oder NK-Zellen - Medizinische Hochschule Hannover

Was ist Zelltherapie?
Zelltherapeutika zur individualisierten Medizin
Ulrike Köhl
Institut für Zelltherapeutika
GMP Development Unit / Cellular Therapy Centre
Medizinische Hochschule Hannover (MHH)
Herstellung von Zelltherapeutika
 Zelluläre Immuntherapien
Wer kann davon profitieren?
 Hämatopoetische Stammzellen
als „klassische Zelltherapie“
 Arzneimittel für neuartige Therapien
Beispiele (1) Virus-spezifische T-Zellen
(2) Gen-transduzierte Stammzellen
(3) “CAR” exprimierende T- oder NK-Zellen
Köhl 14.04.2016
Institut für Zelltherapeutika
Einleitung
Cellular Therapy Centre / GMP Development Unit
 September 2011: MHH erwirbt eine GMP facility
mit 3 Reinräumen
GMP=good manufacturing practice
(>10 jährige GMP-Vorgeschichte, Fa. Cytonet)
 Mai 2012 neues “Institut für Zelltherapeutika” mit:
•
GMP Development Unit (GMPDU), IFB-Tx:
– Service Unit der MHH für neue zellbasierte Therapien
– Forschergruppe „Natürliche Killer Zellen“
•
Cellular Therapy Centre (CTC):
Herstellung und Vertrieb von Zellpräparaten nach
§§13, 20b&c, 21a AMG (Arzneimittelgesetz)
Institut für Zelltherapeutika: 6 Wissenschaftler/Ärzte, 3 PostDOCs,
2 Assistentinnen, 8 MTAs, 2 PhD Studenten, 1 wiss. Koordinatorin
Köhl 14.04.2016
Medical Park
Inst. f. Zelltherapeutika
MHH
Produktion (Reinraum 1+2)
Schleuse
Reinraum 3
Kryokonservierung
Dokumentation
4. OG
Wareneingang
Freigabe
Lager
Prüfung/ Qualitätskontrolle
Institut für Zelltherapeutika
Ziele
Validierungsläufe
Produktentwicklung
Upscaling
Herstellung
Qualitätskontrolle
Freigabe
Herstellungserlaubnis
Zellbasierte Therapien (ohne substantielle Manipulation)
Advanced Therapy Medicinal Products (ATMPs)
• Somatische Zelltherapeutika
Arzneimittel für neuartige Therapien
• Gentherapeutika
• Biotechnologisch bearbeitetes Gewebeprodukt
Köhl 14.04.2016
Prä-klinisch
Herstellung/
Prüfung „AMG“
„first in man“
Studien
Späte Klinische Studien
Routine
Blut und Knochenmark Stammzellen (inkl. CD34 sel., CD3/CD19 depl., TCR α/ß depl.)
europaweit
B. Eiz-Vepser, B. Mäcker-Kolhoff,
Antigen-spezifische T-Zellen (CMV, ADV, EBV, multi-virus) Infektionen, PTLD
E. Jäckel
A. Franzke
Regulatorische T-Zellen
M. Sauer, A. Schambach
„CAR“-exprim. T-Zellen
Somatische
ATMPs
„CAR“ NK-Zellen
S. Petri
MSCs
ALS
T. Lenarz, A. Warnecke
MSCs Neuroprotektion, Cholearimplantation
P. Vogt, C. Radke
MSCs
Wund- und Narbenheilung
Gentherap.
ATMPs
R. Blaszyek, C. Figueiredo
Cell-Tools
F. Limbourg T. Moritz, G. Hansen
Marophagen PAP
R. Stripecke, A. Ganser
„smile“ DZ
U. Martin, A. Haverich
iPS Kardiomyoz.
PTLD = Post Transplant Lymphoprol. Disease
AR = Chimeric Antigen Receptor
MSC = Mesenchymale Stromazellen
ALS = Amytrophische Lateralsklerose
PAP = Pulmonale Alveolarproteinose
DZ = Dendritische Zellen
iPS = induzierte Pluripotente Stammzellen
Biotechn.
bearb.
Gewebeprodukte
Zellinteraktionen bei der Immunabwehr
Gesundes
Patient nach Stammzell-/
Organtransplantation
oder mit Immundefekt
Erreger
angeborenes Immunsystem
Natürliche Barriere
(Haut / Schleimhaut)
Dendriten
Hohes Risiko




Phagozyten
Differenzierung
und Aktivierung
Zytokine
NKZellen
Hemmung
Aktivierung
Zytotox.
T-Zellen
T-Helferzellen
Gesundes
B-Zellen
erworbenes Immunsystem
Lehrnbecher T, Koehl U, et al. Lancet Oncol 2008
Köhl 14.04.2016
Hintergrund
Tumorzellen
Infektionen
Transplantabstoßung
Rezdiv der Erkrankung
GvHD (graft versus host disease)
Allogene SZT bei Patienten mit HochrisikoLeukämien und Tumoren
Spender
Hintergrund
Antigenpräsentierende Zelle
T-Zelle
KM-Entnahme
Leukapherese
G-CSF
Natürliche
Killerzelle
Stammzelle
B-Zelle
Transplantation der
Spenderzellen (SZT)
Chemotherapie
(ggf. Bestrahlung)
Empfänger
Zellzahl/µl
2000
1500
1000
500
0
0
25
50
75
100 125 150 175 200
Tage nach SZT
Immunrekonstitution
nach Warren D. Shlomchik, Nature Reviews Immunology 7, 340-352 (May 2007)
Routineproduktion
Methoden
(PEI-Genehmigungen nach §21a AMG)
Validierungsläufe
Produktentwicklung
Herstellung
Qualitätskontrolle
Freigabe
Upscaling
CD34/CD133
Selektion
CD3/CD19 (TCR αβ)
Depletion
•
•
•
•
•
Autologe Blutstammzellen
Allogene Blutstammzellen
Autologes Knochenmark
Allogenes Knochemark
Donorlymphozyten (DLI)
Insgesamt: > 200 Produkte/ Jahr
CD34-selektierte Stammzellen
 CD133-selektierte Stammzellen
 CD3/CD19-depletierte Stammzellen
 TCR αβ-depletierte Stammzellen

NTCB = Non target cell bag CCB = Cell collection bag PBSC = Peripheral blood stem cells
Köhl 14.04.2016
JACIE Akkreditierung – 2 Kliniken + 2 Institute
der MHH im Julie 2014
Clinic of Pediatric
Hematology and Oncology
Prof. Dr. C. Kratz
Clinic of Hematology,
Oncology and Stem Cell
Transplantation
Institute of Transfusion
Medicine
Institute of Cellular
Therapeutics
Prof. Dr. A. Ganser
Prof. Dr. R. Blasczyk
Prof. Dr. U. Köhl
Core facility
QM
Prof. Dr. M. Sauer / Prof. Dr. M. Eder
Herstellung von Zelltherapeutika
 Zelluläre Immuntherapien
 Hämatopoetische Stammzellen
 Arzneimittel für neuartige Therapien
Beispiele (1) Virus-spezifische T-Zellen
Behandlung schwerer Infektionen
(2) Gen-transduzierte Stammzellen
Chronische Granulomatose
Pulmonalen Alveolarproteinose
(3) “CAR” exprimierende T- oder NK-Zellen
Neue Wege in der Krebstherapie
Köhl 14.04.2016
Immunrekonstitution nach SZT
Hintergrund
Zellzahl [WBC/µl]
KMT
1. Jahr nach SZT:
Konditionierung
Gefahr einer Cytomegalievirus (CMV) – Reaktivierung
(Adenovirus (ADV), Epstein-Barr Virus …)
5.000
Immunrekonstitution
0
-10
0
+10
+20
Tage nach KMT
Köhl 14.04.2016
+30
+40
Herstellung antiviraler T-Zellen
für den Einsatz in der adoptiven Immuntherapie
CMV, EBV oder ADV
spezifische Peptide
B. Mäcker-Kolhoff B. Eiz-Vesper
Antigenstimulation
Apherese
Zytokin-sezernierende
Zellen
Spenderlymphozyten
Spender
Antivirale T-Zellen
Empfänger
Köhl 14.04.2016
Tischer S et al. J Translational Medicine 2015
Zellseparation mittels
Cytokine Capture
System (CCS)
CMV spezifische T-Zellen (CD8+ IFN- +)
vor Aufreinigung
Ergebnisse
nach Aufreinigung
0.3%
CD8
CD8
93%
IFN-
IFN-
Tischer S et al. J Translational Medicine 2015
Köhl 14.04.2016
alloCELL: Herstellung und Applikation antigenspezifischer T-Zellen
Ergebnisse
Herstellungserlaubnis
- CMV-CTLs: 2014
- EBV/ADV-CTLs: 2015
- multi virus-spezifische: 2015
Spender Register alloCELL
(ITM, MHH)
• Einwilligung von >1500 Spendern
• > 500 gut charakterisierteSpender:
CMV-CTLs/ EBV-CTLs/ ADV-CTLs
(HHV6, WT1)
Herstellung n=23
• 10 Patienten: CMV-CTLs
• 3 Patienten: EBV-CTLs
• 1 Patient:
CMV-/ ADV-CTLs
• 9 Patienten: ADV-CTLs
Tischer S, Priesner C … Maecker-Kolhoff B…Koehl U*, Eiz-Vesper B*.
J Translational Medicine 2015
Bereich: 5x104 - 3x106 IFN-+ CD3+T-Zellen
Herstellung von Zelltherapeutika
 Zelluläre Immuntherapien
 Hämatopoetische Stammzellen
 Arzneimittel für neuartige Therapien
Beispiele (1) Virus-spezifische T-Zellen
Behandlung schwerer Infektionen
(2) Gen-transduzierte Stammzellen
Chronische Granulomatose
Pulmonalen Alveolarproteinose
(3) “CAR” exprimierende T- oder NK-Zellen
Neue Wege in der Krebstherapie
Köhl 14.04.2016
Gentherapie für X-CGD
Frankfurt, Hannover, Zürich
Ergebnisse
(X-Chromosomen gebundene chronische Granulomatose)
Erbkrankheit: Funktionaler Defekt der NADPH-Oxidase
Schwere Infektionen; stark reduzierte Lebenserwartung
Transplantation der
modifizierten Stammzellen
Partielle Myeloablation
(Busulfan)
X-CGD Patient
Retroviraler Gentransfer
LTR
gp91phox
Stammzellen
(CD34+)
LTR
Transfervektor
(SF71phox)
G-CSF Mobilisierung
Isolierung von
CD34+ Zellen
Leitung: M. Grez GSH Frankfurt
Benefit und Grenzen der CGD-Behandlung
Ergebnisse
Anteil der Insertionen in %
vor Gentherapie
gp91+ Zellen
MDS1/EVI1
PRDM16
Tage nach Transplantation
nach Gentherapie
Entwicklung eines
Myelodysplastisches Syndroms
mit Monsosomie 7,
Epigenetisches Gen “silencing”
Ott M et al., Nature Medicine 2006
Stein S et al., Nature Medicine 2010
Siler U et al., Curr Gene Therapy 2015
Gentherapie der Pulmonalen Alveolarproteinose (PAP)
G. Hansen
Genkorrigierte autologe Makrophagen
Vorläuferzellen (KM) zur PAP Behandlung
Akkumulation
von Proteinen
in der Lunge
Resolution der Lungenerkrankung
Gesunder Mensch
PAP- Patient
T. Moritz
Herstellung von Zelltherapeutika
 Zelluläre Immuntherapien
 Hämatopoetische Stammzellen
 Arzneimittel für neuartige Therapien
Beispiele (1) Virus-spezifische T-Zellen
Behandlung schwerer Infektionen
(2) Gen-transduzierte Stammzellen
Chronische Granulomatose
Pulmonalen Alveolarproteinose
(3) “CAR” exprimierende T- oder NK-Zellen
Neue Wege in der Krebstherapie
Köhl 14.04.2016
Ergebnisse
Neue therapeutische Wege bei Krebs: “CARs”
Transduktion
EffektorZelle
KrebsZelle
EffektorZelle
GD2
ErbB2
CD19
CD20
CD123/(CD44v6)
+
anti-CAR scFv
Aktivierung der T/NK-Zelle
CAR
Effektor
-Zelle
anti-GD2
anti-ErbB2
anti-CD19
anti-CD20
anti-CD123
CD28
Angriff und Zerstörung
der Krebszelle
Transmembran
Domäne
4-1BB
CD3
“third generation CARs”:
Gerichtete, krebs-spezifische T- oder NK-Zellen:
Exprimieren Chimäre Antigenrezeptoren (CAR) bi-spezifisch
Köhl 14.04.2016
Kombination der Antigenerkennungsdomäne
eines Antikörpers mit der intrazellulären
Domäne von CD3ζ
„chimeric antigen receptor (CAR)“, „scFv=single chain Fv antibody“
Gerichtete “CAR” exprimierende T-Zellen
www.clinicaltrials.gov:
> 150 registrierte klinische „CAR“ T-Zell Studien
(überwiegend USA)
02/2016 - BMBF geförd. multi-zentrische Melanom-Studie: Miltenyi Biotec;
H. Abken (Köln); Institut für Zelltherapeutika, MHH (Hannover): Zentrale Herstellung
FO CUS O N t Um O UR I m m UNO l O g y & I m m UNOtREV
h ERa
p yS
I EW
Transduzierte
Automatische
Herstellung
T-Zellen
FO
CUS O N t Um
O UR I m mgerichteter
UNO l O g y
& I m m UNOtREV
h ERa
p yS
I EW
FO CUS O N t Um
O URSIN
I m m UNO l O g y & I m m UNOtREV
h ERa
p yS
I EW
T-Zellen
a
Lentivraler
CD4/CD8
selektierte
TCR
T-Zellen T cell
Tumourasample
from patient
Tumour sample
TCR
from patient
TCR
T cell
T cell
Vektor für
CD20 CAR
Gen-modifizierte
Expand cell
T-Zellen
Tumourpopulations in culture
“CAR T-Zellen”
gegen
TCR
Expand cell
Tumourpopulations
in culture
Melanom-Stammzellen
Expand
cell
Avidity
testing
Tumour-
TCR
populations in culture
Patient
Patient
Patient
TCR
anti-CAR
a
Tumour sample
from patient
Avidity
testing Avidity Viral vector encoding
testing
Human T cell
engineered to
express tumourT cells isolated
ZellZell- from tumour
ZellViral Zellvector encoding
Human T cell Finale
engineered
to T cell
Viral vector encoding
Human
Expansion
Formulierung
selektion
aktivierung transduktion
expressengineered
tumour- to
T cells isolated
from tumour
express tumour- a
T cells isolated
Tumour sample
from tumour
afrom patient
FO CUS OTCR
N t Um O UR I m m UNO l O g y & I m
Expand cell
Tumour sample
Patient
Tumourpopulations in culture from patient
T cell
TCR
a
TCR
Tumour sample
Exp
Genetically
from patient
T cell
pop
TCR
Avidity Tumourengineered
TCR
T cell
testing
activating
Avidity
Human
T
cell
expressing
Clone chimeric
Avidity
Avidity
motif
testingGenetically
chimeric antigen
antigen receptor
testing
testing
engineered
Genetically
into retroviral vector
Viral vecto
activating
Viral vector encoding
Human T cell
engineered
HumanaT
cell expressing
tumour
antigen
Clone chimeric
engineered to
motif
Viral activating
vector encoding
Human
T cellchimeric
chimeric
antigen
express tumourT cells isolated
Human
T cell expressing
antigen
receptor
Clone
from tumour T cells isolated
Viral vecto
engineered
to
motif
chimeric antigen
into
retroviral
vector
antigen
receptor
from tumour
express
tumoura tumour antigen
into
retroviral vector
b
T cells isolated
Mouse transgenic
a tumour antigen
from tumour
for human MHC
FO CUS O N t Um O UR I m
FO CUS O N t Um O UR I m m UNO l O g y & I m m UNOtREV
h ERa
p yS
I EW
FO
CUS O NKontrolle
t Um O UR I m
a
Melanom
Tumour sample
from patient
Patient
b
LeukaTCRb
phereseb
Lymphodepletion
Konditionierung
T cell
Qualitäts
kontrolle
Zellinfusion
CD8
c isolated
T cells
from tumour
NK-Zellen zur Immuntherapie
Ergebnisse
NK-DLI = NK-Zell Donor Lymphozyten Infusion
Allogene NK-Zellen (NK-DLI) nach haploidenter SZT (Clin Gov: NCT 01386619)
Hochrisikopatienten mit Leukämien und Tumoren
Leukapherese
GMP
GMP
Spender
Eltern
Haploidente
Stammzelltransplantation
(SZT)
NK-Zell-Aufreinigung
IL-2 Expansion
(CD56-Sel./CD3-Depl.)
(1000 U/ml)
NK-Zell-Applikation
1. NK-Zell
Applikation
2. NK-Zell
Applikation
3. NK-Zell
Applikation
(+3)
+40
+100
CD34 sel./ CD3/CD19 depl.
0
Koehl Front Oncol 2013 Stern BMT 2013 Kloess Frontiers Immunol 2015
Kloess Oncoimmunol 2015
[Tage nach SZT]
Koehl OncoImmunol in press (review)
NK-Zellen zur Immuntherapie
Ergebnisse
NK-DLI = NK-Zell Donor Lymphozyten Infusion
Allogene NK-Zellen (NK-DLI) nach haploidenter SZT (Clin Gov: NCT 01386619)
Hochrisikopatienten mit Leukämien und Tumoren
Leukapherese
GMP
GMP
Spender
Eltern
NK-Zell-Aufreinigung
IL-2 Expansion
(CD56-Sel./CD3-Depl.)
(1000 U/ml)
NK-Zell-Applikation
Möglichkeiten
Haploidente
 Alle
Patienten (n=25) Therapie gut vertragen
StammzelltransNK-Zell3/kg
NK-Zell
 Keineplantation
GvHD (graft versus host1.disease)
wenn T-Zellen <2.50x10
Applikation
Applikation
(SZT)
 Applikation
von „third party“ NK-Zellen ist möglich
3. NK-Zell
Applikation
CD34 sel./ CD3/CD19 depl.
Grenzen
0
(+3)
+40
 Tumor Immun-Escape Mechanismen (MICA, TGFβ)
Koehl Front Oncol 2013 Stern BMT 2013 Kloess Frontiers Immunol 2015
Kloess Oncoimmunol 2015
+100
[Tage nach SZT]
Koehl OncoImmunol in press (review)
Retrovirale Transduktion primärer
humaner NK-Zellen
Ergebnisse
EGFP pos. Zellen (%)
Transduktion primärer
humaner NK-Zellen
alpha
EGFP
Mock
FSC-H
Effiziente Transduktionsrate bei primären NK-Zellen mit alpha SIN Vektoren
Suerth J et al. J Mol Med August 2015
Köhl 14.04.2016
Koop.: A. Schambach, MHH
CAR-exprimierende NK-Zellen gerichtet gegen CD19
IL-2-aktivierte NKZellen vs. BV173
Anti-CD19-CAR-NKZellen vs. BV173
Ergebnisse
Anti-CD19-CAR-NK-Zellen
vs. anti-CD19-markierte BV173
CD19+ Leukämiezellen (%)
Blockierung
Zeit [h]; Effektor:Target (NK-Zellen vs. BV173) Ratio: 5:1
Köhl 14.04.2016
Zimmermann S … Koehl U. JIM 2005
Suerth J et al. J Mol Med August 2015
Clinical Scale – CAR-exprimierende NK-Zellen
Validierungsläufe
Produktentwicklung
Upscaling
Herstellung
Qualitätskontrolle
GMP-konformes
Protokoll
„Off the shelf“ Product: Advanced Therapy Medicinal Product
Köhl 14.04.2016
SOP=standard operation protocol
CMC=chemical manufacturing and control
IMPD=investigational medicinal product dossier
Zusammenfassung
Möglichkeiten:
 Herstellung von Stammzellpräparaten zur SZT: Etabliert, > 15 Jahre
 Arzneimittel für neuartige Therapien zur individualisierten Medizin:
Therapieoption für Hochrisikopatienten nach SZT und Organtransplantation
- Antigen-spezifische T-Zellen bei schwersten Infektionen
- Korrektur schwerer Gendefekte durch gen-transduzierte SZ möglich (CGD; Pul. Alveolarpr.)
- Gerichtete T- und NK-Zellen zur Krebstherapie; Gabe „third party Spender-NK-Zellen“
Grenzen:
 Gefahr durch langlebige Zellen, die entarten können (CGD)
 antigen-spezifische T-Zellen: Dosiseskalation schwierig - Anzahl gering
 Äußerst wirkungsvoll, aber zeitaufwendig und teuer
Köhl 14.04.2016
Team Institut für Zelltherapeutika
U. Köhl´s „23 co-worker“
R. Esser
S. Klöss
W. Glienke
O. Oberschmidt
T. Gardlowski
M. Marburger
N. Matthies
K. Zuther
A. Silva
C. Batkai
A. Quaiser
A. Kruel
L. Arseniev
C. Priesner
K. Aleksandrova
J. Leise
K. Bennay-M`Barkiou
S. Könecke
D. Ladas
A. Mut
A. Franke
C. Dehn
A. Oppe
Köhl 14.04.2016
Research
GMP-DU
CTC
Clinic

Pädiatrische Hämatol./Onkol., MHH
Institut f. Transfusionsmedizin, MHH
C. Kratz
B. Mäcker-Kolhoff
R. Baier
R. Blasczyk
M. Sauer
K.W. Sykora
GSH, Frankfurt, D
B. Eiz-Vepser
S. Tischer
Kantons-Spital Basel, CH
M. Grez
Hämatologie, Onkologie, SZT, MHH
A. Ganser
M. Eder
M. Stadler
E. Mischak-Weissinger
R. Stripecke
L. Goudeva
HG. Heuft
J. Passweg
M. Stern
C. Kalberer
Kinderspital, Zürich, CH
J. Reichenbach
R. Seger
Experimentelle Hämatol./Onkol., MHH
Pädiatrische Hämatologie/ Onkologie
Frankfurt, D
T. Klingebiel
D. Schwabe
S. Hünecke
P. Bader
C. Brehm
J. Sörensen
M. Bremm
Köhl 14.04.2016
A. Schambach
M. Morgan
T. Moritz
M. Galla
Pädiatrische Neon./Pneum., MHH
G. Hansen
und Ihnen Danke fuer Ihre Aufmerksamkeit