Themenheft

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Molekularbiologische
Diagnostik
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Laborärztliche Arbeitsgemeinschaft für Diagnostik und Rationalisierung e.V.
Lauenburger Straße 67 • 21502 Geesthacht • Telefon 04152 / 803 0 • Telefax 04152 / 848 490
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Laborärztliche Arbeitsgemeinschaft für Diagnostik und Rationalisierung e. V.
Lauenburger Straße 67 • 21502 Geesthacht • Telefon 04152 / 848 190 • Telefax 04152 / 848 490
E-Mail: [email protected] • Internet: www.ladr.de
Inhaltsverzeichnis
Seite
Molekularbiologische Untersuchungsmethoden
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Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
4
PCR-Untersuchungen
Humangenetische Analysen
Infektionsdiagnostik
5
5
6
Probenentnahme, Lagerung und Transport
7
Glossar
8
Fachlaboratorien der LADR
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Titelfoto: DNA. J. Li, Modelling Simul. Mater. Sci. Eng. 11 (2003) 173
www.LADR.de
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Molekularbiologische Untersuchungsmethoden
Kaum ein Gebiet der Wissenschaft hat sich in den letzten 20 Jahren so rasant
entwickelt wie die Molekularbiologie. Neben eindrucksvollen wissenschaftlichen
Spitzenleistungen, wie z.B. der Entschlüsselung des menschlichen Genoms, haben
viele molekularbiologische Untersuchungsmethoden Einzug in die Routine der
modernen Labordiagnostik gefunden.
Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Die PCR, 1984 von Kary Mullis entwickelt, ist eine molekularbiologische Methode,
mit der ein bestimmter DNA-Abschnitt hoch sensitiv und spezifisch amplifiziert
werden kann. Dies wird durch die zyklische Wiederholung folgender Einzelschritte
erreicht: Aufschmelzen des DNA-Doppelstranges in zwei Einzelstränge, Anlagern
der DNA-Startermoleküle (Primer) und das Ergänzen des DNA-Einzelstranges
durch eine thermostabile DNA-Polymerase. Die Spezifität der PCR und die Länge
des zu amplifizierenden Fragments wird durch die ausgewählten Primersequenzen
bestimmt. Durch die exponentielle Vermehrung - je Zyklus eine Verdopplung - des
DNA-Fragments ist es möglich, selbst geringe DNA-Mengen im Ausgangsmaterial
nachzuweisen. Wenn in einer Probe z. B. nur ein Virus-DNA-Molekül vorliegt, erhält man durch die PCR bei 30 Zyklen theoretisch 230 DNA-Fragmentmoleküle, die
dann mit verschiedenen Methoden nachgewiesen werden können.
Durch die Gelelektrophorese mit anschließender Färbung kann das Produkt sichtbar
gemacht und in seiner Länge bestimmt werden. Zur weiteren Bestätigung kann das
amplifizierte Fragment mittels einer Restriktionsendonuklease sequenzspezifisch
gespalten werden und anhand der Größe der Subfragmente erkannt werden (Restriktions-Fragmentlängen-Polymorphismus). Das PCR-Produkt kann aber auch mit
einem DNA-Sequenziergerät sequenziert werden (d. h. die genaue Reihenfolge der
DNA-Bausteine wird bestimmt) und die Spezifität kann dann durch den Vergleich
mit Sequenzen in einer Gen-Datenbank festgestellt werden. Schliesslich kann das
amplifizierte Fragment durch die Hybridisierung mit einem spezifischen Oligonukleotid (Sonde) identifiziert werden.
Ende der 90‘er Jahre gab es eine weitere Verbesserung der Nukleinsäure Analytik,
die Real-Time (Echtzeit) PCR. Mit dieser neuartigen Technologie können spezifische
DNA-Sequenzen amplifiziert und online durch eine fluorometrische Detektion der
PCR-Produkte gleichzeitig nachgewiesen werden. Somit können DNA-Abschnitte
noch rascher und sicherer detektiert werden. Durch die Möglichkeit einer Software
gesteuerten Schmelzpunktanalyse (Tm-Analyse) nach der Amplifikation kann eine
höhere Spezifität der Reaktion erreicht oder auch eine Genotypisierung z.B. die Differenzierung zwischen HSV-1 und HSV-2 vorgenommen werden.
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informiert
Mit Hilfe einer reversen Transkriptase kann in einer RT-PCR auch RNA (z.B. HAV)
amplifiziert werden. Bei der so genannten multiplex PCR kann in einem Ansatz mit
mehreren Primerpaaren nach verschiedenen DNAs gesucht werden. Neben dem
qualitativen Nachweis eines Krankheitserregers (z.B. HIV) kann die PCR für die
quantitative bzw. Viruslast Bestimmung eingesetzt werden. Darüber hinaus können
Subtypen von Viren (z.B. HCV) differenziert werden, um den Therapieerfolg abschätzen zu können. Die in neuester Zeit eingeführte Bestimmung von Resistenzgen
Mutationen öffnet weitere Möglichkeiten der verbesserten Therapie, insbesondere
bei HIV-Infektionen.
Neben dem Einsatz in der Infektionsdiagnostik kann die PCR auch dazu benutzt
werden, Mutationsanalysen im Bereich der humangenetischen Fragestellungen
durchzuführen. So können z.B. bei Erbkrankheiten vorkommende Punktmutationen
(z.B. bei der Hämochromatose) nachgewiesen werden. Hierbei werden die Primer
so gewählt, dass ihr 3´-Ende genau mit der Punktmutation zusammenfällt. Kann
das 3´-Ende des Primers sich nicht an seinen Gegenstrang anlagern (Mutation), so
ist die DNA-Polymerase nicht in der Lage, den Strang zu verlängern. Auch Mehrfachmutationen innerhalb eines Genes (z.B. bei der cystischen Fibrose) oder Gendeletionen (z.B. bei den Glutathion-S-Transferasen) lassen sich mit molekularbiologischen Methoden nachweisen.
PCR Untersuchungen
Humangenetische Analysen
Parameter
Nachweis
Methode
Material
APO E
Genotypisierung
Typ 2, 3, 4
PCR (Line Probe Assay)
EDTA-Blut
Beta-Thalassämie
Beta-Globingen Mutationen
Sequenzierung
EDTA-Blut
Cystische Fibrose
85% aller westeuropäische Mutationen
PCR (Line Probe Assay)
EDTA-Blut
DPD
Mutation G165A
Sequenzierung
EDTA-Blut
Faktor V Leiden
Mutation G1691A
Sequenzierung
EDTA-Blut
Faktor II Prothrombin
Mutation G20210A
Sequenzierung
EDTA-Blut
GST-T1/-M1
Deletionen
PCR
EDTA-Blut
Hämochromatose
Mutationen C282Y und H63D
Sequenzierung
EDTA-Blut
HLA Klasse I (A,B,C)
siehe Themenheft: HLA-Diagnostik
HLA-Klasse II (DR,DQ)
siehe Themenheft: HLA-Diagnostik
MTHFR
Mutation C677T
Sequenzierung
EDTA-Blut
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Infektionsdiagnostik
Parameter
Nachweis
Methode
Material
Bordetela pertussis /
qualitativ
PCR
Nasopharyngealabstrich (trocken)
qualitativ
PCR
Zecke, Urin, Punktat, Liquor,
parapertussis
Borrelia burgdorferi
(sensu lato)
Chlamydia
Biopsie, EDTA-Plasma
qualitativ
trachomatis
PCR (Cobas Amplicor)/
Tupfer (Roche Transportmedium),
Real-Time PCR
Urin, Sperma
CMV
qualitativ
PCR
EDTA-Blut, Urin
EHEC (VTEC1/STX1)
qualitativ
PCR
Bestätigung aus Kolonien/Bouillon
EHEC (VTEC2/STX2)
qualitativ
PCR
Bestätigung aus Kolonien/Bouillon
EPEC (EAF-Plasmid)
qualitativ
PCR
Bestätigung aus Kolonien
HAV
qualitativ
RT-PCR
Stuhl, EDTA-Plasma
HBV
quantitativ
Real-Time PCR
EDTA-Plasma
HCV
qualitativ
RT-PCR (Cobas Amplicor)
EDTA-Plasma
quantitativ
Real-Time PCR
EDTA-Plasma
Subtypisierung
RT-PCR (Line Probe Assay) EDTA-Plasma
HSV-1
qualitativ
PCR
Tupfer (trocken), Liquor
HSV-2
qualitativ
PCR
Tupfer (trocken), Liquor
HIV
qualitativ
RT-PCR (Cobas Amplicor)
EDTA-Plasma
quantitativ
Real-Time PCR
EDTA-Plasma
Resistenz-
RT-PCR (Sequenzierung)
EDTA-Plasma
PCR
Tupfer (trocken), Biopsie
bestimmung
HPV
MRSA
Screening
Typisierung (High- Hybridisierung
Tupfer (Transportmedium),
Risk, Low-Risk)
Biopsie
Methicillin Resis-
Real-Time PCR
Bestätigung aus Kolonien
PCR
Sputum, Bronchiallavage, Liquor,
tenzbestimmung
Mycobacterium tuber-
qualitativ
culose-Komplex
Mycoplasma hominis
Urin, Biopsie, Punktat
qualitativ
Mycoplasma pneumoniae qualitativ
Real-Time PCR
Urogenitalabstrich (trocken), Urin
PCR
Nasopharyngealabstrich,
Bronchiallavage, Sputum
Neisseria gonorrhoeae
qualitativ
PCR (Cobas Amplicor)
Tupfer (Roche Transportmedium),
Urin, Sperma
Parodontopathogene
qualitativ
PCR
Bakterien
Papierspitzen (Probenmaterial
anfordern)
Ureaplasma urealyticum qualitativ
PCR
Urogenitalabstrich (trocken), Urin
VZV
PCR
Rachenabstrich (trocken),
qualitativ
Bläschenflüssigkeit, Liquor
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Themenheft
informiert
Probenentnahme, Lagerung und Transport
Abstriche:
Nasopharyngeal, Rachen, Urogenital, Bläschenflüssigkeit, Augen:
entweder trocken (Tupfer in einem sterilen Röhrchen ohne Transportmedium) oder in einem Spezialröhrchen mit Transportmedium (Siehe Bestellschein: „Entnahme und Versandmaterial“
Ihres LADR Labors) bei Raumtemperatur einschicken.
Biopsie:
Steril entnehmen und in Kochsalzlösung geben.
Bronchiallavage: Ca. 2 mL in einem sterilen Röhrchen.
EDTA-Plasma:
Blut abnehmen (≥ 2 mL), das Röhrchen nicht zentrifugieren
und nicht öffnen.
Cave: Kein Heparin-Plasma, da Heparin die PCR inhibiert.
EDTA-Blut:
Blut abnehmen (≥ 2 mL), das Röhrchen nicht zentrifugieren
und nicht öffnen.
Cave: Kein Heparin-Blut, da Heparin die PCR inhibiert.
Liquor:
Ca. 2 mL in einem sterilen Röhrchen schnell einsenden.
Punktat:
Ca. 2 mL in einem sterilen Röhrchen.
Serum:
Ca. 2 mL in einem sterilem Röhrchen.
Sperma:
Ca. 2 mL in einem sterilen Röhrchen.
Sputum:
Ca. 2 mL in einem sterilen Röhrchen.
Stuhl:
Ca. 1 g in einem sterilen Gefäß.
Urin:
Ca. 10 mL morgendlichen Erststrahlurin auffangen.
Papierspitzen:
Zahnärztliche Probenentnahme-Papierspitzen nach Sondierung
subgingivaler Zahntaschen (Art.-Nr.: 203060).
Zecken:
Im Röhrchen mit Laubblatt oder feuchtem Zellstoff sofort ins
Labor schicken.
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Glossar
Amplifikation:
Vervielfältigung von DNA-Gensequenzen
APO E:
Apolipoprotein E Polymorphismen: Risikomarker für
Atheriosklerose sowie Alzheimer Erkrankung
Beta-Globingen:
erfasst alle Mutationen, die für eine Beta-Thalassämie
ursächlich sein können
CMV:
Cytomegalie-Virus
Cystische Fibrose:
auch Mukoviszidose genannt, die häufigste letal verlaufende
Erbkrankheit der kaukasischen Population; in Westeuropa
ist ca. jede 20. Person Träger eines defekten CF-Gens
DPD:
Dihydropyrimidindihydrogenase: bei Vorliegen der Mutation G165A in dem Gen für das Enzym Dihydropyrimidindihydrogenase wird das Tumormedikament 5‘-Fluorouracil
verlangsamt abgebaut, so dass es zu starken toxischen
Nebenwirkungen kommt
EHEC:
enterohämorrhagische E. coli
EPEC:
enteropathogene E. coli
Faktor V Leiden:
Risikomarker für Thrombosen, insbesondere bei Vorliegen
weiterer Risikofaktoren (Rauchen, Einnahme oraler Kontrazeptiva usw.) und/oder positiver Familienanamnese
Faktor II Prothrombin: Risikomarker für Thrombosen, insbesondere bei Vorliegen
weiterer Risikofaktoren (Rauchen, Einnahme oraler Kontrazeptiva usw.) und/oder positiver Familienanamnese
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Gelelektrophorese:
Nachweisverfahren, bei dem DNA-Fragmente in Agarosegel
ihrer Länge nach elektrophoretisch aufgetrennt werden
Genotypisierung:
Bestimmung unterschiedlicher Formen eines Genes anhand
deren unterschiedlicher Nukleotidenreihenfolge
Themenheft
informiert
GST-T1/-M1:
Glutathion-S-Transferase: Verdacht auf herabgesetzte
Entgiftungskapazität insbesondere bei Belastung mit
Umweltschadstoffen (Styrole, Glykole, PCP, PCBs,
Aflatoxine, Formaldehyd, Alkohole usw.) oder Umgang
mit Methylbromid, Ethylenoxid oder Dichlormethan am
Arbeitsplatz
Hämochromatose:
Früherkennung einer primären Hämochromatose; Differenzierung zwischen primärer und sekundärer Hämochromatose; erhöhte Therapie-Resistenz bei Patienten mit
einer HCV-Infektion
HAV:
Hepatitis A Virus
HBV:
Hepatitis B Virus
Hybridisierung:
Zusammenlagerung einzelsträngiger, auch nicht zusammengehöriger Nukleinsäuremoleküle (z.B. DNA/RNA)
über Wasserstoffbrücken zwischen den komplementären
Nukleotiden (Adenin mit Thymin / Uracil, Guanin mit
Cytosin)
HCV:
Hepatitis C Virus
HIV:
humanes Immunodefizienzvirus
HPV:
humanes Papillomvirus
HSV:
Herpes Simplex Virus
MRSA:
Methicillin resistenter Staphylococcus aureus
MTHFR:
Methylentetrahydrofolatreduktase Polymorphismen:
Erkennung des Homocysteinspiegels als signifikanten
und unabhängigen Risikofaktor für koronare Herzerkrankungen, Schlaganfälle und venöse Thrombosen;
Beeinflussung des Abbaus von Methotrexat
Parodontopathogene
Bakterien:
Actinobacillus actinomycetemcomitans, Bacteroides forsythus, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia
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PCR:
Polymerase-Kettenreaktion: die exponetielle Vermehrung
von spezifischen DNA-Gensequenzen mit Hilfe des Enzyms
DNA-Polymerase
Restriktions-Fragmentlängen-Polymorphismus:Verfahren, bei dem PCR-Produkte identifiziert werden können anhand der Länge der Fragmente, die nach
Behandlung mit einem Restriktionsenzym (Enzym, das
bestimmte Nukleotidfolgen erkennt und zerschneidet)
entstehen
RT-PCR:
Reverse-Transkriptase PCR: die exponetielle Vermehrung
von spezifischen RNA-Gensequenzen nach einer vorherigen Umschreibung der RNA in DNA mit Hilfe des Enzyms Reverse-Transkriptase
Schmelzpunktanalyse: Bestimmung der Zusammensetzung eines Genbereiches
anhand der Temperatur (Tm = melting temperature), bei
der die zwei DNA Stränge des Genbereiches auseinanderfallen („schmelzen“); wird u.a. bei der Genotypisierung angewandt
Viruslast-Bestimmung: quantitative Bestimmung der Menge eines Virus im Blut
(„Viral Load Monitoring“)
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VTEC:
verotoxinproduzierende E.coli bzw. STX = Shiga Toxin
VZV:
Varizella Zoster Virus
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informiert
Notizen
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Baden-Baden
Laborärztliche Gemeinschaftspraxis Dres. med. Renate Röck,
Dietmar Löbel, Doina Ionescu
Lange Straße 65, 76530 Baden-Baden
Telefon (07221) 21 17 0, Telefax (07221) 21 17 77
Berlin
Laborärztliche Praxis Dr. med. Anton Waldherr
Landgrafenstraße 16, 10787 Berlin
Telefon (030) 30 11 88 0, Telefax (030) 30 11 88 50
Braunschweig /
Salzgitter
Laborärztliche Praxis Peter John
Campestraße 7, 38102 Braunschweig
Telefon (0531) 22 08 80, Telefax (0531) 22 08 88 8
Bremen-Mitte
Gemeinschaftspraxis für Laboratoriumsmedizin
Priv.-Doz. Dr. med. Mariam Klouche, Priv.-Doz. Dr. med. Gregor Rothe
St.-Jürgen-Straße 1, 28205 Bremen
Telefon (0421) 22 27 00, Telefax (0421) 22 27 02 7
Bremen-Süd
Laborärztliche Gemeinschaftspraxis
Dr. med. Martin Sandkamp, Bernhard Köster, Dr. med. Ruth Hiller
Norderoog 2, 28259 Bremen
Telefon (0421) 57 25 0, Telefax (0421) 57 12 49
Dortmund
Laborärztliche Praxis Dr. med. Bernd F. Becker-Kreutz
Rosental 23, 44135 Dortmund
Telefon (0231) 55 72 12 0, Telefax (0231) 55 72 12 21
Geesthacht
Laborärztliche Gemeinschaftspraxis Dr. Kramer & Kollegen
Dres. med. Detlef Kramer, Ivo Mucha, Adel Rahmann, Olaf Bätz,
Priv.-Doz. Dietger Mathias, Prof. Gottfried Mauff (priv.),
Annelie Weichsel, Jürgen Kunz, Peter Wollenberg, Siegfried Krell
Lauenburger Straße 67, 21502 Geesthacht
Telefon (04152) 803 0, Telefax (04152) 76 73 1
Hannover
LADR GmbH, Labormedizinisches Versorgungszentrum Hannover
Ärztliche Leitung: Prof. Dr. med. Günter Hellthaler, Dr. med. Norbert Sloot
Oldenburger Allee 6, 30659 Hannover-Lahe
Telefon (0511) 90 13 61 1, Telefax (0511) 90 13 61 9
Köln
Laborärztliche Praxis Dr. med. Christiane Boogen
Kirchstraße 2, 50996 Köln
Telefon (0221) 93 55 56 0, Telefax (0221) 93 55 56 99
Kyritz
Medizinisches Laboratorium Dr. Manfred Haßfeld
Perleberger Straße 31 A, 16866 Kyritz
Telefon (033971) 895 0, Telefax (033971) 895 20
Plön
Laborärztliche Gemeinschaftspraxis
Dr. med. Annegret Krenz-Weinreich, Dr. med. Wigbert Schulze
Krögen 6, 24306 Plön
Telefon (04522) 50 40, Telefax (04522) 50 48 2
Rendsburg
Laborärztliche Praxis Dr. med. Peter Wrigge
Hollerstraße 47, 24782 Büdelsdorf
Telefon (04331) 708 20 20, Telefax (04331) 708 20 22
Laborärztliche Arbeitsgemeinschaft für Diagnostik und Rationalisierung e. V.
Lauenburger Straße 67 • 21502 Geesthacht • Telefon 04152 / 848 190 • Telefax 04152 / 848 490
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DDL 31.12.2004
Fachlaboratorien der LADR