Lösung

Lösung zu den Fragen aus der Aufgabenstellung zu
"Mord im Stadtwald"
Das Lösungsmuster ist bewußt nicht in der Form eines Zeitungsartikels gehalten, da dann die Zuordnung der fachlichen Inhalte zu einzelnen Fragestellungen
einfacher ist.
1 . Was ist Sichelzellanämie?
Die SichelzellanŠmie ist eine erblich bedingte Krankheit, bei der das HŠmoglobin verŠndert ist. Dabei tritt neben dem im gesunden Menschen vorhandenen
HŠmoglobin HbA ein verŠndertes HŠmoglobin Hb S auf. Dazu ist es zunŠchst
notwendig, den Aufbau des HŠmoglobins zu erlŠutern.
1.1 Wie ist Hämoglobin chemisch aufgebaut?
Hämoglobin ist grundsätzlich aus vier Proteinketten aufgebaut, welche an einen
Nichteiweißanteil, die sogenannte Hämgruppe gebunden sind. Es handelt sich
um zwei a-Ketten und zwei b-Ketten. Jede dieser Ketten besitzt eine Primärstruktur (Aminosäuresequenz), eine Sekundärstruktur (zwei parallele Peptidabschnitte können durch Wasserstoffbrückenbindung Helixstrukturen bilden), und
eine Tertiärstruktur (bedingt durch die Bindungen der Aminosäurereste
zwischen mehreren Helixstrukturen, „Knäuelbildung“). Die Tertiärstrukturen
der beiden a -Ketten und der beiden b -Ketten sind beim Hämoglobin zu einer
Quartärstruktur verbunden.
Die grundlegenden Strukturen der HŠmoglobine Hb S und Hb A sind gleich.
Jedoch gibt es im molekularen Bereich eine kleine Abweichung mit schlimmen
Folgen: in der AminosŠuresequenz, die in der PrimŠrstruktur festgelegt ist,
wurde eine AminosŠure ausgetauscht. In der 6. Position der b-Ketten ist statt
GlutaminsŠure (GLU) Valin (VAL) eingefŸgt worden. Diese VerŠnderung fŸhrt
zu verŠndertem Verhalten gegenŸber Wasser, das auch zur Auftrennung der
HŠmoglobintypen genutzt werden kšnnte und zu einem verŠnderten Verhalten
bei Sauerstoffarmut, was letztendlich zur BeeintrŠchtigung der Gesundheit des
Betroffenen fŸhrt.
Die ausgetauschte Aminosäure an der 6. Aminosäure-Position der b -Kette läßt
sich mit Hilfe des Code-Lexikons einem bestimmten Basentriplet der m-RNA
Modellversuch BINGO
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(Codon bei Hb S GUG, bei Hb A GAG) in 5'-3'- Richtung zuordnen. Hieraus
lassen sich die entsprechenden Triplets auf der DNA (Codogene) in 3'–5' Richtung ableiten (bei Hb S CAC, bei Hb A CTC).
Die Mutation besteht also im Austausch der Base Thymin (T) durch Adenin (A).
1.1.1 Der genetische Code
Die Codonen sind von innen (5‘) nach außen (3‘) zu lesen. Sie geben die Basensequenzen der mRNS-Codonen wieder, die für die außerhalb des Kreises stehenden Aminosäuren codieren.
= Start-Codon
Modellversuch BINGO
= Stopp-Codon
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1.1.2 Zusammenfassung:
Eine Mutation am Codogen 6 in 3'- 5'- Richtung des Genabschnittes für die b Ketten führt über m-RNA und t-RNA zu einem veränderten primären Genprodukt (hier b -Kette des Hb S).
Die b-Ketten von Hb S und Hb A unterscheiden sich an der 6. Aminosäureposition der Primärstruktur: Valin (VAL) bei Hb S und Glutaminsäure (GLU) bei
Hb A.
Beide Hämoglobintypen unterscheiden sich bezüglich ihres Verhaltens
inWasser, da durch den Aminosäureaustausch unterschiedliche partielle
Löslichkeiten vorliegen.
Die beiden b -Ketten unterscheiden sich durch folgende Eigenschaften:
· unterschiedliche isoelektrische Punkte,
· unterschiedliche Ladungen bei einem bestimmten pH-Wert,
· unterschiedliche Löslichkeitseigenschaften im entsprechenden Bereich der b Kette.
1.2 Wie wird Sichelzellanämie vererbt?
Je nachdem, wie die beiden Gene, welche die betrachtete Person von Vater und
Mutter geerbt hat, kombiniert sind, ergeben sich verschiedene Phänotypen
(Merkmalsausprägungen):
· genotypisch homozygot; phänotypisch gesund
(Gen für Hb A / Gen für Hb A):
rote Blutkörperchen sind nur aus Hb A aufgebaut,
· genotypisch heterozygot; phänotypisch gesund
(Gen für Hb A / Gen für Hb S ; trifft auf drei der sieben Brüder zu):
rote Blutkörperchen sind aus Hb A und Hb S aufgebaut; Malariaresistenz;
Selektionsvorteil und daher starke Anhäufung in heutigen und ehemaligen
Malariagebieten,
· genotypisch homozygot; phänotypisch krank (Gen für Hb S / Gen für Hb S):
rote Blutkörperchen sind nur aus Hb S aufgebaut und nehmen daher an sauerstoffarmen Stellen im Organismus eine veränderte Struktur (Sichelform) an;
Modellversuch BINGO
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Folge: tödlicher Verlauf; Schädigungen des Organismus, die die Überlebensfähigkeit schon in jungen Jahren stark beeinträchtigen (Milzriß, Leberriß);
Immunreaktion gegen das eigene Hämoglobin .
Zusammenfassend läßt sich der Erbgang der Sichelzellenanämie als codominant hinsichtlich des primären Genprodukts, aber als rezessiv hinsichtlich der
Merkmale unter „normalen“ Lebensbedingungen einordnen.
2 . Wie werden unterschiedliche Hämoglobintypen identifiziert
(Stichworte: Elektrophorese und isoelektrische Fokussierung)?
2.1 Die Elektrophorese
Die Elektrophorese ist eine analytische Trennmethode, die u.a. in der Biochemie
zum Einsatz kommt. Das Grundprinzip der Elektrophorese beruht auf der
Wanderung von geladenen Teilchen im elektrischen Feld. Entscheidend für die
Qualität des Untersuchungsergebnisses ist die Wanderungsgeschwindigkeit der
Teilchen. Auf diesen Wert müssen angelegte Spannung und Dauer der Durchführung abgestimmt sein.
Um das Blut analysieren zu können, also in seine Bestandteile aufzutrennen,
wird die Probe auf eine Trägersubstanz aufgebracht und dann einem elektrischen
Gleichspannungsfeld ausgesetzt. Die elektrostatischen Kräfte können aber auf
die Hämoglobin-Moleküle nur wirken, wenn diese elektrisch geladen sind. An
sich sind Hämoglobin-Moleküle elektrisch neutral. Sie besitzen positive und
negative Teilladungen. Erst durch eine chemische Reaktion kann eine
Ladungsveränderung hervorgerufen werden. Dies geschieht durch die Zugabe
von H3O+-Ionen oder von OH- -Ionen. Damit ist also eine hohe H3O+Konzentration mit einer großen Zahl von H+ - Ionen zu beschreiben. Ein Maß
für die Konzentration von H+ - Ionen ist der pH-Wert. Dabei gilt: ein kleiner pHWert ist mit einer hohen Konzentration von H+ -Ionen verbunden, ein großer
pH-Wert also läßt auf eine geringere Anzahl von H+ - Ionen schließen. Die Skala
der pH-Werte ist logarithmisch. Eine Lösung mit pH = 3 enthält 10 mal so viele
H+ -Ionen wie eine Lösung mit pH = 4.
Diese freien Wasserstoff-Ionen lagern sich an den Proteinmolekülen an. Dabei
sind folgende Fälle zu unterscheiden:
Modellversuch BINGO
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1. Gibt es sehr viele H+ -Ionen, ist der pH-Wert also niedrig, so lagern sich die
Ionen bevorzugt an den Proteinen an, die dann insgesamt positiv geladen
sind.
2. Gibt es sehr wenige H+ -Ionen, so geben die Proteinmoleküle H+-Ionen ab.
Die Proteine sind also negativ geladen.
3. Zwischen diesen beiden Fällen muß es die Situation geben, daß die Proteinmoleküle und die H+ -Ionen im Gleichgewicht sind. Dann sind die Proteine
neutral geladen. Dieser pH-Wert, bei dem sich für die zu betrachtenden Proteine ein neutrales Ladungsverhältnis einstellt, wird isoelektrischer Punkt
genannt.
Also in Kurzform:
1. pH < IEP ===> Proteine sind positiv geladen,
2. pH > IEP ===> Proteine sind negativ geladen,
3. pH = IEP ===> Proteine sind neutral geladen.
Somit beeinflu§t also der pH-Wert der Lšsung, in die das Blut eingebracht wird,
das Wanderungsverhalten der HŠmoglobine im elektrischen Feld. Je nach Wahl
des pH-Wertes erfolgt eine Wanderung zur Kathode oder zur Anode bzw. keine
Bewegung. Kennt man die isoelektrischen Punkte der zu untersuchenden
Bestandteile einer Substanz, hier also der HŠmoglobine Hb S und Hb A, so kann
man sie auf einfache Weise durch Elektrophorese trennen.
Methode der einfachen Elektrophorese:
Da die Hämoglobine Hb A und Hb S
unterschiedliche isoelektrische Punkte
(IEP) haben, wird bei einer elektrophoretischen Untersuchung mit einer
geeigneten Pufferlösung, deren pHWert zwischen den beiden isoelektrischen Punkten liegt, das eine Hämoglobin zum positiven Pol, das andere
zum negativen Pol wandern. Beide
Hämoglobine sind also eindeutig
unterscheidbar.
Sind aber die isoelektrischen Punkte dieser Bestandteile nicht bekannt, so müßte
das obige Verfahren mit verschiedensten pH-Werten wiederholt werden, bis die
richtige Trennung erfolgt ist. Besser ist es da, das Verfahren der isoelektrischen
Fokussierung anzuwenden.
Modellversuch BINGO
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2.2 Die Methode der isoelektrische Fokussierung
Die Trägersubstanz, meist ein Gel, muß für dieses Verfahren in besonderer
Weise vorbereitet werden. Gelstreifen mit unterschiedlichen pH-Werten werden
aneinander gereiht. Beginnend mit einem Streifen mit sehr niedrigem pH-Wert
werden Streifen für Streifen mit beständig zunehmendem pH-Wert zusammengefügt. So entsteht ein Gelquader, bei dem auf der einen Seite ein niedriger pHWert vorliegt, auf der anderen Seite ein hoher pH-Wert und dazwischen ein
regelmäßiges Ansteigen des pH-Werte zu verzeichnen ist. Bringt man nun die
Blutprobe auf die Seite des Gelstreifens mit sehr niedrigem pH-Wert, so werden
alle Proteine positiv geladen, sie wandern also im elektrischen Gleichspannungsfeld zur Kathode, die auf der anderen Seite des Gels angebracht ist. Dabei werden nacheinander die Gelstreifen mit wachsendem pH-Wert durchlaufen.
Irgendwann kommen diese Proteine zu dem Streifen, in dem der pH-Wert ihrem
speziellen isoelektrischen Punkt entspricht. Die Proteine werden also neutral, die
elektrostatischen Kräfte wirken nicht mehr, sie bleiben dort liegen. Diese
Ansammlung der Proteine an diesem spezifischen Ort kann nachgewiesen werden und bei verschiedenen Bestandteilen in der Probe hat sich somit eine Auftrennung der Substanzen ergeben.
3 . Worin liegt die Aussagekraft des DNA-Fingerprints für die
Ermittlung des Täters?
Die Bedeutung des DNA-Fingerprints beruht auf der Tatsache, daß bei Menschen neben hauptsächlich sehr ähnlichen DNA-Abschnitten auch Sequenzpolymorphismen auftreten (vor allem im Bereich der Selektion nicht ausgesetzten,
nicht codierenden DNA), so daß man davon ausgeht, daß bei verschiedenen
Individuen persönliche Sequenzunterschiede nachweisbar sind. Die DNAStränge verschiedener Menschen stimmt trotz großer Ähnlichkeiten nie vollständig überein, es gibt charakteristische Sequenzunterschiede (die Reihenfolge
der Basen ist von Mensch zu Mensch in bestimmten Abschnitten unterschiedlich).
Diese lassen sich in einem typischen Bandenmuster von mit Restrikionsenzym
hergestellten DNA-Fragmenten darstellen, das sozusagen mit einem Fingerabdruck verglichen werden kann.
Codierende Abschnitte sind für Einzelpersonen nur dann aussagekräftig, wenn
man ein Muster aus mehreren, ausgewählten Bereichen vergleicht, da einzelne
codierende Abschnitte bei verschiedenen Menschen durchaus ohne Unterschiede
Modellversuch BINGO
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vorliegen können. Die nichtcodierenden Abschnitte variieren grundsätzlich, da
Mutationen in diesen Bereichen keine negativen Auswirkungen haben.
Jeder Mensch hat also einen typischen (fast ausnahmslos) nur für ihn
existierenden genetischen Fingerabdruck. Dabei gibt es eine reale Abweichung:
eineiige Zwillinge, da ihr genetisches Erbmaterial identisch ist. Stimmt nun die
am Tatort gefundene Blutprobe genetisch mit der untersuchten Probe vom
Verdächtigen überein, so ist diese Person mit sehr großer Wahrscheinlichkeit
der Täter. Zweifel können nur auftreten, wenn das Labor nicht sorgfältig
gearbeitet hat, die Probe vom Tatort ein Gemisch von Spuren enthält oder doch
der fast unmögliche Fall eintritt, daß sich hier zwei nicht miteinander verwandte
Menschen begegnet sind, deren Erbmaterial zufällig übereinstimmt.
4 . Wie wird ein DNA-Fingerprint erstellt?
4.1 Überblick
Die Blutproben der verschiedenen Verdächtigen müssen mit der Blutprobe vom
Tatort verglichen werden. Dabei genügt eine Untersuchung der HämoglobinTypen aus gegebenem Anlaß nicht. Also müssen alle Proben einem DNA-Fingerprint unterzogen werden. Dazu ist es jedoch zunächst notwendig, eine ausreichende Menge von DNA-Strängen zur Untersuchung sicherzustellen. Die verdächtigen Personen können Blut in ausreichender Menge spenden, jedoch die
am Tatort gefundene Probe ist sicherlich nicht mehr umfassend genug, diese
DNA-Stränge müssen vervielfältigt werden. Hier kommt die PCR-Methode zur
Anwendung.
Zunächst wird die DNA isoliert. Mit Hilfe des PCR-Verfahrens werden dann
bestimmte ausgewählte Abschnitte vervielfältigt. Die so in ausreichender
Konzentration gewonnen, ausgewählten Abschnitte werden mit
Restriktionsenzymen versetzt. Dadurch werden die DNA-Stränge immer an den
gleichen Basensequenzen in einzelne Stücke unterschiedlicher Länge
zerschnitten. Es entsteht ein Gemisch aus DNA-Fragmenten. Diese so
gewonnene Menge von Teilstücken wird nun einem elektrischen Feld in einer
Elektrophoresekammer ausgesetzt. In dieser Apparatur werden die DNAFragmente auf Grund der Beschaffenheit des verwendeten Gels nach ihrer
Größe aufgetrennt. Nach einer gewissen Einwirkzeit des elektrischen Feldes
werden die an verschiedenen Orten befindlichen Bruchstücke fixiert und sichtbar gemacht. Der DNA-Fingerprint ist entstanden.
Modellversuch BINGO
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Jetzt wird mit einem Abdruckverfahren (Blotting) das Bandenmuster auf eine
Folie übertragen.
Radioaktiv behandelte, einsträngige DNA-Sonden, die man auf die Folien gibt,
hybridisieren an komplementären Strängen einzelner DNA-Sequenzen auf der
Folie.
Die Folie wird mit einem Röntgenfilm beschichtet und danach wird dieser entwickelt. Man erkennt ein charakteristisches Bandenmuster von Restiktionsfragmenten, den genetischen Fingerabdruck.
4.2 Das PCR-Verfahren
Das PCR-Verfahren (Polymerase-chain-reaction-Methode) wird dann
angewendet, wenn die noch vorhandene Probenmenge von der Blutspur vom
Tatort nicht groß genug ist. Es gilt also in der vorhandenen DNA diejenigen
Sequenzen zu vervielfältigen, welche personengebundene Merkmalsausprägungen enthalten. Diese Teilstücke müssen in ausreichender Menge
hergestellt werden. Dazu wird zunächst der DNA-Doppelstrang denaturiert, d.h.
der Doppelstrang wird durch Erhitzen in Einzelstränge getrennt. Diesem Ansatz
werden als Startermoleküle Primer zugesetzt, welche die gesuchten Sequenzen
einrahmen. An den Primern wird mit Hilfe der DNA-Polymerase und unter
Zusatz der Triphosphatnukleotide der eingerahmte Abschnitt polymerisiert. Der
Primer markiert also die ausgewählten Abschnitte, da er aus einer
Basenkombination besteht, die sich an ausgesuchten Stellen (20 - 40 Basen) der
DNA-Einzelstränge einfügt, die am Anfang und am Ende des gesuchten
Abschnittes stehen. Damit ist dieser Part markiert.
Die beim Erhitzen entstehenden DNA-Einzelstränge können durch die DNAPolymerase nur in einer Richtung wieder zu Doppelsträngen ergänzt werden und
zwar jeweils in entgegengesetzter Richtung zueinander. Ist nun auf dem DNAStrang eine Markierung durch den Primer gesetzt, so kann nur von dieser Stelle
aus zum Ende hin eine Ergänzung zum Doppelstrang erfolgen. Im Vergleich
zum Reißverschluß wäre also der Schließer an eine bestimmte Stelle gebracht
worden und könnte nun den Reißverschluß selbst bis zum Ende schließen, der
Anfang vor dem Primer aber bliebe als Einzelzahnreihe bestehen. Nach einer
bestimmten Zeit wird der Prozeß beendet. Dann sind zwar die Teilstücke nicht
bis zum Ende ergänzt, aber die gesuchten Sequenzen sind vervollständigt
worden. Die Abschnitte, die für eine Betrachtung nicht in Frage kommen, sind
also nicht vervollständigt worden.
Modellversuch BINGO
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Nun existieren also zwei Doppelstränge mit anhängenden Einzelstrangabschnitten. Der Anfang der DNA wird also bei beiden komplementären Strängen nicht mehr ergänzt und wird bei den folgenden Prozessen auch keine Rolle
mehr spielen. Im Wesentlichen wird also der bei jedem Menschen verschiedene
Teil der DNA, markiert durch den Primer, vervielfältigt. Wird das Verfahren
wiederholt, so werden ffast nur noch die ausgewählten Abschnitte der DNA
vervielfältigt. Dieses Verfahren wird so oft wiederholt, bis eine ausreichende
Menge DNA-Bruchstücke zur weiteren Untersuchung zur Verfügung steht.
Bildliche Darstellung des Vorgangs:
1. Schritt: Denaturierung
des DNA-Doppelstrangs
4. wie 1.
2. Schritt: Primer
zugeben
5. wie 2.
3. Schritt: Enzym DNAPolymerase, DNA-Strang
teilweise ergänzen
6. wie 3.
.......... und so weiter
Zusammenfassung: Folgende Prinzipien liegen dem PCR-Verfahren zu Grunde:
Modellversuch BINGO
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· Trennung der beiden DNA-Stränge (Denaturieren oder Schmelzen):
die zu untersuchende Substanz mit den DNA-Strängen wird erhitzt,
dadurch trennen sich die Doppelstränge in Einzelstränge auf.
· Aufbau zu DNA-Doppelteilsträngen:
Aus den DNA-Einzelsträngen wird der für die weitere Untersuchung wichtige
Teil der DNA ausgewählt und dieser Teil wird hauptsächlich vervielfältigt.
Diese beiden Schritte werden im Wechsel mehrfach wiederholt.
4.3 Der Fingerprint
Zur näheren Untersuchung der vervielfältigten DNA-Teilstücke müssen diese
wiederum in kleinere Abschnitte zerschnitten werden. Dieses Zerschneiden an
bestimmten, festgelegten Stellen wird durch Restriktionsenzyme erreicht. Dabei
ist sichergestellt, daß alle DNA-Teile an denselben Stellen zerlegt werden. Die
Schnittorte sind vom Auftreten bestimmter Basen abhängig, deshalb sind die
DNA-Strangstücke nicht gleich lang und bei verschiedenen DNA-Strängen auch
unterschiedlich in ihrer gesamten Längenzusammensetzung.
Anschließend existieren zwar viele Bruchstücke, aber ihre Vielfalt ist begrenzt.
Die Bruchstücke unterscheiden sich hauptsächlich durch ihre Länge. Die so entstandene Substanz wird nun einem besonderen Elektrophoreseverfahren unterzogen, der Gel-Elektrophorese.
Gele bilden bei ihrer Entstehung eine Gitterstruktur aus. Diese Gitter sind
regelmäßig geformt und haben eine bestimmte Maschenweite, die sogar durch
die Wahl der Gelart beeinflußt werden kann. Durch die Maschen dieses räumlichen Netzes sollen nun die DNA-Bruchstücke unter Einwirkung eines elektrischen Feldes wandern.
DNA-Stränge weisen eine etwa gleichmäßige Ladungsverteilung auf. Wird
durch eine geeignete Pufferlösung wiederum eine Reaktion hervorgerufen, so
kann davon ausgegangen werden, daß die DNA-Abschnitte geladen sind (siehe
2.1). Weiterhin ist festzustellen, daß lange Teile mehr Ladung tragen als kurze,
also ist das Verhältnis von Ladung zu Masse bei allen Stücke etwa gleich. Damit
müßten auch alle DNA-Stücke sich im elektrischen Feld gleich schnell fortbewegen. Also ist eine Trennung der DNA-Stücke nach Länge so noch nicht möglich. Kleine wie große Stücke kämen in einem elektrischen Feld gleich schnell
voran, wenn nicht das Gel selbst noch eine wichtige Aufgabe hätte. Wie oben
schon beschrieben, hat das Gel Maschen, durch die die DNA-Fragmente
schlüpfen müssen. Dabei ist durch die Wahl der geeigneten Maschenweite
sichergestellt, daß lange DNA-Bruchstücke sich auf Grund des wiederholten
Modellversuch BINGO
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Anstoßens an den Gitterstrukturen langsamer bewegen werden als kurze Stücke.
Also kommen kleine Stücke schneller und damit in gleicher Zeit weiter voran
als große. Wird also das Elektrophoreseverfahren eine gewisse Zeit lang betrieben, so ergibt sich, wenn das Gel mit der entsprechenden Probe in ein elektrisches Gleichspannungsfeld gebracht wird, eine Auftrennung der DNA-Bruchstücke nach ihrer Länge.
4.4 Das Blotting-Verfahren
Zur Sichtbarmachung der nun an verschiedenen Orten liegenden DNA-Teile
müssen nun weitere Schritte unternommen werden. Dazu werden diese Doppelstrangbruchstücke wieder in Einzelstränge zerlegt (denaturiert). Die jetzt
einsträngigen DNA-Bruchstücke werden mit Hilfe einer Folie von dem Gel
abgenommen. Dabei bleiben ihre relativen Positionen zueinander erhalten. Die
einsträngigen DNA-Bruchstücke werden wieder zu Doppelsträngen vervollständigt. Aber diesmal werden zur Ergänzung radioaktiv markierte, einsträngige
DNA-Sonden verwendet. So ist es möglich, daß mit Hilfe eines empfindlichen
Films die Aufenthaltsorte der DNA-Bruchstücke festgestellt werden können. Ein
Röntgenfilm wird durch die radioaktiven Sonden belichtet. Nach der Entwicklung des Films sind die nach der Wanderung im elektrischen Feld erreichten
Aufenthaltsorte der zu untersuchenden DNA-Bruchstücke sichtbar. Ein Vergleich kann stattfinden, da nun das typische Strichmuster eines DNA-Fingerprints vorliegt.
4.5 Unterschiedliche Elektrophorese-Verfahren
isoelektrische Fokussierung
bei Proteinen
unterschiedliche Ladung der einzelnen
Polypeptide und unterschiedliche isoelektrische Punkte;
Gelelektrophorese mit
DNA - Fragmenten
gleiche Ladungen der DNA-Fragmente;
Trägermedium:
Gel mit pH-Gradient
Trägermedium:
Gel mit gleichem pH-Wert
Trennung vorwiegend nach Ladung
Trennung nur nach Fragmentgröße und
Fragmentform
Modellversuch BINGO
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