DNA (Virus) Vektoren

Molekulare Virologie I (Sommersemester 2008)
DNA (Virus) Vektoren
Dr. Armin Baiker, Max von Pettenkofer-Institut
Gliederung:
Kriterien für die Einteilung von Vektoren:
1) Adminstration
2) Replikation
3) Nukleäre Retention (Persistenz)
Plasmidreplicons:
1) nicht-viral
2) viral
Replikationsdefiziente Viren:
1) Adenovirale (Ad-) Vektoren
2) Adeno-assoziiertes Virus (AAV-) Vektoren
Replikationskompetente Viren:
1) Vaccinia Virus Vektoren
2) Onkolytische Viren
Überblick über aktuelle Gentherapiestudien
Kriterien für die Einteilung von Vektoren:
1) Administration
Nackte DNA
Replikationsdefiziente Viren
Replikationskompetente Viren
Kriterien für die Einteilung von Vektoren:
1) Administration – nackte DNA
Transfektion
Physikalische Transfektionsmethoden
1) Nadel Injektion in Gewebe / Inhalation
2) Hydrodynamischer Gentransfer
3) Mikroinjektion in Nukleus
4) „Gene Gun“ Transfer
5) Elektroporation
Chemische Transfektionsmethoden
Kondensation
Positive Ladung
1) Kalziumphosphat Co-Präzipitation
(Membranfusion)
2) Kationische Polymere
3) Kationische Lipide („non-bilayer forming“)
4) Liposomen („bilayer forming“)
Transfektionsmethoden mit „nuclear localization signals“
Geringe Effizienz des Gentransfers
Kriterien für die Einteilung von Vektoren:
1) Administration – Replikationsdefiziente Viren
Transduktion
Beibehaltung der Mechanismen der Ausgangsviren zur
Infektion (Transduktion) von Zielzellen
Dadurch: sehr hohe Effizienz des Gentransfers
Zusammenbau in z.T. komplexen Produktionssystemen
Häufig immunogen (humorale und zelluläre Immunantwort)
Nicht-integrierende Vektoren sind nur „transient“
Kriterien für die Einteilung von Vektoren:
1) Administration – Replikationskompetente Viren
Infektion
Basieren auf attenuierten bzw. genetisch modifizierten
replikationskompetenten Viren
Anwendung (Studien) v.a. in der Therapie von Tumoren
(onkolytische Viren) und in der DNA Vakzinierung
Kriterien für die Einteilung von Vektoren:
2) Replikation
Kein Mechanismus zur Replikation vorhanden
Verlust des Vektors während der Zellteilungen !
transiente Expression eines Transgens
(Indirekte) Replikation nach Integration ins Wirtschromosom
stabile Expression eines Transgens
Mechanismen der episomalen Replikation vorhanden
stabile Expression eines Transgens
- Kopienzahl des Vektors ?
- Zellzyklus (MCM2-7) abhängige Replikation ?
Replikation
Exkurs: „MCM2-7 licensing“
ORC1-6 assoziiert
mit ORI
Schrittweise
„assembly“ der
Initiatorproteine:
1)
Cdc6, Cdt1
2)
MCM 10
3)
MCM 2-7
S-Phase assoziierte
CdK‘s:
Cdc6
Cdc7 / 45
Eintritt in S-Phase
(DNA Replikation)
ORC:
MCM:
Cdk:
Cdc:
Cdt1:
RPA:
Dpb:
Origin recognition complex
Minichromosome maintenance (replikative Helikase)
Cyclin dependent kinase
Cell division cycle protein
cdc 10 dependent transcript 1
Replication Protein A
DNA Polymerase binding protein
Kriterien für die Einteilung von Vektoren:
3) Nukleäre Retention (Persistenz)
Kein Mechanismus der Retention vorhanden
Verlust des Vektors während der Zellteilungen !
transiente Expression eines Transgens
(Indirekte) Retention nach Integration ins Wirtschromosom
stabile Expression eines Transgens
Retentionsmechanismen von Episomen vorhanden
stabile Expression eines Transgens
1) Kopienzahl-Strategie
2) Bindung an Metaphasechromosom („piggy-back“) Strategie
3) Centromer-Strategie
4) Selektionsdruck-Strategie
5) Verschiedene Endreplikationsstrategien linearer Episomen
Gliederung:
Kriterien für die Einteilung von Vektoren:
1) Adminstration
2) Replikation
3) Nukleäre Retention (Persistenz)
Plasmidreplicons
1) nicht-viral
2) viral
Replikationsdefiziente Viren
1) Adenovirale (Ad-) Vektoren
2) Adeno-assoziiertes Virus (AAV-) Vektoren
Replikationskompetente Viren
1) Vaccinia Virus Vektoren
2) Onkolytische Viren
Überblick über aktuelle Gentherapiestudien
Plasmidreplicons:
Nicht-virale Plasmidreplicons und künstliche Chromosomen:
1) Historisch: Vektoren für die Hefe
2) Vektoren für Säugetierzellen
Virale Plasmidreplicons:
1) Das Simian Virus 40 (SV40) Plasmidreplicon
2) Das Papillomavirus (HPV / BPV) Plasmidreplicon
3) Das Epstein-Barr Virus (EBV) Plasmidreplicon
4) „Substituted“ EBV Plasmidreplicons
Administration als „nackte“ (Plasmid-) DNA
1976
2 µm - Plasmid
ARS Plasmide
Spindel (Metaphase)
Nach 1976
YAC‘s
ORI
TEL CEN ORI TEL
STB
IR
OR
I
D
Spindel
(Metaphase)
REP1
IR
FLP
Selektionsmarker
REP2
„rolling circle“
Replikationsintermediat
MCM 2-7 Abhängigkeit
Ja
Nukleäre Retention STB (CEN) /
.
Kopienzahl
Ja
Ja
Selektionsdruck
.
CEN / TEL
.
Kopienzahl
50-100
<10
<10
Replikation
2µm ORI
ORI
ORI
Plasmidreplicons / künstliche Chromosomen:
Grundlagenforschung in der Hefe
ORI
ARS
Isolierung
(Klonierung in Plasmide)
Replikation
der Plasmide !
ORC
Entdeckung von autonom replizierenden Sequenzen (ARS)
Grundlagenforschung im Bereich der molekularen
Chromosmenstruktur: ORI‘s, Centromere,Telomere
Plasmidreplicons / künstliche Chromosomen:
Grundlagenforschung in Säugetierzellen
Eine Übertragung der aus Hefe gewonnenen Erkenntnisse im
Bereich der Vektorologie auf Säugetierzellen ist sehr lange
nicht möglich (bis Ende der 1990er Jahre)
(Mögliche) Ursachen:
1) Höhere Komplexität von Säugetier ORI‘s
2) Technische Schwierigkeiten bei der Transfektion von
Säugetierzellen
3) (unbekannte) Epigenetische (Kontroll-) Mechanismen:
- Kopplung von Replikation und Transkription
- „Silencing“ durch Methylierung von Promotoren
- Mechanismen der Etablierung von Episomen
- ???
4) Mechanismen der angeborenen Immunität:
- CpG Inseln im Plasmid „backbone“
Ursachen:
Exkurs: höhere Komplexität von Säugetier-ORI‘s
Der DHFR Locus:
(ca. 25 kbp)
Ursachen:
Exkurs: höhere Komplexität von Säugetier-ORI‘s
Matrix attachment regions (MAR):
nucleosome
30 nm chromatin fiber
MAR
nuclear matrix
300 nm chromatin fiber
- AT-rich sequences of around 100 bp - 1 kbp
- DNA unwinding elements / Base unpairing regions
- DNase I hypersensitive sites
- Topoisomerase II binding and cleavage sites
Ursachen:
Exkurs: „CpG islands“
Statistische Wahrscheinlichkeit eines CpG Dinukleotids: 1:16
In eukaryotischer DNA:
- Häufigkeit eines CpG Dinukleotids: 1:60
- C sehr häufig methyliert: mCpG
- „CpG-reiche“ (ca. 1:16) Regionen häufig assoziiert mit
Promotoren (epigenetische Regulation via „silencing“)
In bakterieller DNA:
- Häufigkeit eines CpG Dinukleotids: 1:16
- C nicht methyliert: CpG
Mechanismen der angeborenen Immunität können zwischen
bakterieller und eukarytischer DNA differenzieren:
- Erkannt werden: nicht methylierte CpG Motive
- via TLR-9 „signalling“
- B-Zellen und Plasmazytoide Dendritische Zellen (pDC‘s)
Ursachen:
Exkurs: „CpG islands“
Produktion inflammatorischer Zytokine !
Plasmidreplicons / künstliche Chromosomen:
nicht-viral – Chromosomale ORI Vektoren
Selektionsmarker
selection
cassette
Chromosomaler ORI (!)
MCM 2-7 Abhängigkeit
Nukleäre Retention
Ja
Selektionsdruck
Kopienzahl
<10
Replikation
Chromosomaler ORI (!)
Plasmidreplicons / künstliche Chromosomen:
nicht-viral – Künstliche Chromosomen
1997
MCM 2-7 Abhängigkeit
Nukleäre Retention
TEL CEN ORI TEL
Spindel
(Metaphase)
Ja
CEN / TEL
Kopienzahl
<10
Replikation
Chromosomaler ORI
Zwei Arten der Konstruktion:
„top - down“ (durch Fragmentierung) [0,5 -1 Mbp]
„bottom – up“ (durch „assembly“ in vitro) [~ 10 Mbp]
Schlechte Handhabbarkeit (Mbp !!!)
Instabilität (?)
Model für die Untersuchung der Chromosomenstruktur
Plasmidreplicons / künstliche Chromosomen:
nicht-viral – pEPI-Vektoren
1999
SAF-A
Chromosom
Kein definierter ORI:
ORC und MCM‘s können an verschiedenen
Stellen des Plasmid „backbones“ assemblieren
MARs
pEPI
TranskriptionsKomplex
mRNA
piggy back
Etablierte pEPI Episomen sind (auch ohne
Selektionsdruck) mitotisch stabil
Geeignet zur Herstellung transgener Tiere etc.
(Schwein, Zebrafisch)
MCM 2-7 Abhängigkeit
Nukleäre Retention
Ja
SAF-A Bindung an MARs
Kopienzahl
~10
Replikation
Transkription in MARs
Plasmidreplicons:
Nicht-virale Plasmidreplicons und künstliche Chromosomen:
1) Historisch: Vektoren für die Hefe
2) Vektoren für Säugetierzellen
Virale Plasmidreplicons:
1) Das Simian Virus 40 (SV40) Plasmidreplicon
2) Das Papillomavirus (HPV / BPV) Plasmidreplicon
3) Das Epstein-Barr Virus (EBV) Plasmidreplicon
4) „Substituted“ EBV Plasmidreplicons
Administration als „nackte“ (Plasmid-) DNA
Virale Plasmidreplicons:
Das Simian Virus 40 (SV40)
5300 bp
Familie: Polyomaviren
40 nm großes, ikosaedrisches Kapsid
Nicht umhüllt
Zirkulares, doppelsträngiges DNA Genom (5300 bp)
MCM 2-7 unabhängige Replikation
(T-Antigen ist replikative Helikase)
Virale Plasmidreplicons:
Exkurs: Polyomaviren und die Kernpore
Durchmesser: 40 nm
Passives Diffusionslimit:
10 nm
Importin (NLS) „mediated“:
40 nm
Polyomaviren „passen“ durch die Kernpore
Virale Plasmidreplicons:
Das SV40 („high copy number“) Plasmidreplicon
ab 1976
Model für die Untersuchung:
- der eukaryontischen DNA Replikation
- der Chromatinstruktur (Nukleosomen)
- der Genregulation („cis acting“ Enhancer)
- des alternativen „splicing“
MCM 2-7 Abhängigkeit
Nein
Nukleäre Retention
Kopienzahl
Kopienzahl
100-1000
DNA Replikation
SV40 ORI + T-Antigen
Virale Plasmidreplicons:
Das SV40 („high copy number“) Plasmidreplicon
heute
Anwendung in der Biotechnologie:
- Plasmidvektoren mit SV40 ORI und Promoter in cis
- Zellinien mit T-Antigen (293T, COS etc.) in trans
Immortalisierung (Transformation) von primären Zellen
via T-Antigen („libraries“ !)
Das T-Antigen:
- Bindung an SV40 ORI
- MCM 2-7 unabhängige, replikative Helikase
- Virales Onkoprotein (Inaktivierung von p53 und pRB)
- Immunogene Eigenschaften
Virale Plasmidreplicons:
Papillomaviren (HPV / BPV)
Familie: Papillomaviren
55 nm großes, ikosaedrisches Kapsid
Nicht umhüllt
Zirkulares, doppelsträngiges DNA Genom (7900 bp)
MCM 2-7 unabhängige Replikation
(E1 ist replikative Helikase)
Virale Plasmidreplicons:
Exkurs: Papillomaviren und die Kernpore
Durchmesser: 55 nm
?
Passives Diffusionslimit:
10 nm
Importin (NLS) „mediated“:
40 nm
Genauer Mechanismus unbekannt
Virale Plasmidreplicons:
Das BPV („intermediate copy number“) Plasmidreplicon
1980
piggy back
Chromosom
E2
E1
MCM 2-7 Abhängigkeit
Nukleäre Retention
.
Kopienzahl
DNA Replikation
Nein
(E1 +) E2 - Chromsom
(Kopienzahl)
~ 50 - 150
BPV ORI + E1 + E2
Virale Plasmidreplicons:
Das BPV („intermediate copy number“) Plasmidreplicon
heute (selten)
Anwendung in der Biotechnologie:
als BPV 69T Fragment
(Depletion von L1 und L2)
Immortalisierung (Transformation)
von primären Zellen:
E6: p53-Degradation
E7: Inaktivierung von pRB
„Warzenbildung“ in vitro
Replikation:
E1 ist die replikative Helikase (MCM 2-7 unabhängig)
Retention:
E2 (E1) Bindung an Chromosom („piggy back“)
Virale Plasmidreplicons:
Das Epstein-Barr Virus (EBV)
172 kbp
ori P
ori lyt
IR:
inverted repeat
TR: terminal repeat
U:
unique region
ori P: latenter (Plasmid) Ori
ori lyt: lytischer ORI
Familie: Herpesviren
160 nm großes, umhülltes Virus
Ikosaedrisches Kapsid
Doppelsträngiges DNA Genom (172 kbp):
- Linear im Virion
- Zirkular nach Rezirkularisierung im Zellkern
MCM 2-7 abhängige latente Replikation (ori P)
MCM 2-7 unabhängige lytische Replikation (ori lyt)
ori lyt
Virale Plasmidreplicons:
Exkurs: Herpesviren und die Kernpore
Durchmesser: <160 nm
Passives Diffusionslimit:
10 nm
Importin (NLS) „mediated“:
40 nm
Andocken des viralen Kapsids und Injektion der DNA
Virale Plasmidreplicons:
Exkurs: Komplexe Replikation von Herpesviren
A: Eintritt in Zelle (Fusion / Endocytose)
A
B
B: Freisetzung des Kapsids
C
D
C: Transport zu Kernporen
D: Einschleussen des linearen Genoms in Nukleus
Rezirkularisierung:
- Kaskadenartige Genexpression (IE, E, L)
- Latente Replikation via ori P
E
F
- Lytische Replikation via ori lyt:
Bildung von Konkatemeren (RCA)
E: Verpackung der Genome in Kapside
F: „Budding an innerer Kernmembran“ (Envelopment)
G
G: De-Envelopment am ER ins Zytoplasma
H
H: Re-Envelopment am TGN
I
I: Freisetzung an Zelloberfläche
Virale Plasmidreplicons:
Das Epstein-Barr Virus (EBV) – lytische Replikation
rolling circle
Amplifikation (RCA)
MCM 2-7 unabhängig
ori lyt
Virale Plasmidreplicons:
Das EBV („low copy number“) Plasmidreplicon
Latenz-ORI: ori P
1985
Nukleäre Retention
EBNA1
FR 24 x
Chromosom
EBNA
FR
DS 4 x
EBNA
FR:
family of repeats (24 x)
DS:
dyad symmetry element (4 x)
DS
ORC / MCM 2-7
piggy back
EBNA1
ORC / MCM2-7 – Rekrutierung
Replikation
MCM 2-7 Abhängigkeit
Nukleäre Retention
.
Kopienzahl
DNA Replikation
Ja
OriP (FR) + EBNA1 - Chromosom
.
~10
OriP (DS) + EBNA1
Virale Plasmidreplicons:
„Substituted“ EBV Plasmidreplicons
NLS
UR2
acidic
linker
AT-hook
HMGA1a::
EBNA1
386
HMGA1a
(Chromatin Bindung)
TetR
609
641
609
641
DBD
450
AT-hook
TetR
(Tet Operator Bindung)
HMGA1:
high mobility group AT hook 1
TetR:
Tetracyclin Repressor
ori P Bindung
ori P Bindung
linker
TetR::
HMGA1a
450
acidic
AT-hook
AT-hook
386
325
AT-hook
89
Chromatin Bindung
DBD
AT-hook
40
LR2
NLS
Gly-Ala
LR1
EBNA1
Gly-Arg
UR1
Gly-Arg
Das EBV Plasmidreplicon ist substituierbar:
hier gezeigt: Substitutionen von EBNA1
TetR
HMGA1a
(Chromatin Bindung)
Virale Plasmidreplicons:
„Substituted“ EBV Plasmidreplicons
Nukleäre Retention
Nukleäre Retention
HMGA1a::
EBNA1
FR
DS
Nukleäre Retention
EBNA1
EBNA1
FR
FR
ORCBindung
4 x TetO
FR:
family of repeats (24 x)
DS:
dyad symmetry element (4 x)
Doxycyclin
HMGA1a::
EBNA1
Replikation
TetR::
HMGA1a
Chromosomaler ORI
Replikation
Replikation
Das EBV Plasmidreplicon ist substituierbar:
hier u.a. gezeigt: Substitutionen des ori P (FR bzw. DS)
Trennung von Replikation und nukleärer Retention
praktische Anwendung z.B. als „ori fishing“ Vektoren
Gliederung:
Kriterien für die Einteilung von Vektoren:
1) Adminstration
2) Replikation
3) Nukleäre Retention (Persistenz)
Plasmidreplicons
1) nicht-viral
2) viral
Replikationsdefiziente Viren
1) Adenovirale (Ad-) Vektoren
2) Adeno-assoziiertes Virus (AAV-) Vektoren
Replikationskompetente Viren
1) Vaccinia Virus Vektoren
2) Onkolytische Viren
Überblick über aktuelle Gentherapiestudien
Replikationsdefiziente Viren:
Das Adenovirus (Ad)
36 kbp
E:
L:
ITR:
Psi:
early
late
inverted terminal repeats
Verpackungssignal
Familie: Adenoviren
60-90 nm großes, nicht umhülltes Virus
Ikosaedrisches Kapsid
ca. 51 bekannte, humanpathogene Ad Serotypen
Lineares, doppelsträngiges DNA Genom (30-36 kbp):
MCM 2-7 unabhängige lytische Replikation
Replikation startet an den „Enden“
Rezeptoren: CAR, Integrine
Replikationsdefiziente Viren:
Exkurs: Adenovirus und die Kernpore
Durchmesser: 60-90 nm
Replikationsdefiziente Viren:
Exkurs: Adenovirale (End-)replikation
5‘ TP
G 3‘
C
3‘ G
TP
5‘
C TP 5‘
Lineares Ad Genom mit
55 kDa TP an 5‘ Enden
G 3‘
G/C Paarung zwischen
80 kDa TP-dCMP und
dem G des 3‘ Endes
des Ad Genoms
E2A
C
5‘
TP
dCMP
3‘
C TP 5‘
3‘ G
dCMP bildet freie 3‘ OHGruppe als Primer für
die Replikation
E2A
5‘
TP
C
+
5‘
TP
G 3‘
dCMP
3‘ G
G 3‘
C TP 5‘
Der nicht-replizierte,
einzelsträngige,
E2A gebundene DNAStrang dient als Matrize…
Replikationsdefiziente Viren:
Exkurs: Adenovirale (End-)replikation
C TP 5‘
3‘
dCMP
G 3‘
TP
5‘
ITR‘s
…für die weitere Replikation unter
Ausbildung einer „Pfannenstielstruktur“
via ITR‘s (internal terminal repeats)
E2A
5‘
TP
dCMP
3‘ G
G 3‘
C TP 5‘
Replikationsdefiziente Viren:
Das Adenovirus (Ad) – weitere Informationen
Das „splicing“ wurde an Adenoviren entdeckt
1977: Erstbeschreibung der (Ad transformierten)
293 Zellen (Graham et al.)
Transformation durch die E1 Proteine:
- E1A Inhibition von pRB
- E1B Inhibition von p53
In Kombination führen beide Proteine zur Transformation
von Zellen in vitro
Daher: in allen replikationsdefizienten Adenoviren ist
das Gen für E1 deletiert
Replikationsdefiziente Viren:
Adenovirale Vektoren (schematisch)
E1
Wildtyp Ad
E2 L1 L2 L3 L4 E3 L5 E4
ITR
Genom: 30-36 kbp
ITR
_ E1
AV – 1.gen.
Transgen E2 L1 L2 L3 L4 E3 L5 E4
ITR
ITR
_ E1
AV – 2.gen.
Klonierungskapazität: 5.2 kbp
+
_ E3 (oder E2 oder E4)
Transgen E2 L1 L2 L3 L4 L5 E4
ITR
Klonierungskapazität: bis 13 kbp
ITR
_ E1-E4 und L1-L5
AV – 3.gen.*
Klonierungskapazität: 36 kbp
Transgen
ITR
(*auch bezeichnet als „gene-deleted“ oder „gutless“ AV)
ITR
Komplexität des
Produktionssystems
Produktion von „1. Generation“ adenoviralen Vektoren (AV‘s)
Transduktion mit AV‘s
_ E1
AV – 1.gen.
transgeneE2 L1 L2 L3 L4 E3 L5 E4
tg
ITR
ITR
cellular
entry
AV release
encapsidation
of AV-DNA
production
of viral
proteins
assembly
tg
mRNA
transcription
E1
E2
E3
E1
AAA
L3
AAA
L1
AAA
tg
AAA
E4
=
L2
AAA
AAA
viral DNA
replication
AAA
L4
AAA
endosomal
release
transgene
production
nuclear
pore
complex
release of
DNA into
nucleus
Replikationsdefiziente Viren:
Adenovirale Vektoren (AV) – Zusammenfassung
Administration (Transduktion) als replikationsdefiziente Viren
Dadurch: sehr effizienter Gentransfer auch in nicht-teilende
Zellen !
Keine Möglichkeit der Replikation
Dadurch: nur transiente Expression eines Transgens
Mechansimen der nukleären Retention sind nicht vorhanden
(bzw. ungeklärt)
Dadurch: nur transiente Expression eines Transgens
AV sind immunogen (z.B. neutralisierende AK !)
Dadurch: wiederholte Behandlungen sind nicht effizient
Erfolgreicher Gentherapie-Vektor:
Häufiger Einsatz in klinischen Studien
Replikationsdefiziente Viren:
Das Adeno assoziierte Virus (AAV)
ITR: inverted terminal repeat
rep: Replikationsproteine
cap: Kapsid Proteine
Hammerkopfstruktur
Familie: Parvoviren
20 nm großes, nicht umhülltes Virus
Können Menschen infizieren; keine Pathogenität !
Lineares, einzelsträngiges (-) DNA Genom (4.7 kbp)
Benötigen Helferviren (Adenoviren, Herpesviren) für eine
produktive Virusvermehrung (Faktoren z.B. Ad E1A)
Ohne Helferviren: site specific integration in Chromsom 19
(ITR und rep benötigt)
Rezeptoren: Heparansulfat, Integrine, FGFR
Replikationsdefiziente Viren:
Exkurs: Parvoviren und die Kernpore
Durchmesser: 20 nm
Passives Diffusionslimit:
10 nm
Importin (NLS) „mediated“:
40 nm
Parvoviren „passen“ durch die Kernpore
Replikationsdefiziente Viren:
Exkurs: AAV (End-)replikation
ITR‘s
Neusynthetisierte DNA
trs: terminal resolution site
Rep: Replikationsprotein
ITR: inverted terminal repeats
Produktive Replikation
bedingt Anwesenheit eines
Helfervirus !
Replikationsdefiziente Viren:
AAV Vektoren (schematisch)
rep
Wildtyp AAV
cap
ITR
Genom: 4.7 kbp
ITR
AAV Vektor
transgene
ITR
Klonierungskapazität: 4.8 kbp
ITR
Für die Produktion von AAV Vektoren:
(1) Bereitstellung von rep und cap
(2) Bereitstellung von Helferviren (Koinfektion)
Produktion von AAV Vektoren
rep
rep
cap
cap
wild-type AAV
ITR
tg
ITR
tg
1
transgene
ITR
ITR
helper-AD
AAVV tg
AAVV and
helper-AD release
2
Transduktion mit AAV
Vektoren
cellular tg
entry
tg
production
of viral
proteins
encapsidation
of DNA
tg
assembly
tg
tg
mRNA
E1
E1
transcription
rep
cap
E2
tg
AAA
viral DNA
replication
AAA
E3
rep
cap
AAA
transgene
production
tg
tg
release of
DNA into
nucleus
tg
tg
AAA
E4
nuclear
entry of
AAVV
AAA
tg
Replikationsdefiziente Viren:
AAV Vektoren – Zusammenfassung
Administration (Transduktion) als replikationsdefiziente Viren
Dadurch: sehr effizienter Gentransfer auch in nicht-teilende
Zellen !
Keine Möglichkeit der Replikation
Dadurch: nur transiente Expression eines Transgens
Mechansimen der nukleären Retention sind nicht vorhanden
(bzw. ungeklärt)
Dadurch: nur transiente Expression eines Transgens
AAV Vektoren sind wenig immunogen
Erfolgreicher Gentherapie-Vektor:
Häufiger Einsatz in klinischen Studien
Aktuell: Einsatz als DNA Vakzinierungs Vektor gegen HIV
Gliederung:
Kriterien für die Einteilung von Vektoren:
1) Adminstration
2) Replikation
3) Nukleäre Retention (Persistenz)
Plasmidreplicons
1) nicht-viral
2) viral
Replikationsdefiziente Viren
1) Adenovirale (Ad-) Vektoren
2) Adeno-assoziiertes Virus (AAV-) Vektoren
Replikationskompetente Viren
1) Vaccinia Virus Vektoren
2) Onkolytische Viren
Überblick über aktuelle Gentherapiestudien
Replikationskompetente Viren:
1) Vaccinia Viren
Familie: Poxviren
Zweitgrößtes bekanntes Virus (300 x 200 x 100 nm)
Lineares, doppelsträngiges DNA Genom (190.000 kbp)
Kovalente Bindung der beiden DNA Stränge an den Enden !
Replikation im Zytoplasma !
Vacciniavirus: Impfstoff gegen Pocken (Jenner – Ende 18. Jhd.)
Replikationskompetente Viren:
1) Vaccinia Viren – Replikation im Zytoplasma !
Durch zytoplasmatische Replikation können auch sich
nicht-teilende Zellen inifziert werden
Replikationskompetente Viren:
1) Vaccinia Viren - Zusammenfassung
Administration (Infektion) als replikationskompetente Viren
Durch zytoplasmatische Replikation können auch sich
nicht-teilende Zellen infiziert werden
Vaccinia Viren (Stamm MVA „modified Vaccinia Ankara“)
kommen häufig zum Einsatz als Vakzinierungsvektoren
z.B. rekombinantes MVA-basiertes HIV Vakzin
Weiterhin: dienen als Impfstoff gegen Pocken !
In der Biotechnologie:
MVA-Vektoren zur Überexpression der T7 RNA Polymerase
Dadurch: Überexpressionssystem von Genen, die hinter
T7 Promotoren geschaltet sind (in fast allen kommerziellen
Vektoren präsent als Ansatzstelle für Sequenzierprimer)
Replikationskompetente Viren:
2) Onkolytische Viren - Geschichte
Aus einer klinischen Beobachtung wird eine Therapieform !
Replikationskompetente Viren:
2) Onkolytische Viren – Aktuell: ONYX - 015
ONYX-015 (CI-1042 bzw. H101):
Modifiziertes Adenovirus
Repliziert in und tötet selektiv Zellen mit p53 Mutationen
Mutationen in p53 sind die häufigste genetische Abnormalität von Krebszellen
Onyx-015 trägt eine loss of function Mutation im E1B Lokus
E1B bindet und inaktiviert das Tumor Suppressor Protein p53
Da Wildtyp Ad p53 inaktivieren müssen, um zu replizieren, lässt ONYX-015
(welches dies nicht mehr kann) gesunde Zellen unbeeinflusst
November 2005:
Shanghai Sunway Biotech Co. Ltd. announced today that the Chinese State Food and Drug
Administration (SFDA) has approved H101 to be used in combination with chemotherapy as
a treatment for patients with late stage refractory Nasopharyngeal cancer, a type of head and
neck cancer prevalent in China.
This marks the first oncolytic viral therapy approved by any regulatory agency in the world.
Gliederung:
Kriterien für die Einteilung von Vektoren:
1) Adminstration
2) Replikation
3) Nukleäre Retention (Persistenz)
Plasmidreplicons
1) nicht-viral
2) viral
Replikationsdefiziente Viren
1) Adenovirale (Ad-) Vektoren
2) Adeno-assoziiertes Virus (AAV-) Vektoren
Replikationskompetente Viren
1) Vaccinia Virus Vektoren
2) Onkolytische Viren
Überblick über aktuelle Gentherapiestudien
Überblick über aktuelle Gentherapie Studien:
Verwendete Vektoren - Stand: 2008
Überblick über aktuelle Gentherapie Studien:
Differenziert nach Kontinent / Land - Stand: 2008
Continent
Country
America
Gene Therapy Clinical
Trials
Number
%
882
67.4
USA
864
66
27.3
150
11.5
Germany
74
5.7
Switzerland
42
3.2
France
20
1.5
Belgium
19
1.5
Italy
15
1.1
Europe *
358
UK
Asia *
37
2.8
Japan
16
1.2
China
8
0.6
Australia
19
1.5
Africa
MultiCountry
Total
1
12
0.1
0.9
1309
Molekulare Virologie I (Sommersemester 2008)
„DNA (Virus-) Vektoren“
Vielen Dank für ihre
Aufmerksamkeit !
Dr. Armin Baiker, Max von Pettenkofer-Institut
[email protected]