Infektion von dendritischen Zellen und Epithelzellen durch RSV
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Aus der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin des St. Josef-Hospitals in Bochum Universitätsklinik der Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. med. E. Hamelmann Infektion von dendritischen Zellen und Epithelzellen durch RSV-Wildtyp-Viren und RSV-Laborstämme Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Meike Sabine Brätsch aus Herne 2012 Dekan: Prof. Dr. med. K.Überla Referent: Prof. Dr. med. U. Schauer Korreferent: Prof. Dr. rer. nat. H.-J. Streckert Tag der mündlichen Prüfung: 14.05.2013 Abstract Brätsch Meike Sabine Infektion von dendritischen Zellen und Epithelzellen durch RSV-Wildtyp-Viren und RSV-Laborstämme Problem: Das Respiratory Syncytial Virus ist insbesondere im Säuglingsalter von klinischer Relevanz. Forscher beschäftigen sich mit diesem Virus auf der Suche nach einem Impfstoff und der Klärung der Pathogenese. Zumeist wird mit dem Long-Strain und dem A2 gearbeitet, zwei RSV-Stämmen, welche sich im Labor recht verlässlich vermehren lassen. Da es sich hierbei Virusstämme handelt, die über lange Zeit in Zellkulturen vermehrt wurden, stellten wir uns die Frage, in wie fern sich diese Virusstämme von den aktuellen Wild-Typ-Viren unterscheiden. Methode: Wir legten Zellkulturen mit Vero- und HEp2-Zellen an, welche häufig zur Virusanzucht verwandt werden, sowie Kulturen aus dendritischen Zellen, welche eine wichtige Rolle in der Pathogenese der RSV-Infektion spielen. Diese infizierten wir sowohl mit RSV-Laborstämmen als auch mit Wildtyp-Viren. Wir untersuchten die Infektiosität der einzelnen Virusstämme, die Expression des FProteins durch die Zellen, und die Effekte, welche die Infektion auf die Zellen der Kultur hatte. Im nächsten Schritt legten wir Ko-Kulturen aus dendritischen Zellen und T-Zellen an und untersuchte, wie eine Infektion durch RSV die Ko-Kulturen beeinflusst. Ergebnis: In der Kultur der Laborzellen benötigen die Wildtyp-Viren höhere Konzentrationen infektiöser Partikel um eine Infektion auszulösen als die Laborstämme. Allerdings führen die WildtypViren zu einem größeren cytopathischen Effekt und zu einer größeren Expression des F-Proteins und können DC schon bei geringen MOIs infizieren. In der Ko-Kultur von RSV-infizierten dendritischen Zellen mit T-Zellen führen die Wildtyp-Viren zu vergleichbaren Effekten wie der Long-Strain; im Vergleich mit der Kontroll-Kultur wird in den infizierten Kulturen die Proliferation der T-Zellen gehemmt und die Expression des Interferon-γ durch die T-Zellen wird vermindert. Diskussion: Wir konnten zeigen, dass sich die aktuellen RSV-Wildtyp-Viren von den Laborstämmen in verschiedenen Eigenschaften unterscheiden; dies ist aufgrund der häufigen Passagen in Zellkulturen nicht überraschend, schließlich kann es in jeder Passage zu Mutationen kommen. Auch konnten wir belegen, dass die Hemmung der Interferon-γ-Produktion durch T-Zellen in der Ko-Kultur mit RSV-infizierten DC keine Eigenart des Long-Strain ist, sondern auch für WildtypViren nachgewiesen werden kann. In klinischen Studien wurden bei Kindern mit schwerer RSVInfektion niedrigere Interferon-γ-Konzentrationen sowohl im Blut als auch im Rachensekret gemessen als bei Kindern mit milden Verläufen. Dies lässt sich durch die Hemmung der IFN-γ-Produktion durch das RSV erklären. In weiteren Studien bleibt zu klären, ob die Schwere des Verlaufs durch eine Prädisposition seitens der Kinder beeinflusst wird, oder die Virulenz des einzelnen Virusstammes und die Effektivität der Hemmung der IFN-γ-Produktion für den Verlauf entscheidend sind. Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung ............................................................................................................ 6 1.1 Das Respiratory Syncytial Virus..................................................................... 6 1.1.1 Epidemiologie der Bronchiolitis ............................................................... 6 1.1.β Verlauf der Infektion ................................................................................ 6 1.1.γ Therapie und Prophylaxe ........................................................................ 8 1.1.4 Eigenschaften ....................................................................................... 10 1.1.5 Geschichte des RSV ............................................................................. 11 1.1.6 RS-Virusstämme ................................................................................... 1β 1.1.6.1 Long Strain ..................................................................................... 1β 1.1.6.β Aβ ................................................................................................... 1γ 1.1.7 Zytokinfreisetzung während der Infektion .............................................. 1γ 1.1.8 Impfstoffentwicklung.............................................................................. 14 1.β Zell-Linien .................................................................................................... 18 1.β.1 HeLa-Zellen .......................................................................................... 18 1.β.γ Vero-Zellen ............................................................................................ β0 1.β.4 A 549-Zellen .......................................................................................... β0 1.γ Dendritsche Zellen ....................................................................................... β1 1.γ.1 Eigenschaften und Funktionen .............................................................. β1 1.γ.β DC-Subtypen ........................................................................................ ββ 1.γ.β.1 Plasmocytoide DCs ........................................................................ ββ 1.γ.β.β Myeloide DCs ................................................................................. βγ 1.γ.β.γ Thymus-DCs................................................................................... βγ 1.γ.γ Migration und Reifung ........................................................................... β4 1.4 T-Zellen ....................................................................................................... β6 1.4.1 Eigenschaften und Funktionen .............................................................. β6 1 1.4.β T-Zell-Subtypen..................................................................................... β6 1.4.β.1 CD8-positive T-Zellen ..................................................................... β6 1.4.β.β CD4-positive T-Zellen ..................................................................... β7 1.4.β.γ Regulatorische T-Zellen ................................................................. β8 1.5 Dendritische Zellen, RSV und T-Zellen........................................................ β9 β. Fragestellung ................................................................................................. γβ γ. Probanden, Material und Methoden .............................................................. γ4 γ.1 Gewinnung und Anzucht dendritischer Zellen .......................................... γ4 γ.β Zellseparation mit MiniMacs ..................................................................... γ6 γ.γ Weiterbehandlung der gewonnenen Zellen .............................................. γ8 γ.4 Gewinnung der T-Zellen........................................................................... γ9 γ.5 Virusgewinnung und Anzucht ................................................................... γ9 γ.6 Virustitration zur Bestimmung der MOI .................................................... 40 γ.7 Ausverdünnung - Limiting Dilution ............................................................ 41 γ.8 Experimente ............................................................................................. 4β γ.8.1 Infektion der dendritischen Zellen ...................................................... 4β γ.8.β Infektion der Feederzellen ................................................................. 4β γ.8.γ Nachweis der Infektion durch F-Protein-ELISA ................................. 4β γ.8.4 Schachbrett-Titration ......................................................................... 4γ γ.8.5 Ko-Kultur DC + T-Zellen .................................................................... 44 γ.8.5.1 Messung der Proliferation ............................................................... 44 γ.8.5.β Messung von IFN- ........................................................................ 44 γ.9 Material ........................................................................................................ 46 4. Ergebnisse..................................................................................................... 50 4.1 Infektion der Feederzellen im Vergleich ................................................... 50 2 4.1.1. Infektion der HEpβ-Zellen ................................................................. 50 4.1.β Infektion der Vero-Zellen ................................................................... 51 4.1.γ Infektion der A549-Zellen................................................................... 5β 4.1.4 Infektion von Vero-Zellen mit verschiedenen Wildtyp-Stämmen ........ 5β 4.1.5 Effekte der Infektion auf Zellkulturen ................................................. 54 4.1.6 Zytopathischer Effekt und Syncytienbildung ...................................... 54 4.β Produktion des F-Proteins auf DC und HEpβ........................................... 56 4.γ Proliferation von T-Zellen bei Stimulation durch infizierte DC .................. 59 4.4 IFN- Produktion in Ko-Kulturen .............................................................. 59 5. Diskussion ..................................................................................................... 61 5.1 Problematik der Virusanzucht im Labor ................................................... 61 5.β Defekte interferierende Partikel stören die Virusreplikation ...................... 6γ 5.γ Wildtyp-RSV-infizierte Kulturen exprimieren mehr F-Protein als durch Laborstämme infizierte Kulturen .................................................................... 64 5.4 Long und Aβ haben im Vergleich zu Wildtyp-RSV eine veränderte Infektiosität ..................................................................................................... 65 5.5 Virusproteine beeinflussen die Infektiosität und Virusausbreitung ........... 65 5.6 Laborstämme infizieren Vero-Zellen effektiver als Wildtyp-RSV .............. 67 5.7 Wild-Typ-Viren verursachen einen größeren cytopathischen Effekt ......... 67 5.8 Auch Wildtyp-RSV beeinflusst die Zell-Funktion von Abwehrzellen ......... 68 6. Zusammenfassung ........................................................................................ 71 7. Literaturverzeichnis........................................................................................ 7γ 3 Abkürzungsverzeichnis APC Antigenpräsentierende Zelle ATCC American Type Culture Collection AWMF Arbeitsgemeinschaft der Wissenschaftlichen Medizinischen Fachgesellschaften e.V. BAL Bronchoalveoläre Lavage cAMP Zyklisches Adenosinmonophosphat CCA Chimpanzee Coryza Agent CCLγ Chemokine (C-C motif) ligand γ (Macrophage inflammatory protein-1α) CCL5 Chemokine (C-C motif) ligand 5 (RANTES) CD Cluster of differentiation CPE Zytopathischer Effekt CPD Citrat-Phosphat-Dextrose CPG-Sequenz Cytosin-Phosphat-Guanin CXCL C-X-C motif chemokine 10 (IFN- induziertes Protein 10) DC Dendritic cell DC-sign DC-specific, ICAM-γ-grabbing non-intergrin DIP Defective interfering particles E. coli Escherichia coli ELISA Enzyme linked immunosorbent assay F-Protein Fusionsprotein GM-CSF Granulocyte macrophage colony-stimulating factor G-Protein Glykoprotein HEpβ Human epithelial cells HRP Horse radish peroxidase ICAMγ Intercellular adhesion molecule γ 4 IFN Interferon Ig Immunglobulin IL- Interleukin- LAG-γ Lymphocyte activation gene-γ NS Nicht-Strukturprotein MHC Major histocompatibility complex MOI Multiplicity of infection MPLA Monophosphyryl Lipid A mRNA Messenger RNA MxA Myxovirus resistance Protein A NK-Zellen Natürliche Killerzellen N SRS Nukleoprotein sub-nucleocapsid ring structure OD optische Dichte PBS Phosphat buffered saline PCR Polymerase chain reaction RANTES Regulated upon Activation, Normal T-cell Expressed, and Secreted RNA Ribonucleic acid RSV Respiratory syncytial virus SH-Protein Short hydrophobe protein Th1, Thβ T-Helferzelle 1/β TLR Toll-like Rezeptor TNF-α Tumor Nekrose Faktor-α 5 1. Einleitung 1.1 Das Respiratory Syncytial Virus 1.1.1 Epidemiologie der Bronchiolitis Das Respiratory Syncytial Virus (RSV) ist der bedeutendste virale Erreger der Lungenentzündung im Kindesalter. Laut epidemiologischen Studien ist es an der Entstehung von 15-40 % der Pneumonien und Bronchiolitiden bei Kindern jünger als 5 Jahre beteiligt. [98] In den USA werden jährlich zwischen 70 000 und 1β0 000 Kinder auf Grund von schweren Atemwegsinfektionen durch RSV stationär behandelt. [105] Insbesondere Säuglinge unter einem Alter von 6 Monaten sind von schweren Verläufen betroffen. Als Risikofaktoren für schwere Verläufe sind drei Faktoren identifiziert worden: ein niedriges chronologisches Alter zu Beginn der RSV-Saison, ein niedriges Geburtsgewicht und der Umstand, mit älteren Geschwistern in einer Familie zusammen zu leben. [95] 1.1.2 Verlauf der Infektion Die Übertragung erfolgt als Tröpfchen- oder Schmierinfektion; 1 ml Speichel enthält ungefähr 1 Million Viruspartikel. [75] Die Adsorption des Virus durch empfängliche Zellen geschieht zu 60-90 % innerhalb der ersten γ0 Minuten nach Kontakt, die Penetration erfolgt innerhalb von 45 Minuten, wahrscheinlich durch Membranfusion. [11β] Haupteintrittspforte für RSV sind die Epithelzellen der oberen Luftwege, allerdings auch das Hornhautepithel des Auges. [1β] Vom respiratorischen Epithel der oberen Luftwege ausgehend kann sich das Virus durch Aspiration von virushaltigem Sekret aus den oberen Luftwegen bis in die Alveolen ausbreiten. Auch eine Ausbreitung durch Zellfusion von Zelle zu Zelle ist möglich, es kommt 6 zur Syncytien-Bildung. Eine Untersuchung mit rekombinantem fluoreszierdem RSV auf Primärkulturen von humanem Atemwegsepithel zeigte, dass RSV bevorzugt das Zilienepithel der Luftwege infiziert, wobei die Infektion nur über die apikale Oberfläche der Zellen erfolgt. Gleichzeitig beschrieben Zhang et al. in dieser Arbeit, dass die Empfänglichkeit der Zellen für eine RSV-Infektion von der Ziliogenese abhängig war: noch unreife, nicht zu Ende ausdifferenzierte Zellen waren deutlich weniger empfänglich für eine RSV-Infektion als reife Zellen. Auch die spätere Virusknospung und Freisetzung geschieht laut dieser Untersuchung an der apikalen Oberfläche. Die Viren werden in die periziliäre Flüssigkeit bzw. die darüber liegende Mukusschicht frei gesetzt; die Ausbreitung des Virus war zumindest in dieser Untersuchung von der Richtung des Zilienschlags abhängig. Weiterhin zeigte sich, dass die tiefer liegenden Schichten des Epithels nicht von RSV infiziert werden, auch dann nicht, wenn diese durch mechanische Verletzungen freigelegt wurden. [1β8] In Arbeiten von O’Donnell et al., Rohwedder et al. und Yui et al. konnte RSV-RNA mittels PCR im peripheren Blut nachgewiesen werden. Die systemische Ausbreitung soll über Zellen des Immunsystems geschehen wie Monozyten und Alveolarmakrophagen. [85][9γ][1β6] Im Mausmodell konnte sogar eine Korrelation zwischen Viruslast im Blut und schwere des klinischen Verlaufs festgestellt werden. [115] Nach einer Inkubationszeit von γ bis 5 Tagen zeigen sich erste Symptome, wobei die Ausprägung vom leichten grippalen Infekt mit Fieber, Rhinitis, Pharyngitis, Tracheitis und Bronchitis bis zur lebensbedrohlichen Bronchiolitis mit respiratorischer Insuffizienz reichen kann. [75] Die Infektion des Epithels führt zu Nekrosen der Epithelzellen, es folgt ein peribronchioläres Infiltrat aus Lymphozyten und Makropagen, Mukosa und Submukosa schwellen ödematös an. Die Sekretion von Mukus wird verstärkt und in den Bronchiolen können sich Schleimpfropfen aus Zellresten und Fibrin bilden. Diese können das ganze Lumen des Bronchiolus ausfüllen, und zu Ventileffekten führen; Emphysemblasen und Atelektasen sind die Folge. Da bei jungen Säuglingen die Durchmesser der Bronchiolen noch klein sind, können diese schneller verschlossen werden und so zu schwereren Verläufen führen. [γ] Auch kommt es bei Kindern im Alter jünger als γ0 Monate in geschätzt 16 bis β5 % der Fälle zu Apnoen, weshalb bei diesen Kindern eine Überwachung essentiell ist. [18] 7 Eine abgelaufene Infektion führt nicht zur Immunität, wiederholtes Auftreten von RSV-Infektionen ist häufig. [50] 1.1.3 Therapie und Prophylaxe Die therapeutischen Optionen sind auch bei einer schweren RSV-Infektion begrenzt. Es wurden viele Studien zu pharmakologischen Therapiemöglichkeiten durchgeführt, allerdings ohne durchschlagenden Erfolg. Eine Übersicht ist bei Wright et al. (β008) zu finden. [1β4] Die Inhalation mit Brochodilatatoren wie Salbutamol oder Epinephrin und Anticholinergika wie Ipatropiumbromid ist weit verbreitet, wobei die Studienlage in dieser Hinsicht nicht eindeutig ist. Insbesondere Epinephrin und Salbutamol sollen einen Vorteil vor allem in Bezug auf die klinische Symptomatik bringen; dass die Genesung bzw. die Entlassung der Kinder beschleunigt wird ließ sich in verschiedenen Studien allerdings nicht belegen. [51][5β][74][10β][10γ] In anderen Untersuchungen konnte auch hinsichtlich der Symptomatik keine Verbesserung festgestellt werden, beziehungsweise die Unterschiede zwischen Verum- und Placebogruppe waren so gering, dass sich daraus keine Empfehlung ableiten lässt. [β5][γ0][γ8][41][61][6β][84][1βγ] Somit sollte die Entscheidung für die Verwendung dieser Substanzen von Fall zu Fall davon abhängig gemacht werden, ob sie zu einer objektivierbaren klinischen Besserung führen. Die Frage, ob eine antibiotische Therapie das Outcome bei RSV-Bronchiolitis verbessert, wurde schon in den 1970er Jahren untersucht: 1966 führten Field et al [γ6] eine randomisiert-kontrollierte Studie zu diesem Thema durch, in der VerumGruppe zeigten sich allerdings keine Vorteile. Und auch eine spätere Studie zeigte, dass der Verlauf durch Antibiotika nicht positiv beeinflusst wird. [γ9] Die Ausnahme bilden die Fälle mit einer bakteriellen Superinfektion. Der Einsatz von Corticosteroiden ist ebenfalls kritisch zu bewerten. Studien, die in den letzten Jahren sowohl die systemische als auch die inhalative Therapie der RSV-Infektion mit Corticosteroiden untersuchten, konnten keinen klaren Vorteil dieser Therapie belegen. [9][1γ][β0][β4][β8][γ5][44][104][114] In 8 Bezug auf die Gabe von Corticosteroiden gilt es also ebenfalls, im Einzelfall zu entscheiden. Ein weiterer Therapieansatz, der in verschiedenen Studien untersucht wurde, ist die Gabe von Ribavirin. Auch für den Einsatz dieses Nukleosidanalogons als Routinetherapeutikum kann anhand der Studienlage keine Empfehlung gegeben werden. [γ4][49][7γ][77][9β][110][11γ] Dennoch empfiehlt die Amerikanische Gesellschaft für Pädiatrie, es zumindest bei immungeschwächten Patienten in Betracht zu ziehen. [1] Ein neuer Therapieansatz ist die endotracheale Gabe von Surfactant bei solchen Patienten, die aufgrund der Infektion eine Beatmung benötigen. Dieses soll Virusantigen binden und dessen Elimination fördern. Die bisher durchgeführten Studien sind vielversprechend, in der von Ventre et al. durchgeführten MetaAnalyse zeigte sich eine Verkürzung der Beatmungsdauer und des Aufenthaltes auf der Intensivstation. Allerdings waren die Fallzahlen nicht sehr groß, so dass es für eine abschließende Beurteilung noch zu früh ist. [1β1] Seit einiger Zeit ist der Cysteinyl-Leukotrien-Rezeptor-Antagonist Montelukast für die Therapie der RSV-Bronchiolitis bei Säuglingen zugelassen. Er wird schon seit Jahren in der Therapie des Asthma brochnchiale eingesetzt und soll die durch Cysteinyl-Leukotrien ausgelösten Effekte wie bronchiale Obstruktion, Ödembildung in der Mukosa und erhöhte Schleimproduktion abmildern. In einer doppelblinden randomisiert-kontrollierten Studie zur Wirksamkeit von Montelukast in der Akutphase der Bronchiolitis zeigten sich zwischen Vero- und Placebogruppe allerdings keinerlei Unterschiede bezüglich Dauer des Krankenhausaufenthaltes oder klinischen Scores. Eine Gabe von Montelukast in der Akutphase scheint den Kindern also keinen Vorteil zu bringen. [4][10][11] Entsprechend wichtig ist die supportive Therapie, bestehend aus der unterstützenden Gabe von Sauerstoff, dem Ausgleich des Flüssigkeitshaushalts, ggf. parenteraler Ernährung, und der Gabe von Nasentropfen, um den Kindern die Nasenatmung zu erleichtern. [1β4] Eine Therapiemöglichkeit, die keinerlei Nebenwirkungen zu haben scheint, ist das Inhalieren mit hypertoner Kochsalzlösung, wodurch der Abtransport des Schleims aus den Bronchien gefördert werden soll. In einer Cochrane Analyse von β008 wurden 4 randomisiert-kontrollierte Studien untersucht, die insgesamt β54 Patienten umfassten. Es zeigte sich, dass durch die Inhalation mit γ%iger Kochsalzlösung die Dauer des Krankenhausaufenthaltes im Schnitt um 1 Tag 9 reduziert werden konnte im Vergleich zur Inhalation mit 0,9%iger Kochsalzlösung. [1β7] Zusammenfassend kann man also feststellen, dass die therapeutischen Optionen bei einer RSV-Infektion sehr beschränkt sind. Für Risikokinder gibt es seit 1999 die RSV-Prophylaxe mit Palivizumab. Dies ist ein humanisierter monoklonaler Antikörper der IgG1-Subklasse gegen das FProtein des RS-Virus. Die Gabe der Antikörper soll Kinder mit einem hohen Risiko für einen schweren Verlauf der Erkrankung während der RSV-Saison vor einer Infektion schützen. In Studien hat sich gezeigt, dass einige Gruppen als besonders gefährdet anzusehen sind, so dass die AWMF für diese Kinder die prophylaktische Gabe von Palivizumab empfiehlt. Die Antikörper werden als intramuskuläre Injektionen im Abstand von einem Monat bis zu fünf Mal während der RSV-Saison verabreicht. [5] 1.1.4 Eigenschaften Das RSV gehört zur Familie der Paramyxoviridae und zur Gattung der Pneumoviren; es handelt sich um ein RNA-Virus mit Lipidhülle. Man unterscheidet zwei RSV-Subgruppen, Gruppe A und Gruppe B, welche sich vor allem in der Nukleotid Sequenz des Glykoprotein G unterscheiden. Innerhalb dieser Subgruppen kann man weiterhin verschiedene Genotypen unterscheiden. [β1] Das Virion kann rund oder pleomorph sein, misst 80 bis 500 nm, oder es hat eine filamentäre Erscheinungsform und kann 1 bis 10μm lang sein. [11β] An seiner Oberfläche trägt es Proteine von verschiedenem Molekulargewicht und unterschiedlicher Funktion. Das Glykoprotein G dient der Anheftung an die Zelle. Es hat ein Molekulargewicht von 90kD und liegt in glykolysierter Form vor, wobei es eine große Variationsbreite aufweist. Diese Abweichungen begründen die Unterschiede zwischen den verschiedenen RSV-Stämmen. Das Fusionsprotein F hat ein Molekulargewicht von 68 kD und dient der Penetration der Zelle. Es bindet an den TLR4, einen Rezeptor auf Abwehrzellen der auch Lipopolysaccharidstrukturen von gramnegativen Bakterien erkennt. [64] Die Aktivierung dieses Rezeptors löst in der Zelle eine Signalkaskade aus. Sowohl das G- als auch das F-Protein binden an Heparin, ein Glycosaminoglycan, 10 was die Funktion als Anheftungsproteine nahe legt. In Studien mit RSV-Mutanten, denen das G- und das SH-Protein fehlten, kam es trotz dieses Mangels zur Infektion und Syncytienbildung in den Kulturen. Aus diesem Grunde ist zu vermuten, dass auch das F-Protein die Anhaftung an die Zelle übernehmen kann. Das F-Protein ist stark konserviert, bietet also einen Angriffspunkt für neutralisierende Antikörper. Das kurze hydrophobe Proteins (SH) hat ein Molekulargewicht von 5 kD und ist in der Lage Pentamere zu bilden, welche in Abhängigkeit vom pH-Wert als Ionenkanäle dienen. So kann es als Transmembran-Protein die Stabilität der Zellmembran beeinflussen. [4γ] In in-vitro Studien wurde gezeigt, dass es Zellen vor der TNF-α abhängigen Apoptose schützt. [40] Das Genom liegt als lineare negative Einzelstrang-RNA vor und besteht aus 15 000 Basenpaaren. Die Replikation erfolgt im Cytoplasma, vermutlich ohne direkte Beteiligung des Nukleolus. Der RNA-Strang ist von dem Nukleoprotein, einem 44 kD großem RNA bindendem Protein, und dem Phosphoprotein umgeben, das γ7 kD groß und phosphoriliert ist. Am Ende des RNA-Stranges liegt die LPolymerase, die mit β00 kD größte Polymerase, welche mRNA und den Antigenomstrang transkribiert. Das Nukleokapsid wird mittels des Matrixproteins M an der Virushülle fixiert, während ein weiteres Matrixprotein Mβ die Transkription der Virusproteine reguliert. Weitere regulatorische Funktionen erfüllen die Nicht-Strukturproteine NS1 und NSβ. NS1 hat ein Molekulargewicht von 16 kD, NSβ von 15 kD; beide hemmen die Produktion von IFN-α. [β7],[111] 1.1.5 Geschichte des RSV 1956 untersuchten Morris, Blount und Savage eine Infektion in einer Schimpansen-Kolonie, deren Leitsymptom die Rhinitis war. Sie konnten dabei das Chimpanzee Coryza Agent (CCA) gewinnen, das bei anderen Schimpansen nach einer Inkubationszeit von γ Tagen ebenfalls eine Rhinitis auslöste. [57] 11 Chanock, Roizman und Myers untersuchten dann im folgenden Jahr Kinder mit Pneumonie und Krupp. Dabei entdeckten sie zwei Virusstämme, die sie anhand ihrer Antigene nicht vom CCA unterscheiden konnten. Der Name „Respiratory Syncytial Virus“ (RSV) wurde 1957 von Robert Chanock und Laurence Finberg eingeführt, um diese drei Erreger zusammenzufassen. Er beschreibt die Charakteristika dieser Viren: sie führen zu einer Infektion der Atemwege und lösen in Zellkulturen eine Syncytienbildung aus. [βγ] 1.1.6 RS-Virusstämme In der RSV-Forschung sind vor allem zwei Virusstämme verbreitet, der LongStrain und der Aβ. Diese beiden RSV-Stämme werden seit vielen Jahren zu Forschungszwecken eingesetzt, ihre Eigenschaften sind daher weitgehend bekannt. Darüber hinaus gibt es die Wildtyp-Viren, welche für die jährlich auftretenden RSV-Ausbrüche verantwortlich sind. Ihre Eigenschaften müssen noch weiter charakterisiert werden, insbesondere die Frage danach, wie sie sich untereinander und von den Laborstämmen unterscheiden, benötigt weiterer Klärung. Dass es Unterschiede gibt ist naheliegend, da auch die Laborstämme in ihren Charakteristika nicht gleich sind. 1.1.6.1 Long Strain Der RSV- Long- Virusstamm ist der älteste RSV-Stamm. Er wurde 1957 als einer der ersten RSV-Stämme von R. Chanock, B. Roizman und R. Myers in den USA entdeckt. Das CCA, das bei Schimpansen Erkältungssymptome auslöste, war bereits bekannt. Nun fanden Chanock et al. im Rachenabstrich eines Kindes mit Bronchopneumonie einen Virusstamm, den sie vom CCA nicht unterscheiden konnten. Es handelte sich hierbei um den Long Strain. Er wurde zuerst für elf bis 1γ Passagen in heteroploiden humanen Zell-Linien (u.a. Hep-β-Zellen) vermehrt, bevor er dann für weitere Studien verwendet wurde. [β6] Er gehört zur Subgruppe A, welche sich vor allem im Aufbau des G-Proteins von der Subgruppe B unterscheidet. [80] 12 1.1.6.2 A2 Der Aβ-Stamm des RSV wurde 1961 in Australien isoliert. Er gehört ebenfalls zur Subgruppe A. [79] Er unterscheidet sich vom Long-Strain unter anderem in der Fähigkeit, in plasmocytoiden dendritischen Zellen die Produktion von IFN-α und IFN- mit Hilfe von NS1 und NSβ hemmen zu können. Dabei hemmt er sowohl den TLR-abhängigen, als auch den TLR-unabhängigen Signalweg. Diese Eigenschaft teilt er mit einigen Wild-Typ-Stämmen. [100] 1.1.7 Zytokinfreisetzung während der Infektion Bei einer Infektion der unteren Luftwege durch RSV kommt es zu einer massiven Infiltration des Gewebes mit Entzündungszellen, insbesondere Neutrophilen. [7β] Bekanntermaßen spielen Chemokine bei der Immunantwort des Körpers eine wichtige Rolle: sie können Immunzellen anlocken und aktivieren. In vitro-Studien haben gezeigt, dass eine Infektion mit RSV zur Chemokinfreisetzung aus dem respiratorischen Epithel, Alveolarmakrophagen und aus dem Blut eingewanderten Neutrophilen führt. Welche Zytokine in vivo während einer RSV-Infektion freigesetzt werden und so eventuell eine Rolle in der Pathogenese der Erkrankung spielen könnten, haben β005 McNamara et al. untersucht. Dazu gewannen sie mittels broncho-alveolärer Lavage Proben von Kindern, die auf Grund einer RSVBronchiolitis beatmet werden mussten, und verglichen diese mit Proben von Kindern, die wegen eines nicht pulmonalen Problems beatmet wurden. Sie fanden heraus, dass während der RSV-Infektion hohe Konzentrationen an Interleukin 8 erreicht werden und auch noch erhalten bleiben, wenn die Symptomatik bereits rückläufig ist. Außerdem registrierten sie erhöhte Spiegel von CXCL10 (IFNinduziertes Protein), CCLγ (Macrophage inflammatory protein-1α ), und CCL5 (RANTES), diese gingen aber mit der sinkenden Zahl der Entzündungszellen im Verlauf der Infektion zurück, wobei das CXCL10 deutlich höhere Konzentrationen erreichte als die anderen Zytokine. CXCL10 wird von verschiedenen Zelltypen als Antwort auf IFN- freigesetzt, unter anderem von Neutrophilen, Monozyten und TLymphozyten, und wirkt als Chemoattraktant auf Monozyten und T-Lymphozyten. [71] 13 1.1.8 Impfstoffentwicklung Die ersten Versuche, einen wirksamen Impfstoff gegen RSV zu entwickeln wurden bereits 1966 von Potash et al. veröffentlicht [89]: sie hatten den Virusstamm „MK5 human strain“ in Nierenzellen von grünen Meerkatzen angezüchtet, mittels Formalin inaktiviert und mit Alaun als Adjuvanz versehen. Das Antigen wurde Kindern im Alter von 5 bis 11 Jahren intramuskulär appliziert, woraufhin die Kinder auch signifikante Titeranstiege zeigten. In einem Feldversuch mit 407 Kindern zwischen γ und 5 Jahren wurde ein heptavalenter Impfstoff mit diesem und sechs weiteren Antigenen von respiratorischen Viren und Mycoplasmen verwendet. Es wurde in den ersten 10 Wochen dieser Studie eine Reduktion von schweren respiratorischen Erkrankungen um γ6% festgestellt, allerdings war nicht feststellbar, ob diese tatsächlich durch die Gabe des RSV-Antigens zu begründen war. Es gab weitere Studien mit einer ähnlichen Vakzine, die aus dem Bernett-Stamm gewonnen, ebenfalls mit Formalin inaktiviert und nach 100-facher Konzentrierung mit Alaun als Adjuvanz kombiniert worden war. Kinder zwischen β Monaten und 10 Jahren erhielten eine intramuskuläre Injektion dieser Vakzine; dies führte bei 4γ% der Kinder, die drei Impfdosen erhalten hatten, zu einem Anstieg der neutralisierenden Antikörper; allerdings ließ sich keine Evidenz dafür finden, dass diese Impfung auch tatsächlich gegen eine Infektion mit RSV schützte. Vielmehr wurde in allen vier Studien festgestellt, dass bei Säuglingen und Kleinkindern im Alter von 6 bis βγ Monaten die Häufigkeit schwerer Verläufe mit Infektion der unteren Atemwege nach der Impfung zunahm, zwei der geimpften Kinder verstarben sogar. Als Reaktion auf diese dramatischen Verläufe begann man schließlich mit der Suche nach einem attenuierten Lebendimpfstoff. Es wurden Studien an Erwachsenen, Kindern und auch Tierversuche durchgeführt, allerdings wurde bisher kein Impfstoff gefunden, der einen ausreichenden Schutz vor schweren RSV-Infektionen bietet, und dabei aber selbst nicht zur Erkrankung führt. Daher wird weiterhin mit verschiedensten Ansätzen an der Entwicklung eines sicheren RSV-Impfstoffes gearbeitet. Im März β008 veröffentlichten Yu et al. [1β5] im Journal of Virology ihre Ergebnisse zu Versuchen mit einem Impfstoff, der aus einem rekombinanten 14 Adenovirus und einem Fragment des RSV-G-Proteins besteht Der Impfstoff wurde Mäusen sowohl intranasal als auch oral und intramuskulär appliziert mit dem Ergebnis, dass es schon nach einer einzelnen intranasalen Gabe zu einer deutlichen Bildung von IgG kam, dessen Level mit dem einer Infektion mit lebendem RSV vergleichbar war. Die intranasale Gabe des Impfstoffs führte bei den Mäusen zu einer Immunität gegenüber dem Aβ-RSV-Stamm, was Yu et al. daran festmachten, dass bei immunisierten Mäusen, die diesem RSV-Stamm ausgesetzt wurden, in der Lunge keine Virus-Replikation messbar wurde. Die in der BAL gemessenen IgA-Spiegel waren in der Gruppe der Mäuse mit intranasaler Applikation deutlich höher als in den Vergleichsgruppen mit oraler oder intramuskulärer Impfung. Die gefürchtete pulmonale Eosinophilie, die in anderen Versuchen in der Impfstoff-Entwicklung zu Lungenschädigungen geführt hatte, lag nach intranasaler Applikation in dieser Studie bei 1 bis γ % der Zellen in der BAL, was einer Größenordnung wie bei einer natürlichen RSV-Infektion entspricht. Das Risiko für eine Lungenschädigung durch eine Eosinophilie scheint also durch diesen Impfstoff nicht erhöht zu werden. Zeitgleich wurde im März β008 eine Studie von Xavier Roux et al. [97] veröffentlicht, die ebenfalls einen intranasal zu applizierenden Impfstoff untersucht hatten. Diesen hatten sie aus dem Nukleoprotein N konstruiert, welches das am stärksten konservierte Protein innerhalb der verschiedenen RS-Virusstämme darstellt. Sie verwendeten die von Tran et al. [114] entwickelte „sub-nucleocapsid ring structure“ (N SRS), ein Nanopartikel, welches aus zehn bis elf rekombinanten Nukleoprotein-Untereinheiten besteht; diese lagern sich ringförmig um einen 70 Basenpaare umfassenden DNA-Abschnitt, welcher von den zur Herstellung benötigten E.coli-Bakterien stammt. Als Adjuvanz kombinierten sie dies mit LT(R19βG), einem Mutanten des hitzelabilen Enterotoxins von E.coli. Sie konnten zeigen, dass eine intranasale Applikation bei Mäusen die Viruslast in der Lunge deutlich reduziert, um eine Logarhythmusstufe stärker als nach subkutaner Injektion. Außerdem führte die Impfung bei Kontakt mit dem Aβ-RSV nicht zu schwereren Verläufen als bei nicht geimpften Mäusen. Zwar löste auch diese Impfung bei den Mäusen eine leichte entzündliche Reaktion in den Atemwegen aus, wobei sie aber zu einem erhöhten Anteil an Lymphozyten in der BAL führte und keine Eosinophilie auslöste. Sie konnten zeigen, dass diese Impfung zu einem Priming von antigenspezifischen IFN- produzierenden CD4+ TZellen führte, und zur Bildung von CD4+ und CD8+ T-Gedächtniszellen mit einer 15 Zytokinfreisetzung, deren Muster einer Th1-Immunantwort entsprach. Auch konnten sie nach Applikation einen Anstieg der Antikörper-Titer messen, insbesondere der Klasse IgG1. Eine subkutane Injektion führte ebenfalls zum Anstieg der Antikörper-Titer im Serum, allerdings war in der BAL nach intranasaler Applikation IgA nachweisbar, was nach subkutaner Applikation nicht der Fall war. Die nachgewiesenen Antikörper konnten in vitro allerdings die Virusreplikation nicht neutralisieren. Ob die Antikörper eventuell die Virusreplikation intrazellulär hemmen können, ist noch unklar, jedenfalls scheint die Wirkung dieses Impfstoffs eher auf der Auslösung einer Th-1 basierten Immunantwort zu beruhen. Ausgehend von dieser Arbeit impften β010 Riffault et al. Kälber mit diesem Impfstoff und konnten eine Immunität der Kälber gegen bovines RSV nachweisen. [91] Ein anderer Ansatz ist die Arbeit mit Virosomen. welche mit einem Adjuvanz kombiniert werden. Kamphuis et al. verwendeten für Ihre Studie RSV-Virosomen, in deren Membran MPLA als Adjuvanz integriert wurde. [60] MPLA ist ein Derivat von LPS und somit ein Ligand für TLR-4. Es stimuliert die Produktion von IFNdurch CD-4 positive T-Zellen und über diesen Weg die Aktivierung von Th1-Zellen. Kamphuis et al. impften Mäuse intramuskulär mit einem solchen Impfstoff und erhielten vielversprechende Resultate: die geimpften Mäuse entwickelten protektive Serumtiter von RSV-spezifischen IgG-Antikörpern und waren nach der Impfung vor einer RSV-Infektion geschützt. In vitro konnte die Neutralisation von RSV durch die produzierten IgG-Antikörper nachgewiesen werden. Durch die Impfung wurde dabei keine Lungenpathologie oder Einwanderung von Eosinophilen ausgelöst, zwei Nebenwirkungen, welche in früheren Studien zur Impfstoffentwicklung häufig beobachtet wurden. Einen anderen Weg wählten Mok et al. [76]: sie nutzten attenuierte Masern-Viren, den Edmonston-Zagreb-Stamm, als Vektor für Antigene des RSV-F-Proteins. Diesen genetisch modifizierten Virusstamm applizierten sie Baumwollratten und Rhesusaffen intramuskulär. In den Versuchen mit den Baumwollratten konnten Mok et al. neutralisierende Antikörper gegen RSV nachweisen, die Tiere waren gegen eine Infektion mit dem RSV-Aβ-Stamm geschützt. Im Primaten-Modell allerdings waren keine ausreichenden Antikörper-Titer nachweisbar, wobei in den Versuchen bezogen auf das Körpergewicht der Tiere mit niedrigeren Impfdosen gearbeitet wurde als bei Baumwollratten, so dass für eine abschließende Beurteilung weitere Versuch notwendig sind. 16 Im Bereich der Impfstoffentwicklung wurden somit in den letzten Jahren vielversprechende Fortschritte gemacht. Wann tatsächlich ein sicherer und wirksamer Impfstoff auf den Markt kommen wird ist aber weiterhin noch nicht abzusehen. 17 1.2 Zell-Linien Bei der Arbeit mit Viren im Labor werden für die Virusanzucht Zellkulturen benötigt. Hier kommen verschiedene Zell-Linien zum Einsatz, die sich entsprechend ihres Ursprungsgewebes voneinander unterscheiden. 1.2.1 HeLa-Zellen HeLa-Zellen sind eine Zell-Linie humaner Epithelzellen, die seit mehr als 50 Jahren weltweit in Laboren zu Forschungszwecken verwendet werden. Sie stammen von der Afroamerikanerin Henrietta Lacks, die 1951 im Alter von γ1 Jahren an einem Cervixkarzinom erkrankte und an diesem Leiden verstarb. Aus einer Gewebeprobe, die aus dem Tumor an Henrietta Lacks Gebärmutterhals entnommen worden war, konnte das Forscherehepaar George und Margaret Gey zum ersten Mal erfolgreich eine Zellkultur anlegen, die sich endlos weiter vermehrte. [108] Dies bedeutete einen großen Fortschritt für die damalige Forschung, waren bisher doch alle Versuche, eine Zell-Linie zu etablieren die sich unendlich häufig teilt, gescheitert. Aufgrund der einzigartigen Fähigkeit zur unendlichen Vermehrung wurden die dann „HeLa“ genannten Zellen an Labore in der ganzen Welt verschickt. [γβ][109] Inzwischen sind die Zellen in der Forschung etabliert und werden bis heute vielfältig eingesetzt. [69][108] In den 1970er und 1980er Jahren kam es zu einer großen wissenschaftlichen Debatte über die HeLa-Zellen. 1966 berichtete Stanley Gartner bei der zweiten „Decennial Review Conference on Cell, Tissue and Organ“, dass 18 humane ZellLinien aus unabhängiger Herkunft von HeLa-Zellen überwuchert worden seien. Dies folgerte er aus der Anwesenheit der Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase Typ A, die nur in der afroamerikanischen Bevölkerung vorkommt, und der Phosphoglucomutase Typ1, außerdem anhand von karyotypischen Markern, Antigenmustern, Empfänglichkeit für Viren, und Profilen in der NukleinsäureHybridisierung. In der „Science“ vom 7. Juni 1974 veröffentlichte Walter Nelson-Rees die Ergebnisse seiner Untersuchungen von insgesamt β0 Zell-Linien, die in Studien 18 zum Einsatz kamen. [8β] Neun dieser Zell-Linien entsprachen in ihrer Enzymausstattung und weiteren Markern HeLa-Zellen. Zwei dieser Zellreihen sollten Brustkrebs-Zellen entsprechen und kamen deshalb in der Brustkrebsforschung zum Einsatz. Nun stellte sich also die Frage, in wie weit die Ergebnisse dieser Forschung überhaupt reliabel sein konnten. Mit der Zeit wurden immer mehr Zell-Linien untersucht, und häufig wurde festgestellt, dass die Kulturen HeLa-Zellen enthielten. Die zuerst positiv geschätzte Eigenschaft, sich unendlich vermehren zu können wurde nun zum Problem, da offensichtlich andere Zellkulturen bei Kontamination durch HeLa-Zellen sehr leicht überwuchert wurden. [81] 1.2.2 HEp2-Zellen HEpβ-Zellen gehören wie die HeLa-Zellen zu den ältesten menschlichen ZellKulturen. Sie waren ursprünglich humane Epithelzellen, die aus Proben eines 56jährigen männlichen Patienten stammten, welche 195β von dessen Larynxkarzinom entnommen worden waren. Im September 195β, nach zwei Generationen Wachstum in Laborratten, begann Fjelde vom Sloan-KetteringInstitut New York die Zellen in vitro weiter zu züchten. Doch schon 1955 beschrieben Moore et al. in einem Artikel, dass die HEpβ-Zellen in ihrem Wachstumsverhalten und ihrer Morphologie nicht von HeLa-Zellen zu unterscheiden seien. [78][8γ] Heute ist bekannt, dass diese Zell-Linie durch HeLaZellen kontaminiert wurde. So weist zum Beispiel die American Type Culture Collection (ATCC) in ihrem Online-Katalog darauf hin, dass diese Zell-Linie nicht in Forschungsvorhaben zum Einsatz kommen sollte, in denen die Eigenschaften des ursprünglichen Gewebes von Bedeutung für die Validität der Ergebnisse sind. 19 1.2.3 Vero-Zellen Die Vero-Zell-Linie wurde 196β von Y. Yasumura und Y. Kawataki an der Universität Chiba, Japan, etabliert. Sie stammt von Epithelzellen ab, die aus der Niere einer gesunden afrikanischen grünen Meerkatze (Cercopithecus) gewonnen wurden. Die Zellen sind aneuploid. Sie werden vor allem in der Virusforschung verwendet, da sie für viele Virusstämme empfänglich sind. Sie werden für die Entwicklung neuer Impfstoffe und die Impfstoffproduktion genutzt. [106] 1.2.4 A 549-Zellen Diese Zelllinie entstammt einer Gewebeprobe, welche 197β von J.D. Giard et al. aus einem Adenokarzinom der Lunge bei einem 58 Jahre alten Mann entnommen worden war. [45] Diese Zellen weisen zu einem großen Teil einen veränderten Karyotyp auf (ββ % haben 66 Chromosomen) und entsprechen in Ihrer Morphologie Epithelzellen. Sie wachsen adhärent und in ihrem Zytoplasma wurden multilamellare cytoplasmatische Einschlusskörper gefunden, welche typisch sind für Typ II Alveolarzellen. [68] 20 1.3 Dendritsche Zellen 1.3.1 Eigenschaften und Funktionen Dendritische Zellen (DC) sind so genannte „Antigen präsentierende Zellen“, das heißt, sie liegen in peripheren Geweben und sammeln potentiell fremde Proteine, also Antigene, um diese dann den Effektorzellen des Immunsystems zu präsentieren. Sie erfüllen somit eine Wächterfunktion. Sie wurden erstmals in den frühen 1980er Jahren durch Steinmann immunologisch charakterisiert. Sie machen weniger als 1 % der gesamten Zellpopulation der Lymphknoten und der Milz aus. [70] Die Lebensdauer der menschlichen DC ist unbekannt, bei Mäusen und Ratten beträgt sie einige Tage bis zu 9 Wochen. DC stammen aus dem Knochenmark, ihre Vorläufer sind CDγ4+ hämatopoetische Stammzellen. Über die Stufe der so genannten „Common myeloid progenitor“ Zelle entwickeln sich schließlich die dendritischen Zellen, deren Subpopulationen sich in ihren Oberflächenmarkern und Funktionen unterscheiden. In vitro werden für die Entwicklung von dendritischen Zellen, je nach Subpopulation, GM-CSF, IL4 und TNFα benötigt, die einzelnen Schritte der Entwicklung der DCs des Menschen sind noch nicht vollständig erforscht. [1ββ] Betrachtet man dendritische Zellen des peripheren Gewebes unter dem Mikroskop, sieht man ihre fingerartigen, langen Fortsätze, die ihnen ihren Namen gaben, da sie den Dendriten von Neuronen ähneln. Der Nukleolus ist unregelmäßig geformten und sie enthalten wenig Organellen, dafür aber prominente Mitochondrien. Färbt man dendritische Zellen mit Giemsa, so stellt sich das Zytoplasma in einem blassen blau-grau, ähnlich den Monozyten dar, nur zeigen sich keinen azurophilen Granula. Dafür enthalten sie eine geringe Anzahl Lysosomen. DCs sind Peroxidase- und Esterase-negativ. [1β0] Als unreife Zellen liegen sie in peripheren Geweben und nehmen über Phagozytose, Makropinozytose und Endozytose sowohl partikuläre als auch lösliche Antigene auf. [70] Durch die Makropinozytose nehmen sie jede Stunde ca. 100 bis 150 µmγ extrazelluläre Flüssigkeit auf, was ihrem eigenen Zellvolumen entspricht. [1ββ] Sie werden durch Lipopolysaccharide, TNF-α oder CD40Ligand aktiviert, verlieren dann ihre Fähigkeit zur Phagozytose und wandern in regionäre Lymphknoten ein, um dort das Antigen zu präsentieren. Erkennt eine T-Zelle 21 dieses Antigen wird sie mittels Oberflächenrezeptoren und Zytokinen aktiviert. Sich selbst schützen die Zellen vor dem Virus mittels MxA, einem Protein, das die DCs unter dem Einfluss von IFN-α exprimieren. [ββ] Die Antigenpräsentation erfolgt wie bei allen professionellen antigen-präsentierenden Zellen über MHC-II, wobei dessen Expression durch IFN- und TNF-α erhöht wird. Die DC ist die einzige Antigen präsentierende Zelle, welche ruhenden, naiven T-Zellen Antigen präsentieren und diese vollständig aktivieren kann. DCs aktivieren sowohl T-Helfer-Zellen als auch cytotoxische T-Zellen, ihnen kommt also sowohl in der humoralen als auch der zellvermittelten Abwehr eine wichtige Rolle zu. Auch haben sie eine Funktion für die angeborene Immunantwort: sie tragen TLRs und Komplement-Rezeptoren. Sie werden durch Komplexe aus bakteriellen oder viralen Produkten und Komplement aktiviert, und setzen dann Zytokine wie IL-1β, IL-15, IL-18 und IFN- frei, wodurch natürliche Killer-Zellen und natürliche Killer-T-Zellen heranreifen und aktiviert werden. Außerdem können DCs Antigen auf den B-Zell-Rezeptor übertragen, und die BZellen dann mit Hilfe von Kostimulatoren und Zytokinen aktivieren und ihre Reifung in Plasmazellen fördern. Insgesamt ist davon auszugehen, dass sie durch ihre Zytokinfreisetzung die Art der Immunantwort zu steuern. [70] 1.3.2 DC-Subtypen 1.3.2.1 Plasmocytoide DCs Diese dendritischen Zellen haben ihren Namen daher erhalten, dass ihre Vorläuferzellen, CD4+ CD11c- plasmocytoide Zellen, stark einer Plasmazelle ähneln. Sie kommen im Blut und in Lymphknoten vor. Wahrscheinlich entstammen sie einer lymphoiden Zelllinie, da in ihnen mRNA nachgewiesen werden konnte, die für die nicht umgelagerte κ-Kette der Immunglobuline kodiert. [1ββ] In vitro führt ihre Stimulation mit bakteriellen Produkten und IL-γ dazu, dass sie die gewohnte DC-Morphologie annehmen, allerdings kommt es nicht zur Proliferation. Sie kennzeichnen sich durch die Expression des B-Zell-Markers Bββ0 und enthalten viel raues endoplasmatisches Retikulum, produzieren aber keine Immunglobuline. Weitere vorhandene Oberflächenmarker sind CD8, IL-γ22 Rezeptor, die TLRs 7 und 9. Nach Stimulation produzieren sie IFN-α und IFN- . 1.3.2.2 Myeloide DCs Myeloide DCs sind Zellen, die aus Monozyten in Gegenwart von GM-CSF und IL-4 entstehen. An ihrer Oberfläche tragen sie CD11c (Komplementrezeptor 4), CD1γ, CDγγ und CDγ8. Zur vollständigen Ausreifung gelangen sie erst durch die Stimulation durch proinflammatorische Zytokine oder mikrobielle Wandbestandteile wie LPS. [1ββ] Myeloide DC kommen in allen nicht-lymphatischen Geweben mit Ausnahme des Nervensystems vor. Weiterhin kann man die myeloiden DC anhand der Expression von CD4 und CD8 einteilen: Die CD8+ DC tragen an ihrer Oberfläche das CD8αα Homodimer und das Lektin CDβ05. Sie exprimieren wenig CD11b und produzieren nach Stimulation große Mengen an IL-1β. So fördern sie eine Th1-Differenzierung und Proliferation. Sie liegen in den T-Zell-Regionen der lymphatischen Organe, insbesondere in der periarteriolären Scheide der Milz. Die CD4+ DC exprimieren viel CD11b und liegen in den Randzonen der Milz. Außerdem gibt es CD4-8- DC, die ebenfalls viel CD11b exprimieren und in Lymphknoten vorkommen. [70] 1.3.2.3 Thymus-DCs Die Thymus-DCs sollen von einer unbekannten Vorläuferzelle des Thymus abstammen. Sie verbleiben im Thymus und spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der zentralen Toleranz der T-Zellen. [1ββ] 23 1.3.3 Migration und Reifung Wie oben erwähnt sind dendritsche Zellen professionelle antigen-präsentierende Zellen. Das heißt ihre Aufgabe besteht darin, fremdes Protein zu erkennen, und dann eine Immunantwort auszulösen. Zu diesem Zweck wandern sie, gesteuert von Chemokin-Rezeptoren und Adhäsionsmolekülen, als noch unreife Zellen in die peripheren Gewebe ein. Ein auf vielen unreifen DCs vorkommendes Protein ist das E-Cadherin. Es interagiert mit den Geweben der Peripherie und sorgt so dafür, dass sich die DCs im gesamten Organismus verteilen. Die unreifen Zellen werden beeinflusst durch Signale, die vor allem im entzündeten Gewebe vorkommen: bakterielle und virale Produkte wie LPS und virale RNA, sowie Cytokine wie TNF-α und IL-1. Der genaue Signalweg, der die Reifung auslöst ist noch ungeklärt, aber anscheinend sind TLRs und CD40 daran beteiligt. In vitro konnten DCs durch eine Stimulation über TLRγ, welcher doppelsträngige Virus-RNA bindet, und TLR9, der bakterielle CpG-Sequenzen bindet, zur Reifung gebracht werden. Die unterschiedlichen DC-Subgruppen tragen unterschiedliche TLRs. Außerdem scheint das MHC II -Molekül an der Ausreifung der DCs beteiligt zu sein. In vitro bindet das Oberflächenmolekül LAG-γ (lymphocyte activation geneγ), das auf T-Effektorzellen und NK-Zellen vorkommt, an MHC-II. Dieses führt zur Reifung der DCs, sie setzen Chemokine frei die Lymphozyten anlocken, und exprimieren verstärkt Chemokin-Rezeptoren. Die Bindung von LAG-γ an MHC-II könnte aber auch der Terminierung von Immunreaktionen dienen, da diese, wenn es in vitro zur Stimulation einer bereits ausgereiften Zelle kommt, bei der DC die Apoptose auslöst. Während des Reifungsprozesses, der durch den Antigenkontakt ausgelöst wird, wird das Zytoskelett der DCs neu organisiert; Rezeptoren, die der Antigenaufnahme dienen, werden herabreguliert, wie zum Beispiel CD91 und CDγ6. Andere Oberflächenmarker, die dagegen der Kontaktaufnahme zu anderen Zellen in den Lymphknoten dienen, werden verstärkt exprimiert, wie CD44Varianten oder Chemokinrezeptoren. Anschließend verlassen sie das Gewebe und wandern in die sekundären lymphatischen Organe ein. Im Lymphknoten angekommen verlieren sie die Fähigkeit zur Antigenaufnahme vollkommen, sind dann aber in der Lage, T-Zellen zu aktivieren. Dies ist dadurch 24 möglich, dass die Zahl der MHC-II-Moleküle an der Zelloberfläche auf das 5- bis β0-fache erhöht wird; so kann das Antigen effektiv den CD4+ T-Zellen präsentiert werden. DCs sind die einzigen APCs, die naive T-Zellen aktivieren können, andere APCs können nur mit Gedächtnis- oder Effektor-T-Zellen interagieren. Dies hat verschiedene Gründe: zum einen lässt es sich durch das hohe Level von PeptidMHC-II-Komplexen an ihrer Oberfläche begründen. Des Weiteren exprimieren sie als einzige APC ein Molekül namens DC-SIGN (DC-specific, ICAMγ-grabbing nonintegrin). Dieses erkennt Mannose-Reste und führt zur ersten Adhäsion an die TZellen. Auch tragen DCs weniger Sialinsäuren auf ihrer Zelloberfläche, so dass die Abstoßung zwischen den Zellen reduziert wird. Weitere Eigenschaften der DC, welche die Kontaktaufnahme mit den T-Zellen erleichtern, sind die hohe Anzahl an Adhäsionsmolekülen wie CD11c und das hohe Level kostimulatorischer Signale wie B7-β und CD40. [70] 25 1.4 T-Zellen 1.4.1 Eigenschaften und Funktionen Im Zusammenspiel mit den dendritischen Zellen haben die T-Zellen eine wichtige Rolle in der Aktivierung einer Abwehrreaktion durch das Immunsystem. Die T-Zellen sind Lymphozyten, welche aus dem Thymus stammen. Auf ihrer Oberfläche tragen sie den T-Zell-Rezeptor sowie das charakteristische Oberflächenmolekül CDγ. Anhand weiterer Oberflächenmoleküle sowie ihrer Funktionen werden die T-Zellen in weitere Subgruppen unterschieden. [59] 1.4.2 T-Zell-Subtypen 1.4.2.1 CD8-positive T-Zellen Diese Subpopulation der T-Zellen wird auch als zytotoxische T-Zellen bezeichnet. Ihre Aufgabe besteht in der Zerstörung von Zellen, welche mit intrazellulären Pathogenen infiziert oder entartet sind. Sie erkennen Antigen, welches über MHC I präsentiert wird. Sind entsprechende kostimulatorische Signale vorhanden wird die Zelle aktiviert. Die T-Zelle schüttet daraufhin IL-β aus, welches zu einer weiteren Differenzierung der T-Zelle führt. Die zytotoxische T-Zelle führt zum programmierten Zelltod der Zielzelle, wobei es hierfür verschiedene Mechanismen gibt. Zum einen setzt die T-Zelle Granula frei, welche Perforin und Granzym enthalten. Das Perforin lagert sich zu transmembranösen Poren zusammen, so dass die Zellmembran durchlässig wird. Das Granzym kann dann in der Zelle Enzyme aktivieren, welche die Apoptose auslösen. Eine weitere Möglichkeit ist die Bindung des Fas-Liganden auf der T-Zelle an Fas auf der Zielzelle. Auch dies setzt die Apoptose in Gang. Über diese Mechanismen können zytotoxische TZellen gezielt einzelne Zellen zerstören, ohne das umgebende Gewebe zu beschädigen. [59] 26 1.4.2.2 CD4-positive T-Zellen Diese T-Zellen werden als T-Helfer-Zellen zusammengefasst. Sie interagieren mit B-Zellen, Makrophagen und APCs, also Zellen, welche MHC II exprimieren. Abhängig von ihrer Funktion werden sie in verschiedene Subgruppen eingeteilt. Die Th1-Zellen führen zu einer zellulären Immunantwort und sind für die Abwehr intrazellulärer Erreger, zum Beispiel Viren, verantwortlich. Sie können Markrophagen aktivieren; in den Makrophagen kommt es dann zum Verschmelzen der Lysosomen mit den Vesikeln, welche die Erreger enthalten, so dass diese zerstört werden. Die Th1-Zellen setzen außerdem Zytokine frei, welche weitere Makrophagen an den Ort der Infektion locken. Sie produzieren unter anderem IFN- , IL-β und TNF-α. Zu einer Th1-Immunantwort kommt es, wenn im umgebenden Zytokinmilieu die entsprechenden Mediatoren überwiegen, wie IFNaus T-Zellen, Interleukin-1β aus APCs und Interleukin-18 aus aktivierten Makrophagen. [59] Die Thβ-Zellen dagegen können Wachstum und Differenzierung von B-Zellen, Eosinophilen und Mastzellen stimulieren. Durch die Interaktion der Thβ-Zellen mit den B-Zellen wird unter anderem der Immunglobulin-Isotypenswitch ausgelöst. Die Thβ-Zellen dienen also der humoralen Immunantwort. Sie produzieren unter anderem Il-4, IL-5, IL-10 und IL-1γ; ihre Proliferation wird durch Interleukin-4, -5 und -10 stimuliert, IFN- dagegen hemmt sie. [86][87] Darüber hinaus gibt es die Th17-Zellen, welche in der Abwehr von extrazellulären Parasiten und Pilzen eine Rolle spielen sollen, indem sie die Einwanderung von Neutrophilen und Makrophagen in das entzündete Gewebe fördern. Sie produzieren als charakteristischen Botenstoff das IL-17. 27 1.4.2.3 Regulatorische T-Zellen Regulatorische T-Zellen modulieren die Aktivität der Abwehrzellen und sollen Autoimmunreaktionen durch entsprechende Regulation und ggf. immunsuppressive Effekte verhindern. Diese T-Zellen stammen aus dem Thymus und werden definiert über die Marker CD4 und CDβ5 sowie den Transkriptionsfaktor Foxpγ. Für ihre Aktivierung wird ILβ benötigt. Die Zellen produzieren die Zytokine IL-4, IL-10 und TGF- welche für die immunmodulatorischen Effekte verantwortlich sein sollen, außerdem können sie cAMP auf andere T-Zellen übertragen, und so ihre Aktivierung verhindern. [118] Sie sind insbesondere aufgrund ihrer Rolle im Rahmen von Tumorerkrankungen in den Fokus der Forschung gelangt: eine Immunsuppression durch fälschlicherweise aktive regulatorische T-Zellen soll laut Gallimore et al. mit dafür verantwortlich sein, dass die körpereigene Abwehr nicht effektiv gegen Tumorzellen vorgehen kann. Je weiter fortgeschritten eine Tumorerkrankung war, desto mehr regulatorische T-Zellen wurden im Tumorgewebe gefunden. [4β] 28 1.5 Dendritische Zellen, RSV und T-Zellen Es ist anzunehmen, dass den dendritischen Zellen eine besondere Rolle in der Pathogenese der RSV-Bronchiolitis zukommt. In Zellkulturen von primärem humanem Atemwegsepithel zeigt sich auch nach mehr als γ Monaten Infektion mit RSV kein zythopathischer Effekt, vermutlich aufgrund der dort fehlenden Immunantwort. Dies legt den Schluss nahe, dass die Immunreaktion des Körpers, unter anderem auch durch die dendritschen Zellen, an der ausgelösten Entzündung und der daraus folgenden Gewebsschädigung beteiligt ist. [1β8] Insbesondere die Rekrutierung von Thβ-Zellen wird für die Gewebsschädigung verantwortlich gemacht, die durch RSV-Antigene getriggert werden soll. [19] In murinen Modellen haben Schwarze et al. festgestellt, dass in der frühen Phase der Infektion vor allem plasmacytoide dendritische Zellen – vermutlich aus dem Knochenmark - in die Lunge einwandern, während im weiteren Verlauf der Infektion in der Lunge aus lokalen Vorläuferzellen myeloide DCs reifen. Diese beiden Zelltypen erfüllen verschiedene Funktionen: die plasmacytoiden Zellen hemmen vor allem die Virusreplikation, eventuell erfüllen sie auch regulatorische Funktionen bezüglich der Entzündung und der hiermit einhergehenden veränderten Lungenfunktion. Die myeloiden DCs dagegen sollen die Inflammation eher noch verstärken und eventuell auch für die diskutierte Allergiedisposition verantwortlich sein. Während sie in der gesunden Lunge noch nicht ausgereift sind, reifen sie während der RSV-Infektion und können dann naive T-Zellen aktivieren. [101] Auch Gill et al. bestätigten in einer Arbeit, für die sie Nasensekret und Blut von Kindern mit nachgewiesener RSV-Infektion untersuchten, dass durch die RSVInfektion die Einwanderung von myeloiden und plasmocytoiden DCs in den Respirationstrakt stimuliert wird. [46] Boogaard et al. veröffentlichten β007 ihre Ergebnisse aus einer Untersuchung zu der Fragestellung, in wie weit sich die durch RSV aktivierten myeloiden und plamycytoiden dendritischen Zellen in ihrer Ausschüttung von Zytokinen und der Aktivierung von T-Zellen unterscheiden. Sie hatten festgestellt, dass die mit RSV stimulierten myeloiden DCs auf ihrer Oberfläche Reifemarker exprimierten und über Zytokine sowohl Th1- als auch Thβ-Zellen stimulierten. Die plasmocytoiden DCs dagegen wurden zur Produktion von Interferon-α angeregt, hatten so also 29 eine direkte anitvirale Funktion, zeigten aber weder Reifemarker an der Oberfläche, noch beeinflussten sie die Proliferation von T-Zellen. [16] Somit könnte die Subgruppe der DC, welche während einer akuten RSV-Infektion aktiv wird, entscheidend sein für den Verlauf einer RSV-Infektion und die späteren Folgen hinsichtlich zum Beispiel der diskutierten Allergiedisposition durch RSV. De Graaff et al. untersuchten RSV-infizierte DC, welche sie aus monozytären Zellen aus dem peripheren Blut gesunder Spender differenziert hatten. Sie konnten zeigen, dass durch die RSV-Infektion eine Reifung der DC eintrat, welche sie durch die Expression von entsprechenden Oberflächenmolekülen definierten; diese Zellen zeigten aber eine eingeschränkte Funktion in der Aktivierung von CD4 T-Zellen. Allerdings gingen sie nicht davon aus, dass dies durch eine unvollständige oder fehlerhafte Reifung der DC ausgelöst wurde, da auch die nicht direkt infizierten DC in ihrer Funktion eingeschränkt waren. Vielmehr vermuten sie aufgrund weiterer Arbeiten mit nicht infizierten Ko-Kulturen einen löslichen Faktor, welcher die Funktion der Zellen beeinflusst. [β9] Rothoeft et al. legten Ko-Kulturen aus DC und naiven T-Zellen bzw. TGedächtniszellen an. Sie untersuchten, wie sich DC verhalten, wenn sie durch RSV infiziert sind, und dann in Kontakt mit den T-Zellen treten. In der Ko-Kultur aus RSV-infizierten DC und naiven T-Zellen konnten die DC eine Proliferation auslösen, allerdings produzierten die T-Zellen unter diesen Bedingungen deutlich weniger IFN- als in einer Ko-Kultur von T-Zellen und DC ohne RSV-Infektion. Der Effekt der RSV-Infektion auf T-Gedächtniszellen war weniger ausgeprägt. [85] In klinischen Untersuchungen bei Kindern mit RSV-Bronchiolitis wurden immer wieder sowohl im nasalen Sekret als auch im peripheren Blut niedrige Konzentrationen von IFN- gemessen (z.B. Aberle et al. [β], Bont et al. [14][15]) So stellten zum Beispiel Legg et al. [67] fest, dass bei Säuglingen mit RSVBronchiolitis das IFN- im nasalen Sekret niedriger war, als bei Kindern, welche einen durch RSV ausgelösten Infekt der oberen Luftwege hatten. Andererseits war im Verlauf bei den Kindern mit Bronchiolitis das IL-4 erhöht. Hieraus folgerten sie, dass aufgrund der somit überwiegenden Thβ Immunantwort keine ausreichende Viruselimination stattfindet, während bei den Kindern mit hohem IFN- durch eine Th1 Immunantwort eine ausreichende Virusclearance möglich ist und somit weniger Pathologie entsteht. Ein Überwiegen der Thβ-Antwort bei RSV wird immer wieder diskutiert (z.B. Roman et al. 1997 [94], Bont et al. 1999 [14], Bendelja et al. β000 [8]), wodurch diese Reaktion des Immunsystems ausgelöst wird ist aber 30 unklar. Schauer et al. [99] stellten β004 fest, dass bei Kindern nach einer RSVBronchiolitis die Anzahl der IFN-gamma produzierenden Zellen in einer Ko-Kultur aus RSV-infizierten DC und naiven T-Zellen deutlich niedriger war, als bei Kindern mit einem milden Verlauf. Kinder, die bis dato keine RSV-Infektion durchgemacht hatten, zeigten eine große Variabilität in der IFN- Produktion. Hieraus ergibt sich die Frage, ob möglicherweise eine hohe IFN- Produktion vor einer schweren RSV-Infektion schützt. Bei Kindern mit schweren Verläufen wurden Gen-Polymorphismen für TGF-beta, IL 4 und IL 4-Rezeptor sowie IL-10 beschrieben [54][55][56]. 31 2. Fragestellung Die RSV-Infektion ist insbesondere im Kindesalter eine bedeutende, da immer wieder schwer verlaufende Infektionskrankheit. Bis heute ist die Pathogenese nicht hinreichend geklärt, zum Beispiel ist unklar, warum unser Immunsystem nicht in der Lage ist, nach einer Infektion einen dauerhaften Immunschutz aufzubauen. Der einzige effektive Schutz, der bisher zur Verfügung steht, ist eine Passivimmunisierung, welche Risikopatienten wie zum Beispiel Frühgeborenen vorbehalten ist. Eine kausale Therapie ist nicht bekannt, auch bei schweren Infektionen ist nur eine symptomatische Behandlung möglich. Einen vielleicht entscheidenden Baustein für das tiefere Verständnis der RSVInfektion könnten Arbeiten der letzten Jahre beisteuern, in denen auffiel, dass bei Kindern mit schweren RSV-Infektionen erniedrigte Konzentrationen von IFNgemessen wurden. Weitere Untersuchungen anhand von Zellkulturen zeigten, dass eine RSV-Infektion die Produktion von IFN- reduziert, und somit die Proliferation und Reifung der T-Zellen beeinflusst. Ein daraus folgendes Überwiegen der Thβ-Antwort könnte eine Erklärung für eine unzureichende Viruselimination und damit eine schwere Infektion sein. Die bisher durchgeführten Untersuchungen wurden mit Hilfe von RSVLaborstämmen durchgeführt. Man weiß, dass sich zwei der am weitesten verbreiteten Laborstämme, der Long-Strain und der Aβ-Virusstamm, darin unterscheiden, dass der Aβ-Stamm über NS1 und NSβ die Produktion von IFN-α und IFN- hemmen kann, während der Long hierzu nicht in der Lage ist. Beide Stämme werden seit Jahrzehnten auf Zellkulturen vermehrt. Es ist anzunehmen, dass in dieser Zeit Veränderungen und Mutationen aufgetreten sind. In welchen Eigenschaften sich diese Stämme nach jahrelanger Weitervermehrung im Labor von den aktuellen Wildtyp-Viren unterscheiden ist aber nicht bekannt. Außerdem werden viele der Arbeiten mit Zellkulturen epithelialen Ursprungs durchgeführt. Allerdings ist gerade bei der RSV-Infektion das Epithel nicht maßgeblich an der Pathogenese der Erkrankung beteiligt, sondern die Zellen des Immunsystems. Für die weitere Klärung der Pathogenese ist es also wichtig auch die Interaktion der Viren mit den Immunzellen weiter zu untersuchen, und wie die Infektion gegebenenfalls die Funktion der Immunzellen beeinflusst. 32 Daher stellten sich uns verschiedene Fragen: Können Wildtypviren die verschiedenen Labor-Zelllinien infizieren? Können Wildtypviren dendritische Zellen infizieren? In wie weit ist eine Anzucht von Wildtypviren im Labor möglich? Welche Effekte hat die Infektion auf die Zellkultur? Unterscheidet sich die Expression des F-Proteins bei Infektion von dendritischen Zellen durch Wildtyp-Viren von der Expression bei einer Infektion durch einen Laborstamm? Nach Infektion von Ko-Kulturen aus dendritischen Zellen und T-Zellen durch Wildtyp-Viren und Laborstämme: unterscheiden sich die Ko-Kulturen hinsichtlich Proliferationsverhalten und IFN- -Produktion durch die T-Zellen? Um die Unterschiede zwischen Wildtyp-Viren und Laborstämmen aufzuzeigen infizierten wir verschiedene Zellkulturen mit den unterschiedlichen Virusstämmen und maßen die Effekte der Infektion anhand des CPE sowie F-Protein-ELISA. 33 3. Probanden, Material und Methoden Diese Arbeit entstand im Rahmen des DFG Projekts „Modulation von dendritischen Zellen und T-Zellen durch das Respiratory Syncytial Virus in-vitro“, an dem eine Gruppe von Doktoranden beteiligt war. Ausgangsmaterial für die Untersuchungen waren aus Nabelschnurblut angezüchtete dendritische Zellen und isolierte naive T-Zellen. Am Aufbau eines Pools an Zellen waren alle Doktoranden gleichermaßen beteiligt. Die Untersuchung der Infektiosität der verschiedenen RS-Virusstämme auf unterschiedlichen Zellkulturen und die Effekte von RSV-Wildtyp-Viren in KoKulturen aus DC und T-Zellen ist alleiniger Gegenstand dieser Arbeit. 3.1 Gewinnung und Anzucht dendritischer Zellen Die dendritischen Zellen gewannen wir aus Nabelschnurblut von gesunden Neugeborenen, die im Augusta Krankenhaus in Bochum geboren wurden. Die Eltern hatten sich nach Aufklärung mit der Verwendung einverstanden erklärt. Es wurde nur Blut verwendet, welches nicht älter als 1β Stunden war. Die Untersuchung ist durch die Ethik-Kommission der medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum geprüft worden, es bestanden keine Einwände. Das Nabelschnurblut wurde direkt nach der Geburt von der Hebamme steril aus der Vena umbilicalis der abgenabelten Plazenta entnommen. Für den Transport wurde das Nabelschnurblut in 50ml-Röhrchen mit 7ml einer Mischung aus CPD, Hepes, Kanamycin und Partricin gefüllt. Im Labor erfolgte die Verdünnung von jeweils 5 bis 7 ml Blut mit PBS 0,6 % in 50 ml Röhrchen, die bis auf γ5 ml mit PBS 0,6 % aufgefüllt wurden. Anschließend wurde mit jeweils 15 ml Ficoll unterschichtet und die Röhrchen für γ0 Minuten bei 400 xg bei Zimmertemperatur zentrifugiert, wobei die Bremse der Zentrifuge deaktiviert wurde. Durch die Zentrifugation entstanden insgesamt vier Schichten, von denen die Interphase oberhalb des Ficoll die gewünschten mononukleären Zellen enthielt. 34 Erythrozyten und polymorphkernige Zellen wurden aufgrund der größeren Dichte durch das Ficoll von diesen getrennt. (Abbildung 1) A B C D Abbildung 1: Nach der Zentrifugation sind im Röhrchen vier Schichten sichtbar: das Serum (A), die Interphase mit mononukleären Zellen (B), das Ficoll (C) sowie polymorphkernige Leukozyten und Erythrozyten (D) Die Zellen der Interphase wurden mit einer 10ml-Pipette vorsichtig abgesammelt, in frische 50 ml-Zentrifugationsröhrchen gegeben, mit PBS 0,6 % bis auf 45 ml aufgefüllt und für 10 Minuten bei γ00 xg bei Zimmertemperatur zentrifugiert. Die Überstände wurden abgegossen, die Pellets in 45 ml PBS 0,6 % resuspendiert und nun für 15 Minuten bei β00 xg gewaschen. Nach erneutem Abgießen des Überstands wurden die Zellen in 5 ml PBS 0,6 % resunspendiert, die Zellen über ein mit 5 ml PBS 0,6 % angefeuchtetes Sieb in ein neues Röhrchen gegeben, und das Sieb nochmals mit 5 ml des Puffers nachgespült. Zum Zählen in einer Neubauer-Zählkammer wurde eine Probe von 10 μl in ein vorbereitetes Eppendorf-Röhrchen gegeben, welches 90 μl Türcks-Lösung enthielt. Das Zentrifugationsröhrchen, in dem die Zellen in 15 ml PBS 0,6 % gelöst waren, wurde nochmals für 10 Minuten bei γ00 xg zentrifugiert. 35 Nach der Zentrifugation wurde wieder der Überstand abgegossen, und die Zellen anschließend in γ00 μl PBS 0,6 % pro 1x108 Zellen gelöst. Zu dieser Lösung wurde aus dem CDγ4-Kit je 1x108 Zellen 100 μl Fc-BlockingReagenz und 100 μl MicroBeads gegeben, bevor die Zellen für γ0 Minuten bei 4°C im Kühlschrank inkubiert wurden. Nach der Inkubation wurde diese Lösung mit dem 10- bis β0-fachen an PBS 0,6 % aufgefüllt und wiederholt für 10 Minuten bei γ00 xg zentrifugiert. Im Anschluss wurde wieder der Überstand abgegossen, und die Zellen mithilfe des MiniMacs nach Empfehlung des Herstellers in CDγ4-positive und in CDγ4negative Zellen, den so genannten Nabeldurchlauf, sortiert. Der Nabeldurchlauf wurde bis auf 15 ml mit PBS 0,6 % aufgefüllt. 3.2 Zellseparation mit MiniMacs Die Zellseparation mit dem MiniMacs erfolgt mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern, den so genannten MicroBeads, und einem starken Magnetfeld. Die MicroBeads sind spezifisch für ein Oberflächenantigen der Zielzellen, binden also nur an einen festgelegten Zelltypus. Die Antikörper sind mit magnetisierbaren Partikeln aus Eisenoxid und Polysacchariden mit einem Durchmesser von 50 nm markiert. Die Separationssäulen, über welche die mit Antikörpern markierten Zellen gegeben werden, enthalten eine Matrix aus ebenfalls magnetisierbarem Material. Wird die Säule in den MiniMacs-Zellseparator eingebracht, und die Zell-Lösung auf die Säule gegeben, werden die enthaltenen Zellen in zwei Fraktionen geteilt: Die nicht markierten Zellen können die Säule passieren und aufgefangen werden. 36 Abbildung β: im Magnetfeld werden die mit magnetisierbaren Antikörpern markierten Zellen in der Säule zurückgehalten, während nicht markierte Zellen die Säule passieren Die markierten Zellen hingegen werden, auf Grund der magnetischen Eigenschaften der MircoBeads und des angelegten Magnetfeldes, in der ebenfalls magnetisierten Matrix in der Separationssäule zurückgehalten. Erst wenn die Säule aus dem Magnetfeld entfernt wird können die Zielzellen aus der Säule heraus gespült werden. Es handelt sich bei dieser Art der Zellseparation also um eine Positivselektion. 37 Abbildung γ: Nach Entfernen der Säule aus dem Magnetfeld können auch die markierten Zellen aus der Säule gespült werden 3.3 Weiterbehandlung der gewonnenen Zellen Aus beiden Zellfraktionen wurden jeweils 10 μl als Probe entnommen und jede Probe in einem Eppendorf-Röhrchen mit 90 μl Türcks-Lösung gefärbt. Die CDγ4positiven Zellen wurden in einer Fuchs-Rosenthal-Zählkammer gezählt, die CDγ4negativen in einer Neubauer-Zählkammer. Der Nabeldurchlauf wurde nach erneuter Zentrifugation (10 Minuten, γ00 xg, Zimmertemperatur) nach Verwerfen des Überstandes in Einfriermedium resuspendiert und -70°C eingefroren. Die CDγ4-positiven Zellen wurden in Nährmedium RPMI++ aufgenommen; für jeweils 1,5 x105 Zellen wurde 1 ml Medium hinzugegeben sowie 10 μl Stammzellfaktor, 10 μl GM-CSF und β 5μl einer Verdünnung von TNF-α (1:100 in Medium). Je 1 ml der Zellsuspension wurde pro Senkloch in einer β4-Loch Zellkulturplatte ausgesät und für insgesamt eine Woche im Brutschrank bei γ7°C und 8 % COβ inkubiert. 38 Am dritten Tag nach der Sortierung wurde die Kultur geteilt; jeweils 0,5 ml aus jedem Senkloch wurden in ein leeres Senkloch pipettiert und dann mit 0,5 ml Nährmedium aufgefüllt. Weitere Teilungen der Kultur erfolgten je nach Wachstumsverhalten der Kultur. Nach einer Woche wurden die Zellen geerntet. Hierzu wurden die Zellen in ein 50 ml Zentrifugationsröhrchen gegeben und für 10 Minuten bei γ00 xg bei Zimmertemperatur zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, die Zellen in 15 ml PBS 0,6 % aufgenommen und eine Probe von 10 μl entnommen, um diese mit 90 μl Türcks-Lösung zu färben und in der Neubauer-Kammer zu zählen. Die Zelllösung wurde nochmals für 10 Minuten bei γ00 xg zentrifugiert, anschließend der Überstand abgegossen, die Zellen in Einfriermedium resuspendiert und bei -70°C eingefroren. 3.4 Gewinnung der T-Zellen Die T-Zellen wurden von uns ebenfalls durch eine Zellseparation mittels MiniMacs gewonnen, wobei wir nun anti-CD45RA-MicroBeads verwendeten. Die T-Zellen wurden nach der Separation der CDγ4-positiven Zellen aus dem Nabeldurchlauf gewonnen. Die Zellseparation wurde wie oben beschrieben durchgeführt, die Zellen wurden nach Zählen in einer Neubauer-Zählkammer für die weiteren Versuche mit Kulturmedium auf eine Konzentration von 10 6 Zellen/ml eingestellt. 3.5 Virusgewinnung und Anzucht Das Ausgangsmaterial war Nasensekret von Kindern, die auf Grund von respiratorischen Symptomen in der Ambulanz der Kinderklinik vorgestellt wurden, und bei denen der RSV-Schnelltest positiv ausgefallen war. Das Sekret wurde vorerst bei -70°C eingefroren. Am Tag0 wurden HEpβ-Zellen in eine 6-Lochplatte gegeben, jeweils βx105 Zellen pro Senkloch, so dass diese adhärent werden konnten. Am Tag1 wurden β ml des aufgetauten Sekrets auf die Zellen gegeben und 39 Partricin sowie PSN Antibiotika-Lösung aus Penicillin, Streptomycin und Neomycin zugesetzt. Dann wurde die Platte für 4 Stunden im Brutschrank bei γ7°C und 8 % COβ inkubiert. Anschließend wurde die Flüssigkeit abpipettiert und die Schale mit Kulturmedium gespült. Dann wurden β ml DMEM-Medium mit 1 % FCS, 1 % PSN und β0 μl/ml Partrizin hinzugefügt und die Kultur wurde wieder in den Brutschrank gegeben. Die Kultur wurde dann täglich unter dem Mikroskop beobachtet, bis sich ein zytopathischer Effekt zeigte. Dieser trat in der Regel nach γ bis 4 Tagen auf. Die Zellen wurden dann mit einem Zellschaber geerntet und in ein 50 ml Tube gegeben. Sie wurden bei -70°C eingefroren und wieder aufgetaut, so dass die Zellen zerstört und das Virus freigesetzt wurde. Es folgte eine Zentrifugation über 10 Minuten bei γ00 xg. Der Überstand wurde dann auf frische HEpβ-Zellen in einer Kulturflasche gegeben, in der Annahme, dass der Überstand Viren enthielt und die Zellen infiziert würden. Dieser Vorgang wurde so lange wiederholt, bis eine ausreichende Virusmenge vorhanden war. Parallel wurde eine Probe entnommen, und mit einem Fluoreszenzkit der Firma Biotrin überprüft, ob die Kultur wirklich nur RSV enthielt. Dazu wurde die Probe auf die häufigsten Erreger von Erkrankungen der Atemwege getestet: Influenza A- und -B-Viren, Parainfluenzaviren und Adenoviren. 3.6 Virustitration zur Bestimmung der MOI Um heraus zu finden, wie viel Virus die Kultur enthielt, wurde eine Virustitration durchgeführt. Dazu wurde eine 96-Lochplatte mit Verozellen vorbereitet, wobei 10 μl Zellsuspension in jedes Senkloch gegeben wurden. Der das Virus enthaltende Überstand wurde in 10er-Schritten mit DMEM in Eppendorfhütchen verdünnt, und dann auf die Zellen gegeben. In Reihe 1 wurde das Virus pur auf die Zellen gegeben, in jeder weiteren Reihe wurde das Viruskonzentrat jeweils um den Faktor 10 verdünnt aufgebracht. Die Platten wurden für 48 Stunden bei γ7°C und 8 % COβ im Brutschrank inkubiert. 40 Dann wurden die Kulturen unter dem Mikroskop auf die Entstehung eines zytopathischen Effekts untersucht; zeigen in einer Kultur β/γ der Zellen einen zytopathischen Effekt, kann man laut Poisson-Verteilung davon ausgehen, dass die Kultur mit einer MOI von 1 infiziert wurde. 3.7 Ausverdünnung - Limiting Dilution Die Limiting Dilution ist eine Methode zur Gewinnung von Reinkulturen. Diese Methode wird sowohl in der Zytologie als auch in der Virologie angewandt. Wir nutzten diese Methode immer dann, wenn in einer unserer Kulturen die RSVReplikation deutlich abnahm. Wir setzten neue Kulturen an mit dem Ziel, eine neue Reinkultur zu erhalten. Auf insgesamt zehn 96-Lochplatten wurden HepZellen eingesetzt, welche mit dem infektiösen Überstand aus den infizierten Kulturen beimpft wurden. Auf jede der 96-Lochplatten wurde das Virus in einer anderen Verdünnungsstufe aufgebracht. Wir suchten die Verdünnungsstufe, bei der statistisch gesehen pro Senkloch genau ein infektiöses Agens aufgebracht wurde. Aufgrund von Verteilungswahrscheinlichkeiten nach Poisson ist dies ist in jener Kultur der Fall, in der β/γ der Senklöcher infiziert sind. Diese Kultur betrachteten wir als Reinkultur. Wir verwendeten für unsere weitere Arbeit die Viren eines Senklochs dieser Kultur, die übrigen Kulturen wurden verworfen. [γ1][47][90] 41 3.8 Experimente 3.8.1 Infektion der dendritischen Zellen Für die Infektion der DC wurden diese aufgetaut, jeweils γx 105 Zellen pro Senkloch auf eine 96-Lochplatte gegeben und mit IL-4 stimuliert, bis sie nach zwölf Tagen ausdifferenziert waren. Dann erfolgte die Infektion der Zellen mit γ00 μl des Virusüberstands der verschiedenen RSV-Stämme pro Senkloch. Der Überstand wurde für γ ½ Stunden auf den Zellen belassen und die Kultur im Brutschrank bei γ7°C und 8 % COβ inkubiert. Anschließend wurde der Überstand vorsichtig abpipettiert, Medium++ hinzugefügt und die Kultur zurück in den Brutschrank gegeben. 3.8.2 Infektion der Feederzellen Für die Anzucht auf den Laborzellen wurden Kulturen von Vero-, HEpβ- und A549Zellen vorbereitet und im wie im zuvor beschriebenen Verfahren mit Virusüberstand von Long-, Aβ- sowie Wildtyp-Viren infiziert, wobei die Virusstämme in verschiedenen Verdünnungsstufen auf die Kulturen gegeben wurden. Die Vero-Zellen infizierten wir mit vier verschiedenen Wild-Typ-Viren, so dass wir davon ausgehen können, dass die beobachteten Effekte nicht in der Eigenart eines einzelnen Wild-Typ-Stammes begründet liegen. 3.8.3 Nachweis der Infektion durch F-Protein-ELISA Um die Infektion nachzuweisen wurde ein ELISA mit Antikörpern gegen das FProtein durchgeführt, sowohl auf DC als auch auf den Feeder-Zellen. Das Virus wurde wie oben dargestellt seriell verdünnt, wobei eine Pufferlösung bestehend aus 0.1M Carbonat Puffer pH 9,5, NaHCOγ und NaβCOγ verwendet wurde. Diese Lösungen mit unterschiedlicher Viruskonzentration wurden auf eine Nunc Maxi-sorp ELISA-Platte gegeben und diese wurde über Nacht bei 4°C 42 gecoatet. Am nächsten Tag wurde die Platte dreimal mit je β50 μl PBS-T 0,05% pro Senkloch gewaschen und anschließend mit β50 μl einer Mischung aus PBS-T 0,05 % und 5 % Magermilchpulver pro Senkloch, die für eine Stunde bei Raumtemperatur in den Senklöchern belassen wurde, geblockt. Im Anschluss wurde wieder dreimal mit PBS-T 0,05 % gewaschen. Dann wurden Antikörper gegen das F-Protein (RSV-F 18F1β) in β %-MagermilchPBS-T 0,05 % mit dem Faktor 1000 verdünnt und jeweils 100 μl pro Senkloch für eine Stunde auf die Platte gegeben. Nach erneutem dreimaligem Waschen mit PBS-T 0,05 % wurde anti-mouse HRP (Dako Pβ060), ein anti-Maus Antikörper, an den eine Peroxidase gekoppelt ist, in einer Verdünnung von 1:1000 in β %-Magermilch-PBS-T 0,05 % zu je 100 μl auf die Senklöcher gegeben und bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einer Stunde wurde wieder dreimal mit PBS-T 0,05 % gewaschen und dann 100 μl TMB als Substrat für die Peroxidase auf die Senklöcher gegeben. Nach 10 Minuten wurde die Reaktion mit 100 µl Stop-Lösung beendet und die Platte im ELISA-Reader bei 450 nm ausgelesen. Um die verschiedenen Virusstämme vergleichen zu können suchten wir die Verdünnungsstufen, bei denen 50 % der Zellen eine F-Protein-Expression zeigten bzw. die Titer, bei denen das Halbmaximum der optischen Dichte erreicht wurde. 3.8.4 Schachbrett-Titration Um den Effekt von Long-Strain und Wild-Typ-Viren auf die Zellen hinsichtlich zytopathischen Effekts, Syncytienbildung und F-Protein-Expression vergleichen zu können, führten wir eine Schachbrett-Titration durch. Eine Kultur aus HEpβ-Zellen wurde in einer 96-Lochplatte mit βx105 Zellen pro Senkloch angesetzt. Das Virus wurde in der untersten Reihe in sieben verschiedenen MOIs von 10-4 bis 10β auf die HEpβ-Zellen gegeben. Die MOI war auf Vero-Zellen ermittelt worden. Dann wurden die Virussuspensionen um 50 % verdünnt und auf die folgende Reihe aufgetragen. Dies wurde insgesamt neunmal durchgeführt, so dass wir von jeder MOI ausgehend insgesamt zehn Verdünnungsstufen erhielten. Um die Infektion der Zellen darstellen und messen zu können, wurde die F43 Protein-Expression im Elisa gemessen. Um die Infektion vergleichen zu können ermittelten wir die Titerstufen, bei denen 50 % der Zellen F-Protein exprimierten und somit nachweislich mit RSV infiziert waren. 3.8.5 Ko-Kultur DC + T-Zellen 3.8.5.1 Messung der Proliferation Wir inkubierten die DC β4 Stunden mit Long, Aβ und Wildtyp-Stamm (MOI β0) und brachten sie dann in einer Ko-Kultur mit naiven T-Zellen zusammen. Wir gaben jeweils βx 105 T-Zellen/ Senkloch mit βx104 / Senkloch DC auf eine β4Lochplatte. Eine Kultur aus T-Zellen und nicht infizierten DC legten wir als Kontrolle an. Die Zellen wurden für 5 Tage bei γ7°C und 8 % COβ-Begasung inkubiert, und dann mit 10 µCi/ml γH-Thymidin (γ7 MBq entsprechen 1 mCi/ml) für β4 Stunden radioaktiv markiert. Anschließend wurden die Zellen mit einem Zellerntegerät auf Filterpapiere überführt und diese in Szintillationsröhrchen mit Szintillationsflüssigkeit gegeben. In einem Beta-Counter wurden die radioaktiven Zerfälle pro Minute (Cpm) gemessen. 3.8.5.2 Messung von IFN-γ Es wurden erneut Ko-Kulturen mit DC und T-Zellen angelegt, wobei die niedrigste MOI verwendete wurde, bei der noch eine Infektion auftrat. Nach β4 Stunden Inkubation der DC mit den RSV-Stämmen wurden die naiven T-Zellen in die Kultur dazu gegeben (βx105 T-Zellen/ Senkloch und βx104 dendritische Zellen/ Senkloch) und die Kulturen für weitere γ Tage inkubiert. Wie zuvor wurde ebenfalls eine KoKultur aus naiven T-Zellen und nicht-infizierten DC als Kontrolle angelegt. Nach 7β Stunden wurden Zellen und Medium geernet und für 10 Minuten bei γ00 xg zentrifugiert. In dieser Zeit wurde eine Kulturplatte vorbereitet: in jedes Senkloch wurden jeweils 500 µl eines biotinylierten Antikörpers gegen IFN- pipetiert. Nach der Zentrifugation der Zellsuspension wurden jeweils 50 µl des Überstandes in 44 jedes vorbereitete Senkloch der Kulturplatte gegeben. Die Platte wurde β Stunden bei Zimmertemperatur inkubiert und anschließend dreimal gewaschen. Dann wurden jeweils 100 µl in Puffer gelöstes Streptavidin HRP-Konzentrat in jedes Senkloch gegeben und die Platte für weitere γ0 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Nun wurden je Senkloch 100 µl TMB-Substrat Lösung hinzugefügt und die Platte γ0 Minuten lang lichtgeschützt und bei Raumtemperatur entwickelt. Die Reaktion wurde mit 100 µl Stop-Lösung pro Senkloch beendet und die Absorption bei 550nm im ELISA-Reader ausgelesen. 45 3.9 Material Abluftbank: Heraeus, Hanau Beta-Counter: LKB-Wallak, Freiburg Brutschrank: Heraeus, Hanau Cryo Tubes: Nunc Cryo Tube, 1,8ml; Nunc GmbH & Co.KG, Langenselbold; Best.-Nr. γ6γ401 Kulturplatten: β4-well Multiwell; Falcon/Becton Dickinson, Heidelberg; Best.-Nr.γ5γ047 96-well Multiwell; Falcon/Becton Dickinson, Heidelberg; Best.-Nr.γ5γ9γ6 Lichtmikroskop: Zeiss Olympus CKβ MACS Multistand: Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach Pipetten: Pipette eppendorf reference 10-100μl; Eppendorf AG, Hamburg Pipette eppendorf reference 50-β00μl; Eppendorf AG, Hamburg Finnpipette β00-1000μl; Labsystems 10ml Serological Pipets; Becton Dickinson, Heidelberg; Best.-Nr. γ56551 Pipetus: Pipetus; Hirschmann Laborgeräte; Eberstadt Röhrchen: Blue-MaxTM 50 ml , BD Falcon , Best.-Nr. γ5β070 15 ml conical tube, BD Falcon Sieb: Cell Strainer 40μm Nylon; Falcon/Becton Dickinson, Heidelberg; Best.-Nr. γ5βγ40 Tubes: Safe-Lock-Tubes 1,5ml Eppendorf AG, Hamburg, Best.Nr. 00γ0-1β0.086 Zählkammern: Fuchs-Rosenthal-Zählkammer, BD, Heidelberg Neubauer-Zählkammer, BD, Heidelberg Zellseparator: MiniMacs Seperator; Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach; Best.-Nr.130-042-102 Zellseparator-Säulen: β5MS Columns steril; Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach; Best.-Nr. 1γ0-04β-β01 46 Zentrifugationsröhrchen: Blue Max, 50ml Polypropylene Conical Tube; Falcon/Becton Dickinson, Heidelberg; Best.-Nr. γ5β070 15ml/High-Clarity Polypropylene Conical Tube, 7x1β0mm Style; Falcon/Becton Dickinson, Heidelberg; Best.-Nr. γ5β096 Zentrifuge: Megafuge 1.0 R ; Heraeus Reagenzien: Aminosäuren: L-Glutamin; Biochrom AG, Berlin; Best.-Nr. K0β8β Nicht-essentielle Aminosäuren; Biochrom AG, Berlin; Best.-Nr. K0β9γ Na-Pyruvat; Biochrom AG, Berlin; Cat.-No. L047γ Antibiotika: Kanamycin, 5mg/ml; Biochrom AG, Berlin; Best.-Nr. Aβ51β Partricin, 50μg/ml; Biochrom AG, Berlin; Cat.-No. Aβ81β Antikörper: RSV-F 18F1β Antikörper, DS Diagnostics GmbH, Witten anti-mouse HRP Pβ060, Dako, Hamburg Biocoll: Biocoll Separating Solution, Isotonic solution, Density 1,077g/ml; Biochrom AG, Berlin; Best.-Nr. L6115 CPD: Citrate-phosphate-dextrose solution, Sigma-Aldrich DMEM: Dulbecco´s modified eagle´s medium; Gibco, Karlsruhe DMSO: Dimethyl Sulfoxide, min.99,5%; Sigma-Aldrich FcR-Blocking-Reagenz: Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach; Best.-Nr. 1γ0-059-901 FCS: Fötales Bovines Serum; Biochrom AG, Berlin; Best.-Nr. S0115, Charge 0766G Hepes-Buffer: Hepes-Pufferlösung; Biochrom AG, Berlin; Best.-Nr. L161γ γ GE Healthcare, Freiburg IFN- -ELISA: R&D Systems, Wiesbaden Microbeads: anti-CDγ4 MicroBead Kit human, βxβml; Miltenyi Biotec H-Thymidin: 47 GmbH, Bergisch Gladbach; Best.-Nr. 1γ0-046-70β anti-CD45 RA; Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Best.-Nr. 1γ0-045-901 Nährmedium: VLE-RPMI 1640, mit β,0g/l NaHCOγ, ohne L-Glutamin; Biochrom AG, Berlin; Best.-Nr. F1415 Paraformaldehyd: Riedel-de Haen, Seelze Puffer: Phosphate Buffered Saline -Dulbecco, ohne Ca/Mg; low endotoxin, Biochrom AG, Berlin; Best.-Nr. L18β5 Saponin: Riedel-de Haen, Seelze Türksche Lösung: Fluka Chemie AG, Buchs, Ch 9γ770 Zytokine: GM-CSF; PromoKine, PromoCell GmbH, Heidelberg; Best.-Nr. B-60480 IL-4, rekombinantes humanes IL-4; PeproTech, Hamburg; Best.-Nr. β00-04 Stammzellfaktor; PeproTech, Hamburg; Best.-Nr. γ00-07 TNF-α; R&D Systems GmbH, Wiesbaden; Best.-Nr. β10-TA Zubereitungen: Röhrchen für Nabelschnurblut: 50ml CPD +1ml Hepes Buffer +1ml Kanamycin +1ml Partricin à 7ml in 50ml-Zentrifugationsröhrchen portionieren RPMI ++ 500ml VLE RPMI +5,75ml L-Glutamin +5,75ml nicht-essentielle Aminosäuren +5,75ml Na-Pyruvat +10ml Kanamycin 48 PBS 0,6% 500ml PBS + γml CPD Einfriermedium freeze ββ ml RPMI + 0,5 ml Kanamycin + 5 ml DMSO + ββ,5 ml FCS Zellen: A549-Zellen American Type Culture Collection HEpβ-Zellen American Type Culture Collection Vero-Zellen American Type Culture Collection Viren: RSV-Long-Strain Virologie der Ruhr-Universität Bochum RSV-Aβ American Type Culture Collection 49 4. Ergebnisse Ziel dieser Arbeit ist es zu untersuchen, in wie fern sich Labor-Stämme und WildTyp-Viren in Ihren Eigenschaften bezüglich Infektion von verschiedenen ZellLinien, Expression des F-Proteins sowie Stimulation von T-Zellen in der Ko-Kultur mit den infizierten DC hinsichtlich Proliferation und IFN-gamma-Produktion unterscheiden. 4.1 Infektion der Feederzellen im Vergleich Um die verschiedenen Virusstämme und Feederzellen vergleichen zu können, bestimmten wir die Expression von viralem F-Protein in den infizierten Kulturen im zellgebundenen ELISA. Wir setzten voraus, dass das Maximum der optischen Dichte erreicht wurde, wenn alle Zellen infiziert waren. Um die Virusstämme miteinander vergleichen zu können, bestimmten wir die Titerstufen der einzelnen Virusstämme bei denen das Halbmaximum der optischen Dichte erreicht wurde, also 50 % der Zellen vom Virus infiziert waren. Wir betrachteten die Infektion von Hepβ-Zellen, Vero-Zellen und A549-Zellen durch verschiedene Wildtyp-Viren sowie RSV-Long-Strain und Aβ als Laborstämme. 4.1.1. Infektion der HEp2-Zellen Auf den HEpβ-Zellen konnten wir – wie aufgrund vorheriger Beobachtungen erwartet – einen deutlichen Unterschied im Verhalten der Virusstämme feststellen. Der Long-Strain erreicht das Halbmaximum der optischen Dichte bereits bei einem Titer von 10-7, der Aβ bei einem Titer von 10-5 und der Wildtyp-Stamm bei einem Titer von 10-γ. Dies bedeutet einen um den Faktor 10 000 höheren Titer, um 50 % der Zellen infizieren zu können. (Abbildung 4) 50 2.5 Hep2 Zellen long titr wt titr A2 titr OD 2.0 1.5 1.0 0.5 0 1 10 10 -1 -2 10 10 10 -3 -4 -5 10 -6 10 10 -7 10 -9 -8 10 10 -1 1 -1 0 10 10 10 -1 2 0.0 Titer auf HeP2 Zellen Abbildung 4: Auf HEpβ-Zellen erreichen die Laborstämme das Halbmaximum der Infektion bei niedrigeren Titern als der Wild-Typ-Stamm 4.1.2 Infektion der Vero-Zellen Mit den Vero-Zellen wurde nach dem gleichen Schema verfahren wie mit den HEpβ-Zellen, allerdings wurden die Infektionen nur mit dem Long- und dem Wildtyp-Stamm durchgeführt. Hier ergab sich ein ähnliches Bild, der Long-Strain erreichte das Halbmaximum der optischen Dichte bei einem Titer von 10-5, der Wildtyp-Stamm bei einem Titer von 10-γ, somit bereits bei einem um den Faktor 100 niedrigeren Titer. In der Kultur mit dem Wildtyp-Stamm ist bis zu einem Titer von 10-4 noch keine Infektion messbar. 2.5 Vero Zellen WT titr OD 2.0 long titr 1.5 1.0 0.5 0 1 10 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5 10 -6 10 -7 10 -8 10 -9 10 -1 0 10 -1 1 10 10 -1 2 0.0 Titer auf Vero Zellen Abbildung 5: Die Infektion von Vero-Zellen durch Wild-Typ-Viren benötigt einen höheren Titer als durch den Long-Strain 51 4.1.3 Infektion der A549-Zellen Auf den A549-Zellen wurden die Infektionen ebenfalls nur mit dem Long- und dem Wildtyp-Stamm durchgeführt. Wiederum erreichte der Long-Strain das Halbmaximum der optischen Dichte bei einem Titer von 10-5, der Wildtyp-Stamm bei einem Titer von 10-β, vom WildtypStamm wurde also ein 1000-fach höherer Titer benötigt, um auf 50 % der Zellen zu einer Infektion zu führen. 2.5 A549 Zellen wt titr OD 2.0 long titr 1.5 1.0 0.5 0 1 10 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5 10 -6 10 -8 -9 -7 10 10 10 -1 0 10 -1 1 10 10 -1 2 0.0 Titer auf A549 Zellen Abbildung 6: Auf den A549-Zellen wird das Halbmaximum der Infektion durch den Long-Strain bei deutlich niedrigeren Titern erreicht als bei Infektion durch WildTyp-Viren 4.1.4 Infektion von Vero-Zellen mit verschiedenen WildtypStämmen Die Viren verhielten sich auf allen Kulturen der klassischen Laborzellreihen vergleichbar, so dass davon auszugehen ist, dass dies nicht in den Eigenschaften der Zellen, sondern im Verhalten der Viren begründet liegt. Um ausschließen zu können, dass oben beschriebenes Phänomen aufgrund einer Eigenart des einen verwendeten Wildtyp-Stammes aufgetreten ist, wiederholten wir die Infektion von Vero-Zellen mit vier weiteren Wildtyp-Stämmen, wobei wir bei allen diesen Stämmen ein vergleichbares Ergebnis erhielten. Wir führten die 52 Experimente mit jedem Stamm jeweils sechs Mal durch. Wie schon in den vorherigen Versuchsreihen erreichte der Long-Strain das Halbmaximum bereits bei einem Titer von 10-5, während bei den Wildtyp-Viren das Halbmaximum bei Titern zwischen 10-γ und 10-β erreicht wurde. Also war auch bei den anderen Wildtyp-Stämmen ein um den Faktor 100 bis 1000 höherer Titer notwendig, es handelte sich nicht um eine Eigenart unseres zuerst verwendeten Wildtyp-Stammes. 2.5 long titr OD 2.0 wt 01 wt 06 wt 07 wt 08 1.5 1.0 0.5 -4 -5 -6 -7 10 -4 10 -3 10 -2 10 -1 10 0 10 1 10 10 10 10 10 -8 0.0 Titer auf Vero Zellen Abbildung 7: Auf Vero-Zellen verhalten sich die alle eingesetzten Wild-Typ-Viren vergleichbar: sie benötigen einen höheren Titer als der Long-Strain für eine Infektion 53 -6 10 -5 10 Virus Titer -4 10 -3 10 -2 10 -1 10 10 0 +1 10 Long wt 1 wt 6 wt 7 wt 8 Abbildung 8: Der Long-Strain kann bereits bei einem Titer von 10-5 50 % der Zellen in einer Kultur infizieren, die Wildtypviren benötigen in allen Kulturen höhere Titer 4.1.5 Effekte der Infektion auf Zellkulturen Da wir diese Unterschiede in der Infektiosität feststellen konnten, war nun zu klären, ob die verschiedenen Virusstämme auch unterschiedliche Effekte auf die Zellkulturen haben. 4.1.6 Zytopathischer Effekt und Syncytienbildung Hierzu betrachteten wir die mit Long- und Wildtyp-RSV infizierten HEpβ-Zellen unter dem Mikroskop und stellten fest, dass der Wildtyp-Stamm bei niedrigen MOIs einen größeren zytopathischen Effekt auslöste als der Long-Strain; bei höheren MOIs nahm allerdings auch beim Long-Strain der CPE zu und wurde schließlich ausgeprägter als beim Wildtyp-Stamm. Ebenfalls gut sichtbar waren die Unterschiede in der Syncytien-Bildung. Die Infektion durch den Wildtyp-Stamm hatte eine ausgeprägtere Syncytienbildung zur Folge als die Infektion durch den Long-Strain, wobei die Syncytien wie auch der CPE beim Wildtyp-Stamm bei einer geringeren MOI auftrat als beim Long-Strain. Vergleicht man die Titerstufen, bei denen 50 % der Zellen in der Kultur vom CPE 54 betroffen sind, sieht man, dass der Wild-Typ-Stamm bei sehr viel geringerer Viruslast und höherer Verdünnungsstufe die Syncytienbildung auslöst als der Long-Strain. gering mittel maximal Abbildung 9: Durchlicht-Phasenkontrast-Mikroskopie von RSV-infizierten DC: von links nach rechts nimmt der CPE zu, ist allerdings auf den DC nicht sehr ausgeprägt gering mittel maximal Abbildung 10: Bei ansteigender MOI (von links nach rechts) kommt es in der Hepβ-Kultur zu einem ausgeprägten cytopathischen Effekt mit Kugelzellbildung 55 2048 HeP2 Zytopathischer Effekt long wt 1024 Titer 512 256 128 64 10 -4 10 -3 10 -2 10 -1 10 0 10 1 10 2 MOI Abbildung 11: Long-Strain und Wildtyp-Stamm haben einen vergleichbaren Effekt auf HEpβ-Zellen hinsichtlich der Auslösung des CPE long wt 1024 HeP2 Syncytien 512 256 128 Titer 64 32 16 8 4 2 1 10 -4 10 -3 10 -2 10 -1 10 0 10 1 10 2 MOI Abbildung 1β: Die Syncytien-Bildung in der Kultur tritt beim Wildtyp-Stamm bei höheren Verdünnungsstufen auf als beim Long-Strain 4.2 Produktion des F-Proteins auf DC und HEp2 Weiterhin interessierte uns, ob sich auch die Produktion viraler Proteine zwischen den Virusstämmen unterscheidet. Daher wurde zunächst die Expression des FProteins durch HEpβ-Zellen nach Infektion durch Wildtyp-Stamm und Long-Strain gemessen, wobei wir im Elisa kaum einen Unterschied feststellen konnten; die Kurven, die sich in der Schachbrett-Titration ergaben lagen nahezu übereinander. Da die Laborzellen in Ihren Eigenschaften nicht den natürlichen Zielzellen der RS56 Viren entsprechen, verglichen wir im nächsten Schritt, wie sich die Infektion von dendritischen Zellen durch Wildtyp-RSV von der durch Long-Strain unterscheidet. Als Marker für die Infektion wurde wiederum die Expression des F-Proteins beurteilt. Bei der Infektion der dendritischen Zellen traten deutliche Unterschiede zwischen Wildtyp-Stamm und Long-Strain auf; unter der Infektion durch das Wildtyp-Virus wurde schon bei geringeren MOIs eine höhere Konzentration des F-Proteins messbar als beim Long-Strain, als Vergleichspunkt wählten wir wiederum die Titer, bei denen in 50% der Zellen eine F-Protein-Expression nachgewiesen werden konnte. keine mittlere maximale Abbildung 1γ: nach Infektion der HEpβ durch RSV und anschließender Fixierung kann das F-Protein immunhistochemisch nachgewiesen werden keine mittlere maximale Abbildung 14: Die Infektion der dendritischen Zellen durch Wildtypviren wird durch den Nachweis der Expression des F-Proteins im ELISA sichtbar 57 Hep2 F-Protein Expression 128 long wt Titer 64 32 16 8 10 -4 10 -3 10 -2 10 -1 10 0 10 1 10 2 MOI Abbildung 15: Die Expression des F-Proteins durch Long-Strain und Wild-TypViren ist auf HEpβ-Zellen beinahe gleich long wt2 DC F-Protein Expression 256 128 Titer 64 32 16 8 10 -4 10 -3 10 -2 10 -1 10 0 10 1 10 2 MOI Abbildung 16: Bei einer MOI von 10-β ist beim Wildtyp-Virus bei einem Titer von 1:γβ in 50 % der Zellen eine F-Protein-Infektion nachweisbar; in der Long-Kultur tritt dieser Effekt bei einem Titer von 1:16 auf, also eine Verdünnungsstufe früher 58 4.3 Proliferation von T-Zellen bei Stimulation durch infizierte DC Aufgrund dieser von uns gefundenen Unterschiede zwischen Long-Strain und Wildtyp-Stamm fragten wir uns, ob die Virusstämme auch unterschiedlichen Einfluss auf die Funktionen der Zielzellen nahmen. Eine wichtige Funktion der DC ist die Aktivierung naiver T-Zellen im Lymphknoten. Die DC stimulieren die TZellen, so dass es zur Proliferation kommt. Daher untersuchten wir die Proliferation von T-Zellen in Ko-Kulturen mit DC; wir verglichen Kulturen, welche mit RSV infiziert waren mit nicht-infizierten Kulturen. Es zeigte sich, dass die Proliferationsrate der T-Zellen in den Kulturen, in denen die dendritischen Zellen mit RSV infiziert worden waren, deutlich niedriger war, als in der Kultur, in der die T-Zellen durch nicht infizierte DC stimuliert wurden. Zwischen den verschiedenen Virusstämmen ließ sich aber kein wesentlicher Unterschied feststellen. In der Kultur mit dem Long-Strain wurden 18 000 cpm gezählt, in der Kultur mit dem Aβ ββ 000 cpm und in der Kultur mit dem WildtypStamm β0 000 cpm, während in der Kultur ohne RSV γ5 000 cpm gezählt wurden. 4.4 IFN-γ Produktion in Ko-Kulturen Damit hatten wir bestätigt, dass die T-Zellen in einer Ko-Kultur mit RSV-infizierten dendritischen Zellen eine niedrigere Proliferation zeigten, als in der Ko-Kultur mit nicht-infizierten DC, wie es auch schon von Rothoeft β007 beschrieben wurde. Er hatte in seiner Arbeit eine verminderte Interferon- Produktion in den infizierten Kulturen gemessen. Wir wollten nun untersuchen, ob sich dieser Effekt zwischen RSV-Long und RSV-Wild-Typ-Viren unterscheidet. Wir konnten deutliche Unterschiede zwischen den einzelnen Kulturen feststellen: in der Kultur, in der die DC nicht mit RSV infiziert worden waren, betrug der Anteil der IFN- produzierenden T-Zellen 58 %, während in der Kultur, welche mit dem Wildtyp-Stamm infiziert worden war der Anteil bei nur β4 % lag. In der Kultur, welche mit dem Long-Strain inkubiert worden war, produzierten sogar nur 15 % der T-Zellen IFN- . Die Infektionen waren mit der niedrigsten MOI, welche noch sicher einer Infektion hervorruft durchgeführt worden, welche beim Wild-Typ-Virus deutlich niedriger war als beim Long-Strain. Dennoch zeigte der Long-Strain eine 59 ausgeprägtere Hemmung der IFN- -Produktion als der Wild-Typ-Stamm. 40 cpm[x10³] 30 20 10 ohne Long A2 wt Abbildung 17: Die Infektion durch alle drei RSV-Stämme führt zu einer geringeren Proliferation der T-Zellen in der Ko-Kultur, verglichen mit einer nicht-infizierten Kultur IFN- Expression [%] 70 60 50 40 30 20 10 0 ohne Long wt Abbildung 18: In der Ko-Kultur, welche nicht mit RSV infiziert ist, ist der Anteil der IFN- produzierenden T-Zellen am größten, in der Ko-Kultur mit dem Long-Strain am niedrigsten 60 5. Diskussion Das Respiratory Syncytial Virus ist der bedeutendst Erreger viraler Lungenentzündungen im Kindesalter und eine der häufigsten Ursachen für stationäre Krankenhausaufenthalte bei Säuglingen. [98] Es kann sowohl einen leichten Schnupfen als auch eine lebensgefährliche Bronchiolitis verursachen, und bis heute gibt es keinen zugelassenen Impfstoff, welcher Säuglinge vor dieser Infektion schützen könnte. Ausgangspunkt dieser Arbeit war der Gedanke, dass Virusstämme, die seit ca. 50 Jahren unter Laborbedingungen gezüchtet und vermehrt werden, sich in dieser langen Zeit an ihre Umgebung angepasst haben könnten. Wir stellten uns daher die Frage, in wie fern wir Unterschiede zwischen Labor-Stämme und Wild-TypViren in Ihren Eigenschaften bezüglich Infektion von verschiedenen Zell-Linien, Expression des F-Proteins sowie Stimulation von T-Zellen in der Ko-Kultur mit den infizierten DC hinsichtlich Proliferation und Interferon- -Produktion feststellen können. Um diese Frage zu beantworten haben wir aus Nabelschnurblut gewonnene dendritische Zellen und HeLa-Zellen als klassische Laborzellen sowohl mit Wildtyp-Viren als auch mit den RSV-Laborstämmen infiziert, und die Infektiosität, den zytopathischen Effekt und die Expression des F-Proteins in den verschiedenen Kulturen untersucht. Außerdem legten wir Ko-Kulturen aus RSVinfizierten DC und T-Zellen an, um den Einfluss der Infektion auf die Proliferationsrate der T-Zellen sowie die IFN- -Produktion zwischen den Virusstämmen zu vergleichen. Tatsächlich konnten wir feststellen, dass sich die aktuell im Umlauf befindlichen Wild-Typ-Viren in einigen ihrer Eigenschaften deutlich von den Labor-Stämmen unterscheiden. 5.1 Problematik der Virusanzucht im Labor Bei der Anzucht von Viren im Labor treten immer wieder typische Schwierigkeiten auf. Arbeitet man mit den Labor-Stämmen, so existieren Erfahrungswerte dafür, unter welchen Bedingungen die Infektion einer Kultur eintritt. Eine weitere 61 Vermehrung der Viren in der Kultur ist jedoch nicht sicher, es kann notwendig werden, zwischenzeitig Ausverdünnungen durchzuführen. Dies führt zu einer Selektion von Viren, welche sich gut in den Zellen vermehren lassen. Ursächlich hierfür sind Mutationen, die zu einer Anpassung an die Umgebung führen. Dies ist in der Praxis nicht zu vermeiden, sollte aber bei der Arbeit mit Viren im Labor nicht außer Acht gelassen werden. Die Verwendung von Laborstämmen bringt darüber hinaus den Vorteil, dass man auf die aufwändige Gewinnung von Wild-Typ-Viren verzichten kann. Die Wild-Typ-Viren hingegen müssen zunächst aus Sekret gewonnen werden und eine Verunreinigung durch andere Viren muss ausgeschlossen sein. Ob die gewonnenen Viren tatsächlich in der Lage sind die Zellkulturen zu infizieren ist keineswegs sicher. Gelingt die Infektion ist die weitere Vermehrung der Viren noch problematischer als bei den Labor-Stämmen. Bei unseren Arbeiten kam es nach einigen Passagen immer wieder zu einer Stagnation der Virusreplikation und zu einer schnellen Degeneration der Wild-Typ-Viren. Nicht immer war es möglich, stabile Viren zu isolieren. Vermehrten sich die Viren in der Kultur nicht mehr, führten wir eine Ausverdünnung durch. Wir verwendeten nur eine Kultur weiter, bei der wir davon ausgingen, dass die Infektion durch ein einzelnes infektiöses Agens hervorgerufen wurde. Wir definierten diese Kultur als neue Reinkultur, allerdings kam es so auch bei den Wildtyp-Viren zu einer Selektion. Man muss davon ausgehen, dass durch das Verdünnen und die häufigen Passagen in der Kultur Mutationen innerhalb der Viren auftreten, so dass eine Selektion solcher Viren erfolgt, welche sich unter den Laborbedingungen effektiv vermehren können. Dies dürfte sowohl auf den Long-Strain als auch auf Wild-TypViren zutreffen, wobei der Long-Strain aufgrund der langjährigen Kultivierung im Labor sicherlich größere Veränderungen erfahren hat, als Wild-Typ-Viren innerhalb von Tagen oder Wochen in der Kultur. Im Gegensatz zu den Labor-Stämmen ließen sich die Wild-Typ-Viren in den Kulturen nicht unbegrenzt vermehren. Nach einiger Zeit wurde bei allen Kulturen ein Punkt erreicht, an dem keine infektiösen Partikel mehr gewonnen werden konnten. 62 5.2 Defekte interferierende Partikel stören die Virusreplikation Es steht zu vermuten, dass defekte interferierende Partikel bei dem von uns beobachteten Verhalten der Viren eine Rolle spielen Defekte interferierende Partikel (DIP) entstehen während der Virusreplikation in vitro. Sie sind nichtinfektiöse Mutanten, die normale virale Strukturproteine enthalten, denen aber ein Teil des Virusgenoms fehlt, so dass sie sich nicht selbstständig vermehren können. Vielmehr benötigen DIP zur Replikation ein homologes infektiöses Virus als Helfer. Da die DIP mit dem Helfervirus um die Replikation konkurrieren, beeinflussen sie dessen Vermehrung und damit auch seine Infektiosität. 1978 hatten sich Pringle et al. mit der Persistenz von RSV-Infektionen in vitro beschäftigt. Sie stellten fest, dass es temperatursensible Virusmutanten gibt, die in Zellkulturen eine andauernde Infektion verursachen, wobei die Zellen zwar Virusantigen produzieren, aber wenig infektiöse Viruspartikel freisetzen, und auch deutlich geringere der für RSV typischen Veränderungen der Zelloberfläche auslösen. Sie zeigten mit Hilfe der Immunfluoreszenz, dass die persistierende Infektion nicht dadurch zu erklären ist, dass es ein Gleichgewicht zwischen infizierten und zeitweise refraktären Zellen entstanden ist, vielmehr waren fast alle Zellen der Kultur zum Zeitpunkt der Untersuchung infiziert. [88] Anfang der 1980er Jahre beschäftigten sich dann Mary Treuhaft und Marc Beem intensiv mit Interferenzen bei der Vermehrung des Respiratory Syncytial Virus. Insbesondere stellten sie fest, dass die von ihnen beobachtete Hemmung der Virusvermehrung nicht durch Interferon vermittelt wurde, und dass diese spezifisch war für das Virus, von dem das interferierende Agens abstammte. Sie sahen in ihren Versuchen, dass die interferierende Aktivität sich nach Zentrifugation im Pellet wiederfand, und dass sie durch UV-Bestrahlung inaktiviert werden konnte. Die Interferenz war abhängig von der MOI und konnte durch Ausverdünnung verhindert werden. Hieraus folgerten sie, dass es sich bei dem interferierenden Agens um DIP handeln musste. Außerdem sahen sie, dass HepβKulturen durch DIP vor dem zytopathischen Effekt des Virus geschützt wurden. [117] Heute müssen wir davon ausgehen, dass DIP eine wichtige Rolle bei der Viruspersistenz in den Wirtszellen spielen. 63 Valdovinos und Gómez beschrieben β00γ, dass sie in Zellkulturen die Persistenz von RSV über bis drei Jahre beobachten konnten. Dies hatten sie erreicht, indem sie die Kulturen mit einer Suspension aus infektiösem Virus und DIP beimpft hatten. Die infizierten Zellen zeigten keinen cytopathischen Effekt, produzierten aber geringe Mengen infektiöser Viruspartikel, DIP und auch virales Antigen. Des Weiteren waren sie gegen eine erneute Infektion mit dem ursprünglichen Virus geschützt. [119] Da DIP wohl durch Mutation der Viren während der Virusvermehrung entstehen, wird es nicht zu verhindern sein, dass sie in Zellkulturen erscheinen und die Virusvermehrung hemmen. Eine Ausverdünnung und damit eventuelle Selektion der Viren wird kaum zu vermeiden sein, wenn man dennoch mit diesen Virusstämmen weiter arbeiten will, man sollte sich dieses Effekts jedoch bewusst sein. 5.3 Wildtyp-RSV-infizierte Kulturen exprimieren mehr F-Protein als durch Laborstämme infizierte Kulturen Wir stellten fest, dass die Wildtyp-Viren deutlich mehr F-Protein exprimieren als die Laborstämme. Wir haben uns auf die Frage beschränkt, ob durch die Viren überhaupt eine Expression dieses Proteins ausgelöst wird, und konnten in diesem Punkt quantitative Unterschiede feststellen. Wie diese zustande kommen muss in weitergehenden Untersuchungen geklärt werden. Das F-Protein spielt als Fusionsprotein in der Pathogenese der RSV-Infektion eine wichtige Rolle. Für den Kliniker ist das F-Protein insofern von Bedeutung, als dass es die Angriffsstelle für die RSV-Prophylaxe mit Palivizumab darstellt. In den letzten Jahren wurden immer wieder Fälle beobachtet, in denen Säuglinge trotz der Prophylaxe an RSV erkrankten. Daher wurden verschiedene Untersuchungen zur Ursachenforschung durchgeführt. Immer wieder wurde gezeigt, dass RSVStämme unter dem Selektionsdruck durch Palivizumab Mutationen im Bereich des F-Proteins aufwiesen. Die Antikörper sind gegen eine hochkonservierte Region im Bereich von Antigen A gerichtet, doch offensichtlich kommt es auch in diesem Bereich unter gewissen Bedingungen zu Mutationen. [7][1β9] 64 5.4 Long und A2 haben im Vergleich zu Wildtyp-RSV eine veränderte Infektiosität Wir haben bei der Arbeit mit Long-Strain und Aβ feststellen können, dass diese Virusstämme HEpβ-Zellen bei deutlich niedrigerer Viruslast infizieren als WildtypViren. Es ist vorstellbar, dass die Infektion von HEpβ-Zellen zum Beispiel durch den Long-Strain grundsätzlich anders verläuft als die Infektion von dendritischen Zellen durch ein Wildtyp-Virus. Die Wildtypviren zeigen zwar eine deutlich höhere Expression des F-Proteins, um HEpβ-Zellen infizieren zu können benötigen sie dennoch eine deutlich höhere MOI als die Laborstämme. Bezüglich der Frage, in welcher Eigenschaft der Viren diese unterschiedliche Infektiosität begründet liegt, besteht allerdings noch Klärungsbedarf 5.5 Virusproteine beeinflussen die Infektiosität und Virusausbreitung Wir haben beobachtet, dass sich RSV-Wildtyp-Viren und Laborstämme hinsichtlich ihrer Infektiosität in Zellkulturen unterscheiden. Die Gründe für die von uns beobachteten Unterschiede sind noch nicht geklärt, es ist aber zu vermuten, dass eine Mutation des Virusgenoms diesen Unterschieden zugrunde liegt, welche die Expression von viralen Proteinen verändert. Um einen verlässlichen Vergleich zwischen Wildtyp-Viren und Laborstämmen ziehen zu können, muss eine Mutation als Anpassung an Kulturbedingungen ausgeschlossen werden. Bei der Gen-Sequenzierungen von Wildtyp-RSV durch Kumaria et al. wurde dies dadurch erreicht, dass sie das von Patienten gewonnene nasale Sekret direkt verwendeten. Mittels PCR vermehrten sie das Genom und sequenzierten die PCR-Produkte anschließend. Sie verglichen 14 Wildtyp-Stämme mit 4 alten Laborstämmen, unter anderem mit dem Long-Strain. Sie zeigten, dass sich die Länge des Virusgenoms zwischen den einzelnen Virusstämmen deutlich unterscheidet, und dass die größte Variabilität im Bereich des G-Proteins auftritt, während das F-Protein stärker konserviert ist. [6γ] Die Existenz genetischer Unterschiede zwischen den verschiedenen 65 Virusstämmen wurden somit von Kumara et al. belegt, ob und wie diese Veränderungen aber das in-vitro Verhalten der Viren beeinflussen wurde nicht untersucht. Für das dem RSV verwandte Masern-Virus konnte der Zusammenhang zwischen genetischer Mutation und verändertem Verhalten der Viren in-vitro von Shibara et al. belegt werden [107] Sie stellten fest, dass sich mit der Anzahl der Passagen des Masern-Virus auf Vero-Zellen die Infektiosität veränderte; zunächst nahm die Infektiosität deutlich ab, nach ca. β0 Passagen war sie dann deutlich erhöht. In der Analyse des Virusgenoms konnte ein Aminosäuren-Austausch Histidin gegen Arginin im Hämagglutinin gefunden werden. Außerdem wurde eine herabgesetzte Neuropathogenität bei Infektionen von Mäusen nach mehreren Passagen der Viren auf Vero-Zellen festgestellt. Für das RS-Virus ist bisher keine vergleichbare Untersuchung durchgeführt worden. Diese ist insofern für spätere Arbeiten mit RSV interessant, als dass man Erkenntnisse darüber gewinnt, ob man Wildtyp-RSV in einer Kultur vermehren kann, ohne dass es zu Mutationen kommt. Analog zum Vorgehen von Shibara et al würde man eine Reinkultur eines Wildtyp-Stammes anlegen und einen Teil der gewonnenen Viruspartikel für eine Gen-Sequenzierung verwenden. Mit dem übrigen Material wären dann Vero-Zellen zu infizieren und das Virus über mehrere Passagen weiter zu vermehren. Die erneute Gensequenzierung sollte allerdings nicht nach einer willkürlich festgelegten Anzahl an Passagen durchgeführt werden. Es sollte ein Indikator für das Infektionsverhalten der Viren wie zum Beispiel die minimal benötigte MOI gewählt werden, um den Zeitpunkt der vermutlichen Mutation für die erneute Gensequenzierung zu bestimmen. Mit dieser GenSequenzierung kann dann eine eventuell aufgetretene Mutation festgestellt werden. 66 5.6 Laborstämme infizieren Vero-Zellen effektiver als Wildtyp-RSV Wir konnten bei unserer Arbeit beobachten, dass sich die Wildtyp-Viren auf VeroZellen deutlich schlechter vermehren als die Laborstämme. Dieses Phänomen wurde für ein anderes Paramyxovirus bereits beschrieben und wird auch als diagnostisches Instrument eingesetzt. Beim Hundestaupevirus ist es problematisch im Falle einer Infektion in geringem zeitlichem Abstand zur Impfung zwischen einer echten Infektion und einer Infektion ausgelöst durch das Impfvirus zu unterscheiden. [γγ] Durch Evans et al. konnte gezeigt werden, dass die Impfstämme des Hundestaupevirus auf Epithelzellen wie z.B. Verozellen hohe Titer erreichen, während die Wildtyp-Stämme deutlich höhere Titer auf Makrophagen erreichen, Verozellen aber nicht infizieren können. Kwilas et al fanden β009 bei RS-Viren, welche auf Vero-Zellen angezüchtet worden waren, ein verändertes G-Protein. Dies hatte zur Folge, dass diese Viren humane Atemwegsepitel-Zellen deutlich weniger effektiv infizierten. [65] Im Vergleich mit Viren desselben Virusstamms, welche auf HEpβ-Zellen angezüchtet worden waren, war die Infektiosität um den Faktor 600 bis 1.800 niedriger. Dies beweist, dass die Wahl der Zellreihe, auf der man einen Virusstamm vermehrt, entscheidend ist für die weitere Entwicklung dieses Virusstamm, und ist auch ein Beleg für die Anpassung der Laborstämme an die Kulturbedingungen im Labor. 5.7 Wild-Typ-Viren auf DC Wir beobachteten, dass sich eine Infektion von dendritischen Zellen durch RSV von einer Infektion auf HEpβ-Zellen deutlich unterscheidet, abhängig davon, ob es sich um ein Wild-Typ-Virus oder einen Laborstamm handelte. Die Laborstämme erreichten auf HEpβ-Zellen deutlich höhere Titer als auf dendritischen Zellen, lösten dabei aber einen viel geringeren cytopathischen Effekt aus als die WildtypViren. Andersherum benötigten die Wildtyp-Viren eine deutlich höhere MOI, um die HEpβ-Zellen überhaupt infizieren zu können. Eine ähnliche Beobachtung machten Forcic et al. β009 für Mumps-Virus-Stämme. Sie sahen bei einigen Stämmen typische Veränderungen mit Syncytienbildung, bei anderen dann wieder nur sehr dezente Effekte wie Formveränderungen und 67 Kugelzellbildung. [γ7] Andererseits konnten wir beobachten, dass Wildtyp-RSV im Gegensatz zu Laborstämmen dendritische Zellen bei sehr geringen MOIs effektiv infizieren können. DC spielen in der Immunantwort auf eine Virusinfektion eine entscheidende Rolle. Als antigen-präsentierende Zellen sammeln sie in der Peripherie Antigene; nach Antigenaufnahme wandern sie über Blut und Lymphe in die lymphatischen Gewebe ein um eine weitere Immunreaktion auszulösen. RS-Viren sind in-vitro in der Lage, dendritische Zellen auch bei niedriger Viruslast zu infizieren. Es ist also realistisch anzunehmen, dass sich RSV auch in vivo über eine Infektion der DC im Körper ausbreitet und somit zu einer systemischen Infektion führt. Hiermit lässt sich auch der Nachweis von RSV-RNA im peripheren Blut durch O’Donnell et al., Rohwedder et al. und Yui et al. erklären. [85][9γ][1β6] 5.8 Auch Wildtyp-RSV beeinflusst die Zell-Funktion von Abwehrzellen Eine Infektion von DC durch RSV beeinflusst die Zellen in ihrer Funktion. Diese Beobachtung stand in den letzten Jahren im Zentrum verschiedenster Untersuchungen: Zum Beispiel untersuchten Bartz et al. β00γ den Effekt einer RSV-Infektion von dendritischen Zellen auf T-Zellen. [6] In einer Ko-Kultur von RSV-infizierten, unreifen DC mit naiven T-Zellen beobachteten sie eine verminderte Produktion von IFN- . Dieses deuteten sie als einen möglichen Mechanismus, der eine Umgehung des Immunsystems ermöglichen könnte, so dass nach einer Infektion keine bleibende Immunität entsteht. Zu einem vergleichbaren Ergebnis kam auch Rothoeft β007.[96] In klinischen Untersuchungen von Kindern mit schweren RSVInfektionen wurden sowohl im peripheren Blut als auch im Rachensekret niedrigere Konzentrationen von IFN- gemessen, als bei Kindern mit milden Verläufen. (Aberle et al.[β], Bont et al. [14][15]) Wir konnten nun zeigen, dass die Produktion von IFN- durch die Wildtyp-Viren ebenso gehemmt wird wie durch den Long-Strain, es handelt sich also nicht um eine Eigenart des Long-Strain. Bei den Wildtyp-Viren trat dieser Effekt sogar 68 schon bei einer geringeren MOI auf als in der Kultur mit dem Long-Strain. In einer Reinkultur aus HEpβ-Zellen benötigt das Virus diese Fähigkeit nicht mehr, da es in einer solchen Zellkultur keine Abwehrzellen gibt, die durch das IFN- aktiviert werden können. Dies könnte erklären, warum diese Fähigkeit beim Long-Strain nicht mehr so stark ausgeprägt ist wie bei den Wildtyp-Viren, die auf diesem Weg versuchen die Abwehrreaktion des Wirtsorganismus zu umgehen. Jones et al. beschäftigten sich in einer Untersuchung von β005 ebenfalls mit der Infektion von dendritischen Zellen durch RSV. [58] Sie infizierten, so wie wir, dendritische Zellen mit RSV, verwendeten hierfür allerdings nur den Aβ. Sie beschrieben, dass nach einer Infektion von DC mit RSV zwei Effekte auftraten: entweder kam es zu einer Aktivierung, oder aber zu einer Infektion der dendritischen Zellen. Die Zellen reiften zwar nach der Infektion weiter aus, sie führten aber zu einer weniger ausgeprägten T-Zell-Aktivierung, sie sahen also ein vergleichbares Ergebnis wie wir. Hierin sahen sie eine mögliche Erklärung dafür, dass nach einer RSV-Infektion keine vollständige Immunität entsteht. Zu einem ähnlichen Ergebnis kamen auch Guerrero-Plata et al. in einer Untersuchung von β005. Sie verglichen die Infektion von dendritischen Zellen durch RSV mit einer Infektion durch humanes Metapneumo-Virus. Im Unterschied zu uns verwendeten sie dendritische Zellen, welche sie durch Differenzierung aus Monozyten aus dem peripheren Blut gewannen. [48] Durch RSV wurde auch bei ihnen die T-Zell-Aktivierung gehemmt, eine Infektion der dendritischen Zellen durch humanes Metapneumo-Virus führte zu keiner ausgeprägten Reduktion der T-Zell-Aktivierung. Von allen bisher veröffentlichten Untersuchungen unterscheidet sich unsere Arbeit allerdings in einem grundsätzlichen Punkt: wir führten die Experimente zusätzlich mit Wildtyp-Viren durch und konnten so zeigen, dass die Effekte keine Eigenart der Labor-Stämme sind. Das Wissen, dass in vitro durch RSV die Bildung von IFN- gehemmt und in vivo bei Kindern mit schweren Infektionen eine niedrige IFN- -Konzentration gemessen wird, könnte der Grundstein für ein besseres Verständnis für der Pathogenese der RSV-Infektion sein. Es könnte dabei helfen, eine effektive Diagnostik und Therapie zu entwickeln. Aufbauend auf den bisherigen Erkenntnissen sollte Ziel weiterer Untersuchungen sein zu klären, ob anhand von IFN- -Spiegeln frühzeitig das Risiko für einen schweren Verlauf abzuschätzen ist, so dass gefährdete Patienten entsprechend überwacht und behandelt werden könnten. Es ist zu klären, ob 69 Kinder eine schwere Infektion erleiden, weil sie aufgrund einer Prädisposition niedrigere IFN- Spiegel haben als andere, oder ob es Unterschiede zwischen den einzelnen Virusstämmen gibt, so dass manche die IFN- -Produktion effektiver hemmen und so eine Antwort des Immunsystems umgehen. Sollte sich herausstellen, dass diese Prädisposition bei den Kindern besteht, wäre zu prüfen ob sich hieraus eine Erweiterung der Indikation für die RSV-Prophylaxe mit Palivizumab ableiten lässt. Aus diesen Erkenntnissen wäre also auch ein praktischer Nutzen zu gewinnen, so dass weitere Untersuchungen bezüglich dieser Fragestellung durchgeführt werden sollten. 70 6. Zusammenfassung Das Respiratory Syncytial Virus ist einer der bedeutendsten Erreger von Atemwegsinfektionen überhaupt, und steht auch mehr als 50 Jahre nach seiner Entdeckung noch immer im Mittelpunkt vieler Forschungsarbeiten. Da sich Wildtyp-Viren nur schlecht in Kultur halten lassen, ist die Arbeit mit den LaborStämmen Long und Aβ weit verbreitet. Diese lassen sich verlässlich in HeLa, HEpβ- oder Vero-Zellen vermehren. Nun sind diese Labor-Stämme schon mehr als 50 Jahre alt, so dass wir uns die Frage stellten, ob und wie sich die LaborStämme von den aktuellen Wild-Typ-Viren unterscheiden. Um Unterschiede zu identifizieren infizierten wir sowohl Laborzellen (HEpβ und Vero) als auch dendritische Zellen mit Labor-Stämmen und Wild-Typ-Viren und verglichen die für eine Infektion benötigte Konzentration infektiöser Partikel, den CPE und die Expression des Fusionsproteins sowie den Einfluss der Infektion auf T-Zellen in der Ko-Kultur mit DC. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass wir deutliche Unterschiede zwischen den Labor- und Wild-Typ-Viren gefunden haben, die in Kenntnis der bisherigen Forschungsarbeiten und Untersuchungen schlüssig sind. Long und Aβ konnten die Laborzellen schon bei niedrigeren Konzentrationen infektiöser Partikel infizieren als die Wild-Typ-Viren, benötigten für die Infektion von dendritischen Zellen aber deutlich höhere MOIs. Sie lösten einen weniger ausgeprägten CPE aus, und die Expression des F-Proteins war im Vergleich zu den Wild-Typ-Viren vermindert. Andererseits sahen wir, dass die Wildtyp-Viren schon bei geringer MOI in der Lage sind, dendritische Zellen zu infizieren. Somit ist es realistisch anzunehmen, dass RSV auch in vivo DC infizieren kann und so eine systemische Ausbreitung der Viren möglich ist. Auch konnten wir belegen, dass die Infektion der DC die Zellen in ihrer Funktion beeinflusst. In der Ko-Kultur von RSV-infizierten DC mit T-Zellen war die Proliferation der T-Zellen im Vergleich mit der nicht infizierten Ko-Kultur niedriger, wobei die Unterschiede zwischen den einzelnen Virusstämmen nicht so ausgeprägt waren. Auch die Produktion von Interferon- wurde durch die RSVInfektion verändert. 71 Diese Ergebnisse belegen, dass sich die Labor-Stämme in einigen ihrer Eigenschaften von den aktuellen Wild-Typ-Viren unterscheiden, andere aktuelle Erkenntnisse bezüglich Hemmung der T-Zell-Proliferation und IFN- -Produktion aber auch auf die Wildtyp-Viren zutreffen. Dieses Wissen hilft, die bis heute nicht ganz geklärte Pathogenese der RSV-Infektion besser zu verstehen. Für zukünftige Arbeiten wird man allein schon aus Gründen der Praktikabilität kaum auf die Labor-Stämme verzichten können, da sich mit diesen im Labor sehr viel verlässlicher arbeiten lässt als mit den Wild-Typ-Viren. Dennoch wird je nach Fragestellung die Arbeit mit Wild-Typ-Viren aufgrund der oben genannten Unterschiede sinnvoll sein. 72 7. Literaturverzeichnis [1] AAP Subcommittee on the Diagnosis and Management of Bronchiolitis (β006). Diagnosis and management of bronchiolitis. Pediatrics. 118, 1774– 179γ [2] Aberle, J.H., Aberle, S.W., Dworzak, M.N., Mandl, C.W., Rebhandl, W., Vollnhofer, G., Kundi, M., Popow-Kraupp, T. (1999). Reduced interferongamma expression in peripheral blood mononuclear cells of infants with severe respiratory syncytial virus disease. Am J Respir Crit Care Med. 160, 1β6γ–1β68 [3] Aherne, W., Bird, T., Court, S.D., Gardner, P.S., McQuillin, J. (1970). 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U.Schauer für die Überlassung des Themas sowie für die jederzeit gewährte fachliche Beratung und Unterstützung während der Anfertigung dieser Arbeit; den Mitarbeiterinnen des immunologischen Labors der Kinderklinik Bochum, Frau Angelika Michels und Frau Veronika Baumeister, für die Einweisung in die angewandten Methoden und ihre Hilfsbereitschaft rund um die praktischen Tätigkeiten und natürlich meinen Eltern für ihre Engelsgeduld und die bedingungslose Unterstützung wenn ich sie brauchte. Lebenslauf Persönliche Daten Name Meike Sabine Brätsch Geburtsdatum 05.07.1983 Geburtsort Herne Familienstand ledig Schulausbildung 1990 bis 1994 Gemeinschaftsgrundschule an der Hohenzollernstraße in Recklinghausen 1994 bis 2002 Hittorf Gymnasium Recklinghausen Studium 2003 bis 2009 Medizinstudium im Modellstudiengang der Ruhr -Universität Bochum August 2008 bis Praktisches Jahr mit Wahltertial Pädiatrie im Juli 2009 Allgemeinen Krankenhaus Hagen November 2009 Zweiter Abschnitt der ärztlichen Prüfung Beruflicher Werdegang seit Dezember 2009 Assistenzärztin in der Kinderklinik des Allgemeinen Krankenhauses Hagen
