Immunhistochemische Untersuchungen zum Nachweis der
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Tierärztliche Hochschule Hannover Institut für Pathologie Immunhistochemische Untersuchungen zum Nachweis der Expression von induzierbarer Stickoxid-Synthase (iNOS), Nitrotyrosin (NT) und Mangan-Superoxid-Dismutase (Mn-SOD) in Lungen von Kälbern nach experimenteller Infektion mit Mycoplasma bovis INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin – Doctor medicinae veterinariae – (Dr. med. vet.) Vorgelegt von Kathrin Anika Hermeyer aus Hamburg Hannover 2008 Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Marion Hewicker-Trautwein 1.Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Marion Hewicker-Trautwein 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Martina Hoedemaker Tag der mündlichen Prüfung: 24. April 2008 Meinen Eltern Inhaltsverzeichnis I INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG .....................................................................................1 2 LITERATURÜBERSICHT ..................................................................3 2.1 Mykoplasmen ......................................................................................... 3 2.1.1 Erregereigenschaften .................................................................................................3 2.1.2 Pathogenitätsmechanismen ......................................................................................4 2.1.3 Mycoplasma bovis-Infektion des Rindes ..................................................................5 2.1.3.1 Infektion des Respirationstraktes .............................................................................. 6 2.2 Makrophagen in der Lunge ................................................................... 9 2.3 Induzierbare Stickoxid-Synthase, Nitrotyrosin, Mangan- Superoxid-Dismutase .......................................................................... 12 2.3.1 Induzierbare Stickoxid-Synthase.............................................................................12 2.3.1.1 Reaktive Sauerstoffspezies ..................................................................................... 13 2.3.2 Nitrotyrosin................................................................................................................14 2.3.3 Mangan-Superoxid-Dismutase ................................................................................15 2.4 iNOS, NT und Mn-SOD im Respirationstrakt ..................................... 16 2.4.1 iNOS im Respirationstrakt........................................................................................16 2.4.2 iNOS und bovine Alveolarmakrophagen.................................................................17 2.4.3 iNOS im Respirationstrakt bei Pneumopathien......................................................19 2.4.4 NT im Respirationstrakt bei Pneumopathien..........................................................23 2.4.5 Mn-SOD im Respirationstrakt bei Pneumopathien ................................................25 2.5 Die Phagozytenmarker S100A8 und S100A9..................................... 27 2.5.1 Eigenschaften und Funktion von S100A8 und S100A9 .........................................27 2.5.1.1 S100A8 und S100A9 im Respirationstrakt bei Pneumopathien.............................. 29 3 3.1 MATERIAL UND METHODEN ........................................................31 Untersuchungsmaterial ....................................................................... 31 3.1.1 Untersuchte Kälber ...................................................................................................31 3.1.2 Kontrolltiere...............................................................................................................31 II Inhaltsverzeichnis 3.1.3 Experimentell mit M. bovis infizierte Kälber ...........................................................33 3.1.3.1 Infektionsversuch mit einer klonalen Variante des M. bovis-Stammes PG45......... 33 3.1.3.2 Infektionsversuch mit dem M. bovis-Feldstamm 1067 sowie mit einem französischen M. bovis-Feldstamm......................................................................... 35 3.1.3.3 Vakzinationsversuch................................................................................................ 36 3.1.4 Lungengewebeproben ..............................................................................................40 3.1.5 Fixation, Paraffineinbettung und physikochemische Färbemethode ..................43 3.1.5.1 Fixierung von Gewebeproben ................................................................................. 43 3.1.5.2 Paraffineinbettung von Gewebeproben................................................................... 43 3.1.5.3 Färbung von Paraffinschnitten mit Hämalaun-Eosin............................................... 44 3.2 Immunhistochemische Untersuchungen........................................... 45 3.2.1 Vorversuche zur Immunhistochemie ......................................................................45 3.2.2 Antikörper und Seren ...............................................................................................45 3.2.2.1 Primärantikörper ...................................................................................................... 45 3.2.2.2 Sekundärantikörper und Detektionssystem............................................................. 48 3.2.2.3 Färbemethoden in der Immunhistochemie.............................................................. 48 3.2.3 Protokoll der Immunhistochemie ............................................................................50 3.2.4 Demaskierungsverfahren .........................................................................................52 3.2.5 Kontrollen in der Immunhistochemie......................................................................53 3.3 Auswertung und Dokumentation........................................................ 53 3.3.1 Lichtmikroskopische Beurteilung ...........................................................................53 3.3.2 Auswertung und Morphometrie ...............................................................................53 3.3.3 Fotografische Dokumentation .................................................................................55 4 4.1 ERGEBNISSE..................................................................................57 Histologische Befunde bei den Kontrolltieren und Lungenveränderungen bei den infizierten Tieren............................. 57 4.1.1 Histologische Befunde bei lungengesunden Kontrolltieren.................................57 4.1.2 Histologische Befunde bei experimentell mit M. bovis infizierten Kälbern.........58 4.1.3 Entzündliche und sonstige Lungenveränderungen bei experimentell mit M. bovis infizierten Kälbern ohne Nekrosen...........................................................60 4.1.4 Entzündliche und sonstige Lungenveränderungen bei experimentell mit M. bovis infizierten Kälbern mit Nekrosen..............................................................62 Inhaltsverzeichnis 4.1.5 Vergleich III der Makrophagenzahlen in verschiedenen Lungen- kompartimenten zwischen Kontrolltieren, Tieren ohne und mit Nekrosen .........64 4.2 Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchungen ............. 68 4.2.1 Immunhistochemische Untersuchungen an Lungengewebeproben der Kontrolltiere...............................................................................................................68 4.2.1.1 Expression von iNOS .............................................................................................. 68 4.2.1.2 Expression von NT .................................................................................................. 69 4.2.1.3 Expression von Mn-SOD ......................................................................................... 69 4.2.1.4 Expression von S100A8 .......................................................................................... 70 4.2.1.5 Expression von S100A9 .......................................................................................... 71 4.2.2 Immunhistochemische Untersuchungen an Lungengewebeproben der experimentell mit M. bovis infizierten Kälber ohne Nekrosen ..............................74 4.2.2.1 Expression von iNOS .............................................................................................. 74 4.2.2.2 Expression von NT .................................................................................................. 75 4.2.2.3 Expression von Mn-SOD ......................................................................................... 76 4.2.2.4 Expression von S100A8 .......................................................................................... 78 4.2.2.5 Expression von S100A9 .......................................................................................... 79 4.2.3 Immunhistochemische Untersuchungen an Lungengewebeproben der experimentell mit M. bovis infizierten Kälber mit Nekrosen .................................80 4.2.3.1 Expression von iNOS .............................................................................................. 80 4.2.3.2 Expression von NT .................................................................................................. 82 4.2.3.3 Expression von Mn-SOD ......................................................................................... 83 4.2.3.4 Expression von S100A8 .......................................................................................... 85 4.2.3.5 Expression von S100A9 .......................................................................................... 86 4.2.3.6 Expression von CD68.............................................................................................. 86 5 5.1 DISKUSSION...................................................................................93 Expression von iNOS, NT und Mn-SOD ............................................. 93 5.1.1 Expression von iNOS, NT und Mn-SOD im Lungengewebe von Kontrolltieren.............................................................................................................93 5.1.2 Expression von iNOS, NT und Mn-SOD im entzündlich veränderten Lungengewebe infizierter Kälber.............................................................................94 5.2 Auftreten von Makrophagen ............................................................. 101 5.3 Mögliche Stimulatoren zur Induzierung von iNOS ......................... 104 IV Inhaltsverzeichnis 6 ZUSAMMENFASSUNG .................................................................109 7 SUMMARY.....................................................................................111 8 LITERATURVERZEICHNIS...........................................................113 9 ANHANG .......................................................................................131 9.1 Ergebnistabellen ................................................................................ 131 9.2 p-Werte ................................................................................................ 139 9.3 Färbungsprotokolle ........................................................................... 140 9.3.1 H&E-Färbung am Paraffinschnitt...........................................................................140 9.3.2 Verwendete Lösungen für die H&E-Färbung........................................................140 9.4 Pufferrezepte für die Immunhistochemie ........................................ 141 9.4.1 Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)........................................................141 9.4.2 Citratpuffer...............................................................................................................141 9.5 Bezugsquellen für Chemikalien und Antikörper ............................. 141 9.6 Bezugsquellen für Geräte und Einmalartikel................................... 145 I Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis ABC Avidin-Biotin-Peroxidase Komplex Abb. Abbildung AEC „3-Amino-9-ethylcarbazole“ AP Alkalische Phosphatase Aqua dest. Aqua destillata ARDS engl. acute respiratory distress syndrome (akute respiratorische Insuffizienz) BAL Bronchoalveoläre Lavage BALT Bronchus-assoziiertes lymphatisches Gewebe BRSV Bovines Respiratorisches Synzytialvirus BOS engl. bronchiolitis obliterans syndrome (Bronchiolitis obliterans) BrPn. Bronchopneumonie BSA Bovines Serumalbumin bzw. beziehungsweise °C Grad Celsius 2+ Ca Kalzium CF engl. cystic fibrosis (Zystische Fibrose) CFU engl. colony forming units (koloniebildende Einheiten) COPD engl. chronic obstructive pulmonary disease (chronisch obstruktive Lungenerkrankung) COX-2 Cyclooxygenase-2 Cu/Zn-SOD Kupfer/Zink-Superoxid-Dismutase DAB 3,3’-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid DNA engl. desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) DRB Deutsch-Rotbunt DSB Deutsch-Schwarzbunt EC-SOD engl. extracellular superoxide dismutase (Extrazelluläre Superoxid-Dismutase) ELISA engl. enzyme-linked immunosorbent assay II Abkürzungsverzeichnis engl. englisch E-Nr. Einsendungsnummer eNOS engl. endothelial nitric oxide synthase (endotheliale Stickoxid-Synthase) et al. lat. et alii (und andere) Fa. Firma g Gramm Geschl. Geschlecht ggr. geringgradig GM-CSF engl. granulocyte-macrophage colony stimulating factor gr. griechisch gstgr. geringstgradig H&E Hämalaun-Eosin HCl Salzsäure H-DSB Holstein-Deutsch-Schwarzbunt hgr. hochgradig HPF engl. high power field (Blickfeld im Lichtmikroskop bei 40facher Vergrößerung) ICAM engl. intercellular adhesion molecules (interzelluläre Adhäsionsmoleküle) IgG Immunglobulin G IgM Immunglobulin M IHC Immunhistochemie IL Interleukin IFN Interferon iNOS engl. inducible nitric oxide synthase (induzierbare Stickoxid-Synthase) J Jahre kat.-eitrig katarrhalisch-eitrig kDa Kilo Dalton III Abkürzungsverzeichnis lat. lateinisch lfd. laufend Lok. Lokalisation LPS Lipopolysaccharid m männlich M Molarität mAK monoklonaler Antikörper max. maximal M. bovis Mycoplasma bovis MHC engl. major histocompatibility complex (Haupthistokompatibilitätskomplex) mgr. mittelgradig Mo Monate Min. Minuten MIP engl. macrophage inflammatory proteins Mn-SOD engl. manganese-superoxide-dismutase (Mangan-Superoxid-Dismutase) mRNA engl. messenger RNA MRP8/14 engl. migration inhibitory factor, (MIF)-related proteins-8/14 MW Mikrowelle NaCl Natriumchlorid NaOH Natronlauge NGZ neutrophile Granulozyten nNOS engl. neuronal nitric oxide synthase (neuronale Stickoxid-Synthase) NO Stickstoffmonoxid Nr. Nummer NRAMP1 engl. natural resistance associated macrophage protein 1 NT Nitrotyrosin obl. obliterierend IV Abkürzungsverzeichnis pAK polyklonaler Antikörper PBS engl. phosphate-buffered saline (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) PCR engl. polymerase chain reaction (Polymerasekettenreaktion) PGE2 Prostaglandin in E2 p.i. lat. post infectionem PIMs pulmonale intravaskuläre Makrophagen PMN engl. polymorphonuclear neutrophils (polymorphkernige neutrophile Granulozyten) rb rekombinant Ri Rind RNA engl. ribonucleic acid (Ribonukleinsäure) RNS engl. reactive nitrogen species (reaktive Nitroverbindungen) ROS engl. reactive oxygen species (reaktive Sauerstoffspezies) RT-PCR engl. real-time polymerase chain reaction SC engl. small colony SOD engl. superoxide dismutase (Superoxid-Dismutase) spp. lat. species subsp. lat. subspecies TGF-β engl. transforming growth factor-β Th T-Helferzelle TNF-α Tumor Nekrose Faktor-α u.a. unter anderem Vsp engl. variable surface protein (variables Oberflächenprotein) w weiblich z.B. zum Beispiel Einleitung 1 1 Einleitung Mycoplasma (M.) bovis gehört zu den für das Rind pathogensten Mykoplasmenarten und führt bei Kälbern zu unterschiedlichen entzündlichen und teils mit schwerwiegenden Nekrosen einhergehenden Lungenläsionen. In vorangegangenen Untersuchungen an experimentell infizierten Kälbern (BUCHENAU 2003; JACOBSEN 2006) wurde gezeigt, dass sowohl M. bovis-Antigen als auch M. bovisDNA insbesondere im nekrotischen Lungengewebe persistieren. Bislang sind die an der Entstehung der Lungenläsionen und an der Erregerpersistenz beteiligten Faktoren weitgehend ungeklärt. Im Rahmen der unspezifischen Immunantwort sind Makrophagen normalerweise als Effektorzellen primär zuständig für die Elimination bakterieller Infektionserreger aus der Lunge. Aktivierte Makrophagen produzieren in entzündlich veränderten Geweben induzierbare Stickoxid-Synthase (iNOS), wodurch die Bildung von Stickstoffmonoxid (NO) katalysiert wird. Da NO zytotoxisch wirkt, wird ihm eine wichtige Rolle bei der Abtötung bakterieller Mikroorganismen zugesprochen. Nitrotyrosin (NT) ist ein Produkt, das während der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies durch die Reaktion von Peroxynitrit mit NO unter Beteiligung von Mangan-Superoxid-Dismutase (MnSOD) entsteht. Der Nachweis von NT stellt einen wichtigen Marker für in vivo entstandenes Peroxynitrit dar und kann somit als Indikator für oxidativen Stress angesehen werden. Aufgrund von immunhistochemischen Ergebnissen zur Expression von iNOS, NT und Mn-SOD bei durch verschiedene bakterielle Erreger bedingten Pneumonien beim Schwein, Rind und Menschen (FLIGGER et al. 1999; RADI et al. 2001; CHO u. CHAE 2002; CHO u. CHAE 2003a; PALMER et al. 2007) geht man davon aus, dass diese Produkte an der Entstehung der pneumonischen Veränderungen beteiligt sind. Untersuchungen an isolierten, bovinen Alveolarmakrophagen haben gezeigt, dass diese nach Stimulation mit M. bovis NO produzieren (JUNGI et al. 1996a). Über eine möglicherweise in vivo stattfindende Bildung derartiger Produkte im Lungengewebe von mit M. bovis infizierten Kälbern und deren Beteiligung an der Entstehung der Lungenläsionen gibt es bislang keine Erkenntnisse. 2 Einleitung Ziel dieser Arbeit war es, die bei experimentell mit M. bovis infizierten Kälbern auftretenden unterschiedlichen Lungenveränderungen hinsichtlich der Expression von iNOS, NT und Mn-SOD immunhistochemisch zu untersuchen. Des Weiteren sollten die das Lungengewebe infiltrierenden Makrophagenpopulationen semiquantitativ und unter Verwendung spezifischer Phagozytenmarker (S100A8, S100A9, CD68) charakterisiert werden. Literaturübersicht 3 2 Literaturübersicht 2.1 Mykoplasmen 2.1.1 Erregereigenschaften Taxonomisch werden Mykoplasmen in die Klasse der Mollicutes (lat. mollis – weich, cutis – Haut) eingeordnet, die vier Ordnungen umfasst. Die Gattung Mycoplasma zählt zur Familie der Mycoplasmataceae und zur 1. Ordnung der Mycoplasmatales (TULLY et al. 1993; BOONE et al. 2001). Mykoplasmen sind äußerst kleine (0,3 – 0,8 µm), selbstständig vermehrungsfähige, pleomorphe Bakterien (RAZIN 1992). Aufgrund ihrer geringen Größe und der fehlenden Zellwand ist eine Filtration durch Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm möglich (HAHN 2000). Das Genom entstand während der Evolution vermutlich aus einer Reduktion ehemals Grampositiver Bakterien (WOESE 1987). Mykoplasmen haben daher eingeschränkte Stoffwechsel- und Biosynthesewege, was der Grund für eine überwiegend parasitäre Lebensform ist (RAZIN 1992; RAZIN et al. 1998). Auf Grund dessen kommt es häufig zu Problemen bei der Kultivierung dieser anspruchsvollen Bakterien, und die Anzucht bedarf spezieller Nährmedien. Auf festen Nährböden zeigen Mykoplasmen ein charakteristisches Wachstum in Form von spiegeleiförmigen Kolonien von bis zu 600 μm Durchmesser (HAYFLICK 1969). Mykoplasmen sind unter bestimmten Bedingungen in der Lage, verzweigte und unverzweigte, bis zu 150 μm lange Filamente auszubilden. Dieses pilzartige Wachstum führte zur Namensgebung dieser prokaryotischen Bakterienspezies (gr. myco – Pilz, plasma – Form) (RAZIN 1981). Die meisten Mykoplasmen sind unbeweglich, jedoch konnte bei einigen Arten eine aktive, gleitende Bewegung nachgewiesen werden (KIRCHHOFF 1992). Außerhalb des Wirtes besitzt M. bovis die Fähigkeit, einen Biofilm zu bilden, der das Bakterium vor hohen Temperaturen und Austrocknung schützt, ohne seine Antibiotikaresistenz zu mindern (McAULIFFLE et al. 2006; PEREZ-CASAL u. PRYSLIAK 2007). Die Bildung eines Biofilms könnte außerdem innerhalb des Wirtes eine Erregerpersistenz begünstigen. Zusätzlich sind Biofilme in der Lage, Phagozyten anzulocken, aber deren phagozytäre Eigenschaften zu hemmen. Folglich können die freigesetzten 4 Literaturübersicht Enzyme der Phagozyten Schäden im umliegenden Wirtsgewebe verursachen und die Infektion aufrechterhalten (McAULIFFLE et al. 2006). 2.1.2 Pathogenitätsmechanismen Viele Mykoplasmen besitzen eine starke Affinität zu den Schleimhautoberflächen des Respirations- und Urogenitaltraktes, wobei sie Kapsel- und Adhärenzstrukturen aufweisen, die zu einer engen Anlagerung der Mykoplasmen an die Wirtszellmembran führen (RAZIN u. JACOBS 1992; SACHSE et al. 1996; RAZIN et al.1998). Da Mykoplasmen keine Zellwand besitzen, sind sie durch gegen Bakterien gerichtete, lysosomale Enzyme des Wirtsorganismus nicht angreifbar (BREDT 1976; RAZIN et al. 1998). Da sie keine Zellwand synthetisieren können, besitzen sie eine natürliche Resistenz gegenüber bestimmten Antibiotika (z.B. β-Lactam-Antibiotika), die an der Zellwandsynthese angreifen (EDWARD u. FREUNDT 1969; RAZIN u. FREUNDT 1984). Weitere Pathogenitätsmechanismen stellen die Hemmung der ziliären Aktivität des Wirtsgewebes, die unspezifische Aktivierung von T- und/oder BLymphozyten, die Suppression von neutrophilen Granulozyten, Lymphozyten und Makrophagen sowie die Antigenvariation dar, durch die Mykoplasmen in der Lage sind, die wirtseigene Abwehr zu unterlaufen (GARBRIDGE et al. 1985; WATSON et al. 1988; CHRISTIANSEN et al. 1990; MOSIER 1997). Einige Mykoplasmen zeigen eine ausgeprägte Variabilität der Oberflächenproteine (variable surface proteins, Vsp), die zu einer ständigen Änderung antigener Strukturen führt, wie sie beispielsweise für Mycoplasma (M.) hyorhinis und M. bovis beschrieben wurden (ROSENGARTEN u. WISE 1991; ROSENGARTEN et al. 1994; ROSENGARTEN et al. 2000; RAZIN et al. 1998). Durch eine Adhäsion an die Wirtszelle mittels 13 verschiedener Adhäsionsmoleküle ist M. bovis in der Lage, die Immunabwehr des Wirtes zu hemmen (ROSENGARTEN et al. 2000; PEREZ-CASAL u. PRYSLIAK 2007). Als Virulenzfaktor wird die Bildung von Cytadhäsin diskutiert (SACHSE et al. 1993; SACHSE 1994; RAZIN et al. 1998). Schon BREDT (1976) vermutete, dass die im Rahmen einer Mykoplasmen-Infektion entstehenden Läsionen im Wirtsgewebe möglicherweise eher durch die Abwehrmechanismen des Wirtes verursacht werden, als durch eine Mykoplasmen-vermittelte Gewebezerstörung. RAZIN et al. (1998) Literaturübersicht 5 beschreiben die Fähigkeit von Mykoplasmen, die Immunantwort des Wirtes durch Induktion von Zytokinen, Hemmung oder Stimulation von T- und B-Lymphozyten, Steigerung der Zytotoxizität von Makrophagen und natürlichen Killerzellen sowie Aktivierung der Komplementkaskade Zellrezeptoren zu modulieren. Für und Verstärkung einige der Expression Mykoplasmenspezies ist von ein Substanzverzehr der Aminosäure L-Arginin beschrieben, allerdings wird M. bovis diese Eigenschaft nicht zugeschrieben (RAZIN et al. 1998; THOMAS et al. 1990). GEARY et al. (1981) beschreiben ein von M. bovis gebildetes Polysaccharidtoxin. RAZIN et al. (1998) sind der Ansicht, dass Mykoplasmen keine Toxine bilden können, beschreiben jedoch durch den Metabolismus dieser Bakterien anfallende toxische Nebenprodukte wie Hydrogenperoxid und Superoxid-Radikale, die in Verdacht stehen, die Wirtszellmembranen oxidativ zu schädigen. 2.1.3 Mycoplasma bovis-Infektion des Rindes HALE et al. (1962) gelang 1961 die Erstisolierung von M. bovis aus einem schweren Mastitisfall. Eine durch internationale Tiertransporte verstärkte Erregerstreuung in viele Länder, unter anderem nach Deutschland im Jahr 1977, wurde anschließend beschrieben und ging mit hohen, wirtschaftlichen Verlusten einher (NICHOLAS u. AYLING 2003). Heute ist M. bovis die am weitesten verbreitete pathogene Mykoplasmenart in Europa und Nordamerika, die Mastitiden bei Milchvieh sowie Arthritiden und enzootische Pneumonien bei Kälbern und Jungrindern verursacht (GOURLAY et al. 1989; PFÜTZNER u. SACHSE 1996). M. bovis wird als primärer Wegbereiter für andere, bakterielle Keime wie Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica, Histophilus somni und Arcanobacterium pyogenes häufig übersehen, da eine Isolierung von M. bovis spezielle Nährmedien erfordert und dieser Erreger in der Routinediagnostik daher häufig nicht erfasst wird (ARCANGIOLI et al. 2007; HEWICKER-TRAUTWEIN et al. 2003; NICHOLAS u. AYLING 2003). M. bovis gilt als streng wirtsspezifisch, wobei natürliche Infektionen sowohl bei Rindern, als auch bei Schafen nachgewiesen werden (PFÜTZNER u. SACHSE 1996). RODRĺGUEZ et al. (2000) bechreiben zudem eine erfolgreiche, experimentelle Infektion bei Ziegen. Bakteriologische Untersuchungen an klinisch gesunden Kälbern und Rindern haben 6 Literaturübersicht gezeigt, dass M. bovis über Monate und Jahre im Respirationstrakt beherbergt werden kann und mit dem Nasenschleim ausgeschieden wird (PFÜTZNER u. SACHSE 1996). Die Entstehung von Polyarthritiden bei Kälbern und Rindern ist auf eine hämatogene Streuung des Erregers infolge einer Bronchopneumonie zurückzuführen, weshalb ROMAVÁRY et al. (1979) für dieses Krankheitsbild die Bezeichnung „Pneumonie-Arthritis-Syndrom“ einführten. Außer Mastitiden, Pneumonien und Arthritiden zählen noch Orchitis, Vesikulitis, Endometritis, Salpingitis, Aborte, Retentio secundinarum, Keratokonjunktivitis, Otitis media, Meningitis und subkutane Dekubitalabszesse zu den Erkrankungen, die durch M. bovis ausgelöst werden können (ADEGBOYE et al. 1995; GOURLAY et al. 1989). 2.1.3.1 Infektion des Respirationstraktes Die ersten klinischen Symptome einer respiratorischen Erkrankung treten zwischen der ersten und der dritten Lebenswoche auf und erreichen ihr Maximum nach zehn bis fünfzehn Tagen nach der Infektion. Die klinische Symptomatik ist gekennzeichnet durch Husten, Dyspnoe und Nasenausfluss unterschiedlicher Stärke. Fieber, Inappetenz und allgemeine Schwäche sowie Gewichtsverlust treten ebenfalls bei der Mehrzahl der erkrankten Tiere über mehrere Tage hinweg auf (BOCKLISCH et al. 1983; STIPKOVITS et al. 2000b). Die in der Lunge von Kälbern im Rahmen einer spontanen oder experimentellen Infektion mit interstitiellen M. bovis beschriebenen pneumonischen Lungenläsionen Veränderungen, variieren zwischen katarrhalisch-eitrigen Bronchopneumonien bis hin zu schwerwiegenden Pneumonien, bei denen obliterierende Bronchiolitiden und multiple Nekroseherde im Lungenparenchym auftreten (THOMAS et al. 1975; GOURLAY et al. 1989; ADEGBOYE et al. 1995; RODRÍGUEZ et al. 1996; HEWICKER-TRAUTWEIN et al. 2002; BUCHENAU 2003). Bei der histologischen Untersuchung finden RODRĺGUEZ et al. (1996) exsudative Bronchopneumonien, von Entzündungszellen umgebene Koagulationsnekrosen und eitrige Bronchiolitiden. Die bronchiolären und alveolären Lumina sind mit einem purulenten Exsudat gefüllt, das Makrophagen, neutrophile Granulozyten und Zelldetritus enthält. Peribronchiolär verzeichnen RODRĺGUEZ et al. (1996) eine Literaturübersicht mononukleäre Bronchiolitis, 7 Zellinfiltration die durch im Zusammenhang Infiltration des mit einer Bronchialepithels nekrotisierenden mit neutrophilen Granulozyten und Makrophagen gekennzeichnet ist. Die Alveolarsepten sind durch Ödeme und Entzündungszellinfiltrate verdickt, und in den Alveolarräumen finden sich Ansammlungen von Makrophagen und neutrophilen Granulozyten. Die Koagulationsnekrosen sind zentral durch ein amorphes, eosinophiles Material gekennzeichnet, das von einem schmalen Saum aus zerfallenden Zellen und einem breiteren Saum aus Makrophagen und Plasmazellen umgeben wird. RODRĺGUEZ et al. (1996) beschreiben Makrophagen als die hauptsächlich beteiligten Entzündungszellen in den Alveolen des entzündlich veränderten Lungengewebes bei Kälbern nach Infektion mit M. bovis. ADEGBOYE et al. (1995) beschreiben in einer histologischen Studie durch M. bovis hervorgerufene Lungenveränderungen, die durch ödematisierte und mit Entzündungszellen infiltrierte Alveolarsepten, eine Füllung der Bronchiolen und der Alveolearräume mit zerfallenden, neutrophilen Granulozyten und Makrophagen sowie eine graduell unterschiedliche, peribronchioläre, lymphozytäre Hyperplasie charakterisiert sind. Multipel auftretende Abszesse mit zentralem, nekrotischem Material sind von einer pyogranulomatösen Entzündung und dichten Bindegewebswällen umgeben (ADEGBOYE et al. 1995). KHODAKARAM-TAFTI u. LÓPEZ (2004) unterscheiden in einer histologischen Studie zwei unterschiedliche Nekrosetypen in Lungen von Kälbern mit natürlicher M. bovis-Infektion, die gleichzeitig in den Lungen der Tiere beobachtet wurden. Zum einen werden große, irreguläre Koagulationsnekrosen festgestellt, die von einem Saum aus zerfallenden, neutrophilen Granulozyten umgeben werden. Der zweite Nekrosetyp ist durch runde, verkäsende Areale, die aus granulärem, eosinophilem Material bestehen, charakterisiert. Diese Nekroseareale werden von einem Saum aus Granulationsgewebe umrandet. M. bovis-Antigen konnte in den Nekrosen, dem peribronchiolären lymphatischen Gewebe sowie in alveolären und interstitiellen Makrophagen immunhistochemisch nachgewiesen werden. KHODAKARAM-TAFTI u. LÓPEZ (2004) gehen davon aus, dass beide Nekrosetypen primär durch M. bovis verursacht werden, allerdings muss beim Vorliegen von Koagulationsnekrosen eine 8 Literaturübersicht Koinfektion mit Mannheimia und haemolytica Histophilus somni differentialdiagnostisch berücksichtigt werden. Bei Kälbern, die experimentell mit M. bovis-Stämmen infiziert wurden, konnten ähnliche klinische Symptome ausgelöst werden, wie sie bei einer natürlichen Infektion mit M. bovis beschrieben werden (GOURLAY et al. 1976; RODRĺGUEZ et al. 1996). Die pathologisch-anatomischen Lungenveränderungen sind in der Studie von MARTIN et al. (1983) hauptsächlich durch eine Verfestigung des Lungenparenchyms der Spitzenlappen sowie der kranioventralen Anteile der Hauptlappen gekennzeichnet. Histologisch zeigen die Kälber dieser Studie ein überwiegend aus neutrophilen Granulozyten bestehendes Exsudat in den Bronchiallumina. Akzentuiert um die Bronchien wird eine interstitielle Pneumonie sowie eine Proliferation der Lymphfollikel des Bronchus-assoziierten lymphatischen Gewebes (BALT) verzeichnet. Tiere mit schwerwiegenderen Läsionen zeigen teilweise konfluierende, katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonien, lobuläre eitrige Bronchopneumonien mit Tendenz zur Gewebseinschmelzung sowie fibrinöse Exsudationen und Abszessbildungen. In diesen Fällen werden außer M. bovis meist noch weitere Bakterien wie Mannheimia haemolytica aus den veränderten Lungenarealen isoliert. HOWARD et al. (1983, 1987a,b) und STIPKOVITS et al. (2000a) können bei experimentell infizierten Kälbern Koagulationsnekrosen nachweisen, deren Zentrum von einem schmalen Saum zerfallender Zellen und einem breiteren Saum von mononukleären Entzündungszellen umschlossen wird. THOMAS et al. (1986) beschreiben gleichartige Nekrosen sowie große Nekroseareale mit Überresten von Alveolen und kleinen Bronchioli, die als „ghost lung structures“ bezeichnet werden. Von den genannten Autoren wird eine unterschiedlich ausgeprägte Hyperplasie des BALT beschrieben. Umgibt das BALT die Bronchien oder Bronchioli vollständig, wird von einer cuff-Bildung gesprochen (BRYS et al. 1989; RODRĺGUEZ et al. 1996). STIPKOVITS et al. (2000a) stellen außerdem mikroskopisch Zellverluste sowie degenerative Veränderungen zilientragender Bronchialepithelzellen bei experimentell mit M. bovis infizierten Kälbern fest. Literaturübersicht 2.2 9 Makrophagen in der Lunge Pulmonale Makrophagen besitzen wichtige phagozytäre, mikrobizide und sekretorische Funktionen und spielen eine Rolle bei der Entstehung von Entzündungen und der Immunabwehr in der Lunge (NELSON u. SUMMER 1998; ZHANG et al. 2000). Makrophagen sind ein Teil der angeborenen und der erworbenen Immunabwehr in der Lunge und tragen dazu bei, Mikroorganismen zu eliminieren (DECLAUX u. AZOULAY 2003). Im adulten Lungengewebe werden Makrophagen je Makrophagentypen nach ihrer eingeteilt: anatomischen Pulmonale, Lokalisation alveoläre in verschiedene Makrophagen (PAMs), pulmonale, intravaskuläre Makrophagen (PIMs) und interstitielle Makrophagen (PABST 1996; POULTER 1997; DECLAUX u. AZOULAY 2003). Interstitielle Makrophagen können zu PAMs werden, wenn sie aus dem Septum interalveolare in die Alveolarräume einwandern. PAMs und Makrophagen in den Luftwegen sind in der Lage, wieder in das Lungenparenchym zurückzuwandern, sich durch das Lungengewebe zu bewegen oder durch die Lymphgefäße in die Lungenlymphknoten zu migrieren (STAUB 1994; POULTER 1997). Die Makrophagenpopulation der Lunge ist demnach nicht stationär, sondern besitzt motile Kapazitäten. PIMs sind in den Lungenkapillaren von Rindern, Schafen, Ziegen, Schweinen, Pferden und Katzen, jedoch nur selten beim Menschen und bei Ratten zu finden (CHITKO-McKOWN et al. 1991; CHITKO-McKOWN 1992; STAUB 1994; PABST 1996; POULTER 1997; CARRASCO et al. 2004; PARBHAKAR et al. 2004; SINGH et al. 2004). PIMs befinden sich in den Kapillargefäßen im Septum interalveolare der Lunge. Von dort können sie in die Interalveolarsepten und in die Alveolarräume auswandern. Ein Teil der PIMs verbleibt im Lumen der kleinen Kapillargefäße der interalveolären Septen und wandert durch die Mikrozirkulation in den systemischen Kreislauf. Bei akuter oder chronischer Endotoxinbelastung werden die PIMs aktiviert und sind in der Lage, sich temporär an das Endothel der Kapillaren zu heften und Phagozytose zu betreiben (STAUB 1994; PABST 1996; SINGH et al. 2004). ATWAL et al. (2001) zeigen in einer ultrastrukturellen Untersuchung, dass bovine PIMs 10 Literaturübersicht adhäsive Verbindungen (adhesive junctions) mit den Endothelzellen der Lunge eingehen und sich diese pulmonalen Mikrokapillaren insbesondere im Septum interalveolare befinden. ACKERMANN et al. (1994) und THOMASMEYER (2006) weisen PIMs in den Kapillaren der interalveolären Septen und PAMs in Alveolarräumen immunhistochemisch mit dem Makrophagenmarker CD68 in der bovinen Lunge nach. In vitro-Untersuchungen zeigen, dass bovine und caprine PIMs Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α), Interleukin-1 (IL-1) und Arachidonsäure- metaboliten sezernieren (CHITKO-McKOWN et al. 1992; SINGH et al. 2004). SINGH et al. (2004) stellen fest, dass PIMs bei Kälbern in vivo nach einer Infektion mit Mannheimia haemolytica TNF-α sezernieren und durch das Anlocken von Entzündungszellen eine akute Pneumonie auslösen. PAMs stellen die erste Abwehr gegen Lungenerkrankungen dar, die durch infektiöse Erreger oder inhalierte Partikel hervorgerufen werden (COONROD 1989; LI et al. 1997; POULTER 1997; DECLAUX u. AZOULAY 2003). Wenn kleine, inhalierte Partikel bis in die Alveolarräume der Lunge gelangen, treffen sie dort auf PAMs, die diese Partikel erkennen und phagozytieren (POULTER 1997; DECLAUX u. AZOULAY 2003). Dieser Prozess wird zum Teil durch Makrophagenrezeptoren vermittelt, die terminale Mannose-Zucker-Moleküle von Mikroorganismen erkennen können. PAMs exprimieren den Rezeptor C3b, der die Komplementkaskade und Fibronektin-Rezeptoren aktiviert. Fibronektin-Rezeptoren können PAMs dazu befähigen, sich um die Alveolen und den Bronchialbaum zu bewegen, da Bronchialepithelzellen Fibronektin sezernieren können (POULTER 1997; ZHANG et al. 2000). Den PIMs werden, im Gegensatz zu den PAMs, eher zytolytische Eigenschaften zugesprochen. PAMs hingegen besitzen hauptsächlich phagozytäre Fähigkeiten (CHITKO-McKOWN et al. 1991; PABST 1996). Neben diesen können PAMs durch bakterielle Produkte indirekt stimuliert werden und proinflammatorische Zytokine wie IL-8, IL-1β und TNF-α sezernieren (DECLAUX u. AZOULAY 2003). TNF-α initiiert die Aufregulierung von Adhäsionsmolekülen, die in der Lage sind, neutrophile Granulozyten aus den Lungengefäßen in die Alveolarräume zu locken (ZHANG et al. 2000; NELSON 2001; DECLAUX u. AZOULAY 2003). TNF-α und IL1β können außer ihren direkten, chemotaktischen Fähigkeiten ebenso die Produktion Literaturübersicht 11 von IL-8, dem wichtigsten chemotaktischen Faktor für neutrophile Granulozyten, in Alveolarmakrophagen, Typ II-Pneumozyten und Fibroblasten der Lunge induzieren (WARE u. MATTHAY 2000; DECLAUX u. AZOULAY 2003). Makrophagen, insbesondere die der Luftwege, sind in der Lage, reaktive Sauerstoffspezies wie Stickstoffmonoxid (NO) zu bilden und in ihrer unmittelbaren Umgebung freizusetzen (MONCADA u. HIGGS 1993; POULTER 1997; WIDDISON et al. 2007). NO ist ein zusätzlicher Mediator der angeborenen Immunabwehr und kann in die Zytokinsynthese der Alveolarmakrophagen eingreifen. Alveolarmakrophagen antworten auf virale Infektionen, indem sie Interferon-α und -β sezernieren, um eine virale Infektion der umliegenden Zellen zu verhindern (POULTER 1997). Makrophagen spielen auch bei der erworbenen Immunantwort eine wichtige Rolle in der Lunge. Pulmonale Makrophagen werden durch Interferon-γ (IFN-γ), IL-3, IL-4 und GM-CSF (granulocyte-macrophage colony stimulating factor), welcher von lokalen, aktivierten T-Zellen produziert wird, stimuliert und in die Lage versetzt, ihre mikrobiziden Kapazitäten zu entfalten. Die Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies von Makrophagen wird durch IFN-γ, GM-CSF, TNF-α, dem Leukotrien LTB4 und IgGImmunkomplexe gesteuert und unterstützt (LOHMANN-MATTHES et al. 1994). LTB4 wiederum besitzt eine starke chemotaktische Wirkung auf neutrophile Granulozyten (WHITELEY et al. 1991). Reaktive Sauerstoffspezies können eine Entzündung unterhalten und lokale Gewebeschädigungen verursachen. Prostaglandine, Thromboxane und Leukotriene werden ebenfalls von aktivierten Makrophagen sezerniert und induzieren eine akute Entzündungsantwort, indem sie polymorphkernige Zellen anlocken (POULTER 1997). Aktivierte PAMs setzen IL-8 und MIP 1 und 2 (macrophage inflammatory proteins) frei, welche eine chemotaktische Wirkung auf polymorphkernige Leukozyten ausüben. Andere Zytokine wie TGF-β (transforming growth factor-β), TNF-α und Fibronektin regen die Proliferation von Fibroblasten an (GORDON et al. 1992). In vitro-Untersuchungen zeigen, dass bovine PAMs nach einer Stimulation mit bakteriellem Lipopolysaccharid (LPS) größere Mengen an TNF-α und Stickstoffmonoxid (NO) bilden als PIMs. 12 Literaturübersicht Unstimulierte bovine PIMs und PAMs sezernieren TNF-α und NO dagegen in gleichen Mengen (CHITKO-McKOWN et al. 1992). 2.3 Induzierbare Stickoxid-Synthase, Nitrotyrosin, Mangan- Superoxid-Dismutase 2.3.1 Induzierbare Stickoxid-Synthase Stickstoffmonoxid (NO) ist ein kleines Molekül, dessen Freisetzung aus Endothelzellen erstmals 1987 beschrieben wurde (PALMER et al. 1987). Es konnte gezeigt werden, dass NO mit dem seit Anfang der 80er Jahre bekannten „endothelium-derived relaxing factor“ identisch ist (MONCADA et al. 1991). Seine ungerade Elektronenzahl macht NO zu einer äußerst reaktiven Verbindung mit Radikalcharakter (BECKMANN u. KOPPENOL 1996). NO wird aus der Aminosäure L-Arginin durch die NO-Synthasen (NOS) synthetisiert. Es werden insgesamt drei verschiedene Isoformen (Typ I bis III) von NO-Synthasen unterschieden (MONCADA u. HIGGS 1993; DONNELLY u. BARNES 2002). Die neuronale NO-Synthase (nNOS, Typ I) und die endotheliale NO-Synthase (eNOS, Typ III) zählen zu den konstitutiven NO-Synthasen und sind beide Ca2+-abhängig, das heißt sie werden durch einen erhöhten Kalziumspiegel induziert. Die dritte Isoform ist die Ca2+unabhängige, induzierbare NO-Synthase (iNOS, Typ II), die in Entzündungen durch proinflammatorische Zytokine, immunologische Stimuli, Bakterien, bakterielle Produkte oder Verbindungen wie Lipopolysaccharide (LPS) überwiegend durch Transkriptionsinduktion aktiviert wird (KNOWLES u. MONCADA 1994; MacMICKING et al. 1997; DONNELLY u. BARNES 2002). Zu den proinflammatorischen Zytokinen, die eine iNOS-Produktion triggern und somit zu einer erheblichen Freisetzung von NO führen, gehören vor allem TNF-α, IL-1β und IFN-γ (ROBBINS et al. 1994). NO wird während der Immunabwehr von iNOS in aktivierten Makrophagen in großen Mengen produziert, da es zytotoxische Eigenschaften besitzt und ihm eine wichtige Rolle bei der Immunabwehr, der Apoptoseregulation und dem Abtöten intrazellulärer Pathogene zugesprochen wird (MONCADA u. HIGGS 1993; WIDDISON et al. 2007). NO besitzt außerdem ein breites Spektrum an antimikrobiellen Fähigkeiten und wird Literaturübersicht 13 von Epithelzellen des Respirationstraktes und von Entzündungszellen synthetisiert (BOGDAN 2001; DECLAUX u. AZOULAY 2003). 2.3.1.1 Reaktive Sauerstoffspezies Zu den reaktiven Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS) gehören freie Radikale wie das Superoxid-Anion O2.-, das hochreaktive Hydroxyl-Radikal OH., das Peroxylradikal LOO. und das Alkoxylradikal LO. von Lipiden sowie stabile molekulare Oxidantien wie Wasserstoffperoxid (H2O2), Lipidhydroxyperoxid (LOOH), Ozon (O3) und die Hypochlorige Säure OCl- und angeregte Sauerstoffmoleküle (SingulettSauerstoff 1O2). Im Organismus entstehen reaktive Sauerstoffspezies (vor allem NO) in den Mitochondrien als Nebenprodukt der Zellatmung, aber auch durch Entzündungszellen, um so Viren und Bakterien zu schädigen (RUTKOWSKI et al. 2007). ROS können unter anderem über den Argininstoffwechsel entstehen (Abbildung 1), wobei L-Arginin von der durch Zytokine induzierbaren NOS zu NO und Citrullin metabolisiert wird (MONCADA u. HIGGS 1993). NO bildet mit Superoxid (O2˙-) das reaktive Peroxynitritanion ONOO-, welches die Oxidantien ۟OH und NO2 bilden kann. Reagiert das Peroxynitritanion mit der Aminosäure Tyrosin, entsteht Nitrotyrosin (NT) (ISCHIROPOULOS et al. 1992; BECKMANN u. KOPPENOL 1996). Peroxynitrit wird zusammen mit NO als reaktive Stickstoffspezies (reactive nitrogen species, RNS) bezeichnet. ROS und RNS sind somit wichtige Oxidantien, denen im Körper z.B. antioxidative Enzyme wie die Superoxid-Dismutasen (SOD) entgegenwirken (PRYOR et al. 2006; RUTKOWSKI et al. 2007). iNOS ist in der Lage, große Mengen an NO zu produzieren, welches mit Superoxid reagieren kann und zu Peroxynitrit umgewandelt wird. Peroxynitrit ist ein äußerst stabiles Oxidans, das zytotoxische Eigenschaften besitzt (ISCHIROPOULOS et al. 1992; BECKMANN u. KOPPENOL 1996). Es wird diskutiert, dass Peroxynitrit die zytotoxischen Effekte des NO vermittelt und somit eine schädigende Wirkung auf Proteine und Zellmembranbestandteile, eisenhaltige Enzyme der Atmungskette und die DNA ausübt sowie durch S-Nitrosylierung irreversible Proteinmodifikationen hervorrufen kann (MASON et al. 1997). ROS können durch antioxidative Enzymsysteme, wie z.B. SOD, die jede Zelle zum Schutz vor Oxidationsreaktionen in unterschiedlich hohen 14 Literaturübersicht Konzentrationen besitzt, abgefangen werden (BECKMANN u. KOPPENOL 1996; PRYOR et al. 2006). Entsteht eine überschießende Produktion von Peroxynitrit durch die oben genannten Mechanismen, ist die SOD kaum noch in der Lage, Peroxynitrit zu neutralisieren. Das Gleichgewicht im Körper verschiebt sich dann zugunsten der oxidationsfördernden Prozesse (BECKMANN u. KOPPENOL 1996; VAN DER VLIET et al. 1999), und es kommt zum sogenannten oxidativen Stress (oxidative stress; respiratory burst). Abbildung 1: Bildung reaktiver Sauerstoff- bzw. Stickstoffverbindungen (modifiziert nach: FORMAN u. TORRES 2001) NADPH = Nicotinamidadenindinukleotidphosphat; O2 = Sauerstoff; O2.- = Superoxid; H+ = Wasserstoff; . NO = Stickstoffmonoxid; H2O2 = Wasserstoffperoxid; ONOO¯ = Peroxynitrit 2.3.2 Nitrotyrosin Nitrotyrosin (NT) ist eine stabile Verbindung, die durch die Reaktion von Peroxynitrit mit der in Proteinen vorkommenden Aminosäure Tyrosin gebildet wird. Diese Reaktion geschieht entweder spontan oder wird durch die Superoxid-Dismutase katalysiert (ISCHIROPOULOS et al. 1992). Der Nachweis von NT stellt einen wichtigen Marker für in vivo entstandenes Peroxynitrit dar und kann somit als Indikator für oxidativen Stress angesehen werden (ISCHIROPOULOS et al. 1992; BECKMANN u. KOPPENOL 1996; VAN DER VLIET et al. 1999). Das durch die Literaturübersicht 15 Reaktion von Superoxid und NO entstehende Peroxynitrit modifiziert als starkes Oxidans Tyrosin-Reste in Proteinen durch die Bindung einer Nitrogruppe (NO2) an eine ortho-Position des Tyrosins. EISERICH et al. (1998) beschreiben noch einen anderen Entstehungsweg von NT durch die Reaktion von Nitrit mit Hypochloriger Säure und durch die Reaktion der Myeloperoxidase mit Hydrogenperoxid. Die so entstehenden, nitrotyrosinylierten Proteine können als 3-Nitrotyrosin immunhistochemisch nachgewiesen werden (ISCHIROPOULOS et al. 1992; BECKMANN u. KOPPENOL 1996). Eine Nitration von Tyrosinresiduen in Proteinen kann deren Funktion beeinträchtigen und Signalübertragungswege beeinflussen (MacMILLAN-CROW et al. 1998). 2.3.3 Mangan-Superoxid-Dismutase Superoxid-Dismutasen sind antioxidantische Enzyme, die eukaryotische Zellen vor der reaktiven Sauerstoffverbindung Superoxid schützen. Superoxid entsteht entweder als Nebenprodukt der Atmungskette oder über den Argininstoffwechsel (Kapitel 2.3.1.1; ISCHIROPOULOS et al. 1992; MONCADA u. HIGGS 1993; BECKMANN u. KOPPENOL 1996). Die oxidierte Form des Enzyms reagiert mit einem Superoxidion unter Bildung von Sauerstoff und der reduzierten Form des Enzyms. Diese Form reagiert weiter mit einem zweiten Superoxidion und zwei Protonen, wobei Wasserstoffperoxid sowie die oxidierte Form des Enzyms entstehen. ISCHIROPOULOS et al. (1992) beschreiben die Superoxid-Dismutase als Katalysator bei der Nitration von Tyrosin durch Peroxynitrit. Drei Formen der Superoxid-Dismutase werden beim Menschen beschrieben: Die zytosolische Superoxid-Dismutase (CuZn-SOD, SOD 1), die mitochondriale Superoxid-Dismutase (Mn-SOD, SOD 2) und die extrazelluläre Superoxid-Dismutase (EC-SOD, SOD 3) (McCORD u. FRIDOVICH 1969; WEISINGER u. FRIDOVICH 1973; FRIDOVICH 1986). Nitration und Inaktivierung der Mn-SOD bewirken einen dramatischen Anstieg des mitochondrialen Superoxids, der wiederum zu einem ansteigenden Peroxynitritlevel führt und somit eine verstärkte Nitration und Oxidation anderer mitochondrialer Proteine bewirkt (MacMILLAN-CROW et al. 1998). 16 2.4 Literaturübersicht iNOS, NT und Mn-SOD im Respirationstrakt 2.4.1 iNOS im Respirationstrakt Die iNOS ist kalziumunabhängig und wird durch inflammatorische Stimuli wie Zytokine und Interleukine, immunologische Stimuli sowie bakterielle Produkte induziert (XIE et al. 1992; KNOWLES u. MONCADA 1994). iNOS kommt u.a. in Makrophagen des Menschen, der Maus, der Ratte, des Pferdes, des Rindes, der kleinen Wiederkäuer und des Huhnes vor (MacMICKING et al. 1997). XIE et al. (1992) beschreiben das Vorkommen von iNOS in immunstimulierten Mäusemakrophagen und folgern, dass Makrophagen die prototypischen Zellen sind, die iNOS exprimieren. In Makrophagen von Ratten kann eine NO-Synthase isoliert werden, die in Abwesenheit von Kalzium oder Calmodulin eine vollkommene Aktivität zeigt (KNOWLES u. MONCADA 1994). KOBZIK et al. (1993) lokalisieren iNOS in fixiertem, gesundem Lungengewebe von Ratte und Mensch, wobei beide Spezies iNOS im Epithel der Luftwege exprimieren (ASANO et al. 1994; GUO et al. 1995). In der Lunge wird NO eine Funktion als Neurotransmitter, Vaso- und Bronchodilatator sowie eine Effektormolekülfunktion beim Entzündungsprozess zugesprochen (MASON et al. 1997; MacMILLAN-CROW et al. 1998). Alveoläre Makrophagen sind in der Lunge des Menschen ein wichtiger Erzeuger von Zytokinen, die eventuell von NO modifiziert werden (SPERANZA et al. 2007). Mit IL-1β, TNF-α und IFN-γ stimulierte, humane Bronchialepithelzellen exprimieren iNOS und setzen NO in vitro frei (ASANO et al. 1994; ROBBINS et al. 1994; DONNELLY u. BARNES 2002). SHERMAN et al. (1999) beschreiben das Vorkommen von iNOS in der glatten Muskulatur der Lunge und der Lungengefäße sowie im Epithel der oberen und unteren Atemwege in fetalem, neonatalem und adultem Lungengewebe von Lämmern und Schafen und vermuten, dass iNOS eine wichtige Quelle für vom Lungenepithel gebildetes NO ist. RADI et al. (2001) finden eine positive iNOSExpression bei lungengesunden Kälbern in bronchiolären und alveolären Epithelzellen, in Chondrozyten des Bronchialknorpels, in Alveolarmakrophagen sowie in der glatten Muskulatur der Lunge. Literaturübersicht 17 2.4.2 iNOS und bovine Alveolarmakrophagen Bei entzündlichen oder infektiösen Prozessen wird iNOS zur Produktion von NO angeregt. Eine anhaltende Produktion von NO stattet Makrophagen mit zytotoxischen und zytostatischen Eigenschaften gegen Viren, Bakterien, Pilze, Protozoen, Helminthen und Tumorzellen aus (JUNGI et al. 1999). Diese Eigenschaften werden durch andere Produkte von Makrophagen wie Säuren, Glutathion, Cystein, Hydrogenperoxid und Superoxid zusätzlich verstärkt (MacMICKING et al. 1997). WIDDISON et al. (2007) isolieren mittels PCR ein Transkript aus 3471 Basenpaaren von iNOS aus der RNA von bovinen Alveolarmakrophagen, die zuvor mit dem intrazellulären Pathogen Mycobacterium bovis stimuliert wurden. Diese Autoren finden eine enge phylogenetische Beziehung der iNOS-Proteine unterschiedlicher Spezies. Die iNOS des Pferdes besitzt die größte Ähnlichkeit mit der bovinen iNOS, die humanen und kaninen iNOS-Proteine zeigen ebenfalls eine große Übereinstimmung, wobei die humane iNOS der bovinen iNOS ähnlicher ist als der murinen iNOS. Dies bedeutet, dass das Rind möglicherweise ein Modell für iNOS/NO beim Menschen darstellen kann. JUNGI et al. (1996a) kultivieren bovine Makrophagen unterschiedlicher Herkunft (Kochenmark, BAL und peripheres Blut) und zeigen, dass diese bei bestimmter Stimulation durch bakterielle Produkte und LPS iNOS exprimieren. Unstimulierte, bovine Makrophagen exprimieren größere Mengen iNOS als stimulierte Makrophagen von Ziegen, Menschen, Schweinen und Kaninchen (JUNGI et al. 1996a). In bovinen Alveolarmakrophagen wird eine starke Produktion hoher NO-Konzentrationen nach Stimulation durch verschiedene, pathogene Mykoplasmenstämme von M. mycoides ssp. mycoides SC und M. bovis in vitro festgestellt. Eine Aufregulierung von NO durch einen nicht-pathogenen Mykoplasmenstamm (M. bovirhinis) tritt nicht auf (JUNGI et al. 1996c). Gramnegative und grampositive Bakterien sind in der Lage, eine NO-Synthese in niedrigen Konzentrationen in bovinen, von Monozyten abstammenden Makrophagen zu induzieren, allerdings erweisen sich gramnegative Bakterien als die stärkeren Stimuli. Mit grampositiven Bakterien stimulierte Makrophagen müssen zusätzlich mit IFN-γ kostimuliert werden, um eine adäquate NO-Produktion nachweisen zu können. 18 Literaturübersicht Die Autoren vermuten, dass das LPS gramnegativer Bakterien für die Aktivierung von iNOS in bovinen Makrophagen verantwortlich ist (JUNGI et al. 1999). JUNGI et al. (1997b) untersuchen die Auf- und Abregulierung des durch Listeria monocytogenes stimulierten, von bovinen Makrophagen produzierten NO. ADLER et al. (1996) aktivieren bovine Makrophagen mit LPS oder Salmonella dublin und weisen eine Expression großer Mengen von iNOS-mRNA, iNOS-Protein und iNOSEnzymaktivität in vitro nach, wobei analog kultivierte caprine Makrophagen nur auf LPS mit einer zwar erhöhten, im Gegensatz zu den bovinen Makrophagen allerdings deutlich niedrigeren NO-Freisetzung und Expression von iNOS reagieren. In einem Vergleich der iNOS-Expression von murinen und bovinen Makrophagen nach Stimulation mit Salmonella dublin können ADLER et al. (1995) keine Aktivierung von iNOS durch IFN-γ, TNF-α, IL-1 und IL-2 in Makrophagen von Rindern feststellen. In bovinen Alveolarmakrophagen lässt sich jedoch eine durch iNOS regulierte Produktion von NO nach Stimulation mit rekombinantem (rb) IFN-γ, rbIL-1β, rbTNF-α und LPS zeigen, wobei IL-4 die iNOS-Expression hemmt (MASON et al. 1996). YOO et al. (1996) finden eine iNOS-Expression und erhöhte Mengen von NO in bovinen Alveolarmakrophagen nach Stimulation durch LPS von einem Pasteurella haemolytica-Stamm (jetzt Mannheimia haemolytica, M. haemolytica nach ANGEN et al. 1999). In Granulomen, die durch Mycobacterium bovis hervorgerufen werden, wird das Makrophagenprotein (natural resistance associated macrophage protein 1, NRAMP1) detektiert, das die Aufregulierung von iNOS bewirkt (ESTRADA-CHÁVEZ et al. 2001; PEREIRA-SUÁREZ et al. 2006). BOGDAN et al. (1997) kommen zu dem Schluss, dass Stimuli verschiedener Bakterien eine unterschiedlich hohe Produktion von iNOS in vitro in pulmonalen Alveolarmakrophagen von Schafen hervorrufen. HICKMAN-DAVIS et al. (1998) finden eine deutlich erhöhte NO-Produktion in Alveolarmakrophagen von Mäusen mit Mycoplasma (M.) pulmonis-Infektion. Sechs Stunden nach Versuchsbeginn kann eine Abnahme der koloniebildenden Einheiten (colony-forming units, CFUs) von M. pulmonis verzeichnet werden, sodass der durch Surfactant-Protein-A vermittelte Abwehrmechanismus möglicherweise durch NO und Peroxynitrit initiiert wird (HICKMAN-DAVIS et al. 1999). Eine in vitro-Produktion von iNOS und eine Bildung von NO durch Alveolarmakrophagen wird außerdem bei Literaturübersicht zahlreichen 19 Erkrankungen wie z.B. Asthma, Tuberkulose und chronischer Pneumonie sowie nach Stimulation mit bakteriellen Proteinen bei verschiedenen Spezies wie Mensch, Ratte und Maus beschrieben (KOBZIK et al. 1993; ROBBINS et al. 1994; NICHOLSON et al. 1996; HICKMAN-DAVIS et al. 1998; DONNELLY u. BARNES 2002; RUBOVITCH et al. 2007). 2.4.3 iNOS im Respirationstrakt bei Pneumopathien Menschen und Labortiere produzieren während einer Infektion stark erhöhte Mengen NO, dessen Synthese durch iNOS katalysiert wird. Eine Stimulation von iNOS erfolgt durch verschiedene Zytokin- und Immunstimuli in infiziertem Gewebe und kann dort direkt nachgewiesen werden (OCHOA et al. 1991; WEINBERG 1999; LOWENSTEIN et al. 1996; NICHOLSON et al. 1996). MASON et al. (1997) und McDERMOTT et al. (1997) finden immunhistochemisch eine deutliche Expression von iNOS und NT in entzündlich verändertem Bronchialepithel und in Entzündungszellen von Menschen mit obliterierender Bronchiolitis nach Lungentransplantation. Das Verteilungsmuster von iNOS ist eng mit den entzündlichen Lungenveränderungen assoziiert, wobei in Arealen mit verändertem, balloniertem Bronchialepithel, Bindegewebsproliferationen und luminaler bindegewebiger Verlegung eine starke iNOS-Expression beobachtet wird. In Lungenparenchymanteilen, im Lumen vieler Luftwege und peribronchiolär zeigt eine große Zahl von Entzündungszellen eine iNOS-positive Reaktion. In vollständig obliterierten Bronchioli ist hingegen keine iNOS-Expression mehr nachweisbar. Das Reaktionsmuster von NT deckt sich in allen Phasen der obliterierenden Bronchiolitis vollständig mit dem von iNOS. MASON et al. (1997) stellen die Hypothese auf, dass die durch iNOS katalysierte Produktion von NO zur Zellschädigung und insbesondere zur Schädigung des Lungenepithels beiträgt, da NT als ein Marker für eine stattgefundene Bildung von Peroxynitrit gelten kann. Auch GABBAY et al. (2000) stellen mittels Immunhistochemie (IHC) eine erhöhte iNOS-Expression im Bronchialepithel und in der Lamina propria in Lungengewebebioptaten von Patienten mit Bronchiolitis obliterans-Syndrom (BOS), oder bakteriell bedingter Pneumonie nach Lungentransplantation im Vergleich zu Lungengewebebioptaten von Patienten 20 Literaturübersicht mit komplikationsloser Transplantation fest. Ebenso ist bei diesen Patienten ein Anstieg von NO in der Atemluft gemessen worden, welcher präventiv als Indikator für ein beginnendes BOS genutzt werden könne. Auch andere Autoren beschreiben, dass der in der Atemluft gemessene Gehalt an NO am höchsten bei Patienten mit akutem BOS ist und wieder abnimmt, je länger die Erkrankung besteht (FISHER et al. 1998). Im Lungengewebe von Patienten mit akuter Abstoßungsreaktion wird keine aufregulierte iNOS-Reaktion im Bronchialepithel verzeichnet (MASON et al. 1997). FACCHETTI et al. (1999) finden eine immunhistochemisch positive iNOS- und NTExpression in epitheloiden Zellen und mehrkernigen Riesenzellen bei Patienten mit Lungengranulomen unterschiedlichster Ätiologie (Tuberkulose, Sarkoidose, Toxoplasmose, Kryptokokkose, Leishmaniose und Bartonellose). Da mittels einer RT-Polymerase-Kettenreaktion (real time-polymerase chain reaction, RT-PCR) die Zytokine IFN-γ, IL-2 und TNF-α nachgewiesen werden können, liegt eine von THelferzellen-1 (Th-1) stimulierte Immunantwort und iNOS-Induktion nahe. Zytokine der T-Helferzellen-2 (Th-2), wie z.B. IL-4 unterdrücken dagegen eine iNOSExpression. CHOI et al. (2002) untersuchen das Vorkommen von iNOS und NT mittels Immunhistochemie in humaner, pulmonärer Tuberkulose und weisen eine Expression in epitheloiden Makrophagen und Riesenzellen der tuberkulösen Granulome sowie in Alveolarmakrophagen und Epithelzellen in Lungenregionen mit Pneumonie nach. Gleichzeitig wird in diesen Zellen eine Expression von TNF-α verzeichnet. Bei experimentell mit Mycobacterium tuberculosis infizierten Mäusen können ARRIAGA et al. (2002) mittels RT-PCR hohe Mengen von TNF-α, iNOS, IL-2 und IFN-γ ermitteln. HERNANDEZ-PANDO et al. (2001) detektieren immunhistologisch iNOS- und NT-positive Makrophagen in Lungengranulomen von Mäusen in der frühen Infektionsphase der Tuberkulose. In der späten Phase der Infektion werden Lungennekrosen beobachtet, die eine verminderte iNOS- und eine erhöhte NT-Expression zeigen. SPEYER et al. (2003) beschreiben eine verstärkte Entzündungsantwort in mit LPS inokulierten iNOS-knockout Mäusen (iNOS¯/¯) und vermuten, dass iNOS eine Rolle bei der Zytokin-Regulierung der pulmonalen Immunantwort spielen müsse. Bei Mäusen mit Asthma wird von TAKEMOTO et al. (2007) eine verstärkte, immunhistologische Expression von iNOS in infiltrierenden Literaturübersicht 21 Granulozyten und Bronchialepithelzellen gezeigt. Für NT sind außerdem Typ II Pneumozyten und Alveolarmakrophagen positiv. CHO und CHAE (2002) weisen iNOS immunhistochemisch in fixiertem Lungengewebe von Schweinen mit fibrinöser Pleuropneumonie, ausgelöst durch eine natürliche Actinobacillus pleuropneumoniae-Infektion, nach. Eine iNOSExpression wird in Makrophagen und neutrophilen Granulozyten in Alveolarräumen und in sogenannten Haferzellen (oat cells) beobachtet. Haferzellen sind dichtgedrängte, langgestreckte Zellen, die sich fischzugartig um durch Actinobacillus hervorgerufene pleuropneumoniae Koagulationsnekrosen im Lungengewebe anordnen und aus degenerierenden Leukozyten bestehen (HÄNI et al. 1973; CHEN 1997). Die Entzündungszellen in Blutgefäßen und in unveränderten Lungenbereichen infizierter Tiere und der Kontrolltiere zeigen keine Reaktion für iNOS. CHO und CHAE (2002) gehen davon aus, dass eine hochgradige Freisetzung von NO durch iNOS für die Gewebeläsionen verantwortlich sein könnte. In den meisten Lungenarealen, in denen iNOS-positive Zellen auftreten, wird mittels in situHybridisierung eine hohe Anzahl DNA-positiver Zellen für Actinobacillus pleuropneumoniae beobachtet (CHO u. CHAE 2003a). Ebenso beschreiben CHO und CHAE (2003a) eine Korrelation von iNOS-positiven Zellen mit NT- exprimierenden Zellen, die überwiegend in der Peripherie entzündlich veränderter Lungenbereiche zu finden sind. Auch eine in vitro-Aktivierung von Alveolarmakrophagen mit Actinobacillus pleuropneumoniae und IFN-γ hat eine erhöhte Produktion von NO zur Folge, die iNOS-abhängig zu sein scheint (CHO u. CHAE 2003b). CHO und CHAE (2004b) finden eine enge Assoziation von NF-ĸB und iNOS in Lungengewebeproben von natürlich mit Actinobacillus pleuropneumoniaeinfizierten Schweinen. NF-ĸB ist ein wichtiges Protein in der transkriptionalen Induktion des iNOS-Genes in verschiedenen Zelltypen einschließlich Makrophagen (BOGDAN et al. 1995; ODDIS u. FINKEL 1996). Neutrophile Granulozyten und Makrophagen zeigen in der in situ-Hybridisierung und in der Immunhistologie eine iNOS- sowie eine Cyclooxygenase-2 (COX-2)-Expression im Lungengewebe von Schweinen mit experimenteller Actinobacillus pleuropneumoniae-Infektion, die eng mit Actinobacillus pleuropneumoniae-DNA-positiven Zellen assoziert ist. Zusätzlich 22 Literaturübersicht wird NO und Prostaglandin E2 (PGE2) in der BAL-Füssigkeit in vivo festgestellt (CHO u. CHAE 2003b). Von iNOS produziertes NO aktiviert COX-2, die wiederum PGE2 synthetisiert. NO und PGE2 können demnach eine synergistische Rolle bei der durch eine Actinobacillus pleuropneumoniae-Infektion hervorgerufenen Immunantwort spielen (CHO u. CHAE 2003b; CHO u. CHAE 2004a). Entzündungsmediatoren in der Lunge stimulieren COX-2, deren Aktivierung vor allem zu einer Mehrbildung von PGE2 führt, das eine Bronchodilatation bewirkt (KOSTIKAS et al. 2003). RADI et al. (2001) beschreiben eine Abnahme der iNOS-Expression in Bronchialepithelzellen in Lungengewebeproben neonataler Kälber mit Mannheimia haemolytica-Infektion, wenn gleichzeitig eine hochgradige iNOS-positive Leukozyteninfiltration vorlag. Eine starke Reaktion für iNOS und NT wird in den multifokalen Infiltraten aus neutrophilen Granulozyten und Makrophagen im Lungengewebe der mit Mannheimia haemolytica infizierten Kälber verzeichnet, wobei sich Kontrollkälber und infizierte Tiere in ihrem Expressionsmuster für NT ansonsten nicht unterscheiden. PALMER et al. (2007) inokulieren Kälber mit Mycobacterium bovis und finden immunhistochemisch iNOS-positive und CD68positive Makrophagen und mehrkernige Riesenzellen ausschließlich in Granulomen in der frühen und mittleren Infektionsphase, aber nicht mehr gegen Versuchsende (Tag 90 p.i.). In Granulomen, die nekrotische Zentren aufweisen, ist die iNOSExpression limitiert und nur in der Zellzone zu verzeichnen, die direkt an die nekrotischen Areale angrenzt. iNOS wird außerdem von Zellen mit spindelförmiger Morphologie exprimiert, bei denen es sich um Fibroblasten handeln könnte. PERREIRA-SUÁREZ et al. (2006) detektieren iNOS mittels IHC in epitheloiden Makrophagen und mehrkernigen Riesenzellen vom Langhans-Typ in Lungengranulomen von Kälbern mit natürlicher Mycobacterium bovis-Infektion. Eine Akkumulation von NT wird ebenfalls in mehrkernigen Riesenzellen vom LanghansTyp festgestellt. FLIGGER et al. (1999) beschreiben eine iNOS-Expression in Lungengewebeproben von Rindern, die mit Arcanobacterium pyogenes und Pasteurella haemolytica (jetzt Mannheimia haemolytica nach ANGEN et al. 1999) infiziert wurden. Bei Tieren, die infolge einer Infektion mit Escherichia coli eine akute oder chronische, interstitielle Literaturübersicht 23 Pneumonie entwickeln, wird keine iNOS-Expression verzeichnet. Um nekrotische Herde im Lungengewebe von Rindern mit Bronchopneumonie, die mit Arcanobacterium pyogenes oder Mannheimia haemolytica infiziert sind, finden die Autoren mittels IHC stark iNOS-exprimierende Zellen. Einige Zellen in den Alveolarräumen und in den Bronchiallumina in weniger stark entzündlich veränderten Lungenbereichen sowie einzelne Chondrozyten des Bronchialknorpels zeigen eine positive Reaktion für iNOS. In entzündlich veränderten Lungen von Rindern mit Bronchopneumonie nach einer Mannheimia haemolytica-Infektion können ebenfalls iNOS-exprimierende Zellen in der die Nekrosen umgebenden Zellzone nachgewiesen werden. In verstreut liegenden Zellen innerhalb nichtnekrotischer Alveolarräume und Bronchien wird ebenfalls eine positive iNOS-Reaktion verzeichnet. Da keine iNOS-Expression in Lungen von Rindern mit interstitieller Pneumonie festgestellt wird, vermuten die Autoren, dass iNOS hauptsächlich bei durch Arcanobacterium pyogenes und Mannheimia haemolytica hervorgerufener, nekrotisierender Bronchopneumonie gebildet wird. Um die iNOS-positiven Zellen im entzündlich veränderten Lungengewebe näher zu charakterisieren, führten die Autoren Doppelfärbungen mit MHC-II, dem Makrophagenmarker CD68 und den Phagozytenmarkern S100A8 und S100A9 durch, die zeigen, dass die Mehrheit der iNOS-exprimierenden Zellen negativ für die genannten Marker ist. Auch in einer Studie, in der die iNOS-Expression in Gehirnen von Ziegen, Schafen und Rindern mit einer Listeria monocytogenes-Infektion untersucht wird, sind die meisten iNOSpositiven Zellen negativ für S100A8 und S100A9 (JUNGI et al. 1997b). 2.4.4 NT im Respirationstrakt bei Pneumopathien NT kann als Marker für eine NO-Produktion durch iNOS in entzündlich veränderten Geweben verwendet werden, da das Vorkommen von NT für eine stattgefundene Bildung von Peroxynitrit spricht (MASON et al. 1997; CHO u. CHAE et al. 2003a; TANAKA et al. 2001). Im Schrifttum werden iNOS und NT immunhistochemisch im Lungengewebe von Menschen und Versuchstieren mit verschiedenen Erkrankungen wie z.B. Tuberkulose, Asthma und Zytomegalievirus-Infektion beschrieben (MASON et al. 24 Literaturübersicht 1997; YAMAZAKI et al. 1998; HERNANDEZ-PANDO et al. 2001; TANAKA et al. 2001; CHOI et al. 2002; TAKEMOTO et al. 2007). MASON et al. (1997) untersuchen mittels IHC die Expression von iNOS und NT in Lungengewebeproben von Menschen mit obliterierender Bronchiolitis nach Lungentransplantation. Die Expression von NT ist stark mit der Expression von iNOS verknüpft und wird in vakuolisiertem Bronchialepithel und bindegewebig verlegten Lumina von Bronchioli nachgewiesen. Zusätzlich werden iNOS und NT von Entzündungszellen in Bronchiallumina, im Lungenparenchym und peribronchiolär exprimiert. In vollständig obliterierten Bronchioli ist hingegen keine Expression für iNOS und NT mehr nachweisbar (Kapitel 2.4.3). Mittels IHC wird NT in epitheloiden Makrophagen und mehrkernigen Riesenzellen humaner, tuberkulöser Granulome sowie in Alveolarmakrophagen und Epithelzellen in entzündlich veränderten Lungenregionen nachgewiesen (CHOI et al. 2002; Kapitel 2.4.3). TAKEMOTO et al. (2007) beschreiben bei Mäusen mit Asthma eine verstärkte, immunhistologische Bronchialepithelzellen, Expression Typ II von NT in Pneumozyten infiltrierenden und Granulozyten, Alveolarmakrophagen (Kapitel 2.4.3). Bei Mäusen mit experimenteller Zytomegalievirus-Infektion (MCMV, murine cytomegalovirus) können TANAKA et al. (2001) NT immunhistologisch in Bronchialepithelzellen darstellen. In der späten Infektionsphase von Mäusen mit Tuberkulose geht in den, die Lungennekrosen demarkierenden, Makrophagen die iNOS-Expression zugunsten der NT-Expression zurück (HERNANDEZ-PANDO et al. 2001; Kapitel 2.4.3). YAMAZAKI et al. (1998) detektieren eine deutliche Reaktion für NT in alveolären Makrophagen von Mäusen, bei denen eine interstitielle Pneumonie durch Bleomycin hervorgerufen wurde. Im veterinärmedizinischen Schrifttum gibt es bislang lediglich Beschreibungen über eine Expression von NT in Lungen von Schweinen nach Infektion mit Actinobacillus pleuropneumoniae und in Lungen von Rindern mit Bronchopneumonie oder nach Infektion mit Mycobacterium bovis (RADI et al. 2001; CHO u. CHAE 2003a; PERREIRA-SUÁREZ et al. 2006). CHO und CHAE (2003a) weisen NT in Literaturübersicht 25 neutrophilen Granulozyten und Makrophagen in der Peripherie entzündlich veränderter Lungenbereiche von Schweinen mit fibrinöser Pleuropneumonie durch natürliche Actinobacillus pleuropneumoniae-Infektion nach (Kapitel 2.4.3). NT ist in allen pneumonisch veränderten Lungenbereichen mit neutrophilen Granulozyten und Makrophagen assoziiert, in nicht entzündlich veränderten Lungenbereichen findet sich hingegen nur eine minimale NT-Expression. RADI et al. (2001) beschreiben bei neonatalen Kälbern mit fibrinopurulenter Bronchopneumonie, hervorgerufen durch Mannheimia haemolytica, eine starke Expression von NT in multifokalen Infiltraten aus neutrophilen Granulozyten und Makrophagen (Kapitel 2.4.3). PERREIRA-SUÁREZ et al. (2006) detektieren NT mittels IHC in mehrkernigen Riesenzellen vom Langhans-Typ in Lungengranulomen von Kälbern mit natürlicher Mycobacterium bovis-Infektion, wobei die epitheloiden Makrophagen der Lungengranulome zusätzlich eine positive Reaktion für iNOS zeigen. 2.4.5 Mn-SOD im Respirationstrakt bei Pneumopathien Mn-SOD ist ein wichtiges antioxidantisches Enzym, dem möglicherweise eine zentrale Rolle in Bezug auf die Abwehrmechanismen der Lunge zuzuschreiben ist (LAKARI et al. 2000). Eine Expression von Mn-SOD in der erkrankten Lunge von Menschen und Versuchstieren in vivo wird von verschiedenen Autoren beschrieben (OBERLEY et al. 1993; LEE et al. 1994; OHBAYASHI et al. 1997; LAKARI et al. 2000; WELLER et al. 2000; HEUNGNAM et al. 2007), allerdings gibt es bislang keine Publikationen über immunhistochemische Untersuchungen mit Mn-SOD an Lungengewebeproben von Schweinen und Rindern. LAKARI et al. (2000) verzeichnen mittels IHC eine Mn-SOD-Expression in Typ IIPneumozyten und Alveolarmakrophagen bei Patienten mit interstitieller Pneumonie. In metaplastischen alveolären und bronchiolären Epithelzellen liegt eine gegenüber normalem Alveolar- und Bronchialepithel erhöhte Expression von Mn-SOD vor. In Lungengewebeproben von Patienten mit Sarkoidose finden sich Mn-SOD-positive 26 Literaturübersicht Zellen in den Granulomen sowie Mn-SOD-exprimierende Alveolarmakrophagen und Typ II-Pneumozyten. In Kontrolllungen wird in Alveolarmakrophagen, Typ IIPneumozyten und Bronchialepithelzellen keine Expression von Mn-SOD nachgewiesen. Bei Säuglingen mit einer bronchopulmonalen Dysplasie wird immunhistologisch eine Mn-SOD-Expression in Alveolarmakrophagen beschrieben. Die Expression ist stärker bei Säuglingen, die eine längere Überlebensdauer zeigen als bei Säuglingen, die innerhalb einer Woche ihren Lungenveränderungen erliegen (OHBAYASHI et al. 1997). In unveränderten Lungen von Ratten finden LEE et al. (1994) in nahezu allen Zellen der Lunge eine Mn-SOD-Expression mittels IHC. Die deutlichste Reaktion für MnSOD zeigen glatte Muskelzellen und endotheliale Zellen. Setzt man die Ratten einer 50 Stunden andauernden Exposition mit Sauerstoff (O2) aus, wird die Intensität der Reaktion mit Mn-SOD abgeschwächt. OBERLEY et al. (1993) weisen ein ähnliches Verteilungsmuster der Mn-SOD in Lungen von transgenen Mäusen nach. HEUNGNAM et al. (2007) inokulieren Ratten intratracheal mit kristallinem Silikat und weisen Mn-SOD immunhistologisch in den pulmonalen Alveolarmakrophagen und den interstitiellen Zellen der proximalen und distalen Abschnitte der Alveolargänge nach. Dabei stellt sich eine enge Assoziation zwischen der Silikatexposition und der Expression der Mn-SOD dar. WELLER et al. (2000) weisen Mn-SOD mittels IHC in Alveolarmakrophagen sowie den proximalen und distalen Abschnitten der Alveolargänge bei Ratten mit progressiver Lungenfibrose nach. Eine in vitro-Infektion humaner Epithelzellen der Atemwege mit einem Influenzavirus kann eine Expression von Mn-SOD auslösen. Eine Behandlung von Mäusen, die mit einem Influenzavirus infiziert worden sind, mit rbMn-SOD bewirkt eine Abschwächung der Infektion und der Lungenveränderungen (JACOBY u. CHOI 1994; SIDWELL et al. 1996). Mn-SOD knockout-Mäuse (Mn-SOD¯/¯) sterben 5 bis 21 Tage nach der Geburt und weisen Myokarddefekte, neuronale Degenerationen, Leberverfettungen, Anämien und eine schwere Schädigung der Mitochondrien auf (LI et al. 1995; LEBOVITZ et al. 1996). SHIRAISHI et al. (1997) finden in einer Lungentransplantationsstudie bei Ratten heraus, dass eine Behandlung mit SOD aus bovinen Erythrozyten eine Verbesserung des histologischen Bildes bei Abstoßungsreaktionen bewirkt. SHIKI et Literaturübersicht 27 al. (1987) beschreiben einen Anstieg der Mn-SOD in bovinen, pulmonalen Endothelzellen nach Stimulation durch ein Escherichia coli- Endotoxin in vitro. Über die Expression von Mn-SOD in Lungen von Rindern gibt es bisher keine Untersuchungen. 2.5 Die Phagozytenmarker S100A8 und S100A9 2.5.1 Eigenschaften und Funktion von S100A8 und S100A9 S100A8 (Calgranulin A) und S100A9 (Calgranulin B) gehören zur S100-Familie der Ca2+-bindenden Proteine. Obwohl beide Proteine keine migrationshemmenden Funktionen aufweisen, werden sie auch MRP8 und MRP14 (migration inhibitory factor (MIF)-related proteins-8 and 14) genannt (KERKHOFF et al. 1998). Beide kommen hauptsächlich im Zytoplasma von Granulozyten und Monozyten, aber auch extrazellulär vor. S100A8 ist in der Lage, Heterodimere mit S100A9 zu formen und einen S100A8/A9-Proteinkomplex zu bilden. S100A8 werden chemotaktische Eigenschaften zugeschrieben (SCHÄFER et al. 1996). S100A8 und S100A9 wurden zuerst bei der Zystischen Fibrose (cystic fibrosis, CF) entdeckt. Aufgrund der chemotaktischen Funktion von S100A8 wird angenommen, dass S100A8 und S100A9 eine Rolle bei der chronischen Entzündung spielen, die die CF begleitet (SCHÄFER et al. 1996; KERKHOFF et al. 1998). Beide S100-Proteine werden als Marker für Phagozyten verwendet. Es gibt viele Hypothesen, allerdings bleibt die exakte Funktion dieser Proteine bisher weitestgehend unbekannt (KERKHOFF et al. 1998). Die C-terminale Region des humanen S100A9 zeigt eine Sequenzhomologie mit einem Faktor, der eine Immobilisierungsaktivität für neutrophile Granulozyten besitzt (EDGEWORTH et al. 1989). Die S100-Proteine A8 und A9 sind hauptsächlich im Zytoplasma lokalisiert. Ein Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration führt zu einer Translokalisation zu Zytoskelettkomponenten und zur Plasmamembran (BAUDIER u. COLE 1988; ROTH et al. 1993). S100A8 und S100A9 können unabhängig voneinander mit der Zellmembran und Vimentin, einem Typ 3Intermediärfilament, interagieren. Die Ca2+-abhängige Neuorganisation der Intermediärfilamente spielt eine wichtige Rolle bei der Aktivierung von Phagozyten 28 Literaturübersicht (STEINERT u. ROOP 1988). Beide Proteine sind in der Lage, die Caseinkinasen I und II zu hemmen, um mit Komponenten des Zytoskeletts zu interagieren (MURAO et al. 1989; ROTH et al. 1993). Dadurch können sie antimikrobielle Eigenschaften entfalten (KERKHOFF et al. 1998). Phagozyten, die S100A8 und S100A9 exprimieren, gehören zu den Entzündungszellen, die akute Entzündungsprozesse dominieren (ZWADLO et al. 1988; KERKHOFF et al. 1998). S100A8- und S100A9exprimierende Phagozyten werden bei einer großen Vielfalt unterschiedlicher, entzündlicher Krankheitsbilder wie rheumatoide Arthritis, Allotransplantat- Abstoßungen, verschiedenen idiopathischen Darmerkrankungen, Sarkoidose und chronischer Bronchitis beobachtet (RUGTVEIT et al. 1994). Wie andere S100Proteine werden S100A8 und S100A9 auf eine gewebe- und zellspezifische Weise exprimiert (KERKHOFF et al. 1998). Verschiedene Studien haben gezeigt, dass S100A8 und S100A9 bei entzündlichen Erkrankungen unabhängig voneinander exprimiert werden. Die Expressionsmuster sind abhängig von akuten und chronischen Entzündungssituationen (ODINK et al. 1987; ZWADLO et al. 1988; SUNDERKÖTTER et al. 1991). S100A8/A9 sind charakteristisch für entzündliche Veränderungen, fungieren als chemotaktische Moleküle und werden von neutrophilen Granulozyten, aktivierten Monozyten und von Makrophagen exprimiert (ODINK et al. 1987; ROTH et al. 1993; GEBHARDT et al. 2006). ZWADLO et al. (1988) und ROTH et al. (1993) beschreiben, dass eine Expression von S100A8 und S100A9 auf die frühe Phase der Differenzierung myeloischer Stammzellen beschränkt sein müsse, da diese Proteine nur in zirkulierenden Granulozyten und Monozyten, nicht aber in Gewebemakrophagen vorkommen. ODINK et al. (1987) finden heraus, dass Makrophagen bei akuten Entzündungen S100A9, aber nicht S100A8 exprimieren. Bei chronischen Entzündungen exprimieren infiltrierende Makrophagen hingegen beide S100-Proteine. AGUIAR-PASSETI et al. (1997) identifizieren S100A9 als einen Makrophagen-Deaktivierungs-Faktor, der von epitheloiden Makrophagen freigesetzt wird und einen respiratory burst von Makrophagen, die durch Mykobakterien aktiviert worden sind, hemmen kann. Der Mechanismus ist bisher allerdings unklar. Literaturübersicht 29 2.5.1.1 S100A8 und S100A9 im Respirationstrakt bei Pneumopathien S100A8 und S100A9 werden von polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (polymorphonuclear neutrophils, PMN), Monozyten und Makrophagen in den verschiedenen Phasen der Entzündung freigesetzt (ODINK et al. 1987; PECHKOVSKY et al. 2000; GEBHARDT et al. 2006). In der gesunden Lunge des Menschen finden ZWADLO et al. (1988) S100A9 in den Gefäßlumina. In den ortsständigen Gewebemakrophagen von Lunge, Haut, Leber, Plazenta und Synovialis kann beim Menschen mittels IHC keine Expression von S100A8/A9-Proteinen festgestellt werden (ZWADLO et al. 1988). In Fremdkörpergranulomen, bei Erythema nodosum und Bartonellose beschreiben DELABIE et al. (1990) eine Expression von S100A8 und S100A9 in Histiozyten, epitheloiden Makrophagen und mehrkernigen Riesenzellen mittels IHC in Granulomen der Haut und des Lymphknotens. In Lungengranulomen, die durch eine Sarkoidose oder Tuberkulose verursacht worden sind, finden die Autoren eine starke Expression für S100A9. Ausschließlich die Histiozyten, die die Granulome umranden, sind positiv für beide S100-Proteine. Eine Färbung für S100A8 ist in anderen Zellen dieser Granulome schwach oder nicht vorhanden. In Alveolarmakrophagen in der BAL-Flüssigkeit von Patienten mit klinisch diagnostizierter Pneumonie ermitteln BÜHLING et al. (2000) per Druchflusszytometrie ein signifikant erhöhtes Vorkommen des MRP8/MRP14-Antigenkomplexes im Vergleich zu Patienten mit interstitieller Pneumonie oder einer chronisch-obstruktiven Lungenerkrankung. Die Expression von isoliertem MRP8 und MRP14 unterscheidet sich nicht signifikant zwischen den drei Patientengruppen. AHMAD et al. (2003) stimulieren humane Epithelzellen der Atemwege in vitro mit proinflammatorischen Molekülen wie TNF-α, IL-1β und LPS und können die Sekretion eines IL-8-stimulierenden, zytoplasmatischen Proteins feststellen, das identisch mit dem Heterodimer von S100A8/A9 ist. Nach einer Stimulation von humanen Bronchialepithelzellen in vitro mit LPS von Pseudomonas aeruginosa finden HENKE et al. (2006) eine Aufregulierung der mRNA von S100A8 und S100A9. Mittels ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) weisen PECHKOVSKY et al. (2000) erhöhte Mengen des MRP8/MRP14-Proteinkomplexes im Plasma von Patienten mit akuter, pulmonaler Tuberkulose nach. Bei Patienten mit 30 Literaturübersicht Sarkoidose wird eine geringere Plasmakonzentration dieses Proteinkomplexes ermittelt. Eine Korrelation zwischen der MRP8/MRP14-Proteinkomplex- Plasmakonzentration, der Leukozytenzahl im Blut und der Zahl der PMN im Blut wird nicht festgestellt. LORENZ et al. (2007) untersuchen die Expression von S100A8 und S100A9 in der BAL-Flüssigkeit und im Sputum von Patienten mit CF, chronischobstruktiver Pneumonie (chronic obstructive pulmonary disease, COPD) oder akuter, respiratorischer Insuffizienz (acute respiratory distress syndrome, ARDS) mittels ELISA. Die Autoren finden heraus, dass im Sputum und in der BAL-Flüssigkeit von Patienten mit CF und COPD eine höhere Konzentration vorliegt, als in der BALFlüssigkeit von ARDS-Patienten. FLIGGER et al. (1999) untersuchen via IHC das Expressionsmuster von S100A8 und S100A9 bei Rindern mit nekrotisierender Bronchopneumonie, ausgelöst durch eine Infektion mit Arcanobacterium pyogenes oder Mannheimia haemolytica. Beide S100Proteine werden in Zellen mit der Morphologie neutrophiler Granulozyten und Makrophagen exprimiert. Eine S100A8/A9-Expression wird zudem in den Zellen der Interalveolarsepten, in intraluminalen Zellen der Alveolarräume und der Luftwege sowie der Blut- und Lymphgefäße beschrieben. Degenerierende Leukozyten (Haferzellen, oat cells) in den Alveolarräumen weisen ebenfalls eine positive Reaktion für S100A8 und S100A9 auf. In Lungengewebeproben von Rindern, die eine durch Escherichia coli hervorgerufene Pneumonie mit hochgradiger Infiltration der Alveolarräume mit neutrophilen Granulozyten und Makrophagen aufweisen, verzeichnen die Autoren eine große Anzahl von Zellen, von der die Mehrheit S100A8 oder S100A9 exprimiert. Eine geringgradige Expression der S100-Proteine wird in Lungen von Kälbern mit akuter, interstitieller Pneumonie beobachtet (Kapitel 2.4.3 und Kapitel 2.4.4). Material und Methoden 31 3 Material und Methoden 3.1 Untersuchungsmaterial 3.1.1 Untersuchte Kälber Für die immunhistochemischen Untersuchungen standen formalinfixierte und paraffineingebettete Lungengewebeproben von insgesamt 55 Kälbern bzw. Rindern verschiedener Rassen und unterschiedlichen Alters zur Verfügung. 35 Kälber stammten aus drei verschiedenen Infektionsversuchen, in denen diese Tiere experimentell mit M. bovis infiziert wurden. 20 Kälber bzw. Rinder dienten als Kontrollgruppe und wiesen bei der makroskopischen sowie bei der histologischen Untersuchung des Lungengewebes keinerlei pathomorphologische Veränderungen auf. 3.1.2 Kontrolltiere Drei der insgesamt 20 lungengesunden Kontrolltiere (Lfd. Nr. 1-3) wurden zur diagnostischen Sektion in das Institut für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover verbracht und dort im Rahmen der Routinediagnostik einer vollständigen Sektion unterzogen. Diese drei Tiere wiesen Erkrankungen auf, die nicht im Zusammenhang mit dem Respirationstrakt standen und waren entweder euthanasiert worden oder verstorben. Zusätzlich standen Lungengewebeproben von zehn weiteren Kälbern im Alter von 6 bis 7 Monaten als Kontrollen zur Verfügung, die im Rahmen eines am FriedrichLoeffler-Institut in Jena durchgeführten Tierversuches als Kontrolltiere dienten. Proben von sieben 2 Jahre alten, lungengesunden Schlachtrindern stammten aus dem Schlachthof Gleidingen. Laufende Nummer, Tiernummer, Alter, Geschlecht, Rasse sowie die Ergebnisse der histologischen Beurteilung der Lunge der 20 Kontrolltiere sind in der Tabelle 1 aufgelistet. 32 Material und Methoden Tabelle 1 Übersicht über die Gruppe der 20 pathomorphologisch lungengesunden Kontrolltiere Lfd. Tier- Nr. nummer* 11 S 1034/05 Rasse DRB Geschl. w Histol. Pathohistolog. Todes- Diagnose art 10 Tage Kat. Enteritis (E. coli, Kryptosporidien) getötet o.b.B. verendet o.b.B. Alter Beurteilung der Lunge 1 S 407/05 DSB w 28 Tage Fibrinöse, diphtheroide bis nekrotisierende Enteritis 31 S 663/05 DSB w 52 Tage Hämorrhag. bis fibrinöse Enteritis verendet o.b.B. 42 Ri 03/0001 DSB w 6 Monate o.b.B. getötet o.b.B. 2 Ri 03/0002 DSB w 6 Monate o.b.B. getötet o.b.B. 62 Ri 03/0003 DSB w 6 Monate o.b.B. getötet o.b.B. 2 Ri 03/0004 DSB w 6 Monate o.b.B. getötet o.b.B. 82 Ri 03/0005 DSB w 6 Monate o.b.B. getötet o.b.B. 2 Ri 03/0006 DSB w 6 Monate o.b.B. getötet o.b.B. 102 Ri 03/0007 DSB w 6 Monate o.b.B. getötet o.b.B. 2 Ri 03/0009 DSB w 7 Monate o.b.B. getötet o.b.B. 122 Ri 03/0010 DSB w 7 Monate o.b.B. getötet o.b.B. 2 Ri 03/0012 DSB w 7 Monate o.b.B. getötet o.b.B. 143 V 1848/04 DSB m 2 Jahre o.b.B. getötet o.b.B. 3 V 1849/04 DSB m 2 Jahre o.b.B. getötet o.b.B. 163 V 1850/04 DSB m 2 Jahre o.b.B. getötet o.b.B. 3 V 1855/04 DSB m 2 Jahre o.b.B. getötet o.b.B. 183 V1856/04 DSB m 2 Jahre o.b.B. getötet o.b.B. 3 V 1857/04 DSB m 2 Jahre o.b.B. getötet o.b.B. 203 V 1866/04 DSB m 2 Jahre o.b.B. getötet o.b.B. 2 5 7 9 11 13 15 17 19 *V= Beprobung und pathomorphologische sowie histopathologische Untersuchung der Lunge; S= Ganzkörpersektion; Lfd. Nr. = laufende Nummer; Ri = Rind; DRB: Deutsch-Rotbunt; DSB = Deutsch-Schwarzbunt; E.coli = Escherichia coli; Geschl. = Geschlecht; w = weiblich; m = männlich; kat. = katarrhalische; hämorrhag. = hämorrhagische; o.b.B. = ohne besonderen Befund; histol. = histologisch; 1 Lfd. Nr. 1-3: Diagnostische Sektion im Institut für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover; 2 Lfd. Nr. 4-13: Kontrolltiere aus dem Friedrich-Loeffler- Institut, Jena; 3 Lfd. Nr. 14-20: Schlachtrinder aus dem Schlachthof Gleidingen Material und Methoden 33 3.1.3 Experimentell mit M. bovis infizierte Kälber Die insgesamt 35, experimentell mit M. bovis infizierten Tiere stammten aus zwei unterschiedlichen Infektionsversuchen und einem Vakzinationsversuch, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten und zum Teil an verschiedenen Instituten durchgeführt wurden. Im Ergebnisteil dieser Arbeit werden die 35 infizierten Kälber nach den unterschiedlichen pneumonischen Veränderungen eingeteilt (Kapitel 4.1.2). 3.1.3.1 Infektionsversuch mit einer klonalen Variante des M. bovis-Stammes PG45 Der erste Infektionsversuch wurde 1997 im Centre National d´Études Vétérinaires et Alimentaires (CNEVA, heute Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments, AFSSA) in Lyon, Frankreich, mit insgesamt neun Kälbern durchgeführt. Acht männliche Kälber aus verschiedenen Herden, in denen bei der Kälbergeneration des Vorjahres sowie bei den Muttertieren keinerlei Symptome einer M. bovis-Infektion wie Arthritiden, Pneumonien oder Mastitiden auftraten, wurden, nach Ausschluss einer natürlichen Infektion mit M. bovis oder anderen Mykoplasmenspezies, durch zwei Bronchialwaschungen im Abstand von einer Woche sowie vier wöchentlichen, indirekten Hämagglutinationstests, experimentell mit M. bovis infiziert. Verwendet wurde eine klonale, VspA-exprimierende Variante des M. bovis-Typ Stammes PG 45, die den zum Zeitpunkt des Versuches drei Wochen alten Kälbern als intratracheale Suspension (Dosis: 4 x 1010 CFU/ml) verabreicht wurde. Das Kontrolltier wurde intratracheal mit sterilem Kulturmedium inokuliert und 14 Tage nach Versuchsbeginn euthanasiert. Jeweils zwei der experimentell infizierten Kälber wurden an Tag 2, 4, 6 und 10 post infectionem euthanasiert. Lungengewebeproben aus sechs verschiedenen Lungenlokalisationen (Abbildung 3) pro Kalb wurden zur kulturellen Reisolierung von M. bovis anlässlich der Sektion entnommen. Bei vier von acht Kälbern wurde bakteriologisch eine Infektion mit M. bovis in einer oder mehreren Lungenlokalisationen nachgewiesen. Drei Tiere zeigten teilweise zusätzlich eine Infektion mit anderen Mykoplasmen-Spezies. Jeweils ein Tier wies eine Infektion mit Pasteurella multocida bzw. Mannheimia haemolytica auf. Bei einem 34 Material und Methoden Tier wurden nicht näher bestimmte Bacillus-Spezies nachgewiesen. Die Daten der Kälber sowie die Ergebnisse der bakteriologischen Untersuchungen der Lungen sind in Tabelle 2 aufgelistet. Tabelle 2 Tiere aus dem Infektionsversuch mit einer klonalen Variante des M. bovis Typ-Stammes PG45 und Ergebnisse der bakteriologischen Untersuchung der Lungengewebeproben nach Euthanasie Lfd.-Nr. Tier-Nr. Alter bei M. bovis- Sektion Bakt. Infektion Stamm p.i. Nachweis (in Tagen) u. Dosis (in Tagen) M. bovis Bakt. Bakt. Nachweis Nachweis anderer anderer 21 2 10 neg. Mykopl. neg. Bakterien neg. 22 5 4 pos. pos. M.h. 23 7 M. bovis- 2 neg. neg. neg. 24 8 Stamm 10 neg. neg. neg. 25 9 PG45/ 6 pos. neg. neg. 6 pos. pos. Bac. 2 pos. neg. neg. 21 10 26 10 4 x 10 27 12 CFU/ml 28 13 4 neg. pos. P.m. 29* E* 14 neg. neg. neg. Lfd.-Nr. = laufende Nummer; Tier-Nr. = Tiernummer; p.i. = post infectionem; Mykopl. = Mykoplasmen; Bakt. = bakteriologisch; CFU = koloniebildende Einheiten (engl.: colony forming units); M. bovis = Mycoplasma bovis; M.h. = Mannheimia haemolytica; Bac. = Bacillus species; P.m. = Pasteurella multocida; neg. = negativ; pos. = positiv; * = Kontrolltier Material und Methoden 35 3.1.3.2 Infektionsversuch mit dem M. bovis-Feldstamm 1067 sowie mit einem französischen M. bovis-Feldstamm Dieser Infektionsversuch wurde im April 1999 im Rahmen eines gemeinsamen Forschungsprojektes der Arbeitsgruppen von Prof. Dr. R. Rosengarten (Institut für Bakteriologie, Mykologie und Hygiene, Veterinärmedizinische Universität Wien, Österreich) und Prof. Dr. M. Hewicker-Trautwein (Institut für Pathologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover) durchgeführt. Die insgesamt zehn, 4 Wochen alten, männlichen Kälber der Rasse Simmentaler, bei denen es sich um zwei Kontrolltiere und acht experimentell mit M. bovis infizierte Tiere handelte, stammten aus Niederösterreich und wurden zweimal im Abstand von 6 Tagen mittels bronchioalveolärer Lavage auf das Vorhandensein von M. bovis getestet. Zusätzlich wurde mithilfe eines Western-Blot-Verfahrens eine natürliche Infektion mit M. bovis ausgeschlossen. Vier Kälber mit den laufenden Nr. 32-35 wurden intratracheal mit einer bakteriellen Suspension des M. bovis-Stammes 1067 mit einem Titer von 108 bzw. 1010 CFU/ml inokuliert. Vier weitere Tiere (Lfd.- Nr. 36-39) wurden mit einem, aus einem Bestand in Frankreich isolierten Feldstamm infiziert. Dieser wurde jeweils zwei Kälbern in einer Dosis von 108 bzw. 1010 CFU/ml intratracheal verabreicht. Zwei Kälber wurden intratracheal mit sterilem Kulturmedium inokuliert und dienten als Kontrolltiere. Die Kälber wurden 21 Tage post infectionem euthanasiert und anschließend einer vollständigen Sektion unterzogen. Je Kalb wurden Lungengewebeproben von sechs Lungenlokalisationen (Abbildung 3) postmortal entnommen und bakteriologisch untersucht. Bei allen acht experimentell infizierten Tieren wurde M. bovis in der Lunge nachgewiesen. Andere Mykoplasmen-Spezies wurden nicht isoliert. Bei vier Kälbern (Lfd.-Nr. 33, 35, 36, 38) wurde zusätzlich Pasteurella multocida nachgewiesen. Die Daten der Tiere dieses Versuches sowie die Ergebnisse der Keimisolierung aus der Lunge sind in Tabelle 3 aufgeführt. 36 Material und Methoden Tabelle 3 Tiere aus dem Infektionsversuch mit dem M. bovis-Feldstamm 1067 und einem französischen Feldstamm und Ergebnisse der bakteriologischen Untersuchung der Lungengewebeproben nach Euthanasie Alter bei Lfd.-Nr. E-Nr. M. bovis- Infektion Stamm (in Tagen) Sektion Bakt. p.i. Nachweis (in Tagen) M. bovis Bakt. Bakt. Nachweis Nachweis anderer anderer Mykoplasmen Bakterien 30* 1504/99* n.d. neg. neg. 31* 1505/99* n.d. neg. neg. 32 1506/99 33 1507/99 34 1508/99 35 1509/99 36 1510/99 37 1511/99 38 1512/99 39 1513/99 neg. M. bovis- P.m. Stamm 1067 28 21 neg. neg. P.m. pos. P.m. franz. neg. M. bovis- P.m. Feldstamm neg. Lfd.-Nr. = laufende Nummer; E-Nr. = Einsendungsnummer; p.i. = post infectionem; Bakt. = bakteriologisch; M. bovis = Mycoplasma bovis; franz. = französisch; P.m. = Pasteurella multocida; neg. = negativ; n.d. = keine Inokulation durchgeführt; pos. = positiv; * = Kontrolltier 3.1.3.3 Vakzinationsversuch Der Vakzinationsversuch wurde im Juli 2000 in Zusammenarbeit mit Prof. Dr. R. Rosengarten (Institut für Bakteriologie, Mykologie und Hygiene, Veterinärmedizinische Universität Wien, Österreich) und Prof. Dr. M. HewickerTrautwein (Institut für Pathologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover) durchgeführt. Ziel dieses gemeinsamen Forschungsprojektes war die Untersuchung der Wirksamkeit eines Impfstoffes gegen M. bovis. Dieser Versuch umfasste insgesamt sechzehn Kälber der Rasse Simmentaler (vierzehn männliche und zwei weibliche), die aus zehn verschiedenen M. bovis-freien Betrieben in Niederösterreich stammten und sich bei Beginn der Versuche in einem Alter von 2,5 bis 4 Wochen befanden. Eine Versuchsbeginn natürliche mittels M. bovis-Infektion der Western-Blot-Verfahren Tiere sowie wurde vor dem bakteriologischer Untersuchungen von Nasen- und Rachentupfern ausgeschlossen. Alle sechzehn Material und Methoden 37 Kälber wurden am Tag 21 post infectionem euthanasiert und einer vollständigen Sektion unterzogen. Die Tiere wurden in insgesamt drei verschiedene Gruppen aufgeteilt (Tabelle 4): Vier Kälber (Lfd.-Nr. 42-45) gehörten einer positiven Kontrollgruppe an, zehn Kälber (Lfd.-Nr 46-55) wurden in die Vakzinierungsgruppe eingeteilt und zwei weitere Kälber dienten als negative Kontrollgruppe (Lfd.-Nr. 40 und 41). Eine 2 ml umfassende Impfdosis, bestehend aus 1 mg eines aufgereinigten M. bovis-VspA-Fusionsproteins, kombiniert mit je einem von zwei verschiedenenen Adjuvantien (Montanide® IMS 1314 oder 2%igem Alum/HS), wurde der Vakzinierungsgruppe zweimal im Abstand von 3 Wochen (an Tag 0 und 21 des Versuchsprotokolls) intramuskulär verabreicht. Den Kälbern der positiven und negativen Kontrollgruppe wurde anstelle der Impfdosis sterile, physiologische Kochsalzlösung, kombiniert mit dem Adjuvans, injiziert. Am Tag 39 des Versuchsprotokolls, 18 Tage nach der zweiten Vakzination, wurden die Tiere der positiven Kontrollgruppe sowie die Tiere der Vakzinationsgruppe mit 30 ml einer Dosis von 7,4 x 109 CFU/ml mit dem M. bovis-Stamm 1067 intrabronchial inokuliert. Die Kälber der negativen Kontrollgruppe bekamen auf dieselbe Art und Weise 30 ml eines sterilen Mykoplasmenmediums verabreicht. Am Tag 60 nach Versuchsbeginn wurden alle Kälber euthanasiert und anschließend seziert. Die Lungengewebeproben wurden aus sechs unterschiedlichen Lungenlokalisationen entnommen (Abbildung 3) und kulturell sowie mit PCR auf M. bovis, andere Mykoplasmen-Spezies und andere Bakterien untersucht. Bei drei Tieren von den insgesamt vier Kälbern aus der positiven Kontrollgruppe sowie bei acht von den zehn Tieren aus der Vakzinationsgruppe konnte postmortal M. bovis aus der Lunge reisoliert werden. Andere Mykoplasmen-Spezies wurden nicht nachgewiesen. Zwei Kälber aus der positiven Kontrollgruppe sowie sieben Kälber aus der Vakzinationsgruppe wiesen eine Infektion mit Arcanobacterium pyogenes auf. Bei einem Tier der Vakzinationsgruppe wurde zusätzlich eine Infektion mit Pasteurella multocida nachgewiesen. Die Daten der insgesamt sechzehn Tiere dieses Versuches sowie die Ergebnisse der Reisolierung der bakteriellen Keime aus den postmortal entnommenen Lungengewebeproben sind in Tabelle 4 und Tabelle 5 aufgeführt. 38 Material und Methoden Tabelle 4 Kälber aus dem Vakzinationsversuch, inokuliert mit dem M. bovis-Stamm 1067 Einteilung Lfd.-Nr. E-Nr. der versch. Testgruppen Alter bei Versuchsbeginn (in Tagen) M. bovisStamm u. Vakzination Dosis 40* 2934/00* Neg. Kontroll- 60 n.d. n.d. 41* 2935/00* gruppe 81 n.d. n.d. 42 2936/00 43 2937/00 44 2938/00 45 57 n.d. Pos. Kontroll- 57 n.d. gruppe 67 n.d. 2939/00 63 n.d. 46 2940/00 67 47 2941/00 60 48 2942/00 74 2943/00 57 IMS 1314 2 x VspA/ Alum/HS 2 x VspA/ Stamm 1067/ 7,4 x 10 50 2944/00 Vakzi- 60 nierungsgruppe 51 2945/00 67 52 2946/00 67 53 2947/00 60 54 2948/00 67 55 2949/00 60 (in Tagen) 2 x VspA/ M. bovis49 Sektion p.i. 9 CFU/ml IMS 1314 2 x VspA/ IMS 1314 21 2 x VspA/ IMS 1314 2 x VspA/ IMS 1314 2 x VspA/ Alum/HS 2 x VspA/ Alum/HS 2 x VspA/ Alum/HS 2 x VspA/ Alum/HS Lfd.-Nr. = laufende Nummer; E-Nr. = Einsendungsnummer; p.i. = post infectionem; M bovis = Mycoplasma bovis; neg. = negativ; pos. = positiv; * = Kontrolltier; n.d. = nicht durchgeführt; versch. = verschieden; CFU = koloniebildende Einheiten (engl.: colony forming units) Material und Methoden 39 Tabelle 5 Ergebnisse der bakteriologischen Untersuchung mittels Kultivierung und PCR der Lungengewebeproben der Kälber aus dem Vakzinationsversuch (Tabelle 4) Lfd.-Nr. E-Nr. Bakt. Nachweis M. bovis Bakt. Nachweis anderer Mykoplasmen Bakt. Nachweis anderer Bakterien 40* 2934/00* neg. neg. 41* 2935/00* neg. neg. 42** 2936/00 pos. Arc.p. 43** 2937/00 pos. Arc.p. 44** 2938/00 pos. neg. 45** 2939/00 neg. neg. 46 2940/00 pos. neg. 47 2941/00 neg. 48 2942/00 pos. 49 2943/00 pos. neg. 50 2944/00 pos. Arc.p. 51 2945/00 pos. neg. 52 2946/00 neg. Arc.p. 53 2947/00 pos. Arc.p./P.m. 54 2948/00 pos. Arc.p. 55 2949/00 pos. Arc.p. neg. Arc.p. Arc.p. Lfd.-Nr. = laufende Nummer; E-Nr. = Einsendungsnummer; Bakt. = bakteriologisch; M. bovis = Mycoplasma bovis; neg. = negativ; pos. = positiv; * = Kontrolltier; ** = positive Kontrollgruppe; Arc.p. = Arcanobacterium pyogenes; P.m. = Pasteurella multocida 40 Material und Methoden 3.1.4 Lungengewebeproben Die Gewebeprobenentnahme bei den in Tabelle 1 aufgeführten Kontrolltieren der Gruppe 1 erfolgte nach der pathologisch-anatomischen Untersuchung aus drei definierten Lungenlokalisationen der rechten Lungenhälfte (Abbildung 2). Die erste Gewebeprobe wurde aus dem rechten Spitzenlappen (Pars cranialis des Lobus cranialis dexter) entnommmen und als Lokalisation A1 bezeichnet. Die zweite Gewebeprobenentnahme erfolgte ebenfalls im rechten Spitzenlappen (Pars caudalis des Lobus cranialis dexter), allerdings unter Einbeziehung der dazugehörigen Bronchi (Bronchi segmentales) und wurde als Lokalisation A2 bezeichnet. Die dritte Entnahmelokalisation befand sich im kaudalen Drittel des rechten Lungenhauptlappens (Lobus caudalis dexter), unter Einbeziehung des rechten Hauptbronchus (Bronchus lobaris caudalis dexter) und wurde als Lokalisation A3 bezeichnet. Die Lungenlokalisationen wurden auf diese Weise gewählt, um Spitzenund Hauptlappen unter Einbeziehung eines Segmentbronchus sowie kleinerer Bronchien und Bronchioli untersuchen zu können. Von den sechs verschiedenen Entnahmelokalisationen für die Infektionsversuche mit dem M. bovis-Feldstamm 1067, der klonalen Variante des M. bovis Typ-Stammes PG45 sowie für den Vakzinationsversuch wurden die Lokalisationen 4 und 6 sowie alle Lokalisationen mit Nekrosen immunhistologisch untersucht (Abbildung 3). Die Lokalisationen aus den postmortal entnommenen Lungengewebeproben aus den drei Infektionsversuchen wurden vorher definiert und aus der rechten und linken Lungehälfte gewonnen. Im Rahmen der Probenentnahme wurde aus der linken Lungenhälfte je eine Probe des Lobus cranialis, Pars cranialis (Lokalisation 1), des Lobus cranialis, Pars caudalis (Lokalisation 2) und des Lobus caudalis (Lokalisation 3) gewonnen. In der rechten Lungenhälfte wurde je eine Probe des Lobus caudalis (Lokalisation 4), des Lobus medius (Lokalisation 5) und des Lobus cranialis, Pars caudalis (Lokalisation 6) entnommen. Pro Lokalisation wurden zwei bis drei Paraffinblöcke angefertigt. Material und Methoden 41 Abbildung 2 Entnahmelokalisationen der Lungengewebeproben der lungengesunden Kontrolltiere (Schema der Rinderlunge, Dorsalansicht, modifiziert nach NICKEL et al. 1999) Lok. = Lokalisation a Lobus cranialis sinister, Pars cranialis b Lobus cranialis sinister, Pars caudalis c Lobus caudalis sinister d Lobus caudalis dexter e Lobus accessorius f Lobus medius dexter g Lobus cranialis dexter, Pars caudalis h Lobus cranialis dexter, Pars cranialis Lok. A1 h Lok. A2 a g f b e c d Lok. A3 linke Lungenhälfte rechte Lungenhälfte 42 Material und Methoden Abbildung 3 Lokalisationen der Lungengewebeproben für die drei Infektionsversuche (Schema der Rinderlunge, Dorsalansicht, modifiziert nach NICKEL et al. 1999) Lok. = Lokalisation a Lobus cranialis sinister, Pars cranialis b Lobus cranialis sinister, Pars caudalis c Lobus caudalis sinister d Lobus caudalis dexter e Lobus accessorius f Lobus medius dexter g Lobus cranialis dexter, Pars caudalis h Lobus cranialis dexter, Pars cranialis h e Lok. 1 Lok. 6 a g f b Lok. 5 Lok. 2 e c Lok. 3 linke Lungenhälfte d Lok. 4 rechte Lungenhälfte Material und Methoden 43 3.1.5 Fixation, Paraffineinbettung und physikochemische Färbemethode 3.1.5.1 Fixierung von Gewebeproben Die Probenentnahme von den lungengesunden Schlachtrindern erfolgte max. 30 Min. post mortem. Die Proben wurden für 24 bis 48 Stunden in 4%igem, gepufferten Formalin (pH 7,2) fixiert. Die Paraffineinbettung erfolgte routinemäßig max. 48 Stunden später. Das Probenmaterial aus dem Friedrich-Loeffler-Institut in Jena wurde am Tag der Sektion in 4%iges Formalin überführt und 24 Stunden lang fixiert. Die Paraffineinbettung wurde routinemäßig vor Ort durchgeführt. Die Fixierung der Gewebeproben aus dem Infektionsversuch mit einer klonalen Variante des M. bovis Typ-Stammes PG 45 erfolgte über 24 Stunden in 4%igem gepuffertem Formalin (pH 7,4 bis 7,6). Anschließend erfolgte die routinemäßige Einbettung in Paraffin, die an der CNEVA-Lyon stattfand. Die Fixierung in 4%igem, gepufferten Formalin der aus dem Infektionsversuch mit den Feldstämmen 1067 und dem französischen Feldstamm (Kapitel 3.1.3.2) sowie aus dem Vakzinationsversuch (Kapitel 3.1.3.3) stammenden Proben dauerte 72 Stunden. Die Paraffineinbettung erfolgte routinemäßig im Institut für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover. 3.1.5.2 Paraffineinbettung von Gewebeproben Das formalinfixierte Probenmaterial wurde in Paraplast Plus (Shandon/Firma ThermoElectron Corporation, Pittsburgh, PA, USA) in einem Automatensystem (Pathcenter, Shandon/Firma ThermoElectron Corporation, Pittsburg, PA, USA) eingebettet. Dabei wurden die Proben erst einem weiteren Formalinschritt unterzogen, bevor sie in Leitungswasser gespült wurden. Es folgte die Dehydrierung in einer aufsteigenden Alkoholreihe (2 x 86%iger Alkohol, 2 x 96%iger Alkohol, 2 x Isopropanol). Nach zwei Bädern in dem Intermedium Essigsäure-n-Butylester wurden die Proben über vier anschließende Paraffinbäder eingebettet. Sämtliche Vorgänge im Automatensystem fanden im Vakuum unter ständiger Rotation bei einer Temperatur von 60°C statt. Die Paraplast-Blöcke wurden bei Raumtemperatur und in 44 Material und Methoden Dunkelheit gelagert. Das Schneiden der ca. 4 μm dicken Paraffinschnitte wurde mit Hilfe eines Schlittenmikrotoms (HM 400, Fa. Microm International GmbH, Walldorf) durchgeführt. Im Anschluss wurden die Schnitte in einem Paraffinstreckbad (Gesellschaft für Labortechnik mbH, Burgwedel) bei 40°C gestreckt und zur besseren Haftung auf Superfrost® Plus Objektträger (Fa. Gerhard Menzel Glasbearbeitungswerk GmbH & Co. KG, Braunschweig) aufgezogen. Anschließend wurden sie für mindestens 60 Min. in einem Wärmeschrank (Fa. Heraeus Sepatech GmbH, Osterode) bei 70°C getrocknet und bei Raumtemperatur aufbewahrt. 3.1.5.3 Färbung von Paraffinschnitten mit Hämalaun-Eosin Die Färbung der Paraffinschnitte mit Hämalaun-Eosin (H&E) erfolgte in einem Färbeautomaten (Leica ST 4040, Leica Microsystems NussWell GmbH, Wetzlar). Von jeder in Paraffin eingebetteten Lungenlokalisation wurde zur histologischen Beurteilung ein Paraffinschnitt mit H&E gefärbt (Kapitel 9.3). Material und Methoden 3.2 45 Immunhistochemische Untersuchungen 3.2.1 Vorversuche zur Immunhistochemie Folgende fünf Antikörper wurden für die immunhistochemischen Untersuchungen eingesetzt: anti-iNOS, anti-NT, anti-Mn-SOD sowie Antikörperklone gegen S100A8 und S100A9. Für jede Reaktion wurde an den Paraffinschnitten des Lungengewebes die optimale Verdünnung des Primärantikörpers durch mehrere SchachbrettTitrationen und die optimale Demaskierungsmethode ermittelt (Kapitel 3.2.4). Als positive Kontrollen dienten Gewebe für die bekannt war, dass die verwendeten Antikörper eine spezifische Reaktivität zeigen (Kapitel 3.2.5). 3.2.2 Antikörper und Seren Zum immunhistologischen Nachweis der induzierbaren Stickoxidsynthase (iNOS), des Nitrotyrosins (NT), der Mangan-Superoxid-Dismutase (Mn-SOD), der Phagozytenmarker S100A8 und S100A9 sowie des Makrophagenmarkers CD68 wurden Paraffinschnitte verwendet und die Avidin-Biotin-Komplex (ABC)-Methode eingesetzt. Die verwendeten Primärantikörper sind in Tabelle 6 mit den Angaben zur Herkunft sowie der entsprechenden Demaskierungsart und Verdünnung aufgeführt. 3.2.2.1 Primärantikörper Der verwendete Primärantikörper wurde in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit Zusatz von 1%igem bovinem Serumalbumin (BSA) verdünnt. Die Sekundärantikörper sowie das Detektionssystem (ABC-Kit) wurden in PBS ohne Zusatz verdünnt. 46 Material und Methoden Folgende Primärantikörper wurden verwendet (Tabelle 6): Anti-induzierbare Stickoxid-Synthase (iNOS/NOSII), polyklonal, Kaninchen, Isotyp IgG (Fa. Upstate, Lake Placid, NY, USA; über Fa. Biomol, Hamburg) iNOS katalysiert die Reaktion von Arginin zu Citrullin, wobei NO als Reaktionsprodukt anfällt. In einer weiteren Reaktion entsteht aus Superoxid und NO Peroxinitrit, das in zwei weiteren Schritten mit Tyrosin durch die Mn-SOD in Nitrotyrosin umgewandelt wird (ISCHIROPOULUS et al. 1992). Dieser Antikörper detektiert iNOS-exprimierende Zellen in entzündeten, nekrotischen oder infizierten Geweben (FLIGGER et al. 1999) und bovine Makrophagen in in vitro-Kulturen (JUNGI et al. 1996a,b). Laut Hersteller besitzt Anti-iNOS eine spezifische Reaktivität für Maus, Rind, Schaf und Meerschweinchen. Anti-Nitrotyrosin (NT), polyklonal, Kaninchen, Isotyp IgG (Fa. Upstate, Lake Placid, NY, USA; über Fa. Biomol, Hamburg) NT ist ein Indikator für die Produktion von NO durch iNOS sowie eine stattgefundene Reaktion von NO mit Peroxynitrit (BECKMANN u. KOPPENOL 1996). NT wurde in humanen Lungenbiopsien im Rahmen einer Sepsis oder einer Pneumonie immunhistochemisch nachgewiesen; Kontrolllungen hingegen zeigten nur eine geringe Nitration (HADDAD et al. 1994; KOOY et al. 1995). Anti-Mangan-Superoxid-Dismutase (Mn-SOD), polyklonal, Kaninchen, Isotyp IgG (Fa. Upstate, Lake Placid, NY, USA; über Fa. Biomol, Hamburg) Die Superoxid-Dismutasen gehören zu den antioxidativen Enzymen einer Zelle und verhindern zerstörende, oxidative Prozesse (CHANG et al. 2001). Mn-SOD ist das wichtigste Antioxidans in Mitochondrien, dessen Hauptfunktion die Umwandlung von Superoxid darstellt (MacMILLAN-CROW u. CRUTHIRDS 2000). Mn-SOD katalysiert die Reaktion von Peroxinitrit und Tyrosin zu NT (ISCHIROPOULUS et al. 1992). Laut Hersteller zeigt dieser Antikörper eine Spezifität für Mensch, Maus, Ratte und Rind. Anti-S100A8 (MRP8, Calgranulin A), monoklonal, Maus, Klon S13.67, Isotyp IgG1 (Fa. BMA Biomedicals GmbH, Augst, Schweiz) Material und Methoden 47 Der Klon S13.67 detektiert MRP8, das auch S100A8 oder Calgranulin A genannt wird, eine Ca2+-bindende, leichte Untereinheit des inflammatorischen L-1 Proteinkomplexes. Dieser Antikörper bildet außerdem Disulfid-bindende Homodimere unter dem Einfluss von Hypochlorid, um eine chemotaktische Eigenschaft von MRP8 außer Kraft zu setzen (TEIGELKAMP et al. 1991). Im Gewebe wird MRP8 überwiegend von Makrophagen in der späten Phase der Entzündung gebildet (ODINK et al. 1987; DELABIE et al. 1990). In frühen Entzündungsphasen sind Endothelzellen positiv für MRP8 und MRP14. Anti-S100A9 (MRP14, Calgranulin B), monoklonal, Maus, Klon S36.48, Isotyp IgG1 (Fa. BMA Biomedicals GmbH, Augst, Schweiz) Der Klon S36.48 identifiziert die Ca2+ bindende 14kD Untereinheit des inflammatorischen L-1 Proteinkomplexes, der auch als S100A9 oder Calgranulin B bezeichnet wird. Dieser Antikörper detektiert zirkulierende Granulozyten oder entzündliche Infiltrate der Myelo-Monozyten-Abstammungslinie. Makrophagen synthetisieren MRP14 zunehmend in frühen Phasen der Entzündung (ODINK et al. 1987; DELABIE et al. 1990). Anti-CD68, monoklonal, Klon EBM11, Isotyp IgG1 (DakoCytomation GmbH, Hamburg) Der Antikörper wurde auf dem vierten internationalen Workshop für humane Leukozytenantigene klassifiziert (STOCKINGER et al. 1989) und reagiert mit einem 110 kDa Glykoprotein, welches primär intrazytoplasmatisch in Assoziation mit lysosomalen Granula vorkommt. Der Antikörper detektiert Makrophagen in den verschiedensten Geweben (ACKERMANN et al. 1994). Zusätzlich wird CD68 auch von Antigen-präsentierenden Zellen wie Langerhans-Zellen und interdigitierenden Retikulumzellen der TZellregionen von Tonsille und Lymphknoten exprimiert. Die Spezifität wurde mit Hilfe von Immunopräzipitation nachgewiesen. Eine spezifische Kreuzreaktivität mit bovinen CD68 tragenden Zellen wurde von BIELEFELDT-OHMANN et al. (1988) beschrieben. 48 Material und Methoden 3.2.2.2 Sekundärantikörper und Detektionssystem Folgende Sekundär-Antikörper wurden verwendet: a) biotinylierter Ziege-anti-Maus-Antikörper (Fa. Vector Laboratories, Burlingame, USA, Nr. BA-9200). b) biotinylierter Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper (Fa. Vector Laboratories, Burlingame, USA, Nr. BA-1000). Als Detektionssystem wurde verwendet: a) Avidin-Biotin-Peroxidase Komplex („Vectastain-ABC-Kit Elite“, Fa. Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA, PK-6100). 3.2.2.3 Färbemethoden in der Immunhistochemie Folgende Färbemethoden wurden verwendet: a) Färbung mittels 3,3´-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid (DAB): Zum Ansetzen der Lösung Auftauen eines „stock solution aliquot“, zusammengesetzt aus 0,1 g DAB und 50 ml PBS (Aufbewahrung bei -20°C unter Lichtausschluss), Verdünnung des „stock solution aliquots“ mit 150 ml PBS, anschließend Filtration durch zwei Faltfilter (Fa. Sartorius) sowie Zugabe von 2 ml 3%igem H2O2. b) Färbung mittels Peroxidase Substratkit AEC: Das AEC-(3-Amino-9-EthylCarbazol) Substratkit-System (Fa. Biologo, Kronshagen) enthält die 2 Komponenten Konzentrat und Substratpuffer, die in einem Verhältnis von 1:10 verdünnt werden. Material und Methoden 49 Tabelle 6 Herkunft, Demaskierungsverfahren und Verdünnung der Primärantikörper und der jeweils verwendeten Sekundärantikörper Antikörper Herkunft anti-iNOS/NOS II pAK, Upstate, Lake Placid, NY, USA anti-NT pAK, Upstate, Lake Placid, NY, USA anti- Mn-SOD pAK, Upstate, Lake Placid, NY, USA anti-S100A8 (MBP8) mAK, BMA Biomedicals AG, Augst, CH anti-S100A9 (MBP14) mAK, BMA Biomedicals AG, Augst, CH Demaskierung Saponin, 20 Min., Brutschrank, 37°C Saponin, 20 Min., Brutschrank, 37°C Saponin, 20 Min., Brutschrank, 37°C Verdünnung Sekundärantikörper 1:50 GaR-b 1:150 GaR-b 1:200 GaR-b Citratpuffer, 3 x 5 Min. Mikrowelle 1:600 GaM-b Citratpuffer, 3 x 5 Min. Mikrowelle 1:8000 GaM-b Pronase E, 40 Min., 1:20 GaM-b anti-CD68 Brutschrank, 37°C iNOS = induzierbare Stickoxidsynthase; NT = Nitrotyrosin; Mn-SOD = Mangan-Superoxid-Dismutase; S100A8 (MRP8) = Calgranulin A, Phagozytenmarker; S100A9 (MRP14) = Calgranulin B, Phagozytenmarker; CD68 = Makrophagenmarker; mAK = monoklonaler Antikörper; pAK = polyklonaler Antikörper; GaR-b = biotinyliertes Ziege-anti-Kaninchen-IgG; GaM-b = biotinyliertes Ziege-anti-Maus IgG mAK, DAKOCytomation GmbH, Hamburg 50 Material und Methoden 3.2.3 Protokoll der Immunhistochemie Der immunhistologische Nachweis der verschiedenen Antigene wurde nach der Avidin-Biotin-Komplex (ABC)-Methode durchgeführt. 1. Entparaffinierung der Paraffinschnitte in der absteigenden Alkoholreihe für jeweils 2 bis 3 Min. in Roti®-Histol 1 bis 3 (Roth C. GmbH & Co. KG, Karlsruhe), für jeweils 5 Min. in Isopropanol, in 96%igem, in 70%igem sowie in 50%igem Alkohol 2. Hemmung der endogenen Peroxidase in einer frisch angesetzten, 0,5%igen H2O2-Lösung, bestehend aus 70%igem Ethanol (197 ml) und 3 ml 30%igem H2O2 3. Dreimaliges Spülen der Schnitte für jeweils 5 Min. in PBS unter langsamem Rühren (Anhang) 4. Demaskierung der Antigene durch, je nach verwendetem Primärantikörper, verschiedene Behandlungen (Tabelle 6 und Kapitel 3.2.4) 5. Dreimaliges Spülen der Schnitte für jeweils 5 Min. in PBS unter langsamem Rühren 6. Überführung der Schnitte aus der Küvette in Shandon Coverplates® (Fa. Shandon Sequenza, Pittsburgh, USA) 7. Überschichtung jedes Schnittes mit 150 μl von 1:5 in PBS verdünntem ZiegenNormalserum für 20 Min. bei Raumtemperatur zur Blockierung elektrostatischer Bindungsstellen 8. Inkubation mit je 150 μl des in PBS mit 1%igem bovinem Serumalbumin verdünnten Primärantikörpers über Nacht bei 4°C 9. Erwärmen der Schnitte auf Raumtemperatur für ca. 30 Min., anschließend dreimaliges Spülen der Schnitte mit PBS 10. Auftragen des 1:200 in PBS verdünnten Sekundärantikörpers (Tabelle 6), Inkubation für 30 Min. bei Raumtemperatur Material und Methoden 51 11. Dreimaliges Spülen der Schnitte für jeweils 5 Min. in PBS 12. Überschichtung der Schnitte mit je 150 μl der ABC-Gebrauchslösung (Ansatz ca. 30 Min. vor Gebrauch mit 1 ml PBS unter Zufügung von 15 μl Reagenz A, gut schütteln, dann Zusatz von 15 μl Reagenz B, erneut gut schütteln) und Inkubation für 30 Min. bei Raumtemperatur 13. Dreimaliges Spülen der Schnitte für jeweils 5 Min. in PBS, wenn mit DAB (3,3´-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid) gefärbt wird, anschließendes Verbringen der Schnitte in eine mit PBS gefüllte Glasküvette 14. Je nach Antikörper: a. Inkubation mit der DAB-Gebrauchslösung für 5 Min. unter ständigem Rühren auf dem Magnetrührer bei Raumtemperatur (Kapitel 3.2.2.3) b. Inkubation mit jeweils 150 μl Peroxidase Substratkit AEC für 30 Min. bei Raumtemperatur (Kapitel 3.2.2.2) 15. Dreimaliges Spülen der Schnitte für jeweils 5 Min. in PBS; anschließend Verbringen der Schnitte in fließendes, kaltes Leitungswasser für 5 Min. 16. Gegenfärbung der Schnitte in Hämalaun nach Mayer (ROMEIS, 1989) für 2 bis 3 Min., je nach gewünschter Stärke der Gegenfärbung 17. Bläuen der Schnitte in fließendem Leitungswasser für ca. 10 Min. 18. Je nach Färbung: a. Die mit DAB gefärbten Schnittte werden in die aufsteigende Alkoholreihe überführt und jeweils für 2 bis 3 Min. in 50%igem, 70%igem und 96%igem Alkohol und für je 5 Min. in Isopropanol und Roti®-Histol 1 bis 3 (Roth C. GmbH & Co. KG, Karlsruhe) verbracht. Anschließend werden die Schnitte mit dem Roti®-Histokitt (Roth C. GmbH & Co. KG, Karlsruhe) eingedeckt b. Die mit AEC gefärbten Schnitte werden nicht in die Alkoholreihe verbracht, sondern sofort im Anschluß an die Spülung mit fließendem 52 Material und Methoden Leitungswasser mit im Wasserbad auf 50°C vorgewärmtem Glycergel® (Fa. DakoCytomation GmbH, Hamburg) eingedeckt Die eingesetzten Verdünnungen der paraffingängigen Antikörper und deren Demaskierungen sowie die Herstellungsverfahren der Gebrauchslösungen sind aus Tabelle 6, Kapitel 3.2.4 und Kapitel 9.4 im Anhang zu entnehmen. 3.2.4 Demaskierungsverfahren Demaskierung mit Citratpuffer in der Mikrowelle Bei dieser Art der Demaskierung wurden die Schnitte in einer Glasküvette in ein mit Citratpuffer (Kapitel 9.4.2) gefülltes, mikrowellengeeignetes Gefäß verbracht. Der Citratpuffer wurde in der Mikrowelle bei 900 Watt zum Sieden gebracht. Die Paraffinschnitte wurden in Zeitintervallen von jeweils 5 Min. dreimal nacheinander bei 900 Watt gekocht. Nach dieser Behandlung kühlten die Schnitte im Citratpuffer bei Raumtemperatur für ca. 10 Min. ab. Demaskierung in 0,1% Saponin-Lösung 0,2 g Saponinpulver (Fa. VWR TM International GmbH, Darmstadt, ehemals Fa. Merck KGaA, Darmstadt) wurden in 200 ml, auf ca. 37°C vorgewärmtem PBS unter Rühren aufgelöst. Eine Inkubation über 20 Min. erfolgte im Wasserbad bei einer Temperatur von 37°C (modifiziert nach FLIGGER et al. 1999). Demaskierung in 0,05% Pronase E-Lösung 0,1 g Pronase E (Fa. VWR TM International GmbH, Darmstadt, ehemals Fa. Merck KGaA, Darmstadt) und 0,2 g CaCl2 x 2 H2O (Fa. VWR TM International GmbH, Darmstadt, ehemals Fa. Merck KgaA, Darmstadt) wurden in 200 ml auf 37°C vorgewärmtem PBS gelöst. Mit 1 N NaOH wurde der pH-Wert auf 7,4 eingestellt. Eine Inkubation der Schnitte über 40 Min. erfolgte im Wasserbad bei einer Temperatur von 37°C . Material und Methoden 53 3.2.5 Kontrollen in der Immunhistochemie Die Antigenspezifität aller verwendeten, kommerziell erhältlichen Antikörper wird von den Herstellerfirmen mit dem ISO-Zertifikat garantiert. Laut Hersteller besitzt der zum Nachweis von iNOS verwendete Antikörper spezifische Reaktivität für Maus, Rind, Schaf und Meerschweinchen. Der zum Nachweis von Mn-SOD verwendete Antikörper zeigt laut Hersteller Spezifität für Mensch, Maus, Ratte und Rind. (Kapitel 3.2.2.1). Als Positivkontrolle dienten Formalin-fixierte, histopathologisch unveränderte Paraffinschnitte aus der Großhirnrinde von Kälbern aus dem Sektionsgut des Institutes für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover. Für die Antikörper gegen CD68, S100A8 und S100A9 wurden Paraffinschnitte von Lungenlymphknoten gesunder Schlachtrinder (Kapitel 3.1.2) als positive Kontrolle eingesetzt. Als Negativkontrolle wurde jeweils ein Lungenschnitt von jedem untersuchten Tier verwendet und anstelle des Primärantikörpers mit PBS inkubiert. 3.3 Auswertung und Dokumentation 3.3.1 Lichtmikroskopische Beurteilung Für die Auswertung der H&E-gefärbten Schnittpräparate und der immunhistologischen Reaktionen wurde ein Standard-Binokular-Lichtmikroskop (Fa. Carl Zeiss AG, Oberkochen) verwendet. 3.3.2 Auswertung und Morphometrie Zur Bestimmung der Expression von iNOS, NT und Mn-SOD bei den verschiedenen Lungenveränderungen wurde aufgrund der in den H&E-gefärbten Paraffinschnitten der Lungengewebeproben aus den Lokalisationen A4 und A6 vorliegenden histopathologischen Veränderungen eine Einteilung in folgende Pneumonieformen vorgenommen: Interstitielle Pneumonie, katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie und nekrotisierende Pneumonie. Zusätzlich wurden Veränderungen wie eitrige 54 Material und Methoden Bronchitis/-iolitis und obliterierende Bronchiolitis beurteilt. Zur näheren Charakterisierung der Makrophagen in den einzelnen Lungenkompartimenten wurden die Phagozytenmarker S100A8 und S100A9 eingesetzt. Die Anzahl der Makrophagen in den einzelnen Lungenkompartimenten aller Kälber wurde semiquantitativ am H&E-Schnitt bestimmt. Alle Lungengewebeproben, die Nekrosen aufwiesen, wurden gesondert aufgeführt. Der Primärantikörper anti-CD68 wurde nur bei den Lungenlokalisationen, die Nekrosen aufwiesen, eingesetzt. Die Ergebnisse der immunhistologischen Untersuchung der Lungenlokalisationen 4 und 6 der infizierten Kälber sowie die der Kontrolltiere mit diesem Antikörper sind in der Dissertation von THOMASMEYER (2006) beschrieben. Die Einteilung der unterschiedlichen pneumonischen Veränderungen erfolgte nach einem semiquantitativen Schema, wobei zunächst alle Lungenlokalisationen einzeln beurteilt wurden und anschließend nach einem Score zusammengefasst wurden. Die semiquantitative Auswertung erfolgte durch einen Score von – (keine Veränderungen des Lungengewebes) bis +++ (hochgradige Veränderung des Lungengewebes) in Bezug auf die jeweilig vorhandenen pneumonischen Läsionen, das Vorhandensein bestimmter Zelltypen oder das Expressionsmuster der verschiedenen Antikörper (Tabelle 7). Da in den verschiedenen Lungenlokalisationen eines einzigen Tieres teilweise gravierende Lungenveränderung, als Unterschiede auch sowohl unterschiedliche im Ausprägungsgrad Pneumonieformen einer in den verschiedenen, untersuchten Lungenlokalisationen auftraten, wurde ein weiterer Score in Form eines Zahlenscores erstellt. Dieser diente dazu, den Ausprägungsgrad sowie die vorherrschende Pneumonieformen eines einzelnen Kalbes zusammenzufassen (Tabelle 7). Aus der Summe des Zahlenscores der einzelnen Lungenlokalisationen eines Tieres wurde der Median für die jeweilig beurteilte Pneumonieform eines Tieres ermittelt. Nach Erstellung und Ausrechnung des Zahlenscores wurde die Tabelle wieder in den semiquantitativen Score überführt (Tabelle 7). Die semiquantitativ ermittelten Daten für die Makrophagenzahl bei infizierten Tieren und Kontrolltieren wurden statistisch mittels Wilcoxon Rangsummen Test mit Hilfe des Statistikprogrammes „Statistical Analysis System“ (SAS, Version 9.1) für Material und Methoden 55 Windows ausgewertet. Zuvor wurden die ermittelten Daten einer Untersuchung auf Normalverteilung unterzogen. Bei allen Berechnungen wurde ein p-Wert von kleiner als 0,05 (p < 0,05) als statistisch signifikant angesehen. Die Ergebnisse dieser statistischen Untersuchung wurden in Boxplot-Diagrammen aufgeführt, die mit dem Programm SPSS (Superior Performing Software Systems, Version 15.0) erzeugt wurden. Die Auswertung des Expressionsmusters von iNOS, NT und Mn-SOD bzw. von S100A8, S100A9 und CD68 erfolgte ebenfalls semiquantitativ nach dem genannten Score von – bis +++, da eine Auszählung der immunhistochemisch positiven Zellen aufgrund des Verteilungsmusters nicht möglich war. Auf die histopathologischen Veränderungen des BALT wurde in dieser Arbeit nicht näher eingegangen, da diese in den Dissertationen von BUCHENAU (2003) und THOMASMEYER (2006) beschrieben wurden. Tabelle 7 Verwendeter semiquantitativer Score und Zahlenscore zur Einteilung der Lungengewebeproben aus den drei verschiedenen Infektionsversuchen nach den jeweiligen pneumonischen Veränderungen Gering- Ausprägung/ Expression negativ Geringst- Gering- bis Mittel- gradig gradig mittel- gradig gradig Semiquantitativer Score Zahlenscore Mittelbis hochgradig Hochgradig - (+) + +(+) ++ ++(+) +++ 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3.3.3 Fotografische Dokumentation Die fotografische Darstellung erfolgte mit dem Mikroskop Axiophot (Fa. Carl Zeiss AG, Oberkochen) und mit Elite Chrome 160 T Diafilmen (Fa. Kodak GmbH, Stuttgart). Ergebnisse 57 4 Ergebnisse 4.1 Histologische Befunde bei den Kontrolltieren und Lungenveränderungen bei den infizierten Tieren 4.1.1 Histologische Befunde bei lungengesunden Kontrolltieren Von den insgesamt 20 pathomorphologisch lungengesunden Kontrollkälbern (Lfd. Nr. 1 bis 20; Kapitel 3.1.2, Tabelle 1) zeigten alle Tiere eine geringgradige, meist sublobulär begrenzte Lymphozyten, neutrophilen Infiltration Plasmazellen, Granulozyten. der Interalveolarsepten eosinophilen Ein Granulozyten gemischtzelliger Saum mit und aus Makrophagen, vereinzelten Lymphozyten, Plasmazellen und Makrophagen sowie vereinzelten eosinophilen und neutrophilen Granulozyten fand sich bei nahezu allen Tieren subepithelial an der Basalmembran größerer Bronchien. Mit Ausnahme eines Tieres (Lfd. Nr. 1) wurde im Bronchialepithel aller Tiere eine geringe Anzahl von Lymphozyten und Plasmazellen festgestellt. Bei drei Tieren (Lfd. Nr. 15 bis 17) konnten intraepithelial liegende Makrophagen verzeichnet werden. Vereinzelte neutrophile sowie eosinophile Granulozyten fanden sich ebenfalls intraepithelial bei der Mehrzahl der Kontrolltiere. Intraluminal in den größeren und kleineren luftleitenden Wegen wurden bei der Mehrzahl der Tiere Makrophagen, die sich auf der Oberfläche des Bronchialepithels bzw. des Epithels der Bronchioli befanden, verzeichnet. In den Lumina der Bronchien war eine geringstgradige Anzahl dieser Makrophagen zu verzeichnen, intraluminal in den Bronchioli eine geringgradige Anzahl. Außerdem konnte bei den meisten Tieren das Vorliegen einer durchschnittlich geringstgradig manifestierten Alveolarhistiozytose verzeichnet werden. Eine gering- bis mittelgradige Proliferation des Bronchus-assoziierten, lymphatischen Gewebes (BALT) wurde bei fast allen Kälbern verzeichnet. Des Weiteren konnten bei allen Kontrolltieren überwiegend gering- bis mittelgradig ausgeprägte, agonale Veränderungen in Form eines akuten, diffusen, alveolären Lungenemphysems und –ödems sowie einer akuten, diffusen Stauungshyperämie diagnostiziert werden. Bei einigen Tieren wurde zusätzlich ein akutes, diffuses, interstitielles Lungenemphysem beobachtet. 58 Ergebnisse 4.1.2 Histologische Befunde bei experimentell mit M. bovis infizierten Kälbern In Tabelle 8 und in Tabelle 9 werden alle 30 experimentell mit M. bovis infizierten Kälber der drei Infektionsversuche sowie die zu den Versuchen gehörenden fünf Kontrolltiere aufgelistet und nach vorliegenden Pneumonieformen unterteilt. Die Erstellung des Scores zur Zusammenfassung der teilweise nebeneinander auftretenden, verschiedenen Lungenveränderungen in den verschiedenen Lungenlokalisationen eines Tieres wurde in Material und Methoden in Kapitel 3.3.2 beschrieben. Ausgenommen von Tabelle 8 sind die Tiere, die eine nekrotisierende Pneumonie aufweisen. Diese werden als eine gesondert zusammengefasste Gruppe in Tabelle 9 dargestellt. Überwiegend wurden die drei unterschiedlichen Pneumonieformen interstitielle Pneumonie, katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie sowie nekrotisierende Pneumonie diagnostiziert. Zusätzlich wurden die Ausprägungsgrade weiterer entzündlicher Veränderungen, wie eitrige Bronchitis und/oder Bronchiolitis und obliterierende Bronchiolitis, bestimmt. Die Anzahl alveolärer Makrophagen (Alveolarhistiozytose) wurde ebenfalls beurteilt. Einige Tiere mit einer mittel- bis hochgradigen Alveolarhistiozytose wiesen mehrkernige, alveoläre Makrophagen auf. Bei der Mehrzahl der Tiere lagen lobulär begrenzt in den verschiedenen Lungenlokalisationen mehrere, verschiedene Pneumonieformen und/oder sonstige entzündliche Veränderungen nebeneinander vor. Für die Tiere mit nekrotisierender Pneumonie wurde die Anzahl der Lungenlokalisationen pro Kalb, in denen Nekrosen vorlagen, in Tabelle 9 angegeben. Die interstitielle Pneumonie war durch eine Entzündungszellinfiltration in den interalveolären Septen gekennzeichnet, wobei in den meisten Fällen eine gemischtzellige, interstitielle Pneumonie mit Vorliegen von vereinzelten neutrophilen Granulozyten, Makrophagen, Lymphozyten und einigen Plasmazellen im Septum interalveolare auftrat. Bei dem Vorliegen von eitrigen Bronchitiden bzw. Bronchiolitiden zeigten sich überwiegend neutrophile Granulozyten und Makrophagen, die sich sowohl Ergebnisse 59 intraepithelial und subepithelial in der Lamina propria mucosae als auch teilweise in geringgradiger Anzahl im Lumen der Bronchien und Bronchioli fanden. Die katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie war durch massives Auftreten von überwiegend neutrophilen Granulozyten und Makrophagen gekennzeichnet, die sich teilweise nesterartig in den Alveolarräumen bis zu einer vollständigen Verdichtung des Lungenparenchyms anordneten (Abbildung 27). In den Lumina der Bronchien und Bronchioli dominierten vor allem neutrophile Granulozyten sowie in geringerem Ausmaß Makrophagen und Lymphozyten. Diese Entzündungszellpopulationen fanden sich zudem intraepithelial und subepithelial in der Lamina propria mucosae sowie in den verbreiterten Interalveolarsepten. Bei einer obliterierenden Bronchiolitis lag eine Lumenverlegung der Bronchioli durch Fibroblasten und Kollagenfasern sowie einigen Makrophagen und neutrophilen Granulozyten vor (Abbildung 24). Das Epithel der obliterierten Bronchioli zeigte in den meisten Fällen eine starke Vakuolisierung des Zytoplasmas. Bei insgesamt 11 Kälbern wurde eine nekrotisierende Pneumonie festgestellt. Die Mehrzahl dieser Tiere zeigte eine nekrotisierende Pneumonie mit folgendem Aufbau: Zentral befand sich ein Nekroseareal aus eosinophilem, amorphem, azellulärem Material, das von zwei verschiedenen, gut voneinander abgrenzbaren Entzündungszellwällen demarkiert wurde. An den Rand der Nekrose schloß sich ein zirkulärer Saum aus teilweise zerfallenden, neutrophilen Granulozyten an. Den äußeren Demarkationswall bildeten Makrophagen, auf die oft noch ein schmaler Saum aus Fibroblasten und Kollagenfasern folgte. Bei sechs von elf Kälbern mit nekrotisierender Pneumonie wurde histomorphologisch in einigen Lokalisationen ein leicht abweichender Aufbau der Nekrosen beobachtet. Bei diesen Tieren waren nekrotische Überreste von Alveolarstrukturen und diffus im veränderten Gewebe verteilte Makrophagen und neutrophile Granulozyten erkennbar. In einigen Fällen wurden die nekrotischen Alveolarstrukturen von schmalen Bindegewebsepten unterteilt und zeigten in der Peripherie teilweise schmale Randsäume Fibroblasten. aus neutrophilen Granulozyten, Makrophagen und 60 Ergebnisse Bei fünf der sechs Tiere wurden außer M. bovis auch andere bakterielle Erreger wie Arcanobacterium pyogenes, Mannheimia haemolytica und Pasteurella multocida isoliert (Tabelle 2, Tabelle 3 und Tabelle 5). 4.1.3 Entzündliche und sonstige Lungenveränderungen bei experimentell mit M. bovis infizierten Kälbern ohne Nekrosen Die Einteilung der 24 experimentell mit M. bovis infizierten Kälber ohne Nekrosen nach vorliegenden Pneumonieformen und sonstigen entzündlichen Lungenveränderungen wurde in Tabelle 8 aufgeführt. Bei der Mehrzahl der Kälber dieser Gruppe (20/24) lag, teilweise neben anderen pneumonischen Veränderungen, eine interstitielle Pneumonie vor. Eine eitrige Bronchitis/-iolitis trat bei sieben Kälbern auf. Bei acht Tieren wurde eine katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie beobachtet. Nur zwei Kälber (2/24) wiesen in einigen Lungenlokalisationen eine obliterierende Bronchiolitis auf. Eine Alveolarhistiozytose konnte zusätzlich bei der Mehrzahl der Tiere (16/24) dieser Gruppe verzeichnet werden. Bei den meisten Kälbern ohne Nekrosen traten verschiedene Lungenveränderungen miteinander kombiniert auf, wie aus Tabelle 8 zu entnehmen ist. Ergebnisse 61 Tabelle 8 Entzündliche und sonstige Lungenveränderungen bei experimentell mit M. bovis infizierten Kälbern ohne Nekrosen Lfd.Nr. Tierbzw. ENr. Interstitielle Pneumonie Eitrige Kat.-eitrige Obl. Bronchitis/- Broncho- Bronchio- iolitis pneumonie litis Alveolarhistiozytose 212 2 + (+) 2 23 7 + + 242 8 +(+) (+) + 2 25 9 + (+) 262 10 ++(+) + + 2 27 12 +(+) +(+) 282 13 + + + + 2 29 * E* + + 303* 1504/99* + 3 32 1506/99 + + 3 34 1508/99 ++ (+) (+) 353 1509/99 +(+) + +(+) 363 1510/99 + (+) +(+) (x) +(+) 393 1513/99 + (+) 4 40 * 2934/00* 414* 2935/00* 4 43 2937/00 + + 444 2938/00 + 4 45 2939/00 ++ (x) + 4 46 2940/00 + + (+) 484 2942/00 + + + 4 49 2943/00 (+) + 544 2948/00 + (+) 554 2949/00 ++ Lfd. Nr. = Laufende Nummer; bzw. = beziehungsweise; E-Nr. = Einsendungsnummer; kat.-eitrig = katarrhalisch-eitrig; obl.Bronchiolitis = obliterierende Bronchiolitis; * = Kontrolltier; (x) = nicht in allen untersuchten Lungenlokalisationen vorhanden; - = negativ; (+) = geringstgradig; + = geringgradig; +(+) = gering- bis mittelgradig; ++ = mittelgradig; ++(+) = mittel- bis hochgradig; +++ = hochgradig; 2 Tiere aus dem Infektionsversuch, die mit einer klonalen Variante des M. bovis-Stammes PG45 infiziert wurden; 3 Tiere, die mit dem M bovis-Feldstamm 1067 oder dem französischen M. bovis-Feldstamm infiziert wurden; 4 Tiere aus dem Vakzinationsversuch, die mit dem M. bovis-Feldstamm 1067 infiziert wurden 62 Ergebnisse 4.1.4 Entzündliche und sonstige Lungenveränderungen bei experimentell mit M. bovis infizierten Kälbern mit Nekrosen Die Einteilung der elf experimentell mit M. bovis infizierten Kälber mit Nekrosen nach vorliegenden Pneumonieformen und sonstigen entzündlichen Lungenveränderungen ist in Tabelle 9 wiedergegeben. Bei allen elf Tieren dieser Gruppe wurde in einer oder mehreren Lungenlokalisationen eine nekrotisierende Pneumonie mit mehreren Nekroseherden pro Paraffinschnitt verzeichnet. Sechs Kälber, bei denen aus dem Lungengewebe außer M. bovis noch weitere bakterielle Erreger wie Pasteurella multocida, Arcanobacterium pyogenes und Mannheimia haemolytica isoliert wurden, wiesen zusätzlich ein anderes morphologisches Erscheinungsbild der Nekrosen auf (Kapitel 4.1.2). In der Mehrzahl der Fälle lag bei Kälbern mit Nekrosen eine katarrhalischeitrige Bronchopneumonie vor (8/11). Im Gegensatz zu den Tieren ohne Nekrosen zeigten sechs der elf Kälber mit nekrotisierender Pneumonie zusätzlich obliterierende Bronchiolitiden. Eine Alveolarhistiozytose mit maximal mittel- bis hochgradigem Ausprägungsgrad konnte bei zehn von elf Kälbern mit Nekrosen verzeichnet werden. Die bei den einzelnen Kälbern mit Nekrosen vorliegende Kombination der pneumonischen und entzündlichen Lungenveränderungen ist aus Tabelle 9 ersichtlich. Bei der Mehrzahl der Tiere war eine mehr oder weniger deutliche Proliferation des BALT zu vermerken, das die Bronchien und Bronchioli zum Teil vollständig umschloss und in einigen Fällen sogar Keimzentren ausbildete. Ergebnisse 63 Tabelle 9 Experimentell mit M. bovis infizierte Kälber mit nekrotisierender Pneumonie Lfd.Nr. Tierbzw. ENr. Interstitielle Pneumonie Eitrige Kat.- Obl. Anzahl der Bronchitis/- eitrige Bronchio- Lok. mit iolitis BrPn. litis Nekrosen Alveolarhistiozytose 222 5 ++ ++ - - 3 +++ 313* 1505/99 + + ++ x 1 ++ 333 1507/99 (+) (+) ++(+) x 4 ++ 373 1511/99 + - ++ - 1 +(+) 383 1512/99 - - ++ (x) 7 ++(+) 424 2936/00 - + +++ x 10 ++ 474 2941/00 - (+) +++ - 2 ++ 504 2944/00 - - ++ - 1 - 514 2945/00 ++ + - - 1 + 524 2946/00 - +(+) - (x) 5 ++(+) 534 2947/00 - + +(+) (x) 2 ++ Lfd. Nr. = Laufende Nummer; bzw. = beziehungsweise; E-Nr. = Einsendungsnummer; kat.-eitrige BrPn. = katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie; obl. Bronchiolitis = obliterierende Bronchiolitis; * = Kontrolltier; x = in allen untersuchten Lokalisationen vorhanden; (x) = nicht in allen untersuchten Lungenlokalisationen vorhanden; Lok. = Lungenlokalisationen; - = negativ; (+) = geringstgradig; + = geringgradig; +(+) = gering- bis mittelgradig; ++ = mittelgradig; ++(+) = mittel- bis hochgradig; +++ = hochgradig; 2 Gruppe 2 der Tiere aus dem ersten Infektionsversuch, die mit der klonalen Variante des M. bovisStammes PG45 infiziert wurden; 3 Gruppe 3 der Tiere, die aus dem zweiten Infektionsversuch stammten und mit dem M. bovisFeldstamm 1067 sowie dem französischen M. bovis-Feldstamm infiziert wurden; 4 Gruppe 4 der Tiere aus dem dritten Infektionsversuch, dem Vakzinationsversuch, die mit dem M. bovisFeldstamm 1067 infiziert wurden 64 Ergebnisse 4.1.5 Vergleich der Makrophagenzahlen in verschiedenen Lungenkompartimenten zwischen Kontrolltieren, Tieren ohne und mit Nekrosen Die Anzahl der Makrophagen in den Lumina von Bronchien und Bronchioli war bei den Tieren ohne Nekrosen im Vergleich zu den Kontrolltieren erhöht. Eine Erhöhung der Makrophagenzahl ließ sich auch bei den Tieren mit Nekrosen im Vergleich zu Tieren ohne Nekrosen feststellen. Ein signifikanter Unterschied bestand allerdings nur bei den Tieren mit Nekrosen im Vergleich zu den Kontrolltieren (Abbildung 4). Die Zahl der Makrophagen in der Lamina propria mucosae der Bronchien nahm bei den Kälbern ohne und mit Nekrosen im Vergleich zu den Kontrolltieren signifikant zu. Eine geringgradige Erhöhung ließ sich auch bei den Tieren mit Nekrosen im Vergleich zu den Tieren ohne Nekrosen feststellen, allerdings ergab sich hier keine Signifikanz (Abbildung 5). Die Anzahl der alveolären Makrophagen sowie die Zahl der Makrophagen im Septum interalveolare waren bei Tieren ohne und mit Nekrosen im Vergleich zu den Kontrolltieren signifikant erhöht. Eine signifikante Zunahme der Makrophagen bestand ebenfalls bei Tieren mit Nekrosen im Vergleich zu Tieren ohne Nekrosen. (Abbildung 6 und Abbildung 7). In Bezug auf die Makrophagenzahl in den hochgradig infiltrierten Lungenarealen bei Tieren mit katarrhalisch-eitriger Bronchoneumonie ergab sich eine Zunahme der Makrophagenzahl bei den Kälbern mit Nekrosen im Vergleich zu den Kälbern ohne Nekrosen, allerdings war der Unterschied nicht signifikant (Abbildung 8). Die p-Werte der einzelnen Gruppenvergleiche sind in Tabelle 19 im Anhang (Kapitel 9.1) aufgeführt. Ergebnisse 65 Abbildung 4 Vergleich der semiquantitativ bestimmten Anzahl der Makrophagen in den Lumina der Bronchien und Bronchioli im H&E-Schnitt zwischen Kontrolltieren, Kälbern ohne Nekrosen und Kälbern mit Nekrosen KT = Kontrolltiere ToN = Tiere ohne Nekrosen TmN = Tiere mit Nekrosen Ausreißerwert Extremwert Maximum 75% Quartil Median 25% Quartil Minimum p < 0,05 Abbildung 5 Vergleich der semiquantitativ bestimmten Anzahl der Makrophagen in der Lamina propria mucosae im H&E-Schnitt zwischen Kontrolltieren, Kälbern ohne Nekrosen und Kälbern mit Nekrosen KT = Kontrolltiere ToN = Tiere ohne Nekrosen TmN = Tiere mit Nekrosen Ausreißerwert Extremwert Maximum 75% Quartil Median 25% Quartil Minimum p < 0,05 66 Ergebnisse Abbildung 6 Vergleich der semiquantitativ bestimmten Anzahl der alveolären Makrophagen im H&E-Schnitt zwischen Kontrolltieren, Kälbern ohne Nekrosen und Kälbern mit Nekrosen KT = Kontrolltiere ToN = Tiere ohne Nekrosen TmN = Tiere mit Nekrosen Ausreißerwert Extremwert Maximum 75% Quartil Median 25% Quartil Minimum p < 0,05 Abbildung 7 Vergleich der semiquantitativ bestimmten Anzahl der Makrophagen im Septum interalveolare im H&ESchnitt zwischen Kontrolltieren, Kälbern ohne Nekrosen und Kälbern mit Nekrosen KT = Kontrolltiere ToN = Tiere ohne Nekrosen TmN = Tiere mit Nekrosen Ausreißerwert Extremwert Maximum 75% Quartil Median 25% Quartil Minimum p < 0,05 Ergebnisse 67 Abbildung 8 Vergleich der semiquantitativ bestimmten Anzahl der Makrophagen im eitrig entzündeten Lungenparenchym im H&E-Schnitt zwischen Kontrolltieren, Kälbern ohne Nekrosen und Kälbern mit Nekrosen KT = Kontrolltiere ToN = Tiere ohne Nekrosen TmN = Tiere mit Nekrosen Ausreißerwert Extremwert Maximum 75% Quartil Median 25% Quartil Minimum p < 0,05 68 4.2 Ergebnisse Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchungen 4.2.1 Immunhistochemische Untersuchungen an Lungengewebeproben der Kontrolltiere 4.2.1.1 Expression von iNOS Bei allen Kontrolltieren (Kapitel 3.1.2, Tabelle 1) konnte eine feingranuläre, in der AEC-Färbung rote, intrazytoplasmatische Expression für iNOS der in den interalveolären Septen gelegenen Makrophagen verzeichnet werden. Bei der Mehrzahl der Tiere lagen vereinzelte, alveoläre Makrophagen pro Paraffinschnitt vor, die sich positiv für iNOS zeigten. In den Lumina der großen Bronchien fanden sich bei 5 der 20 Tiere einzelne Makrophagen auf der Oberfläche des Epithels, die eine positive Reaktion für iNOS aufwiesen. Eine geringgradige Anzahl subepithelial gelegener, für iNOS positiver Makrophagen war bei Kalb Nummer 2 zu verzeichnen. Der Flimmersaum des Bronchialepithels zeigte keine Expression für iNOS. Im BALT gelegene Makrophagen wiesen keine positive Reaktion für iNOS auf. Bei allen Kontrolltieren wurde eine positive immunhistochemische Reaktion des Epithels der Bronchien und Bronchioli (Abbildung 9 und Abbildung 10), der glatten Muskulatur um die Bronchien und Bronchioli, der Tunica media der muskelstarken Venen, der Chrondrozyten des Bronchialknorpels sowie der Bronchialdrüsen (Abbildung 11) für iNOS verzeichnet. Im Septum interalveolare wurde außer iNOSpositiven Makrophagen teilweise eine feingranuläre, extrazelluläre Reaktion verzeichnet (Abbildung 9 und Abbildung 10). Die Ergebnisse der iNOS-Expression an Lungengewebeproben der lungengesunden Kontrolltiere sind in Tabelle 10 im Anhang aufgeführt (Kapitel 9.1.). Ergebnisse 69 4.2.1.2 Expression von NT Wie für iNOS beschrieben, stellte sich in den interalveolären Septen eine mittelgradige Zahl an Makrophagen NT-positiv dar, die ein feingranuläres, intrazytoplasmatisches, in der AEC-Färbung rotes Reaktionsprodukt aufwiesen. Knapp die Hälfte aller vorhandenen, intraalveolären Makrophagen pro Lungenlokalisation zeigte ein positives immunhistologisches Ergebnis für NT. Bei fünf Kontrollkälbern wiesen die vereinzelt in den Lumina der größeren Bronchien liegenden Makrophagen eine positive Reaktion für NT auf. Der Flimmersaum des Bronchialepithels sowie subepithelial gelegene Makrophagen zeigten keine Expression für NT. Das BALT des Tieres mit der laufenden Nummer 12 stellte sich insgesamt deutlich positiv für NT dar, wohingegen das Bronchus-assoziierte lymphatische Gewebe der übrigen lungengesunden Kontrollkälber nur vereinzelte NT-positive Makrophagen aufwies. Das Epithel der Bronchien und Bronchioli sowie die Bronchialdrüsen zeigten eine positive Reaktion für NT. Die glatte Muskulatur um die Bronchien und Bronchioli, die Tunica media der muskelstarken Venen sowie das Zytoplasma der Chondrozyten des Bronchialknorpels wiesen ebenfalls eine positive Expression für NT auf. Die Ergebnisse der NT-Expression an Lungengewebeproben der lungengesunden Kontrolltiere sind in Tabelle 11 im Anhang aufgeführt (Kapitel 9.1). 4.2.1.3 Expression von Mn-SOD Eine geringgradige Anzahl an Makrophagen im Septum interalveolare zeigte ein MnSOD-positives, in der AEC-Färbung rotes, intrazytoplasmatisches, feingranuläres Reaktionsprodukt bei allen Kontrolltieren. Bei Kälbern, die eine Alveolarhistiozytose aufwiesen, zeigte die Hälfte der pro Paraffinschnitt vorhandenen, intraalveolären Makrophagen eine positive Expression für Mn-SOD. Mn-SOD-positive Makrophagen fanden sich ebenfalls innerhalb der größeren Bronchien dreier Kälber. Der Flimmersaum der Epithelzellen von Bronchien und Bronchioli sowie subepithelial gelegene Makrophagen stellten sich bei allen Tieren negativ für Mn-SOD dar. Im BALT fanden sich ebenfalls keine Mn-SOD-positiven Zellen. 70 Ergebnisse Die Epithelzellen der Bronchien und Bronchioli wiesen ein Mn-SOD-positives Reaktionsprodukt auf (Abbildung 12 und Abbildung 13), ebenso wie die Chondrozyten des Bronchialknorpels, die glatte Muskulatur um Bronchien und Bronchioli, die Bronchialdrüsen und die Tunica media der größeren Lungenvenen. Positiv für Mn-SOD stellten sich auch die Ganglienzellen pulmonaler Ganglien dar. Intra- und periganglionär wurde ein granuläres bzw. feinfädiges Reaktionsprodukt verzeichnet, wobei es sich vermutlich um transversale bzw. longitudinale Anschnitte von Nervenfasern handelte (Abbildung 14). Die Ergebnisse der Mn-SOD-Expression an Lungengewebeproben der lungengesunden Kontrolltiere sind in Tabelle 12 im Anhang aufgeführt (Kapitel 9.1). 4.2.1.4 Expression von S100A8 Im Septum interalveolare konnte bei allen Kontrolltieren eine mittelgradige Anzahl S100A8-positiver Makrophagen ermittelt werden, die ein deutliches, in der Färbung mit DAB braunes, intrazytoplasmatisches Reaktionsprodukt aufwiesen. Bei der Mehrzahl der Kontrollkälber lag in den intraalveolären Makrophagen ein deutliches Reaktionsprodukt für S100A8 vor. In den Lumina der Bronchien und Bronchioli zeigten die vereinzelt vorliegenden Makrophagen ebenfalls eine intensive Reaktion für S100A8. Im Gegensatz zu der Expression von iNOS, NT und Mn-SOD zeigte die Hälfte der die Lamina propria mucosae der Bronchien infiltrierenden Makrophagen pro Paraffinschnitt bei der Mehrzahl der Tiere eine positive Reaktion für S100A8. Sieben Kontrollkälber (Lfd. Nr. 7, 6, 10, 11, 12, 15, 16) wiesen im BALT eine geringst- bis geringgradige Anzahl deutlich S100A8-positiver Makrophagen in fast allen untersuchten Lokalisationen auf. Die Tiere Nummer 14 bis 16 zeigten in einer oder mehreren Lungenlokalisationen eine hochgradige Anzahl S100A8-positiver Makrophagen im BALT. Bei zwei Tieren (Lfd. Nr. 15 und 16) fanden sich das Epithel der Bronchien durchwandernde Makrophagen, die eine intensive Reaktion für S100A8 zeigten. Tier Nummer 17 zeigte in einer Lokalisation einzelne, intraepithelial gelegene, S100A8-positive neutrophile Granulozyten. Ergebnisse 71 4.2.1.5 Expression von S100A9 In den interalveolären Septen aller Kontrolltiere ließ sich, wie für die Expression von S100A8 beschrieben, eine mittelgradige Anzahl deutlich S100A9-positiver Makrophagen ermitteln, die in der DAB-Färbung ein braunes, intrazytoplasmatisches Reaktionsprodukt zeigten. Die intraalveolären Makrophagen wiesen ein mit S100A8 übereinstimmendes Färbemuster für S100A9 auf (Kapitel 4.2.1.4). Intraluminal in Bronchien und Bronchioli lag bei der Mehrzahl der Kontrollkälber eine durchschnittlich geringstgradige Anzahl an Makrophagen vor, die ein deutliches Reaktionsprodukt für S100A9 zeigten. Subepithelial in der Lamina propria mucosae nahezu aller lungengesunden Tiere lag eine geringgradige Infiltration mit Makrophagen vor, von denen 50% pro Paraffinschnitt eine intensiv positive Reaktion für S100A9 aufwiesen. Bei acht der 24 Kälber ohne Nekrosen wurde in einigen Lungenlokalisationen eine geringgradige Zahl S100A9-positiver Makrophagen im BALT verzeichnet. In jeweils einer Lokalisation der Tiere Nummer 15 und 17 fanden sich im Lumen der Bronchien vereinzelte neutrophile Granulozyten, die S100A9 exprimierten. 72 Ergebnisse Abbildung 9 Lunge, Kontrolltier Lfd. Nr. 19, Lokalisation A1 Zwei Bronchioli mit positiver Reaktion des Epithels (E, Pfeile) und positiver Reaktion der Tunica media (T.m.) eines venösen Blutgefäßes (offene Pfeilköpfe). Feingranuläre, positive Reaktion im Septum interalveolare (geschlossener Pfeilkopf) L: Lumina der Bronchioli iNOS-Immunhistochemie (AEC) Balken = 70 µm Abbildung 10 Lunge, Kontrolltier Lfd. Nr. 19, Lokalisation A1 Ausschnittsvergrößerung aus Abbildung 9 Bronchiolus mit positiver Reaktion des Epithels (E, Pfeil) und feingranulärer, positiver Reaktion im Septum interalveolare (Pfeilköpfe) L: Lumen des Bronchiolus iNOS-Immunhistochemie (AEC) Balken = 35 µm Abbildung 11 Lunge, Kontrolltier Lfd. Nr. 19, Lokalisation A1 Positive Reaktion des Bronchialdrüsenepithels iNOS-Immunhistochemie (AEC) Balken = 35 µm Ergebnisse 73 Abbildung 12 Lunge, Kontrolltier Lfd. Nr. 1, Lokalisation A2 Bronchialschleimhaut mit positiver Reaktion des Bronchialepithels (E, Pfeil) L: Bronchiallumen L. p. m.: Lamina propria mucosae Mn-SOD-Immunhistochemie (AEC) Balken = 35 µm Abbildung 13 Lunge, Kontrolltier Lfd. Nr. 1, Lokalisation A2 Bronchiolus mit positiver Reaktion des Epithels (E, Pfeil) und positiven Makrophagen (Pfeilköpfe) im Septum interalveolare L: Lumen des Bronchiolus Mn-SOD-Immunhistochemie (AEC) Balken = 35 µm Abbildung 14 Lunge, Kontrolltier Lfd. Nr. 1, Lokalisation A2 Pulmonale Ganglien mit positiver Reaktion der Ganglienzellen (geschlossene Pfeilköpfe). Extrazelluläre Reaktion intra- und periganglionärer Strukturen, vermutlich Nervenfaseranschnitte (offene Pfeilköpfe). Mn-SOD-Immunhistochemie (AEC) Balken = 35 µm 74 Ergebnisse 4.2.2 Immunhistochemische Untersuchungen an Lungengewebeproben der experimentell mit M. bovis infizierten Kälber ohne Nekrosen 4.2.2.1 Expression von iNOS Die Zahl der iNOS-exprimierenden Makrophagen in den verschiedenen, entzündlich veränderten Lungenkompartimenten wurde in Tabelle 13 im Anhang dargestellt (Kapitel 9.1). Bei den Tieren, die eine interstitielle Pneumonie aufwiesen, konnte gegenüber den Kontrolltieren keine erhöhte Anzahl iNOS-positiver Makrophagen im Septum interalveolare verzeichnet werden. Tiere mit katarrhalisch-eitriger Bronchopneumonie zeigten in den durch Infiltration von Entzündungszellen verdichteten Lungenarealen diffus verteilte, iNOS-positive Makrophagen sowie eine geringere Anzahl iNOSexprimierender neutrophiler Granulozyten. In jeweils einer Lungenlokalisation zweier Tiere waren zudem nesterartig angeordnete, neutrophile Granulozyten in dem verdichteten Lungenparenchym zu verzeichnen, die eine positive Reaktion für iNOS zeigten und teilweise von iNOS-exprimierenden Makrophagen umschlossen wurden. In den Lumina der Bronchien und Bronchioli befand sich im Vergleich zu den Kontrolltieren und insbesondere bei Kälbern mit katarrhalisch-eitriger Bronchopneumonie sowie eitriger Bronchitis/-iolitis eine erhöhte Anzahl an intraluminalen Makrophagen und neutrophilen Granulozyten, die eine positive Expression für iNOS aufwiesen. Bei vier der sieben Tiere mit eitriger Bronchitis/-iolitis ließen sich einzelne, iNOS-exprimierende, neutrophile Granulozyten im Bronchialepithel nachweisen. In der Lamina propria mucosae der Tiere, die eine katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie oder eine eitrige Bronchitis/-iolitis aufwiesen, ließ sich eine gegenüber den Kontrolltieren erhöhte Infiltration mit Makrophagen sowie neutrophilen Granulozyten nachweisen, wobei ein Drittel beider Zelltypen iNOS exprimierte. Bei den zwei Kälbern dieser Gruppe, bei denen eine obliterierende Bronchiolitis vorlag, wurden ein iNOS-positives balloniertes Epithel sowie iNOS-exprimierende, zwischen den lumenverlegenden Fibroblasten und Ergebnisse 75 Kollagenfasern gelegene Makrophagen verzeichnet. Die neutrophilen Granulozyten in diesen Arealen wiesen keine Reaktion für iNOS auf. Beim Vergleich mit den Kontrolltieren war bei den experimentell mit M. bovis infizierten Kälbern ohne Nekrosen pro Lungenlokalisation eine erhöhte Anzahl an alveolären Makrophagen zu verzeichnen, von denen sich etwa die Hälte iNOSpositiv zeigte. In den interalveolären Septen, die unmittelbar an mit iNOSexprimierenden Makrophagen angefüllte Alveolarräume angrenzten, wiesen die Makrophagen in den Septen keine positive Reaktion für iNOS auf. Die Makrophagen im BALT zeigten bei allen Kälbern ohne Nekrosen eine iNOS-positive Reaktion. Die Färbung des Epithels der Bronchien und Bronchioli, der Bronchialdrüsen, der Chondrozyten des Bronchialknorpels, der Tunica media der muskelstarken venösen Lungengefäße sowie der glatten Muskulatur um die größeren luftleitenden Wege entsprach bei allen Tieren dieser Gruppe dem Reaktionsbild der Kontrolltiere. Der Flimmersaum des Bronchialepithels war bei zehn Kälbern, die überwiegend eine katarrhalisch-eitrige Bronchopneumponie und/oder eine eitrige Bronchitis/-iolitis aufwiesen, iNOS-positiv. 4.2.2.2 Expression von NT Die Zahl der NT-exprimierenden Makrophagen in den verschiedenen, entzündlich veränderten Lungenkompartimenten wurde in Tabelle 14 im Anhang dargestellt (Kapitel 9.1). Das Expressionsmuster von NT war mit dem im vorherigen Kapitel (Kapitel 4.2.2.1) beschriebenen Reaktionsbild von iNOS vergleichbar. Dies galt größtenteils für das Expressionsmuster bei Tieren mit interstitieller Pneumonie, eitriger Bronchitis/iolitis, katarrhalisch-eitriger Bronchopneumonie, obliterierender Bronchiolitis und Alveolarhistiozytose. Im Gegensatz zum Reaktionsbild von iNOS exprimierte pro Paraffinschnitt nur etwa die Hälfte der intraluminal in Bronchien und Bronchioli vorliegenden Makrophagen bei einigen Kälbern mit eitriger Bronchitis/-iolitis und/oder katarrhalisch-eitriger Bronchopneumonie NT. Die in den Lumina der Bronchien gelegenen neutrophilen 76 Ergebnisse Granulozyten zeigten im Gegensatz zu der Expression von iNOS nicht bei allen Tieren eine positive Reaktion für NT. Gegensätzlich zu dem Expressionsmuster von iNOS zeigten die durch das Bronchialepithel wandernden neutrophilen Granulozyten bei den Kälbern mit eitriger Bronchitis/-iolitis keine Reaktivität für NT. Im Gegensatz zu dem Reaktionsmuster von iNOS stellte sich der Flimmersaum des Bronchialepithels bei allen Kälbern dieser Gruppe negativ für NT dar. Das Epithel der Bronchien und Bronchioli, die Chondrozyten des Bronchialknorpels sowie die glatte Muskulatur zeigten, wie bei den Kontrolltieren beschrieben, eine NT-positive Reaktion. 4.2.2.3 Expression von Mn-SOD Die Zahl der Mn-SOD-exprimierenden Makrophagen in den verschiedenen, entzündlich veränderten Lungenkompartimenten wurde in Tabelle 15 im Anhang dargestellt (Kapitel 9.1). Die Mn-SOD-exprimierenden Zellen zeigten größtenteils ein ähnliches Expressionsmuster wie in den beiden vorherigen Kapiteln (Kapitel 4.2.2.1 und 4.2.2.2) für iNOS und NT beschrieben; allerdings wiesen die Mn-SOD- exprimierenden Makrophagen eine insgesamt stärkere Farbintensität auf, und die neutrophilen Granulozyten zeigten in den veränderten Lungenkompartimenten keine Expression für Mn-SOD. Bei Tieren mit interstitieller Pneumonie wurde, im Gegensatz zu der mit den Antikörpern gegen iNOS und NT erzielten Reaktion, eine erhöhte Anzahl Mn-SODpositiver Makrophagen im Septum interalveolare verzeichnet (Abbildung 15). Bei Kälbern mit katarrhalisch-eitriger Bronchopneumonie fanden sich in den durch Entzündungszellen verdichteten Arealen des Lungenparenchyms diffus verteilte, MnSOD-exprimierende Makrophagen, die bei einigen Tieren nesterartig angeordnete neutrophile Granulozyten demarkierten (Fehler! Verweisquelle konnte nicht gefunden werden.). Wie für die Expression von NT beschrieben, exprimierte die Hälfte der pro Paraffinschnitt in den Lumina der Bronchien und Bronchioli vorliegenden Ergebnisse 77 Makrophagen Mn-SOD. Im Gegensatz zum immunhistologischen Bild von iNOS und NT waren die das Bronchialepithel durchwandernden Makrophagen in einigen Lungenlokalisationen bei Tieren mit eitriger Bronchitis/-iolitis und/oder katarrhalisch-eitriger Bronchopneumonie positiv für Mn-SOD. Wie schon für die Antikörper anti-iNOS und anti-NT beschrieben, exprimierte ein Drittel der die Lamina propria mucosae infiltierenden Makrophagen Mn-SOD. Die zwischen Kollagenfasern den lumenverlegenden befindlichen Bindegewebsfasern, Makrophagen bei Kälbern Fibroblasten mit und obliterierender Bronchiolitis sowie einzelne ballonierte Epithelzellen dieser veränderten Bronchioli zeigten eine deutliche Expression für Mn-SOD (Abbildung 25 und Abbildung 26). Etwa ein Drittel der alveolären Makrophagen stellte sich Mn-SOD-positiv dar. Die Makrophagen in den interalveolären Septen, die direkt an mit Makrophagen gefüllte Alveolarräume angrenzten, wiesen eine deutlich verminderte bis gar keine Expression für Mn-SOD auf. Bei den meisten Kälbern fanden sich pro Lungenlokalisation und BALT einige MnSOD-positive Makrophagen. Wie für das Reaktionsmuster von NT beschrieben, zeigte der Flimmersaum des Bronchialepithels keine Reaktion. Wie bei den Kontrolltieren beobachtet, ließ sich eine Mn-SOD-positive Reaktion im Epithel der Bronchien und Bronchioli, der Chondrozyten des Bronchialknorpels, der Bronchialdrüsen sowie der glatten Muskulatur um Bronchien und Bronchioli und der Tunica media der venösen Lungengefäße verzeichnen. 78 Ergebnisse Abbildung 15 Lunge, Tier mit Nekrose Lfd. Nr. 26, Lokalisation 6 Interstitielle Pneumonie mit Verbreiterung der Interalveolarsepten durch Infiltration mit Entzündungszellen, unter denen sich positive Makrophagen (Pfeilköpfe) befinden Mn-SOD-Immunhistochemie (AEC) Balken = 33 µm 4.2.2.4 Expression von S100A8 Im Vergleich mit den Kontrolltieren ließ sich eine deutlich erhöhte Anzahl an S100A8positiven Makrophagen sowie S100A8-exprimierenden neutrophilen Granulozyten im Lungengewebe der Kälber ohne Nekrosen feststellen. Im Septum interalveolare bei Tieren mit interstitieller Pneumonie wurde im Gegensatz zu den in den drei vorherigen Kapiteln beschriebenen Antikörpern (Kapitel 4.2.2.1, 4.2.2.2 und 4.2.2.3) eine leicht erhöhte Anzahl an S100A8-positiven Makrophagen festgestellt, ebenso in den verdichteten Lungenbereichen bei Tieren mit katarrhalisch-eitriger Bronchopneumonie. Diffus verteilte Makrophagen im hochgradig infiltrierten Lungenparenchym zeigten eine ähnliche Reaktion wie iNOS, NT und Mn-SOD, aber auch Makrophagen, die die Alveolarräume nesterartig ausfüllten, waren S100A8-positiv. Diffus verteilte oder nesterartig angeordnete neutrophile Granulzyten in diesen Bereichen exprimierten ebenfalls S100A8. Alle intraluminal in Bronchien und Bronchioli vorliegenden Makrophagen und neutrophilen Granulozyten bei Tieren mit eitriger Bronchitis/-olitis und/oder katarrhalisch-eitriger Bronchopneumonie waren S100A8-positiv. Intraepithelial gelegene Makrophagen und neutrophile Granulozyten exprimierten bei Kälbern mit diesen pneumonischen Veränderungen S100A8. Die gegenüber den Kontrolltieren erhöhte Anzahl an Makrophagen in der Lamina propria mucosae bei Tieren mit Ergebnisse 79 eitriger Bronchitis/-iolitis und/oder katarrhalisch-eitriger Bronchopneumonie wies zu einem Drittel eine positive Reaktion für S100A8 auf und zeigte somit keine Unterschiede zum Expressionsmuster von iNOS, NT und Mn-SOD. Die bei einzelnen Tieren in einigen Lungenlokalisationen vorliegenden, subepithelial gelegenen neutrophilen Granulozyten exprimierten ebenfalls S100A8. Das Expressionsmuster von S100A8 bei Tieren mit obliterierender Bronchiolitis unterschied sich nicht von dem von iNOS und NT, da die zwischen den lumenverlegenden Fibroblasten und Kollagenfasern gelegenen Makrophagen und neutrophilen Granulozyten eine positive Reaktion für S100A8 zeigten. Alle in den Alveolarräumen vorliegenden Makrophagen bei Kälbern mit einer Alveolarhistiozytose exprimierten S100A8, wobei sich die Zellen im Septum interalveolare nahezu negativ für S100A8 darstellten, wenn die angrenzenden Alveolarräume mit Makrophagen angefüllt waren. Das Expressionsmuster von S100A8 zeigte im Gegensatz zu den Kontrolltieren sowie den Reaktionen von iNOS, NT und Mn-SOD nur bei wenigen Kälbern in einigen Lungenlokalisationen einzelne S100A8-positive Makrophagen im BALT. 4.2.2.5 Expression von S100A9 Das Expressionsmuster von S100A9 entsprach weitestgehend dem in Kapitel 4.2.2.4 beschriebenen Reaktionsbild von S100A8, deshalb werden hier lediglich die Unterschiede im Expressionsmuster beider S-100 Proteine hervorgehoben. Die in den Lumina der Bronchien und Bronchioli gelegenen neutrophilen Granulozyten bei Kälbern mit eitriger Bronchitis/-iolitis und/oder katarrhalisch-eitriger Bronchopneumonie (siehe Tabelle 8), die für S100A8 alle eine positive Reaktion aufwiesen, zeigten sich bei der immunhistologischen Untersuchung mit S100A9 nur zu zwei Drittel pro Bronchiallumen positiv. 80 Ergebnisse 4.2.3 Immunhistochemische Untersuchungen an Lungengewebeproben der experimentell mit M. bovis infizierten Kälber mit Nekrosen 4.2.3.1 Expression von iNOS Die Zahl der iNOS-exprimierenden Makrophagen in den verschiedenen, entzündlich veränderten Lungenkompartimenten der Tiere mit Nekrosen wurden in Tabelle 16 im Anhang wiedergegeben (Kapitel 9.1). Der die Nekrosen ringförmig umschließende Wall aus Makrophagen stellte sich bei allen Tieren mit Nekrosen iNOS-positiv dar (Abbildung 20 und Abbildung 21). Tiere mit abweichendem Aufbau der Nekrosen (Kapitel 4.1.2) zeigten eine diffuse Verteilung iNOS-positiver Makrophagen in und um nekrotische Alveolarstrukturen. Das äußere Drittel des sich an den Makrophagensaum anschließenden Ringes aus neutrophilen Granulozyten wies ebenfalls bei über der Hälfte der Tiere und in der Mehrzahl der Lungenlokalisationen eine deutliche Expression für iNOS auf. Das aus Zelldetritus bestehende Zentrum der Nekrosen zeigte sich bei drei von elf Tieren diffus positiv für iNOS. In den zumeist komplett verdichteten Bereichen um die Nekrosen fanden sich bei den meisten Tieren diffus verteilte iNOS-positive Makrophagen. Bei Kälbern mit interstitieller Pneumonie und Tieren mit katarrhalisch-eitriger Bronchopneumonie, die nur sublobulär eine interstitielle Pneumonie aufwiesen, ergab sich gegenüber den Kälbern ohne Nekrosen kein Unterschied im Expressionsmuster. Im Vergleich zu den Kontrolltieren war allerdings eine erhöhte Anzahl an iNOS-positiven Makrophagen im Septum interalveolare zu verzeichnen. Bei Tieren, die neben dem Vorliegen von Nekrosen eine katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie zeigten, ergaben sich keine Abweichungen im Vergleich zu den Kälbern ohne Nekrosen hinsichtlich der iNOS-exprimierenden Makrophagen in den verdichteten Lungenarealen. Die gegenüber den Kontrolltieren erhöhte Anzahl an Makrophagen und neutrophilen Granulozyten in den Lumina der Bronchien und Bronchioli bei den Tieren, die neben Ergebnisse 81 einer nekrotisierenden Pneumonie eine katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie aufwiesen, war wie bei den Kälbern ohne Nekrosen iNOS-positiv. In der Lamina propria mucosae lag bei allen Tieren mit Nekrosen eine gegenüber den Kontrolltieren erhöhte Infiltration mit Makrophagen und teilweise neutrophilen Granulozyten vor, die allerdings im Vergleich zu den Tieren ohne Nekrosen bei weniger Kälbern dieser Gruppe (6/11 Tieren) eine iNOS-positive Reaktion zeigten. Wie bei den Tieren ohne Nekrosen exprimierte ein Drittel der subepithelial gelegenen Makrophagen iNOS. Bei Tieren mit nekrotisierender Pneumonie trat im Gegensatz zu den Tieren ohne Nekrosen weit häufiger eine obliterierende Bronchiolitis auf, wobei das Expressionsmuster von iNOS bei dieser Veränderung im Vergleich zu den Tieren ohne Nekrosen keine Abweichungen zeigte (Kapitel 4.2.2.1). Gegenüber den Kontrolltieren und den Kälbern ohne Nekrosen lag bei Tieren mit nekrotisierender Pneumonie eine deutlich stärker ausgeprägte Alveolarhistiozytose vor, wobei sich ein Großteil der alveolären Makrophagen pro Paraffinschnitt iNOSpositiv zeigte. Eine geringgradige Anzahl neutrophiler Granulozyten wurde bei einigen Tieren in den Alveolarräumen verzeichnet, allerdings ohne eine iNOSpositive Reaktion zu zeigen. In den interalveolären Septen, die unmittelbar an mit iNOS-exprimierenden Makrophagen angefüllte Alveolarräume angrenzten, wiesen die in den Septen liegenden Makrophagen keine Reaktion für iNOS auf. Im Gegensatz zu den Kontrolltieren und den Tieren ohne Nekrosen zeigten die Makrophagen im BALT nur bei einem Kalb mit Nekrosen eine iNOS-positive Reaktion. Der Flimmersaum des Bronchialepithels exprimierte bei Tieren mit nekrotisierender Pneumonie iNOS, zeigte aber bei den Kontrolltieren und den Kälbern ohne Nekrosen keine Reaktion. Wie bei den Kontrollkälbern exprimierten das Epithel der Bronchien und Bronchioli, die Chondrozyten des Bronchialknorpels, die Bronchialdrüsen sowie die glatte Muskulatur um die luftleitenden Wege und die Tunica media der venösen Lungengefäße iNOS. 82 Ergebnisse 4.2.3.2 Expression von NT Die Zahl der NT-exprimierenden Makrophagen in den verschiedenen, entzündlich veränderten Lungenkompartimenten der Tiere mit Nekrosen wurde in Tabelle 17 im Anhang wiedergegeben (Kapitel 9.1). Wie im vorherigen Kapitel (Kapitel 4.2.3.1) für die Expression von iNOS beschrieben, stellte sich der Ring aus Makrophagen um die Nekrosen sowie das äußere Drittel der sich an den Makrophagensaum anschließenden neutrophilen Granulozyten NTpositiv dar (Abbildung 22). Kälber, die in wenigen Lungenlokalisationen einen leicht abweichenden Aufbau der Nekrosen aufwiesen (Kapitel 4.1.2), zeigten eine diffuse Verteilung NT-exprimierender Makrophagen in und um nekrotische Alveolarstrukturen. Im Zentrum der Nekrosen fanden sich bei drei der elf Tiere diffuse, NT-positive Signale. In den zumeist komplett verdichteten Bereichen in der unmittelbaren Peripherie der Nekrosen fanden sich bei der Mehrzahl der Tiere diffus verteilte, NT-exprimierende Makrophagen. In Bezug auf das Reaktionsmuster der Makrophagen in den interalveolären Septen von Kälbern mit interstitieller Pneumonie sowie der Makrophagen in dem verdichteten Lungenparenchym der Tiere mit katarrhalisch-eitriger Bronchopneumonie ergaben sich keine Unterschiede zwischen der Expression von iNOS und NT (Kapitel 4.2.3.1). Etwa die Hälfte der in den Lumina der Bronchien und Bronchioli vorliegenden Makrophagen pro Bronchiallumen war NT-positiv. Mit Ausnahme einiger Lungenlokalisationen von sieben Tieren, bei denen sich weniger als die Hälfte der intraluminal in Bronchien und Bronchioli auffindbaren neutrophilen Granulozyten NTpositiv zeigten, waren die in den Bronchiallumina vorhandenen neutrophilen Granulozyten der übrigen Kälber und Lungenlokalisationen negativ für NT. Subepithelial gelegene Makrophagen stellten sich nur bei drei von elf Kälbern zu einem Drittel NT-positiv dar. Die in der Lamina propria mucosae vorliegenden neutrophilen Granulozyten wiesen kein Reaktionsprodukt für NT auf. Vergleichbar mit dem Expressionsmuster von iNOS, NT, Mn-SOD, S100A8 und S100A9 der Tiere ohne Nekrosen zeigte das ballonierte Epithel obliterierter Ergebnisse 83 Bronchioli sowie die zwischen den lumenverlegenden Bindegewebsfasern, Fibroblasten und Kollagenfasern befindlichen Makrophagen und neutrophilen Granulozyten eine NT-positive Reaktion. Die Hälfte der alveolären Makrophagen pro Paraffinschnitt exprimierte NT, somit lagen bei Tieren mit Nekrosen keine Abweichungen in Bezug auf die Anzahl der NTpositiven Alveolarmakrophagen gegenüber den Kontrolltieren und den Kälbern ohne Nekrosen vor. Makrophagen in den interalveolären Septen, die unmittelbar an mit Makrophagen angefüllte Alveolarräume angrenzten, zeigten keine Expression für NT. In den Alveolarräumen liegende neutrophile Granulozyten waren, wie beim Expressionsmuster der Kälber ohne Nekrosen beschrieben, negativ für NT. Im Gegensatz zu den Kontrolltieren und den Tieren ohne Nekrosen fanden sich nur bei zwei der elf Kälber mit Nekrosen NT-exprimierende Makrophagen im BALT. Im Gegensatz zu dem Expressionsmuster von iNOS stellte sich der Flimmersaum des Bronchialepithels bei dem Großteil der Kälber überwiegend negativ für NT dar. Das Epithel der Bronchien und Bronchioli, die Chondrozyten des Bronchialknorpels, die Bronchialdrüsen sowie die glatte Muskulatur um Bronchien und Bronchioli und die Tunica media der Lungenvenen stellten sich wie bei den Kontrolltieren NT-positiv dar. 4.2.3.3 Expression von Mn-SOD Die Mn-SOD-exprimierenden Makrophagen in den verschiedenen, entzündlich veränderten Lungenkompartimenten der Tiere mit Nekrosen wurden in Tabelle 18 im Anhang wiedergegeben (Kapitel 9.1). Wie für das Expressionsmuster von Mn-SOD für die Kälber ohne Nekrosen beschrieben, wich das Reaktionsmuster nur insofern von der Expression von iNOS und NT ab, als dass die neutrophilen Granulozyten in einigen entzündlich veränderten Lungenkompartimenten keine Expression für Mn-SOD zeigten. In Bezug auf die Mn-SOD-positiven Makrophagen um die Nekrosen ergaben sich im Vergleich zu der Expression von iNOS und NT keine Unterschiede im Expressionsmuster (Abbildung 23). 84 Ergebnisse Eine geringere Anzahl der im Septum interalveolare gelegenen Makrophagen stellte sich gegenüber den Kontrolltieren und den Tieren ohne Nekrosen, bei Tieren mit interstitieller Pneumonie sowie bei Tieren mit katarrhalisch-eitriger Bronchopneumonie, die nur eine sublobulär begrenzte interstitielle Pneumonie aufwiesen, Mn-SOD-positiv dar. Bei Kälbern, die neben einer nekrotisierenden Pneumonie eine katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie aufwiesen, ergaben sich hinsichtlich der Mn-SOD-exprimierenden Makrophagen in den verdichteten Lungenarealen keine Unterschiede im Hinblick auf das Expressionsmuster von iNOS und NT (Fehler! Verweisquelle konnte nicht gefunden werden.). Die in verdichteten Lungenbereichen gelegenen neutrophilen Granulozyten zeigten bei keinem der Kälber eine Expression für Mn-SOD. Ein Drittel der innerhalb der Lumina von Bronchien und Bronchioli vorkommenden Makrophagen bei einer katarrhalisch-eitrigen Bronchopneumonie wies eine positive Reaktion für Mn-SOD auf. Die Makrophagen, die subepithelial in der Lamina propria mucosae vorlagen, waren bei den meisten Tieren negativ für Mn-SOD mit Ausnahme von sechs Kälbern, bei denen in jeweils zwei Lungenlokalisationen einige der subepithelial gelegenen Makrophagen eine Mn-SOD-positive Reaktion zeigten. In der Lamina propria mucosae und innerhalb des Epithels der Bronchien gelegene neutrophile Granulozyten stellten sich negativ für Mn-SOD dar. Wie für das Reaktionsmuster der Kälber ohne Nekrosen beschrieben, zeigten einzelne ballonierte Epithelzellen obliterierter Bronchioli sowie die zwischen den lumenverlegenden Fibroblasten und Kollagenfasern vorhandenen Makrophagen eine Mn-SOD-positive Reaktion (Abbildung 25 und Abbildung 26). Bei Tieren mit nekrotisierender Pneumonie trat im Gegensatz zu den Tieren ohne Nekrosen häufiger eine obliterierende Bronchiolitis auf, wobei das Expressionsmuster von Mn-SOD bei dieser Veränderung im Vergleich zu den Tieren ohne Nekrosen keine Abweichungen zeigte (Kapitel 4.2.2.3). Die alveolären Makrophagen, die gegenüber den Kontrolltieren und den Kälbern ohne Nekrosen in signifikant erhöhter Anzahl bei Tieren mit Nekrosen vorhanden waren, waren im Gegensatz zu dem Expressionsmuster von iNOS und NT nur zu Ergebnisse 85 einem Viertel der pro Paraffinschnitt insgesamt vorhandenen Alveolarmakrophagen Mn-SOD-positiv. Neutrophile Granulozyten in den Alveolarräumen stellten sich für Mn-SOD negativ dar. Je höher der Anteil an intraalveolären Makrophagen ausfiel, desto weniger Mn-SOD wurde von in den angrenzenden Interalveolarsepten gelegenen Makrophagen exprimiert. Die Makrophagen im BALT zeigten bei den Kälbern mit Nekrosen wie bei den Kontrolltieren keine Reaktion für Mn-SOD. Der Flimmersaum des Bronchialepithels exprimierte, wie bei den Kontrolltieren und den Tieren ohne Nekrosen, kein Mn-SOD. Das Epithel der Bronchien und Bronchioli, die Bronchialdrüsen, die Chondrozyten des Bronchialknorpels sowie die glatte Muskulatur um die größeren luftleitenden Wege und die Tunica media der venösen Lungengefäße zeigten eine Mn-SODpositive Reaktion, womit kein Unterschied zu den Kontrolltieren und den Kälbern ohne Nekrosen zu verzeichnen war. 4.2.3.4 Expression von S100A8 Die ringförmig um die Nekrosen liegenden Makrophagen zeigten sich bei allen Kälbern mit nekrotisierender Pneumonie S100A8-positiv (Abbildung 18). Zwei Drittel des sich an den äußeren Saum aus Makrophagen anschließenden Walls aus neutrophilen Granulozyten exprimierte ebenfalls S100A8 (Abbildung 18). Bei Tieren, die einen leicht abweichenden Aufbau der Nekrosen aufwiesen (Kapitel 4.1.2), waren in und um nekrotische Alveolarstrukturen S100A8-positive Makrophagen und neutrophile Granulozyten zu verzeichnen. Das überwiegend aus Zelldetritus bestehende Zentrum der Nekrosen wies bei allen Tieren eine mittelgradig positive Reaktion für S100A8 auf. In den an die Nekrosen angrenzenden, durch Entzündungszellen verdichteten Lungenbereichen wurden zahlreiche, diffus verteilte, S100A8-exprimierende Makrophagen verzeichnet. Im Septum interalveolare bei Tieren mit interstitieller Pneumonie sowie in den verdichteten Lungenbereichen bei Kälbern mit katarrhalisch-eitriger Bronchopneumonie exprimierte eine gegenüber den Kontrollkälbern und den 86 Ergebnisse Kälbern ohne Nekrosen erhöhte Zahl von Makrophagen S100A8. Neutrophile Granulozyten waren in diesen Lungenkompartimenten ebenfalls S100A8-positiv. Alle in den Lumina der Bronchien und Bronchioli vorliegenden Makrophagen und neutrophilen Granulozyten wiesen eine positive Reaktion für S100A8 auf, ebenso wie die Hälfte der in der Lamina propria mucosae liegenden Makrophagen sowie alle subepithelial und innerhalb des Bronchialepithels gelegenen neutrophilen Granulozyten. Bei Tieren mit obliterierender Bronchiolitis zeigten die zwischen den lumenverlegenden Fibroblasten und Kollagenfasern gelegenen Makrophagen und neutrophilen Granulozyten eine S100A8-positive Expression. Die alveolären Makrophagen sowie die in Alveolarräumen liegenden neutrophilen Granulozyten stellten sich S100A8-positiv dar. In Lungenarealen mit deutlicher Alveolarhistiozytose zeigten die in den angrenzenden interalveolären Septen gelegenen Makrophagen keine Reaktion für S100A8. 4.2.3.5 Expression von S100A9 S100A9 zeigte ein nahezu gleiches Expressionsmuster wie das zuvor beschriebene von S100A8. Daher wurden hier nur die wenigen Abweichungen des Reaktionsmusters beschrieben. Das intrazytoplasmatische, braune Reaktionsprodukt von S100A9 ist insgesamt von geringstgradig schwächerer Farbintensität als das von S100A8. Nur die äußere Hälfte des sich innen an den ringförmigen, die Nekrose umgebenden Wall aus Makrophagen anschließenden Saumes neutrophiler Granulozyten exprimierte S100A9. Das überwiegend aus Zelldetritus bestehende Zentrum der Nekrosen zeigte keine positive Reaktion für S100A9. 4.2.3.6 Expression von CD68 Das Expressionsmuster von CD68 glich dem von S100A8 und S100A9, außer dass CD68 ausschließlich von Makrophagen exprimiert wurde und nicht von neutrophilen Granulozyten (Abbildung 19). Ergebnisse 87 Abbildung 16 Lunge, Tier mit Nekrose Lfd. Nr. 42, Lokalisation 1c NZ: Nekrosezentrum NG: Saum aus neutrophilen Granulozyten M: Ring aus Makrophagen (Pfeilköpfe) H&E-Färbung Balken = 133 µm Abbildung 17 Lunge, Tier mit Nekrose Lfd. Nr. 42, Lokalisation 1c Ausschnittsvergrößerung aus Abbildung 16 N: Nekrose NG:Saum aus neutrophilen Granulozyten M: Ring aus Makrophagen (Pfeilköpfe) H&E-Färbung Balken = 33 µm 88 Ergebnisse Abbildung 18 Lunge, Tier mit Nekrose Lfd. Nr. 42, Lokalisation 3a N: Nekrose NG: Saum aus teilweise positiven neutrophilen Granulozyten M: Ring aus Makrophagen (Pfeilköpfe) S100A8-Immunhistochemie (DAB) Balken = 33 µm Abbildung 19 Lunge, Tier mit Nekrose Lfd. Nr. 42, Lokalisation 2a N: Nekrose NG: Saum aus neutrophilen Granulozyten M: positiver Ring aus Makrophagen (Pfeilköpfe) CD68-Immunhistochemie (DAB) Balken = 33 µm Ergebnisse 89 Abbildung 20 Lunge, Tier mit Nekrose Lfd. Nr. 42, Lokalisation 3a NZ: Nekrosezentrum M: positiver Ring aus Makrophagen (Pfeilköpfe) iNOS-Immunhistochemie (AEC) Balken = 182 µm Abbildung 21 Lunge, Tier mit Nekrose Lfd. Nr. 42, Lokalisation 5a N: Nekrose M: positiver Ring aus Makrophagen (Pfeilköpfe) iNOS-Immunhistochemie (AEC) Balken = 45 µm 90 Ergebnisse Abbildung 22 Lunge, Tier mit Nekrose Lfd. Nr. 42, Lokalisation 2c N: Nekrose M: positiver Ring aus Makrophagen (Pfeilköpfe) NT-Immunhistochemie (AEC) Balken = 45 µm Abbildung 23 Lunge, Tier mit Nekrose Lfd. Nr. 42, Lokalisation 3a N: Nekrose M: positiver Ring aus Makrophagen (Pfeilköpfe) NG: Neutrophile Granulozyten Mn-SOD-Immunhistochemie (AEC) Balken = 45 µm Ergebnisse 91 Abbildung 24 Lunge, Tier mit Nekrose Lfd. Nr. 42, Lokalisation 1b Obliterierende Bronchiolitis (oBr) mit balloniertem Epithel (E) und lumen-verlegenden Fibroblasten, Kollagenfasern, Makrophagen und neutrophilen Granulozyten H&E-Färbung Balken = 35 µm Abbildung 25 Lunge, Tier mit Nekrose Lfd. Nr. 42, Lokalisation 5a Obliterierende Bronchiolitis mit teilweise positiver Reaktion im Epithel (E, Pfeilspitzen) Mn-SOD-Immunhistochemie (AEC) Balken = 70 µm Abbildung 26 Lunge, Tier mit Nekrose Lfd. Nr. 42, Lokalisation 5a, Ausschnittsvergrößerung aus Abbildung 25 Obliterierende Bronchiolitis mit teilweise positiver Reaktion im Epithel (E, Pfeilspitzen) und im obliterierten Lumen Mn-SOD-Immunhistochemie (AEC) Balken = 35 µm 92 Ergebnisse Abbildung 27 Lunge, Tier mit Nekrose Lfd. Nr. 42, Lokalisation 2b Katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie H&E-Färbung Balken = 33 µm Abbildung 28 Lunge, Tier mit Nekrose Lfd. Nr. 49, Lokalisation 4a Katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie mit positiven Makrophagen (Pfeilköpfe) Mn-SODImmunhistochemie (AEC) Balken = 33 µm Diskussion 93 5 Diskussion Nach respiratorischen Infektionen mit M. bovis treten in der Lunge von Kälbern unterschiedliche entzündliche sowie nekrotische Veränderungen auf, deren Pathogenese bislang weitgehend ungeklärt ist. Untersuchungsergebnisse zur Expression von iNOS, NT und Mn-SOD im Lungengewebe von Schweinen, Kälbern und Rindern nach experimenteller Infektion mit verschiedenen bakteriellen Erregern weisen auf eine Beteiligung dieser Enzyme und deren Produkte bei pneumonischen Veränderungen hin. Eine Expression wurde insbesondere in Makrophagen beschrieben (FLIGGER et al. 1999; RADI et al. 2001; CHO u. CHAE 2002; CHO u. CHAE 2003a). Ziel dieser Arbeit war es, die bei experimentell mit M. bovis infizierten Kälbern auftretenden entzündlichen und nekrotischen Lungenveränderungen hinsichtlich der Expression von iNOS, NT und Mn-SOD mittels immunhistochemischer Methoden zu untersuchen, um nähere Aufschlüsse über die Pathogenese dieser Läsionen zu gewinnen. Da bovine Alveolarmakrophagen nach Stimulation durch M. bovis in vitro NO produzieren (JUNGI et al. 1996a), sollten in dieser Arbeit die das Lungengewebe infizierter Kälber infiltrierenden Makrophagen unter Verwendung spezifischer Phagozytenmarker näher charakterisiert werden. 5.1 Expression von iNOS, NT und Mn-SOD 5.1.1 Expression von iNOS, NT und Mn-SOD im Lungengewebe von Kontrolltieren Das Expressionsmuster von iNOS und NT im Epithel der Bronchien und Bronchioli, der glatten Muskulatur um die Atemwege und der Lungengefäße, der Chondrozyten und der Bronchialdrüsen stimmte mit dem von RADI et al. (2001) beschriebenen Reaktionsmuster bei lungengesunden Kontrollkälbern überein. Außerdem exprimierten PAMs, auf der Oberfläche des Epithels der Bronchien und Bronchioli 94 Diskussion befindliche Makrophagen sowie Makrophagen im Septum interalveolare iNOS und NT. Bislang wurde das Reaktionsmuster für Mn-SOD in der Lunge von Rindern oder Schweinen nicht beschrieben. Die eigenen Ergebnisse zeigen, dass Mn-SOD in der unveränderten Lunge von Kälbern und Rindern ein in topografischer Hinsicht übereinstimmendes Expressionsmuster wie iNOS und NT aufweist. Da das immunhistochemische Expressionsmuster von iNOS, NT und Mn-SOD bei Kontrolltieren identisch ist, kann vermutet werden, dass in der gesunden Lunge des Rindes eine Expression von iNOS, NT und Mn-SOD und damit auch eine Bildung von NO, reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und reaktiven Nitroverbindungen (RNS) stattfindet. NT gilt als Indikator für eine stattgefundene Bildung von Peroxynitrit aus NO und Superoxid (ISCHIROPOULOS et al. 1992; BECKMANN u. KOPPENOL 1996; VAN DER VLIET et al. 1999). Andere Autoren vermuten bei Mensch, Ratte und Schaf ebenfalls ein natürliches Vorkommen von iNOS im Lungenepithel, das eine wichtige Quelle für NO darstellt (ASANO et al. 1994; GUO et al. 1995; SHERMAN et al. 1999). 5.1.2 Expression von iNOS, NT und Mn-SOD im entzündlich veränderten Lungengewebe infizierter Kälber Im Vergleich zu den Kontrolltieren fand sich bei allen experimentell mit M. bovis infizierten Tieren eine erhöhte Expression für iNOS, NT und Mn-SOD in den entzündlich veränderten Lungenarealen. Eine starke Reaktion wurde insbesondere in Makrophagen festgestellt. Es lag eine positive Korrelation zwischen dem Schweregrad der entzündlichen Lungenveränderungen und der Anzahl der im H&ESchnitt ermittelten, infiltrierenden Makrophagen vor. Bei Kälbern mit interstitieller Pneumonie ließ sich eine geringgradig erhöhte Expression von iNOS, NT und Mn-SOD in den Makrophagen des Septum interalveolare feststellen. Bei allen infizierten Kälbern lag im Vergleich zu den Kontrolltieren eine erhöhte Zahl an PAMs vor, die zum größten Teil iNOS, NT und Mn-SOD exprimierten. In den Makrophagen der interalveolären Septen, die Diskussion 95 unmittelbar an Alveolarräume, die mit Makrophagen angefüllt waren, grenzten, wurde keine Reaktion für iNOS, NT und Mn-SOD verzeichnet. Die fehlende Expression dieser Marker im Septum in interalveolare Bereichen mit deutlicher Alveolarhistiozytose könnte durch eine mögliche Auswanderung von Makrophagen aus den Kapillargefäßen der Interalveolarsepten und Makrophagen aus dem Septum interalveolare selbst in die Alveolarräume erklärt werden (CRYSTAL 1991; ACKERMANN et al. 1994; POULTER 1997). FLIGGER et al. (1999) beobachten bei Rindern, die nach einer Infektion mit Escherichia coli eine akute interstitielle Pneumonie entwickeln, oder bei denen eine subakute oder chronische interstitielle Pneumonie vorliegt, im Gegensatz zu den vorliegenden Untersuchungsergebnissen keine iNOS-Expression. Die Autoren verzeichnen ausschließlich iNOS-exprimierende Zellen im Lungengewebe von Rindern mit Bronchopneumonie oder nekrotisierender Pneumonie nach Infektion mit Arcanobacterium pyogenes oder Mannheimia haemolytica und gehen von einer möglichen Koexpression anderer, unbekannter, iNOS-induzierender Faktoren in den Nekroseregionen aus. Bei den Kälbern mit Nekrosen, bei denen mehrheitlich gleichzeitig eine katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie vorlag, wurde im Vergleich zu Tieren ohne Nekrosen eine deutlich erhöhte Zahl an Makrophagen im entzündlich veränderten Lungenparenchym festgestellt. Hier fanden sich diffus im Lungenparenchym verteilte, iNOS-, NT- und Mn-SOD-positive Makrophagen, die sich zum Teil um nesterartig angeordnete Ansammlungen neutrophiler Granulozyten gruppierten. Eine geringe Anzahl neutrophiler Granulozyten zeigte in diesen Lungenarealen ebenfalls eine positive Reaktion für iNOS und NT. Zu einem ähnlichen Ergebnis kommen RADI et al. (2001), die bei Kälbern nach Infektion mit Mannheimia haemolytica eine Expression von iNOS und NT in neutrophilen Granulozyten und Makrophagen im infiltrierten Lungengewebe von Kälbern mit akuter Bronchopneumonie feststellen. In der Lamina propria mucosae der Bronchien bei Kälbern mit und ohne Nekrosen wurde im Vergleich zu den Kontrolltieren eine signifikant erhöhte Zahl an Makrophagen verzeichnet, von denen ein Teil iNOS, NT und Mn-SOD exprimierte. Insbesondere bei Tieren mit katarrhalisch-eitriger Bronchopneumonie und eitriger 96 Diskussion Bronchitis/-iolitis konnte eine deutlich erhöhte Infiltration der Lamina propria mucosae sowie der Bronchiallumina mit Makrophagen und neutrophilen Granulozyten verzeichnet werden, von denen sich jeweils ein Teil der infiltrierten Zellen positiv für iNOS und NT darstellte (Kapitel 4.2). Mn-SOD wurde im Gegensatz zu iNOS und NT ausschließlich von Makrophagen exprimiert und nicht von neutrophilen Granulozyten. FLIGGER et al. (1999) beschreiben ebenfalls eine iNOS-Expression der Entzündungszellen in den Luftwegen bei Rindern nach einer Infektion mit Arcanobacterium pyogenes. Der die Nekrosen ringförmig umschließende Wall aus Makrophagen zeigte bei allen Kälbern eine starke Expression für iNOS, NT und Mn-SOD. Das äußere Drittel des sich an den Makrophagensaum anschließenden Ringes aus neutrophilen Granulozyten wies ebenfalls bei der Mehrzahl der Kälber eine Expression für iNOS und NT auf. Das aus Zelldetritus bestehende Zentrum der Nekrosen zeigte bei drei der elf Kälber eine diffuse, positive Reaktion für iNOS und NT. In den zumeist komplett verdichteten, infiltrierten Lungenbereichen um die Nekrosen fanden sich bei nahezu allen Tieren diffus verteilte iNOS-, NT- und Mn-SOD-positive Makrophagen. In der vorliegenden Untersuchung wurden, ähnlich wie von KHODAKARAM-TAFTI und LÓPEZ (2004) beschrieben, zwei Arten von Nekrosen festgestellt. Bei der Mehrzahl der mit M. bovis infizierten Kälber lag ein einheitlicher Aufbau der Nekrosen mit zentralem, eosinophilem, amorphem, azellulärem Material vor, das von teilweise untergehenden neutrophilen Granulozyten und einem sich anschließenden Saum aus Makrophagen und einzelnen Fibroblasten umgeben wurde. KHODAKARAMTAFTI und LÓPEZ (2004) beobachten in Lungen von Kälbern nach natürlicher M. bovis-Infektion verkäsende Nekrosen aus granulärem, eosinophilem Material, die von einem Saum aus Granulationsgewebe umrandet werden. Ein ähnlicher Aufbau der Nekrosen wird auch von anderen Autoren beschrieben (RODRĺGUEZ et al. 1996; SHAHRIAR et al. 2002; KHODAKARAM-TAFTI u. LÓPEZ 2004). Der zweite Nekrosetyp, der bei einigen Kälbern dieser Untersuchung festgestellt wurde, glich den von KHODAKARAM-TAFTI und LÓPEZ (2004) beschriebenen, großen Koagulationsnekrosen aus nekrotischen Alveolarstrukturen, die von einem Saum aus zerfallenden neutrophilen Granulozyten umgeben sind. Die Autoren gehen davon Diskussion 97 aus, dass die verkäsenden Nekrosen charakteristisch für eine M. bovis-Infektion sind und beim Vorliegen von Koagulationsnekrosen eine Koinfektion mit Mannheimia haemolytica, Histophilus somni, Arcanobacterium pyogenes und/oder Pasteurella multocida differentialdiagnostisch berücksichtigt werden muss. In der vorliegenden Arbeit wurden bei der Mehrzahl der Tiere mit Nekrosen (7/11) außer M. bovis weitere Erreger wie Pasteurella multocida, Arcanobacterium pyogenes und Mannheimia haemolytica isoliert. In früheren Untersuchungen konnte mittels IHC und in situHybridisierung jedoch bei der Mehrzahl der Kälber mit Nekrosen (10/11) M. bovisAntigen und/oder M. bovis-DNA nachgewiesen werden (JACOBSEN 2006). Daher kann vermutet werden, dass M. bovis eine pathogenetische Rolle bei der Entstehung der Nekrosen zukommt. Über die Faktoren, die an der Entstehung der Nekrosen durch M. bovis beteiligt sind, ist bisher wenig bekannt. Wie schon an anderer Stelle beschrieben (Kapitel 5.3), bildet M. bovis toxische Stoffwechselnebenprodukte wie Hydrogenperoxid und Superoxid-Radikale, die vermutlich zur Entstehung von Nekrosen beitragen können. Mannheimia haemolytica ist in der Lage, Leukotoxine, die zytolytische Aktivitäten gegen Granulozyten, Monozyten, Gewebsmakrophagen und Lymphozyten richten, zu bilden. Weiterhin induziert Mannheimia haemolytica die Hämolyse boviner Erythrozyten (EWERS et al. 2004). Arcanobacterium pyogenes besitzt ein Cholesterol-abhängiges Zytolysin und Pyolysin (JOST et al. 2003). Diese Toxine sind u.a. wie Mannheimia haemolytica in der Lage, den oxidativen Burst in Phagozyten zu hemmen und sind zytotoxisch für Granulozyten und Makrophagen (JOST et al. 2003; EWERS etal. 2004). Pasteurella multocida bildet ebenfalls ein Toxin, das Phagozyten lysieren kann und die Antikörperbildung unterdrückt (HARPER et al. 2006). Bisher ist der Mechanismus, der bei einer Infektion mit M. bovis zu der Entstehung von Nekrosen führt, unklar. In den Fällen, in denen Sekundärinfektionen nachgewiesen wurden, tragen die von Mannheimia haemolytica, Pasteurella multocida und Arcanobacterium pyogenes gebildeten Toxine möglicherweise zu der Entstehung von Nekrosen bei. Über eine mögliche Stimulation von iNOS, NT und 98 Diskussion Mn-SOD sowie deren Bedeutung bei der Entstehung der Nekrosen wird in einem späteren Kapitel näher eingegangen (Kapitel 5.3). In der vorliegenden Untersuchung konnte gezeigt werden, dass iNOS, NT und MnSOD größtenteils von den Makrophagen, die die Nekrosen umgeben, exprimiert wurde. BUCHENAU (2003) und JACOBSEN (2006) beschreiben mittels IHC und in situ-Hybridisierung M. bovis-Antigen bzw. M. bovis-DNA in den Randbereichen der Nekrosen infizierter Kälber. Demnach ist bei durch M. bovis hervorgerufenen Nekrosen von einer Kolokalisation des Erregers und der Expression von iNOS, NT und Mn-SOD auszugehen. Über eine gleichzeitige, mittels IHC festgestellte Expression von iNOS und dem Vorhandensein von Erregern bzw. der Erreger-DNA in nekrotischen Lungenarealen beim Rind und beim Schwein nach natürlicher und experimenteller Infektion mit verschiedenen Bakterien wird auch von FLIGGER et al. (1999) und CHO und CHAE (2003a) berichtet. In den die Nekrosen demarkierenden Makrophagen bei experimentell mit M. bovis infizierten Kälbern wurde in der vorliegenden Untersuchung eine hochgradige Expression von iNOS, NT, Mn-SOD, CD68, S100A8 und S100A9 beobachtet. CHO und CHAE (2002) weisen iNOS in sogenannten Haferzellen, die sich um durch Actinobacillus pleuropneumoniae hervorgerufene Koagulationsnekrosen in der Lunge von Schweinen anordnen, immunhistochemisch nach. In den meisten Lungenarealen, in denen iNOS-positive Zellen auftreten, wird in der in situHybridisierung eine Kolokalisation mit der DNA von Actinobacillus pleuropneumoniae beobachtet (CHO u. CHAE 2003a). CHO und CHAE (2003a) finden ebenso wie in der vorliegenden Untersuchung beobachtet, eine enge Assoziation von iNOS- und NT-exprimierenden Zellen, insbesondere in der Peripherie entzündlich veränderter Lungenbereiche. FLIGGER et al. (1999) detektieren iNOS-exprimierende Zellen um nekrotische Herde im Lungengewebe von Rindern mit Bronchopneumonie nach einer Infektion mit Arcanobacterium pyogenes und Mannheimia haemolytica, jedoch wird bei der Mehrheit der iNOS-exprimierenden Zellen keine Reaktion für CD68, S100A8 und S100A9 festgestellt. JUNGI et al. (1997b) und PFISTER et al. (2002) weisen iNOS und NT in einer Subpopulation von Makrophagen um zerebrale Mikroabszesse nach Infektion mit Listeria monocytogenes bei Rindern und kleinen Wiederkäuern in Diskussion 99 vivo nach. JUNGI et al. (1997b) untersuchen zusätzlich die Expression von S100A8 und S100A9 und stellen fest, dass die Makrophagen um die zerebralen Mikroabszesse entweder eine starke Expression für iNOS oder S100A8 und/oder S100A9 zeigen. JUNGI et al. (1997b) vermuten, dass iNOS, S100A8 und S100A9 unabhängig voneinander reguliert werden und bekräftigen diese Hypothese mit einer in vitro-Untersuchung, in der gezeigt werden konnte, dass Makrophagen natürlicherweise S100A9 exprimieren, S100A8 dagegen erst nach Stimulation der Makrophagen durch Bakterien oder IFN-γ exprimiert wird. Um die Funktion und die Regulation dieser Ca2+-bindenden S100-Proteine in Entzündungszellen besser zu verstehen, werden weitere Forschungsarbeiten erforderlich sein (JUNGI et al. 1997b). Warum die iNOS-exprimierenden Makrophagen in den Untersuchungen von JUNGI et al. (1997b), FLIGGER et al. (1999) und PFISTER et al. (2002) im Gegensatz zu den eigenen Befunden größtenteils keine Reaktion für CD68, S100A8 und S100A9 zeigen, bleibt letztendlich unklar. Ob das Vorliegen anderer Erreger im entzündlich veränderten Gewebe hierbei eine Rolle spielt, ist fraglich. FACCHETTI et al. (1999) und CHO und CHAE (2004b) beobachten eine Korrelation zwischen iNOS- und NF-ĸB-exprimierenden Entzündungszellen in der Lunge und vermuten, dass NF-ĸB eine Expression von iNOS in Lungen von Schweinen mit Actinobacillus pleuropneumoniae-Infektion initiiert. Um nähere Aufschlüsse über eine Koexpression von iNOS und NF-ĸB in Entzündungszellen und insbesondere in Makrophagen im Lungengewebe von experimentell mit M. bovis infizierten Kälbern zu erhalten, wären entsprechende immunhistochemische Untersuchungen angebracht. Eine obliterierende Bronchiolitis konnte am häufigsten bei Kälbern mit nekrotisierender Pneumonie (6/11) beobachtet werden. Das ballonierte Epithel der obliterierten Bronchioli sowie zwischen den lumenverlegenden Fibroblasten und Kollagenfasern gelegene Makrophagen wiesen in allen Fällen eine positive Reaktion für iNOS, NT und Mn-SOD auf, während die dort befindlichen neutrophilen Granulozyten lediglich eine Expression für iNOS und NT zeigten. Bisher gibt es keine Untersuchungen über die Expression von iNOS, NT und Mn-SOD bei Rindern mit obliterierender Bronchiolitis. Über das Auftreten von obliterierenden Bronchiolitiden 100 Diskussion bei Kälbern mit M. bovis-Infektion gibt es im einschlägigen Schrifttum bislang keine Publikationen. In der Humanmedizin wird eine starke Expression von iNOS und NT bei Menschen mit obliterierender Bronchiolitis nach Lungentransplantation beobachtet (MASON et al. 1997; McDERMOTT et al. 1997). Wie in der vorliegenden Untersuchung beobachtet, überschneidet sich das Verteilungsmuster von iNOS und NT und wird im veränderten, ballonierten Bronchialepithel, in den Bindegewebsproliferationen und luminaler, bindegewebiger Verlegung sowie peribronchiolär gelegenen Entzündungszellen verzeichnet. In komplett obliterierten Luftwegen wird keine Expression für iNOS und NT festgestellt. Die Autoren vermuten einen durch Peroxynitrit hervorgerufenen, gewebeschädigenden Effekt. Die Fähigkeit von NO, eisenhaltige Enzyme der Atmungskette und die DNA-Synthese zu hemmen, reduziert die Zellteilung und somit die Zellerneuerung nach einer Gewebeschädigung. Auch GABBAY et al. (2000) stellen eine erhöhte iNOS-Expression im Bronchialepithel sowie in der Lamina propria mucosae in Lungengewebebioptaten bei Patienten mit Bronchiolitis obliterans und bakterieller Pneumonie nach Lungentransplantation fest. Da die Expression von iNOS und NT in obliterierten Bronchioli bei den in dieser Arbeit untersuchten Kälbern ein ähnliches Muster aufweist wie in transplantierten Lungen beim Menschen, darf vermutet werden, dass NO und Peroxynitrit möglicherweise an der Entstehung dieser nach M. bovis-Infektion auftretenden Alterationen beteiligt sind. RADI et al. (2001) beschreiben eine Abnahme der iNOS-Expression bei Kälbern nach Infektion mit Mannheimia haemolytica in pulmonalen Epithelzellen und parenchymalen Zellen der Lunge bei starker Entzündungszellinfiltration. Die Autoren diskutieren das Vorliegen eines negativen Feedback-Mechanismus und vermuten, dass von Entzündungszellen freigesetzte Superoxid-Radikale die iNOS-Produktion der pulmonalen Epithelzellen hemmen (MATERA 1998). Dieser Mechanismus könnte eine überschießende Freisetzung von NO und anderen freien Radikalen im Gewebe verhindern. Im Gegensatz zu den Befunden von RADI et al. (2001) ergab sich bei keinem der mit M. bovis infizierten Tiere eine bezüglich der Expression von Diskussion 101 iNOS, NT und Mn-SOD in den Epithelzellen der Bronchien und Bronchioli Abweichung im Vergleich zu den Kontrolltieren. 5.2 Auftreten von Makrophagen Pulmonale Makrophagen besitzen phagozytäre, mikrobizide und sekretorische Eigenschaften und spielen eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Entzündungen in der Lunge (NELSON u. SUMMER 1998; ZHANG et al. 2000). Makrophagen sind ein Teil der angeborenen und der erworbenen Immunabwehr der Lunge (PABST 1996; POULTER 1997; DECLAUX u. AZOULAY 2003). Die in der Lunge vorhandenen Makrophagen werden je nach ihrer anatomischen Lokalisation in PIMs, PAMs und interstitielle Makrophagen eingeteilt (PABST 1996; POULTER 1997; DECLAUX u. AZOULAY 2003). Mehrere Autoren berichten über eine Infiltration von Makrophagen in der Lunge von Rindern mit M. bovis Infektion (ADEGBOYE et al. 1995; RODRĺGUEZ et al. 1996; STIPKOVITS et al. 2000a). Um die Makrophagen im entzündlich veränderten Lungengewebe von experimentell mit M. bovis infizierten Tieren näher zu charakterisieren und zu ermitteln, ob es zu einer Erhöhung der Gesamtzahl im Vergleich zu Kontrolltieren kommt, wurde die Zahl der Makrophagen in den verschiedenen Lungenkompartimenten semiquantitativ bestimmt und statistisch analysiert. Im Vergleich zu den Kontrolltieren wurde bei allen infizierten Kälbern eine Erhöhung der Makrophagenzahl in den Lumina der Bronchien und Bronchioli, in der Lamina propria mucosae, im Septum interalveolare, in den Alveolarräumen und im infiltrierten Lungenparenchym festgestellt. Es bestand eine positive Korrelation zwischen dem Schweregrad der Entzündung und der Zahl der Makrophagen im Lungengewebe. Eine signifikante Zunahme der Makrophagenzahl wurde bei den Kälbern mit Nekrosen in den Lumina der Bronchien und Bronchioli im Vergleich zu den Kontrolltieren, in der Lamina propria mucosae bei den Kälbern ohne und mit Nekrosen im Vergleich zu den Kontrolltieren, im Septum interalveolare und in den Alveolarräumen bei den Kälbern ohne und mit Nekrosen im Vergleich zu den 102 Diskussion Kontrolltieren festgestellt. In hochgradig infiltrierten Lungenarealen wurde bei Tieren mit Nekrosen im Vergleich zu Tieren ohne Nekrosen und bei Kälbern ohne und mit Nekrosen im Vergleich zu Kontrolltieren eine signifikante Zunahme von Makrophagen verzeichnet (Kapitel 4.1.5). Im Lungengewebe der mit M. bovis infizierten Kälber traten im Vergleich zu den Kontrolltieren vermehrt Makrophagen sowohl in der frühen als auch in der späten Infektionsphase auf. So wurde eine Zunahme von Makrophagen bereits bei Kälbern nachgewiesen, die vor dem 10. Tag p.i. getötet wurden und die eher geringgradige entzündliche Lungenveränderungen zeigten. Bei Tieren mit chronischen, in der späten postinfektionären Phase (21 Tage p.i.) auftretenden Veränderungen wie Nekrosen und obliterierenden Bronchiolitiden war die höchste Makrophagenzahl festzustellen. Hinsichtlich der Herkunft der das entzündlich veränderte Lungengewebe der infizierten Kälber infiltrierenden Makrophagen ist anzunehmen, dass es sich größtenteils um aus Blutgefäßen emigrierte Phagozyten handelt. Es ist bekannt, dass pulmonale Makrophagen motile Kapazitäten besitzen und sich durch das Lungengewebe bewegen können (STAUB 1994; POULTER 1997). Bronchialepithelzellen können bei aktivierter Komplementkaskade Fibronektin freisetzen, das wiederum PAMs anlocken kann und sie in die Lage versetzt, sich um die Alveolen und den Bronchialbaum zu bewegen (POULTER 1997; ZHANG et al. 2000). PIMs sind in der Lage, bei Entzündungssituationen aus den Kapillargefäßen des Septum interalveolare in dieses einzuwandern und in die Alveolarräume vorzudringen (STAUB 1994; SINGH et al. 2004). Eine Erneuerung der PAMPopulation findet bei Entzündungssituationen am häufigsten durch eine Auswanderung von Blutmonozyten (PIMs) aus den Lungenkapillaren in das Lungenparenchym statt (CRYSTAL 1991). PAMs sind beim Menschen zu einem gewissen Anteil auch stationär am Septum interalveolare angelagert und können bei einer Entzündung lokal proliferieren (CRYSTAL 1991; ACKERMANN et al. 1994; POULTER 1997). Vermutlich ist ein kleiner Teil der vermehrt im entzündeten Lungengewebe infizierter Kälber vorliegenden PAMs durch lokale Proliferation entstanden, da bei einer hochgradigen Alveolarhistiozytose teilweise mehrkernige Diskussion 103 PAMs beobachtet werden konnten (Kapitel 4.1.2). Um diese Vermutung abzuklären, wäre eine Untersuchung mit einem Proliferationsmarker wie Ki-67 sinnvoll (KOGAN et al. 2003). Ein Ziel dieser Arbeit war es, die Makrophagenpopulation in den verschiedenen Lungenkompartimenten, und zwar insbesondere bei Kälbern mit nekrotisierender Pneumonie näher zu charakterisieren. In der vorliegenden Untersuchung wurde eine starke Reaktion der die Nekrosen demarkierenden Makrophagen für die Phagozytenmarker CD68, S100A8 und S100A9 festgestellt. Die im Bereich der Nekrosen befindlichen neutrophilen Granulozyten exprimierten ebenfalls S100A8 und S100A9. Die Proteine S100A8 und S100A9 werden von neutrophilen Granulozyten, aktivierten Monozyten und von Makrophagen exprimiert, die an Entzündungsreaktionen im Gewebe beteiligt sind (ODINK et al. 1987; ROTH et al. 1993; GEBHARDT et al. 2006). Verschiedene Studien haben gezeigt, dass S100A8 und S100A9 bei entzündlichen Erkrankungen auch unabhängig voneinander exprimiert werden können (ODINK et al. 1987; ZWADLO et al. 1988; SUNDERKÖTTER et al. 1991). Im Gewebe wird S100A9 hauptsächlich in frühen Phasen der Entzündung von Makrophagen exprimiert, S100A8 überwiegend in der späten Phase der Entzündung (ODINK et al. 1987; DELABIE et al. 1990). Bei chronischen Entzündungen können infiltrierende Makrophagen beide S100-Proteine exprimieren (ODINK et al. 1987). In der vorliegenden Untersuchung konnte bei infizierten Kälbern eine höhere Zahl an S100A8-, S100A9- und CD68-exprimierenden Makrophagen festgestellt werden, ansonsten ergaben sich hinsichtlich des Expressionsmusters keine Unterschiede im Vergleich zu den Kontrolltieren. Bezüglich des Reaktionsmusters von S100A8 und S100A9 konnten keine Unterschiede zwischen früher oder später Phase der Entzündung festgestellt werden. ACKERMANN et al. (1994) und THOMASMEYER (2006) beschreiben bei Rindern eine starke immunhistochemische Reaktion der PIMs und PAMs, der Makrophagen in hochgradig infiltrierten Lungenarealen sowie kleiner Zellen im Septum 104 Diskussion interalveolare für CD68. Eine Unterscheidung der PIMs und PAMs ist mit diesem Marker jedoch nicht möglich (ACKERMANN et al. 1994). Es gelang somit nicht, mittels der verwendeten Makrophagenmarker eine Unterscheidung der Subpopulationen dieser Zelltypen im Lungengewebe von Kälbern nach Infektion mit M. bovis vorzunehmen. 5.3 Mögliche Stimulatoren zur Induzierung von iNOS In der vorliegenden Untersuchung konnte gezeigt werden, dass iNOS, NT und MnSOD im entzündlich veränderten Lungengewebe von Kälbern mit experimenteller M. bovis Infektion hauptsächlich von Makrophagen exprimiert wurden. Des Weiteren wurde eine positive Korrelation zwischen dem Schweregrad der durch M. bovis hervorgerufenen, entzündlichen Lungenveränderungen und dem Vorliegen erhöhter Makrophagenzahlen in den verschiedenen Kompartimenten der Lunge beobachtet. Somit konnte eine Aufregulierung der Expression von iNOS, NT und Mn-SOD im Lungengewebe infizierter Kälber im Vergleich zu den Kontrolltieren festgestellt werden. Die stärkste Expression wurde bei den Kälbern mit nekrotisierender Pneumonie verzeichnet, bei denen eine hochgradig positive Reaktion der die Nekrosen umgebenden Makrophagen für iNOS, NT und Mn-SOD verzeichnet wurde. iNOS wird durch inflammatorische Stimuli wie Zytokine und Interleukine, immunologische Stimuli und bakterielle Produkte induziert (XIE et al. 1992; KNOWLES u. MONCADA 1994). Zu den proinflammatorischen Zytokinen, die eine iNOS-Produktion triggern und somit zu einer erheblichen Freisetzung von NO führen, gehören vor allem TNF-α, IL-1β und IFN-γ (ROBBINS et al. 1994). NO wird während der Immunantwort von iNOS in großen Mengen produziert. Es besitzt zytotoxische Eigenschaften, und es wird ihm eine wichtige Rolle bei der Apoptoseregulation und dem Abtöten intrazellulärer Pathogene zugesprochen (MONCADA u. HIGGS 1993; WIDDISON et al. 2007). Eine in vitro-Produktion von iNOS und eine Bildung von NO durch Alveolarmakrophagen wird bei verschiedenen Erkrankungen wie z.B. Asthma, Tuberkulose und chronischer Pneumonie sowie nach Stimulation mit bakteriellen Proteinen bei Mensch, Ratte und Maus beschrieben (KOBZIK et al. 1993; ROBBINS et al. 1994; NICHOLSON et al. 1996; HICKMAN-DAVIS et al. 1998; DONNELLY u. Diskussion 105 BARNES 2002; RUBOVITCH et al. 2007). In Makrophagen aus dem Knochenmark und aus dem peripheren Blut sowie in PAMs des Rindes wird iNOS nach Stimulation durch verschiedenste Bakterienspezies in vitro nachgewiesen (ADLER et al. 1996; JUNGI et al. 1996a; JUNGI et al. 1996b; JUNGI et al. 1996c; MASON et al. 1996; YOO et al. 1996; JUNGI et al. 1997b; JUNGI et al. 1999; WIDDISON et al. 2007). JUNGI et al. (1996c) stellen fest, dass bovine PAMs in vitro TNF-α und NO nach einer Stimulation durch die pathogenen Mykoplasmenspezies Mycoplasma mycoides ssp. mycoides SC (engl. small colony) und M. bovis bilden, allerdings nicht nach Stimulation durch nicht-pathogene Mykoplasmen wie Mycoplasma bovirhinis. Bovine pulmonale Makrophagen sind den Ergebnissen dieser Arbeit und den Untersuchungen von JUNGI et al. (1996c) zufolge in der Lage, nach Stimulation durch Mykoplasmen, insbesondere durch M. bovis, in vitro und in vivo iNOS zu exprimieren und NO freizusetzen. Makrophagen werden zusätzlich durch verschiedene Zytokine, die entweder von Makrophagen selbst oder von anderen Entzündungszellen sezerniert werden, aktiviert und stimuliert, iNOS zu exprimieren (LOHMANN-MATHES et al. 1994; DECLAUX u. AZOULAY 2003). Um eine Aussage darüber zu treffen, welches Zytokinmuster im Lungengewebe der experimentell infizierten Kälber dieser Untersuchung vorliegt und ob eine mögliche Kolokalisation mit iNOS, NT und MnSOD besteht, wäre es interessant, die Lungengewebeschnitte dieser Tiere immunhistochemisch hinsichtlich einer möglichen Expression von Zytokinen zu untersuchen, die bekannterweise eine Aktivierung von Makrophagen sowie eine iNOS-Expression induzieren. Zu diesen zählen vor allem TNF-α, IL-1β und IFN-γ. Mykoplasmen besitzen unter anderem die Fähigkeit, die Immunantwort des Wirtes durch Steigerung der Zytotoxizität von Makrophagen zu modulieren (RAZIN et al. 1998). Eine möglicherweise mykoplasmenvermittelte Induktion von Zytokinen könnte zu einer Aktivierung von iNOS und somit zu einer verstärkten Produktion von NO führen, das mit Superoxid zu Peroxynitrit reagieren kann. Peroxynitrit kann wiederum mit der Aminosäure Tyrosin reagieren und zur Bildung von NT führen (ISCHIROPOULOS et al. 1992; BECKMANN u. KOPPENOL 1996). Daher kann NT als ein Marker für im Organismus gebildetes NO angesehen werden 106 Diskussion (ISCHIROPOULOS et al. 1992; BECKMANN u. KOPPENOL 1996; VAN DER VLIET et al. 1999). In der vorliegenden Untersuchung wird eine übereinstimmende Lokalisation der Expression von iNOS und NT im Lungengewebe beobachtet. Diese Beobachtung ist ein Hinweis auf eine stattgefundene Bildung von NO durch iNOS in vivo. Peroxynitrit wird zusammen mit NO als reaktive Stickstoffspezies (RNS) bezeichnet, und Superoxid gehört zur Gruppe der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). RNS antioxidantische und ROS sind Enzyme wie starke SOD Oxidantien, entgegenwirken denen im (PRYOR Organismus et al. 2006; RUTKOWSKI et al. 2007). Es wird diskutiert, dass Peroxynitrit die zytotoxischen Eigenschaften des NO vermittelt und somit eine schädigende Wirkung auf Proteine und Zellmembranbestandteile, eisenhaltige Enzyme der Atmungskette und die DNA ausübt sowie durch S-Nitrosylierung irreversible Proteinmodifikationen hervorrufen kann (MASON et al. 1997). Aus früheren Untersuchungen zum Nachweis von M. bovis-Antigen und M. bovis-DNA im Lungengewebe experimentell infizierter Kälber geht hervor, dass insbesondere in den Nekrosen eine Erregerpersistenz vorliegt (BUCHENAU 2003; JACOBSEN 2006). Da in den Makrophagen und teilweise in den neutrophilen Granulozyten, die die Nekrosen umgeben, eine starke Expression von iNOS und NT vorlag, wäre es denkbar, dass die Bildung von ROS und RNS zu einer Schädigung des Lungengewebes beiträgt, aber keine Erregerelimination bewirken kann. In der vorliegenden Untersuchung wurde neben einer Kolokalisation von iNOS und NT auch eine gleichzeitige Expression von MnSOD in Makrophagen beobachtet. ROS können durch Mn-SOD, das in den Mitochondrien nahezu jeder Zelle in unterschiedlicher Konzentration vorliegt, zum Schutz vor Oxidationsreaktionen abgefangen werden (BECKMANN u. KOPPENOL 1996; PRYOR et al. 2006). ISCHIROPOULOS et al. (1992) beschreiben die Mn-SOD als Katalysator bei der Nitration von Tyrosin durch Peroxynitrit. Durch den Metabolismus von M. bovis können toxische Nebenprodukte wie Hydrogenperoxid und Superoxid-Radikale anfallen, die in Verdacht stehen, die Wirtszellmembran oxidativ zu schädigen (RAZIN et al. 1998). Es wäre möglich, dass im Lungengewebe von M. bovis in vivo gebildetes Superoxid mit dem von iNOS produzierten NO reagiert und Peroxynitrit entsteht. Somit kann es zu hohen Diskussion 107 Konzentrationen von Peroxynitrit im Lungengewebe kommen, wofür die Expression von NT als Marker für in vivo gebildetes NO und Peroxynitrit sprechen könnte. Die Fähigkeit von M. bovis, Superoxid als Stoffwechselprodukt zu bilden, könnte durch erhöhte Konzentrationen von Peroxynitrit die Bildung von ROS und RNS weiter verstärken und somit eine Gewebeschädigung noch stärker begünstigen. Bei einer überschießenden Produktion von Peroxynitrit ist die Mn-SOD kaum noch in der Lage, Peroxynitrit zu neutralisieren. Das Gleichgewicht verschiebt sich zugunsten der oxidationsfördernden und somit gewebeschädigenden Prozesse, und es kommt zum sogenannten oxidativen Stress (BECKMANN u. KOPPENOL 1996; PRYOR et al. 2006; VAN DER VLIET et al. 2006). Dieser Mechanismus könnte ebenfalls an der Entstehung schwerer Gewebeschädigungen durch M. bovis mitbeteiligt sein und die Entstehung und Erhaltung von Nekrosen begünstigen. Außer eukaryotischen SODs werden auch prokaryotische SODs beschrieben, die das Bakterium während eines respiratorischen Bursts in Phagozyten sowie vor Sauerstoffradikalen, die an Gewebeoberflächen und der Schleimhaut während der Kolonisation gebildet werden, schützen. Derartige SODs wurden u.a. bei Mannheimia haemolytica, Actinobacillus pleuropneumoniae, Escherichia coli und Salmonellen identifiziert (KROLL et al. 1995; CANVIN et al. 1996). Für M. bovis ist eine prokaryotische SOD bisher nicht beschrieben. Es wäre daher interessant, die DNA-Sequenz von M. bovis nach derartigen, prokaryotischen SODs zu untersuchen, da diese Bakterien in Phagozyten vor einem respiratorischen Burst schützen können. McAULIFFLE et al. (2006) beschreiben die Fähigkeit von M. bovis, einen Biofilm zu produzieren, der in der Lage sein soll, Phagozyten zwar anzulocken, jedoch ihre phagozytären Eigenschaften zu hemmen. Biofilme sind strukturierte Gemeinschaften von bakteriellen Zellen in einer selbst produzierten Matrix aus polymeren Substanzen, meist Polysaccharide, auf einer inerten oder belebten Oberfläche (COSTERTON et al. 1999). Möglicherweise findet M. bovis innerhalb der Nekrosen im Lungengewebe ein Milieu vor, welches – ähnlich dem eines Biofilmes – eine Eliminierung durch den Wirt verhindert und gleichzeitig eine Erregervermehrung sicherstellt. Sollte M. bovis tatsächlich in der Lage sein, in vivo einen Biofilm zu bilden, der Polysaccharide enthält, wäre es denkbar, dass diese wiederum eine 108 Diskussion iNOS-Produktion in Makrophagen initiieren, da das bakterielle Produkt LPS bekanntlich iNOS aktivieren kann (KNOWLES u. MONCADA 1994; MacMICKING et al. 1997; DONNELLY u. BARNES 2002). In diesem Fall wäre es interessant, die Zusammensetzung der extrazellulären Substanzen innerhalb der Nekrosen, insbesondere hinsichtlich des Vorhandenseins von Polysacchariden, zu bestimmen. Der Bildung von NO im Gewebe wird eine wichtige Rolle beim Abtöten intrazellulärer Pathogene zugesprochen (MONCADA u. HIGGS 1993; WIDDISON et al. 2007). Ebenso soll eine anhaltende Produktion von NO Makrophagen mit zytotoxischen und zytostatischen Eigenschaften gegen bakterielle Erreger ausstatten (JUNGI et al. 1999). Die Beobachtungen der vorliegenden Untersuchung lassen vermuten, dass iNOS, NT und Mn-SOD an der Entstehung der Lungenläsionen und zwar insbesondere der Nekrosen bei experimentell mit M. bovis infizierten Kälbern beteiligt sind, aber keine Elimination der Erreger bewirken können. Für die ausbleibende Erregerelimination bzw. Erregerpersistenz ist vermutlich die für M. bovis nachgewiesene Antigenvariation durch Änderung der Oberflächenproteine (Vsps) verantwortlich (ROSENGARTEN et al. 1994; ROSENGARTEN et al. 2000; LYSNYANSKY et a. 2001; THOMAS et al. 2003; CHOPRA-DEWASTHALY et al. 2005). Zusammenfassung 109 6 Zusammenfassung Kathrin Anika Hermeyer (2008): Immunhistochemische Untersuchungen zum Nachweis der Expression von induzierbarer Stickoxid-Synthase Mangan-Superoxid-Dismutase (iNOS), (Mn-SOD) in Nitrotyrosin Lungen von (NT) und Kälbern nach experimenteller Infektion mit Mycoplasma bovis Mycoplasma (M.) bovis gehört zu den für das Rind pathogensten Mykoplasmenarten und führt bei Kälbern zu unterschiedlichen entzündlichen und teils mit schwerwiegenden Nekrosen einhergehenden Lungenläsionen. Bislang sind die an der Entstehung der Lungenläsionen und an der insbesondere im nekrotischen Gewebe festgestellten Erregerpersistenz beteiligten Faktoren weitgehend ungeklärt. Ziel dieser Arbeit war es, die bei experimentell mit M. bovis infizierten Kälbern auftretenden Lungenveränderungen hinsichtlich der Expression von iNOS, NT und Mn-SOD zu untersuchen und nähere Aufschlüsse über deren Rolle bei der Entstehung dieser Läsionen zu erlangen. Des Weiteren sollten die das Lungengewebe infiltrierenden Makrophagenpopulationen semiquantitativ und unter Verwendung spezifischer charakterisiert werden. Phagozytenmarker Formalin-fixierte (S100A8, und S100A9, CD68) Paraffin-eingebettete Lungengewebeproben von 20 Kontrolltieren sowie von 30 experimentell mit unterschiedlichen M. bovis-Stämmen infizierten Kälbern standen für die Untersuchungen zur Verfügung. Die bei den infizierten Kälbern festgestellten entzündlichen Lungenveränderungen wurden nach einem semiquantitativen Schema in folgende Pneumonieformen eingeteilt: Interstitielle Pneumonie, katarrhalischeitrige Bronchopneumonie und nekrotisierende Pneumonie. Zusätzlich wurden Veränderungen wie eitrige Bronchitis/-iolitis und obliterierende Bronchiolitis beurteilt. Mittels Immunhistochemie wurde das Expressionsmuster von iNOS, NT, Mn-SOD, CD68, S100A8 und S100A9 nach einem semiquantitativen Schema ausgewertet. Bei allen infizierten Kälbern wurde im Vergleich zu den Kontrolltieren eine erhöhte Anzahl iNOS-, NT- und Mn-SOD-exprimierender Zellen im entzündlich veränderten Lungengewebe verzeichnet, wobei insbesondere eine starke Expression der die 110 Zusammenfassung Nekrosen demarkierenden Makrophagen, des veränderten Bronchialepithels und der bei Tieren mit obliterierender Bronchiolitis vorhandenen Makrophagen beobachtet wurde. Da die Makrophagen und teilweise die neutrophilen Granulozyten, welche die Lungennekrosen umgaben, eine starke Expression von iNOS, NT und Mn-SOD zeigten, wäre es denkbar, dass die Bildung von ROS und RNS zu einer Schädigung des Lungengewebes beiträgt, aber keine Erregerelimination bewirken kann. Da die Expression von iNOS und NT als Indikator für eine stattgefundene Bildung von NO und Peroxynitrit anzusehen ist, sind letztere möglicherweise an der Entstehung obliterierender Bronchiolitiden bei Kälbern nach Infektion mit M. bovis beteiligt. Sowohl in der frühen als auch in der späten Infektionsphase der experimentell infizierten Kälber traten im Vergleich zu den Kontrolltieren vermehrt Makrophagen auf, wobei eine positive Korrelation zwischen dem Schweregrad der Entzündung und der Zahl der Makrophagen im veränderten Lungengewebe bestand. Bei Kälbern mit nekrotisierender Pneumonie wurde in allen Lungenkompartimenten die höchste Makrophagenzahl verzeichnet. Eine Unterscheidung der Makrophagen- Subpopulationen, die in den frühen und späten Phasen der Infektion vorhanden waren, war mit Hilfe der verwendeten Phagozytenmarker nicht möglich. Summary 111 7 Summary Kathrin Anika Hermeyer (2008): Immunohistochemical studies on the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS), nitrotyrosine (NT) and manganese superoxide dismutase (MnSOD) in lungs of calves experimentally infected with Mycoplasma bovis Mycoplasma (M.) bovis belongs to the most pathogenic Mycoplasma species causing different inflammatory lung lesions, in some cases associated with severe necrosis, in calves. So far, the factors involved in the development of the lung lesions and in particular in the persistence of the pathogen in the necrotic lung tissue, are widely unknown. The aim of this study was to investigate the expression of iNOS, NT and Mn-SOD in the lung lesions of experimentally with M. bovis infected calves and to achieve more informations about the development of these lesions. Furthermore, the macrophage populations infiltrating the lung tissue should be characterised and analysed semiquantitatively using the specific phagocyte markers S100A8, S100A9 and CD68. Formalin-fixed and paraffin-embedded lung samples of 20 non-infected control calves and 30 calves originating from different M. bovis infection experiments were used in this study. The inflammatory lung alterations in experimentally infected calves were classified into the following types of pneumonia: Interstitial pneumonia, suppurative bronchopneumonia and necrotising pneumonia. Additionally inflammatory lesions like suppurative bronchitis/iolitis and obliterative bronchiolitis were evaluated. The expression pattern of iNOS, NT, Mn-SOD, CD68, S100A8 and S100A9 was analysed immunohistochemically and evaluated by a semiquantitative score. All infected calves showed an increased number of iNOS-, NT- and Mn-SODexpressing cells in the inflamed lung tissue whereas a strong expression of these markers was particularly noticed in macrophages demarcating the necroses, in alterated epithelial cells of the bronchioli as well as in macrophages involved in animals with obliterative bronchiolitis. Because of the strong expression of iNOS, NT and Mn-SOD in macrophages and partially in neutrophilic granulocytes surrounding the necroses makes the participitation of these products by generation of ROS and RNS in the development of tissue damage seems to be possible. Elimination of the 112 Summary agent, however, by these products does not occur. The generation of NO and peroxynitrite, approved by the expression of iNOS and NT, is potentially involved in the development of obliterative bronchiolitis in calves after infection with M. bovis. The number of macrophages increased in the early as well as in the late stages of infection in lungs of experimentally infected calves in comparison to the control calves. Furthermore, a positive correlation between the severity of inflammatory lung lesions and the number of macrophages in lung tissue was observed. In calves with necrotising pneumonia, the highest number of macrophages was documented in all compartments of the lung. A differentiation between macrophage subpopulations involved in early and/or late stages of infection by application of the markers S100A8 and S100A9 was not possible. Literaturverzeichnis 113 8 Literaturverzeichnis ACKERMANN, M. R., B. M. DEBEY, T. J. STABEL, J. H. GOLD, K. B. REGISTER, J. T. MEEHAN (1994) Distribution of anti-CD68 (EBM11) immunoreactivity in formalin-fixed, paraffin-embedded bovine tissues. Vet. Pathol. 31, 340-348 ADEGBOYE, D. S., P. G. HALLBUR, D. L. CAVANAUGH, R. E. WERDIN, C. C. CHASE, D. W. MISKIMINS U. R. F. 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SORG (1988) Two calcium-binding proteins associated with specific stages of myeloid cell differentiation are expressed by subsets of macrophages in inflammatory tissue. Clin. Exp. Immunol. 72, 510-515 Anhang 131 9 Anhang 9.1 Ergebnistabellen Tabelle 10 Zahl der iNOS-exprimierenden Makrophagen in Lungengewebeproben der Kontrolltiere Lfd. Makrophagen im Nr. Bronchiallumen Subepithelial gelegene Makrophagen Alveoläre Makrophagen Makrophagen in den interalveolären Septen 1 0 n.v. n.v. 1 2 0 1 n.v. 1 3 0,5 n.v. 1 1,5 4 0,5 n.v. 0,5 0,5 5 0 n.v. 0,5 2 6 0 n.v. n.v. 2 7 0 n.v. n.v. 2 8 0 n.v. n.v. 2 9 0 n.v. n.v. 2 10 0 n.v. 0,5 2,5 11 0 n.v. 1 2,5 n.v. 12 0 0,5 0,5 n.v. 13 0 1 1,5 14 1 n.v. 1 2,5 15 0 n.v. 1 2 16 0,25 n.v. n.v. 2 n.v. 17 0 0,5 1 n.v. 18 0 0,5 1,5 n.v. 19 0 0,5 2 n.v. 20 1 n.v. 1,5 M 0 1 0,5 2 Lfd. Nr. = Laufende Nummer; 0 = keine Expression für iNOS; 0,5 = geringstgradige Anzahl iNOSpositiver Makrophagen; 1 = geringgradige Anzahl iNOS-positiver Makrophagen; 1,5 = gering- bis mittelgradige Anzahl iNOS-positiver Makrophagen; 2 = mittelgradige Anzahl iNOS-positiver Makrophagen; 2,5 = mittel- bis hochgradige Anzahl iNOS-positiver Makrophagen; 3 = hochgradige Anzahl iNOS-positiver Makrophagen; n.v. = keine Makrophagen in den genannten Lungenarealen vorhanden; M = Medianwert 132 Anhang Tabelle 11 Zahl der NT-exprimierenden Makrophagen in Lungengewebeproben der Kontrolltiere Lfd. Makrophagen im Nr. Bronchiallumen Subepithelial gelegene Makrophagen Alveoläre Makrophagen Makrophagen in den interalveolären Septen 1 0,5 n.v. n.v. 2 2 0 0 n.v. 2,5 n.v. 3 0 1 1 n.v. 4 0 0 1 n.v. 5 0 0 2,5 n.v. 6 0 n.v. 2 n.v. 7 0 n.v. 2 n.v. 8 0 n.v. 2 n.v. 9 0 n.v. 2,5 n.v. 10 0 0,25 2,5 n.v. 11 0 0,25 2,5 n.v. 12 0 0,25 2,5 n.v. 13 0 0,25 2,5 n.v. 14 0 0,5 1 n.v. 15 0,5 0,25 0,5 n.v. 16 0,5 n.v. 1,5 n.v. 17 0 0 1,5 n.v. 18 0,5 1 2 n.v. 19 0 1 2 n.v. 20 0,5 n.v. 1,5 M 0 0,25 2 0 Lfd. Nr. = Laufende Nummer; 0 = keine Expression für NT; 0,5 = geringstgradige Anzahl NT-positiver Makrophagen; 1 = geringgradige Anzahl NT-positiver Makrophagen; 1,5 = gering- bis mittelgradige Anzahl NT-positiver Makrophagen; 2 = mittelgradige Anzahl NT-positiver Makrophagen; 2,5 = mittel- bis hochgradige Anzahl NT-positiver Makrophagen; 3 = hochgradige Anzahl NT-positiver Makrophagen; n.v. = keine Makrophagen in den genannten Lungenarealen vorhanden; M = Medianwert Anhang 133 Tabelle 12 Zahl der Mn-SOD-exprimierenden Makrophagen in Lungengewebeproben der Kontrolltiere Lfd. Nr. Makrophagen im Bronchiallumen Subepithelial gelegene Makrophagen Alveoläre Makrophagen Makrophagen in den interalveolären Septen 1 0 n.v. n.v. 1 2 0 0 n.v. 0 n.v. 3 0,5 2 0 n.v. 4 0,5 0 0 n.v. 5 0 0 0 n.v. 6 n.v. 0 0 n.v. 7 n.v. 0 0 n.v. 8 n.v. 0,5 0 n.v. 9 n.v. 0,5 0 n.v. 10 0,25 0,5 0 n.v. 11 0,5 0,5 0 n.v. 12 0,5 0 0 n.v. 13 0 0 0 n.v. 14 1 2 0 n.v. 15 0,5 0,5 2 n.v. 16 0,5 n.v. 2 n.v. 17 0,25 2 0 n.v. 18 0 2 0 n.v. 19 1 1 0 n.v. 20 1 n.v. 2 M 0 0,5 0,5 0 Lfd. Nr. = Laufende Nummer; 0 = keine Expression für Mn-SOD; 0,5 = geringstgradige Anzahl Mn-SOD positiver Makrophagen; 1 = geringgradige Anzahl Mn-SOD -positiver Makrophagen; 1,5 = gering- bis mittelgradige Anzahl Mn-SOD -positiver Makrophagen; 2 = mittelgradige Anzahl Mn-SOD -positiver Makrophagen; 2,5 = mittel- bis hochgradige Anzahl Mn-SOD -positiver Makrophagen; 3 = hochgradige Anzahl Mn-SOD -positiver Makrophagen; n.v. = keine Makrophagen in den genannten Lungenarealen vorhanden; M = Medianwert 134 Anhang Tabelle 13 Zahl der iNOS-exprimierenden Makrophagen in Lungengewebeproben der experimentell mit M. bovis infizierten Kälber ohne Nekrosen Lfd. Nr. Makrophagen Subepithelial im gelegene Bronchiallumen Makrophagen Makrophagen Makrophagen Alveoläre in den in hgr. Makrophagen interalveolären infiltrierten Septen Lungenarealen 21 1 0 0,5 2 n.v. 23 n.v. n.v. 1 1,5 n.v. 24 1 n.v. 0,5 1,5 n.v. 25 n.v. n.v. 1 2 n.v. 26 1 1 1,5 2 n.v. 27 0,5 1,5 1 1 n.v. 28 0,5 1 0,5 2 1 29* 0,75 0 1,5 2 n.v. 30* 1 0,5 n.v. 1,5 n.v. 32 0,5 1 n.v. 2 1 34 0,5 1,5 0,5 1,5 n.v. 35 1 1 1 1,5 n.v. 36 1 1 1,5 1,5 2 1 1,25 0,5 1,5 n.v. 39 n.v. n.v. n.v. 1,5 n.v. 40* 41* n.v. n.v. n.v. 1,5 n.v. 43 0,5 0,5 n.v. 2 n.v. 44 0,5 0,5 n.v. 2 n.v. 45 0,5 0,5 2 1,5 2 46 0,5 0,75 0,5 2 2 48 0,5 0,5 0,5 2 2 49 0,5 1 n.v. 2 2 54 n.v. 0,5 1 2 n.v. 0,5 1 n.v. 2 2 55 0,5 1 1 2 2 M Lfd. Nr. = Laufende Nummer; * = zum Infektionsversuch gehörendes Kontrolltier; hgr. = hochgradig; 0 = keine Expression für iNOS; 0,5 = geringstgradige Anzahl iNOS-positiver Makrophagen; 1 = geringgradige Anzahl iNOS-positiver Makrophagen; 1,5 = gering- bis mittelgradige Anzahl iNOSpositiver Makrophagen; 2 = mittelgradige Anzahl iNOS-positiver Makrophagen; 2,5 = mittel- bis hochgradige Anzahl iNOS-positiver Makrophagen; 3 = hochgradige Anzahl iNOS-positiver Makrophagen; n.v. = keine Makrophagen in den genannten Lungenarealen vorhanden bzw. keine hochgradig infiltrierten Lungenareale bei Tieren mit ausschließlich interstitieller Pneumonie vorhanden; M = Medianwert Anhang 135 Tabelle 14 Zahl der NT-exprimierenden Makrophagen in Lungengewebeproben der experimentell mit M. bovis infizierten Kälber ohne Nekrosen Lfd. Nr. Makrophagen Subepithelial im gelegene Bronchiallumen Makrophagen Makrophagen in Makrophagen Alveoläre den in hgr. Makrophagen interalveolären infiltrierten Septen Lungenarealen 21 1 0 1,5 1,5 n.v. 23 n.v. n.v. 1 1 n.v. 24 2 n.v. 0,5 2 n.v. 25 n.v. n.v. 0,5 2 n.v. 26 0,5 0,5 0,5 1,5 n.v. 27 0 0 0,5 2,5 n.v. 28 2 0 1 2 1 29* 0 0 1 2,5 n.v. 30* 0 0,5 n.v. 1 n.v. 32 1,5 1 n.v. 2 2 34 0,5 2 0,5 2 n.v. 35 0,5 1 1,5 2 n.v. 36 1 0,5 2 2 2 39 0 1 1 2 n.v. n.v. n.v. n.v. 2 n.v. 40* 41* n.v. n.v. n.v. 2 n.v. 43 0 1 n.v. 2 n.v. 44 0 1,5 n.v. 2 n.v. 45 0,5 0,5 1,5 2 1 46 0,5 1 0,5 2,5 2 48 2 0,5 0,5 2 2 49 2 1 n.v. 2 2 54 n.v. 0 1 1 n.v. 55 1 0 n.v. 2 0,5 0,5 M 0,5 1 2 2 Lfd. Nr. = Laufende Nummer; * = zum Infektionsversuch gehörendes Kontrolltier; hgr. = hochgradig; 0 = keine Expression für NT; 0,5 = geringstgradige Anzahl NT -positiver Makrophagen; 1 = geringgradige Anzahl NT -positiver Makrophagen; 1,5 = gering- bis mittelgradige Anzahl NT -positiver Makrophagen; 2 = mittelgradige Anzahl NT -positiver Makrophagen; 2,5 = mittel- bis hochgradige Anzahl NT -positiver Makrophagen; 3 = hochgradige Anzahl NT -positiver Makrophagen; n.v. = keine Makrophagen in den genannten Lungenarealen vorhanden bzw. keine hochgradig infiltrierten Lungenareale bei Tieren mit ausschließlich interstitieller Pneumonie vorhanden; M = Medianwert 136 Anhang Tabelle 15 Zahl der Mn-SOD-exprimierenden Makrophagen in Lungengewebeproben der experimentell mit M. bovis infizierten Kälber ohne Nekrosen Lfd. Nr. Makrophagen Subepithelial im gelegene Bronchiallumen Makrophagen Makrophagen Makrophagen Alveoläre in den in hgr. Makrophagen interalveolären infiltrierten Septen Lungenarealen 21 1 0 1 1 n.v. 23 n.v. n.v. 0,5 1 n.v. 24 1,5 n.v. 0,5 0,5 n.v. 25 n.v. n.v. 0,5 0,5 n.v. 26 0,5 2 0,5 1 n.v. 27 1 0 1 1 n.v. 28 1 0 0,5 1 2 29* 0,5 0 0,5 0,5 n.v. 30* 0,5 0 n.v. 0,5 n.v. 32 1 2 n.v. 1 1 34 0,5 0 0,5 1 n.v. 35 0,5 1 1,5 2 n.v. 36 0,5 2 1 0,5 2 39 1 1 0,5 2,5 n.v. n.v. n.v. 0,5 2 n.v. 40* 41* n.v. n.v. 0,5 2 n.v. 43 0,5 0,5 n.v. 1 n.v. 44 0,5 0,5 n.v. 1 n.v. 45 0,5 0,5 0,5 2 2 46 0,5 1 0,5 1,5 1 48 0,5 0,5 0,5 1 1,5 49 0,5 1 n.v. 2 3 54 n.v. 0 0,5 2 n.v. 0 n.v. 55 0,5 2 1 M 0,5 0,5 0,5 1 1,75 Lfd. Nr. = Laufende Nummer; * = zum Infektionsversuch gehörendes Kontrolltier; hgr. = hochgradig; 0 = keine Expression für Mn-SOD; 0,5 = geringstgradige Anzahl Mn-SOD -positiver Makrophagen; 1 = geringgradige Anzahl Mn-SOD -positiver Makrophagen; 1,5 = gering- bis mittelgradige Anzahl Mn-SOD positiver Makrophagen; 2 = mittelgradige Anzahl Mn-SOD -positiver Makrophagen; 2,5 = mittel- bis hochgradige Anzahl Mn-SOD -positiver Makrophagen; 3 = hochgradige Anzahl Mn-SOD -positiver Makrophagen; n.v. = keine Makrophagen in den genannten Lungenarealen vorhanden bzw. keine hochgradig infiltrierten Lungenareale bei Tieren mit ausschließlich interstitieller Pneumonie vorhanden; M = Medianwert Anhang 137 Tabelle 16 Zahl der iNOS-exprimierenden Makrophagen in Lungengewebeproben der experimentell mit M. bovis infizierten Kälber mit Nekrosen Lfd. Makrophagen Nr. um Nekrosen Makrophagen Subepithelial im Bronchial- gelegene lumen Makrophagen Makrophagen Alveoläre in den Makrophagen intersalveolären Septen Makrophagen in hgr. infiltrierten Lungenarealen 5* 2,5 0,5 0,5 2 2 n.v. 31 2,5 1 0 3 1,5 2 33 2,5 0,5 1,5 1,5 1 2 37 3 1 1 2 2 2 38 2,5 1 1 2,5 1 2 42 3 1 1 1 2 2 47 3 1 0 1 0,5 0 50 3 1 0,5 n.v. 2,5 2 51 3 0 0,5 1 2,5 n.v. 52 3 0,5 1,5 2 2 n.v. 53 3 0,5 1,5 1,5 2,5 2,5 M 3 1 1 1,75 2 2 Lfd. Nr. = Laufende Nummer; * = zum Infektionsversuch gehörendes Kontrolltier; hgr. = hochgradig; 0 = keine Expression für iNOS; 0,5 = geringstgradige Anzahl iNOS-positiver Makrophagen; 1 = geringgradige Anzahl iNOS-positiver Makrophagen; 1,5 = gering- bis mittelgradige Anzahl iNOSpositiver Makrophagen; 2 = mittelgradige Anzahl iNOS-positiver Makrophagen; 2,5 = mittel- bis hochgradige Anzahl iNOS-positiver Makrophagen; 3 = hochgradige Anzahl iNOS-positiver Makrophagen; n.v. = keine Makrophagen in den genannten Lungenarealen vorhanden bzw. keine hochgradig infiltrierten Lungenareale bei Tieren mit ausschließlich interstitieller Pneumonie vorhanden; M = Medianwert 138 Anhang Tabelle 17 Zahl der NT-exprimierenden Makrophagen in Lungengewebeproben der experimentell mit M. bovis infizierten Kälber mit Nekrosen Lfd. Makrophagen Nr. um Nekrosen Makrophagen Subepithelial im Bronchial- gelegene lumen Makrophagen Makrophagen Alveoläre in den Makrophagen interalveolären Septen Makrophagen in hgr. infiltrierten Lungenarealen 22* 2,5 0,5 0,5 0,5 0,5 n.v. 31 2,5 1 0 1 0,5 0 33 2 1 0 0,5 2 2 37 2 1 0 2 2 2 38 2 1 0 2 1 2 42 3 0,5 0,5 2 2 2 47 2,5 1 0 0,5 2 1,5 50 2 0,5 0 n.v. 2,5 2 51 2 0 0 1 0,5 n.v. 52 3 1 0 1 2 n.v. 53 2,5 0,5 1 0,5 0,5 2 M 2,5 1 0 1 2 2 Lfd. Nr. = Laufende Nummer; * = zum Infektionsversuch gehörendes Kontrolltier; hgr. = hochgradig; 0 = keine Expression für NT; 0,5 = geringstgradige Anzahl NT -positiver Makrophagen; 1 = geringgradige Anzahl NT -positiver Makrophagen; 1,5 = gering- bis mittelgradige Anzahl NT -positiver Makrophagen; 2 = mittelgradige Anzahl NT -positiver Makrophagen; 2,5 = mittel- bis hochgradige Anzahl NT -positiver Makrophagen; 3 = hochgradige Anzahl NT -positiver Makrophagen; n.v. = keine Makrophagen in den genannten Lungenarealen vorhanden bzw. keine hochgradig infiltrierten Lungenareale vorhanden bei Tieren mit ausschließlich interstitieller Pneumonie; M = Medianwert Anhang 139 Tabelle 18 Mn-SOD-exprimierende Makrophagen in Lungengewebeproben der experimentell mit M. bovis infizierten Kälber mit Nekrosen Lfd. Makrophagen Nr. um Nekrosen Makrophagen Subepithelial im Bronchial- gelegene lumen Makrophagen Makrophagen Alveoläre in den Makrophagen interalveolären Septen Makrophagen in hgr. infiltrierten Lungenarealen 22* 3 1 1,5 1 0,5 n.v. 31 3 0,5 1 0,5 1 1 33 3 0,5 0,5 0,5 1 1 37 3 1 1,5 1 1 1,5 38 3 0,5 0 0,5 0,5 2 42 3 1 0 0,5 0 2 47 3 1 0 0 0,5 2,5 50 3 0 0 n.v. 0 2 51 3 0,5 0 0,5 0,5 n.v. 52 3 0,5 0,5 1 0 n.v. 53 3 1 1,5 0,5 0 2 M 3 0,5 0,5 0,5 0,5 2 Lfd. Nr. = Laufende Nummer; * = zum Infektionsversuch gehörendes Kontrolltier; hgr. = hochgradig; 0 = keine Expression für Mn-SOD; 0,5 = geringstgradige Expression für Mn-SOD; 1 = geringgradige Expression für Mn-SOD; 1,5 = gering- bis mittelgradige Expression für Mn-SOD; 2 = mittelgradige Expression für Mn-SOD; 2,5 = mittel- bis hochgradige Expression für Mn-SOD; 3 = hochgradige Expression für Mn-SOD; n.v. = keine Makrophagen in den genannten Lungenarealen vorhanden bzw. keine hochgradig infiltrierten Lungenareale vorhanden bei Tieren mit ausschließlich interstitieller Pneumonie; M = Medianwert 9.2 p-Werte Tabelle 19 Tabellarische Darstellung der p-Werte im Gruppenvergleich (Wilcoxon-Rangsummen-Test) Gruppenvergleich Kontrolltiere – Tiere ohne Nekrosen Kontrolltiere – Tiere mit Nekrosen Tiere ohne Nekrosen – Tiere mit Nekrosen Makrophagen Subepithelial im Bronchial- gelegene lumen Makrophagen Makrophagen Alveoläre in den Makrophagen interalveolären Septen Makrophagen in den verdichteten Lungenarealen 0.1746 0,0002 < .0001 0,0014 0,0041 0,0336 0,0005 < .0001 < .0001 0,0065 0.1548 0.0821 0,0012 0,0029 0.3820 weiße Felder = hochsignifikant; hellgraue Felder = signifikant; dunkelgraue Felder = nicht signifikant 140 Anhang 9.3 Färbungsprotokolle 9.3.1 H&E-Färbung am Paraffinschnitt • Entparaffinisieren der Schnitte in einer absteigenden Alkoholreihe beginnend mit Xylol 1-3 für je 5 Min. • Danach für 5 Min. in Isopropanol eintauchen und für 2-3 Min. in 96%iges, 70%iges und 50%iges Ethanol und Aqua dest. verbringen. • Für 15 Min. in die Lösung Hämalaun nach P. Mayer verbringen, danach 10 Min. in Leitungswasser bläuen und anschließend in Aqua dest. spülen. • Für 1 Min. in 1%iges Eosin (Zugabe von 1 Tropfen Eisessig pro Küvette) verbringen und anschließend in Aqua dest. spülen. • Entwässern der Schnitte in einer aufsteigenden Alkoholreihe für 2-3 Min. in 70%igem und 96%igem Ethanol, danach für 5 Mi. in Isopropanol und anschließend für jeweils 5 Min. in Xylol 1- 3. • Eindecken in Roti-Histol (Eindeckmittel Roti-Histokitt, Roth C. GmbH & Co. KG, Karlsruhe). 9.3.2 Verwendete Lösungen für die H&E-Färbung Hämalaun nach P. Mayer: 1g Hämatoxylin in 1000 ml Aqua dest. lösen, 0,2 g Natriumjodat und 50 g chemisch reines Kalialaun (=Kaliumaluminiumsulfat-12-hydrat) hinzugeben und erwärmen. Nach dem Erkalten: 50 g Chloralhydrat und 1g kristalline Zitronensäure dazugeben und kalt lösen, danach filtrieren. Eosin: 1%ig in Aqua dest. lösen und erwärmen. Nach dem Erkalten filtrieren und zum Färben auf 100ml Eosin 1%ig 2 Tropfen Eisessig geben. Anhang 9.4 141 Pufferrezepte für die Immunhistochemie 9.4.1 Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) 40g NaCl (Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen) und 7,8g NaH2PO4 x H2O (Firma Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen) in 5 Liter Aqua dest. Lösen und mit 1 M Natronlauge (VWR TM International GmbH, Darmstadt) auf pH 7,1 einstellen. 9.4.2 Citratpuffer Herstellung der Endkonzentration aus Konzentrat (Fa. BIOCYC Gesellschaft für Biotechnologie und Recyclingverfahren GmbH&Co., Luckenwalde): Eine Flasche Citrat-Puffer-Konzentrat mit Aqua dest. auf exakt 1 Liter auffüllen und verrühren. 9.5 Bezugsquellen für Chemikalien und Antikörper Biologo, Dr. Hartmut Schultheiß e.K., Immunbiologische Produkte, Kronshagen Peroxidase-Substratkit AEC (3-Amino-9-Ethyl-Carbazol), AE 002-3 BIOCYC Gesellschaft für Biotechnologie und Recyclingverfahren mbH&Co., Luckenwalde (Vertrieb quartett Immundiagnostika und Biotechnologie GmbH, Berlin) Pro Taqs Citrat-Puffer-Konzentrat, 400300692 BfB (Bundesmonopolverwaltung für Branntwein) Verwertungsstelle für Agraralkohol, Offenbach am Main Ethanol unvergällt (mind. 99,8% Vol), Sorte 510 BMA Biomedicals AG, Augst, CH S100A8 (MRP8, Calgranulin A), monoklonal, Maus, Klon S13.67, Isotyp IgG1, T1032 142 Anhang S100A9 (MRP14, Calgranulin B), monoklonal, Maus, Klon S36.48, Isotyp IgG1, T 1026 Fa. Chemicon, Temecula, Ca, USA Maus anti-Mycoplasma bovis, MAB 970, Isotyp IgGK DakoCytomation GmbH (ehemals Dako® Diagnostika GmbH), Hamburg Anti-humaner CD68-Antikörper aus der Maus, Klon EBM 11, M 0718 Glycergel, Eindeckmedium, C 0563 DAKOPATTS Roth C. GmbH & Co. KG, Karlsruhe Chloralhydrat, 2425 Eindeckmittel Roti®-Histokitt, 6638.1 Essigsäure-n-butylester (EBE), 4600.7 Ethanol, vergällt, K928.2 Hämalaunlösung nach Mayer, T865.2 Natriumchlorid (NaCl), P029.2 Natriumjodat p.a., 6549 2-Propanol (Isopropanol) Rotipuran® 9866.4 Rotiprotect®-Nitrilhandschuhe, P777.1 Roti®-Histol, 6640.2 Salzsäure Rotipuran® 25% p.a., 6331.3 Serva Feinbiochemica GmbH und Co Kg, Heidelberg Bovines Serumalbumin (BSA), 11930 Shandon/Firma ThermoElectron Corporation, Pittsburgh PA, USA Paraplast Plus Anhang 143 Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen (ehemals Sigma, Fluka, Riedel de Haën) Aceton, 24201 BSA (Bovines Serum-Albumin), A-2153 Citronensäure-1-hydrat p.a., 33114 3,3’-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid Dihydrat purum (DAB) p.a., 32750 Isopentan (N-Methylbutan), 59080 Natriumdihydrogenphosphat wasserfrei, 71496 Natriumchlorid, 71381 Upstate, Lake Placid, NY, USA; über Biomol, Hamburg Anti-iNOS/NOSII, polyklonal, Kaninchen, Isotyp IgG, 27365 Anti-NT, polyklonal, Kaninchen, Isotyp IgG, 26427 Anti-Mn-SOD, polyklonal, Kaninchen, Isotyp IgG, 26654 Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA, über Biologo, Kronshagen Biotinyliertes Ziege-anti-Kaninchen-IgG (H+L), BA 1000 Biotinyliertes Ziege-anti-Maus IgM (μ-Ketten spezifisch), BA-2020 Biotinyliertes Ziege-anti-Maus IgG (H+L), BA-9200 Vectastain Elite Standart-Kit, PK-6100 VWR TM International GmbH, Darmstadt (ehemals Merck KGaA, Darmstadt) Calciumchlorid-2-hydrat krist., 2382 Formaldehydlösung, mind. 37%., 1.03999 Natriumhydroxid-Plätzchen (NaOH) p.a., 1.06498 Natronlauge, 1.09137 Pronase E (aus Streptomyces griseus), 0743 144 Protease XIV-Lösung, 2382 Salzsäure (HCl) 1N, 1.09057 Salzsäure (HCl) 2N, 1.09063 Saponin GPR Rectapur TM, 27 534.187 Wasserstoffperoxid 30% H2O2 (Perhydrol®) p.a., 1.07209 Flüssiger Stickstoff Anhang Anhang 9.6 Bezugsquellen für Geräte und Einmalartikel Bauknecht Mikrowelle Excellence MWS 2924 Carl Zeiss AG, Oberkochen Standard-Binokular-Lichtmikroskop Mikroskop Axiphot DakoCytomation GmbH (ehemals Dako Diagnostika GmbH), Hamburg Glycergel, Eindeckmedium, C 0563 DAKOPATTS Gerhard Menzel Glasbearbeitungswerk GmbH & Co. KG, Braunschweig SuperFrost®Plus Objektträger, 041300 W. Knittel Glasbearbeitungs GmbH, Braunschweig Deckgläser (24 x 50 mm) Gesellschaft für Labortechnik mbH, Burgwedel Paraffinstreckbad 1052 G. Kisker, Steinfurt PAP-Pen®, MKP-1 Heraeus Sepatech GmbH, Osterode Trockenschrank ST 6200 145 146 Köttermann Labortechnik Wasserbad Typ 3047 Kodak GmbH, Stuttgart Elite Chrome 160 T Diafilm Leica Microsystems NussWell GmbH, Wetzlar Färbeautomat Leica ST 4040 Medite Medizintechnik, Burgdorf Objektträger-Eindeckautomat Promounter RCM 2000 Microm International GmbH, Walldorf Schlittenmikrotom HM 400R Polaroid, Massachusetts, USA Kamera MP 4 Precision Dynamics Corporation Marker II/ Superfrost®, 1451 black Sartorius AG, Göttingen Sartorius excellence Präzisionswaage E1200S Papierfaltenfilter 270 mm Durchmesser, FT-4-303-270 Schleicher & Schuell, Dassel Papierfilter, S&S Rundfilter 150 mm Durchmesser, 311612 Anhang Anhang Shandon/ThermoElectron Corporation, Pittsburgh, PA, USA Shandon Coverplates®, 72110013 Shandon Sequenza® Slide Racks (Einsätze für Coverplates), 7331017 Automatensystem Pathcenter Vogel GmbH & Co. Kg, Gießen Tissue-Tec® TECTM 5, Einbettsystem 147 Danksagung Hiermit möchte ich mich ganz herzlich bei allen bedanken, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben: Mein besonderer Dank gilt…. … Frau Prof. Dr. M. Hewicker-Trautwein für die Überlassung des interessanten Themas, die jederzeit gewährte Hilfe und Unterstützung bei Fragen zur Durchführung und Ausarbeitung dieser Arbeit, die freundliche Zusammenarbeit und die zügige und kooperative Durchsicht dieser Arbeit. … Herrn Klaus-Peter Kuhlmann für die Einarbeitung in die Immunhistochemie und die nette Zusammenarbeit. … der Arbeitsgruppe für Immunpathologie für eine tolle Arbeitsatmosphäre. … allen meinen Kollegen und Freunden im Institut für Pathologie, insbesondere Christina, Ilka, Sven, Frauke und Dirk für Tipps und Tricks im Labor, rund um den PC und bei der Einarbeitung in statistische Programme sowie Verena, Sven und Reiner für die bereitschaftliche Übernahme von zwei meiner Dienstwochen. … Maren, Patricia und Dorothee für die lustigen (Poker-)abende und die gemeinsam verbrachte Zeit. … Christina, Miriam, Anne und Sina für die schönen Spaziergänge mit den Vierbeinern. … Ingo für die schnelle und kritische Durchsicht dieses Manuskripts. … Christian für seine seelische Unterstützung und für die Hilfe bei der Formatierung dieser Arbeit. … meinen Eltern für die Ermöglichung meines beruflichen Werdeganges, den unerschütterlichen, festen Glauben an mich, die liebevolle und aufmunternde Unterstützung zu jeder Zeit und in jeder Hinsicht.
