Inhibition of oncogenic MAPK signaling in - ETH E
Werbung
DISS. ETH NO. 22929 Inhibition of oncogenic MAPK signaling in melanoma triggers a SOX2-dependent stemness program to promote adaptive drug resistance A thesis submitted to attain the degree of DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH (Dr. sc. ETH Zurich) presented by STEFANIE FLÜCKIGER-MANGUAL MSc ETH Biology born on 26.08.1987 citizen of Rohrbachgraben BE accepted on the recommendation of Prof. Dr. Wilhelm Krek (referee) Prof. Dr. Gerhard Christofori (co-referee) Prof. Dr. Matthias Peter (co-referee) 2015 Abstract Melanomas are malign neoplasms originating from melanocytes, the pigment-producing cells in the skin. Melanoma is the deadliest form of skin cancer and affects significantly younger populations than other solid cancers. Until recently, melanomas were infamous for being notoriously resistant to radiation and chemotherapy. Fortunately, clinical successes in immune modulation and the discovery of therapeutically exploitable driver mutations have ushered in a new era in the treatment of metastatic melanoma. Despite this, they continue to impose great clinical hurdles as immune-modulating therapies only benefit a small patient population and small molecules inhibiting onco-proteins are invariably associated with the development of drug resistance. Inter- and intratumoral heterogeneity further complicate clinical disease management. Hence, the long-term prognosis of metastatic melanoma remains poor for most patients. The most frequent mutation in cutaneous melanoma is a missense mutation in the BRAF gene resulting in the substitution of valine to glutamic at position 600. The resulting onco-protein, BRAFV600E, is a hyperactive serine/threonine protein kinase and stimulates constitutive ERK MAPK (mitogen-activated protein kinase) signaling leading to proliferation and enhanced survival of transformed melanocytes. Many drug resistance mechanisms observed in the clinic are directly linked to the intricate architecture of the MAPK pathway and its powerful negative feedback loops. Classically, resistance to mutation-specific small molecule inhibitors such as vemurafenib (PLX4032) has been studied in a long-term setting where the initial drug insult and the resistant tumor entity to be studied lie several weeks or months apart. These studies have uncovered a plethora of acquired escape mechanisms which are commonly referred to as acquired drug resistance, indicating that after an initial drug sensitive phase, a tumor acquired new mutations to drive a drug-resistant relapse. Thus, acquired resistance mechanisms are ”hard-wired” as they are a reflection of genomic alterations in tumor cells. Although much less studied, instances of adaptive drug resistance have been described where cell survival was not driven by changes on the genomic level but rather by a dynamic adaptation of cells to anti-tumor drugs. This suggests that the emergence of resistant lesions in the long-term might be preceded by adaptive response mechanisms in the short-term. This thesis was based on the hypothesis that the acute transcriptional changes elicited by inhibition of oncogenic MAPK signaling are not limited to the repression of classical ERK output programs such as inhibition of proliferation and loss of negative feedback signaling, but also entail gene programs which help cells to cope with drug-related stress. RNA sequencing was employed to identify global gene expression changes upon short-term treatment with PLX4720, the molecular tool analogue of vemurafenib. This approach uncovered a drug-driven induction of a broad stemness and epithelial-tomesenchymal transition (EMT) program including key stemness factors such as SOX2 and CD24. vi These data were confirmed in a panel of human melanoma cell lines and primary human short-term melanoma cultures. Furthermore, the same gene expression changes could be elicited with a MEK inhibitor, confirming that they were not drug-specific artifacts but part of a general adaptive response to inhibition of oncogenic MAPK signaling. To investigate this observation with single-cell resolution, flow cytometry experiments were performed and uncovered that in vitro cultured melanoma cells presented as a dynamic equilibrium of mostly CD24(-) and few CD24(+) cells. Stochastic processes governed this spontaneously emerging heterogeneity. PLX4720-dependent induction of SOX2 was found to be necessary and sufficient to drive the emergence of a CD24(+) subpopulation. Three independent experimental approaches confirmed that the drug-induced CD24(+) cell population had a higher potential to proliferate in the presence of PLX4720. This supports the idea that CD24(+) cells generated in response to the drug constitute treatment-tolerant cells, which can continue to proliferate and possibly acquire hard-wired, resistance-causing mutations. Furthermore, based on a strong body of evidence in the literature suggesting that CD24-expressing cells have a higher migratory and invasive potential than their CD24(-) counterparts, it is possible that PLX4720-generated CD24(+) cells also contribute to metastasis formation in vivo. In summary, this study uncovered the intrinsic potential of in vitro melanoma cultures to generate heterogeneity. The data presented here support the hypothesis that short-term inhibition of oncogenic MAPK signaling can induce adaptive gene expression responses leading to the emergence of a SOX2driven drug-tolerant subpopulation. Conceivably, drug-tolerant cells survive in the presence of antitumor drugs and acquire genomic alterations, leading to bona fide drug-resistant tumor clones. vii Zusammenfassung Melanome sind bösartige Tumoren, die von Melanozyten, den pigmentbildenden Zellen der Haut, stammen. Das Melanom ist die tödlichste Form von Hautkrebs und betrifft deutlich jüngere Bevölkerungsgruppen als andere solide Tumoren. Bis vor kurzem waren Melanome berüchtigt für ihre notorische Resistenz gegen Strahlen- und Chemotherapie. Jüngste klinische Erfolge mit Modulationen des Immunsystems und die Entdeckung von therapeutisch ausnutzbaren Mutationen haben jedoch eine neue Ära in der Behandlung vom metastasierenden Melanom eingeläutet. Trotz allem präsentiert das Melanom noch heute grosse klinische Hürden, da nur eine kleine Patientengruppe von immunmodulierenden Melanomtherapien profitiert und Moleküle zur spezifischen Hemmung von Onkoproteinen ausnahmslos mit der Entwicklung von Medikamentenresistenzen einhergehen. Interund intratumorale Heterogenität kommen weiter komplizierend zum klinischen Krankheitsmanagement hinzu. Für die meisten Patienten mit metastasiertem Melanom bleibt die Langzeitprognose daher schlecht. Die häufigste Mutation beim Melanom der Haut ist eine nicht-synonyme Mutation im BRAF-Gen, welche an der Position 600 zu einer Aminosäuresubstitution von Valin zu Glutaminsäure führt. Das resultierende Onkoprotein, BRAFV600E, ist eine hyperaktive Serin- / Threonin-Proteinkinase und stimuliert die konstitutive Aktivierung der ERK MAPK-Signalkaskade (Mitogen-aktivierte Proteinkinase), was wiederum zur Proliferation und zum Überleben von transformierten Melanozyten führt. Viele in der Klinik beobachteten Resistenzmechanismen gegen Melanommedikamente gehen direkt auf die einzigartige Architektur der MAPK-Signalkaskade und die assoziierten negativen Rückkopplungs-schleifen zurück. Klassischerweise werden Resistenzmechanismen gegen mutationsspezifische Inhibitoren wie Vemurafenib (PLX4032) untersucht, indem unbehandelte Tumore und resistente Tumore verglichen werden. Zwischen den beiden Zeitpunkten können dabei mehrere Wochen oder Monate an Therapie liegen. Solche Studien haben eine Reihe von Mechanismen aufgedeckt, welche Melanomzellen entwickeln, um trotz Krebstherapien zu überlegen. Diese Mechanismen werden gemeinhin als erworbene Medikamentenresistenz bezeichnet. Dieser Begriff weist darauf hin, dass nach einer anfänglichen Phase des Tumorrückgangs, einige Krebszellen Mutationen erworben haben, welche zu einem medikamentenresistenten Rückfall führen. Die erworbene Medikamentenresistenz basiert somit auf genomischen Veränderungen in Tumorzellen. Obwohl hierzu weniger Studien vorliegen, wurden auch Fälle von adaptiver Medikamentenresistenz beschrieben. Hierbei rührt das Überleben von Zellen nicht von Änderungen auf der genomischen Ebene her, sondern wird vielmehr durch eine dynamische Anpassung der Zellen an das Krebsmedikament angetrieben. Dies legt nahe, dass der langfristigen Entstehung von resistenten Tumorablegern kurzfristige, adaptive Mechanismen vorausgehen könnten. viii Diese Dissertation basierte auf der Hypothese, dass die pharmakologische Inhibierung der onkogenen MAPK-Signalkaskade nicht nur zur Hemmung von Tumorzellproliferation und der Aufhebung von negativen Rückkopplungsschlaufen führt, sondern auch zur Expression von Genprogrammen, welche Tumorzellen helfen, in der Präsenz eines Krebsmedikaments zu überleben. Um globale Veränderungen der Genexpression im Rahmen einer kurzzeitigen Behandlung mit PLX4720 (einem Vemurafenib-Analog) zu identifizieren, wurde die gesamte RNA von behandelten Zellen sequenziert. Mit diesem Ansatz wurde aufgedeckt, dass PLX4720 zur Induktion von breiten Genprogrammen führte, welche im Zusammenhang mit Stemness und Epithelialer-zu-mesenchymaler Transition (EMT) standen. Darin enthalten waren auch wichtige Stemness-Faktoren wie SOX2 und CD24. Diese Daten wurden in einer Reihe von menschlichen Melanomzelllinien und primären menschlichen Kurzzeit-Melanomkulturen bestätigt. Weiter konnten die gleichen Genexpressionsveränderungen mit einem MEK-Inhibitor hervorgerufen werden, was bestätigt, dass sie nicht medikamentenspezifische Artefakte sind, sondern Teil einer allgemeinen adaptiven Reaktion auf die Hemmung der onkogenen MAPK-Signalkaskade. Um diese Beobachtung weiter mit Einzelzellauflösung zu untersuchen, wurden Durchflusszytometrie-Experimente durchgeführt, welche aufzeigten, dass in vitro Melanomkulturem in einem dynamischen Gleichgewicht aus hauptsächlich CD24-negativen und wenigen CD24-positiven Zellen bestehen. Stochastische Prozesse unterliegen dieser spontan entstehenden Heterogenität. Weiter wurde gezeigt, dass die PLX4720-abhängige Induktion von SOX2 notwendig und ausreichend ist für die Entstehung einer CD24-positiven Subpopulation. Drei unabhängige experimentelle Methoden bestätigten, dass die Medikamenteninduzierte CD24-positive Zellpopulation ein höheres Potential hatte, sich in der Gegenwart von PLX4720 zu vermehren. Diese Daten unterstützen die Idee, dass CD24-positive Zellen, welche als Reaktion auf ein Krebsmedikament in der Tumorzellpopulation entstehen, behandlungstolerant sind und sich so weiter vermehren und resistenzverursachende Mutationen erwerben könnten. Darüber hinaus deutet der Stand der Literatur darauf hin, dass CD24-exprimierende Zellen ein grösseres invasives Potenzial haben als CD24-negative Zellen. Es ist darum möglich, dass PLX4720-generierte, CD24-positive Zellen auch zur Entwicklung von fernen Tumorablegern im Patienten beitragen. Zusammengefasst zeigte diese Studie auf, dass in vitro Melanomkulturen ein intrinsisches Potential haben, Heterogenität zu erzeugen. Die hier beschriebenen Daten unterstützen die Hypothese, dass kurzzeitige Hemmung der onkogenen MAPK-Signalkaskade zu adaptiven Genexpressionsänderungen führen kann, welche die Entstehung einer SOX2-getriebenen, medikamententoleranten Subpopulation hervorrufen. Es ist denkbar, dass therapietolerante Zellen für eine längere Zeit überleben, in der Gegenwart von Anti-Tumor-Medikamenten proliferieren und genetische Veränderungen erwerben, und sich schlussendlich zu bona fide therapieresistenten Tumorklonen entwickeln. ix
