Dokument_32.
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Auswirkung von Hypoxie und Einfluss des Hypoxieinduzierbaren Transkriptionsfaktors HIF-1α auf die
antibakterielle Kapazität von dendritischen Zellen und
Makrophagen
Meiner Familie
Auswirkung von Hypoxie und Einfluss des Hypoxieinduzierbaren Transkriptionsfaktors HIF-1α auf die
antibakterielle Kapazität von dendritischen Zellen und
Makrophagen
Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.
vorgelegt von
Melanie Wiese
geb. Volke
aus Nürnberg / Mittelfranken
Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung:
03.September 2012
Vorsitzender der Prüfungskommission: Prof. Dr. Rainer Fink
Erstberichterstatter:
Prof. Dr. Michael Hensel
Zweitberichterstatterin:
PD Dr. Ruth Stadler
Inhaltsverzeichnis
1
Einleitung................................................................................................................. - 1 1.1
Hypoxie als Kennzeichen infizierter Gewebe ....................................................... - 1 -
1.2
Makrophagen und dendritische Zellen- Zellen der Immunantwort .................... - 2 -
1.3 Der Hypoxie-induzierbare Transkriptionsfaktor HIF vermittelt die Anpassung an
hypoxische Bedingungen......................................................................................... - 4 1.3.1
Struktur des HIF-Proteins ............................................................................. - 4 -
1.3.2
Sauerstoffabhängige Regulation der Aktivität des Hypoxie-induzierbaren
Transkriptionsfaktors ................................................................................... - 5 -
1.3.3
1.4
Paraloge des Transkriptionsfaktors HIF und deren Zielgene ........................ - 8 -
Die Bedeutung von HIF-1α innerhalb der Immunantwort ................................. - 10 -
1.4.1
Sauerstoffunabhängige Stabilisierung von HIF-1α in Zellen des Immunsystems
.................................................................................................................... - 10 -
1.4.2
1.5
2
HIF-1α reguliert die Funktionen phagozytierender Zellen .......................... - 11 -
Hypoxie beeinflusst antimikrobielle Mechanismen von Leukozyten ................ - 16 -
1.5.1
Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies .............................................. - 16 -
1.5.2
Produktion von reaktiven Stickstoffspezies ................................................ - 18 -
1.5.3
Rolle der NOS2 und PHOX in der Pathogenese von Infektionen................. - 19 -
1.6
Offene Fragen .................................................................................................... - 22 -
1.7
Zielsetzung der Arbeit ........................................................................................ - 23 -
Ergebnisse ............................................................................................................. - 25 2.1 Rolle des Hypoxie-induzierbaren Transkriptionsfaktors HIF-1α für die antibakterielle
Kapazität von dendritischen Zellen und Makrophagen ........................................ - 25 2.1.1
Etablierung einer Methode zur Transfektion von Makrophagen mit siRNA
Molekülen................................................................................................... - 27 -
2.1.2
Auswirkung einer siRNA-vermittelten Unterdrückung der Aktivität von HIF-1α
auf die antibakterielle Kapazität von dendritischen Zellen und Makrophagen .
.................................................................................................................... - 35 -
2.2 Auswirkung von Hypoxie auf die antibakterielle Kapazität von dendritischen Zellen
und Makrophagen ................................................................................................. - 39 2.2.1
Untersuchung des bakteriellen Wachstums unter hypoxischen Bedingungen ..
.................................................................................................................... - 40 -
2.3 Einfluss von Hypoxie auf die Produktion reaktiver Stickstoff- und Sauerstoffspezies ..
............................................................................................................................ - 49 2.4 Beteiligung der induzierbaren NO-Synthase (NOS2) an der sauerstoffabhängigen
Regulation der antibakteriellen Kapazität mononukleärer myeloischer Zellen ... - 52 2.5 Auswirkung eines Verlustes der Aktivität der PHOX und NOS2 auf die antibakterielle
Kapazität myeloischer mononukleärer Zellen....................................................... - 54 2.6 Auswirkung der Hemmung der mitochondrialen Aktivität auf die Eliminierung
phagozytierter Bakterien ...................................................................................... - 58 -
3
Diskussion ............................................................................................................. - 67 3.1 Die antibakterielle Kapazität myeloischer mononukleärer Zellen gegenüber E.coli
und
S.aureus
ist
nicht
von
der
Aktivität
des
Hypoxie-induzierbaren
Transkriptionsfaktors HIF-1α abhängig ................................................................. - 67 3.2
Hypoxie und die Stabilisierung von HIF-1α – „Zuckerbrot und Peitsche“.......... - 68 -
3.3
HIF-2α innerhalb der angeborenen Immunantwort .......................................... - 69 -
3.4 Hypoxie beeinträchtigt die antibakterielle Kapazität von dendritischen Zellen und
Makrophagen-Der Einfluss des Sauerstoffpartialdruckes auf die Abwehr infektiöser
Mikroorganismen .................................................................................................. - 71 3.5 Die verminderte Produktion reaktiver Sauerstoff- und Stickstoffspezies ist nicht
(vollständig) für die Beeinträchtigung der antimikrobiellen Kapazität myeloischer
mononukleärer Zellen unter hypoxischen Bedingungen verantwortlich ............. - 73 3.6 Die Rolle der mitochondrialen Aktivität innerhalb der angeborenen Immunabwehr ..
............................................................................................................................ - 75 3.6.1
Die Hemmung der mitochondrialen Aktivität scheint für die eingeschränkte
antibakterielle Kapazität hypoxischer myeloischer Zellen verantwortlich zu
sein ............................................................................................................. - 75 -
3.6.2
Mitochondriale ROS-Effektormoleküle bei der Abwehr phagozytierter
Pathogene und Schlüssel zur Aufklärung der sauerstoffabhängigen
Regulation der antibakteriellen Kapazität myeloischer mononukleärer Zellen?
.................................................................................................................... - 77 -
3.6.3
Mitophagie und phagosomale Degradierung – Stau im Vesikelverkehr ? . - 79 -
3.6.4
Die Änderung des zellulären Redox-Potentials könnte die Aktivität
antimikrobieller Proteine beeinflussen....................................................... - 80 -
3.6.5
„From
bench
to
bedside“-
Klinische
Relevanz
der
Befunde
zur
mitochondrialen Aktivität bei der Abwehr infektiöser Mikroorganismen.. - 82 -
4
Zusammenfassung ............................................................................................ - 85 -
5
Material und Methoden ................................................................................. - 87 5.1
Chemikalien und Reagenzien ............................................................................. - 87 -
5.2
Antikörper .......................................................................................................... - 90 -
5.3
Primer/Sonden für quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR) .................................. - 92 -
5.4
siRNA Moleküle .................................................................................................. - 93 -
5.5
Zellkulturmedien und Zusätze............................................................................ - 94 -
5.6
Verwendete Zelllinien/ primäre Zellen .............................................................. - 95 -
5.7
Verwendete Bakterienstämme .......................................................................... - 96 -
5.8
Versuchstiere ..................................................................................................... - 96 -
5.9
Auswertung und Darstellung der Daten (software) ........................................... - 97 -
5.10
Laborgeräte ........................................................................................................ - 98 -
5.11
Puffer und Lösungen .......................................................................................... - 99 -
5.12
Methoden......................................................................................................... - 100 -
5.12.1 Anzucht von Bakterien .................................................................................. - 100 5.12.2 Herstellung elektrokompetenter Bakterien................................................... - 100 5.12.3 Transformation von Bakterien mit Plasmiden .............................................. - 101 5.12.4 Analyse des Wachstums von Bakterien......................................................... - 101 5.12.5 Gewinnung muriner myeloischer mononukleärer Zellen .............................. - 102 -
5.12.6 Gewinnung von GM-CSF-haltigem Mediumzusatz........................................ - 103 5.12.7 Gewinnung von M-CSF-haltigem Mediumzusatz .......................................... - 104 5.12.8 Nachweis von zellulären Oberflächenmolekülen mittels Durchflusszytometrie .....
.................................................................................................................................. - 104 5.12.9 Hypoxische Inkubation von Zellen ................................................................. - 105 5.12.10 Infektion von dendritischen Zellen und Makrophagen mit Bakterien ......... - 105 5.12.11 Isolierung von Protein aus Zellen ................................................................ - 106 5.12.12 Bestimmung der Proteinkonzentration ....................................................... - 106 5.12.13 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese.......................................................... - 107 5.12.14 Westernblot (wet-blot Verfahren)............................................................... - 107 5.12.15 Nachweis von Proteinen auf PVDF-Membranen ......................................... - 107 5.12.16 RNA Isolierung aus Zellkulturen .................................................................. - 108 5.12.17 cDNA Synthese ............................................................................................ - 109 5.12.18 Quantitative real-time PCR ......................................................................... - 109 5.12.19 Untersuchung der antibakteriellen Kapazität myeloischer mononukleärer Zellen
.................................................................................................................................. - 110 5.12.20 Analyse des intrazellulären Bakterienwachstums ....................................... - 111 5.12.21 Nachweis der Aktivität der NOS2 (Griess Assay) ......................................... - 114 5.12.22 Nachweis reaktiver Sauerstoffspezies mittels CM-H2DCFDA ...................... - 114 5.12.23 Transfektion von Zellen mit siRNA mittels Elektroporation ........................ - 115 5.12.24 Untersuchung der Viabilität von Zellen ....................................................... - 116 -
6
Literaturverzeichnis ........................................................................................ - 118 -
7
Abkürzungsverzeichnis.................................................................................. - 135 -
8
Publikationen .................................................................................................... - 140 -
9
Danksagung ........................................................................................................ - 142 -
10
Anhang ................................................................................. - 143 -
Einleitung
1
Einleitung
1.1
Hypoxie als Kennzeichen infizierter Gewebe
Aerobe Organismen benötigen Sauerstoff für essentielle metabolische Prozesse. Einer
dieser bedeutenden Prozesse ist die Atmung, die für aerobe Organismen den effizientesten
Stoffwechselweg zur Gewinnung chemischer Energie in Form von ATP darstellt. Die Atmung
gliedert sich in die sauerstoffunabhängige Glykolyse, den Zitronensäurezyklus und die
anschließende oxidative Phosphorylierung, wobei für den letzten Schritt Sauerstoff als
Substrat benötigt wird. Somit ist für die Aufrechterhaltung des Energiehaushaltes die
Verfügbarkeit von Sauerstoff unverzichtbar. Interessanterweise variiert unter normalen, sog.
normoxischen Umständen der Sauerstoffgehalt, dem die Zellen im menschlichen Körper
ausgesetzt sind, zwischen 21 % in den Zellen der oberen Atemwege und 1 % im kortikomedullären Bereich der Niere (Semenza, 2009). Unabhängig von dem gewebsspezifischen
Normalwert der Sauerstoffkonzentration, wird eine relative Verminderung der Verfügbarkeit
von Sauerstoff auf ein Maß, das dem Sauerstoffbedarf der Zelle nicht mehr gerecht wird, als
Hypoxie bezeichnet und stellt eine bedrohliche Situation für die Zelle dar (Lisy et al., 2008;
Semenza, 2009).
In unterschiedlichen pathologischen Situationen entsteht eine Sauerstoffminderversorgung,
wie z.B. im Rahmen der Entwicklung von Tumoren (Semenza, 2003), Anämien (Haase,
2010) sowie im Verlauf von Herz-Kreislauferkrankungen, wie z.B. Myokard-Infarkt (Goswami
et al., 2010), Atherosklerose (Sluimer et al., 2009, 2008) und akuten ischämischen
Nierenversagen (Eckardt et al., 2005). Jedoch bedeuten auch Infektionen und entzündliche
Prozesse für das betroffene Gewebe eine massive Umstellung des Zellstoffwechsels
(Kominsky
et
al.,
2010).
Innerhalb
infizierter
Gewebe
können
beispielsweise
Mikrothrombosen oder Verletzungen von Blutgefäßen und die Einwanderung von
stoffwechselaktiven Immunzellen eine deutliche Erhöhung des Nährstoffbedarfs sowie eine
dramatische Verringerung der Verfügbarkeit von Sauerstoff verursachen (Nizet et al., 2009).
Im Rahmen eines entzündlichen Prozesses fällt der durchschnittliche Sauerstoffpartialdruck
(pO2), der in dem jeweiligen gesunden Gewebe vorliegt, von 2,5 %-9 % pO2 auf unter 1 %
pO2 (Nizet et al., 2009). Basierend auf dieser Beobachtung stieg in den letzten Jahren das
Interesse, die Auswirkung von Hypoxie auf unterschiedliche Aspekte der Immunantwort zu
erforschen.
-1-
Einleitung
1.2
Makrophagen und dendritische Zellen- Zellen der Immunantwort
Zur Bekämpfung von Infektionen werden zunächst nach dem Eindringen des infektiösen
Mikroorganismus die angeborenen Abwehrfunktionen aktiviert. Innerhalb dieser sog. ersten
Frontlinie der Immunabwehr ist eine Reihe von Phagozyten involviert, zu denen unter
anderem Makrophagen gehören (Janeway et al., 2002). Diese Immunzellen entstehen aus
hämatopoetischen Stammzellen des Knochenmarks. Über verschiedene Vorläuferstufen
entwickeln sich aus den Stammzellen Monozyten, die aus dem Knochenmark in den
peripheren Blutstrom entlassen werden (Takahashi et al., 1996; Virolainen, 1968; Taylor et
al., 2003). Von dort gelangen die Zellen in die umliegenden Gewebe, worin sie zu
Makrophagen ausdifferenzieren (Taylor et al., 2003). Einige Monozyten verbleiben als sog.
Gewebsmakrophagen innerhalb der unterschiedlichen Gewebe, wie z.B. Kupffer-Zellen in
der Leber (Kupffer, 1876; Crofton et al., 1978; Lopez et al., 2011) oder Alveolarmakrophagen
in der Lunge (Sibille et al., 1990; Rubins, 2003). Während akuter infektiöser Geschehen
werden weitere Monozyten zu dem Infektionsherd rekrutiert (Van Furth et al., 1973; Taylor et
al., 2003; Barton, 2008). Dieser Einwanderungsprozess wird über Chemokine und Zytokine
gesteuert, die von bereits aktivierten Immunzellen in den Blutkreislauf ausgeschüttet werden.
Am Infektionsherd tragen Makrophagen dazu bei, eingedrungene Pathogene zu beseitigen
(Mechnikov 1908; Mosser et al., 2008). Nach der Phagozytose und Sequestierung der
infektiösen Mikroorganismen in membranumschlossene Phagosomen werden verschiedene
Abwehrmechanismen aktiviert. Zu diesen zählt z.B. die Produktion reaktiver Stickstoff- bzw.
Sauerstoffintermediate, auf die in einem späteren Kapitel näher eingegangen wird. Im
Rahmen der antimikrobiellen Abwehrprozesse werden Makrophagen durch andere
phagozytierende Zellen, wie z.B. neutrophile Zellen ergänzt (Dale et al., 2008; Silva, 2010).
Des Weiteren können Makrophagen durch die Sekretion proinflammatorischer Zytokine, wie
z.B. Interleukin 6 (IL-6) oder Interleukin 1 (IL-1) die Rekrutierung und Aktivierung anderer
Immunzellen hervorrufen und somit eine Entzündungsreaktion unterstützen (Barton, 2008;
Knudsen et al., 2002; Janeway et al., 2002).
Um nach erfolgreicher Bekämpfung infektiöser Mikroorganismen die Immunantwort
abklingen zu lassen und eine Entzündungsreaktion zu bremsen, wird die Aktivität
regulatorischer Immunzellen benötigt. An diesem Prozess sind sog. regulatorische
Makrophagen beteiligt. Diese Makrophagen-Klasse ist gekennzeichnet
durch eine
gesteigerte Produktion des antiinflammatorischen Zytokins Interleukin 10 (IL-10) (Mosser et
al., 2008). Durch die Einwirkung dieses Zytokins wird die Produktion und Aktivität
proinflammatorischer Zytokine eingeschränkt, wodurch Entzündungsreaktionen zum Erliegen
kommen (Gordon, 2003; Cassatella et al., 1993).
-2-
Einleitung
Eine weitere Aufgabe von Makrophagen ist die Sanierung verwundeter Gewebe, wobei sie
abgestorbene Zellen entfernen und zur Wundheilung beitragen (Gordon, 2003; Mosser et al.,
2008; Martinez et al., 2009).
Die unterschiedlichen Effektorfunktionen von Makrophagen werden determiniert durch die
Zusammensetzung der Zytokine, mit denen die Zellen konfrontiert werden. Während z.B. von
T-Zellen sezerniertes IFN-γ (Interferon gamma) in Makrophagen die Abwehrmechanismen
zur
Beseitigung
von
Pathogenen
induziert,
aktiviert
z.B.
das
Zytokin
IL-4
die
Reparaturfunktionen der Makrophagen. Dahingegen bewirkt das antiinflammatorische
Zytokin IL-10 die Entstehung regulatorischer Makrophagen (Mosser et al., 2008; Gordon,
2003; Loke et al., 2007).
Zur Unterstützung der Abwehrmechanismen des angeborenen Immunsystems, tritt zeitlich
verzögert das adaptive Immunsystem in Kraft. Als Übermittler zwischen angeborener und
adaptiver Immunantwort fungieren antigenpräsentierende Zellen, die am Ort der Infektion
Fremdantigene aufnehmen und nach Prozessierung diese an der Oberfläche präsentieren.
Diese Zellen aktivieren innerhalb der naheliegenden lymphatischen Organe spezifische TZellen und lösen somit eine adaptive Immunantwort aus. Makrophagen können die Funktion
einer antigenpräsentierenden Zelle übernehmen (Martinez-Pomares et al., 2007). Weitaus
spezialisierter
auf
diesen
Aufgabenbereich
sind
jedoch
dendritische
Zellen.
Wie
Makrophagen haben diese Zellen Ihren Ursprung in hämatopoetischen Stammzellen
(Steinman et al., 1973; Geissman, 2007). Dendritische Zellen residieren in fast allen
peripheren
Geweben
und
nehmen
über
rezeptorvermittelte
Endozytose
oder
Mikropinozytose kontinuierlich extrazelluläres Material auf. Sobald sie auf ein Fremdantigen
(z.B. einfallende Mikroorganismen) stoßen und gleichzeitig ein Gefahrensignal, das unter
anderem durch bakterielles Lipopolysaccharid (LPS) vermittelt wird, erhalten, beginnen die
dendritischen
Zellen
auszureifen.
Während
dieses
Reifungsprozesses
wird
das
aufgenommene Antigen intrazellulär prozessiert, d.h. in einzelne Fragmente degradiert.
Dabei wird die Degradierung infektiöser Mikroorganismen innerhalb dendritischer Zellen
durch Mechanismen vermittelt, die ebenfalls zum antibakteriellen Arsenal von Makrophagen
zählen, wie z.B. die Produktion reaktiver Sauerstoffmoleküle. Die Fragmente der
Fremdantigene werden anschließend auf sog. Haupthistokompatibilitätskomplexe, die auch
als „major histocompatibility complex“ (MHC)-Moleküle bezeichnet werden, übertragen und
zur Zelloberfläche transportiert. In aktivierten dendritischen Zellen wird des Weiteren die
Expression kostimulierender Moleküle und die Produktion von Chemokinen und Zytokinen
induziert. Die aktivierten dendritischen Zellen verlassen das entzündete Gewebe und
wandern zu naheliegenden Lymphknoten, um dort die prozessierten Antigene naiven TZellen zu präsentieren, wodurch eine Antigen-spezifische adaptive Immunantwort ausgelöst
-3-
Einleitung
wird, die z.B. mit der Produktion spezifischer Antikörper einhergeht (Banchereau et al., 1998;
Granucci et al., 2005; Mellman et al., 2001).
1.3
Der Hypoxie-induzierbare Transkriptionsfaktor HIF vermittelt die
Anpassung an hypoxische Bedingungen
Sowohl Makrophagen als auch dendritische Zellen müssen sich den Änderungen des
Sauerstoffpartialdruckes innerhalb infizierter Gewebe anpassen. Eine zentrale Rolle bei der
Anpassung des Zellstoffwechsels an hypoxische Bedingungen spielt die Regulation von
Genen durch den Hypoxie-induzierbaren Transkriptionsfaktor „HIF“ (Bracken et al., 2003,
Semenza, 2007). Dieses regulatorische Protein ist ein Heterodimer bestehend aus einer αund einer β-Untereinheit, wobei letztere auch als ARNT („aryl hydrocarbon receptor nuclear
translocator“) bezeichnet wird (Wang et al., 1995a,b). Die Gene, die für die Untereinheiten
kodieren, werden konstitutiv exprimiert, wobei die Stabilität der α-Untereinheit unter anderem
durch den intrazellulären Sauerstoffgehalt beeinflusst wird (Wang et al., 1995a,b; Huang et
al.; 1996; Lisy et al., 2008; Majmundar et al., 2010). Es konnten bisher drei Paraloge der
HIF-α Untereinheit und 3 Isoformen des HIF-β (ARNT) Proteins identifiziert werden: HIF-1α,
HIF-2α und HIF-3α bzw. ARNT1, ARNT2 und ARNT3 (Lisy et al., 2008).
1.3.1
Struktur des HIF-Proteins
Strukturell gehören beide Untereinheiten des HIF-Komplexes, HIF-α und HIF-β, zu der basic
helix-loop-helix/ Per-Arnt-Sim Proteinfamilie (Wang et al.; 1995a,b). Sie beinhalten jeweils
eine basic-helix-loop-helix Domäne in der N-terminalen Region, die die Bindung der
Untereinheiten an DNA ermöglicht, gefolgt von einer PAS Domäne, deren Definition auf der
Aminosäuresequenz-Identität zu den ersten Mitgliedern der PAS-Proteinfamilie basiert: Per
(kodiert durch das Gen „period clock protein“ aus Drosophila melanogaster), ARNT
(humaner „aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator“) und SIM (kodiert durch das im
Genom von Fliegen identifizierte Gen „single minded“) (McIntosh et al., 2010; Gu et al.,
2000; Jiang et al., 1996). Innerhalb dieser PAS-Domäne befinden sich zwei über ca. 50
Aminosäuren erstreckende sog. „PAS repeats“, die als PAS A und PAS B bezeichnet werden
und die Dimerisierung zwischen der α- und β-Untereinheit des HIF-Komplexes ermöglichen
(Jiang et al., 1996). Die C-terminale Region der HIF-α und HIF-β Proteine weist eine für die
Aktivierung von Zielgenen essentielle Transaktivierungsdomäne (TAD) auf, die sich im Fall
von
HIF-1α
und
HIF-2α
in
eine
N-terminale
(NAD)
und
C-terminale
(CAD)
Aktivierungsdomäne aufgliedert (Pugh et al., 1997; Jiang et al., 1997; Hu et al., 2007; Lisy et
-4-
Einleitung
al., 2008). Eine weitere wichtige strukturelle Einheit, die nur innerhalb der α-Untereinheit
vorzufinden ist, stellt die „oxygen dependent degradation domain“ (ODDD) dar, die für die
posttranslationale, sauerstoffabhängige Regulation der Aktivität des Transkriptionsfaktors
HIF verantwortlich ist (Huang et al., 1998; Wenger, 2002; Lisy et al., 2008).
Abbildung 1.1: Schematische Darstellung der Domänenstruktur der unterschiedlichen
Untereinheiten des Hypoxie-induzierbaren Transkriptionsfaktors HIF (nach Lisy et al., 2008).
Sowohl die drei Paraloge HIF-1α, HIF-2α, HIF-3α und dessen Splice-Variante IPAS als auch HIF-β
weisen eine „basic-helix-loop-helix“ (bHLH) und eine PAS Domäne (PAS A, PAS B) auf, die die
Bindung der Untereinheiten an DNA und die Interaktion zwischen α- und β-Untereinheit ermöglichen.
Die Transaktivierungsdomänen (TAD, NAD, CAD) sind essentiell für die Induktion der Transkription
der HIF-Zielgene. In der „oxygen dependent degradation domain“ (ODDD) ist die sauerstoffabhängige
Regulation der Stabilität der α-Untereinheiten verankert.
1.3.2
Sauerstoffabhängige Regulation der Aktivität des Hypoxie-induzierbaren
Transkriptionsfaktors
Unter normoxischen Bedingungen ist die HIF-α Untereinheit, deren Gen konstitutiv exprimiert
wird, im Zytoplasma der Zelle lokalisiert und weist eine sehr kurze Halbwertszeit von weniger
als
5
min
auf
(Huang,
et
al.,
1996;
Wang
et
al.,
1995a,b).
Dieser
rapide
Degradierungsprozess wird initiiert durch die Hydroxylierung von spezifischen Prolinresten,
die innerhalb der „oxygen dependent degradation domain“ (ODDD) der α-Untereinheiten
lokalisiert sind. Diese Modifikation wird vermittelt durch spezielle Prolylhydroxylasen, die
PHDs („prolyl hydroxylase domain proteins“), die molekularen Sauerstoff und α-Ketoglutarat
als Substrat für die Enzymreaktion verwenden, in der ein Sauerstoffatom auf einen Prolinrest
innerhalb des HIF-Proteins übertragen wird und α-Ketoglutarat zu Succinat und CO2
umgesetzt wird (Bruick et al., 2001; Chowdhury et al., 2008; Semenza, 2009). Die
Hydroxylierung mindestens eines Prolinrestes innerhalb des HIF-α Proteins ist erforderlich
für den Aufbau des von Hippel-Lindau (VHL) Tumorsupressor Proteinkomplexes, der zur
Familie der E3-Ubiquitin-Ligase Komplexe gehört (Yan et al., 2004; Ivan et al., 2001).
Innerhalb
dieses
Komplexes
übernimmt
das
VHL-Protein
die
Aufgabe
der
-5-
Einleitung
Substraterkennung und bindet zunächst an die α-Untereinheit. Über das Adaptorprotein
Elongin C ist VHL mit einem Heterodimer aus dem Cullin 2 und RING Finger Protein Rbx1
(Cul2/Rbx1 Modul) verbunden, das die Ubiquitinylierung des Substrates, hier HIF-α, durch
das Enzym Ubc5 („ubiquitin-conjugating enzyme 5“) aktiviert. Als Folge der so vermittelten
Ubiquitinylierung wird das HIF-α Protein dem proteasomalen Abbau zugeführt (Yan et al.,
2004; Semenza, 2009).
Die Aktivität der HIF-spezifischen Prolylhydroxylasen, die den proteasomalen Abbau der
HIF-α Untereinheit einleiten, ist abhängig von der Verfügbarkeit von Sauerstoff (Kaelin et al.,
2008). So führt eine Verminderung des Sauerstoffpartialdruckes in den Zellen zu einer
Einschränkung der Funktion der Prolylhydroxylasen, sodass die Hydroxylierung der HIF-α
Untereinheit und somit deren proteasomaler Abbau unterbleibt (Lisy et al., 2008). Die
zytoplasmatische Stabilisierung der HIF-α Proteine erlaubt deren Translokation in den
Zellkern, die gefolgt wird von der Interaktion von HIF-α mit der kernständigen HIF-β
Untereinheit (Wood et al., 1996; Jiang et al., 1996; Lisy et al., 2008). Der vollständige HIFKomplex
bindet
an
die
sog.
„hypoxia
responsive
elements“
(HREs)
mit
der
Konsensussequenz G/ACGTG, die sich im regulatorischen DNA-Abschnitt der von HIF
gesteuerten Gene befinden (Wenger, 2000; Wenger, 2002). Durch die anschließende
Rekrutierung der Koaktivatoren CBP/p300 wird die Transkription der Zielgene induziert
(Arany et al., 1996). Die beiden transkriptionellen Koaktivatoren CBP und p300 ermöglichen
und stabilisieren die Interaktion des HIF-Transkriptionsfaktors mit dem Koaktivator-Komplex
und der Transkriptionsmaschinerie. Zusätzlich besitzen die Koaktivatoren eine Histon
Acetyltransferase Funktion, die durch die Öffnung der Chromatinstruktur den Zugang der
RNA-Polymerase zum kodierenden DNA-Abschnitt und somit die Transkription der Zielgene
erlaubt (Lisy et al., 2008; Semenza, 2009). Essentiell für die Rekrutierung der Koaktivatoren
und den Aufbau des Transkriptionskomplexes sind die Transaktivierungsdomänen innerhalb
der HIF-α Untereinheiten, deren Funktion intensiv für HIF-1α und HIF-2α untersucht wurden
(Ema et al., 1999). HIF-β weist zwar auch eine Transaktivierungsdomäne auf, jedoch scheint
diese Struktur zumindest innerhalb des HIF-Komplexes bei der Induktion der Expression von
Zielgenen keine entscheidende Rolle zu spielen (Bracken et al., 2003). Dahingegen erfüllen
sowohl die N-terminale Transaktivierungsdomäne (NAD) als auch die C-terminale
Transaktivierungsdomäne (CAD) der HIF-1α- und HIF-2α-Proteine distinkte Aufgaben. Für
die Regulation der meisten HIF-Zielgene erwies sich die CAD als essentiell, die deshalb die
dominierende Transaktivierungsdomäne zu sein scheint (Dayan et al., 2006). Die Funktion
der CAD wird gesteuert durch die Modulation eines konservierten Asparaginrestes innerhalb
der als CAD definierten Aminosäuresequenz der α-Untereinheiten. Die Hydroxylierung
dieses Asparaginrestes durch FIH-1 („factor inhibiting HIF-1“) verhindert die Interaktion der
CAD mit den Koaktivator CBP/p300, wodurch die durch den HIF-Komplex mediierte
-6-
Einleitung
Steuerung der Transkription von Genen inhibiert wird (Lando et al., 2002a,b, Mahon et al.,
2001). Wie die PHDs gehört FIH-1 zu der Familie der Eisen- (Fe(II)) und α-Ketoglutarat –
abhängigen Dioxygenasen. FIH-1 verwendet ebenfalls Dioxygen als Substrat, um ein
Sauerstoffatom auf den Asparaginrest zu übertragen, wobei das zweite Sauerstoffatom für
die Umwandlung von α-Ketoglutarat zu Succinat und CO2 genutzt wird (Schofield et al.,
2005; Kaelin et al., 2008). Dementsprechend wird die Aktivität des Transkriptionsfaktors HIF
sowohl über die Stabilität der HIF-α Untereinheiten (abhängig von den PHDs) als auch auf
Ebene der transkriptionellen Aktivität (vermittelt über FIH-1) sauerstoffabhängig reguliert.
Abbildung 1.2: Übersicht über die sauerstoffabhängige Regulation der Aktivität des Hypoxieinduzierbaren Transkriptionsfaktors HIF. Unter normoxischen Bedingungen (a) wird die αUntereinheit des Transkriptionsfaktors durch die sauerstoffabhängige Aktivität von Prolylhydroxylasen
(PHD = „prolylhydroxylase domain protein“) an definierten Prolinresten hydroxyliert. Diese Modifikation
löst den über VHL-vermittelten, rapiden proteasomalen Abbau der Untereinheit aus. Herrscht aufgrund
einer vorliegenden Hypoxie (b) ein Sauerstoffmangel, verringert sich die Aktivität der HIF-spezifischen
PHDs. Dies verhindert den proteasomalen Abbau der α-Untereinheit und ermöglicht die Translokation
dieser in den Zellkern, die gefolgt wird von der Interaktion der α-Untereinheit mit dem Bindungspartner
HIF-β. Der HIF-Komplex bindet an sog. HREs („hypoxia responsive elements“) innerhalb der
regulatorischen DNA-Abschnitte der HIF-Zielgene. Die anschließende Rekrutierung von Koaktivatoren
(CBP/p300) ermöglicht die Transkription der Zielgene.
-7-
Einleitung
Einige HIF-Zielgene zeigten eine ausschließliche Abhängigkeit von der NAD und wurden
nicht beeinflusst von einer Veränderung der Aktivität der CAD (Dayan et al., 2006). Weitere
Studien zeigten, dass in der NAD der HIF-α Untereinheiten die Zuständigkeit für die
Regulation bestimmter, für das jeweilige Paralog spezifischer Gene zu Grunde liegt (Hu et
al., 2007). Dementsprechend kann die HIF-vermittelte Steuerung der Expression von Genen
abhängig von dem intrazellulären Sauerstoffpartialdruck durch die jeweiligen Transaktivierungsdomänen und des jeweiligen HIF-α Paralogs feiner abgestimmt werden.
1.3.3
Paraloge des Transkriptionsfaktors HIF und deren Zielgene
Bisher konnten mehrere hundert Gene identifiziert werden, deren Expression der Regulation
über den Transkriptionsfaktor HIF untergeordnet ist. Darunter erwiesen sich die meisten
dieser Gene als Zielgene des HIF-Transkriptionsfaktors, der die HIF-1α Untereinheit
beinhaltet. Im nachfolgenden Text wird zur Vereinfachung der vollständige, transkriptionell
aktive HIF-Komplex nach der darin enthaltenen α-Untereinheit benannt. HIF-1α wurde zuerst
1992 als ein Protein beschrieben, das unter hypoxischen Bedingungen mit dem HRE
innerhalb der 3´Region des humanen Erythropoetin Gens (EPO) interagiert (Semenza et. al.,
1992). Weiterführende Untersuchungen enthüllten die Struktur und die sauerstoffabhängige
Regulation des HIF-1α Proteins (Wang et al., 1995 a,b). Da dieser Transkriptionsfaktor durch
die Steuerung der Expression einer Vielzahl von Genen die Anpassung der Zelle bzw. des
Organismus an hypoxische Bedingungen bewerkstelligt, wird HIF-1α auch als zentraler
Regulator der zellulären Prozesse unter hypoxischen Bedingungen bezeichnet. So wird z.B.
unter hypoxischen Bedingungen die verminderte Versorgung des Gewebes mit Sauerstoff
durch HIF-1α vermittelte Mechanismen kompensiert. Ein Mechanismus besteht in der
Erhöhung der Sauerstoffkapazität des Blutes. Für die Bildung des Hämoglobins, das in roten
Blutkörperchen (Erythrozyten) den Sauerstofftransport ermöglicht, stellt Eisen einen
limitierenden Faktor dar. Hypoxie induziert die Produktion von Transferrin und damit den
Transport von Eisen zu den Vorläuferzellen der Erythrozyten (Rolfs et al., 1997). Zusätzlich
fördert HIF-1α durch die Induktion des TfR1-Gens die Präsenz von Transferrinrezeptoren,
die die Eisenaufnahme in die Zellen katalysieren (Tacchini et al., 1999; Lok et al., 1999).
Zusätzlich steuert HIF-1α gegen die verringerte Sauerstoffversorgung des hypoxischen
Gewebes durch die Induktion der Produktion von angiogenen Faktoren an, wodurch die
Blutgefäßdichte erhöht wird. Das bekannteste HIF-1α-Zielgen, das in der Gefäßentwicklung
beteiligt ist, ist VEGF-A. Dieses Gen kodiert für den „vascular endothelial growth factor A“,
ein wichtiges Signalmolekül, das die Teilung und Migration von vaskulären Endothelzellen
stimuliert (Ylä-Herttuala et al., 2007; Neufeld et al., 1999). Des Weiteren kontrolliert HIF-1α
durch die Modulation des Gefäßtonus den lokalen Blutfluss. Innerhalb dieses Prozesses ist
-8-
Einleitung
unter anderem die Produktion der Vasodilatatoren NO, CO (vermittelt über die iNOS bzw.
Hämoxygenase) oder Adrenomedullin sowie die Synthese des vasoaktiven Peptidhormons
Endothelin-1 beteiligt, wobei die zuständigen Gene zu den Zielgenen von HIF-1α zählen
(Palmer et al., 1998; Lee et al., 1997; Hu et al., 1998).
Die bedeutendste Konsequenz von Hypoxie ist die Notwendigkeit der Umstellung des
Energiestoffwechsels. Unter hypoxischen Bedingungen kann der sauerstoffabhängige
Prozess der oxidativen Phosphorylierung nicht stattfinden. Der Verlust dieses effektiven
Weges der Energie (ATP)-Gewinnung wird ausgeglichen durch eine entsprechende
Erhöhung der glykolytischen Aktivität. Dieses Phänomen wird auch als sog. Pasteur Effekt
bezeichnet
(Seagroves
et
al.,
2001).
trägt
HIF-1α
zu
dieser
Umstellung
des
Zellmetabolismus bei, indem der Transkriptionsfaktor Gene reguliert, die für glykolytische
Enzyme kodieren, wie z.B. PGK (Phosphoglyzeratkinase), GAPDH (Glyzerinaldehyd-3Phosphat-Dehydrogenase), Phosphofruktokinase oder LDH A (Laktat-Dehydrogenase A)
(Firth et al., 1994; Semenza et al., 1994; Semenza et al., 1996; Graven et al., 1999). Des
Weiteren vermittelt HIF-1α über die Steuerung der Expression des Glukosetransporters
GLUT-1 eine verstärkte zelluläre Aufnahme von Glukose. Dadurch wird die gegenüber der
oxidativen Phosphorylierung geringere Effizienz der anaeroben Glykolyse hinsichtlich der
ATP-Ausbeute pro Glukosemolekül kompensiert (Loike et al., 1992; Ebert et al., 1995).
Während
die
glykolytische
Aktivität
gesteigert
wird,
wird
die
Aktivität
des
Zitronensäurezyklus, des mitochondrialen Elektronentransportes und der oxidativen
Phosphorylierung inhibiert. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass HIF-1α in einer miR-210abhängigen
Weise
sowohl
die
Aktivität
des
Zitronensäurezyklus
als
auch
den
mitochondrialen Elektronentransport beeinflusst (Chan et al., 2009).
Im Gegensatz zu der ubiquitären Expression und zentralen Rolle von HIF-1α erwies sich die
Aktivität von HIF-2α in vivo limitiert auf bestimmte Zellpopulationen in unterschiedlichen
Organen (Wiesener et al., 2003). In vitro Experimente zeigten ebenso eine Zelltypspezifische
transaktivierende
Funktion
von
HIF-2α,
die
sich
sogar
als
von
Zellkulturbedingungen abhängig erwies (Warnecke et al., 2008). Aufgrund des hohen HIF-2α
mRNA Gehaltes in endothelialen Zellen und Geweben mit hoher Gefäßdichte (Masatsugu et
al., 1997; Tian et al., 1997; Wiesener et al., 2003) lautet die Alternativbezeichnung für HIF-2α
„EPAS-1“ („endothelial PAS domain protein 1“). Es wird vermutet, dass dieses Protein
hauptsächlich die hypoxische Anpassung der Gefäßstruktur ermöglicht. Diese Hypothese
wird unterstützt durch die Beobachtung, dass verglichen mit HIF-1α HIF-2α einen stärkeren
Einfluss auf die Promotoraktivität zweier Gene hat, die in der Angiogenese beteiligt sind
(VEGF-A und Tie2) (Tian et al., 1997).
-9-
Einleitung
Das dritte Mitglied der HIF-α Familie, HIF-3α, wurde 1998 von Gu et al. identifiziert. Im
Gegensatz zu HIF-1α und HIF-2α besitzt die α-Untereinheit der dritten Variante des
Transkriptionsfaktors nur eine Transaktivierungsdomäne (Gu et al., 1998; Hara et al., 2001).
Deshalb scheint die Funktion von HIF-3α als Transkriptionsfaktor im Vergleich zu den
anderen beiden HIF-Paralogen geringer ausgeprägt zu sein (Hara et al., 2001). Es existieren
verschiedene Splice-Varianten der HIF-3α-Untereinheit, die sauerstoffabhängig reguliert
werden (Gu et al., 1998; Maynard et al., 2003). Dabei fungiert eine dieser Varianten, die als
IPAS („inhibitory PAS domain protein“) bezeichnet wird, als dominant negative HIFUntereinheit, die mit HIF-α Proteinen interagieren kann, wodurch deren Bindung an HREElemente von Zielgenen verhindert wird (Makino et al., 2001 und 2002). IPAS selbst wird
durch Hypoxie induziert, weshalb dieses Protein vermutlich eine unproduktive HIF-vermittelte
Regulation von Genen verhindert. Durch diesen Mechanismus wird z.B. die nicht
angemessene Vaskularisierung der hypoxischen Cornea gehemmt (Makino et al., 2001).
Die Bedeutung von HIF-1α innerhalb der Immunantwort
1.4
In den letzten Jahren wurde durch Studien verdeutlicht, dass der Transkriptionsfaktor HIF-1α
innerhalb
der
Immunantwort
von
großer
Bedeutung
ist.
Dabei
bewirkt
der
Transkriptionsfaktor nicht nur die Anpassung von Immunzellen an hypoxische Bedingungen
innerhalb infizierter Gewebe, sondern erwies sich ebenfalls als Modulator der Funktionen
von Immunzellen unter normoxischen Bedingungen.
1.4.1
Sauerstoffunabhängige Stabilisierung von HIF-1α in Zellen des Immunsystems
Die klassische Aktivierung von HIF-1α wird durch Hypoxie hervorgerufen. In Immunzellen
konnte kürzlich ein alternativer Weg der HIF-Aktivierung aufgezeigt werden, wodurch die
bedeutende Rolle von HIF-1α innerhalb der Immunantwort hervorgehoben wurde. So führte
die Inkubation von Makrophagen mit Gram-positiven, aber auch Gram-negativen Bakterien
zu einer normoxischen Akkumulation des HIF-1α Proteins sowie zu einer gesteigerten
Aktivität des Transkriptionsfaktors (Peyssonnaux et al., 2005). Weitere Untersuchungen
identifizierten LPS (Lipopolysaccharid) als einen bakteriellen Bestandteil, der eine
normoxische Aktivierung von HIF-1α in Makrophagen und dendritischen Zellen verursacht
(Peyssonnaux et al., 2007; Frede et al., 2006; Jantsch et al., 2008a). Dieser Effekt erwies
sich als abhängig von dem LPS-bindenden Toll-ähnlichen(TLR) Rezeptor 4, dem
Adaptorprotein MyD88 („Myeloid differentiation primary response gene (88)“) und dem
Transkriptionsfaktor NF-κB (“nuclear factor 'kappa-light-chain-enhancer' of activated B- 10 -
Einleitung
cells”), der durch einige TLR-vermittelte Signale aktiviert wird (Peyssonnaux et al., 2007;
Frede et al., 2006; Jantsch et al., 2011). Die Ergründung dieses Phänomens wurde
vorangetrieben durch die Erkenntnis, dass LPS die Transkription des Gens, das für die HIF1α-Untereinheit kodiert, induziert. Die transkriptionelle Regulation der Hif-1α Expression über
NF-κB wurde in der Studie von Rius et al. bestätigt. In Makrophagen resultierte eine Defizit
hinsichtlich der NF-κB Aktivierung durch den Verlust des positiven Regulators IKKβ in einer
verminderten Anzahl der HIF-1α Transkripte sowohl nach bakterieller Infektion als auch unter
hypoxischen Bedingungen (Rius et al., 2008). Basierend auf diesen Daten wurde postuliert,
dass LPS über den TLR-Signalweg und abhängig von NF-κB die Transkription des Hif-1α
Gens so verstärkt, dass die daraus resultierende Erhöhung der HIF-1α-Proteinmenge die
normoxische PHD-Aktivität absättigt. Dadurch würde die Effizienz des proteasomalen
Abbaus der HIF-α Untereinheiten sinken und somit die Aktivität des Hypoxie-induzierbaren
Transkriptionsfaktors ansteigen. Anhand der beschriebenen Untersuchungen kann jedoch
nicht ausgeschlossen werden, dass auch andere Mechanismen außer der beobachteten
Induktion der Hif-1α Genexpression nach Stimulation mit LPS induziert werden, die die
normoxische Stabilisierung des Transkriptionsfaktors verursachen.
Interessanterweise ist die Zusammensetzung der Zielgene von HIF-1α von dem Stimulus
abhängig, der die Stabilisierung der α-Untereinheit bewirkt. So konnte eine Studie von
Jantsch et al. zeigen, dass bestimmte Zielgene des Transkriptionsfaktors nur unter
hypoxischen Bedingungen induziert wurden. Eine andere Gruppe der HIF-gesteuerten Gene
erwies sich als abhängig von der Aktivierung des Transkriptionsfaktors durch einen
inflammatorischen Stimulus. Zusätzlich konnten Gene identifiziert werden, deren Expression
synergistisch durch beide HIF-stabilisierende Stimuli induziert wurde (Jantsch et al., 2011).
1.4.2
HIF-1α reguliert die Funktionen phagozytierender Zellen
Immunzellen
können
am
Infektionsherd
hypoxischen,
also
HIF-1α-stabilisierenden
Bedingungen ausgesetzt sein. Zusätzlich bewirken inflammatorische Stimuli, wie LPS, die
normoxische Stabilisierung von HIF-1α in phagozytierenden Immunzellen myeloischen
Ursprungs, zu denen dendritische Zellen und Makrophagen zählen. Deshalb fokussierten
einige Studien auf den Einfluss einer Hypoxie und der Rolle des Hypoxie-induzierbaren
Transkriptionsfaktors
bezüglich
der
Funktion
dieser
Zellen
als
Effektorzellen
der
angeborenen Immunantwort. Im nachfolgenden Text wird eine Zusammenfassung der
bisherigen Erkenntnisse gegeben.
- 11 -
Einleitung
1.4.2.1 Anpassung des Energiemetabolismus von Immunzellen an hypoxische
Bedingungen
Sauerstoff wird als Substrat für die oxidative Phosphorylierung benötigt und ist deshalb von
großer Bedeutung für den Energiehaushalt aerober Zellen. Unter hypoxischen Bedingungen
wird die Einschränkung der oxidativen Phosphorylierung kompensiert durch eine erhöhte
glykolytische Aktivität in Verbindung mit der sog. Laktat-Fermentation. Diese Umstellung des
Zellstoffwechsels ist für Immunzellen notwendig, da somit das Überleben und die Funktion
der Immunzellen in sauerstoffarmen, infizierten Geweben gewährleistet wird (Cramer et al.,
2003). Wie auch schon für andere Zelltypen gezeigt werden konnte, scheint auch für
Immunzellen der Transkriptionsfaktor HIF-1α die zentrale Rolle zu spielen, um den
Energiemetabolismus den entsprechenden Umgebungsbedingungen anzupassen. So
wiesen murine myeloische Zellen, zu denen Makrophagen und neutrophile Zellen gehören,
in denen zellspezifisch der HIF-1α Genlokus deletiert wurde, einen deutlich verminderten
ATP-Gehalt auf (Cramer et al., 2003). Da in dieser Studie eine verminderte ATP-Gewinnung
über die Glykolyse durch eingeschränkte Funktionen der Zellen begleitet wurde, scheint die
von HIF-1α gesteuerte metabolische Aktivität von Immunzellen für eine adäquate
Immunantwort notwendig zu sein.
1.4.2.2 HIF-1α
steuert
die
Expression
von
Rezeptoren
des
angeborenen
Immunsystems
Damit eine Immunantwort initiiert werden kann, müssen Zellen des Immunsystems zunächst
einfallende pathogene Mikroorganismen erkennen und anschließend ein Gefahrensignal
übermitteln. Daraufhin werden entsprechende Prozesse induziert, die zur Bekämpfung einer
Infektion dienen. Für die Erkennung pathogener Mikroorganismen verfügen Zellen des
angeborenen Immunsystems, wie Makrophagen und neutrophile Zellen, aber auch
dendritische Zellen über eine Vielzahl von Rezeptoren. Eine Gruppe dieser Rezeptoren
stellen die TLRs („toll like receptors“) dar, die sog PAMPs („pathogen associated molecular
patterns“), d.h. konservierte Strukturen, die sich auf oder in pathogenen Mikroorganismen
befinden, binden können (Kumar et al., 2009). Zu den Liganden zählen z.B. Bestandteile der
Hülle Gram-negativer Bakterien (Lipopolysaccharid, LPS) oder Gram-positiver Bakterien
(Lipoteichonsäure, LTA), die mit TLR4 bzw. TLR2 interagieren. Auch virale Bestandteile, wie
doppelsträngige RNA, oder Strukturen von Pilzen (Zymosan) werden durch Mitglieder der
TLR-Familie erkannt (Kumar et al., 2009; Akira et al., 2004). Die Bindung der Liganden an
den entsprechenden Rezeptor löst innerhalb der Zelle eine Signalkaskade aus, die zur
Induktion einer für den Krankheitserreger spezifischen Immunantwort führt (Netea et al.,
- 12 -
Einleitung
2004). Kuhlicke et al. zeigte eine hypoxische, HIF-1α-abhängige Induktion der Expression
zweier Toll-like Rezeptoren (TLR2 und TLR6) (Kuhlicke et al., 2007).
1.4.2.3 HIF-stabilisierende Bedingungen fördern einen Entzündungsprozess
Die
Beobachtung,
dass
die
Produktion
und
Sekretion
unterschiedlicher
Zytokine
sauerstoffabhängig reguliert werden (Kong et al., 2004; Peyssonnaux et al., 2005;
Scortegagna et al., 2008) weist auf eine weitere Ebene der Beeinflussung der Immunantwort
durch Hypoxie bzw. durch die Hypoxie-induzierbaren Transkriptionsfaktoren. Zytokine sind
kleine Proteine, können sowohl autokrin als auch parakrin wirken und bestimmen je nach
Zusammensetzung der ausgeschütteten Botenstoffe den Verlauf der Immunantwort. Der
Prozess einer Entzündung wird maßgeblich von Zytokinen gesteuert, indem z.B. im Bereich
der Infektion die Durchlässigkeit der Blutgefäßwände und der Durchmesser der Gefäße
verändert wird, sodass eine vermehrte Migration von Immunzellen, die ebenfalls durch
Zytokine induziert wird, stattfindet. Diese Mechanismen steigern die Effizienz der lokalen
Bekämpfung der Krankheitserreger und verhindern deren Ausbreitung in andere Gewebe.
Äußerliche Kennzeichen einer Entzündungsreaktion sind Schmerz, Rötung, Hitze und
Schwellung (Janeway et al., 2002; Dinarello, 2000). Die Auswirkung hypoxischer
Bedingungen und die Rolle von HIF-1α innerhalb der inflammatorischen Immunantwort
wurden in unterschiedlichen Studien untersucht. Hypoxie induzierte in einer humanen
Leukozyten-Zelllinie die Expression des β2 Integrins, ein Rezeptor, der eine entscheidende
Rolle bei der Rekrutierung von Leukozyten zum Infektionsherd spielt (Kong et al., 2004). Da
dieser Prozess sich als abhängig von HIF-1α erwies, scheinen sich HIF-stabilisierende
Bedingungen positiv auf die Migration von Immunzellen auszuwirken. Des Weiteren
veranschaulichten Peyssonnaux et al., dass in HIF-1α defizienten Makrophagen im Vergleich
zu den entsprechenden Wildtypzellen die Induktion der TNF-α („tumor necrosis factor-α“)
Expression und die Freisetzung des proinflammatorischen Zytokins nach Infektion mit
Streptokokken unterblieb (Peyssonnaux et al., 2005). Die daraus hervorgehende Hypothese,
dass eine Aktivierung von HIF-1α eine Entzündungsreaktion über die Ausschüttung von
Zytokinen beeinflusst, wird unterstützt durch die Beobachtung von Scortegagna et al.. In
dieser Studie wurde die Auswirkung einer für Keratinozyten spezifischen Überexpression von
HIF-1α hinsichtlich einer lokalen Hautinfektion untersucht. Die Autoren zeigten einen im
Vergleich zu den entsprechenden WT Kontrollen höheren Spiegel verschiedener Zytokine
und Chemokine, wie KC („keratinocyte chemokine“), TNF-α und MIP-2 („macrophage
inflammatory protein 2“) sowie eine deutlicher ausgeprägte Infiltration von Immunzellen in
das entzündete Gewebe (Scortegagna et al., 2008). Zusammenfassend lassen die
- 13 -
Einleitung
erhobenen Daten die Schlussfolgerung zu, dass die durch Hypoxie und HIF induzierten
Mechanismen eine Entzündungsreaktion verstärken.
1.4.2.4 Einfluss von Hypoxie auf die Funktion dendritischer Zellen
Als Folge eines länger andauernden infektiösen Geschehens wird die angeborene
Immunantwort durch die Abwehrfunktionen des adaptiven Immunsystems unterstützt. Dabei
fungieren antigenpräsentierende Zellen, wie dendritische Zellen, als Übermittler zwischen
den beiden Abwehrstrategien. Da dendritische Zellen den Umgebungsbedingungen
entzündeter Gewebe ausgesetzt sind, ist von bedeutender Relevanz, die Auswirkung eines
Sauerstoffentzuges bezüglich der Funktion dendritischer Zellen zu untersuchen. Bisher
konnten in vitro Studien zeigen, dass humane dendritische Zellen, deren Differenzierung aus
peripheren Blutmonozyten unter hypoxischen Bedingungen verlief, eine Einschränkung der
Fähigkeit aufwiesen, nach Aktivierung zu naheliegenden lymphatischen Geweben zu
migrieren. (Zhao et al., 2005; Qu et al., 2005). Die Hypothese, dass hypoxische
Bedingungen die Migration dendritischer Zellen negativ beeinflusst, wurde von Mancino et al.
unterstützt. In dieser Arbeit wurden murine dendritische Zellen mit LPS stimuliert und
gleichzeitig einem Hypoxie-Mimetikum (DFX), das die Stabilisierung des Hypoxieinduzierbaren Transkriptionsfaktors (HIF) auslöst, ausgesetzt. Nach subkutaner Injektion
dieser Zellen in Füße von Mäusen konnte eine, im Vergleich zu den normoxischen
Kontrollzellen, deutlich geringere Migration der hypoxisch vorinkubierten dendritischen Zellen
zu den dränierenden Lymphknoten festgehalten werden (Mancino et al., 2008).
Dieser eher negativen Auswirkung eines Sauerstoffentzuges auf die Funktion dendritischer
Zellen als Vermittler zwischen angeborener und adaptiver Immunantwort steht der Befund
gegenüber, dass Hypoxie die LPS-vermittelte Aktivierung von dendritischen Zellen erhöht
(Jantsch et al., 2008a; Spirig et al, 2010). So führte die Stimulation von murinen
dendritischen Zellen mit LPS unter hypoxischen Bedingungen zu einer erhöhten Expression
und Präsentation von Oberflächenflächenmolekülen wie der kostimulierenden Moleküle
CD86 und CD80 oder des Antigen-präsentierenden MHC II- Proteins. Passend zu dieser
phänotypischen Veränderung zeigten die hypoxischen Zellen eine stärker ausgeprägte
Kapazität, allogene T-Zellen zu stimulieren (Jantsch et al., 2008a). Weiterführende
Untersuchungen ergaben, dass die HIF-1α-induzierte glykolytische Aktivität nach Stimulation
mit LPS die Funktion dendritischer Zellen unter normoxischen Bedingungen unterstützt und
unter den Einfluss einer Hypoxie deutlich steigert (Jantsch et al., 2008a).
- 14 -
Einleitung
1.4.2.5 HIF-1α beeinflusst die Infektionsabwehr
Bakterielle Bestandteile bewirken unter normoxischen Bedingungen die Stabilisierung von
HIF-1α in Immunzellen des angeborenen Immunsystems, wie z.B. in Makrophagen (siehe
Abschnitt 1.4.1). Des Weiteren zeigten unterschiedliche Studien einen Einfluss von HIF-1α
sowohl auf die Expression pathogen-erkennender Toll-ähnlicher Rezeptoren als auch auf die
Produktion proinflammatorischer Zytokine (siehe Abschnitt 1.4.2.2 und 1.4.2.3). Der daraus
hervorgehende Eindruck, dass HIF-1α eine bedeutende Rolle für Mechanismen der
angeborenen Immunantwort trägt, wird unterstützt durch die Befunde, die von Peyssonnaux
et al. erhoben wurden. In dieser Studie wurde der Effekt einer für myeloische Zellen
spezifischen Deletion des für HIF-1α kodierenden Gens untersucht. Die Mäuse, die diesen
konditionalen „knock out“ trugen, wiesen eine im Vergleich zu den entsprechenden WTMäusen deutlich verminderte Fähigkeit auf, eine Infektion durch Streptokokken zu
bekämpfen. Die Autoren führten anhand weiterer Analysen diesen Phänotyp auf
eingeschränkte Abwehrfunktionen myeloischer Zellen zurück. Neutrophile Zellen, die aus
dem Blut der HIF-1α-defizienten Mäuse gewonnen wurden, zeigten nach Infektion mit
Streptokokken eine gegenüber der entsprechenden WT-Zellen geringere Aktivität der
antimikrobiellen Proteasen NE („neutrophile elastase“) und Cathepsin G, sowie eine
verminderte Expression des antimikrobiellen Peptids CRAMP („cathelicidin related
antimicrobial peptide“) (Peyssonnaux et al., 2005).
Eine pharmakologische Aktivierung von HIF-1α dahingegen verbesserte den klinischen
Verlauf einer Infektion mit dem Bakterienstamm Staphylokokkus aureus (Zinkernagel et al.,
2008). Basierend auf diesen Daten scheint HIF-1α die Eliminierung pathogener
Mikroorganismen zu fördern. Die daraus hervorgehende Annahme, dass Hypoxie bei einer
Infektion die antibakterielle Kapazität von Immunzellen durch Erhöhung der HIF-1α Aktivität
unterstützt, wird durch die Beobachtung einer hypoxisch induzierten Expression des
antimikrobiellen Peptids CRAMP bekräftigt (Peyssonnaux et al., 2005).
- 15 -
Einleitung
1.5
Hypoxie beeinflusst antimikrobielle Mechanismen von Leukozyten
Die erwähnten Studien veranschaulichen den positiven Einfluss des Hypoxie-induzierbaren
Transkriptionsfaktors HIF-1α auf die Funktion der Immunzellen, die in der ersten Frontlinie
der Immunantwort agieren. Dieser Erkenntnis steht die Beobachtung gegenüber, dass
hypoxische, also HIF-stabilisierende Bedingungen antimikrobielle Abwehrmechanismen von
Leukozyten negativ beeinflussen können. Dabei sind zwei wichtige Abwehrstrategien
hervorzuheben, die eine Abhängigkeit von der Verfügbarkeit von Sauerstoff vorweisen: Die
Produktion von reaktiven Sauerstoff- und Stickstoffspezies.
1.5.1
Zu
Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies
den
ersten
Hinweisen
hinsichtlich
eines
sauerstoffabhängigen
antibakteriellen
Mechanismus zählt der Bericht von Sbarra und Mitarbeitern, in dem beschrieben wird, dass
der Prozess der Phagozytose in polymorphkernigen Leukozyten von einer rapiden Erhöhung
des Sauerstoffverbrauchs begleitet wird (Sbarra et al., 1959). Weitere Analysen konnten
einen Anstieg der mitochondrialen Aktivität als Ursache für dieses Phänomen, das auch als
„respiratory burst“ beschrieben wurde, ausschließen, zumal sich eine Abhängigkeit der
energetischen Prozesse der Phagozytose von der glykolytischen Aktivität ergab (Sbarra et
al., 1959; Borregaard et al., 1982). Vielmehr schien von phagozytierenden Leukozyten
induziert durch die Aufnahme von Partikeln oder Bakterien vermehrt Sauerstoff für die
Produktion von Peroxid (H2O2) bzw. Superoxid (O2-) genutzt zu werden (McRipley et al.,
1967; Babior et al., 1973). Dieser Prozess wurde mit der Abtötung intrazellulärer Bakterien in
Verbindung gebracht, da Leukozyten, in denen der sog. „respiratory burst“ nicht stattfindet,
eine verminderte antibakterielle Kapazität gegenüber unterschiedlichen Bakterien aufwiesen
(Baehner et al., 1967; McRipley et al., 1967; Quie et al., 1967). Derartige Leukozyten wurden
aus Patienten gewonnen, die an einer chronisch granulomatösen Erkrankung (CGD; „chronic
granulomatous disease“) leiden. Diese vererbliche Erkrankung, äußert sich in einer
ausgeprägten Immundefizienz hinsichtlich bakterieller Infektionen (Goldblatt et al., 2000).
Anhand der weiterführenden Ergründung der molekularen Hintergründe dieser Erkrankung
wurde die NAD(P)H Oxidase der Leukozyten identifiziert, die für die Produktion von
bakteriziden reaktiven Sauerstoffmoleküle (ROS; „reactive oxygen species“) verantwortlich
ist (Baehner et al., 1967; Segal, 1987).
Der Aufbau und die Funktion dieses Enzyms wurden intensiv in neutrophilen Zellen
untersucht (Babior, 1999). Die NAD(P)H Oxidase ist jedoch ebenfalls Bestandteil des
antimikrobiellen Arsenals anderer Phagozyten, wie Makrophagen oder dendritischer Zellen
(Shiloh et al., 1999; Elsen et al., 2004; Savina et al., 2006; Vulcano et al., 2004). Die
- 16 -
Einleitung
NAD(P)H Oxidase der Leukozyten, die auch als PHOX („phagocyte oxidase“) bezeichnet
wird, ist ein Multiprotein-Komplex bestehend aus einem membrangebundenen Bestandteil
und
einigen
zytosolischen
Komponenten.
Das
Flavocytochrom
b558
stellt
den
membrangebundenen Bestandteil dar, der sich aus den beiden Untereinheiten gp91phox
und p22phox zusammensetzt. In ruhenden Phagozyten befindet sich der Komplex in der
Membran sekretorischer Vesikel und interagiert dort mit Rap1a (Babior, 1999; El-Benna et
al., 2005). Die Aktivierung der PHOX in Phagozyten wird unter anderem ausgelöst durch die
Aufnahme von Bakterien (El-Benna et al., 2005; Fang, 2004). Im Verlauf der Aktivierung wird
durch die Fusion der Membran sekretorischer Vesikel mit der Plasmamembran der
Membrankomplex der PHOX zunächst zur Zelloberfläche transferiert (Babior, 1999;
Kobayashi et al., 1998). Gleichzeitig migriert der zytosolische Komplex der PHOX bestehend
aus den Untereinheiten p47phox, p67phox, p40phox und Rac1 oder Rac2 zur
Plasmamembran, um dort mit dem Cytochrom b558 zu interagieren (Babior, 1999; Goldblatt
et al., 2000; El-Benna et al., 2005; Clark et al., 1990). Während der Phagozytose von
beispielsweise infektiösen Mikroorganismen wird die Plasmamembran mit den daran
gebundenen Partikeln nach Innen abgeschnürt, sodass sich das sog. Phagosom bildet,
wobei die Außenseite der ursprünglichen Plasmamembran ins Innere der Phagosomen zeigt
(Babior, 1999). Die assemblierte und aktivierte PHOX innerhalb der Phagosomenmembran
katalysiert den Transfer von Elektronen von dem Substrat NAD(P)H auf molekularen
Sauerstoff, wodurch Superoxid (O2-) generiert wird. Dieses Produkt gilt als Ausgangspunkt
aller reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), die in Phagosomen gebildet werden (El-Benna et
al., 2005). O2- kann spontan oder vermittelt über die SOD (Superoxid Dismutase) zu H2O2
umgewandelt werden. Durch weitere chemische Reaktionen, wie die Haber-Weiss- bzw.
Fenton-Reaktion, führt die Interaktion zwischen H2O2 und O2- in der Anwesenheit von
Transitionsmetallen zur Entstehung von reaktiven Hydroxylradikalen (OH-) (El-Benna et al.,
2005). Zusätzlich können durch die Aktivität der Myeloperoxidase (MPO) weitere toxische
Moleküle, wie Hypochlorid (OCl-) oder Chloramine, generiert werden (El-Benna et al., 2005;
Bogdan et al., 2000; Fang, 2004).
Die antimikrobielle Wirkung dieser reaktiven Moleküle basiert auf deren stark oxidierenden
Eigenschaften. So führt die Oxidation der Basen und der Zuckerbestandteile der bakteriellen
DNA zu Doppelstrangbrüchen. Zusätzlich verursachen oxidative Modifikationen von
Proteinen und Lipiden Membranschäden und Fehlfunktionen unterschiedlicher Enzyme
(Fang, 2004). Auf diese Weise trägt die sauerstoffabhängige, PHOX-vermittelte Produktion
reaktiver Sauerstoffmoleküle zur Eliminierung intrazellulärer Bakterien bei.
- 17 -
Einleitung
1.5.2
Produktion von reaktiven Stickstoffspezies
Der zweite antibakterielle Mechanismus, der auf die Verfügbarkeit von Sauerstoff
angewiesen
ist,
ist
Abwehrmechanismus
die
liegt
Produktion
die
Aktivität
reaktiver
der
Stickstoffspezies
induzierbaren
NO
(RNS).
Diesem
Synthase
(NOS2;
Alternativbezeichnung: iNOS) zugrunde, die unter anderem in Makrophagen und
dendritischen Zellen nachgewiesen werden konnte (Bogdan et al., 2000; Serbina et al.,
2003). Im Gegensatz zu der PHOX oder der anderen bisher identifizierten NO Synthasen,
der neuronalen und endothelialen NO Synthase (ncNOS oder NOS1 und eNOS oder NOS3),
wird die NOS2-Aktivität transkriptionell reguliert. Das Enzym fehlt in ruhenden Zellen,
wohingegen inflammatorische Stimuli, wie z.B. LPS oder proinflammatorische Zytokine
(TNF-α, IFN-γ) die Transkription des Gens, das für die NOS2 (=iNOS) kodiert, induzieren
(Bogdan, 2001; Stuehr et al., 2006). Demzufolge ist für die Aktivierung der NOS2 eine de
novo Proteinbiosynthese notwendig (Bogdan, 2001). Die funktionelle NO Synthase ist ein
Dimer und wird zu den Phagosomen rekrutiert, um die Effizienz der antimikrobiellen Wirkung
der produzierten Stickstoffspezies gegenüber aufgenommenen Mikroorganismen zu steigern
(Miller et al., 2004). Das Enzym katalysiert die Konvertierung der Aminosäure L-Arginin zu LCitrullin und Stickstoffmonoxid (NO), wobei Sauerstoff für diese Reaktion unverzichtbar ist
(Bogdan et al., 2000; Otto et al., 2001). Das generierte Stickstoffmonoxidradikal trägt zur
Bekämpfung intrazellulärer Bakterien bei und kann durch die Reaktion mit Sauerstoff oder
anderen Molekülen zu weiteren reaktiven Stickstoffspezies umgewandelt werden, zu denen
Stickstoffdioxid (NO2.), Stickstofftrioxid (NO3.), Dinitrogen Trioxid (N2O3), Dinitrogen Tetraoxid
(N2O4) und S-Nitrosothiole (RSNO) zählen (Chakravortty et al., 2003; Fang, 1997). Die
zeitgleiche Aktivität der NOS2 und der PHOX resultiert in der Entstehung von Peroxinitrit
(ONOO-), das ebenfalls zu den antimikrobiellen Effektormolekülen zählt (Nathan et al., 2000;
Bogdan et al., 2000; Fang, 2004).
Eine Struktur, die durch reaktive Stickstoffspezies beschädigt wird, ist die bakterielle DNA.
NO-Addukte und NO können die Desaminierung von Nukleosiden bewirken, wodurch
Genmutationen entstehen (Wink et al., 1991). Doppelstrangbrüche und andere oxidative
Schäden werden durch NO2. bzw. Peroxinitrit hervorgerufen (Juedes et al., 1996). Ebenso
inhibieren reaktive Stickstoffspezies die Replikation der bakteriellen DNA und die Reparatur
von DNA-Schäden (Schapiro et al., 2003; Lepoivre et al., 1991).
Die synergistische Einwirkung von reaktiven Stickstoff- und Sauerstoffspezies kann EisenSchwefel-Cluster destabilisieren, die Bestandteil unterschiedlicher Proteine, wie der
Aconitase, NADH Dehydrogenase oder Succinat Dehydrogenase sind, und wirkt sich somit
negativ auf die bakterielle Atmung aus (Pacelli et al., 1995; Stevanin et al., 2000). Vermittelt
- 18 -
Einleitung
über die Fenton-Reaktion amplifiziert das während dieses Prozesses freigesetzte Eisen
oxidative Schäden durch die Entstehung weiterer reaktiver Moleküle (Keyer et al., 1996).
Abbildung 1.3: Überblick über die Entstehung reaktiver Stickstoff- und Sauerstoffspezies
vermittelt über die Aktivität der NOS2 (induzierbare NO-Synthase) und der PHOX (NAD(P)H
Oxidase; "phagocyte oxidase") nach Fang, 2004. Durch die Aktivität der NOS2 und der PHOX
entsteht eine Vielzahl reaktiver Moleküle, die zur Bekämpfung phagozytierter Bakterien beitragen.
1.5.3
Rolle der NOS2 und PHOX in der Pathogenese von Infektionen
Die Produktion reaktiver Sauerstoff- und Stickstoffspezies erwies sich als bedeutungsvoll für
die Bekämpfung unterschiedlicher infektiöser Mikroorganismen. Studien an Mäusen, die
durch spezifische Gendeletion ein Defizit bezüglich der Aktivität der iNOS (=NOS2) oder
PHOX
(NAD(P)H-Oxidase)
trugen
bzw.
durch
genetische
Manipulation
beide
Enzymfunktionen ermangelten, veranschaulichten die Notwendigkeit dieser sauerstoffabhängigen Abwehrmechanismen zur Bekämpfung von Infektionen mit Bakterien, wie
Salmonella Typhimurium oder Mycobacterium tubercolosis (Shiloh et al., 1999; MacMicking
et al., 1997), Viren, wie Herpes Simplex Virus Typ I (MacLean et al., 1998), Pilzen, wie
Aspergillus fumigatus (Morgenstern et al., 1997) oder Parasiten, wie Leishmania
major/donovani oder Schistosoma mansoni (Diefenbach et al., 1998; Murray et al., 1999;
Bodan et al., 2000).
- 19 -
Einleitung
Die besondere Bedeutung der NAD(P)H Oxidase in der humanen Immunantwort wurde
erkannt durch die Symptome einer als CGD („chronic granulomatous disease“) bezeichneten
Erbkrankheit. CGD wird verursacht durch eine eingeschränkte oder fehlende Funktion der
NAD(P)H Oxidase innerhalb der Phagozyten der Patienten, die auf Mutationen in einem oder
mehreren Genen des NAD(P)H Oxidase Komplexes basiert (Goldblatt et al., 2000; Matute et
al., 2009). Die Patienten sind besonders empfänglich gegenüber bakteriellen und Pilzvermittelten Infektionen. Zu den Pathogenen, die zu häufigen Infektionen bei CGD Patienten
führen,
zählt
Staphylokokkus
aureus.
Dieses
Gram-positive
Bakterium
kann
als
Kolonisationskeim die Haut und oberen Atemwege des menschlichen Körpers besiedeln,
wobei dies ein Risiko für invasive Infektionen wie septische Arthritis, Osteomyelitis oder
Endokarditis darstellt (Foster, 2005). Nosokomiale infektiöse Erkrankungen, die bis zu der
Entwicklung einer Sepsis führen können, werden häufig durch das Eindringen von S.aureus
in tiefer liegende Gewebe verursacht, beispielsweise in Folge eines operativen Eingriffes
oder nach Katheterisierung (Foster, 2005). Interessanterweise verfügt dieses Bakterium über
Schutzmechanismen gegenüber Abwehrfunktionen des angeborenen Immunsystems. Die
bakterielle Superoxid-Dismutase bewirkt zusammen mit der Aktivität der bakteriellen
Katalase die Neutralisierung reaktiver Sauerstoffspezies und verhindert somit die oxidative
Eliminierung von S.aureus innerhalb der Phagosomen von Immunzellen (Karavolos et al.,
2003). Die genetische Ausstattung dieses Pathogens mit Schutzfunktionen gegenüber
oxidativen Abwehrmechanismen könnte darauf hinweisen, dass ROS eine besondere
Bedrohung für S.aureus darstellen. Dies würde auch die ausgeprägte Suszeptibilität der
CGD-Patienten für Infektionen mit S.aureus erklären. Passend hierzu konnte in vitro ein
Überlebensvorteil dieses Pathogens in murinen Makrophagen festgehalten werden, die eine
geringere Fähigkeit zur Produktion von Superoxid vorwiesen (Watanabe et al., 2007). Die
Aktivität der NAD(P)H Oxidase scheint also für die antibakterielle Kapazität der Phagozyten
gegenüber S.aureus von großer Bedeutung zu sein, wobei sich auch für den zweiten
sauerstoffabhängigen Abwehrprozess, der Produktion von reaktiven Stickstoffintermediaten
eine positive Korrelation hinsichtlich der Eliminierung des Pathogens ergab (McInnes et al.,
1998).
Eine Abhängigkeit von der Funktion der NOS2 und PHOX konnte ebenso für die Beseitigung
des Gram-negativen Bakteriums Escherichia coli beobachtet werden. Die Behandlung einer
Suspension dieses Bakteriums mit NO Donatoren verschlechterte die bakterielle Viabilität,
wobei dieser Effekt durch die gleichzeitige Gabe von H2O2 amplifiziert wurde bzw. durch
Inkubation mit Peroxinitrit stärker ausfiel (Poljakovic et al., 2003; Pacelli et al., 1995). Die
Notwendigkeit der Produktion reaktiver Stickstoff- und Sauerstoffspezies für die Kontrolle
eines kommensalen Bakteriums, wie E.coli, das ein Bestandteil der menschlichen und
tierischen Darmflora darstellt, wird veranschaulicht durch die Beobachtung von Shiloh et al..
- 20 -
Einleitung
Die Autoren beschreiben, dass steril aufgezogene Mäuse, die eine Deletion der für NOS2
und gp91phox (einer Untereinheit der PHOX) kodierenden Gene trugen, zu spontanen
Infektionen mit E.coli neigten (Shiloh et al., 1999). Weitere Untersuchungen verdeutlichten
die Auswirkung der synergistischen Aktivität der NOS2 und der PHOX auf die Eliminierung
von
E.coli
innerhalb
der
Phagosomen
von
Makrophagen.
Der
Verlust
eines
sauerstoffabhängigen antimikrobiellen Mechanismus, der auf einer Deletion des für NOS2
bzw. gp91phox kodierenden Gens beruhte, verschlechterte die Fähigkeit von Makrophagen,
E.coli abzutöten. Die antimikrobielle Kapazität der Makrophagen wurde jedoch am
deutlichsten beeinflusst durch die gleichzeitige Einschränkung der Funktion beider Enzyme
(Shiloh et al., 1999). In dieser Studie wurde der apathogene E.coli Stamm HB101 verwendet.
Dieser Stamm eignet sich besonders zur Analyse der Auswirkung von antimikrobiellen
Mechanismen,
die
von
Wirtszellen
induziert
werden,
da
das
Bakterium
keine
Virulenzfaktoren besitzt, die mit Abwehrmechanismen der Zelle interferieren. Somit ist es
möglich, auf die Funktion der Wirtszellen zu fokussieren, ohne mögliche Gegenregulationen
der intrazellulären Bakterien beachten zu müssen.
Zusammenfassend stellen die Produktion reaktiver Stickstoffspezies vermittelt über die
induzierbare NO Synthase (NOS2) und die Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies, die auf
der Aktivität der NAD(P)H Oxidase (PHOX) beruht, zwei wichtige antimikrobielle
Abwehrmechanismen dar. Da die Aktivität beider Enzyme von der Verfügbarkeit von
Sauerstoff abhängt, könnte die Fähigkeit myeloischer Zellen phagozytierte Bakterien
abzutöten
durch
einen
Sauerstoffmangel
negativ
beeinflusst
werden.
Tatsächlich
beeinträchtigte eine systemische Hypoxie die Abwehrkapazität von Mäusen hinsichtlich einer
Haut- und Lungeninfektion mit S.aureus (Green et al., 1964; Jönsson et al., 1988). Passend
zu dieser Beobachtung wiesen Granulozyten unter hypoxischen Bedingungen eine geringere
antibakterielle Kapazität auf (Mandell, 1974). McGovern et al. konnte neulich zeigen, dass
dies mit einer verminderten Sauerstoffradikalproduktion korrelierte (McGovern et al., 2011).
- 21 -
Einleitung
1.6
Offene Fragen
Myeloische mononukleäre Immunzellen (z.B. Makrophagen, dendritische Zellen) müssen
sich im Rahmen der Infektionsabwehr den hypoxischen Bedingungen infizierter Gewebe
anpassen. Studien konnten eine proinflammatorische Wirkung von Hypoxie in Korrelation zu
der Aktivität des Hypoxie-induzierbaren Transkriptionsfaktors HIF-1α aufzeigen. Dahingegen
existieren wichtige antimikrobielle Mechanismen, die auf die Verfügbarkeit von Sauerstoff
angewiesen sind. Aufgrund dieser teilweise widersprüchlich erscheinenden Befunde ergeben
sich folgende Fragestellungen:
Welchen Beitrag leistet HIF-1α für die antibakterielle Kapazität myeloischer
mononukleärer Zellen ?
Verändert eine Verminderung des Sauerstoffpartialdruckes die Fähigkeit myeloischer
mononukleärer Zellen, Bakterien zu eliminieren ?
Besteht ein Zusammmenhang zwischen einer möglichen sauerstoffabhängigen
Regulation der antibakteriellen Kapazität myeloischer mononukleärer Zellen und der
Aktivität von HIF-1α ?
Welche
Abwehrmechanismen
sauerstoffabhängige
Änderung
sind
der
verantwortlich
antimikrobiellen
für
eine
Kapazität
mögliche
myeloischer
mononukleärer Zellen ?
- 22 -
Einleitung
1.7
Zielsetzung der Arbeit
Der Hypoxie-induzierbare Transkriptionsfaktor HIF hat eine zentrale Funktion bei der
Anpassung zellulärer Prozesse bei Hypoxie. Da Infektionen und entzündliche Prozesse mit
der Entstehung hypoxischer Areale verbunden sind, stieg in den letzten Jahren das
Interesse, die Auswirkung von Hypoxie und die Rolle des Hypoxie-induzierbaren
Transkriptionsfaktors innerhalb der Immunantwort zu untersuchen. Tatsächlich zeigten sich
einige Funktionen von Makrophagen, neutrophilen Zellen und dendritischen Zellen
beeinflusst durch hypoxische Bedingungen, wobei sich häufig eine Korrelation zu der
Aktivität von HIF-1α-ein Paralog des Hypoxie-induzierbaren Transkriptionsfaktors HIF-ergab.
Dem berichteten positiven Einfluss des Hypoxie-induzierbaren Transkriptionsfaktors auf die
Funktion von Phagozyten steht die Beobachtung gegenüber, dass wichtige antimikrobielle
Mechanismen von Sauerstoff abhängig sind. Hierzu zählt die Produktion reaktiver
Stickstoffspezies (RNS), die auf der Aktivität der induzierbaren NO-Synthase (NOS2) beruht.
Ein zweites Beispiel eines antimikrobiell-wirksamen Enzyms, das auf die Verfügbarkeit von
Sauerstoff angewiesen ist, ist die NAD(P)H-Oxidase, die alternativ auch als PHOX
(„phagocyte oxidase“) bezeichnet wird und für die Produktion reaktiver Sauerstoffmoleküle
(ROS) verantwortlich ist.
Dem zu Folge ergibt sich eine vermeintliche Diskrepanz zwischen dem positiven Einfluss des
Hypoxie-induzierbaren Transkriptionsfaktors und der negativen Auswirkung einer Hypoxie
auf die Funktion von Phagozyten. Zielsetzung dieser Arbeit war es, aufzuklären, welchen
Beitrag HIF-1α für die antimikrobielle Kapazität von myeloischen mononukleären
Immunzellen (hier: Makrophagen und dendritischen Zellen) leistet und zu untersuchen,
inwieweit Hypoxie mit den Abwehrmechanismen dieser Zellen interferiert. Hierfür sollte
zunächst die Expression des für HIF-1α kodierenden Gens durch Einbringen HIF-1αspezifischer siRNA-Moleküle in dendritischen Zellen und Makrophagen vermindert werden.
Die Elektroporation erwies sich als geeignete Methode zur Transfektion von dendritischen
Zellen (Jantsch et al., 2008b). Eine Aufgabe dieser Arbeit bestand darin, ein ähnliches
Verfahren für das Einführen von siRNA-Molekülen in Makrophagen zu etablieren.
Anschließend sollte die Auswirkung einer siRNA-vermittelten Reduktion der Expression des
Hif-1α-Gens auf die antibakterielle Kapazität myeloischer Zellen untersucht werden. Da für
E.coli und S.aureus in unterschiedlichen Studien eine Suszeptibilität gegenüber der
möglicherweise durch Hypoxie eingeschränkten Aktivität der NOS2 und PHOX festgehalten
werden konnte, sollte im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit die intrazelluläre Eliminierung
dieser Mikroorganismen unter hypoxischen Bedingungen analysiert werden. Falls die
antibakterielle Kapazität myeloischer Zellen durch einen Sauerstoffentzug beeinflusst wird,
- 23 -
Einleitung
sollte die Identifizierung des verantwortlichen sauerstoffabhängigen antimikrobiellen
Abwehrmechanismus die Arbeit abrunden.
Da myeloische Zellen während der Abwehr infektiöser Mikroorganismen der sauerstoffarmen
Umgebung infizierter Gewebe ausgesetzt sind, sollten die Befunde der vorliegenden Arbeit
zum einen die Funktionen myeloischer Zellen unter physiologischen Bedingungen
beleuchten. Zum anderen könnten die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit Denkanstöße
liefern, inwiefern eine pharmakologische Modulation des HIF-Systems in myeloischen Zellen
bzw. die Versorgung mit Sauerstoff zur Bekämpfung von Infektionen klinisch eingesetzt
werden könnte.
- 24 -
Ergebnisse
2
Ergebnisse
2.1
Rolle des Hypoxie-induzierbaren Transkriptionsfaktors HIF-1α für die
antibakterielle Kapazität von dendritischen Zellen und Makrophagen
Um die Rolle des Hypoxie-induzierbaren Transkriptionsfaktors HIF-1α bei der Abwehr
phagozytierter Bakterien aufzuklären, wurde zunächst der HIF-1α-Proteingehalt und die
Aktivität des Transkriptionsfaktors nach bakterieller Infektion in dendritischen Zellen und
Makrophagen bestimmt. Hierzu wurden aus Knochenmark von Mäusen dendritische Zellen
und Makrophagen generiert und mit E.coli bzw. S.aureus infiziert, wobei die zu den Zellen
gegebene Bakterienmenge der 10-fachen Wirtszellzahl entsprach (entsprechend einer MOI
von 10). Anschließend wurden die Zellen normoxischen bzw. hypoxischen (0,5 % O2)
Bedingungen ausgesetzt. Für die Inkubation unter Normoxie wurden die Zellen in einen
„alltäglichen“ Zellinkubator gestellt (21 % O2; 37°C; 5 % CO2; 90 % Luftfeuchte). Die
Exposition der Zellen unter hypoxischen Bedingungen verlief in einer Hypoxie-Kammer bei
0,5 % O2; 37°C; 5 % CO2; 90 % Luftfeuchte). 24 h nach Infektion wurde innerhalb der Zellen
der Gehalt der α-Untereinheit des Transkriptionsfaktors bestimmt, der auf die Aktivierung des
Transkriptionsfaktors Rückschlüsse ziehen lässt. Parallel dazu wurde aus in gleicher Weise
behandelten Makrophagen und dendritischen Zellen RNA isoliert, um die Expression eines
HIF-1α Zielgens zu untersuchen. Anhand dieses Ansatzes wurde die transkriptionelle
Aktivität des Hypoxie-induzierbaren Transkriptionsfaktors nachgewiesen.
- 25 -
Ergebnisse
A
B
Abbildung 2.1: Die Infektion von dendritischen Zellen und Makrophagen mit E.coli bzw.
S.aureus führt zur normoxischen Stabilisierung und Aktivierung von HIF-1α.
(A) Dendritische Zellen und Makrophagen, die aus dem Knochenmark von Mäusen gewonnen
wurden, wurden mit E.coli bzw. S.aureus infiziert (MOI 10) und normoxischen bzw. hypoxischen
Bedingungen ausgesetzt. 24 h nach Infektion wurde das Gesamtprotein aus den Zellen isoliert. Der
Nachweis der HIF-1α-Untereinheit erfolgte durch Westernblot-Analyse mittels eines HIF-1α
spezifischen Antikörpers. Zur Kontrolle der gleichmäßigen Auftragung der Proteine wurde zusätzlich
der Aktin-Gehalt der einzelnen Ansätze bestimmt. (B) KM-DZ und KM-MΦ wurden behandelt wie in
(A) beschrieben. 24 h nach Infektion wurde die Expression eines Zielgens (Pgk1;
Phosphoglyzeratkinase-1) von HIF-1α mittels quantitativer RT-PCR gemessen. Dargestellt ist die
relative Pgk1 Expression, wobei der mRNA-Gehalt innerhalb nicht infizierter, normoxischer Zellen auf
den Wert „1“ gesetzt wurde. Des Weiteren diente die Expression des für HPRT-1 kodierenden Gens
als Referenz zur Normalisierung der Daten. Dargestellt sind die Ergebnisse (Mittelwert+SEM) aus
mindestens 4 unabhängigen Experimenten. Die Berechnung der Signifikanz erfolgte mittels des
Student´s t-test;
* =p<0,05,**p<0,01; ns = nicht signifikant.
Wie in Abbildung 2.1 A zu sehen, führte die Inkubation mit dem LPS-tragenden Gramnegativen Bakterium E.coli zu einer normoxischen Akkumulation von HIF-1α. Dabei übertraf
die normoxische Stabilisierungsrate der α-Untereinheit nach Infektion mit E.coli die Erhöhung
des Gehaltes des HIF-1α-Proteins der nicht infizierten Kontrolle unter hypoxischen
- 26 -
Ergebnisse
Bedingungen. Des Weiteren führte die Hypoxie-Exposition infizierter Zellen zu keiner
weiteren Steigerung des jeweiligen unter Normoxie festgehaltenen HIF-1α-Signals. Wurden
die Zellen mit dem Gram-positiven Bakterienstamm S.aureus behandelt, konnte ebenfalls
eine normoxische Akkumulation der HIF-1α Untereinheit beobachtet werden. Jedoch war im
Vergleich zur Infektion mit E.coli zum einen der Gehalt an HIF-1α-Protein in normoxischen
Zellen nach Inkubation mit S.aureus wesentlich schwächer und zum anderen resultierte die
Exposition an einer Hypoxie in einer deutlichen Erhöhung der S.aureus-vermittelten
Stabilisierung von HIF-1α. Diese Regulation des HIF-Proteins spiegelte sich in einer
entsprechenden Induktion der Expression eines Gens wider, das von HIF-1α gesteuert wird
(Pgk1; kodierend für die Phosphoglyzeratkinase 1) (Abbildung 2.1 B). Die beobachtete
Aktivierung des Transkriptionsfaktors aufgrund einer bakteriellen Infektion der Zellen ließ die
Vermutung zu, dass HIF-1α bei der Beseitigung von phagozytierten Mikroorganismen
beteiligt sein könnte. Zur Überprüfung dieser Hypothese sollte die Auswirkung einer siRNAvermittelten Unterdrückung der Expression des Gens, das für HIF-1α kodiert, auf die
antibakterielle Kapazität phagozytierender Zellen analysiert werden.
2.1.1
Etablierung einer Methode zur Transfektion von Makrophagen mit siRNA
Molekülen
Im Vorfeld dieser Arbeit konnte bereits gezeigt werden, dass siRNA Moleküle durch
Elektroporation in dendritische Zellen eingebracht werden können, um den mRNA-Gehalt der
entsprechenden Gene zu vermindern (Jantsch et al., 2008b). Fraglich war jedoch, ob diese
Methode auch auf primäre Makrophagen übertragen werden kann. Gemäß dem Protokoll,
das für dendritische Zellen etabliert wurde, wurden Makrophagen mit einer unspezifischen,
Fluorescein-gekoppelten siRNA (ns-FL-siRNA) elektroporiert. Als Kontrolle wurden die Zellen
nicht elektroporiert belassen (unbehandelt) oder ohne Zugabe von siRNA elektroporiert
(mock). Die Ansätze wurden anschließend durchflusszytometrisch analysiert. Während die
Kontrollzellen keinerlei Fluoreszenz zeigten, konnte in den Zellen, die mit der ns-FL-siRNA
elektroporiert wurden, eine Fluorescein-spezifische Fluoreszenz beobachtet werden, die
einer Transfektionseffizienz von über 95 % entsprach (Abbildung 2.2). Somit stellt die
Elektroporation eine effiziente Methode dar, um siRNA-Moleküle in Makrophagen
einzubringen.
- 27 -
Ergebnisse
A
B
Abbildung 2.2: Effizienz der Transfektion von Makrophagen mittels Elektroporation. Aus
murinen Knochenmarkszellen differenzierte Makrophagen wurden in Ab- bzw. Anwesenheit von
unspezifischer, mit Fluorescein-markierter siRNA elektroporiert (mock bzw. ns-FL-siRNA) oder nicht
elektroporiert belassen (unbehandelt). (A) Nach entsprechender Behandlung wurden die Ansätze
durchflusszytometrisch untersucht. In (B) ist der prozentuale Anteil Fluorescein positiver Zellen
innerhalb der jeweiligen Ansätze aus vier unabhängigen Experimenten aufgezeigt
(Mittelwert+Standardabweichung).
2.1.1.1 Einfluss der Elektroporation auf die Viabilität von Makrophagen
Um Fehlinterpretationen bei späteren Experimenten zu verhindern, wurde untersucht,
inwiefern sich der Prozess der Elektroporation bzw. das Einführen von siRNA-Molekülen auf
die Viabiliät der Makrophagen auswirkt. Die Viabilität elektroporierter Makrophagen wurde
anhand
zweier
experimenteller
Vorgehen
untersucht.
Zum
einen
wurden
die
unterschiedlichen Ansätze in einen sog. MTT-Assay eingesetzt, der darauf beruht, dass in
lebendigen Zellen Enzyme abhängig von den Reduktionsäquivalenten NADH bzw. NADPH
einen
zu
den
Zellen
zugegebenen
Farbstoff
(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-
diphenyltetrazoliumbromid) reduzieren, wodurch ein blau-violettes Formazan entsteht.
Zur Analyse der Viabilität der Makrophagen anhand des MTT-Assays wurden die Zellen 24 h
nach Elektroporation mit unspezifischer siRNA (ns-siRNA) entweder mit LPS (10 ng/ml)
stimuliert (LPS) oder unstimuliert belassen (nicht stimuliert). Dadurch sollte ermittelt werden,
ob sich die Elektroporation auf die Lebensfähigkeit naiver oder durch LPS aktivierter
- 28 -
Ergebnisse
Makrophagen auswirkt. Als Kontrolle dienten nicht stimulierte oder mit LPS behandelte, nicht
elektroporierte Zellen (unbehandelt) bzw. in Abwesenheit von siRNA elektroporierte Zellen
(mock). 24 h nach LPS-Stimulation wurde der MTT-Assay durchgeführt und die
Formazanbildung photometrisch nachgewiesen. Der Formazangehalt der elektroporierten
Zellen unterschied sich nicht wesentlich von dem der Kontrollansätze (Abbildung 2.3 A).
Deshalb konnte eine Einschränkung der Lebensfähigkeit von Makrophagen nach
Elektroporation bzw. nach dem Einbringen einer unspezifischen siRNA ausgeschlossen
werden. Auffällig war die erhöhte Reduktion des MTT-Farbstoffes nach Stimulation der
Zellen mit LPS. Der Eindruck, dass die Stimulation von Makrophagen mit einem Bestandteil
Gram-negativer Bakterien die Viabilität der Zellen verbessert, wurde mittels Behandlung der
Zellen aus den verschiedenen Ansätzen mit dem Farbstoff Trypanblau bestätigt. Dieser
Farbstoff akkumuliert lediglich in abgestorbenen Zellen, sodass ein erhöhter Anteil blau
gefärbter Zellen auf eine Einschränkung der Zellviabilität hinweist. Während das Verhältnis
zwischen ungefärbten und angefärbten Zellen durch den Vorgang der Elektroporation nicht
beeinflusst wurde, konnte ein höherer Prozentsatz lebensfähiger Zellen nach Stimulation mit
LPS festgehalten werden (Abbildung 2.3 B).
A
B
Abbildung 2.3: Auswirkung der Elektroporation auf die Viabilität von Makrophagen. (A) KM-MΦ
wurden 24 h nach Elektroporation mit unspezifischer siRNA (ns-siRNA) mit 10 ng/ml LPS behandelt
oder nicht stimuliert belassen. Als Kontrolle dienten nicht elektroporierte Zellen (unbehandelt) bzw. in
Abwesenheit von siRNA elektroporierte Zellen (mock). 24 h später wurde ein MTT-Assay
durchgeführt. Die Formazanbildung, die auf die Lebensfähigkeit der Zellen schließen lässt, wurde
anhand der Extinktion bei 550 nm vermessen. (B) KM-MΦ wurden wie in (A) beschrieben behandelt.
Durch anschließende Färbung der Zellen mit Trypanblau wurde die Viabilität der Zellen überprüft. Der
Anteil abgestorbener Zellen wurde ermittelt, indem der prozentuale Anteil blau eingefärbter Zellen
über die Gesamtzellzahl berechnet wurde. Graph (A) und (B) zeigen die Zusammenfassung der
Ergebnisse (Mittelwert+Standardabweichung) aus drei unabhängigen Experimenten.
- 29 -
Ergebnisse
Einen weiteren Hinweis auf die Viabilität der Makrophagen lieferte die Analyse der
Morphologie der Zellen, die durch Färbung der Zellen mittels Diff-Quik® erfolgte. Wie in
Abbildung 2.4 zu sehen ergaben sich keine morphologischen Auffälligkeiten, die auf die
Elektroporation oder das Einführen von siRNA Molekülen zurückgeführt werden konnten.
Abbildung 2.4: Untersuchung der Morphologie von Makrophagen nach Elektroporation. KM-MΦ
wurden in Ab- bzw. Anwesenheit von unspezifischer siRNA (mock bzw. ns-siRNA) elektroporiert und
24 h danach mit LPS (10 ng/ml) für weitere 24 h inkubiert (LPS) oder nicht stimuliert belassen (nicht
stimuliert). Als Kontrolle dienten nicht stimulierte bzw. mit LPS behandelte, nicht elektroporierte Zellen
(unbehandelt, nicht stimuliert bzw. unbehandelt, LPS). Nach Färbung der Ansätze mit DiffQuik®
wurde die Morphologie der Zellen mikroskopisch analysiert. Dargestellt sind repräsentative Bilder aus
drei unabhängigen Experimenten.
2.1.1.2 Auswirkung der
Elektroporation auf
unterschiedliche Funktionen
von
Makrophagen
Um weitere unerwünschte Nebeneffekte der Elektroporation auszuschließen, wurden
zusätzlich zu der Lebensfähigkeit verschiedene Funktionen der Makrophagen betrachtet.
Zunächst wurde untersucht, inwiefern Makrophagen nach Elektroporation in der Lage sind,
auf einen inflammatorischen Stimulus zu reagieren. Hierfür wurden Makrophagen ohne bzw.
mit unspezifischer siRNA elektroporiert (mock bzw. ns-siRNA) und anschließend mit LPS
behandelt, wobei als Kontrolle nicht elektroporierte (unbehandelt) bzw. nicht stimulierte
Zellen dienten. Da in Makrophagen die Stimulation mit LPS die Expression des Gens, das für
die induzierbare NO-Synthase kodiert (hier bezeichnet als Nos2), induziert (Xie et al., 1994),
wurde sowohl der Nos2 mRNA Gehalt als auch die Aktivität der NO-Synthase als Hinweis
auf die Aktivierbarkeit der Makrophagen analysiert. Wie erwartet führte die Inkubation der
Zellen mit LPS zu einer verstärkten Nos2-Genexpression und NOS2-Aktivität, wobei letztere
- 30 -
Ergebnisse
durch eine gesteigerte Konzentration von Nitrit im Überstand der entsprechenden Zellen
angezeigt wurde (Abbildung 2.5 A). Dabei wurde die Induktionsrate in beiden Fällen nicht
verändert durch die Elektroporation bzw. durch die Inkubation der Zellen mit unspezifischer
siRNA. Ebenso verhielt es sich mit der LPS-vermittelten Induktion der Expression der für die
inflammatorischen Zytokine IL-6 und TNF-α kodierenden Gene (Abbildung 2.5 B).
In einem weiteren Experiment sollte die Auswirkung einer Transfektion von Makrophagen
mittels Elektroporation auf die Phagozytoserate sowie auf die Fähigkeit der Zellen,
intrazelluläre
Bakterien
abzutöten,
aufgeklärt
werden.
Nachdem
Knochenmarks-
makrophagen mit unspezifischer siRNA transfiziert (ns-siRNA) bzw. ohne Zugabe von
siRNA-Molekülen elektroporiert wurden (mock), erfolgte die Infektion der einzelnen Ansätze
mit E.coli (MOI 10). Zusätzlich wurden nicht elektroporierte Zellen (unbehandelt) in gleicher
Weise infiziert. Zwei Stunden nach Zugabe der Bakterien und nach Antibiotika-vermittelter
Beseitigung extrazellulärer Bakterien wurde die Anzahl der Kolonie-bildenden Einheiten
innerhalb der Makrophagen determiniert. Die Anzahl der intrazellulären Bakterien 24 h nach
Infektion gab Aufschluss über die antibakterielle Kapazität der Makrophagen unter den
angegebenen Bedingungen. In Abbildung 2.5 C wird veranschaulicht, dass die Anzahl der
phagozytierten Bakterien durch den Prozess der Elektroporation nicht verändert wurde. Des
Weiteren konnte keine negative Einwirkung einer derartigen Behandlung der Zellen
bezüglich deren antibakteriellen Kapazität festgehalten werden.
- 31 -
Ergebnisse
A
B
C
Abbildung 2.5: Auswirkungen der Elektroporation auf die Funktion von Makrophagen. (A) KMMΦ wurden 24 h nach Elektroporation mit LPS (10 ng/ml) für 24 h inkubiert. Anschließend wurde die
Expression des Nos2 Gens mittels qRT-PCR analysiert (oberer Graph). Dargestellt ist die relative
Veränderung der Genexpression, wobei der Nos2-mRNA-Gehalt aus nicht elektroporierten
(unbehandelt), nicht stimulierten Zellen als Referenz diente und die Werte aus den unterschiedlichen
Ansätzen auf die Hprt-1-Expression normalisiert wurden. Gezeigt sind die Ergebnisse zweier
unabhängiger Experimente. Zusätzlich wurde in drei unabhängigen Experimenten durch Messung des
Nitritgehaltes im Überstand der entsprechend behandelten Zellen die Aktivität der NOS2 bestimmt
(unterer Graph). (B) KM-MΦ wurden 24 h nach Elektroporation mit LPS (10 ng/ml) stimuliert. Zu den
angegebenen Zeitpunkten wurde die Gesamt-RNA der Zellen isoliert und hinsichtlich der Expression
von zwei inflammatorischen Genen (Tnf-α; Graph oben; Il-6; Graph unten) mittels qRT-PCR
untersucht. Dargestellt ist die relative Veränderung der Genexpression, die in zwei unabhängigen
Experimenten gemessen werden konnte. Der mRNA-Gehalt aus nicht elektroporierten (unbehandelt),
nicht stimulierten Zellen diente hierbei als Referenzwert und die Werte aus den unterschiedlichen
Ansätzen wurden auf den Hprt-1-mRNA-Gehalt normalisiert. (C) 24 h nach Elektroporation wurden
KM-MΦ mit E.coli HB101 infiziert (MOI 10). 2 h und 24 h nach Infektion wurden die Zellen lysiert und
auf Agarplatten ausplattiert, um die Anzahl der intrazellulären Bakterien zu bestimmen. Der linke
Graph zeigt die Anzahl der Kolonie-bildenden Einheiten (KBE) pro ml, die 2 h nach Infektion in den
Zellen festgehalten werden konnte. Der Graph auf der rechten Seite zeigt den relativen Anteil der
Bakterien, der 24 h nach Infektion in Makrophagen überlebt hat, wobei folgende Berechnung zu
diesem Wert führte: % überlebende Bakterien = (KBE/ml (24 h) / KBE/ml (2 h)) x 100. Dargestellt sind
die Ergebnisse aus drei unabhängigen Experimenten; unbehandelt=nicht elektroporiert; mock=ohne
siRNA elektroporiert; ns-siRNA=mit unspezifischer siRNA elektroporiert. In allen Graphen ist jeweils
der Mittelwert+Standardabweichung angegeben.
- 32 -
Ergebnisse
Nachdem durch mehrere experimentelle Ansätze eine Beeinträchtigung der Viabiltät und
Funktion von Makrophagen durch den Transfer von siRNA-Molekülen mittels Elektroporation
ausgeschlossen werden konnte, wurde die Effizienz dieser Methode überprüft, die
Expression eines spezifischen Gens zu reduzieren. In den folgenden Untersuchungen
wurden siRNA-Moleküle verwendet, die eine Komplementarität bezüglich der mRNA des
Mapk1- bzw. CD86-Gens aufwiesen. Die Prozedur der Elektroporation verlief entsprechend
der vorhergehenden Analysen. Um die Wirkung der MAPK1-siRNA auf die Expression des
Gens, das für MAPK1 kodiert, zu beobachten, wurde sowohl der Mapk1 mRNA-Gehalt
innerhalb der unterschiedlichen Ansätze gemessen als auch die MAPK1 Proteinmenge
mittels Westernblot nachgewiesen. In Abbildung 2.6 A ist erkennbar, dass die Expression
des Mapk1 Gens als Folge der Elektroporation mit Mapk1-spezifischer siRNA signifikant
reduziert wurde. Dahingegen konnte keine signifikante Auswirkung des Prozesses der
Elektroporation (mock-Ansatz) oder der Transfektion mit unspezifischer siRNA (ns-siRNA) im
Vergleich zur nicht elektroporierten Kontrolle (unbehandelt) festgehalten werden. Passend zu
den Expressionsdaten konnte eine geringere Menge des MAPK1-Proteins lediglich innerhalb
der Zellen beobachtet werden, die mit zur Mapk1 mRNA sequenzkomplementären siRNAMolekülen behandelt wurden (Abbildung 2.6 B).
A
B
Abbildung 2.6: Das Einführen von siRNA in Makrophagen mittels Elektroporation führt zur
effizienten Unterdrückung der Expression der entsprechenden Gene. (A) KM-MΦ wurden mit
siRNA-Molekülen transfiziert, die eine Sequenzkomplementarität hinsichtlich des Mapk1-Gens
aufwiesen (MAPK1 siRNA). Als Kontrolle wurden in weiteren Ansätzen Zellen nicht elektroporiert
belassen (unbehandelt) oder in Ab- bzw. Anwesenheit von unspezifischer siRNA elektroporiert (mock
bzw. ns-siRNA). 24 h nach entsprechender Behandlung wurde der Gehalt der Mapk1-spezifischen
mRNA der Ansätze mittels qRT-PCR untersucht. Der Graph veranschaulicht die relative Expression
des Mapk1-Gens aus drei unabhängigen Experimenten (Mittelwert+Standardabweichung), wobei der
jeweilige Gehalt der Hprt-1-mRNA zur Normalisierung diente und das Expressionsniveau der nicht
elektroporierten Zellen als Referenzwert zur Berechnung der relativen Mapk1 Expression der
restlichen Proben diente. Die Signifikanzberechnung erfolgte mit Hilfe des Student´s t-test; p<0,05 = *,
ns = nicht signifikant. (B) 4 Tage nach Elektroporation wurden Zellextrakte hergestellt und die in den
Ansätzen enthaltene Menge des MAPK1-Proteins mit Hilfe des Westernblot-Verfahrens bestimmt. Die
Analyse des HSP90-Proteingehaltes ermöglichte die Kontrolle der gleichmäßigen Beladung.
- 33 -
Ergebnisse
Die Auswirkung der Elektroporation von Makrophagen mit siRNA-Molekülen spezifisch für
die mRNA des Oberflächenmoleküls CD86 wurde durch die Analyse des Gehaltes an CD86Molekülen auf der Oberfläche der entsprechend behandelten Makrophagen bestimmt. Das
kostimulatorische Molekül ist nur nach Aktivierung der Makrophagen mit einem
inflammatorischen Stimulus vermehrt auf der Zelloberfläche aufzufinden. Deshalb wurden
die Zellen nach Elektroporation mit LPS stimuliert und anschließend mit einem Fluoreszenzgekoppelten Antikörper, der gegen ein Epitop des CD86-Moleküls gerichtet war, inkubiert.
Anhand durchflusszytometrischer Analysen konnte gemäß der Erwartung eine Erhöhung der
Expression des Oberflächenmoleküls nach Stimulation mit LPS auf den Zellen festgehalten
werden, die entweder nicht elektroporiert belassen wurden (unbehandelt) oder in Ab- bzw.
Anwesenheit von unspezifischer siRNA (mock bzw. ns-siRNA) elektroporiert wurden
(Abbildung 2.7). Im Vergleich zu den Kontrollansätzen verminderte die Transfektion der
Zellen mit der gegen CD86 gerichteten siRNA den Gehalt des kostimulatorischen Moleküls
nach Stimulation der Zellen mit LPS (Abbildung 2.7).
A
B
Abbildung 2.7: Das Einführen von siRNA in Makrophagen mittels Elektroporation führt zur
effizienten Unterdrückung der Expression der entsprechenden Gene. KM-MΦ wurden mit CD86
siRNA elektroporiert. In Kontrollansätzen wurden Zellen nicht elektroporiert belassen (unbehandelt)
oder in Ab- bzw. Anwesenheit von unspezifischer siRNA elektroporiert (mock bzw. ns-siRNA). 24 h
nach Elekroporation wurde ein Teil der Zellen mit LPS (10 ng/ml) stimuliert. Nach weiteren 16 h wurde
die Expression des CD86 Moleküls an der Oberfläche der Zellen durch Zuhilfenahme eines
fluoreszierenden, CD86-spezifischen Antikörpers (CD86-APC) durchflusszytometrisch untersucht. (A)
Repräsentative Darstellung einer durchflusszytometrischen Analyse. Graue Linien veranschaulichen
die CD86-APC spezifische Fluoreszenzintensität nicht stimulierter Zellen, schwarze Linien
verdeutlichen die CD86-Expression nach LPS-Stimulation. % Max=prozentualer Anteil der maximalen
Ereignisanhäufung (Erklärung siehe Abschnitt 5.9) (B) mittlere Fluoreszenzintensität
(MFI)+Standardabweichung der einzelnen Ansätze aus fünf unabhängigen Experimenten. Die Daten
wurden anhand des Student´s t-test statistisch analysiert. * = unbehandelt vs CD86 siRNA, + = mock
vs CD86 siRNA, # = ns siRNA vs CD86 siRNA; jeweils p<0,05.
- 34 -
Ergebnisse
2.1.2
Auswirkung einer siRNA-vermittelten Unterdrückung der Aktivität von HIF-1α
auf die antibakterielle Kapazität von dendritischen Zellen und Makrophagen
Die vorherigen Analysen zeigten, dass die Transfektion von dendritischen Zellen (Jantsch et
al., 2008b) und Makrophagen (Wiese et al., 2009) mit siRNA-Molekülen durch
Elektroporation möglich ist und eine effiziente Unterdrückung der Expression der
entsprechenden Gene vermittelt. Deshalb wurde diese Methode für die Aufklärung der Rolle
des Hypoxie-induzierbaren Transkriptionsfaktors HIF-1α bei der Bekämpfung intrazellulärer
Bakterien verwendet. Aus dem Knochenmark von Mäusen gewonnene dendritische Zellen
und Makrophagen wurden mit siRNA-Molekülen, die eine Sequenzkomplementarität
bezüglich der mRNA des für HIF-1α kodierenden Gens vorwiesen, elektroporiert. Um
unspezifische Nebeneffekte der Elektroporation bzw. der Transfektion mit siRNA-Molekülen
zu erkennen, wurden zusätzlich nicht elektroporierte (unbehandelt) und in Anwesenheit von
unspezifischer siRNA (ns siRNA) elektroporierte Zellen in das Experiment eingeschlossen.
24 h nach Elektroporation erfolgte die Infektion der Zellen mit E.coli bzw. S.aureus. Durch die
Analyse des Gehaltes an Hif-1α mRNA-Molekülen 24 h nach Infektion wurde die Effizienz
und Spezifität der siRNA-vermittelten Verminderung der Expression des für HIF-1α
kodierenden Gens überprüft. Des Weiteren wurde anhand der Expressionanalyse von
Zielgenen (Phd2, Pgk1) des Transkriptionsfaktors die transkriptionelle Aktivität von HIF-1α
nachgewiesen (Abbildung 2.8). Wie erwartet führte innerhalb der Zellen der Kontrollansätze
die Infektion mit E.coli zu einer verstärkten Expression des Hif-1α-Gens sowie zu einer
Erhöhung der Transkription der ausgewählten Zielgene. Dieser Anstieg war in den Zellen,
die mit Hif-1α-spezifischer siRNA transfiziert wurden, nicht erkennbar (Abbildung 2.8). Eine
leichte Erhöhung der Expression des für HIF-1α kodierenden Gens konnte ebenfalls nach
Infektion der Zellen mit S.aureus beobachtet werden. Passend zu den in Abbildung 2.1
gezeigten Daten war hinsichtlich der Expression eines HIF-1α-spezifischen Zielgens (Pgk1)
die S.aureus-vermittelte Induktion unter normoxischen Bedingungen sehr schwach
ausgeprägt. Unter hypoxischen Bedingungen konnte jedoch eine robuste Erhöhung der
Zielgenexpression nachgewiesen werden, die in etwa der Induktionsrate in hypoxischen,
nicht infizierten Zellen glich. Wurden die Zellen mit gegen Hif-1α gerichteten siRNAMolekülen transfiziert, wurde sowohl die Expression des Hif-1α-Gens als auch die Induktion
der Transkription des HIF-1α-Zielgens unterdrückt (Abbildung 2.8).
- 35 -
Ergebnisse
KM-DZ
KM-MΦ
Abbildung 2.8: Die Elektroporation von dendritischen Zellen und Makrophagen mit Hif-1αspezifischer siRNA führt zur Unterdrückung der Aktivität des Hypoxie-induzierbaren
Transkriptionsfaktors HIF-1α. KM-DZ und KM-MΦ wurden mit Hif-1α-spezifischen siRNA-Molekülen
elektroporiert. Um unspezifische Nebeneffekte festzustellen, wurden Zellen mit unspezifischer siRNA
transfiziert (ns siRNA) bzw. nicht elektroporiert belassen (unbehandelt). 24 h nach Elektroporation
erfolgte die Infektion mit E.coli bzw. S.aureus. Nach weiteren 24 h wurde die Expression des für HIF1α kodierenden Gens sowie der mRNA-Gehalt unterschiedlicher HIF-1α-Zielgene (Pgk1, Phd2) mittels
qRT-PCR untersucht. Dargestellt ist die relative Expression der Gene, wobei die Expression
normoxischer, nicht elektroporierter, nicht infizierter Zellen gleich 1 gesetzt wurde. Des Weiteren
diente die Expression des „house-keeping“-Gens Hprt-1 als Referenz zur Normalisierung der Werte.
Die einzelnen Graphen veranschaulichen die zusammengefassten Ergebnisse (Mittelwert+SEM =
„standard mean of error“) aus mindestens 3 unabhängigen Experimenten. Die Berechnung der
Signifikanz erfolgte mittels des Student´s t-test; * =p<0,05, ** p<0,01.
- 36 -
Ergebnisse
Um zu ermitteln, ob eine verminderte Aktivität des Transkriptionsfaktors die antibakterielle
Kapazität von dendritischen Zellen und Makrophagen beeinflusst, wurden die Zellen 24 h
nach Elektroporation mit E.coli bzw. S.aureus infiziert. Da eine Infektion der Zellen mit E.coli
sowohl unter normoxischen als auch hypoxischen Bedingungen zu einer vergleichbaren HIF1α-Aktivierung führte (Abbildung 2.1), wurde angenommen, dass sich ein Verlust der HIF-1αAktivität bei der Abwehr von E.coli bereits unter normoxischen Bedingungen auswirken
müsste. Im Gegensatz dazu ließen die erhobenen Daten hinsichtlich der normoxischen HIF1α Stabilisierung und der Expression der HIF-1α-spezifischen Zielgene nach Infektion mit
S.aureus die Schlussfolgerung zu, dass das hypoxische HIF für die Beseitigung des Grampositiven Bakteriums von größerer Bedeutung sein könnte. Deshalb wurden die
elektroporierten Zellen nach Behandlung mit E.coli normoxischen Bedingungen ausgesetzt,
während nach Infektion mit S.aureus die Inkubation der Zellen unter normoxischen bzw.
hypoxischen (0,5 % O2) Bedingungen verlief. Zur Bestimmung der antibakteriellen Kapazität
wurden die Zellen 2 h und 24 h nach Infektion lysiert. Durch das Ausbringen der Lysate auf
Agarplatten konnte der Gehalt intrazellulärer Bakterien bestimmt werden. In Abbildung 2.9 ist
der prozentuale Anteil der Bakterien veranschaulicht, der im Vergleich zur Bakterienmenge,
die 2 h nach Infektion ermittelt wurde, 24 h nach Infektion in dendritischen Zellen bzw.
Makrophagen detektiert werden konnte. Nach Infektion mit E.coli wurde der relative Anteil
intrazellulärer
Bakterien
in
dendritischen
Zellen
durch
keine
der
durchgeführten
Behandlungen signifikant verändert (Abbildung 2.9 A). Durch die Ermittlung der
überlebenden Bakterien in Makrophagen konnte ebenfalls kein Hinweis auf eine signifikante
Beeinflussung der antibakteriellen Kapazität der Zellen gegenüber E.coli erhalten werden,
die auf eine siRNA-vermittelte Reduktion der Expression des Hif-1α Gens zurückgeführt
werden konnte (Abbildung 2.9 B). Die gleiche Schlussfolgerung ergab sich nach der
Untersuchung der antibakteriellen Kapazität von dendritischen Zellen und Makrophagen
gegenüber dem Gram-positiven Bakterium S.aureus (Abbildung 2.9 C,D). Sowohl unter
normoxischen als auch hypoxischen Bedingungen erwies sich die Überlebensrate
intrazellulärer Bakterien als unbeeinflusst durch den Verlust der Aktivität des Hypoxieinduzierbaren Transkriptionsfaktors HIF-1α. In Makrophagen führte zwar die Elektroporation
der Zellen mit unspezifischer siRNA zu einer Beeinträchtigung der Eliminierung von
S.aureus, jedoch wurde dieser Effekt nicht weiter durch die Transfektion der Zellen mit HIF1α-siRNA verändert. Deshalb scheint dieser Befund durch einen unspezifischen Nebeneffekt
der Elektroporation mit siRNA-Molekülen verursacht worden zu sein. Während der Verlust
der Aktivität von HIF-1α keine signifikanten Änderungen hinsichtlich der Bekämpfung
intrazellulärer Bakterien hervorrief, führte die Inkubation der Zellen unter hypoxischen
Bedingungen zu einer deutlichen Erhöhung der Überlebensrate von S.aureus. Auch diese
Beobachtung erwies sich als unabhängig von der Aktivität des Transkriptionsfaktors HIF-1α.
- 37 -
Ergebnisse
Zusammenfassend scheint die Aktivität des Transkriptionsfaktors HIF-1α für die Eliminierung
von
E.coli
und
S.aureus
sauerstoffabhängige,
nicht
notwendig
HIF-1α-unabhängige
zu
sein.
Regulation
der
Jedoch
ergab
antibakteriellen
sich
eine
Kapazität
myeloischer mononukleärer Immunzellen. Der Aufklärung dieses Phänomens wird in den
nachfolgenden Kapiteln näher nachgegangen.
A
C
B
D
Abbildung 2.9: Auswirkung einer verminderten HIF-1α-Aktivität auf die antibakterielle Kapazität
myeloischer mononukleärer Zellen. KM-DZ und KM-MΦ wurden mit Hif-1α–spezifischer siRNA
elektroporiert. Als Kontrolle wurden Zellen entweder nicht elektroporiert belassen (unbehandelt) bzw.
mit unspezifischer siRNA behandelt (ns siRNA). 24 h nach Transfektion wurden die Zellen mit E.coli
bzw. S.aureus infiziert (MOI 10). (A), (B) Nach Infektion mit E.coli wurden die Ansätze in der Normoxie
für weitere 24 h gehalten. (C), (D) Die mit S.aureus infizierten Zellen wurden entweder unter
normoxischen (N) oder hypoxischen (H) Bedingungen (0,5 % O2) inkubiert. 2 h und 24 h nach
Infektion wurden die Zellen lysiert, um den Gehalt intrazellulärer Bakterien zu bestimmen. Der in den
Graphen dargestellte prozentuale Anteil intrazellulärer Bakterien wurde anhand dieser Gleichung
errechnet: (KBE/ml (24 h) / KBE/ml (2 h)) x 100. (KBE/ml=Kolonie-bildende Einheiten pro ml);
Dargestellt sind die Ergebnisse (Mittelwert+SEM) aus mindestens 4 unabhängigen Experimenten
(siehe n-Zahl über jeweiligem Graphen). Die statistische Auswertung erfolgte über den Student´s ttest; ns = nicht signifikant.
- 38 -
Ergebnisse
2.2
Auswirkung von Hypoxie auf die antibakterielle Kapazität von dendritischen
Zellen und Makrophagen
Im Rahmen des zeitlichen Verlaufes einer Infektion in vivo erscheint es möglich, dass
zunächst bakterielle Bestandteile, wie zum Beispiel LPS, die Stabilisierung von HIF-1α in den
am Infektionsort befindlichen Immunzellen bewirkt, bevor sich die Umgebungsbedingungen
am Infektionsherd ändern. So könnte erst nach der Akkumulation von HIF-1α eine
Entzündungsreaktion induziert werden, die vermittelt über Mikrothrombosen, Veränderung
des Gefäßtonus und die vermehrte Aktivität und Rekrutierung weiterer Abwehrzellen eine
Gewebshypoxie hervorrufen könnte. Da dementsprechend die Immunzellen bei der
Bekämpfung infektiöser Mikroorganismen einem Sauerstoffentzug ausgesetzt sind, sollte in
dieser Arbeit die Auswirkung dieser Änderung der Umgebungsbedingungen untersucht
werden. Hierfür wurden dendritische Zellen und Makrophagen mit einem Gram-negativen
(E.coli) und Gram-positiven (S.aureus) Bakterienstamm infiziert, wobei die Menge der auf die
Zellen gegebenen Bakterien der zehnfachen Wirtszellzahl entsprach (=MOI 10). 2 h nach
Infektion wurden die Zellen normoxischen bzw. hypoxischen (0,5 % O2) Bedingungen
ausgesetzt. Um den Effekt einer Reoxygenierung zu beobachten, wurden die Zellen
zunächst in der Hypoxie gehalten und 8 h nach Infektion normoxischen Bedingungen
zugeführt, wobei diese bis zum Ende des Experimentes beibehalten wurden.
Abbildung 2.10: Hypoxie beeinträchtigt
die antibakterielle Kapazität myeloischer
Zellen. Aus dem Knochenmark von Mäusen
gewonnene dendritische Zellen (KM-DZ)
und Makrophagen (KM-MΦ) wurden mit
E.coli oder S.aureus (MOI 10) infiziert. 2 h
nach Infektion und nach gründlicher
Entfernung extrazellulärer Bakterien wurden
die
Zellen
normoxischen (N)
bzw.
hypoxischen (H) Bedingungen (0,5 % O2)
ausgesetzt. Für den Reoxygenierungsansatz (Re) wurden die Zellen für 8 h
hypoxischen Bedingungen ausgesetzt und
für den Rest des Experimentes in Normoxie
gehalten. 2 h und 24 h nach Infektion
wurden die Zellen lysiert und die darin
enthaltenen Kolonie-bildenden Einheiten pro
ml (KBE/ml) bestimmt. Dargestellt ist der
prozentuale Anteil der Bakterien, der nach
24 h in den Zellen überlebt hat. Dieser Wert
wurde folgendermaßen berechnet:
% überlebende Bakterien:
(KBE/ml (24 h) / KBE/ml (2 h)) x 100
Die Graphen zeigen den Mittelwert+SEM
aus mindestens 5 unabhängigen Experimenten (siehe rechts angegebene n-Zahl).
Die Signifikanzberechnung erfolgte anhand
des Student´s t-test; * =p<0,05, ** =p<0,01,
*** = p<0,001.
- 39 -
Ergebnisse
Die Bestimmung der Zahl der 2 h nach Infektion von den Zellen phagozytierten Bakterien
sowie der 24 h nach Infektion in den Zellen überlebenden Bakterien ließ die Berechnung des
prozentualen Anteils überlebender Bakterien zu. Dies diente als Maß zur Bestimmung der
antibakteriellen Kapazität der Zellen zu den gegebenen Bedingungen.
In Abbildung 2.10 ist zu erkennen, dass die Anzahl der überlebenden Bakterien durch
hypoxische Inkubation der Zellen anstieg. Wurden die Zellen reoxygeniert, entsprach der
Gehalt intrazellulärer Bakterien in etwa dem, der unter normoxischen Bedingungen
festgehalten werden konnte. Basierend auf dieser Beobachtung scheint ein Sauerstoffentzug
das Überleben phagozytierter Bakterien zu begünstigen, wobei dieser Effekt umgekehrt
werden kann, wenn den Zellen wieder eine ausreichende Menge Sauerstoff zugeführt wird.
2.2.1
Untersuchung des bakteriellen Wachstums unter hypoxischen Bedingungen
Die höhere Überlebensrate phagozytierter Bakterien als Folge eines Sauerstoffentzuges
kann auf unterschiedliche Art und Weise begründet sein. Zum einen könnte die
intraphagosomale
Proliferationsrate
der
Bakterien
unter
hypoxischen
Bedingungen
ansteigen, sodass die antimikrobiellen Wirtszellmechanismen partiell kompensiert werden.
Dies würde netto zu einem Anstieg der Anzahl überlebender Bakterien führen. Auf der
anderen Seite könnte der beobachtete Hypoxiephänotyp auf einer eingeschränkten
antibakteriellen Kapazität der Wirtszellen beruhen oder sich aus einer Kombination beider
möglichen Erklärungen ergeben. Die Analyse des bakteriellen Verhaltens unter den
ausgewählten Umgebungsbedingungen sollte bei der Aufklärung der Ursache des HypoxiePhänomens helfen.
2.2.1.1 Analyse des bakteriellen Wachstums in Abwesenheit von Wirtszellen
Zunächst wurde die Wachstumsrate von E.coli und S.aureus in Abwesenheit von Wirtszellen
(myeloischen Zellen) untersucht. Hierfür wurde eine über Nacht angezogene Suspension der
beiden Bakterienstämme in Zellkulturmedium (ohne Antibiotika) auf eine Bakteriendichte, die
der in den Infektionsversuchen verwendeten entsprach, eingestellt (10 mio Bakterien/ml).
Um sich den Bedingungen der Infektionsversuche weiter zu nähern, wurden diese
Suspensionen in Zellkulturplatten stehend entweder unter normoxischen oder hypoxischen
Bedingungen inkubiert. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten wurde ein Probensatz seriell
verdünnt und ausplattiert, um die Anzahl der Kolonie-bildenden Einheiten zu bestimmen.
- 40 -
Ergebnisse
Wachstum von S.aureus
Wachstum von E.coli
1E+12
1E+11
1E+11
1E+10
1E+10
KBE/ml
KBE/ml
1E+09
1E+08
1E+07
1E+09
1E+08
1E+07
Normoxie
Hypoxie
1000000
Normoxie
Hypoxie
1000000
100000
100000
0
4
6
t in h
24
0
4
6
24
t in h
Abbildung 2.11: Effekt von Hypoxie auf das bakterielle Wachstum. Eine über Nacht
herangezogene Kultur von E.coli bzw. S.aureus wurde in gleicher Weise wie vor einem
Infektionsversuch in Zellkulturmedium verdünnt. Die verdünnten Suspensionen wurde anschließend
stehend unter normoxischen bzw. hypoxischen Bedingungen inkubiert. Zu den angegebenen
Zeitpunkten wurde ein Teil der Bakterienkulturen auf Agarplatten ausgebracht, um die Koloniebildenden Einheiten in den jeweiligen Ansätzen zu bestimmen. Gezeigt sind die Kolonie-bildenden
Einheiten (KBE) pro ml für jeden untersuchten Zeitpunkt, wobei die Zusammenfassung aus drei
unabhängigen Experimenten gegeben ist (Mittelwert+Standardabweichung). t in h = Zeit in Stunden.
In Abbildung 2.11 ist erkennbar, dass das Wachstum von normoxischen und hypoxischen
Bakterien ähnlich verlief, wobei die Proliferationsrate durch einen Sauerstoffentzug im
Vergleich zu dem Wachstumsverlauf unter normoxischen Bedingungen tendenziell
beeinträchtigt erschien. Dieses Ergebnis ließ vermuten, dass die höhere Überlebensrate von
E.coli und S.aureus in myeloischen mononukleären Zellen unter hypoxischen Bedingungen
nicht durch eine gesteigerte bakterielle Proliferationsrate hervorgerufen wird.
- 41 -
Ergebnisse
2.2.1.2 Analyse des bakteriellen Wachstums innerhalb myeloischer mononukleärer
Zellen
Basierend auf dem bakteriellen Wachstum außerhalb der Zellen wurde die Hypothese, dass
die höhere Anzahl überlebender Bakterien in hypoxischen myeloischen Zellen auf einer
dementsprechend erhöhten bakteriellen Proliferationsrate beruht, in Frage gestellt. Jedoch
spiegelten die Bedingungen des Experimentes nicht die intraphagosomalen Gegebenheiten
wider.
Deshalb
war
intraphagosomalen
zur
Bestätigung
Teilungsaktivität
der
der
Schlussfolgerung
Bakterien
notwendig.
die
Dies
Analyse
wurde
der
durch
experimentelle Methoden ermöglicht, mit denen die Teilungsrate von Erregern innerhalb der
Wirtszellen anhand einer Verdünnung fluoreszierender Moleküle dargestellt werden konnte.
Mit Hilfe dieser Methoden konnte die bakterielle Proliferation durchflusszytometrisch
untersucht werden.
Überprüfung
einer
Methode
zur
durchflusszytometrischen
Analyse
der
Teilungsaktivität von E.coli
Für die Analyse der Teilungsaktivität von E.coli wurde eine Methode verwendet, die in einer
Publikation von Helaine et al. (2010) vorgestellt wurde. In dieser Studie wurde gezeigt, dass
die bakterielle Proliferation mit Hilfe eines Reporterplasmides (pDiGc) analysiert werden
kann. Dieses Plasmid kodiert zum einen für ein konstitutiv exprimiertes GFP („green
fluorescent protein“) und zum anderen für ein rot fluoreszierendes DsRed Protein, dessen
Synthese unter der Kontrolle eines Arabinose-induzierbaren Promotors steht. Wurde die
DsRed Proteinsynthese der Bakterien mittels Inkubation in Arabinose-haltigem Medium
angeregt und anschließend durch eine Überführung in Arabinose-freies Medium angehalten,
konnte die Teilungsaktivität der Bakterien durchflusszytometrisch anhand der Abnahme der
für DsRed spezifischen Fluoreszenzintensität verfolgt werden (Helaine et al., 2010). Dies
beruht auf einer gleichmäßigen Verteilung der vorhandenen DsRed Proteine auf die
Tochterzellen, wodurch die Fluoreszenzintensität der DsRed Proteine relativ zur Zahl der
Bakterien abnimmt. Um zu überprüfen, ob diese Methode zur Analyse der Teilungsrate des
in der vorliegenden Arbeit verwendeten E.coli Stammes geeignet ist, wurde der
Bakterienstamm (E.coli HB101) mit dem pDiGc Plasmid transformiert. Der entstandene
Bakterienstamm wurde als E.coli pDiGc bezeichnet. Anschließend wurden die Bakterien
über Nacht in Arabinose-haltigem Medium inkubiert. Am nächsten Tag wurde die
Bakteriensuspension in Arabinose-freies Medium überführt und normoxischen bzw.
hypoxischen Bedingungen ausgesetzt. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten wurde die DsRed
spezifische Fluoreszenzintensität der Bakterien durchflusszytometrisch untersucht.
- 42 -
Ergebnisse
A
B
Wachstum E.coli pDiGc
1,00E+08
KBE/ml
1,00E+07
1,00E+06
Normoxie
Hypoxie
1,00E+05
0
2
4
6
t in h
Abbildung 2.12 Analyse der Proliferation von E.coli anhand des pDiGc Plasmides. Eine Kultur
des E.coli Stammes, der mit dem Plasmid pDiGc transformiert wurde (E.coli pDiGc), wurde ÜN in
Arabinose-haltigem LB-Medium angezogen. Diese mit DsRed Protein angereicherte Suspension
wurde in Medium ohne Arabinose überführt, verdünnt und unter normoxischen bzw. hypoxischen
Bedingungen inkubiert. (A) Zu den angegebenen Zeitpunkten wurde die Menge des in den Ansätzen
enthaltenen DsRed Proteins relativ zur Bakterienzahl anhand der DsRed-spezifischen
Fluoreszenzintensität mit Hilfe des Durchflusszytometers festgehalten (B) Des Weiteren wurde ein Teil
der Kulturen auf Agarplatten ausgebracht, um die Kolonie-bildenden Einheiten (KBE) der jeweiligen
Ansätze zu bestimmen. t in h = Zeit in Stunden; N= Normoxie; H= Hypoxie; % Max = prozentualer
Anteil der maximalen Ereignisanhäufung (Erklärung siehe Abschnitt 5.9); KBE/ml= Kolonie-bildende
Einheiten pro ml.
In Abbildung 2.12 A ist zu erkennen, dass die über Nacht in Arabinose-haltigem Medium
angezogene
Bakteriensuspension
des
E.coli
pDiGc-Stammes
eine
hohe
DsRed-
Fluoreszenzintensität aufwies (rote Linie; Aufnahme am Zeitpunkt 0 h). Nach Überführung
dieser Suspension in Arabinose-freie Bedingungen war im Laufe einer Inkubation unter
normoxischen
bzw.
hypoxischen
Bedingungen
eine
Aufteilung
in
unterschiedliche
Bakterienpopulationen erkennbar, wobei die Fluoreszenzintensität relativ zur Bakterienzahl
abnahm. Dieser Befund war begleitet durch eine Erhöhung der Kolonie-bildenden Einheiten
(Abbildung 2.12 B). Da unter Arabinose-freien Bedingungen keine Neusynthese von DsRedProteinen stattfindet, ist die beobachtete Verminderung der DsRed-Fluoreszenzintensität auf
eine teilungsabhängige Verringerung des DsRed-Proteingehaltes relativ zur Zahl der
Bakterien zurückzuführen. Mit diesem Experiment wurde bestätigt, dass die Untersuchung
der Proliferation von E.coli anhand des Reporterplasmides pDiGc möglich ist.
- 43 -
Ergebnisse
Untersuchung der Teilungsaktivität von E.coli innerhalb myeloischer mononukleärer
Zellen
Um nun die Teilungsrate von E.coli nach Aufnahme in dendritische Zellen und Makrophagen
zu analysieren, wurde vor der Infektion der Zellen eine Übernachtkultur des pDiGc-tragenden
E.coli Stammes in Arabinose-haltigem Medium angezogen, sodass der Gehalt an DsRed
Protein innerhalb der Bakterien vor Beginn des Experimentes sehr hoch war. Anschließend
wurden die Bakterien unter Arabinose-freien Bedingungen in Makrophagen und dendritische
Zellen eingebracht. 2 h nach Infektion und nach gründlicher Beseitigung extrazellulärer
Bakterien wurden die Zellen normoxischen bzw. hypoxischen Bedingungen ausgesetzt. Der
DsRed-Gehalt der phagozytierten Bakterien wurde zu unterschiedliche Zeitpunkten nach
Infektion betrachtet. Hierfür wurden die Zellen lysiert und die DsRed-spezifische
Fluoreszenzintensität der in den Zelllysaten enthaltenen Partikel, die eine Bakterien-ähnliche
Größe vorwiesen, bestimmt. Die konstitutive GFP-Expression des Bakterienstammes diente
während der durchflusszytometrischen Analysen als Merkmal zur Unterscheidung zwischen
Zelldebris und Bakterien (Abbildung 2.13 B). In einem parallelen Ansatz wurde bei jedem
Infektionsexperiment als Kontrolle der Zuverlässigkeit der Methode die zeitabhängige
Abnahme der DsRed-Fluoreszenzintensität in einer wachsenden Suspension der zur
Infektion verwendeten Bakterien überprüft (Abbildung 2.13 C).
- 44 -
Ergebnisse
A
B
C
Abbildung 2.13: Untersuchung des Wachstums von E.coli innerhalb mononukleärer
myeloischer Zellen. KM-DZ und KM-MΦ wurden mit einer über Nacht in Arabinose-haltigem Medium
angezogenen Suspension des E.coli pDiGc-Stammes infiziert (MOI 10). Die Infektion verlief unter
Arabinose-freien Bedingungen. 2 h nach Infektion wurden die Zellen normoxischen (N) bzw.
hypoxischen (H) Bedingungen ausgesetzt. (A) Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden die Zellen
lysiert. Anhand durchflusszytometrischer Analysen wurde der DsRed-Gehalt der intrazellulären
Bakterien bestimmt. (B) Dabei diente die konstitutive GFP-Expression zur Unterscheidung zwischen
Wirtszelldebris und Bakterien. Deshalb wurde die Analyse der DsRed Fluoreszenzintensität auf GFPpositive Partikel beschränkt (C) Zur Kontrolle der teilungsabhängigen Verdünnung des DsRed
Proteins wurde die Suspension, die für die Infektion verwendet wurde, ohne Wirtszellen unter
normoxischen Bedingungen inkubiert. Wie erwartet konnte nach 6 h eine Verringerung der DsRedFluoreszenzintensität in den Bakterien beobachtet werden. Gezeigt ist ein repräsentatives Ergebnis
aus 3 unabhängigen Experimenten. % Max = prozentualer Anteil der maximalen Ereignisanhäufung.
Während in der Kontrollsuspension, wie erwartet, eine zeit- und teilungsabhängige
Verminderung des DsRed-Gehaltes in den Bakterien festzustellen war (Abbildung 2.13 C),
konnte über einen Zeitraum von 24 h keine Änderung der DsRed-Fluoreszenzintensität
phagozytierter Bakterien festgehalten werden (Abbildung 2.13 A). Des Weiteren ergab sich
kein Unterschied hinsichtlich des DsRed-Gehaltes der Bakterien, die aus hypoxisch oder
normoxisch inkubierten Wirtszellen isoliert wurden (Abbildung 2.13 A). Deshalb konnte eine
sauerstoffabhängige Teilung von E.coli innerhalb dendritischer Zellen und Makrophagen
ausgeschlossen werden.
- 45 -
Ergebnisse
Überprüfung
einer
Methode
zur
durchflusszytometrischen
Analyse
der
Teilungsaktivität von S.aureus
Aufgrund der geringen Erfahrung in einer zuverlässigen Methode der Transformation von
S.aureus wurde für die Analyse des intrazellulären Wachstumsverhaltens
dieses
Bakterienstammes eine zu dem Reporterplasmid pDiGc alternative Methode angewendet.
Das fluoreszierende Molekül CFSE (Carboxyfluorescein Diacetat Succinimidyl Ester) findet
häufig Anwendung in der Untersuchung von Teilungsraten von Zellen, wie z.B. Lymphozyten
(Lyons, 1999). Dieses Molekül kann Zellmembranen mittels passiver Diffusion durchqueren
und bindet intrazellulär kovalent an zytoplasmatische Proteine. Eine Teilungsaktivität
innerhalb einer CFSE-markierten Zellpopulation führt zu einer Verteilung der CFSE-Moleküle
auf die Tochterzellen. Dies resultiert in einer Verringerung der CFSE-Fluoreszenz relativ zur
Zellzahl. Da in einer Studie gezeigt werden konnte, dass auch Bakterien mit CFSE markiert
werden können ohne eine Einschränkung der Viabilität der Bakterien zu verursachen,
(Tuominen-Gustafsson et al., 2006) sollte in der vorliegenden Arbeit anhand der
teilungsabhängigen Verdünnung des CFSE-Moleküls das Wachstum von S.aureus analysiert
werden. Wie Abbildung 2.14 A veranschaulicht, führte die Inkubation einer mit CFSE
markierten Suspension von S.aureus sowohl unter hypoxischen als auch normoxischen
Bedingungen
zu
einer
zeitabhängigen
Verminderung
der
CFSE-spezifischen
Fluoreszenzintensität innerhalb der Bakterien. Da diese Beobachtung einherging mit einer
entsprechenden Erhöhung der Anzahl Kolonie-bildender Einheiten (Abbildung 2.14 B),
erwies sich die Methode der Einfärbung von S.aureus mit CFSE als geeignet, um das
intrazelluläre Verhalten dieses Bakteriums zu untersuchen.
- 46 -
Ergebnisse
A
B
Abbildung 2.14: Darstellung der Proliferation von S.aureus durch Markierung mit CFSE. Eine
ÜN-Kultur von S.aureus wurde mit CFSE markiert. Nach Verdünnung dieser Suspension erfolgte
deren Inkubation unter normoxischen bzw. hypoxischen Bedingungen. (A) Zu den angegebenen
Zeitpunkten wurde die CFSE-Fluoreszenzintensität der einzelnen Ansätze durchflusszytometrisch
vermessen. (B) Zusätzlich wurde ein Teil der Ansätze auf MH-Agarplatten ausgebracht, um die
Kolonie-bildenden Einheiten (KBE) zu ermitteln. t in h = Zeit in Stunden; N=Normoxie; H=Hypoxie. %
Max = prozentualer Anteil der maximalen Ereignisanhäufung; KBE/ml=Kolonie-bildende Einheiten pro
ml.
Untersuchung
der
Teilungsaktivität
von
S.aureus
innerhalb
myeloischer
mononukleärer Zellen
Für die Analyse der intrazellulären Teilungsaktivität von S.aureus wurden dendritische Zellen
und Makrophagen mit einer CFSE-markierten Suspension von S.aureus infiziert und unter
normoxischen bzw. hypoxischen Bedingungen gehalten. Zu den angegebenen Zeitpunkten
wurden die intrazellulären Bakterien durch Zelllyse aus den Zellen befreit. Die Zelllysate
wurden anschließend mit einem gegen S.aureus gerichteten Antikörper inkubiert, dessen
Bindung
mit
einem
fluoreszierenden
Zweitantikörper
(Fluorochrom:
Alexa
647)
nachgewiesen wurde. Somit wurde sichergestellt, dass in der durchflusszytometrischen
Analyse der CFSE-spezifischen Fluoreszenzintensität nur die intrazellulären Bakterien
untersucht wurden (Abbildung 2.15 B). Parallel zu jedem Infektionsexperiment wurde als
Kontrolle der Zuverlässigkeit der Methode die zeitabhängige Verdünnung der CFSEFluoreszenzintensität innerhalb der zur Infektion verwendeten Bakteriensuspension in einer
- 47 -
Ergebnisse
getrennten Kultur überprüft, die zwar in Zellkulturmedium, jedoch ohne Wirtszellen unter
normoxischen Bedingungen inkubiert wurde (Abbildung 2.15 C).
A
unmarkierte Bakterien
B
C
unmarkierte Bakterien
Abbildung 2.15: Untersuchung des Wachstums von S.aureus innerhalb myeloischer
mononukleärer Zellen. KM-DZ und KM-MΦ wurden mit einer CFSE-markierten S.aureus-Suspension
infiziert (MOI 10). 2 h nach Infektion wurden die Zellen normoxischen (N) bzw. hypoxischen (H)
Bedingungen ausgesetzt. (A) Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden die Zellen lysiert. Anhand
durchflusszytometrischer Analysen wurde die CFSE-Fluoreszenzintensität der intrazellulären
Bakterien bestimmt. (B) Dabei diente die vorhergehende Einfärbung der Lysate mit einem gegen
S.aureus gerichteten Antikörper zur Unterscheidung zwischen Wirtszelldebris und Bakterien. Da die
Bindung des Antikörpers mit einem sekundären Antikörper nachgewiesen wurde, der das Fluorochrom
Alexa 647 trug, wurde die Analyse der CFSE-Fluoreszenzintensität auf Alexa 647-positive Partikel
beschränkt. (C) Zur Kontrolle der teilungsabhängigen Verdünnung der CFSE-Moleküle wurde die
Suspension, die für die Infektion verwendet wurde, ohne Wirtszellen unter normoxischen Bedingungen
inkubiert. Wie erwartet konnte nach 6 h eine Verringerung der CFSE-Fluoreszenzintensität innerhalb
der Bakterien beobachtet werden. Gezeigt ist ein repräsentatives Ergebnis aus 3 unabhängigen
Experimenten. % Max = prozentualer Anteil der maximalen Ereignisanhäufung.
Da in der Kontrollsuspension die Bakterien uneingeschränkt wachsen konnten, ergab sich
bei der durchflusszytometrischen Analyse ein zeitabhängiger Verdünnungseffekt auf die
Fluoreszenzintensität der CFSE-Moleküle über die gesamte Population (Abbildung 2.15 C).
Dahingegen konnte keine (sauerstoffabhängige) Änderung der Verteilung der CFSEMoleküle innerhalb der Gesamtmenge der über einen Zeitraum von 24 h aus dendritischen
Zellen und Makrophagen isolierten phagozytierten Bakterien beobachtet werden (Abbildung
2.15 A). Folglich findet weder in dendritischen Zellen noch in Makrophagen eine
(sauerstoffabhängige) intrazelluläre Teilungsaktivität von S.aureus statt.
- 48 -
Ergebnisse
2.3
Einfluss
von
Hypoxie
auf
die
Produktion
reaktiver
Stickstoff-
und
Sauerstoffspezies
Eine intrazelluläre Proliferation der beiden ausgewählten Bakterienstämme konnte weder
unter normoxischen noch hypoxischen Bedingungen nachgewiesen werden. Deshalb wurde
die Schlussfolgerung gezogen, dass die sauerstoffabhängige Änderung der Anzahl
überlebender Bakterien in dendritischen Zellen und Makrophagen auf entsprechend
modulierten
antibakteriellen
Abwehrfunktionen
der
Wirtszellen
beruht.
Zu
den
Abwehrmechanismen, die durch einen Sauerstoffentzug beeinflusst werden könnten, zählt
die Produktion reaktiver Stickstoffspezies. Der Nachweis der dafür verantwortlichen Aktivität
der induzierbaren NO-Synthase (NOS2) erfolgte durch die Bestimmung des Gehaltes an
Nitrit im Überstand infizierter Zellen. Wie in Abbildung 2.16 A anhand der Nitritkonzentration
im Zellüberstand gezeigt, induzierte die Infektion der Zellen mit E.coli die Aktivität der NOS2,
solange die infizierten Zellen einer Normoxie ausgesetzt waren. Dahingegen führte die der
Infektion mit E.coli folgende Inkubation der Zellen unter hypoxischen Bedingungen zu einer
deutlich verminderten Akkumulation von Nitrit im Zellüberstand. Dieser Hypoxie-Effekt erwies
sich als reversibel, da eine Reoxygenierung der Zellen den Nitritgehalt im Zellüberstand
wieder ansteigen ließ (Abbildung 2.16 A). Im Vergleich hierzu konnte nach Behandlung der
Zellen mit S.aureus unter keinen der untersuchten Bedingungen eine deutlich messbare
Anhäufung von Nitrit festgehalten werden (Abbildung 2.16 A). Die Analyse der in den
Wirtszellen enthaltenen Menge des NOS2-Proteins sollte aufklären, ob die beobachtete
Aktivität der NOS2 unter den gegebenen Bedingungen mit einer entsprechenden
intrazellulären Präsenz des Enzyms korreliert. In den Zellen, die mit E.coli inkubiert wurden,
konnte eine im Vergleich zu nicht infizierten Zellen erhöhte Menge des NOS2-Proteins
detektiert werden (Abbildung 2.16 B). Da sich die NOS2-spezifische Signalstärke als
unabhängig
von
der
Sauerstoffspannung,
die
die
Zellen
umgab,
erwies,
wurde
angenommen, dass die verringerte Aktivität des Enzyms als Folge eines Sauerstoffentzuges
auf einen Substratmangel und nicht auf einen reduzierten Enzymgehalt zurückzuführen ist.
Passend zu den gemessenen Konzentrationen von Nitrit löste die Infektion der Zellen mit
S.aureus keine Akkumulation der NOS2 aus (Abbildung 2.16 B).
- 49 -
Ergebnisse
A
B
NOS2 Proteingehalt in KM-DZ
NOS2 Proteingehalt in KM-MΦ
Abbildung 2.16: Hypoxie verringert die Aktivität der induzierbaren NO Synthase (NOS2). (A)
KM-DZ und KM-MΦ wurden mit E.coli bzw. S.aureus infiziert (MOI 10). 24 h nach Infektion wurde der
Nitritgehalt im Überstand der Zellen vermessen, um die Aktivität der NOS2 zu ermitteln. Dargestellt
sind die Ergebnisse aus mindestens drei unabhängigen Experimenten (Mittelwert+SEM). (B)
Proteinlysate wurden aus infizierten normoxischen und hypoxischen KM-DZ und KM-MΦ gewonnen.
Der NOS2-Proteingehalt der jeweiligen Proben wurde mittels Westernblot-Verfahren festgehalten. Die
statistische Auswertung der Daten erfolgte durch den Student´s t-test; *** = p<0,001; N=Normoxie;
H=Hypoxie; Re=Reoxygenierung.
Neben der Aktivität der NOS2 ist die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) auf eine
Verfügbarkeit von Sauerstoff angewiesen. Dieser Prozess wird vermittelt über die Aktivität
der phagozytären NAD(P)H-Oxidase (PHOX). Dieses Enzym überträgt Elektronen vom
Reduktionsäquivalent NAD(P)H auf Sauerstoff, wodurch Superoxid, das Ausgangsprodukt
vieler weiterer Sauerstoffspezies, entsteht. Der Nachweis dieser reaktiven Substanzen
erfolgte durch einen Fluoreszenzfarbstoff (CM-H2DCFDA), der aufgrund der Interaktion mit
ROS eine stärkere Fluoreszenzintensität aufweist. Dendritische Zellen und Makrophagen
wurden 24 h nach Infektion und Inkubation unter normoxischen oder hypoxischen
Bedingungen mit dem genannten Fluoreszenzfarbstoff beladen. Daraufhin wurde der
intrazelluläre Gehalt an reaktiven Sauerstoffverbindungen durch durchflusszytometrische
Detektion der CM-H2DCFDA-Fluoreszenzintensität bestimmt.
- 50 -
Ergebnisse
A
B
C
D
Abbildung 2.17: Bestimmung der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies unter hypoxischen
Bedingungen. (A)-(D)Zur Überprüfung der Aktivität der PHOX wurde der Gesamtgehalt reaktiver
Sauerstoffspezies (ROS) innerhalb infizierter KM-DZ und KM-MΦ bestimmt. Hiefür wurden die Zellen
24 h nach Infektion mit dem ROS-sensitiven Farbstoff CM-H2DCFDA beladen. Dieser Farbstoff zeigt
nach Interaktion mit reaktiven Sauerstoffmolekülen eine höhere Fluoreszenzintensität. Um eine
Reoxygenierung zu verhindern, wurde der hypoxische Ansatz in der Hypoxiekammer gefärbt, wobei
alle benötigten Lösungen und Puffer an hypoxische Bedingungen äquilibriert wurden. Nach Fixierung
der Ansätze mit PFA wurde die Fluoreszenzintensität des Farbstoffes durchflusszytometrisch
analysiert. Rote Linien symbolisieren die ROS-Produktion infizierter hypoxischer Zellen, blaue Linien
die ROS-Produktion infizierter normoxischer Zellen. Grau hinterlegte Linien zeigen die ROS
Produktion uninfizierter Zellen nach Färbung mit CM-H2DCFDA.
% Max = prozentualer Anteil der maximalen Ereignisanhäufung (Erklärung siehe Abschnitt 5.9).
Dargestellt ist ein repräsentatives Ergebnis aus mindestens 3 unabhängigen Experimenten.
Die Infektion mit E.coli führte in beiden untersuchten myeloischen mononukleären Zellen zu
einer Erhöhung der Fluoreszenzintensität des ROS-sensitiven Farbstoffes, wenn die Zellen
nach Aufnahme der Gram-negativen Bakterien unter normoxischen Bedingungen kultiviert
wurden. Unter hypoxischen Bedingungen war eine deutlich verminderte CM-H2DCFDAFluoreszenzintensität und damit eine reduzierte ROS-Produktion zu beobachten. (Abbildung
2.17 A, B). Wurden die Zellen mit S.aureus behandelt, ergab sich eine vergleichbare
Regulation der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies in Makrophagen (Abbildung 2.17 D).
In dendritischen Zellen konnte 24 h nach Infektion mit S.aureus weder unter normoxischen
noch unter hypoxischen Bedingungen eine Verstärkung des Fluoreszenzsignals des CMH2DCFDA-Farbstoffes
beobachtet
werden
(Abbildung
2.17
C).
S.aureus
besitzt
unterschiedliche Mechanismen, um den Abwehrmechanismen von Wirtszellen zu entgehen.
Hierzu zählt die Expression der Katalase, ein Enzym, das Sauerstoffspezies neutralisiert
(Voyich et al., 2005; Cosgrove et al., 2007). Da der verwendete S.aureus Stamm eine
Katalase-Aktivität vorweist (Tu et al., 1976, Mitteilung der diagnostischen Abteilung der
- 51 -
Ergebnisse
Klinischen Mikrobiologie, Universitätsklinikum Erlangen) könnte diese Eigenschaft des
Bakteriums den intrazellulären Gehalt an ROS, der in dendritischen Zellen produziert wird, in
dem Maße neutralisieren, dass die Grenze der Sensitivität des Farbstoffes erreicht wird.
Dieser Effekt könnte in Makrophagen unterbleiben, da diese Zellen eine erhöhte Fähigkeit
aufweisen, einen sog. „oxidativen burst“ auszuführen (eigene Beobachtung). Diese
Besonderheit der Makrophagen konnte nach Infektion der Zellen mit E.coli anhand einer im
Vergleich zur Situation in dendritischen Zellen wesentlich deutlicheren Verschiebung des
normoxischen Fluoreszenzsignals erkannt werden (Abbildung 2.17 A vs B; blaue Linie).
Trotz
dieser
unerwarteten
Beobachtung
veranschaulichen
die
Ergebnisse
eine
Beeinträchtigung der ROS-Bildung unter hypoxischen Bedingungen.
Basierend auf den Befunden bezüglich eines sauerstoffabhängigen Gehaltes an reaktiven
Sauerstoff- und Stickstoffspezies, entstand die Vermutung, dass eine Verminderung der
Aktivität der PHOX oder NOS2 für die beeinträchtigte antimikrobielle Kapazität unter
hypoxischen Bedingungen verantwortlich sein könnte.
2.4
Beteiligung
der
sauerstoffabhängigen
induzierbaren
Regulation
NO-Synthase
der
(NOS2)
antibakteriellen
an
der
Kapazität
mononukleärer myeloischer Zellen
Um zu überprüfen, ob eine eingeschränkte Produktion von Stickstoffspezies die verringerte
Eliminierungsrate phagozytierter Bakterien in dendritischen Zellen und Makrophagen unter
hypoxischen Bedingungen verursacht, wurde die antibakterielle Kapazität NOS2-defizienter
Zellen untersucht. Hierfür wurden aus dem Knochenmark von Mäusen, die eine Deletion des
für NOS2 kodierenden Gens (Nos2) trugen, Makrophagen und dendritische Zellen generiert.
Nach Infektion der Zellen mit E.coli bzw. S.aureus und anschließender Inkubation der Zellen
unter normoxischen oder hypoxischen Bedingungen wurde die Überlebensrate intrazellulärer
Bakterien unter den angegebenen Gegebenheiten bestimmt. Zusätzlich zur Analyse der
antibakteriellen Kapazität wurde der Nitritgehalt im Überstand der Zellen ermittelt. Wie
erwartet konnte unter keinen Bedingungen eine Anreicherung von Nitrit und somit eine
NOS2-Aktivität in NOS2-defizienten Zellen festgehalten werden (Abbildung 2.18 E).
- 52 -
Ergebnisse
A
C
B
D
E
Abbildung 2.18: Auswirkung einer verminderten Aktivität der NOS2 auf die Eliminierung
-/phagozytierter Bakterien (A-D) KM-DZ und KM-MΦ aus NOS2-defizienten Mäusen (Nos2 ) und
entsprechenden Kontrollmäusen (WT) wurden mit E.coli bzw. S.aureus infiziert (MOI 10). 2 h nach
Infektion wurden die Zellen unter normoxischen (N) bzw. hypoxischen (H) Bedingungen inkubiert. Der
Reoxygenierungsansatz (Re) wurde zunächst für 8 h einer Hypoxie ausgesetzt und anschließend
normoxischen Bedingungen zugeführt. 2 h und 24 h nach Infektion wurden die intraphagosomalen
Bakterien durch das Lysieren der Zellen freigesetzt und auf Agarplatten aufgebracht, um die Koloniebildenden Einheiten zu ermitteln. Die Graphen veranschaulichen die Überlebensrate intrazellulärer
Bakterien unter den angegebenen Bedingungen, wobei dieser Wert folgendermaßen errechnet wurde:
(KBE/ml (24 h) / KBE/ml (2 h)) x 100. Die Berechnung der Signifikanz erfolgte mittels des Student´s ttest; * =p<0,05, ** p<0,01, *** = p<0,001; ns = nicht signifikant. (E) Durch die Analyse des
Nitritgehaltes 24 h nach Infektion wurde der Verlust der NOS2-Aktivität in den NOS2 k.o. Zellen
überprüft.
Die Graphen zeigen die Ergebnisse aus mindestens drei unabhängigen Experimenten
(Mittelwert+SEM).
- 53 -
Ergebnisse
In dendritischen Zellen bewirkte der Verlust der Aktivität der NOS2 keine signifikante
Änderung der antibakteriellen Kapazität. Die Überlebensrate der phagozytierten Bakterien in
NOS2-defizienten Zellen (Nos2-/-) unterschied sich nach keiner der durchgeführten
Behandlung signifikant von der Überlebensrate in Wildtypzellen (WT) (Abbildung 2.18 A, C).
Anhand der Analyse der Fähigkeit von Makrophagen, Bakterien zu beseitigen, konnte
ebenfalls ausgeschlossen werden, dass die sauerstoffabhängige Aktivität der NOS2 die
verminderte antimikrobielle Kapazität von hypoxischen myeloischen Zellen erklärt. Im Falle
der Infektion von Makrophagen mit E.coli war sogar eine signifikant erniedrigte
Überlebensrate phagozytierter Bakterien und somit eine erhöhte Eliminierungsrate innerhalb
der NOS2-defizienten Makrophagen festzustellen (Abbildung 2.18 B). Die allgemein
verbesserte Fähigkeit der NOS2-defizienten Makrophagen, phagozytierte Bakterien zu
beseitigen, könnte auf eine kompensatorische Erhöhung eines oder mehrerer alternativer
Abwehrmechanismen beruhen. Die relative Veränderung der Anzahl intraphagosomaler
Bakterien als Folge eines Sauerstoffentzuges hingegen verlief sowohl in Wildtypzellen als
auch in NOS2-defizienten Makrophagen in ähnlicher Art und Weise (Abbildung 2.18 B). Wie
für dendritische Zellen gezeigt, bewirkte der Verlust der NOS2-Aktivität in Makrophagen
keine signifikante Änderung der Eliminierungsrate gegenüber S.aureus (Abbildung 2.18 D).
Zusammenfassend konnte anhand der durchgeführten Experimente gezeigt werden, dass
eine durch Hypoxie modifizierte Aktivität der NOS2 nicht für die Abhängigkeit der
antimikrobiellen Kapazität myeloischer Zellen vom vorliegenden Sauerstoffpartialdruck
verantwortlich ist.
2.5
Auswirkung eines Verlustes der Aktivität der PHOX und NOS2 auf die
antibakterielle Kapazität myeloischer mononukleärer Zellen
Da Hypoxie nicht nur die Produktion reaktiver Stickstoffspezies sondern auch die
Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies inhibiert, wurde die antimikrobielle Kapazität von
Makrophagen und dendritische Zellen untersucht, die ein Defizit bezüglich der Aktivität der
PHOX und NOS2 aufwiesen. Diese Zellen stammten aus Mäusen, die zum einen eine
genetische Deletion des für NOS2-kodierenden Gens (Nos2) trugen und zum anderen einen
Verlust des Gens aufwiesen, das für gp91phox, einer Untereinheit des membrangebundenen
Bestandteils der PHOX, kodiert (abgekürzt mit „Cybb“). In den vorhergehenden
Experimenten zeigte der Verlust der Aktivität der NOS2 keine Auswirkung, die den HypoxiePhänotyp begründen könnte. Deshalb wurde angenommen, dass derartige Veränderungen
in den PHOX- und NOS2-defizienten (Cybb-/-/Nos2-/-) Zellen auf die verringerte Tätigkeit der
PHOX beruhen würde.
- 54 -
Ergebnisse
Zur Kontrolle des funktionellen „knock outs“ innerhalb der PHOX/NOS2-defizienten Zellen
wurde anhand der bereits erwähnten Methoden die Aktivität beider Enzyme überprüft
(Abbildung 2.19).
A
B
Abbildung 2.19: Verifizierung des Verlustes der Aktivität der NOS2 und PHOX in myeloischen
-/-/mononukleären Zellen aus Cybb /Nos2 Mäusen. (A) Analyse der Aktivität der NOS2 anhand der
Messung des Nitritgehaltes im Überstand infizierter Zellen. N= Normoxie; H= Hypoxie; Re=
Reoxygenierung. Dargestellt ist die Zusammenfassung der Ergebnisse aus mindestens drei
unabhängigen Experimenten (Mittelwert+SEM) (B) Nachweis der Produktion von reaktiven
Sauerstoffspezies mittels des Fluoreszenzfarbstoffes CM-H2DCFDA in infizierten Makrophagen.
Dargestellt ist ein repräsentatives Ergebnis aus drei unabhängigen Experimenten. % Max =
prozentualer Anteil der maximalen Ereignisanhäufung.
Wie erwartet war in den Zellen aus den „knock out“-Mäusen (Cybb-/-/Nos2-/-) die Aktivität der
NOS2, die anhand des Nitritgehaltes bestimmt wurde, kaum messbar bzw. nicht vorhanden
(Abbildung 2.19 A). Für die Analyse der PHOX-Aktivität wurde der ROS-sensitive Farbstoff
- 55 -
Ergebnisse
CM-H2DCFDA verwendet, der die Gesamtheit der reaktiven Sauerstoffspezies unabhängig
von deren Quelle anzeigt. Nach Infektion der Cybb-/-/Nos2-/- Zellen konnte eine im Vergleich
zu den entsprechenden WT-Zellen deutlich eingeschränkte Akkumulation reaktiver
Sauerstoffspezies in Normoxie festgehalten werden (Abbildung 2.19 B). Die dennoch
messbare
Erhöhung
der
normoxischen
Fluoreszenzintensität
des
ROS-sensitiven
Farbstoffes CM-H2DCFDA nach Infektion wurde auf eine PHOX-unabhängige Anreicherung
reaktiver Sauerstoffspezies zurückgeführt (z.B. die Enstehung von ROS innerhalb der
Mitochondrien).
Des Weiteren wurde untersucht, ob der Verlust zweier antibakterieller Abwehmechanismen
die Viabilität der Zellen beeinträchtigt. Hiefür wurde die LDH-Freisetzung der Zellen 24 h
nach Infektion vermessen. Unter keinen der untersuchten Bedingungen konnte eine
signifikante Erhöhung der relativen LDH Freisetzung beobachtet werden, wodurch eine
verminderte Lebensfähigkeit der Zellen ausgeschlossen werden konnte (Abbildung 2.20).
Abbildung 2.20: Überprüfung der Viabilität PHOX/NOS2 defizienter Zellen. Die Viabilität der
Zellen unter den angegebenen Bedingungen wurde anhand der relativen LDH-Freisetzung
vermessen. Hierfür wurde 24 h nach Infektion und entsprechender Behandlung die LDH-Aktivität
sowohl im Überstand (extrazellulär) als auch im Zelllysat (intrazellulär) vermessen. Anschließend
wurde die relative LDH-Freisetzung errechnet, indem der Quotient aus extrazellulärer und
intrazellulärer LDH-Aktivität gebildet wurde. In den Graphen ist die Änderung der relativen LDHFreisetzung gezeigt, wobei die relative LDH-Freisetzung der normoxischen, unbehandelten, nicht
infizierten WT-Kontrolle gleich 1 gesetzt wurde. Da DMSO in hoher Konzentration den Zelltod initiiert,
diente die Behandlung mit 20 % DMSO für 24 h als Positivkontrolle. Die Graphen zeigen eine
Zusammenfassung der Ergebnisse aus mindestens drei unabhängigen Experimenten
(Mittelwert+SEM). N=Normoxie; H=Hypoxie; Re=Reoxygenierung.
- 56 -
Ergebnisse
Anhand
der
Analyse
der
Effizienz der
Cybb-/-/Nos2-/--Zellen
den
Gram-negativen
Bakterienstamm E.coli intrazellulär zu beseitigen, konnte kein Hinweis erhalten werden, der
auf die Ursache der unter Hypoxie verminderten antimikrobiellen Kapazität von Wildtypzellen
deutete (Abbildung 2.21 A,B).
A
B
C
D
Abbildung 2.21: Ein gleichzeitiger Verlust der Aktivität der NOS2 und der PHOX ist nicht
vollständig für die verringerte antimikrobielle Kapazität unter hypoxischen Bedingungen
-/-/verantwortlich. KM-DZ und KM-MΦ aus PHOX/NOS2-defizienten Mäusen (Cybb /Nos2 ) und
entsprechenden Kontrollmäusen (WT) wurden mit E.coli bzw. S.aureus infiziert (MOI 10). 2 h nach
Infektion wurden die Zellen unter normoxischen (N) bzw. hypoxischen (H) Bedingungen inkubiert. Der
Reoxygenierungsansatz (Re) wurde zunächst für 8 h einer Hypoxie ausgesetzt und anschließend
normoxischen Bedingungen zugeführt. 2 h und 24 h nach Infektion wurden die intrazellulären
Bakterien durch das Lysieren der Zellen freigesetzt und auf Agarplatten aufgebracht, um die Koloniebildenden Einheiten (KBE) zu ermitteln. Die Graphen veranschaulichen die Überlebensrate
intrazellulärer Bakterien unter den angegebenen Bedingungen, wobei dieser Wert folgendermaßen
errechnet wurde: (KBE/ml (24 h) / KBE/ml (2 h)) x 100. Die Berechnung der Signifikanz erfolgte mittels
des Student´s t-test; * =p<0,05, ** p<0,01, *** = p<0,001; ns = nicht signifikant. Die Graphen fassen
die Ergebnisse aus mindestens 2 unabhängigen Experimenten zusammen (Mittelwert+SEM).
Sowohl in Makrophagen als auch in dendritischen Zellen, die aus PHOX/NOS2-defizienten
Mäusen (Cybb-/-/Nos2-/-) gewonnen wurden, konnte eine im Vergleich zum Wildtyp geringere
normoxische Überlebensrate von E.coli beobachtet werden. Dabei glich die Überlebensrate
innerhalb der Makrophagen, die einen Verlust hinsichtlich der Aktivität der PHOX und NOS2
- 57 -
Ergebnisse
aufwiesen, derjenigen, die in NOS2-defizienten Makrophagen festgehalten werden konnte.
Im Vergleich zu den entsprechenden WT-Zellen war die Überlebensrate von E.coli in
PHOX/NOS2-defizienten dendritischen Zellen ebenfalls signifikant erniedrigt. Des Weiteren
konnte die in WT-Zellen beobachtete Sauerstoffabhängigkeit der antimikrobiellen Kapazität
nur in einem geringen Maße festgehalten werden (Abbildung 2.21 A). Der genetische Verlust
beider Abwehrmechanismen führt anscheinend zu einer erhöhten, sauerstoffunabhängigen
Eliminierung des Gram-negativen Bakteriums. Beide Befunde schließen jedoch aus, dass
eine verminderte Aktivität der PHOX und NOS2 für die eingeschränkte Beseitigung von
E.coli in hypoxischen myeloischen mononukleären Zellen verantwortlich ist. Die normoxische
antibakterielle Kapazität von myeloischen mononukleären Zellen gegenüber dem Grampositiven Bakterium S.aureus wurde durch den Wegfall der Möglichkeit der Wirtszellen,
reaktive Stickstoff- und Sauerstoffspezies zu produzieren, beeinträchtigt (Abbildung 2.21 C,
D). Jedoch resultierte ein Sauerstoffentzug wie in Wildtypzellen in einer weiteren Erhöhung
der Überlebensrate von S.aureus. Da in vorherigen Experimenten gezeigt werden konnte,
dass die Aktivität der NOS2 nicht an der Eliminierung von S.aureus beteiligt ist, wurde
angenommen, dass die beobachtete Änderung der antimikrobiellen Kapazität von Cybb-//Nos2-/--Mäusen auf dem Verlust der Aktivität der PHOX beruht. Somit scheint die Aktivität
der PHOX in dendritischen Zellen und Makrophagen partiell an der intrazellulären
Beseitigung von S.aureus beteiligt zu sein. Eine alleinige Verantwortlichkeit der modulierten
Produktion
von
reaktiven
Sauerstoffspezies
bezüglich
der
sauerstoffabhängigen
antimikrobiellen Kapazität myeloischer Zellen konnte hingegen ausgeschlossen werden.
2.6
Auswirkung der Hemmung der mitochondrialen Aktivität auf die Eliminierung
phagozytierter Bakterien
Eine bedeutende Folge eines Sauerstoffentzuges ist die Notwendigkeit der Umstellung des
zellulären Energiestoffwechsels. Durch den Mangel an Sauerstoff als Elektronenendakzeptor
bei der oxidativen Phosphorylierung kann die Atmung als effizientester Weg der
Energiegewinnung innerhalb der Zelle nur noch sehr begrenzt stattfinden. Eine sich daraus
ergebende Konsequenz ist die Erniedrigung der mitochondrialen Aktivität verbunden mit
einer Erhöhung der glykolytischen Aktivität und die Umstellung des Energiestoffwechsels auf
die Laktat-Fermentation. Basierend auf diesem Wissen wurde untersucht, inwiefern sich ein
Inhibitor der mitochondrialen Aktivität auf die antibakterielle Kapazität myeloischer
mononukleären Zellen auswirkt. Hiefür sollten dendritische Zellen und Makrophagen mit
Rotenon, einem Inhibitor des Komplex I (NAD(P)H Dehydrogenase) der mitochondrialen
Atmungskette, versetzt werden.
- 58 -
Ergebnisse
Zunächst wurde überprüft, ob der Komplex I-Inhibitor entweder auf die Wirtszelle oder auf
die
Bakterien
unerwünschte,
unspezifische
Nebeneffekte
ausübt.
Der
bakterielle
Stoffwechsel erwies sich als unbeeinflusst von der Behandlung mit Rotenon, da sich keine
Veränderung im Verlauf des Wachstums von E.coli oder S.aureus ergab (Abbildung 2.22).
Einfluss von Rotenon
auf das bakterielle Wachstum
1E+11
1E+10
KBE/ml
1E+09
1E+08
1E+07
E.coli
S.aureus
1000000
E.coli Rotenon
S.aureus Rotenon
100000
0
2
4
6
t in h
24
Abbildung 2.22: Rotenon führt zu keiner
Veränderung des bakteriellen Wachstums. Eine über Nacht angezogene
Suspension von E.coli bzw. S.aureus wurde
in Zellkulturmedium (ohne Antibiotika)
verdünnt. Die verdünnte Kultur wurde
entweder unbehandelt belassen oder mit
Rotenon (100 µM) versetzt, wobei die
Inkubation mit dem Inhibitor über den
gesamten Verlauf des Experimentes verlief.
Nach
Inkubation
unter
normoxischen
Bedingungen bei 37°C wurde zu den
angegebenen Zeitpunkten ein Teil der
Ansätze auf MH-Agarplatten ausplattiert, um
die Kolonie-bildenden Einheiten (KBE) zu
bestimmen. Der Graph veranschaulicht die
Änderung der Bakterienzahl (KBE/ml) über
die Zeit in Stunden (t in h).
Dargestellt ist die Zusammenfassung aus
zwei unabhängigen Experimenten
(Mittelwert+Standardabweichung).
Des Weiteren konnte keine Auswirkung des Komplex I –Inhibitors hinsichtlich der Aktivität
der NOS2 von infizierten dendritischen Zellen und Makrophagen festgehalten werden
(Abbildung 2.23 A). Dieser Befund wurde ergänzt durch die Untersuchung der Viabilität der
Wirtszellen anhand der Ermittlung der LDH-Freisetzung. Auch in diesem Zusammenhang
ergab sich keine negative Beeinflussung, die auf die Inkubation mit Rotenon zurückgeführt
werden konnte (Abbildung 2.23 B).
Dem zu Folge wurde angenommen, dass der Inhibitor keine Effekte auf die Viabilität der
Bakterien und Wirtszellen hervorruft, die eine Beeinflussung der nachfolgenden Experimente
verursachen könnten.
- 59 -
Ergebnisse
A
B
Abbildung 2.23: Rotenon führt zu keiner Beeinträchtigung der Viabilität infizierter KM-DZ und
KM-MΦ. (A) KM-DZ und KM-MΦ wurden mit E.coli bzw. S.aureus (MOI 10) infiziert. 2 h nach Infektion
wurde ein Teil der Zellen mit Rotenon (100 µM) versetzt, bevor die Zellen normoxischen (N) bzw.
hypoxischen (H) Bedingungen ausgesetzt wurden. 24 h nach Infektion wurde die Aktivität der NOS2
anhand der Ermittlung des Nitritgehaltes im Zellüberstand bestimmt. (B) Einen weiteren Hinweis auf
die Lebensfähigkeit der Zellen lieferte die Bestimmung der relativen LDH-Freisetzung. Hierfür wurde
24 h nach Infektion und entsprechender Behandlung die LDH-Aktivität sowohl im Überstand
(extrazellulär) als auch im Zelllysat (intrazellulär) vermessen. Anschließend wurde die relative LDHFreisetzung errechnet, indem der Quotient aus extrazellulärer und intrazellulärer LDH-Aktivität gebildet
wurde. In den Graphen ist die Änderung der relativen LDH-Freisetzung gezeigt, wobei die relative
LDH-Freisetzung der normoxischen, unbehandelten, nicht infizierten Kontrolle gleich 1 gesetzt wurde.
Da DMSO in hoher Konzentration den Zelltod initiiert, diente die Behandlung mit 20 % DMSO für 24 h
als Positivkontrolle.
Die Graphen veranschaulichen die Ergebnisse aus mindestens drei unabhängigen Experimenten
(Mittelwert+SEM).
- 60 -
Ergebnisse
Im nächsten Schritt sollte aufgeklärt werden, inwieweit eine eingeschränkte mitochondriale
Aktivität die Fähigkeit myeloischer mononukleärer Zellen moduliert, phagozytierte Bakterien
abzutöten. Dazu wurden dendritische Zellen und Makrophagen mit E.coli bzw. S.aureus
infiziert. 2 h nach Infektion wurden die Zellen mit Rotenon versetzt und anschließend
normoxischen und hypoxischen Bedingungen ausgesetzt. Abbildung 2.24 zeigt die
Überlebensrate phagozytierter Bakterien unter den gegebenen Bedingungen. Wurden die
Zellen mit E.coli infiziert, führte die Behandlung der Zellen mit Rotenon im gleichen Ausmaß
wie die Inkubation der Zellen unter hypoxischen Bedingungen zu einer eingeschränkten
Eliminierungsrate phagozytierter Bakterien (Abbildung 2.24 A, B). Ein ähnlicher Effekt konnte
nach Infektion der Zellen mit S.aureus festgehalten werden. Die Inkubation mit Rotenon
führte zu einer signifikanten Erhöhung der normoxischen Überlebensrate phagozytierter
Bakterien. Unter hypoxischen Bedingungen war jedoch ein größerer Anstieg der
Überlebensrate von S.aureus zu verzeichnen, sodass die Behandlung mit Rotenon nicht
vollständig die Auswirkung einer Hypoxie widerspiegelte (Abbildung 2.24 C, D). Die im
vorherigen Abschnitt gezeigten Ergebnisse ließen vermuten, dass die Aktivität der PHOX für
den Abbau von S.aureus partiell beiträgt. Deshalb wäre es möglich, dass die normoxische
Aktivität der PHOX die durch Rotenon vermittelte Änderung der Eliminierungsrate
phagozytierter Bakterien teilweise kompensiert. Deshalb wurde die Wirkung von Rotenon auf
den Abbau von S.aureus nicht nur in WT-Zellen, sondern auch in PHOX/NOS2-defizienten
dendritischen Zellen und Makrophagen untersucht. Tatsächlich war in PHOX/NOS2defizienten Zellen kein Unterschied mehr zwischen der Auswirkung einer Hypoxie und der
Behandlung mit Rotenon erkennbar (Abbildung 2.24 E, F). Vorherige Experimente konnten
eine Beteiligung der NOS2 an der sauerstoffabhängigen Eliminierung von S.aureus
ausschließen. Dem zu Folge wurde vermutet, dass die Beeinträchtigung der Eliminierung
von S.aureus unter hypoxischen Bedingungen auf einer verminderten PHOX-vermittelten
ROS-Produktion und einer verminderten mitochondrialen Aktivität basiert.
- 61 -
Ergebnisse
A
B
E
C
D
F
Abbildung 2.24: Wirkung von Rotenon auf die antibakterielle Kapazität von KM-DZ und KM-MΦ.
KM-DZ und KM-MΦ wurden mit E.coli (A)+(B) bzw. S.aureus (C)+(D) infiziert (MOI 10). 2 h nach
Infektion wurde ein Teil der Zellen mit Rotenon (100 µM) versetzt, bevor die Zellen normoxischen (N)
bzw. hypoxischen (H) Bedingungen ausgesetzt wurden. 2 h und 24 h nach Infektion wurden die Zellen
lysiert, um den Gehalt der intrazellulären Kolonie-bildenden Einheiten (KBE) zu bestimmen. (E)+(F)
-/-/KM-DZ und KM-MΦ aus WT- bzw. Cybb /Nos2 -Mäusen wurden mit S.aureus infiziert und
behandelt wie in (A)-(D) beschrieben. In den Graphen ist der prozentuale Anteil der überlebenden
Bakterien gezeigt, der folgendermaßen berechnet wurde: (KBE/ml (24 h) / KBE/ml (2 h)) x 100.
Die Signifikanzberechnung erfolgte mittels Student´s t-test; * =p<0,05, ** p<0,01, *** = p<0,001; ns =
nicht signifikant. Dargestellt sind die Daten aus mindestens vier unahängigen Experimenten
(Mittelwert+SEM).
Zusammenfassend deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die durch Rotenon verursachte
Änderung des Zellstoffwechsels, also eine Einschränkung der mitochondrialen Aktivität,
- 62 -
Ergebnisse
vollständig bzw. zu einem großen Teil für die verminderte antimikrobielle Kapazität von
Makrophagen und dendritischen Zellen im Rahmen eines Sauerstoffentzuges verantwortlich
sein könnte.
Rotenon hemmt den Elektronentransfer über die Atmungskette innerhalb der inneren
Membran der Mitochondrien, indem die Substanz die Bindestelle von Ubiquinon an Komplex
I blockiert. In folgenden Experimenten sollte untersucht werden, ob die Inhibition der
Atmungskette an anderen Positionen einen zu Rotenon ähnlichen Einfluss zeigt. Hierzu
wurden die Zellen 2 h nach bakterieller Infektion mit Antimycin A (Inhibitor des Komplex III; 4
µg/ml) bzw. Natriumazid (Inhibitor Komplex IV; 2 mM) versetzt.
A
C
B
D
Abbildung 2.25: Effekt der Inhibition des Komplex IV in der mitochondrialen Atmungskette auf
die intrazelluläre Eliminierung von Bakterien. (A)–(D) KM-DZ und KM-MΦ wurden 2 h nach
Infektion mit E.coli bzw. S.aureus (MOI 10) mit Natriumazid (NaAzid, 2 mM) versetzt oder unbehandelt
belassen. Anschließend wurden die Zellen unter normoxischen (N) bzw. hypoxischen (H)
Bedingungen inkubiert. Die Bestimmung der Anzahl intrazellulärer Bakterien erfolgte 2 h und 24 h
nach Infektion durch Lyse der Zellen und anschließendes Ausbringen der Lysate auf Agarplatten.
Dargestellt ist der prozentuale Anteil intrazellulärer Bakterien, der 24 h nach Infektion in den Zellen
überlebt hat, wobei die Anzahl der Bakterien, die 2 h nach Infektion in den Zellen festgehalten werden
konnte, als Referenzwert diente. Dementsprechend wurde der prozentuale Anteil der überlebenden
Bakterien folgendermaßen errechnet: (KBE/ml (24 h) / KBE/ml (2 h)) x100. Die Signifikanzberechnung
erfolgte mittels Student´s t-test; * =p<0,05, ** p<0,01, *** = p<0,001; ns = nicht signifikant. Dargestellt
sind die Daten aus mindestens vier unabhängigen Experimenten (Mittelwert+SEM).
- 63 -
Ergebnisse
Im Gegensatz zur Behandlung mit Rotenon ergab sich hinsichtlich der Auswirkung von
Natriumazid, eines Inhibitors des Komplex IV der mitochondrialen Atmungskette, eine
Abhängigkeit von dem gewählten Zelltyp und dem verwendeten Bakterienstamm (Abbildung
2.25). Nach Infektion dendritischer Zellen mit E.coli und anschließender Behandlung mit
Natriumazid konnte zwar keine sauerstoffabhängige Regulation mehr festgehalten werden,
jedoch
wurde
die
normoxische
Überlebensrate
nicht
auf
das
„Hypoxie-Niveau“
unbehandelter Zellen verändert (Abbildung 2.25 A). Dahingegen bewirkte Natriumazid in
Makrophagen eine Verringerung der antimikrobiellen Kapazität gegenüber E.coli in gleicher
Weise, wie es nach Inkubation der Zellen unter hypoxischen Bedingungen beobachtet
werden konnte (Abbildung 2.25 B). Des Weiteren erwies sich der Natriumazid-vermittelte
Effekt als unabhängig von der vorliegenden Sauerstoffspannung. Wurden die Zellen mit
S.aureus infiziert, konnte eine tendenziell höhere Eliminierungsrate phagozytierter Bakterien
beobachtet werden. Zusätzlich unterschied sich die sauerstoffabhängige Regulation der
antibakteriellen Kapazität der Zellen nach Behandlung mit Natriumazid unwesentlich von der
unbehandelter Zellen (Abbildung 2.25 C, D).
Diese Befunde zeigen, dass die Inhibition des Komplex IV der Atmungskette mittels
Natriumazid nur nach Infektion mit E.coli die Auswirkung eines Sauerstoffentzuges teilweise
nachahmen kann.
- 64 -
Ergebnisse
A
C
D
B
Abbildung 2.26: Einfluss von Antimycin A auf die antibakterielle Kapazität myeloischer
mononukleärer Zellen. (A)-(D) KM-DZ und KM-MΦ wurden 2 h nach Infektion mit E.coli bzw.
S.aureus (MOI 10) mit Antimycin A (4 µg/ml) behandelt oder unbehandelt belassen. Anschließend
wurden die Zellen unter normoxischen (N) bzw. hypoxischen (H) Bedingungen inkubiert. Die
Bestimmung der Anzahl intrazellulärer Bakterien erfolgte 2 h und 24 h nach Infektion durch Lyse der
Zellen und anschließendes Ausbringen der Lysate auf Agarplatten. Dargestellt ist der prozentuale
Anteil intrazellulärer Bakterien, der 24 h nach Infektion in den Zellen überlebt hat, wobei die Anzahl
der Bakterien, die 2 h nach Infektion in den Zellen festgehalten werden konnte, als Referenzwert
diente. Dementsprechend wurde der prozentuale Anteil der überlebenden Bakterien folgendermaßen
errechnet: (KBE/ml (24 h) / KBE/ml (2 h)) x 100. Die Signifikanzberechnung erfolgte mittels Student´s
t-test; * =p<0,05, ** p<0,01, *** = p<0,001; ns = nicht signifikant. Dargestellt sind die Daten aus
mindestens vier unabhängigen Experimenten (Mittelwert+SEM).
Ein homogeneres Bild lieferte die Untersuchung der antimikrobiellen Kapazität myeloischer
Zellen nach Behandlung mit Antimycin A. Vergleichbar zu Rotenon führte die Inhibition des
Komplex III der mitochondrialen Atmungskette durch Antimycin A nach Infektion mit E.coli zu
einer
Erhöhung
der
Überlebensrate
phagozytierter
Bakterien.
Dabei
glich
die
Eliminierungsrate nach Inkubation mit Antimycin A sowohl unter normoxischen als auch
hypoxischen Bedingungen der antimikrobiellen Kapazität unbehandelter, hypoxischer Zellen
(Abbildung 2.26 A, B). Eine ähnliche, Antimycin A-vermittelte Änderung der Anzahl
intrazellulär überlebender Bakterien konnte in dendritischen Zellen nach Infektion mit
S.aureus festgehalten werden (Abbildung 2.26 C). Der Eindruck, dass die Behandlung mit
- 65 -
Ergebnisse
Antimycin A die Auswirkung eines Sauerstoffentzuges widerspiegelt, wurde durch die
Untersuchung der Überlebensrate von S.aureus in Makrophagen nicht vollständig bekräftigt.
Wurden Makrophagen mit S.aureus infiziert und anschließend mit Antimycin A versetzt,
verlor sich zwar die sauerstoffabhängige Regulation der Eliminierungsrate. Dies war jedoch
verursacht durch eine Erniedrigung der Anzahl intrazellulärer Bakterien unter hypoxischen
Bedingungen (Abbildung 2.26 D).
Basierend auf den in den vorherigen Abbildungen gezeigten Daten scheint eine Hemmung
der mitochondrialen Atmungskette sich negativ auf die Bekämpfung phagozytierter Bakterien
auszuwirken. Dabei konnte bei der Infektion der Zellen mit E.coli die Behandlung mit
Rotenon, wodurch die Aktivität des Komplex I der Atmungskette beeinträchtigt wird, die
Situation eines Sauerstoffentzuges nachahmen. Die sauerstoffabhängige Bekämpfung von
S.aureus konnte ebenfalls zu einem großen Teil auf die Aktivität des Komplex I
zurückgeführt werden, wobei eine partielle Abhängigkeit von der PHOX-Aktivität beobachtet
werden
konnte.
Wurden
Inhibitoren
eingesetzt,
die
weiter
distal
innerhalb
der
Atmungskettenphosphorylierung eingreifen, wurde die Situation eines Sauerstoffentzuges
bezüglich der Eliminierung phagozytierter Bakterien nicht im selben Maße wie nach
Behandlung der Zellen mit Rotenon widergespiegelt. Deshalb entstand der Eindruck, dass
die sauerstoffabhängige Regulation der antimikrobiellen Kapazität durch Prozesse der
mitochondrialen Atmung begründet sein könnte, die der Aktivität des Komplex III
vorausgehen.
- 66 -
Diskussion
3
Diskussion
3.1
Die antibakterielle Kapazität myeloischer mononukleärer Zellen gegenüber
E.coli und S.aureus ist nicht von der Aktivität des Hypoxie-induzierbaren
Transkriptionsfaktors HIF-1α abhängig
Die Aktivität des Hypoxie-induzierbaren Transkriptionsfaktors HIF-1 wurde basierend auf
der Entdeckung dessen sauerstoffabhängiger Regulation mit den zellulären Prozessen bei
Hypoxie verbunden. Die Beobachtung, dass in Immunzellen trotz einer ausreichenden
Versorgung mit Sauerstoff die Aktivierung des Transkriptionsfaktors unter den Einfluss
inflammatorischer Stimuli induziert wird (Peyssonnaux et al., 2005; Frede et al., 2006;
Jantsch et al., 2008a), erweiterte das Spektrum der zellulären Ereignisse, die durch HIF-1
gesteuert werden könnten. Deshalb fokussierten in den letzten Jahren vermehrt Studien auf
die Rolle von HIF-1 innerhalb der Immunantwort. Eine Zielsetzung dieser Arbeit war es, zu
ergründen, ob HIF-1α die antibakterielle Kapazität myeloischer Zellen beeinflusst. Zunächst
konnte die alternative, sauerstoffunabhängige Stabilisierung der HIF-1-Untereinheit
reproduziert werden. Die Infektion dendritischer Zellen und Makrophagen mit E.coli führte
unter normoxischen und hypoxischen Bedingungen zu einer vergleichbaren, robusten
Stabilisierung und Aktivierung des Transkriptionsfaktors. Wurden die Zellen mit dem Grampositiven Bakterium S.aureus infiziert, konnte ebenfalls eine normoxische Erhöhung des HIF1 Proteingehaltes festgehalten werden. Durch einen Sauerstoffentzug wurde dieser Effekt
weiter gesteigert. Aufgrund dieser Befunde wurde vermutet, dass HIF-1 im Prozess der
Beseitigung phagozytierter Bakterien involviert sein könnte. Jedoch zeigte eine siRNAvermittelten Reduktion der Aktivität des Transkriptionsfaktors keine Auswirkung hinsichtlich
der Eliminierung beider Bakterienstämme. Dies scheint dem Bericht von Peyssonnaux et al.
zu widersprechen, in dem gezeigt wurde, dass ein konditionaler „knock out“ des für HIF-1
kodierenden Gens in Immunzellen myeloischen Ursprungs die antibakterielle Kapazität unter
normoxischen Bedingungen vermindert (Peyssonnaux et al., 2005). Es ist jedoch
hervorzuheben, dass in der erwähnten Studie die Eliminierung von Gruppe A Streptokokken
untersucht wurde. So könnte der vermeintliche Widerspruch durch eine variable
Suszeptibilität
der
Bakterienstämme
gegenüber
unterschiedlichen
antibakteriellen
Abwehrmechanismen erklärt werden. Peyssonnaux und Kollegen führten die verringerte
antimikrobielle Kapazität von HIF-1α defizienten Makrophagen und neutrophilen Zellen unter
anderem auf die HIF-1α gesteuerte Expression des Gens zurück, das für die iNOS (=NOS2)
kodiert. Dem zu Folge wurde postuliert, dass der Hypoxie-induzierbare Transkriptionsfaktor
HIF-1 über die Steuerung der Transkription des entsprechenden Gens die Produktion
reaktiver Stickstoffspezies induziert, wodurch das Abtöten phagozytierter Bakterien
- 67 -
Diskussion
begünstigt wird. In der vorliegenden Arbeit konnte jedoch anhand der Untersuchung iNOS(NOS2)-defizienter Zellen gezeigt werden, dass die Aktivität der NOS2 nicht wesentlich zur
Bekämpfung von E.coli und S.aureus beiträgt. Diese Schlussfolgerung wurde zusätzlich
unterstützt durch die Beobachtung, dass nach Infektion mit S.aureus kaum NOS2-Aktivität
nachweisbar war. Dementsprechend wäre es möglich, dass die in dieser Arbeit verwendeten
Bakterienstämme nicht auf die HIF-1 vermittelten Abwehrmechanismen ansprechen. Um
diese Schlussfolgerung zu bekräftigen und eine bessere Vergleichbarkeit zu der Arbeit von
Peyssonnaux et al. herzustellen, müssten die Infektionsexperimente mit Zellen wiederholt
werden, die aus Hif-1α-/--Mäusen gewonnen werden.
3.2
Hypoxie und die Stabilisierung von HIF-1α – „Zuckerbrot und Peitsche“
Eine weitere Erkenntnis, die nach Gegenüberstellung der Studie von Peyssonnaux und
Kollegen und der vorliegenden Arbeit hervorgeht, ist, dass die HIF-vermittelten Ereignisse
sich nicht zwingend mit den Auswirkungen einer Hypoxie, der klassischen HIFstabilisierenden Bedingung, ergänzen. So benötigt die induzierbare NO-Synthase, die im
Bericht von Peyssonnaux et al. als ein HIF-induziertes antimikrobiell wirksames Enzym
beschrieben wird (Peyssonnaux et al., 2005), Sauerstoff als Substrat zur Produktion der
reaktiven, antimikrobiellen Moleküle. In der vorliegenden Arbeit, aber auch in einer Studie
von Jantsch et al. konnte trotz eines deutlich nachweisbaren NOS2-Proteingehaltes nach
Infektion mit E.coli bzw. nach Stimulation mit LPS eine wesentliche Beeinträchtigung der
Aktivität des Enzyms unter hypoxischen Bedingungen festgehalten werden (Jantsch et al.,
2011). Das bedeutet, dass der positive Effekt von HIF-1α auf die Aktivität der NOS2 lediglich
unter normoxischen Bedingungen bzw. wenn ausreichend Sauerstoff zur Verfügung steht,
zum Tragen kommt. Diese gegensätzliche Auswirkung einer Hypoxie und der Aktivität von
HIF-1 erscheint kontraproduktiv im Zusammenhang mit der Beobachtung, dass
entzündetes Gewebe durch eine Verringerung des Sauerstoffpartialdruckes gekennzeichnet
ist. Jedoch wäre es denkbar, dass im Verlauf einer bakteriellen Infektion zunächst die
Bestandteile
der
eingedrungenen
Mikroorganismen
die
Aktivierung
des
Hypoxie-
induzierbaren Transkriptionsfaktors HIF-1 bewirken. In dieser Phase würden sowohl die
sauerstoffabhängigen als auch sauerstoffunabhängigen, HIF-gesteuerten Mechanismen zur
Entfaltung kommen. Sobald die Infektion fortgeschritten ist und weitere Immunzellen an den
Ort der Infektion rekrutiert wurden, könnte die erhöhte Stoffwechselaktivität der
eingewanderten Zellen in Kombination mit Gefäßveränderungen, wie z.B. Mikrothrombosen
oder Zytokin-vermittelte Erweiterung des Gefäßdurchmessers, am Infektionsherd in einer
Erniedrigung des Sauerstoffpartialdruckes resultieren. Dieser Sauerstoffentzug würde dann
- 68 -
Diskussion
zumindest den sauerstoffabhängigen Prozessen, die durch die Aktivität von HIF-1α induziert
werden, entgegensteuern. Neben der Möglichkeit der Veränderung der Wirkeffizienz
einzelner HIF-vermittelter Prozesse durch Hypoxie konnte gezeigt werden, dass die
Zusammensetzung der durch HIF-1 regulierten Gene durch den Stimulus beeinflusst wird,
der die Stabilisierung des Transkriptionsfaktors hervorruft. In einer Studie von Jantsch et al.
wurde
in
dendritischen
Zellen
das
Zielgenspektrum
des
Hypoxie-induzierbaren
Transkriptionsfaktors HIF-1 sowohl unter hypoxischen Bedingungen, nach Behandlung der
Zellen mit einem TLR-Liganden als auch im Anschluss an einer Kombination von beiden
HIF-stabilisierenden Umständen untersucht. Einige Gene wurden selektiv bei Hypoxie bzw.
unter Einwirkung eines TLR3-Liganden induziert. Eine andere Gruppe von Genen zeigte eine
erhöhte Expression nach Behandlung der Zellen mit einem TLR3-Liganden, wobei die
zusätzliche Exposition der Zellen an einer Hypoxie den expressionsteigernden Effekt
nochmals verstärkte. Zusätzlich konnten Gene identifiziert werden, deren Expression positiv
durch TLR-Ligation, jedoch negativ durch einen Sauerstoffentzug beeinflusst wurde. Diese
differenzierte Regulation des Zielgenspektrums des Transkriptionsfaktors HIF-1 beruht
vermutlich auf einem Zusammenspiel von HIF-1α mit anderen regulatorischen Elementen,
wie z.B. NF-κB, einem Transkriptionsfaktor, der für die Aktivierung von Immunzellen und den
Verlauf der Immunantwort von großer Bedeutung ist (Jantsch et al., 2011).
3.3
HIF-2α innerhalb der angeborenen Immunantwort
In der vorliegenden Arbeit konnte zwar eine Beteiligung des Transkriptionsfaktors HIF-1α bei
der Eliminierung von E.coli und S.aureus in myeloischen mononukleären Zellen
ausgeschlossen werden, jedoch wäre es möglich, dass ein Paralog des Transkriptionsfaktors
regulierend in die antimikrobiellen Mechanismen eingreift. Studien fokussieren immer
häufiger auf die Beteiligung von HIF-2 innerhalb immunologischer Prozesse. In einer
Veröffentlichung von Takeda und Kollegen wird eine HIF-2-vermittelte Beeinflussung der
Effektorfunktionen
von
Makrophagen
beschrieben,
die
von
bestimmten
Zytokinen
hervorgerufen wird (Takeda et al., 2010). Die von Immunzellen ausgeschütteten Zytokine
erlauben eine Signalweitergabe und bestimmen den Verlauf der Immunantwort (Dinarello,
2000). Beispielsweise wird nach Stimulation von Makrophagen mit dem aktivierenden,
proinflammatorischen Zytokin IFN-γ oder mit dem bakteriellen Bestandteil LPS Mechanismen
induziert, die für die Beseitigung infektiöser Mikroorganismen notwendig sind. Makrophagen,
die in dieser Weise stimuliert wurden, werden auch als klassisch aktiviert bzw. M1Makrophagen bezeichnet und können anhand sog. M1-Marker, wie z.B. einer erhöhten
Expression
des
iNOS(NOS2)-Gens
identifiziert
werden.
Dahingegen
bewirken
antiinflammatorische Zytokine, wie IL-4 oder IL-13 die sog. alternative Aktivierung von
- 69 -
Diskussion
Makrophagen. Die auch als M2-Makrophagen beschriebenen Zellen charakterisiert sog. M2Marker,
zu
denen
die
Aktivität
der
Arginase-1
zählt.
Da
diese
Zellen
in
Reparaturmechanismen involviert sind, ist deren Funktion im Rahmen einer abklingenden
Entzündungsreaktion von besonderer Bedeutung (Mosser, 2008; Takeda et al., 2010). In
dem Bericht von Takeda et al. wird postuliert, dass die Aktivität von HIF-1 innerhalb der
klassischen Aktivierung von Makrophagen eine Rolle spielt und die HIF-2α-vermittelte
Regulation der Expression von Genen für M2-Makrophagen benötigt wird. Diese Hypothese
wurde begründet durch eine entsprechende Induktion der Expression der Gene, die für HIF1 bzw. HIF-2 kodieren. Des Weiteren konnte hinsichtlich der Aktivität der iNOS eine
Abhängigkeit von HIF-1 und bezüglich der Regulation der Arginase-1 eine Beteiligung von
HIF-2 zugeordnet werden. Beide Enzyme setzen L-Arginin um. Aufgrund der Kompetition
um das gemeinsame Substrat wird die Aktivität der iNOS, also die Produktion reaktiver
Stickstoffspezies, wie z.B. Stickstoffmonoxid, durch eine stärkere Umsatzrate der Arginase-1
beeinträchtigt. Deshalb scheinen die erwähnten Paraloge des Hypoxie-induzierbaren
Transkriptionsfaktors vermittelt über die Regulation der Arginase-1- bzw. iNOS-Aktivität die
NO-Homäostase in Makrophagen zu steuern (Takeda et al., 2010).
Eine Beteiligung von HIF-2 bei der Regulation von Funktionen von Immunzellen wird durch
die Beobachtungen von Imtiyaz et al. bestätigt. In dieser Studie wurde die Auswirkung einer
Deletion des für HIF-2 kodierenden Gens in Zellen der myeloischen Linie untersucht. Der
Verlust der Aktivität des Transkriptionsfaktors führte zu einer Resistenz gegenüber einer
Endotoxinämie nach Behandlung der entsprechenden Mäuse mit LPS. Weiterführende
Untersuchungen zeigten, dass die Expression und Sekretion proinflammatorischer Zytokine,
wie IL-6 bzw. TNF- HIF-2-abhängig reguliert werden (Imtiyaz et al., 2010).
Da Zytokine die Effektorfunktionen von Immunzellen steuern, wie z.B. antimikrobielle
Abwehrmechansimen, wäre es lohnenswert die Beteiligung von HIF-2 innerhalb der
Prozesse der angeborenen Immunantwort zu ergründen.
So wäre es vorstellbar, dass die in der vorliegenden Arbeit analysierte antibakterielle
Kapazität dendritischer Zellen und Makrophagen durch die Aktivität des zu HIF-1
verwandten Transkriptionsfaktors HIF-2 beeinflusst wird.
- 70 -
Diskussion
3.4
Hypoxie beeinträchtigt die antibakterielle Kapazität von dendritischen Zellen
und Makrophagen-Der Einfluss des Sauerstoffpartialdruckes auf die Abwehr
infektiöser Mikroorganismen
Basierend auf den Befunden dieser Arbeit erscheint eine regulatorische Funktion von HIF-1
bezüglich der Abwehrmechanismen von dendritischen Zellen und Makrophagen gegenüber
E.coli und S.aureus eher unwahrscheinlich. Jedoch ergab sich eine deutliche Abhängigkeit
der Überlebensrate phagozytierter Bakterien von der Sauerstoffspannung, der die Zellen
ausgesetzt
waren.
Gegenüber
der
Inkubation
infizierter
dendritischer
Zellen
und
Makrophagen unter normoxischen Bedingungen führte die Reduktion des Sauerstoffgehaltes
auf 0,5 % zu einem signifikanten Anstieg der Anzahl intrazellulär überlebender Bakterien. Im
Vergleich zu E.coli war die Überlebensrate von S.aureus unter hypoxischen Bedingungen
deutlicher erhöht. Anhand der Analyse des Bakterienwachstums konnte ausgeschlossen
werden, dass dieser Hypoxie-Effekt auf einer Änderung der Proliferationsrate der Bakterien
basiert. Die Beobachtung einer verminderten antibakteriellen Kapazität unter hypoxischen
Bedingungen steht im Einklang mit früheren Berichten. So verringerte die Exposition von
Mäusen an einer systemischen Hypoxie deren Abwehrkapazität gegen S.aureus-vermittelten
Lungen- bzw. Hautinfektionen (Green et al., 1964; Jönsson et al., 1988). Kürzlich zeigte
McGovern et al., dass humane neutrophile Zellen unter hypoxischen Bedingungen im
geringeren Maße fähig sind, S.aureus intrazellulär zu bekämpfen (McGovern et al., 2011).
Die Überlebensrate von Salmonella Typhimurium erwies sich ebenfalls als abhängig von der
die
Wirtszelle
umgebenden
Sauerstoffspannung
(Bachelorarbeit
Jasmin
Matuszak,
Arbeitsgruppe Jantsch, Klinische Mikrobiologie, Universitätsklinikum Erlangen). Wurden
Makrophagen mit
diesem
Bakterienstamm infiziert
und anschließend hypoxischen
Bedingungen ausgesetzt, konnte eine deutliche Erhöhung der Überlebensrate phagozytierter
Bakterien festgehalten werden. S.Typhimurium besitzt im Gegensatz zu den in der
vorliegenden Arbeit verwendeten Bakterienspezies die Fähigkeit, sich innerhalb der
Phagosomen von Makrophagen zu vermehren (García-del Portillo, 2001). Deshalb müssen
weitere Analysen aufklären, ob der Hypoxie-vermittelte Effekt auf einer Beeinträchtigung der
Abwehrmechanismen der Wirtszelle, oder auf
einer gesteigerten Proliferationsrate
phagozytierter Salmonellen beruht.
Auch im Reich der wirbellosen Organismen konnte der Einfluss einer Hypoxie auf die
Beseitigung intrazellulärer Bakterien festgehalten werden. Eine Studie von Macey et al.
veranschaulichte eine verminderte Eliminierung des Bakteriums Vibrio campbellii innerhalb
des Gewebes der Auster Crassostrea virginica bei Hypoxie in Verbindung mit einer erhöhten
CO2-Konzentration (Macey et al., 2008).
- 71 -
Diskussion
Die erwähnten Studien heben die Bedeutung der Verfügbarkeit von Sauerstoff für
antibakterielle Abwehrprozesse hervor. Die klinische Relevanz der Sauerstoffversorgung
bezüglich der Infektionsabwehr wurde in einer Studie von Knighton et al. veranschaulicht, in
der die Auswirkung einer verbesserten Sauerstoffversorgung der Behandlung mit Antibiotika
gegenüber gestellt wurde (Knighton et al., 1986). Die Autoren infizierten Meerschweinchen
intradermal
mit
E.coli
und
setzten
die
Tiere
anschließend
unterschiedlichen
Sauerstoffspannungen aus. Parallel dazu wurden die Tiere mit einem Antibiotikum behandelt
oder erfuhren eine Kombination aus beiden Behandlungen. Eine Verbesserung der
Sauerstoffversorgung des Gewebes durch Exposition der Tiere unter Hyperoxie (45 %
Sauerstoff) spiegelte die Wirkung einer prophylaktischen Antibiotikabehandlung hinsichtlich
der Reduktion einer Gewebsnekrose wider. Dahingegen führte eine Verminderung der
Konzentration des administrierten Sauerstoffes zu einer Verschlechterung des Verlaufes der
Hautinfektion. Basierend auf ihren Beobachtungen schlugen die Autoren vor, Patienten mit
einer Kombination aus 45 % Sauerstoff und prophylaktischen Antibiotika peri- und
postoperativ zu versorgen, um die Gefahr einer Wundinfektion zu reduzieren (Knighton et al.,
1986).
Die in der vorliegenden Arbeit gezeigten Daten unterstreichen die Bedeutung des
Sauerstoffpartialdruckes für die Abwehr infektiöser Mikroorganismen. Unter hypoxischen
Bedingungen konnte eine
signifikant
eingeschränkte
antimikrobielle
Kapazität
von
dendritischen Zellen und Makrophagen festgehalten werden. Jedoch war eine gewisse
Eliminierungsrate der untersuchten Bakterienstämme unter Hypoxie dennoch deutlich
messbar. Dies veranschaulicht, dass sauerstoffunabhängige Mechanismen ebenfalls zur
Bekämpfung phagozytierter Bakterien beitragen. Um die Relevanz des Hypoxie-Effektes bei
bakteriellen Infektionen zu bestätigen und somit die Notwendigkeit einer ausreichenden
Sauerstoffversorgung zu betonen, müssten die erhobenen in vitro Befunde durch die
Durchführung entsprechender Tierexperimente bestätigt werden.
- 72 -
Diskussion
3.5
Die verminderte Produktion reaktiver Sauerstoff- und Stickstoffspezies ist
nicht (vollständig) für die Beeinträchtigung der antimikrobiellen Kapazität
myeloischer
mononukleärer
Zellen
unter
hypoxischen
Bedingungen
verantwortlich
Um die Ursache der hypoxischen Beeinträchtigung der Eliminierung phagozytierter Bakterien
zu ergründen, wurde die Auswirkung einer Hypoxie auf die sauerstoffabhängige Produktion
reaktiver Sauerstoff- und Stickstoffspezies untersucht. Beide Mechanismen wurden in
unterschiedlichen Studien als wichtige antibakterielle Abwehrmechanismen beschrieben.
Tatsächlich wurde die E.coli-vermittelte Induktion der Aktivität der NOS2, die für die
Produktion reaktiver Stickstoffintermediate zuständig ist, unter hypoxischen Bedingungen
inhibiert. Diese Beobachtung steht im Einklang mit Publikationen, die einen Zusammenhang
zwischen der Aktivität der iNOS (=NOS2) und der vorliegenden Sauerstoffspannung
beschreiben (Albina et al., 1995; Daniliuc et al., 2003; Kim et al., 1993; Kwon et al., 1990;
Robinson et al., 2008; Wang et al., 1992; Otto et al., 2001).
Die Infektion der Zellen mit S.aureus dahingegen führte unter keinen der untersuchten
Umständen zu einer signifikanten Aktivierung der induzierbaren NO-Synthase (NOS2). Diese
Beobachtung stellte die Rolle der reduzierten Produktion von Stickstoffspezies bei der
Hypoxie-vermittelten Beeinträchtigung der antibakteriellen Kapazität zumindest gegenüber
S.aureus in Frage. Anhand der Analyse der Eliminierungsrate von E.coli und S.aureus
innerhalb NOS2-defizienter myeloischer Zellen konnte diese Vermutung bestätigt werden.
Zusätzlich veranschaulichten die Befunde, dass die Aktivität der NOS2 auch für die
sauerstoffabhängige Beseitigung von E.coli keine ausschlaggebende Rolle spielt.
Ein weiterer sauerstoffabhängiger Abwehrprozess, der in der vorliegenden Arbeit untersucht
wurde, ist die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) an den Phagosomen, die auf der
Aktivität der phagozytären NAD(P)H-Oxidase (PHOX) basiert. Mittels eines ROS-sensitiven
Fluoreszenzfarbstoffes konnte eine reduzierte Bildung von ROS unter hypoxischen
Bedingungen gemessen werden. Durch die gewählte Methode werden nicht nur die
phagosomalen ROS, sondern die Gesamtheit der intrazellulär gebildeten reaktiven
Sauerstoffmoleküle erfasst. Deshalb wurde die Beteiligung der Aktivität der PHOX
hinsichtlich der Eliminierung phagozytierter Bakterien durch die Analyse der antimikrobiellen
Kapazität von Zellen untersucht, denen aufgrund genetischer Deletionen die Aktivität der
NOS2 und PHOX fehlte (Cybb-/-/Nos2-/-). Vorangegangene Beobachtungen schlossen einen
Beitrag der induzierbaren NO-Synthase zur sauerstoffabhängigen Beseitigung von E.coli und
S.aureus aus. Deshalb wurde angenommen, dass eine Veränderung der Abwehreffizienz
gegenüber phagozytierten Bakterien in Cybb-/-/Nos2-/ --Zellen auf dem Verlust der Aktivität der
PHOX beruhen würde. Wurden Cybb-/-/Nos2-/--Zellen mit S.aureus infiziert, wurde eine im
- 73 -
Diskussion
Vergleich zu WT-Zellen signifikant erhöhte Überlebensrate der Bakterien unter Nomoxie
gefunden. Ein Sauerstoffentzug führte jedoch zu einer größeren Beeinträchtigung der
antibakteriellen Kapazität und verstärkte den Effekt, der durch den Verlust der PHOXAktivität vermittelt wurde. Deshalb wurde die Schlussfolgerung gezogen, dass die ROSProduktion über die PHOX partiell zur Bekämpfung von S.aureus beisteuert. Jedoch scheint
eine Änderung der PHOX-Aktivität nicht vollständig für die in dieser Arbeit beschriebene
sauerstoffabhängige
Regulation
der
antibakteriellen
Kapazität
myeloischer
Zellen
verantwortlich zu sein.
Die Vermutung eines PHOX-unabhängigen Einflusses der Sauerstoffspannung auf die
Eliminierung phagozytierter Bakterien in Makrophagen und dendritischen Zellen wird
unterstützt durch die Beobachtung, dass die Eliminierung von E.coli durch den Verlust der
Aktivität der PHOX (und NOS2) sogar verbessert wurde. Dieser unerwartete Befund
kontrastiert die Studie von Shiloh et al., in der anhand genetisch manipulierter Mäuse die
Bedeutung der PHOX bzw. NOS2 hinsichtlich der Eliminierung des E.coli Stammes HB101,
der ebenfalls in der vorliegenden Arbeit verwendet wurde, analysiert wurde. Die Autoren
postulierten, dass für die Beseitigung dieses Bakterienstammes die Aktivität beider
antimikrobieller Enzyme von Bedeutung ist, wobei der Verlust der Aktivität der PHOX bzw.
eine Kombination aus PHOX- und NOS2-Defizit die antimikrobielle Kapazität am stärksten
beeinträchtigte (Shiloh et al., 1999). Im Gegensatz zu der vorliegenden Arbeit wurde in dem
Bericht von Shiloh et al. die Anzahl der intraphagosomal überlebenden Bakterien nicht nach
24 h, sondern nach 4 h bestimmt. Des Weiteren diente in der Studie von Shiloh et al. die
Anzahl aufgenommener Bakterien, die 30 min nach Infektion in den Zellen ermittelt wurde,
als Referenzpunkt für die Berechnung der Eliminierungsrate phagozytierter Bakterien. In der
vorliegenden Arbeit hingegen wurde die Anzahl der internalisierten Bakterien 2 h nach
Infektion als Ausgangspunkt definiert, um die antibakterielle Kapazität myeloischer Zellen zu
berechnen. Somit könnte der Unterschied im experimentellen Ablauf die Diskrepanz
zwischen der vorliegenden Arbeit und den Befunden von Shiloh et al. erklären. Unterstützt
wird diese Vermutung durch die Erkenntnis von VanderVen und Kollegen, die ein enges
Zeitfenster der Aktivität der phagosomalen NAD(P)H Oxidase veranschaulichten, wobei die
maximale Bildung reaktiver Sauerstoffspezies bereits 30 min nach Phagozytose erreicht
wurde (VanderVen et al., 2009).
In der vorliegenden Arbeit wurde die Eliminierung von E.coli innerhalb myeloischer
mononukleärer Zellen aus Cybb-/-/Nos2-/- Mäusen nicht nur nicht eingeschränkt, sondern
sogar verbessert. Dies könnte auf einen zellulären Prozess zurückgeführt werden, der in
dem Zeitraum zwischen 2 h und 24 h nach Infektion den Verlust der antibakteriellen Wirkung
beider Enzyme kompensiert und überlagert. Ein derartiges Ereignis, das durch den Verlust
- 74 -
Diskussion
der PHOX ausgelöst werden könnte, wurde in einer Studie von Jancic und Kollegen
beschrieben. Die Autoren beschreiben eine rapide Ansäuerung der Phagosomen als Folge
einer
verlangsamten
Rekrutierung
von
gp91phox,
einer
Untereinheit
des
membrangebundenen Bestandteils der PHOX. Dies verursachte einen deutlich schnelleren
Abbau der in den Phagosomen befindlichen Antigene (Jancic et al., 2007). Der Gendefekt
der in der vorliegenden Arbeit verwendeten Cybb-/-/Nos2-/- Mäuse betrifft unter anderem das
Gen, das für gp91phox kodiert. So könnte diese Mutation einer verhinderten Rekrutierung
der PHOX-Untereinheit entsprechen und somit vermittelt über eine verstärkte Ansäuerung
der Phagosomen den besseren Abbau von E.coli in dendritischen Zellen und Makrophagen
hervorrufen. Dies würde jedoch voraussetzen, dass E.coli im Vergleich zu S.aureus eine
geringere Überlebensfähigkeit im sauren Milieu aufweist. Deshalb müssten weitere Analysen
folgen, um die Aufklärung des unerwarteten Ergebnisses zu erhalten.
Trotz
mancher
Unklarheiten
hinsichtlich
der
Funktion
der
PHOX
bei
der
sauerstoffunabhängigen Eliminierung von E.coli, zeigen die in der vorliegenden Arbeit
erhobenen Daten, dass eine verminderte Aktivität der PHOX unter hypoxischen
Bedingungen die Beeinträchtigung der antibakteriellen Kapazität gegenüber E.coli nicht
bewirkt bzw. gegenüber S.aureus nicht vollständig erklärt.
3.6
Die
Rolle
der
mitochondrialen
Aktivität
innerhalb
der
angeborenen
Immunabwehr
3.6.1
Die Hemmung der mitochondrialen Aktivität scheint für die eingeschränkte
antibakterielle Kapazität hypoxischer myeloischer Zellen verantwortlich zu sein
Die Anpassung einer Zelle an hypoxische Bedingungen beinhaltet die Umstellung des
zellulären Energiestoffwechsels. Diese Erkenntnis basiert auf einer Beobachtung von Luis
Pasteur Mitte des 19. Jahrhunderts und wird deshalb auch als Pasteur Effekt bezeichnet.
Steht eine ausreichende Menge Sauerstoff zur Verfügung, gewinnt die Zelle über die Atmung
Energie in Form von ATP, ein Prozess, der maßgeblich in Mitochondrien abläuft. Innerhalb
des ersten Abschnittes, der Glykolyse, wird Glukose zu Pyruvat umgewandelt. Im
anschließenden Zitronensäurezyklus erfolgt innerhalb der Matrix der Mitochondrien die
Umsetzung
dieses
Zwischenproduktes
zu
Kohlenstoffdioxid.
Die
während
der
Oxidierungsschritte freigesetzten Elektronen werden kurzfristig auf Reduktionsäquivalente
NAD(P)+ und FAD+ geladen, im letzten Schritt der Atmung über die Komponenten der
mitochondrialen Atmungskette transferiert und letztendlich auf molekularen Sauerstoff
übertragen. Der Elektronentransport entlang der mitochondrialen
Atmungskette ist
verbunden mit dem Aufbau eines Protonengradienten zwischen der Matrix und dem
- 75 -
Diskussion
Zwischenmembranraum des Organells. Durch die Aktivität der ATP-Synthase, einer
Protonenpumpe, die auch als Komplex V der Atmungskette bezeichnet wird, wird der
Protonengradient abgebaut, wobei die frei werdende Energie zur Generierung von ATP
genutzt wird. Im Rahmen eines Sauerstoffentzuges kann der Prozess der Atmung innerhalb
der Mitochondrien aufgrund der Ermangelung von Sauerstoff als Elektronenendakzeptor
nicht stattfinden. Daraufhin wird in der Zelle die Rate der Respiration erniedrigt und die
glykolytische Aktivität gesteigert. Pyruvat als Endprodukt der Glykolyse wird anschließend zu
Laktat umgewandelt, wodurch die für die Glykolyse notwendigen Reduktionsäquivalente
regeneriert werden. Der Prozess der anaeroben Glykolyse ist zwar im Vergleich zur
oxidativen Phosphorylierung weniger effizient im Hinblick auf die ATP-Gewinnung pro
Glukosemolekül, jedoch wird zur Kompensation der niedrigeren Effizienz die Aufnahmerate
von Glukose unter hypoxischen Bedingungen gesteigert (Loike et al., 1992; Jantsch et al.,
2008a).
Um den Mechanismus aufzuklären, der für die verminderte Eliminierung phagozytierter
Bakterien unter hypoxischen Bedingungen verantwortlich ist, wurde die metabolische
Situation von Hypoxie durch die Hemmung der mitochondrialen Aktivität nachgeahmt. Es
wurden unterschiedliche Inhibitoren eingesetzt, wobei diese gegen einzelne Komplexe der
Atmungskette gerichtet waren. Dabei verringerte die Hemmung der NADH Dehydrogenase
(Komplex I) vermittelt über die Behandlung der Zellen mit Rotenon den normoxischen Abbau
von E.coli in gleicher Weise wie die Inkubation der Zellen unter hypoxischen Bedingungen.
Deshalb
wurde
angenommen,
dass
die
Aktivität
der
Mitochondrien
für
die
sauerstoffabhängige Eliminierung von E.coli verantwortlich sei. Ein signifikanter Beitrag der
Aktivität des Komplex I ergab sich ebenfalls für die Eliminierung von S.aureus. Jedoch
konnte ein geringer Anteil der sauerstoffabhängigen antimikrobiellen Kapazität gegenüber
S.aureus
auf
die
Aktivität
der
PHOX
zurückgeführt
werden.
Die
Inhibition
der
Atmungskettenphosphorylierung an weiter distalen Komplexen (Komplex III und IV)
entsprach bezüglich der antimikrobiellen Aktivität nicht vollständig der Situation einer
Hypoxie. Somit wurde die Schlussfolgerung gezogen, dass die sauerstoffabhängige
antimikrobielle Kapazität durch Prozesse der mitochondrialen Atmung begründet ist, die der
Aktivität des Komplex III vorausgehen.
Passend zu den erhobenen Daten konnten kürzlich Chan et al. zeigen, dass Hypoxie die
Aktivität der Aconitase (ein Enzym des Zitronensäurezyklus) und des Komplex I inhibiert,
indem die Assemblierung der Eisen-Schwefelcluster innerhalb der Proteine verhindert wird
(Chan et al., 2009). Dieser Befund, verbunden mit den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit,
bekräftigt die Hypothese, dass die Blockade des Komplex I der Atmungskette die Situation
- 76 -
Diskussion
eines Sauerstoffentzuges auch hinsichtlich der eingeschränkten antimikrobiellen Kapazität
widerspiegelt.
3.6.2
Mitochondriale
ROS-Effektormoleküle
bei
der
Abwehr
phagozytierter
Pathogene und Schlüssel zur Aufklärung der sauerstoffabhängigen Regulation
der antibakteriellen Kapazität myeloischer mononukleärer Zellen ?
Die vorliegende Arbeit beschreibt einen Aspekt der Rolle der mitochondrialen Aktivität
außerhalb der Energiegewinnung. Analog dazu fiel in letzter Zeit die Beteiligung des
Organells innerhalb der angeborenen Immunantwort in den Fokus verschiedener Studien.
Ein für die Eliminierung einer Reihe infektiöser Mikroorganismen bedeutender Mechanismus
ist die Produktion mitochondrialer reaktiver Sauerstoffspezies (mROS). Diese reaktiven
Moleküle entstehen, wenn Elektronen während des Transfers über die Atmungskette, die
sich in der inneren Membran der Mitochondrien befindet, frühzeitig aus den Komplexen
austreten und auf Sauerstoff übertragen werden. Untersuchungen zeigten, dass sowohl
Komplex I (NADH Dehydrogenase) als auch in einem geringeren Maße Komplex III
(Cytochrom C Reduktase) als Quelle für mROS fungieren (Murphy, 2009). Abgesehen von
durch Beschädigungen vermittelter Unterbrechung des Elektronentransfers wird die
Entstehung der reaktiven Sauerstoffmoleküle unter physiologisch intakten Umständen
begünstigt durch ein erhöhtes NADH+H+/NAD+ Verhältnis in Verbindung mit einem geringen
ATP-Bedarf (Murphy, 2009). In Makrophagen wird die Entstehung von mROS zusätzlich
durch das Protein UCP2 („uncoupling protein 2“) kontrolliert. UCP2 entkoppelt die oxidative
Phosphorylierung durch den Abbau des Protonengradienten entlang der inneren Membran
der Mitochondrien (Negre-Salvayre, 1997). Diese Entkopplung verringert die Freisetzung
mitochondrialer ROS. Eine Studie an UCP2 „knock out“ Tieren bestätigte die negative
Regulation der Produktion von mROS durch UCP2 in Makrophagen und zeigte eine
bedeutende Rolle der reaktiven Sauerstoffmoleküle bezüglich der Eliminierung intrazellulärer
Pathogene, wie Toxoplasma gondii und Salmonella Typhimurium (Arsenijevic et al., 2000).
Interessanterweise scheint der Parasit Leischmania donovani in Wirtszellen die Expression
des für UCP2 kodierenden Gens zu induzieren, um dessen Überlebenswahrscheinlichkeit zu
erhöhen. Basu Ball et al. veranschaulichten eine Unterdrückung der mROS Produktion in der
Makrophagen-ähnlichen Zelllinie RAW 264.7 nach Aufnahme von L. donovani. Diesen Effekt
konnten die Autoren auf eine erhöhte UCP2 Aktivität zurückführen. Durch siRNA-vermittelte
Unterdrückung der Ucp2 Expression in vivo und in vitro wurde verdeutlicht, dass UCP2 in
Makrophagen sowohl die Entstehung mitochondrialer reaktiver Sauerstoffspezies als auch
die Sekretion proinflammatorischer Zytokine unterdrückt, wodurch das Überleben von L.
donovani innerhalb Makrophagen begünstigt wird (Basu Ball et al., 2011).
- 77 -
Diskussion
Der Transkriptionsfaktor ERRα („Estrogen-related receptor alpha“) und der Koaktivator PGC1β („Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1 beta“), die beide in der
Regulation des mitochondrialen Metabolismus involviert sind, wurden als wichtige
Komponenten der IFN-γ-vermittelten mROS-Produktion in Makrophagen identifiziert. Dieser
Mechanismus erwies sich als notwendig für die effiziente Beseitigung des Bakterienstammes
Listeria monocytogenes (Sonoda et al., 2007).
Ein weiteres Beispiel für die Funktion der mitochondrialen ROS innerhalb der Abwehr von
Bakterien im Rahmen der angeborenen Immunantwort ist die Eliminierung von Salmonella
Typhimurium in Makrophagen als Folge eines TLR-vermittelten Signals. So löste die
Aktivierung der Toll-ähnlichen Rezeptoren TLR1, TLR2 und TLR4 innerhalb von
Makrophagen die Rekrutierung von Mitochondrien zu den Phagosomen aus, wobei dieses
Ereignis mit einer Erhöhung des mROS-Gehaltes verbunden war (West et al., 2011a).
Weiterführende Analysen veranschaulichten eine Beteiligung des TLR-Adaptorproteins
TRAF6 und des Proteins ECSIT, das innerhalb des Aufbaus des Komplex I involviert ist. Ein
Verlust einer der beiden Vermittler resultierte in einer verringerten antimikrobiellen Kapazität
von Makrophagen gegen Salmonella Typhimurium (West et al., 2011a).
Bei Sauerstoffentzug wird die Entstehung von mROS zum einen durch den Mangel an
Sauerstoff als Substrat unterdrückt (Hoffman et al., 2007) und zum anderen aktiv durch die
Regulation unterschiedlicher Enzyme und Mechanismen verhindert (Semenza, 2011).
Basierend auf den erwähnten Veröffentlichungen könnte eine verminderte Aktivität der
Mitochondrien
bzw.
ein
verminderter
Elektronentransport
über
die
mitochondriale
Atmungskette unter hypoxischen Bedingungen den Gehalt an mROS reduzieren und zu dem
in der vorliegenden Arbeit beobachteten verbesserten Überleben von E.coli und S.aureus in
myeloischen Zellen führen.
Passend zu dieser Vermutung konnte eine Unterdrückung des Gesamtgehaltes reaktiver
Sauerstoffspezies nach Infektion mit beiden Bakterienstämmen bei Hypoxie festgehalten
werden.
Die Behandlung von Zellen mit Rotenon bzw. Antimycin A hingegen bewirken einen Anstieg
des intrazellulären Gehaltes an (m)ROS (West et al., 2011a; Murphy, 2009; eigene, in der
vorliegenden Arbeit nicht gezeigte Beobachtung). Beide Inhibitoren verursachten in der
vorliegenden Arbeit eine Hypoxie-ähnliche Beeinträchtigung der Eliminierung phagozytierter
Bakterien. Diese Befunde widersprechen der Hypothese, dass eine verminderte Produktion
von mROS ursächlich für die unter Hypoxie reduzierte antibakterielle Kapazität sein könnte.
Weitere Untersuchungen des Abbaus von E.coli und S.aureus nach Behandlung der
Wirtszellen mit Antioxidantien, wie N-Acetylcystein oder α-Tocopherol würden weiteren
- 78 -
Diskussion
Aufschluss über die antimikrobielle Funktion reaktiver Sauerstoffmoleküle geben. Des
Weiteren wäre es hilfreich, reaktive Sauerstoffspezies am Ort der Entstehung, also entlang
der Phagosomen bzw. Mitochondrien sowohl unter normoxischen als auch hypoxischen
Bedingungen, zu visualisieren. Durch experimentelle Verfahren können in lebenden Zellen
Phagosomen,
Mitochondrien
und
reaktive
Sauerstoffmoleküle
mit
fluoreszierenden
Farbstoffen mikroskopisch dargestellt werden. Jedoch existiert bisher noch keine Methode,
um Zellsuspensionen gleichzeitig unter normoxischen und hypoxischen Bedingungen
mikroskopisch zu untersuchen. Die Etablierung einer derartigen Mikroskopie-Einheit, die aus
zwei
luftdichten
Kammern
besteht
und
somit
Lebendzellaufnahmen
unter
zwei
unterschiedlichen Bedingungen ermöglicht, wurde bereits in unserem Labor begonnen.
3.6.3
Die
Mitophagie und phagosomale Degradierung – Stau im Vesikelverkehr ?
Eliminierung
einfallender
Mikroorganismen
innerhalb
dendritischer
Zellen
und
Makrophagen erfolgt nach dem Prozess der Phagozytose. Da während dieses Prozesses die
Plasmamembran der Zelle nach Innen eingeschnürt wird, befinden sich die Mikroorganismen
intrazellulär abgetrennt vom Zytosol in den sogenannten Phagosomen, wobei die
ursprüngliche Außenseite der Plasmamembran ins Innere der Phagosomen zeigt. Im Laufe
des
Degradierungsprozesses
reifen
die
Phagosomen
heran
und
fusionieren
mit
Kompartimenten des endosomalen Netzwerkes. Die stetige Ansäuerung der Phagosomen
und die Aktivität von Proteasen und lysosomalen Proteinen, die durch die Verschmelzung
der Endosomen zu den Phagosomen transferiert werden, bewirkt die Degradierung der
internalisierten Mikroorganismen (Amer et al., 2002).
Ein spezialisierter endosomaler Degradierungsprozess existiert ebenfalls für die Entsorgung
von gealterten, beschädigten Mitochondrien. Die sog. Mitophagie wird unter anderem auch
bei Hypoxie induziert (Kim et al., 2007; Semenza, 2011; Zhang et al., 2008). Dieser Vorgang
verhindert sowohl die Beschädigung der Zelle durch unkontrollierte Freisetzung reaktiver
Sauerstoffspezies als auch die Freisetzung proapoptotischer Proteine.
Die phagosomale Degradierung sowie der Prozess der Mitophagie zeichnen sich durch die
Beteiligung gleicher Proteine, wie z.B. Phosphoinosit-3-Kinasen (PI3K) oder GTP-bindenden
Proteinen
der
Rab-Familie,
aus.
Zusätzlich
findet
auf
beiden
vesikulären
Degradierungsprozessen die Verschmelzung mit Lysosomen statt (Kim et al., 2007; Rupper
et al., 2001; Amer et al., 2002). Deshalb wäre es möglich, dass in hypoxischen, infizierten
myeloischen Zellen der phagosomale Abbau der Mikroorganismen mit der Hypoxievermittelten Beseitigung der Mitochondrien interferiert. Dem zu Folge könnte der Abbau
phagozytierter Bakterien verzögert werden. Dieses Szenario könnte ursächlich für die in der
- 79 -
Diskussion
vorliegenden Arbeit gezeigte hypoxische Beeinträchtigung der antibakteriellen Kapazität
myeloischer Zellen sein.
Da die einzelnen Stadien während der Reifung der Phagosomen durch spezifische
Oberflächenmoleküle unterschieden werden können, könnte durch die Verwendung
entsprechender Antikörper der Verlauf der phagosomalen Degradierung intrazellulärer
Bakterien unter normoxischen und hypoxischen Bedingungen nachvollzogen werden.
3.6.4
Die
Änderung
des
zellulären
Redox-Potentials
könnte
die
Aktivität
antimikrobieller Proteine beeinflussen
Eine Inhibition der mitochondrialen Aktivität unter hypoxischen Bedingungen könnte indirekt
über die Veränderung des Redox-Status der Zelle Mechanismen modulieren, die zur Abwehr
intrazellulärer Mikroorganismen dienen. Das zelluläre Redox-Potential beschreibt, in
welchem Ausmaß innerhalb der Zelle oxidative bzw. reduktive Prozesse stattfinden können.
Diese Größe wird bestimmt durch den Anteil an oxidierenden und reduzierenden Molekülen.
Der Redox-Status der Zelle wird beispielsweise verändert durch die Einwirkung reaktiver
Sauerstoffmoleküle aber auch durch die Änderung der NADP+/NADPH+H+ bzw.
NAD+/NADH+H+ Ratio (Circu et al., 2010; Aw, 2003). Eine Inhibition der mitochondrialen
Aktivität könnte einen Einfluss haben auf die Produktion mitochondrialer ROS. Des Weiteren
erfordert
eine
verminderte
Aktivität
der
Mitochondrien
eine
Umstellung
des
Energiestoffwechsels der Zelle. Da die Reduktionsäquivalente NADP+/NADPH+H+ bzw.
NAD+/NADH+H+ maßgeblich in den Prozessen des Energiestoffwechsels beteiligt sind,
könnte eine Hemmung der mitochondrialen Aktivität den elektrochemischen Zustand dieser
Pyridin-Nukleotide verändern. Deshalb wäre es möglich, dass die Hypoxie-vermittelte
Unterdrückung der mitochondrialen Aktivität das Redox-Potential der Zellen moduliert. Diese
Vermutung wird unterstützt durch Studien, die eine Veränderung des Redox-Status von
Zellen unter hypoxischen Bedingungen zeigten, wobei dieser Effekt unter anderem auf die
metabolische Anpassung der Zelle an einen Sauerstoffentzug zurückgeführt wurde (Kinnula
et al., 1978; Yager et al., 1991; Fan et al., 2008).
NF-κB, ein Transkriptionsfaktor, der eine zentrale Rolle bei der Regulation von Prozessen
der angeborenen Immunantwort trägt, erwies sich als beeinflusst durch eine Änderung des
Redox-Potentials (Adler et al., 1999; Li et al., 1997). Des Weiteren sind Cystein-reiche
Proteine besonders empfindlich gegenüber Modulationen des Redox-Potentials. So führt
eine Oxidation von Cysteinresten zur Ausbildung von Disulfidbrücken, die die Konformation
des betreffenden Proteins und somit dessen Aktivität modifizieren können (Adler et al., 1999;
- 80 -
Diskussion
Yarnell, 2009). Es existieren einige antimikrobielle Peptide, wie z.B. die Familie der
Defensine, deren Struktur durch Disulfidbrücken stabilisiert wird (Ganz, 2003; White et al.,
1995).
Die
Bildung
von
Disulfidbrücken
findet
in
eukaryotischen
Zellen
im
endoplasmatischen Retikulum statt, wobei der Redox-Status innerhalb des Organells für die
Ausbildung von Disulfidbrücken von großer Bedeutung ist (Fridovich et al., 2007). Des
Weiteren konnte in einer Studie gezeigt werden, dass für die oxidative Bildung von
Disulfidbrücken Sauerstoff als Elektronenendakzeptor notwendig ist (Tu et al., 2002). Somit
könnte eine Hypoxie und eine Veränderung des Redox-Status durch eine Hypoxievermittelte Hemmung der mitochondrialen Aktivität mit der Ausbildung von Disulfidbrücken
innerhalb antimikrobieller Peptide interferieren. Dies könnte eine korrekte Faltung der
antimikrobiellen Peptide verhindern und dadurch zu einer verminderten antimikrobiellen
Aktivität dieser Proteine führen.
Diese Beobachtungen ergeben zusammengefasst die Vermutung, dass ein Sauerstoffentzug
eine Veränderung des Redox-Potentials der Zelle veranlassen könnte, die möglicherweise
durch die Blockierung der mitochondrialen Aktivität vermittelt werden könnte. Auf diesem
Weg könnten antimikrobielle Mechanismen (NF-κB-regulierte Prozesse oder die Aktivität
antimikrobieller Peptide) beeinflusst werden, wodurch letztendlich die antibakterielle
Kapazität der Zellen beeinträchtigt werden könnte. Auch diese Möglichkeit der Beeinflussung
der
antimikrobiellen
Abwehr
myeloischer
Zellen
sollte
in
die
Ergründung
des
mechanistischen Hintergrundes der in der vorliegenden Arbeit erhobenen Befunde
einbezogen werden.
Die beschriebenen Mechanismen stellen eine Auswahl dar, inwiefern die mitochondriale
Aktivität innerhalb der angeborenen Immunantwort involviert sein könnte (schematisch
zusammengefasst in Abbildung 3.1). Eine umfangreichere Zusammenfassung der Rolle der
Mitochondrien auch im Rahmen der Abwehr von Viren ist in den Übersichtsartikeln von West
et al. bzw. Arnoult et al. gegeben (West et al., 2011b; Arnoult et al., 2011).
In diesem Zusammenhang ist erwähnenswert, dass Leukozyten, zu denen Makrophagen,
dendritische Zellen bzw. neutrophile Zellen gehören, hinsichtlich der ATP-Gewinnung auf die
glykolytische Aktivität angewiesen sind (Kominsky et al., 2010). Deshalb könnte unterstützt
durch die Befunde der vorliegenden Arbeit spekuliert werden, dass im Allgemeinen innerhalb
von Immunzellen der angeborenen Immunität Mitochondrien nicht nur der Energiegewinnung
dienen, sondern eher eine antibakterielle Abwehrfunktion ausführen.
- 81 -
Diskussion
Abbildung 3.1: Schematische Zusammenfassung der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit.
Die Befunde der vorliegenden Arbeit veranschaulichen einen negativen Einfluss von Hypoxie auf die
antibakterielle Kapazität myeloischer mononukleärer Zellen. Hypoxie beeinträchtigte die Aktivität der
NOS2 bzw. PHOX. Jedoch konnte nur für die Aktivität der PHOX eine partielle Beteiligung an der
sauerstoffabhängigen Eliminierung von S.aureus festgehalten werden. Der Hypoxie-vermittelte Effekt
auf die antibakterielle Kapazität scheint zu einem großen Teil auf einer Hemmung der Aktivität der
Mitochondrien (insbesondere der Aktivität des Komplex I innerhalb der Atmungskette) zu basieren.
Dabei könnten unterschiedliche antibakterielle Mechanismen, die auf der Aktivität der Mitochondrien
beruhen könnten, beeinträchtigt werden. Zum einen könnte die Produktion von reaktiven
Sauerstoffspezies an den Atmungsketten-Komplexen unterbunden werden, wodurch das Überleben
intraphagosomaler Bakterien begünstigt werden könnte. Da eine Hemmung der mitochondrialen
Atmungsketten-Phosphorylierung das Redox-Potential verändern könnte, könnten Redox-Potentialsensitve antibakterielle Mechanismen negativ beeinflusst werden. Des Weiteren könnte eine Hypoxievermittelte Mitophagie mit der phagosomalen Degradierung intrazellulärer Bakterien interferieren.
PHOX=phagozytäre NAD(P)H-Oxidase; NOS2=induzierbare NO-Synthase; mROS=mitochondriale
reaktive Sauerstoffspezies; AMP=“antimicrobial peptides“
3.6.5
„From bench to bedside“- Klinische Relevanz der Befunde zur mitochondrialen
Aktivität bei der Abwehr infektiöser Mikroorganismen
Einige klinische Berichte deuten auf einen möglichen Zusammenhang zwischen einer
veränderten mitochondrialen Aktivität und der Ausprägung von Erkrankungen, die mit einer
eingeschränkten Immunabwehr verbunden sind. Ein Beispiel einer derartigen Erkrankung ist
das Barth Syndrom (MIM 302060; X-linked cardiosceletal myopathy, neutropenia and
abnormal mitochondria). Diese seltene Erbkrankheit beruht auf genetischen Veränderungen
innerhalb X-chromosomaler Gene, wobei hauptsächlich männliche Nachkommen betroffen
sind (Barth et al., 1983, 1999). Das schwerwiegenste Symptom ist eine Kardiomyopathie, die
- 82 -
Diskussion
sich
bei
betroffenen Patienten bereits im
frühen
Kindesalter
zeigt.
Von
dieser
Herzmuskelschwäche leitet sich ein deutlich verschlechtertes Allgemeinbefinden ab und führt
bei gleichzeitiger Manifestation einer skelettalen Myopathie zu einer Unterentwicklung der
gesamten Muskulatur (Barth et al., 1999). Des Weiteren konnte eine Anfälligkeit der
Patienten für bakterielle Infektionen festgehaten werden, sodass die Gefahr einer Septikämie
im höheren Maße besteht (Barth et al., 1983). Bisher wurde die Neutropenie, ein weiteres
Symptom des Barth-Syndroms, als alleinige Ursache der Immunschwäche angesehen.
Jedoch kann die Anzahl der Granulozyten innerhalb eines Patienten schwanken und sogar
das Niveau eines gesunden Menschens erreichen (Barth et al., 1999).
Detaillierte Untersuchungen von Geweben der Patienten zeigten eine Abnormalität der
Mitochondrien. Die Organellen waren deutlich vergrößert und wiesen strukturelle
Auffälligkeiten auf (Barth et al., 1983). Zusätzlich konnte durch biochemische Analysen eine
Einschränkung des mitochondrialen Metabolismus festgehalten werden (Barth et al., 1983).
Basierend auf diesen Befunden und den Daten der vorliegenden Arbeit könnte spekuliert
werden, dass die Anfälligkeit der Barth-Syndrom-Patienten hinsichtlich bakterieller
Infektionen möglicherweise auch auf einer verminderten antibakteriellen Kapazität der
Immunzellen beruht, die in einer eingeschränkten Aktivität der Mitochondrien begründet sein
könnte. Jedoch müssten weitere Untersuchungen den tatsächlichen Beitrag der abnormalen
mitochondrialen Aktivität bezüglich der Neigung zu bakteriellen Infektionen im Rahmen des
Barth-Syndroms klären. Beispielsweise könnte die Analyse der Mitochondrien bzw. der
Abwehreffizienz von aus Patienten isolierten Immunzellen weitere Auskünfte geben.
Die zweite klinische Beobachtung, die auf eine Korrelation zwischen der mitochondrialen
Aktivität und der antibakteriellen Kapazität von Immunzellen deutet, ist die verschlechterte
Prognose von Patienten, die von einer Sepsis betroffen sind und gleichzeitig eine
Dysfunktion der Mitochondrien aufweisen (Brealey et al., 2002). Das Gewebe von SepsisPatienten weist eine verminderte Sauerstoffversorgung auf, wobei Pathogene, Pathogenassoziierte
Moleküle
und/oder
Entzündungsmediatoren
die
Verminderung
des
Sauerstoffpartialdruckes auslösen bzw. verstärken (Castellheim et al., 2009; Nizet et al.,
2009; Sawyer et al., 1991; Rivers et al., 2005; Fink, 1997). Demzufolge könnte eine
Einschränkung der sauerstoffabhängigen Funktion der Mitochondrien in den Zellen von
Sepsis-Patienten durch eine Gewebshypoxie sowie durch Hypoxie-vermittelte Signale
verursacht werden. Die Hypothese, dass eine Hypoxie-vermittelte Einschränkung der
mitochondrialen Funktion den Verlauf einer Sepsis negativ beeinflusst, wird durch eine
Studie von Rivers et al. unterstützt. In diesem Bericht wird beschrieben, dass die Erhöhung
der
Sauerstoffversorgung-und
damit
eine
Umkehrung
der
Hypoxie-vermittelten
Beeinträchtigung der mitochondrialen Aktivität (Protti et al., 2006)-im Vergleich zu einer
- 83 -
Diskussion
konventionellen Behandlung im frühen Stadium einer schweren Sepsis oder eines
septischen Schocks zu einer besseren Prognose der Patienten führte (Rivers et al., 2001). In
einem späteren Stadium einer Sepsis hingegen wirkte sich die Gabe von Sauerstoff negativ
auf den Krankheitsverlauf aus (Gattinoni et al., 1995; Hayes et al., 1994). Dies könnte
dadurch begründet sein, dass in einer späteren Phase der Sepsis die mitochondrialen
Schäden bereits so ausgeprägt sind, dass eine Erhöhung der Sauerstoffversorgung den
Verlust der mitochondrialen Aktivität nicht mehr ausgleichen kann (Protti et al., 2006). In den
erwähnten Publikationen wird der Nutzen einer optimierten mitochondrialen Aktivität während
einer Sepsis auf die Erhöhung der Energieversorgung der Zellen zurückgeführt, die
wiederum den Verlust von Organfunktionen verhindert (Protti et al., 2006). Jedoch könnte
aufgrund der Befunde der vorliegenden Arbeit vermutet werden, dass sich die Reversion der
mitochondrialen Aktivität im Rahmen einer durch Gewebshypoxie gekennzeichneten
bakteriellen Infektion, wie sie in einer Sepsis vorliegt, ebenfalls positiv auf die antibakterielle
Kapazität von Immunzellen auswirken könnte. Auf diese Weise könnte der Verlauf einer
Sepsis beeinflusst, bzw. das Risiko einer sekundären Infektion mit kommensalen Bakterien
vermindert werden. Auch diese Ereignisse würden die klinische Situation der Patienten
verbessern.
Die erwähnten klinischen Berichte deuten auf eine Beteiligung der mitochondrialen Aktivität
an dem Verlauf von Erkrankungen, die mit bakteriellen Infektionen assoziiert sind, und
bekräftigen die Aussage der vorliegenden Arbeit. Die Befunde eröffnen neuartige Strategien
zur Behandlung von Patienten, die an einer bakteriellen Infektion leiden. Unterschiedliche
Studien befassen sich bereits mit Behandlungsmöglichkeiten, die über eine Modulation der
mitochondrialen Aktivität die Prognose von Sepsis-Patienten verbessern könnten (Protti et
al., 2006). Inwiefern sich der Nutzen einer Erhöhung der mitochondrialen Respiration auf die
antibakterielle Kapazität von Immunzellen in vivo ausprägt, muss jedoch durch weitere
Analysen aufgeklärt werden.
- 84 -
Zusammenfassung
4
Zusammenfassung
Eine
Infektion
führt
in
dem
betroffenen
Gewebe
zu
einer
Verminderung
der
Sauerstoffspannung. Dies könnte Auswirkungen auf den Verlauf von Infektionskrankheiten
haben, da dieser Arbeit vorangegangene Studien zeigten, dass die Funktionen einer Reihe
von Immunzellen durch eine verminderte Sauerstoffspannung moduliert werden. Dabei
erwiesen sich einige der untersuchten Prozesse als von dem Hypoxie-induzierbaren
Transkriptionsfaktor 1α (HIF-1α) abhängig (Nizet et al., 2009). Darüber hinaus stabilisierten
inflammatorische Stimuli und Toll-ähnliche Rezeptor (TLR)-Liganden HIF-1α sogar in
Anwesenheit von Sauerstoff. Dies verdeutlicht das enge wechselseitige Zusammenspiel von
inflammatorischen
und
hypoxischen
Regulationskaskaden
(Jantsch
et
al.,
2008a;
Peyssonnaux et al., 2007; Frede et al., 2006).
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Auswirkung von Hypoxie und den Einfluss von HIF1α auf die Eliminierung von Bakterien in myeloischen mononukleären Zellen aufzuklären.
Nach Infektion von murinen dendritischen Zellen (DZ) und Makrophagen (MΦ) mit E.coli und
S.aureus war eine Erhöhung des HIF-1α Proteingehaltes bzw. eine verstärkte HIF-1αAktivität unter normoxischen (und hypoxischen) Bedingungen zu beobachten. Jedoch führte
eine siRNA-vermittelte Reduktion der Hif-1α-Genexpression zu keiner Änderung der
antibakteriellen Aktivität gegenüber E.coli und S.aureus. Deshalb scheint HIF-1α nicht bei
der Eliminierung dieser Bakterien involviert zu sein.
Im Gegensatz dazu führte die Exposition der Zellen unter hypoxischen Bedingungen zu einer
signifikanten Einschränkung der antibakteriellen Kapazität myeloischer mononukleärer
Zellen. Dies korrelierte mit einer Beeinträchtigung der NOS2 (induzierbare NO-Synthase)vermittelten Produktion reaktiver Stickstoffspezies und mit einer verminderten Freisetzung
reaktiver Sauerstoffspezies, die teilweise auf der Aktivität der PHOX (phagozytäre NAD(P)HOxidase) beruht. Untersuchungen der antibakteriellen Kapazität von Zellen aus Nos2-/- bzw.
Cybb-/-/Nos2-/- Mäusen, die nicht NOS2 bzw. PHOX und NOS2 bilden können, zeigten, dass
die sauerstoffabhängige Beseitigung von E.coli und S.aureus nicht vollständig PHOX- und
NOS2-abhängig ist. In E.coli-infizierten DZ und MΦ konnte die Inhibition des Komplex I der
mitochondrialen Atmungskette unter normoxischen Bedingungen die Situation eines
Sauerstoffentzuges
vollständig
nachahmen.
Die
sauerstoffabhängige
antibakterielle
Kapazität gegenüber S.aureus konnte ebenfalls größtenteils auf die mitochondriale Aktivität
und lediglich zu einem geringeren Teil auf die antimikrobielle Wirkung der PHOX
zurückgeführt werden.
Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass Hypoxie nicht nur die Enzymaktivität der PHOX
und NOS2 unterdrückt, sondern dass Sauerstoffmangel ebenso die antibakterielle
Effektorfunktion der Mitochondrien beeinträchtigt. Diese Befunde weisen den Mitochondrien
- 85 -
Zusammenfassung
innerhalb von myeloischen mononukleären Zellen eine neue Funktion zu und lassen den
Schluss zu, dass diese Zellen Mitochondrien zur antimikrobiellen Abwehr nutzen.
Summary
In infected tissues oxygen tensions are low. This may have an important impact on the
outcome of infections, because previous studies showed that different functions of immune
cells are modulated by hypoxia. Some of those processes turned out to be dependent on the
activity of the hypoxia-inducible factor 1α (HIF-1α) (Nizet et al., 2009). Moreover,
inflammatory stimuli and Toll-like-receptor(TLR)-ligands were able to stabilize HIF-1α even in
the presence of ample oxgen, indicating that hypoxic and inflammatory responses are
intimately coregulated (Jantsch et al., 2008a; Peyssonnaux et al., 2007; Frede et al., 2007).
The aim of the present study was to investigate the impact of hypoxia and the influence of
HIF-1α on the elimination of bacteria in myeloid mononuclear cells.
Infection of murine dendritic cells und macrophages with E.coli and S.aureus increased HIF1α-protein level and augmented HIF-1α-activity under normoxic conditions. However, siRNAmediated silencing of Hif-1α gene expression did not alter the bactericidal activity directed
against E.coli and S.aureus. Therefore HIF-1α does not seem to be involved in the killing of
those bacteria.
Hypoxia itself significantly impaired the antibacterial capacity of myeloid mononuclear cells.
This correlated with a decreased NOS2 (inducible NO-synthase)-mediated production of
reactive nitrogen species and a reduced release of reactive oxygen intermediates, which is
partially based on the activity of the PHOX (phagocyte oxidase). The analysis of the
antibacterial capacity of Nos2-/- and Cybb-/-/Nos2-/- cells, which do not express NOS2 or
PHOX and NOS2, respectively, revealed that the oxygen-dependent elimination of E.coli and
S.aureus could not be fully explained by PHOX- or NOS2-activity. In contrast to this, the
inhibition of the complex I of the mitochondrial respiratory chain under normoxic conditions
completely mimicked the effect of hypoxia on the killing of E.coli. The oxygen-dependent
elimination of S.aureus was mainly due to the activity of the mitochondrial respiratory chain
and to a smaller extent to the activity of the PHOX.
In summary, hypoxia shuts down not only the enzyme activity of PHOX and NOS2 but also
the antibacterial effector function of mitochondria. These findings shed new light on the
function of mitochondria in myeloid cells. These data strongly suggest that myeloid cells use
mitochondria for antimicrobial defense.
- 86 -
Material und Methoden
5
Material und Methoden
5.1
Chemikalien und Reagenzien
Name
Vertrieb
Cat.no.
Lot.nr.
Stock
Lagerung
Lösung
5(6)-CFDA,
Invitrogen,
SE;CFSE, mixed
Darmstadt, D
C1157
757066
10 mM in
-20 °C
DMSO
isomers
Acrylamid (40 %)
AppliChem,
A0385,1000
0B001172
-
4°C
21300.260
09l040005
10 % in
-20°C
Darmstadt, D
Ammonium
Prolabo, VWR,
peroxidisulfat
Darmstadt, D
Antimycin A
Sigma Aldrich,
ddH2O
A8674
-029K4113
Taufkirchen, D
Arabinose
Merck,
Sigma Aldrich,
1014920100
-
Prolabo, VWR,
10 % in
4 °C
ddH2O
C3416
129K0610
Taufkirchen, D
Chloroform
-20 °C
Ethanol
Darmstadt, D
Carbenicillin
50 mg/ml in
100 mg/ml
- 20 °C
in ddH2O
22711.290
09K240513
-
RT
C6827
841062,
200 µM in
Vor Gebrauch
936416
DMSO
frisch angesetzt
D4540
18096AM
-
RT
D0632
079K1394
500 mM in
-20 °C
Darmstadt,
CM-H2DCFDA
Invitrogen,
Darmstadt, D
DMSO
SigmaAldrich,
Taufkirchen, D
DTT
SigmaAldrich,
Taufkirchen, D
Gentamicin-sulfat
SigmaAldrich,
ddH2O
G1264
050K0342
Taufkirchen, D
Glycin
Roth,
100 mg/ml
-20 °C
in PBS
3790.3
430163141
-
RT
3783.1
100154391
-
RT
28880.293
09L160003
-
RT
Karlsruhe, D
Glyzerin
Roth,
Karlsruhe, D
Harnstoff
Prolabo, VWR,
Darmstadt, D
Tabelle 5.1: Chemikalien und Reagenzien
- 87 -
Material und Methoden
5.1
Chemikalien und Reagenzien
Name
Vertrieb
Cat.no.
Lot.nr.
Stock
Lagerung
Lösung
LPS
SigmaAldrich,
(aus E. coli 0111)
Taufkirchen,
L2630
04K4120
100 µg/ml
- 20 °C
222488
SZE92180
0,1 % in
4°C
D
Naphtyl-
SigmaAldrich,
Ethylendiamin
Taufkirchen,
ddH2O
D
Natrium Azid
SigmaAldrich,
S8032
0001453190
1 M in PBS
Vor Gebrauch
Taufkirchen,
frisch
D
angesetzt
Natriumchlorid
Prolabo,
(NaCl)
VWR,
27800.360
09L300005
-
RT
237213
BCBC1761
100 mM in
4 °C
Darmstadt, D
Natrium Nitrit
SigmaAldrich,
Taufkirchen,
ddH2O
D
Ortho-
Prolabo,
Phosphorsäure
VWR,
20624.295
09K2505504
-
RT
8.18715.1000
S5506515
3,5 % in PBS
-20 °C
30-2020
052611,122910,
-
4°C
Darmstadt, D
Paraform-
Merck,
aldehyd
Darmstadt, D
peqGOLD
Peqlab,
TriFast
TM
Erlangen, D
0713110,012110,
11269
Protease
Roche
Inhibitor
Diagnostics,
Cocktail
Mannheim
Rotenon
SigmaAldrich,
11836170001
11245300
-
4°C
R8875
078K1514
100 mM in
Vor Gebrauch
Chloroform
frisch
Taufkirchen,
D
angesetzt
Tabelle 5.1: Chemikalien und Reagenzien
- 88 -
Material und Methoden
5.1 Chemikalien und Reagenzien
Name
Vertrieb
Cat.no.
Lot.nr.
Stock
Lagerung
Lösung
SDS
Serva,
20765
091069
-
RT
21159.181
09L170002
1 % in 5 %
4°C
Heidelberg, D
Sulfanilamid
Prolabo, VWR,
Darmstadt,
TEMED
AppliChem,
Phosphorsäure
A1148,0100
9F008118
-
4°C
5429.2
120155197
-
RT
437002A
9W007797
-
RT
Darmstadt, D
Tris
Roth,
Karlsruhe
Triton X-100
Prolabo, VWR,
Darmstadt, D
Trypan Blau
Fluka
93595
BCBB0028
-
RT
Tween 20
Merck,
8.22164.0500
S5449784
-
RT
8.22187.0500
S5463887
-
RT
Darmstadt, D
Tween 80
Merck,
Darmstadt, D
Tabelle 5.1: Chemikalien und Reagenzien
- 89 -
Material und Methoden
5.2
Antikörper
5.2.1 Antikörper (Westernblot)
Antigen
Wirt
Vertrieb
Cat.no.
Verdünnungsfaktor
HIF-1α
rabbit
Cayman Chemical, Ann Arbor,
10006421
1:1000
MI, USA
iNOS (NOS2)
rabbit
Biomol, Hamburg, D
KAS-O001D
1:1000
Aktin
rabbit
Sigma-Aldrich, Taufkirchen, D
A 2066
1:1000
HSP90
rabbit
Santa Cruz, Ca, USA
SC7947
1:1000
rabbit
Cell signalling Technology via
9102
1:500
P039901-2
1:2000
(HSP90 α/β (H-114))
ERK1/2 (MAPK 1/3)
New England Biolabs,
Frankfurt, D
rabbit
swine
DakoCytomation, DK
Immunglobulin, HRP
gekoppelt
Tabelle 5.2.1: Antikörper (Westernblot)
- 90 -
Material und Methoden
5.2.2 Antikörper (Durchflusszytometrie)
Spezifische Antikörper
Antigen
Wirt
Fluorochrom Vertrieb
Klon
Cat.no.
CD 11c
Armenian
APC
N418
17-0114-82
(mouse)
hamster
CD 11b
rat
M1/70
553310
2G9
553623
CA, USA
FITC
(mouse)
MHC II
BD Biosciences,
Heidelberg, D
rat
FITC
(mouse)
F4/80
eBioscience, San Diego,
BD Biosciences,
Heidelberg, D
rat
PE
Serotec, Düsseldorf, D
CI:A3
MCA497PE
goat
AlexaFluor 647
Invitrogen, Darmstadt, D
-
A21245
rabbit
-
Acris, Herford, D
-
AP00865PU-
(mouse)
rabbit IgG
(H+L)
S.aureus
N
ATCC 27660
CD86
rat
APC
(mouse)
CD16/32
BD Biosciences,
GL1
558703
2.4G2
553142
Heidelberg, D
rat
-
BD Biosciences,
(mouse)
Heidelberg, D
Tabelle 5.2.2.1: spezifische Antikörper (Durchflusszytometrie)
Isotyp-Kontrollen
Bezeichnung
Rat IgG2a, k,
Fluorochrom
FITC
isotype control
Rat IgG2b, k;
PE
isotype control
553929
BD Biosciences,
553989
Heidelberg, D
APC
IgG; isotype control
Rat IgG2a, k,
BD Biosciences,
Cat.no.
Heidelberg, D
isotype control
Armenian hamster
Vertrieb
eBioscience, San
17-4888-82
Diego, CA, USA
APC
BD Biosciences,
551442
Heidelberg, D
Tabelle 5.2.2.2: Isotyp-Kontrollen (Durchflusszytometrie)
- 91 -
Material und Methoden
Primer/ Sonden für quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR)
5.3
5.3.1 Taqman® Gene Expression Assay
(Gen-spezifische Primer inklusive FAM-markierter Sonden):
Gen
Vertrieb
Hif-1α
Applied Biosystems, Mm01283760
Darmstadt, D
(mouse)
Pgk1
Cat.no.
Applied Biosystems, Mm01225301_m1
Darmstadt, D
(mouse)
Hprt-1
Applied Biosystems, Mm00446968_m1
Darmstadt, D
(mouse)
Tnf-α
Applied Biosystems, Mm00443258_m1
Darmstadt, D
(mouse)
Il-6
Applied Biosystems, Mm00446191_m1
Darmstadt, D
(mouse)
Nos2
Applied Biosystems, Mm00440485_m1
Darmstadt, D
(mouse)
Tabelle 5.3.1: Taqman® Gene Expression Assay
5.3.2 Primer für qRT-PCR (SYBR-Green Methode)
Gen
Sequenz (forward)
Phd2
5´- TAA ACG GCC GAA CGA 5´- GGG TTA TCA ACG TGA CGG
AAG C-3´
ACA-3´
(mouse)
Hprt-1
(mouse)
Sequenz (reverse)
5´- GTT GGA TAC AGG CCA 5´- CCA CAG GAC TAG AAC ACC
GAC TTT GT-3´
TGC-3´
Tabelle 5.3.2: Gen-spezifische Primer für qRT-PCR (SYBR-Green)
Zur Detektion der Expression des Mapk1-Gens mit Hilfe der SYBR-Green Methode wurden
vorgefertigte, getestete Primer der Firma Quiagen (Hilden, D) verwendet (QuantiTect Primer
Assay QT00133840).
- 92 -
Material und Methoden
5.4
siRNA Moleküle
Bezeichnung
Target sequence(s)
Firma
Cat.no.
(Zielsequenz(en))
ON-TARGETplus
ON-TARGETplus SMARTpool siRNA
Dharmacon
L-040638-
SMARTpool,
J-040638-08, HIF1A:
(Thermo Fisher
00-0020
mouse HIF1A
UGAGAGAAAUGCUUACACA;
Scientific)
(HIF-1α siRNA)
ON-TARGETplus SMARTpool siRNA
Epsom, UK
J-040638-07, HIF1A:
GGAAAGAGAGUCAUAGAAC;
ON-TARGETplus SMARTpool siRNA
J-040638-06, HIF1A:
UUACUGAGUUGAUGGGUUA;
ON-TARGETplus SMARTpool siRNA
J-040638-05, HIF1A:
UUUAAUACCCUCCGAUUUA
Negative Control
AATTCTCCGAACGTGTCACGT
Quiagen, Hilden, D
1027310
AATTCTCCGAACGTGTCACGT
Quiagen, Hilden, D
1027310
MAPK1 siRNA
AACTGGACTTCCAGAAGAACA
Quiagen, Hilden, D
3843438
ON-TARGETplus
ON-TARGETplus SMARTpool siRNA
Dharmacon
L-058966
SMARTpool,
J-058966-09, CD86:
(Thermo Fisher
mouse CD86
GACAUGGGCUCGUACGAUU;
Scientific)
(CD86 siRNA)
ON-TARGETplus SMARTpool siRNA
Epsom, UK
siRNA
(ns-siRNA)
Negative Control
siRNA,
Fluorescein markiert
(ns-FL-siRNA)
J-058966-10, CD86:
CAACUGGACUCUACGACUU;
ON-TARGETplus SMARTpool siRNA
J-058966-11, CD86:
CAACACAGCCUCUAAGUUA;
ON-TARGETplus SMARTpool siRNA
J-058966-12, CD86:
CUCCAAACCUCUCAAUUUC
Tabelle 5.4: siRNA-Moleküle
Die siRNA-Moleküle wurden in lyophilisierter Form angeliefert. Vor Gebrauch wurden diese
auf eine Endkonzentration von 20 µM (0,3 µg/µl) in siRNA Suspension Buffer (Quiagen,
- 93 -
Material und Methoden
Hilden, D) aufgenommen, für 1 min bei 90°C erhitzt und anschließend für 1 h bei 37°C
gehalten. Nach Aliquotieren der Suspension erfolgte die Lagerung bei -80°C.
5.5
Zellkulturmedien und Zusätze
Bezeichnung
Firma
Cat. No.
Lot nr.
Lagerung
RPMI 1640
Invitrogen,
21875034
864105, 803570,
4°C
(+ L-Glutamin (300 mg/l)
Darmstadt, D
761595, 726280,
+ NaHCO3 (2000 mg/l))
744770
DMEM
Invitrogen,
(Natriumpyruvat 0,11 g/l
Darmstadt, D
41966029
775488, 748712,
4°C
726238
+ Pyridoxin)
Optimem
Invitrogen,
11058021
904135
4°C
P11-010
3/P01009-1954
-20 °C
S0115/1243T
1243T
-20°C
M7145
RNBB4233, RNBB1296
4°C
S-HEU 03-I
CEL-5302
-20°C
15630056
713087
4°C
M3148
-
4°C
10131027
624875
4°C
Darmstadt, D
Pen/Strep
PAA, Pasching,
Pen: 10000 U/ml
AU
Strep: 10000 µg/ml
FCS
Biochrom, Berlin,
D
Non essential amino
acids (100 x)
Sigma-Aldrich,
Horse serum
Cellconcepts,
Taufkirchen, D
Freiburg, D
HEPES (1 M)
Invitrogen,
Darmstadt, D
β-Mercaptoethanol
(10 mM)
Sigma-Aldrich,
Taufkirchen, D
Geneticin
Invitrogen,
Darmstadt, D
Tabelle 5.5: Zellkulturmedien und Zusätze
- 94 -
Material und Methoden
5.6
Verwendete Zelllinien/ primäre Zellen:
Bezeichnung
Eigenschaften
Anzucht/
Differenzierungsmedium
Kultivierungsmedium
Kulturbedingungen
X 63
GM-CSF
produzierende
Suspensionszellen
RPMI 1640,
10 % FCS,
10 mM HEPES,
0,05 mM β-ME,
1 % Pen/Strep
RPMI 1640,
10 % FCS,
10 mM HEPES,
0,05 mM β-ME,
1 % Pen/Strep,
nach Bedarf Zugabe
von 1 mg/ml
Geneticin
37°C, 5 % CO2,
90 % Luftfeuchte
L 929
M-CSF
produzierende
Zellen
DMEM, 10 % FCS,
10 mM HEPES,
0,05 mM β-ME,
1 % Pen/Strep
DMEM, 10 % FCS,
10 mM HEPES,
0,05 mM β-ME,
nach Bedarf Zugabe
von 1 % Pen/Strep
37°C, 5 % CO2,
90 % Luftfeuchte
Primäre
dendritische
Zellen
Aus murinem
Knochenmark
gewonnene
primäre Zellen
RPMI 1640,
10 % FCS,
10 mM HEPES,
0,05 mM β-ME,
1 % Pen/Strep,
15 % GM-CSF
RPMI 1640,
10 % FCS,
10 mM HEPES,
0,05 mM β-ME,
nach Bedarf Zugabe
von 1 % Pen/Strep
37°C, 5 % CO2,
90 % Luftfeuchte
Primäre
Makrophagen
Aus murinem
Knochenmark
gewonnene
primäre Zellen
DMEM, 10 % FCS,
1 % non essential
amino acids,
5 % horse Serum,
0,05 mM β-ME,
20 % L929 Überstand
RPMI 1640,
10 % FCS,
10 mM HEPES,
0,05 mM β-ME,
nach Bedarf Zugabe
von 1 % Pen/Strep
Zur Ausdifferenzierung:
37°C, 10 % CO2,
90 % Luftfeuchte;
Nach
Ausdifferenzierung:
37°C, 5 % CO2,
90 % Luftfeuchte
Tabelle 5.6: Zelllinien/primäre Zellen
- 95 -
Material und Methoden
5.7
Verwendete Bakterienstämme
Bezeichnung
Eigenschaften
Resistenz
E.coli HB101
Genotyp:
-
thi-1, hsdS20 (rB—, mB—),
supE44, recA13, ara-14, leu B6,
pro A2, lac Y1,rpsL20 (strr), xyl5, mtl-1, Referenz: Lacks, S and
Greenberg, J.R. (1977), J. Mol.
Biol, 114, 153.
E.coli pDiGc
Trägt pDiGc Plasmid;
Carbenicillin 50 µg/ml
Stamm exprimiert DsRed Protein
Arabinose-induzierbar (0,2 %
Arabinose), GFP konstitutiv;
Referenz (Plasmid): Helaine et
al. (2010), PNAS, 107 (8), 37463751.
Referenzstamm für
diagnostische Untersuchungen
S.aureus ATCC 25923
-
Tabelle 5.7: Bakterienstämme
Der Bakterienstamm E.coli HB101 wurde von Prof. Dr. Hensel (Universität Osnabrück,
ehemals Klinische Mikrobiologie des Universitätsklinikums Erlangen), zur Verfügung gestellt.
Das Plasmid pDiGc, das in E.coli HB101 eingeführt wurde, wurde von David Holden
(Imperial College London, UK) zur Verfügung gestellt. Der Bakterienstamm S.aureus ATCC
25923
wurde
von
der
diagnostischen
Abteilung
der
Klinischen
Mikrobiologie
(Universitätsklinikum Erlangen) erhalten und dient dort zur Qualitätskontrolle diagnostischer
Untersuchungen.
5.8
Versuchstiere
Die zur Herstellung von primären dendritischen Zellen und Makrophagen benötigten Mäuse
(C57BL/6) wurden von Charles River Breeding Laboratories (Sulzfeld, D) bezogen. Die
Zuchtpaare für die Mäuse, die durch genetische Modifikation einen Verlust der NOS2- bzw.
PHOX- und NOS2-Aktivität aufwiesen, (Nos2-/- bzw. Cybb-/-/Nos2-/-), wurden von W.-D. Hardt
(ETH Zürich, Schweiz) zur Verfügung gestellt. Cybb steht für das Gen, das für eine
Untereinheit des membrangebundenen Bestandteils der PHOX (gp91phox) kodiert. Die
Cybb-/-/Nos2-/- Mäuse entstanden, wie von Ackermann et al., 2008 beschrieben, durch
Kreuzung von B6.129S6-Cybbtm1Din/J40 Mäusen mit B6;129P2-Nos2tm1Lau/J41 Maüsen, wobei
beide Mäusestämme von Jackson Laboratories bezogen wurden. Die Zucht der Mäuse fand
innerhalb des Franz Penzoldt Zentrums der Friedrich-Alexander Universität ErlangenNürnberg statt. Alle Tiere wurden unter speziellen Pathogen-freien Verhältnissen gehalten.
- 96 -
Material und Methoden
5.9
Auswertung und Darstellung der Daten (software)
Die Auswertung der Daten erfolgte mit Hilfe der GraphPad Prism Software (Version 4;
GraphPad Software; La Jolla, CA, USA). Für die statistische Auswertung wurde der t-Test
(ungepaart bzw. gepaart, zweiseitig) angewendet, wobei das Signifikanzniveau für alle
Untersuchungen auf p=0,05 festgelegt wurde.
Auswertung der durchflusszytometrischen Daten :
Für die Auswertung der Daten, die am Durchflusszytometer erhoben wurden, wurde die
Software FlowJo (Tree Star, Inc.) verwendet. Die Graphen im Ergebnisteil der vorliegenden
Arbeit veranschaulichen entweder die Anzahl der Ereignisse (Zellzahl) bezogen auf die
entsprechende Fluoreszenzintensität oder den prozentualen Anteil der maximalen
Ereignisanhäufung (% Max) hinsichtlich der jeweiligen in der x-Achse angezeigten
Fluoreszenzintensität.
Erklärung des % Max-Wertes:
In einigen Graphen wurde statt der Zellzahl der prozentuale Anteil der maximalen
Ereignisanhäufung in der Y-Achse aufgeführt. Diese Darstellung veranschaulicht die relative
Verteilung
der
Ereignisse
über
den
gemessenen,
in
der
x-Achse
angezeigten
Fluoreszenzbereich. Hierfür wurde über die software FlowJo der Fluoreszenzbereich, über
den sich die Ereignisse einer Probe erstreckten, in 256 Teilbereiche eingeteilt. Anschließend
ermittelte das Programm den Teilbereich, der die meisten Ereignisse enthielt. Die
Ereignisanzahl dieses Teilbereiches entsprach der maximalen Ereignisanhäufung. Im
nächsten Schritt wurden die Ereignisanzahlen der restlichen 255 Teilbereiche zu der
maximalen Ereignisanhäufung in Relation gestellt, wodurch die Einheit % Max errechnet
wurde. Hierfür wurde nach folgender Gleichung vorgegangen:
% Max (in einem Fluoreszenzteilbereich x) =
Anzahl der Ereignisse (im Teilbereich x) / maximale Ereignisanhäufung X 100.
Ein Beispiel : die größte Anzahl der Ereignisse, die eine gleiche Fluoreszenz aufwiesen
entsprach 5000 Ereignisse (= maximale Ereignisanhäufung, was einem % Max-Wert von 100
% entspricht). In einem anderen Fluoreszenzbereich konnten 500 Ereignisse festgehalten
werden. Nach obiger Gleichung ergab sich ein % Max Wert für den zweiten
Fluoreszenzbereich von:
500 / 5000 X 100 = 10 (% Max)
Diese relative Darstellung wurde gewählt, da aus technischen Gründen nicht immer die
gleiche Ereignisanzahl in jeder Probe analysiert werden konnte. Jedoch wurde bei jeder
- 97 -
Material und Methoden
Messung darauf geachtet, dass mindestens 10000 Ereignisse aufgenommen wurden,
wodurch eine Fehlinterpretation ausgeschlossen war.
5.10 Laborgeräte
Bezeichnung
Vertrieb
Taqman
Applied Biosystems, Foster City, CA, USA
(ABI Prism 7900/7000 Sequence Detection
System)
Spiralplattierer (Eddy Jet)
IUL instruments, Königswinter, D
Hypoxiekammer (INVIVO2 300)
Ruskinn Technology, Bridgend, UK
Elektroporator (GenePulser Xcell)
Biorad, München, D
Durchflusszytometer (FACSCalibur)
BD Biosciences, Heidelberg, D
Spektrophotometer (Spectramax 340PC384)
Molecular Devices, LLC, USA
Lumineszenzdetektor (ChemiLux Imager)
INTAS, Science Imaging Instruments,
Göttingen, D
Tischzentrifuge (5417R)
Eppendorf, Hamburg, D
Zentrifuge (Megafuge 1.0R)
Heraeus Instruments, Hanau, D
SDS-Elektrophorese/
Biorad, München, D
Westernblot Apparatur
(mini PROTEAN® Tetra cell)
Zellinkubatoren (HERAcell 150; HERAcell 240)
Thermo-Scientific, Ulm, D
Tabelle 5.10: Laborgeräte
- 98 -
Material und Methoden
5.11 Puffer und Lösungen
PBS (2 Liter)
2,9 g KH2PO4,
pH=7,3
15,2 g Na2HPO4 2H2O,
9,6 g NaCl
SDS-Ladepuffer (4x)
4 % SDS,
0,125 M Tris pH 6,8,
10 % β-ME, 0,02 % Bromphenolblau,
10 % Glyzerin
SDS-Laufpuffer 10 x (1 Liter)
10 g SDS,
30,3 g Tris,
144,1 g Glycin;
(0,25 M Tris, 1,92 M Glycin, 1 % SDS)
Westernblot Transferpuffer 20 x (1 Liter)
24,22 g Tris,
150,14 g Glycin
(0,2 M Tris, 2 M Glycin); Lagerung bei 4°C
Westernblot Transferpuffer 1 x (1 Liter)
50 ml 20 x Transferpuffer,
200 ml Methanol,
750 ml ddH2O, Lagerung bei 4°C
PE-Rohpuffer
6,65 M Harnstoff,
10 % Glyzerin,
1 % SDS,
10 mM Tris-HCl pH 6,8
PE-Puffer (gebrauchsfertig)
PE-Rohpuffer,
0,5 mM DTT,
Roche Protease Inhibitor Cocktail
(1 Tablette auf 10 ml);
Lagerung bei -20 °C
Trypanblau-Lösung
1 v/v Trypanblau
4 v/v PBS
Tabelle 5.11: Puffer und Lösungen
- 99 -
Material und Methoden
5.12
Methoden
5.12.1 Anzucht von Bakterien
Die verwendeten Bakterien wurden in LB-Medium bzw. auf LB- oder MH-Agarplatten bei
37°C angezogen, wobei Flüssigkulturen im Rollschüttler inkubierten, um eine gleichmäßige
Belüftung der Bakteriensuspension sicher zu stellen. Bei Bedarf wurde zur Selektion der
Bakterienkulturen entsprechende Antibiotika in folgender Konzentration zugesetzt:
Antibiotikum
Konzentration im Anzuchtmedium
Ampicillin
50 µg/ml
Carbenicillin
50 µg/ml
Zum Animpfen von Flüssigkulturen wurden Kolonien der entsprechenden Bakterien
verwendet, die nicht älter als 7 Tage waren. Nach Ablauf von 7 Tagen wurde ein neuer
Ausstrich des Bakterienstammes auf Agarplatten hergestellt, wobei hierfür über den Verlauf
der vorliegenden Arbeit derselbe Bakterienstock (auf -80°C gelagert) verwendet wurde.
5.12.2 Herstellung elektrokompetenter Bakterien
Plasmide wurden mittels Elektroporation in Bakterien eingebracht. Um den entsprechenden
Bakterienstamm
Elektrokompetenz
zu
verleihen,
wurde
über
Nacht
eine
Bakteriensuspension des entsprechenden Stammes in LB-Medium unter den notwendigen
Selektionsbedingungen angezogen. Am nächsten Tag wurde die Suspension 1/100 in LBMedium verdünnt und bis zu einer optischen Dichte bei 600 nm von von 0,5 bis 0,8
subkultiviert. Anschließend wurden die Bakterien für 20 min auf Eis inkubiert, bei 7000 g/4°C
für 10 min zentrifugiert und in einer dem Subkultivierungsvolumen entsprechenden Menge
eiskalten, sterilen, destillierten Wassers resuspendiert. Dieser Waschschritt wurde mehrmals
wiederholt, wobei das Pellet zunächst in der Hälfte des vorherigen Volumens, danach in 1/20
Volumen eiskalten Wassers und letztendlich in 1/100 Volumen einer sterilen 10 %igen
Glyzerinlösung aufgenommen wurde. Die elektrokompetenten Bakterien wurden aliquotiert
und bei -80 °C gelagert.
- 100 -
Material und Methoden
5.12.3 Transformation von Bakterien mit Plasmiden
Um Plasmide in Bakterien einzubringen wurden 40 µl einer Suspension der zu
transformierenden elektrokompetenten Bakterien in einer Elektroporationsküvette (Peqlab,
Erlangen, D; Cat.no. 71-2030; 4 mm) mit ca. 1 µg Plasmid-DNA vermischt und bei 2,5 kV, 25
µF, 200 Ohm elektroporiert. Die Bakterien wurden mit 960 µl LB-Medium, das auf 37°C
vorgewärmt wurde, aus der Küvette gespült, für eine Stunde bei 37°C inkubiert und auf LBAgarplatten über Nacht unter Selektionsbedingungen, die von der in dem Plasmid
integrierten Antibiotikaresistenz vorgegeben wurde, bebrütet. Die angewachsenen Kolonien
wurden auf den Gehalt des Plasmides überprüft und nach positivem Befund für weitere
Experimente verwendet.
5.12.4 Analyse des Wachstums von Bakterien
Um zu untersuchen, ob eine Veränderung der Sauerstoffspannung oder die Behandlung mit
Rotenon den bakteriellen Stoffwechsel direkt beeinflusst, wurde das Wachstum der
Bakterien untersucht. Die Bakterienanzahl pro ml einer über Nacht angewachsenen
Suspension von E.coli bzw. S.aureus wurde in der gleichen Weise eingestellt wie vor der
Infektion von Zellen (siehe Abschnitt 5.12.18). Anschließend wurde die Bakteriensuspension
ohne Wirtszellen in Zellmedium (ohne Antibiotika) unter normoxischen bzw. hypoxischen (0,5
% O2) Bedingungen inkubiert. Wurde die Auswirkung des Inhibitors (Rotenon) untersucht,
wurde dem Medium Rotenon in einer Endkonzentration von 100 µM zugegeben. Da Rotenon
in Chloroform gelöst wurde, wurden in einem parallelen Ansatz Bakterien mit einer
entsprechenden Menge Chloroform gehalten. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten wurde ein
Teil der jeweiligen Ansätze seriell verdünnt und auf MH-Platten ausplattiert. Am nächsten
Tag wurden die KBE/ml (Kolonie-bildenden Einheiten/ml) anhand der auf den Platten
gewachsenen Kolonien bestimmt.
- 101 -
Material und Methoden
5.12.5 Gewinnung muriner myeloischer mononukleärer Zellen
Zur Gewinnung myeloischer mononukleärer Zellen wurden Knochenmarkszellen aus 6-9
Wochen alten Mäusen (Stamm: C57BL/6) isoliert und in speziellen Medien inkubiert, um die
Differenzierung zu dendritischen Zellen und Makrophagen zu veranlassen.
Isolierung von Knochenmarkszellen:
Die Knochenmarkszellen zur Generierung dendritischer Zellen und Makrophagen wurden
aus den Hinterläufen von C57BL/6 Mäusen gewonnen. Hierzu wurde die Maus mittels
Genickbruch getötet und auf einer oberflächensterilisierten Styroporplatte fixiert. Durch
Benutzung von sterilem Präparationsbesteck wurden die hinteren Extremitäten möglichst
nah am Hüftgelenk abgetrennt. Anschließend wurden die Knochen von Fell, Muskelfasern
und Sehnen befreit und in RPMI Vollmedium (RPMI 1640, 10 % FCS, 10 mM HEPES, 0,05
mM β-ME, 1 % Pen/Strep) überführt.
An der sterilen Werkbank wurden die Knochenenden eingeschnitten und durch die
entstandenen Öffnungen wurde das Knochenmark durch Zuhilfenahme einer mit RPMI
Vollmedium
gefüllten
Spritze
ausgespült.
Nach
anschließender
Zentrifugation
der
Knochenmarkszellen bei 1300 rpm für 5 min bei 4°C wurde die Zellzahl anhand einer
Neubauer Zählkammer bestimmt und die Zelldichte auf 6 mio Zellen pro ml eingestellt.
Anzucht dendritischer Zellen
Um die Knochenmarkszellen zu dendritischen Zellen ausdifferenzieren zu lassen, wurden 6
mio Zellen in 10 ml RPMI Vollmedium, das mit 15 % GM-CSF versetzt wurde (siehe Tabelle
5.6; „Differenzierungsmedium“), vermischt und auf speziell beschichtete 10 cm Petrischalen
der Firma Nunc (NunclonTM Surface, Cat.no. 150350) ausgebracht, auf deren Oberfläche die
dendritischen Zellen nicht adhärieren konnten. Die Zellen wurden im Brutschrank bei 37°C/ 5
% CO2/ 90 % Luftfeuchte für insgesamt 7 Tage inkubiert, wobei nach jedem dritten Tag 10 ml
mit 15 % GM-CSF versetztes RPMI Vollmedium zu den Zellen gegeben wurde, um eine
durchgehende Versorgung mit Wachstumsfaktoren und Nährstoffen zu gewährleisten. Am
Ende der 7 tägigen Inkubation wurden die im Medium schwimmenden dendritischen Zellen
von den Petrischalen gespült und für entsprechende Experimente verwendet. Zur Kontrolle
- 102 -
Material und Methoden
der erfolgreichen Ausdifferenzierung wurden bei jeder Zellernte durchflusszytometrische
Untersuchungen durchgeführt (siehe 5.12.8).
Anzucht von Makrophagen
Die Anzucht von Makrophagen erfolgte in hydrophoben Teflonbeuteln (DuPont, Cadillac
Plastic,
Karlsruhe,
Deutschland)
durch
deren
Beschichtung
die
ausdifferenzierten
Makrophagen ohne zellstresserzeugende mechanische oder chemische Maßnahmen
gewonnen werden konnten. Pro Beutel wurden 6 mio Knochenmarkszellen in 50 ml
Makrophagen-Anzuchtmedium, das mit 20 % Überstand von L929 Zellen versetzt wurde
(siehe Tabelle 5.6), vermischt und bei 37°C, 10 % CO2, 90 % Luftfeuchte für 7 Tage
inkubiert. Die Makrophagen wurden nach Ablauf der Ausdifferizierungsphase durch leichtes
Reiben von der Teflonbeutelwand gelöst, steril aus den Beuteln entnommen und in die
entsprechenden Experimente eingesetzt. Zur Kontrolle der erfolgreichen Ausdifferenzierung
wurden bei jeder Zellernte durchflusszytometrische Untersuchungen durchgeführt (siehe
5.12.8).
5.12.6 Gewinnung von GM-CSF-haltigem Mediumzusatz
Zur Ausdifferenzierung von dendritischen Zellen aus murinen Knochenmarkszellen wurde
GM-CSF benötigt, das durch Kultivierung von GM-CSF sezernierenden X63 Zellen
gewonnen wurde. Die Anzucht dieser Zellen erfolgte nach dem Auftauen bei 37°C/ 5 % CO2/
90 % Luftfeuchte in RPMI Vollmedium (siehe Tabelle 5.6; „Anzuchtmedium“). Nachdem die
Zellen konfluent angewachsen waren, wurden die Zellen in Medium, das mit 1 mg/ml
Geneticin versetzt wurde, für 2 Wochen gehalten, wobei das Medium jeden 3. Tag
gewechselt wurde. Die Zellen wurden anschließend in Medium ohne Geneticin weiter
kultiviert und bei Bedarf expandiert. Im weiteren Verlauf wurde jeden 3. Tag der mit GM-CSF
angereicherte Überstand der Suspensionszellen durch Zentrifugation bei 1400 rpm/4°C für 5
min gewonnen, wobei die pelletierten Zellen in frischem Medium weitergezüchtet wurden.
Die Zellüberstände wurden gesammelt, vereinigt und nach Sterilfiltrieren in Aliquots bei 4°C
gelagert.
- 103 -
Material und Methoden
5.12.7 Gewinnung von M-CSF-haltigem Mediumzusatz
Um die Differenzierung von murinen Knochenmarkszellen zu Makrophagen zu veranlassen,
wurde M-CSF-haltiger Überstand von L929 Zellen zum Medium zugefügt. Zur Gewinnung
dieses Mediumzusatzes wurden L929 Zellen in großen Zellkulturflaschen (175 cm2) in 50 ml
Medium (siehe Tabelle 5.6; „Anzuchtmedium“) bei 37°C/ 5 % CO2/ 90 % Luftfeuchte bis zur
Konfluenz kultiviert. Danach wurde jeden 3. Tag ein Mediumwechsel durchgeführt, wobei der
abgenommene, mit M-CSF angereicherte Überstand durch Zentrifugation bei 1400 rpm/4°C
für 5 min von abgelösten Zellen befreit und kühl gelagert wurde. Die Gewinnung dieses
Zellüberstandes wurde solange durchgeführt, bis sich die adhärenten L929 Zellen vom
Boden der Zellkulturflasche lösten.
Die bis zu diesem Zeitpunkt erhaltenen Überstände wurden vereinigt, sterilfiltriert und in
Aliquots bei 4°C gelagert.
5.12.8 Nachweis von zellulären Oberflächenmolekülen mittels Durchflusszytometrie
Nach 7-tägiger Inkubation muriner Knochenmarkszellen in GM-CSF- bzw. M-CSF-haltigem
Medium
wurde
durch
Nachweis
von
für
den
jeweiligen
Zelltyp
spezifischen
Oberflächenmolekülen die erfolgreiche Ausdifferenzierung der Knochenmarkszellen zu
dendritischen Zellen bzw. Makrophagen überprüft. Bei dendritischen Zellen wurde zusätzlich
der MHC II-Gehalt auf der Oberfläche der Zellen untersucht, um eine etwaige, unerwünschte
Voraktivierung zu erkennen. Nach der Zellernte wurden 100.000 Zellen pro Ansatz zunächst
mit anti CD16/32 versetzt (verwendete Verdünnung bei KM-DZ: 1/100; bei KM-MΦ 1/50) und
für 5 min bei 4°C lichtgeschützt inkubiert, um die an der Zelloberfläche vorhandenen
Antikörperrezeptoren (Fc Rezeptoren) zu blockieren. Die anschließende Markierung der
zelltypspezifischen Oberflächenmoleküle mit fluoreszierenden Antikörpern verlief bei
4°C/lichtgeschützt für ca. 20 min, wobei folgende Antikörper verwendet wurden:
Zelltyp
Antikörper
Verwendete AK- angekoppelte
Verdünnung
Fluoreszenz
mouse CD11c
1/100
APC
rat anti MHC II
mouse MHC II
1/100
FITC
rat anti F4/80
mouse F4/80
1/100
PE
rat anti CD11b
mouse CD11b
1/100
FITC
dendritische
Armenian hamster
Zellen
anti CD11c
Makrophagen
Antigen
- 104 -
Material und Methoden
Um die Spezifität der Färbung zu überprüfen, wurden die Zellen in einem separaten Ansatz
mit unspezifischen Antikörpern gefärbt, die den gleichen Isotyp wie die jeweiligen
spezifischen Antikörper aufwiesen und das gleiche Fluorochrom trugen. Der Nachweis der
Bindung der Antikörper und somit die Auswertung der Färbung erfolgte an einem
Durchflusszytometer (FACSCalibur, BD Biosciences, Heidelberg, D), wobei die IsotypKontrolle des jeweiligen Ansatzes genutzt wurde, um zwischen unspezifischer und
spezifischer Antikörperbindung zu unterscheiden.
Sollte die Expression anderer Oberflächenmoleküle (z.B. CD86) nachgewiesen werden,
wurde die Färbung wie im oberen Abschnitt aufgeführt durchgeführt, wobei die
entsprechenden spezifischen Antikörper und Isotyp-Kontrollen verwendet wurden (siehe
Tabelle 5.2.2.1/5.2.2.2)
5.12.9 Hypoxische Inkubation von Zellen
Um Zellen hypoxischen Bedingungen auszusetzen, wurden die Zellen in einer HypoxieKammer gehalten (INVIVO2300, Ruskinn Technology, West Yorkshire), in der der
Sauerstoffpartialdruck durch das Einleiten von gasförmigem Stickstoff erniedrigt wurde. Die
Kulturbedingungen waren: 37°C, 5 % CO2, 0,5 % O2.
5.12.10 Infektion von dendritischen Zellen und Makrophagen mit Bakterien
Aus dem Knochenmark von Mäusen gewonnene dendritische Zellen und Makrophagen
wurden 7 Tage nach Ausdifferenzierung in Antibiotika-freiem Zellkulturmedium (siehe
Tabelle 5.6; „Kultivierungsmedium“) aufgenommen und auf Zellkulturplatten ausgebracht.
Nach dem Adhärieren der Zellen wurden diese mit E.coli oder S.aureus infiziert. Hierfür
wurde
zunächst
die
Bakterienanzahl
einer
über
Nacht
herangewachsenen
Bakteriensuspension photometrisch ermittelt, wobei davon ausgegangen wurde, dass eine
optische Dichte bei 600 nm von 0,2 einer Bakteriendichte von ca. 400 mio Bakterien/ml
entspricht. Die Bakteriensuspension wurde anschließend in Antibiotika-freiem Zellmedium
verdünnt. Eine der jeweiligen MOI entsprechenden Bakterienmenge (MOI 10 = zehnfache
Menge bezogen auf die Anzahl der ausgebrachten myeloischen Zellen) wurde zu den Zellen
gegeben. Um die Infektion zu synchronisieren und um die Bakterien in nahen Kontakt zu den
Zellen zu bringen, wurden die Ansätze bei 1300 rpm für 5 min zentrifugiert. Nach einer
Inkubation der Zellen für 1 h im Zellbrutschrank wurden die Zellen 3x mit PBS gewaschen
und mit Medium, das 100 µg/ml Gentamicin enthielt, bedeckt, um nicht aufgenommene
- 105 -
Material und Methoden
Bakterien zu eliminieren. 1 h nach der ersten Gentamicin-Behandlung wurde die GentamicinKonzentration des Mediums nach einmaligem Waschen mit PBS auf 25 µg/ml reduziert. In
diesem Medium wurden die Zellen für den Rest des Experimentes gehalten. Wenn nicht
anders angegeben, wurden die Zellen 2 h nach Infektion den unterschiedlichen
Sauerstoffspannungen
ausgesetzt,
wobei
für
die
Inkubation
unter
normoxischen
Bedingungen die Zellen in den alltäglichen Zellbrutschrank (21 % O2, 37°C, 5 % CO2, 90 %
Luftfeuchte) gestellt wurden und die Exposition unter hypoxischen Bedingungen in einer
Hypoxie-Kammer (INVIVO2 300 Ruskinn Technology, Bridgend, UK) bei 0,5 % O2, 37°C, 5 %
CO2, 90 % Luftfeuchte verlief. Der Effekt einer Reoxygenierung wurde analysiert, indem die
Zellen nach Infektion für 8 h unter hypoxischen Bedingungen gehalten wurden und
anschließend für den Rest des Experimentes unter normoxischen Bedingungen inkubiert
wurden. Um die Auswirkung von Inhibitoren zu untersuchen, wurde das Zellmedium 2 h nach
Infektion
mit
den
entsprechenden
Reagenzien
versetzt.
Zur
Verhinderung
von
Fehlinterpretationen wurde bei diesen Experimenten zusätzlich ein Zellansatz mit dem
Lösungsmittel des entsprechenden Inhibitors versetzt. Wenn nicht anders angegeben,
erfolgten weitere Untersuchungen der Zellen (wie z.B. Analyse von Genexpressionen oder
Bestimmung des Proteingehaltes) 24 h nach Infektion.
5.12.11 Isolierung von Protein aus Zellen
Für die Isolierung des Gesamtproteins wurden die Zellen nach entsprechender Behandlung
mit einem Zellschaber von der Zellkulturplatte gelöst und in ein Reaktionsgefäß überführt.
Anschließend wurde die Zellsuspension sofort auf Eis gekühlt und bei 2000 rpm/4°C für 5
min zentrifugiert. Nach sorgfältiger Entfernung des Überstandes wurde das Zellpellet in PE
Puffer (50 µl/2 mio Zellen) resuspendiert. Um die Proben zu homogenisieren, wurden diese
im Ultraschallwasserbad bei 4°C für 2 x 5 min beschallt.
5.12.12 Bestimmung der Proteinkonzentration
Die Ermittlung der Proteinkonzentration erfolgte mit dem Dc Protein Assay Kit der Firma
Biorad (Cat.no: 50001-13, -14, -15) nach den Angaben des Herstellers.
- 106 -
Material und Methoden
5.12.13 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
Zur größengemäßen Auftrennung von in experimentellen Proben vorhandenen Proteinen
wurde
eine
diskontinuierliche
SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
nach
Lämmli
durchgeführt. Hierfür wurde die gewünschte Proteinmenge mit Proteinladepuffer versetzt und
auf ein 8 – 10 % iges Polyacrylamidgel geladen. Die Elektrophorese verlief bei 90 Volt bis die
Ladepuffer-Front das Trenngel erreichte. Anschließend wurde die angelegte Spannung für
den restlichen Gellauf auf 120 Volt erhöht. Sobald die Proteine ausreichend aufgetrennt
waren, wurde der Gellauf beendet, wobei der zusätzlich zu den Proben geladene
Proteinmarker (Prestained Protein Ladder; Thermo Scientific, Fermentas Molecular Biology
tools, Cat.no. 26616) als Referenz diente.
5.12.14 Westernblot (wet-blot Verfahren)
Im Anschluss an die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese wurden die der Größe nach
aufgetrennten Proteine auf eine PVDF-Membran (Polyvinylidenfluorid Membran, Millipore
Immobilon-P,
Cat.no.
IPVH00010)
mittels
des
sogenannten
„wet-blot“
Verfahrens
übertragen.
Der Aufbau des Blot-Sandwiches wurde auf der Seite der Blot-Einheit begonnen, die an dem
Minus-Pol der Spannungsquelle angeschlossen wurde. Zunächst wurden in Transferpuffer
getränkte, auf die Größe des SDS-Gels zugeschnittene Whatman- und Schwammfilter auf
die Lochplatte gelegt. Hierauf wurde das SDS-Gel überführt und mit einer PVDF Membran,
die vorher in Methanol für ca. 30 sec äquilibriert wurde, luftblasenfrei bedeckt. Der Abschluss
des Blot-Sandwiches bildete eine weitere Lage Whatman- und Schwammfilter. Die BlotEinheit wurde in eine Westernblotkammer eingesetzt, die vollständig mit Transferpuffer
aufgefüllt wurde. Um eine konstante und gleichmäßige Kühlung des Blot-Aufbaus zu
gewährleisten, wurde die Gelkammer mit einem Kühlaggregat bestückt und durch den
Gebrauch eines Magnetrührers der in der Kammer enthaltene Transferpuffer stetig
umgewälzt. Der Transfer der Proteine erfolgte bei 130 Volt für zwei Stunden, wobei der
Minus-Pol an die Gel-Seite des Blot-Sandwiches angelegt wurde.
5.12.15 Nachweis von Proteinen auf PVDF-Membranen
Die PVDF Membran wurde nach dem Transfer der Proteine kurz angetrocknet und für 1 h in
Blockierungspuffer (0,1 % Tween 20/ 5 % Magermilchpulver in PBS) geschwenkt, um die
- 107 -
Material und Methoden
nicht mit Protein besetzten Stellen auf der Membran mit Protein abzusättigen. Nach dem
Blockieren wurde die Membran in Blockierungspuffer überführt, der in einer entsprechenden
Verdünnung einen für das nachzuweisende Protein spezifischen, ungekoppelten primären
Antikörper enthielt. Die Inkubation im primären Antikörper erfolgte entweder über Nacht bei
4°C oder für 3 h bei RT. Für den Nachweis der Bindung des primären Antikörpers wurde die
Membran mit einem zum primären Antikörper passenden sekundären, HRP gekoppelten
Antikörper (verdünnt in Blockierungspuffer) für 1 h bei RT behandelt. Anschließend wurde
die HRP Aktivität durch Verwendung eines ECL Kits (SuperSignal® West Dura; Thermo
Scientific; Cat.no. 34075) an einem Lumineszenzdetektor (ChemiLux; iNTAS) detektiert.
5.12.16 RNA Isolierung aus Zellkulturen
Zur
Isolierung
von
RNA
aus
Zellen
wurden
diese
nach
Stimulation/Behandlung mit PBS gewaschen und mit peqGOLDTriFast
TM
entsprechender
(Peqlab, Erlangen;
Cat.no. 30-2010) von der Zellkulturplatte gespült, wobei 1 ml TriFast für 2 mio Zellen
verwendet wurde. Das Zelllysat wurde in ein frisches, RNase-freies Reaktionsgefäß
überführt und mit Chloroform (200 µl/ml TriFastTM) versetzt. Nachdem die Ansätze gut
gevortext und für 15 min bei RT inkubiert wurden, folgte eine Zentrifugation bei 12.000 g/4°C
für 20 min. Die obere, wässrige Phase jedes Ansatzes wurde in ein frisches Reaktionsgefäß
pipettiert, wobei darauf geachtet wurde, die Interphase nicht zu berühren, um Kontamination
mit DNA zu vermeiden. Die Fällung der in der wässrigen Phase enthaltenen RNA erfolgte
durch die Vermischung jedes Ansatzes mit 1 v/v Isopropanol, anschließender Inkubation für
10 min bei RT und Zentrifugation der Proben bei 12.000 g/4°C für 15 min. Nachdem das
Pellet mit 75 % Ethanol gewaschen und die Ansätze bei 7500 g/4°C für 5 min zentrifugiert
wurden, wurde der Überstand vollständig entfernt und die pelletierte RNA luftgetrocknet. Um
die RNA für die weitere Verwendung in Lösung zu bringen, wurde das Pellet mit RNasefreiem Wasser versetzt und für 10 min bei 60°C erwärmt.
- 108 -
Material und Methoden
5.12.17 cDNA Synthese
1-2 µg RNA wurde mittels des High Capacity cDNA Archive Kits (Applied Biosystems,
Darmstadt, D; Cat.no. 4322171) gemäß den Angaben des Herstellers in cDNA
umgeschrieben.
5.12.18 Quantitative real-time PCR
Um die Expression unterschiedlicher Gene zu untersuchen, wurde der mRNA Gehalt der
entsprechenden Gene mittels quantitativer real-time (Echtzeit) PCR (qRT-PCR) bestimmt.
Hierfür wurden 40 ng- 100 ng cDNA pro Ansatz eingesetzt. Für die qRT-PCR nach der
SYBR-Green-Methode wurde der jeweilige cDNA-Ansatz in einem Endvolumen von 20 µl mit
SYBR-Green-PCR-Mastermix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA; Cat.no.: 4309155)
und für das zu untersuchende Gen spezifischen Primern (Tabelle 5.3.2) vermischt. Die
Messung des jeweiligen mRNA(cDNA)-Gehaltes erfolgte mit Hilfe des ABI Prism 7000
Sequence Detection Systems (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), wobei die cDNA
unter folgenden Bedingungen amplifiziert wurde: einmaliges Erhitzen bei 95°C für 10 min; 40
Zyklen: 15 s 95°C, 60 s 60°C, 30 s 72°C. Die Daten wurden gemäß der ΔΔCT-Methode
ausgewertet, wobei die Hprt-1-Expression zur Normalisierung des mRNA-Gehaltes diente.
Die Spezifität und Länge der PCR-Produkte wurde durch Analyse des Schmelzpunktes
verifiziert.
Alternativ wurde die qRT-PCR unter Verwendung des Sequenzdetektors ABI Prism 7900
(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA ) durchgeführt. Der PCR-Ansatz setzte sich aus
cDNA, dem Taqman Universal Mastermix (Applied Biosystems, Cat.no. 4304437) und einem
Gemisch aus für das zu untersuchende Gen spezifischen Primern und dazu passender FAMmarkierter Sonde (Taqman® Gene Expression Assay, Applied Biosystems; Tabelle 5.3.1)
zusammen. In einem Endvolumen von 10 µl wurde die im Ansatz enthaltene cDNA unter
folgenden Bedingungen amplifiziert : einmalig: 2 min 50°C, 10 min 95°C; 40 Zyklen: 15 s
95°C, 60 s 60°C. Die Auswertung der Daten erfolgte ebenfalls gemäß der ΔΔCT-Methode,
wobei die Werte auf die jeweilige Expression des Hprt-1-Gens normalisiert wurden.
- 109 -
Material und Methoden
5.12.19 Untersuchung der antibakteriellen Kapazität myeloischer mononukleärer
Zellen
Zur Untersuchung der antibakteriellen Kapazität von dendritischen Zellen und Makrophagen
wurden sog. Gentamicin-Schutzversuche („Gentamicin Protection Assays“) durchgeführt, die
es erlauben die intrazelluläre Bakterienlast unter unterschiedlichen Bedingungen zu
bestimmen. Hiefür wurden pro Aussparung einer 24 well-Platte 500.000 ausdifferenzierte
dendritische Zellen bzw. Makrophagen in 500 µl RPMI Vollmedium ohne Antibiotika (siehe
Tabelle 5.6; „Kultivierungsmedium“) ausgebracht. 3 h nach Aussaat wurden die Zellen mit
einer der MOI („multiplicity of infection“) entsprechenden Bakterienanzahl einer über Nacht
gewachsenen Bakteriensuspension versetzt (bei MOI 10 wurden 500.000 x 10 = 5 mio
Bakterien zugegeben). Dabei wurde die Bakteriendichte der über Nacht angezogenen
Bakterienkultur photometrisch ermittelt, wobei angenommen wurde, dass die optische Dichte
bei 600 nm von 0,2 einer Bakteriendichte von 400 mio Bakterien/ml entspricht. Die
Bakteriensuspension wurde soweit verdünnt, sodass eine gleichmäßige Verteilung der
Bakterienkultur auf die unterschiedlichen Ansätze gewährleistet wurde. Zur Synchronisierung
des Infektionsprozesses und um die Bakterien näher zu den Zellen zu bringen, wurden die
Zellkulturplatten nach Zugabe der Bakterien bei 1300 rpm für 5 min bei RT zentrifugiert.
Während der anschließenden Inkubation der Ansätze für 1 h im Zellinkubator wurde den
dendritischen Zellen bzw. Makrophagen die Möglichkeit gegeben, die zugegebenen
Bakterien aufzunehmen. Nach diesem Inkubationsschritt wurden die Zellen 3x mit PBS
gewaschen und mit Medium, das 100 µg/ml Gentamicin enthielt, bedeckt, um nicht
aufgenommene Bakterien zu eliminieren. Durch diese Antibiotikabehandlung wurde
sichergestellt, dass im weiteren Verlauf des Experimentes nur phagozytierte Bakterien
detektiert wurden. 1 h nach der ersten Gentamicin-Behandlung wurde die GentamicinKonzentration des Mediums nach einmaligem Waschen mit PBS auf 25 µg/ml reduziert. In
diesem Medium wurden die Zellen für den Rest des Experimentes gehalten. Wenn nicht
anders angegeben, wurden die Zellen 2 h nach Infektion den unterschiedlichen
Sauerstoffspannungen
ausgesetzt,
wobei
für
die
Inkubation
unter
normoxischen
Bedingungen die Zellen in den alltäglichen Zellbrutschrank (21 % O2, 37°C, 5 % CO2, 90 %
Luftfeuchte) gestellt wurden und die Exposition unter hypoxischen Bedingungen in einer
Hypoxie-Kammer (INVIVO2 300 Ruskinn Technology, Bridgend, UK) bei 0,5 % O2, 37°C, 5 %
CO2, 90 % Luftfeuchte verlief. Der Effekt einer Reoxygenierung wurde analysiert, indem die
Zellen nach Infektion für 8 h unter hypoxischen Bedingungen gehalten wurden und
anschließend für den Rest des Experimentes unter normoxischen Bedingungen inkubiert
wurden. Um die Auswirkung von Inhibitoren zu untersuchen, wurde das Zellmedium 2 h nach
Infektion
mit
den
entsprechenden
Reagenzien
versetzt.
Zur
Verhinderung
von
- 110 -
Material und Methoden
Fehlinterpretationen wurde bei diesen Experimenten zusätzlich die antibakterielle Kapazität
der Zellen bestimmt, die mit dem Lösungsmittel des entsprechenden Inhibitors versetzt
wurden.
2 h und 24 h nach Infektion wurde das Zellmedium entfernt und durch 0,1 % Triton-X-100 (in
PBS) ersetzt, um die Zellen zu lysieren. Nach einem Zellaufschluss über 15 min wurden die
Zelllysate, die die intrazellulären Bakterien enthielten, in PBS, das mit 0,05 % Tween 80
versetzt wurde, seriell verdünnt und auf Müller-Hinton-Agarplatten ausplattiert. Am nächsten
Tag wurden die Bakterien-Kolonien auf den über Nacht bei 37°C bebrüteten Agarplatten
gezählt und die Kolonien-bildenden Einheiten (KBE oder CFU; „colony forming units“) pro ml
bestimmt. Die gewonnenen Daten wurden als „% überlebende Bakterien“ dargestellt, wobei
für die Ermittlung dieser Werte folgende Formel angewendet wurde:
% überlebende Bakterien :
(KBE/ml 24 h nach Infektion / KBE/ml 2 h nach Infektion) x 100
5.12.20 Analyse des intrazellulären Bakterienwachstums
Durch die Untersuchung der antibakteriellen Kapazität myeloischer mononukleärer Zellen
anhand der Durchführung von Gentamicin Schutzversuchen konnte nicht aufgeklärt werden,
ob der Einfluss auf die Anzahl intrazellulär überlebender Bakterien auf beeinträchtigte
antimikrobielle Mechanismen der Wirtszelle oder auf eine veränderte Teilungsaktivität der
intrazellulären
Bakterien
zurückzuführen
war.
Deshalb
wurde
anhand
von
zwei
experimentellen Ansätzen die bakterielle Proliferation in dendritischen Zellen und
Makrophagen untersucht, wobei beide Methoden auf einer proliferationsabhängigen
Verdünnung eines Fluoreszenzsignals (sog. „Fluorescence dilution assays“) beruhten.
Analyse der intrazellulären Proliferation von E.coli
Um die Teilungsaktivität von E.coli intrazellulär zu bestimmen, wurde ein FluoreszenzReporterplasmid, pDiGc, verwendet. Dieses Plasmid kodiert zum einen für ein konstitutiv
exprimiertes GFP und zum anderen für ein rot fluoreszierendes DsRed Protein unter der
Kontrolle eines Arabinose-induzierbaren Promotors (Helaine et al., 2010). Zur Untersuchung
der bakteriellen Teilungsrate mit Hilfe des Reporterplasmides wird zunächst die DsRedProduktion einer pDiGc-tragenden Bakteriensuspension durch Inkubation in Arabinosehaltigem Medium induziert. Anschließend werden die DsRed-reichen Bakterien Arabinosefreien Bedingungen ausgesetzt, um eine Neusynthese des DsRed-Proteins zu verhindern.
Eine Proliferation der Bakterien innerhalb dieser Bakteriensuspension führt zu einer
Verteilung der DsRed Proteine auf die Tochterzellen und somit zu einer Verringerung des
DsRed Proteingehaltes relativ zur Bakterienzahl. Somit ist es möglich, nach Entzug des
- 111 -
Material und Methoden
DsRed-Induktors
die
bakterielle
Teilung
anhand
einer
Verringerung
der
DsRed-
Fluoreszenzintensität relativ zur Bakterienzahl nachzuvollziehen (Helaine et al., 2010).
Für die Experimente, die das intrazelluläre Verhalten von E.coli aufklären sollten, wurde der
in den vorherigen Infektionsexperimenten verwendete E.coli Stamm (HB101) mit dem
Fluoreszenz-Reporterplasmid pDiGc transformiert. Vor der Infektion von dendritischen Zellen
und Makrophagen, wurde die DsRed-Synthese des so entstandenen E.coli HB101 pDiGc
Stammes durch eine Inkubation in Arabinose-haltigem Medium (0,2 % Arabinose in LB)
induziert. Anschließend wurden die Bakterien mit PBS gewaschen und in Arabinose-freies
Medium überführt. Mit dieser Bakteriensuspension wurden dendritische Zellen und
Makrophagen infiziert, wobei für jeden Ansatz 2 mio Zellen pro well einer 6 well Platte mit 20
mio Bakterien (= MOI 10) versetzt wurden. Nach einer Zentrifugation der Platten bei 1300
rpm/RT für 5 min und einer Inkubation für 1 h im Zellbrutschrank wurden die Zellen 3x mit
PBS gewaschen und für 1 h mit Medium behandelt, das 100 µg/ml Gentamicin enthielt.
Danach wurde die Gentamicinkonzentration durch einen Mediumwechsel auf 25 µg/ml
erniedrigt. Es folgte die Exposition der Zellen unter normoxischen (21 % O2; 5 % CO2; 37°C,
90% Luftfeuchte) bzw. hypoxischen Bedingungen (0,5 % O2; 5 % CO2; 37°C; 90 %
Luftfeuchte). Wie angegeben wurden die Zellen zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach
Infektion mit 0,1 % Triton-X-100 in PBS für 15 min bei RT lysiert. Das Lysat wurde 2x mit
kaltem PBS gewaschen, wobei nach jedem Waschschritt die Ansätze bei 10.000 rpm/4°C
zentrifugiert wurden. Die DsRed Fluoreszenzintensität der in kaltem PBS aufgenommenen
intrazellulären Bakterien wurde durchflusszytometrisch gemessen (FACSCalibur, BD
Biosciences; FL-2H Kanal). Die konstitutive GFP-Expression der Bakterien wurde genutzt,
um während der Analyse zwischen Zelldebris und Bakterien zu unterscheiden, indem nur die
Fluoreszenz der GFP-positiven (FL-1H Kanal) Partikel aufgenommen wurde, die eine
bakterienentsprechende Größe und Granulariät im forward bzw. sideward scatter aufwiesen.
Analyse der intrazellulären Proliferation von S.aureus
Die intrazelluläre Teilungsaktivität von S.aureus wurde in ähnlicherweise wie für E.coli
anhand eines Fluoreszenz-Verdünnungsassays analysiert. Jedoch wurde aufgrund der
verminderten Transformierbarkeit des Bakterienstammes eine andere Strategie gewählt, um
die Bakterien mit einem fluoreszierenden Protein zu versehen, dessen Verteilung über eine
Bakteriensuspension die bakterielle Teilungsrate widerspiegelt. Das fluoreszierende Molekül
CFSE (Carboxyfluorescein Diacetat Succinimidyl Ester) findet häufig Anwendung in der
Untersuchung von Teilungsraten von Zellen, wie z.B. Lymphozyten (Lyons, 1999). Dieses
Molekül kann Zellmembranen mittels passiver Diffusion durchqueren und bindet intrazellulär
kovalent an zytoplasmatische Proteine. Die Teilungsrate innerhalb einer CFSE-markierten
- 112 -
Material und Methoden
Zellpopulation führt zu einer Verteilung der CFSE-Moleküle auf die Tochterzellen. Dies
resultiert in einer Verringerung der CFSE-Fluoreszenz relativ zur Zellzahl. In einer Studie
konnte gezeigt werden, dass auch Bakterien mit CFSE markiert werden können ohne eine
Einschränkung der Viabilität der Bakterien zu verursachen (Tuominen-Gustaffson et al.,
2006). Deshalb wurde in der vorliegenden Arbeit anhand der teilungsabhängigen
Verdünnung des CFSE-Moleküls das intrazelluläre Wachstum von S.aureus analysiert. Vor
der Infektion von dendritischen Zellen und Makrophagen wurden die Bakterien mit CFSE
markiert. Hierfür wurden 500 µl einer Übernacht-Kultur von S.aureus zweimal mit PBS
gewaschen, wobei die Ansätze nach jedem Waschschritt bei 10.000 rpm/4°C zentrifugiert
wurden. Anschließend wurde das Bakterienpellet in 1 ml PBS, das 5 µM CFSE (5(6)-CFDA,
SE;CFSE, mixed isomers; Invitrogen, Darmstadt, D; Cat.no C1157) enthielt, aufgenommen
und für 15 min bei 37°C/lichtgeschützt inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit PBS, das
mit 5 % FCS versetzt wurde, wurden die gefärbten Bakterien in PBS resuspendiert. Die
Infektion der Zellen mit den CFSE-markierten Bakterien verlief analog zur Infektion der
Zellen
mit
dem
pDiGc-tragenden
E.coli-Stamm
(siehe
vorheriger
Abschnitt).
Zu
unterschiedlichen Zeitpunkten nach Infektion wurden die infizierten Zellen durch Inkubation
in 0,1 % Triton-X-100 (in PBS) für 15 min bei RT lysiert. Das Lysat wurde 2x mit kaltem PBS
gewaschen, wobei nach jedem Waschschritt die Ansätze bei 10.000 rpm/4°C zentrifugiert
wurden.
Um während der anschließenden durchflusszytometrischen Analyse zwischen Zelldebris und
phagozytierten Bakterien zu unterscheiden, wurde das Pellet in 100 µl einer Verdünnung
eines anti S.aureus Antikörpers resuspendiert (rabbit anti S.aureus; Acris Antibodies; Cat.No.
AP00865PU-N; Verdünnung des Antikörpers 1/100 in PBS, 10% FCS, 1% BSA) und für 1 h
auf Eis inkubiert. Nach weiterem zweimaligen Waschen in kaltem PBS wurde das Pellet in
100 µl sekundär Antikörperlösung (goat anti rabbit IgG (H+L)- Alexa Fluor 647; Invitrogen;
Cat.No. A21245; Verdünnung des Antikörpers 1/500 in PBS, 10% FCS, 1 % BSA) aufgenommen. Im Anschluss einer Inkubationszeit von 1 h auf Eis unter lichtgeschützten
Verhältnissen wurden die intrazellulären Bakterien innerhalb des erneut mit kaltem PBS
gewaschenen Zelllysates mit 0,4 % PFA fixiert. Die Messung der CFSE-Fluoreszenz der
Bakterien erfolgte mittels des Durchflusszytometers im FL-1H Kanal. Dabei wurde auf die
Alexa 647 (FL-4H Kanal) positiven Partikel fokussiert, die eine bakterienentsprechende
Größe und Granulariät im forward bzw. sideward scatter aufwiesen.
- 113 -
Material und Methoden
5.12.21 Nachweis der Aktivität der NOS2 (Griess Assay)
Die Aktivität der induzierbaren NO-Synthase (NOS2) wurde indirekt über den Nitritgehalt im
Zellüberstand gemessen.
Durch die Aktivität der NOS2 wird die essentielle Aminosäure L-Arginin zu Citrullin und
Stickstoff-Monoxid (NO) umgesetzt. Letzteres kann als gasförmiges, ungeladenes Molekül
frei die Zellmembran durchqueren und akkumuliert im Zellkulturüberstand. Dort wird es zu
Nitrit oxidiert. Deshalb ist es möglich von der Nitritkonzentration im Zellüberstand auf die
Aktivität der NOS2 zu schließen.
Zur Bestimmung der Nitritkonzentration wurden je 50 µl der zu untersuchenden zellfreien
Zellüberstände in eine 96 well Platte pipettiert und mit 50 µl 1 % Sulfanilamid (gelöst in 5 %
Phosphorsäure) versetzt. Nach einer Inkubationszeit von 5-10 min bei RT wurden pro Ansatz
50 µl 0,1 % Naphtylethylendiamin zugegeben. Die bei der Griess-Reaktion nitritabhängige
Bildung eines hellvioletten Azo-Farbstoffes wurde photometrisch bei 550 nm vermessen,
wobei die Höhe des Absorptionswertes mit dem Nitritgehalt im Medium korrelierte. Zur
Berechnung der Nitritkonzentration diente eine Verdünnungsreihe einer Natriumnitritlösung
bekannter Konzentration.
Da für die Oxidation von NO (dem Produkt der NOS2-Aktivität) zu Nitrit Sauerstoff notwendig
ist, wurde der Nitritnachweis aller zellfreien Überstände bei Normoxie (an Raumluft)
durchgeführt.
5.12.22 Nachweis reaktiver Sauerstoffspezies mittels CM-H2DCFDA
Die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies („reactive oxygen species“, ROS), die unter
anderem auf der Aktivität der phagosomenständigen NAD(P)H-Oxidase („phagocyte
NAD(P)H-oxidase“; PHOX) beruht, zählt zu den sauerstoffabhängigen antibakteriellen
Abwehrmechanismen. Um die Auswirkung eines Sauerstoffentzuges auf diesen Prozess zu
untersuchen, wurde der Gehalt an intrazellulären ROS unter den unterschiedlichen
Bedingungen mittels eines Fluoreszenzfarbstoffes, CM-H2DCFDA (Invitrogen, Cat.no.
C6827), bestimmt. Dieser Farbstoff diffundiert passiv in Zellen und reagiert dort mit reaktiven
Sauerstoffmolekülen, wodurch die Fluoreszenzintensität des Farbstoffes zunimmt. Um die
Reoxygenierung der hypoxischen Ansätze zu verhindern, wurden alle Schritte in der
Hypoxiekammer vollzogen, wobei die benötigten Reagenzien und Puffer für mindestens 6 h
unter hypoxischen Bedingungen voräquilibriert wurden. Für die Färbung mit dem ROSsensitiven Farbstoff wurden die Zellen nach entsprechender Behandlung mit PBS
gewaschen und in PBS mit 2 µM bzw. 20 µM CM-H2DCFDA für 20 min bei 37°C/5 % CO2
unter normoxischen bzw. hypoxischen Bedingungen beladen. Nach zweimaligem Waschen
- 114 -
Material und Methoden
der Zellen mit PBS wurden die Zellen für 15 min in RPMI 1640, 10% FCS, 10 mM HEPES,
0,05 mM β-ME inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit 3,5 % PFA für 10 min fixiert.
Die Fluoreszenzintensität des Farbstoffes in den unterschiedlichen Ansätzen wurde
durchflusszytometrisch vermessen (FL-1H Kanal; 10.000 Ereignisse („events“)/Ansatz).
5.12.23 Transfektion von Zellen mit siRNA mittels Elektroporation
Für die siRNA-vermittelte Verminderung der Expression von Genen in dendritischen Zellen
und Makrophagen stellte sich die Methode der Elektroporation als effizient und vorteilhaft
gegenüber der chemischen Transfektion heraus (Jantsch et al., 2008, Wiese et al., 2009).
Die ausdifferenzierten Zellen (7 Tage nach Inkubation in GM-CSF bzw. M-CSF-haltigem
Medium) wurden 3x mit Optimem (Invitrogen, Darmstadt, D; Cat.no. 11058021) gewaschen
und in Optimem auf eine Zellzahl von 4 x 107/ml eingestellt. Pro Ansatz wurden in einer
Elektroporationsküvette (Peqlab, Erlangen, D; Cat.no. 71-2030; 4 mm) 2 mio Zellen (50 µl
der eingestellten Zellsuspension), 6 µg siRNA und Optimem in einem Endvolumen von 100
µl vermischt. Nach einer Inkubationszeit von 5 min auf Eis wurden die Zellen bei 400 V, 150
µF, 100 Ω mit Hilfe des GenePulser Xcell (Biorad) elektroporiert. Anschließend wurden die
Zellen in RPMI Medium ohne Zusätze überführt und nach ca. 1 h mit demselben Volumen
eines RPMI-Mediums versetzt, dass die doppelte Menge an erforderlichen Zusätzen enthielt
(RPMI 1640, 20 % FCS, 10 mM HEPES, 0,1 mM β-ME).
24 h nach Elektroporation erfolgte die Stimulation bzw. Infektion der Zellen wie jeweils
angegeben.
- 115 -
Material und Methoden
5.12.24 Untersuchung der Viabilität von Zellen
Die Viabilität der Zellen wurde anhand verschiedener Methoden untersucht:
1.Trypanblau Färbung
Der in der Trypanblau-Lösung enthaltene Farbstoff kann nicht durch intakte Zellmembranen
diffundieren und akkumuliert somit nur in abgestorbenen Zellen. Dieses Prinzip wurde
ausgenutzt, um die Viabilität von Zellen unter unterschiedlichen Bedingungen zu analysieren.
Hierfür wurden die Zellen nach entsprechender Behandlung einmal mit PBS gewaschen und
mit einer 0,004 % Trypanblau-Lösung versetzt. Anschließend wurde mikroskopisch der Anteil
blau gefärbter Zellen gegenüber der Anzahl nicht gefärbter Zellen bestimmt.
2. MTT Assay
Einen weiteren Hinweis auf die Viabilität der Zellen lieferte die Reduktion des Farbstoffes 3(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT). Wird dieser Farbstoff zu
lebendigen Zellen gegeben, vermitteln die während des Zellstoffwechsels entstehenden
Reduktionsäquivalente NADH bzw. NADPH die Umsetzung des Farbstoffes zu einem
violetten Formazan, das photometrisch quantifiziert werden kann. Basierend auf diesem
theoretischen Hintergrund wurden die Zellen, die in einer 96 well Platte (0,5 x 105 Zellen in
150 µl Medium) unter den angegebenen Bedingungen inkubiert wurden, pro well mit 10 µl
des MTT-Reagenz (10 mg/ml; Sigma-Aldrich, Cat.no. M2128) versetzt und für 4 h bei 37°C
gehalten. Anschließend wurden 100 µl einer Lösung aus 10 % SDS und 0,01 N HCl zu
jedem Ansatz gegeben. Am nächsten Tag wurde die Formazanbildung bei 550 nm
photometrisch bestimmt.
3. Untersuchung der Zellmorphologie mittels Diff-Quik®
Eine Einschränkung in der Viabilität der Zellen ist in den meisten Fällen verbunden mit einer
Veränderung der Morphologie. Um einen Eindruck hinsichtlich einer morphologischen
Veränderung zu erhalten, wurden die Zellen in sog. chamber slides (eight-well Labtek®
Permanox chambers slide; Firma: NUNC; Naperville, IL) inkubiert. Nach entsprechender
Behandlung wurden die Kammern der chamber slides entfernt und die auf dem Objektträger
befindlichen Zellen mittels Diff-Quik® (Dade Behring, Schwalbach, D; Cat.no.: 130832,
130833, 130846) gemäß den Angaben des Herstellers gefärbt. Anschließend wurde die
Morphologie der Zellen mikroskopisch beurteilt.
- 116 -
Material und Methoden
4. Nachweis der Freisetzung der Laktat-Dehydrogenase (LDH)
Das Absterben einer Zelle verursacht die Zerstörung der Struktur der Plasmamembran,
wodurch zytosolische Komponenten aus der Zelle entlassen werden. Die Bestimmung der
Zellviabilität anhand des Cytotoxicity Detection Kits von Roche (Mannheim, Cat.no
11644793001) beruht auf der durch einen Zelltod vermittelten Freisetzung der Laktat
Dehydrogenase, eines zytosolischen Enzyms.
Um die LDH-Freisetzung nach entsprechender Behandlung der Zellen zu messen, wurden
die Zellüberstände entnommen und bei 500 g für 5 min zentrifugiert, um mögliche kontaminierende Zellen zu beseitigen. Bis zur Messung wurden die zellfreien Überstände bei 4°C
gehalten. Gemäß den Angaben des Herstellers wurde der im Kit enthaltenen Katalysator
(„Catalyst“) mit der Färbelösung („Dye solution“) vermischt. Anschließend wurden in einer 96
well Platte je 50 µl der Überstände mit je 50 µl des Reaktionsgemisches versetzt. Nach einer
Inkubation von 15 min bei RT wurde die Extinktion bei 492 nm photometrisch vermessen, die
mit der LDH-Aktivität korrelierte.
Da eine intrazelluläre Induktion der LDH zu einer erhöhten basalen Freisetzung dieses
Enzyms führen könnte, wurde zusätzlich die intrazelluläre Aktivität der LDH jeder Probe bestimmt. Hiefür wurden nach Entnahme der Zellüberstände die Zellen in PBS, das mit 0,1 %
Triton X-100 versetzt wurde, für 15 min inkubiert. Die LDH-Aktivität der Lysate wurde
ebenfalls durch Zuhilfenahme des Cytotoxicity Detection Kits photometrisch ermittelt.
Die relative LDH-Freisetzung wurde folgendermaßen berechnet:
rel. LDH = OD(492 nm) Überstand / OD(492 nm) Lysat
Um die Änderung der relativen LDH-Freisetzung im Vergleich zur Kontrolle darzustellen,
wurde der Wert der relativen LDH-Freisetzung der unbehandelten, normoxischen, nicht
infizierten (WT-) Zellen gleich 1 gesetzt, wodurch sich folgende Berechnung ergab:
Änderung der rel. LDH-Freisetzung: rel. LDH (Ansatz x) / rel. LDH (Kontrollansatz)
Da DMSO in einer hohen Konzentration den Zelltod vermittelt, wurde als Positivkontrolle in
jedem Experiment die relative LDH-Freisetzung von Zellen ermittelt, die für 24 h mit 20 %
DMSO behandelt wurden.
- 117 -
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Abkürzungsverzeichnis
7
Abkürzungsverzeichnis
Amp
Ampicilin
ARNT
“aryl
hydrocarbon
translocator”
AS
Aminosäure(n)
ATP
Adenosintriphosphat
APS
Ammoniumpersulfat
β-ME
beta-Mercaptoethanol
bp
Basenpaare
BSA
Rinderserumalbumin
receptor
nuclear
(engl. “bovine serum albumin”)
Carb
Carbenicillin
cDNA
komplementäre Desoxyribonukleinsäure
(engl. “copy desoxyribonucleic acid”)
5(6)-CFDA, SE;CFSE
(5-(and 6)-carboxyfluorescein diacetate,
succinimidylester)
CM-H2DCFDA
(5-(and-6)-chloromethyl-2´,7´dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl
ester)
CO
Kohlenstoffmonoxid
Cybb
gp91phox (Untereinheit des
membrangebundenen Bestandteils der
phagozytären NAD(P)H Oxidase (PHOX)
DC
“dendritic cells”
DZ
dendritische Zellen
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
Desoxyribonukleinsäure
(engl. “desoxyribonucleic acid”)
- 135 -
Abkürzungsverzeichnis
DNase
Desoxyribonuklease
DTT
Dithiothreitol
E. coli
Escherichia coli
EK
Endkonzentration
EtOH
Ethanol
g
Gramm
Gent
Gentamycin
GFP
grün fluoreszierendes Protein
(engl. “green fluorescent protein”)
GM-CSF
“granulocyte macrophage colony-stimulating
factor”
h
Stunde (engl. “ hour”)
H+
Proton
HIF
Hypoxie-induzierbarer Transkriptionsfaktor
(engl. “Hypoxia-inducible factor”)
HPRT-1
Hypoxanthine Guanin
Phosphoribosyltransferase 1
HRE
“hypoxia responsive element”; Bindestelle
für den Hypoxie-induzierbaren
Transkriptionsfaktor HIF innerhalb
regulatorischer Genabschnitte von HIFZielgenen
IFN-γ
Interferon gamma
IL-1
Interleukin 1
IL-4
Interleukin 4
IL-6
Interleukin 6
IL-10
Interleukin 10
IL-13
Interleukin 13
- 136 -
Abkürzungsverzeichnis
iNOS
induzierbare NO-Synthase (engl. “Inducible
NO- synthase”); Alternativbezeichnung:
NOS2
KBE
Kolonie-bildende Einheiten
KM-DZ
aus murinen Knochenmarkszellen
gewonnene dendritische Zellen
KM-MΦ
aus murinen Knochenmarkszellen
gewonnene Makrophagen
k.o.
“knock out”
l
Liter
LB
Luria Bertani Medium
LPS
Lipopolysaccharid
M
Molar
mA
Milliamper
M-CSF
“macrophage colony-stimulating factor”
MH
Müller-Hinton
MHC
Haupthistokompatibilitäts-Komplex
(engl. “Major histocompatibility complex”)
min
Minute
ml
Milliliter
mM
Millimolar
µM
Mikromolar
µg
Mikrogramm
MOI
“multiplicity of infection”
mRNA
Boten-Ribonukleinsäure
(engl. “messenger ribonucleic acid”)
mROS
mitochondriale ROS
- 137 -
Abkürzungsverzeichnis
NAD(P)H
Nikotinamid-Dinukleotid(Phosphat)
NF-κB
“nuclear factor 'kappa-light-chain-enhancer'
of activated B-cells”
ng
Nanogramm
nm
Nanometer
nmol
Nanomol
NO
Stickstoffmonoxid
NOS2
induzierbare NO-Synthase;
Alternativbezeichnung: iNOS
OD
optische Dichte
P
Phosphat
PAGE
Polyacrylamidgelelektrophorese
PCR
Polymerasekettenreaktion
(engl. “polymerase chain reaction”)
Pen/Strep
Penicillin/Streptomycin
PFA
Paraformaldehyd
Pgk1
Phosphoglyzerat Kinase 1
PHD
HIF-spezifische Prolylhydroxylase (engl.
“Prolyl hydroxylase domain protein”)
PHOX
phagozytäre (NAD(P)H) Oxidase
qRT-PCR
quantitative reverse Transkriptase PCR
RNA
Ribonukleinsäure (engl. ribonucleic acid”)
RNase
Ribonuklease
RNS
reaktive Stickstoffspezies (engl. “reactive
nitrogen species”)
ROS
reaktive Sauerstoffspezies (engl. “reactive
oxygen species”)
- 138 -
Abkürzungsverzeichnis
rpm
Umdrehungen pro Minute (engl. “ rounds
per minute”)
RT
Raumtemperatur
RT-PCR
reverse TranskriptasePolymerasekettenreaktion
(engl. “reverse transcriptase polymerase
chain reaction”)
RT-Reaktion
reverse Transkriptase Reaktion
S.aureus
Staphylokokkus aureus
SDS
Natrium-dodecylsulfat
(engl. “sodium-dodecylsulfate”)
sec
Sekunde (engl. “second”)
SEM
standard error of mean”
siRNA
“small interfering RNA”
Stabw
Standardabweichung
TEMED
N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin
TLR
Toll-ähnlicher Rezeptor (engl. “toll-like
receptor”)
TNF-α
Tumor-Nekrosefaktor α
Tris
Trihydroxymethylaminomethan
U
“Units”
ÜN
über Nacht
V
Volt
WT
Wildtyp
- 139 -
Publikationsliste
8
Publikationen
Auf die vorliegende Arbeit bezogene Publikationen:
1. WIESE, M., GERLACH, R. G., POPP, I., MATUSZAK, J., MAHAPATRO, M.,
CASTIGLIONE, K., CHAKRAVORTTY, D., WILLAM, C., HENSEL, M., BOGDAN, C.
& JANTSCH, J. (2012) Hypoxia-Mediated Impairment of the Mitochondrial
Respiratory Chain Inhibits the Bactericidal Activity of Macrophages. Infection
and Immunity, 80, 1455-1466.
2. WIESE, M., CASTIGLIONE, K., HENSEL, M., SCHLEICHER, U., BOGDAN, C. &
JANTSCH, J. (2009) Small interfering RNA (siRNA) delivery into murine bone
marrow-derived macrophages by electroporation. The Journal of
Immunological Methods, 353, 102-110.
- 140 -
Publikationsliste
Sonstige Publikationen:
1. JANTSCH, J., WIESE, M., SCHÖDEL, J., CASTIGLIONE, K., GLÄSNER, J.,
KOLBE, S., MOLE, D., SCHLEICHER, U., ECKARDT, K.-U., HENSEL, M., LANG,
R., BOGDAN, C., SCHNARE, M. & WILLAM, C. (2011) Toll-like receptor
activation and hypoxia use distinct signaling pathways to stabilize hypoxiainducible factor 1α (HIF1A) and result in differential HIF1A-dependent gene
expression. Journal of Leukocyte Biology, 90, 551-562.
2. GIMM, T., WIESE, M., TESCHEMACHER, B., DEGGERICH, A., SCHÖDEL, J.,
KNAUP, K. X., HACKENBECK, T., HELLERBRAND, C., AMANN, K., WIESENER,
M. S., HÖNING, S., ECKARDT, K.-U. & WARNECKE, C. (2010) Hypoxia-inducible
protein 2 is a novel lipid droplet protein and a specific target gene of hypoxiainducible factor-1. The FASEB Journal, 24, 4443-4458.
3. KLEPEK, Y.-S*., VOLKE, M*., KONRAD, K. R., WIPPEL, K., HOTH, S., HEDRICH,
R. & SAUER, N. (2010) Arabidopsis thaliana POLYOL/MONOSACCHARIDE
TRANSPORTERS 1 and 2: fructose and xylitol/H+ symporters in pollen and
young xylem cells. Journal of Experimental Botany, 61, 537-550.
* These authors contributed equally to this work
4. VOLKE, M., GALE, D. P., MAEGDEFRAU, U., SCHLEY, G., KLANKE, B.,
BOSSERHOFF, A.-K., MAXWELL, P. H., ECKARDT, K.-U. & WARNECKE, C.
(2009) Evidence for a Lack of a Direct Transcriptional Suppression of the Iron
Regulatory Peptide Hepcidin by Hypoxia-Inducible Factors. PLoS ONE, 4,
e7875.
5. JANTSCH, J., CHAKRAVORTTY, D., TURZA, N., PRECHTEL, A. T., BUCHHOLZ,
B. R., GERLACH, R. G., VOLKE, M., GLÃSNER, J., WARNECKE, C., WIESENER,
M. S., ECKARDT, K.-U., STEINKASSERER, A., HENSEL, M. & WILLAM, C. (2008)
Hypoxia and Hypoxia-Inducible Factor-1α Modulate LipopolysaccharideInduced Dendritic Cell Activation and Function. The Journal of Immunology,
180, 4697-4705.
6. JANTSCH, J., TURZA, N., VOLKE, M., ECKARDT, K.-U., HENSEL, M.,
STEINKASSERER, A., WILLAM, C. & PRECHTEL, A. T. (2008) Small interfering
RNA (siRNA) delivery into murine bone marrow-derived dendritic cells by
electroporation. The Journal of Immunological Methods, 337, 71-77.
7. WARNECKE, C., WEIDEMANN, A., VOLKE, M., SCHIETKE, R., WU, X., KNAUP,
K. X., HACKENBECK, T., BERNHARDT, W., WILLAM, C., ECKARDT, K.-U. &
WIESENER, M. S. (2008) The specific contribution of hypoxia-inducible factor2α to hypoxic gene expression in vitro is limited and modulated by cell typespecific and exogenous factors. Experimental Cell Research, 314, 2016-2027.
- 141 -
9
Danksagung
Mein Dank gilt Prof. Dr. Michael Hensel, PD Dr. med Carsten Willam und Dr. med Jonathan
Jantsch, die es mir ermöglichten, ein spannendes und herausforderndes Projekt zu
bearbeiten. Desweiteren möchte ich mich bei Prof. Dr. Hensel für die Möglichkeit zur
Benutzung seiner Laborräume, für die großzügige Bereitstellung von Materialien und nicht
zuletzt für die Übernahme des Erstgutachtens und der Betreuung der Doktorarbeit
bedanken.
Einen großen Dank möchte ich Dr. med Jonathan Jantsch aussprechen für die umfangreiche
Unterstützung, das große Vertrauen in meine Arbeit, die vielen fruchtbaren Diskussionen und
die zahlreichen aufbauenden Worte.
Prof. Dr. Bogdan möchte ich für die Aufnahme als Mitarbeiterin seines Institutes und für
seine Ratschläge und Hilfestellungen danken.
Den Mitarbeitern der Nephrologie (Loschgestr.) und der Klinischen Mikrobiologie in Erlangen,
insbesondere Kirstin Castiglione, möchte ich für die sehr gute Zusammenarbeit, das tolle
Arbeitsklima und Unterstützung danken. Jeder einzelne hat zum Gelingen dieser Arbeit
beigetragen.
Des Weiteren gilt ein besonderer Dank meiner Weggefährtin Dr. Agnes Schröder, die mir in
vielen schwierigen Situationen eine Stütze war. Auch wenn sich unsere Wege doch trennen
mussten, hoffe ich, dass der Kontakt nie abbrechen wird.
Zum Schluss möchte ich meiner Familie und meinem Mann Ralf für die endlose Geduld und
Unterstützung danken.
- 142 -
Anhang
10
Anhang
Abbildungsverzeichnis:
Abbildung 1.1: Schematische Darstellung der Domänenstruktur der unterschiedlichen
Untereinheiten des Hypoxie-induzierbaren Transkriptionsfaktors HIF (nach Lisy et al., 2008)
5
Abbildung 1.2: Übersicht über die sauerstoffabhängige Regulation der Aktivität des Hypoxieinduzierbaren Transkriptionsfaktors HIF
7
Abbildung 1.3: Überblick über die Entstehung reaktiver Stickstoff- und Sauerstoffspezies
vermittelt über die Aktivität der NOS2 (induzierbare NO-Synthase) und der PHOX (NAD(P)H
Oxidase; „phagocyte oxidase“) nach Fang, 2004
19
Abbildung 2.1: Die Infektion von dendritischen Zellen und Makrophagen mit E.coli bzw.
S.aureus führt zur normoxischen Stabilisierung und Aktivierung von HIF-1α
26
Abbildung 2.2: Effizienz der Transfektion von Makrophagen mittels Elektroporation
28
Abbildung 2.3: Auswirkung der Elektroporation auf die Viabilität von Makrophagen
29
Abbildung 2.4: Untersuchung der Morphologie von Makrophagen nach Elektroporation
30
Abbildung 2.5: Auswirkung der Elektroporation auf die Funktion von Makrophagen
32
Abbildung 2.6: Das Einführen von siRNA in Makrophagen mittels Elektroporation führt zur
effizienten Unterdrückung der Expression der entsprechenden Gene
33
Abbildung 2.7: Das Einführen von siRNA in Makrophagen mittels Elektroporation führt zur
effizienten Unterdrückung der Expression der entsprechenden Gene
34
Abbildung 2.8: Die Elektroporation von dendritischen Zellen und Makrophagen mit Hif-1αspezifischer siRNA führt zur Unterdrückung der Aktivität des Hypoxie-induzierbaren
Transkriptionsfaktors HIF-1α
36
Abbildung 2.9: Auswirkung einer verminderten HIF-1α-Aktivität auf die antibakterielle
Kapazität myeloischer mononukleärer Zellen
38
143
Anhang
Abbildung
2.10:
Hypoxie
beeinträchtigt
die
antibakterielle
Kapazität
myeloischer
mononukleärer Zellen
39
Abbildung 2.11: Effekt von Hypoxie auf das bakterielle Wachstum
41
Abbildung 2.12: Analyse der Proliferation von E.coli anhand des pDiGc Plasmides
43
Abbildung
2.13: Untersuchung des
Wachstums von E.coli innerhalb myeloischer
mononukleärer Zellen
45
Abbildung 2.14: Darstellung der Proliferation von S.aureus durch Markierung mit CFSE
47
Abbildung 2.15: Untersuchung des Wachstums von S.aureus innerhalb myeloischer
mononukleärer Zellen
48
Abbildung 2.16: Hypoxie verringert die Aktivität der induzierbaren NO-Synthase (NOS2)
50
Abbildung 2.17: Bestimmung der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies unter hypoxischen
Bedingungen
51
Abbildung 2.18: Auswirkung einer verminderten Aktivität der NOS2 auf die Eliminierung
phagozytierter Bakterien
53
Abbildung 2.19: Verifizierung des Verlustes der Aktivität der NOS2 und PHOX in myeloischen
mononukleären Zellen aus Cybb-/-/Nos2-/- Mäusen
55
Abbildung 2.20: Überprüfung der Viabilität PHOX/NOS2 defizienter Zellen
56
Abbildung 2.21: Ein gleichzeitiger Verlust der Aktivität der NOS2 und der PHOX ist nicht
vollständig für die verringerte antimikrobielle Kapazität unter hypoxischen Bedingungen
verantwortlich
57
Abbildung 2.22: Rotenon führt zu keiner Veränderung des bakteriellen Wachstums
59
Abbildung 2.23: Rotenon führt zu keiner Beeinträchtigung der Viabilität infizierter KM-DZ und
KM-MΦ
60
Abbildung 2.24: Wirkung von Rotenon auf die antibakterielle Kapazität von KM-DZ und KMMΦ
62
Abbildung 2.25: Effekt der Inhibition des Komplex IV in der mitochondrialen Atmungskette auf
die intrazelluläre Eliminierung von Bakterien
63
144
Anhang
Abbildung 2.26: Einfluss von Antimycin A auf die antibakterielle Kapazität myeloischer
mononukleärer Zellen
65
Abbildung 3.1: Schematische Zusammenfassung der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit
82
Tabellenverzeichnis:
Tabelle 5.1: Chemikalien und Reagenzien
87
Tabelle 5.2.1: Antikörper (Westernblot)
90
Tabelle 5.2.2.1: spezifische Antikörper (Durchflusszytometrie)
91
Tabelle 5.2.2.2: Isotyp-Kontrollen (Durchflusszytometrie)
92
Tabelle 5.3.1: Taqman®Gene Expression Assay
92
Tabelle 5.3.2: Gen-spezifische Primer für qRT-PCR (SYBR-Green)
92
Tabelle 5.4: siRNA-Moleküle
93
Tabelle 5.5: Zellkulturmedien und Zusätze
94
Tabelle 5.6: Zelllinien/primäre Zellen
95
Tabelle 5.7: Bakterienstämme
96
Tabelle 5.10: Laborgeräte
98
Tabelle 5.11: Puffer und Lösungen
99
145
