Nachweis spezifischer T-Zell-vermittelter Immunantworten gegen
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Universitätsklinikum Ulm Zentrum für Innere Medizin Klinik für Innere Medizin III Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. med. H. Döhner _________________________________________________________________ Nachweis spezifischer T-Zell-vermittelter Immunantworten gegen Tumor assoziierte Antigene bei Lungenkrebs Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm Vorgelegt von Maximilian Felix Steinhauser München 2014 Amtierender Dekan: Prof. Dr. rer. nat. Thomas Wirth 1. Berichterstatter: Prof. Dr. med. Jochen Greiner 2. Berichterstatter: Prof. Dr. med. Ansgar Schulz Tag der Promotion: 22. Mai 2015 Inhaltsverzeichnis ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS III 1. 1 1.1. EINLEITUNG DAS BRONCHIALKARZINOM 1 1.1.1 PATHOLOGIE UND STAGING 1 1.1.2 THERAPIE UND PROGNOSE 3 1.1.3 NEUE THERAPIEOPTIONEN FÜR DAS BRONCHIALKARZINOM 5 1.2. IMMUNOLOGISCHE GRUNDLAGEN 7 1.3. DIE IMMUNTHERAPIE 8 1.3.1 AKTIVE IMMUNTHERAPIE 9 1.3.2 DIE ROLLE TUMOR-ASSOZIIERTER ANTIGENE IN DER IMMUNTHERAPIE 11 1.4. 15 DIE IMMUNTHERAPIE BEIM BRONCHIALKARZINOM 1.4.1 DIE ROLLE DER TUMORVAKZINIERUNG BEIM BRONCHIALKARZINOM 16 1.5. ZIELSETZUNG DIESER ARBEIT 20 MATERIAL UND METHODEN 21 2. 2.1 MATERIAL 21 2.1.1 GRUNDAUSTATTUNG 21 2.1.2 CHEMIKALIEN 23 2.1.3 PUFFER 24 2.1.4 ZELLLINIEN, ANTIKÖRPER UND ZYTOKINE 25 2.1.5 ZELLKULTURMEDIEN 26 2.1.6 PEPTIDE 27 2.1.7 PATIENTEN 27 2.2 28 METHODEN 2.2.1 MATERIALGEWINNUNG UND AUFBEREITUNG 28 2.2.2 TYPISIERUNG DER HLA-OBERFLÄCHENANTIGENE MITTELS DURCHFLUSSZYTOMETRIE 30 2.2.3 ZELLSEPARATION 31 2.2.5 ETABLIERUNG DER ASSAYS UND NACHWEIS DER T-ZELL-ANTWORT 33 2.2.6 STATISTISCHE METHODEN: 36 3. 37 3.1. ERGEBNISSE BESTIMMUNG DES OBERFLÄCHENANTIGENS HLA-A2 MITTELS DURCHFLUSS- ZYTOMETRIE 37 3.2. 38 AUSWAHL DER UNTERSUCHTEN PEPTIDE I 3.3. ERGEBNISSE DES ELISPOT-ASSAYS 40 3.3.1 ERGEBNISSE DES INTERFERON-γ-ELISPOT-ASSAYS 40 3.3.2 ERGEBNISSE DES GRANZYM-B-ELISPOT-ASSAYS 44 4. 50 4.1 DISKUSSION NACHWEIS EINER ZELLULÄREN IMMUNANTWORT GEGEN DIE UNTERSUCHTEN ANTIGENE 50 4.2 UNTERSCHIEDLICHE ERGEBNISSE IM GRANZYM-B- UND INTERFERON-γ- ELISPOT- ASSAY 55 4.3 SCHLUSSFOLGERUNG 56 5. ZUSAMMENFASSUNG 58 6. LITERATURVERZEICHNIS 60 II Abkürzungsverzeichnis AML Aktute myeloische Leukämie BCIP 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-Phosphat BCG Bacillus Calmette-Guérin CD Cluster of differentiation CML Chronische myeloische Leukämie CMV Cytomegalievirus CTLA-4 Cytotoxic T Lymphocyte Antigen 4 CT/TG Cancer testis/-germline DMSO Dimethylsulfoxid EDTA Ethyldiamintetraessigsäure EGFR Epidermal growth factor receptor ELISpot Enzyme linked immunospot FACS Fluorescence activated cell sorting FCS Fötales Kälberserum/ fetal calf serum FSC Forward scatter FITC Fluorescein-iso-thio-cyanat HER 2 Human epidermal growth factor receptor 2 HLA Human leukocyte antigen hTERT Human telomerase reverse transcriptase IFN Interferon Ig Immunglobulin IMP Influenza matrix protein INCENP Inner centromer protein MACS Magnetic activated cell sorting MAGE Melanoma associated antigen MHC Major histocompatibility complex MLPC Gemischte Lymphozyten-Peptidkultur/ mixed lymphocyte peptide culture MUC-1 Mucin 1 NBT Nitro-blue-tetrazoliumchloride NSCLC Non small cell lung cancer RHAMM Receptor for hyaluronic acid mediated motility RPMI Roswell Park Memorial Institute III PD-1 Programmed Death 1 PD-L1 Programmed Death Ligand 1 PBMC Mononukleäre Zellen des peripheren Bluts/ peripheral blood mononuclear cells PBS Phosphate buffered saline PRAME Preferentially expressed antigen in melanoma PSMA Prostata-spezifisches Membranantigen SEREX Serological analysis of recombinant DNA expression libraries SCLC Small cell lung cancer SSC Side scatter TAA Tumor-assoziiertes Antigen TTP Time to progress TNM Tumor-Nodi-Metastasen VEGF Vascular endothelial growth factor WT-1 Wilms-Tumor-Gen 1 IV 1. Einleitung 1.1. Das Bronchialkarzinom Das Bronchialkarzinom oder auch Lungenkrebs ist eine maligne Neoplasie, die vom Epithel des Respirationstraktes ausgeht. Jährlich sterben in Deutschland 40000 Menschen am Bronchialkarzinom. Damit ist das Bronchialkarzinom die vierthäufigste Todesursache insgesamt, die häufigste Krebstodesursache bei Männern und die dritthäufigste Krebstodesursache bei Frauen. [49] Die Zahl der Neuerkrankungen in Deutschland beträgt bei Männern 32000, bei Frauen 13000 pro Jahr. Die durchschnittliche 5-Jahres-Überlebensrate beträgt in Abhängigkeit vom Stadium bei Diagnosestellung für Frauen 18% und für Männer 15%. [125] Der bedeutendste Risikofaktor für Lungenkrebs ist das Rauchen, 90% der Erkrankungen bei Männern und 60% bei Frauen können darauf zurückgeführt werden. Weitere Risikofaktoren sind Exposition gegenüber ionisierender Strahlung, z.B. durch Röntgenstrahlung oder Inhalation von Radon, inhalative Noxen wie Asbest oder künstlichen Mineralfasern, allgemeine Luftverschmutzung wie Feinstaub und Dieselmotorabgase, polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe, sowie einige Metalle. Auch eine virale Genese durch das Humane Papilloma Virus konnte nachgewiesen werden. [49] 1.1.1 Pathologie und Staging Histopathologisch können Bronchialkarzinome gemäß der WHO-Klassifikation als von vier Zelltypen ausgehend eingeteilt werden: das Plattenepithelkarzinom (3040%), das Adenokarzinom (25-30%), sowie das großzellige Karzinom (unter 10%) die als nicht-kleinzellige Karzinome zusammengefasst werden, sowie das kleinzellige Karzinom (15-20%). [62] Die Unterteilung in kleinzelliges Bronchialkarzinom (engl.: small cell lung cancer, SCLC) und nicht-kleinzelliges Bronchialkarzinom (engl.: non small cell lung cancer, NSCLC) ist hinsichtlich der Prognose und der Auswahl der Therapie von Bedeutung. 1 Die Stadieneinteilung erfolgt mit der am 1. Januar 2011 in Kraft getretenen 7. Edition der TNM-Klassifikation für Lungentumoren, wobei T für die lokale Ausbreitung, N für den Lymphknotenbefall und M für die Fernmetastasierung steht. Die Einteilung ist in den Tabellen 1 und 2 dargestellt. Tabelle 1: Definition von T, N und M in der 7. Edition der TNM-Klassifikation für Lungentumoren [90] T: lokale Ausbreitung 1 2 3 a <2cm in seiner größten Ausdehnung b 2-3cm in seiner größten Ausdehnung a 3-5cm oder Infiltration des Hauptbronchus, Infiltration der viszeralen Pleura b 5-7cm oder Infiltration des Hauptbronchus, Infiltration der viszeralen Pleura <7cm oder direkte Infiltration von Brustwand, Zwerchfell, N. phrenicus, mediastinaler Pleura oder parietalem Perikard 4 Tumor jeglicher Größe mit Infiltration von Mediastinum, Herz, große Gefäße, Trachea, N. larygeus recurrens, Ösophagus, Wirbelkörper, oder Carina oder separater Tumorknoten in einem ipsilateralen Lappen N: Lymphknotenbefall 0 Keine regionären Lymphknotenmetastasen 1 Befall ipsilateraler peribronchialer oder hilärer, oder intrapulmonaler Lymphknoten 2 Befall ipsilateraler mediastinaler oder subcarinaler Lymphknoten 3 Befall kontralateraler mediastinaler, hilärer oder ipsilateraler oder kontralateraler Skalenusoder supraventrikulärer Lymphknoten M: Fernmetastasen 0 Keine Fernmetastasen 1a Separate Tumorknoten in kontralateralem Lappen, Tumor mit pleuralem Knoten oder malignem Pleuraerguss 1b Fernmetastasen 2 Tabelle 2: Stadiengruppierung nach der 7. Edition der TNM-Klassifikation für Lungentumoren [90] Stadium I II T N M A 1 0 0 B 2a 0 0 A 1 1 0 2a 1 0 2b 0 0 B 2b 1 0 0 0 2 0 3 1-2 0 4 0-1 0 B jedes 3 0 4 2 0 jedes 0-1-2-3 1 3 III A 1-2 IV 1.1.2 Therapie und Prognose Die Therapie des NSCLC ist in limitierten Stadien primär operativ. In den Stadien I und II ist die Resektion die Methode der 1. Wahl, in Stadium II erfolgt zusätzlich eine adjuvante, platinbasierte Chemotherapie. [136] Die Therapie im Stadium IIIA hängt vom Lymphknotenbefall ab. Patienten mit N1Lymphknotenbefall erhalten analog zum Stadium II eine Tumorresektion mit anschließender, adjuvanter Chemotherapie. Bei einer N2-Situation, die intraoperativ entdeckt wird, folgt auf die Resektion eine adjuvante Chemotherapie. Individuell wird im Anschluss eine Radiatio durchgeführt. Bei präoperativ entdeckten N2-Situationen oder bulky disease erfolgt primär eine Radiochemotherapie. [126] Im Stadium IIIB erfolgt abhängig vom Allgemeinzustand und den Komorbiditäten des Patienten primär eine kombinierte platinbasierte Radiochemotherapie, alternativ eine alleinige Chemotherapie oder eine alleinige Bestrahlung. [74] 3 In Stadium IV erfolgt bei Patienten mit gutem Allgemeinzustand eine platinhaltige Polychemotherapie, die bei Fehlen von Blutungskomplikationen durch den gegen Vascular-Endothelial-Growth-Factor (VEGF) gerichteten monoklonalen Antikörper Bevacizumab ergänzt werden kann. Bei über 70jährigen Patienten erfolgt eine Chemotherapie mit nur einem Medikament. Für ältere Patienten mit schlechtem Allgemeinzustand können alternativ platinfreie Kombinationen oder Monotherapien gewählt werden. Liegen zum Zeitpunkt der Diagnosestellung symptomatische zerebrale oder ossäre Metastasen vor, wird vor der zytostatischen Therapie eine Radiatio der entsprechenden Läsionen durchgeführt. [130, 150] Die Prognose des nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinoms im Hinblick auf die TNMStadien ist in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3: Stadienadaptierte Prognose des nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinoms nach der 7. Edition der TNM-Klassifikation für Lungentumoren [50] Klinisches Stadium Pathologisches Stadium 5-Jahres- Medianes 5-Jahres- Medianes überleben Überleben überleben Überleben IA 50% 60 Monate 73 % 119 Monate IB 40% 37 Monate 54% 70 Monate IIA 24% 38 Monate 48% 54 Monate IIB 25% 18 Monate 38% 33 Monate IIIA 18% 14 Monate 25% 23 Monate IIIB 8% 10 Monate 19% 16 Monate IV 2% 6 Monate 21% 18 Monate Die Therapie des kleinzelligen Bronchialkarzinoms unterscheidet zusätzlich die zwei Stadien „limited disease“ und „extensive disease“. „Limited disease“ entspricht den I-IIB (T1-2 N0-1 M0) sowie den Stadien IIA-IIIB (T3-4 N2-3 M0). „Extensive disease“ entspricht dem Stadium IV der TNM-Klassifikation. Bei Diagnosestellung befinden sich 60-70% der Patienten bereits in Stadium IV. Im sehr limitierten Stadium (T1-2 N0 M0) erfolgt eine anatomische Tumorresektion mit anschließender, adjuvanter Chemotherapie. In den Stadien T3-4 N0 M0 oder im primär inoperablen, sehr limitierten Stadium erfolgt in Abhängigkeit vom Alter 4 des Patienten eine kombinierte oder sequentielle Radiochemotherapie. In allen limitierten Stadien erfolgt nach Abschluss der primären Therapie eine prophylaktische Schädelbestrahlung. Im Stadium IV besteht die Behandlung aus einer palliativen, platin-basierten Chemotherapie. Patienten, die nach der Chemotherapie eine stable disease bzw. eine partielle oder komplette Remission erreichen, wird eine prophylaktische, Schädelbestrahlung durchgeführt. Beim Vorliegen von primären, symptomatischen Metastasen erfolgt eine primäre Bestrahlung. Das mediane Überleben beträgt bei „limited disease“ 16 bis 22 Monate, bei „extensive disease“ ungefähr 10 Monate. [145] 1.1.3 Neue Therapieoptionen für das Bronchialkarzinom Aufgrund der schlechten Prognose trotz konventioneller Chemo- und chirurgischer Therapie vor allem beim SCLC, aber auch beim NSCLC, ist es wichtig neue Therapiemöglichkeiten zu finden. Mit dem besseren Verständnis der molekularen Mechanismen von Neoplasien eröffnet sich die Möglichkeit neue Therapien für maligne Neoplasien zu finden, die auf einen dieser Mechanismen abzielen und somit im Vergleich zu konventioneller Chemotherapie spezifischer, effektiver und nebenwirkungsärmer sind. Diese Therapien werden als „Targeted Therapies“ bezeichnet. Eines dieser Ziele bei Lungenkrebs ist der Rezeptor für den epidermalen Wachstumsfaktor EGFR (engl.: epidermal growth factor receptor). EGFR ist ein Tyrosinkinaserezeptor, der in der Zelle verschiedene Signalkaskaden auslöst, welche für die Entstehung von Krebs eine wichtige Rolle spielen und unter anderem zu Zellwachstum, lokaler Invasion und Angiogenese führen. [72] EGFR wird bei einem großen Teil der NSCLC-Zellen überexprimiert. [128] Es gibt verschiedene Wege die Funktion von EGFR zu stören. Einer davon besteht darin, die intrazelluläre Signaltransduktion mittels Tyrosinkinaseinhibitoren zu hemmen. Shepherd et al. führten 2005 eine Phase-II-Studie an vorbehandelten NSCLCPatienten durch. Sie konnten einen Überlebensvorteil gegenüber einer Plazebobehandlung nachweisen. [141] Aufgrund dieser Studie wurde Erlotinib in 5 die Therapie des nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinoms aufgenommen. Verschiedene Folgestudien zeigten, dass vor allem Patienten mit einer Mutation des EGFR von den Tyrosinkinaseinhibitoren profitieren. [72] Eine weitere Möglichkeit mit EGFR zu interagieren stellt der monoklonale Antikörper Cetuximab dar. Cetuximab richtet sich gegen die extrazelluläre Domäne von EGFR. Pirker et al. konnten 2009 in einer randomisierten Phase-IIIStudie zur Behandlung des fortgeschrittenen NSCLC mit Chemotherapie mit und ohne Cetuximab einen Überlebensvorteil von einem Monat nachweisen [119], in einer weiteren Studie konnte dieses Ergebnis jedoch nicht wiederholt werden. [94] Ein anderes wichtiges Ziel ist VEGF. VEGF ist der wichtigste Regulator für Angiogenese, sowohl in gesundem, als auch in entartetem Gewebe, und spielt somit eine große Rolle in der Krebsentstehung. [41] Beim Bronchialkarzinom ist eine Überexpression von VEGF mit einer schlechteren Prognose verknüpft. [137] Der monoklonale Antikörper Bevacizumab richtet sich gegen VEGF. Patienten mit großzelligem Karzinom und Adenokarzinom der Lunge, die mit PaclitaxelCarboplatin und Bevacizumab behandelt wurden, haben ein um zwei Monate längeres Überleben gegenüber Patienten, die mit dem gleichen Chemotherapieschema ohne Bevacizumab behandelt wurden. [130] Auch Bevacizumab ist mittlerweile Teil der Standardtherapie. Ein weiteres Beispiel für eine effektive Zielgerichtete Therapie sind Antikörper gegen das Produkt des EML4-ALK-Fusionsgens. Ca. 5-7 % der Patienten mit NSCLC zeigen eine EML4-ALK-Translokation. In einer Phase-II Studie konnte eine hohe klinische Wirksamkeit einer zielgerichteten Therapie mit dem ALKInhibitor Crizotinib bei EML4-ALK-positiven Patienten mit fortgeschrittenem NSCLC gezeigt werden (Kwak et al., NEJM 2010). Die orale Therapie war effektiv und vielversprechend mit einer Ansprechrate (ORR) von 57% und einem progressionsfreien Überleben nach 6 Monaten von 72% bei vertretbarer Toxizität. Der Nachweis einer EML4-ALK-Translokation bei Patienten mit NSCLC ist ein neuer prädiktiver molekularer Marker für das klinische Ansprechen auf eine Inhibition von ALK und etabliert sich als weiterer wichtiger molekularer Marker. [89] In jüngerer Zeit konnten auch durch weitere immuntherapeutische Ansätze Erfolge erzielt werden. 6 1.2. Immunologische Grundlagen Das Immunsystem besitzt die Möglichkeit, zwischen körpereigenen und körperfremden bzw. durch Mutation neu entstandenen Antigenen (in der Regel Peptidsequenzen) zu unterscheiden. [167] Damit ein Peptid vom Immunsystem erkannt werden kann, muss es vom sogenannten Haupthistokompatibilitätskomplex (engl.: major histocompatibility complex, MHC), präsentiert werden. MHC-Moleküle, beim Menschen auch HLA (engl.: human leukocyte antigen) genannt, sind Glykoproteine auf der Zelloberfläche, die eine peptidbindende Furche besitzen. [153] Es gibt zwei Formen des MHC-Moleküls: MHC I und MHC II. MHC I wird auf allen kernhaltigen Zellen exprimiert und bindet Peptide einer Länge von 8-10 Aminosäuren, die Bestandteile zytosolischer Antigene sind und dort abgebaut werden, als MHC-Peptid-Komplex. [122] Peptide, die von MHC-Klasse-IMolekülen präsentiert werden, werden von sogenannten zytotoxischen TLymphozyten erkannt. Diese T-Zellen exprimieren auf ihrer Oberfläche das kostimulatorische Molekül CD8 und werden deshalb auch als CD8-positive TLymphozyten bezeichnet. Das MHC I Molekül besteht aus zwei Peptidketten, der variablen α-Kette und dem konstanten β2-Mikroglobulin. [11] Die α-Kette wird beim Menschen durch drei Gene, das HLA-A, -B und -C- Gen, kodiert, die eine große Anzahl verschiedener Allele besitzen. Die Sequenz der gebundenen Peptide ist allelspezifisch. Auch kann ein T-Lymphozyt ein Peptid nur dann als Antigen erkennen, wenn dieses an eine bestimmte allelische Variante eines MHCMoleküls, z.B. HLA-A2, gebunden ist. Wird das Peptid von einer anderen allelischen Variante des MHC-Moleküls präsentiert, so wird es von der T-Zelle nicht erkannt. Dieses Phänomen bezeichnet man als MHC-Restriktion. [176] Welche Peptide von einer Zelle eines Menschen präsentiert werden können, ist also davon abhängig, welche Allele der HLA-Gene dieser Mensch besitzt. Eines der häufigsten Allele beim Menschen ist - mit einer Häufigkeit von 46% bei der kaukasischen Bevölkerung - das Allel HLA-A2. [40] MHC II Moleküle werden nur von professionellen, antigenpräsentierenden Zellen exprimiert. Die an ihnen gebundenen Peptide werden CD4-positiven T-Zellen 7 präsentiert, die wiederum das kostimulatorische Molekül CD4 auf ihrer Oberfläche exprimieren. Die Erkennung eines MHC-Peptid-Komplexes durch einen T-Lymphozyten erfolgt mittels des T-Zell-Rezeptors. Dieses auf der Oberfläche von T-Lymphozyten exprimierte Molekül ist aus mehreren Untereinheiten aufgebaut. Der aus einer αsowie einer β-Kette bestehende antigenbindende Teil ist hochvariabel. Durch ihn wird vorgegeben, welches Antigen die T-Zelle erkennt, er bestimmt also deren Spezifität. [30] Der konstante Teil, bestehend aus dem CD3-Komplex sowie der ζKette, die ganz oder teilweise zytoplasmatisch lokalisiert sind, ist für die Signaltransduktion innerhalb der Zelle verantwortlich. [149] Das Auslösen dieser Signaltransduktion führt zur Aktivierung des T-Lymphozyten und im Falle einer zytotoxischen T-Zelle zur Freisetzung verschiedener Zytokine und lytischer Granula. [42] Neben Perforin, welches die Zellmembran der antigenpräsentierenden Zelle zerstört, enthalten diese lytischen Granula Granzyme, unter denen das Granzym B eine wichtige Rolle spielt. Granzym B ist eine Protease, die entweder indirekt durch Freisetzung von Cytochrom C aus der mitochondrialen Membran und damit durch Bildung eines Apoptosoms oder direkt durch Proteolyse die Caspasen 3 und 7 aktivieren kann. Diese setzen eine Kaskade in Gang, die schließlich zur Apoptose der antigenpräsentierenden Zelle führt. [26] Da auch Krebszellen ihre durch Mutation neu entstandenen Peptide auf MHCMolekülen präsentieren, können sie von zytotoxischen T-Zellen lysiert werden. Mit den daraus resultierenden Möglichkeiten zur Behandlung von neoplastischen Erkrankungen beschäftigt sich die Immuntherapie. 1.3. Die Immuntherapie Das Ziel der Immuntherapie ist es, eine tumorspezifische Immunantwort zu induzieren bzw. zu verstärken. Schon Paul Ehrlich, aufgrund von Tumortransplantationsversuchen mit Mäusen, und später Burnet postulierten, dass Krebszellen vom Immunsystem erkannt werden können. [19, 37] Krebszellen besitzen jedoch zahlreiche Mechanismen um der Erkennung und Zerstörung durch das Immunsystem zu entgehen. [99] 8 Während der Entstehung eines Tumors durchläuft die Immunantwort drei Phasen: eine Eliminierungsphase, in der potentielle Krebszellen erkannt und getötet werden, eine Gleichgewichtsphase, in der nicht alle Tumorzellen zerstört werden und durch Mutation und Selektion Tumorzellen entstehen, die dem Immunsystem leichter entkommen können (Immuno-Editing), und schließlich eine Evasionsphase, während der der Tumor ungehindert wachsen kann. [35] Um eine tumorspezifische Immunantwort zu erreichen, stehen grundsätzlich zwei Wege zur Verfügung. Zum einen eine passive Immuntherapie, z.B. durch die Verabreichung tumorspezifischer, monoklonaler Antikörper. Diese sind heutzutage bereits fester Bestandteil verschiedener Krebstherapien, z.B. der Anti-CD20Antikörper Rituximab bei Non-Hodgkin-Lymphomen [23, 24, 100], sowie der AntiHER2/neu-Antikörper Trastuzumab in der Therapie des Mammakarzinoms. [146] Zum anderen die aktive Immuntherapie, deren Ziel es ist, eine aktive spezifische Immunantwort zu induzieren. 1.3.1 Aktive Immuntherapie Der älteste Ansatz der Immuntherapie besteht in einer unspezifischen Aktivierung des Immunsystems durch Adjuvantien, welche die Immunantwort gegenüber dem Tumor erhöhen soll. Schon Ende des 19. Jahrhunderts behandelte der New Yorker Chirurg Coley Sarkompatienten durch Injektion einer Suspension aus abgetöteten Streptokokken und Serratia marcensens, bekannt als „Coley´s Toxin“. [25] Die unspezifische Aktivierung des Immunsystems durch Bacillus CalmetteGuérin (BCG) wird zur Therapie von Blasenkarzinomen genutzt. [12, 117] Auch Zytokine, wie Interferon-α, welches bei der antiviralen Immunabwehr eine wichtige Rolle spielt, und Interleukin-2, einem wichtigen T-Zell-Aktivator, werden in der Immuntherapie eingesetzt. Obwohl deren Einsatz aufgrund Dosis-limiterender schwerer Nebenwirkungen sehr eingeschränkt ist, konnte bei Patienten mit Malignem Melanom durch diese Behandlung bei einigen Patienten ein lang anhaltendes Ansprechen und sogar eine komplette Remission erreicht werden. [4, 84] Ein spezifischer Ansatz der Immuntherapie ist der sogenannte adoptive T-ZellTransfer. Hierbei werden antigenspezifische T-Zellen des Patienten in vitro 9 expandiert und dem Patienten danach reinfundiert. [75] Diese Methode hat z.B. beim Malignem Melanom erfolgreiche Resultate gebracht. [34, 174] Die Tumorvakzinierung stellt eine weitere Möglichkeit der spezifischen aktiven Immuntherapie dar. Hierbei spielt neben der präventiven Vakzinierung zur Verhinderung der Entstehung einer Neoplasie, die mit der Impfung gegen Hepatitis B zur Verhinderung des hepatozellulären Karzinoms [22], sowie mit der Impfung junger Mädchen gegen die Serotypen des Humanen Papillomaviruses 16 und 18 zur Vorbeugung des Zervixkarzinoms bereits etabliert sind, auch die der therapeutische Vakzinierung eine wichtige Rolle. [112]. Es gibt verschiedene Strategien eine therapeutische Vakzinierung durchzuführen. Eine Möglichkeit, ein Antigen dem Immunsystem des Patienten zugänglich zu machen, sind auf dendritischen Zellen basierende Impfstoffe. Dendritische Zellen werden z.B. aus dem peripheren Blut des Patienten isoliert, mit verschiedenen Zytokinen in vitro aktiviert, wodurch ihre antigenpräsentierenden Eigenschaften verbessert werden, und mit Peptiden oder autologen Tumorlysaten gepulst. Die dem Patienten reinfundierten, so behandelten dendritischen Zellen können Antigen-spezifische T-Zellen aktivieren und so eine Antitumor-Immunantwort auslösen.[18] Die einfachste Methode ist es, dem Patienten den Impfstoff durch direkte Injektion zu applizieren. Die Vakzinierung kann mit ganzen, sowohl autologen als auch allogenen ganzen Tumorzellen durchgeführt werden. Die Wirksamkeit von GanzZell-Impfstoffen wurde bereits in mehreren Phase-III-Studien getestet. [63, 68, 147, 165]. Außerdem kann eine Immunisierung mit Zellbestandteilen durchgeführt werden, wie z.B. mit Tumor-assoziierten Antigenen (TAA) oder Peptiden, die von TAAs abstammen. [127]. Die meisten dieser Peptide weisen eine HLA-A2Restriktion auf, da HLA-A2 eines der häufigsten Allele beim Menschen ist, und somit viele von aus HLA-A2-restringierten Peptiden bestehenden Impfstoffen profitieren können. [40] 10 1.3.2 Die Rolle Tumor-assoziierter Antigene in der Immuntherapie TAAs sind Antigene, welche entweder ausschließlich von Tumorzellen exprimiert oder von diesen überexprimiert werden. Sie können von zytotoxischen TLymphozyten erkannt werden und somit eine spezifische Immunantwort auslösen [15]. TAAs sind entweder durch Mutation neu entstandene Proteine, oder Proteine, die auf somatischen Zellen nicht vorkommen. Ein Beispiel dafür sind die Cancer/Testis oder Germline (CT/CG)- Antigene, die normalerweise nur auf plazentären Trophoblasten und Keimzellen des männlichen Hodens vorkommen. Diese Zellen exprimieren jedoch kein MHC I und können diese Antigene daher nicht präsentieren, weswegen CT/CG-Antigene als tumorspezifisch anzusehen und damit ideale Antigene zur Tumorvakzinierung sind. [56] Die ersten TAAs wurden beim Malignem Melanom durch Analyse der Zielstrukturen tumorinfiltrierender T-Lymphozyten entdeckt. [76] Weitere TAAs wurden mit der 1995 von Sahin et al. entwickelten Methode der „Serological Analysis of Recombinant cDNA Expression Libraries“ (SEREX) entdeckt. [129] Ein so entdecktes TAA ist RHAMM (engl.: receptor for hyaluronic acid mediated motility), welches von einer Vielzahl maligner Erkrankungen exprimiert wird, in gesunden Zellen aber nur während der Wundheilung vorkommt. [52, 53] Unter anderem wurde die Expression Bronchialkarzinom-Zelllinien von nachgewiesen. RHAMM [156] auf verschiedenen Intrazellulär lokalisiertes RHAMM spielt eine wichtige Rolle in der Formation des Spindelapparates während der Mitose, während RHAMM extrazellulär zur Motilität und Invasivität der Tumorzellen beiträgt. [157] Eine Vakzinierung mit einem von diesem TAA abstammenden Peptid wurde durch die Arbeitsgruppe für Tumorimmunologie der Universität Ulm bereits erfolgreich in einer klinischen Studie bei Patienten mit AML, MDS und Multiplen Myelom getestet. [57] Survivin, ein weiteres TAA, gehört zu der Familie der „inhibitors of apoptosis proteins“. [91] Es hemmt die Apoptose durch Inhibition der Caspase 9 und spielt so eine wichtige Rolle in der Tumorgenese. [33] Die Expression beschränkt sich normalerweise auf fetales Gewebe. Survivin wird jedoch bei fast allen Krebserkrankungen, unter anderem bei Lungen-, Brust- und Blasenkrebs sowie 11 bei Multiplem Myelom und Malignem Melanom gefunden. [1] Bei einigen Malignomen korreliert die Survivinexpression mit einem schlechten Ansprechen auf Chemotherapie und einer schlechten Prognose. [113] Aufgrund seines Vorkommens bei einer Vielzahl von Krebserkrankungen stellt Survivin ein interessantes Target für die Immuntherapie dar. [3] Eine klinische Phase-I/IIStudie zur Vakzinierung mit HLA-A2-restringierten Peptiden von Survivin bei Pankreas-, Zervix-, Kolon-, Nebennieren- und Merkelzellkarzinompatienten, sowie Melanompatienten konnte in 50% eine Peptid-spezifische Immunantwort nachweisen. [79] Auch das zunächst bei Patienten mit Malignem Melanom entdeckte PRAME (engl.: preferentially expressed antigen in melanoma) findet sich bei einer Vielzahl von Krebserkrankungen, wie beim nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinom, beim Nierenzellkarzinom, bei Sarkomen und bei Plattenzellkarzinomen im Kopf/HalsBereich. Es gehört zu den CT/CG-Antigenen und wird somit in gesundem Gewebe nur im Hoden exprimiert. PRAME-spezifische zytotoxische T-Lymphozyten wurden bei Melanompatienten zwar nachgewiesen, der Selektionsvorteil durch die Expression von PRAME schien dem Effekt der Immunantwort jedoch zu überwiegen.[69] PRAME hemmt die durch Retinsäure induzierte Apoptose, Differenzierung und den Zell-Zyklus-Arrest und wirkt sich so vorteilhaft in der Entstehung von Neoplasien aus. [39] Steinbach et al. konnten 2002 eine bessere Prognose bei der Expression von PRAME in der kindlichen AML nachweisen, dies scheint jedoch mit einer Korrelation der PRAME-Expression mit prognostisch günstigen, zytogenetischen Veränderungen wie der Translokation der Chromosomen 8 und 21 zusammenzuhängen. [152, 163] Eine dosisabhängige, TZell-vermittelte Immunantwort gegen das von PRAME abgeleitete Peptid P-3 wurde bei AML-Patienten nachgewiesen. [55] Eine erste Phase-I-Studie zur Peptidvakzinierung mit von PRAME und dem Prostata-spezifischen Membranantigen PSMA abgeleiteten Peptiden bei Patienten mit soliden Tumoren bei HLA-A2 positiven Patienten zeigte keine schweren Nebenwirkungen. PRAMEspezifischen T-Zell-vermittelte Immunantworten konnten bei 11 von 24 Patienten beobachtet werden. [171] Das Produkt des Wilms-Tumor-Gens WT1 wurde zunächst als Tumorsuppressorgen angesehen, da seine Mutation zur Entstehung eines Nephroblastoms oder auch Wilms Tumors bei Kindern führt. [60] Da WT-1 aber 12 bei mehreren soliden Tumoren und Leukämien vorkommt - es wurde unter anderem in 96% bei NSCLC- und in 83% bei SCLC-Zelllinien nachgewiesen [109] -, nimmt man an, dass es eine wichtige Rolle in der Tumorgenese spielt. [154] WT-1 wird von gesunden Zellen während der Embryogenese exprimiert und spielt eine wichtige Rolle in der Entwicklung der Nieren. [61, 101] Bei Leukämiepatienten gibt es bereits mehrere Peptidvakzinierungsstudien. [21] Nachdem an einem Mausmodell nachgewiesen wurde, dass WT-1-spezifische, zytotoxische T-Zellen das Tumorwachstum bei Lungenkrebs hemmen können, bezogen Oka et al. 2004 5 Lungenkrebspatienten und Krug et al. 2010 2 NSCLC-Patienten in Phase-I/IIStudien zur Peptidvakzinierung bei soliden Tumoren mit ein. In beiden Studien wurden bei den Bronchialkarzinompatienten keine schweren Nebenwirkungen festgestellt. 2010 konnte in einem der beiden Patienten eine spezifische Immunantwort gegen WT-1 nachgewiesen werden, 2004 in 3 von 5. Außerdem konnte in 3 Patienten eine Abnahme in der Tumormarkerkonzentration beobachtet werden. [87, 110] Das Protein G250/Carboanhydrase IX wurde zunächst als Zielstruktur des monoklonalen Antikörpers mabG250 entdeckt und G250 genannt. [111] Es stellte sich später heraus, dass es sich bei G250 und dem 1994 entdeckten TAA Carboanhydrase IX/MN [115] um das selbe Protein handelt.[51] Carboanhydrase IX wird in einer Vielzahl von Tumoren exprimiert und ist ein Marker für die Hypoxie. [70] Studien zur prognostischen Bedeutung von Carboanhydrase IX beim NSCLC zeigten, dass es hier zu einem großen Prozentsatz exprimiert wird. Eine Überexpression korreliert mit einer schlechten Prognose. [83, 144] Zur therapeutischen Anwendung von mabG250 bei Nierenzellkarzinompatienten gibt es bereits mehrere klinische Studien. [142] Greiner et al. wiesen 2006 eine spezifische durch zytotoxische T-Zellen vermittelte Immunantwort gegen das von G250/Carboanhydrase IX abstammende Peptid G-2 bei AML Patienten nach. [55] Später wurde dies auch bei Patienten mit Plattenzellkarzinomen des Kopf/Halsbereichs beobachtet. [133] HER-2/neu -das Produkt des „human EGRF-related gene“- ist eine RezeptorTyrosin-Kinase [6], die in verschiedenen malignen Erkrankungen, vor allem beim Mamma- und Ovarialkarzinom, aber auch beim NSCLC vorkommt und deren Expression mit einer schlechteren Prognose korreliert. [155] Der anti-HER2/neuAntikörper Transtuzumab spielt in der Therapie des Mammakarzinoms bereits 13 eine wichtige Rolle. [146] Von HER2/neu abstammende Peptide können jedoch auch eine Immunantwort bei HLA-A2-restringierten T-Lymphozyten auslösen.[116] Es wurden mehrere klinische Phase-II-Studien zur Vakzinierung mit dem von HER2/neu abgeleiteten Peptid E75 bei Mammakarzinompatientinnen durchgeführt. Hierbei wurden keine schweren Nebenwirkungen beobachtet und eine T-Zell-vermittelte, spezifische Immunantwort konnte nachgewiesen werden. [8, 102] Eine Phase-I-Studie zur Vakzinierung mit drei verschiedenen Peptiden bezog auch Ovarialkarzinom- sowie NSCLC-Patienten mit ein. Auch hier konnte in 92% eine T-Zellimmunatwort nachgewiesen werden.[32] Als eine weitere interessante Zielstruktur haben sich die Aurorakinasen herausgestellt. Diese sind eine Gruppe von Seronin/Threoninkinasen von der bisher 3 Subtypen, Aurora-A, -B und -C, bekannt sind. Die Struktur dieser drei Proteine ist zu 70% homolog. Aurora A ist im Zentrosom lokalisiert und wirkt unter anderem beim Eintritt in die Mitose, bei der Ausbildung des Spindelapparates, bei der Anlagerung der Chromosomen an diesen, sowie bei der Zytokinese mit. [93] Aurora A wird bei mehreren Malignomen überexprimiert, in gesundem Gewebe, außer im Hoden jedoch nur sehr schwach.[10] In einer Studie mit NSCLC-Patienten zeigte sich eine erhöhte Expressionsrate in 83% und erwies sich auch als prognostischer Marker. Patienten, bei denen Aurora A hauptsächlich perimembranös lokalisiert war, hatten eine schlechtere 5-Jahresüberlebensrate als Patienten mit einem diffusen Verteilungsmuster, deren 5-Jahresüberlebensrate sich nicht von der Überlebensrate Aurora-A-negativer Patienten unterschied. Dieser Unterschied erwies sich allerdings nur bei Patienten mit Plattenepithelkarzinom als signifikant.[108] Verschiedene Mausmodelle zum Mammakarzinom zeigten, dass eine Überexpression von Aurora A zur Bildung von Tumoren führt.[92, 170] Die Ausschaltung der Funktion von Aurora A durch Kinaseinhibitoren wird bereits in klinischen Studien getestet.[48, 151] Daneben ist Aurora A wegen seiner niedrigen Expressionsrate in gesundem Gewebe auch ein mögliches Ziel in der Immuntherapie. Ochi et al. konnten zeigen, dass ein von Aurora A abstammendes Peptid, welches in das HLA-A2 Bindemotiv passt, zytotoxische T-Zellen generieren kann, die in der Lage sind CML-Zellen zu lysieren. [106] 14 Aurora B bildet mit Survivin, Borealin und INCENP (engl.: inner centromer protein) einen Komplex mit dem Namen „chromosome passanger complex“. [14] Durch Phosphorylierung von Histonen trägt dieser zur Kondensierung der Chromosomen bei. [103] Außerdem spielt der Komplex eine Rolle in der Anlagerung der Mikrotubuli an die Kinetochoren und in der Zytokinese. [161] Smith et al. fanden bei NSCLC-Patienten in 89% eine mindestens doppelt so hohe Expression von Aurora B in den Tumorzellen wie im gesunden Gewebe. Eine sehr starke Überexpression war mit einem signifikant schlechteren, progressionsfreien Überleben vergesellschaftet. [148] Studien zur Immunogenität von Aurora B gibt es bisher nicht. 1.4. Die Immuntherapie beim Bronchialkarzinom Die Immuntherapie wird bereits in der Therapie des Bronchialkarzinoms eingesetzt. Neben der passiven Immuntherapie mit Antikörpern wie Bevacizumab und Cetuximab [119, 131] wird auch mit Ansätzen der aktiven Immuntherapie gearbeitet. Zunächst versuchte man, die Therapie durch unspezifische Anregung des Immunsystems zu verbessern. Bereits in den 70er Jahren des vergangenen Jahrhunderts wurde eine randomisierte, doppelblinde Studie begonnen, in der Patienten mit nichtkleinzelligem Bronchialkarzinom im frühen Stadium nach Resektion intrapleural BCG verabreicht wurde. Es konnte keine Verbesserung des Gesamtüberlebens beobachtet werden. [44] In einer weiteren Studie, in der die Therapie mit BCG und dem T-Zell-stimulierenden Imidazolthiazol Levamisol bei Patienten mit großzelligem Karzinom und Adenokarzinom in den Stadien II und III mit Chemotherapie verglichen wurde, stellte sich die Chemotherapie als überlegen heraus. [67] Der Ansatz einer Therapie mit Interferon-α und Interleukin-2 wurde nicht weiter verfolgt, nachdem in einer Phase-I/II-Studie 9 von 11 Patienten eine Progression der Erkrankung aufwiesen. [73] In jüngster Zeit wurde in der Behandlung verschiedener Tumorentitäten mit PF-3512676 gearbeitet. PF3512676 ist ein Agonist des Toll-like-Rezeptors 9 und aktiviert dendritische Zellen, 15 sowie B-Lymphozyten. Zwei Phase-III-Studien bei Patienten mit fortgeschrittenem, nichtkleinzelligen Bronchialkarzinom mussten wegen schwerwiegender Nebenwirkungen jedoch vorzeitig abgebrochen werden. [65, 97] Erfolgreicher waren Studien mit immunmodulatorischen Antikörpern, wie dem Cytotoxic-T-Lymphocyte-Antigen-Antagonisten (engl.: zytotoxisches T-Zell-Antigen 4, CTLA-4) Ipilimumab. CTLA-4 ist ein auf T-Zellen exprimiertes Molekül, welches durch die Bindung an die kostimulierenden Glykoproteine CD80 und CD86 auf antigenpräsentierenden Zellen bindet und die T-Zell-Aktivierung verhindert. Die Blockade von CTLA-4 durch Ipilimumab verbessert somit die T-Zell-Aktivierung. [107] Zunächst konnte in klinischen Studien beim Malignen Melanom eine Wirksamkeit von Ipilimumab mit und ohne Kombination mit einem Tumorvakzin aus HLA-A2-restringierten Peptiden des TAA gp100 nachgewiesen werden. [66] In einer Phase-II-Studie konnte 2012 auch bei Patienten mit NSCLC ein signifikant besseres progressionsfreies und Gesamt-Überleben in einer Kombination mit einer Chemotherapie aus Paclitaxel und Carboplatin nachgewiesen werden. [95] Ein anderes koinhibitorisches Molekül auf T-Zellen ist das Programmed death 1 Protein (engl.: programmierter Tod) PD-1, dessen Ligand PD-L1 im Gegensatz zu CD80 und CD86 Tumorumgebung selektiv exprimiert tumorspezifischere auf vielen wird T-Zell-Aktivierung und Tumorzellen dessen auslöst. [71] und Zellen in Inhibition somit Klinische Studien der eine mit Antikörpern gegen PD-1 und PD-L1 zeigten unter anderem bei NSCLC-Patienten ein klinisches Ansprechen. [17, 158] 2013 wurde in einer Phase-I-Studie die Wirksamkeit einer Kombination von Ipilimumab mit dem anti-PD-1-Antikörper Nivolumab nachgewiesen. [173] 1.4.1 Die Rolle der Tumorvakzinierung beim Bronchialkarzinom In der Therapie des Bronchialkarzinoms werden verschiedene Ansätze der Tumorvakzinierung verfolgt. Es gibt mehrere klinische Studien zur Vakzinierung mit ganzen Zellen. Die Impfung von NSCLC-Patienten mit autologen Tumorzellen, die durch einen adenoviralen Vektor genetisch so modifiziert wurden, dass sie den Granulozyten und Makrophagen-koloniestimulierenden Faktor GM-CSF 16 freisetzen, um die Immunantwort zu verstärken, wurde in einer Phase-I/II-Studie getestet. Drei von 33 Patienten zeigten eine länger andauernde komplette Regression. [104] In einer weiteren Studie, in der mit autologen Tumorzellen und einer GM-CSF freisetzenden Zelllinie geimpft wurde, konnten zwar zelluläre Immunantworten nachgewiesen werden, ein klinisches Ansprechen konnte jedoch nicht beobachtet werden. [105] Eine weitere Phase-II-Studie wurde mit dem Impfstoff Belagenpumatucel durchgeführt. Belagenpumatucel wurde aus vier verschiedenen NSCLC-Zelllinien gewonnen und genetisch so manipuliert, dass er weniger TGFβ sezerniert und somit immunogener ist. Die Studie zeigte bei Patienten mit höherer Impfdosis ein längeres Überleben. In einer Phase-III-Studie mit dem selben Impfstoff zeigte sich ein gegenüber einer Therapie Placebo um 2,5 Monate längeres durchschnittliches Gesamtüberleben. [27] Verschiedene Phase-I-Studien mit Dendritischen-Zell-Vakzinen, die mit autologen Tumorzellen, Zelllinien und Peptiden gepulst wurden, konnten in einigen Patienten zelluläre Immunantworten nachweisen. [64, 118, 160] Am weitesten fortgeschritten in der klinischen Testung und am erfolgversprechendsten ist bisher die Peptidvakzinierung. Derzeit läuft eine Phase-III-Studie zur Vakzinierung mit einem rekombinaten Fusionsprotein aus dem TAA MAGE (engl.: melanoma associated antigen) A3 und dem Protein D des Haemophilus influenzae. Die Studie hat über 2000 Patienten mit NSCLC in den Stadien IB, II und IIIA in 33 Ländern rekrutiert. [159] MAGE A3 ist ein CT/CG-Antigen und wird bei verschiedenen Tumorarten gefunden. [28] Beim NSCLC kommt MAGE A3 in bis zu 50% vor. Die Expressionsrate steigt mit dem klinischen Stadium an. So konnte bei NSCLC-Patienten im Stadium I eine Expression von MAGE A3 in 30% der Fälle detektiert werden, während die Expressionsrate im Stadium II bei 50% lag. [143] Die Expression von MAGE A3 korreliert mit einer schlechteren Prognose. [59] Schon 1994 wurde nachgewiesen, dass MAGE A3 immunogen ist und von T-Lymphozyten erkannt wird. [46] Bei Melanompatienten, die mit einem HL-A2-restringierten Peptid von MAGE A3 geimpft wurden, konnten sogar komplette Remissionen beobachtet werden. [98] In einer Phase-II-Studie mit NSCLC-Patienten im Stadium IB und II hatten Patienten, die mit dem MAGE A3-Fusionsprotein geimpft wurden, gegenüber Patienten, die mit einem Plazebo behandelt wurden ein längeres krankheitsfreies Überleben und ein längeres Gesamtüberleben. [29] In einer Untergruppe von Patienten, die ein 17 genetisches Muster aufwiesen, das mit einer besonders hohen Rezidivrate assoziiert war, hatten geimpfte Patienten ein um 45% reduziertes relatives Risiko für ein Rezidiv. [78] Eine weitere Phase-III-Studie wird gegenwärtig bei NSCLC-Patienten in den Stadien IIIB und IV mit dem Impfstoff Stimuvax durchgeführt. Stimuvax besteht aus dem vom muzinösen Glykoprotein Mucin 1 (MUC-1) abstammendem Lipoprotein L-BLP25. [20] MUC-1 ist ein glykosyliertes Transmembranprotein, welches normalerweise am apikalen Pol von Epithelzellen vorkommt. [166] In Krebszellen verliert MUC-1 seine Polarität, wird häufig überexprimiert und ist oft weniger glykosyliert, wodurch Peptidepitope zum Vorschein kommen. Dadurch wird es zu einer interessanten Zielstruktur für die Immuntherapie. [132] In einer randomisierten Phase-II-Studie bei NSCLC-Patienten in den Stadien IIIB und IV nach Erstlinientherapie zeigten vakzinierte Patienten einen Überlebensvorteil von 4,4 Monaten gegenüber einer Kontrollgruppe. [20] An der nun laufenden Phase-IIIStudie nehmen über 1400 Patienten teil. [29] Auch das TAA „humane Telomerase reverse Transkriptase“ (hTERT) hat sich als potentes Target in der Immuntherapie gegen Lungenkrebs erwiesen. hTERT ist die katalytische Untereinheit des Ribonukleinprotien-Telomerase-Komplexes. Telomerasen sind Enzyme, die die Telomere genannten Endstücke der Chromosomen wiederherstellen können. Die Telomere gehen in somatischen Zellen nach der Zellteilung verloren, da die DNA-Polymerase nicht dazu in der Lage ist, die Telomere zu kopieren. Die Telomerase ist beim Menschen in den somatischen Zellen inaktiv, wodurch die Anzahl an Teilungen, die eine Zelle erleben kann, limitiert ist. In Krebszellen wird die Telomerase jedoch wieder aktiv und die Zellen können sich so unendlich oft teilen. Deswegen ist hTERT ein in den meisten Krebsarten vorkommendes Antigen. [82] Bei Lungenkrebspatienten wird hTERT in bis zu 94% exprimiert. [88] Patienten mit NSCLC, die hTERT exprimieren, haben eine signifikant schlechtere 5-Jahresüberlebensrate, als hTERT-negative Patienten. [43] Bolonaki et al. veröffentlichten 2007 eine PhaseII-Studie an Patienten mit inoperablem, nichtkleinzelligem Bronchialkarzinom in den Stadien III und IV, die mit Radio- und Chemotherapie vorbehandelt waren. Die Patienten wurden mit TERT572Y geimpft, einem von hTERT abstammendem, HLAA2-restringiertem Peptid, das modifiziert wurde, um die Affinität zu HLA-A2 zu erhöhen und es so immunogener zu machen. Es konnten bei 90% der geimpften 18 Patienten hTERT572Y-spezifische, CD8-positive T-Zellen detektiert werden. Patienten, die eine frühe, schon nach der zweiten Vakzinierung detektierbare Immunantwort zeigten, hatten, wie in Abbildung 1 dargestellt, ein längeres Überleben. Außerdem war die Zeit bis zum Fortschreiten der Erkrankungen bei diesen Patienten ebenfalls länger. [13] Abbildung 1: A: Zeit bis zum Progress (time to progress, TTP) bei Patienten mit früher Immunantwort (blau) und ohne Immunantwort (gelb); B: Überlebenszeit bei Patienten mit früher (blau) und ohne Immunantwort (gelb) [13] Dieselbe Arbeitsgruppe führte 2012 eine weitere Phase-II-Vakzinierungsstudie mit TERT572Y bei Patienten mit anderen fortgeschrittenen Krebserkrankungen durch. Auch hier konnte bei Patienten, die eine Immunantwort aufbauten, gegenüber Patienten ohne adäquate Immunantwort ein längeres progressionsfreies Intervall und ein längeres Gesamtüberleben nachgewiesen werden. [86] 19 1.5. Zielsetzung dieser Arbeit Die Prognose sowohl des kleinzelligen, als auch des nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinoms ist trotz weitreichender Fortschritte in der Chirurgie, der Chemotherapie und der Strahlentherapie nach wie vor sehr schlecht. Lungenkrebs ist die häufigste Krebstodesursache beim Menschen. Deshalb ist die Entwicklung neuer Therapiestrategien von entscheidender Bedeutung. Studien zur Immuntherapie z.B. mit T-Zell-aktivierenden Antikörpern wie Ipilimumab und Anti-PD-1/Anti-PD-L1-Antiköpern, oder Tumorvakzinierung mit TAA-basierten Peptidimpfstoffen haben in letzter Zeit vielversprechende Ergebnisse geliefert. Es ist daher von entscheidender Bedeutung, immunogene Peptide zu identifizieren, mit denen neue Impfstoffe entwickelt werden können. In dieser Arbeit wird die Immunogenität von elf von TAAs abgeleiteten Peptiden bei an fortgeschrittenem Bronchialkarzinom erkrankten Patienten untersucht. Hierzu wurden Granzym-B- und Interferon-γ-ELISpot-Assays etabliert, durchgeführt und ausgewertet und somit das Potential dieser Peptide, Antigenspezifische, zytotoxische Lymphozyten zu induzieren, bestimmt. 20 2. MATERIAL UND METHODEN 2.1 Material 2.1.1 Grundaustattung Allgemeine Laborgeräte • Brutschrank B5042E, CO2-Auto-Zero, Heraeus Instruments, Hanau • Digitalwaage Sartorius BP110S, Sartorius Mechatronics, Göttingen • ELISPOT-Reader Immuno Spot, C.T.L. Europe, Reutlingen • FACS-Gerät FACScan, Fa. Becton Dickinson, Heidelberg • Gefrierschrank -20°C: Superfrost, Liebherr, Ochsenhausen -80°C: Ultra Low, Sanyo Fisher, München • Kühlschrank +4°C: Liebherr, Ochsenhausen • Laminar Flow Hera- Safe HS- 18, Heraeus Instruments, Hanau • Magnetständer MACS MultiStand, Milteny Biotec, Bergisch Gladbach • Mikroskop Carl Zeiss, 10-, 16-, 25- und 100-fache Vergrößerung, Jena • Neubauer Zählkammer Zeiss, Oberkochen • pH-Messgerät 827pH lab, Metrohm, Filderstadt • Pipettboy pipettboy acu, IBS Integra Biosciences, Fernwald • Pipetten 0,5-10 µl 10-100 µl 50-250 µl 200-1000 µl Eppendorf Reference, Eppendorf AG, Hamburg • Stickstofftank Taylor Wharton Type M280, Mildstedt 21 • Vortexer Vortex Genie 2, Scientific Industries, New York, USA • Wasserbad Julabo GFL Typ 1003, Julabo Labortechnik GmbH Seelbach/West • Zentrifuge Beckmann-Coulter, CL-GS6R, Beckman-Coulter Instruments, Fullerton, USA Plastikwaren Alle Plastikwaren wurden von den jeweiligen Firmen steril bezogen: • Einfrier-Röhrchen Nunc Cryo TubeTM Vials 1,8 ml Nalge Nunc International, Roskilde, Dänemark • Einmalspritzen 1 ml, Terumo Syringe, Terumo Europe N.V., Leuven, Belgien • ELISPOT- Platten MultiScreen-IP, MultiScreen 96-well filtration Assay Plate, Millipore, Bedford, USA • Injektionskanüle Gr. 1, Braun AG, Melsungen • Pipettenspitzen 0,1 – 10 µl 2 – 200 µl 50 – 1000 µl Eppendorf AG, Hamburg • Platten FALCON multiwell 12-, 24-wells FALCON microtest™ U-Bottom 96 wells BD Labware, Franklin Lakes, USA • Pre-separation Filter MACS Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach • Eppendorfgefäße Safe-Lock Tube 1,5 ml und 2 ml Eppendorf AG, Hamburg • Röhrchen FALCON® Polypropylen Tubes, 15 ml und 50 ml Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA • Sterilfilter Minisart RC 15 Sartorius, Hannover • Stripetten 2 ml 5 ml 10 ml 22 25 ml 50 ml Costar Stripette, Corning Inc., New York, USA • Trennsäulen MACS MS+ Separation Columns, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach • Zellkulturflaschen NUNCLONTM Surface, 400 ml Nalge Nunc International, Roskilde, Dänemark 2.1.2 Chemikalien Sämtliche Laborchemikalien wurden in höchstmöglicher Reinheit von den jeweiligen Firmen bezogen: • AB-Serum Deutsches Rotes Kreuz, Ulm • AEC-Substratset Fa. BD Biosciences, San Jose, USA • Aqua destillata Spüllösung 1000 ml Fa. Fresenius Kabi, Bad Homburg • β2-Mikroglobulin Fa. Calbiochem, La Jolla, USA • DMSO Dimethylsulfoxid, Fa. Merck, Darmstadt • Färbetabletten 5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphate und Nitroblue tetrazolium chloride, Fa. Sigma-Aldrich, San Louis, USA • Fetales Kälberserum Sera Plus Fa. Pan Biotech GmbH, Aidenbach • Ficoll Separating Solution Fa. Biochrom AG, Berlin • Granzyme B-Antikörper Fa. BD Biosciences, San Jose, USA • IFN-γ-Antikörper Fa. Mabtech, Hamburg • IL-7 Fa. Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach 23 • IL-2 Fa. Sigma-Aldrich, San Louis, USA • L-Glutamin Fa. Biochrom AG, Berlin • MicroBeads CD8 Fa. Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach • DPBS 10x Fa. Gibco, Invitrogen, Auckland, NZ • Penicillin/ Streptomycin Fa. Gibco BRL, Eggenstein • RPMI 1640 Fa. Biochrom AG • Trypanblau-Lösung 0,4% Fa. Sigma-Aldrich, Deisenhofen • Tween20 Fa. Sigma-Aldrich, Deisenhofen • Zelllinien Deutsche Sammlung von Zellen und Mikroorganismen, Braunschweig; American Type Culture Collection, Manassas, USA 2.1.3 Puffer Coating-Puffer In 100 ml Aqua bidest. wurden folgende Inhaltsstoffe gelöst: • 318 mg Natriumcarbonat • 580 mg Natriumhydrogencarbonat • 49 mg Natrium-Azid Die Lösung wurde auf einen pH-Wert von 9,6 eingestellt und steril filtriert. Substrat-Puffer In 500 ml Aqua bidest. wurden folgende Inhaltsstoffe gelöst: • 0,1 M TRIS (6,05 g/500 ml) • 0,1 M NaCl (2,9 g/500 ml) • 5 mM MgCl2 (237 g/500 ml) Die Lösung wurde auf einen pH-Wert von 9,5 eingestellt und steril filtriert. 24 Dilutions-Puffer In 500 ml PBS wurden 50 ml FCS gelöst. Der Dilution-Puffer enthält so 10% FCS. PBS, phosphate buffered saline 1 l Aqua bidest. mit folgenden Salzen: • 8,0 g Natriumchlorid • 0,2 g Kaliumchlorid • 1,44 g Natriumhydrogenphosphat • 0,24 g Kaliumhydrogenphosphat Die Lösung wurde auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt und steril filtriert. PBStween1 l PBS mit 0,5 ml Tween20 Separations-Puffer 500 ml PBS mit 2mM EDTA und 0,5% hitzeinaktiviertem, fetalem Kälberserum Blocklösung Granzyme B-ELISPOT RPMI- Medium mit 10% hitzeinaktiviertem FCS, 1% Penicillin/Streptomycin und 1% L-Glutamin Blocklösung IFN- γ- ELISPOT PBS mit 1% hitzeinaktiviertem AB-Serum 2.1.4 Zelllinien, Antikörper und Zytokine Zelllinien: • T2: ATCC-Nummer: CRL-1992 Die T2-Zelllinie ist eine Variante der T1-Zelllinie, die unter Auswahl des monoklonalen Antikörpers SFR1-MI.3 (gegen eine monomorphe Determinante auf HLA-DR) hergestellt wird. Die humanen Lymphoblasten synthetisieren HLA-B5, aber exprimieren es nicht. Die Zelllinie exprimiert HLA-A2 und ist CD7-positiv. • K562: DSMZ-Nummer: ACC 10 25 Die Zellen dieser Zelllinie wurden 1970 aus dem Pleuraerguss einer 53jährigen CML- Patientin im Stadium der Blastenkrise gewonnen. K-562 Blasten sind multipotente, hämatopoetische, maligne Zellen, die sich spontan in Progenitorzellen der erythrozytären, granulozytären und monozytären Reihe differenzieren können. Diese Zellen exprimieren keine HLA-Antigene. FACS-Antikörper (Fa. Becton-Dickinson) • FITC konjugierter Maus-IgG1-Antikörper (Isotypenkontrolle) • FITC konjugierter α-Human HLA-A2 Antikörper Zytokine • Interleukin-2 (IL-2): Die Sekretion von IL-2 sowie die Expression seines Rezeptors werden durch die Bindung eines Antigens an den T-Zellrezeptor stimuliert. Die IL-2/ IL-2Rezeptor-Interaktion stimuliert auf diese Weise das Wachstum, die Differenzierung und das Überleben der antigenspezifischen zytotoxischen TZelle (CTL). IL-2 ist damit unter anderem auch für die Bildung von TGedächtniszellen zuständig. IL-2 wurde zur Kultivierung von T-Zellen eingesetzt. • Interleukin-7 (IL-7): IL-7 ist ein hämatopoetischer Wachstumsfaktor, der von Stromazellen des Knochenmarks und von Thymozyten gebildet wird. Er stimuliert die Differenzierung von pluripotenten Stammzellen zu lymphoiden Progenitorzellen, B-, T- und NK-Zellen. Des Weiteren ist das Zytokin ein Cofaktor im V(D)J-Rearrangement des T-Zellrezeptors. IL-7 schützt zudem humane CD4+ Effektor- und Gedächtnis-T-Zellen vor Apoptose bei mangelnder Stimulation und fehlender Zytokine. Aufgrund dieser Eigenschaften wurde IL-7 zur Kultivierung von T-Zellen eingesetzt. 2.1.5 Zellkulturmedien Medium zur T-Zell-Kultivierung 26 RPMI-Medium mit 1% Penicillin/Streptomycin, 1% L-Glutamin und 10% L-Glutamin und 10% hitzeinaktiviertem und steril filtriertem, humanem AB-Serum Medium zur K562-Zell-Kultivierung RPMI-Medium mit 1% Penicillin/Streptomycin, 1% hitzeinaktiviertem FCS Einfriermedium RPMI-Medium mit 20% AB-Serum, 1% L-Glutamin, 1% Penicillin/Streptomycin und 10% DMSO (Dimethylsulfoxid) 2.1.6 Peptide Die untersuchten Peptide leiten sich von den TAAs RHAMM, PRAME, WT-1, hTERT, Survivin, MAGE A3, Aurora A, Aurora B, G250 und HER2 ab. Bis auf Aura A1 und Aura B1 sind alle Peptide aus der Literatur bekannt. Letztere wurden in einer bisher unveröffentlichten Arbeit unserer Gruppe untersucht. Alle Peptide sind HLA-A2 restringiert. Die Peptide sind mit ihrer Aminosäurensequenz in Tabelle 4 des Ergebnisteils aufgelistet. Die Peptide wurden von GL Biochem Ltd., Shanghai, China und ThermoFisher Scientific, Ulm bezogen. 2.1.7 Patienten Alle Proben wurden ausschließlich bei Lungenkrebspatienten entnommen, welche hierfür eine Einverständniserklärung unterzeichnet hatten. Diese war zuvor von der Ethikkommission der Universität Ulm approbiert worden. Die Charakteristika der Patienten, die in der Durchflusszytometrie HLA-A2-positiv waren und deren Proben weiter verwendet wurden, sind in Tabelle 4 aufgelistet. 27 Tabelle 4: Alter, Geschlecht und Diagnose der Patienten; M = männlich, W = weiblich, NSCLC = nicht-kleinzelliger Lungenkrebs, SCLC = kleinzelliger Lungenkrebs Patient 2.2 Diagnose Geschlecht Alter in Jahren Patient I NSCLC W 69 Patient II NSCLC W 57 Patient III NSCLC W 61 Patient IV NSCLC W 52 Patient V NSCLC W 46 Patient VI NSCLC W 49 Patient VII NSCLC M 67 Patient VIII SCLC M 62 Patient IX NSCLC M 79 Patient X NSCLC M 57 Patient XI NSCLC M 62 Patient XII NSCLC M 78 Patient XIII NSCLC M 61 Patient XIV SCLC M 80 Patient XV NSCLC W 68 Methoden 2.2.1 Materialgewinnung und Aufbereitung Materialgewinnung: Die peripheren, mononukleären Blutzellen (PBMCs) wurden aus dem Vollblut der Patienten gewonnen. Sämtliche Blutproben wurden in der Klinik für Innere Medizin III des Universitätsklinikums Ulm nach Einwilligung der Patienten abgenommen. Dies geschah durch Punktion einer peripheren Vene. Das Blut wurde sofort nach Abnahme durch Zugabe von 1,2-2mg Ethyldiamintetraessigsäure (EDTA) pro ml Blut gerinnungsunfähig gemacht. 28 Zellisolation: Peripheres Blut besteht ungefähr zu 55% aus Plasma und zu 45% aus korpuskulären Anteilen, also Zellen. Zu diesen gehören die Erythrozyten, die Thrombozyten sowie die Leukozyten. Letztere lassen sich wiederum in Granulozyten und mononukleäre Zellen unterteilen, deren größten Anteil Lymphozyten und Monozyten ausmachen. Um die PBMCs von den restlichen Blutbestandteilen zu trennen wurde eine FicollHypaque-Dichtegradietenzentrifugation durchgeführt. Hierzu wurde das gerinnungsunfähig gemachte, periphere Blut im Volumenverhältnis 2:1 mit PBS verdünnt und 21- 30ml auf 15-18ml Ficoll-Lösung in einem 50ml Falcon geschichtet und bei 2000 Umdrehungen pro Minute 20 Minuten lang ohne Bremse zentrifugiert. Aufgrund ihrer geringeren Dichte lagern sich die PBMCs auf der Grenzschicht zwischen Plasma und Ficoll-Lösung als sogenannter „Buffy-Coat“ ab, während die Erythrozyten und Granulozyten wegen ihrer höheren Dichte nach unten sinken. Der „Buffy-Coat“ wurde daraufhin vorsichtig abpipettiert, in 50ml PBS aufgenommen und durch dreimaliges Zentrifugieren, Abschütten des Überstandes und Aufnehmen des Pellets in 50ml PBS gewaschen. Bestimmung der Zellzahl: Zwischendurch wurden das Pellet in nur 5ml PBS gelöst und 10µl zum Zählen entnommen. Diese 10µl wurden im Verhältnis 1:10 mit Türk-Lösung verdünnt, wodurch eventuell verbliebene Erythrozyten abgetötet und die PBMCs leicht angefärbt werden. Die Lösung wurde in eine Neubauer-Zählkammer pipettiert und die Zellen unter dem Mikroskop ausgezählt. Auf der Neubauerzählkammer finden sich vier Großquadrate. Das Volumen unter einem dieser Großquadrate entspricht 0,1µl. Durch folgende Formel wurde die Zellzahl errechnet: N ×V ×10 4 × v n N = Zahl der gezählte Zellen n V = Zahl der ausgezählten Großquadrate € = Verdünnungsfaktor 104 = Kammerfaktor (um auf die Zellen pro 1ml zu kommen) v = Volumen in dem die Zellen gelöst sind 29 Archivierung der Zellen: Zur Kryokonservierung der Zellen wurden je 1x107 Zellen in 1,5ml Einfriermedium gelöst und in Kryoröhrchen pipettiert. Diese wurden in einem Freezing Container, welcher mit Alkohol gefüllt ist, um eine Einfrierrate von -1°C/min zu gewährleisten, in einen -80°C-Tiefkühlschrank verbracht und nach frühestens 24 Stunden in Flüssigstickstoff überführt. 2.2.2 Typisierung der HLA-Oberflächenantigene mittels Durchflusszytometrie Da alle untersuchten Peptide HLA-A2-restringiert sind, mussten die Zellen der Patienten alle HLA-A2 auf ihrer Oberfläche exprimieren, also HLA-A2-positiv sein. Dies geschah durch ein Durchflusszytometer (engl. fluorescence-activated cell sorter, FACS). Diese Methode basiert auf der Verwendung von monoklonalen Antikörpern gegen das gesuchte Oberflächenmolekül, welche mit dem Fluoreszenzfarbstoff Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) gekoppelt sind. Das Gemisch der markierten Zellen wird durch eine feine Kapillare gedrückt, so dass die Zellen einzeln in einem laminaren Strom einen Laser passieren. Das Licht des Lasers wird von den Zellen gestreut und durch Photodetektoren, die sowohl die Seitwärts- als auch die Vorwärtsstreuung messen, erfasst, wodurch Aussagen über die Größe und Granularität der Zellen getroffen werden können. Außerdem regt der Laser das FITC zur Emission von Licht an. Dieses wird erfasst und liefert so Informationen über die Oberflächenantigene der Zellen. Hierzu wurden je 0,5x106 – 1x106 vorher isolierte PBMCs des Patienten in 2ml ABMedium gelöst und in 2 Röhrchen gegeben, das dann mit FACS-Puffer aufgefüllt wurde und bei 1200 bis 1400 Umdrehungen pro Minute 10 Minuten lang zentrifugiert und anschließend dekantiert. Auf das Pellet im ersten Röhrchen wurden 2µl des Fluoreszenzantikörpers HLA-A2 FITC pipettiert, welcher an HLA-A2 bindet. Auf das Pellet im zweiten Röhrchen wurden als Negativkontrolle 5µl des Fluoreszenzantikörpers ISO-FITC (Anti-Mouse) pipettiert. Die Lösungen wurden dann für 20 Minuten bei 4°C im Dunkeln inkubiert und anschließend mit 1ml PBS aufgefüllt und zentrifugiert. Die Zellen wurden daraufhin in 200µl PBS aufgenommen und mit dem FACS-Gerät ausgewertet. Als Positivkontrolle wurden Zellen der T2-Zelllinie verwendet, die HLA-A2 auf ihrer Oberfläche exprimieren, verwendet und als Negativkontrolle Zellen der Zelllinie K562, die kein HLA-A2 exprimieren. 30 2.2.3 Zellseparation Zur Separation der PBMCs in CD8-positive und CD8-negative Zellen wurden an gegen CD8 gerichtete Maus-Antikörper gekoppelte, paramagnetische Partikel, sogenannte Microbeads, verwendet. In einem Magnetic Cell Sorting (MACS) genanntem Verfahren wurden die mit den Microbeads inkubierten PBMCs durch Stahlwolle enthaltende Trennsäulen gegeben, an denen ein magnetisches Feld angebracht ist. Die CD8-positiven Zellen, an denen die Microbeads haften, bleiben durch das Magnetfeld in der Glaswolle hängen, während die CD8-negativen Zellen die Glaswolle passieren und unten aufgefangen werden. Hierzu wurden die kryokonservierten Zellen in einem 37°C warmen, Wasserbad getaut und in 20ml Plain-Medium aufgenommen. Dann wurden sie für 5-10 Minuten bei 1200-1400 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert und anschließend dekantiert. Das Pellet wurde in 5ml Separationspuffer aufgenommen und es wurden 20µl zum Zählen der Zellen entnommen. Diese wurden im Verhältnis 1:1 mit Tryptanblau verdünnt, welches abgestorbene Zellen blau anfärbt, und wie oben beschrieben in einer Neubauer-Zählkammer ausgezählt. Währenddessen wurden die restlichen Zellen zentrifugiert und dekantiert. Es wurden pro 107 Zellen 80µl Separationspuffer und 20µl Microbeads zugegeben und für 15 Minuten bei 4°C inkubiert. Daraufhin wurden 5ml Separationspuffer zugegeben, die Mischung zentrifugiert und dekantiert und das Pellet in 500µl Separationspuffer aufgenommen. Dies wurde in die zuvor mit 500µl Separationspuffer angefeuchteten Trennsäulen gegeben und drei Mal mit 500µl Separationspuffer nachgespült. Das Eluat, welches die CD8-negativen Zellen enthielt, wurde in einem 50ml Falcon aufgefangen, anschließend wurden 10ml AB-Medium zugegeben. Danach wurde die Trennsäule vom Magneten entfernt und nach Zugabe von 1ml Separationspuffer mit einem Stempel über einem 15ml Falcon ausgedrückt. Zu diesem, die CD8-positiven Zellen enthaltenden, Eluat wurden 4ml AB-Medium gegeben. Beiden Eluaten wurde je 20µl zum Zählen entnommen. Die Zellen wurden wie oben beschrieben gezählt. 31 2.2.4 Gemischte Lymphozyten-Peptid-Kultur Tag 0 Von den ausgezählten, CD8-positiven Zellen wurden 5x106 Zellen in 7ml AB-Medium aufgenommen und in einer 24-Well-Zellkulturplatte auf 14 Näpfe aufgeteilt, so dass pro Napf 5x105 Zellen in 500µl gelöst suspendiert waren. Falls nicht genug Zellen vorhanden waren, wurden nur 2,5x105 Zellen in 500µl pro Napf verwendet. Die übrigen Näpfe wurden mit 1ml PBS aufgefüllt, um einer ungleichen Verdunstung entgegenzuwirken. Die CD8-negativen Zellen wurden für 30 Minuten mit 30 Gray einer Caesium-37Quelle bestrahlt um zu verhindern, dass die mononukleären Zellen als Reaktion auf die T-Zellen aktiviert werden und proliferieren. Die Bestrahlung wurde freundlicherweise vom Deutschen Roten Kreuz Ulm durchgeführt. Die bestrahlten Zellen wurden zentrifugiert und dekantiert. 28x106 Zellen wurden in 7ml AB-Medium aufgenommen und pro ml 2,5µg β2-Mikroglobulin wurden zugegeben. Anschließend wurde die Mischung auf 14 15ml-Falcon-Röhrchen aufgeteilt, so dass je 500µl mit je 2x106 Zellen pro Falcon enthalten waren, um später ein Verhältnis von 4:1 zwischen CD8-positiven und CD8-negativen Zellen zu erreichen. Sollten nur 2,5x105 CD8-positive Zellen pro Napf verwendet worden sein, wurden nur 1x106 Zellen pro Napf zugegeben. Von den 11 zu untersuchenden Peptiden wurden je 10µg in je einen Falcon gegeben, sowie als Positivkontrolle 10µg IMP bzw. CMV in je einen Falcon. Als Negativkontrolle wurde einer Probe kein Peptid zugegeben. Die Zellen wurden 1,5 Stunden bei 37°C im Brutschrank inkubiert, zentrifugiert, dekantiert, in je 500µl AB-Medium aufgenommen und zu den CD8-positiven Zellen in die 24-Well-Zellkulturplatte gegeben. Die CD8-negativen Zellen wirkten als Antigen präsentierende Zellen und präsentierten den CD8-positiven, zytotoxischen T-Zellen die aufgenommenen Peptide auf ihrem HLA-A2 Oberflächenmolekül, um diese zu aktivieren. Die Zellkulturplatte wurde mit Folie beklebt und bei 37°C im Brutschrank über Nacht inkubiert. 32 Tag 1 Pro Napf wurden 2,5ng Interleukin-2 und 20ng Interleukin-7 zugegeben und die Zellen für weitere 7 Tage im Brutschrank inkubiert. Der Wachstumsfaktor Interleukin2 induziert die Proliferation und Differenzierung der T-Zellen. Tag 8 Die stimulierten T-Zellen wurden aus der 24-Well-Platte entnommen und in 15ml Falcons gegeben, die Näpfe wurden anschließend mit 1ml AB-Medium gespült. Den Proben wurde je 20µl zum Zählen entnommen und wie oben beschrieben ausgezählt. Die Zellen wurden dann zentrifugiert, dekantiert und auf eine Konzentration von 1x104 Zellen pro 50µl gebracht. 2.2.5 Etablierung der Assays und Nachweis der T-Zell-Antwort Die Aktivierung der T-Zellen wurde mit einem sogenannten Enzyme-linked Immunoabsorbent spot-Assay (ELISpot) nachgewiesen. Die nachgewiesenen Stoffe waren Interferon-γ, ein Zytokin, das von aktivierten zytotoxischen T-Zellen sezerniert wird, und Granzym B, ein Enzym, das ebenfalls von aktivierten zytotoxischen TZellen freigesetzt wird. Aktivierte T-Zellen werden in einen Napf gegeben, dessen aus Nitrozellulose bestehender Boden den Fc-Teil zytokinspezifischer Antikörper, sogenannter Capture-Antibodies bindet. Die T-Zellen werden entfernt, während die sezernierten Zytokine an den Antikörpern haften bleiben. Ein zweiter zytokinspezifischer Antikörper, Detection-Antibody, wird zugegeben und bindet die Zytokine. Der Fc-Teil des Antikörpers ist biotinyliert, was bedeutet, dass er Biotin gebunden hat. Ein mit Streptavidin, einem Protein, welches mit hoher Affinität Biotin bindet, konjugiertes Enzym wird zugegeben und bindet so an den Detekionsantikörper. Ein Substrat wird zugegeben, aus welchem das Enzym ein unlösliches, farbiges Päzipitat bildet. An jeder Stelle, an der eine Zytokin sezernierende Zelle war, wird so ein Punkt sichtbar. Die Punkte können mit Hilfe eines ELISpot-Readers ausgezählt werden. 33 ELISpot Tag 1 Die 96-Napf Platten für den ELISpot-Assay wurden mit dem Capture-Antibody beschichtet (Coating). Für den Granzym-B-ELISpot wurden die Antikörper 1:200 mit PBS verdünnt und je 100µl in 42 Näpfe pipettiert. Für den IFNγ-ELISpot wurden je 15µl Antikörper auf 1ml Coating Buffer gegeben und je 60µl in 42 Näpfe pipettiert. Beide Platten wurden über Nacht bei 4°C inkubiert. ELISpot Tag 2 Vorbereiten der T2-Zellen: Für eine erneute Antigenpräsentierung zur erneuten Stimulierung der CD8-positiven T-Zellen wurden Zellen der T2-Zelllinie verwendet. Hierzu wurden die T2-Zellen zentrifugiert, dekantiert, ausgezählt und in eine Konzentration von 4x104 Zellen pro 50µl Medium gebracht. Den Zellen wurde pro ml 2,5µg β2-Mikroglobulin zugegeben und je 500µl in 14 15ml-Falcon-Röhrchen pipettiert. 10µg der untersuchten Peptide wurden in je einen Falcon gegeben, sowie 10µg CMV bzw. IMP in je einen Falcon als Positivkontrolle. Einer Probe wurde als Negativkontrolle kein Peptid beigegeben. Die Zellen wurden für 1,5 Stunden bei 37°C im Brutschrank mit den Peptiden inkubiert. Danach wurden sie zentrifugiert, dekantiert und die Pellets in je 500µl ABMedium resuspendiert. Blocken der ELISpot-Platten: Um unspezifische Bindung zu vermeiden, wurden die über Nacht inkubierten Platten geblockt. Die Granzym-B-ELISpot-Platte wurde einmal mit Granzym-B-Blocklösung gewaschen und mit 200µl Blocklösung pro Napf geblockt. Die IFNγ-ELISpot-Platte wurde zweimal mit PBS gewaschen und mit 100µl IFNγ-Blocklösung pro Napf geblockt. Beide Platten wurden bei Raumtemperatur für zwei Stunden gelagert. Beladen der Platten: Die T2-Zellen wurden mit je 500µl der aus der MLPC stammenden CD8-positven TZellen in einer Konzentration von 1x104 Zellen pro 100µl Medium zusammengebracht, so dass sich ein Verhältnis von 4:1 zwischen T2-Zellen und CD8-positiven T-Zellen ergab. 34 Von der Zellsuspension wurde je 100µl pro Napf auf die ELISpot-Platten pipettiert, wobei für jede Probe je drei Näpfe pro Platte verwendet wurden. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C im Brutschrank inkubiert. ELISPOT Tag 3 Aufbringen des Detektionsantikörpers: Granzym B: Die Platte wurde zweimal mit destilliertem H2O und dreimal mit PBS/Tween20 gewaschen. Der Detektionsantikörper wurde im Verhältnis 1:250 mit Verdünnungspuffer verdünnt und je 100µl der Lösung in jeden Napf pipettiert. IFNγ: Die Platte wurde fünfmal mit PBS und fünfmal mit PBS/Tween gewaschen. Es wurde je 1µl Detektionsantikörper auf 1ml PBS/Tween gegeben und in jeden Napf wurden 100µl der Lösung pipettiert. Beide Platten wurden für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Aufbringen des Enzymkonjugats: Granzym B: Die Platte wurde dreimal mit PBS/Tween gewaschen und je 100µl des im Verhältnis 1:100 mit Verdünnungspuffer verdünnten Enzymkonjugats in jeden Napf pipettiert. IFNγ: Die Platte wurde sechsmal mit PBS/Tween gewaschen. Das Enzymkonjugat wurde im Verhältnis 1:1000 mit PBS/Tween verdünnt und je 100µl in jeden Napf pipettiert. Beide Platten wurden für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Färbung: Granzym B: Die Platte wurde viermal mit PBS/Tween und einmal mit PBS gewaschen. Es wurden je 20µl AEC-Chromogen auf 1ml AEC-Substrat gegeben. Je 100µl der chromogenen Substratlösung pro Napf wurden auf die Platte pipettiert. Die Färbung wurde für 5-60 Minuten im Dunkeln einwirken gelassen und durch dreimaliges Waschen mit H2O gestoppt. 35 IFNγ: Eine Tablette 5-Bromo-4-chloro-3-indoyl-phosphat (BCIP) wurde in 500µl Dimethylformamid und eine Nitroblue-Tetrazolium-Chlorid (NBT) wurde in 1ml H2O gelöst. Beide Lösungen wurden durch 0,45µm Filter filtriert. Auf 10ml Substratpuffer wurden je 330µl der NBT-Lösung und 33µl der BCIP-Lösung gegeben und in je 100µl pro Napf auf die Platten pipettiert. Die Reaktion wurde nach 2 Minuten im Dunkeln durch dreimaliges Waschen mit H2O gestoppt. Beide Platten wurden über Nacht bei Raumtemperatur getrocknet und frühestens am nächsten Tag durch den ELISpot-Reader mit Hilfe des Programms ImmunoSPOT automatisch ausgezählt. 2.2.6 Statistische Methoden: Die durchschnittliche Spotzahl der drei Wells wurde mit folgender Formel berechnet: n 1 x = × ∑ xi n i =1 x = Anzahl der Spots n = Anzahl der Wells = 3 36 3. Ergebnisse 3.1. Bestimmung des Oberflächenantigens HLA-A2 mittels Durchflusszytometrie Für die MLPC und den anschließenden ELISpot Assay wurden Proben von Bronchialkarzinompatienten untersucht. Da die untersuchten Peptide alle HLA-A2-restringiert sind, mussten die PBMCs der untersuchten Patienten HLA-A2 auf ihrer Oberfläche exprimieren. Die HLAOberflächenantigene wurden mittels FACS-Analyse bestimmt. Hierzu wurden PBMCs von insgesamt 35 Patienten untersucht. Dabei waren 16 Patienten HLAA2 positiv und 19 HLA-A2 negativ. Abbildung 2 zeigt eine Probe eines HLA-A2 positiven Patienten. A B C Abbildung 2: FACS–Messung der PBMC einer Probe eines HLA-A2 positiven Patienten; A: Gesamtpopulation der PBMCs; B: Mit Mouse-FITC inkubierte Zellen zum Ausschluss unspezifischer Bindungsstellen; C: Darstellung des HLA–A2 positiven Anteils der Population (FACS= fluorescence activated cell sorting, FITC= fluorescein-iso-thio-cyan, HLA= human leukocyte antigen, Ig= Immunglobulin, SSC= side scatter, FSC= forward scatter) Abbildung 3 zeigt die Probe eines HLA-A2 negativen Patienten. 37 A B C Abbildung 3: FACS–Messung der PBMC einer Probe eines HLA-A2 negativen Patienten; A: Gesamtpopulation der PBMCs; B: Mit Mouse-FITC inkubierte Zellen zum Ausschluss unspezifischer Bindungsstellen; C: Darstellung des HLA–A2 positiven Anteils der Population (FACS= fluorescence activated cell sorting, FITC= fluorescein-iso-thio-cyan, HLA= human leukocyte antigen, Ig= Immunglobulin, SSC= side scatter, FSC= forward scatter) 3.2. Auswahl der untersuchten Peptide Die in dieser Arbeit untersuchten Peptide wurden mittels einer internetbasierten Analyse ausgewählt. Sie sind mit ihrer Aminosäurensequenz und ihrer Position im Protein in Tabelle 5 aufgelistet. Alle untersuchten Peptide weisen eine HLA-A2Restriktion auf. 38 Tabelle 5: Untersuchte Peptide und deren Aminosäurensequenz (RHAMM= receptor for hyaluronan acid mediated motility, PRAME= preferentially expressed antigen in melanoma, WT-1= Wilms-Tumor-Gen 1, hTERT= human telomerase reverse transcriptase, MAGE= melanoma associated antigen, HER2= human endothelial growth factor related gene) Peptid Aminosäurensequenz Peptidposition RHAMM-R3 ILSLELMKL 165-173 PRAME-P3 ALYVDSLFFL 300-309 WT-1 RMFPNAPYL 126-134 hTERT ILAKFLHWL 540-548 Survivin 2 ELTLGEFLKL 95-104 MAGE-A3_01 FLWGPRALV 271-279 MAGE-A3_02 KVAELVHFL 112-120 AURA A1 TLCGTLDYL 288-296 AURA B1 KIADFGWSV 215-223 G-250-G2 QLLLSLLLL 24-32 HER-2-H2 RLLQETELV 689-697 Als Positivkontrolle wurden IMP und CMV verwendet. Auch diese Peptide sind HLA-A2-restringiert. Ihre Aminosäuresequenzen finden sich in Tabelle 6. Tabelle 6: Aminosäuresequenzen der als Positivkontrollen verwendeten Peptide (IMP= influenza matrix protein, CMV= Cytomegalievirus) Peptid Aminosäurensequenz Peptidposition IMP GILGFVFTL 58-66 CMV NLVPMVATV 495-503 39 3.3. Ergebnisse des ELISpot-Assays Es wurden bei insgesamt 15 Patienten ELISpot-Assays für Granzym-B und Interferon-γ durchgeführt und dabei in der Anwendung bei Bronchialkarzinompatienten etabliert. 12 dieser Patienten hatten die Diagnose NSCLC und 2 die Diagnose SCLC. Bei einem der Patienten konnte die Diagnose des Bronchialkarzinoms im Nachhinein nicht bestätigt werden. Die Proben dieses Patienten wurden zwar untersucht, tauchen aber in den Ergebnissen nicht auf. Aufgrund teilweise geringer Zellzahlen konnten jedoch nur bei 11 der 15 Patienten alle Peptide untersucht werden. Um eine unspezifische Reaktion auszuschließen, wurde einem Well kein Peptid hinzugefügt, um so eine Negativkontrolle zu erhalten. Ein Nachweis für den Erfolg eines Versuches wurde mit IMP bzw. CMV erbracht, da aufgrund einer hohen Durchseuchungsrate mit Influenza bzw. mit Zytomegalievirus eine positive Reaktion bei der Mehrzahl der Patienten zu erwarten war. 3.3.1 Ergebnisse des Interferon-γ-ELISpot-Assays Abbildung 4 zeigt die Messung der Interferonfreisetzung bei einem Patienten mit NSCLC nach MLPC mit IMP, CMV, den untersuchten Peptiden sowie ohne Stimulation (no peptide). Für jedes Peptid sind die Ergebnisse aus 3 Wells sowie deren Mittelwert dargestellt. 40 Well 1 Well 2 Well 3 Mittelwert HER2 G250 Aura B1 Aura A1 MAGE A3_02 MAGE A3_01 SURVIVIN 2 hTERT WT-1 PRAME RHAMM CMV IMP No Peptide Anzahl der Spots 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 Abbildung 4: Darstellung der Messwerte eines Interferon-γ-ELISpot-Assays bei Patient VIII (Einzelne Wells: hellblau, Mittelwert: dunkelblau) (IMP= influenza matrix protein, CMV= Cytomegalievirus, RHAMM= receptor for hyaluronan acid mediated motility, PRAME= preferentially expressed antigen in melanoma, WT-1= Wilms-Tumor-Gen 1, hTERT= human telomerase reverse transcriptase, MAGE= melanoma associated antigen, HER2= human endothelial growth factor related gene) Die relativ geringe Anzahl von Spots bei der Negativkontrolle spricht für eine geringe unspezifische Reaktion. Eine deutlich positive Reaktion zeigen die Positivkontrollen mit IMP und CMV. Dies zeigt, dass der Versuch erfolgreich war. Reaktionen auf die untersuchten Peptide wurden als spezifisch gewertet, wenn die durchschnittliche Anzahl von Spots mehr als das zweifache der unspezifischen Reaktion der Negativkontrolle betrug. In Einzelfällen wurden Zählfehler des ELISpot-Readers durch visuelle Kontrolle der fotografischen Auswertung, die hier in Abbildung 5 dargestellt ist, korrigiert. In diesem Fall wurden die Reaktionen auf G250 und HER2 als spezifisch gewertet. Die Reaktionen auf die anderen Peptide wurden als unspezifisch gewertet. 41 Abbildung 5: Fotografische Auswertung des Interferon-γ-ELISpot-Assays von Patient VIII (IMP= influenza matrix protein, CMV= Cytomegalievirus, RHAMM= receptor for hyaluronan acid mediated motility, PRAME= preferentially expressed antigen in melanoma, WT-1= Wilms-Tumor-Gen 1, hTERT= human telomerase reverse transcriptase, MAGE= melanoma associated antigen, HER2= human endothelial growth factor related gene) Abbildung 6 zeigt ein weiteres Beispiel für die Interferonfreisetzung bei einem Patienten mit NSCLC. Aufgrund der geringen Zellzahl konnten hier nicht alle Peptide untersucht werden. Des Weiteren musste auf die zweite Positivkontrolle durch CMV verzichtet werden. 300 Well 1 Well 2 Well 3 Mittelwert Anzahl der Spots 250 200 150 100 G250 Aura B1 Aura A1 MAGE A3_01 MAGE A3_02 Survivin 2 hTERT WT-1 PRAME RHAMM IMP 0 No Peptide 50 Abbildung 6: Darstellung der Messwerte eines Interferon-γ-ELISpot-Assays bei Patient IX (Einzelne Wells: hellblau, Mittelwert: dunkelblau) (IMP= influenza matrix protein, CMV= Cytomegalievirus, RHAMM= receptor for hyaluronan acid mediated motility, PRAME= preferentially expressed antigen in melanoma, WT-1= Wilms-Tumor-Gen 1, hTERT= human telomerase reverse transcriptase, MAGE= melanoma associated antigen, HER2= human endothelial growth factor related gene) 42 Die geringe Spotzahl bei der Negativkontrolle sowie die deutlich positive Reaktion auf IMP sprechen für einen erfolgreichen Versuch. Spezifische positive Reaktionen wurden hier bei PRAME, hTERT, sowie bei G250 nachgewiesen. Die dazugehörige fotografische Auswertung ist in Abbildung 7 dargestellt. Abbildung 7: Fotografische Auswertung eines Interferon-γ-ELISpot-Assays von Patient IX (IMP= influenza matrix protein, CMV= Cytomegalievirus, RHAMM= receptor for hyaluronan acid mediated motility, PRAME= preferentially expressed antigen in melanoma, WT-1= Wilms-Tumor-Gen 1, hTERT= human telomerase reverse transcriptase, MAGE= melanoma associated antigen, HER2= human endothelial growth factor related gene) Auf diese Weise wurde die durch die Peptide ausgelöste INFγ-Freisetzung bei 14 Patienten untersucht. Die Peptide, die am häufigsten eine spezifische Reaktion auslösen konnten, sind mit je 58%, 57% und 50% G250, PRAME und HER2. Tabelle 7 gibt einen detaillierten Überblick über die Ergebnisse der IFNγ-ELISpotAssays bei allen Patienten. 43 Tabelle 7: Ergebnisse der IFNγ-ELISpot-Assays; positive Reaktion sind mit einem +, negative mit einem - und nicht untersuchte Peptide mit n.d. für not done gekennzeichnet. (RHAMM= receptor for hyaluronan acid mediated motility, PRAME= preferentially expressed antigen in melanoma, WT1= Wilms-Tumor-Gen 1, hTERT= human telomerase reverse transcriptase, MAGE= melanoma associated antigen, HER2= human endothelial growth factor related gene) RHA PRA MM ME Patient I + + Patient II + Patient III WT-1 hTER Surviv MAGE MAGE Aura A1 B1 G250 HER2 T in 2 + - - - + - - - + + + + + + + + + + + + + - - - - - - - - - Patient V - - - - - - - - - - - Patient V - - - - - + - - - - - Patient VI - + - - - - - - - + - Patient VII + + - + + + + + + + + Patient VIII - - - - - - - - - + + Patient IX - + - + - - - - - + n.d. Patient X - - - - - - - - - + n.d. Patient XI - - - - - - + - - - - Patient XII - - - n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. Patient XIII - + - + - - - + + + + Patient XIV - + - - + - - + + n.d. n.d. 2 von 4 von 3 von 3 von 4 von 4 von Rate % 4 von 8 von A3_01 A3_02 Aura 4 von 7 von 5 von 14 14 14 13 13 13 13 13 13 12 10 29% 57% 15% 31% 23% 23% 31% 31% 31% 58% 50% 3.3.2 Ergebnisse des Granzym-B-ELISpot-Assays Parallel zu den IFNγ-ELISpot-Assays wurden ELISpot-Assays für Granzym-B durchgeführt. Abbildung 8 stellt die Messung der Granzym-B-Freisetzung bei Patient VI dar. 44 HER 2 G250 Aura B1 Aura A1 MiMelwert MAGE A3_01 MAGE A3_02 Well 3 Survivin 2 hTERT Well 2 WT-­‐1 PRAME RHAMM CMV IMP Well 1 No Pep1de Anzahl der Spots 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 Abbildung 8: Darstellung der Messwerte eines Granzym-B-ELISpot-Assays bei Patient VI (Einzelne Wells: rot, Mittelwert: dunkelrot) (IMP= influenza matrix protein, CMV= Cytomegalievirus, RHAMM= receptor for hyaluronan acid mediated motility, PRAME= preferentially expressed antigen in melanoma, WT-1= Wilms-Tumor-Gen 1, hTERT= human telomerase reverse transcriptase, MAGE= melanoma associated antigen, HER2= human endothelial growth factor related gene) Wie beim IFNγ-ELISpot-Assay sprechen die hohe Spotzahl in den Positivkontrollen sowie die geringe Spotzahl in der Negativkontrolle für einen gelungenen Versuch. Auch hier wurde die Reaktion auf Peptide bei einer mehr als doppelt so hohen Spotzahl wie bei der Negativkontrolle als spezifisch gewertet. Patient VII zeigte eine positive Reaktion gegenüber G250. Abbildung 9 zeigt die fotografische Auswertung des Granzym-B-ELISpot-Assays bei Patient VI. 45 Abbildung 9: Fotografische Auswertung eines Granzym-B-ELISpot-Assays von Patient VI (IMP= influenza matrix protein, CMV= Cytomegalievirus, RHAMM= receptor for hyaluronan acid mediated motility, PRAME= preferentially expressed antigen in melanoma, WT-1= Wilms-Tumor-Gen 1, hTERT= human telomerase reverse transcriptase, MAGE= melanoma associated antigen, HER2= human endothelial growth factor related gene) HER2 G250 Aura B1 Aura A1 MAGE A3_02 MAGE A3_01 Mittelwert Survivin 2 3 hTERT 2 WT-1 PRAME RHAMM CMV 1 IMP 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 No Peptide Anzahl der Spots Die Auswertung eines weiteren Granzym-B-ELISpot-Assays zeigt Abbildung 10. Abbildung 10: Darstellung der Messwerte eines Granzym-B-ELISpot-Assays bei Patient VIII (Einzelne Wells: rot, Mittelwert: dunkelrot) (IMP= influenza matrix protein, CMV= Cytomegalievirus, RHAMM= receptor for hyaluronan acid mediated motility, PRAME= preferentially expressed antigen in melanoma, WT-1= Wilms-Tumor-Gen 1, hTERT= human telomerase reverse transcriptase, MAGE= melanoma associated antigen, HER2= human endothelial growth factor related gene) 46 Bei Patient VIII wurde die Reaktion auf G250 als spezifisch gewertet. Die fotografische Auswertung des Granzym-B-ELISpot-Assays von Patient VIII ist in Abbildung 11 dargestellt. Abbildung 11: Fotografische Auswertung eines Granzym-B-ELISpot-Assays von Patient VIII (IMP= influenza matrix protein, CMV= Cytomegalievirus, RHAMM= receptor for hyaluronan acid mediated motility, PRAME= preferentially expressed antigen in melanoma, WT-1= Wilms-TumorGen 1, hTERT= human telomerase reverse transcriptase, MAGE= melanoma associated antigen, HER2= human endothelial growth factor related gene) Die Peptide G250, PRAME und AURA B1 zeigten mit 58%, 43% und 38% am häufigsten spezifische Reaktionen in den Granzym-B-ELISpot-Assays. Die Ergebnisse der Assays aller Patienten sind in Tabelle 8 dargestellt. 47 Tabelle 8: Ergebnisse der Granzym-B-ELISpot-Assays; positive Reaktion sind mit einem +, negative mit einem - und nicht untersuchte Peptide mit n.d. für not done gekennzeichnet. (RHAMM= receptor for hyaluronan acid mediated motility, PRAME= preferentially expressed antigen in melanoma, WT-1= Wilms-Tumor-Gen 1, hTERT= human telomerase reverse transcriptase, MAGE= melanoma associated antigen, HER2= human endothelial growth factor related gene) RHA PRAM MM E Patient I + + Patient II - Patient III Survi MAGE MAGE Aura Aura T vin 2 A3_01 A3_02 A1 B1 + - - - + - - - - - - - - - - - - - - + + - - - - - - + + - Patient IV - - - - - - - - + - - Patient V - + - - + + - + + - - Patient VI - - - - - - - - - + - Patient VII + + - + + - + + + + - Patient VIII - - - - - - - - - + - Patient IX - + - + - - - - - + n.d. Patient X - - - - - - - - - + n.d. Patient XI + - - - - - + - - - - Patient XII - - - n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. Patient XIII - + - + - - + - - + - Patient XIV - - - - + - - + + n.d. n.d. Rate 4 von 6 von 1 von 3 von 3 von 1 von 4 von 3 von 5 von 14 14 14 13 13 13 13 13 13 12 10 29% 43% 13% 23% 23% 8% 31% 23% 38% 58% 0% % WT-1 hTER G250 HER2 7 von 0 von Nur bei einem Patienten (Patient XIII) konnten keine spezifischen T-Zellantworten nachgewiesen werden. Allerdings konnten bei diesem wegen ungenügendem Probenmaterial nur 3 Peptide untersucht werden. Bei allen anderen Patienten konnte zumindest eine positive Reaktion in einem der beiden ELISpot-Assays ausgelöst werden. Elf Patienten zeigten sogar spezifische Immunantworten gegen mindestens zwei Peptidepitope. Die Reaktionen auf die Peptide im Granzym-B- und Interferon-γ-ELISpot-Assay waren nicht immer kongruent. Abbildung 12 stellt die Ergebnisse der beiden 48 ELISpot-Assays einander gegenüber. Die Peptide G250 und PRAME lösten mit 50% und 36% am häufigsten in beiden ELISpot-Assays eine spezifische Reaktion aus. HER2 zeigt hingegen mit 50% im Interferon γ- und 0% im Granzym-BELISpot-Assay ein sehr unterschiedliches Ergebnis. 70% Positivitätsrate 60% IFN und GrB IFN Granzyme B 50% 40% 30% 20% 10% 0% Abbildung 12: Gegenüberstellung des Interferon-γ- und des Granzyme-B-ELISpot-Assays, die lilafarbenen Balken stellen die Peptide dar, die in beiden Assays positiv waren. (RHAMM= receptor for hyaluronan acid mediated motility, PRAME= preferentially expressed antigen in melanoma, WT1= Wilms-Tumor-Gen 1, hTERT= human telomerase reverse transcriptase, MAGE= melanoma associated antigen, HER2= human endothelial growth factor related gene) 49 4. Diskussion 4.1 Nachweis einer zellulären Immunantwort gegen die untersuchten Antigene Das Peptid, welches bei den meisten Patienten eine zelluläre Immunantwort auslösen konnte, war das von G250/Carboanhydrase IX abgeleitete Peptid G2 mit positiven Reaktionen in 58% sowohl im Granzym-B- als auch im Interferon-γELISpot-Assay. Die Immunogenität von G250-G2 wurde durch unsere Arbeitsgruppe bereits bei AML-Patienten untersucht. Dabei konnte mit dem Nachweis von G250G2-spezifischen T-Lymphozyten bei 6 von 10 Patienten ein ähnliches Ergebnis erzielt werden wie in dieser Arbeit. [55] Schmitt et al. untersuchten 2009 die durch G250-G2 hervorgerufene zelluläre Immunantwort bei Patienten mit Tumoren des Kopf/Halsbereiches, bei denen eine G250-Expression bioptisch nachgewiesen wurde. Im Granzym-B-ELISpot-Assay fanden sich in 75% positive Reaktionen, im Interferon-γ-ELISpot in jedoch nur in 14%. [133] Klinische Studien zu einer Peptidvakzinierung mit G250-G2 gibt es bisher nicht. Die bisherigen Daten zeigten jedoch, dass G250-G2 ein interessantes Target für eine zukünftige klinische Anwendung ist. Dies gilt besonders für das nicht-kleinzellige Bronchialkarzinom, da die Expressionsrate von G250/Carboanhydrase IX beim NSCLC bei 72-100% liegt. [83, 144] PRAME-P3 löste mit positiven Reaktionen im Granzym-B-ELISpot in 43% und im Interferon-γ-ELISpot in 57% am zweithäufigsten eine zelluläre Immunantwort aus. Kessler et al. identifizierten 4 von PRAME abstammende Peptidepitope, die mit hoher Affinität an HLA-A2 binden. [81] Unsere Arbeitsgruppe untersuchte deren Immunogenität zunächst bei gesunden Probanden und die dabei vielversprechenden Peptide P1 und P3 bei AML-Patienten. Bei 70% der Patienten konnten PRAME-P3 spezifische, zytotoxische T-Lymphozyten nachgewiesen werden. [55] In einer PhaseI-Studie wurden Patienten mit verschiedenen soliden Tumoren unter anderem mit einem anderen, von PRAME abgeleiteten Peptid geimpft. Es wurden keine schweren Nebenwirkungen beobachtet und in 11 von 24 Patienten konnte eine PRAME 50 spezifische Immunantwort ausgelöst werden. [171] Im Zusammenhang mit unseren Ergebnissen und der Tatsache, dass PRAME bei 78% der Plattenepithelkarzinome und 46% Adenokarzinome der Lunge zu finden ist [69], ist auch PRAME-P3 ein vielversprechender Kandidat für eine zukünftige klinische Anwendung. HER2-H2 konnte im Interferon-γ-ELISpot in 50% eine positive Reaktion hervorrufen. Jedoch hatte es im Granzym-B-ELISpot mit keiner einzigen positiven Reaktion das schwächste Ergebnis. HER2-H2 wurde von Kono et al. 1998 als ein von HER2/neu abstammendes Peptid identifiziert, das mit hoher Affinität an HLA A2 bindet und von zytotoxischen T-Zellen erkannt wird. [85] Da HER2 bei 24-100% der nichtkleinzelligen Bronchialkarzinome vorkommt und eine hohe Expressionsrate mit einer schlechten Prognose einhergeht, ist es eine potente Zielstruktur für die Immuntherapie des NSCLC. [16, 155] HER2-H2 wurde bereits in einer Phase-IIStudie bei 63 Patienten mit NSCLC als Teil eines aus zehn, von verschiedenen TAAs abgeleiteten Peptiden bestehenden Impfstoffs getestet. Das Vorkommen HER2-H2spezifischer zytotoxischer T-Zellen wurde nach der Vakzinierung mittels eines Interferon-γ-ELISpot-Assays untersucht und konnte in 36% nachgewiesen werden. [7] Ein Granzym-B-ELISpot wurde in der Studie nicht durchgeführt. Es wäre interessant zu sehen, ob die Ergebnisse dort analog zu unseren divergieren. Dieser Sachverhalt wird an späterer Stelle diskutiert. Das von hTERT abstammende Peptid mit der Peptidposition 540-548 konnte im Interferon-γ-ELISpot-Assay in 31% und im Granzym-B-ELISpot-Assay in 23% eine positive Reaktion hervorrufen. hTERT540-548 ist ein HLA-A2-restringiertes Peptid, das in der Lage ist, spezifische zytotoxische T-Zellen zu induzieren. [168] In einer PhaseI-Studie wurde hTERT540-548 als Dendritisches-Zell-Vakzin bei 7 Patienten mit metastasiertem Prostata- oder Brustkrebs angewandt. In 4 Patienten konnten hTERT540-548-spezifische T-Lymphozyten nach der Vakzinierung im peripheren Blut nachgewiesen werden, die dem Anschein nach in der Lage waren, hTERT exprimierende Tumorzellen zu lysieren. [169] Parkhurst et al. impften 14 Patienten mit Kolon- und Nierenkarzinom und malignem Melanom mit hTERT540-548. Auch hier konnten bei 7 Patienten spezifische T-Zellen detektiert werden. Diese waren jedoch nicht in der Lage, hTERT540-548-exprimierende Tumorzellen zu erkennen. [114] Ähnliches wurde schon 2001 von Ayyoub et al. beobachtet. Aus PBMCs von Melanom-Patienten wurden hTERT540-548-spezifische T-Zellen gewonnen, die zwar mit hTERT540-548 gepulste Zellen, nicht jedoch hTERT-exprimierende Zellen erkennen 51 konnten. Daraufhin wurde untersucht, ob purifizierte Proteasomen das Vorläuferpeptid hTERT534-554 so prozessieren können, dass hTERT540-548 entsteht. Dies war nicht der Fall. [5] Diese Veröffentlichungen legen die Vermutung nahe, dass hTERT540-548 von hTERT-positiven Tumorzellen in vivo nicht auf HLA A2 präsentiert wird. Wir konnten zwar zeigen, dass es auch bei Bronchialkarzinompatienten möglich ist, hTERT540-548-spezifische T-Zellen zu generieren. Die widersprüchlichen Angaben in der Literatur bezüglich der Präsentation auf HLA A2 in vivo stellen die klinische Relevanz dieser Ergebnisse allerdings in Frage. RHAMM-R3 konnte in beiden ELISpot-Assays in 29% spezifische Reaktionen auslösen. Nachdem RHAMM durch unsere Arbeitsgruppe als Leukämie-assoziiertesAntigen identifiziert wurde [52], wurden verschiedene von RHAMM abgeleitete HLAA2-restringierte Peptide auf ihre Immunogenität untersucht. RHAMM-R3-spezifische, zytotoxische T-Zellen konnten in 7 von 13 Fällen aus dem peripheren Blut von AMLPatienten generiert werden. Diese Zellen waren in der Lage, mit RHAMM-R3 gepulste T2-Zellen und von den Patienten stammende dendritische Zellen sowie zu einem geringeren Prozentsatz unbehandelte AML-Blasten zu erkennen und zu lysieren. Außerdem wurde gezeigt, dass RHAMM-R3 ein natürlich prozessiertes und auf HLA-A2 präsentiertes Epitop ist. [54] In einer Phase-I-Vakzinierungsstudie mit RHAMM-R3 bei 10 Patienten mit AML, Multiplem Myelom und myelodysplastischem Syndrom konnten nach der Vakzinierung bei 7 Patienten spezifische CD8-positive TZellen detektiert werden. Schwere Nebenwirkungen wurden nicht beobachtet. [134] In einer zweiten Studie bei Patienten mit den gleichen Erkrankungen wurde mit einer höheren Dosis immunisiert. Auch hier konnten spezifische Immunantworten induziert werden und es wurden keine schweren Nebenwirkungen beobachtet. [57] Ähnliche Ergebnisse wurden bei Patienten mit Chronischer Lymphatischer Leukämie und Tumoren des Kopf/Halsbereiches erzielt. [47, 133] Die Expression von RHAMM beim Bronchialkarzinom wurde bisher nur für zahlreiche Bronchialkarzinom-Zelllinien beschrieben. [156] Wenn die Expression bei Lungentumoren in vivo ähnlich hoch ist, stellt RHAMM-R3 ein mögliches Target in der Immuntherapie des Bronchialkarzinoms dar. Auch die von uns untersuchten, von Aurorakinasen abgeleiteten Peptide waren in der Lage eine zelluläre Immunantwort auszulösen. Aura A1 zeigte in 31% und 23% positive Reaktionen im Interferon-γ- bzw. Granzym-B-ELISpot-Assay und Aura B1 in 31% respektive 38%. Beide Peptide wurden in einer bisher unveröffentlichten Arbeit 52 unserer Gruppe bei gesunden Freiwilligen und AML-Patienten wie in dieser Arbeit untersucht. Bei den Gesunden wurden für Aura A1 in 70% und 33% positive Reaktionen im Interferon-γ- bzw. Granzym-B-ELISpot beobachtet, für Aura B1 in 50% und 33%. Im Gegensatz zu den Ergebnissen unserer Arbeit konnten diese relativ hohen Positivitätsraten bei den AML-Patienten nicht wiederholt werden. Aura A1 konnte nur bei einem und Aura B1 bei 3 von 9 Patienten eine spezifische Reaktion in mindestens einem der beiden Assays auslösen. [36] Aurora A und Aurora B werden beim NSCLC in 83% respektive 89% überexprimiert. [108, 148] Beide Aurorakinasen sind zu 70% homolog. [93] So kommt das Peptid Aura B1 mit der Aminosäurensequenz KIADFGWSV in Aurora B an der Peptidposition 215-223 vor, während es gleichzeitig in Aurora A an Position 271-279 zu finden ist. [106] Eine Immunsierung gegenüber Aura B1 könnte somit Immunantworten gegen Aurora A und B vermitteln. Von einem der am längsten bekannten TAAs MAGE A3 wurden die Peptide MAGEA3_01 und MAGE-A3_02 untersucht. MAGE A3 wird in bis zu 55% der NSCLCs exprimiert. Die Expressionsrate korreliert mit dem Stadium der Erkrankung und einer schlechteren Prognose. [59, 143] Es ist daher ein interessantes Ziel für eine Immuntherapie. Derzeit läuft eine Phase-III-Studie mit über 2000 NSCLC-Patienten in den Stadien IB, III und IIIA, die mit einem Fusionsprotein aus MAGE A3 und dem von Haemophilus influenzae abstammenden Protein D immunisiert werden, nachdem in einer Phase-II-Studie bereits eine Verbesserung der Prognose nach Verabreichung dieses Vakzins beobachtet wurde. [159] MAGE-A3_01 konnte im Interferon-γ-ELISpot-Assay in 23% eine positive Reaktion auslösen, im Granzym-B-ELISpot-Assay lediglich in 8%. Schon 1994 wurde MAGEA3_01 von van der Bruggen et al. als Peptid identifiziert, das spezifische, zytotoxische T-Zellen induzieren kann, die MAGE-A3 exprimierende, HLA-A2positive Tumorzelllinien erkennen können. [164] Eifukut et al. zeigten, dass aus PBMCs von Gesunden MAGE-A3_01-spezifische T-Zellen generiert werden können, die Bronchialkarzinomzellen erkennen. Es wurde auch untersucht, ob man aus regionären Lymphknoten von Lungenkrebspatienten MAGE-A3_01-spezifische TZellen generieren kann. Dies gelang bei MAGE A3 exprimierenden Patienten in 2 von 7 und bei MAGE-A3-negativen Patienten in 3 von 12 Fällen. Die Rate, in der spezifische T-Zellen induziert werden können, ist bei MAGE-A3-positiven und negativen also ungefähr gleich. [38] Im Widerspruch zu diesen Ergebnissen konnten 53 in einem Experiment von Valmori et al. zwar spezifische T-Zellen generiert werden. Diese waren jedoch nicht in der Lage, MAGE-A3_01 exprimierende Melanomzellen zu lysieren. Diese Beobachtung wurde darauf zurückgeführt, dass MAGE-A3_01 von den Proteasomen nicht aus MAGE-A3 prozessiert wird. [162] Später fand man heraus, dass nur eine Untergruppe von Proteasomen MAGE-A3_01 prozessiert und konnte so die widersprüchlichen Daten erklären. [58] Für MAGE-A3_02 wurden in beiden Assays in 31% spezifische Reaktionen beobachtet. MAGE-A3-02-spezifische zytotoxische T-Zellen sind in der Lage MAGEA3 exprimierende Zellen zu erkennen und zu lysieren. [80] In der Phase-II-Studie bei NSCLC-Patienten mit einem aus zehn Peptiden bestehenden Impfstoff, der unter anderem HER2-H2 enthält, wurde auch ein gegenüber MAGE-A3_02 um eine Aminosäure erweitertes Peptid verwendet. Durch dieses veränderte Peptid konnten bei 36% der Patienten mittels eines Interferon-γ-ELISpot-Assays für den Wildtyp von MAGE-A3_02 spezifische, zytotoxische T-Zellen nachgewiesen werden. [7] Das Peptid Survivin 2 findet sich im TAA Survivin an der Position 95-104. Spezifische Reaktionen auf Survivin 2 konnten im Interferon-γ- und im Granzym-B-ELISpot-Assay in jeweils 23% beobachtet werden. Bereits im Jahr 2000 wurde gezeigt, dass durch Survivin 2 spezifische T-Zellen aus dem peripheren Blut gesunder Freiwilliger induziert werden können und dass dieses Peptid prozessiert und auf HLA-A2 präsentiert wird. [135] Selbiges wurde auch bei Patienten mit malignem Melanom und Chronisch Lymphatischer Leukämie beobachtet. [2] Mit einer Expressionsrate von über 50% beim nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinom ist Survivin ein interessantes Ziel für eine Immuntherapie. [120] Die Häufigkeit der Reaktionen auf Survivin 2 war allerdings geringer als auf andere unserer Peptide. Der Austausch einer Aminosäure erhöht die Immunogenität von Survivin 2. Dies gilt auch für das um eine Aminosäure kürzere Nonamer Survivin96-104 mit der gleichen Manipulation. [9] Nach einer Vakzinierung mit dem veränderten Survivin96-104 wurde bei einem Patienten mit Pankreaskarzinom die komplette Regression von Lebermetastasen beobachtet. [172] In einer Phase-II-Studie wurden mehrere Patienten mit unterschiedlichen soliden Tumorentitäten mit Survivin96-104 immunisiert. Spezifische Immunantworten konnten in 50% der Fälle beobachtet werden. [79] Aufgrund dieser und unserer Ergebnisse scheint es sinnvoll die Entwicklung von Tumorvakzinen mit der veränderten Variante von Survivin 2 zu forcieren. 54 Das von WT-1 abgeleitete Peptid WT-1126-134 ist HLA-A2-restringiert und ist in der Lage spezifische T-Zellen zu induzieren. [45] Rezvani et al. konnten 2005 in 43% der Fälle WT-1126-134-spezifische T-Zellen aus dem peripheren Blut von gesunden Spendern induzieren. Bei CML- und AML-Patienten gelang dies in 38% respektive 50%. [124] Bei den Bronchialkarzinompatienten in dieser Arbeit konnten positive Reaktionen im Interferon-γ-ELISpot-Assay und im Granzym-B-ELISpot-Assay nur in 15% bzw. 13% beobachtet werden. Da WT-1 in 96% beim NSCLC und in 83% beim SCLC exprimiert wird [109], könnten trotzdem viele Patienten von einem Vakzin mit WT-1126-134 profitieren. 4.2 Unterschiedliche Ergebnisse im Granzym-B- und Interferon-γ- ELISpot-Assay Die Reaktionen auf die einzelnen Peptide waren in den ELISpot-Assays für Granzym-B und Interferon-γ nicht immer kongruent (siehe Abbildung 11). Insbesondere für HER 2 zeigten sich mit 50% (5 von 10) positiven Reaktionen im Interferon-γ-ELISpot-Assay gegenüber keiner einzigen für Granzym-B deutliche Unterschiede. Diese große Differenz bei HER 2 mag zum Teil daran liegen, dass aufgrund teilweise geringer Zellzahlen HER 2 nur bei 10, statt wie die meisten anderen Peptide bei 14 Patienten untersucht werden konnte. Die Ergebnisse der beiden Assays weichen aber auch bei anderen Peptiden voneinander ab. Hierfür ist es wichtig sich klarzumachen, was die ELISpot-Assays untersuchen. Sowohl Interferon-γ als auch Granzym-B spielen eine wichtige Rolle in der Elimination von Tumorzellen durch das Immunsystem, insbesondere in der t-zellvermittelten Zytotoxizität. [26, 121, 140] Beide Assays sind daher geeignet, immunkompetente, funktionierende T-Zellen nachzuweisen. Der Interferon-γ- ELISpot-Assay wird in vielen klinischen Tumorvakzinierungsstudien verwendet, um eine zellvermittelte Zytotoxizität gegenüber einem Antigen zu detektieren. Die Korrelation mit dem 51-Chromium-Release-Assay (engl.: Chrom-51-Freisetzung) dem eigentlichen Goldstandard zur Messung Zell-vermittelter Zytotoxizität - ist hoch bei gleichzeitig höherer Sensitivität des ELISpots. [77] Ein Kritikpunkt am Interferon 55 γ-ELISpot-Assay ist jedoch, dass auch nicht-zytotoxische Zellen Interferon-γ freisetzen können. Des Weiteren wurde gezeigt, dass nicht alle aktivierten, zytotoxischen T-Lymphozyten, die in der Lage sind, Zellen zu lysieren, Interferon-γ freisetzen. [31, 123] Im Gegensatz dazu weist Granzym-B-ELISpot-Assay ein zytolytisches Protein direkt nach. Er hat eine höhere Korrelation mit der im 51- Chromium-Release gemessenen Zytotoxizität als der Interferon-γ-ELISpot. [96, 138] Auch er kann als Parameter Tumorvakzinierungsstudien für angewendet die zytotoxische werden. [139] T-Zell-Antwort bei Dies die erklärt unterschiedlichen Reaktionen in den beiden ELISpot-Assays. Mit Granzym-B wird allerdings nur eine Möglichkeit zur T-Zell-vermittelten Zelllyse erfasst. Es gibt auch noch andere Möglichkeiten, Apoptose zu induzieren, wie z.B. durch den FasLiganden. Dieser Weg wird wiederum durch Interferon-γ begünstigt. [175] Es ist daher durchaus sinnvoll, den Interferon-γ- und Granzym-B-ELISpot-Assay parallel zu verwenden. 4.3 Schlussfolgerung Wir konnten zeigen, dass das Immunsystem von Patienten mit fortgeschrittenem Bronchialkarzinom in der Lage ist, spezifische, durch zytotoxische T-Zellen vermittelte Immunantworten gegen eine Reihe von Peptiden, die von TAAs abgeleitet sind, zu generieren. Dadurch wurden mehrere potentielle Kandidaten für Impfstoffe in der Tumorvakzinierung gegen das Bronchialkarzinom gefunden. Besonders die Peptidepitope G250-G2 und PRAME-P3 mit positiven Reaktionen in mindestens einem der beiden ELISpot-Assays in 67% respektive 64% und einer hohen Expressionsrate beim Bronchialkarzinom erwiesen sich als aussichtsreich für eine weitere klinische Testung. G250 wird beim NSCLC in 72-100% exprimiert, während 78% der Plattenepithelkarzinome sowie 46% der Adenokarzinome der Lunge PRAME-positiv sind. [69, 83, 144] Es ist also denkbar, dass ein großer Teil zumindest der NSCLC-Patienten von einem aus diesen Peptiden bestehenden Impfstoff profitieren würde. 56 Eine Verstärkung der durch die Vakzinierung hervorgerufenen Immunantwort durch die Kombination mit T-Zell-aktivierenden Antikörpern ist denkbar. [17, 66, 95, 158] Es bleibt jedoch abzuwarten, ob bei Patienten, in deren Tumoren die Expression der Peptide bioptisch nachgewiesen wurde, die Ergebnisse gleich sind. Untersuchungen zu MAGE A3_01 lassen dies vermuten. [38] Dennoch sollte man die Peptide bei Patienten testen, deren Tumoren die zugrundeliegenden TAAs exprimieren. 57 5. Zusammenfassung Lungenkrebs ist die häufigste zum Tode führende Krebserkrankung in Deutschland. Die Prognose hat sich trotz Fortschritten in der Chirurgie und der Radio- und Chemotherapie in den letzen Jahrzehnten nicht wesentlich verbessert. In jüngerer Zeit konnten mit gezielten Therapieansätzen, wie Kinaseinhibitoren und monoklonalen Antikörper sowie immuntherapeutischen Verfahren, vielversprechende Erfolge erzielt werden. Insbesondere immunmodulatorische Ansätze mit t-zell-aktivierenden Antikörpern zeigten vielversprechende Ergebnisse in klinischen Studien. Impfungen mit tumor-assoziierten Antigenen (TAAs), wie zum Beispiel „melanoma associated antigen A3“ (MAGE-A3) und „human telomerase reverse transcriptase“ (hTERT), werden derzeit in Phase-III-Studien getestet. Es ist daher wichtig, neue immunogene Strukturen, die für eine Immuntherapie des Bronchialkarzinoms in Frage kommen, zu identifizieren. In dieser Arbeit wurden die T-zell-vermittelten, spezifischen Immunantworten gegen 11 Peptidepitope bei Patienten mit fortgeschrittenem nicht-kleinzelligem (n=12) und kleinzelligem Lungenkrebs (n=2) untersucht, die zuvor mittels Durchflusszytometrie bezüglich der Expression von human leukocyte antigen-A2 (HLA-A2) aus 35 Patienten selektiert worden waren. Zu diesem Zweck wurden gemischte Lymphozyten/Peptid-Kulturen und Enzyme-linked-immunosorbent- Spot-Assays (ELISpot-Assays) für Interferon-γ und Granzym-B in der Anwendung bei Bronchialkarzinompatienten etabliert, durchgeführt und ausgewertet. Die Peptide stammen von den bereits bei verschiedenen Tumorentitäten untersuchten TAAs „receptor for hyaluronan acid mediated motility“ (RHAMM), „preferentially expressed antigen in melanoma“ PRAME, Wilms-Tumor-Gen 1 (WT-1), hTERT, Survivin, MAGE A3, G250 und „human epidermal growth factor-related gene2“ (HER2) ab und wurden teilweise schon in Peptidvakzinierungsstudien bei anderen Krebserkrankungen angewendet. Außerdem wurden zwei Peptide der neuen TAAs Aurorakinase A und B untersucht. 13 von 14 Patienten zeigten eine zelluläre Immunantwort gegen mindestens ein Peptid. Alle Peptidepitope konnten in 3 und mehr Fällen positive Reaktionen in zumindest einem der beiden ELISpot-Assays hervorrufen. Als besonders 58 aussichtsreiche Kandidaten für eine weitere klinische Anwendung erwiesen sich die Epitope G250-G2 und PRAME-P-3, die bei 67% respektive 64% der Patienten eine spezifische t-zell-vermittelte Immunantwort auslösen konnten. Beide zugrundeliegende TAAs kommen zu einem hohen Prozentsatz in Lungentumoren vor. Diese Arbeit hat fortgeschrittenem gezeigt, dass das Bronchialkarzinom Immunsystem von T-zell-vermittelte Patienten mit spezifische Immunantworten gegen verschiedene Peptidepitope tumor-assoziierter Antigene generieren kann. Diese Peptide sind mögliche Targets in Tumorvakzinierungstherapien gegen das Bronchialkarzinom. 59 6. Literaturverzeichnis 1. Ambrosini G, Adida C, Altieri D C: A novel anti-apoptosis gene, survivin, expressed in cancer and lymphoma. Nat.Med., 3: 917-921(1997) 2. Andersen M H, Pedersen L O, Becker J C, Straten P T: Identification of a cytotoxic T lymphocyte response to the apoptosis inhibitor protein survivin in cancer patients. Cancer Res., 61: 869-872(2001) 3. Andersen M H, thor S P: Survivin--a universal tumor antigen. Histol.Histopathol., 17: 669-675(2002) 4. 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Oncol.Rep., *contributed equally 31: 384-390(2014). doi: 10.3892/or.2013.2804 Danksagung: Ich danke Prof. Dr. med. Hartmut Döhner, dem Ärztlichen Direktor der Klinik für Innere Medizin III, für die Möglichkeit meine Dissertation in seiner Abteilung durchführen zu können. Großer Dank gilt meinem Doktorvater Prof. Dr. med. Jochen Greiner. Er hat mir das Thema der Dissertation überlassen und mich bei der Erstellung der Arbeit stets zuverlässig und hilfsbereit unterstützt. Zudem Danke ich Dr. med. Anna Babiak für die Betreuung bei der Auswertung der Ergebnisse und die Ratschläge und Korrekturen beim Schreiben der Arbeit. Dem gesamten Laborteam, insbesondere Frau Marlies Götz und Frau Cornelia Herbst, danke ich für die Einführung in die Labortechnik und fortwährende Unterstützung während der Durchführung der Experimente. Meinen Eltern, Dipl.-Geogr. Monika Steinhauser und Dr. med. Dipl. Ing. Gerhard Schwarzkopf-Steinhauser, danke ich dafür, dass sie mich während meines gesamten Lebens bedingungslos unterstützt und gefördert haben. 82 Lebenslauf: Aus Gründen des Datenschutzes entfernt
