (CLP – common lymphocyte progenitor) Stadium exprimiert wird [114].
Während der Entwicklung und Reifung der B-Zellen wird er herunterreguliert und anschließend auf Keimzentrums-B-Zellen re-exprimiert. Auch CD10 ist ein früher B-Zell Marker, der
ab dem pro-B-Zell Stadium exprimiert und mit zunehmender Entwicklung herunterreguliert
wird [115]. CD20 ist hingegen ein Marker, dessen Expression während der B-Zell Entwicklung zunimmt [115, 116]. Auf Plasmazellen wird CD20 jedoch nicht mehr exprimiert [116].
Zusätzlich wurde auch die Expression von FcγRIIB in diesen Organen untersucht.
Wie in Abb. 14 zu sehen ist, waren im humanen Knochenmark nur wenige B-Zellen detektierbar. Diese waren zum Teil IgM+, zum andern IgM negativ. Anhand der FcγRIIB Expression
konnte ebenfalls eine positive und eine negative B-Zell Population detektiert werden. Während nur wenige CD10+ Zellen zu finden waren, konnte eine deutliche Population von
CD20+ Zellen nachgewiesen werden. Anhand der Expression von CD38 waren, wie bei
FcγRIIB und IgM, eine positive und eine negative B-Zell Population erkennbar. In der Milz
war der größte Teil der B-Zellen IgM-, FcγRIIB+, CD20+ und CD38+. Zudem konnte CD38++
Keimzentrums-B-Zellen nachgewiesen werden. Somit liegen in der humanen Milz vorwiegend reife B-Zellen vor, die bereits einen Klassenwechsel vollzogen haben. In Abb. 14B sind
die Anteile von CD19+ B-Zellen, CD3+ T-Zellen und CD33+ myeloiden Zellen in beiden Organen dargestellt. Der Anteil CD19+ B-Zellen betrug im Knochenmark durchschnittlich 11,6%
± 6,3%. Der Anteil an T-Zellen lag bei 46,4% ± 24,6% und der Anteil myeloider Zellen lag bei
23,8% ± 23,6%. In der Milz war der Anteil an B-Zellen zwischen den drei Patienten sehr variabel und lag im Durchschnitt bei 53,0 ± 38,2%. Der Anteil an T-Zellen lag bei 23,2 ± 15,1%
und der Anteil myeloider Zellen bei 8,1 ± 6,3%. Für die Analyse der T-Zellen wurde in beiden
Organen innerhalb der CD3+ Population der Anteil CD4+ und CD8+ T-Zellen bestimmt. Da
die unterschiedlichen Patienten teilweise stark voneinander abwichen, sind die Anteile für
jeden Patienten einzeln dargestellt (Abb. 14C). Im Knochenmark waren bei Patient 1 weniger
CD4+ als CD8+ T-Zellen vorhanden, während dies in Patient 2 genau umgekehrt war. Patient
3 zeigte hingegen annähernd gleiche Mengen an CD4+ und CD8+ T-Zellen. In der Milz waren sich Patient 4 und 5 sehr ähnlich, mit der gleichen Anzahl an CD4+ T-Zellen wie an CD8+
T-Zellen. Lediglich Patient 3 zeigte einen höheren Anteil CD8+ T-Zellen. Bei den Knochenmarksproben wurde innerhalb der CD19+ Fraktion der Anteil CD10- rezirkulierender B-Zellen
und CD10+ B-Zell Vorläufer bestimmt. Innerhalb der CD10+ Zellen wurde zudem der Anteil
der einzelnen B-Zell Vorläufer analysiert. Beim Menschen erfolgt dies anhand der Expression
von CD34 und IgM. Dabei sind pro-B-Zellen CD34+IgM-, prä-B-Zellen CD34-IgM- und die
unreifen B-Zellen CD34-IgM+ [10]. Der Anteil CD10- B-Zellen lag im Mittel bei 77,3% ±
28
Ergebnisse
15,0% und der Anteil CD10+ B-Zellen bei 22,4% ± 11,9% (Abb. 14D). Aufgrund der geringen
Anzahl an CD10+ B-Zellen bei Patient 5 erfolgte die Analyse der B-Zell Vorläufer nur in den
Patienten 4 und 6. Die Anteile der einzelnen B-Zell Entwicklungsstufen war bei beiden Patienten sehr ähnlich. Pro-B-Zellen waren durchschnittlich mit 11,6% ± 2,3%, prä-B-Zellen mit
69,0% ± 12,2% und unreife B-Zellen mit 19,2% ± 9,7% vorhanden (Abb. 14D).
A
B
C
D
Abb. 14: Analyse von humanem Knochenmark und humaner Milz. A) Untersuchung von B-Zell
Markern in Knochenmark und Milz. Dargestellt sind die Zellen von Patient 1 (Knochenmark) und Patient 4 (Milz). B) Anteile von CD19+ B-Zellen, CD3+ T-Zellen und CD33+ myeloiden Zellen in Knochenmark und Milz. C) Anteil CD4+ und CD8+ T-Zellen innerhalb der CD3+ T-Zell Population in den
einzelnen Patienten. D) Analyse CD10- und CD10+ Zellen im Knochenmark, innerhalb der CD19+ BZell Fraktion. CD19+CD10+ B-Zellen wurden zusätzlich auf die Anteile von CD34+IgM- pro-B-Zellen,
CD34-IgM- prä-B-Zellen und CD34-IgM+ unreifen B-Zellen untersucht.
29
Ergebnisse
5.3.2 Analyse des Immunsystems in humanisierten Mäusen
Bei den humanisierten Mäusen konnte die Anwesenheit von B-Zellen, T-Zellen und CD33+
myeloiden Zellen im Blut bereits gezeigt werden (siehe Abb. 7). Die Anwesenheit dieser Zelltypen sollte auch im Knochenmark und in der Milz überprüft werden. Dafür wurden humanisierte Mäuse unterschiedlichen Alters getötet und die humanen Zellen in den Organen mittels Durchflusszytometrie untersucht.
A
B
C
Abb. 15: Nachweis verschiedener Zellpopulationen in Knochenmark und Milz von WT Mäusen
mittels Durchflusszytometrie. A) und B) zeigt Zellen aus Knochenmark und Milz einer 16 Wochen
alten humanisierten WT Maus, C) zeigt Zellen aus Knochenmark und Milz einer 24 Wochen alten
humanisierten WT Maus. A) CD45+ humane Zellen wurden auf die Anwesenheit von CD19+ B-Zellen,
CD3+ T-Zellen, CD33+ myeloiden Zellen und CD16+CD33- NK-Zellen untersucht. B) CD3+ T-Zellen
wurden auf die Expression von CD4 und CD8 untersucht. Die Anwesenheit von NK-Zellen wurden
anhand der Expression von CD56 auf CD19-CD3- Zellen bestätigt. C) Nachweis von CD11c+ dendritischen Zellen und CD14+ Monozyten.
Wie Abb. 15 A zeigt, konnte in 16 Wochen alten Tieren B-Zellen, T-Zellen und myeloide Zellen nachgewiesen werden. Ebenso konnten CD16+ CD33- Zellen detektiert werden, bei de30
Ergebnisse
nen es sich vermutlich um NK-Zellen handelt. Die Analyse mit dem NK-Zell Marker CD56
bestätigte die Anwesenheit dieser Population (Abb. 15B). Die Analyse von CD3+ T-Zellen
zeigte die Anwesenheit von CD8+ zytotoxischen T-Zellen und CD4+ Helfer-T-Zellen (Abb.
15B). Aufgrund der geringen Anzahl myeloider Zellen nach 16 Wochen, wurden diese in 24
Wochen alten Tieren genauer untersucht. Bei diesen war der Anteil an CD33+ Zellen höher.
Sowohl im Knochenmark als auch in der Milz konnten CD33+CD14+ Monozyten nachgewiesen werden. Ebenso konnte in beiden Organen CD33-CD11c+ Dendritische Zellen (DC dendritic cell) detektiert werden (Abb. 15C).
Um den Einfluss von FcγRIIB auf die B-Zell Toleranz in den generierten humanisierten Mäusen zu untersuchen, war es von Bedeutung, dass die B-Zellen eine normale Entwicklung
zeigen und die relevanten B-Zell Populationen vorhanden sind. Um dies zu überprüfen, wurden die humanen Zellen aus Knochenmark, Blut, Milz, Lymphknoten und Peritoneum auf die
Expression verschiedener B-Zell Marker, die auch für die Analyse der humanen Milz und des
humanen Knochenmarks verwendet wurden, untersucht. Für die Analyse der Zellen in den
Lymphknoten wurden die in den Tieren vorhandenen Lymphknoten, meist der mesenterische
und die zervikalen, vereint und untersucht. Wie in Abb. 16 zu sehen ist, waren in allen Organen B-Zellen nachweisbar. IgM+ B-Zellen waren im Knochenmark nur zu einem geringen Teil
zu finden. In den anderen Organen war der größte Teil der B-Zellen IgM+, es konnten aber
auch IgM- B-Zellen detektiert werden. Das Expressionsmuster von FcγRIIB war sehr ähnlich
zu dem Expressionmuster von IgM. Auch hier waren im Knochenmark nur wenige B-Zellen
FcγRIIB positiv. In der Milz war erneut der größte Anteil an B-Zellen FcγRIIB+, während in
Blut, Lymphknoten und Peritoneum fast alle B-Zellen FcγRIIB auf der Oberfläche trugen. Die
Untersuchung des frühen B-Zell Markers CD10 und des späten B-Zell Markers CD20 zeigte,
dass im Knochenmark vorwiegend CD10+CD20- frühe B-Zell Stadien zu finden waren. Im
Blut waren so gut wie alle B-Zellen CD20+. Trotzdem diese auch positiv für CD10 waren, war
die Expression dieses Markers niedriger als im Knochenmark, was auf einen reiferen Charakter hindeutet. In der Milz war die CD20 Expression ähnlich wie die von IgM und FcγRIIB.
Auch hier exprimierten die B-Zellen noch CD10. Ebenso wie im Blut war diese jedoch geringer als im Knochenmark. Im Lymphknoten waren vorwiegend CD20+CD10- reife B-Zellen
vorhanden. Im Peritoneum waren die B-Zellen ebenfalls CD20+, exprimierten aber noch eine
geringe Menge an CD10. Aufgrund der geringen Zellzahl wurde die Anwesenheit von CD38
im Peritoneum nicht bestimmt. CD38 konnte im Knochenmark auf allen B-Zellen detektiert
werden. Auch in Blut und Milz waren die B-Zellen positiv für CD38, während im Lymphknoten
nur wenig oder kein CD38 auf den B-Zellen zu finden war. Dies deutet erneut auf vorwiegend
reife B-Zellen in diesem Organ hin. Im Vergleich zur Expression der untersuchten B-Zell
31
Ergebnisse
Marker in menschlichen Organen zeigten die B-Zellen in humanisierten Mäusen einen unreiferen Charakter. Dies war vor allem anhand der Expression von CD10 und CD38 in der Milz
zu sehen.
Abb. 16: Charakterisierung der B-Zell Population in den verschiedenen Organen von humanisierten Mäusen. Dargestellt sind hCD45+ Zellen von Knochenmark, Blut, Milz, Lymphknoten und
Peritoneum einer 16 Wochen alten WT Maus. Diese wurden auf die Expression verschiedener
B-Zellmarker untersucht.
32
Ergebnisse
Da in Autoimmunpatienten vorwiegend Veränderungen bei den Gedächtnis-B-Zellen, Plasmablasten und Plasmazellen beschrieben sind [86-89, 91], wurde in Knochenmark, Milz und
Lymphknoten die Anwesenheit dieser Zellen untersucht (Abb. 17). Gedächtnis-B-Zellen
zeichnen sich im Menschen durch die Anwesenheit von CD27 auf der Oberfläche aus [14].
Bei B-Zellen mit sehr starker CD27 Expression handelt es sich dagegen um Plasmablasten
[117]. Plasmazellen können, wie in der Maus, durch den Oberflächenmarker CD138 detektiert werden [118]. Während in der Milz CD27+IgM+ Gedächtnis-B-Zellen und CD27++IgM+
Plasmablasten detektiert werden konnten, waren diese in Knochenmark und Lymphknoten
kaum vorhanden. Auch CD138+ Plasmazellen konnten vorwiegen in der Milz nachgewiesen
werden (Abb. 17).
Abb. 17: Nachweis von Gedächtnis-B-Zellen, Plasmablasten und Plasmazellen in humanisierten Mäusen. Dargestellt sind humane Zellen von Knochenmark, Milz und Lymphknoten einer 16 Wochen alten humanisierten WT Maus. Gedächtnis-B-Zellen und Plamablasten wurden anhand der Expression von IgM und CD27 identifiziert. Die Unterscheidung zwischen beiden Populationen erfolgte
anhand der CD27+IgM- T-Zell Population. IgM+ Zellen mit gleich starker Expression wie die T-Zellen
wurden als Plasmablasten identifiziert. Plasmazellen wurden anhand der Expression von CD138 identifiziert.
33
Ergebnisse
5.4
Architektur in sekundären lymphatischen Organen von
humanisierten Mäusen
Neben dem Nachweis von Immunzellen mittels Durchflusszytometrie, wurde die Anordnung
der humanen Zellen in Milz und Lymphknoten mittels Immunfluoreszenz untersucht. Hierbei
sollte vor allem geprüft werden, ob die humanen Zellen follikuläre Strukturen ausbilden.
In der Milz (Abb. 18A und B) war zu sehen, dass sich die humanen Zellen zu follikulären
Strukturen anordnen. In diesen Strukturen konnten sowohl CD3+ T-Zellen als auch CD20+
B-Zellen detektiert werden. Eine der Maus entsprechende Anordnung in B- und T-Zellzone
konnte nicht beobachtet werden. Weiterhin konnten auch einzelne IgM+ extrafollikuläre
Plasmazellen detektiert werden (Abb. 18B). Im Gegensatz zur Milz zeigten die Lymphknoten
von humanisierten Mäusen keine organisierte Struktur (Abb. 18). Da Lymphknoten vorwiegend aus älteren Tieren isoliert werden konnten, war hier ein hoher Anteil an T-Zellen nachweisbar, da deren Anzahl mit dem Alter der Tiere zunahm.
A
B
C
Abb. 18: Humane Zellen in Milz und Lymphknoten von humanisierten Mäusen. A) Nachweis
CD20+ B-Zellen und CD3+ T-Zellen in der Milz einer 16 Wochen alten WT Maus. Vergrößerung: 200x
B) Follikuläre Anordnung hCD45+ Zellen und CD3+ T-Zellen und Nachweis einzelner IgM+ extrafollikulärer Plasmazellen in der Milz einer 16 Wochen alten WT Maus. Vergrößerung: 100x. C) Nachweis
hCD45+ Zellen und CD3+ T-Zellen im mesenterischen Lymphknoten einer 36 Wochen alten 232T/T
Maus. Vergrößerung: 100x.
34
Ergebnisse
5.5
B-Zell Toleranz in den humanisierten Mäusen
Die in dieser Arbeit generierten humanisierten Mäuse mit den unterschiedlichen Allelvarianten des FcγRIIB Gen’s (WT, -386G/C, 232I/T, 232T/T) und mit der stabil integrierten shRNA
gegen FcγRIIB (shRNA) sollten auf den Verlust der B-Zell Toleranz untersucht werden. Hierfür wurde den Tieren nach 16 und 24 Wochen Serum entnommen und auf die Anwesenheit
von Autoantikörpern untersucht. Zusätzlich wurde im Blut der Tiere der Anteil humaner Zellen
und die Verteilung der einzelnen Zellpopulationen bestimmt.
5.5.1 Rekonstitution der einzelnen Gruppen
In 5.1.2 wurde bereits die Rekonstitutionseffizienz der humanisierten Mäuse bestimmt. Diese
beinhaltete alle Tiere, die mit unbehandelten HSCs generiert wurden. Hier sollte nun die Rekonstitution der verschiedenen Gruppen bestimmt werden. Zusätzlich zum 16 Wochen Zeitpunkt wurde der Anteil humaner Zellen im Blut auch nach 24 Wochen bestimmt. Abb. 19
zeigt die mittleren Anteile hCD45+ Zellen im Blut, sowie den Anteil CD19+ Zellen innerhalb
der humanen Population für die einzelnen Mausgruppen zu beiden Zeitpunkten. Die Fehlerbalken sind als Standardabweichung dargestellt.
In Abb. 19A ist die Rekonstitution der WT Gruppe im Vergleich zur shRNA Gruppe dargestellt. 16 Wochen nach Transplantation lag der mittlere Anteil hCD45+ Zellen im Blut bei
44,2% ± 29,7% in der WT Gruppe und bei 51,1% ± 17,2% in der shRNA Gruppe. Während
die WT Gruppe nach 24 Wochen mit 27,3% ± 20,7% etwas weniger humane Zellen zeigte,
lag der Anteil in der shRNA Gruppe mit 68,4% ± 13,1% höher. Zu diesem Zeitpunkt besaß
die shRNA Gruppe signifikant mehr humane Zellen als die WT Gruppe. Trotz des unterschiedlichen Anteils humaner Zellen, war der Anteil CD19+ Zellen bei beiden Gruppen zum
16 Wochen Zeitpunkt (WT: 67,2% ± 22,7%; shRNA: 64,8% ± 10,8%) sowie zum 24 Wochen
Zeitpunkt (WT: 49,8% ± 31,1%; shRNA: 49,3% ± 22,6%) ähnlich.
Die Humanisierung der -386G/C Gruppe im Vergleich zur WT Gruppe ist in Abb. 19B dargestellt. Der Anteil humaner Zellen lag bei 16 Wochen bei 48,0% ± 18,1% und war signifikant
höher als der der WT Gruppe. Auch mit 60,3% ± 25,6% humanen Zellen bei 24 Wochen war
dies der Fall. Der Anteil an B-Zellen im Blut war sowohl nach 16 Wochen (77,2%± 13,3%)
als auch nach 24 Wochen (37,8% ± 25,6%) vergleichbar zur WT Gruppe.
35
Ergebnisse
A
B
C
Abb. 19: Anteil humaner Zellen und humaner B-Zellen im Blut von 16 und 24 Wochen alten
humanisierten Mäusen. Dargestellt ist der Anteil hCD45+ Zellen und der darin enthaltene Anteil an
CD19+ Zellen des Blutes von A) WT (n=32 bzw. 14) und shRNA (n=16 bzw. 8) Mäusen, B) WT und
-386G/C (n=20-22 bzw. 10-11) Mäusen, C) WT, 232I/T (n=6) und 232T/T (n=15 und 13) Mäusen. Die
Zahlen in den Klammern geben die Gruppengröße bei 16 Wochen (erster Wert) und bei 24 Wochen
(zweiter Wert) an. Die WT Gruppe ist in A, B und C die Gleiche. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung; Signifikanzen wurden mit dem Mann-Whitney U Test ermittelt. * p<0,05, ** p<0,01,
*** p<0,001.
Die Gruppen mit heterozygotem bzw. mit homozygotem 232T Allel sind in Abb. 19C gegen
die WT Gruppe aufgetragen. Zum 16 Wochen Zeitpunkt zeigten die 232I/T Gruppe mit 48,0%
± 18,1% und die 232T/T Gruppe mit 45,2% ± 22,0% eine ähnliche Rekonstitution wie die WT
Gruppe. Nach 24 Wochen lag der Anteil humaner Zellen in der 232I/T Gruppe mit 76,9% ±
18,0% deutlich über dem der WT Gruppe und der 232T/T Gruppe. Letztere besaß mit 40,9%
36
Ergebnisse
± 18,1% ebenfalls mehr humane Zellen als die WT Gruppe. Der Anteil von B-Zellen im Blut
lag bei der 232I/T Gruppe nach 16 Wochen bei 81,7% ± 7,0%. Damit hatte diese Gruppe
zwar keinen signifikant höheren Anteil als die WT Gruppe, besaß aber signifikant mehr
CD19+ Zellen als die 232T/T Gruppe mit 61,8%± 12,3%. Nach 24 Wochen war der Anteil an
B-Zellen in der 232I/T Gruppe mit 64,9% ± 27,6% etwas geringer als bei 16 Wochen. Zur WT
Gruppe konnte hier erneut kein Unterschied detektiert werden. Die 232T/T Gruppe zeigte
hingegen mit einem Anteil von 19,8% ± 16,0% weniger B-Zellen als die WT Gruppe und die
232I/T Gruppe.
5.5.2 Serum Immunglobuline
Zur Charakterisierung der verschiedenen Mausgruppen wurde zuerst die Gesamtmenge von
Immunglobulin M (IgM) und Immunglobulin G (IgG) in den Seren von 16 und 24 Wochen
alten Mäusen bestimmt (Abb. 20). Nach 16 Wochen zeigten die WT Gruppe (34,6 ±
27,6µg/ml), die -386G/C Gruppe (32,9 ± 34,0µg/ml) und die 232I/T Gruppe (59,4 ±
50,8µg/ml) vergleichbare IgM Konzentrationen. Die 232T/T Gruppe verfügt mit 68,9 ±
56,5µg/ml über signifikant mehr IgM als die WT und die -386G/C Gruppe. Auch die shRNA
Gruppe zeigte mit 86,3 ± 35,3µg/ml IgM eine signifikant höhere Konzentration als diese beiden Gruppen. Nach 24 Wochen besaß die shRNA Gruppe mit 228,3 ± 215,1µg/ml mehr IgM
als die WT Gruppe mit 57,6 ± 36,9µg/ml und die -386G/C Gruppe mit 74,1 ± 95,8µg/ml. Die
232T/T Gruppe zeigte mit 168,1 ± 170,0µg/ml signifikant mehr IgM als die WT Gruppe und
die 232I/T Gruppe (47,5 ± 34,5µg/ml).
IgG konnte bei der 232I/T und der -386G/C Gruppe mit 0,3 ± 0,8µg/ml bzw. 0,5 ± 1,3µg/ml
zum 16 Wochen Zeitpunkt nicht nachgewiesen werden. Bei der WT Gruppe (4,3 ± 14,7µg/ml)
und der shRNA Gruppe (3,5 ± 11,2µg/ml) war dagegen eine geringe Menge IgG detektierbar. Mit 8,6 ± 18,2µg/ml war auch in der 232T/T Gruppe nur eine geringe Menge an IgG
nachweisbar. Trotz dieser geringen Menge besaß die 232T/T Gruppe signifikant mehr IgG
als die WT, die -386G/C und die 232I/T Gruppen. Auch nach 24 Wochen war in der WT
Gruppe (15,0 ± 28,5µg/ml), der shRNA Gruppe (12,2 ± 32,6µg/ml) und der 232I/T Gruppe
(14,9 ± 34,3µg/ml) nur wenig IgG nachweisbar. Die -386G/C Gruppe zeigte mit 65,8 ±
137,9µg/ml zwar eine höhere Konzentration, dieser hohe Mittelwert wurde aber durch zwei
Mäuse mit hohen IgG Konzentrationen verursacht. Hingegen zeigte die 232T/T Gruppe mit
87,3 ± 105,2µg/ml eine erhöhte Produktion von IgG. Diese war im Vergleich zur shRNA und
zur 232I/T Gruppe statistisch signifikant. Da fast die Hälfte der 232T/T Tiere erhöhte IgG
Spiegel im Serum zeigten, wurde dieser Wert nicht nur durch einzelne Tiere verursacht.
37
Ergebnisse
Abb. 20: Serum Immunglobuline in humanisierten Mäusen. Gesamt IgM und IgG 16 (linke Seite)
und 24 Wochen (rechte Seite) nach Transplantation. Linien zeigen den Mittelwert. WT: n= 30-31 bzw.
14, shRNA: n=15-16 bzw. 11, -386G/C n= 23 bzw. 10-11, 232I/T: n=6, 232T/T: n=20 bzw. 13. Die
Gruppengröße ist jeweils für 16 Wochen (erster Wert) und 24 Wochen (zweiter Wert) angegeben.
Balken zeigen den Mittelwert. Signifikanzen wurden mit dem Mann-Whitney U Test ermittelt. * p<0,05,
** p<0,01, *** p<0,001.
5.5.3 Korrelation zwischen Humanisierungsgrad
und Antikörperproduktion
Aufgrund der unterschiedlichen Rekonstitutionseffizienzen der Gruppen nach 24 Wochen,
wurde für diesen Zeitpunkt der Anteil humaner Zellen im Blut gegen die Menge an produzierten Antikörpern (IgM und IgG) aufgetragen. Damit sollte untersucht werden, ob die Konzentration von Antikörpern im Serum mit dem im Blut bestimmten Humanisierungsgrad korreliert
(Abb. 21).
38
Ergebnisse
Abb. 21: Korrelation der Antikörperkonzentration und dem Anteil humaner Zellen im Blut. Dargestellt sind die einzelnen Tiere der fünf Gruppen zum 24 Wochen Zeitpunkt. Jedem Tier ist der jeweilige Wert für IgM und IgG zugeordnet. Beide Datenpunkte befinden sich übereinander auf der
x-Achse, auf der der entsprechende Anteil humaner Zellen im Blut aufgetragen ist.
Bei dieser Darstellung besitzt jedes Tier 2 Datenpunkte, einen für IgM und einen für IgG, die
dem Anteil hCD45+ Zellen auf der x-Achse zugeordnet sind. Wie Abb. 21 zeigt, besteht bei
keiner der Gruppen eine Korrelation zwischen dem Anteil humaner Zellen im Blut und der
Menge an Antikörpern im Serum. So zeigte beispielsweise in der 232T/T Gruppe die Maus
mit 15,1% hCD45+ Zellen Konzentrationen von 216,7µg/ml IgM und 140,0µg/ml IgG, während die Maus mit 65,4% CD45+ Zellen lediglich 81,3µg/ml IgM und 24,8µg/ml IgG aufwies.
Somit konnte gezeigt werden, dass auch Tiere mit wenigen humanen Zellen im Blut vergleichbare Mengen an Antikörpern produzieren können, wie Tiere mit hohem Anteil humaner
Zellen.
39
Ergebnisse
Tab. 4: Humanisierungsgrad einzelner humanisierter Mäuse in den Organen.
Anteil humaner Zellen [%]
Antikörperproduktion [µg/ml]
KnochenIgM
IgG
mark
-386G/C #1
79,3
75,3
86,1
43,15
1,35
-386G/C #2
66
74,4
79,1
8,47
0,00
-386G/C #3
92,9
31
85,2
9,57
0,00
-386G/C #4
50,1
37,2
29,6
26,94
27,55
232T/T #1
39,2
13,7
33,3
77,79
136,02
232T/T #2
28,5
33,1
7,1
153,30
1,25
232T/T #3
70,4
20,7
14,1
14,61
1,15
232T/T #4
48,7
29,9
28,8
41,38
26,04
Dargestellt ist der Anteil humaner Zellen in den Organen Blut, Milz und Knochenmark von einzelnen
-386G/C und 232T/T Mäusen 24 Wochen nach Rekonstitution. Zu den jeweiligen Tieren sind die Mengen an IgM und IgG zugeordnet.
Blut
Milz
Dass Tiere mit einer geringen Anzahl humaner Zellen im Blut eine ähnliche Produktion von
Antikörpern zeigen wie Tiere mit höherem Anteil humaner Zellen ist vor allem bei der
-386G/C Gruppe und der 232T/T Gruppe zu beobachten. Um herauszufinden, wodurch dies
bedingt ist, wurde von einzelnen Tieren die Humanisierung in den Organen Blut, Milz und
Knochenmark verglichen und die dazugehörigen Konzentrationen von IgM und IgG untersucht (Tab. 4). Dabei stellte sich heraus, dass der Anteil humaner Zellen im Blut nicht gleich
dem Anteil in Milz und Knochenmark war. So besaß Maus 232T/T #2 im Blut weniger humane Zellen als Maus 232T/T #3, aber dafür mehr in der Milz. Dementsprechend zeigte Maus
232T/T #2 eine höhere Konzentration an IgM als Maus 232T/T #3. Bei den -386G/C Tieren
zeigte Maus #4 höhere Mengen an IgM und IgG als z.B. Maus #3, trotzdem der Anteil humaner Zellen im Blut fast die Hälfte war. Der Anteil in der Milz war jedoch bei beiden Tieren annähernd gleich hoch. Aus diesen Daten ergibt sich, dass die Anzahl humaner Zellen im Blut
der humanisierten Mäuse keine Rückschlüsse auf das Gesamtsystem und die Produktion
von Antikörpern zulässt. Dadurch können auch Gruppen mit unterschiedlichen Humanisierungsgraden miteinander verglichen werden.
40
Ergebnisse
5.5.4 Produktion von Autoantikörpern in humanisierten Mäusen
Um zu untersuchen, ob es bei den humanisierten Mausgruppen zu Fehlern bei der Ausbildung der humoralen Toleranz kommt, wurden die Seren der Tiere 16 und 24 Wochen nach
Rekonstitution auf die Präsenz von autoreaktiven Antikörpern untersucht. Hierbei wurden
klassische Antigene von Autoimmunerkrankungen untersucht, wie doppelsträngige DNA
(DNA) als Autoantigen bei SLE [27, 29] und Glucose-6-phosphat-Isomerase (GPI) [32],
Rheuma-Faktor (RF) und zyklisch zitrulliniertes Peptid (CCP) [30, 31] als Autoantigene in
der Rheumatoiden Arthritis. Da die humanisierten Mäuse vorwiegend Antikörper vom Isotyp
IgM produzierten (siehe Abb. 20), wurden Autoantigen-spezifische Antikörper ebenfalls für
diesen Isotyp bestimmt. Die Messung von Antikörpern gegen dsDNA und GPI, sowie der RF
erfolgte semiquantitativ. Hierfür wurde bei jedem ELISA das Serum eines SLE Patienten mitgeführt, auf das die Werte der humanisierten Mäuse bezogen wurden. Antikörper gegen diese Antigene sind deshalb als relative Einheiten (AU – arbitrary units) angegeben. Da Antikörper gegen CCP mit einem käuflich erwerblichen Kit mit gleich bleibender Inkubationszeit
gemessen wurden und die Vergleichsprobe des SLE Patienten negativ für dieses Antigen
war, wurde hier die optische Dichte (OD) aufgetragen.
Zum 16 Wochen Zeitpunkt konnten keine signifikanten Unterschiede in der Produktion von
Antikörpern gegen DNA und GPI ermittelt werden. Die Werte lagen dabei zwischen 0,13 ±
0,09 AU (WT) und 0,21 ± 0,29 AU (232T/T) für anti-DNA Antikörper und zwischen 0,07 ± 0,05
AU (WT) und 0,19 ± 0,26 AU (232T/T) für anti-GPI Antikörper. Trotzdem die Werte für den RF
gering waren, konnte eine verstärkte Produktion bei der 232I/T Gruppe mit 0,09 ± 0,04 AU im
Vergleich zur WT Gruppe mit 0,05 ± 0,03 AU detektiert werden. Die 232T/T Gruppe besaß
mit 0,10 ± 0,11 AU zwar einen höheren Wert als die 232I/T Gruppe, dieser Unterschied war
jedoch nicht statistisch signifikant. Die shRNA Gruppe und die -386G/C Gruppe zeigten mit
0,06 ± 0,06 AU bzw. 0,05 ± 0,05 AU vergleichbare Werte zur WT Gruppe. Bei der Detektion
von anti-CCP Antikörpern waren die ermittelten Werte bei 16 Wochen für alle Gruppen sehr
gering. Trotzdem einige Mäuse der 232T/T Gruppe höhere Werte zeigten, war die OD mit
durchschnittlich 0,03 ± 0,06 nicht höher als bei den anderen Gruppen. Hingegen wiesen sowohl die 232I/T Gruppe mit einer OD von 0,04 ± 0,02 als auch die shRNA Gruppe mit 0,02 ±
0,02 signifikant mehr Antikörper als die WT Gruppe mit einer OD von 0,01 ± 0,01 auf. Die
232I/T Gruppe zeigte ebenfalls einen höheren Wert als die -386G/C Gruppe, mit einer durchschnittlichen OD von 0,01 ± 0,03.
41
Ergebnisse
Abb. 22: Produktion verschiedener Autoantikörper in humanisierten Mäusen mit veränderter
FcγγRIIB Expression. Seren von 16 Wochen (linke Seite) und 24 Wochen (rechte Seite) alten humanisierten Mäusen wurden mittels ELISA auf die Anwesenheit von Autoantikörpern untersucht. Die Werte
für anti-DNA IgM, anti-GPI IgM und RF IgM sind als relative Einheiten (AU - arbitrary units) angegeben, Werte für anti-CCP IgM als optische Dichte (OD). WT: n= 24-32 bzw. 15, shRNA: n=13-16 bzw.
9-11, -386G/C n= 20-23 bzw. 11, 232I/T: n=6, 232T/T: n=20 bzw. 13. Die Gruppengröße ist für 16
Wochen (erster Wert) und 24 Wochen (zweiter Wert) angegeben. Balken zeigen den Mittelwert der
Gruppe. Signifikanzen wurden mit dem Mann-Whitney U Test ermittelt. * p<0,05, ** p<0,01,
*** p<0,001.
42
Ergebnisse
Nach 24 Wochen zeigte die 232T/T Gruppe mit 0,49 ± 0,39 AU signifikant mehr anti-DNA
Antikörper als die WT Gruppe mit 0,17 ± 0,14 AU. Auch die 232I/T Gruppe, mit einem Wert
von 0,33 ± 0,14 AU hatte im Vergleich zur WT Gruppe erhöhte anti-DNA IgM Level. Die
shRNA Gruppe und die -386G/C Gruppe hatten zwar ebenfalls höhere Mittelwerte (0,33 ±
0,36 AU bzw. 0,37 ± 0,29 AU) als die WT Gruppe, diese Unterschiede waren jedoch nicht
signifikant. Bei der Detektion von Antikörpern gegen GPI war das Ergebnis ähnlich. Auch hier
besaß die 232T/T Gruppe mit 0,67 ± 0,81 AU den höchsten Wert. Damit zeigte sie, ebenso
wie die 232I/T Gruppe mit 0,36 ± 0,16 AU, einen signifikant höheren Wert als die WT Gruppe
mit 0,13 ± 0,09 AU. Auch bei der shRNA Gruppe und der -386G/C Gruppe konnten erhöhte
Mittelwerte detektiert werden (0,33 ± 0,33 AU bzw. 0,35 ± 0,33 AU), diese waren aber nicht
signifikant unterschiedlich zur WT Gruppe. Für den Rheuma-Faktor konnten keine statistisch
signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen ermittelt werden. Bei der 232T/T Gruppe
gab es jedoch einzelne Tiere, die eine hohe Menge an RF aufwiesen (WT: 0,14 ± 0,14 AU;
shRNA: 0,25 ± 0,32 AU; -386G/C: 0,13 ± 0,08 AU; 232I/T: 0,13 ± 0,14 AU; 232T/T: 0,62 ±
1,14 AU). Im anti-CCP ELISA konnte sowohl für die shRNA Gruppe (0,12 ± 0,11 OD) als
auch für die 232T/T Gruppe (0,46 ± 0,73 OD) eine erhöhte Produktion im Vergleich zur WT
Gruppe (0,02 ± 0,05 OD) nachgewiesen werden. Die -386G/C Gruppe (0,06 ± 0,11 OD) und
die 232I/T Gruppe (0,04 ± 0,03 OD) zeigten ähnliche Werte wie die WT Gruppe.
Einer der am Häufigsten mit Autoimmunität assozierten Faktoren im menschlichen Immunsystem sind die humanen Leukozytenantigene (HLAs - human leukocyte antigen) des humanen Haupthistokompatibilitätskomplexes. Hierbei sind HLA-DRB1*03/DQB1*02 und HLADRB1*15/DQB1*06 die am häufigsten assoziierten Haplotypen [119, 120]. Um auszuschließen, dass die beobachtete Produktion von Autoantikörpern durch diese HLA-Haplotypen
verursacht wurde, wurden für die injizierten HSC Proben der HLA-Haplotyp bestimmt. Dies
wurde freundlicherweise durch die Arbeitsgruppe von PD Dr. med. Bernd Spriewald (Lehrstuhl für Hämatologie/Internistische Onkologie, Erlangen) durchgeführt. Keine der beiden
HSC Proben, aus denen die 232I/T Gruppe generiert wurde, besaß eine mit Autoimmunitätassozierten HLA-Haplotyp. In der 232T/T Gruppe wurden dagegen Tiere durch HSCs mit
diesen Haplotypen generiert. Die Tiere dieser Gruppe wurden aufgrund der verschiedenen
Haplotypen in drei Untergruppen unterteilt. Die erste Gruppe enthielt HSCs mit dem Haplotyp
DRB1*03,15/DQB1*02,06. Die zweite Gruppe besaß den Haplotyp DRB1*15/DQB1*06, die
dritte alle anderen Haplotypen. Abb. 23 zeigt die Autoantikörper für die vier verschiedenen
Antigene dieser drei Gruppen. Dabei zeigte keine der beiden Gruppen mit autoimmunassoziierten HLAs eine höhere Produktion von Antikörpern bei den vier untersuchten Autoantigenen (siehe Abb. 23). In der WT Gruppe gab es zum 24 Wochen Zeitpunkt 1 Tier mit dem
43
Ergebnisse
Haplotyp HLA-DRB1*03/DQB1*02 und 2 Tiere mit dem Haplotyp HLA-DRB1*15/DQB1*06.
Auch diese zeigten keine erhöhte Produktion von Autoantikörpern im Vergleich zu den anderen WT Tieren (Daten nicht gezeigt).
Abb. 23: Assoziation von autoimmun-assoziierten HLAs mit der Autoantikörperproduktion. Die
Tiere der 232T/T Gruppe wurden entsprechend ihrer HLAs in drei Gruppen geordnet. Gruppe eins
besaß den Haplotyp DRB1*03,15/DQB1*02,06 (n=3); Gruppe zwei besaß den Haplotyp
DRB1*15/DQB1*06 (n=3) und Gruppe drei beinhaltete alle anderen HLA Varianten (n=7). Dargestellt
ist die Produktion von Autoantikörpern zum 24 Wochen Zeitpunkt. Anti-DNA IgM, anti-GPI IgM und RF
IgM sind als AU auf der linken Achse dargestellt, anti-CCP IgM als OD auf der rechten Achse.
Ein weiterer genetischer Einflussfaktor für die Entstehung und den Verlauf von Autoimmunerkrankungen sind die Gene der aktivierenden FcγRIIA und FcγRIIIA. Bei diesen sind bestimmte Allele, die die Affinität dieser Rezeptoren beeinflussen, mit Autoimmunerkrankungen wie
SLE [121-124] und RA [125-128] assoziiert. Im Rahmen einer anderen Studie in unserer Arbeitsgruppe wurden die HSCs von Frau Anja Lux auf Polymorphismen in den Genen von
FcγRIIA (131H/R) und FcγRIIIA (158F/V) genotypisiert. Die FcγRIIA-131R und die FcγRIIIA158F Varianten führen zu niedrigaffinen Rezeptoren, während die FcγRIIA-131H und die
FcγRIIIA-158V Varianten zu hochaffinen Rezeptoren führen. Aufgrund der verwendeten
HSCs wurde die 232T/T Gruppe in Untergruppen mit gleichen Genotypen für FcγRIIA und
FcγRIIIA unterteilt. Insgesamt konnten vier verschieden Gruppen identifiziert werden. Eine für
beide Genen heterozygote Gruppe (H/R F/V), eine Gruppe mit heterozygotem FcγRIIA und
der hochaffinen Variante für FcγRIIIA (H/R F/F), eine Gruppe mit der hochaffinen Variante
des FcγRIIA und mit heterozygotem FcγRIIIA (H/H F/V) und eine Gruppe mit der niedrigaffinen Variante des FcγRIIA und mit heterozygotem FcγRIIIA (R/R F/V). Wie Abb. 24A zeigt,
gab es zwischen den Gruppen keine signifikanten Unterschiede bei der Produktion von autoreaktiven Antikörpern. Allerdings zeigte die Gruppe mit dem Genotyp H/H F/V tendenziell
eine etwas höhere Menge an anti-DNA, anti-GPI und anti-CCP. Um zu überprüfen, ob dies
44
Ergebnisse
allein durch die hochaffine Variante des FcγRIIA verursacht wird, wurde auch die WT Gruppe
entsprechend ihrer Allele für FcγRIIA und FcγRIIIA untergliedert (Abb. 24B). Hier konnten drei
Gruppen unterschieden werden. Eine Gruppe besaß die hochaffinen Variante des FcγRIIA
und die niedrigaffinen Variante von FcγRIIIA (H/H F/F), eine die hochaffine Variante des
FcγRIIA mit heterozygotem FcγRIIIA (H/H F/V) und eine die niedrigaffinen Variante des
FcγRIIA mit heterozygotem FcγRIIIA (R/R F/V). In der WT Gruppe waren keine Unterschiede
zwischen den Genotypen erkennbar. Somit zeigten Mäuse mit dem Genotyp H/H F/V nur in
Kombination mit dem Transmembranpolymorphismus eine tendenziell erhöhte Produktion
autoreaktiver Antikörper.
A
B
Abb. 24: Einfluss von FcγγRIIA und FcγγRIIIA Varianten auf die Produktion von autoreaktiven Antikörpern. Die Tiere der 232T/T (A) und der WT Gruppe (B) wurden entsprechend ihrer FcγRIIA und
FcγRIIIA Allele in entsprechende Untergruppen eingeteilt. Für diese wurden erneut die Mengen an
produzierten Autoantikörpern dargestellt. Anti-DNA, anti-GPI und RF sind als AU auf der linken Achse
dargestellt, anti-CCP als OD auf der rechten Achse. Für Genotypen die in beiden Gruppen vorkamen
wurden gleiche Symbole verwendet. Für die Darstellung der WT Tiere wurde eine andere Achse gewählt, um mögliche Unterschiede zwischen den Gruppen sichtbar zu machen.
Um zu überprüfen, ob in den humanisierten Mäusen ebenfalls Autoantikörper vom Isotyp IgG
produziert werden, wurden Mäuse, bei denen nach 24 Wochen IgG im Serum nachweisbar
war, auf die Anwesenheit von anti-DNA IgG untersucht. Da die Vergleichsprobe des SLE
45
Ergebnisse
Patienten eine sehr viel höhere Menge an anti-DNA IgG besaß, wurden die gemessenen
Werte nicht auf dieses Serum bezogen, sondern sind als OD dargestellt. Zum Vergleich ist
ebenfalls die Menge an gesamt IgG bei diesen Mäusen aufgetragen (Abb. 25). Hierbei war in
individuellen 232T/T Mäusen anti-DNA IgG nachweisbar (Maus 232T/T #1, #3, #4, #6).
Abb. 25: Nachweis von antiDNA IgG. 24 Wochen alte
humanisierte Mäuse mit detektierbaren Mengen an gesamt
IgG (grauer Balken – rechte
Achse) wurden auf die Produktion von anti-DNA IgG (weißer
Balken – linke Achse) untersucht.
Zusammenfassend zeigte die Messung von Autoantikörpern in den Seren der humanisierten
Mäuse eine verstärkte Produktion von Antikörpern gegen dsDNA und GPI bei den beiden
Mausgruppen mit dem 232T Allel, im Vergleich zur WT Gruppe. Die 232T/T Gruppe zeigte
zudem eine erhöhte Produktion von anti-CCP Antikörpern. Die Produktion autoreaktiver Antikörper war in dieser Gruppe unabhängig von den HLA Haplotypen der Donorzellen. Weiterhin war kein direkter Einfluss von FcγRIIA und FcγRIIIA auf die Produktion von Autoantikörpern erkennbar, die hochaffine Variante von FcγRIIA schien allerdings in Kombination mit
dem Transmembranpolymorphismus einen verstärkenden Effekt zu haben. Weiterhin konnte
nachgewiesen werden, dass ein Klassenwechsel der Autoantikörper zu IgG in einzelnen Tieren der 232T/T Gruppe stattfindet.
46
Ergebnisse
5.5.5 Detektion von Antikörper-sekretierender Zellen
Zusätzlich zum Nachweis von Autoantikörpern mittels ELISA, sollte die Anzahl von
Antikörper-sekretierenden Zellen (ASCs – antibody secreting cells) bestimmt werden. Dies
ermöglicht eine Aussage darüber, ob die nachgewiesenen Antikörper im Serum durch einzelne, stark produzierende Zellen oder durch viele, gering produzierende Zellen entstehen. Zur
Detektion von ASCs wurde ein ELISpot Assay durchgeführt. Damit wurden in der Milz und im
Knochenmark die Anzahl an gesamt IgM sekretierenden Zellen, an anti-GPI IgM ASCs und
anti-DNA IgM ASCs bestimmt (Abb. 26). Bei einzelnen Tieren waren auf einigen Membranen
viele kleine Spots detektierbar, vor allem bei der Detektion von gesamt IgM ASCs (Milz und
Knochenmark) und bei anti-DNA ASCs im Knochenmark. Diese wurden als Hintergrund betrachtet. Für die Auswertung der ASCs wurden nur solche Spots gewertet, die sich vom Hintergrund gut abhoben. Als Beispiel sind einige Spots auf Membranen mit starkem Hintergrund mit einem Pfeil gekennzeichnet.
Von den Gruppen WT, -386G/C und 232T/T wurden jeweils zwei Tiere im Alter von 24 Wochen für den ELISpot geopfert. Da eines der 232T/T Tiere jedoch keine CD19+ Zellen im
Durchflusszytometer zeigte, konnten nur die Zellen von einem Tier verwendet werden.
Abb. 26 zeigt die erhaltenen Spots aller Tiere für Milz und Knochenmark, in Duplikaten. Bei
diesen wurden 50.000 CD19+ B-Zellen pro Vertiefung ausgesät. Die Quantifizierung für die
einzelnen Mäuse ist in Abb. 27 dargestellt und zeigt die Anzahl von ASCs pro 105 CD19+
Zellen. Sowohl in Abb. 26 als auch in Abb. 27 ist der Unterschied zwischen den beiden WT
Tieren deutlich zu erkennen. Während bei WT #1 in der Milz 106 gesamt IgM ASCs nachweisbar waren, konnten bei WT #2 lediglich 13 gesamt IgM ASCs detektiert werden. Im
Knochenmark war die Anzahl der gesamt IgM ASCs hingegen bei beiden WT Tieren ähnlich
(14 für WT #1 und 13 für WT #2). Die beiden -386G/C Tiere zeigten sowohl in Milz (-386G/C
#1 mit 41 und -386G/C #2 mit 37) als auch im Knochenmark (-386G/C #1 mit 22 und 386G/C #2 mit 21) eine vergleichbare Anzahl an gesamt IgM ASCs. Die 232T/T Maus besaß
in der Milz 36 gesamt IgM ASCs, während sie im Knochenmark mit 120 ASCs eine deutlich
höhere Anzahl aufwies als die anderen Tiere.
47
Ergebnisse
A
B
Abb. 26: ELISpot von Milz und Knochenmarks B-Zellen aus 24 Wochen alten humanisierten
Mäusen. Detektion von gesamt IgM ASCs, anti-GPI IgM ASCs und anti-DNA IgM ASCs in Milz (A)
und Knochenmark (B). Gezeigt sind Duplikate für jedes Tier und jede Spezifität. Pro Vertiefung wurden 50.000 CD19+ B-Zellen ausgesät.
48
Ergebnisse
GPI-spezifische ASCs waren in der Milz bei keiner WT Maus detektierbar, im Knochenmark
war jeweils eine anti-GPI ASC nachweisbar. Bei den -386G/C Tieren besaß lediglich Maus
# 1 3 ASCs in der Milz, während bei Maus #2 2 anti-GPI ASCs im Knochenmark detektierbar
waren. Bei der 232T/T Maus waren im Knochenmark mit 7 anti-GPI ASCs etwas mehr Zellen
detektierbar als in der Milz (3 ASCs). Beim Nachweis von DNA spezifischen ASCs zeigte WT
Maus #1 5 ASCs in der Milz aber keine im Knochenmark, während WT Maus #2 nur im Knochenmark eine ASC besaß. Bei den -386G/C Mäusen waren in der Milz nur bei Maus #1 3
ASCs detektierbar, während beide Tiere im Knochenmark je 2 ASCs besaßen. Hingegen
konnte bei der 232T/T Maus sowohl in der Milz mit 30 ASCs als auch im Knochenmark mit
54 ASCs eine hohe Anzahl an anti-DNA ASCs detektiert werden.
Abb. 27: Quantifizierung des
ELISpot. Dargestellt ist die Anzahl an ASCs für gesamt IgM,
anti-GPI IgM und anti-DNA IgM
5
pro 10 CD19+ Zellen in Milz und
Knochenmark
der
einzelnen
Mäuse 24 Wochen nach Rekonstitution.
Mit dem ELISpot konnten in allen Tieren IgM ASCs in Milz und Knochenmark nachgewiesen
werden. Anti-DNA ASCs konnten, im Vergleich zu WT und -386G/C Tieren, bei der 232T/T
Maus sowohl in der Milz auch als im Knochenmark verstärkt detektiert werden. Dabei war die
Anzahl im Knochenmark doppelt so hoch wie in der Milz. Die Anzahl an anti-GPI ASCs war
hingegen bei allen Tieren gering. Die unterschiedlichen Spotgrößen zeigten zudem, dass die
Antikörper-Konzentration in den Seren sowohl durch stark produzierende Zellen als auch
durch gering produzierende Zellen hervorgerufen wird.
49
Ergebnisse
5.6
B-Zell Entwicklung und Reifung in humanisierten Mäusen
Die Ergebnisse von ELISA und ELISpot zeigten Unterschiede bei der Produktion von Autoantikörpern und der Anzahl an Autoantikörper-sekretierenden Zellen zwischen der WT Gruppe
und der 232T/T Gruppe. Im Folgenden sollte untersucht werden, ob dies durch eine veränderte B-Zell Entwicklung bzw. B-Zell Reifung in den Tieren verursacht wird. Dafür wurden die
B-Zell Populationen von Milz und Knochenmark verglichen. Zusätzlich wurde auch die
-386G/C Gruppe analysiert, um den möglichen Einfluss des Promotorpolymorphismus auf
das B-Zell Kompartiment zu untersuchen.
5.6.1 Verteilung der Zellpopulationen in Milz und Knochenmark
Nachdem bereits beobachtet werden konnte, dass die 232T/T Gruppe einen verminderten
Anteil CD19+ Zellen im Blut aufwies (siehe Abb. 19), sollte nun untersucht werden, ob dies
auch in den Organen Milz und Knochenmark der Fall ist. Hierzu wurde der Anteil humaner
Zellen in diesen Organen zu beiden Zeitpunkten bestimmt (Abb. 28), sowie die Anteile von
CD19+ B-Zellen, CD3+ T-Zellen und CD33+ myeloiden Zellen in der humanen Fraktion (Abb.
29).
Abb. 28: Anteil humaner Zellen in Milz und Knochenmark von humanisierten Mäusen. Dargestellt ist der Anteil hCD45+ Zellen der drei Gruppen zu den Zeitpunkten 16 und 24 Wochen in Milz und
Knochenmark. Balken zeigen den Mittelwert. Signifikanzen wurden mit dem Studentischen T-Test
bestimmt. * p<0,05, ** p<0,01.
Der Anteil humaner Zellen in der Milz war zum 16 Wochen Zeitpunkt bei allen drei Gruppen
ähnlich (WT: 25,6% ± 20,8%, -386G/C: 27,7% ± 15,9%, 232T/T: 28,7% ± 23,2%). Zum 24
Wochen Zeitpunkt war der Anteil humaner CD45+ Zellen bei der WT (44,8% ± 21,3%) und
der -386G/C (54,5% ± 23,7%) Gruppe etwas höher, bei der 232T/T Gruppe lag er mit 24,4%
± 8,8% etwa so hoch wie zum 16 Wochen Zeitpunkt. Im Knochenmark waren nach 16 Wochen ebenfalls keine Unterschiede im Anteil humaner Zellen detektierbar. Die WT Gruppe
50
Ergebnisse
besaß 42,5% ± 18,2% und die 232T/T Gruppe 25,5% ± 20,4%. Die -386G/C Gruppe hatte
mit 61,4% ± 40,7% zwar einen höheren Anteil humane Zellen, durch die starken Unterschiede der einzelnen Tiere war dies jedoch nicht statistisch signifikant. Zum 24 Wochen Zeitpunkt
besaß die -386G/C Gruppe (70,0% ± 27,1%) signifikant mehr humane Zellen im Knochenmark als die 232T/T Gruppe (20,8% ± 12,3%). Die WT Gruppe besaß 41,7% ± 24,4% humane Zellen.
Bei der Analyse der verschiedenen Zelltypen in der Milz (Abb. 29A) konnte beobachtet werden, dass 16 Wochen nach Rekonstitution der Anteil CD19+ B-Zellen von 232T/T Mäusen
mit 69,7% ± 14,3% signifikant geringer war als bei WT Mäusen mit 89,2% ± 4,6%. Bei den
-386G/C Mäusen lag der Anteil CD19+ Zellen bei 77,7% ± 22,6%. Der Anteil CD3+ T-Zellen
war in der 232T/T Gruppe mit 18,5% ± 10,2% höher als bei der WT Gruppe mit 4,4% ± 3,4%.
Bei der -386G/C Gruppe war der Anteil an T-Zellen mit 16,7% ± 22,1% auch etwas höher als
bei der WT Gruppe, dieser Unterschied war aber nicht statistisch signifikant. Der Anteil von
CD33+ Zellen war bei allen Gruppen ähnlich, mit Werten zwischen 1,7% ± 0,3% (-386G/C)
und 3,7% ± 5,0% (232T/T). Nach 24 Wochen betrug der Anteil CD19+ Zellen in der 232T/T
Gruppe nur noch 29,1% ± 12,3%. Die WT Gruppe mit 77,1% ± 27,6% und die -386G/C
Gruppe mit 67,3% ± 9,2% zeigten hingegen einen doppelt so hohen Anteil. Dementsprechend konnte wieder ein höherer Anteil CD3+ Zellen in der 232T/T Gruppe detektiert werden.
Dieser lag mit 63,5% ± 16,5% signifikant über dem der WT (14,1% ± 23,2%) und der
-386G/C Gruppe (22,1% ± 6,1%). Bei den CD33+ Zellen konnten auch bei 24 Wochen keine
Unterschiede zwischen den Gruppen (WT: 2,6% ± 1,7%; -386G/C: 3,0% ± 2,7%; 232T/T:
0,7% ± 0,5%) detektiert werden.
Im Knochenmark (Abb. 29B) waren nach 16 Wochen die Anteile der untersuchten Zellpopulationen bei allen drei Gruppen ähnlich. Der Anteil CD19+ Zellen betrug 86,5% ± 7,0% in der
WT Gruppe, 76,7% ± 15,3% in der -386G/C Gruppe und 66,2% ± 26,9% in der 232T/T Gruppe. Der Anteil CD3+ Zellen lag zwischen 0,7% ± 0,6% (WT) und 9,8% ± 15,0%
(-386G/C) und der Anteil CD33+ Zellen zwischen 7,7% ± 4,5% (WT) und 18,3% ± 22,3%
(232T/T). Nach 24 Wochen war auch im Knochenmark eine Reduktion des Anteils CD19+
B-Zellen in der 232T/T Gruppe zu detektieren. Dieser lag im Mittel bei 24,2% ± 21,1%, während bei der WT Gruppe noch 65,8% ± 30,0% und bei der -386G/C Gruppe noch 62,0% ±
22,5% CD19+ B-Zellen vorhanden waren. Gleichzeitig konnte wieder ein erhöhter Anteil
CD3+ T-Zellen (58,6% ± 36,1%) in der 232T/T Gruppe detektiert werden. Der Anteil an
T-Zellen lag bei der WT Gruppe hingegen bei 5,0% ± 8,3% und bei der -386G/C Gruppe bei
8,6% ± 9,2%. Der Anteil CD33+ Zellen war bei 24 Wochen in der 232T/T Gruppe (5,1% ±
4,1%) geringer als in der -386G/C Gruppe (20,8% ± 11,4%). Die WT Gruppe besaß mit
51
Ergebnisse
19,5% ± 15,5% ebenfalls einen höheren Anteil CD33+ Zellen als die 232T/T Gruppe, dieser
Unterschied war aber nicht statistisch signifikant.
A
B
Abb. 29: Verteilung von B-Zellen, T-Zellen und myeloiden Zellen in den humanisierten Mäusen.
Dargestellt sind die Anteile von CD19+, CD3+ und CD33+ Zellen in der humanen Fraktion von Milz (A)
und Knochenmark (B), 16 und 24 Wochen nach Rekonstitution. Balken zeigen den Mittelwert. Signifikanzen wurden mit dem Studentischen T-Test bestimmt. * p<0,05, ** p<0,01.
Die Analyse der Zellpopulationen in Milz und Knochenmark zeigte, dass im Vergleich zu den
beiden anderen Gruppen, in der 232T/T Gruppe eine veränderte Verteilung von B-Zellen und
T-Zellen in Milz und Knochenmark vorlag. Zusätzlich wurde beobachtet, dass die ermittelten
Werte individueller Tiere, innerhalb einer Gruppe, zum 16 Wochen Zeitpunkt sehr ähnlich
waren, während es beim 24 Wochen Zeitpunkt zu größeren Abweichungen kam. Dies wurde
vor allem im Knochenmark der WT und der 232T/T Gruppe sichtbar.
5.6.2 B-Zell Entwicklung im Knochenmark
Eine mögliche Ursache für die veränderten Anteile an CD19+ B-Zellen in der 232T/T Gruppe
könnte eine veränderte B-Zell Entwicklung im Knochenmark sein. Um dies zu überprüfen,
wurde das Verhältnis von CD10- reifen, rezirkulierenden B-Zellen und CD10+ B-Zell Entwicklungsstufen untersucht. Wie Abb. 30 zeigt, konnte 16 Wochen nach Rekonstitution ein höherer Anteil von CD10- B-Zellen in der 232T/T Gruppe ermittelt werden. Dieser lag bei durchschnittlich 10,8% ± 3,3%, während er bei der WT Gruppe bei 3,0% ± 2,3% und bei der
-386G/C Gruppe bei 3,3% ± 1,0% lag. Dementsprechend war der Anteil an CD10+ B-Zellen
52
Ergebnisse
bei der 232T/T Gruppe mit 89,2% ± 3,3% geringer als bei der WT Gruppe (97% ± 2,3%) und
der -386G/C Gruppe (96,7% ± 1,0%). 24 Wochen nach Rekonstitution war dieser Unterschied nicht mehr nachweisbar. Die einzelnen Tiere der 232T/T Gruppe zeigten allerdings
starke individuelle Unterschiede.
Abb. 30: Anteil CD10+ und CD10- B-Zellen im Knochenmark von humanisierten Mäusen. Dargestellt ist der Anteil der im Knochenmark vorhandenen CD10- reifen, rezirkulierenden B-Zellen und der
CD10+ B-Zell Entwicklungsstufen von allen CD19+ B-Zellen, 16 und 24 Wochen nach Rekonstitution.
Balken zeigen den Mittelwert. Signifikanzen wurden mit dem Studentischen T-Test bestimmt.
* p<0,05.
Als nächstes wurden anhand der Expression von CD34 und IgM die einzelnen B-Zell Vorläuferstufen innerhalb der CD19+CD10+ B-Zell Population untersucht. Dabei wurde zwischen
pro-B-Zellen (CD34+IgM-), prä-B-Zellen (CD34-IgM-) und unreifen B-Zellen (CD34-IgM+)
unterschieden (Abb. 31A). Wie Abb. 31B zeigt, gab es bei den Anteilen der einzelnen Populationen weder zum 16 Wochen- noch zum 24 Wochen Zeitpunkt Unterschiede zwischen den
Mausgruppen. Der Anteil an pro-B-Zellen lag nach 16 Wochen zwischen 4,3% ± 3,3%
(232T/T) und 6,3% ± 5,1% (WT). Die prä-B-Zellen stellten mit Werten zwischen 64% ± 14,3%
(-386G/C) und 72,2% ± 8,7% (WT) die größte Population. Der Anteil an unreifen B-Zellen
betrug 21,0% ± 11,4% (WT) bis 29,9% ± 13,3% (-386G/C). 24 Wochen nach Rekonstitution
waren die Anteile der einzelnen Entwicklungsstufen ähnlich dem 16 Wochen Zeitpunkt. Die
pro-B-Zell Population schien zwar bei der 232T/T Gruppe mit 1,6% ± 1,6% leicht vermindert
zu den beiden anderen Gruppen (WT mit 5,6% ± 5,7% und -386G/C mit 5,8% ± 4,4%), dieser Unterschied war jedoch nicht signifikant. Der Anteil an prä-B-Zellen lag nach 24 Wochen
zwischen 45,4%± 33,4% (232T/T) und 67,8% ± 4,8% (-386G/C), der Anteil unreifer B-Zellen
zwischen 25,6% ± 4,5% (-386G/C) und 43,8% ± 21,8% (232T/T). Die einzelnen Werte innerhalb der 232T/T Gruppe wichen beim 24 Wochen Zeitpunkt allerdings stark voneinander ab.
53
Ergebnisse
A
B
Abb. 31: Anteil der einzelnen B-Zell Entwicklungsstadien in der CD19+CD10+ B-Zell Fraktion im
Knochenmark. A) Identifizierung der verschiedenen B-Zell Entwicklungsstufen anhand der Expression von CD19, CD10, CD34 und IgM. Dargestellt sind humane Zellen einer 16 Wochen alten WT
Maus. B) Anteil von CD34+IgM- pro-B-Zellen, CD34-IgM- prä-B-Zellen und CD34-IgM+ unreifen
B-Zellen im Knochenmark von humanisierten Mäusen 16 und 24 Wochen nach Rekonstitution. Balken
zeigen den Mittelwert.
Reife B-Zellen im Knochenmark sind nicht nur durch die Abwesenheit von CD10 gekennzeichnet, sondern auch durch eine starke Expression von CD20. Um die in Abb. 30 detektierten Unterschiede beim Anteil reifer, rezirkulierender B-Zellen im Knochenmark von 232T/T
Mäusen zu bestätigen, wurde der Anteil CD20+ Zellen innerhalb der CD19+ B-Zellen untersucht. In Abb. 32A ist die Expression von CD20 und CD10 bei repräsentativen Mäusen aus
den drei untersuchten Gruppen dargestellt. Bei allen Tieren wurde eine ähnliche Anzahl an
B-Zellen aufgetragen und CD20+ B-Zellen wurden markiert. Zum 16 Wochen Zeitpunkt ist
bei der 232T/T Maus eine höhere Anzahl an CD20+ B-Zellen zu erkennen. Dies konnte auch
durch die Quantifizierung (Abb. 32B) bestätigt werden. Hier war ein signifikant höherer Anteil
reifer CD20+ B-Zellen in der 232T/T Gruppe detektierbar. Dieser lag im Mittel bei 23,0% ±
1,0%, während die WT Gruppe 11,8% ± 2,6% und die -386G/C Gruppe 14,8% ± 10,2%
CD20+ B-Zellen besaßen. Da zu diesem Zeitpunkt ein Großteil der CD20+ Zellen noch
CD10 exprimierte, war der Anteil CD20+ B-Zellen höher als der Anteil CD10- B-Zellen. Zum
24 Wochen Zeitpunkt war zwischen den Gruppen statistisch kein Unterschied erkennbar,
54
Ergebnisse
auch wenn der Mittelwert der 232T/T Gruppe tendenziell höher war als bei den beiden anderen Gruppen (WT: 17,2% ± 10,0%; -386G/C: 21,0% ± 14,7%; 232T/T: 36,4% ± 30,0%). In der
-386G/C Gruppe und in der 232T/T Gruppe zeigten die CD20+ B-Zellen allerdings eine geringere Expression von CD10, was auf einen reiferen Phänotyp hindeutet (Abb. 32A).
A
Abb. 32: Anteil CD20+ B-Zellen im
Knochenmark von humanisierten
Mäusen. A) CD20 und CD10 Expression auf CD19+ B-Zellen des Knochenmarks in 16 und 24 Wochen alten
humanisierten Mäusen der drei Gruppen. CD20+ Zellen sind markiert. B)
Quantifizierung des Anteils CD20+
Zellen innerhalb der CD19+ B-ZellFraktion nach 16 und 24 Wochen. Balken zeigen den Mittelwert. Signifikanzen wurden mit dem Studentischen
T-Test bestimmt. *** p<0,001.
B
Die Untersuchung der B-Zellen im Knochenmark zeigte, dass es in der 232T/T Gruppe, im
Vergleich zur WT und -386G/C Gruppe, keine Unterschiede in den frühen B-Zell Entwicklungsstadien gab, während der Anteil an reifen B-Zellen, vor allem zum 16 Wochen Zeitpunkt, erhöht war.
55
Ergebnisse
5.6.3 B-Zell Reifung in der Milz
Der in 5.6.2 detektierte Unterschied an reifen B-Zellen im Knochenmark könnte durch eine
veränderte B-Zell Reifung in den sekundären lymphatischen Organen zurückzuführen sein.
Deswegen wurden die B-Zell Stadien der Milz in den verschiedenen Mausgruppen analysiert.
Hierfür wurden CD19+ B-Zellen auf ihre Expression von CD38 und CD20 untersucht. Bei
dieser Färbung konnten vier Populationen unterschieden werden. CD38+CD20- B-Zell Vorläufer, CD38+CD20+ unreife B-Zellen, CD38-CD20+ reife B-Zellen und stark CD38 exprimierende (CD38++) Keimzentrums-B-Zellen. Abb. 33A zeigt für die drei Gruppen zu beiden Zeitpunkten die Expression dieser Marker auf CD19+ B-Zellen. Die untersuchten Reifestufen
sind markiert, deren Anteile an der B-Zell Population ist in Abb. 33B dargestellt. Bei 16 Wochen zeigte die 232T/T Gruppe mit 4,6% ± 2,3% einen geringeren Anteil an CD38+CD20B-Zell Vorläufern als die WT Gruppe mit 17,6% ± 6,0% oder die -386G/C Gruppe mit 23,2%
± 7,3%. Während unreife CD38+CD20+ Zellen bei allen Gruppen vergleichbar auftraten (WT:
66,3% ± 5,4%; -386G/C: 61,0% ± 5,4%; 232T/T: 60,8% ± 5,7%), konnte bei den reifen CD38CD20+ B-Zellen ein höherer Anteil in der 232T/T Gruppe nachgewiesen werden. Dieser lag
im Durchschnitt bei 29,1% ± 1,4%. Die WT Gruppe besaß hingegen nur 13,1% ± 6,2% und
die -386G/C Gruppe 14,1% ± 1,7%. Der Anteil CD38++ Keimzentrumszellen war bei allen
Gruppen vergleichbar. Er betrug 0,7% ± 1,1% bei der WT, 0,2% ± 0,2% bei der -386G/C und
0,1% ± 0,1% bei der 232T/T Gruppe. Nach 24 Wochen konnten in keiner der untersuchten
Zellpopulationen Unterschiede zwischen den Gruppen detektiert werden. Bei der WT und der
-386G/C Gruppe war jedoch ein geringer Anteil an B-Zell Vorläufern als beim 16 Wochen
Zeitpunkt detektierbar. Dieser lag in der WT Gruppe bei 10,9% ± 8,9% und bei der -386G/C
Gruppe bei 8,9% ± 5,4%. Dieser Unterschied war bei beiden Gruppen statistisch signifikant
(p<0,05). Bei der 232T/T Gruppe war der Anteil an B-Zell Vorläufern mit 8,0% ± 3,5% ähnlich
dem 16 Wochen Zeitpunkt. Die unreifen B-Zellen waren bei der WT (62,9% ± 15,7%) und der
232T/T Gruppe (58,3% ± 6,2%) genauso stark vertreten wie zum 16 Wochen Zeitpunkt. Für
die -386G/C Gruppe war der Anteil leicht vermindert (53,8% ± 9,4%). Dementsprechend
zeigte sich bei dieser Gruppe mit 34,2% ± 12,2% ein signifikant höherer Anteil an reifen
B-Zellen (p<0,05) zum 16 Wochen Zeitpunkt.
56
Ergebnisse
A
B
Abb. 33: Untersuchung verschiedener B-Zell Stadien in der Milz. A) Repräsentative Dot Blots
CD19+ humaner Milzzellen von 16 und 24 Wochen alten Tieren. Verschiedene Stufen der B-Zell Reifung wurden anhand der Expression von CD38 und CD20 ermittelt. Analysierte Populationen sind
markiert. B) Quantifizierung der untersuchten Populationen. Alle ermittelten Werte beziehen sich auf
CD19+ B-Zellen. Balken zeigen den Mittelwert. Signifikanzen wurden mit dem Studentischen T-Test
bestimmt. * p<0,05, ** p<0,01.
Bei der WT Gruppe konnte nach 24 Wochen mit 22,5% ± 17,4% ebenfalls ein höherer Anteil
an reifen B-Zellen, im Vergleich zum 16 Wochen Zeitpunkt, gemessen werden. Der Anteil bei
der 232T/T Gruppe (28,6% ± 6,4%) blieb dagegen über die Zeit unverändert. CD38++ Zellen
waren bei allen Gruppen vergleichbar und zeigten ähnliche Werte wie bei 16 Wochen (WT:
0,3% ± 0,3%; -386G/C: 0,1% ± 0,1%; 232T/T: 0,5% ± 0,4%).
57
Ergebnisse
A
B
Abb. 34: Anteil naiver B-Zellen,
Gedächtnis-B-Zellen und Plasmablasten in der Milz von 16
und 24 Wochen alten humanisierten Mäusen. A) Expression
von CD27 und IgM auf CD19+
B-Zellen der Milz von 16 und 24
Wochen alten Tieren. Für alle
Tiere wurde eine ähnliche Zellzahl dargestellt.Analysierte Populationen
sind
markiert.
B und C) Anteil von naiven BZellen (CD27-IgM+), GedächtisB-Zellen (CD27+IgM+) und Plasmablasten (CD27++ IgM+ oder
IgM-) in der Milz von 16 Wochen
(B) und 24 Wochen (C) alten
Tieren. Die ermittelten Anteile
beziehen sich auf CD19+ BZellen. Balken zeigen den Mittelwert. Signifikanzen wurden mit
dem Studentischen T-Test bestimmt. * p<0,05, ** p<0,01.
C
Um auch den Anteil vorhandener Gedächtnis B-Zellen in den Gruppen vergleichen zu können, wurden B-Zellen zusätzlich auf ihre Expression von CD27 untersucht. Naive B-Zellen
exprimieren kein CD27, Gedächtnis-B-Zellen sind CD27+ [14], während Plasmablasten sehr
viel CD27 exprimieren (CD27++) [117]. Abb. 34A zeigt die Expression von CD27 und IgM auf
58
Ergebnisse
humanen Zellen der Milz für die drei Gruppen zum 16 und zum 24 Wochen Zeitpunkt. Die
untersuchten Populationen wurden markiert. Die Quantifizierung dieser Populationen ist in
Abb. 34B und C dargestellt. Nach 16 Wochen (Abb. 34B) war ein geringerer Anteil naiver
B-Zellen in der -386G/C Gruppe (49,5% ± 8,4%), im Vergleich zur WT Gruppe (69,8% ±
5,8%) und zur 232T/T Gruppe (76,1% ± 13,8%) nachweisbar. Mit durchschnittlich 2,6% ±
2,1% bei der WT, 1,8% ± 0,9% bei der -386G/C und 1,5% ± 0,8% bei der 232T/T Gruppe
waren die Anteile an Gedächtnis-B-Zellen bei allen Gruppen vergleichbar. Dies galt auch für
IgM+ Plasmblasten (WT: 1,0% ± 1,2%; -386G/C: 0,4% ± 0,3%; 232T/T: 0,3% ± 0,2%) sowie
für IgM- Plasmablasten (WT: 0,6% ± 0,7%; -386G/C: 0,8% ± 1,0%; 232T/T: 0,1% ± 0,1%).
24 Wochen nach Rekonstitution (Abb. 34C) war der Anteil naiver B-Zellen bei der WT Gruppe mit 68,1% ± 18,4% leicht erhöht im Vergleich zur -386G/C Gruppe (55,1% ± 8,1%) und
zur 232T/T Gruppe (53,0% ± 17,8%). Der Anteil an Gedächtnis-B-Zellen war in allen Gruppen sehr heterogen. Im Durchschnitt waren aber keine Unterschiede zwischen den Gruppen
detektierbar (WT: 3,3% ± 2,8%; -386G/C: 2,6% ± 1,1%; 232T/T: 5,7% ± 6,6%). Hingegen
konnte bei der 232T/T Gruppe mit durchschnittlich 1,7% ± 1,3% ein höherer Anteil an IgM+
Plasmablasten detektiert werden als bei der WT Gruppe mit 0,3% ± 0,3% oder der -386G/C
Gruppe mit 0,2% ± 0,1%. Ebenso war bei der 232T/T Gruppe (0,8% ± 0,7%) der Anteil von
IgM- Plasmablasten höher als bei den anderen beiden Gruppen (WT: 0,2% ± 0,1%; -386G/C:
0,2% ± 0,1%).
Abb. 35: Expression von IgM und CD27
auf CD138+ Plasmazellen. CD19+
B-Zellen wurden auf deren Expression von
CD138, IgM und CD27 untersucht. Dargestellt sind charakteristische dot blots einer
16 Wochen alten WT Maus.
Zusätzlich zur Analyse der CD27++ Plasmablasten wurde auch der Anteil an CD138+ Plasmazellen untersucht. Plasmazellen bilden die letzte Stufe der B-Zell Differenzierung. Im Gegensatz zu den Plasmablasten, welche die Vorläufer der Plasmazellen sind, können sich die
Plasmazellen nicht mehr teilen [129]. In den humanisierten Mäusen waren vorwiegend
IgM+CD138+ Plasmazellen nachweisbar. Bei der Analyse der CD27 Expression von Plasmazellen zeigte sich, dass die meisten CD138+ Zellen ebenfalls stark positiv für CD27 waren
(Abb. 35). Zur Quantifizierung wurden innerhalb der CD19+ B-Zell Fraktion alle CD138+ Zellen untersucht. Abb. 36A zeigt für alle drei Mausgruppen zu beiden Zeitpunkten charakteristische dot blots von CD19+ B-Zellen. CD138+ Zellen sind markiert. Nach 16 Wochen waren
59
Ergebnisse
zwischen den drei Gruppen keine Unterschiede im Anteil CD138+ Plasmazellen detektierbar
(Abb. 36B). Die WT Gruppe besaß im Mittel 1,3% ± 1,5%, die -386G/C Gruppe 1,0% ± 0,8%
und die 232T/T Gruppe 0,7% ± 0,7% CD138+ Plasmazellen. Nach 24 Wochen konnte mit
2,1% ± 0,9% ein erhöhter Anteil an Plasmazellen in der 232T/T Gruppe detektiert werden.
Dieser war zur WT Gruppe mit 0,9% ± 0,6% und zur -386G/C Gruppe mit 0,6% ± 0,3% statistisch signifikant.
A
Abb. 36: Anteil CD138+ Plasmazellen in den humanisierten Mäusen. A) CD19+
B-Zellen wurden auf die Expression von CD138 und IgM
untersucht. CD138+ Zellen
sind markiert. Dargestellt sind
charakteristische dot blots für
jede Gruppe zum 16 und 24
Wochen Zeitpunkt. Für alle
Tiere wurde eine ähnliche Zellzahl dargestellt. B) Quantifizierung CD138+ Plasmazellen
innerhalb der CD19+ B-Zell
Population in den drei Mausgruppen nach 16 und 24 Wochen. Balken zeigen den Mittelwert. Signifikanzen wurden
mit dem Studentischen T-Test
ermittelt. * p<0,05.
B
Die Analyse der B-Zellen in der Milz ergab somit einen höheren Anteil reifer B-Zellen bei 16
Wochen alten 232T/T Mäusen, sowie einen erhöhten Anteil von Plasmablasten und Plasmazellen nach 24 Wochen.
60
Ergebnisse
5.7
Regulation von FcγγRIIB auf B-Zellen von humanisierten
Mäusen und im humanen Immunsystem
Sowohl in Mausstämmen, die spontan Autoimmunerkrankungen entwickeln, als auch bei
Autoimmunpatienten ist eine veränderte Regulation von FcγRIIB auf verschiedenen B-Zell
Stadien beschrieben [63, 86, 88, 89, 91]. Aufgrund dessen wurden in den humanisierten
Mäusen die einzelnen B-Zell Stadien aus Milz und Knochenmark auf deren Expression von
FcγRIIB untersucht. Zum Vergleich wurden die humanen Knochenmarksproben und die humanen Milzproben (siehe 5.3.1) ebenfalls untersucht.
A
B
Abb. 37: FcγγRIIB Expression auf den B-Zell Entwicklungsstufen im Knochenmark von humanisierten Mäusen und im Menschen. CD19+CD10+ B-Zellen des Knochnemarks wurden anhand der
Expression von CD34 und IgM in CD34+IgM- pro-B-Zellen, CD34-IgM- prä-B-Zellen, CD34-IgM+ unreifen B-Zellen unterteilt. Von diesen Populationen wurde die MFI von FcγRIIB ermittelt und im Diagramm dargestellt. A) Humanisierte Mäuse, WT (n=4), -386G/C (n=6) und 232T/T (n=2). Die Werte
der 16 und 24 Wochen alten Tiere wurden dabei vereint. Balken zeigen den Mittelwert mit Standardabweichung. B) Humanes Knochenmark. Signifikanzen wurden mit dem Studentischen T-Test bestimmt. * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001.
In Abb. 37 treten die vorhandenen Unterschiede zwischen den humanisierten Mäusen und
dem Menschen bei den B-Zellen im Knochenmark hervor. Während die humanisierten Mäuse vorwiegend CD19+CD10+ B-Zellen besaßen, waren im Menschen CD19+CD10B-Zellen genauso stark vertreten wie die CD19+CD10+ B-Zellen. Bei Patient 2 konnten im
Knochenmark kaum CD10 negative B-Zellen detektiert werden, weshalb für diesen Patienten
61
Ergebnisse
keine Werte für die Entwicklungsstufen verfügbar waren. Bei der Analyse der FcγRIIB Expression wiesen alle humanisierten Mausgruppen ein vergleichbares Expressionsmuster auf.
Bei diesen konnte eine Zunahme der FcγRIIB Expression von CD34+IgM- pro-B-Zellen (WT:
181,0 ± 56,3; -386G/C: 250,2 ± 87,2; 232T/T: 361 bei n=1) zu CD34-IgM- prä-B-Zellen (WT:
534,3 ± 199,9; -386G/C: 555,7 ± 93,5; 232T/T: 317,0 ± 192,3) beobachtet werden. Auf CD34IgM+ unreifen B-Zellen (WT: 4639,3 ± 1288,1; -386G/C: 4714,2 ± 796,8; 232T/T: 3901,5 ±
1842,0) war dagegen eine sehr starke Expression von FcγRIIB detektierbar. Dabei hatten die
unreifen B-Zellen eine 8,5- bis 8,7-fach höhere MFI als die prä-B-Zellen. Die Stärke der Expression in den einzelnen Entwicklungsstufen unterschied sich nicht zwischen der WT und
der -386G/C Gruppe. Auf prä-B-Zellen zeigte die -386G/C Gruppe jedoch eine signifikant
höhere Expression (p<0,05) als die prä-B-Zellen von 232T/T Tieren. Bei den menschlichen
B-Zellen war ebenfalls eine leicht höhere Expression von FcγRIIB von den pro-B-Zellen (Patient 1: 105; Patient 3: 126) zu den prä-B-Zellen (Patient 1: 866; Patient 3: 2027) detektierbar. Ebenso zeigten nur die unreifen B-Zellen eine starke FcγRIIB Expression (Patient 1:
20900; Patient 3: 27116). Auf den unreifen B-Zellen der Patienten war die Expression von
FcγRIIB 13- (Patient 3) bis 24-mal (Patient 1) höher als auf den menschlichen prä-B-Zellen.
Im Vergleich zu den humanisierten Mäusen war im Menschen die MFI von FcγRIIB auf den
unreifen B-Zellen 4- bis 5-mal höher.
Auch in der Milz waren zwischen den humanisierten Mäusen und den Patienten Unterschiede im B-Zell Kompartiment nachweisbar. Bei den humanisierten Mäusen waren die meisten
B-Zellen IgM+ und konnten anhand der Expression von CD38 und CD20 in die bereits beschriebenen 4 Reifungsstufen unterteilt werden. Beim Menschen waren die B-Zellen der Milz
meist IgM-. Neben den CD38++ Keimzentrums-B-Zellen waren vorwiegend reife CD38CD20+ B-Zellen detektierbar, während CD38+CD20- Vorläufer nicht vorhanden waren. Somit
scheint das B-Zell Kompartiment in der Milz von humanisierten Mäusen noch einen unreiferen Charakter zu besitzen. Für die vier Reifungsstufen in den humanisierten Mäusen, sowie
für die drei detektierbaren Stufen beim Menschen wurde die MFI von FcγRIIB bestimmt. Die
drei Mausguppen zeigten zueinander ein ähnliches Expressionsmuster. Hier konnte eine
Erhöhung der FcγRIIB Expression von den B-Zell Vorläufern der Milz (WT: 1129,0 ± 335,1;
-386G/C: 1397,1 ± 448,5; 232T/T: 1499,4 ± 849,6) zu unreifen B-Zellen (WT: 4489,2 ± 747,0;
-386G/C: 5371,3 ± 669,4; 232T/T: 4333,5 ± 759,6) nachgewiesen werden. Unreife und reife
B-Zellen (WT: 4639,9 ± 804,1; -386G/C: 5637,4 ± 806,4; 232T/T: 5836,2 ± 1877,4) zeigten
eine ähnliche Expression, während auf Keimzentrums-B-Zellen die Expression von FcγRIIB
erneut zunahm (WT: 7773,9 ± 2082,9; -386G/C: 9567,3 ± 2730,5; 232T/T: 11447,2 ± 3453,8).
Beim Vergleich der Gruppen untereinander konnte in der -386G/C Gruppe eine signifikant
62
Ergebnisse
höhere Expression auf unreifen B-Zellen detektiert werden (p<0,05 zu WT und 232T/T). Weiterhin zeigten reife B-Zellen der -386G/C Gruppe eine höhere Expression als reife B-Zellen
der WT Gruppe (p<0,05). Auf den Keimzentrums-B-Zellen konnte hingegen eine höhere
FcγRIIB Expression in den 232T/T Mäusen detektiert werden. Dieser Unterschied war zur
WT Gruppe statistisch signifikant (p<0,05). Bei den drei untersuchten Patienten waren unterschiedliche FcγRIIB Expressionen nachweisbar. Bei allen Patienten zeigten die Keimzentrums-B-Zellen jedoch die höchste Expression (Patient 4: 25443; Patient 5: 13108; Patient 6:
48780). Auch in der Milz lag die MFI von FcγRIIB beim Menschen höher als in den humanisierten Mäusen. So konnte bei den humanen CD38-CD20+ B-Zellen MFIs von 12828 (Patient 4), 8908 (Patient 5) und 9703 (Patient 6) gemessen werden. Auch die Expression auf
unreifen CD38+CD20+ B-Zellen (Patient 4: 8693; Patient 5: 7141; Patient 6: 7576). war im
Menschen höher als in den humanisierten Mäusen.
A
B
Abb. 38: FcγγRIIB Expression auf den verschiedenen Reifungsstufen von B-Zellen der Milz von
humanisierten Mäusen und vom Menschen. A) Dargestellt ist die Strategie zur Identifizierung von
unterschiedlichen Reifungsstadien innerhalb der CD19+ B-Zellen anhand der Expression von CD38
und CD20. Die MFI von FcγRIIB wurde auf CD38+CD20- B-Zell Vorläufern, CD38+CD20+ unreifen BZellen, CD38-CD20+ reifen B-Zellen und CD38++ Keimzentrums-B-Zellen der WT (n=9), -386G/C
(n=7) und 232T/T (n=6) Gruppe ermittelt. Die Werte der 16 und 24 Wochen alten Tiere wurden dabei
vereint. Balken zeigen den Mittelwert mit Standardabweichung. B) B-Zellen aus drei verschiedenen
humanen Milzproben wurden mit der gleichen Strategie auf deren Expression von FcγRIIB untersucht.
Signifikanzen wurden mit dem Studentischen T-Test bestimmt. * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001.
63
Ergebnisse
A
B
Abb. 39: FcγγRIIB Expression auf naiven B-Zellen, Gedächtnis-B-Zellen und Plasmablasten in
humanisierten Mäusen und im Menschen. A) CD19+ B-Zellen von humanisierten Mäusen wurden
mittels ihrer IgM und CD27 Expression in CD27-IgM+ naiven B-Zellen, CD27+IgM+ Gedächtnis-BZellen und CD27++ Plasmablasten (IgM+ und IgM-) eingeteilt. Das Diagramm zeigt die MFI von
FcγRIIB auf diesen Zellpopulationen bei den drei untersuchten Mausgruppen. WT (n=10), -386G/C
(n=7) und 232T/T (n=7). Die Werte der 16 und 24 Wochen alten Tiere wurden dabei vereint. Balken
zeigen den Mittelwert mit Standardabweichung. B) Äquivalent zu den humanisierten Mäusen wurden
humane CD19+ B-Zellen aus der Milz anhand der CD27 und IgM Expression eingeteilt und die MFI
von FcγRIIB von den drei Spendern im daneben stehenden Diagramm dargestellt. Signifikanzen wurden mit dem Studentischen T-Test bestimmt. * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001.
Für den Vergleich der FcγRIIB Expression von naiven B-Zellen, Gedächtnis-B-Zellen und
Plasmablasten (Abb. 39) zeigte sich erneut, dass beim Menschen vorwiegend IgM- B-Zellen
in der Milz vorhanden waren. Zudem konnten auch IgM- Gedächtnis-B-Zellen detektiert werden. Für den Vergleich der FcγRIIB Expression zwischen humanisierten Mäusen und
Mensch wurden nur die vier Populationen, die in den Mäusen vorhanden waren analysiert.
Bei den drei untersuchten Mausgruppen war erneut eine ähnliche Regulation von FcγRIIB
detektierbar. Bei diesen konnte auf Gedächtnis-B-Zellen (WT: 8159,7 ± 3983,7; -386G/C:
10580,3 ± 2389,5; 232T/T: 10305 ± 5292,5) eine höhere FcγRIIB Expression als auf naiven
B-Zellen (WT: 4007,9 ± 1094,4; -386G/C: 5738,4 ± 520,5; 232T/T: 4301,7 ± 1300,5) nachgewiesen werden. Dabei zeigten Gedächtnis-B-Zellen eine 1,8-fach (-386G/C) bis 2,4-fach
(232T/T) höhere MFI als naive B-Zellen. Auch IgM+ Plasmablasten (WT: 7374,4 ± 1613,2;
-386G/C: 11161,7 ± 1680,6; 232T/T: 13079,2 ± 9601,3) zeigten FcγRIIB Level im Bereich der
64
Ergebnisse
Gedächtnis-B-Zellen. Bei IgM- Plasmablasten war die Expression geringer als auf IgM+ Plasmablasten (WT: 4477,0 ± 3225,9; -386G/C: 3886,5 ± 2393,4; 232T/T: 7964,0 ± 6156,1). Während in den WT und 232T/T Tieren eine ähnliche Expression wie auf naiven B-Zellen gemessen werden konnte, war in der -386G/C Gruppe signifikant weniger FcγRIIB auf der
Oberfläche. Beim Vergleich der Gruppen zueinander war auf den naiven B-Zellen der
-386G/C Gruppe eine höhere FcγRIIB Expression nachweisbar als bei der WT (p<0,01) und
der 232T/T (p<0,05) Gruppe. Die Gedächtnis-B-Zellen zeigten bei allen Gruppen eine vergleichbare Expression. Auf IgM+ Plasmablasten konnte bei der -386G/C Gruppe erneut eine
höhere Expression als bei der WT Gruppe detektiert werden (p<0,001), während bei den
IgM+ Plasmablasten kein Unterschied nachweisbar war. Bei den drei Patienten zeigten Patient 4 und Patient 5 eine sehr ähnliche FcγRIIB Expression. Für naive B-Zellen konnten MFIs
von 10144 (Patient 4) und 9186 (Patient 5), für Gedächtnis-B-Zellen MFIs von 17776 (Patient
4) und 15120 (Patient 5), für IgM+ Plasmablasten MFIs von 21815 (Patient 4) und 19255
(Patient 5) und für IgM- Plasmablasten MFIs von 16976 (Patient 4) und 14409 (Patient 5)
gemessen werden. Die MFI Werte waren wiederum bei allen Populationen höher als bei den
humanisierten Mäusen. Bei Patient 6 konnte auf den Plasmablasten eine höhere MFI als bei
den beiden anderen Patienten detektiert werden (IgM+: 62550; IgM-: 46644) während die
Expression von naiven B-Zellen (7393) und Gedächtnis-B-Zellen (16393) ähnlich zu den
beiden anderen Patienten war. Die Expression von FcγRIIB auf IgM+ Gedächtnis-B-Zellen
war bei den drei Proben im Durchschnitt 1,8-mal höher als auf den naiven-B-Zellen. IgMPlasmablasten zeigten bei allen drei Patienten, wie auch bei den humanisierten Mäusen,
eine geringere FcγRIIB Expression als die IgM+ Plasmablasten.
Bei der Analyse der FcγRIIB Expression auf CD138+ Plasmazellen der Milz (Abb. 40) zeigten
die drei humanisierten Mausgruppen keine unterschiedliche FcγRIIB Expression. Die 232T/T
Gruppe hatte zwar mit einer MFI von 7784,8 ± 3124,7 tendenziell eine geringere Expression
als die WT Gruppe mit 10704,6 ± 5450,1 und die -386G/C Gruppe mit 15441 ± 8076,6, statistisch konnten jedoch keine Unterschiede ermittelt werden. Die Plasmazellen der humanen
Milzproben zeigten sehr unterschiedliche Werte für die FcγRIIB Expression. Patient 5 besaß
mit einer MFI von 19205 den geringsten Wert, Patient 1 zeigte eine MFI von 29056 und Patient 3 besaß mit 56529 die höchste FcγRIIB Expression. Wie auch schon bei den übrigen
B-Zell Populationen zeigten die CD138+ Plasmazellen der humanisierten Mäuse generell
eine niedrigere Expression als die Plasmazellen in den humanen Milzproben.
65
Ergebnisse
A
Abb. 40: FcγγRIIB Expression
auf Plasmazellen der Milz.
Plasmazellen der Milz wurden
durch die Expression von
CD138 innerhalb der CD19+
B-Zell Population identifiziert.
CD138+ Zellen sind markiert.
Von diesen wurde die Expression von FcγRIIB ermittelt und
im Diagramm dargestellt. A)
Humanisierte Mäuse. Tiere
vom 16 und 24 Wochen Zeitpunkt wurden für die jeweiligen
Gruppen vereint. WT (n=10), 386G/C (n=7) und 232T/T
(n=6) B) Humane Milzproben
der einzelnen Patienten.
B
Die Analyse der FcγRIIB Expression zeigte, dass bei allen humanisierten Mausgruppen die
gleiche Regulation zwischen den einzelnen Entwicklungs- und Reifungsstufen der B-Zellen
zu finden war. Die Höhe der Expression variierte aber zwischen den Gruppen. Im Vergleich
zu menschlichen Zellen zeigten humanisierte Mäuse ein ähnliches Expressionsmuster, während die Stärke der Expression in den humanisierten Mäusen niedriger war als beim Menschen.
5.8
Analyse der T-Zell Populationen in Milz und Knochenmark
Aufgrund der hohen Anteile an T-Zellen in den Organen der 232T/T Gruppe, wurden diese
genauer charakterisiert. Hierbei sollte untersucht werden, ob es in den 232T/T Tieren zu einem erhöhten Auftreten einer bestimmten T-Zell Population, im Vergleich zu den anderen
Mausgruppen kommt. Hierfür wurde der Anteil an CD4+ und CD8+ Zellen sowie das Verhältnis von CD4+/CD8+ Zellen innerhalb der CD3+ T-Zell Population nach 16 und 24 Wochen
ermittelt. In der Milz konnten weder bei 16 noch bei 24 Wochen Unterschiede zwischen den
Gruppen detektiert werden. Der Anteil an CD4+ T-Zellen lag bei 16 Wochen zwischen 39,0%
± 7,2% (WT) und 43,6% ± 10,5% (-386G/C), während der Anteil von CD8+ T-Zellen zwischen
42,8% ± 23,1 % (WT) und 49,1% ± 10,3% (232T/T) lag. Damit betrug das durchschnittliche
Verhältnis von CD4+/CD8+ für die drei Gruppen 1,0 ± 0,3. Nach 24 Wochen war der Anteil
an CD4+ T-Zellen etwas höher als bei 16 Wochen (zwischen 45,7% ± 5,2% bei der 232T/T
und 55,5% ± 1,5% bei der -386G/C Gruppe), und der Anteil CD8+ Zellen geringerer (zwi66
Ergebnisse
schen 29,6% ± 9,6% bei der -386G/C und 48,7% ± 3,5% bei der 232T/T Gruppe). Dementsprechend betrug das Verhältnis von CD4+/CD8+ hier 1,6 ± 0,6.
A
B
Abb. 41: Verteilung von CD4+ und CD8+ T-Zellen in Milz und Knochenmark. Anteil der CD4+ und
CD8+ Zellen innerhalb der CD3+ T-Zell Population der Milz (A) und des Knochenmarks (B) 16 und 24
Wochen nach Rekonstitution. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung. WT: n=3; -386G/C: n=2;
232T/T: n=3 (außer bei 24 Wochen in der Milz: n=2). Signifikanzen wurden mit dem Studentischen
T-Test bestimmt. * p<0,05.
Auch im Knochenmark gab es zum 16 Wochen Zeitpunkt keine unterschiedliche Verteilung
von CD4+ und CD8+ T-Zellen zwischen den Gruppen. Der Anteil CD4+ Zellen war mit 58,1%
± 19,1% (-386G/C) bis 74,3% ± 18,8% (232T/T) höher als in der Milz. Demzufolge war der
Anteil CD8+ Zellen im Vergleich zur Milz geringer (zwischen 19,1% ± 18,7% bei der 232T/T
und 33,2% ± 23,1% bei der -386G/C Gruppe). Daraus ergibt sich ein CD4+/CD8+ Verhältnis
von durchschnittlich 4,9 ± 3,2. Nach 24 Wochen war für die CD4+ Zellen im Knochenmark
erneut kein Unterschied zwischen den Gruppen zu beobachten. Deren Anteil lag bei der WT
Gruppe bei 77,7% ± 8,0%, bei der -386 G/C Gruppe bei 68,0% ± 1,6% und bei der 232T/T
Gruppe bei 66,3% ± 21,7%. Bei den CD8+ T-Zellen zeigte die -386G/C Gruppe (21,9% ±
0,3%) einen höheren Anteil als die WT Gruppe mit 12,3% ± 2,5%. Die 232T/T Gruppe hatte
mit 27,3% ± 20,0% zwar durchschnittlich mehr CD8+ Zellen, aber durch die starken Unter-
67
Ergebnisse
schiede in dieser Gruppe war dies nicht signifikant. Für alle Gruppen ist das Verhältnis von
CD4+/CD8+ hier 5,5 ± 2,1.
A
B
Abb. 42: Anteil CD4+CD25+ T-Zellen. A) CD3+ T-Zellen wurden auf ihre Expression von CD25 untersucht. Dargestellt sind charakteristische blots von CD3+ Knochenmarkszellen für jede Gruppe zum
16 und 24 Wochen Zeitpunkt. Für alle Tiere wurde eine ähnliche Zellzahl dargestellt. CD4+CD25+
Zellen sind markiert. B) Quantifizierung des Anteils CD4+CD25+ Zellen innerhalb der CD3+ T-Zell
Fraktion in Milz und Knochenmark, 16 und 24 Wochen nach Rekonstitution. WT: n=3; -386G/C: n=2;
232T/T: n=3 (außer bei 24 Wochen in der Milz: n=2). Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung.
Signifikanzen wurden mit dem Studentischen T-Test bestimmt. * p<0,05, ** p<0,01.
Neben der Verteilung von CD4+ und CD8+ T-Zellen wurde auch das Auftreten von aktivierten
T-Zellen (CD25+) untersucht. In allen Tieren waren nur CD4+CD25+ T-Zellen detektierbar,
nicht aber CD8+CD25+ T-Zellen. Dies ist in Abb. 42A zu erkennen, in der exemplarisch die
CD25 Expression auf CD3+ Knochenmarkszellen für die drei Gruppen nach 16 und 24 Wochen gezeigt ist. In Abb. 42B sind dementsprechend nur die Anteile von CD4+CD25+ Zellen
68
Ergebnisse
in den drei Mausgruppen nach 16 und 24 Wochen dargestellt. Dabei zeigte die 232T/T
Gruppe (2,0% ± 0,7%) in der Milz von 16 Wochen alten Tieren einen geringeren Anteil
CD4+CD25+ Zellen im Vergleich zur -386G/C Gruppe (8,2% ± 1,1%). Die WT Gruppe zeigte
mit 8,8% ± 6,7% im Mittel einen ähnlichen Anteil wie die -386G/C Gruppe. Nach 24 Wochen
konnten diese Unterschiede in der Milz nicht mehr nachgewiesen werden (WT: 3,7% ± 2,3%,
-386G/C: 7,4% ± 3,0%, 232T/T: 4,0% ± 0,7%). Im Gegensatz zur Milz waren die Anteile an
CD4+CD25+ Zellen im Knochenmark von 16 Wochen alten Tieren vergleichbar (WT: 9,5% ±
1,5%, -386G/C: 14,0% ± 5,0%, 232T/T: 7,1% ± 2,4%). Dagegen konnten bei 24 Wochen
alten Tieren in der 232T/T Gruppe (8,6% ± 5,4%) signifikant weniger CD4+CD25+ Zellen
detektiert werden als in der -386G/C Gruppe (26,6% ± 1,1%). Auch die WT Gruppe zeigte mit
19,1% ± 4,8% einen höheren Wert als die 232T/T Gruppe, aufgrund der hohen Standardabweichungen war dies aber nicht signifikant.
Die Analyse des T-Zell Kompartiments der humanisierten Mäuse zeigte ein vergleichbares
Verhältnis zwischen CD4+ und CD8+ T-Zellen in den drei Mausgruppen in Milz und Knochenmark. Dabei war der Anteil CD4+ T-Zellen im Knochenmark höher als in der Milz. Die
Analyse von aktivierten T-Zellen zeigte hingegen einen geringeren Anteil von CD4+CD25+
T-Zellen in den 232T/T Mäusen in Milz und Knochenmark.
69
Diskussion
6
Diskussion
In dieser Arbeit sollte der Einfluss des inhibitorischen FcγRIIB auf die humorale Toleranz im
humanen Immunsystem untersucht werden. Die essentielle Rolle von FcγRIIB beim Erhalt
der B-Zell Toleranz wurde durch die FcγRIIB Knockout Maus für das murine System bereits
beschrieben [60, 67, 68, 70-72]. Der Autoimmunphänotyp in diesen Mäusen war allerdings
abhängig vom genetischen Hintergrund. Während der Verlust von FcγRIIB in C57BL/6 Mäusen zu einer SLE ähnlichen Erkrankung führte, zeigte der Knockout auf Balb/c Hintergrund
keinen solchen Phänotyp [70]. Dies deutet klar auf eine modulierende Rolle des genetischen
Hintergrundes hin. Daher ist unklar, in welchem Umfang diese Daten auf das menschliche
Immunsystem übertragbar sind. Epidemiologische Studien assoziieren bestimmte Polymorphismen im Gen von FcγRIIB mit dem Auftreten und der Schwere von SLE [76-78, 81,
82]. Des Weiteren wurde in verschiedenen Autoimmunerkrankungen wie SLE, CIDP und RA
eine Fehlregulation von FcγRIIB während der B-Zell Reifung nachgewiesen [86-91]. Diese
Daten deuten an, dass der inhibitorische FcγRIIB auch im humanen System zum Erhalt von
Toleranz beiträgt. Um dessen Rolle in der humanen B-Zell Toleranz zu untersuchen, wurde
ein humanisiertes Mausmodell verwendet. Hierfür wurden NSG Mäuse mit humanen CD34+
hämatopoetischen Stammzellen rekonstituiert. Diese wurden zuvor auf die mit SLE assoziierten Polymorphismen in Promotor- (G-386C) und Transmembranregion (I232T) von FcγRIIB
genotypisiert oder mit einem Lentivirus infiziert, der eine shRNA gegen FcγRIIB enthielt.
6.1
Generierung humanisierter Mäuse und Charakterisierung
des humanen Immunsystems
Zur Untersuchung der im humanen System beschriebenen Polymorphismen im Gen von
FcγRIIB wurden die HSCs auf den Polymorphismus im Promotor (G-386C) und in der
Transmembranregion (I232T) genotypisiert. Dabei zeigte der Promotorpolymorphismus eine
Verteilung nach Hardy-Weinberg. Die Frequenz von 0,8% für die homozygote Variante
FcγRIIB-386C lag, in der von uns untersuchten Kohorte, unter den beschriebenen Frequenzen von ca. 8-9% in der europäischen [82] bzw. der amerikanischen Bevölkerung mit europäischer Abstammung [81]. Im Gegensatz zum Promotorpolymorphismus zeigte der Transmembranpolymorphismus keine ideale Verteilung nach Hardy-Weinberg. In der in dieser
Arbeit untersuchten Kohorte war die homozygote Variante des FcγRIIB-232T Allels mit 13,4%
überrepräsentiert. Andere Studien beschreiben, dass diese Variante in der europäischen Be70
Diskussion
völkerung nur zu einem sehr geringen Prozentsatz vorkommt (1-4%) [130], während sie in
der afrikanischen (8-11%) und asiatischen (5-7%) Bevölkerung häufiger Vertreten ist [76, 77,
131]. Faktoren, die die Häufigkeit dieses Allels beeinflusst haben könnten, sind eine zu geringe Gruppengröße, die lokal stark fokussierte Probandengruppe oder ein überdurchschnittlicher Anteil einer nicht europäischen Bevölkerungsgruppe in der Region. Die Rekonstitution
von NSG Mäusen mit den genotypisierten HSCs war sehr variabel und variierte zwischen
10% und 95% humanen Zellen im Blut. Der durchschnittliche Humanisierungsgrad von
48,4% ist jedoch mit anderen Studien, die dieses Mausmodell verwendeten, vergleichbar
[132-135]. Ein Grund für die Variabilität im Anteil humaner Zellen könnte die Optimierung der
Versuchsbedingungen über die Zeit sein. So wurde im Verlauf dieser Arbeit die Anzahl der
injizierten Zellen und die Bestrahlungsdosis verändert, um optimale Rekonstitutionsbedingungen zu erhalten. Zudem kam es während der Arbeit zu einem Wechsel der Bestrahlungsquelle, woraufhin die Bestrahlungsdosis erneut optimiert werden musste.
Für die Generierung von humanisierten Mäusen mit einer shRNA gegen FcγRIIB, musste zu
Beginn der Arbeit das lentivirale System etabliert werden. Da in der Literatur eine verbesserte Infektion von Stammzellen mit RD114 Viren im Vergleich zu VSV-G Viren beschrieben ist
[112], wurden virale Partikel mit diese beiden Hüllproteine hergestellt und deren Infektionseffizienz bei HSCs untersucht. In unserem System konnten nur sehr wenige HSCs mit den
RD114 Viren infiziert werden. Dagegen zeigten Viren mit VSV-G eine bessere Transduktion,
auch wenn die Effizienzen einzelner Viruschargen teilweise sehr unterschiedlich waren (Daten nicht gezeigt). Selbst mit den besten Chargen war die Transduktionseffizienz von HSCs
mit durchschnittlich 13,3% gering. Ähnliche Effizienzen sind zwar für dieses System beschrieben [112], in anderen Studien konnten aber auch Transduktionseffizienzen von 20-50%
erreicht werden [100]. Die Fähigkeit von infizierten HSCs in immundefizienten Mausstämmen
ein humanes Immunsystem auszubilden, konnte schon in verschiedenen anderen Studien
gezeigt werden [100, 112], auch wenn der verwendete Mausstamm und die Anzahl der injizierten HSCs sich von unserem Modell unterschied. Dementsprechend konnten auch in den
von uns generierten Tieren humane Zellen nachgewiesen werden. Mit durchschnittlich 51%
humanen Zellen im Blut war die Rekonstitution vergleichbar zu der Rekonstitution mit unbehandelten HSCs. Während der Infektion konnte zwar ein Verlust des Stammzellcharakters
bei 2/3 der infizierten HSCs beobachtet werden (siehe Abb. 11), dieser Nachteil konnte aber
durch eine Erhöhung der injizierten Zellzahl ausgeglichen werden. Der Nachweis infizierter
Zellen erfolgte in diesen Tieren anhand des im Virus enthaltenen GFP Markerproteins. Aufgrund der geringen Infektionseffizienz der viralen Partikel konnte nur ein geringer Anteil
GFP+ Zellen in den humanisierten Mäusen detektiert werden. Zwar gab es einzelne Tiere mit
71
Diskussion
höherem GFP Anteil, die meisten Tiere besaßen allerdings weniger als 4% GFP+ Zellen.
Aufgrund dieser geringen Zellzahl waren detaillierte Untersuchungen von Zellsubpopulationen innerhalb der infizierten Zellen nicht möglich. Allerdings wurden die Tiere trotzdem auf
das Auftreten von autoreaktiven Antikörpern hin beobachtet. Dieser Punkt wird später genauer behandelt.
Im ersten Teil der Arbeit sollte das humane Immunsystem der humanisierten Mäuse genauer
charakterisiert werden. Die Ausbildung eines vollständigen humanen Immunsystems bei Rekonstitution von NSG Mäusen mit CD34+ HSCs wurde bereits in der Literatur beschrieben
[132, 136, 137]. In diesen Tieren konnten B-Zellen, T-Zellen, myeloide Zellen, DCs und NKZellen in den verschiedenen Organen detektiert werden [132, 137]. In den von uns generierten Tieren waren im Blut sowohl CD19+ B-Zellen als auch CD3+ T-Zellen und CD33+ myeloide Zellen nachweisbar. In den Mäusen, die mit infizierten HSCs generiert wurden, zeigte
sowohl die GFP- als auch die GFP+ infizierte Population die Fähigkeit, in verschiedene Linien zu differenzieren. Während zu frühen Zeitpunkten vorwiegend GFP+ CD19+ B-Zellen
nachweisbar waren, konnten zu späteren Zeitpunkten auch CD3+ T-Zellen in Blut, Milz und
Knochenmark detektiert werden. Somit besitzen auch vorbehandelte HSCs das Potenzial,
ein vollständiges Immunsystem auszubilden. Auch in Milz und Knochenmark konnte die Existenz von B-Zellen, T-Zellen, Monozyten, NK-Zellen und DCs in den von uns generierten
Mäusen nachgewiesen werden (siehe Abb. 15). In den Lymphknoten der Tiere waren vorwiegend B- und T-Zellen zu finden. Neben den einzelnen Zellpopulationen wurde in den humanisierten Mäusen auch die Organisation der Zellen in den lymphatischen Organen untersucht. Dabei konnte bereits gezeigt werden, dass sich die humanen Zellen in der Milz der
Tiere zu follikulären Strukturen zusammenlagern [137, 138], während sie im Lymphknoten
ohne erkennbare Struktur vorliegen [137]. Auch bei unseren Tieren konnten in der Milz follikuläre Ansammlungen humaner Zellen detektiert werden. Die humanen Zellen im Lymphknoten der Tiere zeigten keine erkennbare Struktur. Dies könnte auf das Fehlen von strukturgebenden Mauszellen zurückzuführen sein, da von diesen in der Durchflusszytometrie meist
nur wenige detektierbar waren. Zudem könnte durch die Haltung unter SPF-Bedingungen
der notwendige Stimulus zur Ausbildung von geordneten Strukturen in den Lymphknoten
fehlen.
In den humanisierten Mäusen wurde zu frühen Zeitpunkten ein Überschuss an B-Zellen beschrieben [138]. Beim Menschen konnte nach Transplantation von Zellen aus Nabelschnurblut ein ähnliches Phänomen beobachtet werden. Während sich die Anzahl an B-Zellen relativ schnell normalisierte, waren entsprechende T-Zell Zahlen erst zu späteren Zeitpunkten
vorhanden [139]. Bei der Charakterisierung des B-Zell Kompartiments im Knochenmark
72
Diskussion
konnten vorwiegend frühe B-Zell Entwicklungsstufen in humanisierten Mäusen detektiert
werden, die sich durch die Expression von CD34 und CD10 auszeichnen. IgM, IgD oder
CD20 wurde nur auf einem geringen Anteil von B-Zellen exprimiert. In der Milz sind die
B-Zellen hingegen IgM+, IgD+ und CD20+, und zeigen somit einen reiferen Phänotyp [137,
138]. Auch bei unseren Tieren waren zu frühen Zeitpunkten B-Zellen die am stärksten vertretene Population. Ebenso konnten im Knochenmark vorwiegend IgM- und CD20- B-Zellen
nachgewiesen werden. In der Milz waren ebenfalls reifere Stadien detektierbar, die sowohl
IgM als auch CD20 exprimierten, aber auch B-Zell Vorläufer denen diese Marker fehlten.
Während die B-Zellen der humanen Milzproben vorwiegend CD38- waren, konnten in den
humanisierten Mäusen vorwiegend CD38+ B-Zellen detektiert werden. Somit weist das BZell Kompartiment in der Milz der humanisierten Mäuse einen unreiferen Phänotyp auf als im
Menschen. Dagegen zeigten die aus den Lymphknoten der humanisierten Mäuse isolierten
B-Zellen einen reiferen Phänotyp. Diese exprimierten ebenfalls CD20 und IgM, waren aber
negativ für CD10 und hatte eine geringere CD38 Expression. Beim Vergleich des B-Zell
Kompartiments der humanisierten Mäuse mit dem des Menschen ist jedoch nicht zu erwarten, dass die humanisierten Mäuse mit einem relativ jungen Immunsystem und unter pathogenfreien Haltungsbedingungen den gleichen Reifegrad aufweisen wie ein Erwachsenen
Mensch der im Verlauf seines Lebens schon einer Vielzahl von Pathogenen ausgesetzt war.
Zusätzlich zur Charakterisierung der B-Zellen in den Organen der humanisierten Mäuse
wurde auch die Expression von FcγRIIB auf diesen untersucht. Hierbei konnte eine ähnliche
Expression wie für IgM oder CD20 beobachtet werden, was darauf schließen lässt, dass es
zu einer Zunahme der FcγRIIB Expression während der B-Zell Entwicklung und Reifung
kommt. Die Expression dieses Markers wurde in anderen Studien mit humanisierten Mäusen
bisher nicht untersucht. Bei den einzelnen B-Zell Populationen von Milz und Knochenmark
konnte in den humanisierten Mäusen allerdings ein vergleichbares Expressionsmuster von
FcγRIIB identifiziert werden wie in den humanen Milz- und Knochenmarksproben. Zwar
konnten im Menschen höhere Werte für FcγRIIB auf den B-Zellen nachgewiesen werden, die
Regulation dieses Rezeptors während der B-Zell Entwicklung und Reifung war jedoch ähnlich (siehe Abb. 37, Abb. 39 und Abb. 41).
In den generierten Mäusen mit der spezifischen shRNA gegen FcγRIIB wurde die Expression
des Rezeptors zwischen den infizierten GFP+ und den nicht infizierten GFP- Zellen verglichen. Im Blut zeigten die GFP+ B-Zellen mit 40% der FcγRIIB Expression von GFP- B-Zellen
eine sehr gute Herunterregulation. Diese verminderte Expression von FcγRIIB durch die
shRNA ist damit in den generierten Mäusen stärker als die in Autoimmunpatienten. So konnte auf naive B-Zellen von CIDP Patienten eine ca. 80%ige Expression von FcγRIIB im Ver73
Diskussion
gleich zu naiven B-Zellen von gesunden Spendern detektiert werden [89], während Gedächtnis-B-Zellen von CIDP und SLE Patienten ca. 65% der FcγRIIB Expression von gesunden
Spendern zeigten [86, 89]. In den Organen war die Detektion von GFP+ B-Zellen und die
Bestimmung der Regulation durch die shRNA schwierig, da alle Tiere für mindestens 24 Wochen beobachtet wurden, um den spontanen Verlust von B-Zell Toleranz zu untersuchen. Zu
diesem späten Zeitpunkt waren kaum noch GFP+ B-Zellen zu detektieren, während der Anteil GFP+ T-Zellen zunahm (Daten nicht gezeigt). Eine ähnliche Beobachtung konnte auch in
232T/T Mäusen gemacht werden. Dies wird zu einem späteren Zeitpunkt im Detail diskutiert.
Aufgrund der geringen Anzahl CD19+ GFP+ Zellen zu späten Zeitpunkten wurde die in
Abb. 13 analysierte Maus schon nach 20 Wochen getötet, um eine Aussage über die Regulation in den Organen treffen zu können. Diese Maus zeigt exemplarische, dass die shRNA
auch in den Organen Milz und Knochenmark zu einer verminderten Expression von FcγRIIB
führt.
Neben der Expression von FcγRIIB sollte auch dessen Funktionalität in den humanisierten
Mäusen überprüft werden. Diese konnte durch Stimulation mit anti-IgM IgG nachgewiesen
werden, da es zu der erwarteten Verminderung des Kalziumsignals im Vergleich zur Stimulation mit F(ab)2 kam. Lediglich bei der 232T/T Gruppe, die mit HSCs generiert wurde die homozygot den Transmembranpolymorphismus tragen, konnte diese Inhibition durch FcγRIIB
nicht beobachtet werden. Dies ist auf die bereits beschriebene, verschlechterte Rekrutierung
dieser Variante in lipid rafts zurückzuführen, die zu einem verminderten inhibitorischen Potenzial führt [79, 80].
6.2
Produktion von Autoantikörpern in humanisierten Mäusen
Autoimmunerkrankungen sind durch die Anwesenheit von autoreaktiven Antikörpern in den
Seren der Patienten charakterisiert. Der Nachweis spezieller, krankheitsspezifischer Autoantikörper ist ein wichtiges Werkzeug bei der Diagnose verschiedener Autoimmunerkrankungen. So zeigen SLE Patienten eine erhöhte Anzahl von Antikörpern gegen nukleäre Antigene
wie DNA, Histone und RNA [27-29], während RA Patienten Antikörper gegen GPI und IgG
(RF) aufweisen können [32, 140]. Um zu untersuchen, ob spezielle FcγRIIB Allele oder die
shRNA gegen FcγRIIB in den humanisierten Mäusen zum Verlust der B-Zell Toleranz führt,
wurden die Seren der Tiere auf die Anwesenheit solcher autoreaktiven Antikörper untersucht.
Neben Antikörpern gegen dsDNA, GPI und dem RF wurde auch auf Antikörper gegen CCP
getestet. Diese Antikörper gelten derzeit als einer der zuverlässigsten Marker für die Diagno-
74
Diskussion
se einer RA [31, 141]. Da in den humanisierten Tieren, vor allem nach 16 Wochen, vorwiegend Antikörper des IgM Isotyps präsent waren (siehe Abb. 20), wurden die Autoantikörper
vorwiegend von diesem Isotyp bestimmt. Da der Anteil der humanen Zellen und der Anteil an
B-Zellen in den Tieren einen Einfluss auf die Antikörperproduktion haben könnte, wurde das
Blut der humanisierten Mäuse nach 16 und 24 Wochen auf diese Parameter untersucht. Zwischen den einzelnen Gruppen konnten teilweise starke Unterschiede beim Anteil humaner
Zellen detektiert werden. Da die Rekonstitution der Mäuse durch verschiedene Parameter
beeinflusst wird, wie z.B. die Bestrahlungsdosis, der Zustand und die Menge der injizierten
HSCs und die Injektion selbst, kann dies verschiedene Gründe haben. Die WT und die
232T/T Gruppe zeigten eine ähnliche Rekonstitution. Beide Gruppen wurden über einen Zeitraum von 1,5 bis 2 Jahren und mit einer großen Menge unterschiedlicher HSC Proben generiert (mind. 10 bei der WT Gruppe und mind. 7 bei der 232T/T Gruppe). Somit waren die Bedingungen bei beiden Gruppen ähnlich. Alle anderen Gruppen wurden in einem geringeren
Zeitfenster erzeugt. So wurde der Hauptteil an Tieren der shRNA Gruppe zu Beginn der Arbeit generiert, während am Ende der Arbeit lediglich einzelne Tiere dazugekommen sind. Zur
Erzeugung dieser Gruppe wurden mind. 6 HSC Proben verwendet, wobei aus drei Proben
jeweils nur eine Maus hervorging. Somit ist in dieser Gruppe auch die Anzahl der verwendeten Stammzellproben geringer als in der WT und der 232T/T Gruppe. Bei der -386G/C Gruppe wurden die ersten Tiere zu Beginn der Arbeit generiert, während der Großteil im letzten
halben Jahr entstand. Zudem wurden die Tiere mit einer geringeren Anzahl an Stammzellproben generiert (4 HSC Proben). Dagegen bestand die 232I/T Gruppe aus 6 Tieren, die zur
gleichen Zeit und mit zwei HSC Proben generiert wurde. Bei den Gruppen mit einer geringen
Anzahl an unterschiedlichen HSC Proben ist die Varianz bei der Rekonstitution dementsprechend nicht so stark, wie bei der WT und der 232T/T Gruppe. Trotz unterschiedlicher Rekonstitutionseffizienzen waren die Anteile an CD19+ B-Zellen im Blut zwischen den Gruppen
vergleichbar. Lediglich bei der 232T/T Gruppe war nach 24 Wochen ein verminderter Anteil
an B-Zellen im Blut detektierbar. Da die Unterschiede im Anteil der humanen Zellen zum 24
Wochen Zeitpunkt sehr stark waren, wurde für diesen Zeitpunkt eine Korrelation der produzierten Mengen an IgM und IgG untersucht. Dabei konnte in keiner Gruppe eine erhöhte Antikörperproduktion bei Tieren mit hohem Anteil humaner Zellen nachgewiesen werden. Ein
Vergleich des Anteils humaner Zellen in Blut, Milz und Knochenmark bei einzelnen Tieren
aus unterschiedlichen Gruppen zeigte, dass die Rekonstitution der Organe zueinander sehr
unterschiedlich sein kann und dass die Beurteilung über die Rekonstitution einer Gruppe
nicht nur anhand der Blutwerte vorgenommen werden kann. Somit können die verschiedenen Mausgruppen, trotz unterschiedlichem Anteil humaner Zellen im Blut, miteinander verglichen werden.
75
Diskussion
16 Wochen nach Rekonstitution konnte in keiner der Mausgruppen eine Produktion von autoreaktiven Antikörpern detektiert werden. Zwar gab es signifikante Unterschiede zwischen
einzelnen Gruppen beim Nachweis von RF und anti-CCP Antikörpern, die Werte waren jedoch so niedrig, dass hier nicht von einer Produktion von Autoantikörpern gesprochen werden kann. 24 Wochen nach Rekonstitution konnte bei der 232T/T Gruppe, im Vergleich zur
WT Gruppe, eine erhöhte Produktion von autoreaktiven Antikörpern bei drei von vier Autoantigenen nachgewiesen werden. Auch die 232I/T Gruppe zeigte bei zwei Autoantigenen eine
höhere Produktion. Die ELISA-Daten zeigen, dass der Transmembranpolymorphismus im
FcγRIIB Gen in homozygoten sowie in heterozygoten Individuen zu einem Verlust der B-Zell
Toleranz führt. Da die Ausprägung bei der homozygoten Variante stärker war, scheint es sich
dabei um einen Dosisabhängigen Effekt zu handeln. Die detektierte Produktion von anti-CCP
Antikörpern in den 232T/T Mäusen unterstützt zudem die Studie von Chen et al., die in taiwanesischen RA Patienten mit anti-CCP Antikörpern eine Häufung des homozygoten Transmembranpolymorphismus nachweisen konnten [142]. Durch Bestimmung der Anzahl an Antikörper-sekretierenden Zellen mittels ELISpot konnte die erhöhte Produktion von
autoreaktiven Antikörpern in den 232T/T Mäusen bestätigt werden. Obwohl mittels Durchflusszytometrie CD138+ Plasmazellen und CD27++ Plasmablasten vorwiegend in der Milz zu
detektieren waren, zeigte der ELISpot die meisten ASCs im Knochenmark. Hier besaß die
232T/T Maus eine sehr hohe Anzahl an anti-DNA ASCs. Diese machten ca. die Hälfte aller
IgM produzierenden Zellen aus. Zusätzlich konnten unterschiedlich stark produzierende Zellen detektiert werden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass in WT Mäusen, die eine große
Anzahl IgM sekretierender Zellen besitzen (Abb. 26 und Abb. 27: WT #1), trotzdem keine
autoreaktiven ASCs nachweisbar waren. Diese Ergebnisse sind konsistent mit den Daten
von Fukuyama et al. und Rahman et al., die in FcγRIIB-/- Mäusen eine erhöhte Anzahl von
Autoantikörper-produzierenden Plasmazellen nachweisen konnten [143, 144].
Innerhalb der verschiedenen Immunglobuline, ist IgG der am häufigsten vorkommende Isotyp. Bei der Abwehr von Pathogenen kommt es durch die Wechselwirkung von IgG mit FcγR
zur Rekrutierung von Effektorzellen des angeborenen Immunsystems an den Ort der Entzündung, wodurch eine effektive Immunantwort vermittelt wird [3]. Durch diese Eigenschaften ist IgG bei Autoimmunerkrankungen der Isotyp mit dem höchsten pathogenen Potenzial.
Auch im Serum der humanisierten Mäuse war IgG detektierbar. Dabei konnte in der 232T/T
Gruppe eine erhöhte Menge nachgewiesen werden. Fast die Hälfte aller 232T/T Tiere hatten
hohe IgG Werte, während bei den anderen Gruppen nur einzelne Tiere eine höhere Konzentration von IgG im Serum besaßen. Die Analyse von anti-DNA IgG in den Seren von 24 Wochen alten Mäusen, die eine detektierbare Menge an IgG aufwiesen, zeigte, dass individuelle
76
Diskussion
Tiere der 232T/T Gruppe auch autoreaktive Antikörper dieses Isotyps produzieren. Trotzdem
nur in einzelnen Mäusen autoreaktive IgG Antikörper nachweisbar waren, weist die erhöhte
Anzahl an autoreaktiven IgM Antikörpern und autoreaktiven IgM sekretierenden Zellen deutlich auf einen Verlust der B-Zell Toleranz in diesen Tieren hin. Es ist möglich, dass die Entstehung von autoreaktivem IgG durch äußere Einflüsse wie z.B. virale Infektionen ausgelöst
[145] oder beschleunigt wird. Während der Mensch ständig solchen Pathogenen ausgesetzt
ist, wurden die humanisierten Mäuse unter pathogenfreien Bedingungen gehalten, was das
reduzierte Auftreten von autoreaktivem IgG erklären könnte. Die Immunisierung der humanisierten Mäuse mit Substanzen die Autoimmunerkrankungen induzieren, wie z.B. Nukleosomen oder Pristan, könnte klären, ob 232T/T Mäuse unter solchen Bedingungen autoreaktives
IgG produzieren. Da die geringen Konzentrationen von IgG eine generelle Schwäche des
humanisierten Mausmodells darstellt [132, 146], wäre zudem eine Optimierung dieses Modells notwendig, um eine Produktion von autoreaktivem IgG detektieren zu können.
Eine Vielzahl von genetischen Faktoren wird mit der Entstehung und dem Verlauf von Autoimmunerkrankungen in Verbindung gebracht. So wurden z.B. Defekte im Komplementsystem
[33], oder Faktoren wie B lymphocyte activating factor [147, 148] und a proliferation-inducing
ligand [149], die das Überleben von B-Zellen gewährleisten, mit SLE assoziiert. Neben diesen Molekülen werden auch HLA Allele mit dem Auftreten und dem Verlauf von Autoimmunität in Verbindung gebracht. Die am Häufigsten mit Autoimmunität assozierten Haplotypen
sind HLA-DRB1*03/DQB1*02 und HLA-DRB1*15/DQB1*06 [119, 120]. Um auszuschließen,
dass die detektierte Produktion autoreaktiver Antikörper auf die HLA Allele der HSCs zurückzuführen ist, wurden die injizierten Proben für HLA-DRB1 und HLA-DQB1 typisiert. Die Tiere
der 232T/T Gruppe, die Zellen mit autoimmun-assoziierten HLA Haplotypen besaßen, zeigten jedoch keine höhere Produktion an autoreaktiven Antikörpern als die Tiere mit nichtautoimmun-assoziierten HLA Haplotypen (siehe Abb. 23). Diese Daten zeigen, dass die Produktion autoreaktiver Antikörper in den humanisierten Mäusen unabhängig von den enthaltenen HLA Haplotypen ist.
Neben dem inhibitorischen FcγRIIB wurden auch Allele der aktivierenden FcγRIIA und
FcγRIIIA Rezeptoren mit der Entstehung und dem Verlauf von Autoimmunerkrankungen in
Verbindung gebracht [121-128]. Da diese in direkter Nachbarschaft zu FcγRIIB liegen wurde
untersucht, ob eines dieser Allele in den Autoantikörper-produzierenden Tieren gehäuft vorkam und ob ein bestimmtes Allel einen Einfluss auf die Produktion von Autoantikörpern hatte.
In der 232T/T Gruppen war jedes Allel von FcγRIIA und FcγRIIIA vorhanden. Somit ist der
232T Polymorphismus nicht mit einem bestimmten Allel dieser beiden Gene gekoppelt. Ins-
77
Diskussion
gesamt waren in den 232T/T Mäusen, bezüglich der FcγRIIA und FcγRIIIA Allele, vier verschiedene Genotypen vorhanden. Während die Menge an autoreaktiven Antikörpern bei drei
Gruppen ähnlich war, besaß eine Gruppe tendenziell eine höhere Menge an Autoantikörpern.
Diese zeichnete sich durch die hochaffine Variante des FcγRIIA (H/H) aus. Aufgrund dieser
Tendenz wurde auch die WT Gruppe entsprechend ihrer Genotypen für FcγRIIA und FcγRIIIA
eingeteilt. In der WT Gruppe gab es drei verschieden Genotypen. Eine große Anzahl an Tieren besaß ebenfalls den in der 232T/T Gruppe auffälligen Genotyp, diese zeigten jedoch
keine Unterschiede zu den Tieren mit anderen Genotypen. Somit scheint die hochaffine Variante des FcγRIIA möglicherweise die Produktion von autoreaktiven Antikörpern in Kombination mit dem Transmembranpolymorphismus zu fördern.
6.3
Einfluss von FcγγRIIB auf die B-Zell Entwicklung
und Reifung
Neben dem Auftreten von autoreaktiven Antikörpern konnte auch eine Veränderung des
B-Zell Kompartiments in diversen Studien mit FcγRIIB-/- Mäusen nachgewiesen werden.
Zum einen konnte eine erhöhte Anzahl an Plasmazellen und Keimzentrums-B-Zellen detektiert werden [150, 151], zum anderen zeigten B-Zellen einen aktivierten Phänotyp in diesen
Mäusen [70]. Durch das Einbringen von autoreaktiven schweren Ig-Ketten in die FcγRIIB-/Mäuse konnte ebenfalls eine erhöhte Anzahl an Plasmazellen [75, 143] bzw. eine erhöhte
Anzahl an Antikörper-sezernierenden Zellen detektiert werden [144]. Bei humanen Studien
konnte in SLE Patienten eine erhöhte Anzahl von Plasmablasten und Gedächtnis-B-Zellen
im Vergleich zu gesunden Spendern nachgewiesen werden [87, 152, 153]. Neben den veränderten Anteilen bestimmter B-Zell Populationen ist auch eine veränderte Regulation und
Expression von FcγRIIB auf unterschiedlichen Stufen der B-Zell Reifung beschrieben. Während in der Maus vorwiegend Keimzentrums-B-Zellen betroffen sind [63, 64], wurden im humanen System veränderte Expressionen auf naiven-B-Zellen [89], Plasmablasten [91] und
Gedächtnis-B-Zellen [86, 88, 89, 91] detektiert.
Da FcγRIIB sowohl im Menschen als auch in der Maus einen Einfluss auf die peripheren
B-Zellen hat und die erhöhte Produktion von autoreaktiven Antikörpern in den 232T/T Mäusen auf eine Veränderung dieses Kompartiments schließen lässt, wurden die B-Zellen der
Milz in den humanisierten Mäusen analysiert. In 24 Wochen alten 232T/T Mäusen war ein
erhöhter Anteil an IgM+ und IgM- Plasmablasten, sowie ein erhöhter Anteil an CD138+
Plasmazellen nachweisbar, die für die vermehrte Produktion autoreaktiver Antikörper verant78
Diskussion
wortlich sind. Die Expression von FcγRIIB war auf den Plasmablasten der 232T/T Gruppe
tendenziell höher als bei den beiden anderen Gruppen. Somit sind die erhöhten Anteile der
Plasmablasten auf die beschriebene, verschlechterte Rekrutierung dieser Rezeptorvariante
in lipid rafts [79, 80] zurückzuführen, die auch in den 232T/T Mäusen nachweisbar war. Dadurch wird das inhibitorische Signal von FcγRIIB vermindert und führt zu einer Herabsetzung
des Schwellenwertes für die Aktivierung der B-Zelle. Somit ist diese leichter aktivierbar und
kann schneller Differenzieren. Während für Plasmablasten im humanen System eine ähnliche Expression von FcγRIIB wie auf naiven B-Zellen beschrieben ist [86, 87], wurde in der
humanisierten Maus auf IgM+ Plasmablasten, im Vergleich zu naiven B-Zellen, eine höhere
Menge an FcγRIIB auf der Oberfläche detektiert. IgM- Plasmablasten zeigten hingegen ein
ähnliches Expressionslevel wie die naiven B-Zellen. In den von uns untersuchten humanen
Milzproben konnte auf IgM+ Plasmablasten allerdings ebenfalls eine höhere Expression von
FcγRIIB als auf naiven B-Zellen detektiert werden. Ebenso zeigten die IgM- Plasmablasten
eine geringere Expression als die IgM+ Plasmablasten. Die Unterschiede bei der FcγRIIB
Expression in den von uns untersuchten humanen Proben und der Literatur sind womöglich
auf das Spendermaterial zurückzuführen, da in dieser Arbeit Milzzellen benutzt wurden, während die humanen Studien Zellen aus Blut analysierten. Zusätzlich beeinflusst die Einteilung
in IgM+ und IgM- Zellen die FcγRIIB Expression, da bei unseren Analysen eine geringere
Expression auf IgM- Plasmablasten zu sehen war und auch bei IgM- Gedächtnis-B-Zellen
eine geringere FcγRIIB Expression als auf IgM+ Gedächtnis-B-Zellen nachweisbar ist [88].
Plasmazellen zeigten in den humanisierten Mäusen eine höhere FcγRIIB Expression als naive B-Zellen. Bei der WT und der -386G/C Gruppe war die MFI der Plasmazellen 2,7-mal höher als auf naiven B-Zellen. In der 232T/T Gruppe war die Expression nur 1,8-mal so hoch.
Da zwischen den Gruppen kein Unterschied in der Expression von FcγRIIB auf den Plasmazellen nachweisbar war (siehe Abb. 40), ist jedoch unklar, ob es bei den 232T/T Mäusen in
diesen Zellen zu einer veränderten Regulation von FcγRIIB kommt.
Im Gegensatz zu den Plasmablasten war der Anteil an Gedächtnis-B-Zellen zwischen den
drei Gruppen vergleichbar. Bei der Analyse der FcγRIIB Expression auf naiven B-Zellen und
Gedächtnis-B-Zellen konnte die im humanen System beschriebene Hochregulation von
FcγRIIB auch in den humanisierten Mäusen detektiert werden (siehe Abb. 39). Die Expression von FcγRIIB auf Gedächtnis-B-Zellen ist im Menschen ca. 1,2- bis 1,9-fach höher als auf
naiven B-Zellen [86-89, 91]. Dies konnte auch in den von uns untersuchten Proben der humanen Milzen bestätigt werden. In den humanisierten Mäusen wurde dagegen eine 1,8- bis
2,4-fach höhere Expression gemessen. Auch auf den Keimzentrums-B-Zellen der humani79
Diskussion
sierten Mäuse konnte in allen Gruppen eine höhere Expression von FcγRIIB im Vergleich zu
reifen B-Zellen nachgewiesen werden. Diese Hochregulation von FcγRIIB konnte auch bei
den untersuchten humanen Milzproben nachgewiesen werden und wurde ebenfalls für das
murine System beschrieben [64]. Die Anteile an Keimzentrums-B-Zellen waren in den drei
untersuchten humanisierten Mausgruppen ähnlich. Auch die FcγRIIB Expression auf den
Reifungsstufen, die in der Milz von humanisierten Mäusen identifiziert wurden, war zwischen
den Gruppen vergleichbar. Weitere Unterschiede gab es bei 16 Wochen alten 232T/T Tieren.
Diese besaßen einen geringeren Anteil von B-Zell Vorläufern und einen erhöhten Anteil reifer
B-Zellen (siehe Abb. 33). Dies lässt auf eine schnellere Reifung der B-Zellen in der Milz
schließen, was wiederum auf das verminderte inhibitorische Potenzial der FcγRIIB-232T Variante zurückzuführen sein könnte.
Der Mechanismus, wie FcγRIIB die humorale Toleranz beeinflusst ist bisher nicht vollständig
geklärt. Ein Model hierfür sieht die Rolle von FcγRIIB vorwiegend in der Keimzentrumsreaktion. Dort werden Immunkomplexe durch FDCs gebunden und den aktivierten B-Zellen präsentiert [154]. Die ICs verursachen dabei eine Kreuzvernetzung von FcγRIIB mit dem BCR.
Durch somatische Hypermutation können B-Zellen mit hochaffinem BCR durch ein starkes,
aktivierendes Signal positiv selektiert werden. Dagegen kommt es bei B-Zellen, die ihre Affinität für das Antigen verloren haben, zu einem pro-apoptotischen Signal durch den FcγRIIB,
was zum Tod der Zellen führt [155] (Schema siehe Abb. 4). Das erhöhte Auftreten von autoreaktivem IgM lässt in unserem Modell nicht auf eine Keimzentrumsreaktion schließen. Auch
in der FcγRIIB-/- Maus konnte eine erhöhte Produktion von IgM detektiert werden [60, 75].
Da sowohl in unseren humanisierten 232T/T Mäusen, als auch bei Rahman et al. [144] eine
höhere Anzahl an autoreaktiven IgM sekretierenden Zellen nachweisbar war, hat FcγRIIB
vermutlich nicht nur im Keimzentrum, sondern auch bei der Kontrolle extrafollikulärer Plasmazellen eine regulatorische Funktion. Hierbei könnten zirkulierende ICs, die in geringer
Konzentration im Serum von gesunden Erwachsenen detektierbar sind, eine solche Regulation bewirken [156]. So konnte gezeigt werden, dass humane DCs, bei denen FcγRIIB durch
einen spezifischen Antikörper blockiert wurde, in Anwesenheit von humanem Serum reifen
[156]. Dies zeigt, dass zirkulierende ICs für die Regulation von Immunzellen unter nicht inflammatorischen Bedingungen verantwortlich sind. Eine weitere Möglichkeit wäre, dass die
Regulation durch andere Proteine bewirkt wird, die an FcγRIIB binden können, wie z.B. Creaktives Protein (CRP). So konnte in CRP transgenen Mäusen ein FcγRIIB abhängiger
Schutz vor experimenteller autoimmuner Encephalomyelitis (EAE) nachgewiesen werden
80
Diskussion
[157]. Der genaue Mechanismus, wie FcγRIIB die Reifung und Differenzierung der B-Zellen
in der Milz bei den 232T/T Mäusen beeinflusst, muss jedoch noch analysiert werden.
Bei der -386G/C Gruppe konnte auf unreifen und reifen B-Zellen, sowie auf naiven B-Zellen
und IgM+ Plasmablasten der Milz eine höhere Expression von FcγRIIB im Vergleich zu WT
Mäusen detektiert werden. Dies spricht für eine vermehrte Transkription durch diesen Promotor. Analysen der -386C Promotorvariante mittels Luziferase Reporter System zeigten
bisher widersprüchliche Ergebnisse. So wurde zum einen eine vermehrte [82], zum anderen
eine verminderte Transkription [81, 83] beschrieben. Die Generierung von humanisierten
Mäusen mit der homozygoten Variante des Promotorpolymorphismus wird möglicherweise
dessen Transkriptionsaktivität aufklären.
Ein weiterer Phänotyp, der in Verbindung mit der homozygoten 232T Variante auftrat, war ein
verminderter Anteil von B-Zellen in Blut und Milz im Alter von 24 Wochen (Abb. 19 und Abb.
29). Ein ähnlicher Phänotyp konnte auch bei den GFP+ B-Zellen der shRNA Mäuse beobachtet werden. Eine mögliche Ursache dafür könnte eine verschlechterte Migration unreifer
B-Zellen vom Knochenmark in die Peripherie sein. In diesem Fall müsste es zu einer Anhäufung von B-Zellen im Knochenmark kommen. Dies war in den 232T/T Tieren jedoch nicht zu
beobachten. Auch hier konnte eine Abnahme der B-Zellen beobachtet werden. Da der Anteil
humaner Zellen im Knochenmark zu beiden untersuchten Zeitpunkten ähnlich war (siehe
Abb. 28), kann dies nicht nur auf eine Zunahme der T-Zellen sondern tatsächlich auf eine
gleichzeitige Abnahme der B-Zellen zurückgeführt werden. Falls nur die Anzahl der T-Zellen
zugenommen hätte, würde man in den 24 Wochen alten Mäusen einen erhöhten Anteil humaner Zellen erwarten. Dies wäre z.B. eine mögliche Erklärung für die Zunahme des Anteils
humaner Zellen bei den -386G/C Tieren vom 16 zum 24 Wochen Zeitpunkt. Eine mögliche
Ursache für die massive Zunahme an T-Zellen in den 232T/T Tieren könnte eine durch homeostatische Effekte verursachte Proliferation (homeostasis-driven proliferation) sein. Hierbei handelt es sich um die Fähigkeit von peripheren T-Zellen bei einer abnormalen, geringen
Mengen an Lymphozyten (Lymphopenie) auch ohne Antigenstimulation zu proliferieren [158160]. Dies dient dazu, die Anzahl an Lymphozyten in der Peripherie konstant zu halten. In
verschiedenen Experimenten wurde gezeigt, dass sowohl CD4+ als auch CD8+ T-Zellen bei
Lymphopenie proliferieren [158, 161, 162] und das diese Zunahme von T-Zellen auch in den
unterschiedlichen Organen nachweisbar ist [159, 160]. Durch die Abnahme an B-Zellen in
den 232T/T Mäusen wäre es denkbar, dass die dadurch entstehende Lymphopenie eine solche Proliferation von T-Zellen bewirkt.
81
Diskussion
Der vergleichbare Anteil an B-Zellen zum 16 Wochen Zeitpunkt könnte durch die erhöhte
Anzahl an rezirkulierenden B-Zellen in den 232T/T Mäusen verursacht sein. Dafür spricht vor
allem, dass nach 24 Wochen, wo keine Unterschiede bei diesen Zellen detektierbar sind, der
Anteil an B-Zellen deutlich abnimmt. Trotz der verminderten Anzahl an B-Zellen im Knochenmark der 232T/T Mäuse konnten keine Unterschiede bei den Anteilen von pro-, prä- und
unreifen B-Zellen zwischen den Gruppen detektiert werden. Diese waren sehr ähnlich zu den
in den humanen Knochenmarksproben detektierten Anteilen. Somit war die Entwicklung der
B-Zellen bzw. der Übergang von einem Stadium ins nächste, in den 232T/T Tieren nicht beeinträchtigt. Auch bei der Expression von FcγRIIB auf diesen Entwicklungsstufen war kein
Unterschied zwischen den Gruppen detektierbar. Im Knochenmark der humanisierten Mäuse
war FcγRIIB erst auf unreifen B-Zellen nachweisbar. Die Stärke der FcγRIIB Expression entspricht dabei der Expression auf unreifen und reifen B-Zellen in der Milz. In den humanen
Knochenmarksproben war ebenfalls eine Expression von FcγRIIB auf unreifen B-Zellen detektierbar. Die MFI war allerdings höher als auf naiven B-Zellen der Milz. Die Expression von
FcγRIIB ab dem unreifen B-Zell Stadium wurde auch für humane B-Zelllinien [163] und Genexpressionsanalysen mit adulten Knochenmarks-B-Zellen [10] beschrieben, während
FcγRIIB in der Maus ab dem prä-B-Zell Stadium auf der Oberfläche von B-Zellen zu finden ist
[55]. Somit scheint der Beginn der FcγRIIB Expression auf B-Zellen im Knochenmark zwischen Mensch und Maus unterschiedlich zu sein. Ein Einfluss von FcγRIIB bei der B-Zell
Entwicklung im Knochenmark ist bisher aber bei keiner Spezies beschrieben. Erste Hinweise
mit prä-B-Zelllinien aus WT und FcγRIIB-/- Mäusen deuten aber auf einen anti-apoptotischen
Effekt bei Kreuzvernetzung von FcγRIIB mit dem BCR hin [164]. Somit könnten B-Zellen, die
schwach kreuzreaktiv mit Autoantigenen sind, durch das inhibitorische Signal von FcγRIIB
positiv selektieren werden, anstatt in Apoptose zu gehen. Hierbei würde FcγRIIB vermutlich
nicht durch die Kreuzvernetzung mit dem BCR über IC aktiviert werden, sondern eventuell
durch Bindung an Proteine auf Stromazellen des Knochenmarks. Andererseits könnte
FcγRIIB zu einem geringen Anteil dauerhaft in lipid rafts vorliegen und ein tonisches Signal
senden. In diesem Fall würde die verminderte Rekrutierung der 232T Variante in diese Bereiche zu einem Fehlen des notwendigen inhibitorischen Signals führen, und somit auch bei
einem schwachen Signal vom BCR zur Apoptose der B-Zellen führen. Ob die Kreuzvernetzung von FcγRIIB auf unreifen humanen B-Zellen ein inhibitorisches Signal vermittelt, ist bisher aber nicht bekannt und wurde auch in dieser Arbeit nicht untersucht. Aufgrund der in den
232T/T Mäusen beobachteten Effekte auf die B-Zellen wäre es denkbar, dass ein fehlendes
Signal von FcγRIIB im Knochenmark zu einer negativen Selektion führt, während es bei
B-Zellen, die in die Peripherie entkommen sind, den Schwellenwert für die Aktivierung her82
Diskussion
absetzt und eine schnellere Differenzierung verursacht. Eine weitere mögliche Erklärung für
das Fehlen der B-Zellen wäre, dass diese auch im Knochenmark eine schnellere Entwicklung durchlaufen, in die Peripherie gehen und anschließend vermehrt ins Peritoneum oder in
die Lymphknoten wandern. Tatsächlich konnten in 232T/T Mäusen oft mehr Lymphknoten
gefunden werden als in den WT Mäusen (persönliche Beobachtung). Eine genaue Analyse
dieser Organe ist deshalb notwendig. Um den Grund für die Abnahme der B-Zellen in den
Organen Blut, Milz und Knochenmark zu identifizieren und eine mögliche Rolle von FcγRIIB
bei der zentralen Toleranz zu identifizieren, sind jedoch weitere Experimente notwendig.
6.4
Einfluss des Transmembranpolymorphismus auf T-Zellen
Da neben der Abnahme der B-Zellen in den 232T/T Mäusen auch eine Zunahme der TZellen beobachtet werden konnte, stellte sich die Frage, ob durch die Veränderungen im BZell Kompartiment einige T-Zellen aktiviert werden und proliferieren. Um dies zu untersuchen, wurden die einzelnen T-Zell Subpopulationen in den drei Mausgruppen verglichen. Der
in der Literatur beschriebene Anteil von CD4+ und CD8+ Zellen innerhalb der CD3+ T-Zell
Population in humanisierten Mäusen ist sehr variabel. Während bei den meisten Studien ein
höherer Anteil an CD4+ T-Zellen detektiert wird [105, 137, 138, 146], gibt es auch Studien bei
denen gleiche Mengen von CD4+ und CD8+ T-Zellen zu finden sind [165, 166] oder aber
höhere Anteile von CD8+ T-Zellen [103, 167]. Die Analyse der T-Zellen von den humanen
Milz- und Knochenmarksproben zeigte ebenfalls eine sehr individuelle Verteilung von CD4+
und CD8+ T-Zellen (siehe Abb. 14). In den von uns generierten Mäusen konnte in Milz und
Knochenmark kein Unterschied im Verhältnis von CD4+ zu CD8+ T-Zellen zwischen den
untersuchten Gruppen detektiert werden (Abb. 41). In den 232T/T Mäusen, wie auch in den
beiden anderen Gruppen, waren die CD4+ und CD8+ T-Zellen in der Milz zu gleichen Anteilen vorhanden. Auch im Knochenmark konnte zwischen den Gruppen keine abweichende
Verteilung detektiert werden. Allerdings waren hier die meisten T-Zellen CD4+ (ca. ¾ der TZellen). Auch Watanabe et al., konnten im Knochenmark einen hohen Anteil CD4+ T-Zellen
nachweisen [146]. Somit scheint die Zunahme der T-Zellen in der 232T/T Gruppe nicht durch
die Expansion einiger aktivierter Zellen verursacht zu werden, was auch durch den geringeren Anteil an CD4+CD25+ aktivierten T-Zellen (Abb. 42) in Milz und Knochenmark bestätigt
wird. Vielmehr scheinen sich beide T-Zell Populationen gleich stark zu vermehren.
83
Diskussion
Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass FcγRIIB einen Einfluss auf
die B-Zell Toleranz in humanisierten Mäusen hat. Dabei war der stärkste Verlust von Toleranz
in den Tieren zu sehen, bei denen das 232T Allel homozygot vorhanden war. Diese Tiere
zeigten, eine erhöhte Produktion von Autoantikörpern, besaßen eine große Anzahl an Autoantikörper-sekretierenden Zellen und einen erhöhten Anteil von Plasmablasten und Plasmazellen. Die beobachtete Abnahme von B-Zellen in allen untersuchten Organen deutet darauf
hin, dass FcγRIIB schon während der Entwicklung im Knochenmark von Bedeutung ist. Diese neue Funktion kann möglicherweise in weiteren Versuchen, wie z.B. der Detektion apoptotischer Zellen, aufgeklärt werden. Weiterhin können die Mäuse mit der spezifischen shRNA
gegen FcγRIIB ebenfalls hilfreich für diese Fragestellung sein, da diese Tiere die Möglichkeit
bieten, B-Zellen mit geringerer FcγRIIB Expression mit normalen B-Zellen auf dem gleichen
genetischen Hintergrund zu vergleichen. So könnten beide Populationen auf ihre Entwicklung und Reifung, sowie auf Unterschiede im BCR-Repertoire und in der Produktion von Antikörpern untersucht werden.
84
Material
7
Material
7.1
Chemikalien, Plasik- und Verbrauchsmaterialien
Soweit nicht anders angegeben, stammen alle in dieser Arbeit verwendeten Chemikalien,
Reagenzien, Plastik- und Verbrauchsmaterialen von den Firmen Greiner-Bio-One (Frickenhausen), Sarstedt (Numbrecht), Nunc (Wiesbaden), Millipore (Schwalbach), VWR (Ismaning), J. Peske (Aidling-Arnhofen), Roth (Karlsruhe), Eppendorf (Hamburg), Corning (Wiesbaden), Miltinyi Biotec (Bergisch-Gladbach), Roche (Mannheim), Sigma (Steinheim), Thermo
Fisher Scientific (Rockford, USA), Invitrogen (Darmstadt), New England Biolabs (Frankfurt).
7.2
Cytokine
Alle verwendeten Zytokine stammen von PAN Biotech GmbH, Aidenbach:
Recombinant Human Stem Cell Factor (SCF)
Recombinant Human FLT3 Ligand (FLT-3L)
Recombinant Human Interleukin 3 (IL-3)
Recombinant Human Thrombopoietin (TPO)
7.3
Oligonukleotide
Die in dieser Arbeit verwendeten Oligonukleotide stammen von der Firma Biomers.net, Ulm.
7.4
Kommerzielle Kits
Alexa Fluor 647 Monoclonal Antibody Labeling Kit
Molecular Probes, Leiden, NL
FITC Labeling Kit
KPL, Gaitherburg, USA
DSB-XTM Biotin Protein Labeling Kit
Invitrogen, Darmstadt
PureLink HiPure Maxiprep Kit
Invitrogen, Darmstadt
Qiaquick Gel Extraction Kit
Qiagen, Hilden
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit
Invitrogen, Darmstadt
Direct CD34 Progenitor Cell Isolation Kit, human
Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach
QiaAmp DSP Blood Mini Kit
Qiagen, Hilden
85
Material
LongRange PCR Kit
Qiagen, Hilden
ELISpotPLUS for Human IgM
Mabtech, Hamburg
IMTEC-CCP Antibodies
Human, Wiesbaden
Bethyl Human IgM ELISA Quantification Kit
Biomol GmbH, Hamburg
Bethyl Human IgG ELISA Quantification Kit
Biomol GmbH, Hamburg
7.5
Antikörper und Konjugate für Durchflusszytometrie
und Immunfluoreszenz
Gegen humane Antigene gerichtete Antikörper:
Antigen
Konjugat
Klon
Anwendung Verdünnung
CD3
PE
UCHT1
IF
1:20
Biolegend
CD3
PerCP
UCHT1
FACS
1:200
Biolegend
CD4
APC
RPA-T4
FACS
1:100
BD Pharmingen
CD8
PE
Hit8a
FACS
1:100
BD Pharmingen
CD10
PerCP
MEM-78
FACS
1:100
BD Pharmingen
CD11c
PE-Cy7
3.9
FACS
1:50
Biolegend
CD14
PerCp-Cy5.5
M5E2
FACS
1:50
BD Pharmingen
CD16
FITC
3G8
FACS
1:100
BD Pharmingen
CD19
APC
HIB19
FACS
1:50
BD Pharmingen
CD19
PE
HIB19
FACS
1:50
BD Pharmingen
CD19
PE-Cy7
SJ25C1
FACS
1:50
BD Pharmingen
CD20
FITC*
1F5
FACS
1:300-1:500
Eigenproduktion
CD20
Alexa647*
1F5
FACS
1:800
Eigenproduktion
CD20
APC
2H7
IF
1:10
BD Pharmingen
CD25
FITC
M-A251
FACS
1:100
BD Pharmingen
CD27
APC
M-T271
FACS
1:15
BD Pharmingen
FcγRIIB
Alexa647*
2B6
FACS
1:800
Eigenproduktion
FcγRIIB
biotin*
2B6
FACS
1:200
Eigenproduktion
CD33
PE-Cy7
P67.6
FACS
1:50
BD Pharmingen
CD34
FITC
8G12
FACS
1:15
BD Pharmingen
CD34
PE
8G12
FACS
1:15
BD Pharmingen
CD38
APC
HB-7
FACS
1:400
BD Pharmingen
CD45
APC-H7
2D1
FACS
1:200
BD Pharmingen
CD45
APC
HI30
IF
1:10
BD Pharmingen
CD56
FITC
NCAM16.2
FACS
1:30
BD Pharmingen
86
Hersteller
Material
CD56
PE
NCAM16.2
FACS
1:50
BD Pharmingen
CD64
PE
10.1
FACS
1:50
BD Pharmingen
CD138
APC
MI15
FACS
1:15
BD Pharmingen
IgM
FITC
G20-127
FACS
1:15
BD Pharmingen
IgM
FITC
G20-127
IF
1:10
BD Pharmingen
IgM
PE
G20-127
FACS
1:15
BD Pharmingen
IgM
biotin
G20-127
FACS
1:300
BD Pharmingen
Gegen Antigene der Maus gerichtete Antikörper:
Antigen
Konjugat
Klon
Anwendung Verdünnung
Hersteller
CD45.1
PE
A20
FACS
1:400
Biolegend
CD45.1
FITC
A20
FACS
1:400
Biolegend
F4/80
FITC
CI:A3-1
IF
1:10
Biolegend
Verwendete Sekundärantikörper:
Antigen
Konjugat
SA
SA
APC
PerCp
7.6
Klon
Anwendung Verdünnung
FACS
FACS
1:800
1:300
Hersteller
BD Pharmingen
BD Pharmingen
Material für die Stammzellinjektion
Hamilton Pipette Gastight 1710
Hamilton Bonaduz AG, Bonaduz, Schweiz
Hamilton Injektionsnadeln RN Needles
Hamilton Bonaduz AG, Bonaduz, Schweiz
87
Material
7.7
Software
VectorNTI 10.3
(Sequenzbearbeitung)
Invitrogen, Darmstadt
EasyWin32
(Geldokumentaion)
Herolab, Wiesloch
AxioVision LE 4.6
(Mikroskopie)
Zeiss, Jena
FACSDiva
(Durchflusszytometrie)
Becton Dickinson, USA
Flowjo
(Durchflusszytometrie)
Tree Star, USA
GraphPad Prism 3.03 (Graphische Darstellung)
GraphPad Software Inc., USA
Softmax Pro
(ELISA)
Molecular Devices, USA
EliSpot 5.0
(Elispot)
AID GmbH, Trassberg
88
Methoden
8
Methoden
8.1
Isolation von humanen CD34+ Stammzellen
Die Isolation von humanen CD34+ hämatopoetischen Stammzellen (HSC) erfolgte aus Nabelschnurblut, dass für diesen Zweck vom Klinikum Fürth, unter Einwilligung der Spender,
zur Verfügung gestellt wurde. Zuerst wurden die peripheren mononukläeren Zellen des Blutes (PBMCs - peripheral blood mononuclear cells) mittels Dichtegradientenzentrifugation
aufgereinigt. Hierfür wurde Pancoll (PAN Biotech GmbH, Aidenbach) mit dem Nabelschnurblut, das 1:1 mit RPMI Medium (ohne Zusätze) verdünnt wurde, überschichtet und bei 12°C
mit 1800rpm für 25 min zentrifugiert. Der entstandene Leukozytenring wurde abgenommen,
mit PBS gewaschen und die Zellzahl bestimmt.
Die Anreicherung von CD34+ HSCs erfolgte mittels magnetischer Zellsortierung (MACS magnetic cell seperation) mit dem „Direct CD34 Progenitor Cell Isolation Kit, human“ (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach), nach Anweisung des Herstellers. Hierzu wurden die Zellen
zentrifugiert und in MACS-Puffer (PBS, 2% FCS) resuspendiert. Pro 1x108 Zellen wurden
50µl Fc-Block zugegeben und 15 min auf Eis inkubiert. Anschließend wurden pro 1x108 Zellen 50µl CD34-MACS-Partikel zugegeben und für mindestens 30 min auf Eis inkubiert. Nach
Waschen der Zellen mit MACS-Puffer wurden die markierten Zellen in 500µl MACS-Puffer
aufgenommen. Die MACSR Separation Column (Größe LS, Miltenyi Biotec, BergischGladbach) wurde in die magnetische Haltevorrichtung eingebracht und mit Puffer equilibriert.
Anschließend wurden die Zellen auf die Säule gegeben und mehrmals mit MACS-Puffer gewaschen. Für die Elution der CD34+ Zellen von der Säule wurde diese aus der magnetischen Halterung entfernt, 5ml MACS-Puffer zugegeben und die Zellen mithilfe des beiliegenden Stempels mit Druck aus der Säule gepresst.
Die isolierten Zellen wurden anschließend zentrifugiert, in 1ml Einfriermedium (FCS, 2%
DMSO) aufgenommen und die Zellzahl bestimmt. Anschließend wurden die Zellen bei -80°C
eingefroren und bis zum Gebrauch bei -80°C oder in flüssigem Stickstoff aufbewahrt.
8.2
Isolation genomischer DNA aus Nabelschnurblut
Zur Typisierung des genetischen Hintergrundes der Stammzellproben wurde vom Nabelschnurblut, vor der Aufreinigung, 250µl Vollblut abgenommen und bei -20°C aufbewahrt. Die
genomische DNA wurde mithilfe des „QiaAmp DSP Blood Mini Kit“ (Qiagen, Hilden) entsprechend der Herstelleranweisungen isoliert und bei -20°C gelagert.
89
Methoden
8.3
Typisierung von Promotorpolymorphismus und Transmembranpolymorphismus von FcγγRIIB
Die Typisierung der Polymorphismen im FcγRIIB Gen erfolgte mittels Sequenzierung. Die
hierfür verwendeten Primer sind in Tab. 5 aufgelistet. Zu Beginn war es notwendig, eine Polymersekettenreaktion (PCR) von 15kb durchzuführen, da sich die Gene von FcγRIIB und
FcγRIIC nur in einigen wenigen Basen in Intron 6 unterscheiden. Diese PCR wurde mit Hilfe
des „LongRange PCR Kits“ (Qiagen, Hilden) mit Primer #1 und #2 (siehe Tab. 5) nach Angaben des Herstellers unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: 93°C für 3 min; 10 Zyklen mit 93°C für 15 sec und 68°C für 17 min; 28 Zyklen bei 93°C für 15 sec und 68°C für 17
min und einer Erhöhung von 20 sec bei jedem Zyklus; und einer finalen Verlängerungsphase
von 7 min bei 68°C. Die erhaltenen Fragmente wurden mittels Gelelektrophorese in einem
Agarosegel aufgetrennt, das 15kb PCR Produkt wurde ausgeschnitten und mit dem „Gel
Extraktions Kit“ (Qiagen, Hilden) aufgereinigt. Die erhaltene DNA wurde anschließend als
Matrize für die nested PCRs zur Amplifikation des Promotors und der Transmembrandomäne
verwendet.
Tab. 5: Primer zur Typisierung des Promotors und der Transmembranregion des FcγγRIIB Gens.
Nr.
Primer
Sequenz (5'-3')
Ta
#1
LR for
ctccacaggttactcgtttctaccttatcttac
94°C
#2
LR rev
gcttgcgtggcccctggttctca
76°C
#3
PP for
gttactcgtttctaccttatcttac
60°C
#4
PP rev
ttgcagtcagcccagtcactctc
60°C
#5
PP Seq2
gttccacaactcagcag
52°C
#6
232T for
cctgcctgctcacaaatgta
60°C
#7
232T rev
cactgctctccccaagac
58°C
Die nested PCR zur Bestimmung des Promotorpolymorphismus wurde unter folgenden Bedingungen mit den Primern #3 und #4 durchgeführt: 95°C für 5 min, 35 Zyklen mit 94°C für
30 sec, 56°C für 30 sec und 72°C für 2 min und einer finalen Verlängerungsphase von 7 min
bei 72°C. Die nested PCR zur Bestimmung des Transmembranpolymorphismus erfolgte bei
94°C für 5 min, 35 Zyklen bei 94°C für 30 sec, 58°C für 15 sec und 72°C für 45 sec und finaler Verlängerung bei 72°C für 7 min, mit den Primern #6 und #7. Die PCR Ansätze wurden
erneut mittels Gelelektrophorese in einem Agarosegel aufgetrennt und ausgeschnitten. Das
Produkt zum Nachweis des Promotorpolymorphismus wies eine Größe von ca. 2kb auf, das
Produkt für den Transmembranpolymorphismus ca. 750bp. Nach erneuter Aufreinigung der
Produkte mittels „Gel Extraktions Kit“ wurden diese sequenziert. Für den Promotor wurde ein
90
Methoden
spezieller Sequenzierungsprimer (Primer #5) verwendet, für die Transmembranregion wurde
der forward Primer (#6) benutzt. Die Sequenzierung erfolgte zu Beginn am eigenen Institut
(Nikolaus-Fiebiger Zentrum, Erlangen), später wurde bei GATC Biotech (Konstanz) sequenziert. Die Auswertung der Sequenzen erfolgte mithilfe der ContigExpressTM Software (Invitrogen, Darmstadt).
8.4
Klonierung
8.4.1 Herstellung chemisch kompetenter Bakterien
Chemisch kompetente E.coli TOP10 Bakterien wurden im Labor erzeugt. Hierfür wurden die
Bakterien über Nacht (ÜN) in LB-Medium (Luria/Miller) ohne Zugabe von Antibiotikum bei
37°C und 230rpm kultiviert. 400ml frisches LB-Medium wurden mit 2ml dieser Kultur angeimpft und bis zu einer optischen Dichte (OD) von 0,3 bei einer Wellenlänge von 600nm kultiviert. Anschließend wurden die Bakterien für 15 min bei 4000rpm pelletiert, in 100ml 100mM
MgCl2 resuspendiert und 5 min auf Eis inkubiert. Danach wurden die Bakterien für 5 min bei
4000rpm und 4°C zentrifugiert, das Pellet in 100ml 100mM CaCl2 aufgenommen, und 20 min
auf Eis inkubiert. Nach erneuter Zentrifugation wurden die Bakterien in 10ml in einem Mix
aus 100mM CaCl2 mit 10% Glycerol resuspendiert, in vorgekühlte 1,5ml Reaktionsgefäße
aliquotiert und sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Lagerung der chemisch kompetenten Bakterien erfolgte bei -80°C.
8.4.2 Transformation von E.Coli TOP10 Bakterien
Die DNA wurde für 15 min mit 100µl der chemisch kompetenten TOP10 E.Coli auf Eis inkubiert. Der Hitzeschock erfolgte bei 42°C für 30 sec. Nach Zugabe von 250µl vorgewärmtem
LB-Medium mit 20mM Glucose wurden die Bakterien für 1h bei 37°C und 300rpm kultiviert.
Die transformierten Bakterien wurden schließlich auf LB-Agar-Platten (50ng/ml Carbenicillin
bzw. 25ng/ml Kanamycin) ausplattiert und ÜN bei 37°C kultiviert.
8.4.3 Isolation von Plasmid DNA aus Bakterien
E.coli TOP10 Bakterien wurden ÜN in LB-Medium (5ml für die Plasmidpräparation im kleinen
Maßstab, 400ml für die Plasmidpräparation im großen Maßstab) mit 50ng/ml Carbenicillin
bzw. 25ng/ml Kanamycin bei 37°C und 230rpm ÜN kultiviert.
Im kleinen Maßstab wurde Plasmid-DNA mithilfe der Minilysatmethode durch alkalische Lyse
isoliert. Hierfür wurde 1ml der Übernachtkultur für 10 min bei 5000rpm zentrifugiert und das
Bakterienpellet in 100µl Puffer 1 (50mM Tris, 10mM EDTA, 100µg/ml RNAse A, pH 7,5) re91
Methoden
suspendiert. Anschließend erfolgte die alkalische Lyse durch Zugabe von 200µl Puffer 2
(0,2M NaOH, 1% SDS). Nach der Neutralisierung mit 150µl Puffer 3 (3M Kaliumacetat pH
5,5) wurden die lysierten Bakterien bei 4°C für 15 min bei 13000rpm zentrifugiert. Der Überstand mit der Plasmid-DNA wurde zu 1ml 96% Ethanol gegeben und für 20 min bei
13000rpm und 4°C gefällt. Das DNA-Pellet wurde mit 400µl 70% Ethanol für 7 min bei
13000rpm gewaschen und in 50µl bidest aufgenommen.
Die Gewinnung von Plasmid-DNA in großem Maßstab erfolgte mithilfe des „PureLink HiPure
Maxiprep Kit“ (Invitrogen, Darmstadt) entsprechend der Anleitung des Herstellers. Die Konzentration der isolierten Plasmid-DNA wurde spektrophotometrisch bei einer Wellenlänge von
260 und 280nm bestimmt.
Zur Kontrolle wurden die aufgereinigten Plasmide mit Restriktionsendonukleasen geschnitten
und die Fragmente mittels Agarose-Gelelektrophorese detektiert.
8.4.4 Klonierung der shRNA in den lentiviralen Transfervektor
Zur Herunterregulation von FcγRIIB wurde das SuperArray „SureSilencingTM shRNA Plasmid
for Human FCGR2B“ Kit (Qiagen, Hilden) verwendet. Für eine stabile Integration der shRNA
in die Zielzellen wurde diese aus dem Originalvektor pGeneClipTM hMGFP in den lentiviralen
Transfervektor pTRIP-∆U3-EF1α-GFP (pTRIP) kloniert. Hierzu wurde die shRNA gegen
FcγRIIB, zusammen mit dem U1 Promotor, mittels PCR aus dem Plasmid amplifiziert. Da die
Klonierung über EcoRI durchgeführt werden sollte, wurden beide Primer mit EcoRI Schnittstellen versehen. Die Sequenzen der verwendeten Primer sind in Tab. 6 aufgeführt. Da eine
direkte Klonierung des PCR-Produktes in den pTRIP Vektor nicht erfolgreich war, wurde das
PCR-Produkt zuerst in den pCRII-Topo-Blunt Vektor (Invitrogen) kloniert. Anschließend wurde das U1-shRNA Konstrukt mit EcoRI herausgeschnitten und in den dephosphorylierten, mit
EcoRI linearisierten pTRIP Vektor kloniert (pTRIP-2b#2). Zur Kontrolle wurde ein Restriktionsverdau durchgeführt.
Tab. 6: Primer zur Umklonierung der shRNA in den lentiviralen Transfervektor
enthaltene RestriktionsPrimername
Sequenz (5’-3’)
Ta
schnittstellen
shRNA forward
agtcgacgaattcggatccc
62°C
EcoRI
shRNA reverse
gtacgaattcacgtctagagccgcccagtctacttttg
60°C
EcoRI, XbaI
92
Methoden
8.5
Lentivirale Partikel für RNAi
8.5.1 Elektroporation von LCL1.11 Zellen
Die B-Zelllinie LCL1.11 wurde durch Elektroporation transfiziert. Hierzu wurden 9ml RPMI,
20% FCS im Inkubator vorgewärmt. Pro Ansatz wurden 1x107 Zellen pelletiert, in 1ml OptiMEM Medium (Invitrogen, Darmstadt) resuspendiert und in Elektroporationsküvetten (Peqlab, Erlangen) gegeben. Nach Zugabe von 30µg DNA wurden die Zellen im GenePulserTM
(Biorad, München) bei 130V und 1 Ohm elektroporiert. Anschließend wurde 1ml des vorgewärmten Mediums zugegeben, die Zellen durchmischt und zu den restlichen 8ml Medium
gegeben. Nach drei Tagen Kultivierung wurden die Zellen mittels Durchflusszytometrie auf
das Vorhandensein des green fluorescent protein (GFP) untersucht.
8.5.2 Produktion lentiviraler Partikel
Die Produktion von replikationsdefizienten, selbst-inaktivierenden lentiviralen Partikeln erfolgte unter S2 Bedingungen. Hierzu wurden HEK293T Zellen mithilfe der Kalziumphosphatmethode transient mit drei verschiedenen Plasmiden transfiziert. Die verwendeten Plasmide
waren: pTRIP bzw. pTRIP-2b#2, der lentivirale Transfervektor (mit oder ohne spezifische
shRNA gegen FcγRIIB); pCMV-dR8.2, mit den Genen für die Gag, Pol, Tat und Rev Proteine
des Humanen Immundefizienz-Virus (HIV); und ein Plasmid, das ein virales Hüllprotein kodiert. Hierfür wurde zum einen pMD2.G, der das G-Protein des Vesikulären Stromatitis Virus
(VSV-G) kodiert, und pRDF, der das Hüllprotein vom endogenen Virus RD114 der Katze
(RDF) kodiert, verwendet.
Für die Transfektion wurden HEK293T Zellen in 14cm Zellkulturschalen bis zu einer Konfluenz von 70% kultiviert. Vor der Transfektion wurden die Zellen mit 24ml frischem DMEM,
5% FCS, 1% Glutamin und 1% Penicillin/Streptomycin versorgt. Pro Schale wurde für die
Transfektion ein DNA Mix aus je 40µg pTRIP/pTRIP-2b#2, 18µg pCMV-dR8.2, 9µg
pMD2.G/pRDF, 6µg Helferplasmid, 2,65ml bidest, 300µl 2,5M CaCl2 und 10µl 100µM Chloroquin hergestellt. Dieser Mix wurde tropfenweise mit 3ml vorgewärmtem 2xHBS (50mM
Hepes, 280mM NaCl2, 1,2mM Na2HPO4, pH 7,09) unter ständiger Durchmischung mittels
Luftzufuhr vereint und auf die Zellen getropft. Nach 6-8 h wurde die Transfektion durch Austauschen des Mediums mit 30ml DMEM, 5% FCS, 1% Glutamin und 1% Penicillin/Streptomycin abgestoppt. Nach 36 h wurde der Überstand gesammelt, enthaltene Zellen
bei 1200rpm, 5 min pelletiert und der Überstand durch einen 45µm Filter filtriert. Anschließend wurde der virushaltige Überstand aliquotiert, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei
-80°C gelagert.
93
Methoden
8.5.3 Infektion von LCL1.11 Zellen
Um die Effizienz der viralen Partikel und die Funktionalität der shRNA zu testen, wurden
LCL1.11 Zellen mit den verschiedenen Viren transduziert. Hierzu wurden 5x105 Zellen in 1ml
RPMI, 10% FCS, 1% Penicillin/Streptomycin, 1% Glutamin, 1% NEAA, 1% Natriumpyruvat
auf 6-Well Zellkulturplatten ausgesäht und 1ml Virusüberstand zugegeben. Nach 24 h wurden die Zellen zentrifugiert, einmal gewaschen, in 10ml RPMI resuspendiert und in 10cm2
Flaschen kultiviert. Der Anteil infizierter Zellen und die Regulation der inhibitorischer Rezeptoren durch die shRNA wurde mittels Durchflusszytometrie bestimmt.
8.5.4 Infektion von HSCs
2 Tage vor Transplantation der Stammzellen wurden HSCs aufgetaut und in 1ml
Zytokincocktail (Hematopoietic Progenitor Growth Medium Serum-free (HPGM) (Lonza, Basel) mit 100ng/ml SCF, 100ng/ml FLT-3L, 60ng/ml IL-3 und 10ng/ml TPO) in einer 48-Well
Zellkulturplatte ÜN kultiviert. Eine unbeschichtete 48-Well Platte (BD, Heidelberg) wurde mit
40µg/ml RetroNectin® (RN) (TAKARA Bio Inc, Japan) ÜN bei 4°C beschichtet.
Am nächsten Tag wurden die mit RN beschichteten Wells mit PBS gewaschen und mit PBS,
2% BSA für 30 min bei RT geblockt. Anschließend wurde 1ml Virusüberstand aufgebracht
und für 30 min bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Danach wurde die Virusplatte bei 32°C und
2000xg für 2 h zentrifugiert. Nach Austausch des alten Überstandes gegen frischen Virusüberstand wurde die Zentrifugation wiederholt. Vor Zugabe der HSCs, wurde der Virusüberstand abgenommen und die virushaltigen Wells mit PBS gewaschen. Die HSCs wurden in
der Platte bei 1200rpm 5 min zentrifugiert und 500µl des alten Mediums wurden vorsichtig
abgenommen. Anschließend wurden die HSCs mit den verbleibenden 500µl abgespült und
auf die virushaltigen Wells überführt. Mit 500µl frischem Zytokincocktail wurden verbleibende
Zellen auf der Zellkulturplatte nochmals abgespült und ebenfalls auf die Virusplatte überführt.
Für die Infektion wurden die HSCs auf der virushaltigen Platte ÜN bei 37°C im Brutschrank
kultiviert.
Am Tag der Transplantation wurden die HSCs mit dem alten Medium von der Virusplatte gespült. Um möglichst alle Zellen zu lösen, wurden die Wells mehrmals mit PBS nachgespült.
Das Volumen wurde mit PBS auf 10ml aufgefüllt und die Zellen bei 1200rpm, 5 min zentrifugiert. Das Pellet wurde in entsprechendem Volumen PBS resuspendiert und die Zellzahl mithilfe der Neubauer-Zählkammer und Trypan-Blau bestimmt.
94
Methoden
8.6
Rekonstitution von NOD scid gamma Mäusen mit HSCs
1-3 Tage alte NOD scid gamma Mäuse wurde sublethal in einer Cäsium137 Gammabestrahlungsanlage mit 1 bis 1,3 Gy bestrahlt. Nach 4-6 Stunden wurden die HSCs, in einem Volumen von 30µl pro Maus, intravenös injiziert. Für genotypisierte HSCs wurden mind. 25.000
Zellen pro Maus und für infizierte HSCs mind. 45.000 Zellen pro Maus injiziert. 16 Wochen
nach der Transplantation wurde den Tieren retro-orbital Blut entnommen, und mittels Durchflusszytometrie auf die Anwesenheit humaner Zellen untersucht. Dafür wurde das Blut mit
PBS verdünnt und mononukleäre Zellen über Dichtegradientenzentrifugation isoliert. Anschließend wurde die Rekonstitutionseffienz durch das Verhältnis von humanen Zellen zu
Mauszellen ermittelt. Hierfür wurden Mauszellen mit anti-mouse-CD45.1-PE und humane
Zellen mit anti-human-CD45-APC-H7 angefärbt und im FACSCanto II (BD, Heidelberg) detektiert. Für die Auswertung der Daten wurde die FACSDiva Software verwendet.
8.7
Analyse humanisierter Mäuse
8.7.1 Herstellung von Einzelzellsuspensionen
Zur Analyse von Organen wie Milz, Knochenmark und Lymphknoten wurden humanisierte
Mäuse durch kraniale Dislokation getötet und die entsprechenden Organe entnommen. Um
Einzelzellsuspensionen zu erhalten, wurden Milz und Lymphknoten mit dem Stempel einer
Spritze durch einen 70µm Filter gerieben. Die Knochen (Ober- und Unterschenkel der Hinterläufe) wurden an beiden Enden aufgeschnitten und das Knochenmark mit kaltem PBS und
einer Spritze herausgespült. Danach wurde das Mark ebenfalls durch einen 70µm Filter gerieben. Anschließend wurden die Zellen bei 1200rpm für 5 min bei 4°C pelletiert, in 10ml kaltem PBS resuspendiert und durch einen 40µm Filter filtriert. Nach erneuter Zentrifugation
wurden die Zellen mit PBS in dem entsprechenden Endvolumen aufgenommen.
8.7.2 Durchflusszytometrie
Für die Analyse von Einzelzellsuspensionen im Durchflusszytometer wurden die Zellen in
eine 96-Well V-Bottom Platte überführt. Zum Blockieren der Maus Fc-Rezeptoren wurden die
Zellen abzentrifugiert und in Fc-Block aufgenommen. Dieser wurde vorher mit FACS-Puffer
(PBS, 2% FCS, 0,02% Natriumazid) auf eine Konzentration von 10µg/ml verdünnt. Die Inkubation erfolgte für 10 min auf Eis. Biotin-markierte Antikörper wurden in entsprechender Verdünnung direkt zu den Zellen in Fc-Block gegeben und die Zellen noch einmal durchmischt.
Anschließend wurden die Zellen mit FACS-Puffer gewaschen und mit dem entsprechenden
Färbeansatz, mit den fluoreszenzmarkierten Antikörpern und den Sekundärantikörpern,
95
Methoden
10 min auf Eis inkubiert. Das Anfärben von toten Zellen erfolgte mit 0,2µg/ml Dapi (AppliChem GmbH, Darmstadt) für 5 min auf Eis. Danach wurden die Zellen in FACS-Puffer aufgenommen und mittels FACSCanto II analysiert. Für die Auswertung der Daten wurde die
FACSDiva Software verwendet. Für die Analyse wurden, nach Ausschluss von Dupletten,
ausschließlich lebende Zellen betrachtet.
8.7.3 Messung der Kalziumfreisetzung
Die Detektion von Kalzium erfolgte mit dem Farbstoff Indo-1-AM (Molecular Probes). Hierfür
wurde der Inhalt eines Röhrchens Indo-1-AM in 458µl DMSO und 37µl 20% Pluronic F-127
(Molecular Probes) aufgelöst und bis zum Gebrauch in Aliquots bei -20°C gelagert.
Für die Beladung der Zellen mit dem Farbstoff wurden 5x105 Zellen in 700µl RPMI, 5% FCS
aufgenommen, mit 7µl Indo-1-AM versetzt und bei 30°C, unter ständigem Schütteln, für 25
min inkubiert. Nach Zugabe von 700µl RPMI, 10% FCS wurden die Zellen weitere 10 min bei
37°C inkubiert. Die Zellen wurden anschließend mit FACS-Puffer gewaschen, mit Fc-Block
10 min auf Eis inkubiert und nach erneutem Waschen mit mCD45-FITC, hCD45-APC und
CD19-PE angefärbt. Die Inkubation erfolgte 10 min auf Eis. Nach erneutem Waschen wurden die Zellen anschließend zweimal mit Krebs-Ringer Lösung (10mM HEPES (7,0), 140
mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 10 mM Glukose) gewaschen und in 500µl
Krebs-Ringer Lösung aufgenommen. Für die Detektion des Kalziumeinstroms wurden die
Zellen in 37°C warme Krebs-Ringer Lösung zu einem Endvolumen von 500µl gegeben und
am LSR II (BD, Heidelberg), welches von Prof. Dr. Lars Nitschke zur Nutzung zur Verfügung
gestellt wurde, analysiert. Um das Basallevel des Kalziumstroms zu ermitteln, wurden die
Zellen für 30 sec eingelesen und anschließend mit 13µg anti-IgM F(ab)2 (Jackson ImmunoResearch) bzw. 27µg anti-IgM IgG (Jackson ImmunoResearch) stimuliert. Die Detektion von
Indo-1 erfolgte bei 405nm und 485nm. Die Auswertung erfolgte mittels FlowJo Software.
8.7.4 ELISpot
Antikörper-sekretierende Zellen (ASC) wurden mit der Enzyme-linked Immuno Spot (ELISpot) Methode detektiert. Hierfür wurde der „ELISpotPLUS for Human IgM“ (Mabtech, Hamburg)
nach Anweisung der Herstellers verwendet.
Einzelne Membranen wurden mit 70%igem Ethanol für 1,5 min aktiviert und anschließend
mit sterilem H2O gewaschen. Zum Nachweis von IgM sekretierende Zellen wurden die
Membranen mit dem enthaltenen anti-IgM Antikörper ÜN bei 4°C beschichtet. Zum Nachweis
Glucose-6-Phosphat Isomerase (GPI)-spezifischer Zellen wurden die Membranen mit 1µg/ml
Phosphoglucose Isomerase (from rabbit muscle) (Sigma, Steinheim) in PBS ÜN bei 4°C be96
Methoden
schichtet. Zum Nachweis von Zellen mit Antikörpern gegen doppelsträngige DNA (dsDNA)
wurden die Membranen zuerst mit 5mg/ml poly-L-Lysin (Sigma, Steinheim) in TE-Puffer
(10mM Tris pH 8,0, 1mM EDTA) bei 4°C ÜN beschichtet. Anschließend wurden die Membranen mit TE-Puffer gewaschen und ÜN bei 4°C mit 20µg/ml Kalbsthymus-DNA (Deoxyribonucleic acid, activated, type XV; Sigma, Steinheim) in TE-Puffer beschichtet. Danach wurden
die ELISpot Membranen mit PBS gewaschen und unspezifische Bindungen mit PBS, 2%
FCS für 2h bei RT und anschließend für 1h bei 37°C im Brutschrank blockiert.
Zellen von Milz und Knochenmark wurden wie in 8.7.1 beschrieben präpariert. Um eine bestimmte Zelldichte auf den Membranen nicht zu überschreiten, wurden Mauszellen mittels
MACS entfernt. Hierfür wurden die Zellen in 300-400µl MACS-Puffer aufgenommen und 50µl
mCD45-MACS-Partikel zugegeben. Die Inkubation erfolgte auf Eis für 30 min. Zum Waschen
wurden 10ml MACS-Puffer zugegeben und die Zellen zentrifugiert. Die Zellsuspension wurde
anschließend in 500µl MACS-Puffer aufgenommen und über eine äquilibrierte MACSR Separation Column (LS, Miltenyi Biotech) gegeben. Der Durchfluss und die Waschfraktionen mit
den humanen Zellen wurden gesammelt und mehrmals mit MACS-Puffer gewaschen. Zur
Analyse der Zellzusammensetzung wurde ein kleiner Teil der Zellen abgenommen, mit
mCD45.1-PE, hCD45-APC-H7, CD19-APC, CD3-PerCp und CD33-PE-Cy7 angefärbt und
am FACS Canto II analysiert. Von den restlichen Zellen wurde die Zellzahl mittels NeubauerZählkammer bestimmt und die Anzahl von enthaltenen CD19+ B-Zellen berechnet. Die Zellen wurden anschließend in RPMI, 10% FCS, 1% Penicillin/Streptomycin, 1% Glutamat, 1%
Natriumpyruvat, 1% NEAA auf eine Zellzahl von 10.000, 50.000 bzw. 100.000 CD19+ Zellen
pro 100µl eingestellt und je 100µl der Zellsuspension auf die ELISpot-Membranen gegeben.
Die Inkubation erfolgte über Nacht bei 37°C, 5% CO2 und feuchter Atmosphäre.
Zur Detektion wurden die Membranen am nächsten Tag mit PBS gewaschen und 1µg/ml des
Detektionsantikörpers (anti-IgM biotin) in PBS, 0,5% FCS für 2 h bei RT inkubiert. Nach Waschen mit PBS wurde der Streptavidin(SA)-HRP (horsereddish peroxidase) 1:1000 in PBS,
0,5% FCS verdünnt und für 1 h mit der Membran inkubiert. Die Detektion der sekretierten
Antikörper erfolgte durch Zugabe des im Kit enthaltenen TMB Substrats. Die Farbreaktion
wurde durch intensives Waschen mit bidest von beiden Membranseiten gestoppt. Anschließend wurde die Platte im Dunkeln getrocknet und die einzelnen Membranen mittels AID
EliSpot Reader ELR 03 und der Software EliSpot 5.0 fotografiert und analysiert.
97
Methoden
8.7.5 Immunfluoreszenz
Für histologische Untersuchungen wurden humanisierte Mäuse durch kraniale Dislokation
getötet und Teile der Organe mit TissueTekR O.C.T. Compound (Sakura Finetek, Niederlande) in TissueTek 4566 Cryomold Gefäße (beides Sakura Finetek, Niederlande) eingebettet,
auf Trockeneis eingefroren und bei -80°C gelagert. Mit einem Kryotom (HM550, Thermo
Scientific) wurden 6µm Kryoschnitte angefertigt und auf SuperFrost plus-Objektträger (Menzel-Gläser, Braunschweig) aufgebracht. Diese wurden ÜN bei RT getrocknet, für 150 sec in
-20°C kaltem Aceton fixiert, erneut ÜN getrocknet und bis zum Gebrauch bei -20°C gelagert.
Für die Färbung der Kryoschnitte wurden die Objektträger aufgetaut und die Organe mit einem ImmedgePen (Vector Laboratories, USA) umrandet. Danach wurden die Schnitte mit
PBS gewaschen und in eine feuchte Kammer überführt. Unspezifische Bindungen wurden
durch Inkubation mit PBS, 5% Ziegenserum für 30 min bei RT blockiert. Antikörper wurden
in PBS, 5% Ziegenserum verdünnt und nach Entfernen der Blockierlösung auf die Objektträger aufgebracht. Die Inkubation erfolgte für 1h bei RT. Nach Waschen der Objektträger mit
PBS wurden die Schnitte mit Fluoromount und 24 x 50 mm Deckgläschen (Menzel-Gläser,
Braunschweig) eingedeckelt. Die einzelnen Schnitte wurden mit einem Axiovert 200 M und
einer Axiocam MRm (Zeiss, Jena) fotografiert und mit AxioVision LE 4.6 bearbeitet.
8.7.6 Gewinnung von Serum rekonstituierter Mäuse
Zur Untersuchung des Immunstatus von rekonstituierten Mäusen wurde ab der 16. Woche
monatlich Serum gewonnen. Hierfür wurde den Tieren retro-orbital Blut entnommen und dieses in 1,1ml Z-Gel Probengefäßen (Sarstedt, Nümbrecht) gesammelt und bei 5000rpm für
2 min zentrifugiert. Anschließend wurde das über dem Gel befindliche Serum abgenommen
und bei -20°C gelagert.
8.7.7 ELISA
Zur Bestimmung des Immunstatus der humanisierten Mäuse wurden die Seren mittels enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA) sowohl auf die Gesamtmenge an Immunglobulin
M (IgM) und Immunglobulin G (IgG), als auch auf die Anwesenheit von Autoantigenspezifischen Antikörpern untersucht. Hierbei erfolgte der Nachweis von Antikörpern gegen
dsDNA (anti-DNA ELISA), gegen GPI (anti-GPI ELISA), gegen zyklisch zitrulliniertes Peptid
(anti-CCP ELISA) und der Nachweis von Rheuma-Faktor (RF ELISA). Zur Detektion von
Serum Immunglobulinen der Isotypen IgM und IgG wurden die quantitativen ELISA Kits von
Bethyl verwendet. Zum Nachweis Autoantigen-spezifischer Antikörper wurden als Detektion98
Methoden
santikörper die in diesen Kits enthaltenen HRP-gekoppelten Antikörper verwendet. Bis auf
den anti-CCP ELISA wurden für alle ELISA’s ELISA-Platten (Microcolon, 96W, Greiner) beschichtet, unspezifische Bindungen für 1-2 h blockiert, je 1 h mit Serum und Detektionsantikörper inkubiert und anschließend durch Zugabe von TMB Substrat entwickelt. Die Farbreaktion wurde mit 6% Orthophosphorsäure abgestoppt und die optische Dichte bei 450 und
650nm in einem „VersaMax tunable microplate reader“ (Molecular Devices, Ismaning) gemessen. Die einzelnen Lösungen und Puffer für die unterschiedlichen ELISA und deren einzelne Schritte sind Tab. 5 in aufgeführt.
Tab. 7: Verwendete Puffer für die verschiedenen ELISA.
Verdünnung von
Beschichtung
Waschlösung
Blockierlösung
quantitativer
IgM
0,05M CarbonatBicarbonatPuffer (pH 9,6)
PBS,
0,05% Tween 20
PBS, 1% BSA
PBS, 1% BSA,
0,05% Tween 20
quantitativer
IgG
0,05M CarbonatBicarbonatPuffer (pH 9,6)
PBS,
0,05% Tween 20
PBS, 1% BSA
PBS, 1% BSA,
0,05% Tween 20
anti-DNA
PBS
PBS
anti-GPI
PBS
PBS
PBS, 3% BSA
PBS, 1% BSA
RF
0,05M CarbonatBicarbonatPuffer (pH 9,6)
PBS,
0,05% Tween 20
PBS, 3% BSA
PBS, 3% BSA
Seren und
Detektionsantikörpern
PBS, 0,1% GelatiPBS, 0,1% Gelatine, 3%
ne, 3% BSA,
BSA, 1mM EDTA
1mM EDTA
Für die quantitative Bestimmung von IgM und IgG wurde die Platte mit 100µg/ml des jeweiligen capture-Antikörpers für 1 h bei RT beschichtet. Die Seren wurden so verdünnt, dass sie
im linearen Bereich der Standardkurve lagen (1:100 bis 1:2000). Die Detektionsantikörper
wurden 1:20.000 verdünnt.
Für den Nachweis von Antikörpern gegen dsDNA wurden ELISA-Platten mit 10µg/ml methyliertem BSA für 2 h bei RT beschichtet. Danach erfolgte die Beschichtung mit 50µg/ml Kalbsthymus-DNA ÜN bei 4°C. Seren wurden 1:100 verdünnt, der Detektionsantikörper 1:10.000.
Der Nachweis von Antikörpern gegen GPI erfolgte durch Beschichtung der ELISA-Platten mit
1µg/ml Phosphoglucose Isomerase ÜN bei 4°C. Die Verdünnung der Seren und des Detektionsantikörpers erfolgte wie beim anti-DNA ELISA.
99
Methoden
Für die Bestimmung des RF wurden ELISA-Platten mit je 100ng anti-CD20-IgG1 (Eigenproduktion) ÜN bei 4°C beschichtet. Die Verdünnung der Seren betrug 1:100, die des Detektionsantikörpers 1:10.000.
Antikörper gegen CCP wurden mit Hilfe des „IMTEC-CCP Antibodies“ Kit (Human, Wiesbaden) bestimmt. Seren von humanisierten Mäusen wurden 1:100 im enthaltenen Verdünnungspuffer verdünnt und auf die vorbeschichtete ELISA-Platte gegeben. Die Inkubation
erfolgte für 1 h bei RT. Für die Detektion wurde der anti-human IgM-HRP (aus dem quantitativen IgM Kit von Bethyl) 1:10.000 im beiliegenden Verdünnungspuffer verdünnt und für 1 h
bei RT inkubiert. Zwischen den einzelnen Inkubationsschritten wurden die Platten mit dem
beiligenden Waschpuffer gewaschen. Die Detektion erfolgte, nach Angaben des Herstellers,
mit der beiligenden TMB- und Stoplösung.
8.8
Antikörper-Markierung
Für die Analyse von humanisierten Mäusen mittels Durchflusszytometrie wurden einige der
verwendete Antikörper zuvor mit Biotin oder verschiedenen Fluorochromen markiert.
Je 200µg monoklonale 2B6 Antikörper (gegen FcγRIIB) wurden mit dem „DSB-XTM Biotin
Protein Labeling Kit“ (Invitrogen, Darmstadt) in einem Reaktionsvolumen von 200µl entsprechend der Herstelleranweisung biotinyliert.
Je 250µg des monoklonalen 1F5 Antikörpers (gegen CD20) wurden mithilfe des „SureLinkTM
FITC Labeling Kit“ (KPL, Gaitherburg, MD, USA) in einem Reaktionsvolumen von 500µl entsprechend der Anweisungen des Herstellers mit Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) Gruppen
konjugiert.
Je 100µg des 2B6 Antikörpers wurden in einem Reaktionsvolumen von 100µl mit Alexa647Fluorochromen konjugiert. Hierfür wurde das “Alexa FluorR 647 Monoclonal Antibody Labeling Kit“ (Molecular Probes, Leiden, NL) laut der Herstelleranweisung verwendet.
8.9
Zellkultur
Soweit nicht anders vermerkt, stammten alle verwendeten Medien und Medienzusätze von
Invitrogen, Darmstadt. Das Fötale Kälberserum (FCS) stammte von der Firma Lonza, Basel
und wurde vor Gebrauch bei 56°C für 30 min hitzeinaktiviert.
Als Standardmedium für HEK293T (human embryonal kidney) Zellen diente DMEM, 5%
FCS, 1% Penicillin/Streptomycin, 1% Glutamat. Für LCL 1.11 und andere Suspensionszellen
wurde RPMI, 10% FCS, 1% Penicillin/Streptomycin, 1% Glutamat, 1% Natriumpyruvat, 1%
100
Methoden
nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA) verwendet. Die verwendeten Zelllinien wurden unter
Standardbedingungen kultiviert (37°C, 5% CO2, feuchte Atmosphäre). Die Zellen wurden alle
2-3 Tage passagiert, bei adhärenten Zellen unter Verwendung von 0,25% Trypsin/EDTA. Die
Bestimmung von Zellzahlen erfolgte mittels einer Neubauer-Zählkammer.
8.10 Versuchstierhaltung
Alle verwendeten Versuchstiere wurden in den zentralen Tierversuchseinrichtungen der Medizinischen und Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, d.h. zunächst im Franz-Penzold-Zentrum (FPZ), später im Biologisch
Technischen Entwicklungsgebäude (BTE), in isolated ventilated cages (IVC) unter specific
pathogen free (SPF)-Bedingungen gehalten. Wie von The Jackson Laboratories empfohlen,
wurde das Trinkwasser der immundefizienten NOD scid gamma Mäuse durch Zugabe von
HCl auf einen pH Wert von ca. 3,0 eingestellt. Für die Versuche wurden männliche und weibliche Tiere im Alter von 12-44 Wochen eingesetzt.
8.11 Statistik
Die statistische Auswertung erfolgte mit dem Studentschen T-Test mittels Microsoft Office
Excel 2003 oder mit dem Mann-Whitney U Test mittels GraphPad Prism 3.03. Dabei wurden
p-Werte kleiner 0,05 als signifikant (*), p-Werte zwischen 0,01 und 0,001 als signifikanter (**)
und p-Werte kleiner 0,001 als hochsignifikant (***) bewertet.
101
Literaturverzeichnis
9
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
Literaturverzeichnis
Armant, M.A. and M.J. Fenton, Toll-like receptors: a family of pattern-recognition receptors in mammals. Genome Biol, 2002. 3(8): p. REVIEWS3011.
Pearson, A.M., Scavenger receptors in innate immunity. Curr Opin Immunol, 1996.
8(1): p. 20-8.
Sylvestre, D.L. and J.V. Ravetch, Fc receptors initiate the Arthus reaction: redefining
the inflammatory cascade. Science, 1994. 265(5175): p. 1095-8.
Hozumi, N. and S. Tonegawa, Evidence for somatic rearrangement of immunoglobulin genes coding for variable and constant regions. Proc Natl Acad Sci U S A, 1976.
73(10): p. 3628-32.
Brack, C., et al., A complete immunoglobulin gene is created by somatic recombination. Cell, 1978. 15(1): p. 1-14.
Rolink, A., et al., The c-kit-encoded tyrosine kinase regulates the proliferation of early
pre-B cells. Eur J Immunol, 1991. 21(10): p. 2609-12.
Rolink, A., et al., IL-2 receptor alpha chain (CD25, TAC) expression defines a crucial
stage in pre-B cell development. Int Immunol, 1994. 6(8): p. 1257-64.
Palacios, R. and S. Nishikawa, Developmentally regulated cell surface expression
and function of c-kit receptor during lymphocyte ontogeny in the embryo and adult
mice. Development, 1992. 115(4): p. 1133-47.
Loken, M.R., et al., Flow cytometric analysis of human bone marrow: I. Normal
erythroid development. Blood, 1987. 69(1): p. 255-63.
Hystad, M.E., et al., Characterization of early stages of human B cell development by
gene expression profiling. J Immunol, 2007. 179(6): p. 3662-71.
Loken, M.R., et al., Flow cytometric analysis of normal B lymphoid development.
Pathol Immunopathol Res, 1988. 7(5): p. 357-70.
Ghia, P., et al., Ordering of human bone marrow B lymphocyte precursors by singlecell polymerase chain reaction analyses of the rearrangement status of the immunoglobulin H and L chain gene loci. J Exp Med, 1996. 184(6): p. 2217-29.
Wijdenes, J., et al., A plasmocyte selective monoclonal antibody (B-B4) recognizes
syndecan-1. Br J Haematol, 1996. 94(2): p. 318-23.
Agematsu, K., et al., CD27: a memory B-cell marker. Immunol Today, 2000. 21(5): p.
204-6.
Tiegs, S.L., D.M. Russell, and D. Nemazee, Receptor editing in self-reactive bone
marrow B cells. J Exp Med, 1993. 177(4): p. 1009-20.
Hartley, S.B., et al., Elimination from peripheral lymphoid tissues of self-reactive B
lymphocytes recognizing membrane-bound antigens. Nature, 1991. 353(6346): p.
765-9.
Nemazee, D.A. and K. Burki, Clonal deletion of B lymphocytes in a transgenic mouse
bearing anti-MHC class I antibody genes. Nature, 1989. 337(6207): p. 562-6.
Goodnow, C.C., et al., Altered immunoglobulin expression and functional silencing of
self-reactive B lymphocytes in transgenic mice. Nature, 1988. 334(6184): p. 676-82.
Goodnow, C.C., et al., Induction of self-tolerance in mature peripheral B lymphocytes.
Nature, 1989. 342(6248): p. 385-91.
Russell, D.M., et al., Peripheral deletion of self-reactive B cells. Nature, 1991.
354(6351): p. 308-11.
Lederberg, J., Genes and antibodies. Science, 1959. 129(3364): p. 1649-53.
102
Literaturverzeichnis
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
Mosier, D.E., J.J. Mond, and E.A. Goldings, The ontogeny of thymic independent antibody responses in vitro in normal mice and mice with an X-linked B cell defect. J
Immunol, 1977. 119(6): p. 1874-8.
Gavin, A., et al., Peripheral B lymphocyte tolerance. Keio J Med, 2004. 53(3): p. 1518.
Diamond, B. and M.D. Scharff, Somatic mutation of the T15 heavy chain gives rise to
an antibody with autoantibody specificity. Proc Natl Acad Sci U S A, 1984. 81(18): p.
5841-4.
Guo, W., et al., Somatic hypermutation as a generator of antinuclear antibodies in a
murine model of systemic autoimmunity. J Exp Med. 207(10): p. 2225-37.
Shlomchik, M., et al., Anti-DNA antibodies from autoimmune mice arise by clonal expansion and somatic mutation. J Exp Med, 1990. 171(1): p. 265-92.
Notman, D.D., N. Kurata, and E.M. Tan, Profiles of antinuclear antibodies in systemic
rheumatic diseases. Ann Intern Med, 1975. 83(4): p. 464-9.
Tan, E.M., Antinuclear antibodies: diagnostic markers for autoimmune diseases and
probes for cell biology. Adv Immunol, 1989. 44: p. 93-151.
Hardin, J.A. and J.E. Craft, Patterns of autoimmunity to nucleoproteins in patients
with systemic lupus erythematosus. Rheum Dis Clin North Am, 1987. 13(1): p. 37-46.
Schellekens, G.A., et al., Citrulline is an essential constituent of antigenic determinants recognized by rheumatoid arthritis-specific autoantibodies. J Clin Invest, 1998.
101(1): p. 273-81.
Schellekens, G.A., et al., The diagnostic properties of rheumatoid arthritis antibodies
recognizing a cyclic citrullinated peptide. Arthritis Rheum, 2000. 43(1): p. 155-63.
Schaller, M., D.R. Burton, and H.J. Ditzel, Autoantibodies to GPI in rheumatoid arthritis: linkage between an animal model and human disease. Nat Immunol, 2001. 2(8):
p. 746-53.
Atkinson, J.P., Complement deficiency: predisposing factor to autoimmune syndromes. Clin Exp Rheumatol, 1989. 7 Suppl 3: p. S95-101.
Berglin, E., et al., A combination of autoantibodies to cyclic citrullinated peptide (CCP)
and HLA-DRB1 locus antigens is strongly associated with future onset of rheumatoid
arthritis. Arthritis Res Ther, 2004. 6(4): p. R303-8.
Graham, R.R., et al., Visualizing human leukocyte antigen class II risk haplotypes in
human systemic lupus erythematosus. Am J Hum Genet, 2002. 71(3): p. 543-53.
Chan, O.T., et al., A novel mouse with B cells but lacking serum antibody reveals an
antibody-independent role for B cells in murine lupus. J Exp Med, 1999. 189(10): p.
1639-48.
Chan, O. and M.J. Shlomchik, A new role for B cells in systemic autoimmunity: B cells
promote spontaneous T cell activation in MRL-lpr/lpr mice. J Immunol, 1998. 160(1):
p. 51-9.
Corr, M. and B. Crain, The role of FcgammaR signaling in the K/B x N serum transfer
model of arthritis. J Immunol, 2002. 169(11): p. 6604-9.
Monach, P.A., D. Mathis, and C. Benoist, The K/BxN arthritis model. Curr Protoc Immunol, 2008. Chapter 15: p. Unit 15 22.
Albert, H., et al., In vivo enzymatic modulation of IgG glycosylation inhibits autoimmune disease in an IgG subclass-dependent manner. Proc Natl Acad Sci U S A,
2008. 105(39): p. 15005-9.
Nandakumar, K.S., L. Svensson, and R. Holmdahl, Collagen type II-specific monoclonal antibody-induced arthritis in mice: description of the disease and the influence
of age, sex, and genes. Am J Pathol, 2003. 163(5): p. 1827-37.
103
Literaturverzeichnis
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
51.
52.
53.
54.
55.
56.
57.
58.
59.
60.
Meyer, D., et al., FcgammaRIII (CD16)-deficient mice show IgG isotype-dependent
protection to experimental autoimmune hemolytic anemia. Blood, 1998. 92(11): p.
3997-4002.
Hazenbos, W.L., et al., Impaired IgG-dependent anaphylaxis and Arthus reaction in
Fc gamma RIII (CD16) deficient mice. Immunity, 1996. 5(2): p. 181-8.
Clynes, R., C. Dumitru, and J.V. Ravetch, Uncoupling of immune complex formation
and kidney damage in autoimmune glomerulonephritis. Science, 1998. 279(5353): p.
1052-4.
Takai, T., et al., FcR gamma chain deletion results in pleiotrophic effector cell defects.
Cell, 1994. 76(3): p. 519-29.
Heusser, C.H., C.L. Anderson, and H.M. Grey, Receptors for IgG: subclass specificity
of receptors on different mouse cell types and the definition of two distinct receptors
on a macrophage cell line. J Exp Med, 1977. 145(5): p. 1316-27.
Daeron, M., Intracytoplasmic sequences involved in the biological properties of lowaffinity receptors for IgG expressed by murine macrophages. Braz J Med Biol Res,
1995. 28(3): p. 263-74.
Wirthmueller, U., et al., Signal transduction by Fc gamma RIII (CD16) is mediated
through the gamma chain. J Exp Med, 1992. 175(5): p. 1381-90.
Brooks, D.G., et al., Structure and expression of human IgG FcRII(CD32). Functional
heterogeneity is encoded by the alternatively spliced products of multiple genes. J
Exp Med, 1989. 170(4): p. 1369-85.
Stuart, S.G., et al., Human IgG Fc receptor (hFcRII; CD32) exists as multiple isoforms
in macrophages, lymphocytes and IgG-transporting placental epithelium. Embo J,
1989. 8(12): p. 3657-66.
Miettinen, H.M., J.K. Rose, and I. Mellman, Fc receptor isoforms exhibit distinct abilities for coated pit localization as a result of cytoplasmic domain heterogeneity. Cell,
1989. 58(2): p. 317-27.
Budde, P., et al., Tyrosine-containing sequence motifs of the human immunoglobulin
G receptors FcRIIb1 and FcRIIb2 essential for endocytosis and regulation of calcium
flux in B cells. J Biol Chem, 1994. 269(48): p. 30636-44.
Amigorena, S., et al., Cytoplasmic domain heterogeneity and functions of IgG Fc receptors in B lymphocytes. Science, 1992. 256(5065): p. 1808-12.
Muta, T., et al., A 13-amino-acid motif in the cytoplasmic domain of Fc gamma RIIB
modulates B-cell receptor signalling. Nature, 1994. 368(6466): p. 70-3.
Foy, T.M., R.G. Lynch, and T.J. Waldschmidt, Ontogeny and distribution of the murine
B cell Fc gamma RII. J Immunol, 1992. 149(5): p. 1516-23.
Courtney, A.H., et al., Sialylated multivalent antigens engage CD22 in trans and inhibit B cell activation. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009. 106(8): p. 2500-5.
Phillips, N.E. and D.C. Parker, Cross-linking of B lymphocyte Fc gamma receptors
and membrane immunoglobulin inhibits anti-immunoglobulin-induced blastogenesis. J
Immunol, 1984. 132(2): p. 627-32.
Adachi, T., et al., CD72 negatively regulates signaling through the antigen receptor of
B cells. J Immunol, 2000. 164(3): p. 1223-9.
Chacko, G.W., et al., Negative signaling in B lymphocytes induces tyrosine phosphorylation of the 145-kDa inositol polyphosphate 5-phosphatase, SHIP. J Immunol,
1996. 157(6): p. 2234-8.
Takai, T., et al., Augmented humoral and anaphylactic responses in Fc gamma RIIdeficient mice. Nature, 1996. 379(6563): p. 346-9.
104
Literaturverzeichnis
61.
62.
63.
64.
65.
66.
67.
68.
69.
70.
71.
72.
73.
74.
75.
76.
77.
78.
79.
Pearse, R.N., et al., SHIP recruitment attenuates Fc gamma RIIB-induced B cell
apoptosis. Immunity, 1999. 10(6): p. 753-60.
MacLennan, I.C., Germinal centers. Annu Rev Immunol, 1994. 12: p. 117-39.
Jiang, Y., et al., Genetically determined aberrant down-regulation of FcgammaRIIB1
in germinal center B cells associated with hyper-IgG and IgG autoantibodies in murine systemic lupus erythematosus. Int Immunol, 1999. 11(10): p. 1685-91.
Jiang, Y., et al., Polymorphisms in IgG Fc receptor IIB regulatory regions associated
with autoimmune susceptibility. Immunogenetics, 2000. 51(6): p. 429-35.
Pritchard, N.R., et al., Autoimmune-prone mice share a promoter haplotype associated with reduced expression and function of the Fc receptor FcgammaRII. Curr Biol,
2000. 10(4): p. 227-30.
Xiu, Y., et al., Transcriptional regulation of Fcgr2b gene by polymorphic promoter region and its contribution to humoral immune responses. J Immunol, 2002. 169(8): p.
4340-6.
Suzuki, Y., et al., Distinct contribution of Fc receptors and angiotensin II-dependent
pathways in anti-GBM glomerulonephritis. Kidney Int, 1998. 54(4): p. 1166-74.
Clynes, R., et al., Modulation of immune complex-induced inflammation in vivo by the
coordinate expression of activation and inhibitory Fc receptors. J Exp Med, 1999.
189(1): p. 179-85.
Yuasa, T., et al., Deletion of fcgamma receptor IIB renders H-2(b) mice susceptible to
collagen-induced arthritis. J Exp Med, 1999. 189(1): p. 187-94.
Bolland, S. and J.V. Ravetch, Spontaneous autoimmune disease in Fc(gamma)RIIBdeficient mice results from strain-specific epistasis. Immunity, 2000. 13(2): p. 277-85.
McGaha, T.L., B. Sorrentino, and J.V. Ravetch, Restoration of tolerance in lupus by
targeted inhibitory receptor expression. Science, 2005. 307(5709): p. 590-3.
Brownlie, R.J., et al., Distinct cell-specific control of autoimmunity and infection by
FcgammaRIIb. J Exp Med, 2008. 205(4): p. 883-95.
Cyster, J.G., S.B. Hartley, and C.C. Goodnow, Competition for follicular niches excludes self-reactive cells from the recirculating B-cell repertoire. Nature, 1994.
371(6496): p. 389-95.
Mandik-Nayak, L., et al., Regulation of anti-double-stranded DNA B cells in nonautoimmune mice: localization to the T-B interface of the splenic follicle. J Exp Med, 1997.
186(8): p. 1257-67.
Paul, E., et al., Follicular exclusion of autoreactive B cells requires FcgammaRIIb. Int
Immunol, 2007. 19(4): p. 365-73.
Kyogoku, C., et al., Fcgamma receptor gene polymorphisms in Japanese patients
with systemic lupus erythematosus: contribution of FCGR2B to genetic susceptibility.
Arthritis Rheum, 2002. 46(5): p. 1242-54.
Siriboonrit, U., et al., Association of Fcgamma receptor IIb and IIIb polymorphisms
with susceptibility to systemic lupus erythematosus in Thais. Tissue Antigens, 2003.
61(5): p. 374-83.
Chu, Z.T., et al., Association of Fcgamma receptor IIb polymorphism with susceptibility to systemic lupus erythematosus in Chinese: a common susceptibility gene in the
Asian populations. Tissue Antigens, 2004. 63(1): p. 21-7.
Kono, H., et al., FcgammaRIIB Ile232Thr transmembrane polymorphism associated
with human systemic lupus erythematosus decreases affinity to lipid rafts and attenuates inhibitory effects on B cell receptor signaling. Hum Mol Genet, 2005. 14(19): p.
2881-92.
105
Literaturverzeichnis
80.
81.
82.
83.
84.
85.
86.
87.
88.
89.
90.
91.
92.
93.
94.
95.
96.
97.
98.
99.
Floto, R.A., et al., Loss of function of a lupus-associated FcgammaRIIb polymorphism
through exclusion from lipid rafts. Nat Med, 2005. 11(10): p. 1056-8.
Blank, M.C., et al., Decreased transcription of the human FCGR2B gene mediated by
the -343 G/C promoter polymorphism and association with systemic lupus erythematosus. Hum Genet, 2005. 117(2-3): p. 220-7.
Su, K., et al., A promoter haplotype of the immunoreceptor tyrosine-based inhibitory
motif-bearing FcgammaRIIb alters receptor expression and associates with autoimmunity. I. Regulatory FCGR2B polymorphisms and their association with systemic lupus erythematosus. J Immunol, 2004. 172(11): p. 7186-91.
Olferiev, M., et al., The role of activating protein 1 in the transcriptional regulation of
the human FCGR2B promoter mediated by the -343 G -> C polymorphism associated
with systemic lupus erythematosus. J Biol Chem, 2007. 282(3): p. 1738-46.
Liossis, S.N., et al., B cells from patients with systemic lupus erythematosus display
abnormal antigen receptor-mediated early signal transduction events. J Clin Invest,
1996. 98(11): p. 2549-57.
Enyedy, E.J., et al., Defective FcgammaRIIb1 signaling contributes to enhanced calcium response in B cells from patients with systemic lupus erythematosus. Clin Immunol, 2001. 101(2): p. 130-5.
Mackay, M., et al., Selective dysregulation of the FcgammaIIB receptor on memory B
cells in SLE. J Exp Med, 2006. 203(9): p. 2157-64.
Su, K., et al., Expression profile of FcgammaRIIb on leukocytes and its dysregulation
in systemic lupus erythematosus. J Immunol, 2007. 178(5): p. 3272-80.
Isaak, A., et al., Physiological up-regulation of inhibitory receptors Fc gamma RII and
CR1 on memory B cells is lacking in SLE patients. Int Immunol, 2008. 20(2): p. 18592.
Tackenberg, B., et al., Impaired inhibitory Fcgamma receptor IIB expression on B
cells in chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy. Proc Natl Acad Sci U S
A, 2009. 106(12): p. 4788-92.
Prokopec, K.E., et al., Down regulation of Fc and complement receptors on B cells in
rheumatoid arthritis. Clin Immunol. 137(3): p. 322-9.
Catalan, D., et al., B cells from rheumatoid arthritis patients show important alterations in the expression of CD86 and FcgammaRIIb, which are modulated by antitumor necrosis factor therapy. Arthritis Res Ther. 12(2): p. R68.
Hannon, G.J., RNA interference. Nature, 2002. 418(6894): p. 244-51.
Bartel, D.P., MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell, 2004.
116(2): p. 281-97.
Elbashir, S.M., et al., Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in
cultured mammalian cells. Nature, 2001. 411(6836): p. 494-8.
Goff, S.P., Genetics of retroviral integration. Annu Rev Genet, 1992. 26: p. 527-44.
Lee, Y., et al., The nuclear RNase III Drosha initiates microRNA processing. Nature,
2003. 425(6956): p. 415-9.
Yi, R., et al., Exportin-5 mediates the nuclear export of pre-microRNAs and short
hairpin RNAs. Genes Dev, 2003. 17(24): p. 3011-6.
Bernstein, E., et al., Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA
interference. Nature, 2001. 409(6818): p. 363-6.
Hammond, S.M., et al., An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene
silencing in Drosophila cells. Nature, 2000. 404(6775): p. 293-6.
106
Literaturverzeichnis
100.
101.
102.
103.
104.
105.
106.
107.
108.
109.
110.
111.
112.
113.
114.
115.
116.
117.
118.
119.
Gimeno, R., et al., Monitoring the effect of gene silencing by RNA interference in human CD34+ cells injected into newborn RAG2-/- gammac-/- mice: functional inactivation of p53 in developing T cells. Blood, 2004. 104(13): p. 3886-93.
Schotte, R., et al., The ETS transcription factor Spi-B is required for human plasmacytoid dendritic cell development. J Exp Med, 2004. 200(11): p. 1503-9.
Zollner, T.M., et al., Proteasome inhibition reduces superantigen-mediated T cell activation and the severity of psoriasis in a SCID-hu model. J Clin Invest, 2002. 109(5): p.
671-9.
Cocco, M., et al., CD34+ cord blood cell-transplanted Rag2-/- gamma(c)-/- mice as a
model for Epstein-Barr virus infection. Am J Pathol, 2008. 173(5): p. 1369-78.
Islas-Ohlmayer, M., et al., Experimental infection of NOD/SCID mice reconstituted
with human CD34+ cells with Epstein-Barr virus. J Virol, 2004. 78(24): p. 13891-900.
Gorantla, S., et al., CD8+ cell depletion accelerates HIV-1 immunopathology in humanized mice. J Immunol. 184(12): p. 7082-91.
Gorantla, S., et al., Links between progressive HIV-1 infection of humanized mice and
viral neuropathogenesis. Am J Pathol. 177(6): p. 2938-49.
Baenziger, S., et al., Disseminated and sustained HIV infection in CD34+ cord blood
cell-transplanted Rag2-/-gamma c-/- mice. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006. 103(43):
p. 15951-6.
Libby, S.J., et al., Humanized nonobese diabetic-scid IL2rgammanull mice are susceptible to lethal Salmonella Typhi infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 107(35): p.
15589-94.
Song, J., et al., A mouse model for the human pathogen Salmonella typhi. Cell Host
Microbe. 8(4): p. 369-76.
Yajima, K., et al., FcgammaRIIB deficiency with Fas mutation is sufficient for the development of systemic autoimmune disease. Eur J Immunol, 2003. 33(4): p. 1020-9.
Qi, P., et al., A transient three-plasmid expression system for the production of hepatocytes targeting retroviral vectors. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai), 2007.
39(8): p. 567-74.
Hanawa, H., et al., Comparison of various envelope proteins for their ability to pseudotype lentiviral vectors and transduce primitive hematopoietic cells from human
blood. Mol Ther, 2002. 5(3): p. 242-51.
Terstappen, L.W., et al., Sequential generations of hematopoietic colonies derived
from single nonlineage-committed CD34+CD38- progenitor cells. Blood, 1991. 77(6):
p. 1218-27.
Galy, A., et al., Human T, B, natural killer, and dendritic cells arise from a common
bone marrow progenitor cell subset. Immunity, 1995. 3(4): p. 459-73.
Loken, M.R., et al., Flow cytometric analysis of human bone marrow. II. Normal B
lymphocyte development. Blood, 1987. 70(5): p. 1316-24.
Pescovitz, M.D., Rituximab, an anti-cd20 monoclonal antibody: history and mechanism of action. Am J Transplant, 2006. 6(5 Pt 1): p. 859-66.
Avery, D.T., et al., Increased expression of CD27 on activated human memory B cells
correlates with their commitment to the plasma cell lineage. J Immunol, 2005. 174(7):
p. 4034-42.
Jego, G., et al., Reactive plasmacytoses are expansions of plasmablasts retaining the
capacity to differentiate into plasma cells. Blood, 1999. 94(2): p. 701-12.
Skarsvag, S., et al., Distribution of HLA class II alleles among Scandinavian patients
with systemic lupus erythematosus (SLE): an increased risk of SLE among
107
Literaturverzeichnis
120.
121.
122.
123.
124.
125.
126.
127.
128.
129.
130.
131.
132.
133.
134.
135.
136.
137.
138.
non[DRB1*03,DQA1*0501,DQB1*0201] class II homozygotes? Tissue Antigens,
1992. 40(3): p. 128-33.
Galeazzi, M., et al., HLA class II DNA typing in a large series of European patients
with systemic lupus erythematosus: correlations with clinical and autoantibody subsets. Medicine (Baltimore), 2002. 81(3): p. 169-78.
Koene, H.R., et al., The Fc gammaRIIIA-158F allele is a risk factor for systemic lupus
erythematosus. Arthritis Rheum, 1998. 41(10): p. 1813-8.
Manger, K., et al., Fcgamma receptor IIa, IIIa, and IIIb polymorphisms in German patients with systemic lupus erythematosus: association with clinical symptoms. Ann
Rheum Dis, 2002. 61(9): p. 786-92.
Gelmetti, A.P., et al., Polymorphism of the FcgammaRIIalpha IgG receptor in patients
with lupus nephritis and glomerulopathy. J Rheumatol, 2006. 33(3): p. 523-30.
Jonsen, A., et al., Association between SLE nephritis and polymorphic variants of the
CRP and FcgammaRIIIa genes. Rheumatology (Oxford), 2007. 46(9): p. 1417-21.
Nieto, A., et al., Involvement of Fcgamma receptor IIIA genotypes in susceptibility to
rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum, 2000. 43(4): p. 735-9.
Morgan, A.W., et al., Fcgamma receptor type IIIA is associated with rheumatoid arthritis in two distinct ethnic groups. Arthritis Rheum, 2000. 43(10): p. 2328-34.
Lee, Y.H., J.D. Ji, and G.G. Song, Associations between FCGR3A polymorphisms and
susceptibility to rheumatoid arthritis: a metaanalysis. J Rheumatol, 2008. 35(11): p.
2129-35.
Radstake, T.R., et al., Role of Fcgamma receptors IIA, IIIA, and IIIB in susceptibility to
rheumatoid arthritis. J Rheumatol, 2003. 30(5): p. 926-33.
Radbruch, A., et al., Competence and competition: the challenge of becoming a longlived plasma cell. Nat Rev Immunol, 2006. 6(10): p. 741-50.
Willcocks, L.C., et al., A defunctioning polymorphism in FCGR2B is associated with
protection against malaria but susceptibility to systemic lupus erythematosus. Proc
Natl Acad Sci U S A. 107(17): p. 7881-5.
Clatworthy, M.R., et al., Systemic lupus erythematosus-associated defects in the inhibitory receptor FcgammaRIIb reduce susceptibility to malaria. Proc Natl Acad Sci U
S A, 2007. 104(17): p. 7169-74.
Ishikawa, F., et al., Development of functional human blood and immune systems in
NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood, 2005. 106(5): p. 1565-73.
Andre, M.C., et al., Long-term human CD34+ stem cell-engrafted nonobese diabetic/SCID/IL-2R gamma(null) mice show impaired CD8+ T cell maintenance and a
functional arrest of immature NK cells. J Immunol. 185(5): p. 2710-20.
Billerbeck, E., et al., Development of human CD4+FoxP3+ regulatory T cells in human stem cell factor, GM-CSF and interleukin 3 expressing NOD SCID
IL2R{gamma}NULL humanized mice. Blood.
Mota, J. and R. Rico-Hesse, Humanized mice show clinical signs of dengue fever
according to infecting virus genotype. J Virol, 2009. 83(17): p. 8638-45.
Ito, M., et al., NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model
for engraftment of human cells. Blood, 2002. 100(9): p. 3175-82.
Hiramatsu, H., et al., Complete reconstitution of human lymphocytes from cord blood
CD34+ cells using the NOD/SCID/gammacnull mice model. Blood, 2003. 102(3): p.
873-80.
Traggiai, E., et al., Development of a human adaptive immune system in cord blood
cell-transplanted mice. Science, 2004. 304(5667): p. 104-7.
108
Literaturverzeichnis
139.
140.
141.
142.
143.
144.
145.
146.
147.
148.
149.
150.
151.
152.
153.
154.
155.
156.
157.
158.
Liao, Y., et al., Cord blood transplantation and stem cell regenerative potential. Exp
Hematol.
Nielen, M.M., et al., Specific autoantibodies precede the symptoms of rheumatoid
arthritis: a study of serial measurements in blood donors. Arthritis Rheum, 2004.
50(2): p. 380-6.
Aigner, E., et al., Contribution of anti-cyclic citrullinated peptide antibody and rheumatoid factor to the diagnosis of arthropathy in haemochromatosis. Ann Rheum Dis,
2007. 66(9): p. 1249-51.
Chen, J.Y., et al., A transmembrane polymorphism in FcgammaRIIb (FCGR2B) is
associated with the production of anti-cyclic citrullinated peptide autoantibodies in
Taiwanese RA. Genes Immun, 2008. 9(8): p. 680-8.
Fukuyama, H., F. Nimmerjahn, and J.V. Ravetch, The inhibitory Fcgamma receptor
modulates autoimmunity by limiting the accumulation of immunoglobulin G+ anti-DNA
plasma cells. Nat Immunol, 2005. 6(1): p. 99-106.
Rahman, Z.S., B. Alabyev, and T. Manser, FcgammaRIIB regulates autoreactive primary antibody-forming cell, but not germinal center B cell, activity. J Immunol, 2007.
178(2): p. 897-907.
Harley, J.B. and J.A. James, Epstein-Barr virus infection induces lupus autoimmunity.
Bull NYU Hosp Jt Dis, 2006. 64(1-2): p. 45-50.
Watanabe, Y., et al., The analysis of the functions of human B and T cells in humanized NOD/shi-scid/gammac(null) (NOG) mice (hu-HSC NOG mice). Int Immunol,
2009. 21(7): p. 843-58.
Cheema, G.S., et al., Elevated serum B lymphocyte stimulator levels in patients with
systemic immune-based rheumatic diseases. Arthritis Rheum, 2001. 44(6): p. 1313-9.
Zhang, J., et al., Cutting edge: a role for B lymphocyte stimulator in systemic lupus
erythematosus. J Immunol, 2001. 166(1): p. 6-10.
Koyama, T., et al., Raised serum APRIL levels in patients with systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis, 2005. 64(7): p. 1065-7.
Tiller, T., et al., Development of self-reactive germinal center B cells and plasma cells
in autoimmune Fc gammaRIIB-deficient mice. J Exp Med. 207(12): p. 2767-78.
Xiang, Z., et al., FcgammaRIIb controls bone marrow plasma cell persistence and
apoptosis. Nat Immunol, 2007. 8(4): p. 419-29.
Odendahl, M., et al., Disturbed peripheral B lymphocyte homeostasis in systemic lupus erythematosus. J Immunol, 2000. 165(10): p. 5970-9.
Dorner, T., et al., Abnormalities of B cell subsets in patients with systemic lupus erythematosus. J Immunol Methods. 363(2): p. 187-97.
Tew, J.G., et al., Follicular dendritic cells as accessory cells. Immunol Rev, 1990. 117:
p. 185-211.
Nimmerjahn, F. and J.V. Ravetch, Antibody-mediated modulation of immune responses. Immunol Rev. 236: p. 265-75.
Dhodapkar, K.M., et al., Selective blockade of inhibitory Fcgamma receptor enables
human dendritic cell maturation with IL-12p70 production and immunity to antibodycoated tumor cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005. 102(8): p. 2910-5.
Hu, X.Z., et al., Inhibition of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Human
C-Reactive Protein Transgenic Mice Is FcgammaRIIB Dependent. Autoimmune Dis.
2011: p. 484936.
Ernst, B., et al., The peptide ligands mediating positive selection in the thymus control
T cell survival and homeostatic proliferation in the periphery. Immunity, 1999. 11(2): p.
173-81.
109
Literaturverzeichnis
159.
160.
161.
162.
163.
164.
165.
166.
167.
Rocha, B., A.A. Freitas, and A.A. Coutinho, Population dynamics of T lymphocytes.
Renewal rate and expansion in the peripheral lymphoid organs. J Immunol, 1983.
131(5): p. 2158-64.
Beutner, U. and H.R. MacDonald, TCR-MHC class II interaction is required for peripheral expansion of CD4 cells in a T cell-deficient host. Int Immunol, 1998. 10(3): p.
305-10.
Kieper, W.C. and S.C. Jameson, Homeostatic expansion and phenotypic conversion
of naive T cells in response to self peptide/MHC ligands. Proc Natl Acad Sci U S A,
1999. 96(23): p. 13306-11.
Goldrath, A.W., L.Y. Bogatzki, and M.J. Bevan, Naive T cells transiently acquire a
memory-like phenotype during homeostasis-driven proliferation. J Exp Med, 2000.
192(4): p. 557-64.
Van Den Herik-Oudijk, I.E., et al., Functional analysis of human Fc gamma RII (CD32)
isoforms expressed in B lymphocytes. J Immunol, 1994. 152(2): p. 574-85.
Kato, I., T. Takai, and A. Kudo, The pre-B cell receptor signaling for apoptosis is negatively regulated by Fc gamma RIIB. J Immunol, 2002. 168(2): p. 629-34.
Yahata, T., et al., Functional human T lymphocyte development from cord blood
CD34+ cells in nonobese diabetic/Shi-scid, IL-2 receptor gamma null mice. J Immunol, 2002. 169(1): p. 204-9.
Strowig, T., et al., Priming of protective T cell responses against virus-induced tumors
in mice with human immune system components. J Exp Med, 2009. 206(6): p. 142334.
Shultz, L.D., et al., Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid
IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J
Immunol, 2005. 174(10): p. 6477-89.
110
Anhang
10 Anhang
10.1 Abkürzungen
°C
Grad Celsius
µg
Mikrogramm
µl
Mikroliter
µm
Mikrometer
A647
Alexa647
Abb.
Abbildung
APC
Allophycocyanin
AS
Aminosäure
ASC
engl. Antiboy-secreting cell
AU
engl. arbitrary units; freie Einheiten
BCR
engl. B cell receptor; B-Zell Rezeptor
bp
Basenpaare
BSA
engl. bovine serum albumin, Rinderserumalbumin
Btk
engl. Bruton’s tyrosine kinase
bzw.
beziehungsweise
C
Cytosin
ca.
circa
Ca2+
Kalzium
CCP
engl. cyclic citrullinated peptide
CIDP
engl. chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy
CD
engl. cluster of differentiation
CLP
engl. common lymphoid progenitor
DAPI
4′,6-Diamidin-2-phenylindol
DC
engl. dendritic cell, dendritische Zelle
DNA
engl. Desoxyribonucleic acid, Desoxyribonukleinsäure
dsDNA
doppelsträngige DNA
ELISA
engl. enzyme linked immunosorbant assay
ELISpot
engl. enzyme linked immuno spot
F
Phenylalanin
111
Anhang
FACS
engl. Fluorescence activated cell sorting, Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung
FcR
Fc Rezeptor
FCS
engl. fetal calf serum, Fötales Kälberserum
FcγR
Fc gamma Rezeptor
FDC
engl. follicular dendritic cell; Follikuläre Dendritische Zelle
FITC
Fluoresceinisothiocyanat
g
engl. gravitational force
G
Guanin
GFP
engl. green fluorescent protein
GPI
Glucose-6-Phosphat Isomerase
Gy
Gray
H
Histidin
h
lat. hora, Stunde
ddH2O
doppelt destilliertes Wasser
HIV
humanes Immundefizienz-Virus
HLA
engl. human leukocyte antigen
HEK
engl. human embryonal kidney
HRP
engl. horseraddish peroxidase
HSC
hämatopoetische Stammzellen
I
Isoleucin
IC
engl. immune complex
Ig
Immunglobulin
IL
Interleukin
ITAM
engl. immunoreceptor tyrosine based activation motif
ITIM
engl. immunoreceptor tyrosyine based inhibitory motif
kDa
Kilodalton
lat.
lateinisch
M
Molar
MACS
engl. magnetic assisted cell sorting, Magnetische Zellsortierung
MFI
Mittlere Fluoreszenzintensität
min
Minuten
mind.
mindestens
miRNA
engl. micro RNA
112
Anhang
ml
Milliliter
mM
Millimolar
ng
Nanogramm
NK-Zellen Natürliche Killer Zellen
nm
Nanometer
NOD
non-obese diabetic
OD
Optische Dichte
ORF
engl. open reading frame, offenes Leseraster
PBMC
engl. peripheral blood mononuclear cells
PBS
engl. phosphate-buffered saline, Phosphate-gepufferte Saline
PCR
engl. polymerase chain reaction, Polymerasekettenreaktion
PE
Phycoerythrin
PerCP
Peridininchlorophyll
pH
lat. Pondus Hydrogenii, “Stärke des Wasserstoffs”
Pol III
Polymerase III
R
Arginin
RA
Rheumatoide Arthritis
RF
Rheuma Faktor
RISC
engl. RNA induced silencing complex
RNA
engl. Ribonucleic acid, Ribonukleinsäure
RNAi
RNA Interferenz
rpm
engl. rotations per minute
RT
Raumtemperatur
scid
engl. severe combined immunodeficiency
sec
Sekunde
SHIP
engl.Src-homology-2 domain-containing inositol polyphosphate-5-phosphatase
SHM
engl. somatic hypermutation
shRNA
engl. Short hairpin RNA
siRNA
engl. Short interfering RNA
SLE
Systemischer Lupus Erythematodes
SNP
engl. single nucleotide polymorphism
T
Threonin
TD
engl. thymus dependent
113
Anhang
TI
engl. thymus independent
TNP
2,4,6-Trinitrophenyl
U
engl. unit, Einheit
ÜN
über Nacht
UV
ultraviolett
V
Valin
VSV-G
G-Protein des vesikulären stromatitis Virus
WT
Wildtyp
z.B.
zum Beispiel
10.2 Vektorkarten
LTR 5'
A
psi
NotI
RRE
EcoRI
EF1 Promoter
pTRIP
BamH I
10060 bp
Abb. 43: Lentivirale Transferplasmide. A) Ausgangsvektor pTRIP∆U3-EF1α-GFP (pTRIP). B) pTRIP
Vektor mit intergrierter shRNA gegen
FcγRIIB mit U1 Promoter. Die shRNA
mit U1 Promoter wurde über EcoRI
in den pTRIP kloniert.
GFP
NotI
XhoI
LTR 3'
PstI
AMP
PstI
PstI
LTR 5'
psi
B
NotI
RRE
NcoI
EcoRI
BamH I
pTRIP 2b#2
XbaI U1-shRNA-FcgR2b#2
EcoRI
10562 bp
EF1 Promoter
BamHI
NcoI
AMP
NotI
XhoI
KpnI
GFP
LTR 3'
114
Anhang
10.3 Eigene Publikationen
10.3.1 Zeitschriftenartikel
Glorius P., Baerenwaldt A., Kellner C., Staudinger M., Dechant M., Stauch M., Beurskens F.,
Parren P., van de Winkel J., Valerius T., Humpe A., Repp R., Gramatzki M. Nimmerjahn F.
and Peipp M. The novel tribody [(CD20)2xCD16] efficiently triggers effector cellmediated lysis of B cell tumors. eingereicht
Baerenwaldt, A., Biburger, M., and Nimmerjahn, F. (2010). Mechanisms of action of intravenous immunoglobulins. Expert Rev Clin Immunol 6, 425-434.
Aschermann, S., Lux, A., Baerenwaldt, A., Biburger, M., and Nimmerjahn, F. (2009). The
other side of immunoglobulin G: suppressor of inflammation. Clin Exp Immunol 160, 161167.
Tackenberg, B., Jelcic, I., Baerenwaldt, A., Oertel, W. H., Sommer, N., Nimmerjahn, F., and
Lunemann, J. D. (2009). Impaired inhibitory Fcgamma receptor IIB expression on B cells in
chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 47884792
Baerenwaldt, A., and Nimmerjahn, F. (2008). Immune regulation: FcgammaRIIB--regulating
the balance between protective and autoreactive immune responses. Immunol Cell Biol 86,
482-484.
115
Anhang
10.3.2 Vorträge und Posterpräsentationen
09/2010
10. Mitarbeiterkolloquium, Bayrisches Genomforschungsnetzwerk (BayGene),
München
Vortrag
05/2010
8th B Cell Forum, Dresden, Deutschland
Vortrag: Impact of impaired FcγRIIB function on humoral tolerance in the immune
system of humanized mice
11/2009
Netzwerktreffen 2009, Kloster Schöntal, Deutschland
Vortrag: Tolerance checkpoints in the human humoral immune system
09/2009
2nd European Congress of Immunology, Berlin, Deutschland
Poster: Impaired inhibitory Fc receptor IIB expression on B cells in CIDP
07/2009
8. Mitarbeiterkolloquium, Bayrisches Genomforschungsnetzwerk (BayGene),
München
Vortrag
07/2009
16th Germinal Centre Conference, Frankfurt, Deutschland
Poster: FcγRIIB in CIDP
05/2009
7th B Cell Forum, Salzburg, Österreich
Poster: FcγRIIB in CIDP
10/2008
2nd International GK Symposium, Erlangen, Deutschland
Poster: FcγRIIB in CIDP
07/2008
Netzwerktreffen 2008, Rothenburg o.d.T., Deutschland
Poster: Regulation of B-cell tolerance in humanized mice
07/2007
5. Mitarbeiterkolloquium, Bayrisches Genomforschungsnetzwerk (BayGene),
München
Vortrag
116
Anhang
10.4 Lebenslauf
Angaben zur Person
Name
Anne Bärenwaldt
Geburtstag
12.10.1981
Geburtsort
Rostock
Familienstand
ledig
Nationalität
deutsch
Schul- und Hochschulausbildung
Seit 05/2010
Universität
Erlangen-Nürnberg,
Lehrstuhl
für
Genetik,
AG Nimmerjahn Promotion, Betreuer: Prof. Dr. Falk Nimmerjahn
08/2007-04/2010
Experimentelle Immunologie und Immuntherapie, AG Nimmerjahn,
Universitätsklinikum Erlangen, Promotion
10/2000 – 03/2007
Technische Universität Berlin, Deutschland
Studium der Biotechnologie mit Spezialisierung auf medizinische
Biotechnologie , Abschluss als Diplom-Ingenieur für Biotechnologie
01/2006 – 03/2007
Charité Berlin, Centrum für Muskuloskeletale Chirurgie,
Abteilung Zellbiologie, Betreuerin: Dr. Ing. Grit Kasper
Diplomarbeit: „Charakterisierung mesenchymaler Stammzellen der
Ratte in Abhängigkeit vom Donoralter und der systemischen Umgebung“
11/2004 - 01/2005
Institut für Gewässerökologie und Binnenfischerei, Abteilung Binnenfischerei, Berlin, Deutschland
Studienarbeit: „Einfluss von Huminstoffen auf das Verhalten von Caenorhabditis elegans“
09/1992 - 07/2000
Richard Wossidlo Gymnasium, Ribnitz-Damgarten
Abschluss mit der Allgemeinen Hochschulreife, Note: 1,7
09/1988 - 07/1992
Grundschule Damgarten
117
Danksagung
Danksagung
Ich danke meinem Doktorvater Prof. Dr. Falk Nimmerjahn für die Möglichkeit, dass ich dieses
interessante Projekt in seiner Arbeitsgruppe durchführen durfte. Ich bedanke mich außerdem
für die hervorragende Betreuung während der Promotion. Seine Tür stand immer für mich
offen und durch seine Ratschläge und Anregungen hat er das Gelingen dieser Arbeit ermöglicht. Ich danke Ihnen für das mir entgegengebrachte Vertrauen.
Prof. Dr. Lars Nitschke danke ich für Erstellung des Zweitgutachtens. Prof. Dr. Thomas Winkler und Prof. Dr. med. Reinhard Voll danke ich für die Bereitschaft als Prüfer in diesem Promotionsverfahren zu fungieren.
Den Mitgliedern meiner Betreuungskomission, Prof. Dr. Thomas Winkler und Prof. Dr. André
Gessner danke ich für die Anregungen und Vorschläge im Verlauf meiner Arbeit. Weiterhin
danke ich Prof. Dr. Thomas Winkler als Sprecher der Forscherschergruppe 832 und Prof. Dr.
Hans-Martin Jäck als Sprecher des GK592, die mir die Integration in die Erlanger Forschungswelt sowie die Teilnahme an Kongressen und die Möglichkeit von zusätzlichen Qualifikationen ermöglichten.
Dem Klinikum Fürth danke ich für die Bereitstellung von Nabelschnurblut und Prof. Dr. Diana
Dudziak für die Bereitstellung der humanen Milz- und Knochenmarkproben. PD Dr. med.
Bernd Spriewald danke ich für die HLA Typisierung und Dr. Astrid Schweizer für die Hilfe bei
der Kalziummessung.
Ich danke meiner Kollegin Anja Lux, die mir in den Jahren der gemeinsamen Promotion zu
einer sehr guten Freundin geworden ist. Sie hat dazu beigetragen, dass ich mich in Erlangen
sehr wohl gefühlt habe und hat mich auch in den frustrierenden Zeiten dieser Arbeit ermutigt
und aufgebaut. Der stetige Austausch von Wissen und Ideen hat ebenso zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen, wie die notwendige Ablenkung durch eine ordentliche Portion Unfug.
Natürlich danke ich ihr auch für das fleißige Korrekturlesen dieser Arbeit.
Ich danke Heike Albert und Heike Danzer für die Hilfe im Labor, vor allem in der heißen Endphase dieser Arbeit. Weiterhin danke ich all meinen Kollegen: Susanne Aschermann, Markus
Biburger, Sybille Böhm, Birgit Lehmann, Sidonia Mihai, Inessa Schwab und Melissa Woigk,
die ein sehr harmonisches Arbeiten in der Gruppe ermöglichten und mich jeden Tag gerne
ins Labor kommen ließen.
Ich danke meinen Eltern und meinem Bruder für die Unterstützung, nicht nur während der
letzten Jahre der Promotion.
Ganz besonders möchte ich meinem Lebensgefährten Stephan Rodewald danken, der die
letzten Jahre Fernbeziehung tapfer ertragen hat und mir dadurch ermöglicht hat, mich voll
auf meine Arbeit zu konzentrieren. Zudem danke ich ihm, dass er stets ein Ohr für meine
Probleme während dieser Zeit hatte. Ich liebe dich.
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