Herstellung artifizieller antigenpräsentierender Zellen zur adoptiven
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Aus der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover und der Abteilung für Gastroenterologie der Medizinischen Hochschule Hannover Herstellung artifizieller antigenpräsentierender Zellen zur adoptiven Immuntherapie bei Tumorpatienten INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover vorgelegt von Sonja Obermann, geb. Zieseniß aus Hannover Hannover 2007 Wissenschaftliche Betreuung: Apl. Prof. Dr. H.-J. Schuberth (Tierärztliche Hochschule Hannover) Apl. Prof. Dr. T. Greten (Medizinische Hochschule Hannover) 1. Gutachter: Apl. Prof. Dr. H.-J. Schuberth 2. Gutachter: Prof. Dr. I. Nolte Tag der mündlichen Prüfung: 29.05.2007 Die Arbeit wurde freundlicherweise durch Mittel der Fresenius Stiftung (AICR (04-269)) gefördert. Für meine Eltern, die mir diesen Weg ermöglichten und für Arne, ohne den ich dieses Ziel nie erreicht hätte. Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung..................................................................................................................... 1 2 Literaturübersicht........................................................................................................ 3 2.1 MHC-Moleküle und Antigenprozessierung .............................................................. 4 2.1.1 MHC-Klasse-II-Moleküle.................................................................................... 5 2.1.2 MHC-Klasse-I-Moleküle..................................................................................... 5 2.1.3 Rekombinante MHC-Klasse-I-Moleküle............................................................. 7 2.2 Professionelle antigenpräsentierende Zellen........................................................... 9 2.3 T-Zellen ................................................................................................................. 10 2.4 Manipulation von antigenspezifischen T-Zellen in vitro ......................................... 12 2.4.1 Antigenunabhängige Amplifikation von T-Zellen ............................................. 13 2.4.2 Antigenspezifische Expansion von T-Zellen .................................................... 14 2.4.3 Expansion antigenspezifischer T-Zellen mit aAPCs ........................................ 15 2.5 Nachweis von antigenspezifischen T-Zellen.......................................................... 18 2.6 Tumorimmunologie................................................................................................ 19 2.6.1 Tumorantigene ................................................................................................ 20 2.6.2 Immuntherapie von Tumorerkrankungen......................................................... 24 2.6.2.1 Aktive Immunisierung und andere immuntherapeutische Verfahren ......... 25 2.6.2.2 Adoptiver T-Zelltransfer ............................................................................. 27 2.6.2.3 Therapieansätze in der Veterinärmedizin .................................................. 29 2.6.3 Problematiken der Immuntherapie von Tumoren ............................................ 31 3 Material und Methoden ............................................................................................. 33 3.1 Material.................................................................................................................. 33 3.1.1 Geräte ............................................................................................................. 33 3.1.2 Plastik- und Glaswaren.................................................................................... 34 3.1.3 Reagenzien ..................................................................................................... 35 3.1.4 Häufig verwendete Puffer ................................................................................ 38 3.1.5 Biologische Materialien.................................................................................... 38 3.1.5.1 Bakterienstämme....................................................................................... 38 3.1.5.2 Eukaryontische Zellen ............................................................................... 38 3.1.5.3 HLA-A2-positives Blut................................................................................ 40 3.1.5.4 Mäuse........................................................................................................ 41 3.1.6 Kulturmedien ................................................................................................... 41 3.1.6.1 Medien für Bakterien ................................................................................. 42 3.1.6.2 Medien für die Zellkultur ............................................................................ 42 3.1.6.3 Antibiotika.................................................................................................. 43 3.1.7 Antikörper ........................................................................................................ 44 3.1.8 Vektoren .......................................................................................................... 45 3.1.9 Peptide ............................................................................................................ 46 3.1.10 Primer........................................................................................................... 47 Inhaltsverzeichnis 3.2 Methoden .............................................................................................................. 48 3.2.1 Allgemeine molekularbiologische Methoden ................................................... 48 3.2.1.1 Kultivierung und Konservierung von E. coli -Stämmen.............................. 48 3.2.1.2 Transformation von E. coli mit Plasmid-DNA............................................. 48 3.2.1.3 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli .................................................... 49 3.2.1.4 Konzentrations- und Reinheitsbestimmung von Nukleinsäuren ................ 49 3.2.1.5 Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen ................................... 50 3.2.1.6 Gelelektrophorese von DNA...................................................................... 50 3.2.1.7 Isolierung und Reinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen ......... 51 3.2.1.8 Ethanol-DNA-Präzipitation......................................................................... 51 3.2.1.9 Ligation von DNA-Fragmenten .................................................................. 51 3.2.1.10 Sequenzierung von Plasmid-DNA............................................................ 51 3.2.1.11 PCR ......................................................................................................... 52 3.2.1.12 Aufreinigung von PCR-Produkten ............................................................ 53 3.2.2 Konstruktion der Expressionsvektoren ............................................................ 53 3.2.2.1 Klonierung von Peptid-SC pEGFP-Konstrukten ........................................ 53 3.2.2.2 Expressionsvektor Influenza M1 pEGFP ................................................... 57 3.2.3 Allgemeine Zellkulturmethoden ....................................................................... 59 3.2.3.1 Kultivierung eukaryontischer Zellen........................................................... 59 3.2.3.2 Bestimmung der Zellzahl ........................................................................... 60 3.2.3.3 Einfrieren und Auftauen von Zellen ........................................................... 60 3.2.4 Spezielle Zellkulturmethoden .......................................................................... 60 3.2.4.1 Gewinnung von Serum .............................................................................. 60 3.2.4.2 Isolierung mononukleärer Zellen aus dem peripheren Blut ....................... 61 3.2.4.3 Gewinnung von Monozyten aus dem peripheren Blut ............................... 61 3.2.4.4 Transfektion eukaryontischer Zellen.......................................................... 62 Elektroporation ...................................................................................................... 62 Transfektion mittels Lipofektamin .......................................................................... 63 3.2.4.5 Bestrahlung von Zellen.............................................................................. 64 3.2.4.6 Herstellung von PHA-Blasten .................................................................... 64 3.2.4.7 TCGF-Medium........................................................................................... 64 Herstellung ............................................................................................................ 64 Prüfung des hergestellten TCGF-Mediums ........................................................... 65 3.2.4.8 Generierung peptidspezifischer CTLs ....................................................... 65 Generierung antigenspezifischer CTLs mit autologen PBMCs.............................. 66 Generierung antigenspezifischer CTLs mit autologen MoDCs .............................. 66 Generierung antigenspezifischer CTLs mit aAPCs ............................................... 67 3.2.5 Charakterisierung von Zellen........................................................................... 68 3.2.5.1 Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie............................................ 68 Untersuchung der Immunfluoreszenz mittels Fluoreszenzmikroskop.................... 68 Durchflusszytometrie ............................................................................................. 68 Oberflächen-FCM-Analyse .................................................................................... 70 Bestimmung der Peptidspezifität mittels Pentamer-Färbung................................. 70 IFN-γ-Bestimmung mittels intrazellulärer FCM-Analyse ........................................ 71 3.2.5.2 Bestimmung der GM-CSF-Konzentration mittels Zytokin-ELISA............... 72 3.2.5.3 Proliferations-Assays................................................................................. 73 CFSE-Assay.......................................................................................................... 74 Inhaltsverzeichnis [3H]-Thymidin-Assay.............................................................................................. 74 3.2.5.4 51Cr release assay..................................................................................... 75 3.2.6 Tierexperimentelle Methoden .......................................................................... 76 3.2.6.1 Injektion von Tumorzellen.......................................................................... 76 3.2.6.2 Adoptiver T-Zelltransfer ............................................................................. 77 3.2.6.3 Entnahme und Charakterisierung von Maustumoren ................................ 77 3.2.7 Statistische Auswertung .................................................................................. 77 4 Ergebnisse ................................................................................................................. 79 4.1 Klonierung von Peptid-SC pEGFP-Konstrukten .................................................... 79 4.2 Klonierung von Influenza M1 pEGFP .................................................................... 83 4.3 Methodische Vorarbeiten....................................................................................... 85 4.3.1 Prüfung des hergestellten TCGF-Mediums ..................................................... 85 4.3.2 Expressionsmodulation kostimulatorischer Moleküle ...................................... 86 4.4 Generierung peptidspezifischer T-Zellen mit aAPCs............................................. 88 4.4.1 Transfektion von Daudi-Zellen mit Peptid-SC pEGFP-Konstrukten................. 88 4.4.2 Funktionalität von Daudi M1-SC-Zellen ........................................................... 89 4.4.2.1 Überprüfung der M1-Reaktivität gesunder Spender .................................. 89 4.4.2.2 Stimulation von M1-spezifischen T-Zellen mit Daudi M1-SC-Zellen .......... 90 4.5 In vitro-Funktionalität der generierten M1-spezifischen T-Zellen ........................... 99 4.5.1 Zytokinsekretion .............................................................................................. 99 4.5.2 Proliferation ................................................................................................... 100 4.5.3 Zytotoxizität ................................................................................................... 103 4.5.4 Reaktivität gegenüber Influenza M1-transfizierten Tumorzellen.................... 105 4.5.4.1 Intrazelluläre IFN-γ-Analyse..................................................................... 106 4.5.4.2 GM-CSF-ELISA ....................................................................................... 107 4.5.4.3 Zytotoxizität ............................................................................................. 108 4.6 Vergleich von aAPCs mit DCs............................................................................. 109 4.7 Funktionalität von M1-spezifischen T-Zellen in vivo ............................................ 116 4.8 Generierung M1-spezifischer T-Zellen aus Patienten mit fortgeschrittenen Karzinomen des Gastrointestinaltraktes unter palliativer Chemotherapie .................... 118 4.9 Generierung tumorspezifischer T-Zellen aus Patienten mit hepatozellulärem Karzinom ...................................................................................................................... 120 5 Diskussion ............................................................................................................... 123 5.1 Herstellung von Peptid-SC-Konstrukten mittels 4-Step-PCR .............................. 123 5.2 Transfektion von MHC-Klasse-I-negativen Zellen mit Peptid-SC-Konstrukten .... 124 5.3 Generierung M1-spezifischer CTLs mit Hilfe der aAPCs und Prüfung verschiedener Kulturbedingungen ....................................................................................................... 126 5.4 Überprüfung der Funktionalität generierter Effektorzellen in vitro........................ 129 Inhaltsverzeichnis 5.5 Vergleich von Daudi Peptid-SC-Zellen mit klassischen DCs und transfizierten K562-Zellen .................................................................................................................. 135 5.6 Überprüfung der Funktionalität generierter Effektorzellen in vivo ........................ 138 5.7 Generierung antigenspezifischer CD8+ T-Zellen aus Tumorpatienten ................ 141 5.8 Relevanz der erhobenen Daten für die Tiermedizin ............................................ 144 6 Zusammenfassung.................................................................................................. 147 7 Summary.................................................................................................................. 150 8 Literaturverzeichnis ................................................................................................ 152 9 Anhang ..................................................................................................................... 181 9.1 Vorveröffentlichungen der Dissertation ............................................................... 181 9.2 Danksagung ........................................................................................................ 182 9.3 Eidesstattliche Erklärung nach § 3 Abs. 2 Nr. 7 PromO ...................................... 183 Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis AS Aminosäure 7AAD 7-Amino-Actinomycin D aAPC künstliche antigenpräsentierende Zelle (artificial APC) Abb. Abbildung AFP α-Fetoprotein AK Antikörper APC antigenpräsentierende Zelle (antigen presenting cell) Aquadest. einfach destilliertes Wasser (aqua destillata) β2m beta2-Mikroglobulin bp Basenpaar Bq Becquerel (SI-Einheit für Radioaktivität) BSA Bovines Serumalbumin bzgl. bezüglich bzw. beziehungsweise CD cluster of differentiation CFSE 5, 6-Carboxyfluorescein-Diacetat-Succinimidyl-Ester CLIP class II-associated invariant-chain peptide cm Zentimeter CMV Cytomegalievirus CO2 Kohlenstoffdioxid CpG Cytosin-Phosphat-Guanosin cpm counts per minute DC Dendritische Zelle (dendritic cell) DMEM Dulbecco's modified eagle medium DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure dsDNA doppelsträngige DNA EBV Epstein-Barr-Virus E. coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamintetraacetat I Abkürzungsverzeichnis EGFP enhanced green fluorescent protein ER endoplasmatisches Retikulum E:T Effektor:Target-Verhältnis (Verhältnis zwischen Effektor- und Zielzellen) et al. und andere (latein: et alii) F Farad (SI-Einheit für elektrische Kapazität) FACS fluorescence activated cell sorting FACScalibur Fluoreszenzaktiviertes Zellmessgerät der Fa. Becton-Dickinson Fc Carboxy-terminales Fragment von Immunglobulinen (fragment crystalline) FCM Durchflusszytometer (flow cytometer) FCS Fetales Kälberserum FITC Fluoreszeinisothiocyanat FL-1, -2, -3, -4 Messkanäle des Durchflusszytometers für emittierte Fluoreszenz FP forward primer FSC Vorwartsstreulicht (forward scatter) g Gramm GFP green fluorescent protein GM-CSF Granulozyten-Makrophagen-Koloniestimulierender Faktor Gy Gray (SI-Einheit für die Dosis radioaktiver Strahlung) h Stunde (latein: hora) HCC hepatozelluläres Karzinom HEPES 4-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-1-ethansulfonsäure HIV humanes Immundefizienzvirus HLA human leukocyte antigen HPLC high performance liquid chromatography HSP Hitze-Schock-Protein (heat shock protein) ICAM interzelluläres Adhäsionsmolekül (intercellular adhesion molecule) i.d.R in der Regel IFN Interferon Ig Immunglobulin II Abkürzungsverzeichnis IL Interleukin i.v. intravenös kg Kilogramm L Ligand l Liter li invariante Kette (invariant chain) Lnn. Lymphknoten (latein: lymphonodii) LPS Lipopolysaccharid µ mikro (x 10-6) m milli (x 10-3) MACS magnetic activated cell sorting mAK monoklonale(r) Antikörper MgCl Magnesiumchlorid MHC Haupthistokompatibilitätskomplex (major histocompatibility complex) min Minute(n) MoDCs aus CD14+ Zellen gereifte DCs (monocyte-derived DCs) mRNA messenger RNA n nano (x 10-9) n= bei Berechnung des Mittelwertes die Anzahl der Einzelbeobachtungen NaCl Natriumchlorid NK Natürliche Killerzelle NaN3 Natriumazid Nr. Nummer NOD-scid Non-Obese Diabetical Severe Combined Immunodeficiency NY-ESO-1 New York Esophageal-1 OD Optische Dichte ODN Oligodesoxynukleotide OVA Ovalbumin p Irrtumswahrscheinlichkeit bei der Analyse der Ähnlichkeit zweier Datengruppen (probability) PAMP Pathogen-assoziiertes molekulares Muster III Abkürzungsverzeichnis (pathogen associated molecular pattern) PBMCs mononukleäre Zellen des peripheren Blutes PBS phosphatgepufferte Kochsalzlösung (phosphate buffered saline) PCR Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction) PE Phycoerythrin PHA Phythämagglutinin PI Propidiumjodid PMA Phorbol-12-Myristat-13-Acetat RNA Ribonukleinsäure RP reverse primer rpm Drehungen pro Minute (rounds per minute) RT Raumtemperatur s.c. subkutan scid schwerer kombinierter Immundefekt SD Standardabweichung SDS Natriumdodecylsulfat SEREX serological analysis of recombinant cDNA expression libraries sec Sekunde(n) sog. so genannte(r) SSC Seitwärtsstreulicht (side scatter) TAP transporter associated with antigen processing TCR T-Zellrezeptor TCGF T-Zell-Wachstumsfaktor (T cell growth factor) TH1, TH2 Phänotyp einer T-Helfer-Zelle 1 oder 2 TILs Tumorinfiltrierende Lymphozyten TLR Toll-like-Rezeptor (toll-like receptor) TNF Tumornekrosefaktor (tumor necrosis factor) U Einheit (Unit) u.a. unter anderem V Volt (SI-Einheit für elektrische Spannung) v/v Volumen pro Volumen IV Einleitung 1 Einleitung Antigenspezifische T-Zellen nehmen eine zentrale Aufgabe in der Abwehr von Infektionen und der Kontrolle von Tumorerkrankungen ein. Diese funktionellen Eigenschaften lymphatischer Zellen macht man sich bei der adoptiven Immuntherapie zunutze. Das Prinzip beruht darauf, dass Patienten mit einer viralen oder malignen Erkrankung ex vivo expandierte, antigenspezifische T-Zellen appliziert werden, um eine Beseitigung infizierter oder entarteter Zellen in vivo zu erreichen. Aufgrund des komplizierten Selektions- und Herstellungsprozesses spezifischer TZellklone und T-Zelllinien sowie einer meist geringen Zellausbeute sind antigenspezifische T-Zellen für den therapeutischen Einsatz bislang nur eingeschränkt nutzbar. Dennoch konnte die Wirksamkeit einer Therapie mit spezifischen T-Zellen in der Behandlung von EBV- sowie CMV-Infektionen nach allogener Knochenmarktransplantation nachgewiesen werden (HAQUE et al., 2002; PEGGS et al., 2003; RAUSER et al., 2004). Durch gezielte Selektion von T-Lymphozyten, die gegen tumorassoziierte Antigene gerichtet sind, kann die Einsatzmöglichkeit auf weitere Tumorentitäten ausgedehnt werden (YEE et al., 2002; DUDLEY und ROSENBERG, 2003; GOTTSCHALK et al., 2003). Die antigenspezifischen T-Zellen werden in vitro aus den mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) der jeweiligen Patienten generiert. Hierfür werden klassischerweise professionelle antigenpräsentierende Zellen (APCs) verwendet. Sie werden mit dem gewünschten Antigen beladen und können unter bestimmten Kulturbedingungen spezifische T-Zellen zur Proliferation und Expansion anregen. Da es sich bei dieser „klassischen“ Methode um ein sehr zeit- und kostenintensives Verfahren handelt, wurden alternative Strategien zur spezifischen T-Zellaktivierung entwickelt. Diese beinhalten den Einsatz so genannter künstlicher antigenpräsentierender Zellen (aAPCs), welche die professionellen APCs möglichst gut imitieren sollen. So wurden Moleküle, die für die Stimulation von Effektor-T-Zellen in vivo bedeutsam sind, in nichtimmune Zellen eingebracht oder an magnetische Partikel oder Vesikel gebunden. Die generierten aAPCs waren unterschiedlich gut in der Lage, antigenspezifische T-Zellen in vitro zu stimulieren und zu expandieren (KIM et al., 2004; OELKE et al., 2005a; OELKE et al., 2005b). 1 Einleitung Ziel der vorliegenden Arbeit war es, zellbasierte künstliche APCs zu generieren, die das so genannte Peptid-MHC-Fusionskonstrukt (Peptid-SC) an ihrer Oberfläche exprimieren. Hierbei handelt es sich um genetisch veränderte MHC-Klasse-I-Moleküle, bei denen sowohl das β2-Mikroglobulin als auch das jeweilige Peptid kovalent mit der schweren α-Kette des Moleküls verbunden sind. Diese Konstrukte sollten in MHC-Klasse-I-negative Zellen eingebracht werden, um aAPCs zu erhalten, die nur das gewünschte Peptid, nicht jedoch endosomal prozessierte Antigene an ihrer Oberfläche präsentieren. In den sich anschließenden Versuchen sollte die Fähigkeit der hergestellten aAPCs überprüft werden, antigenspezifische CD8+ T-Zellen effektiv zu stimulieren und zu expandieren. Die Arbeit lässt sich in folgende Arbeitsschritte untergliedern: 1. Herstellung von Peptid-SC-Konstrukten mittels 4-Step-PCR. 2. Transfektion von MHC-Klasse-I-negativen Zellen mit den Peptid-SC-Konstrukten. 3. Generierung peptidspezifischer T-Zellen mit Hilfe der hergestellten aAPCs und Prüfung verschiedener Kulturbedingungen. 4. Überprüfung der Funktionalität generierter Effektorzellen in vitro und in vivo. 5. Vergleich der stimulatorischen Kapazität von Daudi Peptid-SC-Zellen mit klassischen DCs und transfizierten K562-Zellen. 6. Generierung antigenspezifischer CD8+ T-Zellen aus PBMCs von Tumorpatienten mit Hilfe der hergestellten aAPCs. 2 Literaturübersicht 2 Literaturübersicht Während der Evolution hat sich das Immunsystem zu einem hochkomplexen und effektiven Netzwerk entwickelt, welches in der Lage ist, Fremdkörper und Mikroorganismen wie z.B. Viren, Bakterien und Pilze, aber auch körpereigene, entartete Zellen zu erkennen und abzutöten. Aufgrund des komplexen Zusammenspiels von humoralen und zellulären Abwehrmechanismen ist das Immunsystem dabei in der Lage, zwischen körpereigenen und fremden Strukturen zu unterscheiden. Die Immunantwort kann in ein angeborenes und erworbenes Immunsystem unterteilt werden. Das angeborene Immunsystem bildet eine erste Abwehrlinie des Organismus. Es zeichnet sich dadurch aus, dass es nach dem Eindringen von Pathogenen innerhalb kürzester Zeit reagiert. Die Erkennung fremder Strukturen erfolgt über so genannte PAMPs (pathogenassociated molecular patterns). Sie binden an spezifische Rezeptoren der Effektorzellen und induzieren somit eine Hochregulierung bestimmter Oberflächenmoleküle und eine Ausschüttung inflammatorischer Mediatoren. Dies führt zur Aktivierung von Zellen des erworbenen Immunsystems. Einige Zellen des angeborenen Immunsystems sind außerdem in der Lage, Krankheitserreger direkt abzutöten. Komponenten der unspezifischen Abwehr sind inflammatorische Zellen wie Makrophagen, Granulozyten, Mastzellen, Natürliche Killerzellen, Untergruppen von T- und B-Zellen (z.B. γ:δ T-Zellen und NK1.1+ NKT-Zellen) sowie das Komplementsystem. Im Gegensatz zur angeborenen ist die adaptive Immunität hochspezifisch für das jeweilige Pathogen und stets antigenvermittelt. Sie zeichnet sich durch die vier Merkmale: Spezifität, Diversität, Gedächtnis und Unterscheidung von selbst und fremd aus. Nach Aktivierung kommt es zur klonalen Selektion und Expansion antigenspezifischer T- und BLymphozyten. Die humorale Immunität wird von Antikörpern gebildet, die von BLymphozyten sezerniert werden. Sie schützt den Organismus vor extrazellulären Antigenen und Toxinen durch die drei Mechanismen: Neutralisation, Opsonierung und Komplementaktivierung. Intrazelluläre Pathogene, wie z.B. Viren und einige Bakterien sowie Tumorzellen werden von zytotoxischen T-Zellen und inflammatorischen TH1-Zellen bekämpft (zelluläre Immunität). T-Helferzellen sind zudem für die Koordination vieler Funktionen des Immunsystems zuständig. Die Aktivierung der Zellen des erworbenen Immunsystems basiert auf ihrer Interaktion mit professionellen antigenpräsentierenden Zellen (APCs). APCs 3 Literaturübersicht spielen somit eine entscheidende Rolle bei der Vermittlung von Immunität und stellen ein Bindeglied zwischen dem angeborenen und dem erworbenen Immunsystem dar. 2.1 MHC-Moleküle und Antigenprozessierung Um naive T-Lymphozyten zu stimulieren, müssen ihnen Antigene über spezielle, membranständige Glykoproteine präsentiert werden (ZINKERNAGEL und DOHERTY, 1974). Hierbei handelt es sich um Moleküle, die Peptide aus extrazellulären bzw. zytosolischen Proteinen binden können. Sie werden beim Menschen als human leukocyte antigens (HLA) bezeichnet und von Genen des Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) kodiert, der auf Chromosom 6 lokalisiert ist. Bei den Haustieren liegen diesbezüglich artspezifische Unterschiede vor. So befindet sich beispielsweise der ELA (equine leukocyte antigen)Komplex auf Chromosom 20. Beim Schwein sind die Gene des MHC hingegen auf Chromosom 7, beim Rind auf Chromosom 23 und beim Hund auf Chromosom 12 lokalisiert. Man unterscheidet zwei Arten von MHC-Molekülen, die als MHC-Klasse-I und MHCKlasse-II bezeichnet werden. Für MHC-Klasse-I-Moleküle existieren beim Menschen jeweils drei Genorte: HLA-A, -B und -C. Die drei Genregionen für MHC-Klasse-II sind HLADP, -DQ und -DR. Diese Gene zeichnen sich durch einen außergewöhnlich starken Polymorphismus aus, so dass die meisten Individuen für jeden Lokus heterozygot sind und wegen der kodominanten Expression der Gene der schweren Ketten bis zu sechs verschiedene MHC-Klasse-I- bzw. bis zu acht verschiedene MHC-Klasse-II-Moleküle besitzen. Aufgrund der hohen Variation in den einzelnen Genorten existieren 489 unterschiedliche Allele für HLA-A, 830 Allele für HLA-B und 266 Allele für HLA-C (IMGT/HLA Sequence Database; http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/stats.html). Aufgrund seiner großen Häufigkeit in allen ethnischen Gruppen findet in vielen immunologischen Untersuchungen eine Fokussierung auf den HLA-A*0201 (HLA-A2)-Lokus statt. So tragen beispielsweise etwa 46 % der mitteleuropäischen Bevölkerung HLA-A2 als eines ihrer Allele (The Central Data Analysis Committee. Section 6.3 Splits Combined (Five Loci). The Data Book of the 11th International Histocompatibility Workshop. Yokohama, Japan; 1991:807-814). 4 Literaturübersicht 2.1.1 MHC-Klasse-II-Moleküle Bei MHC-Klasse-II-Molekülen handelt es sich um heterodimere Glykoproteine, die aus zwei nichtkovalent assoziierten, membranständigen Ketten, der 34 kDa großen α- und der 29 kDa großen β-Kette, bestehen. Jede Kette lässt sich in zwei extrazelluläre Immunglobulindomänen (α1 und α2 bzw. β1 und β2), eine Transmembranregion und eine kurze zytosolische Domäne unterteilen (BROWN et al., 1993). Die im Gegensatz zu MHC-Klasse-IMolekülen an beiden Enden offene Peptidbindungsgrube wird von der α1- und β1-Domäne gebildet. Sie nimmt Liganden mit einer variablen Länge von 13-25 Aminosäuren auf (CHICZ et al., 1992). MHC-Klasse-II-Moleküle werden in der Regel nur von professionellen APCs exprimiert. Sie präsentieren Liganden an ihrer Oberfläche, die aus dem endolysosomalen Zellkompartment abstammen (MORRISON et al., 1986). MHC-Klasse-IIPeptide werden durch saure Proteasen, wie z.B. Cathepsine, in den Endolysosomen generiert. Nach Fusion mit Vesikeln, die MHC-Klasse-II-Moleküle enthalten, kommt es zur Verankerung der Peptide in der Peptidbindungsfurche. Die MHC-Klasse-II-Moleküle werden im ER mit Hilfe des Chaperons Calnexin synthetisiert (BRYANT und PLOEGH, 2004). Durch Anlagerung der trimeren invarianten Kette (invariant chain, li) an die α- und β-Kette kommt es zunächst zu einem Schutz des Moleküls. Über den Golgi-Apparat gelangt der nonamere Komplex (li)3(α:β)3 zum späten endosomalen Kompartment. Aufgrund des dort vorherrschenden niedrigen pH-Wertes kommt es zur Spaltung der li durch saure Proteasen. Zurück bleibt ein als CLIP (class II-associated invariant-chain peptide) bezeichnetes Fragment, das erst im nachfolgenden Schritt mit einem MHC-Klasse-II-Liganden ausgetauscht wird. Dieser Vorgang wird durch das nicht-klassische MHC-Klasse-II-Molekül HLADM assistiert (SLOAN et al., 1995). 2.1.2 MHC-Klasse-I-Moleküle MHC-Klasse-I-Moleküle sind ebenfalls heterodimere Glykoproteine, die in ihrer Struktur den MHC-Klasse-II-Molekülen ähneln. Sie werden von allen kernhaltigen Zellen bis auf Spermatozyten exprimiert. Sie bestehen aus einer 46 kDa großen α-Kette (schwere Kette), die nichtkovalent mit einem extrazellulären 12 kDa großen Polypeptid verbunden ist (MADDEN, 1995). Diesem, als β2-Mikroglobulin (β2m) bezeichneten Polypeptid, wird eine 5 Literaturübersicht wichtige Rolle beim intrazellulären Transport, der Peptidbindung sowie bei der Aufrechterhaltung der Konformationsstabilität zugeschrieben (HANSEN und LEE, 1997). Die α-Kette setzt sich aus einer kurzen zytoplasmatischen, einer transmembranären sowie drei extrazellulären Domänen (α1-α3) zusammen. Die beiden C-terminalen Domänen α1 und α2 formen eine längliche Peptidbindungsfurche, deren Boden von einer β-Faltblattstruktur gebildet wird. Seitlich wird sie von zwei α-helikalen Bereichen begrenzt. Ein aus 8-10 Aminosäuren bestehendes Peptid ist über hydrophobe und ionische Wechselwirkungen nichtkovalent in der Peptidbindungsfurche verankert. Den größten Anteil an der Bindung nehmen Bereiche der α1-Helix ein, die mit so genannten „Ankeraminosäuren“ des Peptids in Wechselwirkung treten. Die Tatsache, dass die Peptidbindungsfurchen der einzelnen HLA-Allelprodukte jeweils charakteristische chemische Verhältnisse aufweisen, führt dazu, dass jedem Allel ein bestimmtes „Peptidmotiv“ zugewiesen werden kann (FALK et al., 1991). Die Peptide, die von MHC-Klasse-I-Molekülen präsentiert werden, sind vor allem zytosolischen Ursprungs. Sie werden aus den im Zytoplasma kontinuierlich synthetisierten Proteinen gebildet und stellen Spaltprodukte von ihnen dar (YORK et al., 1999). Auf gesunden Zellen handelt es sich demnach um Selbstpeptide, die den regulären zytoplasmatischen Zellbestand widerspiegeln. Im Fall einer Infektion oder Tumorerkrankung werden dagegen auch Peptide mikrobiellen bzw. tumorösen Ursprungs auf der Zelloberfläche exprimiert. Initial wird das zu degradierende Protein an Ubiquitin gebunden und zu dem im Zytoplasma lokalisierten Proteasom geleitet. Bei dem Proteasom handelt es sich um einen Multienzymkomplex, der aus einer katalytisch aktiven Komponente, dem 20S-Proteasom besteht. Das 20S-Proteasom ist ein fassartiger Komplex aus vier übereinander liegenden Ringen mit je sieben α- (äußere Ringe) und β-Untereinheiten (innere Ringe), wobei je drei β-Untereinheiten enzymatisch aktive Zentren mit unterschiedlichen Schnittspezifitäten darstellen (GROLL et al., 1997). Unter dem Einfluss von IFN-γ, zum Beispiel im Zusammenhang mit einer viralen Infektion, kommt es zum Austausch der β-Untereinheiten mit den proteasomalen Untereinheiten LMP2 und LMP7 sowie MECL-1 (GACZYNSKA et al., 1993; NANDI et al., 1996). Das konstitutive Proteasom konvertiert somit zum so genannten Immunoproteasom. Verglichen mit dem konstitutiven Proteasom weist das Immunoproteasom typische Schnittmuster auf. So ergeben sich vermehrt Schnitte nach hydro- 6 Literaturübersicht phoben und weniger nach sauren Aminosäuren (TOES et al., 2001). Da alle bekannten Peptidmotive für humane MHC-Klasse-I-Moleküle C-terminal entweder hydrophobe oder basische Aminosäuren aufweisen, werden nun verstärkt Peptide generiert, die potentielle MHC-Klasse-I-Liganden darstellen. Die durch das Proteasom gebildeten Peptide gelangen nach weiterer N-terminaler Modifikation durch zytosolische Peptidasen über das heterodimere Transportprotein TAP ATP-abhängig in das endoplasmatische Retikulum (LANKATBUTTGEREIT und TAMPE, 2002). Dort werden sie an ein passendes, leeres Heterodimer, bestehend aus der schweren α-Kette und dem β2m, das zudem mit weiteren Molekülen wie dem transmembranären Glykoprotein Tapasin, dem Chaperon Calreticulin sowie der Proteindisulfidisomerase Erp57 interagiert, gebunden. Aus dem ER gelangt der trimere Komplex aus Peptid, α-Kette und β2m auf dem regulären Exozytoseweg für Membranproteine über den Golgi-Apparat und exozytotische Vesikel an die Zelloberfläche, wo er CD8+ T-Zellen präsentiert wird (BOUVIER, 2003). 2.1.3 Rekombinante MHC-Klasse-I-Moleküle Die Tatsache, dass zytotoxischen T-Zellen eine wichtige Rolle bei der Kontrolle vieler Krankheiten zugesprochen wird, hat zur Entwicklung stabiler MHC-Klasse-I-Komplexe geführt, die für funktionelle und strukturelle Studien von Bedeutung sind. Durch den Einsatz multimerer MHC-Peptid-Komplexe kann beispielsweise die Spezifität und Affinität von TZellrezeptoren gegenüber ihrem Peptid-MHC-Liganden bestimmt werden. Weiterhin ist es möglich, antigenspezifische T-Zellen direkt zu detektieren, sie phänotypisch zu charakterisieren oder auch zu aktivieren (DENKBERG et al., 2000). Solche Untersuchungen setzen voraus, dass große und reproduzierbare Mengen an löslichen und funktionellen MHCPeptid-Komplexen synthetisiert werden, was zur Generierung verschiedener, rekombinanter MHC-Moleküle geführt hat. Erste Studien beinhalteten die Entwicklung rekombinanter MHC-Klasse-I-Moleküle, deren Komponenten schwere Kette und β2m separat voneinander in E. coli exprimiert wurden. Die Faltung dieser Moleküle erfolgte anschließend in vitro unter Peptidanwesenheit (GARBOCZI et al., 1992). Da unter Kulturbedingungen in nur ca. einem Viertel der Fälle eine korrekte Assoziation der schweren Kette mit dem β2m stattfindet (HANSEN und LEE, 7 Literaturübersicht 1997), wurde versucht, beide Polypeptidketten kovalent über einen Peptid-Linker miteinander zu verknüpfen (MOTTEZ et al., 1991; DENKBERG et al., 2000). Eine Beladung dieser so genannten single-chain-Konstrukte mit gewünschten Peptiden erfolgte anschließend in vitro. In anderen Studien wurde das Peptid mit Hilfe eines flexiblen AminosäureLinkers an den N-Terminus der schweren α-Kette (MOTTEZ et al., 1995) oder auch direkt an das β2-Mikroglobulin gebunden (UGER und BARBER, 1998; WHITE et al., 1999). Ein weiteres, rekombinantes MHC-Klasse-I-Molekül wurde im Jahre 2002 von GRETEN et al. beschrieben (Abb. 1). Hierbei handelt es sich um das so genannte Peptid-β2Mikroglobulin-MHC-single-chain (SC)-Konstrukt (Peptid-SC), ein Fusionsmolekül, bei dem die drei Komponenten des humanen HLA-A2-Moleküls kovalent miteinander verbunden sind. Das bedeutet, dass die Assoziation zwischen der schweren α-Kette, dem β2m sowie dem Peptid nicht, wie natürlicherweise, über elektrostatische Wechselwirkungen erfolgt, sondern über flexible Aminosäuregruppen zustande kommt. Peptid A) B) Peptid α2 α1 α2 α1 α3 β 2m α3 β 2m C) S1 β2m signal peptide peptide S2 α2 α1 human β 2m α3 TM Cyto Abb. 1: Schematische Darstellung von MHC-Klasse-I- und Peptid-SC-Molekülen. Struktur eines MHC-Klasse-I-Moleküls, das aus zwei Polypeptidketten (α-Kette und β2m) besteht, die nichtkovalent miteinander verbunden sind. In der von der α1- und α2-Domäne gebildeten Peptidbindungsfurche ist das 8-10 AS lange Peptid verankert (A). Beim rekombinanten Peptid-SC-Konstrukt befindet sich sowohl zwischen β2m und der α1-Domäne als auch zwischen β 2m und dem Peptid ein AS-Linker, der aus Serin- und Glycin-Resten besteht (B). Schematische Darstellung der DNASequenz des Peptid-SC-Konstruktes (C). β2m: β 2-Mikroglobulin; S1 bzw. S2: AS-Linker; TM: transmembranäre Region; Cyto: zytoplasmatische Domäne. 8 Literaturübersicht Wie aus Abb. 1 hervorgeht, befindet sich in dem Peptid-SC-Konstrukt jeweils ein aus Glycin- und Serin-Molekülen bestehender Aminosäure-Linker sowohl zwischen Peptid und β2m als auch zwischen β2m und der α1-Domäne der schweren Kette. Nach Fusion dieses Konstruktes mit einem murinen Immunglobulin-Molekül war es möglich, peptidspezifische T-Zellen zu detektieren und zu stimulieren. Das rekombinante Peptid-SC-Fusionsprotein war hierbei in der Lage, antigenspezifische T-Zellen mit hoher Spezifität und Sensibilität zu binden (GRETEN et al., 2002). 2.2 Professionelle antigenpräsentierende Zellen Hochspezialisierte Zellen, die Proteinantigene zerlegen und die Peptidfragmente gemeinsam mit MHC-Klasse-I- oder MHC-Klasse-II-Moleküle auf ihrer Oberfläche darbieten können, werden als professionelle APCs bezeichnet. Sie sind in der Lage, CD4+ bzw. CD8+ TZellen zu stimulieren und stellen ein Bindeglied zwischen dem angeborenen und dem adaptiven Immunsystem dar. Typische APCs sind B-Zellen, Monozyten, Makrophagen und DCs, wobei Letztere die potentesten Zellen dieser Gruppe darstellen. Sie wurden in den 70er Jahren von Ralph Steinman entdeckt (STEINMAN und COHN, 1973). Es handelt sich hierbei um eine heterogene Zellpopulation, die laufend von Knochenmarkstammzellen nachgebildet wird. Man unterscheidet zwei humane DC-Linien: myeloide DCs, die aus myeloiden Monozyten hervorgehen und durch Produktion von IL-12 eine TH1-Antwort induzieren sowie lymphoide DCs, deren Vorläufer als plasmazytoide DCs bezeichnet werden und die die Immunreaktion in Richtung TH2 lenken (LIU et al., 2001). DCs besitzen die Eigenschaft, Antigene in hohem Maße aufzunehmen und zu prozessieren. Durch mikrobielle Produkte (z.B. LPS, unmethylierte CpG-DNA oder doppelsträngige RNA), proinflammatorische Zytokine (z.B. TNF-α oder IL-1β) und / oder Bindung von CD40L werden sie aktiviert und wandern, aus den peripheren Geweben kommend, über die afferenten Lymphgefäße zu den drainierenden Lymphknoten (kurz: homing). Dort treten sie in den T-Zellbereichen als interdigitierende, retikuläre Zellen in Erscheinung (STEINMAN, 1991). Als Konsequenz ihrer Reifung kommt es zur Hochregulierung von MHC-Klasse-Iund Klasse-II-Molekülen (CELLA et al., 1997), zu einem erhöhten Level an kostimulatori- 9 Literaturübersicht schen Molekülen (SHARPE und FREEMAN, 2002) und einer Exposition von CD83 auf ihrer Oberfläche (ZHOU und TEDDER, 1996; BANCHEREAU und STEINMAN, 1998). CD80 und CD86 stellen klassische, kostimulatorische Moleküle dar. Sie werden von allen professionellen aAPCs exprimiert und spielen als so genanntes Signal 2 eine entscheidende Rolle bei der Aktivierung von T-Lymphozyten. CD83 ist ein transmembranäres Glykoprotein, das zur Immunglobulin-Superfamilie gerechnet wird. Beim Menschen wird dieses Membranprotein als Differenzierungsmarker reifer DCs eingesetzt. Neben DCs wird es auch von aktivierten Lymphozyten exprimiert. Obwohl seine Funktion bislang noch nicht vollständig geklärt werden konnte, wird vermutet, dass es Interaktionen von DCs und TZellen beeinflusst (SCHOLLER et al., 2001). Nach Einwanderung in den Lymphknoten sind die nun reifen DCs nicht mehr in der Lage, Antigene zu phagozytieren und zu prozessieren. Dafür verfügen sie über die ausgeprägte Fähigkeit, T-Zellen zu stimulieren. Dies geschieht über die Ausbildung einer stabilen Verbindung, die auch als immunologische Synapse bezeichnet wird. Folgende molekulare Interaktionen sind in diesem Zusammenhang zwischen DC und T-Zelle von Bedeutung: Peptid-MHC / TCR, kostimulatorische Moleküle wie CD80 und CD86 / CD28, CD40 / CD40L, Adhäsionsmoleküle wie LFA-3 / CD2 sowie ICAM-1 / LFA-1 (LANZAVECCHIA und SALLUSTO, 2001). 2.3 T-Zellen Im peripheren Blut eines gesunden Menschen befinden sich ca. 70% T-Lymphozyten, 15% B-Lymphozyten und ungefähr 15% NK-Zellen. Der Anteil an CD3+CD4+ T-Zellen liegt im Mittel bei 44 (28-57) %. CD3+CD8+ T-Zellen stellen 24 (10-39) % der gesamten Lymphozytenpopulation dar (COMANS-BITTER et al., 1997). Beim Haustier existieren diesbezüglich deutliche individuelle Unterschiede. Zusammenfassend nehmen B-Zellen im Blut einen prozentualen Anteil von 40-80 % ein. Der Anteil an T-Zellen liegt je nach Tierart in einem Bereich von 31-89 %, wobei 8-49 % auf die CD3+CD4+ und 4-39 % auf die CD3+CD8+ Zellfraktion fallen (TIZARD, 2004). 10 Literaturübersicht T-Zellen tragen auf ihrer Oberfläche einen Rezeptor, der als T-Zellrezeptor (TCR) bezeichnet wird. Er besteht aus zwei membranständigen Polypeptidketten, der α- und der βKette (α:β-T-Zellen) bzw. γ- und δ-Kette (γ:δ T-Zellen). Jede Kette kann in zwei Immunglobulin-ähnliche Domänen, eine aminoterminale variable und eine konstante Region, eingeteilt werden. Die Antigenbindungsstelle wird von den variablen Regionen der beiden Ketten gebildet. Auf der Oberfläche der T-Zelle ist der α:β T-Zellrezeptor Teil eines Rezeptorkomplexes, der zusätzlich aus akzessorischen Molekülen besteht. Hierbei handelt es sich z.B. um die Korezeptoren CD4 oder CD8, die direkt mit den MHC-Klasse-I- bzw. -IIMolekülen interagieren. Die akzessorischen Ketten CD3δ, CD3ε und CD3ζ spielen eine wichtige Rolle bei der Induktion einer intrazellulären Signalkaskade (HUANG und WANGE, 2004). Entsprechend der von BRETSCHER und COHN (1970) eingeführten Hypothese benötigt eine naive T-Zelle zur Aktivierung zwei Signale. Signal 1 entsteht durch die Interaktion des TCR mit einem Peptid-MHC-Molekül. Signal 2, auch als kostimulatorisches Signal bezeichnet, stellt klassischerweise die Bindung von CD28 auf der T-Zelle an die kostimulatorischen Moleküle CD80 und CD86 auf den APCs dar (SHARPE und FREEMAN, 2002). Bleibt das zweite Signal aus, tritt die T-Zelle in den Zustand der Anergie über (APPLEMAN und BOUSSIOTIS, 2003). Bei einer adäquaten Stimulierung kommt es hingegen in der TZelle zu einer massiven Phosphorylierung intrazellulärer Tyrosinreste, woraus eine Aktivierung multipler Signalkaskaden resultiert. Dies führt wiederum zur Expression weiterer akzessorischer Moleküle auf ihrer Oberfläche, wie z.B. 4-1BB, CD40L, ICOS und OX40, die durch Bindung an 4-1BBL, CD40, LICOS bzw. OX40L auf den APCs zu einer Verstärkung der Immunreaktion führen können (CURTSINGER et al., 1999). Das Molekül CTLA-4 bindet an CD80 bzw. CD86 und stellt einen negativen Regulator der Signalkaskade dar. Erfolgreich aktivierte CD4+ und CD8+ T-Zellen expandieren, erhöhen die Expression an Aktivierungsmarkern wie CD69 und CD25 (α-Kette des IL-2-Rezeptors) und synthetisieren den autokrinen Wachstumsfaktor IL-2. Sie wandern in den inflammatorischen Bereich ein, um dort spezifische Effektorfunktionen auszuüben. Eine kleine Fraktion proliferierter TZellen entwickelt sich zu den so genannten Gedächtnis-T-Zellen. Zytotoxische T-Zellen binden spezifisch über ihren TCR an Peptid-MHC-Klasse-IKomplexe auf infizierten oder auch entarteten Zellen und zerstören diese mittels Induktion 11 Literaturübersicht von Apoptose. Dies kann durch die Expression von FasL auf ihrer Oberfläche erfolgen, der an Fas-Rezeptoren auf den Targetzellen bindet. Eine weitere Möglichkeit besteht in der Sekretion zytotoxischer Moleküle wie Perforin und Granzym, die eine Degradierung der DNA in den Zielzellen hervorrufen (SHRESTA et al., 1998). CD4+ T-Zellen üben in erster Linie Helferfunktionen aus und unterhalten somit die spezifische Immunantwort. Das Zytokinprofil, das durch aktivierte T-Zellen und durch Zellen in der direkten Umgebung der Entzündung gebildet wird, ist ausschlaggebend für die Art der Immunreaktion. Man unterscheidet eine TH1- von einer TH2-gerichteten Immunantwort. TH1-Zellen synthetisieren IL-2, IL-12, IFN-γ und TNF-β und sind direkt in eine T-Zellvermittelte Immunreaktion involviert, in deren Zusammenhang es zur Bildung von zytotoxischen T-Zellen kommt. Im Gegensatz dazu bilden TH2-Zellen IL-4, IL-5 und IL-10 und induzieren eine humorale, B-Zell-vermittelte Immunantwort. Durch die Bildung von IL-12 bzw. IL-10 üben beide Immunreaktionen einen negativen Einfluss aufeinander aus. Des Weiteren kann es durch regulatorische T-Zellen zur Hemmung von Effektor-T-Zellen kommen (REIS E SOUSA, 2001). γ:δ T-Zellen werden zum unspezifischen Immunsystem gerechnet und bilden einen Anteil von 1-5 % aller Lymphozyten im peripheren Blut gesunder Personen. Der überwiegende Teil an γ:δ T-Zellen setzt sich aus einer Subpopulation von Zellen zusammen, die den γ9:δ2 TCR exprimiert. Die Reaktivität von γ:δ T-Zellen ist meist nicht MHC-restringiert und richtet sich gegen ein breites Spektrum an Antigenen. Hierzu zählen lösliche Liganden, die nicht von Peptiden abstammen, wie z.B. Phosphoantigene, Aminobiphosphonate und Alkylamine, sowie aktivierte, viral infizierte oder maligne entartete Zellen (ESPINOSA et al., 2002). 2.4 Manipulation von antigenspezifischen T-Zellen in vitro Eine in vitro-Amplifikation von antigenspezifischen T-Zellen kann einerseits ihrer Detektion, Quantifizierung und / oder näheren Charakterisierung dienen. Andererseits kann sie durchgeführt werden, um Effektorzellen z.B. für den klinischen Einsatz in der adoptiven Immuntherapie zu generieren (2.6.2.2). 12 Literaturübersicht Es ist möglich, Immunzellen spezifisch oder unspezifisch zur Proliferation anzuregen. Unabhängig von der Art der Methode können als Ausgangsmaterial entweder gemischte Zellpopulationen oder zuvor aufgereinigte, spezifische T-Zellen eingesetzt werden. Für die Aufreinigung werden verschiedene Methoden angewandt, die die Vitalität der Zellen nicht beeinträchtigen dürfen. Eine Möglichkeit, lebende, antigenspezifische Zellen zu isolieren, besteht darin, sie mit dem gewünschten Antigen zu stimulieren. Die hierdurch hervorgerufene Hochregulierung von Aktivierungsmarkern, Sekretion von Zytokinen oder Degranulation kann dazu genutzt werden, antigenspezifische T-Zellen mittels funktioneller Assays zu detektieren. Eine andere Möglichkeit besteht in der Markierung spezifischer TEffektorzellen mit Hilfe von MHC-Multimeren. Die anschließende Sortierung der detektierten T-Zellen erfolgt in beiden Fällen mittels FACS oder magnetischer Zellseparation (MACS). Die Durchführung von Verdünnungsreihen (limiting dilution assay) kann ebenfalls dazu genutzt werden, spezifische Zellklone aus einer gemischten Zellpopulation zu isolieren. Hierbei werden die Zellen zunächst vereinzelt und durch gezielte Stimulation zur Proliferation angeregt. Angewachsene Zellklone können anschließend isoliert werden. 2.4.1 Antigenunabhängige Amplifikation von T-Zellen Durch Zugabe mitogener Substanzen wie z.B. Phythämagglutinin (PHA) oder Concanavalin A zur Zellkultur kann eine Vernetzung von Glykoproteinen an der Zelloberfläche und somit eine polyklonale, antigenunabhängige Aktivierung von Leukozyten induziert werden. Eine weitere Möglichkeit, T-Zellen unspezifisch zu stimulieren, besteht in der Verwendung von Antikörpern, die gegen das T-Zellrezeptorkomplex-Molekül CD3 gerichtet sind. Sie werden häufig in Kombination mit Antikörpern eingesetzt, die an kostimulatorische Antigene, wie z.B. CD28, binden. Die Antikörper können sowohl in löslicher Form (RIDDELL und GREENBERG, 1990) als auch gebunden an feste Substrate wie Zellkulturplatten, Mikrosphären oder Zellen eingesetzt werden, um eine optimale Quervernetzung der Zielstrukturen auf den Lymphozyten zu bewirken. Durch den Einsatz von hochdosiertem IL-2 in Kombination mit Anti-CD3-Antikörpern sowie feeder-Zellen (sog. „rapid expansion protocol“) konnte eine ausreichende Anzahl an tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TILs) für den klinischen Einsatz gewonnen werden (DUDLEY et al., 2002). LEVINE et al. (1998) erzielten eine unspezifische Expansion von TIL-Kulturen und MHC-Tetramer-aufgereinigten T- 13 Literaturübersicht Lymphozyten durch Bindung muriner Anti-CD3- und Anti-CD28-Immunglobuline an magnetische Partikel (Beads). Die Proliferation war jedoch primär auf CD4+ T-Zellen begrenzt, wohingegen CD8+ T-Zellen nur eingeschränkt expandierten und zudem nach zweiwöchiger Kultur bis zu 90 % ihrer Spezifität einbüßten (OELKE et al., 2003). GARLIE et al. (1999) berichteten von einer Anreicherung von sowohl CD4+ als auch CD8+ T-Zellen nach Stimulation mit Antikörper-beladenen Beads. In den Arbeiten von THOMAS et al. (2002) wurde anstelle von Beads die MHC-Klasse-Inegative Tumorzelllinie K562 eingesetzt. Durch Kopplung von Anti-CD28- und Anti-CD3Antikörpern an den Fcγ-Rezeptor CD32, mit dem die Zellen zuvor transduziert wurden, konnte eine rapide und langanhaltende Expansion von CD4+ T-Zellen erreicht werden. Durch zusätzliche Expression des kostimulatorischen Moleküls 4-1BBL an der Zelloberfläche war ebenfalls eine Amplifikation zuvor aufgereinigter, antigenspezifischer CTLs möglich (MAUS et al., 2002). YAN et al. (2004) transfizierten humane K562- sowie murine Yac1-Zellen mit CD32 und 4-1BBL und konnten nach Beladung dieser Zellen mit Anti-MausCD3- und Anti-Maus-CD28-Antikörpern murine CD8+ T-Zellen unspezifisch zur Proliferation anregen. 2.4.2 Antigenspezifische Expansion von T-Zellen Für den Erfolg einer adoptiven Immuntherapie spielt die Antigenspezifität transferierter TZellen eine entscheidende Rolle. In vivo wird eine Aktivierung naiver T-Zellen hervorgerufen, indem der T-Zellrezeptor spezifisch an einen Peptid-MHC-Komplex auf der Oberfläche von professionellen APCs bindet. Um eine Proliferation antigenspezifischer T-Zellen in vitro zu erreichen, muss dieser in vivo ablaufende Prozess möglichst gut nachgeahmt werden. Hierfür bietet sich der Einsatz von DCs an. Sie können direkt aus dem Blut isoliert oder aus autologen Monozyten durch Inkubation mit spezifischen Zytokinen, wie IL-4 und GM-CSF, generiert werden (so genannte MoDCs). Nach Reifung und Beladung mit dem gewünschten Peptid können sie Effektor-T-Zellen spezifisch zur Expansion anregen (BANCHEREAU und STEINMAN, 1998; MACKENSEN et al., 2000; OELKE et al., 2000; SANTIN et al., 2002; KASS et al., 2003; MEIDENBAUER et al., 2003). Eine weitere Möglichkeit besteht im Einsatz autologer, aktivierter bzw. virustransduzierter B-Zellen (SCHULTZE et al., 1997; SUN et al., 2000; HOOGENDOORN et al., 2004) oder 14 Literaturübersicht in der Verwendung autologer T-Zellen. Letztere werden zwar nicht zu den professionellen APCs gezählt, sie weisen aber einige kostimulatorische Moleküle an ihrer Oberfläche auf (GAGLIARDI et al., 1995). Werden für die Gewinnung peptidspezifischer T-Zellen als Ausgangsmaterial PBMCs eingesetzt, kann ebenfalls durch direkte Zugabe von Peptiden oder Proteinen eine gezielte Stimulation und Expansion erreicht werden (MANNERING et al., 1998; NOLTE et al., 2003). Für die hierbei erzielte Aktivierung antigenspezifischer T-Zellen scheinen DCs verantwortlich zu sein, die in geringen Mengen in den PBMCs enthalten sind. Zusätzlich wird von einer Beteiligung „fakultativer“ APCs, wie B-Zellen oder Monozyten, ausgegangen (MANNERING et al., 1998). 2.4.3 Expansion antigenspezifischer T-Zellen mit aAPCs Die unter 2.4.2 beschriebene Verwendung autologer APCs ist jedoch mit einigen Nachteilen verbunden. So können DCs nur in einem extrem kosten- und zeitintensiven sowie schwer zu standardisierenden Verfahren aus Vorläuferzellen hergestellt werden (OELKE et al., 2005b). Für ihre Generierung wird eine große Blutmenge benötigt, die bei schwer erkrankten Personen häufig nicht zur Verfügung steht. Ein weiterer Nachteil besteht darin, dass die Anzahl und Qualität der in vitro generierten DCs infolge vorangegangener Therapien mit Chemotherapeutika und Immunsuppressiva hoch variabel ist. Zudem konnte eine Beeinträchtigung der Funktionalität dieser Zellen allein aufgrund der Krebserkrankung festgestellt werden (GABRILOVICH, 2004; ORMANDY et al., 2006). Schließlich muss noch erwähnt werden, dass APCs permanent endogen prozessierte Proteine über MHCKlasse-I-Moleküle an ihrer Oberfläche präsentieren. Dies birgt die Gefahr, dass nicht nur T-Zellen mit der gewünschten Spezifität, sondern auch autoreaktive CTLs in vitro generiert werden (OELKE et al., 2005b). Für eine Expansion autologer, antigenspezifischer T-Zellen im klinischen Maßstab sind DCs aus den oben genannten Gründen nur eingeschränkt nutzbar. Als Alternative wurden so genannte künstliche antigenpräsentierende Zellen (aAPCs) entwickelt. Sie sollen die Eigenschaften der DCs bzgl. Antigenprozessierung und -präsentation möglichst gut imitieren, um eine hohe Anzahl funktionsfähiger T-Zellen innerhalb kürzester Zeit zu generieren. Im Gegensatz zu autologen DCs sollte ihre Herstellung und Anwendung kostengünstig, reproduzierbar und anpassungsfähig sein. Optimal wären „ready-to-use“ aAPCs, die bei 15 Literaturübersicht jedem Patienten eingesetzt werden können und zu einer selektiven Expansion spezifischer und therapeutisch potenter T-Zellen führen (KIM et al., 2004). Weiterhin wäre von Vorteil, wenn sie die für den klinischen Einsatz erforderlichen GMP-Richtlinien (good manufacturing practices) erfüllen würden. Mit aAPCs können T-Zellen einerseits antigenunspezifisch expandiert werden. So wurden Antikörper-beladene Beads oder transfizierte K562-Zellen für die Vermehrung von CD4+ bzw. CD8+ T-Zellen in vitro eingesetzt (2.4.1). Andererseits kann durch gezielte Modifikation der Substrate ebenfalls eine antigenspezifische Expansion von Effektorzellen erreicht werden. Je nach verwendetem System können zellbasierte von azellulären aAPCs unterschieden werden. Zelluläre Techniken wurden auf der Basis von Insektenzellen, Mausfibroblasten und humanen leukämischen Zelllinien (K562-Zellen) entwickelt. Ausgehend von der von SUN et al. (1996) abstammenden Idee, Insektenzellen als aAPCs zu verwenden, transfizierten MITCHELL et al. (2002) eine aus dem Insekt Drosophila melanogaster abstammende Zelllinie mit den Molekülen CD80, ICAM-1 und HLA-A2 und überprüften deren Funktionalität nach exogener Beladung mit dem Tumorantigen Tyrosinase. Sie konnten eine Expansion antigenspezifischer CTLs beobachten, die jedoch abhängig von der Anwesenheit zusätzlicher, autologer PBMCs war. Mausfibroblasten konnten ebenfalls in potente aAPCs umgewandelt werden, indem sie mit den drei kostimulatorischen Molekülen CD80, ICAM-1 und LFA-3 transduziert wurden. Die Expression von viralen Peptiden (Influenza Matrixprotein) oder Tumorantigenen (MART-1, gp100) erfolgte nach intrazellulärer Beladung über HLA-A2-Moleküle (LATOUCHE und SADELAIN, 2000). Die Mausfibroblasten waren außerdem in der Lage, Proteine, wie z.B. das CMV-Protein pp65, intrazellulär zu prozessieren und an ihrer Oberfläche über HLA-A2 zu präsentieren. Mit diesen aAPCs konnte eine rapide Expansion CMV-spezifischer T-Zellen erzielt werden (PAPANICOLAOU et al., 2003). Ausgehend von der Idee, synthetische Oberflächen mit bestimmten Molekülen zu beladen und anschließend als künstliche APCs einzusetzen (GOLDSTEIN und MESCHER, 1986), wurden verschiedene, azelluläre Technologien entwickelt, um T-Zellen in vitro zur Expansion anzuregen. Unter anderem handelt es sich hierbei um Beads, Vesikel und Exosomen. Eine Bead-basierte Methode wurde von THAM et al. (2001) veröffentlicht. Sie koppelten die kostimulatorischen Moleküle CD80 und CD86 zusammen mit einem murinen MHC- 16 Literaturübersicht Klasse-I-single chain-Konstrukt an die Oberfläche von Latex-Mikrosphären. Nach Bindung des Peptids Ovalbumin (OVA) wurde in einem transgenen Mausmodell gezeigt, dass diese aAPCs in der Lage sind, OVA-spezifische T-Zellen zu stimulieren. Die von OELKE et al. (2003) entwickelten aAPCs wiesen als Grundgerüst magnetische Partikel auf, an die, neben Anti-CD28-Antikörpern, MHC-Klasse-I-Immunglobulin-FusionsMoleküle (HLA-A2-Ig) gebunden wurden. Mit diesen Partikeln war es möglich, nach externer Beladung mit Peptiden, CD8+ T-Zellen zu amplifizieren. Die generierten CTLs wiesen eine hohe Spezifität gegenüber den klinisch relevanten Peptiden CMVpp65 und MART-1 auf. Verglichen mit Anti-CD3 / Anti-CD28-beladenen Beads, die in der Lage waren, zuvor isolierte, antigenspezifische CTLs zu expandieren, besaßen diese peptidbeladenen Beads eine größere stimulatorische Kapazität (OELKE et al., 2005b). WALTER et al. (2003) koppelten rekombinante MHC-Moleküle zusammen mit Anti-CD28Ig biochemisch an Mikrosphären und konnten durch genaue Kontrolle der MHC-Dichte antigenspezifische CTLs mit unterschiedlich hoher Avidität erzeugen. Die Idee, Liposomen oder Exosomen als aAPCs zu benutzen, geht auf die Beobachtung zurück, dass eine flexible biologische Zellmembran für die Ausbildung einer immunologischen Synapse essentiell ist (KIM et al., 2004). PRAKKEN et al. (2000) integrierten MHCKlasse-II-Moleküle in aus Cholesterol und Phospholipiden bestehende Liposome. Durch Bindung relevanter Peptide konnten antigenspezifische, murine CD4+ T-Zellen zur Proliferation angeregt werden. Exosomen sind von Zellen abstammende Vesikel, die nach der Fusion von Endosomen mit der Zellmembran freigesetzt werden. Je nach Ursprungszelle können sie MHC-KlasseI- und / oder -Klasse-II- sowie kostimulatorische Moleküle enthalten. Eine Stimulation von T-Zellen durch exogene Beladung aufgereinigter Exosomen mit Peptiden konnte gezeigt werden (HWANG et al., 2003; CHAPUT et al., 2005). Mittels aAPCs generierte T-Zellen wurden bereits in einigen klinischen Studien eingesetzt (KIM et al., 2004). 17 Literaturübersicht 2.5 Nachweis von antigenspezifischen T-Zellen T-Zellen, denen das Antigen über MHC-Komplexe präsentiert wird, werden spezifisch aktiviert und reagieren mit einer messbaren T-Zellantwort. Diese äußert sich in Form von Expression bestimmter Aktivierungsmarker auf der Zelloberfläche, Synthese von Zytokinen, Proliferation, Degranulation, Zytotoxizität und / oder trogocytosis (siehe unten) und kann mittels funktioneller Testverfahren erfasst werden. Hierzu gehört der Nachweis der Aktivierungsmarker CD25, CD69 sowie, im Fall humaner Lymphozyten, HLA-DR mittels Immunfluoreszenz. Synthetisierte Zytokine, wie z.B. IFN-γ, können quantitativ mittels SandwichELISA oder auf mRNA-Ebene mittels real time PCR nachgewiesen werden. Methoden, um die von antigenspezifischen T-Zellen sezernierten Proteine nach Antigenkontakt auf Einzelzellebene zu detektieren, sind der ELISPOT (enzyme-linked immunospot)-Assay, der intrazelluläre Zytokin-Assay sowie der capture assay. Die Zellproliferation stellt ebenfalls einen sehr wichtigen in vitro-Parameter für die in vivoFunktionalität zytotoxischer T-Zellen dar. Ihre Bestimmung kann unter anderem mit Hilfe eines Thymidin- oder CFSE-Assays erfolgen. Zur Untersuchung der zytotoxischen Aktivität generierter Effektor-T-Zellen eignet sich der 51 Chromium-Freisetzungsversuch (51Cr release assay). Weiterhin kann die Degranulation antigenspezifischer CTLs als Parameter zur Bestimmung ihrer Funktionalität dienen. Freigesetztes Perforin oder Granzym sowie an der Oberfläche exprimierte Proteine wie CD107a/b können mittels Durchflusszytometrie detektiert werden. Bei dem als trogocytosis bezeichneten Phänomen findet ein Transfer von Membranbestandteilen der APC auf die T-Zelle statt. Durch Kopplung von GFP an die HLA-Moleküle der Targetzelle können somit antigenspezifische T-Zellen erkannt werden (TOMARU et al., 2003). Zur reinen Bestimmung der Antigenspezifität von Effektor-T-Zellen finden multimere MHCPeptid-Moleküle Anwendung. Hierzu gehören z.B. MHC-Tetramere, die antigenspezifische CTLs mit hoher Affinität binden können. 18 Literaturübersicht 2.6 Tumorimmunologie In der westlichen Welt stellen Tumoren nach Erkrankungen des Herzkreislaufsystems beim Menschen die Haupttodesursache dar. Auch in der Veterinärmedizin hat die Onkologie aufgrund der erhöhten Lebenserwartung der in der Obhut des Menschen lebenden Haustiere zunehmend an Bedeutung gewonnen. Die Ätiologie der Krebserkrankungen ist vielfältiger Natur. So spielen neben exogenen Faktoren wie chemische, physikalische und infektiöse (virale) Noxen auch endogene Faktoren wie z.B. Alter, Geschlecht sowie familiäre Disposition eine entscheidene Rolle. Die klassischen Behandlungsmethoden sind Chemotherapie, Bestrahlung und chirurgische Entfernung der Geschwulst. Ein großer Nachteil dieser Therapien besteht darin, dass sie mit extremen Nebenwirkungen verbunden sind. Weiterhin ist der Behandlungserfolg in vielen Fällen nur unzureichend. Aufgrund dieser Problematiken wird nach neuen Strategien gesucht, Tumoren zu bekämpfen. Große Hoffnung wird dabei auf die Tumorimmunologie gesetzt. Sie befasst sich mit der Erforschung von Immunreaktionen gegen Malignome. Ihr Ursprung geht auf den Chirurgen WILHELM COLEY zurück, der im späten 19. Jahrhundert feststellte, dass die Stimulation des Immunsystems mit pyogenen Bakterien zu einer Regression von Tumoren führen kann (COLEY, 1893). PAUL EHRLICH stellte als Erster die Vermutung auf, dass das Immunsystem den Wirt vor der Entstehung von Neoplasien schützen kann. Diese Vorstellung wurde mehr als 50 Jahre später formal als Immunüberwachungs-Hypothese bezeichnet (THOMAS, 1959; BURNET, 1970). Sie beinhaltet, dass Krebserkrankungen mit einer ähnlichen Häufigkeit wie Infektionen mit pathogenen Erregern auftreten und dass das Immunsystem diese entarteten Zellen aufgrund der Expression von tumorassoziierten Antigenen erkennen und eliminieren kann. Trotz anfänglich starker Debatten unterstützen Ergebnisse neuerer Studien mehr und mehr die Ansicht von THOMAS und BURNET, dass das Immunsystem eine wichtige Rolle bei der Kontrolle maligner Erkrankungen spielt (SHANKARAN et al., 2001b; DUNN et al., 2002; DARNELL und POSNER, 2003). So konnten vereinzelt spontane Regressionen von Tumoren in immunkompetenten Individuen beobachtet werden. Immunkompromitierte Organismen wiesen hingegen eine erhöhte Inzidenz an Krebserkrankungen auf. Weiterhin konnten in experimentellen Mausmodellen Immunreaktionen gegen Tumoren demonstriert werden. Beispielsweise ist die Empfänglichkeit von Mäusen mit definierten immunologischen Defekten gegenüber spontanen oder 19 Literaturübersicht induzierten Tumoren deutlich erhöht. Werden solche Tumorzellen in normale Tiere (Wildtyp-Mäuse) transplantiert, kommt es in der Regel zu ihrer Abstoßung (SHANKARAN et al., 2001a). Die gegen die Immunüberwachungs-Hypothese sprechende Tatsache, dass Nacktmäuse, die ein defizientes adaptives Immunsystem aufweisen, keine erhöhte Tumorinzidenz aufweisen (STUTMAN, 1974), konnte inzwischen durch das Vorhandensein IFNγ-produzierender Zellen des angeborenen Immunsystems, wie z.B. NK-Zellen, in diesen Tieren erklärt werden (DUNN et al., 2004). ZHANG et al. (2003) stellten fest, dass eine Akkumulation von Immunzellen im Bereich des Tumors mit einer verbesserten Prognose für den Patienten korreliert. Schließlich konnten durch verbesserte Technologien Immunreaktionen gegen Tumoren direkt am Patienten nachgewiesen werden. Zusammenfassend sprechen zahlreiche bisherige Untersuchungen dafür, dass die Tumorentwicklung durch Komponenten des Immunsystems kontrolliert oder wenigstens beeinflusst werden kann. Die Induktion einer tumorspezifischen Immunantwort resultiert aus dem komplexen Zusammenspiel von APCs, CTLs, T-Helferzellen, Antikörper-produzierenden B-Zellen und Effektorzellen des angeborenen Immunsystems wie NK-Zellen, NKT und γ:δ T-Zellen, die transformierte Zellen erkennen und zerstören können (SMYTH et al., 2001). T-Zellen wird hierbei eine dominierende Rolle zugesprochen. So konnte gezeigt werden, dass ein Großteil aller humanen Tumoren von TILs infiltriert wird. 2.6.1 Tumorantigene Arbeiten von PREHN und MAIN Ende der 50er Jahre schufen die Grundlage für die Hoffnung, T-Zellen im Kampf gegen Tumoren einsetzen zu können. Sie zeigten, dass Malignome spezifisch von CD8+ T-Zellen abgestoßen werden können, indem sie Tumorzellen, die aus Mäusen mit chemisch induzierten Karzinomen isolierte wurden, subkutan in syngene Tiere transplantierten. In Rezipienten kam es zum Auswachsen des Transplantationstumors, während er im Donor abgestoßen wurde. Wurden jedoch vor Injektion der Tumorzellen CD8+ T-Zellen der Donormäuse in die syngenen Tiere transferiert, kam es zur Abstoßung der Tumorzellen. Diese Protektion war tumorspezifisch (PREHN und MAIN, 1957). Daraus resultierend wurde vermutet, dass Tumoren Antigene exprimieren, die von tumorspezifischen T-Zellen erkannt werden können. Diese Antigene wurden als Tumoran- 20 Literaturübersicht tigene bezeichnet. Sie werden sowohl von den Tumorzellen selbst als auch von spezialisierten, antigenpräsentierenden Zellen präsentiert. Welche Antigene T-Zellen auf Tumoren erkennen, wurde erst Anfang der 90er Jahre entdeckt (PARDOLL, 1994; TSOMIDES und EISEN, 1994; BOON et al., 1995; VAN DEN EYNDE und VAN DER BRUGGEN, 1997). Ihre Identifizierung erfolgte zumeist entweder mit der biochemischen oder der genetischen Methode. Grundlage hierfür waren tumorspezifische T-Zellklone, die als sensitives Detektionsmittel dienten. Sie wurden generiert, indem T-Zellen aus Blut, Lymphknoten oder Tumoren isoliert und mit Tumorzellen desselben Patienten kokultiviert wurden. Beim biochemischen Ansatz (COX et al., 1994) wird durch Säurebehandlung eine Elution der Peptide vom MHC-Klasse-I-Molekül der Tumorzellen bewirkt und der Peptid-Pool nach Fraktionierung mittels HPLC auf Zielzellen geladen, die ein passendes MHC-Molekül tragen. Durch den anschließenden Einsatz von tumorspezifischen T-Zellklonen kann überprüft werden, ob die Zielzellen durch die Peptidbeladung sensitiv für eine Lyse geworden sind. Die AS-Sequenz kann anschließend durch Massenspektroskopie festgestellt werden. Die genetische Methode (BOON et al., 1989; VAN DER BRUGGEN et al., 1991) beruht auf der Herstellung einer cDNA-Bibliothek von einer Tumorzelle. Die cDNA-Pools werden nachfolgend in Zielzellen eingebracht, die die entsprechenden MHC-Allele exprimieren. Eine Lyse der Transfektanten durch in vitro generierte, autologe CTLs kann nach Subfraktionierung zur Isolierung einer einzelnen cDNA führen. Eine alternative Technik zur Identifizierung von Tumorantigenen stellt die serologische Analyse von rekombinanten cDNA-Expressionsbibliotheken mit autologen Antikörpern (SEREX) dar (SAHIN et al., 1995). Ein Tumorantigen, das auf diese Weise identifiziert werden konnte, ist das zuerst beim Oesophaguskarzinom entdeckte Antigen NY-ESO-1 (CHEN et al., 1997b; GRETEN und JAFFEE, 1999). Eine Analyse des Genprofils überexprimierter DNA-Produkte in neoplastischen Zellen durch Microarray-basierte Studien ist eine weitere Möglichkeit zur Identifikation potentieller Zielantigene in Tumoren unterschiedlichen Ursprungs (MOHR et al., 2002). Tumorantigene können grob in zwei Klassen unterteilt werden. Zur ersten Klasse werden Antigene gerechnet, die selektiv auf Tumorzellen, nicht jedoch auf normalen, somatischen Zellen exprimiert werden. Sie sind streng tumorspezifisch und werden in mutierte Antigene sowie von Viren abstammende Antigene eingeteilt. Erstere gehen aus Punktmutationen 21 Literaturübersicht oder Gen-Umordnungen hervor, die häufig mit dem Prozess der Onkogenese einhergehen. Bei den mutierten Genen kann es sich um Onkogene, Tumorsuppressorgene oder Gene handeln, deren Produkte keinen Einfluss auf die Tumorentstehung haben. Ein typisches Beispiel hierfür sind Mutationen im Tumorsuppressorgen p53, die in 60-80 % aller humanen Tumoren vorkommen (GREENBLATT et al., 1994). Von onkogenen Viren abstammende Produkte stellen, ähnlich wie mutierte Antigene, fremde Antigene dar, gegen die keine Toleranzinduktion stattgefunden hat. Sie sind in der Lage, T-Zellantworten zu induzieren und bilden somit eine sehr immunogene Gruppe an Tumorantigenen (DE VISSER et al., 2003). Die Onkoproteine E6 und E7 des humanen Papillomavirus 16 sowie EBNA-1 des Epstein-Barr-Virus stellen klassische Vertreter dar. Ein tumorspezifisches Antigen der Katze, das nach einer Infektion mit dem Felinen Leukämievirus (FeLV) an der Oberfläche von Tumorzellen nachgewiesen werden kann, ist das FOCMA-Antigen (Felines Oncornavirus-assoziiertes Membran-Antigen) (ESSEX et al., 1979). Bei Hühnervögeln geht eine Infektion mit dem Gallinen Herpesvirus 2 mit einer Expression tumorassoziierter Antigene (,,Marek disease tumorassociated surface antigens") einher (MURTHY und CALNEK, 1979). Die zweite Klasse von Tumorantigenen setzt sich aus Antigenen nicht-mutierter Strukturgene zusammen, die der zentralen oder peripheren Toleranzinduktion unterworfen sein können. Hierzu werden unter anderem Differenzierungsantigene, onkofetale Antigene sowie tumorassoziierte Tumor / Testis-Antigene gerechnet. Differenzierungsantigene sind gewebsspezifisch, das heißt, dass sie nur in besonderen Gewebstypen und in aus ihnen hervorgehenden Tumorzellen exprimiert werden. Gut charakterisierte Beispiele für Differenzierungsantigene sind Tyrosinase, gp100 und MART-1 / Melan-A. Sie sind sowohl in Melanozyten als auch in Melanomzellen vorhanden (BOON et al., 1995). Aufgrund ihrer nur schwachen Expression auf gesunden Zellen und einer damit verbundenen, ausbleibenden Toleranzinduktion stellen sie interessante Zielstrukturen für Therapien dar. Onkofetale Antigene wurden erstmals von GOLD und FREEDMAN (1965) beschrieben. Es handelt sich um Proteine, die normalerweise nur von fetalen Zellen gebildet werden. Aufgrund einer Rückdifferenzierung während der Transformation kann es zu einer erneuten Expression durch Tumorzellen kommen. Die bekanntesten Vertreter dieser Gruppe sind 22 Literaturübersicht das α-Fetoprotein (AFP) und das carcinoembryonale Antigen (CEA). AFP ist ein Glykoprotein, das primär von der fetalen Leber synthetisiert wird. Normalerweise fällt seine Serumkonzentration kurz nach der Geburt rapide ab (BECKER et al., 1977). Im Fall einiger Tumorerkrankungen kann es jedoch zu einem starken Anstieg des Serumspielgels kommen. So wurde festgestellt, dass die Mehrzahl aller am hepatozellulären Karzinom (HCC) erkrankten Personen dieses onkofetale Antigen überexprimieren (VOLLMER, Jr. et al., 1999). Aus diesem Grund kann AFP als diagnostisches Hilfsmittel bei tumorösen Entartungen z.B. der Leber eingesetzt werden (KIRKWOOD et al., 1994). Beim Hund konnte ebenfalls ein erhöhter Serumlevel an AFP und CEA bei tumorösen Entartungen der Leber beschrieben werden (LOWSETH et al., 1991; MARTIN DE LAS et al., 1995; KITAO et al., 2006). Die eigentliche Funktion von AFP ist nicht bekannt. Aufgrund seiner Eigenschaft, Fettsäuren, Steroide und Schwermetalle zu binden, wird allerdings vermutet, dass es eine Rolle beim Transport von Serumkomponenten spielt (RUOSLAHTI und SEPPALA, 1979; MIZEJEWSKI, 1995; CHEN et al., 1997a). AFP könnte auch eine immunsuppressive Rolle während der fötalen Entwicklung spielen (SHEPPARD, Jr. et al., 1977). Tumorassoziierte Tumor / Testis-Antigene werden im Gegensatz zu onkofetalen Antigenen nicht zur falschen Zeit, sondern am falschen Ort exprimiert. Es handelt sich um Proteine, die in zahlreichen Tumoren und in den Testis, jedoch nicht im normalen Gewebe vorkommen. Der Grund für die Expression von Hoden-spezifischen Genen in Tumoren könnte in einer Demethylierung der Promotorregion dieser Gene liegen, die als zufälliges Ereignis sowohl in männlichen Keimzellen als auch in fortgeschrittenen Malignomen vorkommt (DEL MAZO et al., 1994; DE SMET et al., 1996). Zu dieser Gruppe von Tumorantigenen gehören beispielsweise die Melanom-Antigene (MAGE), BAGE und GAGE (DE PLAEN et al., 1994). Ein anderes Beispiel ist NY-ESO-1, ein Tumorantigen, das mittels SEREX von CHEN et al. (1997b) in einem Patienten mit einem Oesophaguskarzinom identifiziert wurde. NY-ESO-1 scheint eine Rolle bei der Regulation der Zellproliferation zu spielen. Eine Expression dieses Proteins wurde in 34 % aller Melanome, 30 % aller Mammakarzinome, in 25 % aller Prostatakarzinome und in fast 80 % aller Blasenkarzinome beschrieben (CHEN et al., 1997b). WANG et al. (1998) konnten 2 HLA-A31-restringierte Epitope nachweisen. Von JAGER et al. (1998) wurden 3 HLAA2-restringierte Epitope beschrieben. Eine NY-ESO-1-spezifische, spontane humorale und 23 Literaturübersicht zelluläre Immunantwort konnte in einer Vielzahl von Patienten mit fortgeschrittenem NYESO-1-exprimierenden Karzinom detektiert werden (KORANGY et al., 2004; KARBACH et al., 2006). Da tumorassoziierte Tumor / Testis-Antigene in vielen Tumoren vorkommen und mit Ausnahme der Hoden nicht in normalen Geweben exprimiert werden, eignen sie sich gut für eine Immuntherapie. Die Expression im Testis kann als nicht so problematisch angesehen werden, da ein direkter Kontakt zwischen Immunzellen und testikulären Zellen nicht stattfindet (BARKER und BILLINGHAM, 1977) und die Keimzellen zudem MHCKlasse-I-negativ sind (TOMITA et al., 1993). Zu den Antigenen nicht-mutierter Strukturgene zählen weiterhin Glykolipide und Glykoproteine, die aufgrund einer gestörten, tumorspezifischen posttranskriptionalen Modifikation veränderte Zuckerstrukturen tragen oder Proteinbestandteile abnormal exponieren. Diese Moleküle können als Antigene fungieren. Ein Beispiel ist das fehlerhaft glykosylierte Protein MUC-1, das in zahlreichen Tumoren vorkommt (GIRLING et al., 1989; FINN et al., 1995). 2.6.2 Immuntherapie von Tumorerkrankungen Bei der Immuntherapie wird die Fähigkeit des Immunsystems ausgenutzt, entartete Zellen zu erkennen und gezielt zu eliminieren. Sie beinhaltet eine aktive Beteiligung verschiedener Zellpopulationen. So kann z.B. die Aktivierung von CD4+ und CD8+ T-Zellen eine Zerstörung infizierter oder entarteter Zellen induzieren. Wie in Abb. 2 verdeutlicht wird, können Zellen des angeborenen oder erworbenen Immunsystems einerseits in vivo antigenspezifisch stimuliert und amplifiziert werden. Andererseits ist eine Expansion antigenspezifischer Lymphozyten ebenfalls in vitro möglich (adoptive Immuntherapie). In beiden Fällen ist eine korrekte Aktivierung, Expansion und Differenzierung der Effektorzellen Voraussetzung für die Etablierung einer erfolgreichen Immunreaktion. 24 Literaturübersicht Adoptive Immuntherapie Aktive Immunisierung Inaktivierte Tumozellen Transfizierte (GM-CSF) Tumozellen Peptidepitope (CD4+,CD8+) Protein RNA DNA Virale Vektoren Bakterielle Vektoren CD4+ TH CD8+ CTL Antigen Chemokine IL-15 IL-2 genetische Manipulation Adjuvantien Blockierung von CTLA-4 Blockierung von B7x Chemokine Depletion von Treg PBMCs Nichtmyeloablative / Myeloablative Therapie Abb. 2: Immuntherapie von Tumorerkrankungen. Die Immuntherapie kann in die Bereiche adoptive Immuntherapie und aktive Immunisierung eingeteilt werden. Die adoptive Immuntherapie beinhaltet eine gezielte Modifikation und Expansion antigenspezifischer T-Zellen in vitro und ihre Infusion zurück in den Patienten. Bei der aktiven Immunisierung (Vakzination) sowie anderen immuntherapeutischen Verfahren wird hingegen durch Applikation verschiedener Substanzen versucht, Zellen der angeborenen oder erworbenen Abwehr in vivo zu manipulieren. (Modifiziert nach PURE et al., 2005). 2.6.2.1 Aktive Immunisierung und andere immuntherapeutische Verfahren In den vergangenen Jahren wurden verschiedene Vakzinationsstrategien entwickelt, die darauf abzielen, Zellen des Immunsystems in vivo zu aktivieren (Abb. 2, rechts). Eine Möglichkeit der aktiven Immunisierung besteht in der Applikation inaktivierter Tumorzellen zusammen mit verschiedenen Adjuvantien (MITCHELL, 2002). Durch Transfektion der autologen Tumorzellen mit verschiedenen Gene, die für proinflammatorische Zytokine oder kostimulatorische Moleküle kodieren, kann ihre Immunogenität weiterhin erhöht werden (CHEN et al., 1992; DRANOFF et al., 1993; JAFFEE et al., 2001). Die Identifikation von Tumorantigenen schuf die Basis für peptidbasierte Vakzinationsstrategien. Eine zusätzliche, hochdosierte Applikation von IL-2 führte zu Immunreaktionen gegen Tumoren in Melanompatienten (ROSENBERG et al., 1998). Andere Gruppen steigerten die Immunogenität der Peptide durch parallele Injektion von kostimulatorischen Mole- 25 Literaturübersicht külen und Zytokinen (SCHAED et al., 2002). Neben Peptiden können auch Proteine, RNA, DNA oder mikrobielle Vektoren appliziert werden. In DC-basierten Immunisierungen wird die Eigenschaft professioneller APCs ausgenutzt, naive T-Zellen zu stimulieren (SCHULER et al., 2003). Durch Beladung dieser Zellen mit Peptiden, Proteinen oder Tumorzellextrakten (PAGLIA et al., 1996; ZITVOGEL et al., 1996; ASHLEY et al., 1997), Fusion mit ganzen Tumorzellen (GONG et al., 1997) oder Transfektion mit Tumorzell-mRNA (SPECHT et al., 1997) konnten zytotoxische Immunreaktionen hervorgerufen werden. Einige klinische Studien wiesen recht viel versprechende Resultate auf (NESTLE et al., 1998; MACKENSEN et al., 2000; SADANAGA et al., 2001; SCHULER-THURNER et al., 2002; BANCHEREAU und PALUCKA, 2005). Eine weitere Strategie besteht in der Blockade von Oberflächenmolekülen wie z.B. CTLA4 oder B7x, die einen negativen Einfluss auf die Entstehung einer effektiven T-Zellantwort ausüben (PURE et al., 2005). Zellen des unspezifischen Immunsystems können durch Bindung verschiedener Strukturen, wie z.B. unmethylierte bakterielle DNA, aktiviert werden (SPORRI und REIS E SOUSA, 2003). Klinisch wurde von einer solchen Immuntherapie bei Melanompatienten berichtet (VAN OJIK et al., 2002). Ebenfalls klinisch erprobt wurden Hitzeschockproteine (HSPs), die zusammen mit gebundenen Antigenen von APCs phagozytiert werden und die Entstehung einer zytotoxischen T-Zellantwort fördern können (PARMIANI et al., 2004). Die NK-Zell-vermittelte Tumorerkennung und -elimination stellt ein Beispiel für weitere immunmodulatorische Verfahren dar. Schließlich wird in neueren Studien versucht, über eine Blockade der immunsuppressiven Aktivität von regulatorischen T-Zellen eine effektive Tumorimmunität zu induzieren (PURE et al., 2005). Unreife myeloide Vorläuferzellen, die in verschiedenen murinen und humanen Tumoren nachgewiesen werden konnten und einen negativen Einfluss auf die Entstehung einer TZell-vermittelten Immunantwort haben, werden als so genannte myeloide Suppressorzellen bezeichnet. Eine Hemmung, Ausreifung oder Deletion dieser Zellen in Krebspatienten könnte ebenfalls eine neue immuntherapeutische Strategie darstellen (KUSMARTSEV und GABRILOVICH, 2006). 26 Literaturübersicht 2.6.2.2 Adoptiver T-Zelltransfer Die ebenfalls in Abb. 2 schematisch dargestellte adoptive Immuntherapie stellt eine sehr attraktive und elegante Strategie dar, eine Vielzahl lebensbedrohlicher Krankheiten zu behandeln. Sie beinhaltet die antigenspezifische Stimulation, Aktivierung und Expansion autologer T-Zellen ex vivo und ihre anschließende Infusion zurück in den Patienten (DUDLEY und ROSENBERG, 2003). Für einen erfolgreichen adoptiven Transfer müssen die generierten T-Zellen wichtige Grundeigenschaften aufweisen. Dazu gehört eine hohe Spezifität gegenüber dem jeweiligen Antigen, um das entartete bzw. infizierte Gewebe gezielt attackieren zu können und die Gefahr des Auftretens von Autoimmunreaktionen möglichst zu minimieren. Der TCR sollte eine hohe Affinität gegenüber dem Antigen besitzen und nach Bindung an seinen Liganden eine effektive Aktivierung der T-Zelle induzieren. Nach Injektion einer hohen Anzahl spezifischer Effektorzellen zurück in den Patienten sollte es zu einem korrekten homing der Zellen in den lymphatischen und inflammatorischen bzw. entarteten Bereich kommen. Die Zellen müssen hohe Funktionalität in Form von Zytotoxizität aufweisen und sollten in vivo nach Antigenkontakt proliferieren, um über einen möglichst langen Zeitraum im Patienten persistieren zu können. Das erste Mal wurde eine erfolgreiche adoptive Immuntherapie an immunkompromierten Patienten nach allogener Knochenmarktransplantation durchgeführt. Cytomegalieviren (CMV) können nach immunsuppressiver Therapie zu einer lebensbedrohlichen Erkrankung in diesen Patienten führen. Nach Injektion antigenspezifischer T-Zellen kam es in keinem der behandelten Patienten zu einem Ausbruch einer CMV-Erkrankung (RIDDELL et al., 1994; WALTER et al., 1995). In anderen Studien konnte gezeigt werden, dass auch bei Infektionen mit dem Epstein-Barr-Virus (EBV) oder dem humanen Immundefizienzvirus (HIV) mehr oder weniger gute Therapieerfolge durch den adoptiven Transfer antigenspezifischer zytotoxischer Effektorzellen bzw. CD4+ T-Zellen erzielt werden konnten (HESLOP et al., 1994; HAQUE et al., 1998; ROONEY et al., 1998; BRODIE et al., 2000; RIDDELL und GREENBERG, 2000; SAVOLDO et al., 2002). Im Gegensatz hierzu hat sich der adoptive T-Zelltransfer zur Behandlung maligner Erkrankungen als weitaus schwieriger herausgestellt. Zum einen wegen der Schwierigkeit, hochaffine, tumorspezifische T-Zellen zu generieren, die auch in vivo ausreichende Funktio- 27 Literaturübersicht nalität aufweisen und zum anderen wegen einer Vielzahl von Mechanismen, mit denen sich ein Tumor vor der Zerstörung durch das Immunsystem schützt (DRAKE et al., 2006). In verschiedenen xenogenen Mausmodellen konnte allerdings die Wirksamkeit von in vitro expandierten, humanen CTLs gezeigt werden (CROWLEY et al., 1992; MALKOVSKA et al., 1992; SABZEVARI und REISFELD, 1993; STENHOLM et al., 1998; ZEH, III et al., 1999; FEUERER et al., 2001; YANG et al., 2002; WESTWOOD et al., 2005). Erste Ansätze zum adoptiven Transfer von malignomreaktiven Lymphozyten bei Patienten mit malignen Erkrankungen wurden von ROSENBERG et al. durchgeführt. Sie stimulierten isolierte Lymphozyten mit IL-2 und überprüften anschließend die Funktionalität der expandierten, als Lymphokin-aktivierte Killerzellen bezeichneten Zellen in vivo. Eine eindeutige Wirksamkeit dieser Therapieform konnte jedoch nicht nachgewiesen werden (ROSENBERG et al., 1985; ROSENBERG et al., 1993). Einige Jahre später gelang es der gleichen Gruppe, TILs erfolgreich aus Melanomen zu isolieren und in vitro unter Anwesenheit eines Tumorantigens zu expandieren. Nach Reinfusion dieser autologen, tumorspezifischen T-Zellen konnte in einigen Patienten eine Tumorregression beobachtet werden. Allerdings kam es auch zum Auftreten von Autoimmunreaktionen gegenüber gesundem Gewebe (ROSENBERG et al., 1988; ROSENBERG et al., 1994; YEE et al., 2000). Studien von MEIDENBAUER et al. (2003) zeigten, dass tumorantigenspezifische T-Zellen in den entarteten oder metastasierten Bereich einwandern und über mehrere Wochen im Patienten persistieren können. Letzteres konnte ebenfalls durch MHC-Tetramer-Analysen von YEE et al. (2002) bestätigt werden. Bisherige Ergebnisse stützen sich vor allem auf Untersuchungen an Patienten mit malignen Melanomen (ROSENBERG et al., 1988; AEBERSOLD et al., 1991; DUDLEY et al., 2002; YEE et al., 2002; NOLTE et al., 2003) und EBV-assoziierten lymphoproliferativen Erkrankungen (ROSKROW et al., 1998; KHANNA et al., 1999; KHANNA et al., 2001; GOTTSCHALK et al., 2003; SHERRITT et al., 2003). Es existieren aber auch Studien, die über den adoptiven Transfer bei anderen Tumorerkrankungen berichten (MACARY et al., 2006). Die Nachteile der adoptiven Immuntherapie bestehen darin, dass die Isolation und Expansion antigenspezifischer Effektorzellen in vitro sehr zeit- und kostenintensiv ist. So wird hierfür eine Dauer von 4-16 Wochen veranschlagt; eine lange Zeitspanne, in Anbetracht 28 Literaturübersicht der Tatsache, dass die Patienten unter einer progressiven Erkrankung leiden. Einfrier- und Auftauprozesse sowie Lagerung und Transport können negative Auswirkungen auf die Zellprodukte haben. Diese Faktoren fallen bei der aktiven Immunisierung weg (YEE, 2005). Problematisch ist weiterhin, dass optimale Stimulationsbedingungen in vitro bislang nicht bekannt sind. In derzeitigen Veröffentlichungen variiert demzufolge die Art und Weise, wie die Zellen für den klinischen Einsatz generiert werden. Dies trifft vor allem auf die Antigenpräsentation (autologe DCs versus aAPCs), die Konzentration und Art der Zytokine (10 U / ml bis 6000 U / ml IL-2 versus TCGF u.a.) sowie die Anzahl infundierter Zellen zu (YEE, 2005). Weiterhin scheint eine vorangegangene Lymphodepletion einen entscheidenden Einfluss auf den Erfolg einer Immuntherapie zu haben (KLEBANOFF et al., 2005b; GATTINONI et al., 2006). Der Vorteil der adoptiven T-Zelltherapie gegenüber Vakzination besteht hingegen in der Möglichkeit, expandierte T-Zellen phänotypisch und funktionell charakterisieren und gezielt selektieren zu können. Weiterhin können sie ex vivo manipuliert und hierdurch ihre Spezifität, Funktionalität und Überlebensfähigkeit beeinflusst werden. Dies kann z.B. durch Einführung mutierter oder chimärer TCRs oder bestimmter Oberflächenrezeptoren erfolgen (HO et al., 2003; KERSHAW et al., 2005). Durch retrovirale Transduktion von humanen PBMCs mit TCRs, die Spezifität gegenüber p53 aufwiesen, konnten KUBALL et al. (2005) beispielsweise hochpotente Effektor-T-Zellen erzeugen. Vakzinationsstrategien scheitern zudem häufig an einer zu geringen Anzahl zirkulierender, tumorspezifischer Immunzellen. Im Gegensatz hierzu kann durch den adoptiven T-ZellTransfer ein weitaus größerer, prozentualer Anteil an malignomreaktiven CTLs im Patienten erreicht werden (ROSENBERG et al., 2004). 2.6.2.3 Therapieansätze in der Veterinärmedizin Aufgrund der Tatsache, dass Tumorerkrankungen in der Tierarztpraxis einen immer größeren Stellenwert einnehmen und bisherige Behandlungsmethoden häufig nur unzureichende Wirksamkeit zeigen, wird auch in der Tiermedizin nach neuen Strategien zur Tumorbekämpfung gesucht. So existieren bereits einige Studien, in denen versucht wurde, durch aktive oder passive Beeinflussung des Immunsystems eine Regression verschiedener Tumoren zu erzielen (NEVOIGT, 2007). Bei der nicht-spezifischen aktiven Immunstimulation werden Substanzen appliziert, die über eine Stimulation von Zellen der angebo- 29 Literaturübersicht renen und / oder erworbenen Abwehr einen antitumoralen Effekt bewirken sollen. So konnte beispielsweise beim Rind durch eine intratumorale Applikation von niedrig dosiertem humanen IL-2 eine temporäre Reduktion von Papillomen oder Karzinomen der Vulva beobachtet werden (HILL et al., 1994a). BCG (Bazillus Calmette-Guérin), ein attenuiertes, avirulentes Mycobabacterium bovis, induzierte sogar eine komplette Regression bereits fortgeschrittener Papillome (HILL et al., 1994b). Beim equinen Sarkoid handelt es sich um einen aggressiven Hauttumor des Pferdes. Eine Behandlung dieses immunogenen Tumors mit BCG erbrachte viel versprechende Resultate (KLEIN et al., 1986; VANSELOW et al., 1988). Auch bei Hund und Katze konnten durch Applikation verschiedener Zytokine und / oder Paramunitätsinducer zum Teil signifikante Erfolge bei der Tumorbekämpfung erzielt werden (NEVOIGT, 2007). Eine spezifische aktive Immunstimulation kann durch Verabreichung reiner Tumorantigene in Form von Proteinen, Peptiden, nackter DNA oder ganzen Tumorzellen erfolgen. Über die Verabreichung von autologen oder allogenen Tumorzellen, die aus unterschiedlichen Malignomen extrahiert und nach Abtötung in den Patienten (re)injiziert wurden, liegen beim Tier einige Studien mit zum Teil viel versprechenden Ergebnissen vor (NEVOIGT, 2007). So behandelten KINNUNEN et al. (1999) Pferde, die an einem primären Sarkoid litten, mit einer autologen Vakzine aus zuvor entnommenem Tumormaterial. Bei Hunden wurde die Wirksamkeit einer Tumorzellvakzine an verschiedenen Neoplasien wie z.B. malignes Melanom, Fibrosarkom und Mammatumor getestet. Die Tumorzellen wurden hierfür z.T. mit immunologisch wirksamen Subtanzen (z.B. GM-CSF) modifiziert (NEVOIGT, 2007). Nachteile die- ser Methode sind der erforderliche chirurgische Eingriff und der beachtliche finanzielle Aufwand. Unter einer passiven Immuntherapie wird unter anderem die Verabreichung von in vitro stimulierten Effektorzellen verstanden. Therapieansätze mit IL-2-aktivierten NK-Zellen existieren für Hund und Katze (TIZARD, 2004). Immuntherapeutische Verfahren, die bereits erfolgreich in der Tiermedizin eingesetzt werden, sind Vakzinierungen gegen tumorinduzierende Viren, die als Ursache von Spontantumoren in Betracht kommen. In diesem Zusammenhang seien das Feline Leukämievirus (FeLV) sowie das Virus der Marekschen Krankheit (Galliner Herpesvirus 2) genannt. Es handelt sich hierbei um RNA- bzw. DNA-Viren, die nach Einschleusung in das Genom zu 30 Literaturübersicht malignen Entartungen von hämatopoietischen Zellen führen können. Durch Impfung mit entsprechenden Antigenen kann über eine gezielte Aktivierung des Immunsystems einer Tumorentstehung entgegengewirkt werden (MURTHY und CALNEK, 1979; TIZARD, 2004). 2.6.3 Problematiken der Immuntherapie von Tumoren Durch bisherige immuntherapeutische Strategien konnten lediglich Teilerfolge in der Bekämpfung von Tumoren erzielt werden (ROSENBERG et al., 2004). Der Grund für das Versagen des Immunsystems, den Organismus vor dem Auswachsen einer Geschwulst zu schützen, wird auf verschiedene Mechanismen zurückgeführt. Intrinsische, von der Funktionalität des Immunsystems abhängige Mechanismen, beinhalten eine inadäquate Stimulation von Immunzellen durch maligne entartete Zellen. Die Ursache hierfür kann eine generelle Abwesenheit tumorspezifischer T-Zellen vom Immunrepertoire infolge peripherer und zentraler Toleranzmechanismen sein. Weiterhin kann eine insuffiziente Präsentation tumorassoziierter Antigene durch APCs sowie eine fehlende Inflammation zu einer ausbleibenden Proliferation und Einwanderung von Effektorzellen in den tumorös entarteten Bereich führen. Auch regulatorische T-Zellen können durch Inhibition aktivierter T-Zellen einen negativen Einfluss auf die Entstehung einer Immunantwort haben (KERSHAW et al., 2005). Weiterhin könnte eine durch Therapeutika induzierte, allgemeine Immunsuppression des Patienten den Erfolg von Vakzinationsstrategien beeinträchtigen (HO et al., 2003; MACARY et al., 2006). Extrinsische Mechanismen gehen direkt vom Tumor selbst aus. Ihre Entstehung wird auf die Tatsache zurückgeführt, dass Malignome permanent dem Immunsystem ausgesetzt sind. Hierdurch kann es zum Auswachsen solcher Zellen kommen, die der Immunkontrolle nicht mehr unterliegen, weil sie beispielsweise Tumorantigene nicht mehr exprimieren oder die Anzahl funktioneller MHC-Moleküle auf ihrer Oberfläche reduzieren. In klinischen Studien an Melanompatienten wurde vom Auftreten einer Mutation nach einer Immuntherapie berichtet, die zum Verlust der Expression des Tumorantigens führte (THURNER et al., 1999; YEE et al., 2002). Durch Sekretion von immunsuppressiven Faktoren können Tumorzellen Immunzellen direkt in ihrer Funktion beeinträchtigen. Eine weitere Möglichkeit 31 Literaturübersicht besteht in der Herunterregulierung von Apoptose-induzierenden Oberflächenrezeptoren oder intrazellulären Signalmolekülen (KERSHAW et al., 2005). 32 Material und Methoden 3 Material und Methoden 3.1 Material 3.1.1 Geräte Autoklav Typ GE406 Getinge AB, S-Getinge Brutschrank mit CO2-Begasung, Baureihe 5060 Heraeus, D-Hanau Bunsenbrenner mit automatischer Zündung Wartewig, D-Göttingen Eismaschine „UBE 30-10“ Ziegra, D-Isernhagen Einfrierkontainer „Nalgene Cryo 1 °C Container“ Nunc, D-Düsseldorf Elektroporationsgerät „Gene Pulser“ Biorad, D-München ELISA-Reader „Dynatech MR 5000“ Dynatech, D-Denkendorf FACScan flow cytometer Becton Dickinson, D-Heidelberg Fluoreszenz-Durchflusszytometer „FACSCalibur“ Becton Dickinson, D-Heidelberg Fluoreszenzmikroskop „Diaphot 300“ Nikon, D-Düsseldorf Gelelektrophoresekammer Biozym, D-Hess.-Oldendorf γ-Microplate Scintillation-Counter Wallac, F-Turku γ-Strahlungsquelle „Gammacell 2000” Molsgaard, Dänemark Labor-pH-Meter „766 Calimatic“ Knick, D-Berlin Laborwaage „BL310“ Sartorius GmbH, D-Göttingen MACS MultiStand Miltenyi, D-Bergisch Gladbach Magnetrührer mit Heizplatte Janke und Kunkel, D-Staufen Pipetten, einstellbar (2, 10, 20, 200,1000 µl) Eppendorf, D-Hamburg Pipettierhilfe „accu-jet“ Brand, D-Wertheim Power Supplier „Power Pac 300“ Biorad, D-München Reinwerkbank „Laminair HL2448“ Heraeus, D-Hanau Schlauchpumpe „Rumo100“ Heidolph, D-Schwabach Schüttler „Orbital Shaker“ Forma Scientific, USA-Marietta Spektralphotometer „Gene Quant II“ Pharmacia Biotech, D-Freiburg 33 Material und Methoden Stickstofftank Linde, D-Höllriegelskreuth Thermocycler „Mastercycler” Eppendorf, D-Hamburg Tischzentrifuge „5415C“ Eppendorf, D-Hamburg Trockenschrank Heraeus, D-Hanau UV-Transilluminator „GelDoc 2000“ Biorad, D-München Wasserbad mit Temperaturregelung „Typ 1003“ GFL, D-Hannover Zentrifuge „Megafuge 1.0R“ Heraeus, D-Hanau Zellharvester „Tomec 3[H] Cell Harvester” Wallac, F-Turku 3.1.2 Plastik- und Glaswaren Combitips (0,5 ml, 2,5 ml, 12,5 ml) Eppendorf, D-Hamburg Cryoröhrchen (1,8 ml) Nunc, D-Düsseldorf Einmalspritzen Braun, D-Melsungen Elektroporationsküvette „Gene Pulser Cuvette“ (0,4 cm) Biorad, D-München FACS-Röhrchen „Polystyrene Round-Bottom Tube“ Becton Dickinson, D-Heidelberg Filtertips „Biosphere“ Greiner, D-Frickenhausen Gewebekulturflaschen (25 cm2, 75 cm2, 175 cm2) Greiner, D-Frickenhausen Glasfaserfilter „MN“ Machery-Nagel, D-Düren Klebefolie „Scotch Pad“ Einzelhandel Laborflaschen mit Gewinde, 500 ml VWR int., D-Hannover Leucosep®-Röhrchen Greiner, D-Frickenhausen MACS „Separation columns“ (MS) Miltenyi, D-Bergisch Gladbach Mikrotiterplatten (96 Vertiefungen, rund / flach / spitz) Greiner, D-Frickenhausen Mikrotiterplatten (6, 24 und 48 Vertiefungen) Sarstedt, D-Nürnbrecht Messplatte „LumaPlate-96“ Perkin Elmer, USA-Boston Nylon-Filter (Nylon-Netz) (70 µm) Heidland, D-Harsewinkel Pasteurpipetten aus Glas (22,5 mm) Brand, D-Wertheim Pipettenspitzen (10, 200, 1000) Sarstedt, D-Nürnbrecht Quarzküvette „UVette” Eppendorf, D-Hamburg Reagent Reservoir (50 ml) Costar, USA-NY Reaktionsgefäße (0,5 ml, 1,5 ml, 2 ml) Eppendorf, D-Hamburg 34 Material und Methoden Röhrchen für die Durchflusszytometrie (1,4 ml) Micronic Systems, N-Lelystad Sample Bag (90 x 120 cm) Wallac, F-Turku Serologische Pipetten (steril; 1, 5, 10 und 25 ml) Sarstedt, D-Nürnbrecht Sterilfilter „Steriflip“ (0,2 µm und 0,45 µm) Millipore, D-Eschborn Zentrifugenröhrchen „Falcon Tubes“ (15 ml, 50 ml) Greiner, D-Frickenhausen Zählkammer nach Neubauer Brand, D-Giessen 3.1.3 Reagenzien 7AAD Becton Dickinson, D-Heidelberg Agarose Gibco-Invitrogen, D-Karlsruhe AIM-V®-Medium Gibco-Invitrogen, D-Karlsruhe Ampicillin Sigma-Aldrich, D-Schnelldorf Aqua (steril) Delta Select, D-Dreireich Auftragspuffer „Blue-Juice“ Gibco-Invitrogen, D-Karlsruhe β-Mercaptoethanol Merck, D-Darmstadt β2-Mikroglobulin, humanes Sigma-Aldrich, D-Steinheim BSA Serva, D-Heidelberg BSA (10x) Gibco-Invitrogen, D-Karlsruhe CD14 MicroBeads, human Miltenyi, D-Bergisch Gladbach 51 Amersham Biotech, D-Freiburg Chrom (Na2 51 CrO4) CFSE (5 mmol / l) Molecular Probes, D-Göttingen Collagenase Sigma-Aldrich, D-Schnelldorf Dispase II Sigma-Aldrich, D-Schnelldorf DMEM-Medium Gibco-Invitrogen, D-Karlsruhe DMSO Merck, D-Darmstadt dNTP Mix (10 mmol / l) Gibco-Invitrogen, D-Karlsruhe Ethanol (99 %) Calbiochem, D-Schwalbach Ethidiumbromid Sigma-Aldrich, D-Steinheim EDTA Sigma-Aldrich, D-Steinheim FACSFlow™ Becton Dickinson, D-Heidelberg 35 Material und Methoden FCS Biochrom, D-Berlin Ficoll „Biocoll Separation Solution“ Biochrom, D-Berlin Geneticin G-418 Sulfat (Neomycin) Gibco-Invitrogen, D-Karlsruhe Glykogen-Lösung Amersham Biotech, D-Freiburg Glycerol (99 %) Sigma-Aldrich, D-Steinheim HEPES (1 mol / l) Biochrom, D-Berlin Ionomycin Sigma-Aldrich, D-Schnelldorf Isopropanol (2-Propanol, 99 %) Sigma-Aldrich, D-Schnelldorf Kanamycin-Sulfat Gibco-Invitrogen, D-Karlsruhe LB-Agar-Medium (Kapseln) Q-Biogene, D-Heidelberg L-Glutamin Biochrom, D-Berlin Ligase-Puffer (10 x) New England Biolabs (NEB), D-Schwalbach LPS Sigma-Aldrich, D-Steinheim Liquemin N 25000 (L-Heparin) Roche, D-Mannheim MgCl Gibco-Invitrogen, D-Karlsruhe NaN3 Merck, D-Darmstadt NaCl Roth, D-Karlsruhe Optimem-Medium Gibco-Invitrogen, D-Karlsruhe Optiphase “Super-Mix” Wallac, F-Turku PBS (D-PBS, 10 x) Gibco-Invitrogen, D-Karlsruhe PCR-Puffer (10 x) NEB, D-Schwalbach Penicillin/Streptomycin 100x Gibco-Invitrogen, D-Karlsruhe PHA Sigma-Aldrich, D-Steinheim PMA Sigma-Aldrich, D-Steinheim RPMI-Medium 1640 Gibco-Invitrogen, D-Karlsruhe SDS Gibco-Invitrogen, D-Karlsruhe S.O.C.-Medium Gibco-Invitrogen, D-Karlsruhe Sodium-Pyruvat Biochrom, D-Berlin Stickstoff Linde, D-Höllriegelskreuth Szintillationsflüssigkeit “Betaplate Scint 3[H]“ Wallac, F-Turku 36 Material und Methoden TAE-Puffer (10x) Gibco-Invitrogen, D-Karlsruhe 3 Amersham-B., D-Braunschweig Trypanblau (0,4 %) Sigma-Aldrich, D-Steinheim Trypsin / EDTA Solution (1x) Biochrom, D-Berlin [H]-Thymidin Amersham TRU 120 (1 mCi / ml) ® Tween 20 Calbiochem, D-Schwalbach Kits BD Cytoperm / Cytofix Becton Dickinson, D-Heidelberg DuoSet Human GM-CSF-ELISA R&D-Systems, D-Wiesbaden Lipofectamine™ 2000 Reagent Gibco-Invitrogen, D-Karlsruhe QIAprep Miniprep Kit Qiagen, D-Hilden QIAgen Plasmid Midi und Maxi Kit Qiagen, D-Hilden QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen, D-Hilden QIAquick PCR Purification Kit Qiagen, D-Hilden MHC-Pentamere (HLA-A*0201 MHC Pro5™) M1-MHC-Pentamer Proimmun, UK-Oxford (M1-Peptidsequenz: GILGFVFTL) NY-ESO-1-MHC-Pentamer Proimmun, UK-Oxford (NY-ESO-1-Peptidsequenz: SLLMWITQC) Enzyme Hind III und Bgl II Gibco-Invitrogen, D-Karlsruhe Mlu I, Kpn I, Bam HI und Eco RI NEB, D-Schwalbach T4-DNA-Ligase Gibco-Invitrogen, D-Karlsruhe Taq-Polymerase Gibco-Invitrogen, D-Karlsruhe Zytokine GM-CSF R&D Systems, D-Wiebaden IL-2 (Proleukin) Chiron, N-Amsterdam IL-4 R&D Systems, D-Wiesbaden 37 Material und Methoden Molekulargewichtsmarker 1 kb DNA Längenstandard NEB, D-Schwalbach 100 bp Marker NEB, D-Schwalbach λ DNA / Hind III Fragment-Leiter NEB, D-Schwalbach 3.1.4 Häufig verwendete Puffer FACS-Puffer 1x PBS; 10 % FCS (v / v); 1 mg / ml NaN3 MACS-Puffer 1x PBS, 5 mg / ml BSA, 2 mmol / l EDTA Die Lagerung der Puffer erfolgte bei 4 °C. Der MACS -Puffer wurde vor Gebrauch sterilfiltriert. 3.1.5 Biologische Materialien 3.1.5.1 Bakterienstämme E. coli TOP10 Gibco-Invitrogen, D-Karlsruhe Genotyp: F [lacIq Tn10 (tetR)] mcr A ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) ϕ80 lacZ ∆M15 ∆lacX74 recA1 deoR araD139 ∆(ara-leu)7697 gal/U gal/K rpsL (strR) endA1 nupG Die Bakterien wurden bei -80 °C gelagert. 3.1.5.2 Eukaryontische Zellen Sofern nicht anders angegeben, wurden die nachfolgend aufgeführten Zelllinien von ATCC (Manassas, USA) bezogen. 38 Material und Methoden Daudi (ATCC-Nr.: CCL-213) Bei der Daudi-Zelllinie handelt es sich um B-Lymphoblasten, die von einem männlichen, schwarzhäutigen Jungen mit Burkitt´s Lymphom abstammen (KLEIN et al., 1967). Aufgrund eines genetischen Defektes im Bereich des β2-Mikroglobulins sind diese Zellen nicht in der Lage, funktionelle MHC-Klasse-I-Moleküle zu konstruieren und an ihrer Oberfläche zu präsentieren. Die in Suspension wachsenden Zellen sind MHC-Klasse-II-positiv. K562 (ATCC-Nr.: CLL-243) Die permanente Zelllinie K562 wurde aus der Pleuralflüssigkeit einer 53 Jahre alten Frau mit chronischer, myeloischer Leukämie gewonnen (LOZZIO und LOZZIO, 1975). Es handelt sich um eine, zur Granulozytenserie gehörende, hoch undifferenzierte Zellpopulation. K562-Zellen weisen einen genetischen Defekt im Bereich des MHC-Lokus auf und sind aus diesem Grund nicht in der Lage, MHC-Klasse-I-Moleküle zu exprimieren. T2 (ATCC-Nr.: CLL-1992) Die T2-Zelllinie stellt eine Fusion einer lymphoblastoiden B-Zelllinie, die eine Deletion in den MHC-Klasse-II-Molekülen aufweist, mit der T-Zelllinie CEM dar (SAVAGE et al., 2004). Die Syntheserate der MHC-Klasse-I-Moleküle ist bei der T2-Zelllinie normal. Aufgrund einer Mutation des TAP1- und TAP2-Gens ist die Peptidbeladung im ER allerdings unzureichend. Daraus resultiert eine Instabilität der nicht-peptidbeladenen MHC-Klasse-IMoleküle und somit eine reduzierte Zelloberflächenexpression von HLA-A2-Molekülen. Durch Inkubation der T2-Zellen mit HLA-A2-restringierten Peptiden kann die Expression der MHC-Klasse-I-Moleküle erhöht werden, indem das jeweilige Peptid die unbeladenen MHC-Klasse-I-Moleküle stabilisiert und dadurch die Dichte an MHC-Peptid-Komplexen an der Zelloberfläche erhöht. Aufgrund dieser Eigenschaft können T2-Zellen als Targetzellen in verschiedenen Assays eingesetzt werden. NIH/3T3 CD40L NIH/3T3 CD40L-Zellen wurden durch stabile Transfektion der permanenten Mausfibroblastenzelllinie NIH/3T3 (ATCC-Nr.: CLL-1658) mit dem Oberflächenmolekül CD40L hergestellt. Sie wurden für die Stimulation von Daudi-Zellen verwendet. Die Zelllinie wurde 39 Material und Methoden uns freundlicherweise von Britta Maecker (Transplantations-Forschungszentrum, MHH) zur Verfügung gestellt. NW-38-Mel NW-38-Mel-Zellen wurden von Elke Jäger (Medizinische Klinik Hämatologie-Onkologie, Frankfurt) aus einem Patienten mit malignem Melanom isoliert. Es handelt sich um eine HLA-A2-positive Tumorzelllinie, die uns freundlicherweise zur Verfügung gestellt wurde. Hlx Pxt Hlx Pxt-Zellen stellen eine Hepatomazelllinie dar. Sie wurden aus einem Patienten mit hepatozellulärem Karzinom isoliert. Sie exprimieren an ihrer Oberfläche das MHC-Klasse-IMolekül HLA-A2. 3.1.5.3 HLA-A2-positives Blut Das Blut HLA-A2-positiver, gesunder Spender stammte aus der Blutbank der Medizinischen Hochschule Hannover. Es wurde benötigt, um die Funktionalität der generierten Daudi M1-SC-Zellen zu überprüfen. Buffy coats, die der Herstellung des TCGF-Mediums dienten, wurden von der Blutbank des Universitätsklinikums Göttingen bezogen. Neben Blut gesunder Spender wurde zur Überprüfung der Effektivität der hergestellten aAPCs ebenfalls Blut von Patienten verwendet, die an einem gastrointestinalen Karzinom (Stadium IV) litten. Diese Patienten wiesen aufgrund einer palliativen Chemotherapie (FOLFOX4) eine Immunsuppression auf. Das Blut wurde den Patienten im Rahmen eines Aufenthaltes in der onkologischen Tagesklinik der Medizinischen Hochschule Hannover entnommen. Des Weiteren wurde Blut von HLA-A2-positiven Patienten verwendet, die an einem hepatozellulären Karzinom (HCC) erkrankt waren. Personen mit einem solchen Krankheitsbild weisen in der Mehrzahl aller Fälle einen erhöhten Serumspiegel an AFP auf (BUTTERFIELD, 2004). Eine Expression von NY-ESO-1 konnte ebenfalls in einem Teil der Patienten festgestellt werde (BUTTERFIELD, 2004). Gegen beide Tumorantigene kam es zu nachweisbaren Immunreaktionen (VOLLMER, Jr. et al., 1999; BUTTERFIELD et al., 40 Material und Methoden 2003; KORANGY et al., 2004). Die aus dem Patientenblut isolierten PBMCs wurden eingesetzt, um die generierten AFP-SC- bzw. NY-ESO-SC-exprimierenden aAPCs auf Funktionalität zu testen. Die durchgeführten Versuche wurden von der Ethikkommission der Medizinischen Hochschule Hannover genehmigt. 3.1.5.4 Mäuse Die tierexperimentellen Versuche wurden mit NOD/LtSz-scid (non-obese diabetical severe combined immunodeficiency)-Mäusen durchgeführt. Die scid-Mutation ist durch einen Defekt des Prkdc-Gens gekennzeichnet, der eine gestörte VDJ-Rekombination zur Folge hat. Betroffene Tiere weisen eine schwere B- und T-Zell-Defizienz auf (BOSMA et al., 1983). Durch Rückkreuzung der scid-Mutation auf den NOD/Lt-Hintergrund wurde ein neuer, transgener Mausstamm entwickelt, der neben der schweren Defizienz des adaptiven Immunsystems eine reduzierte Funktionalität des angeborenen Immunsystems aufweist. So konnte in NOD/LtSz-scid-Mäusen ein Mangel an zirkulierenden Komplementfaktoren und eine Beeinträchtigung der Differenzierung und Funktionalität von APCs sowie von NKZellen festgestellt werden (SHULTZ et al., 1995). Demzufolge eignen sich NOD/LtSz-scidMäuse besonders gut zur Transplantation humaner (xenogener) Tumoren. Die Tiere wurden in einem Alter von 6 bis 12 Wochen vom Zentralen Tierlabor der Medizinischen Hochschule Hannover bezogen und während der Versuche unter keimfreien Bedingungen im Tierlabor des Forschungszentrums Oststadt gehalten. Futter und Wasser standen den Tieren ad libitum zur Verfügung. Alle Tierversuche unterlagen tierschutzrechtlichen Bestimmungen und wurden unter der Versuchstiernummer 05 / 965 von der zuständigen Behörde genehmigt. 3.1.6 Kulturmedien Das in der Zellkultur eingesetzte Serum (FCS und humanes AB-Serum) wurde vor Gebrauch für 45 min bei 56 °C hitzeinaktiviert, um d ie hitzesensitiven Komponenten des Komplementsystems zu entfernen. 41 Material und Methoden 3.1.6.1 Medien für Bakterien LB-Medium und LB-Agar-Platten für die Kultur bzw. Anzucht von Bakterien wurden entsprechend Herstellerangaben aus Kapseln hergestellt. Zur Selektion erfolgreich transformierter Bakterien erfolgte die Zugabe entsprechender Antibiotika. S.O.C.-Medium wurde für die Transformation von Bakterien benötigt (3.2.1.2). Die Lagerung der flüssigen Medien erfolgte bei Raumtemperatur, LB-Agar-Platten wurden bei 4 °C aufbewahrt. 3.1.6.2 Medien für die Zellkultur DMEM-Medium Zusätze: 10 % FCS (v / v), 100 U / ml Penicillin/Streptomycin, 2 mmol / l L-Glutamin, 1 mmol / l Natrium-Pyruvat. Zelllinien, die mit DMEM-Medium kultiviert wurden, waren K562-, NIH/3T3 CD40L-, NW38-Mel- und Hlx Pxt-Zellen. Den transfizierten Zelllinien K562 M1SC und K562 HLA-A2 wurde zusätzlich zum Medium 1 mg / ml Neomycin (G418) zugesetzt. NIH/3T3 CD40LZellen wurden mit 500 µg / ml G418 und NW-38-Mel M1-Zellen mit 300 µg / ml G418 kultiviert. RPMI 1640-Medium Zusätze: 10 % FCS (v / v), 100 U / ml Penicillin/Streptomycin. Folgende Zelllinien wurden mit RPMI 1640-Medium kultiviert: Daudi- und T2-Zellen. Transfizierte Daudi-Zellen (Daudi M1-SC, Daudi NY-ESO-SC und Daudi AFP-SC) erhielten zum Medium zusätzlich eine Zugabe von 1 mg / ml G418. M`-Medium M`-Medium wurde zur Herstellung des T cell growth factors (TCGF-Medium) verwendet. Zusammensetzung: RPMI 1640, 5 % humanes AB-Serum (v / v), 1 mmol / l NatriumPyruvat, 2 mmol / l L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin/Streptomycin, 50 µmol / l βMercaptoethanol. 42 Material und Methoden Aktivierungsmedium Aktivierungsmedium wurde zur Herstellung des TCGF-Mediums benötigt. Es setzte sich aus M´-Medium plus 1 mg / ml PMA sowie 1 mg / ml PHA-L zusammen. TCGF-Standard Der zur Überprüfung des hergestellten TCGF-Mediums verwendete TCGF-Standard wurde uns freundlicherweise von Monika Laumer (Hämatologie und Onkologie, Universität Regensburg) zur Verfügung gestellt. Humanes T-Zellmedium Mit humanem T-Zellmedium wurde die in vitro-Kultivierung von humanen T-Zellen durchgeführt. Zusammensetzung: RPMI 1640, 10 % humanes AB-Serum (v / v), 2 mmol / l LGlutamin, 10 mmol / l HEPES, 100 U / ml Penicillin/Streptomycin. Sofern angegeben, erfolgte der Zusatz von 10 % TCGF-Medium (v / v). DC-Medium Das für die Generierung von DCs (MoDCs) eingesetzte Medium setzte sich folgendermaßen zusammen: AIM-V®-Medium, 5 % humanes AB-Serum (v / v), 2 mmol / l L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin/Streptomycin. Einfriermedium Das zum Einfrieren von Zellen verwendete Medium setzte sich aus folgenden Komponenten zusammen: 10 % DMSO (v / v), 90 % FCS (v / v). 3.1.6.3 Antibiotika Ampicillin-Stammlösung 100 mg / ml in H2O. Die Lösung wurde sterilfiltriert und bei -20 °C ge lagert. Die Zugabe zum Medium erfolgte in einer Konzentration von 100 µg / ml. 43 Material und Methoden Kanamycin-Stammlösung 10 mg / ml in H2O. Die Lösung wurde sterilfiltriert und bei -20 °C ge lagert. Die Zugabe zum Medium erfolgte in einer Konzentration von 50 µg / ml. Neomycin (Geneticin G418)-Stammlösung 400 mg / ml in H2O. Die Lösung wurde sterilfiltriert und bei 4 °C gela gert. In der Zellkultur wurde eine Konzentration von 300 µg / ml bis 1 mg / ml eingesetzt. 3.1.7 Antikörper In Tabelle 1 werden die für die durchflusszytometrische Charakterisierung von zellulären Oberflächenstrukturen bzw. intrazellulären Molekülen verwendeten monoklonalen Antikörper dargestellt. Alle Antikörper sind murinen Ursprungs. Sie wurden bei 4 °C gelagert. Tabelle 1: Murine monoklonale Antikörper. Bezeichnung Antigen Isotyp Herkunft Anti-human CD3-APC hu CD3 IgG1 eBioscience Anti-human CD4-FITC hu CD4 IgG1 BD Pharmingen Anti-human CD8-PE hu CD8 IgG1 BD Pharmingen Anti-human CD14-PE / Cy5 hu CD14 IgG2a ImmunoTools Anti-human CD56-PE hu CD56 IgG1 ImmunoTools Anti-human CD80-FITC hu CD80 IgG1 ImmunoTools Anti-human CD83-FITC hu CD83 IgG1 Caltag Anti-human CD86-FITC hu CD86 IgG1 Caltag Anti-human γ:δ TCR-PE Hu γ:δ TCR IgG1 BD Pharmingen Anti-human IFN-γ-FITC hu IFN-γ IgG1 BD Pharmingen BB7.2 HLA-A2.1, Aw69 IgG2b ATCC In der nachfolgenden Tabelle ist der verwendete Sekundärantikörper aufgelistet. 44 Material und Methoden Tabelle 2: Sekundärantikörper. Bezeichnung Herkunft Ziege-anti-Maus IgG-PE Southern Biotechnology Zur Isotypenkontrolle wurden nachfolgende Antikörper eingesetzt: Tabelle 3: Isotypenkontrolle. Bezeichnung Herkunft Maus IgG1-Isotypenkontrolle-FITC Southern Biotechnology Maus IgG2b-Isotypenkontrolle Pharmingen 3.1.8 Vektoren Tabelle 4 enthält eine Auflistung der in dieser Arbeit verwendeten bzw. hergestellten Vektoren. Sie wurden bei -20 °C gelagert. Tabelle 4: Vektoren. 1 Plasmid-Bezeichnung Herkunft pEGFP-N3 HLA-A2 pEGFP-N3 Tax-SC pCR II M1-SC pCDNA 3 M1-SC pEGFP AFP-SC pEGFP NY-ESO-SC pEGFP Influenza Flu Matrix pCDNA 3.1 Influenza M1 pEGFP Clontech, Heidelberg (TOMARU et al., 2003)1 unveröffentlicht2 unveröffentlicht2 unveröffentlicht2 unveröffentlicht3 unveröffentlicht3 (GILEADI et al., 1999)4 unveröffentlich3 HLA-A2 pEGFP-N3 enthält die DNA-Sequenz des MHC-Klasse-I-Moleküls HLA-A2, fusioniert mit dem grünfloreszierenden Protein EGFP. Das Konstrukt wurde uns freundlicherweise von Steve Jacobson (NIH, USA-Maryland) zur Verfügung gestellt. 2 Wurde in der Arbeitsgruppe Tim Greten (MHH, Hannover) etabliert. 3 Wurde in dieser Arbeit konstruiert. 45 Material und Methoden 4 Der Vektor Influenza Flu Matrix pCDNA 3.1 enthält die DNA, die für das Matrixprotein des Influenza A- Virus kodiert. Das Konstrukt wurde uns freundlicherweise von Uzi Gileadi (Nuffield Department of Medicine, Oxford) zur Verfügung gestellt. 3.1.9 Peptide Alle Peptide wurden von der Firma Eurogentec (Belgien-Seraing) bezogen. Sie wiesen eine Reinheit von > 95 % auf und wurden in DMSO gelöst. Die Lagerung erfolgte bei -20 °C. Tabelle 5: Peptide. 1 Bezeichnung Nukleinsäuresequenz Aminosäuresequenz M158-661 GGTATTCTCGGCTTCGTCTTCACCCTT GILGFVFTL AFP542-550 2 GGTGTAGCGCTGCAAACGATGAAGCAA GVALQTMKQ NY-ESO-1157-165 2 TCCCTGTTGATGTGGATCACGCAGTGC SLLMWITQC CMV495-503 3 AACCTCGTGCCAATGGTGGCCACTGTT NLVPMVATV M1-Peptid: Beim M1-Peptid handelt es sich um ein HLA-A2-restringiertes Epitop, das an Position 58- 66 der Aminosäuresequenz des Influenza A-Matrixproteins lokalisiert ist. Im Rahmen einer Infektion mit Influenza A-Viren kommt es zur Ausbildung einer humoralen sowie zellvermittelten Immunität (MCMICHAEL et al., 1983). An Letzterer sind CTLs beteiligt, die gegen multiple Epitope gerichtet sind (BOON et al., 2004). Bei HLA-A2-positiven Spendern weisen die zytotoxischen T-Zellen in erster Linie Spezifität gegenüber dem immundominanten Epitop M1 auf (GOTCH et al., 1987; BOON et al., 2004). Aufgrund der hohen Prävalenz der Influenza-Viruserkrankung sowie ihrer starken Immunogenität können bei einem relativ großen Anteil der Bevölkerung Serumantikörper sowie Gedächtniszellen detektiert werden (DUNBAR et al., 1998; BOON et al., 2004). Somit stellt das Matrix-Epitop M1 ein geeignetes Modellpeptid dar und wurde zur Funktionalitätsprüfung der Daudi M1-SC-Zellen eingesetzt. 2 3 AFP-Peptid und NY-ESO-1-Peptid (2.6.1). CMV-Peptid: Es handelt sich um ein MHC-Klasse-I (HLA-A2)-restringiertes Peptid, das an Position 495-503 des pp65-Proteins von Cytomegalieviren lokalisiert ist. Es wurde in dieser Arbeit als Kontrollpeptid eingesetzt. 46 Material und Methoden 3.1.10 Primer Alle verwendeten Oligonukleotide wurden von IBA NAPS (D-Göttingen) bezogen. Die Lagerung erfolgte bei -20 °C. Die in der nachfolgende n Tabelle aufgelisteten Primer wurden zur Klonierung von AFP-SC pEGFP bzw. NY-ESO-SC pEGFP verwendet. Tabelle 6: Primer für die Herstellung von NY-ESO-SC pEGFP und AFP-SC pEGFP. Bezeichnung Nukleinsäuresequenz (5´-3´-Richtung) AFP Oligo A 5´-GGGGCTTCATCGTTTGCAGCGCTACACCAG CCTCCAGGCCAGAAAG-3´ AFP Oligo B 5´-GGGGACCACCTCCTCCGGAGCCACCTCCTT GCTTCATCGTTTGCAG-3´ NY-ESO Oligo A 5´-GGGGCTGCGTGATCCACATCAACAGGGAAGC CTCCAGGCCAGAAAG-3´ NY-ESO Oligo B 5´-GGGGACCACCTCCTCCGGAGCCACCTCCGC ACTGCGTGATCCACAT-3´ TG2 5´-CCGGACCCTCCTGCTCTATCCACGGCGCC-3´ TG10 5´-GGGGACGCGTCGATGAGTCGCTCCGTGGCCTTAGCT-3´ Oligo 4 5´-TGGCTCCGGAGGAGGTGGTTCTGGTGGAGGTTCGATCCA-3´ Tabelle 7 zeigt die für die Klonierung von Influenza M1 pEGFP benötigten Primer. Tabelle 7: Primer für die Herstellung von Influenza M1 pEGFP. Bezeichnung Nukleinsäuresequenz (5´-3´-Richtung) Influenza M1 FP 5´-GGGGAAGCTTATGAGTCTTCTAACCGAGGTC-3´ Influenza M1 RP 5´-GGGGGGATCCGCCGTTCCCATTAAGGGCATT-3´ Die Sequenzierung der hergestellten Konstrukte wurde bei der Firma GATC Biotech (DKonstanz) in Auftrag gegeben. Nachfolgende Primer wurden hierfür eingesetzt: 47 Material und Methoden Tabelle 8: Sequenzierungsprimer. 3.2 Bezeichnung Nukleinsäuresequenz (5´-3´-Richtung) pEGFP forward-Primer 5´-TTTAGTGAACCGTCAGATC-3´ pEGFP reverse-Primer 5´-AACAGCTCCTCGCCCTTG-3´ Methoden 3.2.1 Allgemeine molekularbiologische Methoden 3.2.1.1 Kultivierung und Konservierung von E. coli -Stämmen Die Anzucht von E. coli-Stämmen erfolgte bei 37 °C in LB-Medium, dem bei p lasmidtragenden Stämmen das entsprechende Antibiotikum zugesetzt wurde. Vorkulturen wurden mit Einzelkolonien von LB-Agar-Platten angeimpft. Zur dauerhaften Konservierung von Bakterienstämmen wurden 350 µl einer stationären Übernachtkultur mit 650 µl Glycerin (99 %) versetzt und bei - 80 °C aufbewahrt. 3.2.1.2 Transformation von E. coli mit Plasmid-DNA Die Transformation von E. coli mit Plasmid-DNA erfolgte mit Hilfe der Calcium-ChloridMethode. Hierbei werden E. coli-Keime chemisch kompetent gemacht, indem sie unter definierten Bedingungen mit Calciumchlorid versetzt werden. Dadurch wird die Membran der Zellen nach Einwirkung von Hitze für eine kurze Zeit permeabel und die gewünschte Plasmid-DNA kann in die Bakterien penetrieren. Es wurden jeweils 100 µl kompetente Zellen (3.1.5.1) mit der zu transformierenden Plasmid-DNA versetzt (2 µl eines 10 µl Ligationsansatzes). Das Gemisch wurde nach 30minütiger Inkubation auf Eis einem Hitzeschock unterzogen. Hierzu wurde es für 30 Sekunden in ein 42 °C warmes Wasserbad verbracht. Nach Zug abe von 250 µl S.O.C.Medium wurden die Bakterien bei 37 °C und 225 rpm fü r eine Stunde geschüttelt und anschließend je 150 µl der Suspension auf einer LB-Agar-Platte ausplattiert, die das entsprechende Antibiotikum enthielt. Die Inkubation erfolgte über Nacht bei 37 °C. Ange- 48 Material und Methoden wachsene Kolonien wurden am folgenden Tag gepickt und in je 2 ml LB-Medium zzgl. Antibiotikum transferiert. Nach Übernachtkultur (37 °C, 2 25 rpm) wurde die Plasmid-DNA isoliert (3.2.1.3). 3.2.1.3 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli Um qualitativ besonders hochwertige Plasmid-DNA zu gewinnen, wurden Plasmide mit hoher Kopienzahl mit Hilfe des „QIAprep Miniprep Kit“ isoliert. Dieses Verfahren beruht auf der Methode der alkalischen Lyse mit einer sich anschließenden Adsorption der DNA an die Silikagelmembran einer Minisäule unter Hochsalzbedingungen. Die nachfolgende Elution der DNA erfolgte unter Niedrigsalzbedingungen. Für eine Standardplasmidisolierung wurden von 2 ml einer bei 37 °C über Nacht gewachsenen Kultur von E. coli 1,5 ml abgenommen und für 1 min bei 800 g abzentrifugiert. Die anschließende Plasmidisolierung erfolgte nach Angaben des QIAgen-Protokolls. Die isolierte Plasmid-DNA konnte direkt zur Spaltung durch Restriktionsendonukleasen eingesetzt werden (3.2.1.5). Zur Isolierung von Plasmid-DNA im größeren Maßstab wurde der „QIAgen Plasmid Midi“ bzw. „Maxi Kit“ verwendet. Hierbei wurden aus einer 2 ml Vorkultur je nach Trübung 0,2 bis 1,0 ml Bakteriensuspension entnommen und für eine Übernachtkultur mit 50 bis 100 ml LB-Medium zzgl. Antibiotikum vermischt. Die Inkubation erfolgte bei 37 °C und 225 rpm auf einem Schüttler. Die DNA wurde am nächsten Tag entsprechend Herstellerprotokoll isoliert. 3.2.1.4 Konzentrations- und Reinheitsbestimmung von Nukleinsäuren Das Absorptionsspektrum von doppel- und einzelsträngigen Nukleinsäuren hat sein Maximum bei einer Wellenlänge von 260 nm. Zur Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren wurde deshalb deren Extinktion (Optische Dichte, OD) mittels Spektralphotometer bei 260 nm in Quarzküvetten bestimmt und wie folgt errechnet: Konzentration (dsDNA) [mg / ml] = OD260 (dsDNA) x 50 x Verdünnung Verunreinigungen in Nukleinsäurepräparationen stellen neben den Fällungsreagenzien vornehmlich zelluläre Proteine dar. Da das Absorptionsmaximum von Proteinen bei einer 49 Material und Methoden Wellenlänge von 280 nm liegt, ergibt sich aus dem Quotienten der Extinktionen bei λ = 260 nm und λ = 280 nm ein Parameter für die Reinheit der Nukleinsäurelösung. Üblicherweise liegt der OD260 / OD280-Quotient für DNA-Präparationen bei 1,78. 3.2.1.5 Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen Im Restriktionsverdau werden Enzyme eingesetzt, die als Restriktionsendonukleasen bezeichnet werden. Sie schneiden einen DNA-Abschnitt sequenzspezifisch an festgelegten Schnittstellen und produzieren hierdurch DNA-Fragmente definierter Länge. Restriktionsanalysen wurden in einem Gesamtvolumen von 10 bis 20 µl durchgeführt. Für den analytischen Verdau wurden standardmäßig 0,2-1 µg Plasmid-DNA eingesetzt. Für DNA-Spaltungen im präparativen Maßstab wurden DNA-Mengen von 1-2 µg verwendet. Dem Ansatz wurden 0,5-1,0 µl der entsprechenden Restriktionsendonukleasen sowie 1 bis 2 µl des vom Hersteller mitgelieferten 10-fach konzentrierten Reaktionspuffers zugesetzt. Sofern vorgeschrieben wurde zusätzlich BSA (1-2 µl der 10-fach konzentrierten Lösung) zugegeben. Anschließend erfolgte eine mindestens 90-minütige Inkubation bei 37 °C im Wasserbad. Nach dem Verdau wurde die DNA auf einem Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt (3.2.1.6). 3.2.1.6 Gelelektrophorese von DNA Zur elektrophoretischen Auftrennung von DNA mittels horizontaler Gelelektrophorese wurden je nach Größe der erwarteten DNA-Bande 1-2 %-ige Agarosegele in TAE-Puffer verwendet. Nach Erhitzung wurde der Lösung 1 %-iges Ethidiumbromid (0,5 µl / 10 ml) zugesetzt. Ethidiumbromid interkaliert mit der DNA, so dass nach Auftrennung der DNA im elektrischen Feld eine Betrachtung unter dem UV-Licht (UV-Transilluminator) möglich wird. Zur Probenvorbereitung wurde die DNA mit 1 / 10 ihres Volumens Auftragspuffer versetzt und anschließend auf einem Gel aufgetragen. Die Elektrophorese wurde bei einer konstanten Spannung von 80-90 Volt durchgeführt. Mit Hilfe von Molekulargewichtsmarkern (3.1.3) konnte die Größe der DNA-Fragmente ermittelt werden. 50 Material und Methoden 3.2.1.7 Isolierung und Reinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen Nach elektrophoretischer Auftrennung von DNA-Fragmenten auf einem 1-2 %-igem Agarosegel wurde die gewünschte Bande unter UV-Licht ausgeschnitten und mit Hilfe des „QIAquick Gel Extractionkit“ nach Protokoll des Herstellers aufgereinigt. 3.2.1.8 Ethanol-DNA-Präzipitation Die Ethanol-Präzipitation wurde durchgeführt, um eine Konzentrierung extrahierter und aufgereinigter DNA zu erreichen. Hierzu wurden zwei Volumen Ethanol (99 %) sowie 0,8 mol / l LiCl bzw. 0,2 mol / l NaCl zur Probe gegeben. Zusätzlich wurden zum Ansatz 1-2 µl Glycogen pipettiert. Nach einer 30-minütigen Inkubation bei -20 °C und anschließender Zentrifugation (10 min, 4 °C) wurde das Präzipitat m it Ethanol (70 % v / v in H2O) gewaschen, bei Raumtemperatur getrocknet und in 5 µl H2O aufgenommen. 3.2.1.9 Ligation von DNA-Fragmenten Nach Darstellung der Vektor- und Insert-DNA auf einem Agarosegel wurde mit Hilfe des λ−DNA / Hind III-Fragment-Leiters ihre ungefähre DNA-Konzentration abgeschätzt. Zur Kalkulation der für die Ligation benötigten Menge an Vektor- und Insert-DNA wurde nachfolgende Formel verwendet: MasseInsert [ng] = 5 x MasseVektor [ng] x LängeFragment [bp] / LängeVektor [bp] Bei einer standardmäßig eingesetzten Menge von 25 ng Vektor lautet die Formel: MasseInsert [ng] = 125 [ng] x LängeFragment [bp] / LängeVektor [bp] Ligationen wurden in einem Gesamtvolumen von 10 µl durchgeführt. Initial wurden Vektor und Insert zusammen mit Wasser über einen Zeitraum von 5 min auf 45 °C erhitzt. Anschließend erfolgte die Zugabe von einer Einheit T4-DNA-Ligase sowie von 1 µl des vom Hersteller mitgelieferten Ligasepuffers (10-fach konzentriert). Die Inkubation des Ligationsansatzes erfolgte bei 16 °C über Nacht. Für die anschli eßende Transformation von E. coli wurden 2 µl des Ligationsansatzes eingesetzt. 3.2.1.10 Sequenzierung von Plasmid-DNA Die Bestimmung der Basenabfolge von Plasmid-DNA erfolgte gemäß der Kettenabbruch- 51 Material und Methoden methode nach SANGER. Sie wurde bei der Firma GATC in Auftrag gegeben. 3.2.1.11 PCR Die in vitro-Amplifikation von DNA mit Hilfe der PCR nach MULLIS (MULLIS et al., 1986) wurde mit der Taq-Polymerase durchgeführt. Als Matrize diente Plasmid-DNA (3.1.8) oder isolierte DNA. Die verwendeten Primer wurden in Abschnitt 3.1.10 aufgelistet. Sie variierten in ihrer Länge zwischen 29 und 46 Basen. Für die Amplifikation eines spezifischen DNA-Abschnittes wurden die beiden Primer, die diesen Bereich einschlossen, möglichst so gewählt, dass sie annähernd gleiche Hybridschmelzpunkte aufwiesen. Der Schmelzpunkt wurde mit Hilfe eines Programms von Promega.com / Biotech ermittelt. Die PCR wurde in einem Thermocycler mit beheiztem Deckel durchgeführt. Der Reaktionsansatz setzte sich standardmäßig folgendermaßen zusammen: MgCl (1,5 mmol / l), dNTP-Mix (0,8 mmol / l), Primer A (0,4 mmol / l), Primer B (0,4 mmol / l), cDNA (0,4 ng), Taq-Polymerase (0,125 µl) und H2Obidest. ad 25 µl. Als Negativkontrolle diente ein PCR-Ansatz, dem keine Template-DNA (cDNA) zugefügt wurde. Die Komponenten wurden auf Eis in ein Eppendorfgefäß (0,5 ml) pipettiert. Die PCR wurde in 31 Zyklen durchgeführt. Für die Herstellung der Konstrukte Influenza M1 pEGFP und Peptid-SC pEGFP wurden verschiedene PCR-Programme benötigt (Tabelle 9). Tabelle 9: PCR-Programme zur Herstellung von Influenza M1 pEGFP und Peptid-SC pEGFP Influenza M1 pEGFP Peptid-SC pEGFP 1. Denaturierung (95 °C, 5 min) 1. Denaturierung (9 4°C, 1 min 30) 2. Denaturierung (95 °C, 1 min) 2. Denaturierung (9 2 °C, 30 sec) 3. Anlagerung der Primer (60 °C, 30 sec) 3. Anlagerun g der Primer (65 °C, 30 sec) 4. Polymerisation (74 °C, 30 sec) 4. Polymerisation (74 °C, 1 min 30) Schritt 4 an Schritt 2 (30 Zyklen) Schritt 4 an Schritt 2 (30 Zyklen) 5. Endsynthese (16 °C, 7 min 30) 5. Endsynthese (16 ° C, 10 min) 6. Pause (16 °C) 6. Pause (16 °C) 52 Material und Methoden Die Anlagerungstemperatur der Primer war abhängig von ihrer jeweiligen Schmelztemperatur. Im Regelfall lag sie 2-5 °C unterhalb der Schm elztemperatur des Primers mit der niedrigeren Schmelztemperatur. Nach Abschluss der PCR wurde der Ansatz auf Eis gehalten. Ein Aliquot von 5 µl wurde elektrophoretisch aufgetrennt (3.2.1.6), um die Amplifikation zu überprüfen. Wies die amplifizierte DNA die korrekte Größe auf, wurde sie anschließend nach präparativer Elektrophorese aus dem Gel isoliert (3.2.1.7). Eine andere Möglichkeit bestand in der Aufreinigung der Probe mittels „PCR-Purification Kit“. Bei Verwendung der amplifizierten DNA als Template für einen nächsten PCR-Schritt wurde auf eine Extraktion verzichtet und direkt ein Aliquot von 0,5-2,0 µl aus der Probe entnommen. 3.2.1.12 Aufreinigung von PCR-Produkten Das „QIAquick PCR Purification Kit“ dient der direkten Aufreinigung von doppel- oder einzelsträngigen PCR-Produkten, die eine Größe von 100 bp - 10 kb aufweisen. Das Protokoll wurde entsprechend Herstellerangaben durchgeführt. 3.2.2 Konstruktion der Expressionsvektoren Die Konstruktion der Expressionsvektoren erfolgte mit Hilfe von Standardklonierungstechniken, die im Abschnitt 3.2.1 erläutert wurden. 3.2.2.1 Klonierung von Peptid-SC pEGFP-Konstrukten In dieser Arbeit wurden die beiden Peptid-SC-Konstrukte AFP-SC pEGFP und NY-ESOSC pEGFP hergestellt. Sie unterscheiden sich anhand der Peptid-Sequenz, die am 3´Ende über einen Aminosäure-Linker kovalent mit dem β2m des von GRETEN et al. (2002) etablierten, β2-Mikroglobulin-MHC-single-chain (SC)-Konstruktes verbunden ist (Abb. 1). Zur Herstellung der beiden Peptid-SC-Konstrukte musste zunächst die DNA-Sequenz des tumorassoziierten Antigens AFP bzw. NY-ESO-1 in das rekombinante MHC-Klasse-IMolekül integriert werden. Eine anschließende Ligation des erhaltenen DNA-Abschnitts mit dem Vektor pEGFP-N3 führte zur Entstehung eines Fusionsproteins aus Peptid-SC und EGFP (Abb. 3). 53 Material und Methoden A) B) Peptid Peptid α2 α1 α2 α1 α3 β2m α3 β 2m EGFP C) S1 β2m peptide signal peptide S2 α2 α1 α3 TM Cyto EGFP mutated stop codon human β2m Abb. 3: Schematische Darstellung von Peptid-SC pEGFP. Die Struktur des von Greten et al. (2002) etablierten, rekombinanten Peptid-SC-Konstruktes wird vergleichend mit dem in dieser Arbeit konstruierten Peptid-SC pEGFP dargestellt (A;B). Durch eine 4-Step-PCR und anschließende Klonierung in den Vektor pEGFP wurde ein Peptid-SC-EGFP-Fusionsprotein mit ausgetauschter Peptidsequenz (AFP bzw. NY-ESO-1) und an die zytoplasmatische Domäne angehängtem EGFP hergestellt (B). Schematische Darstellung der DNA-Sequenz des Peptid-SC pEGFP-Konstruktes. Zwischen dem 3`-Ende der zytoplasmatischen Domäne und dem 5´-Ende des EGFP befindet sich ein mutiertes Stopp-Kodon (C). β2m: β2-Mikroglobulin; S1 bzw. S2: AS-Linker; TM: transmembranäre Region; Cyto: zytoplasmatische Domäne; EGFP: grünfluoreszierendes Protein. Der erste Schritt der Klonierung beinhaltete die Durchführung einer 4-Step-PCR, die es ermöglicht, jedes beliebige MHC-Klasse-I-restringierte Peptid in das Peptid-SC-Konstrukt einzubauen. Hierfür mussten zunächst die DNA-Sequenzen der beiden Primer Oligo A und Oligo B bestimmt werden. Dies erfolgte mit Hilfe des in Abb. 4 dargestellten Schemas. Die grau unterlegte Region stellt die DNA-Sequenz des Peptids dar, die dem 3´-Ende des β2m-Signalpeptids angehängt ist. Durch Austausch der Basenabfolge wurde sie dem entsprechenden Peptid angepasst und die Primer komplementär zu der dargestellten DNASequenz konstruiert. Die Primer TG2, TG10 und Oligo 4 (3.1.10) konnten sowohl zur Herstellung von AFP-SC pEGFP als auch von NY-ESO-SC pEGFP verwendet werden. In Primer TG10 wurde die Restriktionsschnittstelle Mlu I integriert. 54 Material und Methoden β m-Signal 2 atgagtcgctccgtggccttagctgtgctcgcgctactctct Oligo A ctttctggcctggaggct ctgctcttcggctatcccgtctac Peptid-Sequenz Oligo B gtg ggaggtggctccggaggaggtggttctggtggagg β 2m ttcaatccagcgtactccaaa… Abb. 4: Schema zur Herstellung der Primer für die Klonierung von Peptid-SC-Konstrukten. Durch Einfügen der Basenabfolge des gewünschten Peptids (grau unterlegte Region) können die DNA-Sequenzen von Primer Oligo A (rot) und Oligo B (blau) abgelesen werden. Für den ersten PCR-Schritt wurde als Template der Vektor Tax-SC pCR II (3.1.8) eingesetzt. Durch Bindung der Primer TG10 und Oligo A an das 5´- bzw. 3´-Ende des β2mSignalpeptids konnte seine Gensequenz amplifiziert werden. Aufgrund des DNAÜberhangs am 5´-Ende des Oligo A-Primers wurde dem ersten PCR-Produkt außerdem der Anfangsabschnitt der gewünschten Peptid-Sequenz angehängt (Abb. 5A). Im zweiten PCR-Schritt wurde das PCR-Produkt 1 als Template verwendet. Durch Zugabe von Primer TG10 und Oligo B wurde das Amplifikat um den am 5´-Ende des Oligo BPrimers befindlichen DNA-Abschnitt verlängert (Abb. 5B). Die dritte PCR diente der Amplifikation des 3`-Endes des β2m-Genabschnitts (Abb. 5C). Hierfür wurde erneut der Vektor Tax-SC pCR II als Template verwendet, an den sich die Primer Oligo 4 und TG2 anlagern konnten. Im letzten PCR-Schritt erfolgte die Synthese und Vervielfachung des Endproduktes, das sich aus dem β2m-Signal-Genabschnitt, der gewünschten Peptid-Sequenz und dem Anfangsbereich des humanen β2m zusammensetzte. Hierfür wurden die Primer TG10 und TG2 zusammen mit den PCR-Produkten aus der zweiten und dritten PCR als Template eingesetzt (Abb. 5D). 55 Material und Methoden C A TG10 β2m-Signal Oligo 4 β2m-Signal β2m Peptid Oligo A TG2 PCR-Produkt 3 D B TG10 β2m Peptid PCR-Produkt 2 PCR-Produkt 1 TG2 TG10 Oligo B Peptid-Sequenz Endprodukt PCR- Produkt 2 β2m-Signal PCR-Produkt 3 Peptid-Sequenz β2m Abb. 5: Schematische Darstellung der 4-Step-PCR. Anlagerung der Primer TG10 und Oligo A an die DNA-Sequenz des β 2m-Signalpeptids (A). Durch Primer Oligo A wird der amplifizierten Sequenz am 3`-Ende der erste Abschnitt des gewünschten Peptids angehängt (grau untermalte Region). Darstellung des zweiten PCR-Schritts (B). Primer TG10 und Oligo B sorgen für eine Amplifikation des β2m-Signalpeptids, an dessen 3`-Ende sich die komplette Sequenz des gewünschten Peptids befindet. Amplifikation der β2m-Region durch die beiden Primer Oligo 4 und TG2 (C). Durch den Einsatz von PCR-Produkt 2 und 3 als Template sowie TG10 und TG2 als Primer im vierten PCR-Schritt kommt es zur Amplifikation des gewünschten PCR-Endproduktes (D). Zur Überprüfung der Zwischenprodukte erfolgte nach jedem PCR-Schritt der Auftrag von 5 µl der amplifizierten DNA auf ein Elektrophoresegel. Entsprach die Größe der DNA-Bande der Größe des jeweils erwarteten PCR-Produktes, wurde ein 0,5-2,0 µl großes Aliquot aus der PCR-Probe entnommen und direkt als Template für den nächsten PCR-Schritt eingesetzt. Das PCR-Endprodukt wurde nach elektrophoretischer Auftrennung aus dem Gel herausgeschnitten, eluiert (3.2.1.7) und als Template in einer weiteren PCR eingesetzt, die seiner zusätzlichen Amplifikation diente. Es wurden dieselben Primer wie in PCR-Schritt 4 verwendet. Die erhaltene DNA wurde aufgereinigt (3.2.1.12) und nach Verdau mit den Restriktionsenzymen Mlu I, Eco RI und Bam HI in den Vektor M1-SC pCDNA 3 ligiert, der zuvor mit den beiden Enzymen Mlu I und Eco RI geschnitten wurde. Der Einsatz des Enzyms Bam HI war notwendig, um eine Unterscheidung des aus der Spaltung mit Mlu I und Eco RI hervorgehenden, zweiten DNA-Fragmentes (309 bp) von dem Zielfragment (338 bp) zu ermöglichen. Die Plasmid-DNA wurde in E. coli vermehrt, aufgereinigt und auf den korrekten Einbau des Inserts überprüft. Anschließend wurde ein 1 kb großer DNA- 56 Material und Methoden Abschnitt herausgeschnitten, der von den Restriktionsschnittstellen Bgl II und Kpn I flankiert wurde. Das Insert wurde in den Zielvektor HLA-A2 pEGFP-N3 kloniert, der zuvor ebenfalls mit Bgl II und Kpn I verdaut wurde (Abb. 6). A MluI 5 BglII 12 EcoRI 343 Peptid-Sequenz MluI 228 EcoRI 1232 889 HindIII BglII BamHI 445 KpnI 1704 M1-SC komplett B BglII 2396 NotI pEGFP KpnI HLA-A2 Peptid-SC-PCREndprodukt SspI 6757 KpnI HLA-A2 652 pEGFP M1-SC in pCDNA3 HLA-A2 pEGFP Peptid-SC pEGFP Abb. 6: Klonierungsstrategie von Peptid-SC pEGFP-Konstrukten. Nach Verdau des PCREndproduktes mit den Enzymen Mlu I, Eco RI und Bam HI (A; oben) erfolgte die Ligation des ca. 340 bp großen DNA-Fragmentes in den Vektor M1-SC pCDNA 3 (A; Mitte). Ein von den beiden Restriktionsschnittstellen Bgl II und Kpn I flankierter, 1 kb großer Abschnitt wurde anschließend herausgeschnitten und in den Vektor HLA-A2 pEGFP-N3 eingebracht, um ein Fusionskonstrukt aus Peptid-SC und EGFP zu erhalten (A; unten). Darstellung des Endproduktes Peptid-SC pEGFP, das aus dem Peptid-SC-Abschnitt mit gewünschter Peptidsequenz und dem HLA-A2 pEGFP-N3-Fusionskonstrukt besteht (B). 3.2.2.2 Expressionsvektor Influenza M1 pEGFP Um zu untersuchen, ob die mittels aAPCs generierten, M1-spezifischen T-Zellen Reaktivität gegenüber Zellen aufweisen, die das M1-Peptid an ihrer Oberfläche exprimieren, wurden in dieser Arbeit einerseits T2-Targetzellen exogen mit dem relevanten Peptid beladen. Anderseits wurde das Epitop über M1-SC pEGFP-Konstrukte an der Oberfläche von transfizierten Zellen präsentiert. Nachteil beider Methoden ist, dass weder eine intrazelluläre Prozessierung noch reguläre Beladung von MHC-Klasse-I-Molekülen mit dem jeweiligen 57 Material und Methoden Peptid stattfindet. Hierdurch kann nicht gewährleistet werden, dass z.B. die Dichte der Peptid-MHC-Moleküle an der Oberfläche der Targetzelle sowie die Art der Bindung des Antigens an seinen Liganden die in vivo ablaufenden Vorgänge naturgetreu widerspiegeln. Um dies zu erreichen, muss DNA in die Zielzelle eingebracht werden, die für das gewünschte Epitop kodiert. Im Fall von M1 könnte das durch eine Infektion mit Influenza AViren erreicht werden. Eine weitere Möglichkeit besteht in der Transfektion einer HLA-A2positiven Zelllinie mit einem Plasmid, das die relevanten DNA-Abschnitte enthält. Nach intrazellulärer Proteinsynthese würde es hierdurch im Rahmen regulärer Zellumbauprozesse zur Spaltung des Proteins im Zytosol der Zelle kommen. Die Peptidfragmente könnten anschließend im ER an MHC-Klasse-I-Moleküle gebunden und über den Exozytoseweg an die Zelloberfläche transportiert werden (2.1.2). Um herauszufinden, ob die generierten CTLs in der Lage sind, solche intrazellulär prozessierten Peptide zu erkennen, wurde das so genannte Influenza M1 pEGFP-Konstrukt hergestellt. Es enthält u.a. den DNA-Abschnitt des Influenza A-Virus, der für das HLA-A2restringierte Epitop M1 kodiert. Zunächst wurde ein 266 bp großer Abschnitt des Influenza A Matrix-Proteins amplifiziert. Nachfolgend erfolgte der Einbau des hergestellten DNAFragmentes in den Vektor pEGFP-N3. Hierdurch war es möglich, ein Fusionskonstrukt, bestehend aus dem das M1-Epitop enthaltenen Abschnitt des Influenza Matrix-Proteins und dem EGFP des Vektors, zu generieren. Als Grundlage für die Herstellung des Expressionsvektors Influenza M1 pEGFP diente das Plasmid Influenza Flu Matrix pCDNA 3.1 (3.1.8), in dem die komplette DNA-Sequenz des Influenza Matrix-Proteins enthalten ist. Ausgehend von diesem Plasmid wurde eine am 5´Ende lokalisierte 266 bp große Gensequenz des Proteins mittels PCR amplifiziert. In diesem PCR-Fragment war sowohl eine ATG-Startsequenz als auch die für das Influenza M1-Epitop GILGFVFTL kodierende DNA-Sequenz enthalten. Mit Hilfe der für die Amplifikation verwendeten Primer wurde am 5‘-Ende des Gens eine Hind III- und am 3´-Ende eine Bam HI-Restriktionsschnittstelle eingefügt. Um nach Ligation mit dem pEGFP-N3Vektor eine Verschiebung des Leserasters zu vermeiden, erfolgte außerdem der Einbau einer zusätzlichen Base (Zytosin) direkt vor der Bam HI-Schnittstelle am 3´-Ende des Gens. Als Primer wurden Influenza M1 FP für das 5‘-Ende und Influenza M1 RP für das 3‘Ende der zu kodierenden Sequenz verwendet. Nach dem Restriktionsverdau des amplifi- 58 Material und Methoden zierten Fragmentes mit Bam HI und Hind III erfolgte die Insertion in den ebenfalls mit Bam HI und Hind III linearisierten Vektor pEGFP-N3. Der Expressionsvektor Influenza M1 pEGFP wurde nach Überprüfung der korrekten Sequenz mittels Lipofectamin-Transfektion in die eukaryontische Tumorzelllinie NW-38-Mel eingebracht. Die Klonierungsstrategie wird in Abb. 7 dargestellt. A B M1 58-66 HindIII- -KpnI 616 Sac I 622 Hin dIII 632 Bbs I 653HindIII Bsi WI 677 847 Pst I 854 Acc I 857 Ahd I 892 892Bam HI 896 Xcm I Apa LI 4589 Influenza Flu Matrix (in pCDNA3.1) PCR BamHI 1008 Bcg I ATG HindIII- Influenza M1 PCR in pEGFP N3 M1 58-66 -BamHI Influenza M1 Klonierung in pEGFP-N3 4961 base pairs Unique Sites 1616 Bsr GI 1628 Not I 1639 Xba I 1697 Rle AI 1735 Mfe I 1746 Hin cII 1746 Hpa I 1867 Afl II 3211 111I 3100 Fsp I 3085 Msc I 3065 Sfo I 2984 Plasmidkarte von Influenza M1 pEGFP Influenza M1 pEGFP Abb. 7: Herstellung von Influenza M1 pEGFP. Schematische Darstellung der Klonierungsstrategie. Ein mittels PCR amplifiziertes, 266 bp großes DNA-Fragment des Influenza A-Matrix-Proteins wurde nach Verdau mit den Enzymen Hind III und Bam HI in den Vektor pEGFP-N3 kloniert (A). Plasmidkarte des Expressionsvektors Influenza M1 pEGFP (B). 3.2.3 Allgemeine Zellkulturmethoden 3.2.3.1 Kultivierung eukaryontischer Zellen Alle Zellen wurden bei 37 °C, 5 % CO 2 und 95 % Luftfeuchtigkeit in einem Brutschrank kultiviert. Zum Medienwechsel bei Suspensionszellen wurde die Hälfte des Mediums abgesaugt und nachfolgend mit neuem Medium aufgefüllt. Adhäsionszellen wurden mit Hilfe von Trypsin von ihrer Unterlage gelöst, in Kulturmedium aufgenommen und anschließend 10 min in einem sterilen Röhrchen bei 400 x g und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in frischem Medium resuspendiert. Die permanenten Zelllinien wurden alle zwei bis drei Tage gesplittet. Alle Arbeiten erfolgten unter einer sterilen Werk- 59 Material und Methoden bank. Die Zellen wurden in regelmäßigen Abständen auf das Freisein von Mykoplasmen untersucht. 3.2.3.2 Bestimmung der Zellzahl Die Zellzahlbestimmung erfolgte durch Färbung mit Trypanblau. 10 µl Zellsuspension wurden mit Trypanblau (0,5 %-ige Lösung) in einem Verhältnis von 1:1 verdünnt. Ein Aliquot von 10 µl wurde unter ein Deckglas auf eine Neubauer-Zählkammer gegeben. Nach lichtmikroskopischer Auszählung der vier Quadranten erfolgte die Kalkulation der Zellzahl mit Hilfe folgender Formel: Gesamtzellzahl = (Zellzahl aus 2 Großquadranten x ml Gesamtvolumen) x 104 3.2.3.3 Einfrieren und Auftauen von Zellen PBMCs und Zelllinien wurden auf die gleiche Art und Weise eingefroren und aufgetaut. Die Zellen wurden gewaschen, gezählt und auf 5 x 106 bis 1 x 107 Zellen pro ml Einfriermedium eingestellt. Je 1 ml der Zellsuspension wurde in ein Kryoröhrchen gefüllt und in einem Einfrierkontainer mit Isopropanolmantel bei -80 °C eingefroren. Frühestens am folgenden Tag erfolgte die Überführung der Zellen in flüssigen Stickstoff für die Langzeitaufbewahrung. Zum Auftauen wurden die Zellen aus dem Flüssigstickstoff entnommen, in einem 37 °C-Wasserbad angetaut und sofort in ein Röhrch en mit 50 ml NaCl (0,9 %) überführt. Nach einem Zentrifugationsschritt wurden die Zellen gezählt und in einer Zellkulturflasche ausplattiert. 3.2.4 Spezielle Zellkulturmethoden 3.2.4.1 Gewinnung von Serum Frisches Vollblut (ohne Heparin) wurde in ein 50 ml Falkonröhrchen überführt, 3-4 h bei Raumtemperatur stehengelassen und anschließend bei 720 g für 20 min zentrifugiert. Im nachfolgenden Schritt wurde das Serum abpipettiert und bei -20 °C eingefroren. Zur Herstellung von „humanem AB-Serum“ wurden die Seren von jeweils drei Spendern gepoolt. 60 Material und Methoden Kurz vor Verwendung wurde das Serum aufgetaut und für 45 min bei 56 °C im Wasserbad hitzeinaktiviert. 3.2.4.2 Isolierung mononukleärer Zellen aus dem peripheren Blut Als Ausgangsmaterial zur Isolierung humaner Monozyten und Lymphozyten wurde heparinisiertes Vollblut gesunder, HLA-A2-positiver Spender verwendet (3.1.5.3). Die Isolierung der Leukozyten erfolgte mittels Dichtegradientenzentrifugation. Sie ermöglicht die Auftrennung von Gemischen mononukleärer Zellen aus dem peripheren Blut (PBMCs) mit Hilfe eines Ficoll-Gradienten (Dichte: 1,077 g / ml). Zunächst wurden 15 ml des Separationsmediums (Ficoll) in ein Leukosep-Röhrchen überführt und anschließend 30 Sekunden bei 400 x g und RT zentrifugiert. Nachfolgend wurde das heparinisierte Blut in das Röhrchen pipettiert und mit NaCl (0,9 %) auf ein Gesamtvolumen von 50 ml aufgefüllt. Die 30minütige Zentrifugation erfolgte bei 800 x g, 25 °C und ausgestellter Bremse. Nach Entfernung eines Teils der Plasmafraktion (oberste Schicht) konnte die als buffy coat bezeichnete, angereicherte Zellfraktion (Interphase aus Lymphozyten / PBMCs) mit Hilfe einer Pasteurpipette geerntet werden. Die Zellen wurden mehrmals in NaCl (0,9 %) gewaschen und anschließend gezählt. 3.2.4.3 Gewinnung von Monozyten aus dem peripheren Blut Ausgangsmaterial für die Anreicherung von Monozyten waren mononukleäre Zellen des peripheren Blutes, die mittels Dichtegradientenzentrifugation gewonnen wurden (3.2.4.2). Die PBMCs wurden entweder frisch isoliert oder kurz vor Gebrauch aufgetaut. Pro Ansatz wurden 2 bis 3 x 107 Zellen eingesetzt. Das nachfolgend beschriebene Protokoll bezieht sich auf 1 x 107 Zellen. Die Zellen wurden zunächst gewaschen und das Pellet in 80 µl MACS-Puffer aufgenommen. Anschließend erfolgte der Zusatz von 20 µl CD14 MicroBeads zu der Zellsuspension. Der Ansatz wurde für 15 min bei 4 °C inkubiert. Alle 3 min erfolgte eine Durchmischung der Zellen, um die Effizienz der Antikörperbindung zu erhöhen. Nach Zugabe von 5 ml MACS-Puffer wurden die Zellen über einen 70 µm Nylon-Filter filtriert, um Aggregate zu entfernen. Der Filter wurde einmal mit 5 ml MACS-Puffer gespült und die Zellsuspension zentrifugiert (400 x g, 10 min, 4 °C). Nach Verwerfen des Überstandes wurde das Zellpellet in 500 µl MACS-Puffer aufgenommen und auf eine Separati- 61 Material und Methoden onssäule des MACS-Systems gegeben, die zuvor mit 500 µl MACS-Puffer equilibriert wurde. Durch das die Säule umgebende magnetische Feld wurden die markierten Zellen im System gehalten. Der Durchlauf mit depletierten Zellen wurde aufgefangen. Anschließend wurde die Säule fünfmal mit je 500 µl MACS-Puffer gewaschen. Nach dem Herausnehmen der Säule aus dem Ständer wurden die positiv selektierten Zellen mit 1 ml MACS-Puffer durch Einsetzen des Kolbens aus der Säule gewaschen und separat aufgefangen. Die Zellsuspension wurde zentrifugiert, das Pellet in 1 ml DC-Medium aufgenommen und die Reinheit nach Bestimmung der Zellzahl durchflusszytometrisch analysiert. Hierzu wurden PBMCs vor Selektion, depletierte sowie selektierte Zellen mit einem gegen humanes CD14 gerichteten Antikörper gefärbt (3.1.7). Nur Zellen, die eine Reinheit von über 80 % aufwiesen, wurden für die in vitro-Generierung von DCs aus mononukleären Zellen des Blutes (MoDCs) (3.2.4.8) eingesetzt. 3.2.4.4 Transfektion eukaryontischer Zellen Elektroporation Die Elektroporation stellt eine Möglichkeit dar, Plasmid-DNA in eukaryontische Zellen einzubringen. Am Vortag der Transfektion wurden die Zellen gesplittet. 1 x 107 der sich in der exponentiellen Wachstumsphase befindlichen Zellen wurden 24 h später geerntet und das Zellpellet nach zweimaligem Waschen mit NaCl (0,9 %) in 1 ml Kulturmedium aufgenommen. 0,7 ml der Zellsuspension sowie 20 µg Plasmid-DNA wurden in eine eisgekühlte Elektroporationsküvette überführt und nach Durchmischung für 10 min auf Eis gestellt. Nachfolgend wurde die Küvette auf den Schlitten des Elektroporationsgerätes verbracht und die Elektroporation mit 0,35 kV und 0,95 µF durchgeführt. Die Zeitkonstante lag zwischen 17 und 22 msec. Nach einer dreiminütigen Inkubation auf Eis wurden die Zellen in 7,5 ml Medium aufgenommen und für zwei Tage ohne Antibiose in den Brutschrank gestellt. Zur Selektion und Vermehrung erfolgreich transformierter Zellen wurden am dritten Tag Verdünnungsreihen hergestellt. Ziel sollte sein, einen Zellklon aus möglichst einer positiven Zelle zu gewinnen. Hierzu wurden die Zellen nach Zentrifugation in 22 ml Medium zzgl. 1 mg / ml G418 aufgenommen. Die Zellsuspension wurde anschließend auf einer 96-Flachbodenmikrotiterplatte ausplattiert (180 µl / Well). 2 ml des restlichen Mediums 62 Material und Methoden wurden 1:10 mit Medium plus G418 verdünnt und auf einer weiteren Mikrotiterplatte verteilt. Dieser Vorgang wurde insgesamt noch zweimal wiederholt, so dass am Ende vier Verdünnungen vorlagen: unverdünnt, 1:10, 1:100 und 1:1000. Nach zwei bis drei Wochen waren Zellklone makroskopisch sichtbar und konnten nach ausreichender Proliferation geerntet werden. Die Zellen eines Klons wurden unter dem Fluoreszenzmikroskop betrachtet und bei sichtbarer, grüner Fluoreszenz einer FCM-Analyse unterzogen. Hierbei wurden die Zellen auf GFP- sowie MHC-Klasse-I-Expression untersucht. Positive Zellen wurden in Kultur genommen und in regelmäßigen Abständen auf stabile Transformation überprüft. In dieser Arbeit erfolgte die Transfektion von in Suspension wachsenden Tumorzelllinien mittels Elektroporation. Folgende Zellen wurden mit Hilfe dieser Methode hergestellt: Daudi M1-SC, Daud AFP-SC, Daudi NY-ESO-SC, K562 HLA-A2 und K562 M1-SC. Transfektion mittels Lipofektamin Bei der Transfektion mit Hilfe von Lipofektamin wird die DNA als Teil eines Komplexes mit Lipopolysacchariden in eukaryontische Zellen eingebracht. Lipopolyamine binden die DNA und bedecken sie mit einer kationischen Schicht. Solche Komplexe adsorbieren an die Zelloberfläche, fusionieren mit der Zellmembran oder werden durch Endozytose aufgenommen und transportieren somit die DNA ins Zytoplasma. Die Lipofektamin-Methode eignet sich vor allem gut für die Transfektion adhärent wachsender Zellen. Sie diente in dieser Arbeit der Generierung von NW-38-Mel M1- sowie Hlx Pxt M1-SC-Zellen. Hierfür wurde ein kommerziell erhältliches Kit verwendet (3.1.3). 5 x 105 Zellen wurden in je 2 ml Medium ohne Antibiose aufgenommen und auf einer 6Well-Platte ausplattiert. Die Zellen wiesen i.d.R. nach 24-48 h ausreichende Konfluenz (70-90 %) auf. Nun erfolgte die tropfenweise Addition eines Lipofektamin-DNAGemisches, das zuvor durch 30-minütige Inkubation von jeweils 5 µl Lipofektamin mit 5 µg DNA in 500 µl Optimem-Medium hergestellt wurde. Eine Analyse der Zellen auf GFPExpression erfolgte nach 48 h mittels FCM bzw. Fluoreszenzmikroskopie. Um positive Zellklone zu erhalten, wurden Verdünnungsreihen angesetzt (siehe oben). 63 Material und Methoden 3.2.4.5 Bestrahlung von Zellen Um die Proliferation von Zellen in Kultur zu verhindern, wurden diese über einen definierten Zeitraum einer γ-Strahlungsquelle ausgesetzt. Die Bestrahlung von Zellen induziert irreversible DNA-Schäden, die über die Aktivierung von p53 zur Einleitung der Apoptose und somit zum irreversiblen Zelltod führen. Die Stärke der Bestrahlung richtete sich nach der jeweiligen Zellart. Sie betrug bei den Zelllinien Daudi, K562, EBV-Rosi und den CD40L-exprimierenden NIH/3T3-Zellen 80 Gy. PBMCs wurden mit 50 Gy bestrahlt. 3.2.4.6 Herstellung von PHA-Blasten Zur Herstellung von PHA-Blasten wurden 4 x 107 frisch isolierte PBMCs in einer Konzentration von 2 x 106 Zellen / ml humanes T-Zellmedium zzgl. 60 U / ml IL-2 in einer 75 cm2 Kulturflasche ausplattiert. Zur Stimulation der Zellen erfolgte die Zugabe von 20 µg PHA. An Tag vier wurden die Zellen gewaschen, gezählt und anschließend 1 x 106 Zellen / ml Medium neu ausgesät. Am siebten Tag wurden die PHA-Blasten in frisches Medium ohne IL-2 überführt und nach 24 h für die Austestung des TCGF-Mediums im ProliferationsAssay eingesetzt. 3.2.4.7 TCGF-Medium Herstellung Als TCGF wird ein Medium bezeichnet, das als Zusatz für die Kultivierung von humanen T-Zellen verwendet werden kann. Es wird aus dem Überstand mitogenaktivierter Leukozyten gewonnen und setzt sich aus einer Vielzahl löslicher Faktoren, unter anderem IL-2, zusammen, die die in vitro-Proliferation von T-Zellen fördern. Das in dieser Arbeit verwendete TCGF wurde bis auf einige Modifikationen entsprechend dem von OELKE et al. (2000) etablierten Protokoll hergestellt. Zunächst wurden drei buffy coats (3.1.5.3) in einem Verhältnis von 1:1 mit PBS verdünnt und die PBMCs anschließend mittels Ficoll isoliert. 2 x 109 PBMCs wurden nachfolgend in 30 ml M´-Medium (3.1.6.2) aufgenommen und jeweils 5 ml dieser Zellsuspension in einer großen Kulturflasche (175 cm2), die zuvor mit 165 ml M´-Medium befüllt wurde, ausgesät. Zur Stimulation wurden jeweils 3 ml sterilfiltriertes Aktivierungsmedium (3.1.6.2) sowie 6,7 64 Material und Methoden x 106 bestrahlte, EBV-transformierte B-Zellen (EBV-Rosi) zugegeben. Nach einer Inkubationszeit von 3 h bei 37 °C und 5 % CO 2 wurde die Zelladhäsion am Flaschenboden verifiziert und der Überstand vorsichtig abgenommen. Anschließend wurde jede Flasche dreimal vorsichtig mit je 50 ml M´-Medium gewaschen und nach Zugabe von 170 ml frischem M´-Medium für weitere 36 h im Brutschrank inkubiert. Der Zellüberstand wurde geerntet, 10 min bei 400 x g zentrifugiert, sterilfiltriert (0,45 µm Porengröße) und anschließend bei -20° C gelagert. Prüfung des hergestellten TCGF-Mediums Um die Wirksamkeit des hergestellten TCGF zu beurteilen, wurde sein Einfluss auf die Proliferation von PHA-Blasten untersucht. Hierzu wurden verschiedene Konzentrationen an TCGF hergestellt und nach mehrtägiger Inkubation die Vermehrung der PHA-Blasten mittels Proliferations-Assay bestimmt. In der vorliegenden Arbeit wurde zur Austestung des TCGF ein Thymidin-Assay durchgeführt. Zunächst wurden pro Well einer 96Rundbodenmikrotiterplatte 1 x 105 PHA-Blasten in einem Volumen von 50 µl humanem TZellmedium ausplattiert. Es wurde eine Verdünnungsreihe mit zehn verschiedenen Konzentrationen TCGF bzw. TCGF-Standard (3.1.6.2) hergestellt und jeweils 50 µl der entsprechenden Verdünnung zu den Targetzellen gegeben. Als Negativkontrolle wurden PHA-Blasten ohne TCGF und als Basalwert Medium ohne Zellen verwendet. Für jede Bedingung wurden Triplikate angesetzt. Die Zellen wurden für 48 h im Brutschrank inkubiert und anschließend erfolgte die Zugabe von 37 kBq [3H]-Thymidin pro Well in einem Volumen von 100 µl Medium. Nach 18-stündiger Inkubation bei 37 °C und 5 % CO 2 wurden die Proben eingefroren und die Radioaktivität zu einem späteren Zeitpunkt ermittelt (3.2.5.3). Die Messwerte wurden gemittelt und der Wert der Negativkontrolle von allen Messwerten subtrahiert. Die einzusetzende Konzentration an TCGF in der T-Zellkultur wurde durch Vergleich der ermittelten Werte des neu hergestellten TCGF mit dem TCGF-Standard bestimmt. 3.2.4.8 Generierung peptidspezifischer CTLs Die Generierung peptidspezifischer CTLs erfolgte aus PMBCs HLA-A2-positiver Spender. Die Konzentration eingesetzter PBMCs betrug 2 x 106 Zellen / ml humanes T-Zellmedium. 65 Material und Methoden Sie wurden in einem Gesamtvolumen von 1 ml jeweils in die Vertiefung einer 48Mikrotiterplatte gegeben. Die Zellen wurden je nach Versuchsansatz durch Zugabe von Peptid bzw. antigenpräsentierenden Zellen stimuliert. Eine Restimulation der Zellen wurde wöchentlich durchgeführt. Hierzu wurden sie geerntet und nach Auszählung in einer Konzentration von 2 x 106 Zellen / ml neu ausplattiert. Zur Stimulation wurden antigenpräsentierende Zellen in entsprechender Menge zugegeben. 24 h nach jeder Stimulation bzw. Restimulation erfolgte die Zugabe von IL-2 (60 U / ml). Bei Gelbverfärbung des Mediums wurden die Zellen des jeweiligen Wells gesplittet und frisches Kulturmedium plus 60 U / ml IL-2 hinzugegeben. Generierung antigenspezifischer CTLs mit autologen PBMCs Diese Methode wurde u.a. durchgeführt, um die generelle Reaktivität der HLA-A2positiven Spender gegenüber dem Influenza M1-Peptid zu überprüfen. Hierzu wurde das Peptid dem Medium zu Kulturbeginn in einer Konzentration von 0,2 µg / ml zugesetzt. Das Peptid kann von im PBMC-Pool befindlichen APCs aufgenommen und den T-Zellen präsentiert werden. Nach einwöchiger Inkubation wurden die CD8+ T-Zellen entweder auf Peptidspezifität untersucht oder es erfolgte eine Restimulation mit Hilfe autologer PBMCs, die über 2 h mit 30 µg / ml M1-Peptid inkubiert wurden. Nach Bestrahlung wurden sie in einem Verhältnis von 1:10 zu den zu stimulierenden Zellen gegeben. Generierung antigenspezifischer CTLs mit autologen MoDCs Um peptidspezifische T-Zellen zu generieren, werden üblicherweise DCs eingesetzt, da es sich hierbei um die potentesten APCs handelt. Sie können in vitro aus myeloiden Vorläuferzellen generiert werden und nach Beladung mit dem gewünschten Peptid spezifische TZellen zur Proliferation anregen. In dieser Arbeit wurde die Generierung von DCs aus CD14+ Zellen durchgeführt. Die Isolation CD14+ Zellen erfolgte aus PBMCs HLA-A2-positiver Spender mittels magnetisch aktivierter Zellseparation (3.2.4.3). Die Zellen wurden anschließend in einer Anzahl von 5 x 105 pro Vertiefung einer 96-Flachbodenmikrotiterplatte ausgesät. Pro Well wurde ein Volumen von 100 µl eingesetzt. Als Medium wurde DC-Medium verwendet, dem 1000 U / ml GM-CSF sowie 1000 U / ml IL-4 zugesetzt wurde. Am zweiten und vierten Tag erfolgte 66 Material und Methoden eine zusätzliche Addition von jeweils 50 µl desselben Mediums. Zur Reifung der DCs wurden am sechsten Tag 100 ng / ml LPS zur Kultur gegeben. Natürlicherweise befindet sich LPS in der Zellmembran gramnegativer Bakterien. Es bindet an TLR 4 auf der Oberfläche von Zellen des angeborenen Immunsystems und induziert deren Aktivierung durch Ingangsetzung intrazellulärer Signalkaskaden. Hieraus resultiert eine Freisetzung von Zytokinen sowie eine Expressionsmodulation von Oberflächenmolekülen (MEDZHITOV und JANEWAY, Jr., 1997). An Tag sieben wurden die Zellen geerntet, gezählt und auf eine Zellkonzentration von 1,5 x 106 Zellen / ml humanes T-Zellmedium eingestellt. Entsprechend des von OELKE et al. (2000) beschriebenen Protokolls erfolgte die Peptidbeladung durch eine zweistündige Inkubation der MoDCs mit 30 µg / ml M1-Peptid sowie 10 µg / ml β2m im Brutschrank. Anschließend wurden die Zellen zweimal gewaschen und zu 2 x 106 PBMCs desselben Spenders in einem Verhältnis von 1:10 gegeben. Zur Restimulation wurden autologe PBMCs verwendet, die genau wie die MoDCs für 2 h mit 30 µg / ml M1-Peptid sowie 10 µg / ml β2m inkubiert wurden. Nach Bestrahlung wurden sie in einem Verhältnis von 1:5 zu den zu stimulierenden Zellen gegeben. Generierung antigenspezifischer CTLs mit aAPCs Bei der Stimulation antigenspezifischer T-Zellen mit künstlichen APCs wurden Letztere nach Bestrahlung und zweimaligem Waschen in jeweils angegebener Menge zu den PBMCs des entsprechenden Spenders gegeben. Daudi Peptid-SC-Zellen wurden, sofern angegeben, vor ihrer Verwendung als antigenpräsentierende Zellen über 24 h mit 10 ng / ml LPS, 500 U / ml IL-4 und CD40Lexprimierenden NIH/3T3-Zellen in einem Verhältnis von 10:1 stimuliert. Sie wurden hierzu in einer Konzentration von 1 x 106 Zellen / ml pro Vertiefung einer 24-Mikrotiterplatte ausgesät. Eine Aktivierung der Daudi-Zellen erfolgt hierbei durch Bindung von LPS an TLR 4, von CD40L an CD40 sowie von IL-4 an den IL-4-Rezeptor auf ihrer Oberfläche. K562 HLA-A2-Zellen wurden vor ihrer Bestrahlung mit M1-Peptid beladen, indem 1,5 x 106 Zellen / ml für 2 h mit 30 µg / ml M1-Peptid im Brutschrank inkubiert wurden. Die Restimulation der peptidspezifischen T-Zellen mit aAPCs erfolgte wöchentlich in gleicher Art und Weise wie die initiale Stimulation. 67 Material und Methoden 3.2.5 Charakterisierung von Zellen 3.2.5.1 Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie Untersuchung der Immunfluoreszenz mittels Fluoreszenzmikroskop In dieser Arbeit erfolgte die Transfektion eukaryontischer Zellen mit so genannten Fusionskonstrukten, bei denen die Peptid-SC- bzw. Influenza M1-Sequenz kovalent an EGFP gekoppelt wurde. EGFP ist ein grünfluoreszierendes Protein, das eine Variante des aus der Qualle Aequorea victoria isolierten GFP darstellt. Durch seine Verwendung können plasmidtragende Zellen als solche im Fluoreszenzmikroskop erkannt werden. Das Prinzip der Fluoreszenzmikroskopie besteht darin, dass der entsprechende Farbstoff durch Licht einer bestimmten Wellenlänge (495 nm) angeregt und das abgetrahlte Licht, das im Bereich des sichtbaren Spektrums liegt, durch einen selektiven Filter zum Betrachter geleitet wird. Mit Hilfe einer Digitalkamera können die Bilder abfotografiert und auf einen Computer übertragen werden. Durchflusszytometrie Die fluoreszenzaktivierte Zellanalyse (FCM-Analyse) ist ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Oberflächenmolekülen und intrazellulären Proteinen. Grundlage ist die Antigen-Antikörper-Reaktion, die mit Fluoreszenzfarbstoff-markierten Antikörpern durchgeführt wird. Zur Analyse werden die Zellen in einer Einzelzellsuspension durch hydrodynamische Fokussierung an einem gebündelten Argonlaserstrahl vorbeigeleitet. Bei exakter Anregung der Elektronen des Fluoreszenzfarbstoffes durch den monochromatischen Laserstrahl werden diese auf ein höheres Energieniveau gehoben und fallen anschließend unter Abgabe von Energie in Form von Photonen auf ihr Ursprungsniveau zurück. Die emittierte Photonenkonzentration, die durch einen Photodetektor registriert und nach Verstärkung zuerst in ein elektrisches und anschließend in ein digitales Signal umgewandelt wird, verhält sich proportional zur Menge an gebundenen Antikörpern pro Zelle. Eine gleichzeitige Messung mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen ist möglich, weil sich die eingesetzten Farbstoffe zwar bei einer gemeinsamen Wellenlänge anregen lassen aber über unterschiedliche, für den jeweiligen Farbstoff charakteristische Emmissionsspektren 68 Material und Methoden verfügen. Die Emission kann entsprechend ihrer Wellenlänge von vier verschiedenen Kanälen des FACSCalibur erfasst werden: Kanal 1 (Fl 1): Emissionsmaximum 530 nm (z. B. FITC, GFP); Kanal 2 (Fl 2): Emissionsmaximum 585 nm (z. B. PE); Kanal 3 (Fl 3): Emissionsmaximum 670 nm (z. B. Cy5-PE, PI, 7AAD); Kanal 4 (Fl 4): Emissionsmaximum 661 nm (z. B. APC). Zusätzlich werden durch die Lichtbeugung und -streuung Informationen über die Zellgröße und die Binnenstruktur der Zelle gewonnen, was eine Identifikation unterschiedlicher Zellpopulationen (z.B. Lymphozyten, Makrophagen) ermöglicht. Das in einem geringen Winkel gestreute Licht wird als Vorwärtsstreuung (FSC) erfasst und durch die Zellgröße beeinflusst. Im rechten Winkel dazu kann die Seitwärtsstreuung (SSC) registriert werden, deren Stärke vom Grad der zellulären Granularität und Komplexität abhängig ist. Mit Hilfe der Software „Cell Quest“ erfolgte die computergestützte Auswertung der Daten. Die Ergebnisse wurden mehrparametrisch als korrelierte Punktediagramme (Dot Plots) oder Histogramme dargestellt. Zur Definition einzelner Untergruppen der Messereignisse (Events) wurden nach der Messung softwaregestützt elektronische „Fenster“ (Gates) gesetzt und zum Teil mehrere Fenster logisch miteinander verknüpft. Anhand der Negativpopulation wurden im Dot Plot Quadranten festgelegt, wobei UR (upper right) die obere rechte, UL (upper left) die obere linke, LR (lower right) die untere rechte und LL (lower left) die untere linke Population beschreibt. In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Zellen hinsichtlich ihrer Expression bestimmter Oberflächenmoleküle sowie intrazellulärer Zytokine untersucht. Neben der Oberflächen-FCM-Analyse wurde der zytoplasmatische Gehalt an IFN-γ mittels intrazellulärer FCM-Analyse bestimmt. Die bei den verschiedenen Messungen verwendeten Antikörper wurden unter 3.1.7 aufgelistet. Sie wurden vor Verwendung austitriert, um ihre optimale Konzentration zu ermitteln. Zur Bestimmung des Prozentanteils peptidspezifischer Zellen in der T-Zellpopulation sowie der Anzahl peptidspezifischer T-Zellen in der Gesamtpopulation wurden die nachfolgend aufgeführten Formeln eingesetzt: 69 Material und Methoden IFN-γγ UR=13,3% 19,6% 5,8x106 CD3+CD8+ % peptidspez. T-Zellen in CD3+CD8+ Zellpopulation = 100 / (UR (%) + LR (%)) x UR Anzahl Peptid-spezifischer CD3+CD8+ Zellen = Zellzahl (total) x UR (%) / 100 Oberflächen-FCM-Analyse Die FCM-Analyse von Zelloberflächenmolekülen wurde in 96-Rundbodenmikrotiterplatten durchgeführt. Nach Bestimmung der Zellzahl (pro Ansatz wurden in der Regel 1 x 105 bis 5 x 105 Zellen eingesetzt) wurden die Zellen zweimal mit FACS-Puffer gewaschen und anschließend mit den entsprechenden Antikörpern für 30 min im Dunkeln auf Eis inkubiert. Nichtgekoppelte Antikörper wurden durch zweimaliges Waschen mit FACS-Puffer und anschließende Zentrifugation (2 min, 400 x g) entfernt. Durch Verwendung von Isotypenkontrollen wurden unspezifische Bindungen des jeweiligen Antikörpers ausgeschlossen. Bei unkonjugierten, primären Antikörpern erfolgte nun die Zugabe des sekundären, fluoreszierenden Anti-Immunglobulins zu den Zellen (indirekte Immunfluoreszenz). Hintergrundfärbung wurde durch alleinige Addition des sekundären Antikörpers bestimmt. Nach 30-minütiger Inkubation wurden die Zellen erneut gewaschen und in je 200 µl FACS-Puffer überführt. Zum Ausschluss toter Zellen erfolgte anschließend die Zugabe von 7AAD zu den Proben. Bestimmung der Peptidspezifität mittels Pentamer-Färbung Bei der Färbung mit multimeren MHC-Molekülen handelt es sich um eine sensitive Methode zur Identifizierung von antigenspezifischen T-Zellen (ALTMAN et al., 1996). Sie beruht auf der spezifischen Bindung von T-Zellen an ihren Peptid-MHC-Komplex. Durch die Verwendung von MHC-Multimeren können mehrere TCR-Moleküle gleichzeitig gebunden 70 Material und Methoden werden, was zu einer stabilen Interaktion mit der Effektor-T-Zelle führt. Klassischerweise werden für die Quantifizierung von peptidspezifischen T-Zellen so genannte MHCTetramere eingesetzt. Sie werden hergestellt, indem lösliche, humane MHC-Klasse-IMoleküle mit unterschiedlichen Systemen exprimiert und nach Reinigung, Anreicherung und Biotinylierung mit antigenspezifischen Peptiden gekoppelt werden. Anschließend erfolgt eine Tetramerisierung mit Hilfe von Streptavidin. Die entstandenen, peptidspezifischen MHC-Tetramere können mit fluoreszierenden Farbstoffen markiert und direkt für die Analyse im Durchlußzytometer eingesetzt werden. Die in dieser Arbeit verwendeten MHCPentamere stellen eine Weiterentwicklung der tetrameren Moleküle dar. Sie bestehen aus fünf MHC-Peptid-Komplexen, die über eine spezifische Domäne multimerisiert werden. Durch ihre spezielle Konfiguration sind alle fünf MHC-Peptid-Komplexe in der Lage, an einen TCR zu binden. Dies führt zu einer stabilen Interaktion mit hoher Avidität. Pro Ansatz wurden 3 x 105 Zellen in FACS-Puffer aufgenommen, zentrifugiert und anschließend das Pellet mit 30 µl des verdünnten, fluoreszenzmarkierten MHC-PeptidPentamer-Komplexes versetzt. Nach einer 15-minütigen Inkubation im Dunkeln bei RT wurden die Zellen zweimal gewaschen und nachfolgend mit einem gegen humanes CD8 gerichteten, verdünnten Oberflächen-Antikörper gefärbt. Das Färbevolumen betrug ebenfalls 30 µl. Nach 20-minütiger Inkubation bei 4 °C w urden die Zellen gewaschen, in 180 µl FACS-Puffer aufgenommen und im FACSCalibur-Durchflusszytometer analysiert. Der Ausschluss toter Zellen erfolgte mit Hilfe von 7AAD. IFN-γ-Bestimmung mittels intrazellulärer FCM-Analyse Die Durchflusszytometrie bietet zusammen mit neuen Techniken für intrazelluläre Zytokinanfärbung die Möglichkeit, antigenspezifische T-Zellen genauer zu charakterisieren (JUNG et al., 1993). T-Zellen, die spezifisch aktiviert werden, produzieren nach Erkennung ihres Antigens verschiedene Zytokine, wie z.B. IFN-γ. Diese Reaktion stellt einen ersten Schritt in der zellulär vermittelten Immunantwort dar. Mittels Durchflußzytometrie können die antigenspezifischen T-Zellen phänotypisch auf Einzelzellebene charakterisiert werden. Die zu testenden Zellen werden zunächst zur spezifischen Zytokinproduktion angeregt, indem sie mit antigenpräsentierenden Targetzellen, die das entsprechende Peptid an ihrer Oberfläche tragen, stimuliert werden. Während der Inkubation wird dem Medium Brefeldin 71 Material und Methoden A zugefügt. Brefeldin A bewirkt eine Hemmung des Proteintransportes in der Zelle und induziert somit eine intrazelluläre Anreicherung synthetisierter Zytokine. Durch Paraformaldehyd werden die Zellen nachfolgend fixiert und Saponin sorgt dafür, dass die Membran für Antikörper permeabel wird. In dieser Arbeit wurde der Nachweis des intrazellulär synthetisierten Zytokins IFN-γ mittels BD Cytofix / Cytoperm™-Kit entsprechend Herstellerangaben durchgeführt. In einer initialen Stimulationsphase wurden zunächst jeweils 1 x 106 Effektorzellen / ml humanes T-Zellmedium eingestellt und mit T2-Zellen in einem Verhältnis von 1:1 gemischt. Das entsprechende Peptid wurde in einer Konzentration von 1 µg / ml hinzugegeben. Als Negativkontrolle erfolgte die Inkubation der Effektorzellen mit T2-Zellen, die mit einem irrelevanten Peptid beladen wurden. Für die Postitivkontrolle wurden die Zellen unspezifisch mit einer Kombination aus PMA (50 ng / ml) und Ionomycin (1 µg / ml) stimuliert. Nach einstündiger Inkubation bei 37 °C wurde zu jedem Ansatz 1 µl / ml Brefeldin A (Golgi-Plug™) gegeben und die Zellen anschließend für weitere 5 h inkubiert. Nach zweimaligem Waschen der Zellen in FACS-Puffer und Transfer in eine 96- Rundbodenmikrotiterplatte erfolgte die Oberflächenfärbung mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern, die gegen humanes CD3 und CD8 gerichtet waren. Weiterhin wurde in diesem Schritt eine Totzellfärbung mit 7AAD durchgeführt. Nichtgebundene Antikörper wurden in einem nachfolgenden Waschschritt entfernt. Die Fixation und Permeabilisation der Zellen wurde mit Cytoperm / Cytofix durchgeführt. Die Zellen wurden anschließend zweimal in Perm / Wash gewaschen und IFN-γ-positive Zellen durch eine 30-minütige Inkubation mit FITC-gekoppelten, Anti-human IFN-γ-Immunglobulinen markiert. Als Kontrolle wurde FITCgekoppelter Maus IgG1-Isotyp verwendet. Zur Bestimmung der Antigenspezifität wurden die oben angegebenen Formeln angewandt. Die Ergebnisse der Kontrollstimulation (T2Zellen plus irrelevantes Peptid) wurden von denen der peptidspezifischen Stimulation subtrahiert. 3.2.5.2 Bestimmung der GM-CSF-Konzentration mittels Zytokin-ELISA Eine andere Möglichkeit, Zytokine, die von antigenspezifischen T-Zellen sezerniert werden, nachzuweisen, ist der enzymgekoppelte Immunabsorptionstest (ENGVALL und PERLMAN, 1971). Das Prinzip dieses Sandwich-ELISAs besteht darin, dass antigenspezi- 72 Material und Methoden fische Antikörper, die das entsprechende Antigen mit einer hohen Affinität binden, an einen Träger gekoppelt werden. Sie können das Antigen auf der Trägeroberfläche konzentrieren. Ein weiterer markierter Antikörper, der im Vergleich zum fixierten Antikörper ein anderes Epitop auf dem Antigen erkennt, dient dann dem Nachweis des Antigens. Die spezifische Bindung kann durch einen enzymatischen Farbwechsel dargestellt werden. In dieser Arbeit diente die Messung der GM-CSF-Konzentration der Überprüfung der Spezifität generierter Effektor-T-Zellen. Hierzu wurden jeweils 1 x 105 Effektorzellen pro Vertiefung einer 96-Rundbodenmikrotiterplatte pipettiert. Zu diesen Zellen wurden Targetzellen in einem Verhältnis von 1:1 gegeben. T2-Targetzellen wurden zuvor mit dem entsprechenden Peptid beladen, indem es ihnen in einer Konzentration von 1 µg / ml zugesetzt wurde. Die Zellen wurden über einen Zeitraum von 24 h im Brutschrank inkubiert. Anschließend erfolgte die Bestimmung des humanem GM-CSF im Überstand mittels DuoSetELISA-Kit nach Angaben des Herstellers. Die Intensität der Enzymreaktion und die damit korrespondierende Farbintensität waren proportional zum Gehalt an GM-CSF. Die Auswertung erfolgte photometrisch mittels ELISA-Reader bei einer Wellenlänge von 450 nm. Durch einen Vergleich der Werte mit einer angelegten Kalibrierungsreihe konnten die absoluten GM-CSF-Gehalte der Proben ermittelt werden. 3.2.5.3 Proliferations-Assays Für einen erfolgreichen adoptiven T-Zell-Transfer ist es bedeutsam, dass die generierten Effektorzellen nach Injektion in den Patienten in relativ großer Anzahl und über einen möglichst langen Zeitraum persistieren können. Grundvoraussetzung hierfür ist einerseits, dass optimale in vitro-Bedingungen geschaffen werden, um eine starke Expansion der gewünschten CTLs zu erreichen. Andererseits müssen die Zellen auch in vivo die Fähigkeit besitzen, nach Antigenkontakt zu proliferieren. Diese Antwort sollte möglichst spezifisch sein, um eine Expansion unerwünschter Zellen und somit die Gefahr des Auftretens von Autoimmunerkrankungen soweit wie möglich zu minimieren. Somit ist die Proliferation ein sehr bedeutsamer in vitro-Parameter für die in vivo-Funktionalität generierter CTLs. Eine Möglichkeit, die Proliferation von Zellen als Antwort auf eine spezifische Stimulation zu bestimmen, ist der Thymidin-Assay. Alternativ hierzu kann die T-Zellproliferation ebenfalls mittels CFSE-Assay detektiert werden. 73 Material und Methoden CFSE-Assay Die Fähigkeit der generierten T-Zellen nach Stimulation mit dem entsprechenden Antigen zu proliferieren, wurde mittels 5-(6)-Carboxyfluorescein-Diazetat-Succinimidylester (CFSE) untersucht (LYONS und PARISH, 1994). CFSE ist ein Fluorescein-Derivat und in seiner ursprünglichen Form membranpermeabel und nicht fluoreszierend. Nach Diffusion in die Zelle werden durch intrazelluläre Esterasen Azetatgruppen abgespalten, wodurch das Molekül in einen membranimpermeablen und grünfluoreszierenden Farbstoff umgewandelt wird. Zusätzlich bindet CFSE stabil an intrazelluläre Proteine. Proteine mit langer Halbwertszeit, wie z.B. die des Zytoskeletts, sind für die lange Haltbarkeit der CFSE-Färbung verantwortlich. Im Zuge von Zellteilungsprozessen kommt es zu einer fortschreitenden Verdünnung des Farbstoffes, der sich gleichmäßig auf die beiden Tochterzellen aufteilt. Anhand der mittels Durchflusszytometrie gemessenen Farbintensität kann auf die Stärke der Zellproliferation geschlossen werden. 1 x 107 CTLs wurden in 20 ml PBS plus 1 mg / ml BSA aufgenommen und mit 1,5 µmol / l CFSE für 9 min bei 37 °C im Dunkeln inkubiert. Durch A ddition von 25 ml FCS wurde die Reaktion gestoppt und die Zellen 3 x mit NaCl (0,9 %) gewaschen. Jeweils 1 x 106 Zellen wurden anschließend in 2 ml humanes T-Zellmedium aufgenommen und in einem Well einer 24-Mikrotiterplatte ausplattiert. Zu den CFSE-markierten Effektorzellen wurden bestrahlte Targetzellen in einem Verhältnis von 1:1 gegeben. T2-Zellen wurden zuvor für eine Stunde mit 5 µg / ml eines relevanten bzw. irrelevanten Peptids beladen. Nach 72 h wurden die Zellen mit Fluorochrom-konjugierten Anti-CD3- und Anti-CD8-Antikörpern gefärbt und nach Totzellfärbung mit 7AAD im Durchflußzytometer analysiert. Analysiert wurde die CFSE-Intensität CD8+ T-Zellen nach Setzten des Gates auf Lymphozyten, lebende sowie CD3+ T-Zellen. Die Proliferation wurde als prozentualer Anteil der Zellen mit Proliferation im Verhältnis zur Gesamtpopulation dargestellt. [3H]-Thymidin-Assay Beim Thymidin-Assay handelt es sich um eine radioaktive Methode, bei der Tritiummarkiertes Desoxythymidin ([3H]-Thymidin) in neu synthetisierte DNA eingebaut wird (SCHWARTZ et al., 1975). Da die Proliferation von Zellen proportional zur DNA- 74 Material und Methoden Neusynthese erfolgt, gibt die Höhe der gemessenen Radioaktivität Aufschluss über die Höhe der stattgefundenen Zellvermehrung. In dieser Arbeit wurden jeweils 1 x 105 Effektorzellen pro Vertiefung einer 96Spitzbodenmikrotiterplatte ausgesät. Die Targetzellen wurden nach γ-Bestrahlung (3.2.4.5) in einem Verhältnis von 1:1 hinzugegeben. Die Antigenbeladung von T2-Zellen erfolgte durch Zugabe von 5 µg / ml des entsprechenden Peptids zur Kultur. Als Medium wurde humanes T-Zellmedium verwendet (200 µl / Well). Jeder Ansatz wurde als Triplikat erstellt, um eventuelle Proliferationsschwankungen mitteln zu können. Die Zellen wurden über 72 h im Brutschrank inkubiert. Anschließend erfolgte die Addition einer [3H]-Thymidin-Lösung (37 kBq pro Well). Nach einer 18-stündigen Inkubation bei 37 °C und 5 % CO 2 wurden die Proben bis zur weiteren Analyse eingefroren. Zur Bestimmung des [3H]-Thymidin-Einbaus wurden die Zellen mit einem Zellharvester auf einen Glasfaserfilter transferiert und mit H2Odest. gewaschen. Auf diese Weise wurden die Zellen auf dem Filter fixiert und die nicht eingebauten Nukleotide entfernt. Der Filter wurde im Trockenschrank bei 80 °C getrocknet, in einen Sample Bag eingetütet und mit Szintillationsflüssigkeit bestückt. Nach Versiegelung erfolgte die Messung der Radioaktivität in counts per minute (cpm) mittels γ-Microplate Scintillation-Counter. 3.2.5.4 51 Cr release assay Eine etablierte Methode, die zytotoxische Aktivität von antigenspezifischen T-Zellen zu untersuchen, ist der 51 Chromium-Freisetzungsversuch (BRUNNER et al., 1968). Das Prin- zip dieser Methode beruht darauf, dass radioaktives 51 Cr von Zielzellen über Anionen- transporter aufgenommen werden kann. Eine anschließende vierstündige Inkubation mit antigenspezifischen Effektorzellen führt über die Freisetzung von Perforin und Granzym zur Lyse dieser Zielzellen. Das in den Überstand freigesetzte 51 Cr (γ-Strahler) kann mit entsprechenden Messgeräten quantifiziert werden. Diese Methode kann zur Identifizierung von antigenspezifischen T-Zellen in einer gemischten Kultur oder PBMCs verwendet werden. Zur Überprüfung der zytotoxischen Kapazität der mit den aAPCs generierten CTLs wurden sie über einen Zeitraum von vier Stunden zusammen mit 51 Chrom-markierten Targetzellen inkubiert. Als Targetzellen wurden T2-Zellen eingesetzt, die entweder mit 1 µg / ml M1- 75 Material und Methoden oder CMV-Peptid beladen wurden. Alternativ kamen Zellen zur Anwendung, die mit dem Influenza M1 pEGFP-Konstrukt transfiziert wurden. 2 x 106 dieser Zellen wurden bei 37 °C für eineinhalb Stunden mit 3,7 MBq 51 Cr beladen. Nach dreimaligem Waschen in je 5 ml RPMI-Medium wurden die Zellen in 20 ml Medium aufgenommen und anschließend auf einer 96-Spitzbodenmikrotiterplatte in einer Endkonzentration von 5 x 103 Zellen / 50 µl Medium ausplattiert. Zur Beladung der T2-Targetzellen mit Peptid wurden sie vor Zugabe der Effektorzellen über eine Stunde mit 50 µl Medium, dem eine entsprechende Menge Peptid zugesetzt wurde, inkubiert. Die Effektorzellen wurden anschließend in dem jeweils gewünschten Effektor:Target-Verhältnis in einem Volumen von 100 µl zu den Targetzellen gegeben. Zur Bestimmung der maximalen Lyse (max. Release) wurden die Targetzellen mit 100 µl SDS inkubiert. Für die minimale Lyse (min. Release) wurde reines RPMIMedium zugegeben. Alle Ansätze wurden in Triplikaten durchgeführt. Nach vierstündiger Inkubation im Brutschrank wurden 50 µl Überstand von jeder Probe entnommen, auf eine Messplatte transferiert und mit 150 µl Optiphase gemischt. Die Platte wurde mit einer Klebefolie abgedeckt und bei RT im Dunkeln aufbewahrt. Die Auswertung der Proben erfolgte am nächsten Tag mit Hilfe des γ-Microplate Scintillation-Counter. Die Radioaktivität wurde als cpm angegeben. Die Bestimmung der spezifischen Zytotoxizität erfolgte mittels nachstehender Formel: Spezifische Lyse (%) = (cpm Probe – cpm min. Release) x 100 (cpm max. Release – cpm min. Release) 3.2.6 Tierexperimentelle Methoden Die in vivo-Experimente wurden an sechs bis zwölf Wochen alten NOD-scid-Mäusen durchgeführt. 3.2.6.1 Injektion von Tumorzellen Mit dem Influenza M1-Konstrukt transfizierte NW-38-Mel M1-Zellen wurden geerntet und zweimal in PBS gewaschen. Einzelzellsuspensionen wurden in einem Volumen von 150 µl PBS subkutan in die rechte Kniefalte der Tiere injiziert. Nach vorheriger Austitration wurde die Anzahl injizierter Tumorzellen auf 5 x 105 pro Tier festgelegt. Das Allgemeinbefinden 76 Material und Methoden der Mäuse sowie die Größe des heranwachsenden Tumors wurden alle drei bis vier Tage kontrolliert. Zur Bestimmung der Tumorgröße wurden Länge und Breite in ihrer maximalen Ausdehnung mittels Messschieber bestimmt und der mittlere Tumordurchmesser folgendermaßen berechnet: mittlerer Tumordurchmesser (cm) = max. Tumorlänge (cm) + max. Tumorbreite (cm) 2 Die Mäuse wurden bis zu einer Tumorgröße von 0,4 cm als tumorfrei eingestuft und getötet, wenn die Tumoren eine Größe von max. 1,5 cm erreichten. Alle Tierversuche wurden entsprechend tierschutzrechtlicher Bestimmungen durchgeführt. 3.2.6.2 Adoptiver T-Zelltransfer Für den adoptiven Transfer wurden mittels aAPCs generierte Zellen nach einem Waschschritt in PBS aufgenommen und auf eine Zellzahl von 1 x 108 / ml eingestellt. Die Injektion von jeweils 1 x 107 Zellen erfolgte in die Schwanzvene der Maus. Zur Kontrolle wurden 1 x 107 naive PBMCs bzw. 100 µl PBS appliziert. Die Injektion wurde 48 h nach subkutaner Injektion der Tumorzellen durchgeführt. 3.2.6.3 Entnahme und Charakterisierung von Maustumoren Am Ende des Versuches wurden die Tiere mittels zervikaler Dislokation oder CO2Applikation getötet. Aus einigen Tieren wurde der Tumor vorsichtig entfernt, in 5 ml RPMIMedium aufgenommen und mittels Skalpell zerkleinert. Nach 40-minütiger Inkubation mit Collagenase und Dispase II in einer Konzentration von 0,64 mg / ml bzw. 1,4 mg / ml bei 37 °C erfolgte eine Filtration der Zellen über ein Nylonnetz. Nach zwei weiteren Waschschritten wurden die Zellen im Durchflusszytometer auf GFP-Expression analysiert. 3.2.7 Statistische Auswertung Die Versuche wurden entsprechend der in den Einzelexperimenten angegebenen Häufigkeiten durchgeführt. Bei den aufgeführten Mittelwerten handelt es sich um arithmetische Mittelwerte mit der entsprechenden Standardabweichung (Mittel ± SD). Die statistische Auswertung der Daten erfolgte mit den Computerprogrammen MicrosoftExcel Version 77 Material und Methoden 2002 und GraphPad Prism Version 4.03 (GraphPad Software, San Diego, California, USA). Vergleiche zwischen zwei Mittelwerten wurden mittels des ungepaarten t-Tests durchgeführt. Die Signifikanzniveaus wurden folgendermaßen festgelegt: * = p ≤ 0,05; ** = p ≤ 0,01; *** = p ≤ 0,001; n.s. = nicht signifikant. Bei der Erstellung der Graphiken fanden ebenfalls MicrosoftExcel Version 2002 und GraphPad Prism Version 4.03 Verwendung. Der im intrazellulären IFN-γ-Assay angegebene cut-off-value stellt den durchschnittlichen Prozentanteil zytokinsezernierender T-Zellen in der unstimulierten Kontrolle (PBMCs ohne Peptid) plus einmal Standardabweichung dar (BOON et al., 2002). Alle Werte, die oberhalb des cut-off-values lagen, wurden als positiv angesehen. 78 Ergebnisse 4 Ergebnisse 4.1 Klonierung von Peptid-SC pEGFP-Konstrukten In dieser Arbeit erfolgte die Herstellung der beiden Peptid-SC-Konstrukte AFP-SC pEGFP und NY-ESO-SC pEGFP (3.2.2.1). Ausgehend von dem Tax-SC pCR II-Vektor, der für ein Peptid-SC-Molekül kodiert, das das Modellpeptid Tax an der Oberfläche trägt, wurde mit Hilfe einer 4-Step-PCR eine Gensequenz erzeugt, in der das Tax-Peptid durch das AFPbzw. NY-ESO-1-Peptid ausgetauscht wurde. Da die Klonierung von AFP-SC und NYESO-SC gleichermaßen erfolgte, wird im Folgenden beispielhaft nur auf die Klonierung des AFP-SC-Konstruktes eingegangen. Im ersten PCR-Schritt wurde durch Anlagerung der Primer TG10 und Oligo A an das Template eine 100 bp lange DNA-Sequenz amplifiziert. Dem 25 µl großen PCR-Ansatz wurden 2 µl entnommen und als Template in der zweiten PCR eingesetzt. Durch Zugabe der Primer TG10 und Oligo B erfolgte nun eine Verlängerung der Sequenz um 30 bp. Die Ergebnisse der ersten beiden PCR-Schritte werden in Abb. 8A dargestellt. Auf dem Gel ist erkennbar, dass das Produkt aus der ersten PCR eine Größe von ca. 100 bp aufwies. Das PCR-Produkt 2 stellte sich im Gel als 130 bp großes Fragment dar. Der Auftrag des Kontrollansatzes erbrachte keine sichtbare Bande. Im dritten PCR-Schritt wurde das 3´-Endes des humanen β2m durch Anlagerung der Primer Oligo 4 und TG2 an das Template Tax-SC pCR II vervielfältigt. Die Bandengröße lag bei 548 bp (Abb. 8B). Die Komplettierung der Peptid-β2m-Gensequenz erfolgte im vierten PCR-Schritt durch die Anlagerung der Primer TG10 und TG2 an das PCR-Produkt der zweiten bzw. dritten PCR und Verknüpfung der beiden Amplifikate. Hierfür wurden als Template 0,5 µl aus dem zweiten und 2 µl aus dem dritten PCR-Ansatz eingesetzt. Wie aus Abb. 8C ersichtlich wird, hatte das PCR-Endprodukt eine Länge von 652 bp. 79 Ergebnisse A B neg. PCR 2 C PCR 1 PCR 3 neg. PCR 4 neg. 1500 bp 1500 bp 1500 bp 600 bp 600 bp 600 bp 300 bp 300 bp 300 bp 100 bp 100 bp 100 bp Abb. 8: Herstellung des AFP-SC-Konstruktes mittels 4-Step-PCR. Darstellung der beiden DNA-Fragmente aus PCR 1 und PCR 2 auf einem 2 %-igen Agarosegel. Auf Spur zwei befindet sich die Negativkontrolle der zweiten PCR (A). Nach Durchführung der dritten PCR war eine ca. 550 bp große Bande im Gel sichtbar (Spur 2). Spur drei zeigt das Ergebnis des Kontrollansatzes (B). Durch den letzten PCR-Schritt wurde das DNA-Segment um ca. 100 bp verlängert (Spur 2). Die Negativkontrolle wird in Spur drei dargestellt (C). Zur Bestimmung der Bandengrößen wurde der 100 bp-Marker eingesetzt (A-C). Das PCR-Endprodukt wurde aus dem Gel eluiert (3.2.1.7) und die aufgereinigte DNA einer weiteren Amplifikation unterzogen. Anschließend erfolgte ein Restriktionsverdau mit den Endonukleasen Mlu I, Eco RI und Bam HI (3.2.1.5). Nach elektrophoretischer Auftrennung wurden drei DNA-Fragmente mit einer Größe von 338 bp, 200 bp und 109 bp auf dem Gel erkennbar (Abb. 9A). Das größte Fragment resultierte aus der Spaltung des PCREndproduktes mit Mlu I und Eco RI. Es wurde aus dem Gel herausgeschnitten, eluiert und nach Ethanolpräzipitation (3.2.1.8) zusammen mit einem 5,8 kb großen DNA-Fragment, das aus dem Verdau des Vektors M1-SC pCDNA 3 mit Mlu I und Eco RI resultierte, auf ein Gel aufgetragen (Abb. 9B). Aufgrund der nur schwach erkennbaren Bande des Inserts (Abb. 9B; umkreister Bereich) wurde in der Ligation ein Vektor:Insert-Verhältnis von 1:8 eingesetzt. Die erhaltene Plasmid-DNA wurde in E. coli transformiert (3.2.1.2) und anschließend aus acht angewachsenen Kolonien isoliert (3.2.1.3). Nach Restriktionsverdau mit den Enzymen Mlu I und Kpn I und elektrophoretischer Auftrennung wurden in allen Ansätzen jeweils zwei Banden mit einer Größe von 800 bp und 5,3 kb sichtbar (Abb. 10). 80 Ergebnisse B A Insert PCR 4 cut Vektor 1000 bp 3054 bp 1636 bp 600 bp 1018 bp 600 bp 300 bp 300 bp 100 bp 100 bp Abb. 9: Klonierung von AFP-SC pEGFP. Elektrophoretische Auftrennung des mit den Enzymen Mlu I, Bam HI und Eco RI verdauten PCR-Endproduktes auf einem 2 %-igen Agarosegel. Es sind drei Banden mit einer Größe von 338 bp, 200 bp und 109 bp sichtbar. Spur 2: 100 bp-Marker (A). Darstellung des 338 bp großen Inserts (umkreister Bereich) und des 5,8 kb großen Vektors nach Linearisierung und Aufreinigung. Spur 1: 1 kb-Marker. Spur 4: 100 bp-Marker. 1 %-iges Gel (B). 1 2 3 4 5 6 7 8 5020 bp 3054 bp 1500 bp 1636 bp 1018 bp 800 bp 600 bp 300 bp 100 bp Abb. 10: Gelelektrophorese der mittels Mini-Prep isolierten Plasmid-DNA nach Restriktionsverdau mit Mlu I und Kpn I. In allen acht Ansätzen waren nach Gelelektrophorese (1 %-iges Gel) jeweils zwei Banden mit einer Größe von ca. 5,3 kb und 800 bp erkennbar. Die Größen der DNABanden wurden mit Hilfe des 100 bp- bzw. 1 kb-Markers bestimmt (Spur 1 bzw. Spur 10). Im nächsten Schritt erfolgte der Einbau des mit den beiden Enzymen Bgl II und Kpn I geschnittenen Zwischenproduktes AFP-SC pCDNA 3 in den Vektor HLA-A2 pEGFP-N3, der mit den gleichen Enzymen verdaut wurde. Der Verdau von AFP-SC pCDNA 3 erbrachte 81 Ergebnisse ein ca. 1 kb sowie ca. 5,1 kp großes DNA-Fragment. Der Vektor HLA-A2 pEGFP-N3 wurde in eine 5,4 kb und 1 kb große Bande gespalten. Das 1 kb große DNA-Fragment aus dem AFP-SC pCDNA 3-Verdau wurde nach Gelextraktion und Ethanolpräzipitation mit der 5,4 kb großen Vektor-DNA ligiert. Hierfür wurden 1,7 µl des präzipitierten Vektors und 2 µl Insert eingesetzt. Nach Transformation in E. coli, DNA-Präparation und Verdau mit den Enzymen Bgl II und Kpn I wiesen vier der acht isolierten Plasmide eine Fragmentgröße von 5370 bp und 1030 bp auf (Abb. 11). A Insert Vektor B 1 2 3 4 5 6 7 8 5020 bp 3054 bp 5020 bp 3054 bp 1636 bp 1636 bp 1018 bp 1500 bp 1500 bp 1018 bp 1000 bp 1000 bp 600 bp 600 bp 300 bp 300 bp 100 bp 100 bp Abb. 11: Klonierung von AFP-SC pEGFP. Darstellung des 5,4 kb großen, linearisierten Vektors HLA-A2 pEGFP-N3 und des 1 kb großen Inserts, das aus dem Verdau von AFP-SC pCDNA 3 mit den Enzymen Kpn I und Bgl II hervorgegangen ist. Spur 1 und 2: 1 kb bzw. 100 bp-Marker (A). Verdau der DNA aus 8 Mini-Preps und elektrophoretische Auftrennung auf einem 1 %-igen Agarosegel. Plasmid-DNA Nr. 2, 5, 6 und 7 wiesen eine korrekte Bandengröße von 5,4 kb und 1 kb auf (B). Klon Nr. 7 wurde aufbereitet und das Endprodukt AFP-SC pEGFP nach Präparation im großen Maßstab mittels Restriktionsverdau (Abb. 12) sowie DNA-Sequenzierung überprüft. Der Restriktionsverdau erfolgte mit folgenden Enzymen: Bgl II und Kpn I (zu erwartende Bandengrößen: 1030 bp und 5370 bp), Bgl II und Eco RI (Bandengrößen: 557 bp und 5843 bp), Mlu I und Kpn I (Bandengrößen: 813 bp und 5587 bp) sowie Mlu I und Eco RI (Bandengrößen: 341 bp und 6054 bp). Die Sequenzierung erbrachte eine korrekte Basenabfolge. 82 Ergebnisse A B C D 1500 bp 1000 bp 600 bp 300 bp 100 bp Abb. 12: Überprüfung des Endproduktes AFP-SC pEGFP mittels Restriktionsverdau. Nach Präparation im großen Maßstab wurde das Endprodukt AFP-SC pEGFP einem Restriktionsverdau unterzogen und die DNA auf einem 1 %-igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Verdau mit Bgl II und Kpn I (A). Verdau mit Bgl II und Eco RI (B). Verdau mit Mlu I und Kpn I (C). Verdau mit Mlu I und Eco RI (D). Spur 5: 100 bp-Marker. 4.2 Klonierung von Influenza M1 pEGFP Zur Herstellung des Expressionsvektors Influenza M1 pEGFP wurde entsprechend der unter 3.2.2.2 beschriebenen Klonierungsstrategie vorgegangen. Ausgehend von dem Vektor Influenza Flu Matrix pCDNA 3.1 wurde durch Anlagerung der Primer Influenza M1 FP und Influenza M1 RP an das Template ein 290 bp großer DNA-Abschnitt amplifiziert (Abb. 13A). Das durch die Primer bewirkte Anhängen der Restriktionsschnittstellen Bam HI und Hind III an das 5´- bzw. 3´-Ende ermöglichte den Einbau des geschnittenen PCR-Produktes in den Expressionsvektor pEGFP-N3. Dieser wurde zuvor ebenfalls mit den Restriktionsenzymen Bam HI und Hind III verdaut. Abb. 13B zeigt die aufgereinigten und präzipitierten DNA-Fragmente von Vektor und Insert auf einem Agarosegel. Das 270 bp große Influenza M1 PCR-Konstrukt sowie der 4,7 Kb große Vektor wurden ligiert, in kompetente E. coliZellen transformiert und anschließend auf einer Kanamycin-enthaltenen LB-Agar-Platte ausplattiert. Am nächsten Tag erfolgte die Überprüfung der Plasmid-DNA auf den Einbau 83 Ergebnisse des Inserts. Hierfür wurden angewachsene Klone gepickt, die Plasmid-DNA isoliert und mit den Restriktionsenzymen Bam HI und Hind III geschnitten. Der Testverdau zeigte, dass das 270 bp große Insert erfolgreich eingebaut wurde (Abb. 14). A B 5020 bp 3054 bp 1500 bp Vektor 1636 bp 1500 bp 1018 bp 600 bp 600 bp 300 bp Insert PCRProdukt 300 bp Abb. 13: Klonierung von Influenza M1 pEGFP. Darstellung des 290 bp großen PCR-Produktes auf einem 2 %-igen Agarosegel (Spur 3). Spur 2: Nagativkontrolle. Spur 1 und 4: 1 kb bzw. 100 bpMarker (A). Nach Verdau mit den Enzymen Bam HI und Hind III war ein 270 bp großes Insert auf dem Gel erkennbar. Der linearisierte Vektor wies vor der Ligation eine Größe von 4,7 kb auf. Spur 1 und 4: 1 kb bzw. 100 bp-Molekulargewichtsmarker (B). 4,7 Kb 5020 bp 3054 bp 1636 bp 1500 bp 1018 bp 600 bp 300 bp 270 bp Abb. 14: Klonierung von Influenza M1 pEGFP; Miniprep-Verdau. Verdau der mittels Mini-Prep isolierten Plasmid-DNA mit den Restriktionsenzymen Bam HI und Hind III. Nach Gelelektrophorese waren zwei Banden mit einer erwarteten Größe von 270 bp und 4,7 kb erkennbar (Spur 2 und 3). Spur 1 und 4: 100 bp- bzw. 1 kb-Molekulargewichtsmarker. 1 %-iges Gel. 84 Ergebnisse 4.3 Methodische Vorarbeiten 4.3.1 Prüfung des hergestellten TCGF-Mediums Zur Prüfung der Funktionalität des hergestellten TCGF-Mediums (3.2.4.7) sowie zur Bestimmung der in der T-Zellkultur einzusetzenden Konzentration wurden PHA-Blasten generiert, die mit unterschiedlichen TCGF-Konzentrationen inkubiert wurden. Die durch den Wachstumsfaktor induzierte Zellproliferation wird in Abb. 15 dargestellt. 220000 220000 176000 176000 1% 2% 3% 4% 5% 7% 9% 11% 13% 15% CPM 132000 132000 88000 88000 44000 44000 0 0 Mittel (neu) TCGF neu Mittel (Laumer) TCGF-Standard Abb. 15: Austestung des TCGF-Mediums. PHA-Blasten wurden mit TCGF-Medium inkubiert und die Proliferation mittels Thymidin-Assay bestimmt. TCGF wurde in entsprechend angegebener Konzentration zu den Zellen gegeben. Die Säulen stellen die Mittelwerte ± SD der Proliferation abzüglich der Negativkontrolle (unstimulierte Zellen) dar (n = 3). Die Ergebnisse des TCGFStandards (links) werden neben den Ergebnissen des neu hergestellten TCGF-Mediums (rechts) abgebildet. Die gestrichelte Linie markiert die ungefähre Höhe der Proliferation nach Zugabe von 5 % TCGF-Standard. Aus der Abbildung geht hervor, dass die Zugabe von TCGF zum Medium zu einem deutlichen Anstieg der Zellproliferation führte. Je höher die eingesetzte TCGF-Konzentration war, desto höher war auch die gemessene Teilungsrate der PHA-Blasten. Dies war vor allem bei geringeren TCGF-Konzentrationen der Fall (bis 9 %). Bei darüber hinausgehenden Konzentrationen war der Anstieg der Proliferation nicht mehr so deutlich ausgeprägt 85 Ergebnisse bzw. blieb vollständig aus. Der TCGF-Standard wies bei gleichen Konzentrationen eine insgesamt stärkere Wirksamkeit auf. Da dieser in einer Konzentration von 5 % eingesetzt werden sollte, wurde die Konzentration des neuen TCGF-Mediums auf 10 % eingestellt (Abb. 15; gestrichelte Linie). 4.3.2 Expressionsmodulation kostimulatorischer Moleküle Um die in dieser Arbeit verwendete Tumorzelllinie Daudi näher zu charakterisieren, wurde eine Oberflächenfärbung gegen die kostimulatorischen Moleküle CD80, CD83 sowie CD86 durchgeführt. Hierzu erfolgte eine durchflusszytometrische Analyse der Zellen nach Färbung mit den entsprechenden FITC-gekoppelten Antikörpern. Im naiven Zustand wiesen Daudi-Zellen eine Expression der beiden kostimulatorischen Moleküle CD80 und CD86 auf ihrer Oberfläche auf. CD83 war im Vergleich hierzu nur sehr schwach detektierbar und hob sich kaum von der Isotypenkontrolle ab (Abb. 16A). A IgG1-Isotyp CD80 CD83 CD86 B CD80 C CD83 D CD86 Abb. 16: Expressionsmodulation kostimulatorischer Moleküle auf Daudi-Zellen. Durchflusszytometrische Analyse der Oberflächenexpression von CD80 (schwarz), CD83 (blau) und CD86 (rot) auf naiven Daudi-Zellen. Die Isotypenkontrolle wird in grau dargestellt. Gezeigt wird ein repräsentatives Ergebnis von mindestens drei unabhängig voneinander durchgeführten Analysen (A). Nach 24-stündiger Stimulation von 1 x 106 Daudi-Zellen mit einer Kombination aus LPS (10 ng / ml), NIH/3T3 CD40L (1 x 105) und IL-4 (500 U / ml) wurde die Expressionshöhe von CD80 (B; rot), CD83 (C; rot) und CD86 (D; rot) mit der auf naiven Daudi-Zellen (B-D; blau) verglichen. Die Isotypenkontrolle wird in grau dargestellt. 86 Ergebnisse Im Folgenden sollte untersucht werden, ob durch Stimulation dieser Zellen eine Expressionsmodulation der kostimulatorischen Moleküle auf der Zelloberfläche hervorgerufen werden kann. Hierzu wurden die Daudi-Zellen mit LPS, IL-4 oder CD40L-exprimierenden NIH/3T3-Zellen allein oder in Kombination inkubiert (3.2.4.8) und anschließend durchflusszytometrisch analysiert. In Abb. 16B bis D wird die Expressionshöhe von CD80, CD83 und CD86 nach Stimulation mit einer Kombination aus LPS, IL-4 und CD40L in Form von Histogrammen dargestellt. Abb. 17 zeigt vergleichend die Ergebnisse aller Stimulationsbedingungen. Die Expressionssteigerung der drei kostimulatorischen Moleküle wird als Stimulationsindex angegeben. Hierbei handelt es sich um den Quotienten des geometrischen Mittels stimulierter und unstimulierter Zellen. Eine Aktivierung von Daudi-Zellen induzierte eine Expressionssteigerung aller drei kostimulatorischen Moleküle auf der Zelloberfläche. Unabhängig von der Art der Stimulation wurde CD83 weitaus stärker hochreguliert als CD80 und CD86. Im Fall von CD80 konnte kein signifikanter Unterschied zwischen den vier Stimulationsbedingungen festgestellt werden. Die Expression von CD83 sowie CD86 erhöhte sich hingegen signifikant, wenn die Zellen anstatt mit CD40L allein mit einer Kombination aus CD40L und IL-4 bzw. CD40L, IL-4 und LPS stimuliert wurden. Letztere induzierte ebenfalls eine signifikante Expressionssteigerung von CD83 im Vergleich zu CD40L- und LPSbehandelten Daudi-Zellen. Somit schien die Inkubation der Zellen mit einer Kombination aus CD40L-exprimierenden NIH/3T3-Zellen, LPS und IL-4 den stärksten Einfluss auf die Expressionhöhe von CD83 zu haben. Der Stimulationsindex von CD86 konnte zudem durch zusätliche Addition von IL-4 anstelle von LPS signifikant gesteigert werden (Abb. 17). 87 Ergebnisse ** * 14 14 Stimulationsindex 12 12 * CD40L CD40L CD40L+IL-4 CD40+IL-4 CD40L+LPS CD40L+LPS CD40L+IL-4+LPS CD40L+IL-4+LPS 10 10 88 66 44 * 22 * * 00 CD80 Mittel CD80 CD83 Mittel CD83 CD86 Mittel CD86 Abb. 17: Hochregulierung der kostimulatorischen Moleküle CD80, CD83 und CD86 auf Daudi-Zellen. Daudi-Zellen wurden mit NIH/3T3 CD40L-Zellen allein oder in Kombination mit LPS und / oder IL-4 über 24 h stimuliert und die Expressionshöhe von CD80, CD83 und CD86 mittels FCM bestimmt. Der Stimulationsindex zeigt den Anstieg der kostimulatorischen Moleküle auf der Zelloberfläche im Vergleich zur unstimulierten Kontrolle. Mittelwerte ± SD; n = 3. * p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,01. 4.4 Generierung peptidspezifischer T-Zellen mit aAPCs 4.4.1 Transfektion von Daudi-Zellen mit Peptid-SC pEGFP-Konstrukten Die Transfektion von Daudi-Zellen mit den Peptid-SC pEGFP-Konstrukten erfolgte mittels Elektroporation (3.2.4.4). Erfolgreich transfizierte Zellklone wurden unter Zugabe von G418 selektiert und anschließend durchflusszytometrisch auf Expression von GFP und HLA-A2 überprüft. Aus Abb. 18 ist zu entnehmen, dass über 90 % der Daudi-Zellen, die mit dem M1-SC pEGFP-, NY-ESO-SC pEGFP- bzw. AFP-SC pEGFP-Konstrukt transfiziert wurden, sowohl GFP als auch HLA-A2 an ihrer Oberfläche aufwiesen. Die Zellen konnten über mehrere Wochen in Kultur gehalten werden, ohne dass es zu einer Verminderung 88 Ergebnisse der Expressionshöhe kam. Einfrier- und Auftauprozesse übten ebenfalls keinen negativen Einfluss auf die transfizierten Zellen aus. GFP 0% Daudi M1-SC 97% Daudi NY-ESO-SC 93% Daudi AFP-SC 92% Daudi naive HLA-A2 Abb. 18: FCM-Analyse von Daudi-Peptid-SC-Zellen. Nach Transfektion von Daudi-Zellen mit den Peptid-SC-Konstrukten und anschließender Selektion exprimierten über 90 % der Zellen sowohl GFP als auch HLA-A2. Naive Daudi-Zellen waren für keines der beiden Moleküle positiv. Die Färbung auf HLA-A2 erfolgte mittels indirekter Immunfluoreszenz (1.Ak: BB7.2; 2.Ak: Ziege-antiMaus IgG-PE). 4.4.2 Funktionalität von Daudi M1-SC-Zellen 4.4.2.1 Überprüfung der M1-Reaktivität gesunder Spender Zur Überprüfung der Funktionalität von Daudi M1-SC-Zellen wurden sie zusammen mit PBMCs HLA-A2-positiver Spender über einen unterschiedlich langen Zeitraum und unter verschiedenen Kulturbedingungen in vitro inkubiert. Um eine möglichst hohe M1spezifische Antwort zu erzielen, wurden die PBMCs vor Gebrauch auf ihre generelle M1Reaktivität untersucht. Hierzu wurden sie mit M1-Peptid stimuliert, das dem Medium zu Kulturbeginn zugesetzt wurde (3.2.4.8). Zur Kontrolle wurden PBMCs ohne Peptid-Zugabe inkubiert. Die M1-Spezifität wurde nach einer Woche mittels intrazellulärem IFN-γ-Assay bestimmt (3.2.5.1). Die Ergebnisse von 37 getesteten Spendern werden in Abb. 19 zusammengefasst. Gezeigt wird der Prozentanteil M1-reaktiver Zellen in der CD8-positiven 89 Ergebnisse Zellfraktion nach Subtraktion der Negativkontrolle. Dieser Wert lag im Mittel bei 4,9 ± 6,7 %. Unstimulierte Zellen wiesen eine durchschnittliche M1-Spezifität von 0,45 ± 0,38 % auf. Die gestrichelte Linie stellt den cut-off-value dar (3.2.7), der 0,83 % betrug. Wie aus dem Diagramm ersichtlich wird, lag der prozentuale Anteil an M1-spezifischen CD8+ T-Zellen bei 22 von 37 Spendern oberhalb des cut-off-values. Somit wiesen mehr als die Hälfte der getesteten Personen Reaktivität gegenüber dem Influenza M1-Peptid auf. 2020 1515 1010 55 00 1593 3050 1570 3154 1639 1604 1813 1907 1869 1798 1701 2879 1868 3314 1911 3392 1555 1826 1869 1657 1853 1609 SZ 1801 1808 3336 1758 1846 1886 3349 2878 1825 3307 1884 1858 1908 3318 % M1-spez. Zellen in CD8-pos. Population 2525 1 5 9 13 17 21 25 29 33 37 HLA-A2-pos. Spender Abb. 19: M1-Reaktivität HLA-A2-positiver Spender. PBMCs 37 gesunder Spender wurden mit 0,2 µg / ml M1-Peptid stimuliert und nach einwöchiger Inkubation auf M1-Reaktivität im intrazellulären IFN-γ-Assay überprüft. Dargestellt wird der Prozentanteil M1-reaktiver Zellen in der CD8+ Zellpopulation nach Abzug der Negativkontrolle (unstimulierte Zellen). Die gestrichelte Linie markiert die Höhe des cut-off-values. 4.4.2.2 Stimulation von M1-spezifischen T-Zellen mit Daudi M1-SC-Zellen Für nachfolgende Versuche wurden PBMCs von Spendern verwendet, die eine M1Reaktivität aufwiesen, die mindestens oberhalb des cut-off-values lag. Die Stimulation M1spezifischer Zellen erfolgte nach dem unter 3.2.4.8 beschriebenen Protokoll. 90 Ergebnisse Abb. 20 und Abb. 21 zeigen Ergebnisse initialer Studien, bei denen PBMCs dreier Spender repetitiv mit Daudi M1-SC-Zellen stimuliert wurden. Die Frequenz M1-spezifischer Zellen wurde mittels Pentamer-Färbung (Abb. 20) bzw. intrazellulärer IFN-γ-Analyse (Abb. 21) bestimmt. Die in Abb. 20 dargestellten Ergebnisse zeigen die M1-Spezifität des Spenders 1907 nach dreiwöchiger Stimulation mit Daudi M1-SC-Zellen. 19,8 % aller gegateten Zellen waren sowohl positiv für CD8 als auch für das M1-Pentamer. Unspezifische Bindungen von Zellen an das HLA-A2-Pentamer wurden durch eine Kontrollfärbung mit dem NY- 0% 0% 19,8% 19,8% M1-Penta NY-ESO-Penta NY-ESO-Penta ESO-Pentamer ausgeschlossen (Abb. 20; links). CD8 CD8 Abb. 20: Generierung M1-spezifischer T-Zellen mit Daudi M1-SC-Zellen; Pentamer-Färbung. PBMCs des Spenders 1907 wurden mit Daudi M1-SC-Zellen in einem Verhältnis von 10:1 stimuliert und die M1-Spezifität nach dreiwöchiger Inkubation mittels M1-Pentamer-Färbung bestimmt (rechts). Als Negativkontrolle wurde das NY-ESO-Pentamer eingesetzt (links). Gate: vitale Lymphozyten. In zwei weiteren Versuchen wurde ebenfalls eine dreiwöchige Stimulation mit aAPCs durchgeführt, die das M1-SC-Konstrukt an ihrer Oberfläche präsentierten. Sowohl in der gemischten Zellpopulation von Spender 1604 als auch von Spender 1570 konnten CD8+ Zellen detektiert werden, die nach sechsstündiger Stimulation mit M1-gekoppelten T2Zellen IFN-γ sezernierten. Bei Spender 1604 lag der Prozentanteil M1-reaktiver CD8+ TZellen in der CD8+ Zellpopulation bei 4 % (3,3 % von 78,6 % CD8+ Zellen) (Abb. 21; oben rechts). Dieser Wert wurde von Spender 1570 deutlich übertroffen. So synthetisierten 66 % seiner CD8+ Zellen (33,5 % von 51 % CD8+ Zellen) IFN-γ nach Inkubation mit dem entsprechenden Peptid (Abb. 21; unten rechts). Eine Kontrollstimulation mit ungepulsten T2Zellen erbrachte in beiden Fällen keine IFN-γ-positive Zellpopulation (Abb. 21; links). 91 Ergebnisse IFN-γγ T2 / (-) T2 / M1 0,1% 3,3% 87,1% 75,3% T2 / (-) T2 / M1 0,02% 33,5% 53,4% 17,5% CD8 Abb. 21: Stimulation M1-spezifischer T-Zellen mit Daudi M1-SC-Zellen; intrazellulärer Zytokin-Assay. PBMCs des Spenders 1604 (oben) bzw. 1570 (unten) wurden über drei Wochen mit Daudi M1-SC-Zellen inkubiert und der Prozentanteil IFN-γ-produzierender CD8+ T-Zellen mittels intrazellulärem Zytokin-Assay bestimmt. Zur Kontrolle wurden die Zellen mit unbeladenen T2-Zellen inkubiert (links). Dargestellt werden Dot Plots nach Ausschluss toter Zellen und Gate auf die Lymphozytenpopulation. In nachfolgenden Experimenten wurde versucht, durch Veränderung der Kulturbedingungen eine möglichst optimale Stimulation M1-spezifischer T-Zellen zu erzielen. Hierzu wurde zunächst das Verhältnis von PBMCs zu aAPCs ausgetestet. Zu Beginn des Versuches wurden 2 x 106 PBMCs zusammen mit Daudi M1-SC-Zellen in einem Verhältnis von 2:1, 5:1, 10:1, 25:1 und 50:1 ausplattiert. Zytokinzugabe (IL-2) und Restimulation erfolgten gemäß Protokoll (3.2.4.8). Die Auswertung wurde nach zweiwöchiger Inkubation durchgeführt. Aus Abb. 22 geht hervor, dass die Anzahl M1-reaktiver CD3+CD8+ T-Zellen ihr Maximum bei einem Verhältnis von 10:1 erreichte. Insbesondere bei höheren PBMC:aAPCVerhältnissen konnte keine weitere Erhöhung induziert werden. Auf Berechnung der Signifikanz wurde aufgrund zu geringer n-Zahlen verzichtet. Um die Anzahl peptidspezifischer T-Zellen in der in vitro-Kultur zu steigern, wurde weiterhin die Addition von Zytokinen ausgetestet. Hierzu wurde dem Medium TCGF, das aus 92 Ergebnisse dem Überstand mitogenaktivierter Lymphozyten gewonnen wurde, in unterschiedlichen Konzentrationen zugesetzt. TCGF induzierte eine Proliferation und somit auch Expansion peptidspezifischer T-Zellen. Höhere TCGF-Konzentrationen (10-15 %) übten einen stärkeren Einfluss aus als geringere Konzentrationen (1-5 %) (Daten nicht gezeigt). 3,0E+06 3,0x106 Anzahl M1-spezifischer CD3+CD8+ T-Zellen 2,5x106 2,5E+06 2,0E+06 2,0x106 1,5x106 1,5E+06 1,0x106 1,0E+06 5x105 5,0E+05 0 0,0E+00 2:1 5:1 10:1 25:1 50:1 2:1 5:1 PBMCs 10:1 : aAPCs25:1 50:1 Abb. 22: Überprüfung des optimalen Verhältnisses von PBMCs zu aAPCs. PBMCs des Spenders 1813 wurden mit Daudi M1-SC-Zellen in unterschiedlichen Verhältnissen (2:1, 5:1, 10:1, 25:1 und 50:1) inkubiert und die Anzahl M1-spezifischer T-Zellen nach zweiwöchiger Inkubation mittels intrazellulärem IFN-γ-Assay bestimmt. Das Gate wurde auf die Lymphozytenpopulation, lebende Zellen und CD3+ T-Zellen gesetzt. Mittelwert ± SD aus n = 2. Zusätzlich wurde überprüft, ob eine erhöhte Expression von kostimulatorischen Molekülen auf der Oberfläche von Daudi M1-SC-Zellen, ihre Eigenschaft, als antigenpräsentierende Zellen zu fungieren, verbessern kann. Hierzu wurden die aAPCs vor ihrer Verwendung mit LPS, IL-4 und CD40L stimuliert (4.3.2) und in einem Verhältnis von 1:10 zu PBMCs gesunder, HLA-A2-positiver Spender gegeben. Als Kontrolle wurden parallel PBMCs mit unstimulierten Daudi M1-SC-Zellen inkubiert. Wöchentlich erfolgte eine Restimulation der Zellen mit aktivierten bzw. naiven Daudi M1-SC-Zellen. Daudi M1-SC-Zellen, die aufgrund der Stimulation eine erhöhte Expression kostimulatorischer Moleküle auf ihrer Oberfläche aufwiesen, induzierten eine signifikant höhere Anzahl 93 Ergebnisse M1-spezifischer T-Zellen in der gemischten Kultur als naive Daudi M1-SC-Zellen (Abb. Anzahl M1-spezifischer CD3+CD8+ T-Zellen 23). * 2,1x106 2,1E+06 1,4x106 1,4E+06 7,0x105 7,0E+05 0,0E+000 Daudi M1-SC Daudi M1SC naive (naiv) Daudi M1-SC Daudi M1SC stim. (stim.) Abb. 23: Stimulatorische Kapazität aktivierter Daudi M1-SC-Zellen. Zur Hochregulierung der kostimulatorischen Moleküle CD80, CD83 und CD86 wurden Daudi M1-SC-Zellen mit CD40Lexprimierenden NIH/3T3-Zellen, LPS und IL-4 über 24 h stimuliert und anschließend zur Generierung M1-spezifischer T-Zellen aus PBMCs des Spenders 3050 eingesetzt (rechts). Eine Restimulation der Zellen erfolgte in wöchentlichen Abständen unter den gleichen Bedingungen. Als Kontrolle dienten naive aAPCs (links). Die Analyse der Zellen erfolgte nach dreiwöchiger Inkubation mittels intrazellulärem IFN-γ-Assay. Dargestellt wird die Anzahl M1-spezifischer CD3+CD8+ TZellen nach dreiwöchiger Inkubation. Mittelwert ± SD aus n = 3. * p ≤ 0,05. In nachfolgenden Versuchen wurde aufgrund der Ergebnisse der Vorexperimente die Generierung M1-spezifischer T-Zellen mit Hilfe von Daudi M1-SC-Zellen nach folgendem Schema durchgeführt: 2 x 106 PBMCs wurden in einem Verhältnis von 10:1 zusammen mit stimulierten Daudi M1-SC-Zellen ausplattiert. Als Medium wurde humanes T-Zellmedium verwendet, dem TCGF in einer Konzentration von 10 % zugesetzt wurde. Zur Förderung der Proliferation erfolgte die Zugabe von IL-2. Die generierten Effektorzellen wurden in Folgeexperimenten auf Spezifität und Funktionalität überprüft und die stimulatorische Kapazität der aAPCs zudem mit der autologer MoDCs verglichen. Abb. 24 gibt einen Überblick über die Stimulationsbedingungen sowie durchgeführten Analysemethoden. 94 Ergebnisse PBMC HLA-A2-positive gesunde bzw. krebskranke Spender; M1-Reaktivität: positiv Stimulation mit Daudi M1-SC - 2x106 PBMCs + 2x105 stimulierte aAPCs - humanes T-Zellmedium + 10 % TCGF - nach 24 h: Addition von 60 U / ml IL-2 - wöchentliche Restimulation Vergleich der stimulatorischen Kapazität von aAPCs mit autologen MoDCs Testen der Spezifität und Funktionalität generierter Effektorzellen (siehe 4.6) M1-Spezifität (M1Pentamer-Färbung) Funktionalität gegenüber M1präsentierenden Targetzellen (siehe 4.4.2.2, 4.6 und 4.8) - nach exogener Beladung m. M1-Peptid in vivo - nach Transfektion mit M1-SC - nach Transfektion m. Influenza M1-DNA → intrazelluläre Prozessierung GM-CSF-Sekretion (siehe 4.7) Affinität (siehe 4.5.3) (siehe 4.5.1 und 4.5.4.2) IFN-γγ-Sekretion (siehe 4.4.2.2, 4.5.4.1, 4.6 und 4.8) Proliferation Zytotoxizität (siehe 4.5.2) (siehe 4.5.3 und 4.5.4.3) Abb. 24: Generierung M1-spezifischer Effektorzellen mit Daudi M1-SC-Zellen. Schematische Darstellung der Stimulationsbedingungen sowie nachfolgend durchgeführter Experimente. Die Generierung M1-spezifischer T-Zellen aus PBMCs gesunder bzw. krebskranker HLA-A2positiver Spender mit Daudi M1-SC-Zellen erfolgte nach einem einheitlichen Schema. Die expandierten Zellen wurden mit Hilfe verschiedener Analysemethoden auf Spezifität und Funktionalität überprüft. Die Abbildung gibt einen Überblick über die in dieser Arbeit durchgeführten Experimente. Abb. 25 zeigt das Beispiel eines Spenders, dessen PBMCs über mehrere Wochen zusammen mit Daudi M1-SC-Zellen in Kultur gehalten wurden. Die Spezifität der generierten Zellen wurde wöchentlich in einem intrazellulären IFN-γ-Assay überprüft. Es konnte ein deutlicher Anstieg des Prozentanteils M1-reaktiver CD3+CD8+ T-Zellen in der Gesamtkultur beobachtet werden. 95 Ergebnisse IFNγγ naiv 3 Wo 0% 3,4% 14,4% 11.2% 5 Wo 6 Wo 5,7% 14.8% 11,9% 4.1% 7 Wo / irrel. 7 Wo / irrel. 7 Wo 35,3% 0.2% 8,4% 27.1% CD8 Abb. 25: Langzeitstimulation von Zellen des Spenders 1798 mit Daudi M1-SC-Zellen. Zu 2 x 106 PBMCs wurden initial 2 x 105 Daudi M1-SC-Zellen gegeben. Die Inkubation erfolgte über einen Zeitraum von sieben Wochen. Wöchentlich erfolgte eine Restimulation der Zellen. Die M1Spezifität wurde mittels intrazellulärer IFN-γ-Analyse nach drei (oben rechts), fünf (Mitte links), sechs (Mitte rechts) und sieben Wochen (unten) bestimmt. Oben links werden als Ausgangswert unstimulierte PBMCs dargestellt. Ein Beispiel einer Kontrollstimulation (T2-Zellen plus irrelevantes Peptid) ist unten rechts abgebildet. Gate: vitale Lymphozyten und CD3+ T-Zellen. Der Anteil M1-spezifischer CD3+CD8+ T-Zellen in der CD8+ Zellpopulation betrug in der Ausgangspopulation 0,07 %. Nach drei Wochen lag er bei 23,3 % (3,4 % von 14,6 % CD3+CD8+ Zellen) und erhöhte sich auf 32,4 % (5,7 % von 17,6 % CD3+CD8+ Zellen) nach fünfwöchiger Stimulation. Nach sechs Wochen waren 78,3 % (14,8 % von 18,9 %) aller CD3+CD8+ T-Zellen spezifisch für M1 und eine Woche später stieg ihr Prozentanteil nochmals um 3 % an. Die totale Anzahl peptidspezifischer Zellen stieg innerhalb von drei Wochen von ca. 200 zu Beginn der Stimulation auf 7,1 x 105. Sie erhöhte sich also ungefähr um den Faktor 3500. Nach sieben Wochen waren von 5,2 x 107 Zellen 35 % spezi- 96 Ergebnisse fisch für M1. Das entspricht einer Anzahl von 1,8 x 107 Zellen. Bezogen auf M1-reaktive Zellen betrug der Faktor der Vermehrung somit 90000. Auch die Inkubation zweier weiterer Spender mit Daudi M1-SC-Zellen führte nach mehrwöchiger Inkubation zu einem prozentualen Anstieg M1-spezifischer T-Zellen in der Kultur (Abb. 26A und B). Die Bestimmung der M1-Spezifität erfolgte mittels MHC-PentamerFärbung (3.2.5.1). Der Prozentanteil peptidspezifischer CD8+ T-Zellen in der CD8+ Zellpopulation stieg innerhalb der ersten Woche bei Spender 1907 von 0 % auf 11,8 % (1,1 % von 9,3 % CD8+ Zellen) an. Nach 2 Wochen waren 42,6 % (19,4 % von 45,5 % CD8+ Zellen) und nach 3 Wochen 59 % (43,7 % von 74,7 %) seiner CD8+ T-Zellen positiv für das M1-Peptid. Die Anzahl M1-spezifischer T-Zellen stieg in diesem Zeitraum auf 2,3 x 106. Das entspricht einer Vermehrung der Zellen um den Faktor 2300. Bei Spender 3050 war nach einwöchiger Stimulation ein Anstieg M1-spezifischer CD8+ TZellen von 0,2 % auf 34,9 % (9,5 % von 27,2 % CD8+ Zellen) detektierbar. Nach drei Wochen wiesen 64,8 % (25,9 % von 40 %) all seiner CD8+ T-Zellen M1-Reaktivität auf. Es konnte eine Vermehrung M1-spezifischer Zellen von 800 in der Ausgangspopulation auf 2,5 x 107 festgestellt werden (Faktor von 31000). M1-spezifische T-Zellen der Spender 1593, 1570 und 1813 konnten nach dreiwöchiger Stimulation um den Faktor 143, 360 bzw. 933 expandiert werden. Eine 450-fache Amplifikation wurde mit Zellen des Spenders 1619 nach zweiwöchiger Inkubation mit Daudi M1SC-Zellen erreicht (Daten nicht gezeigt). 97 Ergebnisse A Penta mer naive 0% 1 Wo/M1-Penta 1.1% 7.9% 8.2% 2 Wo/M1-Penta 19.4% 3 Wo/M1-Penta 43.7% 26.1% 31.0% CD8 B Penta mer 0.02% 1 Wo/M1-Penta 9.5% 9.1% 17.7% 3 Wo/M1-Penta 25.9% 3 Wo/NY-Penta 0.1% 14.1% 38.9% naive CD8 Abb. 26: Pentamer-Färbung nach dreiwöchiger Stimulation von PBMCs zweier Spender mit Daudi M1-SC-Zellen. Zellen der Spender 1907 (A) und 3050 (B) wurden über einen Zeitraum von drei Wochen mit Daudi M1-SC-Zellen stimuliert und die M1-Spezifität nach ein- (A und B; oben rechts), zwei- (A; unten links) bzw. dreiwöchiger Inkubation (A und B; unten rechts bzw. links) bestimmt. Zur Kontrolle erfolgte eine Färbung der Zellen mit dem NY-ESO-Pentamer (B; unten rechts). Gate: vitale Lymphozyten. Dargestellt wird ein repräsentatives Ergebnis von mehrfach durchgeführten Experimenten mit PBMCs unterschiedlicher Spender. 98 Ergebnisse 4.5 In vitro-Funktionalität der generierten M1-spezifischen T-Zellen Nach spezifischer Bindung einer Effektor-T-Zelle mit ihrem TCR an einen Peptid-MHCLiganden kommt es zu einer typischen T-Zellantwort, die sich unter anderem in Form von Zytokinsekretion, Proliferation und Zytotoxizität äußert. Die mit den Daudi M1-SC-Zellen generierten T-Zellen wurden auf in vitro-Funktionalität überprüft, indem mittels verschiedener immunologischer Methoden untersucht wurde, ob sie das von Targetzellen über MHCKlasse-I-Moleküle präsentierte M1-Peptid erkennen können. 4.5.1 Zytokinsekretion Ein Zytokin, das von aktivierten CTLs sezerniert wird, ist GM-CSF. Durch Aktivierung peptidspezifischer T-Zellen mit entsprechenden Targetzellen kommt es zur Synthese dieses Faktors, der im Überstand der Zellkultur nachweisbar ist. In dieser Arbeit erfolgte die Detektion von GM-CSF mittels Sandwich-ELISA (3.2.5.2). M1-spezifische T-Zellen wurden generiert, indem PBMCs eines gesunden Spenders über einen Zeitraum von 17 Tagen mit Daudi M1-SC-Zellen inkubiert wurden. An Tag sieben und vierzehn erfolgte eine Restimulation der Zellen. In einem parallelen Ansatz erfolgte die Stimulation antigenspezifischer T-Zellen mit Hilfe autologer PBMCs (3.2.4.8). Zur Bestimmung der Funktionalität der auf diese Weise generierten Zellen wurden sie mit T2-Zellen, die mit M1-Peptid beladen wurden, stimuliert und die GM-CSF-Konzentration im Überstand bestimmt. Zur Kontrolle erfolgte eine Inkubation der Effektorzellen mit naiven T2-Zellen. Die Ergebnisse sind in Abb. 27 dargestellt. Sowohl mit autologen PBMCs als auch mit Daudi M1-SC-Zellen generierte Effektorzellen wiesen eine vergleichbare, peptidspezifische GM-CSF-Sekretion auf, die in beiden Fällen über 600 pg / ml lag. Eine Inkubation der Zellen mit naiven T2-Zellen führte zu einer deutlich geringeren Synthese von GM-CSF (unter 160 pg / ml). 99 Ergebnisse 800 800 GM-CSF (pg/ml) 700 700 600 600 500 500 M1-Peptid 400 400 Daudi M1-SC 300 300 200 200 100 100 00 T2 T2 T2 T2 T2+M1 T2+M1 T2+M1 T2+M1 Abb. 27: In vitro-Funktionalität generierter Effektorzellen im GM-CSF-ELISA. Nach Generierung peptidspezifischer T-Zellen mit Hilfe von autologen PBMCs (linke Balken) bzw. Daudi M1-SCZellen (rechte Balken) über einen Zeitraum von 17 Tagen erfolgte deren Funktionalitätsprüfung durch Bestimmung der GM-CSF-Konzentration im Überstand mittels GM-CSF-ELISA. Mittelwert ± SD aus n = 2. 4.5.2 Proliferation Eine Möglichkeit, die Proliferation von Zellen als Antwort auf eine spezifische Stimulation zu bestimmen, ist der Thymidin-Assay, eine radioaktive Methode, bei der [H3]-Thymidin in neu synthetisierte DNA eingebaut wird. Alternativ hierzu kann die T-Zellproliferation mittels CFSE-Assay detektiert werden, indem die Zellen mit einem als CFSE bezeichneten Farbstoff markiert werden. Die im Zuge von Zellteilungsprozessen fortschreitende Verdünnung des Farbstoffs kann mittels Durchflusszytometrie detektiert werden (3.2.5.3). Für den Thymidin-Assay wurden Zellen des Spenders 1798 verwendet, die über einen Zeitraum von fünf Wochen mit Daudi M1-SC-Zellen stimuliert wurden. In einem zuvor durchgeführten intrazellulären Zytokin-Assay wiesen rund 32 % aller CD3+CD8+ T-Zellen M1-Spezifität auf. Die Zellen wurden über 72 h zusammen mit verschiedenen Targetzellen inkubiert und die Thymidin-Inkorporation mittels Szintillations-Zähler bestimmt. Das Ergebnis des Thymidin-Assays wird in Abb. 28 dargestellt. 100 Ergebnisse ** 210000 2,1x105 180000 1,8x105 *** 150000 1,5x105 CPM 120000 1,2x105 90000 9x104 60000 6x104 30000 3x104 0 0 ohne Stimulation negative T2/M1 T2+M1 T2/CMV T2+CMV Daudi M1-SC Daudi M1SC Daudi Daudi Abb. 28: In vitro-Funktionalität generierter Effektorzellen im Thymidin-Assay. Eine mit Daudi M1-SC-Zellen über fünf Wochen generierte Zellpopulation wurde auf ihre Fähigkeit untersucht, nach Antigenkontakt spezifisch zu proliferieren. Hierzu wurde sie mit T2- bzw. Daudi-Zellen, die entweder M1 (2. bzw. 4. Balken), das irrelevante CMV-Peptid (Balken 3) oder gar kein MHCKlasse-I-restringiertes Peptid (rechter Balken) an ihrer Oberfläche trugen, inkubiert. Im Kontrollansatz erfolgte keine Zugabe von Targetzellen (linker Balken). Mittelwert ± SD aus n = 3. ** p ≤ 0,01; *** p ≤ 0,001. Wurden die generierten Zellen mit M1-Peptid-beladenen Targetzellen inkubiert, kam es zu einer deutlichen Proliferation. T2-Zellen, die das irrelevante CMV-Peptid an ihrer Oberfläche präsentierten, induzierten keine erhöhte Inkorporation von Thymidin in die DNA. Der Unterschied zwischen beiden Bedingungen war signifikant. Die stärkste Proliferation wurde durch Daudi-Zellen hervorgerufen, die das M1-SC-Konstrukt an ihrer Oberfläche trugen. Nach Inkubation mit naiven Daudi-Zellen konnte ebenfalls eine Vermehrung der mit den aAPCs generierten Zellen festgestellt werden. Die Höhe dieser lag jedoch signifikant unterhalb der durch Daudi M1-SC-Zellen induzierten Zellproliferation. Bei ausbleibender Addition von Targetzellen zu den Effektorzellen konnte keine Proliferation detektiert werden. Der CFSE-Assay wurde mit Zellen eines Spenders durchgeführt, die fünf bzw. acht Wochen mit Daudi M1-SC-Zellen stimuliert wurden. Bezogen auf die Gesamtpopulation wie- 101 Ergebnisse sen sie im intrazellulären IFN-γ-Assay eine M1-Spezifität von ca. 6 % bzw. 35 % auf. Die Stimulation CFSE-markierter Zellen erfolgte über einen Zeitraum von drei Tagen. Als Targetzellen wurden verschiedene Zellen verwendet, die entweder naiv oder peptidgekoppelt eingesetzt wurden. Die Kalkulation des Prozentanteils proliferierter Zellen erfolgte nach Anteil proliferierender CD3+CD8+ Zellen (%) Immunfluoreszenzfärbung und FCM-Analyse wie im Methodenteil beschrieben (3.2.5.3). 80 80 60 60 40 40 Mittel 20 20 00 T2/CMV T2/M1 ohne T2/CMV T2/M1 Target negative control Daudi Daudi M1K562 M1Daudi Daudi Daudi K562 SC SC AFP-SC M1-SC M1-SC Daudi AFPSC Abb. 29: In vitro-Funktionalität generierter Zellen im CFSE-Assay. Fünf bzw. acht Wochen mit Daudi M1-SC-Zellen stimulierte Zellen wurden einem CFSE-Assay unterzogen und der Anteil proliferierender CD3+CD8+ T-Zellen mittels FCM bestimmt. Als Targetzellen dienten Zellen, die entweder mit dem relevanten M1- bzw. dem irrelevanten CMV-Peptid beladen (T2-Zellen) oder mit dem M1-SC- bzw. AFP-SC-Konstrukt transfiziert wurden (Daudi- und K562-Zellen). Dargestellt wird der Mittelwert aus zwei unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten. Mittelwert ± SD. Wie aus Abb. 29 ersichtlich wird, war eine Proliferation der generierten CD3+CD8+ TZellen vor allem nach spezifischem Kontakt mit dem M1-Peptid nachweisbar. So proliferierten die Zellen am deutlichsten, wenn sie mit M1-gepulsten T2-Zellen bzw. transfizierten Daudi M1-SC- und K562 M1-SC-Zellen inkubiert wurden. Im Gegensatz dazu induzierten CMV-beladene T2-Zellen nahezu keine Proliferation. Etwas stärker war diese in den Kontrollansätzen mit naiven Daudi- bzw. transfizierten Daudi AFP-SC-Zellen. Wurden keine Targetzellen zu den generierten Effektorzellen addiert, blieb eine messbare Antwort aus. Aufgrund der geringen n-Zahlen wurde keine Signifikanzberechnung durchgeführt. 102 Ergebnisse 4.5.3 Zytotoxizität Zur Überprüfung der zytotoxischen Kapazität der generierten CTLs wurden sie in unterschiedlichen Effektor:Target-Verhältnissen mit 51 Chrom-markierten Targetzellen inkubiert. Hierfür wurden T2-Zellen eingesetzt, die mit M1- bzw. CMV-Peptid beladen wurden. Die verwendeten Effektorzellen stammten von einem gesunden Spender, dessen PBMCs über einen Zeitraum von fünf Wochen mit Daudi M1-SC-Zellen stimuliert wurden. Bezogen auf die Gesamtzellpopulation lag ihre M1-Spezifität im IFN-γ-Assay bei 6 %. Targetzellen, die das M1-Peptid über ihren MHC-Klasse-I-Komplex an ihrer Oberfläche präsentierten, wurden von den in der gemischten Kultur enthaltenen Effektorzellen lysiert (Abb. 30). Bei einem Effektor:Target-Verhältnis von 100:1 lag die Lyse bei 91 % und sank bis auf 74 %, wenn das Verhältnis auf 3:1 reduziert wurde. Als Kontrolle wurde die Lyse von T2-Zellen überprüft, die mit einem irrelevanten Peptid beladen wurden. Sie betrug 53 % bei einem Effektor:Target-Verhältnis von 100:1 und 12 % bei einem Verhältnis von 3:1 und war somit signifikant reduziert. 100 100 80 80 lysis (%) ** 60 60 B1 T2/M1 Mittelwert T2/M1 B2 T2/CMV Mittelwert T2/CMV 40 40 20 20 00 100:1 100:1 10:1 10:1 33:1 33:1 3:1 3:1 E:T E:T Abb. 30: In vitro-Funktionalität generierter Zellen im 51Cr release assay. Mit Daudi M1-SCZellen generierte Zellen, deren Spezifität im intrazellulären IFN-γ-Assay bei 6 % lag, wurden im Zytotoxizitäts-Assay mit M1-beladenen T2-Zellen in den angegebenen E:T-Verhältnissen inkubiert (braune Quadrate). Als Kontrolle wurden T2-Zellen eingesetzt, die das irrelevante CMV-Peptid an ihrer Oberfläche präsentierten (weiße Quadrate). Mittelwert ± SD aus n = 3. Das dargestellte Diagramm stellt ein repräsentatives Ergebnis von zwei unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten dar. ** p ≤ 0,01. 103 Ergebnisse Um zu überprüfen, mit welcher Affinität die CTLs an die Targetzellen binden und eine Zytolyse induzieren, wurden in einem weiteren Versuch Effektorzellen in einem Verhältnis von 20:1 mit T2-Targetzellen inkubiert, die mit einer ansteigenden Konzentration an M1Peptid beladen wurden. Die benutzten Effektorzellen stammten von Spender 1798 und befanden sich drei bzw. sieben Wochen mit Daudi M1-SC-Zellen in Kultur. Der Prozentanteil M1-positiver Zellen in der CD3+CD8+ Zellpopulation belief sich im intrazellulären Zytokin-Assay auf 20 % bzw. 75 %. Abb. 31 stellt das Ergebnis zweier unabhängig voneinander durchgeführter Versuche dar. 100 100 7 Wochen 3 8080 lysis (%) 3 Wochen 7 6060 4040 n.s. 2020 0 0 10^6 10 1066 10^5 10 1055 10^4 10 1044 10^3 10 1033 10^2 10 1022 10^1 10 1011 ohne Peptid T2 without M1 M1-Peptidkonzentration (pg/ml) Abb. 31: Konzentrationsabhängige Lyse von Targetzellen durch generierte Effektorzellen. Zur Untersuchung der konzentrationsabhängigen Lyse von T2-Zellen wurden sie mit unterschiedlichen Peptidkonzentrationen beladen und mit Effektorzellen in einem E:T-Verhältnis von 20:1 inkubiert. Als Effektorzellen wurden Zellen verwendet, die über drei (braune Quadrate) bzw. sieben Wochen (weiße Quadrate) mit Daudi M1-SC-Zellen generiert wurden. Der Basalwert wird von T2Zellen ohne Peptid gebildet. Mittelwert ± SD aus n = 3. n.s. = nicht signifikant. In beiden Fällen konnte eine konzentrationsabhängige Lyse der Targetzellen nachgewiesen werden. Sie betrug bis zu einer Peptid-Konzentration von 104 pg / ml (10 nmol / l) über 80 % in dem einen und über 60 % in dem anderen Versuch. Erst ab einer Peptidkonzent- 104 Ergebnisse ration, die unterhalb von 103 pg / ml (1 nmol / l) lag, konnte eine geringe Abnahme der Lyse festgestellt werden. Deutlich vermindert war die durch die Effektorzellen induzierte Zytotoxizität, wenn die T2-Zellen mit 102 pg / ml (0,1 nmol / l) bzw. einer geringeren Peptidkonzentration beladen wurden. Der Basalwert der Lyse (T2-Zellen ohne Peptid) war bei sieben Wochen generierten Zellen geringer als bei drei Wochen stimulierten Effektorzellen. Bei höheren Peptidkonzentrationen wiesen hingegen Letztere eine stärkere Zytotoxizität auf, wobei dieser Unterschied nicht signifikant war (Abb. 31). 4.5.4 Reaktivität gegenüber Influenza M1-transfizierten Tumorzellen In bisherigen Versuchen wurde die Reaktivität der generierten M1-spezifischen Effektorzellen gegenüber M1-Peptid-gepulsten bzw. M1-SC-transfizierten Targetzellen untersucht. Nachfolgend sollte überprüft werden, ob die Effektorzellen ebenfalls in der Lage sind, Zellen zu erkennen, die das M1-Peptid des Influenzavirus nach natürlicher Prozessierung an ihrer Oberfläche exprimieren. Hierzu wurden zunächst HLA-A2-positive NW-38-Mel-Zellen mit dem in dieser Arbeit hergestellten Influenza M1 pEGFP-Konstrukt (4.2) transfiziert. Aus Abb. 32A geht hervor, dass die Zellen nach Transfektion positiv für GFP waren. Dies wurde mittels Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenzmikroskopie untersucht. Parallel hiezu erfolgte eine Lipofektamin-Transfektion der Hepatomzelllinie Hlx Pxt mit dem M1-SC pEGFP-Konstrukt. Hlx Pxt M1-SC-Zellen wiesen ebenfalls eine Expression des grünfluroeszierenden Proteins GFP auf (Abb. 32B). Auf naiven NW-38-Mel- bzw. Hlx Pxt-Zellen konnte kein GFP detektiert werden. In nachfolgenden Experimenten wurde untersucht, ob mit aAPCs generierte T-Zellen die Fähigkeit besitzen, transfizierte NW-38-Mel M1-Zellen zu erkennen. Dies erfolgte mittels intrazellulärer IFN-γ-Analyse, GM-CSF-ELISA sowie Zytotoxizitäts-Assay. Hlx Pxt M1-SCZellen wurden als Positivkontrolle im GM-CSF-ELISA eingesetzt. 105 Ergebnisse A B NW-38-Mel M1 HlxPxt M1-SC Abb. 32: GFP-Expression durch NW-38-Mel M1- und Hlx Pxt M1-SC-Zellen. Die HLA-A2positiven Zelllinien NW-38-Mel und Hlx Pxt wurden mit dem Influenza M1 pEGFP- (A) bzw. M1-SC pEGFP-Konstrukt (B) transfiziert und die GFP-Expression mittels FCM-Analyse (oben) sowie Fluoreszenzmikroskopie (unten) untersucht. Naive NW-38-Mel- bzw. Hlx Pxt-Zellen werden im Histogramm als grau ausgefüllte Kurven dargestellt (A und B; oben). 4.5.4.1 Intrazelluläre IFN-γ-Analyse Für den intrazellulären Assay wurden Zellen des Spenders 1907 verwendet. Sie kamen nach zweiwöchiger Kultur mit Daudi M1-SC-Zellen zum Einsatz. Ihre M1-Spezifität, bezogen auf die CD3+CD8+ Zellpopulation, belief sich auf ca. 17 %. Für den intrazellulären Assay wurden sie zusammen mit naiven oder transfizierten NW-38-Mel-Zellen in einem Verhältnis von 1:1 inkubiert und die anschließende Färbung gemäß Protokoll durchgeführt (3.2.5.1). Aus Abb. 33 geht hervor, dass die generierten T-Zellen IFN-γ sezernierten, wenn sie mit NW-38-Mel M1-Zellen stimuliert wurden. Der Anteil IFN-γ-produzierender Zellen in der CD3+CD8+ Zellpopulation betrug 29 % (19,5% von 66,5% CD3+CD8+ Zellen). Eine Inkubation der Zellen mit naiven NW-38-Mel-Zellen induzierte hingegen keine erhöhte IFN-γSynthese. 106 Ergebnisse IFN-γγ NW-38-Mel naive NW-38-Mel M1 0.12% 19.5% 51.3% 47.0% CD8 Abb. 33: IFN-γ-Synthese nach Erkennung M1-exprimierender Tumorzellen. Mittels Daudi M1SC-Zellen generierte Zellen wurden mit der transfizierten Tumorzelllinie NW-38-Mel M1 über einen Zeitraum von 6 h inkubiert und die IFN-γ-Sekretion mittels intrazellulärem Zytokin-Assay untersucht. Als Kontrolle wurden naive Tumorzellen eingesetzt. Es handelt sich um ein repräsentatives Ergebnis von zwei unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten. Gates: vitale Lymphozyten und CD3+ T-Zellen. 4.5.4.2 GM-CSF-ELISA Im nachfolgenden GM-CSF-ELISA wurden ebenfalls Zellen des Spenders 1907 verwendet, die sich in diesem Fall für eine Dauer von drei Wochen in Kultur befanden. Eine Analyse mittels Pentamer-Färbung ergab, dass, bezogen auf die CD8+ T-Zellpopulation, ca. 46 % der Effektorzellen M1-Spezifität aufwiesen. Sie wurden mit verschiedenen Targetzellen inkubiert. Hierbei handelte es sich entweder um T2-Zellen, die mit M1-Peptid beladen wurden oder um NW-38-Mel-Tumorzellen, die das Influenza M1-Konstrukt an ihrer Oberfläche exprimierten. Außerdem wurden in diesem Versuch Hlx Pxt M1-SC-Zellen als Targetzellen eingesetzt. Naive T2-, NW-38-Mel- bzw. Hlx Pxt-Zellen dienten als Negativkontrolle. Eine Synthese von GM-CSF konnte durch alle Targetzellen induziert werden, die M1 an ihrer Oberfläche exprimierten, wobei die gemessene Zytokinkonzentration mit 1400 pg / ml bei den Hlx Pxt M1-SC-Zellen höher war als bei den NW-38-Mel M1-Zellen mit 850 pg / ml. T2-Zellen, die das M1-Peptid über MHC-Klasse-I-Moleküle präsentierten, lösten die stärkste GM-CSF-Sekretion aus (1650 pg /ml). Bei allen drei Kontrollansätzen lag die GMCSF-Konzentration unter 100 pg / ml und hob sich signifikant von der durch M1exprimierende Targetzellen induzierten Zytokinsekretion ab (Abb. 34). 107 Ergebnisse *** *** 1500 1500 1200 1200 *** 900 900 600 600 300 300 HlxPxt M1SC Hl xP xt +M 1S C Hl xP xt NW-38- NW-38- HlxPxt Mel M1 Mel NW -3 8+ M 1 T2+M1 NW -3 8 T2 T2 00 T2 +M 1 GM-CSF (pg/ml) 1800 1800 Abb. 34: M1-spezifische GM-CSF-Sekretion durch Effektor-T-Zellen. M1-exprimierende Targetzellen (T2+M1, NW-38-Mel M1 und Hlx Pxt M1-SC) wurden mit Effektorzellen (M1-Spezifität ca. 46 %) in einem Verhältnis von 1:1 inkubiert und die GM-CSF-Konzentration im Zytokin-ELISA detektiert. Die Kontrollansätze bestanden aus naiven T2-, NW-38-Mel- bzw. Hlx Pxt-Zellen. Mittelwert ± SD aus n = 3. *** p ≤ 0,001. 4.5.4.3 Zytotoxizität Zur Untersuchung der lytischen Aktivität gegenüber NW-38-Mel M1-Zellen wurden Zellen des Spenders 3050 verwendet, die aus der Stimulation naiver PBMCs mit Daudi M1-SCZellen hervorgegangen waren. Ca. 10 % ihrer CD8+ T-Zellen wiesen Spezifität für das M1Pentamer auf. Sie wurden in verschiedenen E:T-Verhältnissen mit NW-38-Mel M1-Zellen zusammengebracht. Zur Kontrolle wurden die CTLs mit naiven NW-38-Mel-Zellen inkubiert. Bei einem E:T-Verhältnis von 33:1 wurden die NW-38-Mel M1-Zellen zu 56 % lysiert. Betrug das Verhältnis 3:1 lag die Lyse bei 41 %. Im Vergleich dazu wurden naive NW-38Mel-Zellen bei diesen beiden E:T-Verhältnissen zu 37 % bzw. 14 % lysiert. Der Unterschied zwischen beiden Gruppen war bei allen E:T-Verhätnissen signifikant (Abb. 35). 108 Ergebnisse 70 70 NW-38-Mel+M1 ** *** Lysis (%) 60 60 NW-38-Mel *** 50 50 40 40 30 30 20 20 10 10 00 33:1 33:1 10:1 10:1 3:1 3:1 E:T Abb. 35: M1-spezifische Lyse von NW-38-Mel M1-Zellen durch generierte Effektorzellen. Zellen des Spenders 3050 (M1-Spezifität ca. 10 %) wurden auf ihre Zytotoxizität gegenüber M1exprimierenden NW-38-Mel-Zellen überprüft, die stabil mit dem Influenza M1 pEGFP-Konstrukt transfiziert wurden. Eingesetzt wurden drei verschiedene Effektor:Target-Verhältnisse (E:T). Als Negativkontrolle dienten naive NW-38-Mel-Zellen. Mittel ± SD aus Triplikaten. ** p ≤ 0,01; *** p ≤ 0,001. 4.6 Vergleich von aAPCs mit DCs Um die Effektivität der hergestellten Daudi M1-SC-Zellen einschätzen zu können, wurden sie in nachfolgenden Experimenten mit autologen APCs verglichen. Weiterhin wurde getestet, ob auch andere Tumorzelllinien, in diesem Fall K562-Zellen, in der Lage sind, nach Transfektion mit dem M1-SC pEGFP- bzw. HLA-A2 pEGFP-Konstrukt, M1-reaktive TZellen spezifisch zur Expansion anzuregen. Abb. 36 zeigt die GFP-Expression von K562 M1-SC- bzw. K562 HLA-A2-Zellen nach Elektroporation und Selektion erfolgreich transfizierter Zellen im Vergleich zu Daudi M1SC-Zellen. Bezogen auf die Negativkontrolle (naive Daudi- bzw. K562-Zellen) betrug der GFP-Expressionsindex 21 bei Daudi M1-SC-Zellen, 16 bei K562 HLA-A2-Zellen und 11 bei K562 M1-SC-Zellen. 109 Ergebnisse A B K562 M1-SC u. K562 HLA-A2 Daudi M1-SC Abb. 36: GFP-Expression von Daudi M1-SC-, K562 M1-SC- und K562-HLA-A2-Zellen. Nach Transfektion von K562-Zellen mit M1-SC pEGFP (A; dicke Linie) bzw. HLA-A2 pEGFP-N3 (A; dünne Linie) wurde die GFP-Expression mittels Durchflusszytometrie untersucht. Sowohl K562 M1-SC- als auch K562 HLA-A2-Zellen waren positiv für das grünfluoreszierende Protein. Zum Vergleich werden Daudi M1-SC-Zellen dargestellt (B). Die grau ausgefüllten Kurven entsprechen der GFP-Expression naiver K562- (A) bzw. Daudi-Zellen (B). Für die nachfolgenden Vergleichsstudien wurden PBMCs sechs verschiedener, gesunder Spender über zwei Wochen mit autologen DCs, Daudi M1-SC-, K562 M1-SC- bzw. K562 HLA-A2-Zellen gemäß Protokoll stimuliert (3.2.4.8). Die M1-Spezifität wurde zum Zeitpunkt der Restimulation sowie am Ende des Experimentes mittels Pentamer-Färbung bestimmt. Um die generierte Zellpopulation näher zu charakterisieren, erfolgte zudem ihre Phänotypisierung mit Hilfe der Oberflächen-FCM-Analyse. Die absolute Anzahl generierter Zellen nach zweiwöchiger Kultur wird in Abb. 37 dargestellt. Unabhängig vom Versuchsansatz konnte eine deutliche Expansion von Zellen beobachtet werden. Diese war am schwächsten bei den DCs ausgeprägt. Hier kam es nach zweiwöchiger Inkubation im Mittel zu einer 2,7-fachen Vermehrung der Zellen. Zellen, die mit M1-beladenen K562 HLA-A2-Zellen stimuliert wurden, hatten sich am Ende des Versuches um das 3,5-fache vermehrt. K562 M1-SC-Zellen induzierten nach einwöchiger Kultur eine mit K562 HLA-A2-Zellen vergleichbare Expansion. Der Faktor der Vermehrung lag allerdings am Ende des Versuches mit 4,3 etwas höher. Die deutlichste Zellproliferation wurde durch Addition von Daudi M1-SC-Zellen zur PBMC-Kultur ausgelöst. So lag die absolute Zellzahl nach zwei Wochen Inkubation im Mittel bei 1,6 x 107 und war signifikant höher als die absolute Zellzahl, die durch M1-beladene DCs, K562 M1-SC bzw. K562 HLA-A2-Zellen erzielt werden konnte (Abb. 37). Der Proliferationsindex betrug im Fall von Daudi M1-SC-Zellen 8,2. 110 Ergebnisse Wurden die Zellen über einen längeren Zeitraum als zwei Wochen in Kultur gehalten, kam es zu einem verstärkten Absterben der Zellen und somit zu einem Abfall der absoluten Zellzahl, wenn transfizierte K562-Zellen bzw. M1-gepulste DCs als APCs verwendet wurden. Im Gegensatz hierzu wiesen Zellen, denen das M1-Peptid von Daudi M1-SC-Zellen präsentiert wurde, eine auch weiterhin bestehende Proliferation auf (Daten nicht gezeigt). *** 25000000 2,5 x 107 absolute Zellzahl ** Data ** 2 2,0 x 107 20000000 1,5 x 107 15000000 1,0 x 107 10000000 5,0 x 106 5000000 00 H LA -A 2 K 56 2 M 1SC K 56 2 M 1SC D au di D C s DCs+M1 Daudi K562 K562 HLA0 M1-SC M1-SC A2+M1 Abb. 37: Vergleich von aAPCs mit autologen DCs; absolute Zellzahl nach zweiwöchiger Stimulation. PBMCs sechs gesunder Spender (3050, 3154, 1907, 1869, 3407 und 3448) wurden mit DCs, Daudi M1-SC, K562 M1-SC bzw. K562 HLA-A2 über einen Zeitraum von zwei Wochen inkubiert und die absolute Anzahl lebender Zellen mittels Trypanblaufärbung bestimmt. DCs und K562-HLA-A2-Zellen wurden vor Verwendung mit 30 µg / ml M1-Peptid beladen. Individuelle Werte und Mittelwert (waagerechte Linie) aus n = 6. ** p ≤ 0,01; *** p ≤ 0,001. Die mittels Pentamer-Färbung untersuchte M1-Spezifität der generierten Zellpopulation wird in Abb. 38 dargestellt. Tendenziell war die Anzahl an M1-spezifischen CD8+ T-Zellen im Mittel bei den Zellen am größten, die mit M1-beladenen DCs stimuliert wurden. Mit den aAPCs Daudi M1-SC, K562 M1-SC und K562 HLA-A2 konnten vergleichsweise weniger peptidspezifische T-Zellen in der Kultur detektiert werden. Der Unterschied war allerdings nicht signifikant. 111 Ergebnisse Anzahl M1-spezifischer CD8+ T-Zellen 2500000 2,5 x 106 2000000 2,0 x 106 1500000 1,5 x 106 1,0 x 106 1000000 5,0500000 x 105 00 0 DCs+M1 Daudi K562 K562 HLAM1-SC M1-SC A2+M1 Abb. 38: Vergleich von aAPCs mit autologen DCs; Anzahl M1-spezifischer T-Zellen nach zweiwöchiger Stimulation. PBMCs sechs gesunder Spender (3050, 3154, 1907, 1869, 3407 und 3448) wurden mit DCs, Daudi M1-SC, K562 M1-SC bzw. K562 HLA-A2 über einen Zeitraum von zwei Wochen stimuliert und die Anzahl M1-spezifischer CD8+ T-Zellen nach 14 Tagen mittels Pentamer-Färbung bestimmt. Gate: vitale Lymphozyten. Individuelle Werte und Mittelwert (waagerechte Linie) aus n = 6. 70 70 * * * ** % postive Zellen 60 60 50 50 40 40 30 30 20 20 10 10 00 naive DC+M1 Daudi K562 K562HLAHLA-A2 naive DCs+M1 DaudiM1-SC K562M1-SC K562 PBMCs M1-SC M1-SC A2+M1 Abb. 39: Vergleich von DCs mit aAPCs; Anteil CD3+CD4+ T-Zellen. PBMCs sechs gesunder Spender (3050, 3154, 1907, 1869, 3407 und 3448) wurden mit professionellen APCs bzw. aAPCs stimuliert und der prozentuale Anteil an CD3+CD4+ T-Zellen in der Gesamtpopulation im Vergleich zu naiven PBMCs dargestellt. Gate: vitale Lymphozyten. Individuelle Werte und Mittelwert (waagerechte Linie) aus n = 6. * p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,01. 112 Ergebnisse Eine nähere Charakterisierung der Zusammensetzung der generierten Zellpopulation erfolgte durch Bestimmung des Prozentanteils positiver Zellen für die Oberflächenmoleküle CD3, CD4, CD8 und CD56 sowie für den γ:δ TCR. Die verwendeten Antikörper werden in Tabelle 1 aufgelistet. Die nachfolgenden drei Abbildungen zeigen den Prozentanteil an CD4+ und CD8+ T-Zellen sowie γ:δ T-Zellen nach zweiwöchiger Stimulation mit DCs, Daudi M1-SC-, K562 M1-SC- bzw. K562 HLA-A2-Zellen im Vergleich zu naiven PBMCs. Es wird deutlich, dass naive PBMCs im Mittel den größten Anteil an CD4+ T-Zellen aufwiesen. Bei Zellen, die über zwei Wochen mit aAPCs bzw. DCs inkubiert wurden, kam es zu einem signifikanten Rückgang dieser Zellen in der gemischten Kultur (Abb. 39). Im Gegensatz hierzu induzierten transfizierte K562-Zellen ebenso wie autologe, peptidbeladene DCs einen Anstieg der CD8+ T-Zellen in der gemischten Zellpopulation. Dieser war bei M1-beladenen K562 HLA-A2-Zellen signifikant. Wurden Daudi M1-SC-Zellen als aAPCs verwendet, lag der Prozentanteil an CD8+ T-Zellen im Mittel bei 25 ± 15 % und somit in einem ähnlichen Bereich wie bei naiven PBMCs mit 28 ± 18 % (Abb. 40). * * 70 70 % postive Zellen 60 60 50 50 40 40 30 30 20 20 10 10 00 naive DC+M1 Daudi K562 K562 HLA-A2 naive DCs+M1 DaudiM1-SC K562M1-SC K562 HLAPBMCs M1-SC M1-SC A2+M1 Abb. 40: Vergleich von DCs mit aAPCs; Anteil CD3+CD8+ T-Zellen. PBMCs sechs gesunder Spender (3050, 3154, 1907, 1869, 3407 und 3448) wurden mit professionellen APCs bzw. aAPCs stimuliert und der prozentuale Anteil an CD3+CD8+ T-Zellen in der Gesamtpopulation im Vergleich zu naiven PBMCs dargestellt. Gate: vitale Lymphozyten. Individuelle Werte und Mittelwert (waagerechte Linie) aus n = 6. * p ≤ 0,05. 113 Ergebnisse * 80 80 % postive Zellen 70 70 60 60 50 50 40 40 30 30 20 20 10 10 00 naive DC+M1 Daudi K562 K562 HLA-A2 naive DCs+M1 DaudiM1-SC K562M1-SC K562 HLAPBMCs M1-SC M1-SC A2+M1 Abb. 41: Vergleich von DCs mit aAPCs; Anteil γ:δ T-Zellen. PBMCs sechs gesunder Spender (3050, 3154, 1907, 1869, 3407 und 3448) wurden mit professionellen APCs bzw. aAPCs stimuliert und der prozentuale Anteil an γ:δ T-Zellen in der Gesamtpopulation im Vergleich zu naiven PBMCs dargestellt. Gate: vitale Lymphozyten. Individuelle Werte und Mittelwert (waagerechte Linie) aus n = 6. * p ≤ 0,05. Der Prozentanteil an γ:δ-T-Zellen wurde überprüft, indem die Zellen mit Antikörpern gegen CD3 sowie γ:δ-TCR gefärbt wurden. Transfizierte K562-Zellen und DCs induzierten im Vergleich zu naiven PBMCs eine leichte Erhöung dieses Zellttyps in der Kultur. Hervorzuheben ist jedoch der signifikante Anstieg von γ:δ-T-Zellen nach zweiwöchiger Inkubation mit Daudi M1-SC-Zellen (Abb. 41). So waren 36 ± 28 % der mit diesen aAPCs kultivierten Zellen positiv für CD3 und γ:δ-TCR. Im Vergleich hierzu betrug der Anteil an γ:δ-T-Zellen in der naiven Zellpopulation nur 2 ± 0,7 %. Die mit den DCs bzw. aAPCs erhaltene Zellpopulation wurde ebenfalls auf das Vorhandensein von NK- (CD3-CD56+) sowie NKT-Zellen (CD3+CD56+) überprüft. Der prozentuale Anteil an NK-Zellen war am höchsten, wenn transfizierte K562-Zellen als antigenpräsentierende Zellen verwendet wurden. Daudi M1-SC-Zellen sowie autologe DCs induzierten keinen Anstieg der CD3-CD56+ Zellen. Der Prozentanteil an NKT-Zellen betrug im Fall von unstimulierten PBMCs im Mittel 0,6 ± 0,4 %. Sowohl DCs als auch aAPCs bewirkten einen leichten Anstieg dieser Zellen in der 114 Ergebnisse Kultur. So lag der Prozentanteil bei der mit DCs generierten Zellpopulation im Mittel beispielsweise bei 4 % und im Fall von Daudi M1-SC-Zellen bei 5 %. Zur weiteren Analyse wurde die Funktionalität generierter Zellen vergleichend betrachtet. Hierzu wurden PBMCs drei gesunder, HLA-A2-positiver Spender über eine Woche zusammen mit professionellen APCs, Daudi M1-SC- bzw. K562-M1-SC-Zellen kultiviert. Als professionelle APCs dienten in diesem Experiment autologe PBMCs, die mit M1-Peptid beladen wurden. Die Negativkontrolle wurde von unstimulierten PBMCs derselben Spender gebildet. Die Fähigkeit der generierten Zellen, nach M1-Peptidkontakt Zytokine zu sezernieren, wurde im intrazellulären IFN-γ-Assay untersucht. Unabhängig von der Art der Antigenpräsentation konnte im Vergleich zur unstimulierten Kontrolle ein signifikanter Anstieg an M1-spezifischen T-Zellen beobachtet werden. Die Effektorzellen waren hierbei in der Lage, nach Antigenkontakt IFN-γ zu synthetisieren. Der Anteil M1-spezifischer CD8+ T-Zellen war tendenziell bei den Zellen, die mit K562 M1-SCZellen stimuliert wurden, am geringsten. Es bestand allerdings kein signifikanter Unterschied zwischen professionellen APCs und aAPCs (Abb. 42). ** 25 % IFNγγ-pos. Zellen in CD8+ Zellpopulation 25 * ** 20 20 15 15 10 10 5 5 0 0 PBMCs alone PBMCs (-) PBMCs + M1 M1Peptid PBMCs + K562 M1-SC K562 M1-SC PBMCs + Daudi M1-SC Daudi M1-SC Abb. 42: Vergleich von DCs mit aAPCs; IFN-γ-Sekretion durch M1-spezifische T-Zellen. Aus PBMCs drei gesunder Spender (1619, 1604 und 1639) wurden M1-spezifische T-Zellen generiert, indem sie über eine Wochen mit M1-beladenen, autologen APCs, K562 M1-SC-Zellen oder Daudi M1-SC-Zellen stimuliert wurden. Die Funktionalität der CD8+ T-Zellen wurde nach spezifischem Antigenkontakt im intrazellulären Zytokin-Assay bestimmt. Gate: vitale Lymphozyten. Mittelwert ± SD aus n = 3. * p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,01. 115 Ergebnisse 4.7 Funktionalität von M1-spezifischen T-Zellen in vivo In der vorgestellten Arbeit wurden die in vivo-Experimente an immundefizienten NOD-scidMäusen durchgeführt. In diesen Tieren wurde durch subkutane Injektion von humanen NW-38-Mel M1-Zellen ein xenogener Tumor induziert, der das M1-Peptid an seiner Oberfläche exprimierte. 48 h nach Injektion von 5 x 105 Tumorzellen pro Maus erfolgte die intravenöse Applikation von in vitro generierten, M1-spezifischen T-Zellen (3.2.6). Diese Zellen wurden in einer dreiwöchigen Stimulationsphase aus PBMCs des Spenders 3050 generiert. Mittels FCM-Oberflächenanalyse wurde festgestellt, dass sich die gemischte Zellpopulation aus den in Tabelle 10 aufgeführten Zellen zusammensetzte. Im Vergleich zu unstimulierten PBMCs desselben Spenders wiesen die mit aAPCs stimulierten Zellen einen ca. 10-fach höheren Anteil an NKT- sowie γ:δ T-Zellen auf. Weiterhin konnte eine Halbierung der CD4+ T-Zellpopulation detektiert werden, wohingegen der Anteil an CD8+ TZellen nahezu unverändert blieb. Die mittels Pentamer-Analyse gemessene M1-Spezifität betrug 13 %. Bezogen auf die CD8+ T-Zellpopulation wiesen ca. 57 % der CD8+ Zellen Reaktivität gegenüber dem M1-Peptid auf. Kontrolltiere erhielten entweder eine Injektion von naiven PBMCs desselben Spenders (Tabelle 10) oder von PBS. Tabelle 10: Phänotypisierung generierter Zellen für den Einsatz in vivo. Spender PBMCs 3050 M1CD3+CD8+ CD3+CD4+ (%) Spezifität (%) (% UR) 0,2 31,3 39,9 13,1 31,8 18,4 CD3+γ:δ TCR+ (%) 3,7 NKT CD3+CD56+ (%) 0,8 NK CD3-CD56+ (%) 2,6 32,5 11,5 0,7 PBMCs des Spenders 3050 wurden über 3 Wochen mit Daudi M1-SC-Zellen stimuliert und die generierte Zellpopulation auf M1-Spezifität und Expression angegebener CD-Moleküle untersucht (untere Zeile). Als Vergleich wurden naive PBMCs desselben Spenders analysiert (obere Zeile). In Abb. 43 wird das Tumorwachstum in allen drei Tiergruppen über die Zeit dargestellt. Es wird deutlich, dass sowohl die Mausgruppe, die eine intravenöse Applikation von naiven PBMCs erhalten hat, als auch die Gruppe, die mit PBS behandelt wurde, ein progressives Wachstum des NW-38-Mel M1-Tumors aufwies. Bei der Gruppe, die mit M1-spezifischen 116 Ergebnisse T-Zellen behandelt wurde, konnte eine leichte Regression festgestellt werden. So kam es im Vergleich zu den beiden Kontrollgruppen zu einem um einige Tage verzögerten Aus- mittlerer Tumordurchmesser (cm) wachsen des Tumors. Der Unterschied stellte sich jedoch als nicht signifikant heraus. 1,6 M1-spez.Zellen Zellen M1-spez. 1,4 naive PBMCs PBMCs (naiv) n.s. PBS PBS 1,2 1,0 1 0,8 0,6 0,4 0,2 00 0 0 5 5 10 10 15 15 20 20 25 25 30 30 35 35 40 40 45 45 50 50 55 55 60 60 65 65 Tage Abb. 43: In vivo-Funktionalität generierter Zellen. Nach subkutaner Injektion von 5 x 105 NW38-Mel M1-Tumorzellen erfolgte eine intravenöse Applikation von PBS (grau), naiven PBMCs (schwarz) bzw. mittels Daudi M1-SC generierten Zellen (rot); siehe Pfeil. Das Tumorwachstum wurde über einen Zeitraum von 65 Tagen protokolliert. Mittelwert ± SD aus n = 3 pro Gruppe. n.s. = nicht signifikant. Die ausgewachsenen NW-38-Mel M1-Tumoren wurden nach Beendigung des Experimentes aus den Tieren isoliert und nach Herstellung von Einzelzellsuspensionen (3.2.6.3) mittels Durchflusszytometrie auf GFP-Expression untersucht. Aus dem in Abb. 44 dargestellten Ergebnis geht hervor, dass, unabhängig von der Behandlung, NW-38-Mel M1-Zellen nach Expansion in vivo positiv für das GFP-Protein waren. Im Vergleich zu in vitro kultivierten Zellen war die Höhe der Expression jedoch reduziert. 117 Ergebnisse naive NW-38 Mel-Zellen NW-38 Mel M1-Zellen PBS naive PBMCs M1-spez. T-Zellen GFP Abb. 44: GFP-Expression durch NW-38-Mel M1-Zellen nach in vivo-Passage. Tumorzellen wurden aus 65 Tage alten Tumoren isoliert und auf GFP-Expression untersucht. Dargestellt wird ein repräsentatives Ergebnis von je einer Maus pro Gruppe (rot: PBS; gelb: naive PBMCs; blau: M1-spezifische T-Zellen). In vitro kultivierte, naive bzw. transfizierte NW-38-Mel-Zellen werden in grau bzw. schwarz dargestellt. 4.8 Generierung M1-spezifischer T-Zellen aus Patienten mit fortgeschrittenen Karzinomen des Gastrointestinaltraktes unter palliativer Chemotherapie Im Folgenden wurde überprüft, ob die in dieser Arbeit hergestellten aAPCs ebenfalls in der Lage sind, M1-spezifische T-Zellen aus PBMCs erkrankter Personen zu generieren. Hierzu wurden die mononukleären Zellen des peripheren Blutes aus Patienten isoliert, die an einem gastrointestinalen Karzinom litten und aufgrund einer palliativen Chemotherapie einen supprimierten Immunstatus aufwiesen (3.1.5.3). Nach einwöchiger Stimulation von PBMCs fünf verschiedener Patienten mit Daudi M1-SCZellen konnten M1-spezifische CD8+ T-Zellen in der gemischten Zellpopulation detektiert werden. Die Höhe des Prozentanteils variierte von Patient zu Patient. So waren über 3 % der CD8+ T-Zellen positiv für das M1-Pentamer, wenn PBMCs des Patienten 3257 verwendet wurden. Bei Spender 3262 lag dieser Wert bei 0,8 %. Wurden PBMCs der Patienten 3190, 3185 und 3349 über eine Woche mit den generierten aAPCs inkubiert, wiesen weniger als 0,5 % der CD8+ T-Zellen M1-Spezifität auf (Abb. 45). Im Mittel lag der Prozentanteil M1-reaktiver T-Zellen bei 0,99 ± 1,3 %. 118 % M1-spez. T-Zellen in CD8-pos. Population % M1-specific cells Ergebnisse 44 33 22 1 0 3257 3257 3262 3262 3190 3190 3185 3185 3349 3349 Abb. 45: Generierung M1-spezifischer T-Zellen aus Krebspatienten. PBMCs fünf verschiedener HLA-A2-positiver Patienten wurden mit Daudi M1-SC-Zellen gemäß Protokoll stimuliert und die M1-Spezifität nach einer Woche mittels M1-Pentamer-Färbung detektiert. Gezeigt wird der Prozentanteil M1-spezifischer CD8+ T-Zellen in der CD8+ Zellpopulation nach Abzug der Negativkontrolle (Färbung mit dem NY-ESO-Pentamer). Die in Abb. 45 dargestellte stimulatorische Kapazität von Daudi M1-SC-Zellen im Fall von immunsupprimierten Tumorpatienten wurde im nachfolgenden Experiment mit professionellen APCs verglichen. Hierfür wurden ebenfalls PBMCs aus Patienten mit einem gastrointestinalen Karzinom isoliert. Diese wurden einerseits mit M1-gepulsten, aus CD14+ Zellen generierten, autologen DCs und andererseits mit Daudi M1-SC-Zellen über einen Zeitraum von einer Woche inkubiert. Die Bestimmung der M1-Spezifität erfolgte mittels Pentamer-Färbung sowie intrazellulärer IFN-γ-Analyse. Unabhängig von Art der Stimulation und Analysemethode konnten in beiden getesteten Patienten M1-spezifische T-Zellen detektiert werden. Bei Patient 3257 war die stimulatorische Kapazität von DCs und Daudi M1-SC-Zellen fast identisch. Im Fall von Spender 3427 konnten durch Daudi M1-SCZellen etwas mehr peptidspezifische Zellen generiert werden (Abb. 46). 119 % M1-spez. T-Zellen in CD8-pos. Population Ergebnisse 1,0 1 DCs+M1 Daudi M1-SC 0,8 0,8 0,6 0,6 DC 0,4 0,4 DM1-SC 0,2 0,2 00 IFN-γγ IFN-g M1Pentamer M1-Penta IFN-γγ IFN-g 3257 3257 M1Pentamer M1-Penta 3427 3427 Abb. 46: Vergleich von DCs mit aAPCs bei Tumorpatienten. Aus zwei Patienten mit gastrointestinalem Karzinom isolierte PBMCs wurden über eine Woche mit peptidbeladenen DCs (schwarz) bzw. Daudi M1-SC-Zellen (weiß) stimuliert. Die Bestimmung der M1-Spezifität erfolgte mittels intrazellulärer IFN-γ-Analyse bzw. Pentamer-Färbung. Dargestellt wird der Prozentanteil M1-spezifischer T-Zellen in der CD8+ Zellpoplulation nach Abzug der entsprechenden Negativkontrolle. Gate: Lymphozyten und lebende Zellen und im Fall des intrazellulären IFN-γ-Assays zusätzlich CD3+ Zellen. 4.9 Generierung tumorspezifischer T-Zellen aus Patienten mit hepatozellulärem Karzinom Neben Daudi M1-SC-Zellen wurden in dieser Arbeit ebenfalls aAPCs generiert, die das Tumorantigen AFP bzw. NY-ESO-1 an ihrer Oberfläche exprimieren (4.4.1). Sie wurden gemäß Protokoll zusammen mit PBMCs inkubiert, die aus HCC-Patienten isoliert wurden (3.1.5.3). Die Überprüfung der Spezifität generierter Zellen erfolgte nach ein- bis dreiwöchiger Inkubation mittels intrazellulärer IFN-γ-Analyse. Die Funktionalität von Daudi AFP-SC-Zellen wurde insgesamt an neun verschiedenen HCC-Patienten ausgetestet. Zwei Patienten zeigten nach einwöchiger Stimulation mit diesen aAPCs geringe Spezifität für AFP. So wiesen 0,9 % der CD3+CD8+ T-Zellen des Spenders 2462 Reaktivität gegenüber dem AFP-Peptid auf. Zellen desselben Spenders, 120 Ergebnisse die über eine Woche ohne Zusatz von Daudi AFP-SC-Zellen inkubiert wurden, zeigten nach sechsstündiger Stimulation mit AFP-Peptid-beladenen T2-Zellen eine vergleichsweise geringere Spezifität von 0,3 %. Im Fall von Spender 2483 waren 1,9 % der mittels Daudi AFP-SC-Zellen generierten CD3+CD8+ T-Zellen positiv für AFP. Bei der Negativkontrolle betrug dieser Wert 0,8 % (Abb. 47). IFN-γ 2462 2483 (-) T2 / AFP D AFP T2 / (-) 0.8% 0.3% D AFP T2 / AFP D AFP T2 / AFP 0.9% 1,9% CD8 Abb. 47: Generierung AFP-spezifischer Zellen mit Hilfe von Daudi AFP-SC-Zellen. Aus HCCPatient 2462 bzw. 2483 isolierte PBMCs wurden über eine Woche mit Daudi AFP-SC-Zellen inkubiert und anschließend auf AFP-Spezifität untersucht. Als Kontrolle wurden bei Patient 2462 unstimulierte Zellen verwendet, die im IFN-γ-Assay mit AFP-beladenen T2-Zellen stimuliert wurden (links oben). Bei Patient 2483 dienten als Kontrolle Zellen, die über eine Woche mit Daudi AFPSC-Zellen inkubiert und im Zytokin-Assay mit ungepulsten T2-Zellen stimuliert wurden (rechts oben). Die Zahlenwerte geben den Prozentanteil IFN-γ-sezernierender Zellen in der CD3+CD8+ TZellpopulation an. Gate: Lymphozyten, lebende Zellen, CD3+ T-Zellen. Zur Untersuchung von Daudi NY-ESO-SC-Zellen wurden sie mit PBMCs von vier HCCPatienten inkubiert. Nach einwöchiger Stimulation wies bei Patient 2537 ein Anteil von 0,8 % der CD3+CD8+ T-Zellen Spezifität gegenüber dem NY-ESO-1-Epitop auf. Die Negativkontrolle belief sich auf 0,4 %. Wurden die Zellen desselben Spenders über zwei weitere Wochen mit Daudi NY-ESO-Zellen inkubiert, erhöhte sich ihr Anteil abzüglich der Negativkontrolle auf 1,8 %. In beiden Fällen konnte eine unspezifische IFN-γ-Sekretion durch CD3+CD8- Zellen beobachtet werden. Zu beachten ist, dass bei dieser Analyse die sechs- 121 Ergebnisse stündige Stimulation im IFN-γ-Assay anstatt mit peptidbeladenen T2-Zellen mit Daudi M1SC- bzw. Daudi NY-ESO-SC-Zellen durchgeführt wurde (Abb. 48). IFN-γγ 1 Wo 3 Wo T2 / AFP D M1-SC 1,7% 0.4% D NY-ESO T2 / NY-ESO 0.8% 3,5% CD8 Abb. 48: Generierung NY-ESO-1-spezifischer T-Zellen mit Hilfe von Daudi NY-ESO-SCZellen. Aus HCC-Patient 2537 isolierte PBMCs wurden über eine Woche (links) bzw. drei Wochen (rechts) mit Daudi NY-ESO-SC-Zellen inkubiert und anschließend auf NY-ESO-1-Spezifität untersucht. Dies erfolgte mittels intrazellulärer IFN-γ-Analyse nach sechsstündiger Stimulation mit NYESO-1-gepulsten T2-Zellen (unten links) bzw. Daudi NY-ESO-SC-Zellen (unten rechts). Zur Kontrolle wurden die generierten Zellen entweder mit AFP-beladenen T2-Zellen (oben links) bzw. Daudi M1-SC-Zellen (oben rechts) inkubiert. Die Zahlenwerte geben den Prozentanteil IFN-γsezernierender Zellen in der CD3+CD8+ T-Zellpopulation an. Gate: Lymphozyten, lebende Zellen, CD3+ T-Zellen. 122 Diskussion 5 Diskussion 5.1 Herstellung von Peptid-SC-Konstrukten mittels 4-Step-PCR Für die Herstellung der in dieser Arbeit vorgestellten, zellbasierten aAPCs war es zunächst notwendig, verschiedene Peptid-SC-Konstrukte zu synthetisieren. Diese Konstrukte sollten das Modellpeptid Influenza M1 bzw. die tumorassozierten Antigene AFP oder NY-ESO-1 exprimieren. Durch die Durchführung einer einfachen 4-Step-PCR war es möglich, die kovalent an das β2m gebundenen Peptide auszutauschen. Die einzelnen Klonierungsschritte sowie deren Ergebnisse wurden beispielhaft anhand des AFP-SC pEGFP-Konstruktes dargestellt (4.1). Im ersten PCR-Schritt erfolgte die Amplifikation einer 100 bp großen DNA-Sequenz, die an ihrem 3´-Ende die Basenabfolge der ersten acht Aminosäuren des AFP-Peptids beinhaltete. Die zweite PCR diente der Vervollständigung des Peptidabschnittes. Die DNA wurde in diesem Schritt um 30 bp verlängert. Dies konnte nach elektrophoretischer Auftrennung auf einem Agarosegel verifiziert werden (Abb. 8A). Im nachfolgenden PCR-Schritt wurde die DNA-Sequenz des β2m-Moleküls vervielfältigt. Das Amplifikat wies eine erwartete Länge von 550 bp auf (Abb. 8B). Eine Verknüpfung der PCR-Produkte aus der zweiten und dritten PCR erfolgte mit Hilfe der letzten PCR. Hierdurch wurde ein 652 bp großer DNA-Abschnitt synthetisiert (Abb. 8C). Dieser setzte sich aus folgenden Abschnitten zusammen: β2m-Signal-Sequenz, AFP-Peptid und β2m. Das so amplifizierte PCR-Endprodukt wurde nach Restriktionsverdau in den Zwischenvektor M1SC pCDNA 3 kloniert. Trotz schwach erkennbarer Bande des 338 bp großen Inserts (Abb. 9B) war möglich, erfolgreich transformierte E. coli-Keime zu isolieren (Abb. 10). In einem nachfolgenden Schritt wurde eine 1 kb große, von den beiden Restriktionsschnittstellen Bgl II und Kpn I flankierte DNA-Region in den Endvektor HLA-A2 pEGFP-N3 ligiert (Abb. 11). Die Peptid-β2m-HLA-A2-Sequenz wurde hierdurch kovalent an das grünfluoreszierende Protein EGFP gekoppelt. Der korrekte Einbau des Inserts konnte mit Hilfe verschiedener Testverdaue (Abb. 12) sowie einer DNA-Sequenzierung bestätigt werden. Aufgrund der einfachen Durchführbarkeit können mit dieser Klonierungsstrategie PeptidSC-Konstrukte mit beliebigen MHC-Klasse-I-restringierten Epitopen synthetisiert werden. 123 Diskussion Neben AFP-SC pEGFP wurde in dieser Arbeit ebenfalls NY-ESO-SC pEGFP erfolgreich hergestellt. 5.2 Transfektion von MHC-Klasse-I-negativen Zellen mit Peptid-SC-Konstrukten Die hergestellten Peptid-SC-Konstrukte wurden in MHC-Klasse-I-negative Zellen eingebracht. Als Zellsystem wurde die Tumorzelllinie Daudi ausgewählt, die aus einem Jungen mit Burkitt´s Lymphom isoliert wurde. Daudi-Zellen sind maligne entartete BLymphoblasten, die einen Defekt im β2m-Gen aufweisen und dadurch nicht in der Lage sind, intrazellulär prozessierte Peptide über MHC-Klasse-I-Moleküle zu präsentieren. Aufgrund dieser Eigenschaft eignen sie sich besonders gut als aAPCs, da eine unspezifische Stimulation autoreaktiver CTLs durch endogene Proteine ausbleibt. Weiterhin exprimieren Daudi-Zellen an ihrer Oberfläche kostimulatorische Moleküle. So konnte die Expression von CD80 sowie CD86 mittels FCM-Analyse bestätigt werden (Abb. 16A). Eine Expression dieser Moleküle ist für die Induktion einer antigenspezifischen Immunantwort unerlässlich (GAGLIARDI et al., 1995; BRENTJENS et al., 2003; WALTER et al., 2003). CD83 war im naiven Zustand nur sehr schwach detektierbar. Durch Stimulation mit CD40Lexprimierenden NIH/3T3-Zellen, LPS sowie IL-4 war eine Expressionsmodulation dieser kostimulatorischen Moleküle auf der Oberfläche von Daudi-Zellen möglich (Abb. 16B-D). So erhöhte sich die Expression von CD80 und CD86 um das 2,5 bis 3-fache und von CD83 um das 10-fache, wobei eine alleinige Stimulation der Zellen mit CD40Lexprimierenden NIH/3T3-Zellen den gleichen Effekt auf die CD80-Expression hatte wie eine kombinierte Behandlung mit CD40L, LPS und / oder IL-4 (Abb. 17). Im Fall von CD83 und CD86 induzierte die Inkubation von Daudi-Zellen mit CD40L, LPS und IL-4 hingegen einen signifikanten Anstieg des Expressionsindex. Eine zusäztliche Addition von IL-4 schien einen größeren Effekt zu haben als die Zugabe von LPS zum Medium (Abb. 17). Ähnliche Ergebnisse wurden von HOOGENDOORN et al. (2004) beschrieben. Sie isolierten transformierte B-Zellen aus Patienten mit chronischer, lymphozytärer Leukämie und wandelten diese in effiziente APCs um, indem sie die Expression von kostimulatorischen Molekülen sowie von Adhäsionsmolekülen an ihrer Oberfläche induzierten. Dies erfolgte 124 Diskussion durch eine Stimulation mit CD40L und IL-4. Eine zusätzliche Addition von PAMPs führte zu keiner weiteren Erhöhung der Expression. SCHULTZE et al. (1997) und BERGWELTBAILDON et al. (2002) bewirkten eine Aktivierung von B-Zellen aus gesunden bzw. krebskranken Personen durch alleinige Inkubation dieser Zellen mit CD40L. Die hergestellten Peptid-SC-Konstrukte wurden mittels Elektroporation in Daudi-Zellen eingebracht und plasmidtragende Zellklone gezielt selektiert. Eine FCM-Analyse zeigte, dass über 90 % der mit dem M1-SC-, NY-ESO-SC- bzw. AFP-SC-Konstrukt transfizierten Zellen positiv für das grünfluoreszierende Protein EGFP und HLA-A2 waren (Abb. 18). Peptid-SC-Zellen konnten über mehrere Wochen in Kultur gehalten werden, ohne dass es zu einem Verlust der Expressionshöhe kam. K562 ist eine weitere Tumorzelllinie, die in dieser Arbeit erfolgreich mit dem M1-SC pEGFP-Konstrukt transfiziert wurde (Abb. 36). Aufgrund eines genetischen Defektes im Bereich des MHC-Lokus sind diese, zur Granulozytenserie gehörenden, hoch undifferenzierten Zellen nicht in der Lage, MHC-Klasse-I-Moleküle zu exprimieren. Ein anderes Fusionsmolekül, das in K562-Zellen eingebracht wurde, stellt das von TOMARU et al. (2003) publizierte, HLA-A2 pEGFP-N3-Konstrukt dar. Die Transfektion erfolgte, genau wie bei K562 M1-SC-Zellen, mittels Elektroporation. Die generierte Zellpopulation war zu einem hohen Prozentsatz positiv für GFP (Abb. 36). Die Idee, MHC-Klasse-I-negative K562-Zellen als aAPCs zu verwenden, wurde auch von THOMAS et al. (2002) aufgegriffen. Sie führten eine retrovirale Transfektion dieser Tumorzelllinie mit dem Fcγ-Rezeptor CD32 durch und konnten nach dessen Beladung mit Anti-CD3-Ig sowie Anti-CD28-Ig eine Amplifikation von CD4+ T-Lymphozyten erzielen. Zwar konnte auf K562-Zellen eine konstitutive Expression von nicht-klassischen, kostimulatorischen Molekülen beschrieben werden (THOMAS et al., 2002), allerdings bewirkte erst eine zusätzliche Transduktion dieser Zellen mit dem kostimulatorischen Molekül 41BBL eine Expansion zuvor aufgereinigter, antigenspezifischer CTLs (MAUS et al., 2002). 125 Diskussion 5.3 Generierung M1-spezifischer CTLs mit Hilfe der aAPCs und Prüfung verschiedener Kulturbedingungen Zur Austestung der Funktionalität der hergestellten Daudi M1-SC-Zellen wurden PBMCs gesunder, HLA-A2-positiver Spender verwendet. Daudi M1-SC-Zellen präsentieren das Modellpeptid M158-66 an ihrer Oberfläche. Hierbei handelt es sich um ein HLA-A2restringiertes Epitop des Influenza A-Matrixproteins. Die Influenza A-Virusinfektion weist eine hohe Prävalenz in der Bevölkerung auf. So können Serumantikörper sowie Gedächtniszellen in einer Vielzahl von Personen detektiert werden (DUNBAR et al., 1998; BOON et al., 2004). In HLA-A2-positiven Spendern richtet sich die zelluläre Immunität in erster Linie gegen das immundominante Epitop M1 (GOTCH et al., 1987; BOON et al., 2004). Aus diesem Grund wurde das M1-Peptid, genau wie in den Studien von MAUS et al. (2002) sowie LATOUCHE und SADELAIN (2000), zur Funktionalitätsprüfung der hergestellten, zellbasierten aAPCs herangezogen. Da in den nachfolgenden Untersuchungen nur PBMCs solcher Spender eingesetzt werden sollten, die eine hohe M1-Reaktivität aufwiesen, wurde zunächst der Prozentanteil M1spezifischer, CD8+ T-Zellen nach einwöchiger Inkubation mit dem M1-Peptid bestimmt. Mehr als die Hälfte aller getesteten Personen zeigte eine M1-spezifische Immunantwort (Abb. 19). Es kann davon ausgegangen werden, dass diese vor allem durch eine Aktivierung von T-Gedächtniszellen zustande gekommen ist, die im Rahmen einer vorangegangenen Infektion mit Influenza A-Viren gebildet wurden (LALVANI et al., 1997; BERGWELT-BAILDON et al., 2002). Dies konnte auch durch den relativ hohen Anteil M1reaktiver T-Zellen in den unstimulierten Kontrollansätzen bestätigt werden (0,45 ± 0,38 %). Um herauszufinden, ob Daudi M1-SC-Zellen überhaupt in der Lage sind, M1-spezifische CTLs aus PBMCs M1-reaktiver Spender zu generieren, wurden Letztere über einen Zeitraum von drei Wochen repetitiv mit den aAPCs stimuliert und die M1-Spezifität CD8+ TZellen mittels Pentamer-Färbung bzw. IFN-γ-Assay bestimmt. In allen drei getesteten Spendern konnten M1-reaktive CD8+ T-Zellen detektiert werden, wobei ihr Prozentanteil aufgrund individueller Schwankungen deutlich variierte (Abb. 20 und Abb. 21). Aus diesen ersten Ergebnissen konnte geschlossen werden, dass die eingesetzten Daudi M1-SCZellen das immundominante Epitop M1 an ihrer Oberfläche präsentierten und, trotz kovalenter Kopplung des Peptids an ein rekombinantes MHC-Klasse-I-Molekül, eine regelrech- 126 Diskussion te Aktivierung von antigenspezifischen CTLs induzierten. Auch die Fusion des Peptid-SCKonstruktes mit EGFP schien die Funktionalität dieser aAPCs nicht zu beeinträchtigen. In weiteren Versuchen wurde versucht, durch Optimierung der Kulturbedingungen eine Erhöhung der stimulatorischen Kapazität der generierten Daudi M1-SC-Zellen zu erreichen. Hierfür wurde zunächst das Verhältnis von PBMCs zu aAPCs variiert. Ein Verhältnis von 10:1 schien dabei den größten Effekt zu haben. Weder eine Erhöhung noch Erniedrigung der Anzahl an aAPCs induzierte einen weiteren Anstieg M1-spezifischer CD3+CD8+ T-Zellen in der Kultur (Abb. 22). Die Ursache hierfür könnte darin liegen, dass für die Aktivierung von T-Zellen eine bestimmte Dichte an MHC-Klasse-I-Molekülen und somit auch an APCs notwendig ist. Eine zu hohe Dichte könnte hingegen, z.B. aufgrund kompetitiver Hemmung oder direkter negativer Beeinflussung der T-Zellen, zu einer abgeschwächten Induktion einer Immunantwort führen. Die Addition von TCGF zur T-Zellkultur wurde von verschiedenen Autoren beschrieben (MACKENSEN et al., 1994; OELKE et al., 2000; OELKE et al., 2005b). Durch Förderung der Proliferation scheint dieser Wachstumsfaktor einen positiven Einfluss auf die Generierung und Expansion antigenspezifischer Effektorzellen in vitro zu haben. In dieser Arbeit erfolgte die Synthese von TCGF aus dem Überstand mitogenaktivierter Leukozyten. Das hergestellte Medium wurde auf Funktionalität getestet, indem sein Einfluss auf die Proliferation von PHA-Blasten untersucht und mit einem TCGF-Standard verglichen wurde. Die Ergebnisse zeigen eindeutig, dass TCGF die Expansion dieser Zellen förderte (Abb. 15). Verglichen mit dem Standard wies das neu hergestellte TCGF etwas geringere Aktivität auf. Dies lässt sich auf kulturbedingte Variationen bei der Herstellung zurückführen. Dass der Wachstumsfaktor ebenfalls einen positiven Einfluss auf CTLs ausübt, konnte in weiteren Versuchen bestätigt werden. So induzierte die Addition höherer Konzentrationen an TCGF eine stärkere Proliferation und somit auch Expansion peptidspezifischer T-Zellen. NOLTE et al. (2003) verwendeten in ihren Studien einen kommerziell erhältlichen TZellwachstumsfaktor, den sie in einer Konzentration von 20 % zur T-Zellkultur gaben. Zwar konnten sie einen signifikanten Anstieg der absoluten Zellzahl beobachten, gleichzeitig stellten sie aber auch fest, dass TCGF in höheren Konzentrationen zu einer Expansion unspezifischer Effektorzellen und somit zu einer Verdrängung von in der Kultur befindlichen, antigenspezifischen CTLs beitragen kann. 127 Diskussion Es wurde bereits beschrieben, dass Daudi-Zellen die klassischen kostimulatorischen Moleküle auf ihrer Oberfläche tragen und dass deren Expression durch eine spezifische Aktivierung modulierbar ist. Aufgrund der großen Bedeutung dieser Moleküle für die Induktion einer Immunantwort in vivo als so genanntes Signal 2 wurde untersucht, ob mit CD40L, LPS und IL-4 stimulierte Daudi M1-SC-Zellen, im Vergleich zu naiven aAPCs, bessere antigenpräsentierende Eigenschaften aufweisen. Aus PBMCs, die über drei Wochen mit aktivierten Daudi M1-SC-Zellen stimuliert wurden, konnte eine signifikant höhere Anzahl M1-spezifischer CD3+CD8+ CTLs generiert werden als aus PBMCs desselben Spenders, bei denen naive Daudi M1-SC-Zellen zum Einsatz kamen. Dieses Ergebnis wird durch Untersuchungen von HOOGENDOORN et al. (2004) bestätigt, in denen aus B-Zell-Lymphomen isolierte Tumorzellen in der Lage waren, nach Hochregulierung ihrer kostimulatorischen Moleküle, tumorreaktive CTLs in vitro zu generieren. Naive Tumorzellen wiesen diese Fähigkeit hingegen nicht auf. Ähnliche Ergebnisse erzielte die gleiche Gruppe an einem anderen Krankheitsmodell (HOOGENDOORN et al., 2005). In Veröffentlichungen von BERGWELT-BAILDON et al. (2002) wurde bewiesen, dass CD40L-aktivierte B-Zellen aus gesunden sowie krebskranken Personen in der Lage sind, antigenspezifische CTLs sowohl aus dem naiven als auch aus dem Gedächtnis-TZellpool zu stimulieren. MAUS et al. (2002) sowie LATOUCHE und SADELAIN (2000) demonstrierten in ihren Studien die Bedeutsamkeit kostimulatorischer Moleküle auf der Oberfläche zellbasierter aAPCs für die in vitro-Generierung zytotoxischer T-Zellen. Aufgrund der Ergebnisse der Vorexperimente erfolgte die Stimulation antigenspezifischer Effektor-T-Zellen in nachfolgenden Versuchen nach einem einheitlichen Schema: Das PBMC:aAPC-Verhältnis wurde bei 10:1 belassen, zusätzlich zu IL-2 erfolgte eine Addition von 10 % TCGF und Daudi Peptid-SC-Zellen wurden vor ihrer Verwendung mit CD40L, LPS und IL-4 aktiviert (Abb. 24). Zur genaueren Bestimmung der M1-Spezifität wurde in verschiedenen Assays neben CD8+ eine Detektion CD3+ T-Zellen durchgeführt. Hierdurch sollte eine durch NK-Zellen induzierte, falsch positive Immunantwort ausgeschlossen werden. Die aAPCs wurden mit PBMCs verschiedener Spender inkubiert. Abb. 25 und Abb. 26 verdeutlichen beispielhaft die Ergebnisse der Spender 1798, 1907 und 3050. Im Vergleich zur unstimulierten Kontrolle kam es in allen drei Fällen zu einer deutlichen Anreicherung 128 Diskussion M1-spezifischer CTLs in der gemischten Kultur. So belief sich der Proliferationsindex nach dreiwöchiger Stimulation bei Spender 1798 und 1907 auf 2300 bzw. 3500. Im Fall von Spender 3050 konnte sogar eine über 30000-fache Expansion beobachtet werden. Zellen des Spenders 1798 wurden zur Langzeitstimulation in Kultur gehalten. Es konnte ein steter Anstieg antigenspezifischer CD3+CD8+ T-Zellen detektiert werden. Nach siebenwöchiger Kultur hatten sich die Effektorzellen um das 90000-fache vermehrt. Somit wiesen Daudi M1-SC-Zellen eine hohe stimulatorische Kapazität auf. Diese war mit den Ergebnissen verschiedener anderer Autoren vergleichbar, die anstelle von PBMCs, aufgereinigte CD8+ T-Zellen in der Startkultur einsetzten. So erzielten OELKE et al. (2000) durch Verwendung von peptidbeladenen MoDCs und anschließende, unspezifische Stimulation eine 600-fache Expansion antigenspezifischer CTLs nach fünfwöchiger Kultur. Mit Hilfe von HLA-Ig-beladenen Beads konnten Mart-1-spezifische CD8+ T-Zellen in weniger als zwei Monaten um den Faktor 1000 vermehrt werden (OELKE et al., 2003). Eine 1500-fache Expansion EBV-spezifischer CTLs wurde nach 16-wöchiger Stimulation mit EBVtransformierten B-Zellen beschrieben (ROSKROW et al., 1998). PAPANICOLAOU et al. (2003) konnten mit ihren aAPCs nach einmaliger Stimulation eine 300- bis 600-fache Amplifikation CMV-spezifischer T-Zellen erzielen. Vergleicht man die Ergebnisse aus Abb. 20 und Abb. 26A, wird noch einmal deutlich, dass durch Optimierung der Kulturbedingungen eine verbesserte Generierung M1-spezifischer T-Zellen erzielt werden konnte. In beiden Fällen wurden PBMCs des Spenders 1907 mit Daudi M1-SC-Zellen stimuliert. In der initialen Studie waren nach drei Wochen rund 20 % der Zellen positiv für CD8 und das M1-Pentamer (Abb. 20). In einem späteren Experiment lag dieser Wert bei 44 % (Abb. 26A). Kulturbedingte Schwankungen können als Ursache hierfür allerdings nicht vollständig ausgeschlossen werden. 5.4 Überprüfung der Funktionalität generierter Effektorzellen in vitro Für einen erfolgreichen adoptiven T-Zelltransfer müssen die ex vivo stimulierten und expandierten Effektor-T-Zellen bestimmte Grundeigenschaften aufweisen. So spielt neben ihrer Quantität auch ihre Qualität bzgl. Spezifität, Avidität, Funktionalität und Überlebens- 129 Diskussion fähigkeit in vivo eine entscheidende Rolle. Zur Untersuchung dieser Eigenschaften wurden zahlreiche immunologische Methoden entwickelt (2.5). So kann die Avidität von CTLs beispielsweise mit Hilfe von MHC-Multimeren nachgewiesen werden. Zur Überprüfung der Funktionalität eignen sich Verfahren zum Nachweis intra- oder extrazellulärer Zytokine. Weiterhin können hierfür verschiedene Proliferations- oder auch Zytotoxizitäts-Assays zur Anwendung kommen. Dass Daudi M1-SC-Zellen die Fähigkeit besitzen, CD8+ T-Zellen zu generieren, die in der Lage sind, das M1-Peptid auf MHC-Pentameren zu binden, wurde bereits erläutert. Nach spezifischem Antigenkontakt konnte zudem eine Sekretion von IFN-γ durch die expandierten Effektorzellen nachgewiesen werden (5.3). Ein weiteres Zytokin, das nach Bindung einer T-Zelle an ihren Liganden synthetisiert wird, ist GM-CSF. Der Nachweis dieses Faktors im Zellkulturüberstand erfolgte mittels Sandwich-ELISA. Über 17 Tage stimulierte TZellen wiesen eine im Vergleich zur Negativkontrolle deutlich höhere Sekretion von GMCSF auf, unabhängig davon, ob Daudi M1-SC-Zellen oder autologe PBMCs als APCs eingesetzt wurden (Abb. 27). Für den Thymidin-Assay (Abb. 28) wurden neben peptidbeladenen T2-Zellen ebenfalls naive bzw. transfizierte Daudi-Zellen als Targetzellen eingesetzt. Bei den Effektorzellen handelte es sich um eine gemischte Zellpopulation des Spenders 1798, die aus einer fünfwöchigen in vitro-Stimulation mit Daudi M1-SC-Zellen hervorgegangen war. Der Anteil M1-spezifischer CD3+CD8+ T-Zellen in der Gesamtkultur belief sich auf rund 6 %. Von den CD8+ T-Zellen wies ca. ein Drittel M1-Spezifität auf. Die generierten, peptidspezifischen Zellen waren in der Lage, nach Erkennung des M1-Peptids spezifisch zu expandieren. Dies war deutlich in dem Ansatz erkennbar, in dem M1-beladene T2-Zellen als Targetzellen fungierten. Nach alleiniger Inkubation mit naiven T2-Zellen kam es zu einer signifikant schwächeren Proliferation der Zellen, die sich kaum von der Negativkontrolle abhob. Wurde das Epitop auf der Oberfläche von Daudi M1-SC-Zellen präsentiert, kam es ebenfalls zu einer starken Expansion. Allerdings induzierten auch naive Daudi-Zellen eine Vermehrung der Effektorzellen. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass sich in der gemischten Zellkultur neben den M1-spezifischen CTLs ebenfalls Zellen befanden, die durch Erkennung bestimmter Zelloberflächenmoleküle auf den Targetzellen aktiviert wurden. Eine genaue Eingrenzung der Zellpopulation ist mittels Thymidin-Assay nicht möglich, da es sich 130 Diskussion hierbei um eine rein quantitative Methode handelt. Demzufolge könnten im Prinzip alle in der Kultur befindlichen Zellen an der unspezifischen Reaktion beteiligt gewesen sein. Dies sind sowohl die Targetzellen selbst als auch Zellen des adaptiven und / oder unspezifischen Immunsystems. Da die Daudi-Targetzellen vor ihrer Verwendung mit 80 Gy bestrahlt wurden, kann ihr Einfluss auf die Zellproliferation ausgeschlossen werden. In Frage kommende Zellen des adaptiven Immunsystems sind CD8+ T-Zellen, die Spezifität gegenüber einem anderen Epitop als M1 aufwiesen. Allerdings müsste ihnen dieses über MHCKlasse-I-Moleküle präsentiert werden, wozu β2m-defiziente Daudi-Zellen jedoch nicht in der Lage sind. Im Gegensatz zu MHC-Klasse-I exprimieren diese, von einem B-ZellLymphom abstammenden Tumorzellen jedoch MHC-Klasse-II-Moleküle an ihrer Oberfläche (KAUR et al., 1993). Dies könnte zu einer Generierung antigenspezifischer CD4+ TZellen während der in vitro-Kultur mit Daudi M1-SC-Zellen geführt haben. Da über MHCKlasse-II-Moleküle nur exogene Antigene exprimiert werden, könnte demzufolge eine Spezifität gegenüber sich in der Kultur befindlichen Fremdantigenen, wie z.B. allogenen Serumproteinen oder Zellfragmenten abgestorbener Tumorzellen, ausgebildet worden sein. Zellen des angeborenen Immunsystems, die häufig an unspezifischen Immunreaktionen beteiligt sind, stellen NK-Zellen dar. Aufgrund der fehlenden Expression von MHC-KlasseI-Molekülen auf Daudi-Zellen, könnten diese Zellen durchaus zur beobachteten, unspezifischen Proliferation beigetragen haben. Ob es allerdings während der in vitro-Kultur bereits zu einem Auswachsen dieser Zellart gekommen ist, muss in Frage gestellt werden, da für die Generierung antigenspezifischer T-Zellen Daudi M1-SC-Zellen eingesetzt wurden. Diese Zellen tragen aufgrund der Transfektion mit einem Peptid-SC-Konstrukt funktionelle MHC-Klasse-I-Moleküle auf ihrer Oberfläche. Eventuell weicht aber die Dichte dieser Liganden auf den künstlichen APCs von der auf natürlichen Zellen ab, woraus eine verminderte Inhibition von NK-Zellen resultieren könnte. γ:δ T-Zellen könnten ebenfalls an der unspezifischen Proliferation beteiligt gewesen sein. Dies kann aus der Tatsache geschlossen werden, dass eine Inkubation von PBMCs mit naiven Daudi-Zellen zu einer deutlichen Expansion von Vγ9:Vδ2 T-Zellen in der Zellkultur führt (FISCH et al., 1990; STURM et al., 1990; MALKOVSKA et al., 1992; KAUR et al., 1993). Die Ursache hierfür konnte auf eine Expression bestimmter Hitzeschockproteine 131 Diskussion auf der Oberfläche von Daudi-Zellen zurückgeführt werden, die von dem TCR der Vγ9:Vδ2 T-Zellen MHC-unabhäbhig erkannt werden (FISCH et al., 1990; KAUR et al., 1993). Alternativ zum Thymidin-Assay wurde ebenfalls ein CFSE-Assay durchgeführt (Abb. 29). Aufgrund der Möglichkeit, CFSE-positive Zellen mit spezifischen Ak zu färben und mittels FCM zu analysieren, können mit dieser Methode bestimmte Zellpopulationen gezielt auf Proliferation untersucht werden. Der Versuch wurde mit fünf bzw. acht Wochen stimulierten Zellen durchgeführt. Genau wie im Thymidin-Assay, waren die in der Kultur befindlichen, antigenspezifischen CTLs in der Lage, nach Peptidkontakt spezifisch zu proliferieren. Hierbei spielte es keine Rolle, ob das M1-Epitop über MHC-Klasse-I-Moleküle an der Oberfläche von T2-Zellen oder über rekombinante M1-SC-Konstrukte durch transfizierte Daudi- oder K562-Zellen präsentiert wurde. Naive T2-Zellen wurden nicht erkannt. Hingegen konnte eine recht deutliche Zellproliferation nach Inkubation mit naiven bzw. AFP-SCtransfizierten Daudi-Zellen detektiert werden. Da in die Analyse nur CD3+CD8+ T-Zellen einbezogen wurden, können sowohl NK- als auch CD4+ T-Zellen als Verursacher dieser Hintergrundproliferation ausgeschlossen werden. Demzufolge liegt die Vermutung nahe, dass es sich hierbei um γ:δ T-Zellen handelte. Zwar exprimieren diese CD3+ T-Zellen i.d.R. kein CD8, allerdings konnte in den Arbeiten von ZHENG et al. (2001a) nach dreiwöchiger Kultur von PBMCs mit einer Myelomzelllinie eine Vγ9:Vδ2 T-Zellpopulation generiert werden, die zu einem Anteil von 20 % positiv für CD8 war. Eine Beteiligung von CD8+ Effektor-T-Zellen mit unerwünschter Spezifität sollte ebenfalls in Betracht gezogen werden. Neben der Proliferation ist auch die Zytotoxizität ein wichtiger Parameter, um die Funktionalität generierter CTLs zu überprüfen. Der Zytotoxizitäts-Assay wurde mit peptidbeladenen T2-Zellen durchgeführt, die mit verschiedenen Effektorzellkonzentrationen inkubiert wurden (Abb. 30). Sogar bei einem E:T-Verhältnis von 3:1 wurden noch über 70 % der Targetzellen lysiert, obwohl der Anteil an M1-reaktiven CTLs in diesem Experiment nur 6 % der gemischten Zellpopulation ausmachte. Somit wiesen diese Zellen eine deutliche lytische Aktivität auf. Trotz nachgewiesener Signifikanz muss auf die relativ hohe, unspezifische Lyse CMV-beladener T2-Zellen hingewiesen werden. Diese war am stärksten bei höheren E:T-Verhältnissen ausgeprägt. OELKE et al. (2000) konnten nach ein- und zweiwöchiger Stimulation von aufgereinigten CD8+ T-Zellen mit M1-beladenen DCs eine vergleichbar hohe, unspezifische Lyse gegen- 132 Diskussion über unbeladenen T2-Zellen beobachten. Diese führten sie auf in der Kultur vorhandene, „unspezifische“ CD8+ T-Zellen zurück. Weiterhin kann nicht ausgeschlossen werden, dass ein Teil der T2-Zellen von durch Daudi M1-SC-Zellen stimulierte γ:δ T-Zellen lysiert wurde, da diese Zellen zytotoxische Reaktivität gegenüber einer Vielzahl von Tumorzellen aufweisen (KAUR et al., 1993; ZHENG et al., 2001a). Eine Beteiligung von NK-Zellen ist hingegen unwahrscheinlich, da T2-Zellen nach Peptidbeladung MHC-Klasse-I-Moleküle an ihrer Oberfläche exprimieren. Die Avidität generierter CTLs wird maßgeblich von der Dichte an Petid-MHC-Molekülen auf der Oberfläche antigenpräsentierender Zellen beeinflusst (WALTER et al., 2003). So wurde gezeigt, dass APCs mit supraphysiologischer Konzentration an Peptid-MHCMolekülen zur Entstehung von T-Zellen mit geringerer Affinität beitragen können (ALEXANDER-MILLER et al., 1996). Da die Anzahl an MHC-Klasse-I-Konstrukten auf den synthetisierten Peptid-SC-Zellen nicht bekannt ist, wurde im nachfolgenden 51 Cr release assay neben der Zytotoxizität die Avidität M1-spezifischer T-Lymphozyten bestimmt (Abb. 31). Die Ergebnisse zeigen eindeutig, dass die Effektorzellen M1-beladene Targetzellen konzentrationsabhängig lysierten. Erst unterhalb einer M1-Konzentration von 1 nmol / l konnte ein Abfall der Zytotoxizität festgestellt werden. Wurden die Targetzellen mit weniger als 100 pmol / l beladen, fiel die Lyse auf den Basalwert ab. Dies war sowohl bei drei Wochen als auch bei sieben Wochen mit Daudi M1-SC inkubierten Zellen desselben Spenders der Fall. Obwohl Letztere im parallel durchgeführten IFN-γ-Assay höhere Funktionalität in Form von Zytokinsekretion aufwiesen (75 % versus 20 %), konnte dies im Zytotoxizitäts-Assay nicht bestätigt werden. So war die effektive Zytotoxizität in beiden Fällen vergleichbar. Eine ähnliche, konzentrationsabhängige Lyse konnte auch von BEDNAREK et al. (1991) nach dreiwöchiger Stimulation von T-Zellen mit M1-beladenen, autologen PBMCs gezeigt werden. In den Studien von WALTER et al. (2003) lysierten hochaffine CTLs Targetzellen bereits ab Peptidkonzentrationen im pmol / l-Bereich und wiesen demnach eine etwas höhere Affinität als die in dieser Arbeit expandierten CTLs auf. Um die Funktionalität der mit den aAPCs generierten CD8+ T-Zellen in weiteren Versuchen zu bestätigen, wurde überprüft, ob sie ebenfalls in der Lage sind, das M1-Peptid nach natürlicher Prozessierung auf allogenen Tumorzellen zu erkennen. Dies ist bedeutsam, da in einigen Studien festgestellt werden konnte, dass mit DCs expandierte CTLs 133 Diskussion zwar Reaktivität gegenüber Targetzellen aufwiesen, die exogen mit dem spezifischen Antigen beladen wurden, allerdings nicht gegenüber solchen Zellen, die das Peptid nach endogener Prozessierung an ihrer Oberfläche präsentierten (OELKE und SCHNECK, 2004). Die Unfähigkeit generierter CTLs, endogene Peptide zu erkennen, wurde auf ihre geringe Affinität gegenüber dem Antigen zurückgeführt (YEE et al., 1999; WALTER et al., 2003). Zur Untersuchung der in dieser Studie expandierten CTLs wurde ein 290 bp großer DNAAbschnitt des Influenza Matrix-Proteins nach Amplifikation in den Expressionsvektor pEFGP-N3 kloniert (Abb. 13). Ein Kontrollverdau mit den Enzymen Bam HI und Hind III bestätigte den korrekten Einbau des Inserts (Abb. 14). Nachfolgend wurde die HLA-A2positive Tumorzelllinie NW-38-Mel mit dem Influenza M1 pEGFP-Konstrukt transfiziert. Aufgrund der Fusion mit EGFP konnten erfolgreich transfizierte Zellen mittels FCM und Fluoreszenzmikroskopie verifiziert werden (Abb. 32A). Eine Expression des M1-Peptids über MHC-Klasse-I-Moleküle wurde in verschiedenen funktionellen Assays bestätigt. Daraus wurde geschlossen, dass das Epitop nach endogener Prozessierung an HLA-A2Moleküle gebunden wurde. Eine Freisetzung des intrazellulär synthetisierten M1-Peptids durch lysierte Zellen mit anschließender exogener Anlagerung an MHC-Klasse-I-Moleküle wurde aufgrund der Ergebnisse von BEDNAREK et al. (1991) ausgeschlossen. Sie testeten die Funktionalität M1-spezifischer CTLs, indem sie ein für das Epitop M158-66 kodierendes Minigen mittels Expressionsvektor in Zielzellen einbrachten. Durch verschiedene Untersuchungen konnten sie sicherstellen, dass das M1-Peptid ausschließlich nach intrazellulärer Prozessierung an der Zelloberfläche exprimiert wurde. Die in dieser Arbeit generierten NW-38-Mel M1-Zellen wurden in einem intrazellulären IFN-γ-Assay, einem GM-CSF-ELISA sowie einem Zytotoxizitäts-Assay zusammen mit Effektorzellen inkubiert, die aus der Stimulation von PBMCs mit Daudi M1-SC-Zellen hervorgegangen waren. Die detektierte IFN-γ-Sekretion war hochspezifisch (Abb. 33). GM-CSF konnte nur im Überstand jener Effektorzellen nachgewiesen werden, die mit M1 pEGFPtransfizierten NW-38-Mel kultiviert wurden. Als Vergleich erfolgte in diesem Assay zusätzlich eine Bestimmung der Aktivität generierter T-Zellen gegenüber exogen beladenen T2sowie transfizierten HlxPxt M1-SC-Zellen. Letztere exprimierten das M1-SC pEGFPKonstrukt an ihrer Oberfläche (Abb. 32B). In beiden Ansätzen konnte eine spezifische Zytokinsekretion gemessen werden. Dass NW-38-Mel M1-Zellen eine vergleichsweise gerin- 134 Diskussion gere GM-CSF-Sekretion induzierten, kann evtl. dadurch erklärt werden, dass neben den M1-beladenen HLA-A2-Molekülen auch andere Peptid-MHC-Klasse-I-Moleküle auf ihrer Zelloberfläche exprimiert werden. Hierdurch ist die Dichte an M1-präsentierenden MHC Klasse-I-Molekülen reduziert und es kommt zu einer schwächeren Stimulation M1spezifischer CTLs. T2-Zellen weisen aufgrund eines Defektes im TAP-Transportersystem hingegen nur M1-beladene MHC-Klasse-I-Moleküle an ihrer Oberfläche auf. Bei HlxPxtZellen könnte eine hohe Dichte an M1-SC-Konstrukten für die im Vergleich zu NW-38-MelZellen höhere Aktivität verantwortlich gewesen sein. Im Zytotoxizitäts-Assay konnte eine peptidspezifische Lyse von NW-38-Mel-Zellen festgestellt werden, die bei allen drei E:T-Verhältnissen signifikant war. Aus der Tatsache, dass sich in dem gemischten Zellpool auch andere Effektorzellen als M1-spezifische T-Zellen befanden, lässt sich der hohe, unspezifische Hintergrund erklären (Abb. 35). 5.5 Vergleich von Daudi Peptid-SC-Zellen mit klassischen DCs und transfizierten K562-Zellen Autologe DCs bilden den derzeitigen „Goldstandard“ für die in vitro-Generierung peptidspezifischer CTLs. Aus diesem Grund wurde die Effektivität der hergestellten aAPCs im Folgenden mit der von MoDCs verglichen. Neben der Funktionalität von Daudi M1-SCZellen wurde ebenfalls die stimulatorische Kapazität transfizierter K562-Zellen in die Analyse miteinbezogen. K652 M1-SC-Zellen präsentieren das rekombinante Peptid-SCKonstrukt an ihrer Oberfläche. K562 HLA-A2-Zellen wurden hingegen mit dem von TOMARU et al. (2003) etablierten HLA-A2 pEGFP-N3-Konstrukt transfiziert und mussten, genau wie die MoDCs, vor ihrer Verwendung mit dem M1-Peptid beladen werden. Das Ergebnis einer FCM-Analyse der hergestellten aAPCs zeigt, dass Daudi M1-SC-Zellen einen etwas höheren GFP-Expressionsindex und somit evtl. eine größere Dichte an MHCKlasse-I-Molekülen auf ihrer Oberfläche aufwiesen als K562 M1-SC- bzw. K562 HLA-A2Zellen (Abb. 36). Eine eindeutige Abgrenzung zur Negativkontrolle war allerdings in allen drei Zellsystemen möglich. 135 Diskussion Für die Vergleichsstudien wurden PBMCs sechs verschiedener, HLA-A2-positiver Spender verwendet. Eine Bestimmung der absoluten Zellzahl führte zu dem Ergebnis, dass Daudi M1-SC-Zellen die größte Potenz aufwiesen, Zellen zur Proliferation anzuregen. So hob sich der Faktor der Zellvermehrung in diesem System signifikant von dem Proliferationsfaktor ab, der durch MoDCs bzw. transfizierte K562-Zellen erzielt wurde (Abb. 37). Die Anzahl M1-spezifischer CD3+CD8+ T-Zellen in der generierten Zellpopulation wurde nach zweiwöchiger Inkubation mittels Pentamer-Färbung bestimmt. Es stellte sich heraus, dass diese im Mittel bei den mit MoDCs stimulierten T-Zellen tendenziell am größten war (Abb. 38). Die Tatsache, dass die aAPCs, trotz hoher absoluter Zellzahl, eine vergleichsweise geringere Anzahl peptidspezifischer CTLs hervorbrachten, lässt auf eine Expansion unspezifischer Zellen in der Kultur schließen. Diese Hypothese konnte durch die Ergebnisse der FCM-Oberflächenanalyse bestätigt werden. So war der prozentuale Anteil CD3+CD8+ T-Zellen bei Daudi M1-SC-Zellen vergleichbar mit dem der naiven Zellpopulation. Hingegen konnte mit autologen MoDCs, K562 M1-SC- sowie K562 HLA-A2-Zellen ein Anstieg dieses Phänotyps in der gemischten Kultur erreicht werden (Abb. 40). Dieses Resultat weist darauf hin, dass Daudi M1-SC-Zellen zwar in der Lage waren, M1-spezifische CTLs zu generieren, allerdings waren sie hierbei nicht so effizient. Das Auswachsen CD8+ T-Zellen wurde scheinbar durch die Proliferation von einer oder mehreren anderen Zellarten beeinflusst. Von der Präsenz solcher Zellen wurde bereits aufgrund des häufig beobachteten, unspezifischen Hintergrundes in den verschiedenen funktionellen Assays ausgegangen (5.4). Prozentual gesehen konnte kein Anstieg der CD3+CD4+ T-Zellen in der Kultur detektiert werden. Im Gegenteil, im Vergleich zu naiven PBMCs reduzierte sich deren Anzahl sowohl bei den autologen DCs als auch bei den aAPCs signifikant (Abb. 39). Somit scheinen Daudi M1-SC-Zellen, trotz MHC-Klasse-II-Expression, keine Expansion dieser Zellart hervorgerufen zu haben. Anders verhält es sich mit den γ:δ T-Zellen. Wie bereits beschrieben, sind Daudi-Zellen aufgrund spezifischer Oberflächenmoleküle in der Lage, diesen Zelltyp in der in vitro-Kultur zu stimulieren, was eindeutig bestätigt werden konnte. Zwar kam es im Mittel in allen vier Ansätzen zu einer tendenziellen Erhöhung der γ:δ T-Zellen, allerdings war diese bei den Daudi M1-SC-Zellen signifikant (Abb. 41). KAUR et al. (1993) testeten nach einwöchiger Stimulation von PBMCs mit naiven Daudi-Zellen ebenfalls den Phänotyp 136 Diskussion generierter Zellen und konnten einen vergleichbaren Anstieg von Vγ9:Vδ2 T-Zellen in der Kultur detektieren. Parallel hierzu kam es zu einer Reduktion CD4+ sowie CD8+ T-Zellen, was mit einer Verdrängung durch Vγ9:Vδ2 T-Zellen begründet wurde. Hieraus lässt sich schließen, dass die Fähigkeit der Daudi-Zellen, γ:δ T-Zellen in vitro zu expandieren, trotz Transfektion mit einem humanen MHC-Klasse-I-Molekül, nicht aufgehoben wurde. Dies steht im Widerspruch zu Daten von ROTHENFUSSER et al. (2002), die die proliferative sowie zytotoxische Kapazität dieser Zellen gegenüber Vγ9:Vδ2 TZellen durch das Einbringen von MHC-Klasse-I-Komplexen inhibieren konnten. Allerdings war hierfür eine korrekte Konformation dieser Moleküle notwendig, wovon bei dem rekombinanten Peptid-SC-Molekül nicht unbedingt ausgegangen werden kann. Ein leichter Anstieg von NKT-Zellen konnte ebenfalls in allen Bedingungen detektiert werden. Der Prozentanteil an NK-Zellen erhöhte sich hauptsächlich bei den transfizierten K562-Zellen, evtl. aufgrund einer geringeren Dichte an MHC-Klasse-I-Molekülen auf ihrer Oberfläche. Eine vergleichende funktionelle Analyse von mit autologen PBMCs, Daudi M1-SC- oder K562-M1-SC-Zellen generierten T-Zellen erfolgte mittels Zytokin-Assay. Nach einwöchiger Inkubation kam es in allen drei Ansätzen zu einem signifikanten Anstieg IFN-γsezernierender CD8+ T-Zellen in der gemischten Kultur (Abb. 42). Unabhängig von der Art der Antigenpräsentation konnten somit M1-spezifische T-Zellen mit vergleichbarer Funktionalität expandiert werden. Demzufolge war es möglich, sowohl mit autologen DCs als auch mit den künstlichen APCs Daudi M1-SC-, K562 M1-SC- und K562 HLA-A2-Zellen M1-spezifische T-Zellen zu generieren. Ein deutlicher Unterschied in der stimulatorischen Kapazität von K562 M1-SC- und K562 HLA-A2-Zellen war nicht vorhanden. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass die rekombinanten MHC-Fusionskonstrukte in ihrer Funktionalität mit klassischen, peptidbeladenen MHC-Klasse-I-Molekülen vergleichbar sind. Eine solche exogene Peptidbeladung erfolgt bei der Verwendung autologer DCs für die T-Zellgenerierung und wurde auch von Autoren beschrieben, die aAPCs zur Expansion antigenspezifischer T-Zellen einsetzten. So inkubierten beispielsweise OELKE et al. (2003) an Beads gekoppelte MHC-Ig-Dimere mit verschiedenen, tumorassoziierten Antigenen. Der Nachteil der exogenen Beladung besteht darin, dass eine Abdissoziation des Peptids von seinem MHC-Molekül nicht ausgeschlos- 137 Diskussion sen werden kann. So konnte gezeigt werden, dass, z.B. im Fall der dimeren MHCMoleküle, nur eine geringe Fraktion mit dem jeweils gewünschten Peptid beladen wird (GRETEN et al., 2002). Hierdurch könnten Peptide mit geringer Affinität nicht effizient genug gebunden werden, was die Generierung, speziell von tumorantigenspezifsichen CTLs, beeinträchtigen könnte. Alternativ hierzu haben WALTER et al. (2003) in ihren Untersuchungen nachgewiesen, dass an synthetische Partikel gekoppelte, rekombinante MHC-Peptid-Komplexe in Kombination mit Anti-CD28 in der Lage waren, eine gezielte Expansion antigenspezifischer TZellen mit hoher Affinität hervorzurufen. In der hier vorgestellten Arbeit wurde durch Verwendung rekombinanter Peptid-SC-Konstrukte eine feste Bindung des Epitopes an das MHC-Klasse-I-Molekül sichergestellt. Verglichen mit Daudi M1-SC-Zellen konnte mit transfizierten K562-Zellen keine LangzeitExpansion von CD8+ T-Zellen erreicht werden (Daten nicht gezeigt). Ähnliches wurde von MAUS et al. (2002) sowie YAN et al. (2004) beschrieben. Sie stellten fest, dass eine Transfektion der K562-Zelllinie mit 4-1BBL für eine mehrwöchige Proliferation humaner bzw. muriner Effektor-T-Zellen erforderlich ist. 5.6 Überprüfung der Funktionalität generierter Effektorzellen in vivo Wichtig für eine erfolgreiche adoptive Immuntherapie ist die in vivo-Persistenz transferierter Effektor-T-Zellen. Diese hängt im großen Maße von der Art ihrer Generierung in vitro sowie der Art ihrer Administration ab (YEE, 2005). Obwohl bereits zahlreiche Studien über die Generierung von antigenspezifischen CTLs mit Hilfe von aAPCs in vitro vorliegen, wurden Untersuchungen an in vivo-Modellen bislang nur unzureichend durchgeführt. Die Bedeutsamkeit solcher Analysen wurde jedoch von ROSENBERG et al. (2003) hervorgehoben, die feststellten, dass eine hohe Avidität generierter CTLs in vitro nicht unbedingt mit einer hohen Funktionalität dieser Zellen in vivo korreliert. Dieses Paradoxon wurde auch von anderen Autoren beschrieben. So zeigten GATTINONI et al. (2005), dass hochdifferenzierte T-Zellen, trotz hoher antitumoröser Wirksamkeit in vitro, einen in Mäusen wachsenden Tumor nicht eliminieren konnten. Als Ursache hierfür nannten sie eine Herun- 138 Diskussion terregulierung kostimulatorischer Moleküle, ausbleibendes homing der CTLs, ihre Unfähigkeit, IL-2 zu sezernieren, sowie einen Übergang dieser Zellen in einen proapoptotischen Zustand durch hohe Teilungsraten während der in vitro-Kultur (GATTINONI et al., 2005). Effektorzellen, die sich in einem frühen Entwicklungsstadium befinden, scheinen hingegen ein größeres Potential für eine in vivo-Persistenz zu haben (YEE, 2005). In dieser Arbeit erfolgte die Analyse der in vivo-Funktionalität generierter Effektorzellen in NOD-scid-Mäusen nach Induktion eines M1-exprimierenden Tumors. Aufgrund einer schweren Defizienz des angeborenen und erworbenen Immunsystems kommt es in diesen Tieren zu keiner Abstoßung der xenogenen Tumorzelllinie. Die applizierten Effektorzellen stammten aus der Stimulation von PBMCs des Spenders 3050 mit Daudi M1-SC-Zellen. 13 % der in der gemischten Zellkultur befindlichen Zellen wiesen M1-Spezifität auf (Tabelle 10). Im Vergleich zu den beiden Kontrollansätzen bewirkten diese Effektorzellen nach einmaliger Injektion eine leichte Regression des Tumorwachstums. Ein Auswachsen des Tumors konnte allerdings nicht verhindert werden (Abb. 43). Somit wiesen die generierten CTLs, trotz nachweislicher Funktionalität in vitro, nur eingeschränkte Wirksamkeit in vivo auf. Die Ursachen hierfür können vielfältiger Natur sein. Zunächst könnte eine einmalige Injektion von 1 x 107 Zellen nicht ausreichend für eine Tumor-eliminierende Therapie gewesen sein. So wird in Mausmodellen eine Frequenz antigenspezifischer T-Zellen von 1-10 % der CD8+ T-Zellen vorgeschlagen (YEE, 2005). KIRCHER et al. (2003) empfehlen zudem repetitive Infusionen von CTLs, um eine dauerhafte Tumorregression in Mausmodellen zu erzielen. In den Arbeiten von WESTWOOD et al. (2005) wurde beispielsweise eine Regression s.c. injizierter Eierstockstumoren in NOD-scid-Mäusen durch mehrmalige Injektion genetisch modifizierter T-Zellen hervorgerufen. Ein weiterer Grund für die in dieser Arbeit nur schwachen Reaktivität generierter CTLs in vivo könnte ebenfalls in einer fehlenden Koadministration von IL-2 gelegen haben. Eine solche Ursache wurde auch bei Untersuchungen von MITCHELL et al. (2002) in Betracht gezogen, die nach Injektion einer polyklonalen Zellpopulation in ihrem in vivo-Modell ebenfalls nur bedingte Therapieerfolge erzielten. Allerdings scheinen unphysiologische Konzentrationen an IL-2 ebenso eine verminderte proliferative Kapazität von CTLs in vivo zur Folge haben zu können (YEE, 2005). Entsprechend der Ergebnisse von MOROZ et al. (2004) hätte evtl. auch eine Behandlung der tumortragenden Mäuse mit IL-21 zu einer er- 139 Diskussion höhten, klonalen Expansion antigenspezifischer CTLs und hierdurch zu einer erfolgreicheren adoptiven Immuntherapie führen können. Eine weitere Möglichkeit für die beobachtete, schwache Regression könnte in einer suboptimalen Stimulation der Effektorzellen in vitro gelegen haben. So wird unter anderem eine inadäquate Kostimulation als Ursache für eine fehlende Persistenz transferierter T-Zellen im peripheren Blut des Wirtes in Betracht gezogen (YEE, 2005). Die in dieser Arbeit verwendeten Daudi M1-SC-Zellen wiesen hingegen eine hohe Expression kostimulatorischer Moleküle auf ihrer Oberfläche auf. Anstelle von IL-2 wird für die in vitro-Generierung zytotoxischer T-Zellen von einigen Autoren die Verwendung von IL-15 empfohlen (BRENTJENS et al., 2003). Die durch dieses Zytokin expandierten, tumorreaktiven CD8+ T-Zellen konnten einen etablierten Tumor deutlich besser attackieren (KLEBANOFF et al., 2005a). Als weiteres Zytokin scheint IL-7 durch Förderung der Langzeitkultur tumorreaktiver CTLs in vitro deren immuntherapeutische Effizienz in vivo zu fördern (LYNCH und MILLER, 1994). Da die injizierten Effektorzellen einer mehrwöchigen Kultur mit Daudi M1-SC-Zellen unterzogen wurden, könnten sie sich zum Zeitpunkt ihrer Applikation bereits am Ende ihrer Lebensspanne befunden haben. Dies würde ihre Expansion in vivo stark einschränken. Ein Faktor, der als sehr bedeutend für den Erfolg einer adoptive Immuntherapie angesehen wird (GATTINONI et al., 2005). Zur Steigerung der Effektivität transferierter, antigenspezifischer CTLs wird von einigen Autoren auch eine Lymphodepletion des Wirtes vor der Immuntherapie als sinnvoll erachtet (KLEBANOFF et al., 2005b; WANG et al., 2005). Die Verwendung einer gemischten Zellkultur ist ein weiteres Kriterium, das das Ergebnis des durchgeführten Experimentes beeinflusst haben könnte. So wird von vielen Autoren eine Applikation aufgereinigter CD8+ T-Zellen bevorzugt. Hierauf wurde in dem vorgestellten in vivo-Experiment verzichtet, da durch Verwendung einer Mischkultur eine positive Beeinflussung durch zusätzlich vorhandene Zellpopulationen erhofft wurde. Neben CD8+ T-Zellen, von denen knapp über 50 % spezifisch für M1 waren, wurden ebenfalls γ:δ TZellen und zu einem geringeren Prozentsatz auch CD4+ T-Zellen sowie NKT-Zellen detektiert (Tabelle 1). γ:δ T-Zellen können zu Abwehrreaktionen gegenüber tumorösen Erkrankungen beitragen (KAUR et al., 1993; WILHELM et al., 2003) und wurden auch schon erfolgreich für einen adoptiven Transfer im Mausmodell eingesetzt (MALKOVSKA et al., 140 Diskussion 1992; ZHENG et al., 2001b). Ein positiver Einfluss dieser Zellen auf die Beseitigung des M1-exprimierenden NW-38-Mel-Tumors konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. Das gleiche gilt für die ebenfalls in der generierten Zellpopulation vorhandenen CD4+ T-Zellen, obwohl ihnen als Helferzellen eine wichtige Rolle bei Immunreaktionen gegenüber Tumoren zugesprochen wird (HUNG et al., 1998). Außerdem scheinen sie die in vivo-Persistenz transfizierter CD8+ T-Zellen fördern zu können (WALTER et al., 1995; DUDLEY et al., 2002). Der Verlust des Antigens auf Tumorzellen stellt einen wichtigen Tumor-escapeMechanismus dar (THURNER et al., 1999; YEE et al., 2000). Um dieses Phänomen als Ursache für die schwache Regression des Tumors auszuschließen, wurden die NW-38Mel M1-Tumorzellen am Ende des Versuches auf GFP-Expression untersucht (Abb. 44). Zwar war diese im Vergleich zu in vitro-kultivierten Tumorzellen reduziert, was auf das Vorhandensein anderer Zellen im Tumorstroma zurückzuführen ist, ein vollständiger Verlust konnte jedoch nicht festgestellt werden. Um neben der GFP-Expression eine auch weiterhin bestehende Präsentation des M1-Peptids über MHC-Klasse-I-Moleküle sicherzustellen, hätten allerdings weitere funktionelle Assays durchgeführt werden müssen. 5.7 Generierung antigenspezifischer CD8+ T-Zellen aus Tumorpatienten Es hat sich herausgestellt, dass eine Expansion antigenspezifischer Effektor-T-Zellen aus Krebspatienten mit Hilfe von autologen DCs nur eingeschränkt möglich ist. Dies liegt daran, dass die Funktionalität von professionellen APCs und / oder Lymphozyten einerseits aufgrund der Krebserkrankung selbst und andererseits aufgrund einer Behandlung der Patienten mit Chemotherapeutika eingeschränkt ist (GABRILOVICH, 2004; MACARY et al., 2006; ORMANDY et al., 2006). So beschrieben beispielsweise ROSKROW et al. (1998) eine deutlich reduzierte Expansionsrate EBV-spezifischer T-Zellen aus PBMCs krebskranker Personen im Vergleich zu gesunden Spendern. Ausgehend hiervon wurden die hergestellten aAPCs auf ihre Fähigkeit überprüft, M1-spezifische T-Zellen aus PBMCs immunsupprimierter Patienten mit fortgeschrittenem, gastrointestinalen Karzinom zu generieren. 141 Diskussion Nach einwöchiger Inkubation mit Daudi M1-SC-Zellen konnten in der generierten Zellpopulation aller fünf getesteten Patienten M1-spezifische, CD8+ T-Zellen detektiert werden, wobei zwischen den Spendern deutliche Unterschiede bestanden (Abb. 45). Erwartungsgemäß lag der Prozentanteil M1-spezifischer T-Zellen im Mittel unterhalb des Wertes, der bei gesunden Spendern durch Stimulation mit M1-beladenen, autologen PBMCs gemessen werden konnte (0,99 % versus 4,9 %). Daudi M1-SC-Zellen wiesen eine mit autologen DCs vergleichbare, wenn nicht sogar bessere, stimulatorische Kapazität auf. Dies konnte anhand zweier Krebspatienten nachgewiesen werden. Die generierten Effektorzellen zeigten ebenfalls Funktionalität in Form von IFN-γ-Sekretion (Abb. 46). Somit waren die Peptid-SC-Zellen in der Lage, M1-reaktive CTLs aus PBMCs schwer erkrankter, unter palliativer Chemotherapie stehender Spender zu generieren. In den vorangegangenen Experimenten wurde gezeigt, dass die hergestellten aAPCs die Fähigkeit aufweisen, M1-spezifische Gedächtniszellen aus PBMCs gesunder sowie krebskranker, immunsupprimierter Spender effektiv zu stimulieren. Für eine erfolgreiche TumorImmuntherapie ist es allerdings wünschenswert, malignomreaktive Effektorzellen aus dem T-Zellrepertoire zur Expansion anzuregen. Dies hat sich in den vergangenen Jahren jedoch als große Herausforderung dargestellt, was zum einen auf eine sehr geringe Anzahl an tumorspezifischen Vorläuferzellen zurückzuführen ist. Diese Zellen werden durch die in der Ontogenese stattfindende, klonalen Deletion aus dem T-Zellpool entfernt. Zum anderen überleben im Rahmen der negativen Selektion zumeist nur solche T-Zellen, die eine geringe Affinität gegenüber dem Selbst-Antigen aufweisen (YEE et al., 1999). Da die potentiell tumorreaktiven T-Zellen häufig aus dem Gedächtnis-T-Zellpool abstammen, weisen sie zudem eine eingeschränkte, replikative Kapazität auf. Hieraus resultiert eine schwere Stimulierbarkeit in vitro und somit eine eingeschränkte Langzeit-Expansion dieser Zellen (VERRA et al., 2004). Um eine für den klinischen Einsatz ausreichende Anzahl malignomreaktiver Lymphozyten mit hoher Spezifität, Affinität sowie Funktionalität zu generieren, müssen die verwendeten APCs eine hohe stimulatorische Kapazität aufweisen. Zudem müssen optimale in vitro-Bedingungen geschaffen werden. In dieser Arbeit wurde versucht, tumorantigenspezifische T-Zellen aus Patienten mit hepatozellulärem Karzinom zu generieren. Dazu wurden aAPCs synthetisiert, die die tumorassoziierten Antigene AFP bzw. NY-ESO-1 an ihrer Oberfläche exprimieren. 142 Diskussion AFP wird zur Gruppe der onkofetalen Proteine gerechnet (2.6.1). Seine Expression konnte in 80 % aller HCC-Patienten nachgewiesen werden (BUTTERFIELD et al., 2003). Bislang wurden vier immundominante, HLA-A2-restringierte Epitope identifiziert, mit denen AFPspezifische T-Zellen aus PBMCs gesunder Spender stimuliert werden konnten (BUTTERFIELD et al., 1999; BUTTERFIELD et al., 2001). Dies gibt einen Hinweis darauf, dass, trotz hoher Plasmalevel während der Embryogenese, keine vollständige klonale Deletion potentiell AFP-spezifischer T-Zellen aus dem T-Zellpool stattfindet (BUTTERFIELD et al., 2003). VOLLMER et al. (1999) gelang es, durch DNA-Vakzinierung eine AFPspezifische Immunantwort in Mäusen zu induzieren. NY-ESO-1 ist ein Tumor / Testis-Antigen (2.6.1), das von 30 % aller HCC-Tumoren exprimiert wird (CHEN et al., 2001). In einer signifikanten Anzahl von HCC-Patienten konnte sowohl eine zelluläre als auch humurale, NY-ESO-1-spezifische Immunantwort detektiert werden (KORANGY et al., 2004). Durch einwöchige in vitro-Stimulation mit autologen, peptidbeladenen PBMCs gelang es der gleichen Gruppe, NY-ESO-1-reaktive, CD8+ TZellen aus fünf von sechs NY-ESO-1-serumpositiven HCC-Patienten zu generieren. Die synthetisierten aAPCs wurden in dieser Arbeit mit PBMCs verschiedener HCCPatienten inkubiert, wobei deren AFP- bzw. NY-ESO-1-Serumlevel nicht bekannt war. Nach einwöchiger Stimulation solcher PBMCs mit Daudi AFP-SC-Zellen konnte in zwei von neun getesteten HCC-Patienten eine AFP-spezifische T-Zellantwort hervorgerufen werden. Die generierten CD3+CD8+ T-Zellen wiesen die Fähigkeit auf, nach Antigenkontakt spezifisch IFN-γ zu sezernieren. Eine solche, tumorantigenspezifische Immunreaktion konnte ebenfalls in einem von vier getesteten Krebspatienten durch einwöchige Inkubation mit Daudi NY-ESO-SC-Zellen nachgewiesen werden. Der Anteil NY-ESO-reaktiver CTLs erhöhte sich deutlich, wenn die Zellen über weitere zwei Wochen mit denselben aAPCs stimuliert wurden. Die hohe IFN-γ-Sekretion CD3+CD8- T-Zellen in diesem Experiment ist auf die Verwendung von Daudi Peptid-SC-Zellen als Targets im intrazellulären ZytokinAssay zurückzuführen. Sie lässt sich durch eine unspezifische Stimulierung von in der gemischten Kultur befindlichen Effektorzellen durch Daudi M1-SC- bzw. Daudi AFP-SCZellen erklären. Aus diesen Ergebnissen lässt sich schließen, dass die hergestellten aAPCs in der Lage waren, eine Aktivierung und Expansion von AFP- bzw. NY-ESO-1-spezifischen T-Zellen 143 Diskussion zu induzieren. Allerdings konnte lediglich in einem geringen Anteil der getesteten Personen eine schwache, antigenspezifische Immunantwort induziert werden. Eine Erklärung hierfür könnte sein, dass nicht alle Patienten Reaktivität gegenüber den tumorassoziierten Antigenen AFP und NY-ESO-1 aufweisen. So konnte eine Expression dieser tumorassoziierten Antigene nur in 80 % bzw. 30 % aller HCC-Patienten nachgewiesen werden. In NYESO-1-serumnegativen Krebspatienten sowie gesunden Spendern konnte hingegen keine antigenspezifische Immunantwort detektiert werden (KORANGY et al., 2004). Eine andere Möglichkeit besteht darin, dass die gestesteten Patienten entweder eine zu weit fortgeschrittene Tumorerkrankung aufwiesen oder, bei serumpositiven Patienten, eine NY-ESO-1-spezifische Immunantwort gegen ein anderes Eptitop ausgebildet hatten (KORANGY et al., 2004). Da für eine adäquate Stimulierung von CTLs mit geringer Affinität hochpotente APCs benötigt werden, könnte der Grund für den relativ geringen Prozentanteil an tumorspezifischen T-Zellen nach Inkubation mit Daudi Peptid-SC-Zellen ebenfalls in einer zu geringen stimulatorischen Kapazität dieser aAPCs gelegen haben. Allerdings muss in diesem Zusammenhanghang berücksichtigt werden, dass eine Expansion tumorreaktiver T-Zellen aus den oben genannten Gründen sehr schwierig ist, und bislang keinerlei Veröffentlichungen über eine für den adoptiven Transfer ausreichende Aktivierung und Expansion AFP- bzw. NY-ESO-1-spezifischer CTLs aus HCC-Patienten vorliegen. 5.8 Relevanz der erhobenen Daten für die Tiermedizin In der hier vorgestellten Arbeit wurde über die Herstellung künstlicher antigenpräsentierender Zellen für die adoptive Immuntherapie von Krebserkrankungen des Menschen berichtet. Hierfür wurden MHC-Klasse-I-negative Zellen humanen Ursprungs mit einem Peptid-SC-Konstrukt transfiziert, um eine gezielte und effektive Expansion antigenspezifischer T-Zellen in vitro zu erzielen. Die Verwendung künstlicher antigenpräsentierender Zellen stellt eine Möglichkeit dar, funktionelle CTLs für den zukünftigen Einsatz in der Krebstherapie zu generieren. 144 Diskussion Aufgrund der Tatsache, dassTumorerkrankungen auch beim Haustier einen hohen Stellenwert einnehmen und bei Hund und Katze mittlerweile zu den häufigsten Todesursachen gerechnet werden, wird die Tumorimmunologie sicherlich auch im Bereich der Veterinärmedizin zur Entwicklung zukünftiger Therapieansätze beitragen können. So wurde die Wirksamkeit verschiedener immuntherapeutischer Verfahren bereits in einigen Studien an Hund, Katze, Pferd und Rind getestestet. Die Ergebnisse waren z.T. viel versprechend (2.6.2.3). Der Einsatz der in dieser Dissertation beschriebenen Peptid-SC-aAPCs ist grundsätzlich auch beim Tier möglich. Neben dem extrem hohen finanziellen Aufwand ist allerdings zu berücksichtigen, dass für die Herstellung funktioneller aAPCs zunächst bestimmte Grundvoraussetzungen geschaffen werden müssten. Der erste Schritt wäre die Konstruktion eines Peptid-β2-Mikroglobulin-MHC-Fusionskonstruktes. Dies ist prinzipiell möglich und wurde nicht nur für den Menschen, sondern auch für die Maus bereits erfolgreich durchgeführt (GAMREKELASHVILI et al., 2007). In diesem Zusammenhang muss allerdings erwähnt werden, dass das MHC-System der Haustiere im Vergleich zu dem des Menschen und der Maus bislang nicht vollständig definiert ist. Eine genaue Kenntnis des jeweiligen MHCKlasse-I-Haplotyps ist jedoch erforderlich, da nur MHC-kompatible Peptide in der Lage sind, tumorspezifische T-Zellen des entsprechenden Patienten in vitro zu stimulieren. Weiterhin müssten tumorassoziierte Antigene für die jeweilige Tierart identifiziert werden. Diese könnten dann, gekoppelt an ein MHC-SC-Konstrukt, in MHC-Klasse-I-negative Zellen transfiziert und in einem nachfolgenden Schritt zur Expansion peptidspezifischer CTLs verwendet werden. Optimale in vitro-Bedingungen müssten hierfür für jede Tierart geschaffen werden. 145 Zusammenfassung 6 Zusammenfassung Sonja Obermann, geb. Zieseniß (2007): Herstellung artifizieller antigenpräsentierender Zellen zur adoptiven Immuntherapie bei Tumorpatienten. Die adoptive T-Zelltherapie stellt einen viel versprechenden Ansatz dar, bisher unheilbare Krankheiten zu behandeln. Sie beinhaltet die Selektion und Expansion von Effektorzellen in vitro sowie deren Transfer zurück in den Patienten. Ziel dieser Therapieform ist es, eine antigenspezifische Immunantwort in vivo zu initiieren bzw. zu verstärken. Grundvoraussetzung für einen erfolgreichen, adoptiven T-Zelltransfer stellt die Generierung einer optimalen Lymphozytenpopulation dar. Der derzeitige „Goldstandard“ für die Expansion antigenspezifischer, zytotoxischer T-Zellen (CTLs) beinhaltet den Einsatz autologer MoDCs (dendritische Zellen, die aus Monozyten des Patienten generiert werden). Da diese Methode zahlreiche, limitierende Faktoren, wie z.B. aufwendige und kostenintensive Herstellung sowie hohe Variationen aufweist, wurden neue Strategien zur Generierung hochaffiner, antigenspezifischer T-Zellen entwickelt. Künstliche antigenpräsentierende Zellen (aAPCs) haben sich in diesem Zusammenhang als mögliche Alternative herausgestellt. In dieser Arbeit wird über die Entwicklung zellbasierter aAPCs berichtet, die das Peptid-β2Mikroglobulin-MHC-Fusionskonstrukt (Peptid-SC) an ihrer Oberfläche präsentieren. Hierbei handelt es sich um ein rekombinantes MHC-Klasse-I-Molekül, bei dem sowohl das β2Mikroglobulin als auch das jeweilige Peptid kovalent mit der schweren α-Kette des HLAA2-Moleküls verbunden sind. Die Durchführung einer einfachen Klonierungsstrategie ermöglichte die Synthese verschiedener Peptid-SC-Konstrukte, die erfolgreich in MHCKlasse-I-negative Tumorzelllinien transfiziert werden konnten. Hierdurch sollte eine Expression endogen prozessierter Peptide und somit eine Generierung alloreaktiver CTLs verhindert werden. Als Zellsystem wurden Daudi-Zellen ausgewählt. Neben einer MHCKlasse-I-Defizienz weisen sie klassische, kostimulatorische Moleküle auf ihrer Oberfläche auf. Durch Aktivierung mit CD40-Ligand, Lipopolysaccharid und Interleukin (IL)-4 konnte dessen Expressionshöhe moduliert werden. Zusätzlich wurden MHC-Klasse-I-negative 147 Zusammenfassung K562-Zellen in einige Studien miteinbezogen. Es wurden Peptid-SC-aAPCs hergestellt, die entweder das Modellpeptid Influenza M158-66 (M1-SC) oder die tumorassoziierten Antigene AFP542-550 (AFP-SC) bzw. NY-ESO-1495-503 (NY-ESO-SC) an ihrer Oberfläche exprimierten. Diese aAPCs wurden dazu verwendet, antigenspezifische CTLs aus mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) zu generieren. Anschließend erfolgte die Überprüfung der T-Effektorzellen auf Spezifität, Funktionalität und Avidität in vitro und in vivo. Die stimulatorische Kapazität der aAPCs wurde zudem mit der autologer MoDCs verglichen. Mit Hilfe von M1-SC-transfizierten Daudi-Zellen (Daudi M1-SC) war es möglich, innerhalb kurzer Zeit eine hohe Anzahl hochaffiner, M1-spezifischer T-Zellen aus PBMCs gesunder sowie krebskranker, immunsupprimierter Personen zu generieren. Diese CTLs waren in der Lage, das M1-Peptid an der Oberfläche von Targetzellen zu erkennen, unabhängig davon, ob es exogen an MHC-Klasse-I-Moleküle gebunden, intrazellulär prozessiert oder über rekombinante Peptid-SC-Konstrukte präsentiert wurde. Sie wiesen zudem Funktionalität in Form von Proliferation, Zytokinsekretion und Zytotoxizität auf. Die stimulatorische Kapazität der Daudi M1-SC-Zellen war mit der von autologen MoDCs vergleichbar. Daudi M1-SC-Zellen wiesen den Vorteil auf, dass sie die in Kultur befindlichen Zellen über einen sehr langen Zeitraum stimulieren und expandieren konnten. Allerdings konnte auch gezeigt werden, dass neben den M1-spezifischen T-Zellen ebenfalls andere Effektorzellen in der gemischten Zellpopulation vorhanden waren. Diese führten in verschiedenen funktionellen Testverfahren zu unspezifischen Reaktionen. Zusätzlich reduzierten sie die Effizienz der Daudi M1-SC-Zellen, antigenspezifische CD8+ T-Zellen in vitro zu expandieren. Basierend auf der Tatsache, dass Daudi-Zellen durch Expression bestimmter Hitzeschockproteine γ:δ T-Zellen zur Proliferation anregen können, wurden diese Zellen als mögliche Kandidaten in Betracht gezogen. Diese Vermutung konnte mittels durchflusszytometrischer Analysen bestätigt werden. Eine in vivo-Funktionalität M1-spezifischer CTLs, die mit Hilfe von Daudi M1-SC-Zellen stimuliert wurden, konnte nur eingeschränkt nachgewiesen werden. Transfizierte K562-Zellen waren ebenfalls in der Lage, M1-spezifische Effektor-T-Zellen ex vivo zu stimulieren. Eine Langzeitexpansion war allerdings nicht erfolgreich, was vermutlich auf das Fehlen klassischer, kostimulatorischer Moleküle zurückzuführen ist. 148 Zusammenfassung Die Generierung AFP- bzw. NY-ESO-1-reaktiver CTLs aus PBMCs von Patienten mit hepatozellulärem Karzinom mit Hilfe von Daudi Peptid-SC-Zellen wurde anhand zweier Beispiele gezeigt. Allerdings wies nur ein sehr geringer Prozentsatz Spezifität gegenüber dem entsprechenden, tumorassoziierten Antigen auf. Die Avidität und Funktionalität dieser Zellen wurde nicht überprüft und sollte in weiteren Analysen erfolgen. Außerdem sollte versucht werden, durch Optimierung der Kulturbedingungen, wie zum Beispiel einer Aufreinigung CD8+ T-Zellen vor ihrem Einsatz, Zugabe von IL-7 und IL-15 zur Zellkultur und Einführung zusätzlicher, kostimulatorischer Moleküle, die Effizienz der generierten aAPCs noch weiter zu erhöhen. 149 Zusammenfassung 7 Summary Sonja Obermann, geb. Zieseniß (2007): Artificial antigen-presenting cells for the adoptive immunotherapy in cancer. The adoptive immunotherapy represents a promising approach for the treatment of recently incurable diseases. It includes the selection and expansion of effector cells in vitro as well as their infusion back into the patient. The aim of this therapy is the induction and / or enhancement of an antigen-specific immune response in vivo. Successful immunotherapy depends on the generation of an optimal lymphocyte population. The current “gold standard” to expand antigen-specific cytotoxic T cells (CTLs) entails generating autologous monocyte-derived dendritic cells (MoDCs) out of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The use of MoDCs is limited by a lot of factors like complexity, expenses and variations. Therefore, new strategies were developed to generate antigen-specific T cells with high affinity. In this context, artificial antigen-presenting cells (aAPCs) turned out to be a possible alternative. This thesis deals with the development of a new cell-based aAPC, carrying a peptide-β2microglobulin-MHC fusion construct (peptide-SC) on the surface. This peptide-SC construct represents a recombinant MHC class I molecule in which the β2-microglobulin as well as the peptide of interest are covalently coupled to the α-chain of HLA-A2. Performing a defined and reproducible cloning strategy enabled the synthesis of different peptide-SC constructs, which could be successfully transfected into MHC class I-negative tumor cell lines. By this strategy the expression of endogenously processed peptides and therefore the generation of alloreactive CTLs should be inhibited. Daudi cells were chosen as cell system. Beside their MHC class I-deficiency they express costimulatory molecules on their surface. This expression could be modulated by stimulation with CD40 ligand, lipopolysaccharide and interleukin (IL)-4. Additionally, transfected MHC class I-negative K562 cells were included in some studies. In this report, peptide-SC aAPCs presenting the model antigen M158-66 (M1-SC) or the tumour associated antigens AFP542-550 (AFP-SC) and NY-ESO-1495-503 (NY-ESO-SC) were constructed, respectively. They were used to generate antigen-specific CTLs out of 150 Zusammenfassung PBMCs. Expanded T effector cells were checked for their specifity, functionality and avidity in vitro as well as in vivo. The stimulatory capacity of the constructed aAPCs was also compared with that of autologous MoDCs. M1-SC-transfected Daudi cells (Daudi M1-SC) enabled the rapid generation of high numbers M1-specific T cells out of PBMCs from healthy persons as wells as immunocompromised cancer patients. These effector cells showed high affinity and were able to recognize the M1 peptide on the surface of target cells, regardless whether it was loaded exogenously onto MHC class I molecules, intracellulary processed or presented by recombinant peptide-SC constructs. Besides, they displayed functionality in terms of proliferation, cytokine secretion and cytotoxicity. The stimulatory capacity of Daudi M1-SC cells was comparable to autologous MoDCs. The advantage of Daudi M1-SC-Zellen was their ability to stimulate and expand cultured cells over a longer time period. However, beside M1-specific T cells other cell populations could be detected in the mixed cell culture. They induced unspecific reactions in different functional assays. Additionally, they reduced the efficiency of Daudi M1-SC to expand antigen-specific CD8+ T cells in vitro. Daudi cells are able to induce the proliferation of γ:δ T cells by expressing distinct heat shock proteins on their surface. Based on this fact γ:δ T cells were considered as possible candidates. This supposition could be proven by flow cytometric analysis. M1-specific CTLs which were generated by Daudi M1-SC cells showed only limited functionality in vivo. Next to Daudi M1-SC cells transfected K562 cells were also able to stimulate M1-specific effector cells ex vivo. However a long-term expansion was not successful, perhaps because of missing costimulatory molecules on their surface. The generation of AFP- and NY-ESO-reactive CTLs out of patients with hepatocellular carcinoma could be shown in two cases but the percentage of tumour-reactive effector T cells was relative low. The avidity and functionality of these cells was not checked and should be performed in following experiments. Additionally, it should be attempted to further increase the efficiency of the generated aAPCs by optimizing the culture conditions like stimulation of isolated CD8+ T cells, addition of IL-7 and / or IL-15 to the cell culture and introduction of different costimulatory molecules. 151 Literaturverzeichnis 8 Literaturverzeichnis AEBERSOLD, P., C. HYATT, S. JOHNSON, K. HINES, L. KORCAK, M. SANDERS, M. LOTZE, S. TOPALIAN, J. YANG, und S. A. 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GRETEN (2005): Generation of artificial antigen-presenting cells for the adoptive immunotherapy in cancer Joint Annual Meeting of the German and Scandinavian Societies of Immunology, Kiel Immunbiology 210: 470:J38 ZIESENISS S., J. GAMREKELASHVILI, S. PETRYKOWSKA, T. HILLEMANN, F. KORANGY, M.P. MANNS und T.F. GRETEN (2005): Generation of artificial antigen-presenting cells for the adoptive immunotherapy in cancer Gemeinsame Tagung der Deutschen, Österreichischen und Schweizerischen Gesellschaften für Hämatologie und Onkologie, Hannover Onkologie 28 (suppl): 204:P631 Mündliche Vorträge: ZIESENISS S. und T.F. Greten (13.02.2006): Artificial Antigen Presenting Cells for Adoptive Immunotherapy in Cancer. Colloquium of the Department of Gastroenterology, Hepatology and Endocrinology¸ Hannover Medical School 181 Anhang 9.2 Danksagung An dieser Stelle möchte ich mich bei all denjenigen bedanken, die mich in den letzten Jahren auf vielfältige Weise unterstützt und so die Entstehung dieser Arbeit erst möglich gemacht haben. Mein besonderer Dank gilt Prof. Dr. Tim Greten und Dr. Firouzeh Korangy für die Überlassung des interesanten Themas, die stetige Unterstützung bei dessen Weiterentwicklung, die finanzielle Organisation sowie die freundliche Aufnahme in ihre Arbeitsgruppe. Herrn Prof. Dr. M. P. Manns danke ich für die Bereitstellung des Arbeitsplatzes im Forschungszentrum Oststadt der Medizinischen Hochschule Hannover. Herrn Prof. Dr. Hans-Joachim Schuberth danke ich ganz herzlich für seine hilfreichen Tipps und Ratschläge, die mir besonders in den Anfangsphasen der Promotion sowie beim Zusammenschreiben geholfen haben. Vielen Dank für die Durchsicht dieser Arbeit und die konstruktiven Anmerkungen. Recht herzlich gedankt sei allen Personen, die ihr Blut für diese Arbeit zur Verfügung gestellt haben. Allen derzeitigen und ehemaligen Mitarbeitern der Arbeitsgruppe Greten, der Arbeitsgruppe Ott sowie allen anderen Personen, die mir in den letzten drei Jahren im Forschungszentrum Oststadt über den Weg gelaufen sind, möchte ich für die schöne Zeit und all die netten Gespräche danken. Mein ganz besonderer Dank gilt hierbei Susanne, Lars, Annette, Christine und vor allem Tina, die mir mit ihren Hilfen und aufmunternden Worte zu Beginn meiner Arbeit und z.T. auch noch später zur Seite standen. Jaba möchte ich ganz besonders für seine vielen theoretischen Ratschläge sowie für nötige Kritik danken. Seine „I have a question“-Fragen in den Labmeetings werde ich sicher vermissen. Sylvana, Bastian, Annika und Lydia danke ich für die nette Atmosphäre, gerade in den letzten Monaten. Vielen Dank für die tägliche, vitamin- und schokoladenreiche Versorgung (Amélie lässt grüßen!) und für all die lebenswichtigen Weisheiten (ich sage nur Colanüsse!). Ich vermute, dass mein Auto euch (vor allem Bastian) vermissen wird. Sylvana danke ich zudem für das Lesen der Arbeit und all ihre Korrekturvorschläge. Gut, dass es die Bahn gibt! Ben, Fei, Ulf-Eike und Anke danke ich für all ihre Unterstützung sowie für wunderschöne, lustige und unvergessliche Stunden, die wir im Rahmen der Arbeit und vor allem auch privat miteinander erleben durften. Das größte Dankeschön gebührt jedoch meiner Familie, die stets an mich geglaubt und mich mit lieben Worten und Taten aufgemuntert hat. Meinem lieben Mann Arne danke ich dafür, dass er immer für mich da war und jederzeit ein offenes Ohr für all meine Probleme hatte. Zu guter Letzt danke ich Amélie dafür, dass sie mir Kraft gegeben hat. Danke 182 Anhang 9.3 Eidesstattliche Erklärung nach § 3 Abs. 2 Nr. 7 PromO Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation „Herstellung artifizieller antigenpräsentierender Zellen zur adoptiven Immuntherapie bei Tumorpatienten“ selbstständig verfasst habe. Bei der Anfertigung wurden folgende Hilfen Dritter in Anspruch genommen: 1. Materialien und Geräte wurden von der Abteilung für Gastroenterologie, Hepatologie und Endokrinologie der Medizinischen Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt. 2. NOD/LtSz-scid-Mäuse wurden im Zentralen Tierlabor der MHH gezüchtet. 3. Das Blut HLA-A2-positiver, gesunder Spender stammte aus der Blutbank der Göttinger Universitätsklinik sowie der Blutbank MHH. Blut krebskranker Spender wurde in der Gastroenterologischen Tagesklinik der MHH entnommen. Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten (Promotionsberater oder anderen Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen fur Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen. Ich habe die Dissertation in der Abteilung für Gastroenterologie, Hepatologie und Endokrinologie der Medizinischen Hochschule Hannover angefertigt. Die Arbeit wurde durch finanzielle Mittel der Fresenius Stiftung unterstützt (AICR (04-269). Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht. Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der Wahrheit entsprechend gemacht habe. Hannover, den 28. Februar 2007 Sonja Obermann 183
