Tumor Counterattack: Apoptose-vermittelte
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Tumor Counterattack: Apoptose-vermittelte Immunsuppression durch Tumore von der Fakultät für Geo- und Biowissenschaften der Universität Stuttgart zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) genehmigte Dissertation Vorgelegt von Frederik Igney aus München Hauptberichter: Prof. Dr. Peter Scheurich Mitberichter: Prof. Dr. Peter H. Krammer Tag der mündlichen Prüfung: 3. Dezember 2002 Deutsches Krebsforschungszentrum Heidelberg 2002 Hiermit erkläre ich, dass ich diese Arbeit selbständig verfasst und keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel verwendet habe. Heidelberg, Oktober 2002 DANKSAGUNG Mein Dank gilt besonders meinem Doktorvater Prof. Peter H. Krammer für seine stete Unterstützung sowie für die Überlassung des Themas und die Betreuung dieser Arbeit, die es mir erlaubt hat, meine Kenntnisse im biologisch-medizinischen Bereich zu erweitern. Prof. Peter Scheurich möchte ich für die unkomplizierte Betreuung von Seiten der Universität Stuttgart danken. Prof. Hermann Bujard und seinen Mitarbeitern danke ich für die Überlassung der Plasmide für das tet-System und für die Unterstützung der damit verbundenen Experimente. Prof. Klaus Pfeffer danke ich für die Bereitstellung der p47phox-/--Mäuse. Allen Mitarbeitern des Zentralen Tierlabors des DKFZ danke ich für die zuverlässige Betreuung der Tiere und die hervorragende Zusammenarbeit. Ich danke allen Mitarbeitern des Forschungsschwerpunkts Tumorimmunologie, ganz besonders den Mitarbeitern der Abteilung Immungenetik (G0300), für ihre ständige Hilfsund Diskussionsbereitschaft und das sehr gute Arbeitsklima. Besonders danke ich meinen Eltern für ihre selbstlose Unterstützung während meiner gesamten Ausbildung. Inhalt 5 INHALT ABKÜRZUNGEN ....................................................................................................... 8 ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................................10 ABSTRACT...............................................................................................................12 1. EINLEITUNG ..................................................................................................14 1.1 Immunevasion von Tumoren .................................................................................... 14 1.1.1 Tumore und das Immunsystem ................................................................................ 14 1.1.2 Mechanismen der Immunevasion von Tumoren...................................................... 15 1.2 Apoptose ...................................................................................................................... 20 1.2.1 Die Apoptose-Signalwege........................................................................................ 20 1.2.2 Apoptose im Immunsystem...................................................................................... 22 1.2.3 Die Bedeutung von Apoptose für Krebserkrankungen ............................................ 25 1.3 Apoptose-vermittelte Immunsuppression durch Tumore (Tumor Counterattack) ...................................................................................................................................... 30 1.3.1 Fakten, die für die Existenz von Tumor Counterattack sprechen ............................ 30 1.3.2 Fakten, die gegen die Existenz von Tumor Counterattack sprechen ....................... 32 1.3.3 Mögliche Mechanismen der Abstoßung von CD95L+ Tumoren ............................. 33 1.3.4 Faktoren, die Tumor Counterattack beeinflussen .................................................... 33 1.4 Aufgabenstellung ........................................................................................................ 35 2. MATERIAL UND METHODEN .......................................................................36 2.1. Material ....................................................................................................................... 36 2.1.1. Mäuse ....................................................................................................................... 36 2.1.2. Zellen........................................................................................................................ 36 2.1.3. Bakterienstämme...................................................................................................... 36 2.1.4. Vektoren ................................................................................................................... 37 2.1.5. PCR-Primer .............................................................................................................. 37 2.1.6. Antikörper ................................................................................................................ 38 2.1.7. Enzyme und Chemikalien ........................................................................................ 38 2.1.8. Medien und Lösungen.............................................................................................. 39 2.1.9. Zellkulturmedien ...................................................................................................... 39 2.1.10. Kits ........................................................................................................................... 40 2.1.11. Geräte und sonstige Materialien............................................................................... 40 2.2. Molekularbiologische und biochemische Methoden ............................................... 42 2.2.1. Amplifikation von Plasmid-DNA ............................................................................ 42 2.2.2. Restriktionsanalyse von DNA.................................................................................. 43 2.2.3. Agarose-Gelelektrophorese...................................................................................... 43 2.2.4. Isolierung von Gesamt-RNA aus eukaryontischen Zellen....................................... 43 6 Inhalt 2.2.5. RT-PCR.................................................................................................................... 43 2.2.6. FITC-Markierung von Antikörpern ......................................................................... 44 2.2.7. DNA-Isolierung aus Mausschwänzen...................................................................... 45 2.3. Zellbiologische Methoden .......................................................................................... 46 2.3.1. Kultivierung eukaryontischer Zellen........................................................................ 46 2.3.2. Transfektionen.......................................................................................................... 47 2.3.3. Zytotoxizitätstests..................................................................................................... 48 2.3.4. Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie (FACS)............................................ 49 2.3.5. Tumor-spezifische Aktivierung von T-Zellen in vitro (MLTR) .............................. 49 2.3.6. Aufreinigung von T-Zellen aus einer MLTR........................................................... 50 2.4. Tierexperimentelle Methoden ................................................................................... 51 2.4.1. Zucht und Typisierung von TCRPKO-Mäusen ....................................................... 51 2.4.2. Zucht und Typisierung von iNOS-/-- und p47phox-/--Mäusen.................................. 52 2.4.3. Tumorapplikation und Auswertung des Tumorwachstums ..................................... 53 2.4.4. Präparation von Tumoren, Milz und Lymphknoten zur ex vivo Analyse ................ 53 2.4.5. Isolation von Neutrophilen....................................................................................... 53 3. ERGEBNISSE ................................................................................................55 3.1. Auswirkung der CD95L-Expression von Tumoren auf Tumor-spezifische TZellen in vitro .............................................................................................................. 55 3.1.1. Charakterisierung der Tumorzelllinien .................................................................... 55 3.1.2. CD95L-Expression von Tumoren verhindert die Generierung von Tumorspezifischen T-Zellen in vitro.................................................................................. 56 3.1.3. Tumor- und T-Zellen besitzen wechselseitige Zytotoxizität.................................... 59 3.1.4. Kostimulation mit B7 hat keinen nachweisbaren Einfluss auf die Generierung Tumor-spezifischer T-Zellen ................................................................................... 61 Einfluss des CD95L-Expressionsniveaus auf die Abstoßung von CD95L+ Tumoren in Mäusen ................................................................................................... 63 3.2.1 Generierung und Charakterisierung von LKC-CD95L-Klonen mit unterschiedlicher Zytotoxizität............................................................................................................. 63 3.2.2 LKC-CD95L-Klone wachsen in Nacktmäusen nur langsam ................................... 65 3.2.3 LKC-CD95L-Klone werden in TCRPKO-Mäusen abgestoßen............................... 67 3.2. Einfluss des Zeitpunkts der CD95L-Expression auf die Abstoßung von CD95L+ Tumoren in Mäusen ................................................................................................... 68 3.3.1 Generierung und Charakterisierung von LKCR-tetCD95L und LKCR................... 68 3.3.2 LKCR-tetCD95L wird in Nacktmäusen nach CD95L-Induktion abgestoßen ......... 70 3.3.3 Nach CD95L-Induktion wird LKCR-tetCD95L auch in NOD/SCID-Mäusen abgestoßen ............................................................................................................... 72 3.3.4 CD95L-Induktion führt zur Abstoßung von LKCR-tetCD95L in TCRPKO-Mäusen ................................................................................................................................. 74 3.3. 3.4. Rolle der Neutrophilen bei der Abstoßung von CD95L+ Tumoren ....................... 78 3.4.1 Generierung und Charakterisierung von B16-CD95L und B16-neo ....................... 78 3.4.2 Neutrophile besitzen in vitro keine Zytotoxizität gegenüber Tumorzellen.............. 79 3.4.3 Die Abstoßung von CD95L+ Tumoren ist unabhängig von iNOS und p47phox..... 80 Inhalt 7 4. DISKUSSION..................................................................................................83 4.1. Auswirkung der CD95L-Expression von Tumoren auf Tumor-spezifische TZellen in vitro .............................................................................................................. 83 4.2. Einfluss des Niveaus und des Zeitpunkts der CD95L-Expression auf die Abstoßung von CD95L+ Tumoren ............................................................................ 86 4.3. Rolle der Neutrophilen bei der Abstoßung von CD95L+ Tumoren ....................... 90 5. LITERATUR....................................................................................................92 8 Abkürzungen ABKÜRZUNGEN AICD aktivierungsinduzierter Zelltod (activation-induced cell death) bio Biotin bp Basenpaare BSA Rinderserumalbumin cDNA komplementäre DNA cpm Zählereignisse pro Minute crmA cytokine response modifier A CTL zytotoxischer T-Lymphozyt (cytotoxic T lymphocyte) DISC Tod-induzierender Signalkomplex (death-inducing signalling complex) DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxyribonukleosid-triphosphat dsDNA doppelsträngige DNA E/T Effektor/Ziel (Effektor/Target) EDTA Ethylendiamintetraessigsäure FCS fötales Kälberserum FITC Fluoresceinisothiocyanat ha Hamster HEPES N-(2-Hydrocyethyl)piperazin-N'-2-Ethansulfonsäure i.p. intraperitoneal Ig Immunglobulin iNOS induzierbare NO-Synthase LZ Leucin-Zipper MACS magnetisch aktivierte Zellsortierung (Magnetic Activated Cell Sorting) MLTR gemischte Lymphozyten-Tumor-Reaktion (Mixed Lymphocyte Tumor Reaction) MuLV murines Leukämievirus NOD nicht-fettleibig diabetisch (nonobese diabetic) PI Propidiumiodid PMA Phorbol-12-myristat-13-acetat RNA Ribonukleinsäure Abkürzungen 9 ROI reaktive Sauerstoffspezies (reactive oxygen intermediates) rpm Umdrehungen pro Minute RT-PCR reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion rtTA reverser Transaktivator (tet-System) s.c. subkutan SCID schwere kombinierte Immundefizienz (severe combined immunodeficiency) SDS Natriumdodecylsulfat Ta Annealing-(Anlagerungs-)Temperatur TCR T-Zellrezeptor TCR tg T-Zellrezeptor transgen TCRPKO T-Zellrezeptor transgen Perforin knockout TIL Tumor-infiltrierender Lymphozyt TNF Tumornekrosefaktor TRAIL TNF-related apoptosis-inducing ligand 10 Zusammenfassung ZUSAMMENFASSUNG Tumorzellen wehren sich möglicherweise nicht nur passiv gegen eine Zerstörung durch das Immunsystem. Viele Tumore exprimieren CD95L, mit dessen Hilfe sie Tumor-infiltrierende Lymphozyten aktiv töten und so die anti-Tumor Immunantwort unterdrücken könnten - ein Phänomen, das Tumor Counterattack genannt wird. Um die Auswirkungen der CD95L-Expression von Tumoren auf Tumor-spezifische T-Zellen genauer zu charakterisieren, wurde in dieser Arbeit die Tumor-Counterattack-Situation zunächst in einem Modellsystem in vitro nachgestellt. Dazu wurden einerseits T-Zellen von anti-Kb T-Zell-Rezeptor-transgenen Perforin-knockout (TCRPKO)-Mäusen und andererseits verschiedene Tumorzelllinien eingesetzt, die als Modell-Tumorantigen das MHC-Molekül Kb exprimieren. Dabei bestand eine wechselseitige Zytotoxizität zwischen dem CD95L+ Tumor und den aktivierten anti-Tumor T-Zellen. Die CD95L-Expression der Tumorzellen verhinderte in gemischten Lymphozyten-Tumor-Reaktionen die Generierung von zytotoxischen anti-Tumor T-Zellen. Sie hatte aber keinen Einfluss auf die Lyse des Tumors durch aktivierte T-Zellen. Ein Einfluss von Kostimulation mit B7 auf Tumor Counterattack konnte in vitro nicht nachgewiesen werden. Obwohl in humanen CD95L+ Tumoren vermehrt apoptotische T-Zellen gefunden werden und auch in-vitro-Befunde für die Existenz von Tumor Counterattack sprechen, führt die CD95LExpression zur Abstoßung oder einem Wachstumsnachteil der Tumore in Mäusen. Zwei wesentliche Faktoren, die die Auswirkung der CD95L-Expression auf Tumoren in vivo beeinflussen konnten und daher für diese kontroverse Situation verantwortlich gemacht wurden, waren das CD95L-Expressionsniveau und der Zeitpunkt der CD95L-Expression. Um den Einfluss des CD95L-Expressionsniveaus auf die Abstoßung von CD95L+ Tumoren in Mäusen zu untersuchen, wurden zunächst Tumorzelllinien generiert, die unterschiedliche Mengen von CD95L konstitutiv exprimieren. In Nacktmäusen wuchsen diese Tumorzelllinien deutlich langsamer als der CD95L- Kontrolltumor. Das CD95L-Expressionsniveau hatte keinen nachweisbaren Einfluss auf die Wachstumsgeschwindigkeit der CD95L+ Tumore. In TCRPKO-Mäusen wuchsen sie gar nicht oder nur verzögert. Um zusätzlich den Einfluss des Zeitpunktes der CD95L-Expression untersuchen zu können, wurde eine CD95-resistente Zelllinie generiert, in der mit Hilfe des tet-Systems eine CD95LExpression induziert werden konnte. Diese Zelllinie wurde in Nackt-, NOD/SCID- oder TCRPKO-Mäuse injiziert. In allen Mausstämmen wurden etablierte Tumore nach CD95LInduktion schnell und mit ähnlicher Geschwindigkeit abgestoßen. Eine CD95L-Expression zu einem späteren Zeitpunkt in einem etablierten Tumor führte also genauso zur Abstoßung wie Zusammenfassung 11 eine konstitutive Expression. Eine geringere CD95L-Induktion verzögerte die Abstoßung der Tumore nur minimal. Bei der Abstoßung von CD95L+ Tumoren in Mäusen handelt es sich folglich nicht um ein Artefakt durch Überexpression. Die Abstoßung hängt außerdem nicht von Ereignissen zu Beginn der Tumorentstehung ab. In zahlreichen Studien wurden Neutrophile für die Abstoßung von CD95L+ Tumoren verantwortlich gemacht. Es wurde daher in vitro untersucht, ob Neutrophile selektiv gegenüber CD95L+ Tumorzellen zytotoxisch sind. In Zytotoxizitäts-Tests konnte keine Lyse von CD95L+ oder CD95L- Maus-Tumorzelllinien durch murine oder humane Neutrophile beobachtet werden. Um zu klären, welchen Zytotoxizitäts-Mechanismus Neutrophile benutzen, um CD95L+ Tumore abzustoßen, wurde das Wachstum von CD95L+ Tumoren in iNOS-/-- und p47phox-/--Mäusen untersucht. In beiden knockout-Mausstämmen wuchsen die CD95L+ Tumore und die Kontrolltumore genauso schnell wie in Wildtyp-Mäusen. Die phagozytäre NADPH-Oxidase (p47phox) und iNOS sind also bei der Abstoßung der CD95L+ Tumore nicht ausschließlich involviert. Insgesamt ist damit die Apoptose-vermittelte Immunsuppression von Tumoren (Tumor Counterattack) ein möglicher und plausibler Immunevasionsmechanismus von Tumoren, die Relevanz für die Situation in vivo ist aber offen. Eine weitere Aufklärung dieser komplexen Zusammenhänge ist für die Tumorimmunologie und die Krebstherapie von großer Bedeutung. 12 Abstract ABSTRACT Tumor cells may not only passively resist destruction by the immune system. Many tumors express CD95L and may also actively kill tumor-infiltrating lymphocytes to suppress the antitumor immune response - a phenomenon called "tumor counterattack". To characterize the effect of CD95L-expression of tumor cells on tumor-specific T cells, we established a model to mimic the tumor counterattack situation in vitro. In this model T cells from anti-Kb T cell receptor transgenic perforin knockout (TCRPKO) mice and tumor cell lines expressing the MHC molecule Kb as a model tumor antigen were used. The CD95L+ tumor cells and the activated anti-tumor T cells were able to kill each other. CD95L expression of the tumor cells inhibited the generation of cytotoxic anti-tumor T cells in mixed lymphocyte tumor reactions. However, it did not inhibit the lysis of the tumor cells by activated T cells. Costimulation by B7 did not influence the tumor counterattack situation in vitro. Although in human CD95L+ tumors increased apoptosis of T cells can be found and in vitro experiments support the tumor counterattack hypothesis, in mice CD95L+ tumors are rejected or grow more slowly than CD95L- tumors. Two factors that could influence the outcome of CD95L expression on tumors in vivo and thus could account for the controversial situation, were the level and the time-point of CD95L expression. To investigate the influence of the CD95L-expression level on the rejection of CD95L+ tumors in mice, tumor cell lines constitutively expressing different levels of CD95L were generated. The CD95L expression level had no influence on the growth rate of CD95L+ tumors in nude mice. In contrast, growth of CD95L- control tumors was much faster. In TCRPKO mice the CD95L+ cell lines did not form tumors. To investigate the influence of the time-point of CD95L expression, we generated a CD95resistant cell line in which CD95L can be induced via the tet-system. This cell line was injected into nude, NOD/SCID and TCRPKO mice. In all mouse strains induction of strong CD95L expression in established tumors lead to rapid rejection of the tumors. Induction of lower CD95L expression levels delayed tumor rejection only minimally. Therefore, neither the CD95L expression level nor the time-point of CD95L expression influenced the rejection of CD95L+ tumors substantially. These results demonstrate that rejection of CD95Lexpressing tumors in mice is not an overexpression artefact and does not depend on events at the onset of tumor progression. Various studies indicated that CD95L+ tumors are rejected by neutrophils. Hence we investigated whether neutrophils selectively kill CD95L+ tumor cells in vitro. In cytotoxicity Abstract 13 assays no lysis of murine tumor cells by murine or human neutrophils could be found. CD95L+ tumor cells were not killed specifically by neutrophils. To clarify which cytotoxicity mechanism neutrophils use that might lead to rejection of CD95L+ tumors, we investigated growth of CD95L+ tumors in iNOS-/- and p47phox-/- mice. In both knockout strains the growth rate of CD95L+ and control tumors was the same as in wildtype mice. Therefore, the phagocytic NADPH oxidase and iNOS are each not essential for the rejection of CD95L+ tumors in mice. Taken together, apoptosis-mediated immunosuppression (tumor counterattack) is a plausible immune escape mechanism of tumors. However, its importance for the in vivo situation remains to be determined. Further investigation of this complex situation is highly relevant for tumor immunology and cancer therapy. 14 Einleitung 1. EINLEITUNG 1.1 Immunevasion von Tumoren 1.1.1 Tumore und das Immunsystem Das Immunsystem hat die Aufgabe, Pathogene aufzuspüren und zu beseitigen, die dem Organismus schaden könnten. Außerdem überwacht es transformierte Zellen, die zu Krebs führen können (Smyth et al., 2001; Sogn, 1998). Die wichtigsten Immunzellen für die Überwachung von Tumoren sind T-Zellen. T-Zellen gehören zur adaptiven Immunität. Nach der Erkennung eines Antigens auf einem Tumor mittels des T-Zell-Rezeptors (TCR) können aktivierte CD8+ T-Zellen Tumorzellen töten und werden daher als zytotoxische T-Zellen bezeichnet. Eine Untergruppe der CD4+ T-Zellen, die Th1 Zellen, helfen bei der Aktivierung von CD8+ T-Zellen. Eine andere CD4+ Untergruppe, die Th2-Zellen, stimulieren eine humorale Immunantwort und unterdrücken die Entwicklung einer Th1-Antwort. CD4+ Zellen können auch zytotoxische Aktivität zeigen. CD8+ und CD4+ T-Zellen erkennen mit dem TCR Antigene, die als Peptide von Haupthistokompatibilitäts-Komplex-(MHC)-Molekülen der Klasse I beziehungsweise Klasse II präsentiert werden. Zahlreiche Tumorantigene, die von T-Zellen erkannt werden, sind identifiziert worden (Boon and van der Bruggen, 1996; Houghton et al., 2001; Rosenberg, 2001). Einige dieser Antigene werden ausschließlich von Tumoren exprimiert und werden daher Tumor-spezifische Antigene genannt. Diese Antigene entstehen durch Mutation oder Translokation von zellulären Genen (z.B. β-Catenin, Cdk4, Ras). Diese Mutationen können direkt an der Karzinogenese beteiligt sein. Eine weitere Gruppe von Antigenen sind die Tumor-assoziierten Antigene, die nicht nur von Tumorzellen, sondern auch von anderen Zellen im Körper exprimiert werden. Onkospermatogene Antigene (z.B. MAGE, BAGE, GAGE) werden von einer Reihe epithelialer Tumoren und auch in Hoden und Plazenta exprimiert. Überexprimierte nicht-mutierte Proteine (z.B. p53, Her2/neu) können ebenso als Tumorantigene für T-Zellen dienen. Außerdem wurden Tumor-infiltrierende T-Zellen identifiziert, die auf Differenzierungsantigene reagieren, die sich sowohl auf normalen Melanozyten als auch auf Melanomen befinden (z.B. MART-1/Melan-A, Tyrosinase, gp100). Zudem werden Antigene von onkogenen Viren auf Tumorzellen präsentiert. Die Expression von Tumorantigenen kann innerhalb eines Tumors heterogen sein, und ein einzelner Patient kann Immunreaktionen gegen viele Antigene entwickeln (Lee et al., 1999; Wortzel et al., 1983). Zwei verschiedene Modelle für die Immunantwort gegen Tumore wurden aufgestellt: das Konzept der „Immunüberwachung“ („immunosurveillance“) und das „Gefahr“-Modell Einleitung 15 („danger model“). Nach der Immunüberwachungs-Hypothese werden Tumore, die Antigene exprimieren, vom Immunsystem als „nicht-selbst“ angesehen, und eine der Hauptaufgaben des Immunsystems ist es, zu überwachen, ob im Körper maligne Zellen vorhanden sind, und diese dann zu zerstören (Burnet, 1970). Nach dem „Gefahr“-Modell setzt das Immunsystem professionelle Antigen-präsentierende Zellen als Wächter für Gewebeschäden ein. Beim Auftreten von Gefahrensignalen stimulieren die Antigen-präsentierenden Zellen, z.B. dendritische Zellen, aktivierte Makrophagen und B-Zellen, eine T-Zell-Antwort. Krebszellen erscheinen dem Immunsystem nicht direkt als Gefahr, so dass die T-Zellantwort gegen Tumore oft nicht eingeleitet wird (Fuchs and Matzinger, 1996). Auch Natürliche Killer(NK)-Zellen des angeborenen Immunsystems spielen eine wichtige Rolle in der Immunüberwachung von Tumoren (Smyth et al., 2001). NK-Zellen töten MHCKlasse-I-defiziente Zellen, ein Phänomen, das zur „Fehlendes Selbst“-Hypothese gehört (Pardoll, 2001). Die NK-Zell-Aktivität wird durch ein Gleichgewicht von aktivierenden und inhibierenden Signalen kontrolliert. Weitere Zellen der angeborenen Immunität, die an der Immunreaktion gegen Tumore beteiligt sind, sind Makrophagen und Neutrophile (Bonnotte et al., 2001; Di Carlo et al., 2001; Elgert et al., 1998; Lollini and Forni, 1999). Sie können Tumore durch direktes Töten der Tumorzellen, durch Zerstörung der Blutgefäße und der Matrix des Tumors und durch Inhibition der Angiogenese abstoßen. Außerdem präsentieren sie Tumorantigene und können andere Immunzellen, wie zytotoxische T-Zellen, NK-Zellen oder Antigen-präsentierende Zellen, stimulieren. Im Gegensatz dazu können inflammatorische Zellen auch durch Produktion von Tumorwachstumsfaktoren und durch Stimulation der Angiogenese zur Tumorprogression beitragen. Makrophagen und Neutrophile werden durch die Expression von Adhäsionsmolekülen auf Endothelzellen und durch chemotaktische Faktoren zum Tumor gelockt. 1.1.2 Mechanismen der Immunevasion von Tumoren Trotz der Antigenpräsentation von malignen Zellen und der Gegenwart von Immunzellen, die gegen diese Zellen reagieren könnten, wird das Immunsystem in vielen Fällen nicht aktiviert, sondern „ignoriert“ den Tumor (Chen, 1998; Sogn, 1998). Nach dem „Gefahr“-Modell werden in dieser Situation Antigen-präsentierende Zellen nicht aktiviert, weil Gefahrensignale fehlen (Fuchs and Matzinger, 1996). Andere Faktoren können ebenso zur immunologischen Ignoranz beitragen. Es wurde gezeigt, dass Tumorzellen, die nicht in die Lymphknoten wandern und T-Zellen nicht direkt aktivieren, vom Immunsystem ignoriert werden 16 Einleitung (Ochsenbein et al., 1999; Ochsenbein et al., 2001). Außerdem werden Tumore, die in immunprivilegierten Regionen wie dem Gehirn oder dem Auge wachsen, nicht vom Immunsystem überwacht (Rocha et al., 1998). Die Herunterregulation von Adhäsionsmolekülen in malignem Gewebe kann die Immuninfiltration inhibieren und damit zur immunologischen Ignoranz beitragen (Ishido et al., 2000; Onrust et al., 1996; Piali et al., 1995). Es wurde auch gezeigt, dass das Tumorstroma eine wichtige Rolle spielt (Ochsenbein et al., 2001; Singh et al., 1992) und als eine physische Barriere zwischen Tumor und Immunzellen fungieren könnte. Das Wachstum von antigenen Tumoren in der Gegenwart von potentiell reaktiven Immunzellen kann nicht durch immunologische Ignoranz allein erklärt werden. Ein Hauptziel der Immuntherapie von Krebs ist es, eine anti-Tumor Immunantwort zu generieren, z.B. durch Vakzinierung mit Krebszellen, die mit Antigen-präsentierenden Zellen fusioniert wurden, Tabelle 1: Mechanismen der Immunevasion von Tumoren Strategie Mechanismus Ignoranz Fehlen von Gefahren-Signalen Fehlen von Tumorantigenen in lymphoiden Organen Wachstum in immunprivilegierten Regionen Fehlen von Adhäsionsmolekülen physische Barriere durch Stroma Defekte Antigenpräsentation Mutation oder Herunterregulation von Tumorantigenen Mutation oder Herunterregulation von MHC-Genen Defekte in der Antigenprozessierung (z.B. TAP-, LMPDefizienz) Expression von immunsuppressiven Molekülen Zytokine (TGF-β, IL-10, VEGF etc.) Prostaglandine RCAS1 Induktion von Toleranz Anergie-Induktion (Fehlen kostimulatorischer Moleküle) Immun-Abweichung regulatorische T-Zellen T-Zell-Deletion Apoptose-Resistenz Expression anti-apoptotischer Moleküle Herunterregulation/Mutation pro-apoptotischer Moleküle Tumor Counterattack (?) CD95L-Expression Expression anderer Todesrezeptorliganden Einleitung 17 oder durch Transfer von Tumor-spezifischen T-Zellen. Allerdings stimulieren viele dieser Ansätze keine effiziente Immunantwort, oder die Tumore wachsen trotz der Gegenwart einer Immunreaktion weiter (Rosenberg, 2001; Smyth et al., 2001; Wick et al., 1997). Viele Mechanismen wurden identifiziert, die Tumore dazu benutzen, der Abstoßung zu entkommen (Tabelle 1) (Antonia et al., 1998; Gilboa, 1999; Igney and Krammer, 2002; Villunger and Strasser, 1999). Wahrscheinlich werden resistente Tumorzellen durch das Immunsystem selektioniert (Konzept der Immunselektion oder des Immunediting). Ein Mechanismus, einer adaptiven Immunantwort zu entgehen, ist mangelnde Antigenpräsentation. Im allgemeinen sind Defekte in der Antigenpräsentation in metastatischen Läsionen stärker ausgeprägt als im primären Tumor. In einigen Tumoren ist die Expression des Tumorantigens herunterreguliert, was zu erhöhter Tumorinzidenz und Metastasierung führt (Kim et al., 1975; Maeurer et al., 1996; Vasmel et al., 1989). Außerdem können Mutationen des Antigens zum Entkommen von der initialen Antwort führen und zur Heterogenität von Tumorläsionen beitragen (Stackpole et al., 1980). Die heterogene Expression von mehreren Antigenen könnte die Etablierung einer effizienten spezifischen Immunantwort behindern. Darüber hinaus verhindert eine reduzierte MHC-I-Expression die Erkennung von Tumorzellen durch das Immunsystem (Garrido et al., 1997; Hicklin et al., 1999). Tumore haben häufig eine heterogene MHC-I-Expression. Völliger Verlust von MHCI wird vor allem durch Mutationen der β2-Mikroglobulin-Untereinheit verursacht (Bicknell et al., 1994). Deletionen oder Umordnungen von MHC-Genen, Punktmutationen und Defekte in der transkriptionellen Regulation führen zu selektivem Verlust eines MHC Haplotyps, Locus oder Allels (Blanchet et al., 1992; Bosshart and Jarrett, 1998; Ishido et al., 2000; Natali et al., 1989; Seung et al., 1993; Vasmel et al., 1989). Völlige Herunterregulation von MHC-I kann den Tumor zum Ziel eines NK-Zell-Angriffs machen. Daher braucht der Tumor weitere Mechanismen, um der NK-Zell-vermittelten Lyse zu entgehen, wie z.B. die Expression von MHC-I-Surrogaten (Cretney et al., 1999; Farrell et al., 1997). Reduzierte Präsentation von Tumorantigenen wird auch durch Defekte in der Antigen-Prozessierung erreicht. Herunterregulation der Proteasom-Untereinheiten LMP2 (low molecular mass polypeptide 2) und LMP7 verändern das Spektrum der Peptide, die von MHC-Molekülen präsentiert werden (Restifo et al., 1993; Rotem-Yehudar et al., 1996; Seliger et al., 1997). Auch zwei Proteine, die an der Beladung von MHC-I Molekülen mit antigenen Peptiden beteiligt sind - TAP (transporter associated with antigen processing) und Tapasin - sind in Tumorzellen häufig mutiert oder herunterreguliert (Cromme et al., 1994; Garrido et al., 1997; Hicklin et al., 1999; 18 Einleitung Johnsen et al., 1999; Restifo et al., 1993; Rotem-Yehudar et al., 1996; Seliger et al., 1997). TAP-Defizienz führt zum Verlust der MHC-I-Expression und zur Zunahme der Tumorgenese. Eine andere Strategie von Tumoren, der Abstoßung durch das Immunsystem zu entkommen, ist die Expression von immunsuppressiven Faktoren (Chouaib et al., 1997; Elgert et al., 1998). Diese Faktoren können von den malignen Zellen selbst oder von nicht-malignen Zellen am Tumorort, wie Immun-, Epithel- oder Stromazellen, exprimiert werden. Der wichtigste dieser Faktoren ist TGF-β (transforming growth factor β) (Gorelik and Flavell, 2001; Loeffler et al., 1992; Pasche, 2001; Ranges et al., 1987; Tada et al., 1991; Torre-Amione et al., 1990). TGF-β ist ein Zytokin, das die Proliferation und Differenzierung von Zellen der angeborenen und der adaptiven Immunität beeinflusst und damit die anti-Tumor Immunantwort inhibiert. Außerdem wird VEGF von vielen Tumorzellen produziert (Gabrilovich et al., 1996). Neben seiner angiogenen Eigenschaften inhibiert es die Differenzierung von Vorläuferzellen zu dendritischen Zellen. Weitere immunsuppressive Faktoren, die von malignen Zellen exprimiert werden, sind Prostaglandine (McLemore et al., 1988; Plescia et al., 1975; Young and Knies, 1984), IL-10 (Matsuda et al., 1994), M-CSF (Oghiso et al., 1993; Sotomayor et al., 1991) und lösliche Tumorganglioside (McKallip et al., 1999). Das Membranprotein RCAS1 (receptor-binding cancer antigen expressed on SiSo cells) inhibiert die Proliferation und induziert Apoptose in T-Zellen in vitro, was auf eine Rolle dieses Moleküls bei der Immunevasion von Tumoren hindeutet (Nakashima et al., 1999). Das Fehlen einer T-Zellantwort gegen Tumor-assoziierte Antigene, die auch in anderen Zellen des Körpers oder während der Entwicklung exprimiert werden, kann auch durch Toleranz erklärt werden (Antonia et al., 1998; Kiessling et al., 1999). In gesunden Organismen werden auto-reaktive T-Zellen im Thymus deletiert, ein Prozess, der zentrale Toleranz genannt wird. In auto-reaktiven T-Zellen, die dem Prozess der zentralen Toleranz entkommen, wird in der Peripherie Toleranz induziert. Periphere Toleranzinduktion ist ein komplexer, vielschrittiger Prozess (Arnold et al., 1993; Ganss et al., 1999), bei dem im Prinzip vier Hauptmechanismen unterschieden werden können. Ein Mechanismus ist die Induktion von Anergie. T-Zell-Aktivierung benötigt zwei Signale: Bindung eines PeptidMHC-Komplexes an den T-Zell-Rezeptor und Bindung von kostimulierenden Molekülen (z.B. B7) an ihre Liganden (CD28) auf der T-Zell-Oberfläche (Chen et al., 1992; Guinan et al., 1994). Wenn eine T-Zelle über ihren T-Zell-Rezeptor an einen Peptid-MHC-Komplex auf der Zielzelle ohne ausreichende Kostimulation bindet, wird die T-Zelle anergisch und wird nicht mehr aktiviert, wenn sie mit dem Antigen stimuliert wird. Viele Tumorzellen exprimieren keine kostimulatorischen Moleküle und könnten daher in anti-Tumor Einleitung 19 Lymphozyten Anergie induzieren (Becker et al., 1993; Ishido et al., 2000; Shrikant et al., 1999; Staveley-O'Carroll et al., 1998). Ein weiterer Prozess der Toleranzinduktion, den Tumore ausnutzen, ist die Immunabweichung (immune deviation). In diesem Prozess wird die Immunantwort von einer Th1-Antwort, die für eine effiziente Tumorabstoßung durch zytotoxische T-Zellen benötigt wird, zu einer humoralen Th2-Antwort gelenkt. Der Mechanismus der Immundeviation ist nicht exakt verstanden, aber er könnte von einer Sezernierung von TGF-β und IL-10 (Maeda and Shiraishi, 1996) oder von der Präsentation des Tumorantigens durch B-Zellen für CD4+ T-Helfer-Zellen abhängen (Qin et al., 1998). Tumore können auch die Erzeugung von regulatorischen T-Zellen induzieren (Sakaguchi, 2000). Obwohl der molekulare Mechanismus unklar ist, scheint diese Untergruppe von CD4+ T-Zellen die Antwort von zytotoxischen T-Zellen gegen Tumore unter bestimmten Umständen zu supprimieren (Matsui et al., 1999; Takahashi et al., 1988). Ein weiterer Mechanismus der peripheren Toleranz gegenüber Selbstantigenen ist die T-Zell-Deletion. Wiederholte Stimulation von T-Zellen mit Antigen induziert Apoptose, ein Prozess, der Aktivierungs-induzierter Zelltod (AICD) genannt wird. Es wurde gezeigt, dass die Gabe von Antigenen wie Superantigenen, Peptiden oder allogenen Zellen oder die direkte Restimulation des T-Zell-Rezeptors durch anti-CD3-Antikörper Toleranz durch T-Zell-Depletion induziert (Kirchhoff et al., 2000; Martin and Miller, 1989; Radvanyi et al., 1993; Russell et al., 1991). Dieser Prozess wird vor allem durch das CD95/CD95L-System vermittelt (Brunner et al., 1995; Dhein et al., 1995; Li-Weber et al., 1998; Singer and Abbas, 1994). Kostimulation durch CD28 kann T-Zellen vor AICD bewahren (Kirchhoff et al., 2000), was auf eine weitere wichtige Rolle der B7-Expression auf Tumoren hindeutet. Es wurde gezeigt, dass Tumore Toleranz durch Deletion von anti-Tumor T-Zellen induzieren (Bogen, 1996; Lauritzsen et al., 1998). AICD durch chronische Stimulation mit dem Tumorantigen könnte zur Immunevasion beitragen, jedoch wurde die Bedeutung dieses Prozesses bisher nicht direkt gezeigt. Zwei weitere Strategien, die von Tumoren benutzt werden, um der Abstoßung durch das Immunsystem zu entkommen, hängen mit Apoptose zusammen (Igney and Krammer, 2002). Erstens zeigen maligne Zellen Veränderungen in der Expression von Molekülen der Apoptose-Signalwege, was zur Resistenz der Tumore gegenüber den Effektormechanismen des Immunsystems führen kann. Zweitens könnten Tumore einen Effektormechanismus der zytotoxischen Immunzellen übernehmen, um die attackierenden anti-Tumor Lymphozyten zu deletieren - ein Konzept, das „Tumor Counterattack“ (Gegenangriff des Tumors) genannt wird. 20 1.2 Einleitung Apoptose 1.2.1 Die Apoptose-Signalwege Zellen haben einen eingebauten Selbstzerstörungsmechanismus, der programmierter Zelltod oder Apoptose genannt wird. Im Prinzip gibt es zwei alternative Wege, Apoptose einzuleiten: entweder über Todesrezeptoren auf der Zelloberfläche - auch als extrinsischer Weg bezeichnet - oder über Mitochondrien - als intrinsischer Weg bezeichnet (Krammer, 1999; Schmitz et al., 2000). Alle Todesrezeptoren sind Mitglieder der Tumor-Nekrose-Faktor(TNF)-Rezeptor-Superfamilie und stellen eine Subfamilie dar, die durch eine intrazelluläre CD95L DISC FADD sCD95, DcR3 CD95 Zellmembran Procaspase-8 (Procaspase-10) Bcl-2 Bcl-xLL FLIPL,S Caspase-8 (Caspase-10) Bid Caspase-9 Caspase-3, -6, -7 Apoptosom: Apaf-1 Cyt c Procaspase-9 IAP Smac/Diablo (Effektorcaspasen) Todessubstrate Apoptose Abb.1: Apoptose-Signalwege. Die Bindung von CD95L an CD95 führt zur Bildung des Todinduzierenden Signal-Komplexes (DISC). Im DISC wird die Initiator-Caspase-8 (und eventuell Caspase-10) aktiviert. Spaltung von Bid durch Caspase-8 aktiviert den mitochondrialen Signalweg, was zur Amplifikation des Apoptosesignals führt. Die Aktivierung von Mitochondrien führt zur Freisetzung von Cytochrom c ins Zytosol und der Bildung des Apoptosoms. Im Apoptosom wird Caspase-9 aktiviert. Caspase-8 und -9 aktivieren Effektor-Caspasen, die zelluläre Substrate spalten, was schließlich zu Apoptose führt. Apoptose kann auf verschiedenen Ebenen durch anti-apoptotische Proteine inhibiert werden. Einleitung 21 Domäne, die Todesdomäne (Death Domain), charakterisiert ist. Die sogenannten DecoyRezeptoren („Köder-Rezeptoren“) sind eng mit den Todesrezeptoren verwandt, enthalten aber keine Todesdomäne (Pitti et al., 1998; Yu et al., 1999). Todesrezeptoren werden durch ihre natürlichen Liganden, Mitglieder der TNF-Familie, aktiviert (Abb. 1). Wenn der entsprechende Ligand an die Todesrezeptoren CD95, TRAIL-R1, TRAIL-R2 oder TNF-RI bindet, werden durch die Todesdomänen Adaptor-Proteine gebunden, die dann die inaktiven Proformen von Mitgliedern der Caspasen-Familie rekrutieren. Die Caspasen, die in diesen Tod-induzierenden Signal-Komplex („Death-inducing Signaling Complex“, DISC) rekrutiert werden, fungieren als „Initiator“-Caspasen: Caspase-8 und möglicherweise Caspase-10 (Kischkel et al., 1995; Kischkel et al., 2001; Sprick et al., 2000). Im DISC werden Procaspase-8 und -10 gespalten und ergeben die aktiven Initiator-Caspasen. In einigen Zellen, den Typ-I-Zellen, reicht die Menge an aktiver Caspase-8, die im DISC erzeugt wird, aus, um Apoptose direkt einzuleiten (Scaffidi et al., 1998). In Typ-II-Zellen ist die Menge zu gering, und Mitochondrien werden als „Verstärker“ des Apoptose-Signals eingesetzt. Mitochondrien werden durch das Bcl-2-Familienmitglied Bid aktiviert. Bid wird durch aktive Caspase-8 gespalten und transloziert zu den Mitochondrien. Apoptose wird auf der Ebene der Mitochondrien durch Stimulation der mitochondrialen Membran durch noch genauer zu definierende Mechanismen eingeleitet und verläuft über die Freisetzung von Cytochrom c und anderen apoptogenen Faktoren aus dem IntermembranRaum der Mitochondrien (Martinou and Green, 2001; Zamzami and Kroemer, 2001). Im Zytosol bildet Cytochrom c mit Apaf-1, ATP und einer weiteren inaktiven Initiator-Caspase, Procaspase-9, einen Komplex. In diesem Komplex, Apoptosom genannt, wird Caspase-9 aktiviert. Nachdem die Initiator-Caspasen aktiviert wurden, spalten und aktivieren sie EffektorCaspasen, vor allem Caspase-3, -6 und -7. Aktive Effektor-Caspasen spalten sich gegenseitig, wodurch eine sich verstärkende proteolytische Kaskade der Caspasen-Aktivierung gestartet wird (Rathmell and Thompson, 1999). Schließlich spalten die aktiven Effektor-Caspasen zelluläre Substrate, die „Todessubstrate“, was zu charakteristischen biochemischen und morphologischen Veränderungen führt. Spaltung von nukleärem Lamin ist an der ChromatinKondensation und am nukleären Schrumpfen beteiligt. Spaltung von ICAD (DFF45), dem Inhibitor der DNase CAD (DFF40), verursacht die Freisetzung der Endonuklease, die dann in den Nukleus wandert und die DNA fragmentiert. Spaltung von Zytoskelett-Proteinen (z.B. Aktin, Plektin, Rho Kinase 1, Gelsolin) führt zur Zellfragmentierung und der Bildung von apoptotischen Körperchen. Nach dem Erscheinen von bestimmten Signalen auf der 22 Einleitung Zelloberfläche (z.B. Phosphatidylserin, Veränderungen von Zuckerstrukturen) werden die Überreste der sterbenden Zelle durch Phagozyten aufgenommen (Savill and Fadok, 2000). Der apoptotische Selbstzerstörungsmechanismus ist genau reguliert. Verschiedene Proteine kontrollieren den apoptotischen Prozess auf unterschiedlichen Ebenen. FLIPs (FLICEinhibitory proteins) inhibieren die Einleitung der Apoptose auf der Ebene der Todesrezeptoren (Krueger et al., 2001). Zwei Splice-Varianten wurden in humanen Zellen identifiziert, eine lange (FLIPL) und eine kurze Form (FLIPS). Sie besitzen strukturelle Homologie zu Procaspase-8, haben aber kein funktionelles katalytisches Zentrum. Diese Struktur erlaubt es ihnen, an den DISC zu binden und dadurch die Prozessierung und Aktivierung der InitiatorCaspasen zu inhibieren. Eine wichtige Klasse von regulatorischen Proteinen sind die Mitglieder der Bcl-2 Familie, die Apoptose auf der mitochondrialen Ebene regulieren (Martinou and Green, 2001; Zamzami and Kroemer, 2001). Nach ihrer Funktion können die Bcl-2 Familienmitglieder in antiapoptotische und pro-apoptotische Proteine eingeteilt werden. Alle anti-apoptotischen Mitglieder besitzen die Bcl-2-Homologie-(BH)-Domänen 1, 2 und 4, während für die Apoptose-Induktion die BH3-Domäne entscheidend zu sein scheint. Die pro-apoptotischen Mitglieder können in die Bax-Subfamilie und die „BH3-only“-Proteine unterteilt werden. Bcl2 Proteine beeinflussen die Permeabilität der mitochondrialen Membran. Der biochemische Mechanismus ihrer Wirkung ist jedoch nicht ganz klar. Eine dritte Klasse von regulatorischen Proteinen sind die IAPs (inhibitor of apoptosis proteins) (Deveraux and Reed, 1999). IAPs binden und inhibieren Caspasen. Sie fungieren möglicherweise auch als Ubiquitin-Ligasen und fördern den Abbau der gebundenen Caspasen. Allerdings wurde nicht für alle IAPs gezeigt, dass sie Apoptose unterdrücken. Einige haben möglicherweise auch eine andere Funktion als die, Caspasen zu inhibieren. IAPs selbst werden durch das Protein Smac/DIABLO inhibiert (Du et al., 2000; Verhagen et al., 2000). Es wird zusammen mit Cytochrom c aus Mitochondrien während der Apoptose freigesetzt und fördert Caspasen-Aktivierung, indem es an IAPs bindet. 1.2.2 Apoptose im Immunsystem Apoptose spielt eine fundamentale Rolle im Immunsystem (Baumann et al., 2002; Krammer, 2000). Das T-Zell-Repertoire wird im Thymus durch Apoptose und „Überlebens“-Signale („Survival“-Signale) geformt. Die Zahl der T-Zellen, die den Thymus verlassen und in die Peripherie gelangen, beträgt nur etwa 2-3 % der zunächst generierten Zellen. Prä-T-Zellen differenzieren nach dem Eintritt in den Thymus und ordnen ihre T-Zellrezeptorgene um. Die Einleitung 23 T-Zellen, die ihre T-Zellrezeptorgene nicht erfolgreich umordnen und daher nicht durch MHC-Peptid-Komplexe stimuliert werden können, sterben durch Apoptose. Thymozyten mit erfolgreich umgeordneten T-Zellrezeptorgenen entwickeln sich zu CD4+CD8+ T-Zellen und werden einer T-Zellrezeptor-abhängigen positiven und negativen Selektion unterzogen. Nur T-Zellen, die diese Selektionsprozesse überleben, verlassen den Thymus und werden zu peripheren T-Zellen. Auch periphere T-Zellen werden durch Apoptose deletiert (Baumann et al., 2002; Krammer, 2000). Nach Aktivierung durchlaufen T-Zellen mehrere Phasen: (1) eine klonale Expansionsund Effektorphase nach Antigenstimulation, (2) eine Phase, in der die Immunantwort wieder abgeschaltet wird, indem die meisten Antigen-spezifischen T-Zellen schließlich eliminiert werden - ein Prozess, der Aktivierungs-induzierter Zelltod (AICD) genannt wird -, und (3) eine Phase, in der einige überlebende T-Zellen zu Gedächtniszellen werden. In der ersten Phase sind T-Zellen Apoptose-resistent. In der Abschaltphase werden sie zunehmend Apoptose-sensitiver. T-Zellaktivierung führt zur Expression von CD95L und erlaubt es TZellen, CD95-sensitive Nachbarzellen zu eliminieren (Brunner et al., 1995; Dhein et al., 1995). Zellen, die löslichen CD95L produzieren, können auch Selbstmord begehen. Aktivierte T-Zellen können vor dem Aktivierungs-induzierten Zelltod durch Kostimulation über CD28, Adhäsionsmoleküle oder Zytokinrezeptoren gerettet werden. Kostimulation über CD28 führt zur Hochregulation von c-FLIPS und Bcl-xL und zur Herunterregulation von CD95L (Kirchhoff et al., 2000). Der AICD dient auch als ein weiterer Schutzmechanismus gegen Autoimmunität, indem autoreaktive T-Zellen in der Peripherie deletiert werden. Bei der Maus wurden Mutationen im CD95-System gefunden, die zu komplexen Störungen des Immunsystems führen. Bei der lpr („lymphoproliferation“)-Mutation ist die CD95Expression stark vermindert (Watanabe-Fukunaga et al., 1992). Bei lprcg Mäusen ist die intrazelluläre Todesdomäne von CD95 mutiert (Matsuzawa et al., 1990). In gld („generalized lymphoproliferation disease“)-Mäusen ist CD95L mutiert und kann nicht mehr an CD95 binden (Takahashi et al., 1994). Alle Mutationen führen zur Akkumulation von T-Zellen, Lymphadenopathie und Autoimmunität. Ähnliche Defekte führen bei Menschen zum autoimmunen lymphoproliferativen Syndrom (ALPS oder Canale Smith Syndrom). T-Zellen und NK-Zellen benutzen hauptsächlich zwei Mechanismen, um Tumorzellen zu töten: den Todesrezeptor-Signalweg und den Granula-Exozytose-Signalweg (Shresta et al., 1998). Beim Todesrezeptor-Signalweg induziert auf der Zelloberfläche von Lymphozyten exprimierter CD95L Apoptose in CD95-exprimierenden Zielzellen (Li et al., 1998; Rouvier et al., 1993; Walsh et al., 1994). Außerdem verwenden NK-Zellen zur Überwachung von 24 Einleitung Tumoren und Metastasen den Todesliganden TRAIL, der Apoptose über die Todesrezeptoren TRAIL-R1 und TRAIL-R2 induziert (Smyth et al., 2001; Takeda et al., 2001; Takeda et al., 2002). Im Kalzium-abhängigen Granula-Exozytose-Signalweg sezernieren Lymphozyten Perforin und Granzyme aus zytotoxischen Granula in Richtung der Zielzellen. In der Gegenwart von Kalzium polymerisiert Perforin und induziert Veränderungen in der Membran der Zielzelle, die es den Granzymen erlauben, in die Zelle einzudringen (Kagi et al., 1994; Lowin et al., 1994; van den Broek et al., 1996). Granzyme sind neutrale Serinproteasen, die Caspasen in den Zielzellen aktivieren können (Heusel et al., 1994; Medema et al., 1997; Sarin et al., 1997). Außerdem kann Granzym B das Bcl-2 Familienmitglied Bid direkt spalten und so den mitochondrialen Apoptoseweg aktivieren (Heibein et al., 2000). Perforin-defiziente Mäuse sind anfällig für bestimmte Karzinogene und onkogene Viren (van den Broek et al., 1996) und entwickeln im Alter spontan Lymphome (Smyth et al., 2000). Obwohl klar ist, dass Granzyme unentbehrliche Effektormoleküle für die Abwehr von viralen Pathogenen sind (Mullbacher et al., 1999), ist ihr Beitrag zur Tumorabstoßung noch unklar (Davis et al., 2001): Mäuse, die defizient für Granzym A und B sind, können Tumore effizient abstoßen. Makrophagen und Neutrophile benutzen andere Zytotoxizitäts-Mechanismen. Im allgemeinen verwenden sie vier Arten von zytotoxischen Molekülen (Witko-Sarsat et al., 2000). Der erste Effektormechanismus ist die Freisetzung von reaktiven Sauerstoffspezies (Superoxid-Anion, Wasserstoffperoxid und Derivate), die durch die phagozytäre NADPH-Oxidase produziert werden (Babior, 1999; Bastian and Hibbs, 1994; Hampton et al., 1998). Reaktion von Peroxiden über den Myeloperoxidase-Weg kann zu hypochloriger Säure und Chloraminen führen. Ein weiterer Zytotoxizitäts-Mechanismus ist die Produktion von Stickstoffmonoxid (NO) durch die induzierbare NO-Synthase (iNOS) (Bastian and Hibbs, 1994; Bogdan et al., 2000). Die Toxizität von NO wird stark erhöht durch die Reaktion mit Superoxid zu Peroxynitrit. Die molekularen Ziele der reaktiven Sauerstoffspezies, NO und Derivaten innerhalb der Zielzelle sind nicht vollständig bekannt, aber schließen Enzyme ein, die für das Überleben der Zelle essentiell sind. Phagozyten können auch antimikrobielle Peptide Defensine und Cathelicidine - freisetzen, die Affinität zu bakteriellen und eukaryontischen Membranen haben und Zellen möglicherweise durch Zerstörung der Phospholipidmembran lysieren (Gudmundsson and Agerberth, 1999). Ein weiterer Mechanismus ist die Produktion und Freisetzung einer Vielzahl von Proteasen, einschließlich Elastase, Proteinase-2 und Metalloproteasen (Witko-Sarsat et al., 2000). Diese Proteasen degradieren die extrazelluläre Matrix und andere Proteine. Einleitung 25 1.2.3 Die Bedeutung von Apoptose für Krebserkrankungen Um Gewebehomöostase zu gewährleisten, müssen sich Leben und Tod von Zellen im Gleichgewicht befinden - zu viel Wachstum und zu wenig Zelltod können zu einer Störung führen, die schließlich in eine Krebserkrankung mündet (Hanahan and Weinberg, 2000; Igney and Krammer, 2002; Krammer et al., 1998). In den Zellen und Geweben von multizellulären Organismen wachen physiologische Mechanismen über Proliferation und Homöostase. Viele dieser Wachstums-Kontrollmechanismen sind mit Apoptose verbunden: übermäßige Proliferation oder Wachstum an verkehrten Stellen induziert Apoptose in den betroffenen Zellen. Tumore können jedoch über diese Wachstumsbeschränkungen hinaus proliferieren. Daher ist Apoptose-Resistenz von Tumoren wesentlich für die Krebsentstehung. Diese Annahme wird durch die Tatsache bestätigt, dass deregulierte Proliferation allein nicht zur Tumorentstehung ausreicht, sondern zu Zelltod führt (Evan and Vousden, 2001): Überexpression von wachstumsfördernden Onkogenen - wie c-Myc, E1A oder E2F1 sensitiviert Zellen für Apoptose (Evan et al., 1992). Außer der Expression von Proteinen, die Proliferation fördern (z.B. c-Myc), ist zur Tumorentstehung die Expression von antiapoptotischen Proteinen (z.B. Bcl-2) oder die Inaktivierung von wesentlichen proapoptotischen Proteinen notwendig (Bissonnette et al., 1992; Harrington et al., 1994; Sabbatini et al., 1995). Die Verbindung zwischen Proliferation und Zelltod könnte auch die Tatsache widerspiegeln, dass Zellen „Überlebens-Signale“ benötigen. Das Fehlen dieser Signale löst Apoptose aus ein Phänomen, das „Tod durch Vernachlässigung“ genannt wird. Als Überlebens-Signale können Wachstumsfaktoren, Hormone und andere Stimuli, wie die Signale, die von Adhäsionsmolekülen vermittelt werden, wirken. Im allgemeinen werden Überlebens-Signale über den Phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/AKT Signalweg vermittelt (Datta et al., 1999; Stambolic et al., 1999). Ein spezieller Fall des „Todes durch Vernachlässigung“ ist Anoikis die Art von Apoptose, die durch fehlende oder falsche Zell-Matrix-Kontakte ausgelöst wird (Frisch and Screaton, 2001). Das Binden von Integrinen an die extrazelluläre Matrix vermittelt Überlebens-Signale durch Aktivierung des PI3K/AKT Signalwegs. Eine Behandlung mit Chemotherapie oder Bestrahlung tötet Krebszellen vor allem durch Apoptose-Induktion (Herr and Debatin, 2001; Stahnke et al., 2001). Ein Schlüsselelement bei dieser Stress-induzierten Apoptose ist p53 (Ryan et al., 2001; Sherr, 2001). Eine schnelle Induktion von p53 wird bei den meisten Stressarten durch translationale Mechanismen erreicht. p53 kann durch Inaktivierung der Ubiquitin-Ligase MDM2 stabilisiert und aktiviert 26 Einleitung werden. Außerdem wurde gezeigt, dass viele posttranslationale Modifikationen die transkriptionelle Aktivität von p53 erhöhen, z.B. Phosphorylierung, Sumoylierung und Acetylierung. p53 kann die Expression von Proteinen induzieren, die am mitochondrialen Signalweg (z.B. Bax, NOXA, PUMA, p53AIP1) und am Todesrezeptor-Signalweg (z.B. CD95, TRAIL-R1, TRAIL-R2) beteiligt sind (Miyashita and Reed, 1995; Nakano and Vousden, 2001; Oda et al., 2000; Oda et al., 2000) (Guan et al., 2001; Muller et al., 1998; Wu et al., 1997). Ein anderer Stress-Signalweg, der bei Chemotherapie aktiviert wird, ist der Stress-aktivierte Proteinkinase (SAPK/JNK)-Signalweg (Herr and Debatin, 2001). Diese Kinasen, die Mitglieder der Mitogen-aktiverten Proteinkinase-Familie sind, können die Aktivität der AP-1-Familie von Transkriptionsfaktoren regulieren. Bekannte pro-apoptotische AP-1-Zielgene sind CD95L und TNFα. Der am besten definierte Mechanismus, mit dem Therapie-induzierter Zellstress schließlich zum Tod von Tumorzellen (vor allem von Lebertumorzellen) führt, verläuft über das CD95-System (Friesen et al., 1996; Fulda et al., 1998). Chemotherapeutika (z.B. 5-Fluoruracil) induzieren CD95 durch einen transkriptionell regulierten, p53-abhängigen Mechanismus (Muller et al., 1998; Muller et al., 1997; Muller et al., 1998). Sie aktivieren außerdem den SAPK/JNK-Signalweg, was schließlich zur CD95LHochregulation führt (Eichhorst et al., 2000). Erhöhte Expression von CD95 und CD95L veranlasst die Zellen dann entweder zum Selbstmord oder dazu, Nachbarzellen durch Fratrizid zu töten. Defekte Apoptose-Signalwege können also zu neoplastischer Zellvermehrung führen. Resistenz gegenüber Apoptose kann auch das Entkommen von Tumorzellen von der Überwachung durch das Immunsystem ermöglichen. Außerdem können Defekte in den Apoptose-Signalwegen Krebszellen resistent gegenüber einer Krebstherapie machen (Igney and Krammer, 2002). Tumore können durch verschiedenartige Mechanismen Apoptoseresistent werden. Ein Mechanismus ist die Überexpression von anti-apoptotischen Genen. Ein häufiges Merkmal von follikulären B-Zell-Lymphomen ist die erhöhte Expression von Bcl-2 (McDonnell et al., 1989; Reed et al., 1988; Tsujimoto et al., 1985). In in vitro- und in vivoModellen kann Bcl-2-Expression Resistenz gegenüber Chemotherapeutika und Bestrahlung bewirken (Findley et al., 1997; Miyashita and Reed, 1992; Schmitt et al., 2000; Weller et al., 1995). In einigen Tumorarten ist hohe Bcl-2-Expression mit schlechter Chemotherapiewirkung assoziiert (Campos et al., 1993; Coustan-Smith et al., 1996; Hermine et al., 1996). Die Tumor-assoziierten Viren Epstein-Barr-Virus (EBV) und humanes HerpesVirus 8 (HHV8) exprimieren Gene für Proteine, die Bcl-2-Homologe sind (Henderson et al., 1993; Sarid et al., 1997; Tarodi et al., 1994). Beide Proteine haben eine anti-apoptotische Einleitung 27 Funktion und erhöhen das Überleben der infizierten Zellen. Weitere anti-apoptotische Mitglieder der Bcl-2-Familie, die an der Apoptose-Resistenz von Tumoren beteiligt zu sein scheinen, sind Bcl-xL (Boise et al., 1993; Findley et al., 1997; Minn et al., 1995) und MCL-1 (Kaufmann et al., 1998; Zhou et al., 1997). Einige humane Melanome und Lymphome exprimieren große Mengen an FLIP (Irmler et al., 1997; Krueger et al., 2001; Mueller and Scott, 2000). Virale Analoge von FLIP, virale FLIPs (v-FLIPs) genannt, werden von einigen onkogenen Viren kodiert (Bertin et al., 1997; Hu et al., 1997; Thome et al., 1997). Während FLIP-Expression Apoptose-Induktion über Todesrezeptoren verhindert, inhibiert es nicht den Zelltod, der durch Perforin/Granzym, Chemotherapie oder Bestrahlung ausgelöst wird (Kataoka et al., 1998). Trotzdem bewirkt es in Mausmodellen die Immunevasion von Tumoren (Djerbi et al., 1999; Medema et al., 1999). Es wurden Tumore mit hohem FLIP-Expressionsniveau beschrieben, die einer T-Zellvermittelten Immunität in vivo trotz der Anwesenheit des Perforin/Granzym-Signalwegs entkamen. Ein anderer Mechanismus der Apoptose-Resistenz könnte die Expression von löslichen Rezeptoren sein, die als „Köder“ für Todesliganden fungieren. Zwei lösliche Rezeptoren wurden bisher charakterisiert, löslicher CD95-Rezeptor (sCD95), der durch alternatives Splicing von CD95 entsteht, und Decoy-Rezeptor 3 (DcR3, TR6). Beide können CD95Signalgebung kompetitiv inhibieren und sind in verschiedenen Tumorarten exprimiert (Cheng et al., 1994; Midis et al., 1996) (Pitti et al., 1998; Yu et al., 1999). Das IAP-Familienmitglied Survivin ist in der Mehrzahl der humanen Tumore exprimiert, aber nicht in normalem adulten Gewebe (Ambrosini et al., 1997). In Neuroblastomen korreliert die Expression mit einer ungünstigeren Prognose (Adida et al., 1998). Neben seiner antiapoptotischen Aktivität hat Survivin jedoch auch eine Funktion im Zellzyklus (Reed, 2001). Weitere IAP-Familienmitglieder, die an der Karzinogenese beteiligt sein könnten, sind cIAP2 und ML-IAP (Dierlamm et al., 1999; Vucic et al., 2000). Schließlich kann in Tumoren auch der Perforin/Granzym-Signalweg blockiert sein. Expression des Serin-Protease-Inhibitors PI-9/SPI-6, der Granzym B inhibiert, macht Tumorzellen resistent gegenüber zytotoxischen Lymphozyten, was zu Immunevasion führt (Medema et al., 2001). Außer durch Überexpression von anti-apoptotischen Genen können Tumore durch Herunterregulation oder Mutation von pro-apoptotischen Molekülen Apoptose-resistent werden. In bestimmten Krebsarten ist das pro-apoptotische Bcl-2 Familienmitglied BAX mutiert (Rampino et al., 1997). Tumorzelllinien mit BAX-Mutationen sind Apoptose- 28 Einleitung resistenter. Mehrere Mausstudien haben die Funktion von BAX als Tumorsuppressor bestätigt (Bargou et al., 1996; Yin et al., 1997). Metastasierende Melanome exprimieren häufig kein Apaf-1, das ein wichtiger Teil des Apoptosoms ist (Soengas et al., 2001). Neuroblastome, in denen das N-MYC Onkogen amplifiziert ist, sind oft Caspase-8-defizient (Teitz et al., 2000). In diesen Tumoren sind die pro-apoptotischen Gene deletiert oder durch Genmethylierung transkriptionell inaktiviert. Außerdem sind Todesrezeptoren in vielen Tumoren herunterreguliert oder inaktiviert. Im Vergleich zu normalen Zellen zeigen einige Tumore eine verringerte CD95-Expression (Leithauser et al., 1993; Moller et al., 1994; Strand et al., 1996; Volkmann et al., 2001). Dies könnte zu Chemotherapieresistenz und Immunevasion beitragen. Zahlreiche CD95Genmutationen wurden in Myelomen und T-Zell-Leukämien gefunden (Cascino et al., 1996; Landowski et al., 1997; Maeda et al., 1999). Diese mutierten CD95-Formen könnten Apoptose-Induktion über das CD95-System dominant-negativ inhibieren. In Familien mit vererbten CD95-Mutationen, die normalerweise zum autoimmunen lymphoproliferativen Syndrom (ALPS) führen, ist das Risiko, Lymphome zu entwickeln, erhöht (Straus et al., 2001). Deletionen und Mutationen der Todesrezeptoren TRAIL-R1 und TRAIL-R2 wurden ebenfalls in Tumoren beobachtet (Lee et al., 1999; Pai et al., 1998; Shin et al., 2001). Da p53 eine zentrale Rolle bei der Apoptose-Induktion spielt, beeinflussen Veränderungen des p53-Signalweges die Apoptose-Sensitivität von Tumoren (Lowe et al., 1994; Ryan et al., 2001). Dies wurde in zahlreichen Studien bestätigt. Auf p53-defiziente Tumore hatten in immundefizienten Mäusen Bestrahlung und Chemotherapie nur eine schwache Wirkung (Lee and Bernstein, 1993). Spezifische p53-Mutationen stehen in Verbindung mit primärer Resistenz gegenüber Doxorubicin-Behandlung und eines frühen Rezidivs bei BrustkrebsPatienten (Aas et al., 1996). Mutationen von CDKN2A, das den MDM2-Inhibitor ARF kodiert, sind fast genauso verbreitet wie p53-Mutationen (Sherr, 2001). Lymphome von p53und von CDKN2A-Knockout-Mäusen sind beide invasiv und relativ resistent gegenüber Chemotherapie (Schmitt et al., 1999). Die meisten Tumore sind unabhängig von den Überlebens-Signalen, die normale Zellen vor dem „Tod durch Vernachlässigung“ schützen. Dies wird durch Veränderungen im PI3K/AKT-Signalweg verursacht. Onkogene wie z.B. Ras oder BCR-ABL können die PI3KAktivität erhöhen (Kauffmann-Zeh et al., 1997). PTEN, der zelluläre Antagonist von PI3K, ist in fortgeschrittenen Tumoren häufig deletiert oder mutiert (Podsypanina et al., 1999; Steck et al., 1997; Suzuki et al., 1998). Darüber hinaus ist AKT in einigen Krebsarten überexprimiert (Cheng et al., 1992). Einleitung 29 Ein weiterer wichtiger Faktor, der Apoptose von Tumorzellen beeinflusst, ist der Transkriptionsfaktor NFκB (Bours et al., 2000). Abhängig vom Stimulus und vom zellulären Kontext kann NFκB sowohl pro-apoptotische Gene - wie CD95, CD95L und TRAILRezeptoren - und anti-apoptotische Gene - wie IAPs, Bcl-xL und FLIP - aktivieren. Gene, die für NFκB oder den Inhibitor von NFκB (IκB) kodieren, sind in humanen Tumoren amplifiziert oder transloziert (Rayet and Gelinas, 1999). 30 1.3 Einleitung Apoptose-vermittelte Immunsuppression durch Tumore (Tumor Counterattack) 1.3.1 Fakten, die für die Existenz von Tumor Counterattack sprechen Tumorzellen wehren sich möglicherweise nicht nur passiv gegen eine Zerstörung durch das Immunsystem. Sie könnten Tumor-infiltrierende Lymphozyten auch aktiv töten, um die antiTumor Immunantwort zu unterdrücken - ein Phänomen, das „Tumor Counterattack“ genannt wird (Igney et al., 2000; Krammer, 1997; Walker et al., 1998). Die „Waffe“, die Tumore benutzen könnten, um CD95-sensitive Immunzellen zu deletieren, ist CD95L (Abb. 2). Viele Publikationen unterstützen die Vorstellung, dass Tumor Counterattack ein Immunevasionsmechanismus sein könnte. CD95/CD95L-Interaktionen sind wahrscheinlich ein wichtiger Mechanismus, um ein Immunprivileg aufrechtzuerhalten. CD95L wird in immunprivilegierten Regionen, z.B. den Augen und den Hoden, exprimiert (French et al., 1996; Griffith et al., 1995; Stuart et al., 1997). Im Auge wird ohne immunsuppressive Therapie ein hoher Anteil von Cornea-Transplantaten toleriert. In einem Mausmodell wurden CD95L-positive Cornea-Allotransplantate mit einer Rate von etwa 45 % akzeptiert, während alle Transplantate von Mäusen mit einem mutierten, nicht-funktionellen CD95L (gld) abgestoßen wurden (Stuart et al., 1997). Außerdem starben inflammatorische Zellen, die wegen einer viralen Infektion in die vordere Augenkammer infiltrierten, durch CD95abhängige Apoptose und beschädigten das Gewebe nicht (Griffith et al., 1995). Im Gegensatz dazu führte eine virale Infektion in gld-Mäusen zu Entzündung und Invasion von okularem Gewebe durch Zellen, die nicht apoptotisch waren. CD95-vermittelte Apoptose von lymphoiden Zellen war notwendig, um nach einer Antigen-Injektion in die vordere TCR Tumorantigen T-Zelle Tumorzelle CD95 CD95L Abb. 2: Die Tumor-Counterattack-Hypothese. Im Idealfall erkennt eine T-Zelle mit Hilfe ihres TZell-Rezeptors (TCR) das Tumorantigen auf einer Tumorzelle und tötet diese dann. Exprimiert jedoch die Tumorzelle CD95L, kann sie möglicherweise ihrerseits die attackierende T-Zelle umbringen und so der Abstoßung durch das Immunsystem entkommen. Einleitung 31 Augenkammer Toleranz zu induzieren (Griffith et al., 1996). Ähnliche Ergebnisse wurden auch mit murinen Testis-Transplantaten gefunden. Transplantate, die Wildtyp-CD95L exprimierten, überlebten nach Transplantation unter die Nierenkapsel von allogenen Tieren, während Testis-Transplantate von gld-Mäusen abgestoßen wurden (Bellgrau et al., 1995). Allerdings waren Versuche einer anderen Gruppe, diese Beobachtungen zu reproduzieren, nicht erfolgreich (Allison et al., 1997). Da Neuronen und Astrozyten ebenfalls CD95L exprimieren, könnte auch beim Immunprivileg des Zentralnervensystems CD95L beteiligt sein (Choi et al., 1999; French et al., 1996; Saas et al., 1997). CD95L könnte daher vielleicht dazu benutzt werden, ein transplantiertes Gewebe zu einer immunprivilegierten Region zu machen. Tatsächlich wurde berichtet, dass Kotransplantation von syngenen CD95L-transfizierten Myoblasten transplantierte Langerhans'sche Inseln vor der Abstoßung durch das Immunsystem schützte (Lau et al., 1996). Allerdings haben andere Autoren trotz Benutzung einer ähnlichen Methode genau das Gegenteil gefunden (Kang et al., 1997). Eine Reihe von Studien hat gezeigt, dass Tumor Counterattack ein wichtiger Immunevasionsmechanismus von Tumoren sein könnte. Viele CD95-resistente Tumore exprimieren CD95L konstitutiv oder nach Induktion durch Chemotherapie (Bennett et al., 1998; Hahne et al., 1996; Mariani and Krammer, 1998; O'Connell et al., 1996; Saas et al., 1997; Strand and Galle, 1998; Villunger et al., 1997; Walker et al., 1998). Solche Tumorzellen töteten CD95-positive, Apoptose-sensitive Zellen in vitro. Außerdem wurde Apoptose von Tumor-infiltrierenden Lymphozyten in situ in CD95L-exprimierenden humanen Tumoren gefunden (Hahne et al., 1996; Strand et al., 1996). Bei ÖsophagusKarzinomen war in CD95L-exprimierenden Regionen die Zahl der infiltrierten Lymphozyten reduziert, gleichzeitig war der Anteil apoptotischer Lymphozyten erhöht (Bennett et al., 1998). Viele Tiermodelle wurden benutzt, um zu zeigen, dass von Tumoren exprimierter CD95L eine anti-Tumor Immunantwort erschweren kann. Das Tumorwachstum von subkutan injizierten CD95L-positiven murinen Melanomzellen war in Wildtyp- oder gld-Mäusen etwas schneller als in Mäusen mit einem mutierten oder herunterregulierten CD95-Rezeptor (lprMäuse) (Hahne et al., 1996). Eine andere Studie in syngenen Mäusen zeigte, dass das Wachstum von murinen CD95L-transfizierten Zellen, die unter die Nierenkapsel transplantiert wurden, signifikant besser war als das von Kontrollzellen (Nishimatsu et al., 1999). Immunsuppression in vivo wurde in allogenen Mäusen, denen CD95L-transfizierte 32 Einleitung Kolonkarzinom-Zellen injiziert wurden, direkt gezeigt. Alloantikörper waren praktisch völlig unterdrückt und allospezifische zytotoxische T-Zellen und T-Helfer-Zellen waren reduziert (Arai et al., 1997). 1.3.2 Fakten, die gegen die Existenz von Tumor Counterattack sprechen Trotz der Vielzahl von Fakten, die die Tumor-Counterattack-Hypothese unterstützen, wurden auch viele Studien publiziert, die dagegen sprechen (Restifo, 2001). Im Gegensatz zu den oben beschriebenen Untersuchungen wurde berichtet, dass CD95L-Expression auf einem Transplantat oder Tumor zu einer schnellen Zerstörung der Zellen durch Neutrophile führt. CD95L-Epxression auf Pankreasinseln, die in allogene Wirte transplantiert wurden, führte zu einer massiven Infiltration von Neutrophilen und zur Zerstörung der Inseln (Kang et al., 1997). In ähnlicher Weise entwickelten transgene Mäuse, die CD95L auf Pankreasinseln exprimierten, eine massive Neutrophileninfiltration und Diabetes (Allison et al., 1997; Judge et al., 1998). Außerdem wurden CD95L-exprimierende Herzen von transgenen Mäusen, die in syngene und allogene Empfänger transplantiert wurden, schneller abgestoßen als Kontrolltransplantate und zeigten eine massive Neutrophileninfiltration bereits einen Tag nach Transplantation (Takeuchi et al., 1999). Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass Überexpression von CD95L auf murinen Tumorzellen, die selbst resistent gegenüber CD95-vermittelter Apoptose sind, das Wachstum in vitro nicht beeinflusst, aber eine Abstoßung durch Neutrophile in vivo bewirkt (Behrens et al., 2001; Okamoto et al., 1999; Seino et al., 1997; Shimizu et al., 1999; Yagita et al., 1996). CD8+ T-Zell-vermittelte Immunität gegen die parentalen Tumorzelllinien wurde hervorgerufen. Eine Abstoßung des CD95L-exprimierenden Tumors wurde sogar in der oben erwähnten Studie gefunden, die eine Immunsuppression durch den Tumor in einem allogenen Mausmodell gezeigt hatte (Arai et al., 1997). Als Kontrolltumorzellen mit den CD95Lexprimierenden Zellen an der gleichen Stelle ko-implantiert wurden, wurde eine „Bystander“Abstoßung der CD95L-negativen Zellen beobachtet (Seino et al., 1997; Shimizu et al., 1999). Infektion eines subkutan wachsenden CD95-negativen Tumors durch einen adenoviralen Vektor, der CD95L kodiert, führte zur schnellen Abstoßung des Tumors (Arai et al., 1997). Diese Berichte zeigen, dass CD95L eine proinflammatorische Funktion hat und dass CD95LGentransfer zur Tumorbekämpfung genutzt werden könnte. Einleitung 33 1.3.3 Mögliche Mechanismen der Abstoßung von CD95L+ Tumoren Mehrere Mechanismen für die Rekrutierung der Transplantat- oder Tumor-abstoßenden Neutrophilen wurden vorgeschlagen. Zwei Studien zeigten, dass löslicher CD95L direkt chemotaktisch für Neutrophile ist, was nahe legt, dass löslicher CD95L die Abstoßung von CD95L-exprimierenden Transplantaten fördert (Ottonello et al., 1999; Seino et al., 1998). Jedoch haben andere Studien eine chemotaktische Aktivität von löslichem CD95L weder in vitro noch in vivo gefunden (Behrens et al., 2001; Shudo et al., 2001). Außerdem riefen Tumorzellen, die nur löslichen CD95L exprimierten, keine Abstoßung durch Neutrophile hervor (Hohlbaum et al., 2000; Shudo et al., 2001). Andererseits wurden Tumorzellen, die eine nicht-spaltbare Membran-gebundene Form von CD95L exprimierten, rasch abgestoßen (Hohlbaum et al., 2000; Kang et al., 2000; Shudo et al., 2001). Das Ausmaß der Entzündung, die durch die verschiedenen Transfektanten hervorgerufen wurde, schien mit der zytotoxischen Aktivität von CD95L zu korrelieren. Als andere Möglichkeit wurde vorgeschlagen, dass CD95L in umliegenden Zellen die Produktion von chemoattraktiven Stoffen für Granulozyten anregt. Es wurde berichtet, dass CD95L die Prozessierung und Freisetzung von IL-1β induziert, das für die Infiltration von Neutrophilen verantwortlich sein könnte (Miwa et al., 1998). CD95L könnte auf Makrophagen wirken, was zur erhöhten Produktion von IL-1β und Makrophagen-inflammatorischen Proteinen führen könnte (Hohlbaum et al., 2001). Außerdem könnte die Aktivierung von CD95 auf dendritischen Zellen die Sezernierung von proinflammatorischen Zytokinen induzieren (Rescigno et al., 2000). Diese Daten unterstützen einen indirekten Mechanismus für den inflammatorischen Effekt von CD95L. Trotzdem ist der exakte Mechanismus, wie Neutrophile zu CD95Lexprimierenden Tumoren rekrutiert werden und wie CD95L-exprimierende Tumore abgestoßen werden, noch immer unklar. 1.3.4 Faktoren, die Tumor Counterattack beeinflussen Eine Vielzahl weiterer Faktoren könnte die Auswirkung der CD95L-Expression auf Tumoren in vivo beeinflussen und damit für die kontroverse Situation verantwortlich sein. Die Höhe und der Zeitpunkt der CD95L-Expression könnte von besonderer Bedeutung sein. In den meisten Tierexperimenten wurden CD95L-transfizierte Tumorzelllinien verwendet. Diese Zellen exprimieren wahrscheinlich mehr CD95L als natürlich vorkommende Tumore. Die Überexpression von CD95L könnte zur Abstoßung durch Neutrophile führen, während ein physiologisches Expressionsniveau möglicherweise keine Neutrophilen-Infiltration induziert, aber immer noch ausreicht, anti-Tumor Lymphozyten zu deletieren. Außerdem könnten in situ 34 Einleitung wachsende Tumore CD95L erst in späten Stadien der Tumorgenese exprimieren, z.B. nach Induktion durch Chemotherapie (Friesen et al., 1996; Muller et al., 1997). Daher könnte der Zeitpunkt der CD95L-Expression Tumor Counterattack direkt beeinflussen. Darüber hinaus variiert die Apoptose-Sensitivität von T-Zellen je nach ihrem Aktivierungszustand beträchtlich (Ehl et al., 1996; Kirchhoff et al., 2000; Kirchhoff et al., 2000; Klas et al., 1993; Scaffidi et al., 1999). Daher könnte es entscheidend sein, wann die TZellen auf CD95L treffen und wie die T-Zellen aktiviert und kostimuliert wurden. Die Auswirkung der CD95L-Expression könnte auch von der Mikroumgebung des Tumors abhängen. TGF-β ist möglicherweise ein notwendiger Kofaktor, um immunologische Toleranz zu induzieren (Chen et al., 1998). CD95L-exprimierende Tumorzellen wurden nach subkutaner Injektion durch Neutrophile abgestoßen. Wenn gleichzeitig TGF-β an den subkutanen Stellen vorhanden war, wurde der Tumor nicht abgestoßen. Allerdings ist nicht klar, ob in vivo TGF-β und CD95L zusammen für eine Immunevasion notwendig sind und ob CD95L einen immunsuppressiven Effekt in der Gegenwart von TGF-β hat. Einleitung 1.4 35 Aufgabenstellung Tumorzellen wehren sich möglicherweise nicht nur passiv gegen eine Zerstörung durch das Immunsystem. Viele Tumore exprimieren CD95L, mit dessen Hilfe sie Tumor-infiltrierende Lymphozyten aktiv töten könnten, um der anti-Tumor Immunantwort zu entkommen - ein Phänomen, das Tumor Counterattack genannt wird. Viele Studien zu Tumor Counterattack wurden veröffentlicht, die Ergebnisse sind aber widersprüchlich und klären nicht, ob Tumor Counterattack in vivo ein relevanter Immunevasionsmechanismus ist. Einerseits werden in humanen CD95L+ Tumoren vermehrt apoptotische T-Zellen gefunden, und in vitro-Befunde zeigen, dass aktivierte T-Zellen CD95-sensitiv sind. Andererseits führt die CD95L-Expression zur Abstoßung oder einem Wachstumsnachteil der Tumore in Mäusen. Aufbauend auf einem im Labor vorhandenen Mausmodell sollte diese kontroverse Situation genauer untersucht werden. Bei diesem Mausmodell wurden einerseits Tumore vom Haplotyp H-2d eingesetzt, die als Modell-Tumorantigen das MHC-Molekül Kb exprimieren, und andererseits anti-Kb T-Zellrezeptor-transgene Perforin-knockout (TCRPKO)-Mäuse mit dem Haplotyp H-2d×k. Um die Auswirkungen der CD95L-Expression von Tumoren auf Tumor-spezifische T-Zellen genauer charakterisieren zu können, sollte die Tumor-Counterattack-Situation zunächst in einem Modellsystem in vitro nachgestellt werden. Dabei sollte untersucht werden, ob die CD95L-Expression von Tumorzellen die Generierung von zytotoxischen anti-Tumor T-Zellen und die Lyse des Tumors durch aktivierte T-Zellen beeinflusst. Wichtige Faktoren, die die Auswirkung der CD95L-Expression auf Tumoren in vivo beeinflussen und damit für die kontroverse Situation verantwortlich sein könnten, sind das CD95L-Expressionsniveau und der Zeitpunkt der CD95L-Expression. Es sollte daher untersucht werden, ob diese beiden Faktoren in vivo eine entscheidende Rolle bei der Abstoßung von CD95L+ Tumoren und Tumor Counterattack spielen. In zahlreichen Studien wurden Neutrophile für die Abstoßung von CD95L+ Tumoren verantwortlich gemacht. Es sollte daher in vitro untersucht werden, ob Neutrophile tatsächlich selektiv gegenüber CD95L+ Tumorzellen zytotoxisch sind. Außerdem ist bisher nicht klar, welchen Zytotoxizitäts-Mechanismus Neutrophile benutzen, um CD95L+ Tumore abzustoßen. Die wichtigsten Zytotoxizitäts-Mechanismen von Neutrophilen sind die mit Hilfe der induzierbaren NO-Synthase (iNOS) produzierten zytotoxischen Stickoxide und die mit Hilfe der phagozytären NADPH-Oxidase produzierten reaktiven Sauerstoffradikale. Daher sollte das Wachstum von CD95L+ Tumoren in iNOS-/-- und p47phox-/--Mäusen, deren Neutrophilen jeweils einer dieser Zytotoxizitäts-Mechanismen fehlt, untersucht werden. 36 2. Material und Methoden MATERIAL UND METHODEN 2.1. Material 2.1.1. Mäuse Acht Wochen alte C57BL/6 Mäuse (H-2b) wurden von Charles River Wiga, Sulzfeld, Balb/c Nacktmäuse (H-2d) von Iffa Credo, Frankreich, und iNOS-/--Mäuse (Laubach et al., 1995) von Jackson, USA, bezogen. NOD/SCID-Mäuse wurden von Dr. Philipp Beckhove (Heidelberg) zur Verfügung gestellt. p47phox+/--Mäuse (H-2b) (Jackson et al., 1995) wurden von Prof. Klaus Pfeffer (München) zur Verfügung gestellt. Anti-Kb T-Zell-Rezeptor-transgene Perforin-/- (TCRPKO)-Mäuse (H-2d, H-2k, H-2d×k) wurden von Dr. Christian Behrens (Heidelberg) übernommen (Behrens et al., 2001; Schönrich et al., 1991). Für Versuche wurden TCRPKO-, iNOS-/-- und p47phox-/--Mäuse durch eigene Züchtung erhalten. Alle Tiere wurden unter spezifiziert pathogenfreien (spf) Bedingungen in Barrieren, Isolatoren oder VentiRacks im Zentralen Tierlabor des DKFZ gehalten. Bei allen Arbeiten mit Mäusen wurden die Methodenempfehlungen der Arbeitsgemeinschaft der Tierschutzbeauftragten in Baden-Württemberg (Weiß, 1993) beachtet. 2.1.2. Zellen Die folgenden Zelllinien und von ihnen abgeleitete Transfektanten wurden in der vorliegenden Arbeit verwendet: Zelllinie Beschreibung Jurkat J16 humane akute T-Zell-Leukämie L1210 lymphozytäre Leukämie von der DBA/2-Maus P815 Mastozytom von der DBA/2-Maus PC60 Hybridom aus Ratten-B-Zelle und Maus-Myelomzelle B16 Melanom aus der C57BL/6-Maus 2.1.3. Bakterienstämme Zur Plasmidamplifikation wurde der Stamm E. coli XL-1 blue (Stratagene) verwendet. Material und Methoden 37 2.1.4. Vektoren Vektor Quelle; Referenz pFM92 (Gunning et al., 1987) pEFpuroPGK (Strasser et al., 1995) pUHG17-1 H. Bujard (Heidelberg); (Gossen and Bujard, 1992) pUHD13-3 H. Bujard (Heidelberg); (Gossen et al., 1995) pUHD10-3 H. Bujard (Heidelberg); (Gossen et al., 1995) pX343 H. Bujard (Heidelberg) 2.1.5. PCR-Primer Synthetische Oligonukleotide wurden von MWG-Biotech, Ebersbach, oder Sigma-ARK bezogen. Name Sequenz Mlqu1 CTT GGG CTC CTC CAG GGT CAG T Mlqu2 TCT CCT CCA TTA GCA CCA GAT CC mbactup ATT GTT ACC AAC TGG GAC GAC ATG mbactdw CTT CAT GAG GTA GTC TGT CAG GTC mFas.up CGC GGA TCC ACC ATG CTG TGG ATC TGG GCT mFas.dw CGC GAA TTC TCA CTC CAG ACA TTG TCC crmA-A CAC ATA GAT GAA CGG ATG ATC TGC crmA-S ACT GAT TGT CGC ACT GTA GAT GCG JT98 TGG GCA GCA TGC CTG GTT GGT GAC CTT JT272 CCA CTC CAC CTT GAC TTC AAA AAG GCG JT308 CAT TGG GTG GAA ACA TTC CAG GCC oIMR1216 ACA TGC AGA ATG AGT ACC GG oIMR1217 TCA ACA TCT CCT GGT GGA AC oIMR1218 AAT ATG CGA AGT GGA CCT CG p47koA ACA TCA CAG GCC CCA TCA TCC TCC p47koB CAA CGT CGA GCA CAG CTG CGC AAG p47koC GGA GAG CCC CCT TTC TCT CCC TCA 38 Material und Methoden 2.1.6. Antikörper Die folgenden Antikörper wurden in dieser Arbeit verwendet. Soweit nicht anders angegeben, sind sie gegen das entsprechende Mausprotein gerichtet. Als Zweitreagenzien für biotinylierte Antikörper wurden Streptavidin-QuantumRed und Streptavidin-R-Phycoerythrin (Sigma, Deisenhofen) verwendet. Antigen Name Isotyp Modifikation Quelle; Referenz B220 RA3-6B2 rat IgG2a PE Pharmingen CD4 L3T4 (H129.19) rat IgG2a Cychrome Pharmingen CD8a 53-6.7 rat IgG2a PE Pharmingen CD95 Jo2 ha IgG FITC Pharmingen CD95L MFL3 ha IgG κ bio; gereinigt Pharmingen Kb K10-56.1 mIgG2b bio d K K9-18 mIgG2a bio Kk 11.4-1 mIgG2a bio anti-Kb TCR Desire-1 mIgG2a FITC oder bio Gr-1 RB6-8C5 rat IgG2b Isotyp A19-3 ha IgG Isotyp A95-1 rat IgG2b Pharmingen FITC; gereinigt 2.1.7. Enzyme und Chemikalien Agarose GibcoBRL (Eggenstein) Ampicillin, Na-salz Sigma (Deisenhofen) β-Casein aus Rindermilch Sigma (Deisenhofen) Doxycyclin Sigma (Deisenhofen) Ficoll Seromed (Berlin) Geneticin, Na-salz (G418) GibcoBRL (Eggenstein) Hygromycin B Sigma (Deisenhofen) LB-Agar GibcoBRL (Eggenstein) Lympholyte-M Cedarlane Labs, Kanada MuLV Reverse Transkriptase Perkin Elmer (USA) Na251CrO4-Lösung (1 mCi/ml) NEN (Neu-Isenburg) Proteinase K Boehringer (Mannheim) Puromycin Sigma (Deisenhofen) Pharmingen Pharmingen Material und Methoden 39 Taq DNA Polymerase Sigma (Deisenhofen) Trypsin-EDTA-Lösung GibcoBRL (Eggenstein) Wachs Monojet Scientific (Irland) Alle weiteren Chemikalien wurden bei Sigma (Deisenhofen), Fluka (Neu-Ulm) und Merck (Darmstadt) bezogen. 2.1.8. Medien und Lösungen LB-Medium: Trypton Hefeextrakt NaCl H2O 10 g/l 5 g/l 10 g/l ad 1 l PBS-Puffer: Natriumchlorid Kaliumchlorid Na2HPO4 KH2PO4 H2O pH 7.4 mit HCl 8g 0.2 g 1.44 g 0.24 g ad 1 l TAE-Puffer (50x): Tris Eisessig EDTA, pH 8 H2O 242 g/l 57 ml 0.5 M ad 1 l DNA-Auftragspuffer (6x): Glycin Bromphenolblau EDTA, pH 7.5 30 % (m/v) 0.2 % (m/v) 25 mM 2.1.9. Zellkulturmedien Pulverisierte Zellkulturmedien RPMI 1640 und DMEM wurden von der Firma GibcoBRL (Eggenstein) bezogen und nach Herstellerangaben in pyrogenfreiem Wasser gelöst. Die Medien wurden sterilfiltriert und anschließend bei 4 °C gelagert. Vor der Verwendung wurden die Medien mit folgenden Zusätzen komplementiert: 10 % 10 mM 50 µg/ml 1 mM 50 µM FCS HEPES Gentamicin Natriumpyruvat 2-Mercaptoethanol GibcoBRL, Eggenstein GibcoBRL, Eggenstein GibcoBRL, Eggenstein Fluka, Neu-Ulm Merck, Darmstadt Folgende Zusätze wurden zur Selektion von eukaryontischen Zellen eingesetzt: 1 mg/ml 10 µg/ml 400 µg/ml Geneticin, Na-salz (G418) Puromycin Hygromycin B GibcoBRL, Eggenstein Sigma, Deisenhofen Sigma, Deisenhofen 40 Material und Methoden 2.1.10. Kits Qiagen RNeasy Mini Kit Qiagen (Hilden) Qiagen Plasmid Maxi Kit Qiagen (Hilden) Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega (USA) RNA PCR Core Kit Perkin Elmer (USA) 2.1.11. Geräte und sonstige Materialien Analysenwaage Sartorius, Göttingen Cobra Autogamma Packard, Dreieich CO2-Inkubator Forma Scientific, USA 137 Cs-Quelle Atomenergiebehörde, Kanada Einmalkanülen Becton Dickinson, Heidelberg Einmalpipetten Renner, Darmstadt Einmalspritzen Pharma-Plast, Dänemark Elektroporationsgerät Bio-Pulser Biorad, München FACScan Becton Dickinson, Heidelberg Gefrierschrank -20 °C Liebherr, Deutschland Gefriertruhe -80 °C Forma Scientific, USA Gelkammersystem für Agarose-Gele Hybaid, Heidelberg Heizblock Thermomixer Eppendorf, Hamburg Kryoröhrchen Nalgene, USA Kunststoffröhrchen (15 ml, 50 ml) Renner, Darmstadt Mikroskop Diaphot Nikon, Düsseldorf Mikrotiterplatten Renner, Darmstadt Neubauerkammer Brand, Weinheim pH-Meßgerät Migge, Heidelberg Photometer Pharmacia, Freiburg Reaktionsgefäße (1.5ml, 2 ml) Eppendorf, Hamburg Spritzenaufsatzfilter Millex Millipore, Frankreich Sterile Werkbank Baker, USA Stickstofftank Messer Griesheim, Ludwigshafen UV-Flächenstrahler Benda, Wiesloch Vortex-Mischer Bender und Hobein, Zürich Zentrifugen: Laborzentrifuge Varifuge Heraeus, Osterode/Harz Material und Methoden 41 Sorvall-Zentrifuge RC-5B DuPont, Bad Homburg Tischzentrifuge Wifug, Schweden Tischzentrifuge Heraeus, Osterode/Harz 42 Material und Methoden 2.2. Molekularbiologische und biochemische Methoden 2.2.1. Amplifikation von Plasmid-DNA Herstellung von kompetenten Bakterien 200 ml LB-Medium wurden mit 1 ml einer exponentiell wachsenden E. coli Kultur angeimpft und bis zum Erreichen einer OD260 von 0.6 im Schüttler inkubiert. Die Bakterien wurden abzentrifugiert (10 min, 3000 rpm, 4 °C) und anschließend in 60 ml eiskalter TFB1-Lösung (100 mM RbCl2, 50 mM MnCl2, 30 mM KOAc, 10 mM CaCl2, 15 % Glycerin, pH 5.8) resuspendiert. Nach 90 min Inkubation in Eis wurde erneut wie oben zentrifugiert. Danach wurde das Bakterienpellet in 8 ml eiskalter TFB2-Lösung (10 mM RbCl2, 75 mM MnCl2, 15 % Glycerin, 10 mM MOPS pH 7) resuspendiert. Von der auf diese Weise entstandenen Bakteriensuspension wurden je 200 µl in 1.5 ml Reaktionsgefäße pipettiert, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C gelagert. Transformation von Bakterien Kompetente E. coli Bakterien wurden in Eis aufgetaut. Pro Transformationsansatz wurden 50 µl Bakteriensuspension in 1.5 ml-Reaktionsgefäße überführt und 30 min mit 25 ng PlasmidDNA in Eis inkubiert. Zum Hitzeschock wurde 90 s auf 42 °C erwärmt, danach für 2 min in Eis abgekühlt. Nach der Zugabe von 400 µl LB-Medium wurden die Bakterien 45 min bei 37 °C inkubiert („recovery phase“) und anschließend auf Ampicillin-haltige (100 µg/ml) LBAgarplatten ausplattiert. Nach 16 h bei 37 °C konnten Bakterienkolonien gepickt werden. Plasmid-Präparation im Maxi-Maßstab Die Isolierung von Plasmid-DNA im Maxi-Maßstab wurde mit dem Qiagen Plasmid Maxi Kit nach Herstellerangaben durchgeführt. Die DNA wurde schließlich in 250 µl TE oder Wasser gelöst. Nach photometrischer Konzentrationsbestimmung wurde sie auf 1 mg/ml eingestellt und bei -20 °C gelagert. Bestimmung von Nukleinsäurekonzentrationen Die Absorption bei λ= 260 nm (A260) der Nukleinsäurelösung wurde photometrisch bestimmt, und die Konzentration daraus wie folgt berechnet: Für dsDNA c(µg/ml)=50×Verdünnungsfaktor×A260. Für RNA c(µg/ml)=40×Verdünnungsfaktor×A260. Aus dem Quotienten A260/A280 konnte die Reinheit der Präparation bestimmt werden. Material und Methoden 43 2.2.2. Restriktionsanalyse von DNA 1 µg Plasmid-DNA wurde in einem Gesamtvolumen von 20 µl mit 1 µl Restriktionsenzym unter den entsprechenden Pufferbedingungen nach Angaben des Herstellers 1 h bei 37 °C gespalten. Ein Aliquot des Ansatzes wurde anschließend durch Auftrennung in einem Agarose-Gel analysiert. 2.2.3. Agarose-Gelelektrophorese Zur Größenanalyse von DNA-Fragmenten wurden diese elektrophoretisch im 1 %igen Agarosegel (TAE, 1µg/ml Ethidiumbromid) getrennt und mit einem DNA-Längenstandard verglichen. Die Proben wurden dafür mit 1/5 Volumenteil DNA-Auftragspuffer versetzt und auf das Gel aufgetragen. Danach wurde die Elektrophorese 1 h bei 100 V durchgeführt. In Anwesenheit von Ethidiumbromid ließ sich die DNA im UV-Licht sichtbar machen und mit Hilfe einer Videokamera photographieren. 2.2.4. Isolierung von Gesamt-RNA aus eukaryontischen Zellen Gesamt-RNA aus Zelllinien und Tumoren wurde mit dem Qiagen RNeasy Kit nach Herstellerangaben isoliert. Die RNA wurde in 40 µl Wasser aufgenommen und ihre Konzentration photometrisch bestimmt. 2.2.5. RT-PCR Zur Analyse der Expression von CD95L, CD95, crmA und β-Aktin wurde Gesamt-RNA revers transkribiert und die entstandene cDNA per PCR mit sequenzspezifischen Primern amplifiziert. Für die reverse Transkription (RT) wurde ein „Mastermix“ hergestellt, der pro Probe folgende Reagenzien enthielt: 4 µl 2 µl 8 µl 1 µl 1 µl 1 µl MgCl2 10xPCR-Puffer Desoxyribonukleotidmix (je 2.5 mM) Oligo-dT Wasser (RNAse-frei) RNAse Inhibitor Je 17 µl des „Mastermixes“ wurden in Reaktionsgefäße überführt. 0.5 µg der jeweiligen RNA in 2 µl Wasser wurden zugegeben, der Ansatz wurde 5 min auf 65 °C erhitzt und anschließend in Eis abgekühlt. Es wurde 1 µl MuLV Reverse Transkriptase zugegeben, und der Reaktionsansatz wurde 45 min bei 42 °C inkubiert. 44 Material und Methoden Für die Polymerase-Kettenraktion (PCR) wurde ein Mastermix aus den folgenden Reagenzien pro Probe gemischt: 1.5 µl 2.25 µl 1 µl 1.5 µl 1.5 µl 14.6 µl 0.125 µl MgCl2 (25 mM) 10xPCR-Puffer Desoxyribonukleotidmix 5’-Primer (5 pmol/µl) 3’-Primer (5 pmol/µl) Wasser Taq-Polymerase Je 22.5 µl Mastermix wurden in PCR-Reaktionsgefäße überführt. Es wurden 2.5 µl des jeweiligen RT-Ansatzes zugegeben, und die Reaktion wie folgt durchgeführt: 94 °C 94 °C Ta 72 °C 72 °C 4 °C 4 min 1 min 1 min 1 min 5 min 25-30x Zur Amplifikation von CD95 betrug der Elongationsschritt 1 min 30 s. Die folgenden Primer und Annealing-Temperaturen (Ta) wurden verwendet: Gen Primer Fragmentlänge Ta CD95L Mlqu1, Mlqu2 611 bp 56 °C CD95 mFas.up, mFas.dw 979 bp 54 °C crmA crmA-A, crmA-S 650 bp 55 °C β-Aktin mbactup, mbactdw 350 bp 54-56 °C 2.2.6. FITC-Markierung von Antikörpern 1 mg einer 1 mg/ml Antikörperlösung wurde mit 1/36 Volumenteil einer 7.5 %igen NaHCO3Lösung versetzt. Nach der Zugabe von 100 µl einer frisch angesetzten FluoresceinIsothiocynat (FITC)-Lösung (1 mg/ml in DMSO) wurde 1 h im Dunkeln bei 37 °C inkubiert. Während dieser Zeit wurde eine PD-10 Gelfiltrationssäule (Pharmacia) mit 15 ml PBS äquilibriert. Nach dem Auftragen der Reaktionslösung auf die Säule waren zwei farbige Banden sichtbar, von denen die untere den FITC-markierten Antikörper enthielt. Die entsprechenden Fraktionen wurden in Aliquots von 200 µl aufgefangen. Die Antikörperenthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, sterilfiltriert und bei -20 °C in Anwesenheit von 0,1 % Natriumazid gelagert. Material und Methoden 45 2.2.7. DNA-Isolierung aus Mausschwänzen Zur Genotypisierung von Mäusen wurde DNA aus der Schwanzspitze isoliert. Etwa 0.8 cm Biopsiematerial wurde mit einer Schere in 700 µl Lysepuffer (100 mM TrisHCl, pH 8.5, 5 mM EDTA, 0.2 % SDS, 200 mM NaCl) zerkleinert und ÜN im Heizblock bei 56 °C mit 0.1 mg/ml Proteinase K inkubiert. Um ungelöste Bestandteile zu entfernen, wurde zentrifugiert (5 min, 13000 rpm) und der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Nach der Zugabe von 420 µl Isopropanol wurde geschüttelt und der nun sichtbare DNA-Faden um eine zugeschmolzene Glaskapillare gewickelt. Die Kapillare wurde kurz in 70 % EtOH und dann in 100 % EtOH getaucht und danach 5 min zum Trocknen aufgestellt. Anschließend wurde die Kapillare in einem sauberen Reaktionsgefäß zerbrochen und die DNA in 200 µl TE gelöst (15 min bei 65 °C). Die DNA konnte direkt zur PCR mit spezifischen Primern eingesetzt werden. 46 Material und Methoden 2.3. Zellbiologische Methoden 2.3.1. Kultivierung eukaryontischer Zellen Um Kontaminationen mit Mikroorganismen zu vermeiden, wurden alle Arbeiten mit eukaryontischen Zellkulturen in Werkbänken mit laminarem Luftstrom durchgeführt. Es wurden nur γ-sterilisierte Zellkulturmaterialien aus Plastik und autoklavierte Pipettenspitzen verwendet. Passagieren von Zellen Bei adhärenten Zellen wurde alle zwei Tage das Medium abgenommen und die Zellen einmal mit PBS gewaschen. Für 75 cm2-Flaschen wurden 2.5 ml Trypsin-EDTA-Lösung zugegeben und die Flasche 5 min im Brutschrank inkubiert. Sobald sich die Zellen abgelöst hatten, wurde ein Teil der Zellsuspension in eine neue, bereits mit Medium befüllte Flasche transferiert. Suspensionszellen wurden stets bei Zelldichten zwischen 105/ml und 106/ml gehalten. In der Regel wurden die Zellen alle zwei Tage mit frischem Zellkulturmedium im Verhältnis 1:5 bis 1:10 verdünnt. Bestimmung der Zellzahl Zur Bestimmung von Zellzahl und Lebendzellzahl wurde einer frisch suspendierten Kultur ein Aliquot entnommen und im Verhältnis 1:1 mit Trypanblaulösung gemischt. Der Farbstoff Trypanblau dringt nur in tote, nicht aber in lebende Zellen ein, wodurch diese voneinander unterschieden werden können. Die Zellsuspension wurde in eine Neubauer-Zählkammer gegeben. Die Zahl ungefärbter Zellen in zwei Großquadraten der Zählkammer multipliziert mit dem Kammerfaktor 104 ergab die Zellzahl pro Milliliter der Kultur. Einfrieren und Auftauen eukaryontischer Zellen Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase wurden geerntet und zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen, und das Zellpellet wurde in 0.9 ml kaltem FCS resuspendiert. Die Zellsuspension wurde in ein 2 ml-Kryoröhrchen transferiert, das dann in Eis gekühlt wurde. Nach der Zugabe von 100 µl DMSO wurden die Zellen zügig bei -80 °C eingefroren. 24 h später konnten die Zellen zur Dauerkonservierung in flüssigen Stickstoff überführt werden. Vor dem Auftauen von Zellen wurden 6 ml Zellkulturmedium in eine 25 cm2Zellkulturflasche und 3 ml in ein 5 ml-Röhrchen vorgelegt. Die Zellen wurden zügig im Wasserbad bei 37 °C aufgetaut und in das 5 ml-Röhrchen überführt. Nach Zentrifugation (45 Material und Methoden 47 s, 5500 rpm) wurde der Überstand dekantiert, und das Zellpellet mit 2 ml Medium in die Zellkulturflasche transferiert. Subklonierung durch limitierende Verdünnung Um Klone von Einzelzellen zu erhalten, wurden Zellen so verdünnt, dass beim Ausplattieren in 96-Loch-Platten eine theoretische Zellhäufigkeit von 0.1 Zellen pro Loch erreicht wurde. Bei der Subklonierung von Transfektanten wurde das entsprechende Antibiotikum zugesetzt. Hochwachsende Subklone wurden erneut getestet und gegebenenfalls kryokonserviert. 2.3.2. Transfektionen Stabile Transfektion Zur Herstellung von stabilen Transfektanten wurden die zu transfizierenden Zellen in Medium auf eine Zelldichte von 107/ml eingestellt. 10 µg Plasmid-DNA wurden mit 800 µl Zellsuspension in einer Elektroporationsküvette gemischt und 10 min auf Eis inkubiert. Zur Elektroporation wurden die folgenden Spannungen bei einer Kapazität von 960 µF verwendet: L1210: 320 V, B16: 280 V. Anschließend wurden die Zellen sofort in Medium überführt und im Brutschrank inkubiert. Nach 24-48 h wurden die Zellen in Selektionsmedium aufgenommen und 104/Loch in 96-Loch-Platten ausgesät. Dabei wurden für adhärente Zellen Platten mit flachem, für Suspensionszellen Platten mit rundem Boden verwendet. Resistente Klone wurden expandiert und funktionell und durch Oberflächenfärbung getestet. Positive Klone wurden zweimal durch limitierende Verdünnung subkloniert. Transiente Transfektion und Luciferase-Aktivitätsbestimmung Um das Vorhandensein und die Funktion des reversen Transaktivators (rtTA) zu überprüfen, wurden Zellen transient transfiziert. 2 × 106 Zellen wurden in einer Küvette in 400 µl kaltem RPMI mit 0.2 µg plucRenilla und 2.5 µg pUHC13-3luc gemischt. Zur Elektroporation wurden 320 V und 960 µF verwendet. Jeweils die Hälfte des Ansatzes wurde in 2 ml Medium mit oder ohne Doxycyclin (1 µg/ml) gegeben und 24 h inkubiert. Die Luciferase-Aktivitäten wurden mit dem Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega) bestimmt. Dazu wurden die Zellen abzentrifugiert (45 s, 5500 rpm), in 100 µl Passive Lysis Buffer resuspendiert und zweimal bei –20 °C eingefroren und wieder aufgetaut. 25 µl wurden für die Messung im Luminometer eingesetzt. 48 Material und Methoden 2.3.3. Zytotoxizitätstests Aktivierung von PC60-Zellen PC60-Zellen wurden 24 h vor dem Experiment auf eine Zelldichte von 105/ml eingestellt. Zur Aktivierung wurden die Zellen dann für 4-6 h mit 3.5 ng/ml PMA und 2.1 µg/ml Ionomycin inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen, auf eine Zelldichte von 3 × 106/ml eingestellt und anschließend als Effektorzellen im Zytotoxizitätstest verwendet. 51 Chrom-Freisetzungstest Effektorzellen wurden in Triplikaten in 96-Loch-Rundbodenplatten vorgelegt und bis zur Zugabe der Zielzellen im Brutschrank inkubiert. Alternativ wurde rekombinanter LZ-CD95L eingesetzt (Überstand mit ungefähr 5 µg/ml). 1-4 × 106 Zielzellen wurden zentrifugiert und in 100 µl Na251CrO4-Lösung (100 µCi) resuspendiert. Nach 45 min bei 37 °C wurden die Zielzellen dreimal mit je 2 ml Medium gewaschen und anschließend auf 105/ml eingestellt. 100 µl dieser Suspension wurden zu den Effektorzellen zugegeben und nach Zentrifugation (5 min, 800 rpm, 20 °C) für 16 h im Brutschrank inkubiert. Je 100 µl des Überstandes wurden abgenommen und im Gammacell gemessen. Die spezifische Zellyse L wurde nach der folgenden Formel berechnet: L=(E-S)/(T-S), wobei E=Zählrate der unbekannten Probe, S=spontane Freisetzung und T=maximale Freisetzung (bestimmt mit HCl als Effektor) bedeuten. Der Test wurde nur gewertet, wenn S/T<25 % war. Durchflusszytometrische Apoptose-Bestimmung Effektorzellen wurden in Triplikaten in 96-Loch-Rundbodenplatten vorgelegt. Alternativ wurde rekombinanter LZ-CD95L eingesetzt (Überstand mit ungefähr 5 µg/ml). Die Zielzellen wurden mit PBS gewaschen, in 1 ml PBS aufgenommen und mit 4 µl Carboxyfluoresceindiacetat-N-succinimidylester-Lösung (CFSE, 2.5 mM) versetzt. Nach 15minütiger Inkubation bei 37 °C wurde 1 ml FCS zugegeben, dreimal mit PBS gewaschen und die Zellen in RPMI aufgenommen. Je 100 µl (105/ml) der Zielzellen wurden zu den Effektorzellen gegeben. Nach Zentrifugation (800 rpm, 5 min) wurde über Nacht inkubiert. Die Zellen wurden resuspendiert, und je 100 µl wurden im FACScan analysiert. Die Zielzellen konnten anhand ihrer CFSE-Färbung identifiziert werden. Die Anzahl der toten Zielzellen wurde anhand des Forward/Sideward Scatters bestimmt. Material und Methoden 49 2.3.4. Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie (FACS) Die Expression von Zelloberflächenproteinen wurde durch Färbung mit spezifischen fluoreszenzmarkierten Antikörpern und anschließender Messung im FACScan bestimmt. Die Inkubationsschritte erfolgten bei 4 °C im Dunkeln. Erstantikörper wurden in FACS-Puffer (PBS mit 5 % FCS und 0.1 % NaN3) auf eine Konzentration von 10 µg/ml verdünnt. Die Zweitreagenzien Streptavidin-QuantumRed und -PE wurden 1:200 verdünnt. 5 × 105 Zellen wurden geerntet, in 1.5 ml Reaktionsgefäße überführt und zentrifugiert (4 min, 3500 rpm, 20 °C). Der Überstand wurde abgesaugt, und die Zellen wurden in 50 µl Erstantikörperlösung resuspendiert und 30 min inkubiert. Zum Waschen wurde 1 ml PBS zugegeben, zentrifugiert und der Überstand abgesaugt. Die Zellen wurden dann in 50 µl Zweitreagenzlösung resuspendiert, und nach 15-30 min Inkubation wurde wie oben gewaschen. Schließlich wurden die Zellen in 200 µl PBS aufgenommen und im FACScan gemessen. Zur Unterscheidung von toten und lebenden Zellen wurden 10 min vor der Messung 15 µl (20 µg/ml) Propidiumiodid (PI) zugegeben. Tote Zellen haben eine geschädigte und deshalb PIdurchlässige Zellmembran, so dass sie im FACScan als PI-positiv identifiziert werden können. 2.3.5. Tumor-spezifische Aktivierung von T-Zellen in vitro (MLTR) Zur Tumor-spezifischen Aktivierung von T-Zellen in vitro wurde eine gemischte Lymphozyten-Tumor-Reaktion (mixed lymphocyte tumor reaction, MLTR) duchgeführt. Als Stimulatorzellen wurden dazu die Tumorzellen auf 5 × 105/ml eingestellt und mit Strahlung aus einer 137 Cs-Quelle bestrahlt (Dosis P815, P815-Kb: 200 Gy; P815-Kb-CD95L: 160 Gy). Als Responderzellen wurden Milzzellen aus TCRPKO-Mäusen verwendet. Dazu die Milz entnommen, zur Vereinzelung der Zellen durch eine Gaze (PA-60/35 Nybolt, Eckert GmbH Waldkirch) gedrückt und zur Lyse von Erythrozyten für 30 s in eiskaltem RBC-Lyse-Puffer (0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2) resuspendiert. Die LyseReaktion wurde mit 10 ml eiskaltem PBS gestoppt. Die Zellen wurden abzentrifugiert (1300 rpm, 5 min) und in RPMI auf eine Dichte von 2 × 106/ml eingestellt. Gleiche Volumina von Stimulator- und Responderzellen wurden zusammengegeben und bei 37 °C im Brutschrank inkubiert. Die Reaktion wurde in 96-Loch-Rundbodenplatten, 12-Lochplatten oder aufrecht stehenden 75 cm2-Flaschen durchgeführt. 50 Material und Methoden 2.3.6. Aufreinigung von T-Zellen aus einer MLTR Zur Analyse der in einer MLTR generierten T-Zellen durch Immunfluoreszenzfärbung und FACScan wurden die Kokultur-Ansätze direkt für die Färbung eingesetzt. Um nur die lebenden Zellen in die weitere Auswertung einzuschließen, wurde im Forward/SidewardScatter ein entsprechendes Gate gesetzt. Für funktionelle Tests wurden aus dem Kokultur-Ansatz T-Zellen über einen FicollGradienten aufgereinigt. Dazu wurden 10 ml Lympholyte-M mit 35 ml des Ansatzes überschichtet und zentrifugiert (30 min, 1800 rpm, 20 °C, ohne Bremse). Der LymphozytenRing wurde abgenommen und mit Medium gewaschen. CD8+ T-Zellen wurden anschließend mit Hilfe von magnetischen anti-CD8 Micro-Beads (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach) nach Angaben des Herstellers aufgereinigt. Aus dem Durchlauf wurden gegebenenfalls CD4+ T-Zellen mit magnetischen anti-CD4 Micro-Beads aufgereinigt. Material und Methoden 51 2.4. Tierexperimentelle Methoden 2.4.1. Zucht und Typisierung von TCRPKO-Mäusen TCR tg+ Perforin-/- H-2d×k-Mäuse wurden durch Verpaarung von TCR tg+ Perforin-/- H-2dMäusen mit TCR tg+ Perforin-/- H-2k-Mäusen erhalten (Behrens et al., 2001; Schönrich et al., 1991). Der Perforin-Status der Tiere wurde durch Analyse genomischer DNA aus der Schwanzspitze mit Hilfe einer PCR bestimmt. Perforin-/--Mäuse haben eine NeomycinInsertion in Exon 3, die mit spezifischen Primern nachgewiesen werden kann. Folgender Ansatz wurde pro Probe verwendet: 1.5 µl 2.5 µl 0.25 µl 2.5 µl 5 µl 2.5 µl 0.25 µl 6.5 µl 4 µl MgCl2 10x PCR-Puffer Desoxyribonukleotide (je 10 mM) Primer JT98 Primer JT272 Primer JT308 Taq DNA-Polymerase (5 U/ml) Wasser genomische DNA (200-400 ng) Die Reaktion wurde wie folgt durchgeführt: 94 °C 94 °C 55 °C 72 °C 72 °C 4 min 1 min 1 min 1 min 5 min 30x Die Analyse in einem 1 %igen Agarosegel zeigte eine Bande von 600 bp bei Wildtypmäusen und eine Bande von 180 bp bei Perforin-/--Mäusen. Die Haplotypisierung und der Nachweis des transgenen TCR erfolgte durch Oberflächenfärbung von peripheren Blutlymphozyten. Dazu wurden die Mäuse retrookulär geblutet und das Blut (ca. 250 µl) in 500 µl Heparinlösung (5 U/ml Heparin-Natrium, 2 % FCS, 0.1 % NaN3) aufgefangen. Zur Isolierung der Lymphozyten wurde 1 ml Ficoll (d=1.077 g/cm3) in ein 5 ml Röhrchen vorgelegt und mit dem Heparinblut überschichtet. Nach Zentrifugation (30 min, 1800 rpm, 20 °C, ohne Bremse) wurden die Lymphozyten vorsichtig abgenommen und auf zwei Ansätze verteilt. Diese wurden in 96-Loch-Platten mit Vförmigem Boden mit Desire-FITC und K9-18-bio beziehungsweise Desire-FITC und 11.4.1bio als Erstantikörper und Streptavidin-QuantumRed als Zweitreagenz gefärbt. Die Proben wurden anschließend im FACScan gemessen. 52 Material und Methoden 2.4.2. Zucht und Typisierung von iNOS-/-- und p47phox-/--Mäusen iNOS-/-- und p47phox-/--Mäuse wurden als homozygote Stämme gehalten (Jackson et al., 1995; Laubach et al., 1995). Der iNOS- bzw. p47phox-Status wurde mit Hilfe einer PCR aus genomischer DNA bestimmt. Zur Bestimmung des p47phox-Status wurde folgender Ansatz pro Probe verwendet: 2.5 µl 0.5 µl 0.5 µl 0.5 µl 0.5 µl 0.5 µl 19 µl 1 µl 10x PCR-Puffer Desoxyribonukleotide (je 10 mM) Primer p47koA (50 pmol/µl) Primer p47koB Primer p47koC Taq DNA-Polymerase Wasser genomische DNA Die Reaktion wurde wie folgt durchgeführt: 94 °C 5 min 94 °C 1 min 65 °C 1 min Stepdown -1 °C pro Zyklus 72 °C 1 min 94 °C 1 min 60 °C 1 min 72 °C 1 min 72 °C 5 min 5x 30x Die Analyse in einem 1 %igen Agarosegel zeigt zwei Banden zwischen 600 und 800 bp. Die obere Bande zeigt das Vorhandensein des knockout-Allels an, die untere das des WildtypAllels. Zur Bestimmung des iNOS-Status wurde der gleiche Ansatz pro Probe wie bei p47phox verwendet, aber mit den Primern oIMR1216, oIMR1217, oIMR1218. Die Reaktion wurde wie folgt durchgeführt: 94 °C 1 min 30 s 94 °C 30 s 60 °C 30 s Stepdown -1 °C pro Zyklus 72 °C 30 s 94 °C 30 s 55 °C 30 s 72 °C 30 s 72 °C 2 min 5x 30x Die Analyse in einem 1 %igen Agarosegel zeigte eine Bande von 108 bp bei Wildtypmäusen und eine Bande von 270 bp bei iNOS-/- Mäusen. Material und Methoden 53 2.4.3. Tumorapplikation und Auswertung des Tumorwachstums Bei allen Tierexperimenten wurden die Kriterien zur vorzeitigen Tötung von Tumortragenden Ratten und Mäusen aus den Methodenempfehlungen der Arbeitsgemeinschaft der Tierschutzbeauftragten in Baden-Württemberg eingehalten. Zur Tumorapplikation wurde die gewünschte Zellzahl von Tumorzellen in 200 µl PBS resuspendiert und der Maus in die rechte Flanke subkutan injiziert. Zur Messung des Tumorwachstums wurden bei subkutan wachsenden Tumoren zwei senkrecht zueinander liegende Durchmesser des Tumors d1 und d2 mit einer Schieblehre gemessen und die Tumorfläche nach der vereinfachten Formel A=(d1d2)/2 berechnet. Tiere wurden als Tumortragend gewertet, wenn die Fläche 2 mm2 überstieg. Zur Behandlung mit Doxycyclin wurde den Mäusen Trinkwasser mit Doxycyclin (0.02 bis 2.0 g/l) und 5 % Saccharose in lichtdichten Trinkflaschen gegeben und alle drei Tage gewechselt. 2.4.4. Präparation von Tumoren, Milz und Lymphknoten zur ex vivo Analyse Die Tiere wurden durch Genickbruch oder CO2-Inhalation getötet. Tumorgewebe, Milz und mesenteriale Lymphknoten wurden entnommen und zur Vereinzelung der Zellen durch eine Gaze (PA-60/35 Nybolt, Eckert GmbH Waldkirch) gedrückt. Tumor- und Lymphknotenzellen wurden in RPMI gewaschen und in RPMI oder PBS aufgenommen. Zur ex vivo-Analyse von Oberflächenmarkern wurden die Tumore sofort mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gefärbt und im FACScan analysiert. Zur Analyse des Anteils lebender Zellen im Tumor wurden die Einzelzellsuspensionen direkt im FACScan gemessen und der Anteil lebender Zellen im Forward/Sideward Scatter bestimmt. Vor der Durchführung von funktionellen Tests wurden die Tumorzellen 2-5 Tage kultiviert. Milzzellen wurden nach der Vereinzelung zur Lyse von Erythrozyten für 30-60 s in eiskaltem RBC-Lyse-Puffer (0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2) resuspendiert. Die Reaktion wurde mit 10 ml eiskaltem PBS gestoppt. Die Zellen wurden abzentrifugiert (1300 rpm, 5 min) und in RPMI aufgenommen. 2.4.5. Isolation von Neutrophilen Zur Isolation von murinen Neutrophilen wurde TCRPKO-Mäusen 1 ml frisch bereitete, sterile Casein-Lösung (9 g β-Casein, 100 ml PBS, pH 7.2, 0.9 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2) intraperitoneal injiziert. Die Injektion wurde am nächsten Morgen wiederholt. Drei Stunden später wurden die Tiere durch CO2-Inhalation getötet. Die Neutrophilen wurden durch 54 Material und Methoden peritoneale Lavage mit 10 ml PBS (mit 0.02 % EDTA) isoliert. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und in RPMI aufgenommen. Die Reinheit der Neutrophilen lag zwischen 70 und 95 % (bestimmt durch Färbung mit anti-Gr-1). Über 95 % der Neutrophilen waren PI-negativ. Humane Neutrophile wurden aus dem peripheren Blut isoliert. 15 ml Ficoll in einem 50 mlRöhrchen wurden mit 35 ml peripherem Blut überschichtet und zentrifugiert (2420 rpm, 20 min, keine Bremse). Das Pellet wurde in 20 ml RPMI resuspendiert. Das gleiche Volumen Dextran-Salzlösung (3 % Dextran T-500 in 0.9 % NaCl) wurde zugegeben und mit der Zellsuspension vermischt. Das Röhrchen wurde etwa 20 min bei Raumtemperatur aufrecht stehengelassen, wobei die Zellen sedimentierten. Die Leukozyten-reiche Schicht über dem Erythrozyten-Pellet wurde abgenommen. Die verbliebenen Erythrozyten wurden durch hypotonische Lyse mit RBC-Lyse-Puffer (0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2) für 30 s entfernt. Die Reaktion wurde mit 20 ml PBS gestoppt, die Neutrophilen abzentrifugiert (1300 rpm, 5 min) und in RPMI aufgenommen. Ergebnisse 3. 55 ERGEBNISSE 3.1. Auswirkung der CD95L-Expression von Tumoren auf Tumorspezifische T-Zellen in vitro 3.1.1. Charakterisierung der Tumorzelllinien Um die Auswirkungen der CD95L-Expression von Tumoren auf Tumor-spezifische T-Zellen genauer charakterisieren zu können, wurde die Tumor-Counterattack-Situation zunächst in einem Modellsystem in vitro nachgestellt. Dazu wurden einerseits T-Zellen von anti-Kb TZell-Rezeptor transgenen Mäusen (Haplotyp H-2d×k) und andererseits verschiedene Transfektanten der Tumorzelllinie P815 (H-2d) eingesetzt (Schönrich et al., 1991). P815-Kb, P815-Kb-CD95L und P815-Kb-gld exprimierten das Modell-Tumorantigen Kb, nicht jedoch die Parentalzelllinie P815 (Abb. 3A). Nur bei P815-Kb-CD95L konnte eine CD95L- B P815 P815-Kb C spe z ifische Lyse [%] A P815 P815-Kb 50 Effektor: 40 P 815-K b-CD95L 30 P 815-K b-CD95L + CD95-Fc 20 10 P 815-K b 0 30:1 10:1 3:1 E/T Ra tio P815-Kb-gld P815-Kb-CD95L D spe z ifische Lyse [%] P815-Kb-CD95L P815-Kb-gld 60 Target: 50 P 815 40 30 P 815-K b 20 10 P 815-K bCD95L 0 1:50 Kb CD95L 1:100 1:200 V e rdünnung Abb. 3: Charakterisierung von P815-Kb-CD95L, P815-Kb und P815. A Kb-Expression wurde durch FACS-Färbung getestet (offen: anti-Kb, schwarz: Autofluoreszenz). B CD95L-Expression wurde durch FACS-Färbung getestet (offen: anti-CD95L, schwarz: Isotyp). C Zytotoxische Aktivität. P815-Kb-CD95L und P815-Kb wurden in verschiedenen Effektor-zu-Target-Verhätnissen mit 51 Cr-markierten P815-Kb- Targetzellen inkubiert. Wenn angegeben, wurde CD95-Fc (10 µg/ml) zugegeben. D Apoptose-Resistenz. P815-Kb-CD95L, P815-Kb und P815 wurden mit LZ-CD95L inkubiert. 51 Cr markiert und mit verschiedenen Verdünnungen von 56 Ergebnisse Expression durch FACS-Färbung und RT-PCR nachgewiesen werden (Abb. 3B bzw. nicht gezeigt). Auch bei einer Koinkubation mit CD95-sensitiven Tumorzellen besaß nur P815-KbCD95L CD95L-abhängige Zytotoxizität (Abb. 3C). P815-Kb-gld exprimierte CD95L mit der gld-Mutation (F273L), die zur funktionellen Inaktivität führt. P815, P815-Kb und P815-Kbgld waren sensitiv für CD95-vermittelte Apoptose, P815-Kb-CD95L dagegen war resistent (Abb. 3D und nicht gezeigt). 3.1.2. CD95L-Expression von Tumoren verhindert die Generierung von Tumorspezifischen T-Zellen in vitro Zur Analyse von Tumor Counterattack in vitro wurden gemischte Lymphozyten-TumorReaktionen (mixed lymphocyte tumor reactions, MLTRs) durchgeführt. Dabei wurden bestrahlte P815-Transfektanten (Haplotyp H-2d) als Stimulatorzellen eingesetzt. Als Responderzellen dienten Splenozyten aus anti-Kb T-Zell-Rezeptor-transgenen Mäusen (Haplotyp H-2d×k). Um zu untersuchen, ob eine CD95L-Expression des Tumors zur Deletion von anti-Kb TZellen führt, wurden die T-Zellen über einen Zeitraum von 5 Tagen durch Immunfluoreszenzfärbung und FACS analysiert. Bei einer MLTR mit P815-Kb nahm die Zahl von CD8+ anti-Kb T-Zellen zu (Abb. 4A). Die Expression des Kb-Antigens auf P815-Kb stimulierte also wie erwartet anti-Kb T-Zellen, was zur Proliferation der T-Zellen führte. Eine Kokultur mit P815-Kb-CD95L führte dagegen nicht zu einer Zunahme der CD8+ anti-Kb TZellen. Die zusätzliche Expression von CD95L verhinderte also die Generierung von anti-Kb T-Zellen. Bei einer MLTR mit P815 konnten nach 5 Tagen keine CD8+ anti-Kb T-Zellen mehr detektiert werden. Bei fehlender Expression des Kb-Antigens wurden also wie erwartet antiKb T-Zellen nicht stimuliert. Mit P815-Kb-gld wurden nach 5 Tagen ähnliche T-Zell-Zahlen detektiert wie mit P815-Kb, d.h. der inaktive gld-Ligand verhinderte die Generierung von CD8+ anti-Kb T-Zellen nicht (Abb. 4B). Zur Kontrolle wurden die Splenozyten mit P815-Kb in der Gegenwart von rekombinantem zytotoxischem CD95L (LZ-CD95L) stimuliert (Abb. 4A). Ähnlich wie bei der Expression von CD95L auf den Tumorzellen wurde keine Zunahme von CD8+ anti-Kb T-Zellen festgestellt. Als weitere Kontrolle wurde zur MLTR mit P815-Kb-CD95L anti-CD95LAntikörper zugegeben, um CD95L zu blockieren (Abb. 4D). Dadurch konnte zwar nur eine geringere Zahl von CD8+ anti-Kb T-Zellen generiert werden wie bei einer MLTR mit P815Kb, dennoch zeigt die teilweise Blockade die wichtige Rolle von CD95L bei diesem Vorgang. Ergebnisse 57 CD4+ anti-Kb T-Zellen werden durch das MHC-I-Molekül Kb nicht stimuliert. Die Zahl der CD4+ anti-Kb T-Zellen änderte sich daher nicht oder nahm ab (Abb. 4C). B 800 350 Za hl de r CD8 + P 815 P 815-K b P 815-K b-CD95L P 815-K b+ LZ-CD95L 400 TCR tg + T-Ze lle n 1200 TCR tg + T-Ze lle n Za hl de r CD8 + A 0 300 250 200 150 100 50 0 0 1 2 3 4 5 P 815 Ta ge M L TR C D 800 Za hl de r CD8+ TCR tg+ T-Ze lle n TCR tg T-Ze lle n 1200 P 815 P 815-K b P 815-K b-CD95L P 815-K b+ LZ-CD95L + Za hl de r CD4 + 1200 400 0 1 2 3 4 Ta ge M L TR E 1000 800 600 400 200 0 0 5 αCD95L 1- Stimulator: P815-Kb 2- 3 d0+3 4 d0+4 P815-Kb-CD95L 400 TCR tg + T-Ze lle n Za hl de r CD8 + P 815-K b- P 815-K bgld CD95L 300 200 100 P 815-K b P 815-K b-CD95L 0 1 2 3 T a ge Re stim ula tion Abb. 4: Aktivierung von anti-Kb T-Zellen durch CD95L+ und CD95L- Tumore. A, C Anzahl der CD8+ (A) bzw. CD4+ (C) anti-Kb T-Zellen. In einer MLTR wurden Splenozyten aus TCRPKO-Mäusen mit bestrahlten P815-Transfektanten kokultiviert. Wenn angegeben wurde LZ-CD95L (1:200) zugegeben. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurde jeweils ein Ansatz mit Antikörpern gegen den transgenen TCR, CD8 und CD4 gefärbt und im FACS analysiert. B Aktivierung der T-Zellen mit P815-Kb-gld. MLTRs mit den angegebenen P815-Transfektanten als Stimulatorzellen wurden nach 5 Tagen durch FACS-Färbung wie in A analysiert. D Einfluss der Blockierung von CD95L. Splenozyten aus TCRPKO-Mäusen wurden in einer MLTR mit P815-Kb oder P815-Kb-CD95L 5 Tage stimuliert. Wenn angegeben wurde bei P815-Kb-CD95L an den Tagen 0 und 3 oder 0 und 4 anti-CD95L Antikörper (10 µg/ml) zugegeben. E Restimulation von TZellen. Splenozyten aus TCRPKO-Mäusen wurden in einer MLTR mit P815-Kb oder P815-Kb-CD95L kokultiviert. Nach 5 Tagen wurden aus diesen Ansätzen T-Zellen über Gradientenzentrifugation aufgereinigt. Gleiche Zahlen von T-Zellen (2 × 106) wurden in einer erneuten MLTR mit P815-Kb für die angegebene Dauer restimuliert. 58 Ergebnisse Stim.: Gate: P815-Kb-gld TCR tg+ CD8+ CD69 P815-Kb-gld CD8+ P815-Kb-CD95L CD8+ P815 CD8+ n.d. CD25 CD44 Abb. 5: Expression von Aktivierungsmarkern auf stimulierten T-Zellen. Splenozyten aus TCRPKOMäusen wurden in einer MLTR mit den angegebenen P815-Transfektanten 5 Tage stimuliert. Die Ansätze wurden mit Antikörpern gegen den transgenen TCR, CD8 und die Aktivierungsmarker CD69, CD25 oder CD44 gefärbt. Gezeigt ist die Expression der Aktivierungsmarker der CD8+ bzw. TCR tg+ CD8+ Zellen. n.d. nicht gemessen. Um die Aktivierung der T-Zellen zu analysieren, wurde die Expression von Aktivierungsmarkern auf den T-Zellen untersucht (Abb. 5). CD8+ Zellen, die 5 Tage mit P815-Kb stimuliert worden waren, exprimierten CD69, kein CD44 und teilweise CD25. CD8+ Zellen, die mit P815-Kb-CD95L oder P815 stimuliert worden waren, exprimierten weder CD69, noch CD44 und teilweise CD25. Nur nach Stimulation mit P815-Kb waren also aktivierte T-Zellen vorhanden. Nach fünftägiger Stimulation mit P815-Kb-CD95L war eine geringe Zahl nicht aktivierter CD8+ anti-Kb T-Zellen vorhanden. Um zu überprüfen, ob diese Zellen anerg sind oder noch aktiviert werden können, wurden sie mit P815-Kb restimuliert (Abb. 4E). Dabei nahm ihre Zahl im Verlauf von 3 Tagen zu. Allerdings waren weniger CD8+ anti-Kb T-Zellen vorhanden als bei Restimulation von T-Zellen, die vorher mit P815-Kb aktiviert worden waren. Die Zahlen glichen sich jedoch innerhalb von 3 Tagen an. Die bei einer Stimulation mit P815-KbCD95L verbleibenden CD8+ anti-Kb T-Zellen verhielten sich also ähnlich wie naive T-Zellen. Ein entscheidender Faktor für die Bedeutung von Tumor Counterattack ist die Sensitivität der T-Zellen für CD95-vermittelte Apoptose. Nicht aktivierte CD8+ anti-Kb T-Zellen exprimierten CD95 nur in geringem Maße (Abb. 6A). Die Aktivierung mit P815-Kb führte zu Ergebnisse 59 B spe zifische Apoptose [%] A Tag 0 Tag 1 Splenozyten 100 80 LZ-CD95L 60 1:50 1:100 40 20 0 0 1 2 3 4 5 T a ge M LTR Tag 5 CD95 spe zifische Apoptose (%) C CD8+ T-Zellen 100 LZ-CD95L 80 1:12.5 1:25 60 1:50 40 20 0 0 1 3 5 Ta ge M L TR Abb. 6: Apoptose-Sensitivität von aktivierten anti-Kb T-Zellen. A CD95-Expression wurde durch FACSFärbung getestet (offen: anti-CD95, schwarz: Isotyp). B CD95-Sensitivität von aktivierten T-Zellen. Splenozyten aus TCRPKO-Mäusen wurden in einer MLTR mit P815-Kb für die angegebene Dauer aktiviert. T-Zellen wurden über Gradientenzentrifugation aufgereinigt, über Nacht mit den angebenenen Verdünnungen von LZ-CD95L inkubiert und der Anteil apoptotischer Zellen durch FSC/SSC-Analyse im FACS bestimmt. C CD95-Sensitivität von CD8+ T-Zellen. CD8+ Zellen aus Milzen von TCRPKO-Mäusen wurden in einer MLTR mit P815-Kb für die angegebene Dauer aktiviert und die CD95-Sensitivität wie in B bestimmt. einer erhöhten CD95-Expression. Frisch isolierte Splenozyten waren resistent gegenüber CD95-vermittelter Apoptose (Abb. 6B). Nach fünftägiger Stimulation mit P815-Kb waren die T-Zellen dagegen sensitiv. Die Sensitivität nahm ab Tag 3 der MLTR deutlich zu. Auch CD8+ T-Zellen waren an Tag 0 oder 1 wesentlich resistenter als nach 3 oder 5 Tagen Stimulation (Abb. 6C). 3.1.3. Tumor- und T-Zellen besitzen wechselseitige Zytotoxizität Durch Aktivierung werden T-Zellen sensitiver für CD95-vermittelte Apoptose. Daher wurde untersucht, ob CD95L+ Tumorzellen anti-Tumor T-Zellen direkt töten können und ob die CD95L-Expression einen Einfluss auf die Zytotoxizität der T-Zellen gegenüber den Tumorzellen hat. 60 Ergebnisse Dazu wurden zunächst anti-Kb T-Zellen in einer 5-tägigen MLTR mit bestrahlten P815-Kb generiert. Die so aktivierten T-Zellen konnten durch P815-Kb-CD95L lysiert werden, nicht jedoch durch P815-Kb oder P815-Kb-gld (Abb. 7A). Ein CD95L+ Tumor kann also in aktivierten anti-Tumor T-Zellen direkt Apoptose induzieren. Um zu untersuchen, inwieweit die CD95L-Expression eines Tumors die anti-Tumor Immunantwort behindert, wurde die Zytotoxizität der T-Zellen analysiert. Nicht aktivierte TZellen besaßen keine Zytotoxizität gegenüber P815, P815-Kb und P815-Kb-CD95L. T-Zellen, die 5 Tage in einer MLTR durch P815-Kb aktiviert wurden, lysierten P815-Kb, nicht jedoch P815 (Abb. 7B). Die Zytotoxizität gegenüber P815-Kb war nach 3-tägiger Aktivierung geringer als nach 5-tägiger Aktivierung (Abb. 7C). Sie war strikt abhängig von CD8+ Zellen B 50 40 spe zifische Lyse (%) spe zifische Lyse (%) A Effektor: 30 P 815-K b-CD95L 20 P 815-K b 10 P 815-K b-gld 0 30 10 50 40 Target: 30 P 815-Kb 20 P 815-Kb-CD95L 10 P 815 0 3 30 E/T Ra tio 3 D 30 25 Effektor: 20 T-Zellen 15 day 0 10 day 3 5 day 5 0 30 10 spe zifische Lyse (%) C spe zifische Lyse (%) 10 E/T Ra tio 40 Target: P 815-K b 30 20 P 815-K b-CD95L 10 0 30 3 E/T Ra tio 10 3 P 815-K b-CD95L + anti-CD95L E/T Ra tio Abb. 7: Wechselseitige Zytotoxizität von P815-Kb-CD95L und anti-Kb T-Zellen. A Zytotoxizität von Tumorzelllinien gegenüber aktivierten T-Zellen. Splenozyten aus TCRPKO-Mäusen wurden in einer MLTR mit P815-Kb 5 Tage aktiviert. Die aktivierten T-Zellen wurden nach Gradientenzentrifugation als Targetzellen mit 51Cr markiert und mit den angegebenen P815-Transfektanten in verschiedenen Effektor-zuTarget-Verhältnissen inkubiert (spontane Lyse: 35 %). B Zytotoxizität von anti-Kb T-Zellen gegenüber Tumorzellen. Aktivierte anti-Kb T-Zellen wurden mit den angegebenen 51Cr-markierten P815-Transfektanten in verschiedenen Effektor-zu-Target-Verhältnissen inkubiert. C Abhängigkeit der Zytotoxizität von anti-Kb T-Zellen von der Aktivierungsdauer. Splenozyten aus TCRPKO-Mäusen wurden in einer MLTR mit P815Kb für die angegebene Dauer aktiviert und dann nach Gradientenzentrifugation mit 51Cr-markierten P815-KbTargetzellen inkubiert. D Einfluß der CD95L-Expression der Tumorzellen auf die Zytotoxizität von anti-Kb T-Zellen. Aktivierte anti-Kb T-Zellen wurden mit 51 Cr-markierten P815-Kb- oder P815-Kb-CD95L- Targetzellen inkubiert. Als Targetzellen wurden außerdem 51 Cr-markierte P815-Kb-CD95L eingesetzt, bei denen durch vorherige Inkubation mit anti-CD95L-Antikörper CD95L blockiert wurde. Ergebnisse 61 (nicht gezeigt). Die mit P815-Kb aktivierten T-Zellen waren auch gegenüber P815-Kb-CD95L zytotoxisch (Abb. 7B), allerdings in geringerem Maße als gegenüber P815-Kb. Um zu untersuchen, ob diese verringerte Lyse von P815-Kb-CD95L auf die CD95L-Expression oder auf die erhöhte Apoptose-Resistenz zurückzuführen ist, wurde vor der Zugabe der aktivierten T-Zellen CD95L auf P815-Kb-CD95L mit Hilfe eines anti-CD95L Antikörpers blockiert (Abb. 7D). P815-Kb-CD95L wurde mit und ohne Blockade von CD95L in gleichem Maße durch die TZellen lysiert. Für die geringere Lyse durch T-Zellen scheint also die erhöhte ApoptoseResistenz von P815-Kb-CD95L verantwortlich zu sein. Die Blockade von CD95L hatte keinen Einfluss auf die spontane Lyse von P815-Kb-CD95L und auf die Sensitivität gegenüber LZ-CD95L (nicht gezeigt). Im Unterschied zu T-Zellen, die mit P815-Kb aktiviert wurden, besaßen T-Zellen, die mit P815-Kb-CD95L stimuliert wurden, keinerlei zytotoxische Aktivität gegenüber den Tumorzelllinien (nicht gezeigt). Insgesamt besteht also eine wechselseitige Zytotoxizität zwischen einem CD95L+ Tumor und aktivierten anti-Tumor T-Zellen. Die CD95L-Expression des Tumors verhindert zwar die Generierung von zytotoxischen anti-Tumor T-Zellen in vitro. Sie hat aber keinen Einfluss auf die Lyse des Tumors durch die T-Zellen. 3.1.4. Kostimulation mit B7 hat keinen nachweisbaren Einfluss auf die Generierung Tumor-spezifischer T-Zellen Die Kostimulation von aktivierten T-Zellen über CD28 führt zu einer erhöhten ApoptoseResistenz der T-Zellen (Kirchhoff et al., 2000). Mit Hilfe von Kostimulation könnten TZellen also möglicherweise vor Tumor Counterattack geschützt werden. Um dies im in vitroModell zu überprüfen, wurden P815-Kb-Transfektanten eingesetzt, die mit dem kostimulatorischen Molekül B7 transfiziert waren (P815-Kb-B7). Splenozyten aus TCRPKO-Mäusen wurden mit P815-Kb oder P815-Kb-B7 5 Tage lang aktiviert und dann auf ihre CD95-Sensitivität getestet. P815-Kb-B7-stimulierte T-Zellen waren nicht resistenter als P815-Kb-stimulierte T-Zellen (Abb. 8A). Außerdem wurden die Splenozyten aus TCRPKO-Mäusen in der Gegenwart von rekombinantem zytotoxischem CD95L (LZ-CD95L) stimuliert (Abb. 8B). In An- und Abwesenheit von B7 wurden jeweils gleiche Zahlen an CD8+ anti-Kb T-Zellen generiert. Eine Kostimulation mit B7 hatte also keinen nachweisbaren Einfluss auf die Tumor Counterattack Situation in vitro. 62 Ergebnisse V e rdünnung LZ-CD95L P 815-K b-B 7 400 200 1:25 1:50 0 1:100 1:100 1:50 1:25 0 P 815-K b-gld 600 1:200 P 815-K b-B 7 20 10 800 1:400 P 815-K b 30 1000 1:800 50 40 0 60 Za hl de r CD8+ TCR tg+ T-Ze lle n B 1:12.5 spe z ifische Apoptose (%) A V e rdünnung LZ-CD95L Abb. 8: Einfluß der Kostimulation mit B7 auf die Aktivierung von anti-Kb T-Zellen. A CD95Sensitivität von aktivierten T-Zellen. Splenozyten aus TCRPKO-Mäusen wurden in MLTRs mit P815-Kb oder P815-Kb-B7 5 Tage lang aktiviert. Die aktivierten T-Zellen wurden über Nacht mit den angebenenen Verdünnungen von LZ-CD95L inkubiert und der Anteil apoptotischer Zellen durch FSC/SSC-Analyse im FACS bestimmt. B Anzahl der CD8+ anti-Kb T-Zellen. In MLTRs wurden Splenozyten aus TCRPKOMäusen mit P815-Kb-gld oder P815-Kb-B7 5 Tage lang aktiviert. Die angegebenen Verdünnungen von LZCD95L wurden zugegeben. Jeweils zwei Ansätze wurden mit Antikörpern gegen den transgenen TCR, CD8 und CD4 gefärbt und im FACS analysiert. Ergebnisse 63 3.2. Einfluss des CD95L-Expressionsniveaus auf die Abstoßung von CD95L+ Tumoren in Mäusen 3.2.1 Generierung und Charakterisierung von LKC-CD95L-Klonen mit unterschiedlicher Zytotoxizität Um den Einfluss des CD95L-Expressionsniveaus auf die Abstoßung von CD95L+ Tumoren in Mäusen zu untersuchen, wurden Tumorzelllinien generiert, die unterschiedliche Mengen von CD95L konstitutiv exprimieren. Dazu wurde das Lymphom L1210 benutzt, das bereits mit anti-sense CD95 und dem Kb-Antigen transfiziert war (Bezeichnung: LF-Kb, Abb. 9A). Diese Zellen wurden mit dem murinen CD95L (Plasmid pFM92-mCD95L) oder der Vektorkontrolle transfiziert (Bezeichnung LKC-CD95L bzw. LKC). Außerdem wurde der Caspasen-Inhibitor crmA (Plasmid pEFpuroPGKcrmA) kotransfiziert, um die Apoptoseresistenz der Zellen zu erhöhen. Es wurden Klone von LKC-CD95L mit unterschiedlicher Zytotoxizität ausgewählt und zweimal subkloniert (Abb. 9B). LKC-CD95L A L1210 antisenseFas LF - Kb LF-Kb D CD95L LKC-CD95L crmA LKC spe z ifische Lyse [%] B Effektor: high (A1) A1 LKC-CD95L 35 30 25 20 med (A4) A4 LKC-CD95L low (A5) A5 LKC-CD95L 15 10 5 0 low (A6) A6 LKC-CD95L low B3 LKC-CD95L LKC-CD95L (A1) (B3) LK C LKC 30 10 3 Effe ktor/Ta rge t Ra tio C Kb LKC B3 A6 A5 A4 A1 LKC-CD95L CD95L ß-Aktin Abb. 9: Charakterisierung von LKC-CD95L Klonen mit unterschiedlicher Zytotoxizität. A Transfektionsschema. B Zytotoxische Aktivität. LKC oder verschiedene Klone von LKC-CD95L wurden in verschiedenen Effektor-zu-Target-Verhätnissen mit 51 Cr-markierten P815-Kb-Targetzellen inkubiert. C CD95L-Expression wurde durch RT-PCR getestet. D Kb-Expression wurde durch FACS-Färbung getestet (gezeigt für LKC und LKC-CD95L Klon A1; offen: anti-Kb, schwarz: Autofluoreszenz). 64 Ergebnisse Klone mit niedriger Zytotoxizität (<10 % spezifische Lyse, Klone A5, A6, B3) wurden als LKC-CD95Llow bezeichnet, Klone mit mittlerer Zytotoxizität (10-20 %, Klon A4) als LKCCD95Lmed und Klone mit hoher Zytotoxizität (>25 %, Klon A1) als LKC-CD95Lhigh. In einer RT-PCR konnte eine CD95L-Expression in allen Klonen nachgewiesen werden (Abb. 9C). Die zytotoxische Aktivität von LKC-CD95L nahm allerdings bei Kultivierung in vitro mit der Zeit ab. LKC besaß keine zytotoxische Aktivität (Abb. 9B) und zeigte keine CD95LExpression auf RNA-Ebene (Abb. 9C). Die erhaltenen Klone von LKC-CD95L und LKC exprimierten das Kb-Molekül in gleichem Maße (Abb. 9D). LKC-CD95L und LKC waren resistent gegenüber CD95-vermittelter Apoptose (Abb. 10A). Eine FACS-Färbung zeigte, dass alle Klone den CD95-Rezeptor in einem geringen Maße exprimierten (Abb. 10B). Durch RT-PCR konnte die crmA-Expression in allen Klonen nachgewiesen werden (nicht gezeigt). Die Wachstumsgeschwindigkeit aller Klone in vitro war gleich (nicht gezeigt). LKC und die LKC-CD95L Klone erfüllten also in vitro die für das Tumormodell A spe z ifische Lyse [%] wesentlichen Eigenschaften und unterschieden sich nur in ihrer CD95L-Expression. 60 Target: Jurkat Jurkat 50 40 30 high (A1) A1 LKC-CD95L 20 low (A5) A5 LKC-CD95L 10 LK C LKC 0 1:25 1:50 1:100 V e rd ü n n u n g B LF-Kb CD95 LKC CD95 LKC-CD95L (A1) CD95 LKC-CD95L (A4) CD95 Abb. 10: Apoptose-Resistenz und CD95-Expression von LKC-CD95L Klonen. A Apoptose-Resistenz. LKC, die LKC-CD95L Klone (gezeigt für Klone A1 und A5) und die Positivkontrolle Jurkat wurden mit verschiedenen Verdünnungen von LZ-CD95L inkubiert, und der Anteil apoptotischer Zellen wurde durch FSC/SSC-Analyse im FACS bestimmt. B CD95-Expression wurde durch FACS-Färbung getestet. Gezeigt sind die Färbungen der Ausgangszelllinie LF-Kb sowie von LKC und den LKC-CD95L Klonen A1 und A4 (offen: anti-CD95, schwarz: Istotyp). Ergebnisse 65 3.2.2 LKC-CD95L-Klone wachsen in Nacktmäusen nur langsam Ein Wachstumsnachteil von CD95L+ Tumoren wurde bereits in Nacktmäusen in Abwesenheit einer anti-Tumor-spezifischen Immunantwort gefunden (Behrens et al., 2001). Daher wurden LKC-CD95L Klone mit unterschiedlicher zytotoxischer Aktivität und die CD95L- Zelllinie LKC in Nacktmäuse subkutan injiziert (Abb. 11A). LKC Tumore wuchsen sehr schnell. Alle LKC-CD95L Tumore wuchsen deutlich langsamer und mit etwa gleicher Geschwindigkeit. Das CD95L-Expressionsniveau hatte also keinen nachweisbaren Einfluss auf das Wachstum der CD95L+ Tumore. A B Tum orgröße (m m 2 ) 140 120 LK C LKC 100 high (A1) A1 LKC-CD95L 80 med (A4) A4 LKC-CD95L 60 low (A5) A5 LKC-CD95L 40 LKC ex vivo low (A6) A6 LKC-CD95L 20 low (B3) B3 LKC-CD95L 0 0 5 12 14 16 19 21 23 26 LKC-CD95L (A4) ex vivo Ta ge n a ch Inje ktion spe z ifische Apoptose (%) C Kb 60 Effektor: LZ-CD95L 50 40 Verdünnung 30 1:25 20 1:50 10 1:100 CD95L ß-Aktin 0 Jurkat 1 Target: D 2 in 3 4 vitro LKC-CD95L (A5) 5 6 ex vivo 7 8 LKC-CD95L (A1) Abb. 11: Wachstum von LKC-CD95L Klonen mit unterschiedlicher Zytotoxizität in Nacktmäusen. A Tumorwachstum in Nacktmäusen. LKC oder die verschiedenen Klone von LKC-CD95L (107 Zellen) wurden subkutan in Balb/c nude/nude Mäuse injiziert (mind. 3 Tiere pro Gruppe). Das Tumorwachstum wurde durch Messung der Tumorfläche verfolgt. B Expression des Kb-Antigens ex vivo. Einzelzellsuspensionen der Tumore wurden direkt mit einem anti-Kb-Antikörper gefärbt und im FACS analysiert. Exemplarisch gezeigt sind die Ergebnisse eines LKC und eines LKC-CD95L (Klon A4) Tumors (offen: anti-Kb, schwarz: Autofluoreszenz). C Apoptose-Resistenz ex vivo. Aus LKC-CD95L Tumoren wurden Einzelzellsuspensionen hergestellt (ex vivo). Nach Behandlung mit verschiedenen Verdünnungen von LZ-CD95L wurde der Anteil apoptotischer Zellen durch FSC/SSC im FACS bestimmt. Exemplarisch gezeigt sind Ergebnisse der Klone A1 und A5. Als Kontrollen wurden die ursprünglichen Zellen LKC-CD95L (in vitro) und die Positivkontrolle Jurkat eingesetzt. D CD95LExpression ex vivo. Aus LKC-CD95L Tumoren wurde RNA isoliert. CD95L-Expression wurde durch RT-PCR nachgewiesen. 66 Ergebnisse Die Tumore wurden nach dem Töten der Tiere entnommen. Sie exprimierten alle noch das Antigen Kb (Abb. 11B) und waren genauso resistent gegenüber CD95-vermittelter Apoptose wie die ursprünglichen Zellen (Abb. 11C). Durch RT-PCR konnte die Expression von CD95L in LKC-CD95L Tumoren nachgewiesen werden (Abb. 11D). Die LKC-CD95L Klone besaßen aber eine geringere Zytotoxizität als vor der Injektion. Ergebnisse 67 3.2.3 LKC-CD95L-Klone werden in TCRPKO-Mäusen abgestoßen Um eine mögliche Auswirkung der CD95L-Expression auf anti-Tumor T-Zellen zu untersuchen, wurden die LKC-CD95L Klone in TCRPKO-Mäuse injiziert. Es bildeten sich jedoch trotz Injektion hoher Zellzahlen (107) nur in wenigen Mäusen und erst sehr spät Tumore (Abb. 12A). Die Tumore exprimierten ex vivo das Kb-Antigen nicht mehr (Abb. 12B). CD95 war stärker exprimiert als in den ursprünglichen Zelllinien (Abb. 12C). Außerdem besaßen die Tumorzellen keine zytotoxische Aktivität mehr (Abb. 12D). Daher konnte eine Auswirkung auf die T-Zellen nicht untersucht werden. A Tum orinz ide nz (%) 100 80 high (A1) A 1 LKC-CD95L 60 med (A4) A 4 LKC-CD95L low (A5) A 5 LKC-CD95L 40 low (A6) A 6 LKC-CD95L B 3 low (B3) LKC-CD95L 20 0 0 8 13 17 22 27 32 36 41 Ta ge na ch Inje ktion D Kb LKC-CD95L (A4) Kb C LKC-CD95L (A1) 120 80 E/T 60 30 (5) 40 10 (1) 20 3 (0.2) 0 LKC-CD95L (A4) 1 Effektor: CD95 Target: P815-Kb 100 B16-CD95L LKC-CD95L (A1) spe z ifische Lyse (%) B 2 3 4 5 6 7 8 LKC-CD95L ex vivo 9 CD95 Abb. 12: Wachstum von LKC-CD95L in TCRPKO-Mäusen. A Tumorinzidenz von LKC-CD95L. Die verschiedenen Klone von LKC-CD95L (107 Zellen) wurden s.c. in TCRPKO-Mäuse injiziert. B, C Expression von Kb (B) und CD95 (C) ex vivo. Einzelzellsuspensionen der Tumore wurden direkt mit einem anti-Kb-Antikörper (B) oder einem anti-CD95-Antikörper (C) gefärbt und im FACS analysiert (offenes Histogramm). Als Kontrolle wurden die ursprüngliche Zelllinien gefärbt [grau: anti-Kb (B) bzw. anti-CD95 (C); schwarz: Autofluoreszenz (B) bzw. Isotyp (C)]. Exemplarisch gezeigt sind die Ergebnisse von 2 Tumoren. D Zytotoxizität von LKC-CD95L ex vivo. Aus LKC-CD95L Tumoren wurden Einzelzellsuspensionen hergestellt. Diese Zellen wurden als Effektorzellen in den angegebenen Effektorzu-Target-Verhätnissen (30, 10 und 3) mit 51Cr-markierten P815-Kb-Targetzellen inkubiert. Als Kontrolle wurden B16-CD95L als Effektorzellen (E/T-Verhältnisse 5, 1 und 0.2) eingesetzt. 68 Ergebnisse 3.3. Einfluss des Zeitpunkts der CD95L-Expression auf die Abstoßung von CD95L+ Tumoren in Mäusen 3.3.1 Generierung und Charakterisierung von LKCR-tetCD95L und LKCR Um zusätzlich den Einfluss des Zeitpunktes der CD95L-Expression untersuchen zu können, wurde das anti-Kb TCR-transgene Mausmodell dahingehend erweitert, dass CD95L nicht konstitutiv, sondern mit dem tet-System (Gossen et al., 1995) induzierbar exprimiert werden konnte. Für das hier verwendete tet-on-System wurden zwei Komponenten in den Zellen benötigt: zum einen das zu induzierende CD95L-Gen hinter einem speziellen tet-responsiven Promotor; zum anderen der konstitutiv exprimierte reverse Transaktivator (rtTA), der nur in Anwesenheit von Doxycyclin an den tet-responsiven Promotor bindet und so die Transkription von CD95L aktiviert. Zur Generierung der für das Tumormodell benötigten Zelllinie wurde das Lymphom L1210, das bereits mit anti-sense CD95 und dem Kb-Antigen transfiziert war, benutzt (Bezeichnung: LF-Kb, Abb. 13A). Diese Zellen wurden mit dem rtTA des tet-Systems (Plasmid pUHG17-1, A B rtTA LF -K b LKCR LKCR tet- LKCR-tetCD95L LKCR-tetCD95L mCD95L Kb D 140 120 100 80 60 40 20 0 + Dox - Dox 0 1 2 3 4 spe zifische Lyse [%] 10 4 Ze lle n/m l C Kb 120 Target: 100 P 815-K b 80 60 L1210 40 LF-K b 20 5 Ta ge LK CRtetCD95L 0 1 0,2 E/T Ra tio Abb. 13: Charakterisierung von LKCR-tetCD95L und LKCR. A Transfektionsschema. B Kb-Expression wurde durch FACS-Färbung nachgewiesen (offen: anti-Kb, schwarz: Autofluoreszenz). C 4 Wachstumsgeschwindigkeit in vitro. 10 Zellen von LKCR-tetCD95L wurden an Tag 0 in Abwesenheit oder Gegenwart von Doxycyclin (1 µg/ml) ausplattiert, und die Zellzahl wurde täglich bestimmt. Gezeigt sind Mittelwerte und Standardabweichungen von je drei Kulturen. D Apoptose-Resistenz. LKCR-tetCD95L, die Parentalzelllinien L1210 und LF-Kb sowie die Positivkontrolle P815-Kb wurden mit den Effektorzellen B16-CD95L koinkubiert. 51 Cr markiert und mit Ergebnisse 69 Puromycin-Resistenz pEFpuroPGK) transfiziert (Bezeichnung: LKCR). Durch transiente Transfektion von LKCR mit einem rtTA-abhängigen Luciferase-Konstrukt (pUHD13-3) wurden positive Klone selektioniert und dreimal subkloniert (nicht gezeigt). Ein positiver Klon von LKCR wurde mit CD95L unter Kontrolle eines rtTA-abhängigen Promotors (Plasmid: p10-3/mAPO-1L, Hygromycin-Resistenz pX343) transfiziert (Bezeichnung: 51 LKCR-tetCD95L). Klone mit induzierbarer zytotoxischer Aktivität wurden durch Cr- Freisetzungstests identifiziert und dreimal subkloniert. Die erhaltenen Klone von LKCR-tetCD95L und LKCR exprimierten das Kb-Molekül in gleichem Maße (Abb. 13B). LKCR-tetCD95L und LKCR waren resistent gegenüber CD95vermittelter Apoptose (Abb. 13D und nicht gezeigt). Sie waren auch in Anwesenheit von Doxycyclin CD95-resistent; Doxycyclin sensitivierte die Zellen also nicht. FACS-Färbung und RT-PCR zeigten, dass LKCR-tetCD95L und LKCR den CD95-Rezeptor in einem geringen Maße exprimieren (nicht gezeigt). Außerdem waren beide Zelllinien resistent spe z ifische Lyse [%] 100 + Dox 80 - Dox 60 + + + + 40 20 0 24 12 6 Dox anti-CD95L Dox Is oty p spe z ifische Lyse [%] C A 2.0 40 1.0 30 0.2 20 10 0.05 0.0 0 10 3 E/T Ra tio D Dox - Doxycyclin (µg/ml) 60 50 30 3 E/T Ra tio B 70 Dox + CD95L CD95L ß-Aktin ß-Aktin Abb. 14: Induzierbarkeit von CD95L in LKCR-tetCD95L. A Induzierbare Zytotoxizität von LKCRtetCD95L. LKCR-tetCD95L wurde in den angegebenen Effektor-zu-Target-Verhätnissen mit 51 Cr- b markierten P815-K -Targetzellen in Abwesenheit oder Gegenwart von Doxycyclin (1 µg/ml) inkubiert. Wenn angegeben, wurde anti-CD95L Antikörper (10 µg/ml) oder Isotypkontrolle zugegeben. B Induzierbare CD95L-Expression wurde durch RT-PCR nachgewiesen. LKCR-tetCD95L wurden davor 24 h in Ab- oder Anwesenheit von Doxycyclin (1 µg/ml) inkubiert. C Konzentrationsabhängige zytotoxische Aktivität von LKCR-tetCD95L. LKCR-tetCD95L wurde mit 51 Cr-markierten P815-Kb-Targetzellen in Anwesenheit der angegebenen Doxycyclin-Konzentrationen inkubiert. D Konzentrationsabhängige CD95L-Expression wurde durch RT-PCR nachgewiesen. LKCR-tetCD95L wurden davor 24 h mit verschiedenen Konzentrationen von Doxycyclin (0 - 2.0 µg/ml) inkubiert. 70 Ergebnisse gegenüber TRAIL-vermittelter Apoptose (nicht gezeigt). Die Wachstumsgeschwindigkeit von LKCR-tetCD95L in vitro war in Anwesenheit und Abwesenheit von Doxycyclin (1 µg/ml) im Medium gleich schnell (Abb. 13C). LKCR-tetCD95L besaß in der Anwesenheit von Doxycyclin zytotoxische Aktivität, die sich durch einen anti-CD95L-Antikörper vollständig blockieren ließ (Abb. 14A). In Abwesenheit von Doxycyclin wurde keine zytotoxische Aktivität beobachtet. Die Höhe der zytotoxischen Aktivität von LKCR-tetCD95L war abhängig von der Doxycyclin-Konzentration im Medium (Abb. 14C). Auch in einer RT-PCR war die Expression abhängig von der DoxycyclinKonzentration (Abb. 14D). Allerdings war bereits in der Abwesenheit von Doxycyclin eine schwache Expression zu sehen (Abb. 14B). LKCR besaß weder in Anwesenheit noch in Abwesenheit von Doxycyclin zytotoxische Aktivität (nicht gezeigt). Auch auf RNA-Ebene wurde keine CD95L-Expression festgestellt (nicht gezeigt). Um die Stabilität von LKCR-tetCD95L ohne Selektionsdruck durch Antibiotika festzustellen, wurden die Zellen ohne Selektionsdruck in vitro kultiviert (nicht gezeigt). Im Zeitraum von 7 Wochen nahm die induzierbare zytotoxische Aktivität etwas ab. Die Kb-Expression war noch vorhanden. Die CD95-Expression und die Sensitivität für CD95-vermittelte Apoptose änderten sich nicht. Die Zelllinie ist also in vitro auch ohne Selektionsdruck über einen ausreichend langen Zeitraum stabil. Die Zelllinien LKCR und LKCR-tetCD95L erfüllten also in vitro die für das Tumormodell wesentlichen Eigenschaften. Insbesondere exprimierten beide das Modell-Tumorantigen Kb und waren selbst resistent gegenüber CD95-vermittelter Apoptose. Durch Doxycyclin konnte nur in LKCR-tetCD95L eine CD95L-Expression induziert werden. Eine basale zytotoxische Aktivität konnte weder in LKCR noch in LKCR-tetCD95L beobachtet werden. 3.3.2 LKCR-tetCD95L wird in Nacktmäusen nach CD95L-Induktion abgestoßen Um den Einfluss des Zeitpunktes und des Niveaus der CD95L-Expression in vivo untersuchen zu können, wurden LKCR-tetCD95L und LKCR in Nacktmäuse subkutan injiziert. Die Tiere bekamen nach etwa einer Woche sichtbare Tumore und mussten nach etwa zwei Wochen getötet werden. Einige Tumor-tragende Tiere wurden für 1, 3 oder 5 Tage mit Doxycyclin behandelt. Um eine mögliche Abstoßung der Tumore durch die CD95L-Induktion festzustellen, wurde der Anteil an lebenden Zellen im Tumor bestimmt. Dazu wurden Einzelzellsuspensionen der Tumore durch FSC/SSC im FACS analysiert (Abb. 15A). Aus unbehandelten Mäusen wurden 71 % lebende Zellen isoliert. Einen Tag nach Beginn der Doxycyclin-Gabe (2 g/l) konnten noch 48 % lebende Tumorzellen detektiert werden. Bei Ergebnisse 71 längeren Behandlungen (3 oder 5 Tage) wurden die Tumore komplett abgestoßen (<5 % lebende Zellen). Die toten Bereiche im Tumor konnten auch makroskopisch bei der Präparation erkannt werden. Bei LKCR-Kontrolltumoren gab es keinen Unterschied zwischen behandelten und unbehandelten Tieren. Ex vivo waren die Tumorzellen alle noch genauso resistent gegenüber CD95-vermittelter Apoptose wie die ursprünglichen Zellen (Abb. 15B). Eine CD95L-Expression zu einem späteren Zeitpunkt in einem etablierten Tumor führt also ebenso zur Abstoßung wie eine konstitutive Expression. Mit dem tet-System lässt sich die Gen-Expression konzentrationsabhängig regulieren. Um niedrigere Expressionsniveaus von CD95L zu erzielen, wurden einigen Tieren geringere Konzentrationen von Doxycyclin ins Trinkwasser gegeben (Abb. 15A). Auch bei 0.2 g/l lebende Zellen (%) A 100 80 60 40 20 0 Tage Dox (g/l) 0 Zellen 1 3 5 1 3 5 1 3 5 0.02 0.2 2.0 LKCR-tetCD95L 1 0 3 5 2.0 LKCR spe z ifische Apoptose [%] B Target: 100 80 Jurk at 60 LK CR-tetL 40 20 0 1:12.5 1:25 1:50 LK CR-tetL ex ex vivo vivo LK CR ex vivo vivo ex V e rd ü n n u n g L Z-CD95L Abb. 15: Tumorabstoßung nach CD95L-Induktion in Nacktmäusen. A Tumorabstoßung nach CD95LInduktion. LKCR-tetCD95L oder LKCR (107 Zellen) wurden s.c. in Nacktmäuse injiziert. Nach Tumorinzidenz (Größe ca. 30 mm2) wurden die Mäuse mit den angegebenen Konzentrationen von Doxycyclin im Trinkwasser für die angegebene Dauer behandelt. Die Tumore wurden isoliert, und Einzelzellsuspensionen wurden durch FSC/SSC im FACS analysiert. B Apoptose-Resistenz der Tumorzellen ex vivo. Aus den Tumoren der unbehandelten Nacktmäuse wurden Einzelzellsuspensionen von LKCR-tetCD95L und LKCR hergestellt (LKCR-tetL ex vivo bzw. LKCR ex vivo). Nach Behandlung mit verschiedenen Verdünnungen von LZ-CD95L wurde der Anteil apoptotischer Zellen durch FSC/SSC im FACS bestimmt. Als Kontrollen wurden die ursprünglichen Zellen LKCR-tetCD95L und die Positivkontrolle Jurkat eingesetzt. 72 Ergebnisse wurden die Tumore schnell abgestoßen (<5 % lebende Zellen nach 3 Tagen). Bei 0.02 g/l nahm der Anteil lebender Zellen zunächst auf 9 % ab (nach 3 Tagen). Nach 5 Tagen wurden wieder mehr lebende Zellen detektiert (49 %). In diesen Tumoren waren aber makroskopisch große tote Bereiche zu erkennen. Geringere Doxycyclin-Konzentrationen verzögerten eine Abstoßung von LKCR-tetCD95L also nur minimal. Ein niedrigeres CD95L- + Expressionsniveau führte also auch in diesem Modell zur Abstoßung der CD95L Tumore. 3.3.3 Nach CD95L-Induktion wird LKCR-tetCD95L auch in NOD/SCID-Mäusen abgestoßen LKCR-tetCD95L wurde außerdem in NOD/SCID-Mäuse subkutan injiziert. Aufgrund der scid (severe combined immunodeficiency)-Mutation haben diese Mäuse keine funktionellen T- und B-Zellen. Wegen des NOD (nonobese diabetic)-Hintergrundes besitzen sie Defekte in der NK-Zell-Funktion, der Regulation des T-Zell-Repertoires und den immunregulatorischen Funktionen der Antigen-präsentierenden Zellen. Die Tiere bekamen nach etwa einer Woche sichtbare Tumore und mussten nach zwei Wochen getötet werden. Einige Tumor-tragende Tiere wurden für 1, 3 oder 5 Tage mit Doxycyclin (2 g/l) behandelt. Um eine mögliche Abstoßung der Tumore durch die CD95L-Induktion festzustellen, wurde der Anteil an lebenden Zellen im Tumor bestimmt (Abb. 16A). Aus unbehandelten Mäusen wurden 80 % lebende Zellen isoliert. Einen Tag nach Beginn der Doxycyclin-Gabe konnten noch 27 % lebende Tumorzellen detektiert werden. Bei längeren Behandlungen (3 oder 5 Tage) wurden keine lebende Zellen gefunden. Die Abstoßung von LKCR-tetCD95L nach Induktion von CD95L scheint also unabhängig vom Mausstamm und nicht T- oder NK-Zell-vermittelt zu sein. In allen Tumorzellen konnte ex vivo durch Doxycyclin CD95L induziert werden (Abb. 16B). Die induzierbare zytotoxische Aktivität war etwas geringer als die der ursprünglichen Zellen. Die Tumorzellen waren ex vivo genauso resistent gegenüber CD95-vermittelter Apoptose wie die ursprünglichen Zellen (Abb. 16C) und exprimierten ähnliche Mengen an CD95 (Abb. 16D) und Kb (Abb. 16E). Ergebnisse 73 B 100 spe zifische Lyse (%) le be nd e Ze lle n (%) A 80 60 40 20 0 0 1 3 5 Effektor: LKCR-tetCD95L 50 40 E/T 30 30 20 10 10 3 0 Dox - + + + in vitro T ag e Do x C spe z ifische Lyse (%) 60 + + + ex vivo D 60 Effektor: B16-CD95L 50 40 E/T 30 5 20 1 10 0.2 0 in vitro CD95 E ex vivo Kb Abb. 16: Tumorabstoßung nach CD95L-Induktion in NOD/SCID-Mäusen. A Tumorabstoßung nach CD95L-Induktion. LKCR-tetCD95L (107 Zellen) wurden s.c. in NOD/SCID-Mäuse injiziert. Nach Tumorinzidenz (Größe ca. 30 mm2) wurden Mäuse mit Doxycyclin im Trinkwasser (2 g/l) für die angegebene Dauer behandelt. Aus den isolierten Tumoren wurden Einzelzellsuspensionen hergestellt, und der Anteil apoptotischer Zellen wurde durch FSC/SSC im FACS bestimmt. B Induzierbare Zytotoxizität von LKCRtetCD95L ex vivo. Aus den Tumoren von unbehandelten Mäusen wurden Einzelzellsuspensionen hergestellt. Diese Zellen wurden als Effektorzellen in den angegebenen Effektor-zu-Target-Verhätnissen mit 51 Cr- markierten P815-Kb-Targetzellen in Abwesenheit oder Gegenwart von Doxycyclin (1 µg/ml) inkubiert. Als Kontrolle wurde die ursprüngliche Zelllinie (in vitro) eingesetzt. C Apoptose-Resistenz ex vivo. Einzelzellsuspensionen aus Tumoren von unbehandelten Mäusen (ex vivo) wurden mit 51Cr markiert und mit den Effektorzellen B16-CD95L koinkubiert. Als Kontrolle wurde die ursprüngliche Zelllinie (in vitro) als Targetzellen eingesetzt. D, E Expression von CD95 (D) und Kb (E) ex vivo. Einzelzellsuspensionen der Tumore wurden direkt mit einem anti-CD95-Antikörper (D) oder einem anti-Kb-Antikörper (E) gefärbt und im FACS analysiert (offenes Histogramm). Als Kontrolle wurden die ursprüngliche Zelllinien gefärbt [grau: antiCD95 (D) bzw. anti-Kb (E); schwarz: Isotyp (D) bzw. Autofluoreszenz (E)]. Exemplarisch gezeigt sind die Ergebnisse von jeweils einem Tumor. 74 Ergebnisse 3.3.4 CD95L-Induktion führt zur Abstoßung von LKCR-tetCD95L in TCRPKOMäusen Um eine mögliche Auswirkung der CD95L-Expression auf anti-Tumor T-Zellen zu untersuchen, wurde LKCR-tetCD95L in TCRPKO-Mäuse injiziert. Bei den höchsten injizierten Zellzahlen (107 oder 5 × 107) waren erst nach 17 Tagen in 50 % der Tiere Tumore palpierbar (Abb. 17A). Bei Injektion von geringeren Zellzahlen bildeten sich Tumore erst später oder überhaupt nicht. Da LKCR-tetCD95L Tumore verhältnismäßig langsam wuchsen, wurden auch die vorherigen Transfektionsstufen injiziert (L1210, LF-Kb, LKC, LKCR). Je mehr Transgene die Tumorzellen besaßen, umso später waren Tumore festzustellen (Abb. 17B und 18A). Einige der Tiere mit einem LKCR-tetCD95L-Tumor wurden mit Doxycyclin im Trinkwasser (2 g/l) behandelt. Um eine mögliche Abstoßung der Tumore durch die CD95L-Induktion festzustellen, wurde der Anteil an lebenden Zellen im Tumor bestimmt (Abb. 18B). Aus unbehandelten Mäusen wurden 77 % lebende Zellen isoliert. Bei Doxycyclin-Gabe wurden die Tumore innerhalb von 2 Tagen komplett abgestoßen (<5 % lebende Zellen). Bei LKCR- A Tum orinzide nz (%) 100 80 57 5 x 107 60 7107 65 x 106 40 55 x 105 20 45 x 104 0 0 8 13 17 22 27 32 36 41 47 B Tum orflä che (m m 2 ) Ta g e na ch Inje ktio n 300 250 200 L1210 L1210 150 LF-K LF-Kbb 100 LK C LKC 50 LK CR LKCR 0 0 8 14 19 22 29 32 Ta g e na ch Inje ktion Abb. 17: Wachstum von L1210-Transfektanten in TCRPKO-Mäusen. A Tumorinzidenz von LKCRtetCD95L. Die angegebenen Zellzahlen von LKCR-tetCD95L wurden s.c. in TCRPKO-Mäuse injiziert. B Tumorwachstum von L1210-Transfektanten. Die angegebenen Trnasfektanten von L1210 (107 Zellen) wurden subkutan in TCRPKO-Mäuse injiziert. Das Tumorwachstum wurde durch Messung der Tumorfläche verfolgt. Ergebnisse 75 Kontrolltumoren gab es keinen Unterschied zwischen behandelten und unbehandelten Tieren. Auch in TCRPKO-Mäusen werden also Tumore nach CD95L-Induktion abgestoßen. Nach 11-tägiger Behandlung eines LKCR-tetCD95L Tumors waren wieder ähnlich viele lebende Zellen vorhanden wie in einem unbehandelten Tumor (Abb. 18B). In diesem Tumor konnte ex vivo CD95L nicht mehr induziert werden. Es wurden also nach CD95L-Induktion nicht alle Tumorzellen komplett abgestoßen, so dass CD95L- Tumorzellen wieder einen etablierten Tumor bilden konnten. Um niedrigere Expressionsniveaus von CD95L zu erzielen, wurden den Tieren geringere Konzentrationen von Doxycyclin ins Trinkwasser gegeben (Abb. 18B). Bei 1.0 g/l wurde der Tumor nach 3 Tagen vollständig abgestoßen, bei 0.5 g/l nach 5 Tagen. Auch bei 0.1 g/l Tum orinzide nz (%) A 100 80 LK CR-tetL 60 LK CR 40 LK CR-tetL + Dox 20 LK CR + Dox 0 0 6 8 11 14 17 21 25 30 35 41 Ta ge na ch Inje ktion lebende Zellen (%) B 100 80 60 40 20 0 Tage 3 5 7 2 3 5 3 1 2 4 11 0.1 0.5 1.0 2.0 Dox (g/l) 0 LKCR-tetCD95L Zellen 0 1 2 11 2.0 LKCR Abb. 18: Tumorabstoßung nach CD95L-Induktion in TCRPKO-Mäusen. A Tumorinzidenz von LKCRtetCD95L und LKCR. LKCR-tetCD95L oder LKCR (107 Zellen) wurden s.c. in TCRPKO-Mäuse injiziert. Eine Gruppe wurde jeweils mit Doxycyclin (2 g/l) im Trinkwasser während des gesamten Versuchs mit Beginn des Injektionstages behandelt (LKCR-tetL +Dox bzw. LKCR +Dox). Dies simulierte eine konstitutive CD95L-Expression. B Tumorabstoßung nach CD95L-Induktion. LKCR-tetCD95L oder LKCR (107 Zellen) wurden s.c. in TCRPKO-Mäuse injiziert. Nach Tumorinzidenz (Größe ca. 30 mm2) wurden die Mäuse mit den angegebenen Konzentrationen von Doxycyclin im Trinkwasser für die angegebene Dauer behandelt. Aus den isolierten Tumoren wurden Einzelzellsuspensionen hergestellt, und der Anteil apoptotischer Zellen wurde durch FSC/SSC im FACS bestimmt. 76 Ergebnisse wurden nach 5 Tagen keine lebenden Zellen mehr detektiert. Geringere DoxycyclinKonzentrationen verzögern eine Abstoßung von LKCR-tetCD95L also nur minimal. LKCR-tetCD95L-Tumore in Mäusen, die von Anfang an fortwährend mit Doxycyclin behandelt werden, sollten sich wie konstitutiv exprimierende Tumore verhalten, sie sollten also in vivo abgestoßen werden. Um dies zu überprüfen, wurden Mäuse vom Zeitpunkt der Tumorinjektion an mit Doxycyclin behandelt (Abb. 18A). Bei unbehandelten Mäusen waren nach drei Wochen in 75 % der Tiere Tumore palpierbar. In behandelten Mäusen waren nach drei Wochen keine Tumore palpierbar. Allerdings wuchsen zu späteren Zeitpunkten (Tag 22 bis 41) auch in 50 % der behandelten Tiere Tumore. Bei LKCR-Tumoren gab es keinen Unterschied in der Tumorinzidenz zwischen behandelten und unbehandelten Tieren. Die Tumore wurden nach dem Töten der Tiere entnommen. Die induzierbare Zytotoxizität war ex vivo deutlich geringer als in den ursprünglichen Zellen (Abb. 19A). In vielen Tumorzellen konnte durch Doxycyclin überhaupt keine Zytotoxizität mehr induziert werden. Die meisten Tumorzellen exprimierten ex vivo nicht mehr das Tumorantigen Kb (Abb. 19C). Nur bei einigen Tumoren (<5 %) war eine Mischung aus Kb- und Kb+ Zellen vorhanden. Außerdem waren bei vielen Tumoren die Zellen ex vivo sensitiver für CD95-vermittelte Apoptose als vor der Injektion (Abb. 19B). Sie exprimierten CD95 stärker als die ursprüngliche Zelllinie, wie durch FACS-Färbung nachgewiesen wurde (Abb. 19D). LKCRtetCD95L verlieren also in TCRPKO-Mäusen die meisten der für das Tumormodell wesentlichen Eigenschaften. Eine Untersuchung der Auswirkung der CD95L-Expression auf die anti-Tumor T-Zellen war wegen der schnellen Abstoßung der Tumore nach CD95L-Induktion nicht möglich. Ergebnisse 77 80 spe z ifische Lyse (%) A C Effektor: LKCR-tetCD95L 70 60 50 E/T 40 30 30 in vitro 10 20 10 3 0 Dox (g/l) 1 2 0.1 3 0.5 4 0.5 5 Tage - 0 1 2 3 in vitro ex vivo (#6411) ex vivo B spe z ifische Lyse (%) 100 Effektor: B16-CD95L 80 E/T 60 5 40 Kb 1 20 0,2 D 0 P815-Kb 1 Target: ex vivo (#8114) 2 3 in vitro 4 5 6 ex vivo 7 8 LKCR-tetCD95L CD95 Abb. 19: Ex vivo-Charakterisierung von LKCR-tetCD95L aus TCRPKO-Mäusen. A Induzierbare Zytotoxizität. Aus den Tumoren von Mäusen, die mit den angegebenen Konzentrationen von Doxycyclin für die angegebene Dauer behandelt wurden, wurden Einzelzellsuspensionen hergestellt. Diese Zellen (ex vivo) wurden als Effektorzellen in den angegebenen Effektor-zu-Target-Verhätnissen mit 51 Cr-markierten P815- b K -Targetzellen in Gegenwart von Doxycyclin (1 µg/ml) inkubiert. Exemplarisch gezeigt sind die Ergebnisse von 4 Tieren. Als Kontrolle wurde die ursprüngliche Zelllinie (in vitro) eingesetzt. B Apoptose-Resistenz ex vivo. Einzelzellsuspensionen aus Tumoren von behandelten oder unbehandelten Mäusen (ex vivo) wurden mit 51 Cr markiert und mit den Effektorzellen B16-CD95L koinkubiert. Exemplarisch gezeigt sind die Ergebnisse von 6 Tieren. Als Kontrollen wurden die ursprüngliche Zelllinie LKCR-tetCD95L (in vitro) und P815-Kb als Targetzellen eingesetzt. C Expression des Kb-Antigens. Einzelzellsuspensionen der Tumore wurden direkt mit einem anti-Kb-Antikörper gefärbt und im FACS analysiert. Exemplarisch gezeigt sind die Ergebnisse der Tiere #6411 und #8114 (ex vivo). Als Kontrolle wurde die ursprüngliche Zelllinie gefärbt (offen: anti-Kb, schwarz: Autofluoreszenz). D Expression von CD95. Einzelzellsuspensionen der Tumore wurden mit anti-CD95-Antikörper gefärbt und im FACS analysiert (offenes Histogramm). Exemplarisch gezeigt ist das Ergebnis eines Tumors. Als Kontrolle wurde die ursprüngliche Zelllinie gefärbt (grau: antiCD95, schwarz: Isotyp). 78 Ergebnisse 3.4. Rolle der Neutrophilen bei der Abstoßung von CD95L+ Tumoren 3.4.1 Generierung und Charakterisierung von B16-CD95L und B16-neo In zahlreichen Studien wurden Neutrophile für die Abstoßung von CD95L+ Tumoren verantwortlich gemacht (Behrens et al., 2001; Okamoto et al., 1999; Seino et al., 1997; Shimizu et al., 1999; Yagita et al., 1996). Eine direkte Beteiligung der Neutrophilen wurde allerdings nur in einer Studie gezeigt (Seino et al., 1997). Außerdem ist nicht klar, welchen Zytotoxizitäts-Mechanismus Neutrophile benutzen, um CD95L+ Tumore abzustoßen (Behrens et al., 2001). Um dies in vivo genauer untersuchen zu können, wurden CD95L-exprimierende Tumorzellen mit dem genetischen Hintergrund H-2b benötigt, da nur in diesem Hintergrund die entsprechenden Knockout-Mäuse existieren (siehe unten). Die Melanomzelllinie B16 wurde mit dem murinen CD95L (Plasmid pFM92-mCD95L) oder einem Kontrollvektor B 90 70 80 70 60 Effektor: 60 50 B 16-CD95L 40 30 + anti-CD95L 20 10 B 16-neo + is otype 0 spe zifische Lyse [%] P C60 -> P 815-K b 50 P C60 -> B 16-neo 40 P C60 -> B 16-CD95L 30 20 B 16-CD95L -> B 16-CD95L 10 0 5 1 30 0.2 0.04 E/T Ra tio 3 E/T Ra tio D B16-CD95L B16-neo C 10 E B16-CD95L B16-neo CD95L 10 4 Ze lle n spe zifische Lyse [%] A 50 B 16-CD95L 40 B 16-neo 30 20 10 0 ß-Aktin CD95L CD95L 0 2 4 Ta g e Abb. 20: Charakterisierung von B16-CD95L und B16-neo. A Zytotoxische Aktivität. In einem 51 Cr- Freisetzungstest wurden B16-CD95L oder B16-neo in verschiedenen Effektor-zu-Target-Verhätnissen mit 51 Cr-markierten P815-Kb-Targetzellen inkubiert. Wenn angegeben, wurde zu B16-CD95L anti-CD95L Antikörper (10 µg/ml) oder Isotypkontrolle zugegeben. B Apoptose-Resistenz. B16-CD95L, B16-neo und die Positivkontrolle P815-Kb wurden mit 51 Cr markiert und mit den Effektorzellen B16-CD95L oder aktivierten PC60 koinkubiert. C, D Die CD95L-Expression von B16-CD95L und B16-neo wurde durch RTPCR (C) und FACS-Färbung (D) getestet. E Wachstumsgeschwindigkeit in vitro. 1.5 × 104 Zellen von B16CD95L und B16-neo wurden an Tag 0 ausplattiert, und die Zellzahl wurde täglich bestimmt. Gezeigt sind Mittelwerte und Standardabweichungen von je drei Kulturen. Ergebnisse 79 (pFM92) transfiziert und dreimal subkloniert. Die CD95L-transfizierten Zellen B16-CD95L besaßen eine hohe zytotoxische Aktivität, die sich mit einem anti-CD95L-Antikörper vollständig blockieren ließ (Abb. 20A). Die Vektor-transfizierte Zelllinie B16-neo zeigte keine Zytotoxizität. Auch durch FACS-Färbung und RT-PCR ließ sich die hohe CD95LExpression von B16-mCD95L und das Fehlen jeglicher CD95L-Expression in B16-neo nachweisen (Abb. 20C, D). Sowohl B16-mCD95L als auch B16-neo waren resistent gegenüber CD95-vermittelter Apoptose (Abb. 20B). In vitro wuchsen beide Zelllinien ungefähr gleich schnell (Abb. 20E). Der Kulturüberstand von B16-CD95L war weder selbst zytotoxisch, noch inhibierte er CD95-vermittelte Apoptose (nicht gezeigt). 3.4.2 Neutrophile besitzen in vitro keine Zytotoxizität gegenüber Tumorzellen Es wurde publiziert, dass Neutrophile in vitro CD95L+ Tumorzellen lysieren, nicht aber CD95L- Tumorzellen (Chen et al., 1998). Um dies in den verwendeten Masumodellen A 90 % M1 Gr-1 10 3 4 5 B16CD95L 2 B16-neo Target: Jurkat 1 P815-KbCD95L 0 E/T: 50 20 25 10 0 Target: 1 2 3 4 5 B16CD95L 20 B16-neo 30 Effektor: hum. Neutr. 30 P815-KbCD95L 40 40 P815-Kb Effektor: mur. Neutr. 50 Jurkat 60 spe z ifische Ly< se (%) C P815-Kb spe zifische Lyse (%) B Abb. 21: Zytotoxizität von Neutrophilen in vitro. A Reinheit der murinen Neutrophilen. Aus TCRPKOMäusen wurden durch i.p. Injektion von β-Casein und peritoneale Lavage aktivierte Neutrophile isoliert. Durch FACS-Färbung mit anti-Gr-1 wurde die Reinheit überprüft. Die Prozentzahl gibt den Anteil der Gr-1+ Zellen (M1) an (offen: anti-Gr-1, schwarz: Isotyp). B Zytotoxizität von murinen Neutrophilen. Die Neutrophilen aus A wurden als Effektorzellen im Effektor-zu-Target-Verhätnis 24:1 zu den angegebenen 51Crmarkierten Targetzellen gegeben und über Nacht inkubiert. C Zytotoxizität von humanen Neutrophilen. Humane Neutrophilen wurden aus dem peripheren Blut gewonnen. Sie wurden als Effektorzellen in den Effektor-zu-Target-Verhätnissen 50:1 oder 25:1 zu den angegebenen und über Nacht inkubiert. 51 Cr-markierten Targetzellen gegeben 80 Ergebnisse nachzuvollziehen, wurden aus TCRPKO-Mäusen durch i.p. Injektion von β-Casein und peritoneale Lavage aktivierte Neutrophile isoliert. Die Reinheit der Neutrophilen lag über 90 %, wie durch Färbung mit anti-Gr-1 bestimmt wurde (Abb. 21A). Über 95 % der Neutrophilen waren PI-negativ (nicht gezeigt). In Zytotoxizitäts-Tests konnte keine Lyse von Maus-Tumorzelllinien (B16-neo, B16-CD95L, P815-Kb, P815-Kb-CD95L, LKC) beobachtet werden (Abb. 21B und nicht gezeigt). Auch alle CD95L+ Tumorzelllinien wurden von den Neutrophilen nicht lysiert. Bei zusätzlicher Aktivierung der Neutrophilen mit PMA war eine schwache Lyse zu beobachten, diese war aber unabhängig von der CD95L-Expression der Tumore (nicht gezeigt). Humane JurkatZellen wurden dagegen durch die Neutrophilen teilweise lysiert. Zusätzlich wurden humane Neutrophile aus peripherem Blut isoliert. Es wurde ebenfalls keine selektive Zytotoxizität von Neutrophilen gegenüber CD95L+ Tumoren festgestellt (Abb. 21C). 3.4.3 Die Abstoßung von CD95L+ Tumoren ist unabhängig von iNOS und p47phox Die wichtigsten Zytotoxizitäts-Mechanismen von Neutrophilen sind die mit Hilfe der induzierbaren NO-Synthase (iNOS) produzierten zytotoxischen Stickoxide und die mit Hilfe der phagozytären NADPH-Oxidase produzierten reaktiven Sauerstoffradikale. Um zu untersuchen, welchen Zytotoxizitäts-Mechanismus Neutrophile in vivo benutzen, um CD95L+ Tumore abzustoßen, wurde das Wachstum von B16-CD95L und B16-neo in Wildtyp-Mäusen mit dem Wachstum in zwei Arten von knockout-Mäusen verglichen, deren Neutrophilen jeweils ein Zytotoxizitäts-Mechanismus fehlt. Die Neutrophilen der iNOS-/--Mäuse können keine zytotoxischen Stickoxide produzieren (Laubach et al., 1995). Die Neutrophilen von p47phox-/--Mäusen, bei denen das Gen für die Untereinheit p47 der phagozytären NADPHOxidase deletiert ist, können keine zytotoxischen Sauerstoffradikale produzieren (Jackson et al., 1995). Zunächst wurden in C57BL6-Wildtyp-Mäuse verschiedene Zellzahlen (2 × 104, 2 × 105 oder 2 × 106) von B16-CD95L oder B16-neo subkutan injiziert. Die Tumorinzidenz und das Wachstum waren erwartungsgemäß abhängig von der Zahl der injizierten Zellen (nicht gezeigt). Bei allen drei Zellzahlen wuchsen die B16-CD95L-Tumore langsamer als die B16neo-Tumore. Außerdem wurden B16-CD95L oder B16-neo in Wildtyp-, iNOS-/-- und p47phox-/--Mäuse subkutan injiziert (Abb. 22A). In allen Mausstämmen wuchsen die B16CD95L-Tumore langsamer als die B16-neo-Tumore. Außerdem wuchsen in beiden knockoutMausstämmen sowohl die B16-CD95L-Tumore als auch die B16-neo-Tumore genauso schnell wie in den Wildtyp-Mäusen. Ergebnisse 100 Tum orflä che (m m 2 ) A 81 B 16-CD95L in wt 80 B 16-CD95L in p47phox 60 B 16-CD95L in iNOS 40 B 16-neo in wt B 16-neo in p47phox 20 B 16-neo in iNOS 0 0 3 5 7 10 12 14 17 19 Ta ge na ch Inje ktion spezifische Lyse spe cific lysis (%)(%) B 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Effektor: Maus: E/T 5 1 0,2 1 2 3 4 Wildtyp Zellen: C B16-CD95L 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 p47phox-/- iNOS-/- p47ph.-/- B16-CD95L B16-neo B16-neo CD95L ß-Aktin Abb. 22: Wachstum von B16-CD95L und B16-neo in Wildtyp-, iNOS-/-- und p47phox-/--Mäusen. A 5 × 105 B16-CD95L oder B16-neo Zellen wurden in Wildtyp- (wt), iNOS-/- und p47phox-/--Mäuse subkutan injiziert (5-9 Tiere pro Gruppe). Das Tumorwachstum wurde durch Messung der Tumorfläche verfolgt. B Zytotoxizität ex vivo. Aus den Tumoren in A wurden Einzelzellsuspensionen hergestellt. Diese Zellen wurden als Effektorzellen in den angegebenen Effektor-zu-Target-Verhätnissen mit 51 Cr-markierten P815-Kb- Targetzellen inkubiert. Exemplarisch sind gezeigt sind die Ergebnisse von mehreren Tieren. C CD95LExpression ex vivo. Aus B16-CD95L und B16-neo Tumoren wurde RNA isoliert. CD95L-Expression wurde durch RT-PCR nachgewiesen. Die Tumore wurden nach dem Töten der Tiere entnommen und auf ihre CD95L-Expression untersucht. Die B16-CD95L-Tumore zeigten ex vivo die gleiche Zytotoxizität wie vor der Injektion (Abb. 22B). B16-neo-Tumore zeigten keine Zytotoxizität. Eine RT-PCR zeigte ähnliche CD95L-Expression in den B16-CD95L-Tumoren wie in der ursprünglichen Zelllinie (Abb. 22C). In den B16-neo-Tumoren wurde gelegentlich eine schwache CD95L-Expression 82 Ergebnisse beobachtet, möglicherweise durch in den Tumor infiltrierte Lymphozyten. In vivo fand also keine wesentliche Veränderung der CD95L-Expression statt. Insgesamt führte eine CD95L-Expression also auch bei diesem Mausmodell zu einem Wachstumsnachteil in vivo. Darüber hinaus scheinen die NADPH-Oxidase (p47phox) und iNOS bei der Abstoßung der CD95L+ Tumore jeweils nicht ausschließlich involviert zu sein. Diskussion 4. 83 DISKUSSION 4.1. Auswirkung der CD95L-Expression von Tumoren auf Tumorspezifische T-Zellen in vitro Tumorzellen wehren sich möglicherweise nicht nur passiv gegen eine Zerstörung durch das Immunsystem. Viele Tumore exprimieren CD95L, mit dessen Hilfe sie Tumor-infiltrierende Lymphozyten aktiv töten könnten, um die anti-Tumor Immunantwort zu unterdrücken - ein Phänomen, das Tumor Counterattack genannt wird (Abb. 2) (Igney et al., 2000; Krammer, 1997; Walker et al., 1998). Um die Auswirkungen der CD95L-Expression von Tumoren auf Tumor-spezifische T-Zellen genauer charakterisieren zu können, wurde in dieser Arbeit die Tumor-Counterattack-Situation zunächst in einem Modellsystem in vitro nachgestellt. Dabei bestand eine wechselseitige Zytotoxizität zwischen dem CD95L+ Tumor und den aktivierten anti-Tumor T-Zellen. Die CD95L-Expression der Tumorzellen verhinderte die Generierung von zytotoxischen anti-Tumor T-Zellen. Sie hatte aber keinen Einfluss auf die Lyse des Tumors durch aktivierte T-Zellen. Eine Beeinflussung der Tumor-Counterattack-Situation durch B7-Kostimulation war in vitro nicht nachweisbar. In gemischten Lymphozyten-Tumor-Reaktionen (mixed lymphocyte tumor reactions, MLTRs) wurden anti-Kb TCR-transgene Perforin-knockout (TCRPKO) T-Zellen (Behrens et al., 2001; Schönrich et al., 1991) durch Tumore stimuliert, die das Modell-Tumorantigen Kb exprimierten. Dies führte zur Aktivierung und Proliferation der T-Zellen (Abb. 4, 5 und 7). Die zusätzliche Expression von CD95L auf dem Tumor verhinderte jedoch die Generierung von zytotoxischen anti-Tumor T-Zellen. Die geringe Zahl an anti-Tumor T-Zellen, die nach einer Stimulation mit dem CD95L+ Tumor noch verblieb, verhielt sich ähnlich wie naive TZellen: Sie exprimierten keine Aktivierungsmarker, waren nicht zytotoxisch und proliferierten bei Restimulation mit einem CD95L- Tumor, waren also nicht anerg (Abb. 4 und 5). Die Aktivierung von T-Zellen führte zur erhöhten CD95-Expression und der Sensitivierung der TZellen für CD95-vermittelte Apoptose (Abb. 6). CD95L+ Tumorzellen konnten in aktivierten anti-Tumor T-Zellen direkt Apoptose induzieren (Abb. 7). Es ist jedoch unklar, wie die CD95L-Expression des Tumors die Generierung der anti-Tumor T-Zellen verhindert. Denkbar wäre, dass die T-Zellen zunächst durch den Tumor aktiviert und damit für Apoptose sensitiviert werden und dass dann durch CD95L Apoptose induziert wird. Andererseits könnte aber auch das gleichzeitige Signal über TCR und CD95 die Aktivierung und Proliferation der T-Zellen direkt verhindern. In einer anderen Studie wurden humane T-Zellen durch allogene Tumorzellen aktiviert (Dulat et al., 2001). Auch dabei nahm die Sensitivität der T-Zellen zu. Bei der Stimulation mit CD95L+ oder CD95L- Tumorzellen exprimierten am zweiten Tag der 84 Diskussion Aktivierung jeweils ähnlich viele T-Zellen CD25. Dies spricht dafür, dass die T-Zellen unabhängig vom CD95L-Status des Tumors aktiviert wurden. T-Zellen, die mit den allogenen CD95L+ Tumorzellen stimuliert wurden, besaßen keine Zytotoxizität gegenüber der entsprechenden CD95L- Tumorzelllinie. Sie konnten auch nicht mit den CD95L- Tumorzellen restimuliert werden, sondern nur durch PHA, was eine spezifische Deletion der anti-Tumor TZellen in diesem Modell nahe legt. Die Relevanz dieser in vitro-Befunde für die in vivo-Situation ist unklar. Vor allem ist bisher nicht eindeutig geklärt, wie in vivo überhaupt eine anti-Tumor Immunantwort initiiert wird. Dies könnte durch direkten Kontakt der T-Zellen mit den Tumorzellen geschehen (Immunüberwachungs-Hypothese) (Burnet, 1970). Einige Studien zeigen aber, dass beispielsweise lymphoide Organe für die Stimulation einer anti-Tumor Antwort nötig sind (Ochsenbein et al., 2001). Damit könnten auch Antigen-präsentierende Zellen, die Tumorantigene vom Tumor in die Lymphknoten transportieren und dort den T-Zellen präsentieren, entscheidend sein. Darüber hinaus scheinen Gefahren-Signale bei der Induktion einer effizienten Immunantwort eine wichtige Rolle zu spielen (Fuchs and Matzinger, 1996). In vitro konnten die Tumorzellen direkt zytotoxische T-Zellen aktivieren. Auch aufgereinigte CD8+ Zellen wurden durch Tumorzellen aktiviert, eine Kreuz-Präsentation oder T-Zell-Hilfe war also nicht nötig. Damit unterscheidet sich die Aktivierung in den in vitro-Modellen wahrscheinlich vom Vorgang in vivo. Klar ist jedoch, dass T-Zellen durch Aktivierung in vitro und in vivo für CD95-vermittelte Apoptose sensitiviert werden und dass ein Tumor durch CD95L-Expression gegenüber aktivierten T-Zellen zytotoxisch wirken kann. Obwohl eine wechselseitige Zytotoxizität zwischen dem CD95L+ Tumor und den aktivierten T-Zellen bestand, hatte die CD95L-Expression des Tumors keinen wesentlichen Einfluss auf die Zytotoxizität der T-Zellen gegenüber den Tumorzellen (Abb. 7D). Dies wurde auch in anderen Studien gefunden. Die oben erwähnten allogen stimulierten humanen T-Zellen lysierten CD95L+ und CD95L- Tumorzellen innerhalb von 4 h gleichermaßen (Dulat et al., 2001). Nach 20 h wurden allerdings CD95L- Tumorzellen stärker lysiert. Dieser Unterschied könnte einerseits damit erklärt werden, dass die CD95L+ Tumorzellen innerhalb von 20 h einige der anti-Tumor T-Zellen deletieren und somit der Lyse durch die T-Zellen teilweise entkommen. Andererseits könnte der Unterschied aber auch dadurch erklärt werden, dass beide Tumorzelllinien zwar die gleiche Sensitivität für Perforin-vermittelte Zytotoxizität, aber durch die Transfektion mit CD95L unterschiedliche Resistenz gegenüber CD95-vermittelter Apoptose haben. In einer weiteren Studie wurden murine T-Zellen mit syngenen oder allogenen Tumorzellen in vivo stimuliert (Li et al., 2002). Auch diese T-Zellen wurden CD95- Diskussion 85 sensitiv. Allerdings lysierten sie CD95L+ und CD95L- Tumorzellen in vitro in gleichem Maße. Insgesamt besteht also eine wechselseitige Zytotoxizität zwischen Tumor und T-Zellen. TZellen sind zum Zeitpunkt großer Zytotoxizität auch selbst sehr sensitiv für Apoptose. Es scheint daher wahrscheinlich, dass es von den jeweiligen Bedingungen abhängt, zugunsten welcher Seite sich das Verhältnis zwischen Tumor und T-Zellen verschiebt, ob also das Immunsystem oder der Tumor gewinnt. Bei den Zytotoxizitäts-Tests in vitro wurden hohe Verhältnisse von T-Zellen zu Tumorzellen eingesetzt. In vivo ist dieses Verhältnis zugunsten der Tumorzellen verschoben. In humanen soliden Tumoren sind nur etwa 4 % der Tumorinfiltrierenden Zellen zytotoxische T-Zellen (Li et al., 2002). Dennoch ist es erstaunlich, dass die CD95L-Expression auch dann keinen Einfluss auf die Lyse des Tumors durch die TZellen hatte, wenn der wichtigste Zytotoxizitäts-Mechanismus der T-Zellen durch Deletion des Perforin-Gens blockiert war. Die Kostimulation von aktivierten T-Zellen über CD28 in vitro führt zu einer erhöhten Apoptose-Resistenz der T-Zellen (Kirchhoff et al., 2000). Mit Hilfe von Kostimulation könnten T-Zellen also möglicherweise vor Tumor Counterattack geschützt werden. Kostimulation mit B7 hatte aber keinen Einfluss auf die Tumor Counterattack Situation in vitro (Abb. 8). B7 bindet nicht nur an CD28, sondern auch an CTLA4, das inhibierende Signale übermittelt und eine höhere Affinität zu B7 besitzt als CD28. Eine zu geringe B7Expression könnte daher für eine effektive Kostimulation nicht ausreichen. Insgesamt wurde im hier etablierten in vitro-Modell gezeigt, dass eine wechselseitige Zytotoxizität zwischen CD95L+ Tumorzellen und aktivierten anti-Tumor T-Zellen besteht. CD95L-Expression von Tumorzellen verhindert die Generierung von zytotoxischen antiTumor T-Zellen, hat aber keinen Einfluss auf die Lyse des Tumors durch aktivierte T-Zellen. Ein Einfluss von Kostimulation mit B7 auf die Tumor-Counterattack-Situation konnte in vitro nicht nachgewiesen werden. Damit ist Tumor Counterattack ein möglicher und plausibler Immunevasionsmechanismus von Tumoren, die Relevanz der in vitro-Befunde für die in vivoSituation ist aber offen. 86 Diskussion 4.2. Einfluss des Niveaus und des Zeitpunkts der CD95LExpression auf die Abstoßung von CD95L+ Tumoren Viele Studien zu Tumor Counterattack wurden veröffentlicht, die Ergebnisse sind aber widersprüchlich und klären nicht, ob Tumor Counterattack in vivo ein relevanter Immunevasionsmechanismus ist (Igney et al., 2000; O'Connell et al., 2001; Restifo, 2001). Einerseits werden in CD95L+ Tumoren vermehrt apoptotische T-Zellen gefunden (O'Connell et al., 1996; Strand et al., 1996). Auch in vitro-Befunde zeigen, dass aktivierte T-Zellen CD95-sensitiv sind und die CD95L-Expression auf Tumoren einen Einfluss auf die Generierung zytotoxischer T-Zellen hat. Andererseits führt die CD95L-Expression in Mäusen zur Abstoßung oder einem Wachstumsnachteil der Tumore. Mehrere Faktoren wurden für diese kontroverse Situation verantwortlich gemacht (Igney et al., 2000; O'Connell et al., 2001). In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass weder das CD95LExpressionsniveau noch der Zeitpunkt der CD95L-Expression eine wesentliche Auswirkung auf die Abstoßung der Tumore hat. Bei der Abstoßung von CD95L+ Tumoren in Mäusen handelt es sich also nicht um ein Artefakt durch Überexpression. Die Abstoßung hängt außerdem nicht von Ereignissen am Anfang der Tumorentstehung ab. In den meisten Tierexperimenten wurden CD95L-transfizierte Tumorzelllinien verwendet. Diese Zellen exprimieren wahrscheinlich mehr CD95L als natürlich vorkommende Tumore. Es wurde daher spekuliert, dass die Überexpression von CD95L zur Abstoßung durch Neutrophile führen könnte, während ein physiologisches Expressionsniveau möglicherweise keine Neutrophilen-Infiltration induzieren, aber immer noch ausreichen kann, anti-Tumor Lymphozyten zu deletieren. Um den Einfluss des CD95L-Expressionsniveaus auf die Abstoßung von CD95L+ Tumoren in Mäusen zu untersuchen, wurden Zelllinien (LKCCD95L) generiert, die unterschiedliche Mengen von CD95L konstitutiv exprimieren (Abb. 9). In Nacktmäusen wuchsen alle LKC-CD95L Tumore deutlich langsamer als CD95L-negative Kontrolltumore und mit etwa gleicher Geschwindigkeit (Abb. 11). Das CD95LExpressionsniveau hatte also keinen nachweisbaren Einfluss auf das Wachstum der CD95L+ Tumore. Da die Zellen in vitro und ex vivo resistent gegenüber CD95-vermittelter Apoptose sind (Abb. 10A und 11C), ist ein Suizid- oder Fratrizid-Mechanismus für die Abstoßung unwahrscheinlich. Ex vivo waren die Tumorzellen nicht mehr zytotoxisch, was darauf hindeutet, dass die CD95L-Expression einen Wachstumsnachteil darstellt und daher CD95LTumorzellen selektioniert werden. In TCRPKO-Mäusen wuchsen die CD95L+ Tumore gar nicht oder nur verzögert (Abb. 12). Ex vivo exprimierten die wachsenden Tumore das ModellTumorantigen Kb nicht mehr. Der zusätzliche Selektionsdruck durch die anti-Kb T-Zellen Diskussion 87 führte also in TCRPKO-Mäusen zu einem weiteren Wachstumsnachteil im Vergleich zu den Nacktmäusen. In beiden Mausstämmen spielte also das CD95L-Expressionsniveau keine entscheidende Rolle für das Wachstum der CD95L+ Tumore. Möglicherweise exprimieren in situ wachsende Tumore CD95L erst in späteren Stadien der Karzinogenese, z.B. nach Induktion durch Chemotherapie (Eichhorst et al., 2000; Friesen et al., 1999; Muller et al., 1997). Außerdem variiert die Apoptose-Sensitivität von T-Zellen je nach ihrem Aktivierungszustand beträchtlich (Klas et al., 1993; Scaffidi et al., 1999). Es wurde daher vermutet, dass der Zeitpunkt der CD95L-Expression Tumor Counterattack direkt beeinflussen könnte. Um zusätzlich den Einfluss des Zeitpunktes der CD95L-Expression untersuchen zu können, wurde deshalb das Mausmodell dahingehend erweitert, dass CD95L mit dem tet-System (Gossen et al., 1995) induzierbar exprimiert werden konnte. Es wurde eine Zelllinie (LKCR-tetCD95L) generiert, die selbst resistent gegenüber CD95-vermittelter Apoptose war und in der durch Doxycyclin eine CD95L-Expression induziert werden konnte (Abb. 13 und 14). Diese Zelllinie wurde in Nackt-, NOD/SCID- oder TCRPKO-Mäuse injiziert. In allen Mausstämmen wurden die Tumore nach CD95L-Induktion schnell und mit ähnlicher Geschwindigkeit abgestoßen (Abb. 15, 16, 18). Eine CD95L-Expression zu einem späteren Zeitpunkt in einem etablierten Tumor führt also genauso zur Abstoßung wie eine konstitutive Expression. Die Abstoßung scheint außerdem nicht T- oder NK-Zell-vermittelt zu sein. Eine Abstoßung etablierter Tumore nach CD95L-Induktion wurde auch von Arai et al. (Arai et al., 1997) beobachtet. Subkutan wachsende CD95+ oder CD95- Tumore wurden adenoviral mit CD95L transfiziert. Sowohl die CD95+ als auch die CD95- Tumore wurden schnell abgestoßen. Durch die CD95L-Expression wurde in den CD95+ Tumoren Apoptose induziert, während die CD95- Tumore durch inflammatorische Zellen eliminiert wurden. CD95L-Gentransfer wurde daher auch als Tumortherapie vorgeschlagen. Mit dem tet-System ließ sich neben dem Zeitpunkt auch das CD95L-Expressionsniveau über die Doxycyclin-Konzentration im Trinkwasser der Mäuse regulieren (Abb. 14C). Geringere Konzentrationen verzögerten eine Abstoßung von LKCR-tetCD95L nur minimal (Abb. 15, 18). Ein niedrigeres CD95L-Expressionsniveau führte also in diesem Modell genauso zur Abstoßung der CD95L+ Tumore. In TCRPKO-Mäusen wuchsen LKCR-tetCD95L Tumore relativ langsam (Abb. 17). Ex vivo hatten die Tumorzellen die meisten der für das Tumormodell wesentlichen Eigenschaften verloren (Abb. 19). Der Selektionsdruck durch die anti-Kb T-Zellen führte zum Verlust der Kb-Expression. Die Induzierbarkeit nahm ab. Tumore, in denen über einen langen Zeitraum CD95L induziert wurde, wurden nicht vollständig abgestoßen. Ex vivo war jedoch CD95L 88 Diskussion nicht mehr induzierbar, was wiederum für einen Wachstumsnachteil durch die CD95LExpression und eine Selektion von CD95L- Tumorzellen spricht. Ex vivo exprimierten die Tumorzellen mehr CD95 und waren sensitiver für CD95-vermittelte Apoptose. Dies wurde bei der gleichen Parentalzelllinie auch von anderen beobachtet (Rosen et al., 2000). Möglicherweise verlieren die Zellen nach einigen Wochen in vivo die Expression des antisense-Fas-Transgens. Eine CD95-Expression könnte auch z.B. durch Interferon-γ aus aktivierten T-Zellen im Tumor induziert werden. Prinzipiell ist daher für die Abstoßung von LKCR-tetCD95L nach CD95L-Induktion in den TCRPKO-Mäusen auch ein Suizid/FratrizidMechanismus denkbar. In Nackt- und NOD/SCID-Mäusen wuchsen LKCR-tetCD95L Tumore schnell und behielten die wesentlichen Eigenschaften (Kb-Expression, Apoptose-Resistenz, Induzierbarkeit) bei. Eine Abstoßung durch Suizid oder Fratrizid ist hier also unwahrscheinlich. Da die Tumore in einem ähnlichen Zeitrahmen wie in anderen Studien abgestoßen wurden, kann wohl von einem ähnlichen Mechanismus, also der Abstoßung durch Neutrophile, ausgegangen werden. Eine Analyse der Auswirkung der CD95L-Expression auf die anti-Tumor T-Zellen war wegen der schnellen Abstoßung der Tumore nach CD95L-Induktion nicht möglich. Bisher hat keine Studie eindeutig gezeigt, dass ein Tumor durch CD95L-Expression anti-Tumor-spezifische Lymphozyten deletiert, so der Immunantwort entkommt und dadurch einen Wachstumsvorteil in vivo hat. Eine Immunsuppression durch CD95L in vivo wurde nur in einer Studie gezeigt (Arai et al., 1997). Allerdings wurden auch in dieser Studie die CD95L+ Tumore schnell abgestoßen. In anderen Studien wurde durch die Abstoßung der CD95L+ Tumore eine T-Zellvermittelte Immunität gegenüber den Tumorzellen induziert (Arai et al., 1997; Behrens et al., 2001; Seino et al., 1997). Einige der in diesem Tumormodell verwendeten CD95L+ Zellen wachsen in Nacktmäusen und verändern dabei ihre Eigenschaften nicht. Zur Analyse einer Auswirkung der CD95L-Expression von Tumoren auf anti-Tumor T-Zellen in vivo würde sich daher ein adoptiver Transfer von anti-Kb T-Zellen in Nacktmäuse mit diesen Tumoren anbieten. In diesem Modell könnte überprüft werden, ob Tumor Counterattack überhaupt stattfindet. Weiterhin könnten die Bedingungen, unter denen T-Zellen in vivo resistent oder sensitiv für Tumor Counterattack sind, bestimmt werden und Möglichkeiten, Tumor Counterattack zu beeinflussen, getestet werden. Insgesamt ist Tumor Counterattack also ein plausibler, aber kontrovers diskutierter Immunevasionsmechanismus von Tumoren. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass es sich bei der Abstoßung von CD95L+ Tumoren in Mäusen nicht um ein Artefakt durch Überexpression handelt und dass die Abstoßung nicht von Ereignissen am Anfang der Tumorentstehung Diskussion 89 abhängt. Damit wurden zwei Faktoren, die für die kontroverse Situation verantwortlich gemacht wurden, ausgeschlossen. 90 Diskussion 4.3. Rolle der Neutrophilen bei der Abstoßung von CD95L+ Tumoren In zahlreichen Studien wurden Neutrophile für die Abstoßung von CD95L+ Tumoren verantwortlich gemacht (Behrens et al., 2001; Okamoto et al., 1999; Seino et al., 1997; Shimizu et al., 1999; Yagita et al., 1996). Eine direkte Beteiligung der Neutrophilen wurde allerdings nur in einer Studie gezeigt (Seino et al., 1997). CD95L+ Tumorzellen bildeten in syngenen immunkompetenten und in Nacktmäusen keine Tumore. Nach Depletion von Granulozyten wuchsen Tumore. Außerdem wurde publiziert, dass Neutrophile in vitro CD95L+ Tumorzellen lysieren, nicht aber CD95L- Tumore (Chen et al., 1998). Dies wurde in dieser Arbeit nicht gefunden (Abb. 21). In Zytotoxizitäts-Tests konnte keine Lyse von MausTumorzelllinien durch Neutrophile beobachtet werden. Auch alle CD95L+ Tumorzelllinien wurden von den Neutrophilen nicht lysiert. Neutrophile werden sehr leicht aktiviert und sind nach Aktivierung kurzlebig. Unterschiedliche Isolations- und Aktivierungsmethoden können daher zu unterschiedlichen Ergebnissen führen. Außerdem ist bisher nicht klar, welchen Zytotoxizitäts-Mechanismus Neutrophile benutzen, um CD95L+ Tumore abzustoßen (Behrens et al., 2001). Um dies in vivo zu untersuchen, wurde das Wachstum von CD95L+ und CD95L- Tumoren (B16-CD95L und B16-neo) in Wildtyp-Mäusen mit dem Wachstum in zwei Arten von knockout-Mäusen verglichen, deren Neutrophilen jeweils ein Zytotoxizitäts-Mechanismus fehlt. Die Neutrophilen der iNOS-/-Mäuse können keine zytotoxischen Stickoxide produzieren (Laubach et al., 1995). Die Neutrophilen von p47phox-/--Mäusen, bei denen die Untereinheit p47 der phagozytären NADPH-Oxidase fehlt, können keine zytotoxischen Sauerstoffradikale produzieren (Jackson et al., 1995). Die CD95L-Expression führte auch bei diesem Mausmodell zu einem Wachstumsnachteil in vivo (Abb. 22). Außerdem wuchsen sowohl die Kontrolltumore als auch die CD95L+ Tumore in allen drei Mausstämmen jeweils gleich schnell. Die NADPHOxidase (p47phox) und iNOS scheinen also bei der Abstoßung der CD95L+ Tumore nicht direkt involviert zu sein. Allerdings ist nicht völlig auszuschließen, dass sich beide Zytotoxizitäts-Mechanismen gegenseitig kompensieren, dass die Tumore also in iNOS-/-Mäusen durch reaktive Sauerstoffradikale und in p47phox-/--Mäusen durch NO-Derivate abgestoßen werden. Dies könnte mit iNOS-/--p47phox-/--Mäusen überprüft werden. Jedoch ist schon in beiden Einfach-Knockout-Mausstämmen die zytotoxische Aktivität der Neutrophilen stark eingeschränkt. Außerdem interagieren beide Mechanismen miteinander und bilden gemeinsame zytotoxische Moleküle (Peroxynitrit). Da keinerlei Wachstumsunterschiede festgestellt wurden, ist es also unwahrscheinlich, dass iNOS und p47phox eine wichtige Rolle bei der Abstoßung spielen. Neutrophile besitzen darüber hinaus weitere Zytotoxizitäts- Diskussion 91 Mechanismen, die an der Abstoßung beteiligt sein könnten (Witko-Sarsat et al., 2000). Sie produzieren antimikrobielle Peptide sowie eine Vielzahl von Proteasen, die nach Freisetzung zur Lyse oder Abstoßung der Tumore führen könnten. Insgesamt ist es nach den Ergebnissen in dieser Arbeit fraglich, ob Neutrophile überhaupt direkt CD95L+ Tumore abstoßen. Sowohl die Zytotoxizitätsexperimente in vitro als auch die in vivo-Experimente lassen keine wichtige Rolle für die Neutrophilen erkennen. Möglicherweise sterben CD95L+ Tumore durch andere Mechanismen, wodurch dann Neutrophile angelockt werden und die sterbenden Zellen phagozytieren. Genaueren Aufschluss darüber könnte man durch Experimente mit Neutrophilen-Depletion erhalten. Eine Aufklärung der Verbindung zwischen CD95L und Neutrophilen ist auch deshalb besonders interessant, da bisher davon ausgegangen wird, dass apoptotischer Zelltod nicht zu Entzündungsreaktionen führt. Der wahrscheinlichste alternative Abstoßungsmechanismus ist der Suizid oder Fratrizid der Tumorzellen. Obwohl in den meisten Studien Tumorzellen eingesetzt wurden, die in vitro relativ CD95-resistent waren, schließt dies nicht vollständig aus, dass CD95L+ Tumorzellen in vivo ihre Nachbarzellen umbringen. Einerseits haben die Zellen beim Wachstum in vivo möglicherweise mehr und dichtere Zell-Zell-Kontakte, so dass eine geringe CD95-Sensitivität ausreichen könnte. Andererseits wurde gezeigt, dass einige Tumorzellen in vivo sensitiviert werden (z.B. durch Interferon-γ). Um einen Suizid/Fratrizid-Mechanismus auszuschließen, könnten Experimente mit lpr-Tumoren durchgeführt werden. Allerdings ist nicht anzunehmen, dass menschliche CD95L+ Tumore wesentlich resistenter gegenüber CD95vermittelter Apoptose sind als die eingesetzten Maustumore. Bei ihnen kommt es aber nicht zum Suizid oder zur Abstoßung. Das unterschiedliche Wachstum der murinen CD95L+ und CD95L- Tumore könnte auch durch Unterschiede im Stroma oder der Vaskularisation verursacht werden. Eine genaue Aufklärung dieser komplexen Zusammenhänge ist für die Tumorimmunologie und die Krebstherapie von großer Relevanz. CD95L-Gentransfer wurde bereits als Möglichkeit zur Tumor-Therapie vorgeschlagen (Arai et al., 1997). Bevor aber klar ist, ob im Menschen eine CD95L-Expression zur Tumorabstoßung oder zur Immunevasion führt, ist dies keine rationale Therapieoption. Außerdem wurde gezeigt, dass konventionelle Chemotherapie zur Induktion von CD95L führen kann (Eichhorst et al., 2000; Friesen et al., 1999; Muller et al., 1997). Es ist daher dringend notwendig festzustellen, ob diese CD95LInduktion nicht direkt zur Immunevasion des Tumors und damit zu einer schlechteren Prognose des Patienten beiträgt. 92 5. Literatur LITERATUR Aas, T., Borresen, A. L., Geisler, S., Smith-Sorensen, B., Johnsen, H., Varhaug, J. E., Akslen, L. A., and Lonning, P. E. (1996). Specific P53 mutations are associated with de novo resistance to doxorubicin in breast cancer patients. Nat Med 2, 811-4. Adida, C., Berrebi, D., Peuchmaur, M., Reyes-Mugica, M., and Altieri, D. C. (1998). Antiapoptosis gene, survivin, and prognosis of neuroblastoma. Lancet 351, 882-3. Allison, J., Georgiou, H. M., Strasser, A., and Vaux, D. L. (1997). 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