Immunhistologische Untersuchungen zur Expression variabler

Aus dem Institut für Pathologie
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Immunhistologische Untersuchungen zur Expression variabler
Oberflächenantigene von Mycoplasma bovis und zur Immunreaktion
in der Lunge von experimentell infizierten Rindern
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Inka Buchenau
aus Hildesheim
Hannover 2003
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. M. Hewicker-Trautwein
1. Gutachter:
Univ.-Prof. Dr. M. Hewicker-Trautwein
2. Gutachter:
PD Dr. H.-J. Schuberth
Tag der mündlichen Prüfung:
30. Mai 2003
Meinen Eltern und Thomas
Inhaltsverzeichnis
1
Einleitung
1
2
Literaturübersicht
2
2.1 Mykoplasmen
2.1.1 Allgemeine Eigenschaften und Taxonomie
2
2.1.2 Variabilität bei Mykoplasmen
4
2.1.2.1
Antigen- und Phasenvariation bei Mykoplasmen
4
2.1.2.2
Variabilität bei Mycoplasma bovis
6
2.1.3 Mykoplasmen als Krankheitserreger bei Tieren
2.2 Mykoplasmosen des Rindes
2.2.1 Respiratorische Infektionen
8
10
10
2.2.1.1
Lungenseuche
10
2.2.1.2
Mycoplasma bovis-Infektion
10
2.2.1.3
Weitere respiratorische Mykoplasmeninfektionen
10
2.2.2 Sonstige Infektionen
2.3 Erkrankungen durch Mycoplasma bovis
11
12
2.3.1 Eigenschaften von Mycoplasma bovis
12
2.3.2 Erkrankungen des Respirationstraktes
13
2.3.2.1
Spontaninfektionen
13
2.3.2.2
Experimentelle Infektionen
15
2.3.2.3
Immunhistologische Befunde
18
2.3.3 Sonstige Erkrankungen
2.4 Bronchus-assoziiertes lymphatisches Gewebe (BALT)
3
2
19
21
2.4.1 Das immunologische System der Lunge
21
2.4.2 Vorkommen und Entwicklung des BALT bei Mensch und Tier
22
2.4.3 Reaktionen des BALT bei respiratorischen Mykoplasmeninfektionen
27
Eigene Untersuchungen
3.1 Material und Methoden
3.1.1 Infektionsversuche und Untersuchungsmaterial
3.1.1.1
Infektionsversuche
29
29
29
29
3.1.1.2
Kontrolltiere
32
3.1.1.3
Pathologisch-anatomische Untersuchung der Lungen
35
3.1.1.4
Untersuchungsmaterial
35
3.1.2 Probenaufbereitung für die Lichtmikroskopie und Immunhistochemie
3.1.2.1
Gewebefixierung und Einbettung sowie Anfertigung von Paraffinschnitten
3.1.2.2
Gewebekonservierung und Anfertigung von Kryostatschnitten
3.1.3 HE- und Spezialfärbungen
3.1.3.1
36
36
37
37
Färbung der Paraffinschnitte mit Hämalaun-Eosin (HE-Färbung)
37
3.1.3.2
Färbung der Paraffinschnitte mit Toluidinblau
37
3.1.3.3
Elastika van Gieson-Färbung der Paraffinschnitte
37
3.1.4 Vorversuche für die Immunhistologie
38
3.1.5 Immunhistologische Untersuchungen
38
3.1.5.1
Verwendete Antikörper
38
3.1.5.2
Untersuchungsmethoden am Paraffinschnitt
38
3.1.5.3
Untersuchungsmethoden am Kryostatschnitt
40
3.1.5.4
Primäre Antikörper
40
3.1.5.5
Sekundäre Antikörper
42
3.1.5.6
Spezifitätskontrollen
42
3.1.6 Auswertung und Dokumentation
3.2 Untersuchungsergebnisse
3.2.1
43
44
Histopathologische und immunhistologische Befunde an Lungengewebeproben des Versuches A
44
3.2.1.1
Histopathologische Befunde
44
3.2.1.2
Immunhistologische Befunde am Paraffinschnitt mit dem
monoklonalen Antikörper 4D7
3.2.1.3
Immunhistologische Befunde am Paraffinschnitt mit dem
monoklonalen Antikörper 2A8
3.2.2
46
47
Histopathologische und immunhistologische Befunde an Lungengewebeproben des Versuches B
47
3.2.2.1
Histopathologische Befunde
47
3.2.2.2
Immunhistologische Befunde am Paraffinschnitt
50
3.2.2.3
Immunhistologische Befunde am Kryostatschnitt
52
3.2.3 Histopathologische und immunhistologische Befunde an Lungengewebeproben des Versuches C
55
3.2.3.1
Histopathologische Befunde
55
3.2.3.2
Immunhistologische Befunde am Paraffinschnitt
62
3.2.3.3
Immunhistologische Befunde am Kryostatschnitt
65
3.2.4 Histopathologische und immunhistologische Befunde an Lungengewebeproben der Kontrolltiere
67
3.2.4.1
Histopathologische Befunde
67
3.2.4.2
Immunhistologische Befunde am Paraffinschnitt
68
3.2.4.3
Immunhistologische Befunde am Kryostatschnitt
68
3.2.4.4
Reaktionen an Mastzellen
70
3.2.5 Immunhistologische Untersuchungen zum Vorkommen von
Lymphozyten im Lungengewebe (Versuche A, B und C)
3.2.5.1
Vorkommen und Verteilung von T-Lymphozyten und deren
Subpopulationen (CD3, CD4 und CD8)
3.2.5.2
4.
70
Verteilung von B-Lymphozyten und Plasmazellen (CD79a)
Diskussion
70
72
76
4.1
Histopathologische Befunde
76
4.2
Variable Oberflächenproteine
80
4.3
BALT und Lymphozyten des Lungengewebes
84
5
Zusammenfassung / Summary
90
6
Literaturverzeichnis
94
7
Anhang
113
7.1 Immunhistochemische Methoden
113
7.1.1 Übersicht für die ABC Methode am Paraffinschnitt
113
7.1.2 Übersicht für die ABC Methode am Kryostatschnitt
114
7.2 Vorbehandlungen für die Immunhistochemie
115
7.2.1 Demaskierung mit Demaskierungslösung G im Wasserbad
115
7.2.2 Demaskierung mit 0,25%iger Trypsinlösung
115
7.3 Reagenzien für die Immunhistochemie
7.3.1 Phosphatpuffer (PBS)
115
115
7.3.2 ABC-Gebrauchslösung
115
7.3.3 DAB-Gebrauchslösung
115
7.4 Färbungsprotokolle
116
7.4.1 HE-Färbung am Paraffinschnitt
116
7.4.2 Toluidinblau-Färbung
116
7.4.3 Elastika van Gieson-Färbung
116
7.5 Ergebnistabellen
117
7.5.1 Ergebnisse der Immunhistologie, Versuch B (CD4 / CD8)
117
7.5.2 Ergebnisse der Immunhistologie, Versuch C (CD4 / CD8)
118
Abkürzungsverzeichnis
ABC
Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex
Aq. dest.
Aqua destillata
BALT
engl. bronchus associated lymphoid tissue (Bronchus-assoziiertes
lymphatisches Gewebe)
BRSV
engl. bovine respiratory syncytial virus
BSA
Bovines Serumalbumin
BVDV
Bovines Virusdiarrhoe Virus
CD
engl.
Cluster
of
differentiation
(System
zur
Bezeichnung
von
Leukozytendifferenzierungsantigenen)
CFU
engl. Colony forming units (Koloniebildende Einheiten)
DAB
3,3’-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid
DNS
Desoxyribonukleinsäure
et al.
et alii (=und andere)
HIV
engl. human immunodeficiency virus
HEV
engl. high endothelial venules (postkapilläre Venulen)
IFN-?
Interferon- ?
IL-4
Interleukin-4
IgA
Immunglobulin A
IgG
Immunglobulin G
kbp
Kilobasenpaare
mAk
monoklonaler Antikörper
M. bovis
Mycoplasma bovis
PBS
engl. phosphate-buffered saline (Phosphat-gepufferte Koch-salzlösung)
p.i.
post infectionem
SDS-PAGE
engl.
sodium
dodecyl
sulfate-polyacrylamid
gel
electrophoresis
(Dodecylsulfat-Natriumsalz-Polyacrylamid-Gelelektrophorese)
V-1
variables Antigen 1 von Mycoplasma pulmonis
Vlp
variables Lipoprotein
vsa
Gen
im
Mycoplasma
pulmonis-Genom,
das
phasenvariable
Oberflächenantigene kodiert
Vsp
engl. variable surface protein (variables Oberflächenprotein)
Einleitung
1
1 Einleitung
Mycoplasma (M.) bovis ist neben Mycoplasma mycoides subsp. mycoides der wichtigste
Auslöser boviner Mykoplasmosen und tritt weltweit mit zunehmender Bedeutung auf.
Pneumonien und Arthritiden bei Kälbern und Jungrindern sowie Mastitiden bei Kühen sind
dabei die häufigsten Erkrankungen, die dieser Erreger hervorruft. Die durch Mycoplasma
bovis verursachte Pneumonie bei Kälbern ist neben der Mastitis bei Kühen die wirtschaftlich
bedeutungsvollste Erkrankung. Große wirtschaftliche Bedeutung haben die bei Kälbern
auftretenden therapieresistenten Pneumonien, zumal es bislang keinen wirksamen
kommerziellen Impfstoff gibt.
Da in vitro gezeigt wurde, dass M. bovis variable Oberflächenproteine (variable surface
proteins, Vsps) exprimiert, wird diskutiert, dass eine im Lungengewebe des Wirtes
erfolgende Antigenvariation an der Persistenz des Erregers im Respirationstrakt beteiligt
bzw. für die fehlende Elimination desselben mitverantwortlich ist.
Die Kenntnisse über die in der Lunge infizierter Tiere auftretenden Immunreaktionen, die im
Hinblick auf die zukünftige Entwicklung einer wirksamen Immunprophylaxe nötig wären, sind
bislang ausgesprochen spärlich.
Ziel dieser Arbeit war es, aufbauend auf die von LINKNER (1998) durchgeführten
Untersuchungen die in vivo Expression und Verteilung variabler Oberflächenproteinantigene
im Lungengewebe experimentell infizierter Kälber mittels immunhistologischer Methoden und
monoklonaler Antikörper zu charakterisieren. Zudem sollte eine Phänotypisierung der im
Rahmen der M. bovis-Infektion in der Lunge auftretenden Lymphozyten zu den gewählten
Zeitpunkten post infectionem vorgenommen werden, um erste Einblicke in die nach der
Infektion auftretende Verteilung von T- und B-Lymphozyten sowie in die Zahl der CD4- und
CD8-positiven T-Zellen zu erhalten.
Literaturübersicht
2
2 Literaturübersicht
2.1 Mykoplasmen
2.1.1 Allgemeine Eigenschaften und Taxonomie
Mykoplasmen sind die kleinsten, selbständig vermehrungsfähigen Bakterien. Da sie keine
Zellwand synthetisieren können, ist ihre Gestalt pleomorph (RAZIN 1992), und sie besitzen
dadurch eine natürliche Resistenz gegenüber Antibiotika, die in die Zellwandsynthese
eingreifen (EDWARD u. FREUNDT 1969; RAZIN u. FREUNDT 1984). Auch die
Passierbarkeit durch Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 µm kann durch dieses
Fehlen einer starren Zellwand und die geringe Größe der Mykoplasmen erklärt werden
(RAZIN u. FREUNDT 1984; MASOVER u. HAYFLICK 1985).
Bei einer Größe von 0,3 bis 0,8 µm liegt überwiegend eine kokkoide Zellmorphologie vor,
aber auch verzweigte und unverzweigte, bis 150 µm lange filamentöse Zellen bzw.
Zellverbände können ausgebildet werden (EDWARD u. FREUNDT 1969; RAZIN 1981;
RAZIN u. FREUNDT 1984). Auf festen Nährmedien zeigen Mykoplasmen ein Wachstum in
charakteristischen spiegeleiförmigen Kolonien (Durchmesser 50 bis 600 µm), deren Zentrum
durch das Einwachsen der Zellen in den Agar dunkler erscheint, als die Peripherie
(HAYFLICK 1969).
Die meisten Mykoplasmenspezies sind unbeweglich, bei einigen Arten konnte jedoch eine
aktive gleitende Bewegung nachgewiesen werden (KIRCHHOFF 1992).
Phylogenetisch lässt sich der Ursprung der Mykoplasmen auf grampositive Bakterien
zurückführen (WOESE 1987). Aufgrund ihrer parasitären Lebensweise haben Mykoplasmen
im Laufe einer reduktiven Evolution genetische Informationen verloren und besitzen daher
nur
eine
reduzierte
Enzymausstattung
und
eingeschränkte
Stoffwechsel-
und
Biosynthesewege (RAZIN 1992). Daher ist auch eine Kultivierung vieler Mykoplasmen bis
heute sehr schwierig und bedarf spezieller Nährmedien.
Taxonomisch werden die Mykoplasmen in die Klasse der Mollicutes eingeordnet (TULLY et
al. 1993), die wiederum vier Ordnungen umfasst (Tabelle 1).
Literaturübersicht
3
Tabelle 1: Taxonomie und Eigenschaften der Klasse Mollicutes (modifiziert nach TULLY et al. 1993)
Klassifizierung
Guanin/
Genom-
Chole-
(Anzahl bekannter Spezies)
Cytosin-
größe
sterol-
charakteristische
(kbp)
abhängig
Eigenschaften
600-1350
+
gehalt
(mol %)
Vorkommen
Andere
1. Ordnung:
Mycoplasmatales
Familie: Mycoplasmataceae
Gattung: Mycoplasma (98)
23-40
Mensch, Tiere
Opt.
Wachstums-
temp. 37°C
Gattung: Ureaplasma (6)
27-30
760-1170
+
Mensch, Tiere
Harnstoffhydrolyse
27-29
790-1140
+
Insekten,
Opt.
Pflanzen
temp. 30°C
Insekten,
Opt.
Pflanzen
temp. 30°C;
2. Ordnung:
Entomoplasmatales
Familie: Entomoplasmataceae
Gattung: Entomoplasma (5)
Gattung: Mesoplasma (12)
27-30
870-1100
-
WachstumsWachstums-
Wachstum nur in
serumfreiem
Medium mit 0,04%
Tween  80
Familie: Spiroplasmataceae
25-30
940-2200
+
Gattung: Spiroplasma (20)
Insekten,
helikale Filamente,
Pflanzen
Opt.
Wachstums-
temp. 30-37°C
3. Ordnung:
Acholeplasmatales
Familie: Acholeplasmataceae
Gattung: Acholeplasma (13)
26-30
1500-1650
-
Tiere,
Pflanzen
einige Opt.
Wachstums-
und temp. 30-37°C
Insekten
4. Ordnung:
Anaeroplasmatales
Familie: Anaeroplasmataceae
Gattung: Anaeroplasma
29-30
1500-1600
+
Pansen
von O2-sensitive
Rind und Schaf Anaerobier
Gattung: Asteroleplasma
40
1500
-
Pansen
von O2-sensitive
Rind und Schaf Anaerobier
Literaturübersicht
4
2.1.2 Variabilität bei Mykoplasmen
2.1.2.1 Antigen- und Phasenvariation bei Mykoplasmen
Unter Antigenvariation versteht man die Expression antigenetisch unterschiedlicher
Varianten einer zellulären Komponente (Proteine, Lipopolysaccharide) mit einer Rate, die
signifikant höher als die Mutationsrate (10-6) ist. Die einfachste Form der Antigenvariation ist
die Phasenvariation, bei der die Expression einer Antigenkomponente reversibel an- und
abgeschaltet wird („on-“ und „off-Switch“) (SEIFERT u. SO 1988).
Bei einer Vielzahl von Mykoplasmenspezies kann phänotypische Variabilität beobachtet
werden, die sowohl zwischen verschiedenen Stämmen einer Spezies, als auch innerhalb
eines Stammes auftritt und sich in einer variablen Pathogenität und Proteinexpression
bemerkbar macht (WATSON et al. 1988; ZHAO et al. 1988; CHRISTIANSEN et al. 1990;
ROSENGARTEN u. WISE 1990; THIRKELL et al. 1990; CITTI u. ROSENGARTEN 1997).
Weitere variierende Merkmale sind Koloniegröße und –opazität (ROSENGARTEN u. WISE
1990) sowie das Zytadhärenzverhalten (STEVENS u. KRAUSE 1990).
Mycoplasma hyorhinis, eine schweinepathogene Spezies, besitzt das bisher bestuntersuchte
variable System von Oberflächenproteinen der Mykoplasmen (ROSENGARTEN u. WISE
1990, 1991; YOGEV et al. 1991; WISE 1993). Das System besteht aus mindestens vier
variablen Lipoproteinen, die als Vlp A, Vlp B, Vlp C und Vlp E bezeichnet werden. Für die
Expression der Lipoproteine Vlp A, B und C wurden drei verschiedene, aber verwandte
Strukturgene nachgewiesen, die Existenz eines weiteren Gens, das für Vlp E codiert, ist
wahrscheinlich. Versuche an klonalen Linien ergaben, dass die Expression der Lipoproteine
voneinander unabhängig und in allen Kombinationen möglich ist (ROSENGARTEN u. WISE
1991; ROSENGARTEN et al. 1993). Diese unterschiedlichen Expressionsmuster kommen
durch hochfrequente, spontane Mutationen (Insertion oder Deletion) in der Promotor-Region
jedes Vlp-Gens zustande. Die starken Größenvariationen der variablen Lipoproteine (12 bis
30 Größenvarianten pro Vlp) resultieren aus spontaner „in-frame“ Insertion oder Deletion von
repetitiven Untereinheiten, welche die Länge des 3´Endes jedes Vlp-Gens modifizieren. Die
Größe der exprimierten variablen Oberflächenproteine steht zudem in umgekehrter
Korrelation mit der Kolonieopazität von Mycoplasma hyorhinis. Auch im natürlichen Wirt
werden Vlps exprimiert und wirken immunogen (CITTI u. ROSENGARTEN 1997;
ROSENGARTEN u. WISE 1991).
Literaturübersicht
5
Die Bedeutung der variablen Lipoproteine ist noch nicht bekannt, mögliche Funktionen wie
Adhärenz, Invasion oder Umgehung des Immunsystems werden diskutiert (CITTI u.
ROSENGARTEN 1997).
CITTI et al. (1997) fanden heraus, dass die Varianten mit längeren Versionen der
Lipoproteine resistent gegen die humorale Immunantwort des Wirtes sind, hingegen die
Varianten mit kürzeren Vlps empfänglich reagieren. Da das Ziel der untersuchten
wachstumshemmenden Wirtsantikörper nicht die variablen Oberflächenproteine waren,
vermuten diese Autoren, dass das Vlp-System dem Schutz vitaler, noch undefinierter
Oberflächenantigene dient.
Eine Variabilität phänotypischer Eigenschaften konnte auch bei Mycoplasma arthritidis,
einem Arthritiserreger bei Ratten und Mäusen, nachgewiesen werden. Neben den
Oberflächenantigenen (DROESSE et al. 1995) sind von der Variabilität auch die Virulenz, die
Wachstumsgeschwindigkeit in vitro, die Persistenz im Wirt sowie die Koloniemorphologie
betroffen (GOLIGHTLY-ROWLAND et al. 1970).
Bei Mycoplasma pulmonis, dem Erreger der murinen respiratorischen Mykoplasmose, wurde
die Variabilität des V-1-Antigens (variables Antigen 1) in vitro und in vivo nachgewiesen
(WATSON et al. 1988; TALKINGTON et al. 1989). Änderungen im Proteinprofil dieses
Antigens beeinflussen die Koloniegröße, die Anfälligkeit gegenüber dem Mykoplasmenvirus
P1, die Hämadsorption von Erythrozyten und die Virulenzeigenschaften (DYBVIG et al.
1989; TALKINGTON et al. 1989; WATSON et al. 1990). Das V-1-Antigen ist das Produkt des
vsa-Genlokus. Im Genom gibt es „stille“ vsa-Gene, die nicht exprimiert werden, da ihnen die
5´-Enden fehlen, und vsa-Expressionsgene. Durch Rekombination wird das 5´-Ende eines
Expressionsgens mit dem 3´-Ende eines „stillen“ Gens zu einem vollständigen Gen
kombiniert (DYBVIG et al. 1994). Als zweites System hochfrequenter DNS-Rearrangements
unterliegt das Restriktions- und Modifikationssystem dieses Organismus der Phasenvariation
(DYBVIG u. YU 1994). Der bisherigen Annahme, dieses System diene vorwiegend dem
Schutz des Mikroorganismus vor der Invasion durch fremde DNS stellen GUMULAK-SMITH
et al. (2001) eine Studie entgegen, in der erst im tieferen Atmungstrakt eine vermehrte
Aktivität des Restriktions- und Modifikationssystems nachzuweisen ist. Die Autoren vermuten
daher, dass dieses System zusammen mit der vsa-Variabilität durch Selektionsdruck im Wirt
beeinflusst wird und für die Überlebensstrategien im Wirtsorganismus wichtig ist.
Literaturübersicht
6
Der Nachweis von variablen Oberflächenproteinen humanpathogener Mykoplasmenspezies
gelang bei Mycoplasma pneumoniae (KRAUSE et al. 1983; STEVENS u. KRAUSE 1990),
Mycoplasma hominis (OLSON et al. 1991; CHRISTIANSEN et al. 1990) und Ureaplasma
urealyticum, welches ein stamm- und größenvariables Oberflächenprotein (MB-Antigen; MB
= engl. multiple banded) aufweist (CASSELL et al. 1988; ZHENG et al. 1992, 1994). Bei
Mycoplasma penetrans, einem Keim der häufig bei HIV-Infektion isoliert werden kann, wurde
in vitro ein Oberflächenprotein nachgewiesen, welches eine unabhängige, sehr schnelle
Phasenvariation zeigt. Die Expression dieses Oberflächenproteins wird auch in vivo vermutet
(RÖSKE et al. 2001).
Auch bei Mycoplasma meleagridis, einer geflügelpathogenen Spezies, konnte mit
monoklonalen Antikörpern eine Variabilität von Oberflächenproteinen bei verschiedenen
Stämmen nachgewiesen werden (ZHAO et al. 1988; DUFOUR-GESBERT et al. 2001).
Mycoplasma gallisepticum, Verursacher respiratorischer Erkrankungen beim Geflügel, weist
ebenfalls Phasen- und Größenvariation verschiedener Proteine auf (GARCÍA et al. 1994;
YOGEV et al. 1994). Eines dieser Proteine (PvpA) zeigt eine Kreuzreaktivität mit den
variablen Proteinen von Mycoplasma bovis (YOGEV et al. 1994), ein weiteres mit variablen
Proteinen von Mycoplasma synoviae (BENCINA et al. 1994 a). Zudem unterliegt das
Mycoplasma gallisepticum-Adhäsin pMGA der Phasenvariation (BENCINA et al. 1994 b). Bis
zu 50 verschiedene pMGA-Gene werden vermutet (MARKHAM et al. 1994).
Zudem wird bei Mycoplasma agalactiae, dem Verursacher der infektiösen Agalaktie bei
Schaf und Ziege, von hochfrequenten Oberflächenvariationen berichtet (BERGONIER et al.
1996; GLEW et al. 2000). Durch die nahe Verwandtschaft zu Mycoplasma bovis und wegen
der großen genetischen Ähnlichkeit wird vermutet, dass die vpma- (= variable proteins of
Mycoplasma agalactiae) und die bei Mycoplasma bovis auftretende vsp- (=variable surface
protein) Genfamilie homologe Systeme darstellen (GLEW et al. 2000).
2.1.2.2 Variabilität bei Mycoplasma bovis
Verschiedene Mycoplasma bovis-Stämme sowie die Klone der einzelnen Stämme
unterscheiden sich in der Koloniemorphologie (AHRENS 1991) und in der Expression von
Antigenen im Westernblot (POUMARAT et al. 1992; RASBERRY u. ROSENBUSCH 1992).
BEHRENS et al. (1994) wiesen in Untersuchungen mit poly- und monoklonalen Antikörpern
im Kolonieblot sowie mittels SDS-PAGE drei antigenetisch und strukturell verwandte
Literaturübersicht
7
Lipoproteine nach, die sie als variable Oberflächenproteine (Vsp, engl. variable surface
protein) A, Vsp B und Vsp C bezeichneten. Diese unterliegen der Größenvariation und
werden unabhängig voneinander exprimiert (Phasenvariation). Die Verankerung in der
Mycoplasma bovis-Membran erfolgt wie bei Mycoplasma hyorhinis mit der N-terminalen
Region, die C-terminale Region liegt frei zugänglich an der Oberfläche.
Die Variationsrate dieser prominenten Antigene, die sich auch in vivo als Hauptimmunogene
herausgestellt haben, liegt mit 2x10-3 pro Zelle und Generation höher als die Mutationsrate
(ROSENGARTEN et al. 1994). LYSNYANSKY et al. (1996) stellten fest, dass die
phänotypische Variation durch DNS-Rearrangement im Chromosom verursacht wird, der
Mechanismus der die Vsp-Gene reguliert bleibt aber weiterhin unklar. Weiterhin weist das
näher untersuchte VspA-Molekül ein unübliches Strukturmotiv auf: 80% dieses Moleküls
bestehen aus vier verschiedenen Regionen sich wiederholender Kodierungssequenzen, die
sich vom N- zum C-Terminal erstrecken. Bei Mycoplasma hyorhinis und Mycoplasma
pulmonis hingegen findet sich nur ein repetitives C-Terminal. Neueren Untersuchungen
zufolge wurden bereits 13 unterschiedliche Mitglieder der Vsp-Genfamilie im Chromosom
von Mycoplasma bovis identifiziert (LYSNYANSKY et al. 2001).
Der
Nachweis
eines
weiteren,
nicht
mit
den
Vsps
verwandten
immunogenen
Oberflächenproteins (pMB67) gelang BEHRENS et al. (1996 b) am Referenzstamm PG 45.
Auch dieses Protein unterliegt einer hochfrequenten Phasen- und Größenvariation.
Mit
Hilfe
verschiedener
Konzentrationen
von
Serumantikörpern
und
spezifischen
monoklonalen Antikörpern gegen Vsps und pMB67 zeigten LE GRAND et al. (1996), dass
wachsender Immundruck eine Unterdrückung der Expression oder Verkürzung der
Zielproteine sowie das Switchen zu einem antigenetisch unterschiedlichen Protein
verursacht. Das anschließende Passagieren der Mykoplasmen in ein antikörperfreies
Kulturmedium konnte die Wiederherstellung des ursprünglichen Phänotyps bewirken.
Eine mögliche Quelle zusätzlicher antigenetischer Diversifikation entdeckten LYSNYANSKY
et al. (2001) in der intergenetischen Rekombination zweier eng verwandter Mitglieder der
Vsp-Genfamilie. Die Autoren wiesen nach, dass aus den eng verwandten VspA und VspO
ein neues chimäres Gen, VspC entstehen kann. Zudem wurden bei Feldstämmen von
Mycoplasma bovis Variationen in Vsp-Genkomplexen nachgewiesen, die hauptsächlich in
den repetitiven Kodierungssequenzen stattfinden (NUSSBAUM et al. 2002).
Bei der immunelektronenmikroskopischen Darstellung der Vsps mit zwei monoklonalen
Antikörpern konnte eine Verteilung der zur Markierung verwendeten Goldpartikel über die
gesamte Oberfläche festgestellt werden, die meist in Haufen oder filamentösen Strukturen,
Literaturübersicht
8
zum Teil aber auch akkumuliert an einem Pol der Zelle vorlagen. Eine Beteiligung dieser
akkumulierten Strukturen an der Adhärenz von Mycoplasma bovis erscheint nicht unmöglich
(BEHRENS et al. 1996 a). Weitere Nachweise der Beteiligung der Vsps an der Zytadhärenz
von Mycoplasma bovis erbrachten SACHSE et al. (2000).
2.1.3 Mykoplasmen als Krankheitserreger bei Tieren
Die meisten Mykoplasmen sind Kommensalen, bei Tieren und Menschen kommen jedoch
auch verschiedene unterschiedlich pathogene Arten vor.
So ist Mycoplasma hyopneumoniae bei Ferkeln als Erreger der Enzootischen Pneumonie
weit verbreitet, führt als Monoinfektion jedoch meist nur zu subklinischen oder leichten
Erkrankungen, die erst durch Sekundärinfektionen verkompliziert werden (MAES et al. 1996;
SELBITZ 2002).
Bei Schafen und Ziegen sind die wichtigsten Mykoplasmosen die kontagiöse kaprine
Pleuropneumonie, durch Mycoplasma capricolum subsp. capripneumoniae verursacht, und
die Infektiöse Agalaktie, die durch Mycoplasma agalactiae hervorgerufen wird (SELBITZ
2002).
Mycoplasma equirhinis sowie Mycoplasma equigenitalium werden beim Pferd im
Zusammenhang mit Infektionen des Respirations- und Genitaltraktes isoliert, ihre
Pathogenität konnte jedoch bislang nicht schlüssig bewiesen werden (KIRCHHOFF 1985 a;
SELBITZ 2002).
Mycoplasma cynos lässt sich bei respiratorischen Erkrankungen des Hundes nachweisen,
Mycoplasma canis wurde im Zusammenhang mit Orchitis und Epidydimitis bei Rüden sowie
vereinzelt bei Endometritiden der Hündin isoliert. Bei der Katze wird Mycoplasma felis als
Erreger von Konjunktivitiden angesehen, die Rolle der Mykoplasmen als Krankheitserreger
bei Hund und Katze bedarf jedoch noch weiterer Untersuchungen (SELBITZ 2002;
KIRCHHOFF 1985 b).
Genaueres weiß man über die Mykoplasmosen der Labortiere. So führt Mycoplasma
neurolyticum zur sogenannten Rollkrankheit der Mäuse, Mycoplasma pulmonis verursacht
bei Mäusen und Ratten respiratorische Infektionen, Otitiden und Arthritiden sowie Aborte. Bei
der Ratte führt zudem eine Infektion mit Mycoplasma arthritidis zur Polyarthritis (SCHÜTZE
u. LABER 1985).
Beim Geflügel ist Mycoplasma gallisepticum am weitesten verbreitet, es verursacht
Infektionen der oberen Luftwege und der Luftsäcke (chronic respiratory disease = CRD) mit
möglicher Beteiligung der Gelenke, Sehnenscheiden und des Genitaltraktes. Auch
Literaturübersicht
9
Mycoplasma synoviae führt zu Arthritiden beim Geflügel. Mycoplasma meleagridis
verursacht eine erhöhte embryonale Mortalität wie auch Bewegungsstörungen und
Gelenkschwellungen bei der Pute (SELBITZ 2002).
Mykoplasmen besiedeln vorwiegend die Schleimhautoberflächen des Respirations- und
Urogenitaltraktes, aber auch das Auge, die Gelenke, die Milchdrüse und andere Organe; nur
wenige Spezies vermögen die Wirtszellmembran zu penetrieren (LO et al. 1992; JENSEN et
al. 1994, HOWARD et al. 1987 b). Bei der Besiedlung von Organoberflächen nutzen
Mykoplasmen vor allem Kapsel- und Adhärenzstrukturen (SACHSE et al. 1996). Bisher
bekannte
Pathogenitätsmechanismen
der
Mykoplasmen
sind
Nährstoffentzug
und
Wirtszellschädigung durch mykoplasmale Stoffwechselprodukte wie Wasserstoffperoxid und
Ammoniak (RAZIN 1991).
Zudem haben Mykoplasmen verschiedene Strategien entwickelt, um die wirtseigene Abwehr
zu unterlaufen. Dazu zählen die Hemmung ziliarer Aktivitäten des Wirtsgewebes und die
unspezifische Aktivierung von T- und/oder B-Lymphozyten (GABRIDGE et al. 1985).
Weiterhin kann molekulare Mimikry eine Angleichung antigener Strukturen von Wirt und
Parasit bewirken, wodurch in späteren Erkrankungsstadien auch Autoimmunreaktionen
hervorgerufen werden können (SIMECKA et al. 1993; BISSET 1994; TANGEN u.
KIRCHHOFF 1995). Als weiterer Mechanismus, die Immunantwort zu umgehen, wird die
Antigenvariation verschiedener Mykoplasmen angesehen (s. Kapitel 2.1.2).
Weiterhin
führen
einige
Mykoplasmenspezies
zur
Suppression
von
neutrophilen
Granulozyten, Lymphozyten und Makrophagen (ALMEIDA et al. 1992; THOMAS et al. 1991;
BENNETT u. JASPER 1977).
Die oben genannten Faktoren bzw. Mechanismen werden als Erklärung für die Neigung zur
Chronizität sowie die subklinischen Verläufe mykoplasmaler Infektionen herangezogen
(RAZIN 1992). Erschwert werden Mykoplasmeninfektionen häufig durch Sekundärinfektionen
und immunsuppressive Umweltfaktoren (KIRCHHOFF u. RUNGE 1998).
Literaturübersicht
10
2.2 Mykoplasmosen des Rindes
2.2.1 Respiratorische Infektionen
2.2.1.1 Lungenseuche
Die schwerste durch Mykoplasmen hervorgerufene Erkrankung des Rindes ist die
kontagiöse Pleuropneumonie des Rindes (Lungenseuche), deren Erreger, Mycoplasma
mycoides subsp. mycoides SC (= small colony type), bereits 1898 von NOCARD und ROUX
isoliert werden konnte. Obwohl die Erkrankung seit Anfang des letzten Jahrhunderts nur
noch sporadisch in Westeuropa auftrat, kam es in den sechziger und achtziger Jahren erneut
zu Ausbrüchen in Spanien und Frankreich, Anfang der neunziger Jahre auch in Italien. In
Portugal ist der Erreger der Lungenseuche seit 1983 wieder endemisch, und auch in Afrika
und Asien ist die Lungenseuche immer noch weit verbreitet.
Die klinischen Bilder der Erkrankung variieren erheblich zwischen hyperakuten, chronischen
und subklinischen Verläufen. Pathologisch-anatomisch findet sich meist ein hochgradiges
serofibrinöses Exsudat in der Thorakalhöhle sowie eine Pleuritis, die Lunge zeigt das
charakteristische Bild der Marmorierung durch unterschiedliche Stadien der Hepatisation und
verbreiterte interlobuläre Septen. Eine besondere Bedeutung in der Epidemiologie der
Erkrankung, die in Europa hauptsächlich in der chronischen, milden Verlaufsform auftritt,
haben
die
klinisch
gesunden
Keimträger.
Diese
beherbergen
vermehrungsfähige
Mykoplasmen über längere Zeit in Lungensequestern, die sich in fortgeschrittenen Stadien
der Lungenseuche bilden können (KIRCHHOFF u. RUNGE 1998; SELBITZ 2002).
2.2.1.2 Mycoplasma bovis-Infektion
Die wichtigste Mykoplasmenerkrankung des Rindes in Deutschland wird durch Mycoplasma
bovis hervorgerufen. Die durch diesen Erreger bei Kälbern hervorgerufene Pneumonie wird
in Kapitel 2.3 näher beschrieben.
2.2.1.3 Weitere respiratorische Mykoplasmeninfektionen
Infektionen mit Mycoplasma bovigenitalium können Pneumonien hervorrufen, die allerdings
in der Regel wesentlich milder verlaufen als die durch M. bovis verursachten (GOURLAY u.
HOWARD 1982; KIRCHHOFF u. RUNGE 1998). Auch Mycoplasma dispar sowie
Ureaplasma sp. wurden bei Kälberpneumonien isoliert. Bei gnotobiotischen Kälbern konnte
durch experimentelle Infektion mit diesen beiden Spezies eine subklinische Pneumonie (sog.
Literaturübersicht
11
„cuffing pneumonia“) hervorgerufen werden (HOWARD et al. 1976 a). Im Rahmen der
enzootischen Pneumonie der Kälber spielen sie neben Pasteurella multocida, Pasteurella
(Mannheimia) haemolytica, Haemophilus somnus und Arcanobacterium pyogenes eine
wichtige Rolle (MOSIER 1997).
BEER et al. (1984) sowie HEWICKER-TRAUTWEIN et al. (2002) konnten Mycoplasma
californicum in der Lunge von Kühen und Kälbern nachweisen, die an einer Pneumonie
erkrankt waren. Für Mycoplasma californicum wird insbesondere eine Beteiligung am
„Pneumonie-Arthritis-Syndrom“, das ursprünglich für Mycoplasma bovis beschrieben wurde
(ROMVÁRY et al. 1979) für möglich gehalten (SPERGSER et al. 2001; HEWICKERTRAUTWEIN et al. 2002).
BINDER et al. (1990) konnten bei einer Untersuchung auf Mykoplasmen an Kälbern und
Rindern mit Symptomen einer Bronchopneumonie am häufigsten (46,2%) die apathogene
Mykoplasmenart Mycoplasma bovirhinis besonders aus dem Nasen-Rachenraum, aber auch
aus der Lunge isolieren. Bei Kälbern liegt der Nachweis dieser Spezies mit 76,2% im
Nasenraum deutlich höher als bei Jungrindern (34,4%). Im Pneumoniegeschehen der Rinder
spielt jedoch Mycoplasma bovirhinis sehr wahrscheinlich keine Rolle.
2.2.2 Sonstige Infektionen
Besonders bei Kühen mit hoher Milchleistung treten durch Mykoplasmen hervorgerufene
Mastitiden auf. Mycoplasma bovis ist auch hier der wichtigste Erreger schwerer
Euterentzündungen (BINDER 1990), aber auch Mycoplasma bovigenitalium, Mycoplasma
alkalescens und Mycoplasma canadensis verursachen natürlich vorkommende Mastitiden
mit etwas milderem Verlauf und Tendenz zur Selbstheilung (JASPER 1977; PFÜTZNER et
al. 1983 a). Eine ähnlich schwere Mastitis, wie die von Mycoplasma bovis hervorgerufene,
vermag Mycoplasma californicum zu verursachen (PFÜTZNER et al. 1986).
Im Verlauf von Infektionen mit Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC kommt es vor
allem bei jungen Kälbern zu Arthritis, Tendovaginitis und Synovialitis (GOURLAY 1973). Am
häufigsten werden Polyarthritiden allein oder im Zusammenhang mit respiratorischen
Infektionen jedoch durch Infektionen mit Mycoplasma bovis verursacht (BOCKLISCH et al.
1983; siehe Kapitel 2.3.3). Auch Mycoplasma bovigenitalium und Mycoplasma alkalescens
wurden aus Gelenken an Arthritis erkrankter Tiere isoliert (ERNØ u. PERREAU 1985).
Literaturübersicht
12
Häufig werden aus dem Genitaltrakt von Bullen und Kühen Mykoplasmen isoliert, ihre Rolle
bei Urogenitalinfektionen ist jedoch noch nicht eindeutig geklärt. Mycoplasma bovigenitalium
wird oft im Zusammenhang mit Fruchtbarkeitsproblemen, Endometritis und Aborten isoliert,
aber
Infektionsversuche
ergaben
keine
einheitlichen
Ergebnisse
hinsichtlich
der
Pathogenität. Ureaplasmen können experimentell Erkrankungen der Vulva und des Uterus
hervorrufen, ihre Rolle bei natürlichen Infektionen ist jedoch unklar. Es gibt nur einzelne
Mitteilungen über eine durch Mykoplasmen verursachte Orchitis, Epididymitis und Vesiculitis
(GOURLAY 1973; BINDER 1990).
Bei der Infektiösen Bovinen Keratokonjunktivitis (IBK) wird Mycoplasma bovoculi eine
ätiologische Rolle zugesprochen, möglicherweise als Wegbereiter für eine Infektion mit
Moraxella bovis (ERNØ u. PERREAU 1985).
2.3 Erkrankungen durch Mycoplasma bovis
2.3.1 Eigenschaften von Mycoplasma bovis
Mycoplasma bovis ist die wichtigste pathogene Mykoplasmenart des Rindes in Europa und
Nordamerika (PFÜTZNER u. SACHSE 1996), eine weltweite Verbreitung mit geographisch
sehr unterschiedlicher Prävalenz wird vermutet (NICOLET 1994). Neuste Studien in
europäischen Ländern ergaben bei dänischen Rindern innerhalb von fünf Jahren einen
Anstieg der Mycoplasma bovis-Prävalenz von 2% auf 24% (KUSILUKA et al. 2000), in Irland
und Nordirland konnte bei 18% bzw. 15% der untersuchten pneumonischen Kälberlungen
Mycoplasma bovis isoliert werden (BRICE et al. 2000; BYRNE et al. 2001). Untersuchungen
von VOGEL et al. (2001) in der Schweiz ergaben sogar eine Mycoplasma bovis-Prävalenz
von 69% bei jungen pneumonischen Kälbern. Eine kürzlich von LE GRAND et al. (2002)
durchgeführte serologische Studie in Frankreich zeigte, dass je nach Region bis zu 90% der
Herden mindestens ein mit Mycoplasma bovis infiziertes Tier beherbergen. Bei
durchschnittlich 60% infizierter Herden betrug der Prozentsatz seropositiver Tiere in der
Herde jedoch nur durchschnittlich 7%.
Einer epidemiologischen Analyse von BURNENS et al. (1999) zufolge war der wesentliche
Risikofaktor für eine Einschleppung von Mycoplasma bovis in Milchviehbestände der Zukauf
insbesondere von Kälbern aber auch von Milchkühen.
Besonders in Rinderbeständen mit Intensivhaltung entstehen jährlich große wirtschaftliche
Verluste durch Mycoplasma bovis (NICOLET 1994; TER LAAK et al. 1992). Neben der
Literaturübersicht
13
massiv verminderten Milchleistung durch schwere Mastitiden und der verminderten
Mastleistung durch Pneumonien und Arthritiden werden die wirtschaftlichen Verluste auch
dadurch verstärkt, dass in vielen Ländern Mykoplasmen bei der Routinediagnostik nicht
berücksichtigt und daher nicht immer als Ursache erkannt werden (PFÜTZNER u. SACHSE
1996; NICOLET 1994).
Mycoplasma bovis ist streng wirtsspezifisch und kommt außer beim Rind nur beim Schaf vor,
welches auch Überträger sein kann (PFÜTZNER u. SACHSE 1996). Experimentell können
auch Ziegen mit Mycoplasma bovis infiziert werden (RODRÍGUEZ et al. 2000).
Als Virulenzfaktor von Mycoplasma bovis wird die Bildung von Cytadhäsin diskutiert
(SACHSE et al. 1993; SACHSE 1994). Durch die Expression variabler Oberflächenantigene
vermag der Erreger möglicherweise die wirtseigene Abwehr zu unterlaufen (s. Kapitel
2.1.2.2).
2.3.2 Erkrankungen des Respirationstraktes
2.3.2.1 Spontaninfektionen
Die durch Mycoplasma bovis verursachte Pneumonie bei Kälbern, die vorwiegend in
kleineren Betrieben vorkommt, ist neben der Mastitis bei Kühen die wirtschaftlich
bedeutungsvollste Erkrankung, die durch diesen Erreger hervorgerufen wird (PFÜTZNER u.
SACHSE 1996).
Betroffen von der respiratorischen Infektion sind Kälber unterschiedlichen Alters, von kurz
nach der Geburt bis ins Jungrindalter. Die Infektion tritt in Betrieben meist enzootisch auf
(BOCKLISCH et al. 1983). ROMVÁRY et al. (1979) beschreiben eine jahrelange Persistenz
in einer infizierten Herde. Die Morbidität in der Herde schwankt, abhängig vom
Infektionsdruck, zwischen 20 und 50%, kann bei schlechten Haltungsbedingungen aber auch
100% erreichen (PFÜT ZNER 1990; PFÜTZNER u. SACHSE 1996).
Innerhalb von Beständen kann die Übertragung des Erregers bereits intrauterin stattfinden
(GRUNERT et al. 1992; ROMVÁRY et al. 1979; BOCKLISCH et al. 1983). Weitere wichtige
Übertragungswege sind die aerogene Verbreitung, die Milch mastitiskranker Kühe und
infizierter Samen (ROMVÁRY et al. 1979). Erkrankungen des Respirationstraktes bei
Kälbern stehen häufig im Zusammenhang mit gleichzeitig in den Betrieben auftretenden
Mykoplasmenmastitiden (BOCKLISCH et al. 1983). Bei Infektionen, die bereits im
Jungtieralter erfolgt sind, können die Tiere auch später noch Träger des Erregers und für
eine weitere Verbreitung im Uterus oder durch den Samen verantwortlich sein (KIRCHHOFF
Literaturübersicht
14
u. BINDER 1986). Nach der Primärinfektion über Euter, Respirationstrakt oder Genitaltrakt
kann eine hämatogene Ausbreitung stattfinden (HEITMANN et al. 1981; BOCKLISCH et al.
1983).
Die ersten Anzeichen einer respiratorischen Erkrankung treten zwischen der ersten und
dritten Lebenswoche auf, und erreichen ihr Maximum in einem Alter von zehn bis fünfzehn
Tagen. Die Kälber husten, zeigen Dyspnoe und Nasenausfluss unterschiedlicher Stärke.
Über mehrere Tage tritt bei der Mehrzahl der Tiere Fieber bis 41°C, Inappetenz und
allgemeine Schwäche auf. Nicht selten kommt es zu arthritischen Symptomen. Verminderte
Gewichtszunahmen sind die Regel. Auch einzelne Todesfälle werden beschrieben
(BOCKLISCH et al. 1983; STIPKOVITS et al. 2000 b). Das Auftreten von Pneumonie
gleichzeitig oder in kurzer zeitlicher Abfolge mit Arthritis wurde von ROMVÁRY et al. (1979)
als „Pneumonie-Arthritis-Syndrom“ beschrieben.
Die pathologisch-anatomischen Veränderungen variieren zwischen geringgradigen lobulär
begrenzten katarrhalischen Pneumonien in den Spitzenlappen, vorwiegend bei alleiniger
Isolierung von Mycoplasma bovis, bis hin zu schweren fibrinös-nekrotisierenden
Pleuropneumonien, die große Teile der Lunge bis hin zu den kranioventralen Anteilen der
Zwerchfellslappen betreffen. Bei den schwereren Infektionen handelt es sich meist um
Mischinfektionen (BOCKLISCH et al. 1983; STIPKOVITS et al. 2000 b). Die interlobulären
Septen sind verdickt und weisen ein fibrinreiches Ödem auf, aus den Bronchien lässt sich
muköses bis eitriges Exsudat abpressen (STIPKOVITS et al. 2000 b).
Bei der histologischen Untersuchung des Lungengewebes zeigt sich das Bild einer akuten
bis subakuten exsudativen Bronchopneumonie, mit Füllung der Alveolen und Bronchiolen mit
zerfallenden
neutrophilen
Granulozyten,
mononukleären
Zellen
und
fibrinreicher
Ödemflüssigkeit. Die Alveolarwände erscheinen durch Ödem und Zellinfiltration verdickt
(THOMAS et al. 1975; GOURLAY et al. 1989; RODRÍGUEZ et al. 1996 a; STIPKOVITS et al.
2000 b). Es kommt zu graduell unterschiedlicher peribronchiolärer lymphozytärer
Hyperplasie (LANGFORD 1977; RODRÍGUEZ et al. 1996 a). GOURLAY et al. (1989),
ADEGBOYE et al. (1995 a) sowie RODRÍGUEZ et al. (1996 a) konnten zudem eine
nekrotisierende Bronchiolitis und fokale Koagulationsnekrosen mit amorphem eosinophilem
Material im Zentrum, umgeben von einem schmalen Saum pyknotischer Zellen und einer
breiteren Schicht aus Entzündungszellen, hauptsächlich Makrophagen und Plasmazellen, im
Lungenparenchym feststellen. GOURLAY et al. (1989) beschreiben zudem „ghost“
Strukturen des Lungenparenchyms im Bereich dieser nekrotischen Bereiche. STIPKOVITS
Literaturübersicht
15
et al. (2000 b) beobachteten eine Schädigung des Bronchialepithels. BASHIRUDDIN et al.
(2001) beschreiben die Veränderungen nach erfolgloser antibiotischer Behandlung als
interstitielle Pneumonie mit Lymphozyteninfiltration in den Alveolarsepten, um Bronchioli und
Gefäße. Vereinzelt kommt es auch zu Koagulationsnekrosen, die von Bindegewebe
umgeben sind. Die Läsionen dieser Tiere, bei denen nur Mycoplasma bovis isoliert wurde,
ähnelten denen bei Lungenseuche mit mildem Verlauf.
Die Behandlung von Mycoplasma bovis-Infektionen des Rindes ist in der Regel erfolglos, da
viele Stämme weitgehend resistent gegen Antibiotika sind (AYLING et al. 2000), und zudem
Mykoplasmen sich vorwiegend in Interzellularräumen und Vertiefungen der Zelloberflächen
befinden, wo sie für Antibiotika nicht erreichbar sind (KIRCHHOFF u. RUNGE 1998). Eine
Besserung der Symptomatik durch Unterdrückung von Sekundärinfektionen mittels
Antibiotikagabe wird von einigen Autoren beschrieben (STIPKOVITS et al. 2001; TER LAAK
et al. 1992; GALASSI 1974), eine Eliminierung von Mycoplasma bovis ist allerdings nicht
möglich (TER LAAK et al. 1992). Die Tötung betroffener Tiere wird daher angeraten
(PFÜTZNER u. SACHSE 1996).
2.3.2.2 Experimentelle Infektionen
Durch die endobronchiale oder intratracheale Infektion drei bis sieben Wochen alter
gnotobiotischer Kälber mit einem bei einem Ausbruch respiratorischer Erkrankungen in
England isolierten Stamm (Ab/1) bewiesen GOURLAY et al. (1976) die Pathogenität von
Mycoplasma bovis für das Lungengewebe.
Die Durchführung weiterer experimenteller Infektionen lässt sich in zwei Gruppen einteilen:
THOMAS et al. (1986 b) und HOWARD et al. (1987 a) infizierten wie schon GOURLAY et al.
(1976) gnotobiotische Kälber intratracheal mit dem Mycoplasma bovis -Stamm Ab/1 und
töteten die Tiere zwei bis vier Wochen nach der Infektion. MARTIN et al. (1983) und
PFÜTZNER et al. (1983 b) sowie STIPKOVITS et al. (2000 a) hingegen untersuchten etwa
drei Wochen alte, RODRÍGUEZ et al. (1996 a) zwei Monate alte, konventionell gehaltene
Kälber. Für diese Infektionsversuche verwendeten RODRÍGUEZ et al. (1996 a) aus
natürlichen Infektionen stammende Feldisolate. Die von MARTIN et al. (1983) und
PFÜTZNER et al. (1983 b) verwendeten Mycoplasma bovis -Stämme stammten ebenfalls aus
Spontaninfektionen und waren aus der Milch (Stamm J282), den Lungen (Stämme 997 und
505) und aus dem Gelenk (Stamm 392) an Mastitis, Pneumonie bzw. Arthritis erkrankter
Literaturübersicht
16
Tiere isoliert worden. Die Infektion erfolgte bei MARTIN et al. (1983) und PFÜTZNER et al.
(1983 b) bei der Mehrzahl der Tiere intratracheal sowie endobronchial, bei RODRÍGUEZ et
al. (1996 a) intratracheal und zusätzlich intranasal, bei STIPKOVITS et al. (2000 a) mittels
eines im Abstand von zehn Zentimetern vor den Nasenlöchern applizierten Mycoplasma
bovis-haltigen Sprays. Die Tötung der Tiere erfolgte 10 bis 14 Tage, bei STIPKOVITS et al.
(2000 a) drei Wochen nach der Infektion. Die trotz unterschiedlichen Versuchsaufbaus gleich
gearteten Untersuchungsergebnisse werden zusammenfassend dargestellt.
Sowohl bei den gnotobiotischen, als auch bei den konventionell gehaltenen Kälbern
erkranken nur wenige der experimentell mit Mycoplasma bovis infizierten Tiere klinisch. Bei
diesen Tieren kommt es zu vorübergehender Pyrexie, Tachypnoe, Husten, Apathie und
Lahmheit (GOURLAY et al. 1976; RODRÍGUEZ et al. 1996 a). Auch seröser Nasenausfluss
oder vorübergehendes Fieber als einziges Symptom bei der überwiegenden Anzahl der
Versuchstiere wird bei den Kälbern aus konventioneller Haltung beschrieben (PFÜTZNER et
al. 1983 b; RODRÍGUEZ et al. 1996 a). STIPKOVITS et al. (2000 a) beschreiben sogar
einzelne Todesfälle, die sie auf eine durch andere Bakterien wie Pasteurella multocida
erschwerte Infektion mit Mycoplasma bovis zurückführen.
Bei der Sektion kann auch bei klinisch gesunden Tieren meist eine Verfestigung des
Lungenparenchyms von etwa zehn Prozent bei gnotobiotischen Versuchstieren und bis zu
mehr als 25 Prozent bei Kälbern aus konventioneller Haltung festgestellt werden. Bevorzugt
betroffen von den Veränderungen sind bei allen Tieren die Spitzen- und Mittellappen sowie
der Lobus accessorius, bei einer größeren Ausbreitung auch der kranioventrale Bereich
eines oder beider Hauptlappen (GOURLAY et al. 1976; MARTIN et al. 1983; RODRÍGUEZ et
al. 1996 a).
MARTIN et al. (1983) teilen die histologischen Veränderungen der Tiere ihres
Infektionsversuches in drei Gruppen ein. Zur ersten Gruppe gehören, neben Kälbern mit
geringen Krankheitserscheinungen, die Tiere, die bei der Sektion keine makroskopischen
Lungenveränderungen zeigten. Die histologischen Veränderungen umfassen die Ausfüllung
der Lumina von Bronchiolen mit zellig-entzündlichem Exsudat, welches sich überwiegend
aus Granulozyten zusammensetzt. Von hier aus findet die Ausbreitung des entzündlichen
Prozesses auf das peribronchioläre Gewebe statt, wo eine interstitielle Pneumonie mit
Aktivierung und Proliferation von histiozytären Zellen sichtbar wird. Die Proliferation von
peribronchiolären Lymphfollikeln führt nicht zu einer vollständigen Umschließung der
Literaturübersicht
17
Bronchioli („cuff“-Bildung). Von diesen produktiv-entzündlichen Veränderungen sind einzelne
Läppchen bis hin zu zusammenhängenden Läppchengruppen betroffen.
In der zweiten Gruppe sind exsudative entzündliche Prozesse vorherrschend, die sich
ebenfalls von eitrigen Reaktionen in den Bronchiolen her als katarrhalische bis katarrhalischeitrige Bronchopneumonien auf ganze Läppchen ausbreiten. Die Lumina von Bronchien und
Bronchiolen sind mit granulozytenreichem Exsudat ausgefüllt, es kommt endobronchial zur
Einbeziehung von Nachbarläppchen und somit zu konfluierenden pneumonischen Prozessen
mit vermehrt neutrophilen Granulozyten.
Zur dritten Gruppe gehören Tiere mit den heftigsten Entzündungsprozessen, wobei hier auch
solche eingestuft wurden, bei denen Sekundärinfektionen mit Pasteurella haemolytica
vorlagen. Die Veränderungen bestehen in einer lobulären eitrigen Bronchopneumonie mit
Tendenz zu nekrotischen Einschmelzungen, fibrinöser Exsudation und Abszessbildung.
Auch HOWARD et al. (1987 a) sowie STIPKOVITS et al. (2000 a) fanden drei bis vier
Wochen nach Versuchsbeginn Koagulationsnekrosen unterschiedlichen Ausmaßes im
Lungenparenchym experimentell infizierter Kälber. Diese waren, wie auch bei den
natürlichen Infektionsfällen, umgeben von einem schmalen Saum pyknotischer Zellen und
einer breiteren Zone mit überwiegend mononukleären Zellen. In größeren Nekrosearealen
bemerkten THOMAS et al. (1986 b) sogenannte „ghost lung structures“, Überreste von
Alveolen und kleineren Bronchiolen.
Die bei Mykoplasmeninfektionen häufig auftretende Proliferation des peribronchiolären
lymphatischen Gewebes ist bei den Versuchstieren graduell unterschiedlich und reicht von
einfacher Infiltration des peribronchiolären Gewebes bis zu ausgedehnter lymphoider
Hyperplasie mit Lymphfollikelbildung (RODRÍGUEZ et al. 1996 a; GOURLAY et al. 1976).
STIPKOVITS et al. (2000 a) stellten mikroskopisch Zilienverluste und degenerative
Veränderungen zilientragender Zellen des Epithels der mit Mycoplasma bovis infizierten
Tiere fest.
LINKNER (1998) sowie LINKNER et al. (2000) beschreiben pathologisch-histologische
Befunde im Lungengewebe von Kälbern, die im Alter von drei Wochen mit einer klonalen
Variante des Mycoplasma bovis Typ-Stammes PG 45 intratracheal infiziert worden waren.
Nähere Angaben zu den pathologisch-histologischen Lungenveränderungen bei diesen
Kälbern sind in Kapitel 3.2.1.1 zu finden, da unter anderem Gewebeproben dieser Tiere als
Untersuchungsmaterial für die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Untersuchungen
dienten.
Literaturübersicht
18
Durch intravenöse Infektion mit mehreren Mycoplasma bovis-Stämmen aus natürlicher
Infektion (J282, 997 505 und 392) konnten MARTIN et al. (1983) weder klinische noch
pathologisch-histologische Veränderungen hervorrufen.
2.3.2.3 Immunhistologische Befunde
Mittels immunhistochemischer Methoden lässt sich Mycoplasma bovis Antigen mit
polyklonalen und monoklonalen Antikörpern in Lungengewebeschnitten natürlich und
experimentell infizierter Tiere nachweisen.
Besonders im Randbereich der nekrotischen Veränderungen weisen mehrere Untersucher
mittels
Immunperoxidase-Technik
mit
gegen
Mycoplasma
bovis
gerichtetem
Kaninchenantiserum als primärem Antikörper häufig Antigen nach, das mit den dort
liegenden nekrotischen Zellen assoziiert ist oder extrazellulär liegt (THOMAS et al. 1986 b;
HOWARD et al. 1987 a; GOURLAY et al. 1989; RODRÍGUEZ et al. 1996 a). Die Darstellung
von Mycoplasma bovis-Antigen in der Umgebung dieser Nekroseareale gelingt RODRÍGUEZ
et al. (1996 a, b) zudem mit einem monoklonalen Antikörper der Bezeichnung 5A10 sowie
ADEGBOYE et al. (1995 a) mit einem Antikörper-Pool aus drei monoklonalen Antikörpern
aus Mäuseascitesflüssigkeit (Bezeichnungen der Klone: MYB57, MYB87, MYB163), die mit
dem Mycoplasma bovis-Stamm M23 erzeugt worden waren. Auch im Zentrum von Nekrosen
können RODRÍGUEZ et al. (1996 a) und HOWARD et al. (1987 a) mit beiden genannten
Primärantikörpern Mycoplasma bovis -Antigen darstellen.
Im Bereich der Luftwege lässt sich Mycoplasma bovis-Antigen mittels Kaninchenantiserum
oder verschiedenen monoklonalen Antikörpern vorwiegend im Bronchialexsudat nachweisen
(THOMAS et al. 1986 b; HOWARD et al. 1987 a; GOURLAY et al. 1989; RODRÍGUEZ et al.
1996 a; LINKNER et al. 2000). Aber auch als granuläre Strukturen in Bronchial- und
Bronchiolarepithelzellen finden ADEGBOYE et al. (1995 a, b) mit einem monoklonalen
Antikörperpool gegen Mycoplasma bovis, GOURLAY et al. (1989) mit Kaninchenantiserum
und RODRÍGUEZ et al. (1996 a) mit einem monoklonalen Antikörper (Klon 5A10) Antigen.
RODRÍGUEZ et al. (1996 a) konnten bei experimentell infizierten Tieren zudem an der
Oberfläche von Epithelzellen kleinerer Bronchien und Bronchiolen Antigen nachweisen.
Im Bereich der Alveolarwände stellten LINKNER et al. (2000) mit dem monoklonalen
Antikörper 1E5 Antigen fest.
Literaturübersicht
19
Makrophagen mit Antigen im Zytoplasma können mit allen verwendeten Antikörpern in
verschiedenen Bereichen der Lungen gefunden werden: im Lumen von Luftwegen, teilweise
in der Nachbarschaft von Mykoplasmenantigen-positiven neutrophilen Granulozyten
(ADEGBOYE et al. 1995 b; RODRÍGUEZ 1996 a; LINKNER 1998), in Alveolarwänden und
Alveolen (ADEGBOYE et al. 1995 b; RODRÍGUEZ et al. 1996 a) sowie in nekrotischen
Bereichen zusammen mit positiven nekrotischen Zellen (THOMAS et al. 1986 b). LINKNER
et al. (2000) finden in Gefäßen mit monoklonalen Antikörpern Monozyten mit Antigen im
Zytoplasma bei drei von acht Tieren.
2.3.3 Sonstige Erkrankungen
Besonders in Gebieten mit intensiver Milchproduktion und großen Milchviehherden ist die
durch Mycoplasma bovis hervorgerufene enzootische Mastitis Ursache beachtlicher
ökonomischer Einbußen. Die Morbidität beträgt, abhängig von der Herdengröße und der
Schnelligkeit und Effektivität eingeleiteter Gegenmaßnahmen, zwischen 10 und 50%. Die
Infektion tritt unabhängig vom Laktationsstadium auf, auch trockenstehende Kühe können
erkranken (PFÜTZNER u. SACHSE 1996). Eine Häufung von Mastitiden tritt jedoch bei der
Kalbung oder kurze Zeit später auf (JASPER 1977). Kühe im frühen Laktationsstadium
neigen zu besonders schweren Verlaufsformen, wie sie auch bei Neuausbrüchen zu
beobachten sind (PFÜTZNER u. SACHSE 1996). Der Erreger wird in der Regel in
Mycoplasma bovis -freie Herden durch Zukauf infizierter Tiere oder mittels infiziertem Samen
bei der künstlichen Befruchtung eingeschleppt.
Die Infektion des Euters erfolgt galactogen aszendierend durch den Zitzenkanal. Besonders
im Melkstand und auf Liegeflächen stellen daher subklinisch erkrankte Erregerausscheider
eine große Gefahr für die Herde dar. Auch eine Übertragung von Mycoplasma bovis bei der
unkorrekten intrazisternalen Antibiotikaapplikation, bei der aseptische Erfordernisse nicht
beachtet werden, ist möglich (PFÜTZNER 1990).
Die Mykoplasmenmastitis beginnt meist akut mit einer plötzlichen starken Vergrößerung und
Verhärtung der Milchdrüse, vermehrte Schmerzhaftigkeit oder Ödeme fehlen jedoch. Weitere
Anzeichen einer durch Mycoplasma bovis hervorgerufenen Mastitis sind eine hohe
Therapieresistenz, eine starke Alteration des Milchcharakters bei nur wenig bis ungestörtem
Allgemeinbefinden, deutliche Einbrüche in der Milchleistung bis hin zur Agalaktie und ein
Überspringen der Infektion auf die anderen Viertel (PFÜTZNER 1990; WEIGT et al. 1981;
JASPER 1977). Befallene Euterviertel werden nach etwa zwei Wochen atrophisch, die
Milchleistung kann auch in nachfolgenden Laktationsperioden stark herabgesetzt bleiben, so
Literaturübersicht
20
dass eine Schlachtung notwendig wird (PFÜTZNER u. SACHSE 1996). Auch aus
bestandshygienischer Sicht ist eine Tötung betroffener Tiere anzuraten, denn aus dem
Sekret dieser Tiere lässt sich häufig noch über Monate Mycoplasma bovis isolieren (WEIGT
et al. 1981).
Besonders bei Kälbern, selten aber auch bei Kühen (HENDERSON u. BALL 1999), kann
Mycoplasma bovis (Poly-)arthritiden verursachen. Häufig treten diese gleichzeitig oder in
direktem zeitlichen Zusammenhang mit Pneumonien auf, was zur Bezeichnung „PneumonieArthritis-Syndrom“ geführt hat (ROMVÀRY et al. 1979). Nicht selten besteht im gleichen
Bestand eine enzootische Mastitis der Mutterkühe (PFÜTZNER und SACHSE 1996). Den
beiden Autoren zufolge kann in diesen Fällen ohne geeignete Maßnahmen zur
Mastitisbekämpfung die Morbidität gegenüber einer Arthritis ebenfalls 20 bis 50% erreichen.
Zur hämatogenen Infektion der Gelenke kommt es normalerweise nur unter hohem
Infektionsdruck (PFÜTZNER u. SACHSE 1996). Betroffen sind vorwiegend die Karpal- und
Tarsalgelenke, wobei die Tiere plötzliche hochgradige Lahmheit, Bewegungsunlust und
Festliegen zeigen. Die Gelenke sind stark geschwollen, schmerzhaft und vermehrt warm,
auch Bursen und Sehnenscheiden können miteinbezogen werden. Häufig bekommen die
Kälber Fieber bis 41°C und werden apathisch (GRUNERT et al. 1992). Zudem beschreiben
letztere Autoren zwei intrauterin infizierte Kälber mit hochgradiger Verkrümmung der
Vordergliedmaßen und deutlicher Störung des Allgemeinbefindens und des Stehvermögens.
Bei der Sektion weisen die Gelenkflächen fibrinöse bis fibrinopurulente, teils nekrotisierende
Entzündungen und der subchondral gelegene Knochen eine herdförmige purulente
Osteomyelitis auf. Des Weiteren kommt es zum Auftreten fibrinöser bis fibrinopurulenter
Tendovaginitiden mehrerer Sehnen. ADEGBOYE et al. (1996) beschreiben zudem eine
durch Mycoplasma bovis hervorgerufene pyogranulomatöse Tendosynovitis und Enzephalitis
bei Kälbern. Das Stratum synoviale betroffener Gelenke weist herdförmige Nekrosen und
stellenweise starke Fibrinablagerungen auf (THOMAS et al. 1986 a).
Durch aszendierende Infektion über das Präputium des Bullen führt Mycoplasma bovis zu
Orchitis, Vesiculitis, abnehmender Samenqualität und Verbreitung des Erregers mit dem
Samen. Auf diesem Weg, aber auch durch aszendierende Infektion aus der kontaminierten
Umwelt, gelangt der Erreger in den weiblichen Genitaltrakt. (PFÜTZNER u. SACHSE 1996;
EAGLESOME u. GARCIA 1990). Unklar ist, ob eine Besiedlung des weiblichen
Genitaltraktes auch durch hämatogene Streuung von einer Mastitis aus zustande kommen
Literaturübersicht
21
kann (PFÜTZNER u. SACHSE 1996). Eine Infektion bei Kühen kann zu Endometritis und
Salpingitis führen (HARTMANN et al. 1964). Zudem wurden Spätaborte (BOCKLISCH et al.
1986), Geburten toter und lebensschwacher Kälber sowie Nachgeburtsverhaltungen
beobachtet (GRUNERT et al. 1992). Eine Verschlechterung der Fertilisation (EAGLESOME
u. GARCIA 1990) und verlängerte Rast- und Zwischenkalbezeiten (UHAA et al. 1990)
wurden festgestellt.
Weitere
Erkrankungen,
die
durch
Mycoplasma
bovis
verursacht
werden
sind
Keratokonjunktivitis (KIRBY u. NICHOLAS 1996), Otitis media (WALZ et al. 1997) und
Meningitis (STIPKOVITS et al. 1993). KINDE et al. (1993) berichten von subkutanen
Dekubitalabszessen bei Kälbern, die von Mycoplasma bovis verursacht wurden.
2.4 Bronchus-assoziiertes lymphatisches Gewebe (BALT)
2.4.1 Das immunologische System der Lunge
Die Abwehrmechanismen der Rinderlunge können nach LIGGIT (1985) in die physikalische,
die zelluläre und die sekretorische Abwehr unterteilt werden. Insbesondere im oberen
Respirationstrakt bis hin zu den Bronchien sorgen physikalische Mechanismen wie
aerodynamische Filtration, mucociliäre Clearence und Husten für eine Eliminierung der
meisten unerwünschten Partikel und Mikroorganismen aus der Lunge.
Untersuchungen zur zellulären Abwehr der Lunge mittels Bronchoalveolärer Lavage ergaben
einen Anteil von 87% Makrophagen in der Lavageflüssigkeit. (LIGGIT 1985; CANTO et al.
1994). POULTER (1997) unterscheidet in der Lunge vier Typen von Makrophagen anhand
ihrer anatomischen Lage: pleurale, interstitielle, Alveolar- und intravaskuläre Makrophagen,
deren funktionelle Unterschiede durch den Ort, an dem sie sich befinden, bestimmt wird. Des
Weiteren gibt es dendritische Zellen, die überwiegend im Bronchialepithel, seltener im
Interstitium der Lunge lokalisiert sind.
Weitere 2% der zellulären Bestandteile der Lavageflüssigkeit werden LIGITT (1985) und
CANTO et al. (1994) zufolge von neutrophilen Granulozyten gestellt. Zu einer dramatischen
Steigerung dieser Zellpopulation durch Bereitstellung aus dem Blut kommt es allerdings
unter anderem durch virale und bakterielle Stimulation. Zehn Prozent der mittels alveolärer
Lavage gewonnenen Zellen entfallen auf Lymphozyten, wovon 70% T-Lymphozyten
darstellen. Der Rest entfällt auf B-Lymphozyten und Plasmazellen sowie auf einen geringen
Literaturübersicht
22
Anteil untypisierbarer Zellen, die vermutlich Nullzellen darstellen (CANTO et al. 1994).
Eosinophile Granulozyten stellen im Alveolarbereich der normalen Lunge weniger als 1% der
zellulären Population.
Die
sekretorische
Abwehr
besteht
in
erster
Linie
aus
Antikörpern.
Im
oberen
Respirationstrakt des Rindes besteht der überwiegende Anteil der Antikörper aus
sekretorischem IgA, bei Kälbern, die weniger als sechs Wochen alt sind, aus IgG 1. Im
tieferen Respirationstrakt des Rindes überwiegt IgG, dicht gefolgt von IgA (LIGGIT 1985).
Zudem zählt der Autor zu der sekretorischen Abwehr Interferone, Komplementfaktoren und
Surfactant.
Nach BIENENSTOCK (1984) lässt sich die Lunge aus immunologischer Sicht in vier
interagierende Kompartimente einteilen: das erste Kompartiment umfasst die Lymphozyten
im Epithel des Respirationstraktes über der epithelialen Membran und zwischen den
Epithelzellen. Das zweite Kompartiment besteht aus in der Lamina propria der Mukosa
locker organisiertem lymphatischen Gewebe, welches sowohl T- als auch B-Lymphozyten
enthält. Die B-Zellen dieses Bereichs synthetisieren überwiegend IgA. Als drittes
Kompartiment nennen die Autoren die Population der bronchoalveolären Zellen, die sich
mittels bronchoalveolärer Lavage erfassen lassen. Als viertes Kompartiment wird das
Bronchus-assoziierte lymphatische Gewebe (BALT) bezeichnet. PABST (1997) erweitert die
Kompartimente um den intravaskulären und den interstitiellen Lymphozytenpool.
2.4.2 Vorkommen und Entwicklung des BALT bei Mensch und Tier
Den Begriff BALT prägten BIENENSTOCK et al. (1973) für organisiertes lymphatisches
Gewebe, das im Allgemeinen zwischen einem Bronchus oder Bronchiolus und einem
arteriellen Gefäß liegt und bei einer sonst wahllosen Verteilung im Bronchialtrakt häufig in
der Nähe von Bifurkationsstellen zu finden ist (SMINIA et al. 1989; GOULD u. ISAACSON
1993). Die Grundstruktur des BALT besteht bei allen bislang untersuchten Tierarten in einer
follikelartigen Akkumulation von Lymphozyten, die mit der Bildung von Keimzentren
einhergehen kann. In der Peripherie sind postkapilläre Venolen, sogenannte Highendothelial-venules (HEV) zu finden, durch die Lymphozyten das Blut verlassen und in das
BALT einwandern sowie efferente Lymphgefäße, die ein Abwandern der Lymphozyten
ermöglichen (TSCHERNIG u. PABST 2000). Bei verschiedenen Spezies lassen sich im
Wesentlichen vier Bereiche unterscheiden (s. Abbildung 1): ein follikulärer Bereich, in dem
hauptsächlich B-Zellen angesiedelt sind, ein parafollikulärer Bereich mit überwiegend T-
Literaturübersicht
23
Lymphozyten, ein Bereich unmittelbar unter dem Epithel, das sogenannte „Dome area“, in
dem sich viele interdigitierende Zellen befinden und das darüber liegende Lymphepithel aus
zilienlosen, kuboidalen bis abgeflachten Epithelzellen und intraepithelialen Lymphozyten
(SIMECKA et al. 1986; MAIR et al. 1987; CHEN et al. 1989; SUDA et al. 1999). Das
Lymphepithel enthält keine Becherzellen (GOULD u. ISAACSON 1993; BIENENSTOCK et
al. 1973). BALT-Follikel müssen nicht notwendigerweise von Lymphepithel überzogen sein,
auch unverändertes Bronchialepithel liegt häufig vor (GREGSON et al. 1979 b). Zudem kann
bei verschiedenen Tierarten BALT als fokale Lymphozytenaggregation ohne follikuläre
Organisation vorliegen (ANDERSON et al. 1986; MAIR et al. 1987; CHEN et al. 1989).
Abbildung 1: Verteilung der Lymphozytensubtypen und Makrophagen in einem BALT-Follikel
(modifiziert nach TSCHERNIG u. PABST 2000)
Mp = Makrophage; T4/T8 = T-Lymphozytensubtyp; B = B-Lymphozyt; HEV = high endothelial venule
Hinsichtlich der Entwicklung und der Organisation des BALT bei den verschiedenen
Tierarten bestehen große Unterschiede. Beim Schwein kann schon im Fetus BALT
nachgewiesen werden, bei den meisten anderen Spezies aber erst nach der Geburt.
(SMINIA et al. 1989). Bei Ratten und Kaninchen können vier Tage post partum im kranialen
Bereich die ersten lymphatischen Aggregationen in der bronchialen Submukosa unterhalb
der glatten Muskulatur beobachtet werden, die hauptsächlich aus B-Lymphozyten bestehen.
Innerhalb der ersten zwei Lebenswochen durchdringen die lymphatischen Zellen die
Muskelschicht und siedeln sich zunächst in der Lamina propria und kurz später auch im
Literaturübersicht
24
Epithel an, welches um die dritte Lebenswoche die morphologischen Charakteristika des
Lymphepithels annimmt. Die ersten T- und B-Zellareale entstehen nach vier Wochen,
werden aber erst nach zwölf Wochen regelmäßig angetroffen. Die Entwicklung bei
pathogenfrei aufgezogenen Tieren ist zwar verlangsamt, aber identisch, was für einen
antigenunabhängigen Ursprung des BALT spricht. Die weitere Entwicklung des BALT
hingegen ist antigenabhängig (GREGSON et al. 1979 a; SMINIA et al. 1989). So sind bei
konventionell gehaltenen Ratten häufiger Lymphepithel sowie Keimzentren festzustellen.
Auch die Anzahl an BALT-Follikeln und deren Größe nimmt bei konventioneller Haltung mit
steigendem Lebensalter deutlich zu (GREGSON et al. 1979 a, b). Die Aufteilung der
Lymphozytenpopulationen im BALT der Ratte entspricht der weiter oben im Text
aufgeführten: ein zentraler Bereich mit hauptsächlich B-Zellen ist umgeben von T-Helfer- und
T- Suppressor- sowie zytotoxischen Zellen. Der Bereich unter dem Lymphepithel enthält
vermutlich Makrophagen und dendritische Zellen (SIMECKA et al. 1986).
Während das BALT bei Ratten weit verbreitet ist (GREGSON et al. 1979 a, b), ist es bei der
Maus eher unauffällig (BREEL et al. 1988). Nur bei 30 bis 50 Prozent der Mäuse findet man
BALT (PABST u. GEHRKE 1990). Das BALT der Maus weist eigenständige T- und BZellbereiche auf, die aber keinen festgelegten Ort im Verhältnis zum Bronchus haben. Die
Mehrzahl der T-Zellen sind T-Helferzellen. Am Rand des BALT und darin verteilt befinden
sich Makrophagen unterschiedlichen Typs (BREEL et al. 1988).
Wie bei der Maus liegt auch beim Schwein die Anzahl der Tiere, bei denen BALT
nachzuweisen ist, mit 30 bis 50 Prozent unter dem BALT-Vorkommen bei der Ratte und
beim Kaninchen (PABST u. GEHRKE 1990). Bei keimfrei aufgezogenen Ferkeln enthält die
Lunge kein BALT (PABST 1996). Nach experimenteller Infektion mit Actinobacillus
pleuropneumoniae ist eine Vermehrung des BALT festzustellen (DELVENTHAL et al. 1992).
Eine weitere Zunahme der Häufigkeit und der Größe des BALT mit größeren lymphatischen
Zellen und Mitosen im zentralen Bereich sowie deutlicher Lymphozyteninfiltration des
darüber liegenden Epithels konnte nach Immunisierung und anschließender Infektion der
Tiere festgestellt werden. Das BALT des Schweines ist überwiegend um Bronchioli und
kleine Bronchien herum anzutreffen, nach antigenem Stimulus ist jedoch die Vermehrung um
große Bronchien auffällig. Definierte Kompartimente von B- und T-Zellen können
immunhistologisch nur bei einzelnen Tieren nach mikrobieller Stimulation mit Actinobacillus
pleuropneumoniae dargestellt werden (DELVENTHAL et al. 1992).
Literaturübersicht
25
Auch beim gesunden Pferd kommen dichte lymphatische Zellinfiltrate vor, die den
morphologischen Charakteristika des BALT der oben genannten Spezies entsprechen.
Dieses BALT umschließt besonders die kleinen Luftwege teilweise oder vollständig. Der
Hauptanteil liegt unterhalb der Muskelschicht, über Lücken in der Muskulatur erreichen die
Lymphozyten das Epithel. Die Zelldichte im Bereich des BALT variiert beim Pferd stark
zwischen den Individuen. Die Bildung von follikelartigen Aggregaten ist im Wesentlichen in
den oberen Luftwegen bis zur Trachea zu beobachten, kommt aber auch gelegentlich in
kleineren Bronchien vor. Diese Follikel, die häufig Keimzentren aufweisen, sind von
Lymphepithel überzogen. Das organisierte lymphatische Gewebe beim Pferd ist im
Unterschied zum Kaninchen und der Ratte weiter distal in der Lunge zu finden (MAIR et al.
1987).
Bis zum siebten Lebenstag kann bei Ziegen aus konventioneller Haltung kein BALT
nachgewiesen werden. Ab einem Alter von einem Monat finden sich in allen Lungenlappen
ein bis zwei BALT-Areale auf 4,5 cm2 Lungenfläche. Das darüber liegende Epithel ist mit
Lymphozyten infiltriert, eine typische Dome-Bildung ist jedoch nicht zu beobachten und auch
Keimzentren sind nicht vorhanden. Bei der Hälfte der adulten Tiere ist eine Vermehrung des
BALT auf bis zu sechs Aggregate auf der gleichen Fläche festzustellen. Das BALT ist bei
den älteren Tieren größer und deutlicher, eine Kompartimentierung ist aber nicht zu
erkennen. Die andere Hälfte der adulten Ziegen weist kein BALT auf, es handelt sich
vermutlich beim BALT der Ziege um keine konstante Einrichtung. Bei Tieren mit
verschiedenen pathologischen Veränderungen der Lunge kommt es zur Hyperplasie des
vorhandenen BALT. Dies ist insbesondere bei fibrinöser Pneumonie zu beobachten
(BARMAN et al. 1996).
Das gesunde, über sechs Monate alte Schaf hat nur wenig BALT. Es stellt sich bei dieser
Tierart in Form lymphatischer Aggregate oder in Form von Lymphfollikeln dar. Sowohl
zwischen Individuen, als auch zwischen einzelnen Bereichen des Respirationstraktes sind
Variationen in der Verteilung festzustellen. Wie beim Pferd liegen die lymphatischen
Aggregate häufiger im Bereich kleinerer Bronchiolen, als um knorpelgestützte Bronchien.
Das Epithel über diesen Bereichen ist nicht spezialisiert. Die Lymphfollikel, die sich
überwiegend im oberen Respirationstrakt ausbilden, weisen hingegen die vier Regionen
Dome, Follikel, parafollikulärer Bereich sowie Lymphepithel auf. Auch beim Schaf ist eine
Literaturübersicht
26
stärkere Organisation des BALT durch antigene Stimulation nachzuweisen (CHEN et al.
1989).
Im Verhältnis zur Ratte und zum Kaninchen hat das Rind nur wenig BALT. In den Lungen
neonataler Kälber liegt kein BALT vor (ANDERSON et al. 1986). Die Autoren untersuchten
neben neonatalen Kälbern vier, acht und 18 Monate sowie über drei Jahre alte gesunde
Schlachtrinder und stellten fest, dass mit wachsendem Alter die Anzahl der BALT-Foci bis zu
einem Maximum im Alter von 18 Monaten steigt. Anschließend ist ein Zurückgehen zu
verzeichnen: die Anzahl von BALT-Foci adulter Rinder entspricht denen der vier Monate
alten Kälber. Bei der Mehrzahl des BALT handelt es sich in allen Altersgruppen um
Lymphaggregate ohne follikuläre Organisation, in individuell unterschiedlicher Anzahl liegen
jedoch auch Lymphfollikel vor. In größeren Luftwegen mit breiter Lamina propria und dicker
Muskelschicht befindet sich das BALT direkt unter der Basalmembran des Epithels, in
kleineren Luftwegen ist die Lokalisation variabel, häufig aber in der Submukosa unter einem
schmalen Band glatter Muskulatur. An Bronchioli reicht das BALT vom Epithel bis zur
Adventitia. Das BALT ist beim Rind über die gesamte Lunge verteilt, tendenziell ist aber in
den kranialen Lappen mehr BALT zu finden. Die Infiltration des über dem BALT liegenden
Epithels mit Lymphozyten erfolgt unter Beibehaltung der Epithelstruktur. Das Vorkommen
von Lymphepithel bei gesunden Rindern können die Autoren weder mittels Licht- noch
mithilfe der Transmissionselektronenmikroskopie nachweisen. Eine Dome-Region liegt beim
gesunden Rind nicht vor. Bei Tieren mit enzootischer Bronchopneumonie steigert sich auch
beim Rind die Anzahl der BALT-Foci, insbesondere an den Bronchioli in den kranialen
Lappen der Lunge. Es kommt zur Ummantelung dieser kleineren Luftwege („cuff“-Bildung),
zu vermehrter Follikelbildung und zu einzelnen Lymphepithelbildungen (ANDERSON et al.
1986).
Mittels Durchflusszytometrie und Immunhistochemie haben MATHY et al. (1997) die
Zellpopulationen in der Bronchoalveolären Lavage-Flüssigkeit bzw. im Lungenparenchym
gesunder Rinder untersucht. Die Hauptzellpopulation des Lungenparenchyms stellen den
Autoren zufolge die Makrophagen. Mehr T-Zellen als B-Zellen liegen verteilt im
Lungenparenchym, hauptsächlich sind beide Populationen jedoch im BALT der Lunge
anzutreffen, wobei die T-Zellen um eine zentrale Zone mit B-Zellen verteilt liegen. Die TZellen unterteilen sich in eine größere Anzahl CD8 positiver Zellen und einen geringeren
Anteil CD4 positiver Zellen. Nur wenige der CD8 positiven Zellen befinden sich im BALT
Literaturübersicht
27
zwischen den B-Zellfollikeln, der größere Anteil liegt im Parenchym. Die meisten CD4 und
CD8 positiven T-Zellen scheinen Gedächtniszellen zu sein (MATHY et al. 1997).
TSCHERNIG u. PABST (2000) finden beim gesunden Fetus kein BALT in der Lunge, bei
gesunden Menschen bis zu einem Alter von 20 Jahren nur vereinzelt. Durch Rauchen und
durch mikrobielle Stimulation kann den Autoren zufolge aber auch beim Menschen BALT
gebildet werden. Frühestens ab der 16. Woche finden GOULD u. ISAACSON (1993) bei
etwa der Hälfte der von Ihnen untersuchten abortierten Feten, in deren Plazenta eine
Chorioamnionitis feststellbar ist, und Kindern BALT. Das Vorkommen von BALT bei vor der
23. Woche abortierten Feten korreliert deutlich mit der Infektion, der Nachweis von BALT bei
Feten dieses Alters ohne Anzeichen einer Infektion gelang nur ein Mal. Jedoch weist ein
Viertel der Feten über 24 Wochen ohne Infektion in dieser Studie ebenfalls BALT auf.
2.4.3 Reaktionen
des
BALT
bei
respiratorischen
Mykoplasmen-
infektionen
Bei natürlichen und experimentellen respiratorischen Infektionen von Labortieren, Rindern
und Schweinen mit verschiedenen Mykoplasmenspezies kommt es im Verlauf des
Krankheitsgeschehens zu einer teilweise massiven lymphatischen Hyperplasie des BALT
(FERNALD 1979; SCHÜTZE u. LABER 1985; HOWARD et al. 1987 a; MAES et al. 1996),
wobei der Mechanismus, der dazu führt noch weitgehend unklar ist. HOWARD et al. (1987 a)
vermuten, dass eine Persistenz der Organismen auf der Mukosaoberfläche zu diesen
peribronchialen lymphatischen Akkumulationen beiträgt.
Bislang gibt es nur wenige Untersuchungen, in denen die Lymphozytenpopulationen in der
Lunge nach Mykoplasmeninfektionen näher differenziert wurden. JONES et al. (2002)
fanden heraus, dass Mycoplasma pulmonis in der murinen Lunge 14 Tage nach der Infektion
zu einer Vermehrung von CD8 und CD4 positiven T-Zellen führt, wobei die T-Helferzellen
(CD4 positiv) stärker expandieren. Die T-Helferzellen Subtypen (Th1 und Th2) produzieren
nach Infektion in der Lunge die Zytokine IFN-? und IL-4. Da mehr IFN-? nachweisbar ist, wird
den Autoren zufolge die Hauptkomponente der T-Helferzellantwort vermutlich von Th1-Zellen
getragen.
Auffällig bei der Erkrankung von Mäusen durch Mycoplasma pulmonis ist eine dramatische
Verschlimmerung des Krankheitsbildes durch experimentelle Verringerung der CD8 positiven
sowie eine Besserung des Krankheitsbildes durch eine experimentelle Verringerung der CD4
Literaturübersicht
28
positiven T-Zellen, ohne dass es dabei zu einer Änderung der Anzahl an Mykoplasmen in
der Lunge kommt (CARTNER et al. 1998; JONES et al. 2002).
Eine immunhistologische Untersuchung an Lungen von Ziegen, bei denen eine
Spontaninfektion mit drei verschiedenen Mykoplasmenspezies (M. mycoides subsp.
mycoides, M. mycoides subsp. capri bzw. M. capricolum subsp. capricolum) vorlag
(RODRÍGUEZ et al. 2001), ergibt als Hauptzelltyp im BALT CD3 positive Zellen, was auf
eine signifikante Rolle der T-Zellvermittelten Immunität hindeutet. Dabei sind mehr als
doppelt so viele CD4 positive T-Zellen gegenüber CD8 positiven Zellen zu finden, während
das Verhältnis beider Zelltypen bei den negativen Kontrolltieren etwa gleich ist. Beide
Zelltypen liegen perifollikulär verteilt vor, CD4 positive Zellen zudem aggregiert im
Keimzentrum zwischen B-Lymphozyten und weiteren, nicht näher spezifizierten MHC
Klasse II positiven Zellen, während CD8 positive Zellen auch unter dem Epithel anzutreffen
sind. Zwischen den Lymphozyten und unter der Basalmembran des Bronchialepithels liegen
weiterhin MHC-II positive Zellen, darunter auch dendritische Zellen. Auch in den
Alveolarwänden kommt es zu einem signifikanten Anstieg CD3, CD4 und CD8 positiver
sowie
immunglobulinhaltiger
Zellen,
die
dominierende
phagozytierende
Zelle
im
Lungenparenchym ist der Makrophage (RODRÍGUEZ et al. 2001). Bei einer experimentellen
Infektion von Ziegen mit Mycoplasma bovis oder Mycoplasma agalactiae fällt die CD4Antwort etwas geringer aus (Verhältnis CD4+:CD8+>1). Die Verteilung der Zelltypen im BALT
bleibt ähnlich, zudem werden disseminiert verteilte CD8 positive Zellen in den Follikeln
beschrieben. Die Beobachtung von immunglobulinhaltigen Plasmazellen perifollikulär und
subepithelial im BALT und spezifischen Antikörpern im Serum lässt auch eine Beteiligung
der humoralen Abwehr beim Versuch, die Mykoplasmen aus dem Respirationstrakt zu
beseitigen, vermuten (RODRÍGUEZ et al. 2000).
Bislang gibt es im Schrifttum keine Untersuchungen über Art und Topographie der in der
Lunge von Kälbern oder Rindern mit respiratorischer Mycoplasma bovis-Infektion
auftretenden Lymphozytenpopulationen.
Material und Methoden
29
3 Eigene Untersuchungen
3.1 Material und Methoden
3.1.1 Infektionsversuche und Untersuchungsmaterial
3.1.1.1 Infektionsversuche
Für die Untersuchungen standen Lungengewebeproben von insgesamt 21 Kälbern zur
Verfügung, die aus drei verschiedenen Infektionsversuchen (A, B und C) stammten.
Der Infektionsversuch A ist am damaligen Centre National d’Études Vétérinaires et
Alimentaires (CNEVA, jetzt Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments, AFSSA) in
Lyon, Frankreich, im Januar 1997 durchgeführt worden. Hierbei wurden acht Kälber (Tabelle
2) im Alter von drei Wochen intratracheal mit 20 bis 40 ml Mykoplasmenkultur, bestehend
aus einer klonalen Variante des Typ-Stammes PG 45, inokuliert. Diese klonale Variante
exprimiert ausschließlich das variable Oberflächenprotein VspA 64 kDa. Der Inokulumtiter
betrug etwa 1010 CFU/ml. Die Kälber stammten aus Herden seronegativer Kühe, deren
Kälber im vorangegangenen Jahr weder Symptome von Pneumonie noch von Arthritis
gezeigt hatten. Pro Herde wurden 15 Tiere serologisch getestet und es wurde sichergestellt,
dass keine der Kühe im vorangegangenen Jahr Anzeichen einer Mastitis gezeigt hatte.
Tabelle 2: Versuchstiere (Infektionsversuch A), inokuliert mit einer klonalen Variante des M. bovis
Typ-Stammes PG 45
Tier-Nr.
Ohrmarken-Nr.
Alter bei Inokulation (in Wochen)
Tötung (Tage p.i.)
1
7
3
2
2
12
3
2
3
5
3
4
4
13
3
4
5
9
3
6
6
10
3
6
7
2
3
10
8
8
3
10
9*
E
3
14 Tage nach Versuchsbeginn
p.i. = post infectionem; * Kontrolltier
Material und Methoden
30
Vor Versuchsbeginn wurden alle Tiere auf eine bereits bestehende Infektion mit M. bovis
oder anderen Mykoplasmen durch zwei im Abstand von einer Woche durchgeführte
Bronchialwaschungen (zwei und eine Woche vor Inokulation, s. Tabelle 3) und vier
wöchentliche serologische Tests (indirekte Hämagglutination) untersucht. Die Ergebnisse der
Reisolierung von M. bovis nach der Tötung sind in Tabelle 6 wiedergegeben. Je zwei Kälber
wurden im Abstand von zwei, vier, sechs und zehn Tagen nach der Infektion durch
Betäubung und anschließendes Entbluten getötet und anschließend seziert.
Tabelle 3: Ergebnisse der bakteriologischen Untersuchung des Infektionsversuches A mittels
Tracheobronchialer Lavage an Tag 3 und 1 vor der Infektion
Tier Nr.
M. bovis
andere
Mykoplasmen
andere Bakterien
1
-
+
-
2
-
+
P.m.
3
-
+
-
4
-
+
P.m.
5
-
+
-
6
-
+
Ek.
7
-
+
-
8
-
+
n.d.
9*
-
-
-
*Kontrolltier
+
n.d.:
negativ
2
3
10 bis 10
nicht durchgeführt
P.m.: Pasteurella multocida
Ek.: Enterokokken
Bei den Infektionsversuchen B und C handelt es sich um ein gemeinsames
Forschungsprojekt der Arbeitsgruppen von Prof. Dr. R. Rosengarten (Institut für
Bakteriologie, Mykologie und Hygiene, Veterinärmedizinische Universität Wien, Österreich)
und Prof. Dr. M. Hewicker-Trautwein (Institut für Pathologie, Tierärztliche Hochschule
Hannover). Diese Versuche sind im April 1999 (Versuch B) und im Juli 2000 (Versuch C)
durchgeführt worden.
Bei dem Infektionsversuch B wurden vier männliche Kälber der Rasse Simmentaler im Alter
von vier Wochen intratracheal mit 30 ml einer bakteriellen Suspension aus 108
beziehungsweise 1010 CFU/ml des M. bovis Stammes 1067 inokuliert (Tabelle 4). Die Kälber
stammten aus Niederösterreich und wurden nach ihrer Ankunft auf Krankheitsanzeichen
Material und Methoden
31
untersucht. Während einer sich anschließenden zweiwöchigen Akklimatisationsphase
wurden die Tiere täglich klinisch untersucht. Des Weiteren wurden 9 und 3 Tage vor
Versuchsbeginn
mittels
bronchoalveolärer
Lavage
gewonnene
Proben
auf
das
Vorhandensein von M. bovis getestet. Zudem wurden die Tiere mittels Western-Blot-Technik
serologisch auf das Freisein von Antikörpern gegen M. bovis untersucht. Drei Wochen nach
der Inokulation wurden die Kälber durch eine intravenös applizierte Überdosis Pentobarbital
(Nembutal) getötet und anschließend seziert. Die Ergebnisse der an postmortal
gewonnenen Lungengewebeproben durchgeführten bakteriologischen Untersuchungen sind
in Tabelle 7 wiedergegeben.
Tabelle 4: Versuchstiere (Infektionsversuch B)
Tier-Nr.
Ohrmarken-Nr.
E-Nr.
Alter bei Sektion Geschlecht
Inokuliert mit M. bovis
(in Wochen)
8
10
7701
1506/99
7
männlich
Stamm 1067, 10 CFU/ml
11
3051
1508/99
7
männlich
Stamm 1067, 10 CFU/ml
12
3688
1507/99
7
männlich
Stamm 1067, 10
10
CFU/ml
Stamm 1067, 10
10
CFU/ml
8
13
0353
1509/99
7
männlich
14*
0307
1504/99
7
männlich
-
15*
4261
1505/99
7
männlich
-
*Kontrolltier; E-Nr. = Identifikationsnummer der in Paraffin eingebetteten Gewebeproben
Der Infektionsversuch C umfasste ebenfalls vier Kälber der Rasse Simmentaler, die im
Rahmen eines Immunisierungsversuches als positive Kontrollgruppe dienten und die im Alter
von drei bis fünf Wochen mit 30 ml einer Mykoplasmenkultur aus 7,4x10 9 CFU/ml des M.
bovis Stammes 1067 intratracheal inokuliert worden waren (Tabelle 5). Alle im Versuch
verwendeten Tiere stammten aus M. bovis -freien Höfen in Niederösterreich.
Vier Tage vor Versuchsbeginn entnommene Nasen- und Rachentupferproben waren bei
allen Kälbern negativ für M. bovis. Zudem waren alle Tiere bei der Untersuchung mittels
Western-Blot-Technik seronegativ für Antikörper gegen M. bovis-Vsp A. Zu Versuchsbeginn
(Tag 0) und am Tag 21 des Versuchs wurde allen Tieren dieser Gruppe sterile
physiologische Kochsalzlösung mit einem Adjuvans intramuskulär injiziert. Die Inokulation
mit M. bovis Stamm 1067 erfolgte 18 Tage später (Tag 39 des Versuches). Die Ergebnisse
der
bakteriellen
Untersuchung
mittels
Polymerase-Kettenreaktion
sowie
kultureller
Nachweisverfahren nach der Infektion sind in Tabelle 8 zusammengefasst. Nach drei
Material und Methoden
32
Wochen (Tag 60 des Versuches) wurden die Tiere mittels einer Überdosis Pentobarbital
(Nembutal) getötet.
Tabelle 5: Versuchstiere (Infektionsversuch C)
Tier- Ohrmarken
Nr.
16
E-Nr.
-Nr.
Alter bei Sektion
Geschlecht
(in Wochen)
176
2936/00
11
männlich
Vorbehandlung
Inokuliert mit
(Tag 0 und 21)
M. bovis (Tag 39)
sterile phys. NaCl
Stamm 1067
9
Lösung / Adjuvans 7,4 x 10 CFU/ml
17
998
2937/00
11
männlich
sterile phys. NaCl
Stamm 1067
9
Lösung / Adjuvans 7,4 x 10 CFU/ml
18
4838
2938/00
12,5
männlich
sterile phys. NaCl
Stamm 1067
9
Lösung / Adjuvans 7,4 x 10 CFU/ml
19
341
2939/00
12
männlich
sterile phys. NaCl
Stamm 1067
9
Lösung / Adjuvans 7,4 x 10 CFU/ml
20*
3444
2934/00
11,5
männlich
sterile phys. NaCl
Lösung / Adjuvans
21*
4835
2935/00
14,5
männlich
sterile phys. NaCl
Lösung / Adjuvans
-
-
phys. = physiologisch
* Kontrolltier
3.1.1.2 Kontrolltiere
Als Kontrolltiere dienten ein im Versuch A (Tier Nr. 9) und zwei im Versuch B (Tiere Nr. 14
und 15) mit sterilem Kulturmedium in die Trachea inokulierte Tiere. Den Kontrolltieren aus
Versuch C (Tiere Nr. 20 und 21) war am Tag 0 und am Tag 21 des Versuches sterile
physiologische Kochsalzlösung mit einem Adjuvans intramuskulär injiziert worden. Achtzehn
Tage später wurde diesen beiden Kontrollkälbern 30 ml steriles Mykoplasmenmedium (SP4,
ohne Penicillin) intratracheal verabfolgt.
Des
Weiteren
standen
je
drei
in
Formalin
fixierte
und
paraffineingebettete
Lungengewebeproben von zwei 3,5 Monate alten gnotobiotischen Kälbern zur Verfügung
(Tiere Nr. 22 und 23). Diese Tiere waren im Rahmen eines am Institute for Animal Health,
Compton
Laboratory,
Compton,
Newbury,
England
durchgeführten
Vakzinationsexperimentes immunisiert und anschließend mit dem Bovinen Respiratorischen
Synzytialvirus (BRSV) inokuliert worden. Diese Tiere hatten bei der postmortalen
Untersuchung keinerlei makroskopische Lungenveränderungen gezeigt.
Material und Methoden
33
Tabelle 6: Ergebnisse der bakteriologischen Untersuchung des Infektionsversuches A am
homogenisierten Lungengewebe nach Infektion und Tötung
Tier Tag
Lokalisation 1
Lokalisation 2
Lokalisation 3
Lokalisation 4
Lokalisation 5
Lokalisation 6
Nr.
p.i.
M.b a.M a.B M.b a.M a.B M.b a.M a.B M.b a.M a.B M.b a.M a.B M.b a.M a.B
1
2
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
2
2
++
-
-
++
-
-
++
-
-
+
-
-
+
-
-
+
-
-
3
4
-
-
M.h
-
-
-
(+)
(+)
-
-
-
-
-
-
-
-
+
M.h
4
4
-
-
P.m
-
-
P.m
-
-
P.m
-
-
P.m
-
-
P.m
-
++
P.m
5
6
-
-
-
-
-
-
-
-
-
(+)
-
-
-
-
-
-
-
-
6
6
(+)
(+)
Ba.
-
+
Ba.
-
-
-
-
-
-
+
-
-
-
++
-
7
10
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
8
10
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
9*
14
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
*Kontrolltier, Tötung 14 Tage nach Inokulation mit sterilem Medium
p.i.:
post infectionem
M.h.:
Lokalisation 1 bis 6: s. Abb. 2
Mannheimia (früher Pasteurella)
haemolytica
P.m.: Pasteurella multocida
-
negativ
(+)
bis 10
+
++
Ba.:
Bacillus sp.
M.b.: Mycoplasma bovis
2
3
a.M.: andere Mykoplasmen
4
5
a.B.:
10 bis 10
10 bis 10
andere Bakterien
Material und Methoden
34
Tabelle 7: Ergebnisse der kulturellen bakteriologischen Untersuchung 21 Tage nach der Infektion
(Infektionsversuch B)
makroskopisch unverändertes
Tier
pneumonisches Lungengewebe
Lungengewebe
Nr.
M. bovis
a.M.
pos.
-
a.B.
M. bovis
a.M.
pos.
-
a.B.
++ Ec.
10
++ Ec.
+ Sc.
+ Sc.
+ St.a.
+ St.a.
+++ Sc.
11
pos.
-
es lagen makroskopisch keine
++ St.
pneumonischen Veränderungen vor
+ St.a.
+ P.m.
12
pos.
-
+++ P.m.
pos.
+ Sc.
-
+ St.
+ St.
++ P.m.
13
pos.
-
++ P.m.
pos.
+ Sc.
-
+ St.a.
-
-
es lagen makroskopisch keine
+ Ec
pneumonischen Veränderungen vor
+ St.
++ Ec.
15*
-
-
+ Sc.
+ St.a.
++ Sc.
14*
+ Sc.
++ Ec.
-
++ Sc.
-
+ St.a.
++ Sc.
+ St.a.
*Kontrolltiere
pos.:
positiv
M. bovis:
Mycoplasma bovis
-:
negativ
P.m.:
Pasteurella multocida
+
geringgradig
Sc.:
α-hämolysierende Streptokokken
++
mittelgradig
St.:
koagulase-negative
+++
hochgradig
Staphylokokken
St.a.:
Staphylococcus aureus
Ec:
Enterococcus species
Material und Methoden
Tabelle
8:
Ergebnisse
35
der
bakteriologischen
Untersuchung
21
Tage
nach
der
Infektion
(Infektionsversuch C)
Tier
Nr.
Obere Atemwege
Untere Atemwege
(Nasen-/Rachentupfer)
(BALF)
Ln. tracheo-
Lunge
bronchialis
M. bovis
a.B.
M. bovis
a.B.
M. bovis
a.B.
M. bovis
16
pos.
-
-
A.p.+
pos.
A.p.+/++
pos.
17
pos.
-
pos.
-
pos.
A.p.+/++
pos.
18
-
-
-
-
pos.
-
pos.
19
pos.
-
pos.
-
-
-
pos.
20*
-
-
-
-
-
-
-
21*
-
-
-
-
-
-
-
*Kontrolltiere
pos.:
positiv
-
negativ
+
geringgradig
++
mittelgradig
Ln.
Lymphonodus
BALF:
Bronchoalveoläre Lavage
Flüssigkeit
M. bovis:
Mycoplasma bovis
A.p.:
Arcanobacterium pyogenes
a.B.:
andere Bakterien
(u.a. Enterokokken, Mikrokokken)
3.1.1.3 Pathologisch-anatomische Untersuchung der Lungen
Die makroskopische Beurteilung der bei den Kälbern der drei Infektionsversuche bei der
Sektion festgestellten Lungenveränderungen erfolgte durch eine Pathologin der École
Nationale Vétérinaire de Lyon, Frankreich (Versuch A, Dr. D. Le Grand) bzw. durch Prof. Dr.
M. Hewicker-Trautwein, Tierärztliche Hochschule Hannover (Versuche B und C).
3.1.1.4 Untersuchungsmaterial
In allen drei Versuchen wurden von jedem Tier bei der pathologisch-anatomischen
Untersuchung aus sechs vorher festgelegten Lokalisationen der linken und rechten Lunge (s.
Abbildung 2) mehrere Gewebeproben entnommen. Bei den Tieren, deren Lungen
makroskopisch pneumonische Veränderungen aufwiesen, wurden zusätzlich Gewebeproben
aus diesen veränderten Bereichen entnommen. Für die vorliegenden histologischen und
immunhistologischen Untersuchungen standen aus jeder dieser sechs Lungenlokalisationen
zwei (Versuche A und B) bzw. eine (Versuch C) formalinfixierte und paraffineingebettete
sowie eine (Versuche B und C) tiefgefrorene Gewebeprobe zur Verfügung.
Material und Methoden
36
Abbildung 2: Entnahmelokalisationen für die Versuche A, B und C am Schema der Rinderlunge
(Dorsalansicht, modifiziert nach NICKEL et al. 1999)
3.1.2 Probenaufbereitung für die Lichtmikroskopie und
Immunhistochemie
3.1.2.1 Gewebefixierung und Einbettung sowie Anfertigung von Paraffinschnitten
Die Fixierung der Gewebeproben aus Versuch A erfolgte für 24 Stunden in 4%igem
gepuffertem Formalin (pH 7,4 - 7,6). Die Proben aus den Versuchen B und C wurden 72
Stunden ebenfalls in neutralem, gepuffertem 4%igem Formalin fixiert. Danach erfolgte die
routinemäßige Einbettung in Paraffin. Diese Arbeiten wurden an der CNEVA-Lyon (Proben
aus Versuch A) bzw. im Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
(Proben der Versuche B und C) durchgeführt.
Die Anfertigung der Paraffinschnitte mit einer Dicke von 3 µm erfolgte auf einem
Schlittenmikrotom (HM 400, Fa. Microm, Heidelberg). Die Schnitte wurden in einem
Wasserbad bei 40°C gestreckt und auf Superfrost Plus Objektträgern (Fa. Menzel-Gläser,
Material und Methoden
37
Wiesbaden) aufgezogen. Anschließend wurden sie für 60 min in einem Trockenschrank bei
70°C (Fa. Heraeus, Hanau) getrocknet und bei Raumtemperatur aufbewahrt.
3.1.2.2 Gewebekonservierung und Anfertigung von Kryostatschnitten
Die bei der Sektion entnommenen Lungenproben wurden in flüssigem Stickstoff
schockgefroren, bei –70°C gelagert und am darauffolgenden Tag auf Trockeneis zum Institut
für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover transportiert, wo sie bei –70°C
gelagert wurden.
Zur
Schnittherstellung
wurden
die
Lungenproben
mit
einem
Einbettmedium
für
Gefrierschnitte (Tissue Tek O.C.T. Compound, Saleura, Zoeterwoude, Niederlande) auf
den Mikrotomschlitten (HM 500, Fa. Microm, Heidelberg) aufgefroren. Es wurden 6-8 µm
dicke Kryostatschnitte angefertigt, die auf Superfrost Plus Objektträger (Fa. Menzel-Gläser,
Wiesbaden) aufgebracht wurden. Sie wurden 30 min bei Raumtemperatur getrocknet und
dann bei –70°C bis auf Weiteres gelagert.
3.1.3 HE- und Spezialfärbungen
3.1.3.1 Färbung der Paraffinschnitte mit Hämalaun-Eosin (HE-Färbung)
Die Färbung erfolgte in einem Färbeautomaten (Varistain 24-3, Fa. Shandon, Frankfurt). Von
jeder Lokalisation der Lungen aller Kälber wurde ein Paraffinschnitt mit Hämalaun und Eosin
nach dem Protokoll, das im Anhang unter 7.4.1 aufgeführt ist, gefärbt. Diese Schnitte dienten
zur Auswertung und Beschreibung der histologischen Veränderungen und zur Orientierung
für die immunhistologischen Untersuchungen.
3.1.3.2 Färbung der Paraffinschnitte mit Toluidinblau
Zur Darstellung von Mastzellen in der Lunge wurden einige Paraffinschnitte mit Toluidinblau
nach der Methode, die im Anhang unter 7.4.2 aufgeführt ist, gefärbt. Auf blassblauem
Hintergrund stellten sich Mastzellgranula rosa-violett dar.
3.1.3.3 Elastika van Gieson-Färbung der Paraffinschnitte
Zum Nachweis einer Bindegewebszubildung in der Lunge wurden die betroffenen Schnitte
einer Elastika van Gieson-Färbung unterzogen (Methode s. Anhang 7.4.3). Hierbei stellte
sich Bindegewebe rot dar.
Material und Methoden
38
3.1.4 Vorversuche für die Immunhistologie
Für jeden der immunhistologisch eingesetzten Antikörper wurde die optimale Verdünnung
durch mehrere Probereaktionen ermittelt, bei Paraffinschnitten zusätzlich die optimale
Demaskierungsmethode.
Bei den Kryostatschnitten war zu beachten, ob die Hemmung der endogenen Peroxidase vor
der Inkubation mit dem primären Antikörper erfolgen durfte, ohne dessen Reaktivität zu
hemmen.
Bei dem monoklonalen Antikörper gegen M. bovis 4D7 wurde zudem die Paraffingängigkeit
ermittelt, der monoklonale Antikörper 1E5 wurde entsprechend der von LINKNER (1998)
angegebenen Methode erneut auf diese getestet.
3.1.5 Immunhistologische Untersuchungen
3.1.5.1 Verwendete Antikörper
Zur Darstellung von Mycoplasma bovis-Antigen wurden an Paraffin- wie auch an
Kryostatschnitten monoklonale Antikörper, die gegen variable Oberflächenproteine von M.
bovis gerichtet sind, eingesetzt (4D7, 1A1, 1E5, 2A8, I2). Des Weiteren wurde ein aus
mehreren monoklonalen Antikörpern bestehendes, kommerziell erhältliches (Fa. Chemicon,
Temecula, CA, USA) Antikörpergemisch eingesetzt (sog. mAbpool). Zudem wurde die
Verteilung der Leukozytenoberflächenantigene von T-Lymphozyten (CD3, CD4 und CD8)
und B-Lymphozyten (CD79a) im Lungengewebe untersucht (s. Tabelle 9).
3.1.5.2 Untersuchungsmethoden am Paraffinschnitt
Die Darstellung der Antigene erfolgte indirekt mittels der Avidin-Biotin-Komplex Methode
(ABC-Methode).
Hierbei bindet ein unkonjugierter Primärantikörper an im Gewebe enthaltenes Antigen. Ein
gegen die Tierart des primären Antikörpers gerichteter, biotinylierter sekundärer Antikörper
bindet daraufhin am Primärantikörper. Um die Lokalisation des Antigens sichtbar zu machen,
wurde ein kommerziell erhältlicher ABC-Komplex verwendet (Vectastain Elite ABC-Kit, Fa.
Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA), der mit Peroxidase gekoppelt ist. Durch ein
geeignetes Chromogen wird das Antigen sichtbar gemacht.
Bei dieser Immunperoxidase-Färbung wird die starke Affinität von Avidin zu Biotin
ausgenutzt, mit dem der Sekundärantikörper konjugiert ist. Die freien Bindungsstellen am
Avidinmolekül ermöglichen hierbei die Bindung an das konjugierte Biotin.
Material und Methoden
39
Zunächst war eine Entparaffinisierung und Rehydrierung der Schnitte erforderlich, die mit
drei Schritten für je fünf Minuten in Xylol, dann in Isopropanol, 96%igem sowie 70%igem
Ethanol durchgeführt wurde.
Zur Verhinderung einer übermäßigen Hintergrundfärbung durch unspezifische Reaktionen
mit dem Farbstoff wurden die Schnitte in mit 0,5% H2O2 versetztes 70%iges Ethanol
verbracht. Die gewebeeigenen endogenen Peroxidasen werden hierbei durch den
Überschuss an H2O2 irreversibel gehemmt.
Die Fixierung in Formalin und die anschließende Einbettung in Paraffin führt häufig zu einer
Maskierung von Antigenen. Durch übermäßige Aldehydvernetzungen, Denaturierungsvorgänge,
die
eine
Strukturänderung
des
Antigens
bewirken
und
Bildung
von
Hydroxymethylenbrücken zwischen den basischen Aminosäuren der Epitope, kann eine
Erkennung des Epitops durch den Antikörper verhindert werden. Um diese Effekte der
Fixierung rückgängig zu machen, ist eine für jeden Antikörper spezifisch zu ermittelnde
Vorbehandlung erforderlich. Die Vorbehandlung erfolgte je nach Antikörper entweder durch
proteolytische Verdauung der Aldehydvernetzungen mit Trypsin oder im Wasserbad mit
einem kommerziell erhältlichen Reagenz (Demaskierungslösung G). Die für die einzelnen
Antikörper verwendeten Vorbehandlungen sind Tabelle 9 zu entnehmen.
Den einzelnen Reaktionsschritten folgte jeweils dreimaliges Spülen in phosphatgepufferter
Kochsalzlösung (PBS).
Durch elektrostatische Anziehung kann es zu unspezifischen Bindungen von Proteinen an
bestimmte Gewebeelemente wie stark geladene Bindegewebsbestandteile kommen. Die
damit einhergehende unspezifische Hintergrundfärbung kann durch Inkubation mit
Normalserum, das bei 56°C 30 Minuten inaktiviert wurde, vermindert werden. Das
Normalserum stammte von der Spezies, in der der sekundäre Antikörper hergestellt worden
war.
Direkt im Anschluss folgte die Inkubation mit dem primären Antikörper, der in PBS mit
1%igem Zusatz von bovinem Serumalbumin (BSA) verdünnt wurde, wodurch wiederum
Protein für unspezifische Bindungen zugeführt wurde. Die Verdünnungen der einzelnen
Antikörper sind der Tabelle 9 zu entnehmen. Die negative Kontrolle wurde mit Aszites aus
der Maus (Balb/c) oder Kaninchenserum überschichtet.
Nach der spezifischen Reaktion zwischen Antigen und Primärantikörper erfolgte die
Kopplung eines biotinylierten sekundären Antikörpers an das Fc-Segment des primären
Antikörpers. Der dann hinzugefügte Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex bindet nun an das
Biotinmolekül des sekundären Antikörpers.
Material und Methoden
40
Die im ABC-Komplex enthaltene Peroxidase fällt unter Zugabe des Elektronendonors
Wasserstoffperoxid
(H2O2;
Fa.
Riedel-de-Haen,
Seelze)
das
Chromogen
3,3‘-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid (DAB; Fa. Buchs, Schweiz) zu einem braunen
Farbniederschlag aus. Dieses Reaktionsprodukt ist sehr stabil und lagert sich in
unmittelbarer Nähe zum Antigen ab, so dass eine genaue lichtmikroskopische Zuordnung
möglich ist.
Die Gegenfärbung erfolgte mit Hämalaun nach Mayer. Eingedeckt wurden die Schnitte mit
Corbit-Balsam (Fa. Hecht, Kiel).
Eine Übersicht zur Durchführung der ABC-Methode findet sich im Anhang unter 7.1.1.
3.1.5.3 Untersuchungsmethoden am Kryostatschnitt
Besonders Oberflächenantigene werden zum Teil durch die Fixierung in Formalin irreversibel
geschädigt. In Gefrierschnitten bleiben diese labilen Antigene wesentlich besser erhalten.
Die Immunhistologie wurde auch bei den Kryostatschnitten anhand der ABC-Methode
durchgeführt. Die Entparaffinisierung sowie die Demaskierung entfällt bei Gefrierschnitten.
Die bei –70°C gelagerten Schnitte wurden zunächst für 30 Minuten auf Raumtemperatur
erwärmt und anschließend 5 Minuten bei Raumtemperatur in Aceton fixiert. Die Hemmung
der endogenen Peroxidase erfolgte erst nach der Inkubation mit dem Primärantikörper, da
eine frühere Hemmung bei den eingesetzten monoklonalen Antikörpern zu einer
verminderten oder ausbleibenden Reaktivität führte.
Die Schnitte wurden mit wässrigem Eindeckmittel (Immu-Mount; Fa. Shandon, Pittsburgh,
USA) eingedeckt.
Die eingesetzten Verdünnungen sind in Tabelle 9 aufgeführt. Eine Übersicht zur
Durchführung dieser Methode findet sich im Anhang unter 7.1.2.
3.1.5.4 Primäre Antikörper
Die monoklonalen Antikörper gegen M. bovis wurden unverdünnt bei –20°C aufbewahrt und
erst kurz vor Gebrauch aufgetaut. Die Antikörper gegen die Oberflächenantigene der T- und
B- Lymphozyten wurden unverdünnt bei +4°C gelagert. Alle Antikörper wurden kurz vor
ihrem Gebrauch mit PBS-Puffer mit 0,1% BSA-Zusatz verdünnt. Die Inkubation erfolgte bei
4° C über Nacht.
Material und Methoden
41
Tabelle 9: Tabellarische Darstellung der verwendeten primären Antikörper
AntikörperKlon bzw.
1E5
1A1
Gebrauchs-
Reaktivität
konzentration
Isotyp
mono-
Maus
Mycoplasma
klonal
IgG1k u. IgM
bovis
Maus IgM(κ)
Vsp A,B, C
Bezeichnung
mAb pool
Spezifität und
Typ
monoklonal
P: 1:2000
Herkunft und
Quellenangabe
0,25% Trypsin
Fa. Chemicon,
(37°C, 60 min)
Temecula, CA, USA
VMU Wien,
K: 1: 70
--
ROSENGARTEN et al.
(1994)
Vsp A, C und
mono-
Maus IgG1
klonal
andere (noch nicht
K: 1: 800
P: 1:200
definierte)
4D7
Vorbehandlung
mono-
Maus IgG3
klonal
Vsp A, B, C
K: 1:1200
P: 1:700
K: --
CNEVA / IZS;
P: 0,25% Trypsin
LE GRAND et
(37°C, 60 min)
al.(1996)
K: -P: 0,25% Trypsin
BgVV
BEIER et al.(1998)
(37°C, 60 min)
2A8
mono-
Maus IgG
klonal
nicht zu
ermitteln
BgVV
verschiedene
BEIER et al.(1998)
CNEVA / IZS
mono-
I2
Vsp C
Maus IgG1
klonal
pMB 67
K: 1:900
--
POUMARAT et al.
(1994)
Demaskierungs Anti-CD3
poly-
Kaninchen
CD3 /
klonal
IgG
T-Lymphozyten
P: 1:300
Fa. DAKO,
lösung G
Hamburg
(Fa. Biologo)
(Nr. A 0452)
(95°C, 20 min)
CC30
CC63
HM57
Vsp =
mono-
monoklonal
monoklonal
variable
CD4 /
Maus IgG1
klonal
K: 1:5
T-Lymphozyten
CD8 /
Maus IgG2a
T-Lymphozyten
(Nr. MCA834S)
K: 1:50
surface
B-Lymphozyten
Demaskierungs -
(variables
Oberflächenantigen von M. bovis)
K=
für Kryostatschnitte
P=
für Paraffinschnitte
P: 1:60
nicht erforderlich
VMU Wien = Veterinärmedizinische Universität
Wien, Österreich
Hamburg;
(Nr. M 7051)
(95°C, 20 min)
CNEVA = Centre National D’Études Vétérinaires et
Alimentaires, Lyon, Frankreich
IZS = Istituto Zooprofilattico Sperimentale, Brescia,
Italien
BgVV
-- =
Fa. DAKO,
lösung G
(Fa. Biologo)
und Plasmazellen
protein
Fa. Serotec
--
(Nr. MCA837G)
CD79a /
Maus IgG1κ
Fa. Serotec
--
=
Bundesinstitut
für
gesundheitlichen
Verbraucherschutz und Veterinärmedizin, Jena
(jetzt
Bundesforschungsanstalt
für
Virus -
krankheiten der Tiere, BFAV, Standort Jena)
Material und Methoden
42
3.1.5.5 Sekundäre Antikörper
Als sekundäre Antikörper standen kommerziell erhältliche, biotinylierte Antiseren zur
Verfügung. Sie wurden unverdünnt bei +4°C aufbewahrt und kurz vor Gebrauch 1:200 in
PBS verdünnt. Die Inkubation erfolgte 30 Minuten bei Raumtemperatur.
Tabelle 10: Tabellarische Darstellung der verwendeten sekundären Antikörper
Antikörper
Typ
Hersteller
GAR
IgG (H+L)
Vector Laboratories,
(Ziege anti-Kaninchen)
GAM
Burlingame, USA
IgG (H+L)
(Ziege anti-Maus)
GAM
(Ziege anti-Maus)
Vector Laboratories,
Burlingame, USA
IgM (µ)
Vector Laboratories,
Burlingame, USA
3.1.5.6 Spezifitätskontrollen
Die Antigenspezifität aller verwendeten kommerziell erhältlichen Antikörper wird von den
Herstellerfirmen mit ISO-Zertifikat garantiert. In Tabelle 9 sind die monoklonalen Antikörper,
die von Dr. F. Poumarat (CNEVA, Lyon), von Prof. Dr. R. Rosengarten (VMU Wien) und von
Dr. K. Sachse (BgVV) bereitgestellt wurden, sowie die entsprechenden Veröffentlichungen,
in denen die Reaktivität der Antikörper mit variablen Oberflächenproteinen von M. bovis
beschrieben wird, aufgeführt.
Als positive Kontrolle für die Reaktion zur Darstellung von Mycoplasma bovis -Antigen
wurden Lungenschnitte mitgeführt, die von einem Rind stammten, aus dessen Lunge
Mycoplasma bovis isoliert worden war und an denen mittels eines polyklonalen (LINKNER et
al. 2000) sowie eines monoklonalen Antikörpers (mAbpool) das Erregerantigen mehrfach
nachgewiesen worden war (Tier Nr. 4). Für die Antikörper gegen CD3 und CD79a wurde ein
Lymphknotenschnitt eines Kalbes aus Versuch C (Tier Nr. 20) als Positivkontrolle verwendet.
Als Negativkontrolle wurde je ein Lungenschnitt statt mit dem primären monoklonalen
Antikörper mit Balb/c-Serum (BioLogo, Kronshagen) inkubiert. Als Negativkontrolle für den
polyklonalen Antikörper CD3 wurde Kaninchenserum eingesetzt.
Material und Methoden
43
3.1.6 Auswertung und Dokumentation
Für die Auswertung der HE gefärbten Schnittpräparate und der immunhistochemischen
Reaktionen stand ein Standard-Binokular-Lichtmikroskop (Fa. Zeiss, Oberkochen) zur
Verfügung. Die HE gefärbten Schnittpräparate von Lungen der Tiere aus Versuch A wurden
auf der Grundlage der von LINKNER (1998) beschriebenen histologischen Befunde erneut
mikroskopisch beurteilt, wobei insbesondere eine weiterführende Analyse der Beschaffenheit
des peribronchiolären lymphatischen Gewebes vorgenommen wurde.
Die Auszählung der CD4 und CD8 positiven Zellen im BALT erfolgte computergestützt mit
digitaler Bildanalyse (Programm analySIS ®, Version 3.2, Fa. Soft Imaging System GmbH,
Münster) an einem Lichtmikroskop (Axiophot, Fa. Zeiss, Oberkochen). Es wurden im Mittel
1000 Zellen im BALT pro Lokalisation ausgezählt, aus denen die jeweils positiven Zellen
ermittelt wurden. In Fällen, in denen die 1000 Zellen nicht erreicht werden konnten, wurde
die höchstmögliche Anzahl an Zellen zu Grunde gelegt. Aus der ermittelten Gesamtzahl
positiver Zellen wurde das arithmetische Mittel errechnet und die Standardabweichung
gebildet. Die Anteile der verschiedenen positiven Zellen im BALT wurden schließlich
prozentual dargestellt. Als Signifikanztest wurde der Student-t-Test angewendet. Das
Signifikanzniveau wurde auf p<0,05 festgelegt.
Die fotografische Dokumentation erfolgte mit einem Mikroskop Axiophot (Fa. Zeiss,
Oberkochen) und mit Elite Chrome 160 T Diafilmen (Fa. Kodak).
Untersuchungsergebnisse
44
3.2 Untersuchungsergebnisse
3.2.1 Histopathologische und immunhistologische Befunde an Lungengewebsproben des Versuches A
3.2.1.1 Histopathologische Befunde
Bei den infizierten Tieren dieses Versuchs waren in allen untersuchten Lungenlokalisationen
lobulär, bei Tier Nr. 6 diffus über alle Lungenläppchen verteilte Verbreiterungen der
Alveolarsepten festzustellen, die mit neutrophilen Granulozyten, Makrophagen und
Lymphozyten infiltriert waren. Zudem waren in den Alveolen geringgradige Ansammlungen
von neutrophilen Granulozyten und Makrophagen vorhanden. Des Weiteren waren bei allen
infizierten Tieren neutrophile Granulozyten und Makrophagen in den Lumina der Bronchien
in unterschiedlicher gradueller Ausprägung festzustellen. Bei Tier Nr. 2 waren zudem große,
vakuolisierte Makrophagen (sog. „foamy macrophages“) und mehrkernige Riesenzellen in
den Bronchiallumina zu beobachten.
Im Bronchialepithel aller Tiere waren einzelne neutrophile Granulozyten und selten
Lymphozyten zu sehen. Subepithelial war eine geringgradige Infiltration mit einzelnen diffus
verteilten Lymphozyten und Plasmazellen vorhanden. Mit Ausnahme zweier Tiere (Nr. 2 und
5) lag eine geringgradige (Tiere Nr. 1, 3, 8) oder mittelgradige (Tiere Nr. 4, 6, 7) Proliferation
des peribronchialen lymphatischen Gewebes vor. Das BALT lag überwiegend als
lymphoidzelliges Aggregat ohne follikuläre Organisation, selten auch in Form eines einzelnen
oder mehrerer zusammenliegender Lymphfollikel mit Keimzentren vor. Nur bei Tier Nr. 3
konnte ein Überwiegen der Lymphfollikel festgestellt werden. Häufig lag das BALT zwischen
zwei dicht beieinander liegenden Bronchien oder Bronchiolen, nur selten zwischen einem
Bronchus bzw. Bronchiolus und der nahe gelegenen Arterie. In der Mehrzahl der Fälle
befanden sich BALT-Follikel oder Aggregate außerhalb der intakten Tunica muscularis,
häufig konnte aber auch eine von Lymphozyten durchbrochene Muskelschicht beobachtet
werden. Nur selten lag das BALT hingegen im subepithelialen Gewebe unter einer intakten
Muskelschicht. Postkapilläre Venulen (HEVs) konnten nur selten in der Peripherie des BALT
gesehen werden (Tiere 1 und 8). In BALT-Follikeln und Aggregaten waren nur wenige
apoptotische Lymphozyten und Mitosen zu sehen. Im Bereich der aus den Lobi caudales
gewonnenen Gewebeschnitte lagen tendenziell weniger BALT-Follikel und Aggregate vor,
als in den Gewebeschnitten der weiter kranial liegenden Lungenanteile.
Untersuchungsergebnisse
45
Bei Tier Nr. 4, bei dem bei der bakteriologischen Untersuchung Pasteurella multocida isoliert
worden war, lag eine akute eitrige Bronchopneumonie vor. Die Alveolen enthielten zahlreiche
neutrophile Granulozyten und Makrophagen und in den Lumina der Bronchien und
Bronchiolen waren außer neutrophilen Granulozyten teilweise mehrkernige Riesenzellen und
große vakuolisierte Makrophagen zu beobachten.
Tier Nr. 3, bei dem bei der bakteriologischen Untersuchung Mannheimia haemolytica isoliert
worden war, wies die stärksten Lungenveränderungen auf. In beiden Spitzenlappen lagen
ausgedehnte, teils konfluierende Nekroseherde vor, die ein homogenes, eosinophiles
Zentrum besaßen, das von neutrophilen Granulozyten und Makrophagen sowie einem Wall
aus fibrösem Bindegewebe umgeben war. In der unmittelbaren Umgebung größerer
Nekroseareale waren sogenannte „ghost lung structures“, Reste nekrotischer alveolärer
Strukturen, zu erkennen. In der Peripherie dieser Nekroseareale befanden sich Alveolen, die
mit
Fibrin
angefüllt
waren.
Das
interlobuläre
Bindegewebe,
das
ebenfalls
Fibrinansammlungen enthielt, war durch ein hochgradiges Ödem stark verbreitert und mit
Entzündungszellen infiltriert. Die Lymphgefäße waren erweitert. Die Pleura war verdickt und
mit Makrophagen und neutrophilen Granulozyten infiltriert.
Tabelle 11: Zusammenfassung der Ergebnisse der pathohistologischen Untersuchungen des
Infektionsversuches A
Tier-Nr.
Tötung p.i. Alveolarsepten eitr. BP
eitrige
BALT-
(Wochen)
infiltriert
Bronchitis / Proliferation
(Makr./nGr/Lz)
Bronchiolitis
Nekrosen
obliterierende
Bronchiolitis
1
2
+
-
+
ggr.
-
-
2
2
+
-
+
-
-
-
3
4
+
-
+
ggr.
+
-
4
4
+
+
+
mgr.
-
-
5
6
+
-
+
-
-
-
6
6
+
-
+
mgr.
-
-
7
10
+
-
+
mgr.
-
-
8
10
+
-
+
ggr.
-
-
p.i. = post infectionem ; Makr. = Makrophagen; nGr = neutrophile Granulozyten; Lz = Lymphozyten; eitr. BP =
eitrige Bronchopneumonie; ggr = geringgradig; mgr =mittelgradig
Untersuchungsergebnisse
46
3.2.1.2 Immunhistologische Befunde am Paraffinschnitt mit dem monoklonalen Antikörper
4D7
Bei
der
Auswertung
der
mit
dem
monoklonalen
Antikörper
4D7
inkubierten
Lungengewebsschnitte sämtlicher Lokalisationen fiel bei allen infizierten Tieren dieses
Versuches im Bereich der Alveolarsepten sowie an der Oberfläche von Alveolen ein teilweise
lobulär begrenztes lineares Reaktionsprodukt auf (Abb. 3). Insbesondere in Läppchen mit
eitriger Bronchopneumonie war ein intensiv gefärbtes und quantitativ vermehrtes braunes,
lineares Reaktionsprodukt vorhanden.
Bei den Tieren 1 und 3 fiel ein schmaler positiver Saum auf dem Flimmersaum des Epithels
einzelner Bronchien auf.
Vereinzelt reagierte in Läppchen mit verbreiterten interalveolären Septen das Zytoplasma
von Makrophagen positiv (Tiere Nr. 1, 2, 3, 6, 7).
Im proliferierten BALT des Tieres Nr. 3 konnte fokal extrazellulär gelegenes granuläres
Reaktionsprodukt sowie eine Anfärbung des Zytoplasmas einzelner Zellen beobachtet
werden. Zudem waren bei diesem Tier im Randbereich nekrotischer Areale feingranuläres
Reaktionsprodukt sowie positive Makrophagen nachzuweisen.
Bei allen Tieren war in mehreren Gewebeschnitten eine abschnittsweise lineare Reaktion der
Basalmembranen von Bronchialepithel und Bronchialdrüsenepithel festzustellen.
Abbildung 3: Nachweis von variablen Oberflächenproteinen von Mycoplasma bovis als lineares
Muster auf der Alveolarwandoberfläche (schwarzer Pfeil) und innerhalb des interalveolären
Interstitiums (roter Pfeil).
Tier-Nr. 5, Lokalisation 5; Paraffinschnitt; mAk 4D7 (1:700); Originalvergrößerung 400fach
Untersuchungsergebnisse
47
3.2.1.3 Immunhistologische Befunde am Paraffinschnitt mit dem monoklonalen Antikörper
2A8
Der Antikörper 2A8 zeigte am Paraffinmaterial in keiner der verwendeten Verdünnungsstufen
eine Reaktion.
Tabelle 12: Zusammenfassung der Ergebnisse der immunhistologischen Untersuchungen des
Infektionsversuches A (mAk 4D7)
Tier-
Tötung p.i. Makrophagen
Interalveolar-
Bronchial-
Oberfläche
Nr.
(Tage)
septen
lumen
Bronchien (Br) bzw.
(Interalveolarsepten / Alveolen)
von
Alveolarepithel (Ae)
1
2
+
+
-
Br / Ae
2
2
+
+
-
Ae
3
4
+
+
-
Br / Ae
4
4
-
+
-
Ae
5
6
-
+
-
Ae
6
6
+
+
-
Ae
7
10
+
+
-
Ae
8
10
-
+
-
Ae
p.i. = post infectionem
3.2.2 Histopathologische und immunhistologische Befunde an Lungengewebsproben des Versuches B
3.2.2.1 Histopathologische Befunde
Die
aus
diesem
Versuch
Entzündungserscheinungen
mit
stammenden
verbreiterten
Tiere
zeigten
Alveolarsepten,
unterschiedlich
die
mit
starke
neutrophilen
Granulozyten, Makrophagen und Lymphozyten infiltriert waren. Häufig waren die
Veränderungen lobulär begrenzt und peribronchiolär akzentuiert. In allen Fällen bestand eine
Hyperämie der interalveolären Kapillaren. Zudem lag bei allen Tieren eine graduell
unterschiedliche eitrige Bronchitis und Bronchiolitis vor, die sich durch Ansammlungen von
neutrophilen Granulozyten, Makrophagen und teilweise abgeschilferten Epithelzellen, bei
Tier Nr. 10 auch einzelnen eosinophilen Granulozyten im Lumen bemerkbar machte. Auch
Untersuchungsergebnisse
48
intraepitheliale und teilweise subepitheliale Infiltrationen mit neutrophilen Granulozyten traten
häufig auf.
Das peribronchioläre Lymphgewebe war bei allen Tieren in den verschiedenen
Lokalisationen sehr unterschiedlich ausgeprägt und reichte von vereinzelten subepithelialen
Lymphozyteninfiltrationen bis zu einer hochgradigen Proliferation des BALT. Dieses konnte
als Aggregat von überwiegend Lymphozyten und einzelnen Plasmazellen vorliegen, als
einzelner Follikel, oder in Form von mehreren nahe beieinander liegenden Follikeln, wobei
die Anzahl der Lymphaggregate gegenüber den Lymphfollikeln anscheinend leicht überwog.
Abbildung 4: Hochgradige BALT-Hyperplasie mit Ausbildung eines Lymphfollikels (L) zwischen zwei
Anschnitten von Bronchiallumina.
Tier-Nr. 10; Lokalisation 5; Paraffinschnitt, HE-Färbung; Originalvergrößerung 100fach
Nicht selten konnte eine vollständige Umschließung des Bronchus bzw. Bronchiolus („cuff“Bildung) beobachtet werden. Bei Tier Nr. 12 konnten auch Keimzentren im BALT bemerkt
werden, in deren Zentrum größere Lymphozyten lagen. Die BALT-Follikel und Aggregate
lagen teilweise außerhalb der intakten Tunica muscularis, häufiger konnte jedoch ein
Auseinanderweichen der Muskelschicht durch die Lymphozyten festgestellt werden, die sich
dann bis in das subepitheliale Gewebe erstreckten. Seltener konnten die BALT-Follikel und
Aggregate im subepithelialen Gewebe unter einer intakten Muskelschicht beobachtet
werden. Das über dem BALT liegende Epithel war häufig mit Lymphozyten infiltriert.
Vereinzelt war in diesen Bereichen eine Abflachung von Epithelzellen zu bemerken. BALT
Untersuchungsergebnisse
49
war häufig zwischen zwei benachbarten Anschnitten von Bronchien bzw. Bronchiolen
anzutreffen (Abb. 4). Nur selten lag es zwischen einem Bronchus bzw. Bronchiolus und der
nahe gelegenen Arterie. Eine gegenüber Versuch A vermehrte Anzahl an apoptotischen
Lymphozyten sowie Mitosen im BALT aller Tiere war festzustellen. HEVs konnten nur selten
in der Peripherie des BALT beobachtet werden (Tiere 10 und 11). Im Bereich der aus den
Lobi caudales gewonnenen Gewebeschnitte lagen tendenziell weniger BALT-Follikel und
Aggregate vor, als in den Gewebeschnitten der weiter kranial liegenden Lungenanteile.
Bei Tier Nr. 10 kamen zu den entzündlichen Infiltraten im interalveolären Interstitium akute
katarrhalisch-eitrige Entzündungsprozesse in Bronchien, Bronchiolen und Alveolen hinzu, mit
alveolärem Ödem, Hyperämie und massenhaft neutrophilen Granulozyten, aber auch
Makrophagen und einzelnen eosinophilen Granulozyten in den Lumina.
Bei Tier Nr. 12 überwogen in den Gewebeschnitten der Spitzenlappen und der kranialen
Anteile der Hauptlappen die meist hochgradigen Veränderungen in Form einer eitrigen
Bronchopneumonie mit Ansammlungen von massenhaft neutrophilen Granulozyten, aber
auch Makrophagen und einzelnen mehrkernigen Zellen in den Lumina von Luftwegen und
Alveolen. Die Lymphgefäße waren stark dilatiert. Das interlobuläre Bindegewebe zeigte sich
teilweise stark verbreitert. Im rechten Spitzenlappen lagen mehrere Nekroseherde mit
zentralem homogen eosinophilen Bereich, um den sich eine Zone aus neutrophilen
Granulozyten und Makrophagen gebildet hatte. Vereinzelt lagen in der Peripherie dieser
Nekrosen epithelzellähnliche Verbände. Im angrenzenden interlobulären Bindegewebe
waren teilweise proliferierende kapilläre Blutgefäße zu sehen. In beiden Kraniallappen sowie
im Mittellappen dieses Tieres lag an jeweils mehreren Bronchioli eine obliterierende
Bronchiolitis vor. Das Lumen der betroffenen Bronchioli war größtenteils oder vollständig
verlegt
durch
ein
aus
Fibroblasten
und
Bindegewebsfasern
bestehendes
Granulationsgewebe, in dem oft neutrophile Granulozyten vorhanden waren. Das Epithel der
Bronchioli zeigte, soweit noch vorhanden, eine starke Vakuolisierung des Zytoplasmas.
Untersuchungsergebnisse
50
Tabelle 13: Zusammenfassung der Ergebnisse der pathohistologischen Untersuchungen des
Infektionsversuches B
Tier-
Tötung
Alveolarsepten eitr. BP
eitrige Bronchitis / BALT-
Nr.
p.i.
infiltriert
Bronchiolitis
(Wochen)
(Makr./nGr/Lz)
Nekrosen obliterierende
Proliferation
Bronchiolitis
10
3
+
+
+
ggr-mgr
-
-
11
3
+
-
+
mgr-hgr
-
-
12
3
+
+
+
mgr-hgr
+
+
13
3
+
-
+
hgr
-
-
p.i. = post infectionem ; Makr. = Makrophagen; nGr = neutrophile Granulozyten; Lz = Lymphozyten; eitr. BP =
eitrige Bronchopneumonie; ggr = geringgradig; mgr = mittelgradig; hgr =hochgradig
3.2.2.2 Immunhistologische Befunde am Paraffinschnitt
3.2.2.2.1 Untersuchungen mit dem monoklonalen Antikörper-Gemisch (mAb pool)
Sehr häufig war lineares oder granuläres Reaktionsprodukt auf dem Flimmersaum des
Epithels zu sehen (Tiere 10, 12 und 13). Auflagerungen eines feinen linearen
Reaktionsproduktes auf Alveolarwänden konnten nur bei Tier 10 beobachtet werden.
Im Lumen von Bronchien und Bronchiolen konnte zwischen neutrophilen Granulozyten
extrazellulär gelegenes feingranuläres Reaktionsprodukt festgestellt werden, vereinzelt
reagierte auch das Zytoplasma neutrophiler Granulozyten und Makrophagen positiv.
Besonders in stark entzündlich alterierten Lungenbereichen lagen einzelne positive
Makrophagen.
Das monoklonale Antikörper-Gemisch verursachte bei einigen Lungenschnitten eine zum
Teil sehr starke Hintergrundfärbung. Die Anfärbung des Epithels von Bronchien und
Bronchiolen sowie Bronchialdrüsen war unterschiedlich: in vielen Lokalisationen kam es zu
einer diffusen Reaktion in allen Epithelzellen, in anderen Lokalisationen war eine granuläre
Reaktion besonders an den basalen Bereichen der Epithelzellen, aber auch zwischen diesen
und apikal der Zellkerne sowie in Becherzellen festzustellen. Das in den Bronchialdrüsen
enthaltene Sekret war stark angefärbt.
3.2.2.2.2 Untersuchungen mit dem monoklonalen Antikörper 4D7
Bei der Untersuchung der Lungengewebeschnitte mit dem monoklonalen Antikörper 4D7
konnte bei allen vier Tieren aus Versuch B wie bei den Tieren des Versuches A ein lineares
Untersuchungsergebnisse
51
Reaktionsmuster im Bereich der Alveolarsepten, besonders in Läppchen mit eitriger
Bronchopneumonie, dargestellt werden. Jedoch war sowohl die Intensität als auch die
Menge des Reaktionsproduktes bei den aus diesem Versuch stammenden Präparaten
geringer.
Im proliferierten BALT der Tiere Nr. 11 und 12 konnte vereinzelt, bei Tier Nr. 13 häufig eine
extrazelluläre granuläre Reaktion nachgewiesen werden. Bei einer zur Kontrolle
durchgeführten Reaktion, bei dem je ein Paraffinschnitt eines Lymphknotens der Tiere Nr. 14
und 15 (negative Kontrolltiere) mit dem monoklonalen Antikörper 4D7 inkubiert wurde, war
keine Reaktion festzustellen.
Nahe einzelner obliterierter Bronchioli des Tieres Nr. 12 konnte extrazellulär gelegenes
feingranuläres angefärbtes Material dargestellt werden. Bei den drei anderen Tieren war an
Bronchien und Bronchiolen kein Antigen nachweisbar.
3.2.2.2.3 Untersuchungen mit dem monoklonalen Antikörper 1A1
Bei der Auswertung der mit dem monoklonalen Antikörper 1A1 behandelten Paraffinschnitte
konnte eine lineare Ablagerung von Reaktionsprodukt auf dem Flimmersaum des Epithels in
einzelnen Lokalisationen bei zwei Tieren beobachtet werden (Nr. 10 und 12).
Im Lumen von Bronchien und Bronchiolen war bei allen Tieren extrazellulär gelegenes
Reaktionsprodukt festzustellen, welches meist körnig bis feingranulär zwischen neutrophilen
Granulozyten und Zelldetritus lag, bei Tier Nr. 11 dagegen eher fadenförmig das Lumen
durchzog. Vereinzelt lagen auch positive Makrophagen in diesen Bereichen (Tiere Nr. 11
und 13).
Außer bei Tier Nr. 12 waren vereinzelt positive Makrophagen in den Alveolarsepten
verstreut. Bei Tier Nr. 10 fielen zudem in zwei Lokalisationen lineare Auflagerungen auf den
Alveolarwänden auf.
Am Rand einer Nekrose war bei Tier Nr. 12 eine granuläre Reaktion festzustellen, die
möglicherweise in Resten von Epithelzellen lag.
Im proliferierten BALT des Tieres Nr. 13 war granuläres Reaktionsprodukt zu sehen.
Zudem fiel eine in fast allen Lokalisationen auftretende Reaktion am Bronchialepithel auf, die
selten diffus alle Epithelzellen betraf, häufiger hingegen granulär die Becherzellen und
granulär bis linear basale Anteile des Epithels anfärbte. Auch das Bronchialdrüsenepithel
zeigte teilweise diese Reaktion.
Untersuchungsergebnisse
52
3.2.2.2.4 Untersuchungen mit dem monoklonalen Antikörper 1E5
Der Antikörper 1E5 zeigte am Paraffinmaterial in keiner der verwendeten Verdünnungsstufen
eine Reaktion.
3.2.2.2.5 Untersuchungen mit dem monoklonalen Antikörper 2A8
Der Antikörper 2A8 zeigte am Paraffinmaterial in keiner der verwendeten Verdünnungsstufen
eine Reaktion.
3.2.2.3 Immunhistologische Untersuchungen am Kryostatschnitt
3.2.2.3.1 Untersuchungen mit dem monoklonalen Antikörper 4D7
Eine mit diesem Antikörper häufig auftretende Reaktion zeigte sich bei Kryostatschnitten
aller Tiere grobgranulär basal im Epithel von Bronchien, Bronchiolen und teilweise auch im
Bronchialdrüsenepithel.
Wie schon in den Paraffinschnitten fand sich bei zwei Tieren (Nr. 10 und 12) häufig
feingranuläres Reaktionsprodukt extra- und seltener intrazellulär im Lumen von Bronchiolen,
die mit neutrophilen Granulozyten und einzelnen Makrophagen angefüllt waren (Abb. 5).
3.2.2.3.2 Untersuchungen mit dem monoklonalen Antikörper 1A1
Im Lumen der Bronchien und Bronchioli der Tiere Nr. 10, 11 und 12 befand sich
überwiegend feingranuläres extrazellulär gelegenes Antigen zwischen neutrophilen
Granulozyten, aber auch einzelne positive Makrophagen und neutrophile Granulozyten mit
positiv reagierendem Zytoplasma waren zu sehen (Abb. 6). Lineare Auflagerungen auf dem
Flimmersaum traten nur bei den Tieren Nr. 10 und 12 auf.
Im Bereich der Alveolarsepten wie auch in Alveolarlumina waren ebenfalls einzelne positive
Makrophagen und neutrophile Granulozyten sowie extrazelluläres feingranuläres Antigen zu
sehen (Tiere Nr. 10, 12, 13). Exsudat, das sich in den Alveolarlumina befand, färbte sich
stark an.
Bei den Tieren Nr. 10, 11 und 12 fiel teilweise eine zytoplasmatische Färbung von Bronchialund Bronchiolarepithel auf, die bei Tier Nr. 12 diffus alle Epithelzellen der luftleitenden Wege,
bei den anderen beiden Tieren die Becherzellen betraf.
3.2.2.3.3 Untersuchungen mit dem monoklonalen Antikörper 1E5
Die Auswertung der Reaktionen dieses Antikörpers im Kryostatmaterial ergab insgesamt
eine eher schwache Anfärbung. Bei Tier Nr. 10 fanden sich feingranuläres Reaktionsprodukt
im Lumen einzelner Bronchien sowie geringgradige Auflagerungen auf dem Flimmersaum
Untersuchungsergebnisse
53
des Epithels. Bei den Tieren Nr. 11 und 12 zeigten sich eine feingranuläre Verteilung des
Reaktionsproduktes im Bereich einiger Alveolarsepten sowie einzelne Makrophagen mit
positivem Zytoplasma.
Bei Tier 13 konnte keine positive Reaktion festgestellt werden.
3.2.2.3.4 Untersuchungen mit dem monoklonalen Antikörper I2
Die Auswertungen der mit dem Antikörper I2 inkubierten Kryostatschnitte ergaben bei den
Tieren Nr. 10 und 12 feingranuläres Reaktionsprodukt in den Lumina von Bronchien und
Bronchiolen (Abb. 7). Zudem konnte bei diesen beiden Tieren extra- sowie seltener
intrazelluläres Reaktionsprodukt in mit neutrophilen Granulozyten angefüllten Alveolen
festgestellt werden. Einzelne positive Makrophagen fanden sich innerhalb der Alveolarwände
und im Lumen von Alveolen.
Im Zentrum einer beginnenden Nekrose fand sich bei Tier Nr. 12 eine deutliche feingranuläre
bis grobgranuläre Reaktion. Eine positive Reaktion an dieser Stelle konnte auch mit den
Antikörpern 4D7 und 1A1 festgestellt werden.
Bei den Tieren Nr. 11 und 13 konnte keine positive Reaktion festgestellt werden.
Tabelle 14: Zusammenfassung der Ergebnisse der immunhistologischen Untersuchungen des
Infektionsversuches B
Tier-
Tötung p.i. Makrophagen
Interalveolar-
Bronchial-
Oberfläche von Bronchien
Nr.
(Wochen)
septen
lumen
(Br) bzw. Alveolarepithel
(Interalveolarsepten / Alveolen)
(Ae)
10
3
+1A1; I 2
4D7
11
3
+1A1; 1E5
4D7
12
3
+1A1;1E5; I 2
4D7
13
3
+1A1
4D7
+mAbpool;
+mAbpool (Br); 1A1 (Br/Ae);
1A1;4D7;1E5; I2
4D7 (Ae); 1E5 (Ae)
+mAbpool; 1A1
+mAbpool (Ae); 4D7 (Ae)
+ mAbpool;
+mAbpool (Br); 1A1 (Br);
1A1;4D7; I2
4D7 (Ae)
+mAbpool; 1A1
+mAbpool (Br); 4D7 (Ae)
p.i. = post infectionem; mAbpool; 1A1;4D7; 1E5; I 2 = monoklonale Antikörper
Untersuchungsergebnisse
54
Abbildung 5: Hochgradig
Antigen (Vsps) im Lumen
eines
B ronchiolus,
dargestellt mit dem mAk
4D7.
Tier Nr. 12; Lokalisation 3;
Kryostat-schnitt; mAk 4D7
(1:1200);
Originalvergrößerung 400 fach
Abbildung 6: Im Lumen
des gleichen Bronchiolus
wie in Abb. 5 lassen sich
Vsps auch mit dem mAk
1A1 darstellen.
Tier Nr. 12, benachbarter
Kryostatschnitt; mAk 1A1
(1:800);
Originalvergrößerung 400 fach
Abbildung 7: Im Lumen
des gleichen Bronchiolus
(s. Abb. 5 u. 6) ist auch
variables
Oberflächenantigen
pMB
67
nachweisbar.
Tier Nr. 12, benachbarter
Kryostatschnitt; mAk I2
(1:900);
Originalvergrößerung 400 fach
Untersuchungsergebnisse
55
3.2.3 Histopathologische und immunhistologische Befunde an Lungengewebsproben des Versuches C
3.2.3.1 Histopathologische Befunde
Bei zwei der vier Tiere (Nr. 16 und 19) des Versuches C lag in allen untersuchten
Lungenlokalisationen eine mittel- bis hochgradige katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie
vor, die teilweise lobulär begrenzt auftrat, teilweise auch alle im Gewebeschnitt vorhandenen
Läppchen betraf (Abb. 8). Neben Ansammlungen von neutrophilen Granulozyten und
einzelnen Makrophagen sowie vereinzelt Zelldetritus im Lumen von Bronchien und
Bronchiolen waren auch intra- und subepitheliale Infiltrationen mit neutrophilen Granulozyten
und Lymphozyten sowie subepitheliale Infiltrationen mit Plasmazellen zu beobachten. In den
Alveolarsepten und den Alveolen waren massenhaft neutrophile Granulozyten und wenige
Makrophagen zu sehen. Im linken Spitzen- und im rechten Hauptlappen des Tieres Nr. 16
lag eine geringgradige Infiltration der Alveolarsepten mit eosinophilen Granulozyten vor.
Abbildung 8: Katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie mit hochgadigen Ansammlungen
neutrophilen Granulozyten im Lumen eines Bronchiolus (B) und in benachbarten Alveolen.
Tier Nr. 19; Lokalisation 2; Paraffinschnitt; HE-Färbung; Originalvergrößerung 400fach
von
Bei beiden oben genannten Tieren war eine chronische obliterierende Bronchiolitis
festzustellen (Abb. 9 u. 10). Bei Tier Nr. 16 waren in beiden Spitzenlappen, im Mittellappen
sowie im linken Hauptlappen jeweils mehrere Bronchioli ganz oder teilweise obliteriert. Bei
Tier Nr. 19 lag eine obliterierende Bronchiolitis im rechten Spitzenlappen vor. Das in den
Untersuchungsergebnisse
56
Lumina der Bronchiolen vorhandene Gewebe wurde mittels Elastica van Gieson-Färbung als
fibroblasten-
und kollagenfaserhaltiges Bindegewebe identifiziert. Das Epithel der
betroffenen Bronchiolen war vakuolisiert, abschnittsweise fehlte es.
Bei Tier Nr. 16 lag in mehreren Lokalisationen eine zum Teil hochgradige Fibrosierung der
interlobulären Septen vor. In zwei dieser Lokalisationen war die Einsprossung von Kapillaren
zu sehen. Zudem konnten bei diesem Tier multiple Nekroseherde in allen untersuchten
Bereichen der Lunge festgestellt werden, die aus einem homogen eosinophilen Zentrum,
umgeben von neutrophilen Granulozyten und Makrophagen sowie einer zum Teil sehr
breiten peripher gelegenen Bindegewebsschicht bestanden (Abb. 11 u. 12). Im Bereich
mehrerer großer Nekroseareale konnten sog. „ghost lung structures“, Reste nekrotischer
alveolärer Strukturen, erkannt werden (Abb. 13). In der Peripherie mehrerer Nekroseherde
konnten epithelzellartige Verbände beobachtet werden.
Abbildung 9: Obliterierende Bronchiolitis. Das Lumen des Bronchiolus ist vollständig verlegt mit
Granulationsgewebe und darin entaltenen neutrophilen Granulozyten. Das Zytoplasma der
Epithelzellen ist vakuolisiert.
Tier Nr. 16, Lokalisation 5; Paraffinschnitt; HE-Färbung; Originalvergrößerung 400fach
Untersuchungsergebnisse
57
Abbildung 10: Obliterierende Bronchiolitis. Vollständig mit Fibroblasten und Bindegewebsfasern
verlegtes Lumen eines Bronchiolus. Epithel (Pfeil) nur noch teilweise vorhanden, z.T. vakuolisiert
(Pfeilköpfe).
Tier 19; Lokalisation 6; Paraffinschnitt; HE-Färbung; Originalvergrößerung 200fach
Bei den Tieren Nr. 17 und 18 war eine gering- bis mittelgradige Infiltration der Alveolarsepten
mit einzelnen neutrophilen Granulozyten, Makrophagen und Lymphozyten festzustellen
(Abb. 14). Auffällig war bei beiden Tieren eine teilweise hochgradige Infiltration der
Alveolarsepten und der Alveolen mit eosinophilen Granulozyten, die bei Tier Nr. 17
besonders ausgeprägt war. Auch im Lumen von Bronchien- und Bronchiolen sowie intra- und
subepithelial und vereinzelt perivaskulär konnten eosinophile Granulozyten gefunden
werden.
Bei Tier Nr. 18 lag im Bereich des rechten Spitzenlappens eine geringgradige lobulär
begrenzte katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie vor.
Untersuchungsergebnisse
58
Abbildung 11: Nekroseherd (N) im Lungenparenchym mit Demarkationszone (D) aus neutrophilen
Granulozyten und Makrophagen.
Tier Nr. 16, Lokalisation 5; Paraffinschnitt; HE-Färbung; Originalvergrößerung 100fach
Abbildung 12: Ausschnittsvergrößerung aus Abb. 11.
Tier Nr. 16; Lokalisation 5; Paraffinschnitt, HE-Färbung; Originalvergrößerung 200fach
Untersuchungsergebnisse
59
Abbildung 13: Nekrose (N) im Lungenparenchym mit Resten alveolärer Strukturen, sog. „ghost lung
structures“ (G).
Tier Nr.16, Lokalisation 5;Paraffinschnitt; HE-Färbung; Originalvergrößerung 100fach
Abbildung 14: Verbreiterung der Alveolarsepten durch Infiltration mit Makrophagen, neutrophilen
Granulozyten und Lymphozyten.
Tier 18, Lokalisation 5; Paraffinschnitt; HE-Färbung; Originalvergrößerung 200fach
Untersuchungsergebnisse
60
Das peribronchioläre Lymphgewebe war bei den Tieren Nr. 16 und 19 in allen Lokalisationen
mittel- bis hochgradig proliferiert, bei den Tieren Nr. 17 und 18 in den verschiedenen
Lokalisationen hingegen sehr unterschiedlich ausgeprägt, wobei tendenziell in den kranialen
Bereichen der Lunge eine stärkere Proliferation des BALT verzeichnet werden konnte. Die
Ausprägung reichte von geringgradigen subepithelialen Lymphozyteninfiltrationen bis zu
einer hochgradigen Proliferation des BALT. Auch in diesem Versuch konnte zwischen
lymphoidzelligen Aggregaten ohne follikuläre Organisation (Abb. 15) und Lymphfollikeln mit
Keimzentren (Abb. 16 a und b) unterschieden werden, wobei auch hier die Anzahl der
lymphoidzelligen Aggregate leicht überwog. Die Lage der BALT-Follikel und Aggregate in
Bezug auf die Tunica muscularis entsprach der unter Versuch B beschriebenen. Das über
dem BALT liegende Epithel war in einer Lokalisation mit Lymphozyten durchsetzt. HEVs
konnten nur selten in der Peripherie des BALT beobachtet werden. Vereinzelt konnte eine
Infiltration des BALT mit neutrophilen oder eosinophilen Granulozyten festgestellt werden.
Wie in Versuch B waren auch in diesem Versuch im BALT sehr häufig apoptotische
Lymphozyten und Mitosen zu sehen.
Abbildung 15: BALT an einem Bronchus in Form eines lymphoidzelligen Aggregates ohne
Keimzentrum.
Tier Nr. 18; Lokalisation 5; Paraffinschnitt, HE-Färbung; Originalvergrößerung 200fach
Untersuchungsergebnisse
Abbildung 16 a: BALT an einem Bronchus in Form von mehreren Lymphfollikeln mit Keimzentren.
Tier Nr. 18, Lokalisation 5; Paraffinschnitt; HE-Färbung; Originalvergrößerung 50fach
Abbildung 16 b: Ausschnittsvergrößerung aus Abb. 16 a. Lymphfolikel mit Keimzentrum.
Tier Nr. 18, Lokalisation 5; Paraffinschnitt; HE-Färbung, Originalvergrößerung 200fach
61
Untersuchungsergebnisse
62
Tabelle 15: Zusammenfassung der Ergebnisse der pathohistologischen Untersuchungen des
Infektionsversuches C
Tier-
Tötung
Alveolarsepten eitr. BP
eitrige Bronchitis /
BALT-
Nr.
p.i.
infiltriert
Bronchiolitis
Proliferation
(Wochen)
(Makr./nGr/Lz)
Nekrosen obliterierende
Bronchiolitis
16
3
-
+
+
mgr-hgr
+
+
17
3
+ (eos.Gr)
-
-
ggr-hgr
-
-
18
3
+ (eos. Gr)
(+)
-
ggr-mgr
-
-
19
3
-
+
+
mgr-hgr
-
+
p.i. = post infectionem ; Makr. = Makrophagen; nGr = neutrophile Granulozyten; Lz = Lymphozyten; eos. Gr. =
eosinophile Granulozyten; eitr. BP = eitrige Bronchopneumonie; ggr = geringgradig; mgr = mittelgradig; hgr
=hochgradig
3.2.3.2 Immunhistologische Befunde am Paraffinschnitt
3.2.3.2.1 Untersuchungen mit dem monoklonalen Antikörper-Gemisch (mAb pool)
Bei zwei Tieren (Nr. 17 und 18) waren lineare Auflagerungen auf dem Flimmerepithel von
Bronchien und Bronchiolen zu finden, nur in einer Lokalisation konnten Auflagerungen auf
Alveolarwänden beobachtet werden (Tier Nr. 19). Vereinzelt lagen bei allen Tieren positive
Makrophagen in Alveolarwänden und in Alveolen.
Tier Nr. 16 zeigte zudem positive neutrophile Granulozyten in einem obliterierten
Bronchiolus, im umgebenden Gewebe eines weiteren obliterierten Bronchiolus lag
feingranuläres Reaktionsprodukt. Im Lumen eines intakten Bronchus war extrazellulär
gelegenes Antigen festzustellen. Am Rand mehrerer nekrotischer Bereiche befanden sich
sowohl extrazelluläres feingranuläres Reaktionsprodukt, als auch einzelne positive
Makrophagen und neutrophile Granulozyten.
Das Epithel aller Bronchien und Bronchiolen sowie Bronchialdrüsen reagierte positiv, wobei
es zu den zwei bereits unter Versuch B beschriebenen unterschiedlichen Reaktionsmustern
kam.
3.2.3.2.2 Untersuchungen mit dem monoklonalen Antikörper 4D7
Im Versuch C zeigten die mit dem monoklonalen Antikörper 4D7 inkubierten Gewebeschnitte
aller Tiere die schon im Versuch A und B festgestellten linearen Reaktionen an den Alveolen
(Abb. 17). Die Intensität des Reaktionsproduktes sowie die Häufigkeit seines Auftretens
hingegen war geringer. Auch bei diesem Versuch fiel das vermehrte Auftreten von
Reaktionsprodukt in Läppchen mit eitriger Bronchopneumonie auf.
Untersuchungsergebnisse
63
Bei Tier Nr. 16 lag feingranuläres Reaktionsprodukt im Lumen einzelner Bronchien. Zudem
konnte in den nekrotischen Bereichen dieses Tieres in den Randbereichen feingranuläres
extrazellulär gelegenes Antigen festgestellt werden. In der Peripherie dieser Nekrosen waren
vereinzelt positive Makrophagen nachweisbar.
Bei den Tieren Nr. 17 und 18 waren im proliferierten BALT fokal feingranuläre bis
fadenförmige Reaktionen festzustellen.
Bei drei von vier Tieren (Nr. 17, 18 und 19) konnte mehrfach eine lineare Anfärbung der
Basalmembranen von Bronchialepithel und seltener von Bronchialdrüsenepithel festgestellt
werden.
Abbildung 17: Darstellung variabler Oberflächenproteine als lineares Muster auf der
Alveolaroberfläche.
Tier Nr. 16, Lokalisation 6; Paraffinschnitt; mAk 4D7 (1:700), Originalvergrößerung 630fach,
Ölimmersion
3.2.3.2.3 Untersuchungen mit dem monoklonalen Antikörper 1A1
Bei Tier Nr. 16 waren vereinzelt lineare Auflagerungen auf dem Flimmersaum des
Bronchialepithels zu bemerken. Im Lumen mehrerer Bronchien und Bronchiolen der Tiere Nr.
16 und 19 war feingranuläres Antigen zwischen zahlreichen neutrophilen Granulozyten und
vereinzelt im Zytoplasma von Makrophagen festzustellen (Abb. 18). Bei Tier Nr. 19 fiel
zudem
in
einer
Reaktionsprodukt auf.
Lokalisation
subepithelial
extrazellulär
gelegenes
grobkörniges
Untersuchungsergebnisse
64
Im Bereich der Alveolarsepten lag teilweise besonders in Bereichen mit Infiltration von
neutrophilen Granulozyten feingranuläres Reaktionsprodukt extrazellulär, vereinzelt auch im
Zytoplasma von Makrophagen.
Bei den Tieren Nr. 17, 18 und 19 kam es in einzelnen Lokalisationen zu einer granulären
Reaktion im Bereich des BALT, die im Wesentlichen intra-, aber auch extrazellulär zu finden
war.
Die unter Versuch B beschriebene Reaktion am Bronchialepithel trat in diesem Versuch nur
bei den Tieren Nr. 16 und 19 auf (Abb. 18).
Abbildung 18: Intra- und extrazelluläres Antigen im Lumen eines Bronchus. Granuläre Reaktion im
Epithel dieses Bronchus.
Tier Nr. 16; Lokalisation 2; Paraffinschnitt; mAk 1A1; Originalvergrößerung 400fach
3.2.3.2.4 Untersuchungen mit dem monoklonalen Antikörper 1E5
Der Antikörper 1E5 zeigte am Paraffinmaterial in keiner der verwendeten Verdünnungsstufen
eine Reaktion.
3.2.3.2.5 Untersuchungen mit dem monoklonalen Antikörper 2A8
Der Antikörper 2A8 zeigte am Paraffinmaterial in keiner der verwendeten Verdünnungsstufen
eine Reaktion.
Untersuchungsergebnisse
65
3.2.3.3 Immunhistologische Befunde am Kryostatschnitt
3.2.3.3.1 Untersuchungen mit dem monoklonalen Antikörper 4D7
Bei den Tieren Nr. 16, 17 und 19 zeigte sich vermehrt Reaktionsprodukt in Bereichen mit
eitriger Bronchopneumonie, sowohl im Lumen kleinerer Luftwege, als auch in mit
neutrophilen Granulozyten angefüllten alveolären Bereichen. Das Reaktionsprodukt lag
überwiegend extrazellulär, konnte aber auch in einzelnen Makrophagen und neutrophilen
Granulozyten festgestellt werden.
Im proliferierten BALT des Tieres Nr. 17 zeigte sich eine intrazelluläre Reaktion.
Die unter Versuch B beschriebene grobgranuläre Reaktion basal am Epithel von Bronchien
und einzelnen Bronchialdrüsen war in Versuch C nur bei Tier Nr. 16 festzustellen. Zudem
konnten bei diesem Tier und bei Tier Nr. 19 vereinzelt positive Auflagerungen auf der
luminalen Seite dieses Epithels nachgewiesen werden.
Bei Tier Nr. 18 konnte keine positive Reaktion festgestellt werden.
3.2.3.3.2 Untersuchungen mit dem monoklonalen Antikörper 1A1
Bei Tier Nr. 19 färbten sich bei dieser Reaktion im Lumen eines Bronchus einzelne
neutrophile Granulozyten wie auch Makrophagen an. Des Weiteren war bei diesem Tier im
Lumen eines größeren Bronchiolus extrazellulär gelegenes sowie zellassoziiertes Antigen
nachweisbar. Zum Teil nur schwach pos itive lineare Auflagerungen auf dem Flimmersaum
fanden sich bei den Tieren Nr. 16 und 19.
Die häufigste Reaktion mit dem Antikörper 1A1 fand sich bei den Kryostatschnitten dieses
Versuches, die insgesamt deutlich geringer reagierten als im Versuch B, im Bereich der
Alveolarsepten und Alveolen, wo bei den Tieren Nr. 16, 17 und 18 einzelne positive
Makrophagen zu finden waren.
Im BALT einer Lokalisation des Tieres Nr. 16 war vereinzelt intrazelluläres Reaktionsprodukt
zu sehen, beim gleichen Tier färbte sich auch das Sekret im Lumen einzelner
Bronchialdrüsen stark an.
Nur bei einem Tier (Nr. 16) kam es bei dieser Reaktion zu einer zytoplasmatischen
Anfärbung von Epithelzellen, die ein feingranuläres Muster aufwies.
3.2.3.3.3 Untersuchungen mit dem monoklonalen Antikörper 1E5
Bei den Tieren Nr. 16, 17 und 19 fand sich häufig in den Lumina von Bronchien und
Bronchiolen
extrazellulär
liegendes,
seltener
intrazelluläres,
feingranuläres
Reaktionsprodukt, das zum Teil auf dem Flimmersaum des Epithels als feiner, oberflächlich
Untersuchungsergebnisse
66
gelegener Saum vorhanden war (Tiere Nr. 16 und 19). Bei Tier Nr. 17 konnten zudem selten
feine lineare Ablagerungen auf den Alveolarwänden dargestellt werden.
Im Bereich der Alveolarsepten lagen vereinzelt Makrophagen mit positivem Zytoplasma
verstreut. Bei den Tieren Nr. 17 und 19 war eine vermehrte extra- und intrazelluläre
Anfärbung in Bereichen mit eitriger Bronchopneumonie festzustellen.
Teilweise kam es zu einer schwachen diffusen Anfärbung von Epithelzellen.
Bei Tier Nr. 18 konnte keine positive Reaktion festgestellt werden.
3.2.3.3.4 Untersuchungen mit dem monoklonalen Antikörper I2
Auch bei dieser Reaktion konnte bei zwei Tieren (Nr. 16 und 19) extrazelluläres
feingranuläres Antigen im Lumen von Bronchien und Bronchiolen zwischen neutrophilen
Granulozyten dargestellt werden. Vereinzelt waren auch positive Makrophagen und
neutrophile Granulozyten zu sehen.
Bei den Tieren Nr. 16 und 17 waren in den Alveolarsepten und -lumina einzelne positive
Makrophagen zu beobachten.
Bei Tier Nr. 18 war keine Anfärbung festzustellen.
3.2.3.3.5 Untersuchungen mit dem monoklonalen Antikörper 2A8
Der
Antikörper
2A8
zeigte
am
Kryostatmaterial
in
keiner
der
verwendeten
Verdünnungsstufen eine Reaktion.
Tabelle 16: Zusammenfassung der Ergebnisse der immunhistologischen Untersuchungen des
Infektionsversuches C
Tier-
Tötung p.i. Makrophagen
Interalveolar-
Bronchial-
Oberfläche von Bronchien (Br)
Nr.
(Wochen)
septen
lumen
bzw. Alveolarepithel (Ae)
(Interalveolarsepten / Alveolen)
16
3
17
3
18
3
19
3
+mAbpool; 1A1;
4D7; 1E5; I2
+mAbpool; 1A1;
4D7; 1E5; I2
+mAbpool; 1A1;
1E5
+mAbpool; 1A1;
4D7; 1E5
4D7
+mAbpool; 1A1;
+ 1A1 (Br); 4D7 (Ae);
4D7; 1E5; I2
1E5 (Br)
+mAbpool (Br); 4D7 (Ae);
4D7
4D7; 1E5
4D7
-
+mAbpool (Br); 4D7 (Ae)
1A1;4D7; 1E5;
+mAbpool (Ae); 1A1 (Br);
I2
4D7 (Br/Ae); 1E5 (Br)
4D7
p.i. = post infectionem; mAbpool; 1A1;4D7; 1E5; I 2 = monoklonale Antikörper
1E5 (Ae)
Untersuchungsergebnisse
3.2.4 Histologische
67
und
immunhistologische
Befunde
an
Lungengewebsproben der Kontrolltiere
3.2.4.1 Histopathologische Befunde
Beim Kontrolltier Nr. 9 (Versuch A) waren keine histopathologischen Veränderungen und
kein BALT festzustellen.
Bei den Kontrolltieren Nr. 20 und 21 (Versuch C) war in fast allen Lokalisationen eine lobulär
begrenzte geringgradige, bei Tier Nr. 14 (Versuch B) bis mittelgradige, Infiltration der
Alveolarsepten mit Makrophagen, Lymphozyten und einzelnen neutrophilen Granulozyten
festzustellen. Zudem kam es vereinzelt zu Ansammlungen von neutrophilen und
eosinophilen Granulozyten im Lumen von Bronchien und Bronchiolen sowie zu einer intraund subepithelialen Infiltration mit eosinophilen und neutrophilen Granulozyten sowie
Lymphozyten und Plasmazellen.
In einer Lokalisation des Tieres Nr. 14 waren einzelne große, vakuolisierte Makrophagen
(Schaumzellen) im Lumen eines Bronchus zu sehen.
In sechs Lokalisationen dieser drei Tiere kam es zu einer deutlichen Proliferation des BALT,
in den anderen Bereichen war das BALT nur geringgradig oder gar nicht ausgebildet.
Das Kontrolltier Nr. 15 zeigte sowohl Anzeichen einer interstitiellen Pneumonie mit Infiltration
der alveolären Septen mit Makrophagen und Lymphozyten, als auch in mehreren
Lokalisationen eine mittel- bis hochgradige katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie. In einer
Lokalisation waren die interlobulären Septen stark verbreitert, in den Gefäßlumina lagen
Thromben aus fibrinreichem Material. Das BALT dieses Tieres war überwiegend stark
proliferiert.
Tabelle 17: Zusammenfassung der Ergebnisse der pathohistologischen Untersuchungen der
Kontrolltiere
Tier-
Tötung
Alveolarsepten eitr. BP
eitrige Bronchitis /
BALT-
Nekrosen obliterierende
Nr.
nach
infiltriert
Bronchiolitis
Proliferation
(Wochen)
(Makr./nGr/Lz)
Bronchiolitis
9
2
-
-
-
-
-
-
14
3
+
-
(+)
ggr(-mgr)
-
-
15
3
+
+
-
hgr
-
-
20
3
(+)
-
(+)
ggr(-mgr)
-
-
21
3
(+)
-
(+)
ggr(-mgr)
-
-
Makr. = Makrophagen; nGr = neutrophile Granulozyten; Lz = Lymphozyten; eitr. BP = eitrige Bronchopneumonie;
ggr = geringgradig; mgr = mittelgradig; hgr =hochgradig
Untersuchungsergebnisse
68
3.2.4.2 Immunhistologische Befunde am Paraffinschnitt
3.2.4.2.1 Untersuchungen mit dem monoklonalen Antikörper-Gemisch (mAb pool)
Bei allen Kontrolltieren fiel eine teilweise diffuse, teilweise grobgranuläre Reaktion am Epithel
von Bronchien und Bronchiolen sowie Bronchialdrüsen auf. In den Drüsen und im
Bronchiallumen gelegener Mukus färbte sich intensiv braun an. Auch glatte Muskulatur
reagierte mit diesem Antikörpergemisch stark.
Bei den Kontrolltieren des Versuches B wurden einzelne Makrophagen mit positivem
Reaktionsprodukt gesehen, auch die Schaumzellen des Tieres Nr. 14 reagierten positiv.
3.2.4.2.2 Untersuchungen mit dem monoklonalen Antikörper 4D7
Die Kontrolltiere Nr. 15, 20 und 21 zeigten in wenigen Lokalisationen eine lineare Anfärbung
im Bereich der Alveolarsepten, wie sie auch bei den infizierten Versuchstieren beschrieben
wurde. Die Intensität dieser Reaktion war außer in zwei Lokalisationen geringer als bei den
infizierten Versuchstieren. Sehr vereinzelt war auch eine feingranuläre Reaktion im BALT zu
beobachten (Tiere Nr. 15 und 20). Die zusätzlich untersuchten Kontrolltiere 22 und 23
zeigten keine Reaktion.
3.2.4.2.3 Untersuchungen mit dem monoklonalen Antikörper 1A1
Bei dem Kontrolltier Nr. 14 war eine diffuse Anfärbung der Epithelien von Bronchien und
Bronchiolen in allen Lokalisationen festzustellen, bei Tier Nr. 20 war nur in zwei
Lokalisationen eine granuläre bis grobgranuläre Reaktion an Bronchien und Bronchiolen zu
erkennen. Bei beiden Tieren war zudem teilweise eine lineare Reaktion auf dem
Flimmersaum des Epithels sichtbar. Bei Tier Nr. 14 fielen auch einzelne feine Auflagerungen
auf den Alveolarwänden auf.
3.2.4.2.4 Untersuchungen mit dem monoklonalen Antikörper 1E5
Der Antikörper 1E5 zeigte auch bei den Kontrolltieren in keiner der verwendeten
Verdünnungsstufen eine Reaktion.
3.2.4.3 Immunhistologische Befunde am Kryostatschnitt
3.2.4.3.1 Untersuchungen mit dem monoklonalen Antikörper 4D7
Bei den Kontrolltieren des Versuches B war häufig eine positive Reaktion basal am Epithel
festzustellen, wie sie bei der Auswertung der infizierten Versuchstiere beschrieben ist.
Untersuchungsergebnisse
69
3.2.4.3.2 Untersuchungen mit dem monoklonalen Antikörper 1A1
Die Kontrolltiere des Versuches C zeigten häufig eine diffuse Anfärbung des Epithels von
Bronchien und Bronchiolen, Tier Nr. 20 und Tier Nr. 14 (Versuch B) hatten zudem in einer
Lokalisation geringgradige Auflagerungen auf dem Flimmersaum des Epithels aufzuweisen.
Bei beiden Kontrolltieren des Versuches B konnte auch im BALT extrazelluläres granuläres
Reaktionsprodukt festgestellt werden. Bei Tier Nr. 15 war in zwei Lokalisationen
extrazelluläres Reaktionsprodukt in Nachbarschaft zu neutrophilen Granulozyten zu sehen.
3.2.4.3.3 Untersuchungen mit dem monoklonalen Antikörper 1E5
Bei den Kontrolltieren des Versuches B trat eine unterschiedlich starke unspezifische
Hintergrundfärbung auf. In einzelnen Lokalisationen war eine diffuse Anfärbung von
Epithelzellen von Bronchien, Bronchiolen und Bronchialdrüsen festzustellen.
3.2.4.3.4 Untersuchungen mit dem monoklonalen Antikörper I2
Bei der Auswertung der Kontrolltiere Nr. 14, 20 und 21 war in keiner Lokalisation
Reaktionsprodukt feststellbar.
Bei Tier Nr. 15 zeigte sich in einer Lokalisation extrazelluläres feingranuläres
Reaktionsprodukt im BALT. Zudem lag in zwei Lokalisationen extrazelluläres feingranuläres
Reaktionsprodukt zwischen neutrophilen Granulozyten vor.
Tabelle 18: Zusammenfassung der Ergebnisse der immunhistologischen Untersuchungen der
Kontrolltiere
Tier-
Tötung
Makrophagen
Interalveolar-
Bronchial-
Oberfläche von Bronchien
Nr.
nach
(Interalveolar-
septen
lumen
(Br) bzw. Alveolarepithel
(Wochen)
septen / Alveolen)
(Ae)
9
2
-
-
-
-
14
3
-
-
-
1A1 (Br)
15
3
-
-
-
(4D7 (Ae))
20
3
-
-
-
(4D7 (Ae)) 1A1 (Br/Ae)
21
3
-
-
-
(4D7 (Ae))
1A1;4D7 = monoklonale Antikörper
Untersuchungsergebnisse
70
3.2.4.4 Reaktionen an Mastzellen
Bei allen Tieren der Versuche A, B und C, Kontrolltiere eingeschlossen, die mit den primären
Antikörpern inkubiert wurden, kam es zu einer teilweise sehr intensiven, meist granulären
Anfärbung des Zytoplasmas von ovoiden bis runden oder fusiformen Zellen, die im
perivaskulären und interlobulären Bindegewebe und in den Alveolarsepten lagen. Aufgrund
ihres Färbeverhaltens mit Toluidinblau und ihrer Verteilung im Gewebe handelte es sich bei
diesen Zellen wahrscheinlich um Mastzellen.
3.2.5 Immunhistologische
Untersuchungen
zum
Vorkommen
von
Lymphozyten im Lungengewebe (Versuche A, B und C)
3.2.5.1 Vorkommen und Verteilung von T-Lymphozyten und deren Subpopulationen (CD3,
CD4 und CD8)
Die Auswertung der mit dem Pan-T-Lymphozytenmarker CD3 inkubierten Schnitte zeigte,
dass bei allen infizierten Tieren häufig eine peribronchiale und peribronchioläre Ansammlung
positiver Lymphozyten vorlag. Dabei lagen die T-Lymphozyten meistens disseminiert im
subepithelialen Gewebe, infiltrierten teilweise aber auch das Epithel der Bronchien und
Bronchiolen.
Im proliferierten BALT erstreckte sich die Verteilung der CD3-positiven Zellen in den meisten
Fällen über die gesamte Fläche, in einigen Fällen war aber auch eine Häufung der TLymphozyten am Rand, häufig zur epithelnahen Seite hin, festzustellen.
Viele CD3-positive Zellen ließen sich auch einzeln liegend in den Alveolarsepten beobachten
(Abb. 21 a). In der Mehrzahl der Lokalisationen mit lobulären Entzündungserscheinungen
war eine höhere Anzahl von T-Lymphozyten in stark alterierten Bereichen gegenüber wenig
veränderten Alveolarsepten festzustellen. Bei den Tieren Nr. 11, 13 und 16 lagen CD3positive Zellen in den Alveolen.
Häufig konnten Ansammlungen von T-Lymphozyten in größeren Gefäßen und Kapillaren
gesehen werden. Eine perivaskuläre Anhäufung fiel nur bei Tier Nr. 2 auf.
Um die bei den Tieren Nr. 3, 12 und 16 auftretenden Nekrosen konnte eine ringförmige
Anordnung disseminiert liegender CD3-positiver Zellen beobachtet werden, die sich im
Makrophagenwall beginnend bis in das anschließende Bindegewebe erstreckte (Abb. 22 b).
Auch zwischen Resten alveolärer Strukturen lagen positive Zellen.
Die Verteilung der CD3-positiven Zellen bei den Kontrolltieren wies keine Unterschiede zu
den Versuchstieren auf. Bei Tier 9 kam es allerdings nur selten zu peribronchiolären T-ZellInfiltraten.
Untersuchungsergebnisse
71
Da von den Tieren des Versuches A kein gefrorenes Lungengewebe zur Verfügung stand,
konnten die Untersuchungen zu Vorkommen und Verteilung CD4- und CD8-positiver
Lymphozyten nur bei den Versuchen B und C durchgeführt werden.
Die CD4-positiven Lymphozyten lagen bei den infizierten Tieren dieser Versuche
hauptsächlich in der Nähe von Bronchien und Bronchiolen im subepithelialen Gewebe sowie
vereinzelt intraepithelial. Im BALT waren die CD4-positiven Lymphozyten überwiegend
peripher angeordnet. In wenigen Lokalisationen aller Tiere waren die CD4-positiven Zellen
über das gesamte BALT verteilt.
Im Bereich der Alveolen und Alveolarsepten konnten nur wenige CD4-positive Lymphozyten
beobachtet werden. Weiterhin lagen CD4-positive Zellen vereinzelt im Lumen von
Bronchiolen sowie intra- und perivaskulär.
Diese Verteilung war auch bei den Kontrolltieren zu sehen, bei Tier 20 lagen jedoch deutlich
mehr CD4-positive Zellen im Alveolarbereich, bei Tier 21 hingegen konnten kaum positive
Zellen festgestellt werden.
Die CD8-positiven Lymphozyten lagen überwiegend in den Alveolarwänden verteilt. Im BALT
gab es nur wenige, überwiegend in der Peripherie gelegene CD8-positive Lymphozyten.
Die Verteilung der CD8-positiven Lymphozyten bei den Kontrolltieren wies keinen
Unterschied zu der bei den infizierten Tiere auf.
Unterschiede in der Verteilung der Lymphozyten in Lymphfollikeln mit Keimzentrum oder
Lymphaggregaten konnten mit keinem der drei Antikörper festgestellt werden.
Die computergestützte Auszählung der CD4- und CD8-positiven Lymphozyten im BALT der
Tiere der Versuche B und C ergab eine signifikant erhöhte (Versuch B: p = 0,0003; Versuch
C: p = 0,0002) Anzahl an CD4-positiven Zellen (s. Abb. 20 und 21).
Tabelle 19: Zusammenfassung der Lymphozytenverteilung im Lungengewebe der Infektionsversuche
A, B und C
peribronchial / BALT
Alveolarsepten Alveolarlumina Bronchial- Peripherie von
peribronchiolär
epithel
Nekrosen
CD3
++
++
++
++
+
+
CD4
++
++
+
+
-
n.d.
CD8
++
+
++
-
-
n.d.
CD79a
++
++
+
+
++
++
+ = vereinzelt; ++ = häufig;- = nicht nachweisbar; n.d. =nicht darstellbar, da keine Nekroseareale im
Kryostatschnitt
Untersuchungsergebnisse
72
Abbildung 20: Prozentuale Verteilung der CD4- und CD8-positiven Lymphozytenpopulationen im
BALT der Tiere des Versuches B
45
40,86
38,83
40
34,21
32,42
35
30
%
24,27
25
CD4
CD8
(arithmetisches
Mittel)
20
15
8,07
6,3
10
6,77
9,74
2,11
5
7,39
0,96
*Kontrolltiere
0
10
11
12
13
14*
15*
Tier-Nr.
Abbildung 21: Prozentuale Verteilung der CD4- und CD8-positiven Lymphozytenpopulationen im
BALT der Tiere des Versuches C
35
33,42
32,77
28,14
30
27,09
25
%
20
(arithmetisches
Mittel)
15
21,29
7,79
10
CD4
CD8
6,12
5
1,35
0,98
0
16
17
18
19
20*
Tier-Nr.
* Kontrolltier
(Kontrolltier Nr. 21 wies in den Kryostatschnitten zu wenig BALT für eine repräsentative Auszählung auf und
wurde daher nicht berücksichtigt.)
3.2.5.2 Verteilung von B-Lymphozyten und Plasmazellen (CD79a)
Auch bei den CD79a-positiven Lymphozyten und Plasmazellen fiel eine peribronchiale und
peribronchioläre Verteilung auf. Die CD79a-positiven Zellen lagen einzeln, teilweise auch
aneinandergereiht im subepithelialen Gewebe, einzelne CD79a-positive Lymphozyten
infiltrierten das Epithel der Bronchien und Bronchiolen.
Untersuchungsergebnisse
73
Im BALT kam es teilweise zu einer Verteilung der CD79a-positiven Zellen gleichmäßig über
den gesamten Anschnitt, teilweise konnte aber auch eine Häufung von CD79a-positiven
Lymphozyten und Plasmazellen am epithelnahen Rand gesehen werden. Seltener kam es
zu einer zentralen Häufung der positiven Zellen.
Die Lymphozyten, die bei den meisten Tieren stellenweise das über dem BALT liegende
Bronchialepithel infiltrierten, reagierten überwiegend CD79a positiv. Auch in den weniger
häufigen Lokalisationen mit abgeflachten Epithel waren die infiltrierenden Lymphozyten
überwiegend CD79a positiv (Tiere Nr. 11, 13, 17 und 18).
Im Bronchiallumen lagen zwischen neutrophilen Granulozyten auch einzelne CD79a-positive
Lymphozyten. Die semiquantitative Auswertung ergab, dass bei allen untersuchten Tieren in
den Alveolarsepten und den Alveolen deutlich weniger CD79a- als CD3-positive
Lymphozyten vorhanden waren (Abb. 21 a und b). Auch die CD79a-positiven Zellen lagen
vermehrt in entzündlich infiltrierten Lungenbereichen. Eine perivaskuläre Anhäufung konnte
nur bei Tier 3 festgestellt werden.
Abbildung 21 a: Repräsentative Darstellung von T-Lymphozyten im Lungenparenchym eines
experimentell mit Mycoplasma bovis infizierten Rindes.
Tier Nr. 18; Lokalisation 5; Paraffinschnitt; T-Lymphozytenmarker CD3; Originalvergrößerung 400fach
Untersuchungsergebnisse
74
Abbildung 21 b: Repräsentative Darstellung CD79a-positiver Zellen im Lungenparenchym des
experimentell mit Mycoplasma bovis infizierten Rindes aus Abb. 21 a.
Tier Nr. 18; Lokalisation 5; Paraffinschnitt; B-Lymphozyten- und Plasmazellmarker CD79a;
Originalvergrößerung 400fach
In der Peripherie nekrotischer Bereiche (Tiere Nr. 3, 12 und 16) waren mehr CD79a-positive
Lymphozyten und Plasmazellen als CD3-positive Lymphozyten festzustellen (Abb. 22 a und
b).
Die Tiere des Versuches A wiesen insgesamt weniger CD79a-positive Zellen, insbesondere
im Bereich der Alveolarsepten, auf, als die Tiere der anderen beiden Versuche.
Die Kontrolltiere zeigten in der Verteilung der CD79a-positiven Lymphozyten keine
Unterschiede zu den infizierten Tieren. Bei Tier Nr. 15 fiel in einem mit Lymphozyten
infiltrierten Bereich des Epithels auf, dass nur wenige dieser Lymphozyten CD79a-positiv
waren. Das Kontrolltier Nr. 9 zeigte nur sehr wenige CD79a-positive Lymphozyten.
Untersuchungsergebnisse
75
Abbildung 22 a: Darstellung von B-Lymphozyten und Plasmazellen in der Peripherie eines
nekrotischen Areals (N) im Lungenparenchym eines mit Mycoplasma bovis infizierten Rindes.
Tier Nr. 16; Lokalisation 1; Paraffinschnitt; B-Lymphozyten- und Plasmazellmarker CD79a;
Originalvergrößerung 400fach
Abbildung 22 b: Darstellung von T-Lymphozyten in der Peripherie der Nekrose (N) aus Abbildung
22 a.
Tier Nr. 16; Lokalisation 1; Paraffinschnitt; T-Lymphozytenmarker CD3; Originalvergrößerung 400fach
Diskussion
76
4 Diskussion
Ziel dieser Arbeit war es unter Verwendung verschiedener monoklonaler Antikörper die
Expression und Verteilung variabler Oberflächenproteinantigene von Mycoplasma bovis
(Vsps) im Lungengewebe von experimentell mit Mycoplasma bovis infizierten Kälbern
immunhistologisch zu untersuchen sowie mit Hilfe spezifischer Antikörper gegen T- und BLymphozyten eine immunhistologische Phänotypisierung der im Lungengewebe dieser Tiere
auftretenden lymphozytären Zellen vorzunehmen.
4.1.1 Histopathologische Befunde
In der vorliegenden Arbeit wurden Lungenproben von mit einer klonalen Variante des
Mycoplasma bovis Typ-Stammes PG 45 infizierten Kälbern (Versuch A) in den frühen
postinfektionären Stadien (zwei bis zehn Tage p.i.) untersucht. Die Ergebnisse wurden Daten
gegenübergestellt, die an Kälbern gewonnen wurden, die 21 Tage nach Infektion mit dem
Mycoplasma bovis -Stamm 1067 getötet worden waren (Versuche B und C). Bei der
pathologisch-histologischen Untersuchung der Lungen zeigten die infizierten Tiere des
Versuches A im Wesentlichen Veränderungen, wie sie auch von anderen Autoren (MARTIN
et al. 1983; RODRÍGUEZ et al. 1996 a, STIPKOVITS et al. 2000 a) für experimentell mit
Mycoplasma bovis infizierte Tiere beschrieben wurden, nämlich graduell unterschiedliche
Infiltration
der
Alveolarsepten
mit
Entzündungszellen,
katarrhalisch-eitrige
Entzündungsprozesse in Bronchien, Bronchiolen und Alveolen und eine Hyperplasie des
peribronchiolären lymphatischen Gewebes. Die Befunde an den Lungen der Kälber aus
Versuch A zeigen, dass es bereits wenige Tage nach der Infektion zu einer Infiltration der
Alveolarsepten mit neutrophilen Granulozyten und Makrophagen kommt. Es sind mehrere
Faktoren bekannt, die eine chemotaktische Wirkug auf bovine neutrophile Granulozyten
haben (PERSSON et al. 1993). Zu diesen Faktoren gehört unter anderem Interleukin-8 (IL8). Untersuchungen an Rindern mit experimentell induzierter Pneumonie durch Pasteurella
(Mannheimia) haemolytica haben gezeigt, dass es bereits zwei bis vier Tage post
infectionem zu einem starken Anstieg von IL-8 in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit
kommt und dass IL-8 mRNS von verschiedenen Zelltypen in den pneumonischen Lungen
exprimiert wird (CASSWELL et al. 1998). Über das Auftreten von IL-8 oder anderer
Mediatoren, die an der in der vorliegenden Untersuchung beobachteten Rekrutierung von
neutrophilen Granulozyten im frühen postinfektiösen Stadium beteiligt sein könnten, ist
bislang nichts bekannt.
Diskussion
77
Die Veränderungen der Tiere der Versuche B und C waren gleich geartet, aber graduell
stärker ausgeprägt. Insbesondere das peribronchioläre lymphatische Gewebe war drei
Wochen nach der Infektion hochgradig hyperplastisch. Bei den Tieren des Versuches A war
hingegen nur eine gering- bis mittelgradige Hyperplasie des BALT festzustellen.
Bei einem Tier aus Versuch A (Tier Nr. 3) traten vier Tage post infectionem Nekrosen im
Lungenparenchym auf, wobei eine Sekundärinfektion mit Mannheimia haemolytica bei
diesem Kalb nachgewiesen wurde. Auch bei je einem Tier der Versuche B (Tier Nr. 12) und
C (Tier Nr. 16) fielen Nekrosen im Lungenparenchym auf. Von diesen beiden Tieren konnte
nur bei Tier Nr. 16 eine Sekundärinfektion (Arcanobacterium pyogenes) festgestellt werden.
Da sowohl bei dem betroffenen Tier aus Versuch A als auch bei Tier Nr. 16 zu
Versuchsbeginn keine Krankheitserreger aus der Lunge isoliert werden konnten, bestätigen
diese Befunde die Ansicht anderer Untersucher (HOUGHTON u. GOURLAY 1983; MARTIN
et al. 1983; GOURLAY et al. 1989; BINDER et al. 1990; RODRÍGUEZ et al. 1996 a; BYRNE
et al. 2001), dass mit Mycoplasma bovis infizierte Kälber eine erhöhte Anfälligkeit für
Sekundärinfektionen der Lunge mit bakteriellen Infektionserregern zeigen. Bei beiden Tieren
konnten im Gegensatz zu Tier Nr. 12 auch sog. „ghost lung structures“ in größeren
nekrotischen Arealen bemerkt werden, wie sie auch von THOMAS et al. (1986 b) bei
Infektion mit Mycoplasma bovis beschrieben wurden.
In einem Teil der Nekroseherde der Tiere 3 und 16 konnte immunhistologisch Mycoplasma
bovis-Antigen nachgewiesen werden. Dies lässt vermuten, dass synergistische Effekte von
Mycoplasma bovis und Mannheimia haemolytica bzw. Arcanobacterium pyogenes zu
stärkeren Entzündungsprozessen in der Lunge führen. Insbesondere bei Tier Nr. 16 ist der
nicht gelungene Nachweis von Mycoplasma bovis-Antigen in anderen Nekroseherden
möglicherweise darauf zurückzuführen, dass das Antigen zum Zeitpunkt der Untersuchung
(drei Wochen p.i.) bereits teilweise eliminiert war. Den Synergismus zwischen Mycoplasma
bovis und Mannheimia haemolytica beschreiben HOUGHTON und GOURLAY (1983), die
bei mit beiden Erregern zugleich experimentell infizierten Tieren einen Schweregrad der
Erkrankung feststellten, der über den additiven Effekt der durch den einzelnen Erreger
hervorgerufenen Erkrankung hinausgeht. Auch RODRÍGUEZ et al. (1996 a) vermuten als
Ursache für die gegenüber experimentellen Infektionen schwerwiegender verlaufenden
natürlichen Infektionen ein Zusammenwirken von Mycoplasma bovis mit anderen Erregern
wie Mannheimia haemolytica, Pasteurella multocida, Arcanobacterium pyogenes oder
verschiedenen Viren (BRSV, BVDV). Unklar bleibt, warum es in den vorliegenden Versuchen
nur bei einzelnen Tieren zu einer Infektion mit sekundären Erregern gekommen ist.
Diskussion
78
Möglicherweise spielt eine individuelle Disposition des Tieres ebenfalls eine Rolle im
Rahmen respiratorischer Infektionen mit Mycoplasma bovis.
Die Isolierung nicht lungenpathogener Keime aus der Lunge von Tier 12 im Zusammenhang
mit dem immunhistologischen Nachweis von Antigen in der Peripherie der Nekrosen deutet
auf ursächlich durch Mycoplasma bovis hervorgerufene nekrotische Einschmelzungen des
Lungenparenchyms hin. Diese Beobachtung machten auch HOWARD et al. (1987 a) und
THOMAS et al. (1986 b), die gnotobiotische Kälber experimentell mit Mycoplasma bovis
infizierten und dadurch unterschiedlich große Koagulationsnekrosen im Lungengewebe
hervorrufen konnten. Auch diese Autoren fanden immunhistologisch Antigen in der
Peripherie der Nekrosen. ADEGBOYE et al. (1995 a und 1996) vermuten, dass unter den
verschiedenen
Mycoplasma
bovis
Stämmen
nur
einige
in
der
Lage
sind,
Lungengewebsnekrosen mit Abszedierung hervorzurufen. Die vorliegenden Ergebnisse
deuten darauf hin, dass zumindest der Stamm 1067, mit dem die Tiere der Versuche B und
C infiziert wurden, solch ein Stamm sein könnte.
Bislang ist der genaue Pathomechanismus, der bei mit Mycoplasma bovis infizierten Rindern
in der Lunge und nach hämatogener Ausbreitung im Kapselgewebe von Gelenken zur
Entstehung von Nekrosen führt, nicht bekannt. Die Wirkung eines von Mycoplasma bovis
produzierten Toxins kann ausgeschlossen werden, da keine der bislang diesbezüglich
untersuchten Mykoplasmenspezies zur Toxinbildung befähigt ist (ROSENGARTEN,
persönliche Mitteilung).
Eine bisher im Schrifttum nicht beschriebene pathohistologische Veränderung der Lunge fiel
bei der mikroskopischen Auswertung von drei aus den Versuchen B und C stammenden
Tieren (Nr. 12, 16 und 19) in Form von obliterierenden Bronchiolitiden auf. In die gleiche
Richtung weisende Veränderungen der Luftwege finden STIPKOVITS et al. (2000 b) bei
Kälbern aus einer endemisch mit Mycoplasma bovis infizierten Milchviehherde, bei denen die
Autoren eine nicht näher beschriebene Zerstörung des Bronchialepithels erwähnen. Eine
hydropische Degeneration des Bronchialepithels mit Zilienverlust sehen STIPKOVITS et al.
(2000 a) bei Kälbern, die experimentell durch ein vor die Nasenlöcher appliziertes
Mycoplasma bovis -haltiges Spray infiziert wurden. Sowohl RODRÍGUEZ et al. (1996 a) als
auch STIPKOVITS et al. (2000 a) finden bei natürlich bzw. experimentell infizierten zwei bis
zwölf Wochen alten Kälbern nekrotisierende Bronchiolitiden. Möglicherweise stellen diese
Veränderungen eine Vorstufe zur obliterierenden Bronchiolitis dar.
Diskussion
79
Über das Vorkommen von obliterierender Bronchiolitis beim Rind wird im Schrifttum
insbesondere im Zusammenhang mit natürlichen bzw. experimentellen Infektionen mit dem
Bovinen Respiratorischen Synzytialvirus (BRSV) (PIRIE et al. 1981; PHILIPPOU et al. 1996,
2000) und Pasteurella haemolytica (FRIEND et al. 1977; HAZIROGLU et al. 1997) berichtet.
Über die Isolierung von Mykoplasmen aus Lungen von Kälbern mit obliterierender
Bronchiolitis berichten PIRIE et al. (1981) und BRYSON et al. (1978). PIRIE et al. (1981)
isolierten bei zwei Kälbern mit obliterierender Bronchiolitis, die sechs Wochen nach dem
Ausbruch einer Infektion mit BRSV in einem Bestand euthanasiert und seziert wurden,
Mycoplasma dispar aus dem Lungengewebe. Auch BRYSON et al. (1978) fanden bei der
mikrobiologischen Untersuchung der Lungen von mehreren Kälbern mit obliterierender
Bronchiolitis Mycoplasma dispar.
Dass eine obliterierende Bronchiolitis nur bei Kälbern der Versuche B und C, aber nicht bei
den Tieren des Versuches A auftrat, könnte möglicherweise auf die wesentlich kürzere
Zeitspanne zwischen Infektion und Tötung der Tiere (zwei bis maximal zehn Tage) in
Versuch A zurückzuführen sein. Denkbar wäre auch, dass andere Faktoren wie
Erregerstamm oder individuelle Empfänglichkeit bzw. Reaktionsweise der Kälber eine Rolle
bei der Entwicklung schwerwiegender, mit obliterierender Bronchiolitis einhergehender
Lungenveränderungen spielen.
Auch bei anderen Spezies wurden obliterierende Bronchiolitiden im Zusammenhang mit
Mykoplasmeninfektionen beobachtet. KIRCHNER et al. (1990) beschreiben die Isolierung
von drei untypisierbaren Mykoplasmenarten von fünf Hunden, die aufgrund einer
respiratorischen Erkrankung getötet wurden und in deren Lungen vereinzelt obliterierende
Bronchiolitiden auftraten. Beim Menschen treten obliterierende Bronchiolitiden, die mit einer
intraluminalen Proliferation von Fibroblasten einhergehen, unter anderem nach Infektionen
mit verschiedenen Mikroorganismen auf, zu denen auch Mycoplasma pneumoniae gehört
(YOSHINOUCHI et al. 2002; EBNÖTHER et al. 2001; COLBY 1998, LLIBRE et al. 1997).
Das Auftreten von obliterierender Bronchiolitis stellt eine Hauptursache für oft tödlich
verlaufende postoperative Komplikationen nach Lungentransplantationen beim Menschen
dar
(MASON
et
al.
1998).
Immunhistochemische
Untersuchungsergebnisse
am
Lungengewebe von Patienten, die wegen einer derartigen Komplikation retransplantiert
wurden, sprechen für eine Beteiligung induzierbarer Stickstoffmonoxid Synthase (iNOS)
sowie von Peroxynitrit an der Pathogenese obliterierender Bronchiolitiden (Mc DERMOTT et
al. 1997; MASON et al. 1998). Ob iNOS oder Peroxynitrit in Lungen von mit Mycoplasma
bovis infizierten Kälbern exprimiert wird bzw. ob diesen Faktoren möglicherweise eine
Diskussion
80
pathognetische Bedeutung zukommt, müsste in zukünftigen Untersuchungen abgeklärt
werden. In der vorliegenden Arbeit wurde in den obliterierten Bronchiolen der Kälber aus den
Versuchen B und C das Vorhandensein von neutrophilen Granulozyten festgestellt. Daher
wäre es denkbar, dass es einen Zusammenhang zwischen von diesen Zellen gebildeten
Sauerstoffradikalen und einer Epithelschädigung mit einer sich daraufhin entwickelnden
obliterierenden Läsion in den Bronchiolen geben könnte, ähnlich wie dies für die beim
Menschen nach Lungentransplantation auftretende obliterierende Bronchiolitis vermutet wird
(ELSSNER u. VOGELMEIER 2001).
Die Kontrolltiere der Versuche B und C, die während der Versuche von den infizierten Tieren
getrennt gehalten worden sind, hatten keine Krankheitsanzeichen gezeigt. Makroskopisch
wiesen die Lungen dieser Kontrolltiere, abgesehen von Tier Nr. 15, bei der Sektion keine
Veränderungen auf. Die bei der histopathologischen Untersuchung dieser Lungen
festgestellte Infiltration der Alveolarsepten mit Entzündungszellen ist möglicherweise auf die
intrabronchiale Applikation von Mykoplasmenmedium bzw. auf die wiederholt durchgeführte
Bronchoalveoläre Lavage zurückzuführen.
4.1.2 Variable Oberflächenproteine
Obwohl BEHRENS et al. bereits 1994 in vitro variable Oberflächenproteine von Mycoplasma
bovis nachweisen konnten, sind bislang in vivo nur die Untersuchungen von LINKNER
(1998) und POUMARAT et al. (1998) zur Darstellung variabler Oberflächenantigene im
Lungengewebe sowie serologische Untersuchungen von BRANK et al. (1999) bei mit
Mycoplasma bovis infizierten Rindern bekannt, die ausschließlich an den Tieren des in der
vorliegenden Arbeit als Versuch A bezeichneten Infektionsversuches durchgeführt wurden.
POUMARAT et al. (1998) untersuchten dabei in der frühen Infektionsphase (bis zehn Tage
nach Infektion) mittels Westernblot-Analyse die Variabilität des von der klonalen Variante des
Typ-Stammes PG45 exprimierten VspA (64 kDa) in Lungenproben und tracheobronchialer
Lavageflüssigkeit. Die Autoren stellten bei zwei Tieren (Tiere Nr. 5 und 6 der vorliegenden
Untersuchungen) fest, dass am zweiten und fünften Tag post infectionem ein VspA mit
einem kleineren Molekulargewicht im Wirt exprimiert wurde. BRANK et al. (1999) konnten
serologisch bei diesen Tieren neben der Bildung von Antikörpern gegen Vsp A auch
Antikörper gegen die Vsps B und C nachweisen, was auf eine Variation der klonalen
Variante in vivo hindeutet. Die von LINKNER (1998) durchgeführten Untersuchungen am
Paraffinmaterial der mit einer klonalen Variante des Typ-Stammes PG45 infizierten Tiere des
Versuches A wurden in der vorliegenden Arbeit ergänzt und durch zwei weitere
Diskussion
81
Versuchsgruppen, die mit einem anderen Mycoplasma bovis Stamm (Stamm 1067) infiziert
worden waren, erweitert.
In allen drei Versuchen lässt sich mit den in dieser Arbeit eingesetzten monoklonalen
Antikörpern gegen variable Oberflächenproteine (4D7, 1A1 u. 1E5) eine positive Reaktion im
Lungengewebe infizierter Kälber darstellen. Diese Ergebnisse sprechen für die Expression
variabler Oberflächenproteine in vivo und stehen damit im Einklang mit den von POUMARAT
et al. (1998) gemachten Beobachtungen der in vivo Variabilität von Mycoplasma bovis. In der
vorliegenden
Untersuchung
konnte
darüber
hinaus
festgestellt
werden,
dass
im
Lungengewebe der Tiere des Versuches A bereits zwei Tage nach der Infektion variable
Oberflächenproteine nachweisbar sind. Der immunhistologische Nachweis von Vsps bei den
am 21. Tag post infectionem getöteten Tieren der Versuche B und C lässt darauf schließen,
dass variable Oberflächenantigene über mehrere Wochen nach der Infektion im
Respirationstrakt auftreten.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass zudem das Oberflächenprotein pMB67
in der Lunge experimentell mit Mycoplasma bovis infizierter Kälber exprimiert wird.
Die Lokalisation des Erregerantigens in den vorliegenden Untersuchungen entspricht im
Wesentlichen der schon von anderen Autoren (THOMAS et al. 1986 b; HOWARD et al. 1987
a; GOURLAY et al. 1989; ADEGBOYE 1995 b; RODRÍGUEZ et al. 1996 a) beschriebenen:
im Randbereich der Nekrosen, im Bronchialexsudat, teilweise auch in darin liegenden
Makrophagen und neutrophilen Granulozyten, als feiner Saum auf dem Flimmerepithel, aber
auch in interstitiellen Makrophagen sowie als lineare Auflagerung auf Alveolarwänden. Diese
letztgenannte Reaktion tritt besonders deutlich mit dem gegen die Vsps A, B und C
gerichteten monoklonalen Antikörper 4D7 auf, mit dem zum Teil große Bereiche der
untersuchten
Lungengewebeschnitte
ein
auffallendes
lineares
Muster
auf
den
Alveolarwänden aufweisen. Besonders ausgeprägt tritt dieses lineare Muster bei den Tieren
des Versuches A auf, ist aber auch bei den Tieren der Versuche B und C deutlich zu sehen.
Die Unterschiede zwischen Versuch A und den Versuchen B und C hinsichtlich Quantität
und Intensität des mit dem Antikörper 4D7 dargestellten Reaktionsproduktes haben
möglicherweise ihre Ursache in den zur Infektion verwendeten unterschiedlichen
Erregerstämmen. Eine weitere mögliche Ursache für die quantitativen Unterschiede
hinsichtlich des mit diesem Antikörper nachweisbaren Reaktionsproduktes zwischen Versuch
A und den Versuchen B und C könnte die längere Zeitspanne zwischen Infektion und
Probenentnahme sein. Es wäre denkbar, dass es durch Phagozytose von Antigen durch
Diskussion
82
Alveolarmakrophagen zu einer sukzessiven Abnahme des mit dem Antikörper 4D7
nachweisbaren variablen Antigens gekommen ist.
Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass es sich bei der an der Oberfläche der
Alveolarwände
mit
dem
monoklonalen
Antikörper
4D7
festgestellten
linearen
Immunreaktivität um eine Reaktion mit variablen Antigenen von Mycoplasma bovis handelt,
die mit dem in dieser Lokalisation zu erwartenden Surfactant assoziiert sind. Da KNOWN
und CHAE (1999) bei mit Mycoplasma hyopneumoniae infizierten Schweinen mittels in situ
Hybridisierung die erregerspezifische DNS innerhalb von Typ I-Pneumozyten nachweisen
konnten, wäre es denkbar, dass Mycoplasma bovis ebenfalls eine Affinität zu diesem Zelltyp
besitzt und dass es sich bei der mit dem monoklonalen Antikörper 4D7, aber auch mit den
übrigen Antikörpern an der Alveolaroberfläche beobachteten Immunreaktivität um im
Zytoplasma dieses Zelltyps befindliches variables Antigen handelt.
Andererseits kann nicht ausgeschlossen werden, dass der monoklonale Antikörper 4D7 eine
Kreuzreaktivität mit Bestandteilen des bovinen Surfactants aufweist. Das fehlende lineare
Reaktionsmuster an der Alveolaroberfläche der mit diesem Antikörper inkubierten
Kryostatschnitte könnte ein Hinweis darauf sein, dass in den Paraffinschnitten Bestandteile
des Surfactant fixiert wurden und dass antigene Epitope desselben in den Gefrierschnitten
nicht konserviert wurden. Auch die bei einzelnen Kontrolltieren beobachtete ähnliche, wenn
auch schwächere lineare Reaktion mit dem Antikörper 4D7 deutet auf eine Beteiligung einer
unspezifischen bzw. kreuzreagierenden immunhistologischen Reaktion hin. Andererseits
zeigten weder die Schnitte des pathologisch-histologisch unveränderten Kontrolltieres aus
Versuch A, noch die zusätzlich in die Untersuchungen aufgenommenen beiden Kontrolltiere
(Nr. 22 und 23) ein derartiges lineares Reaktionsmuster. Um abzuklären, ob Mycoplasma
bovis-Antigen mit Surfactant assoziiert ist oder ob es sich um eine Kreuzreaktion des
Antikörpers
4D7
mit
bovinem
Surfactant
handelt,
sollten
immunhistologische
Doppelfärbungen unter Verwendung Surfactant-spezifischer Antikörper durchgeführt werden.
Inwieweit es sich bei dem mit dem monoklonalen Antikörper 4D7 erzielten Immunreaktionen
tatsächlich um in den betreffenden Lokalisationen befindliches erregerspezifisches Antigen
handelt, müsste durch die Untersuchung von Lungengewebsschnitten infizierter Kälber
mittels in situ Hybridisierung unter Verwendung entsprechender Gensonden abgeklärt
werden.
HOWARD et al. (1976 b) und THOMAS et al. (1991) beschreiben, dass es in vitro zur
Adhärenz von Mycoplasma bovis an die Oberfläche boviner neutrophiler Granulozyten
Diskussion
83
kommt. Die in den vorliegenden Untersuchungen gemachte Beobachtung, dass
insbesondere mit dem monoklonalen Antikörper 4D7 sowohl im Paraffin-, als auch im
Kryostatmaterial vermehrt Antigen in Bereichen mit Ansammlungen von neutrophilen
Granulozyten zu finden war, könnte als Hinweis auf eine möglicherweise auch in vivo
auftretende Adhärenz von Mycoplasma bovis an diesen Zelltyp sein.
THOMAS et al. (1987) finden bei ihren Untersuchungen an mit Mycoplasma bovis infizierten
bovinen fetalen Trachealorgankulturen eine Akkumulation von Erregerantigen in der Lamina
propria des Luftwegepithels, und zwar besonders in der Region der Basalmembran. Ob es
sich bei der in der vorliegenden Untersuchung mit dem Antikörper 4D7 festgestellten
Immunreaktion an der Basalmembran von Bronchien und Bronchiolen tatsächlich um
erregerspezifisches Antigen handelt, oder ob eine Kreuzreaktion mit körpereigenen
Wirtsantigenen vorliegt, müsste in zukünftigen Untersuchungen mit Hilfe der Methode der in
situ Hybridisierung ermittelt werden.
Mit allen gegen die Vsps gerichteten monoklonalen Antikörpern trat bei den meisten Tieren
in mehreren Lokalisationen eine diffuse oder granuläre Reaktion im Bereich des Bronchialund Bronchiolarepithels auf. Teilweise waren selektiv Becherzellen angefärbt und auch eine
positive Reaktion zwischen den Epithelzellen konnte beobachtet werden. Auch andere
Autoren berichten über derartige positive Immunreaktivitäten (GOURLAY et al. 1989;
ADEGBOYE et al. 1995 a und b; RODRÍGUEZ et al. 1996 a; LINKNER 1998). In einer
Studie an bovinen fetalen Trachealorgankulturen konnten THOMAS et al. (1987)
elektronenmikroskopisch nachweisen, dass Mycoplasma bovis zwischen den Epithelzellen
lag und von dort aus die Lamina propria infiltrierte. Eine intrazelluläre Lage des Erregers
konnten die Autoren jedoch nicht feststellen. Da in den vorliegenden Untersuchungen auch
bei den Kontrolltieren eine gleichartige immunologische Reaktion der Epithelzellen zu
beobachten war, könnte es sich um eine unspezifische Kreuzreaktion mit intrazellulären
Strukturen der Epithelzellen handeln. Ob die beobachtete immunhistologische Reaktion am
Bronchialepithel spezifischer Natur ist, kann anhand der vorliegenden Ergebnisse nicht
entschieden
werden.
Eine
in
situ
Hybridisierung
oder
zukünftige
immunelektronenmikroskopische Untersuchungen könnten darüber möglicherweise nähere
Aufschlüsse geben.
Diskussion
84
Der monoklonale Antikörper 2A8, mit dem in den vorliegenden Untersuchungen keine
Reaktion erzielt werden konnte, zeigte BEIER et al. (1998) zufolge im Immunoblotting eine
spezifische Reaktion mit klonalen Varianten des Mycoplasma bovis Stammes PG 45. Eine
Erklärung, weshalb der Antikörper 2A8 in den Paraffinschnitten von Tieren des Versuches A
keinerlei Immunreaktivität zeigte, könnte sein, dass die betreffenden Antigenepitope durch
die Formalinfixation zerstört wurden bzw. dass die eingesetzten Methoden zur
Antigendemaskierung erfolglos waren.
Gefrorene Gewebeproben, an denen eine immunhistochemische Reaktion zu erwarten
gewesen wäre, standen von den mit einer klonalen Variante des Stammes PG 45 infizierten
Tieren des Versuches A nicht zur Verfügung. Mit dem Mykoplasmenstamm 1067, mit dem
die Tiere der anderen beiden Versuche inokuliert worden waren, zeigte dieser Antikörper
auch an den Kryostatschnitten keinerlei Reaktivität. Demnach könnte der Mycoplasma bovisStamm 1067 zu denjenigen Stämmen gehören, die vom Antikörper 2A8 nicht erkannt
werden, zumal BEIER et al. (1988) dieses auch für weitere Mycoplasma bovis-Stämme
zeigen konnten.
Die mit allen eingesetzten monoklonalen Antikörpern aufgetretene Färbung von Mastzellen
ist vermutlich auf eine selektive Bindung des Avidins des für die immunhistochemischen
Reaktionen eingesetzten Avidin-Biotin-Komplex an Mastzellen zurückzuführen. Dass es bei
immunhistologischen Reaktionen, bei denen Avidin-Peroxidase eingesetzt wird, zu einer
spezifischen Färbung von Mastzellen kommt, stellten FRITZ et al. (1984) bei einer
Untersuchung an Gewebeproben von Patienten mit rheumatoiden Arthritis und Osteoarthritis
fest.
4.1.3 BALT und Lymphozyten des Lungengewebes
In den vorliegenden Untersuchungen wurden bei den experimentell mit Mycoplasma bovis
infizierten
Kälbern
hyperplastische
Veränderungen
des
peribronchialen
und
peribronchiolären lymphatischen Gewebes festgestellt, wie sie bereits von anderen Autoren
(MARTIN et al. 1983; HOWARD et al. 1987 a; RODRÍGUEZ et al. 1996 a) bei natürlich und
experimentell mit dieser Mykoplasmenspezies infizierten Rindern beschrieben wurden. Die
vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass es bei der Mehrzahl der Tiere des Versuches A, die
zwei bis zehn Tagen post infectionem untersucht wurden zu einer gering- bis mittelgradigen
Proliferation des BALT gekommen ist. Im Gegensatz dazu war bei allen Tieren der Versuche
Diskussion
85
B und C, die drei Wochen post infectionem getötet worden waren, eine mehrheitlich mittelbis hochgradige Proliferation des BALT zu verzeichnen.
Als Ursache für die Proliferation des BALT bei Mykoplasmosen der Lunge von Rindern, aber
auch anderer Tiere wie Mäuse, Ratten, Hamster und Schweine wird im Schrifttum die
Persistenz des Erregers auf der Mukosaoberfläche vermutet (CASSELL et al. 1974;
FERNALD 1979; HOWARD et al. 1987 a; ROSS u. YOUNG 1993; RODRÍGUEZ et al. 2000).
Der Nachweis von variablen Oberflächenproteinantigenen von Mycoplasma bovis im Lumen
und an der Epitheloberfläche von Bronchien und Bronchiolen mit hyperplastischem BALT in
der vorliegenden Untersuchung ist ein weiterer Hinweis auf die Rolle der Persistenz von
Erregerantigen als Stimulus für eine Proliferation des peribronchiolären lymphatischen
Gewebes des infizierten Wirtes.
Obwohl in den vorliegenden Untersuchungen nur vergleichsweise kleine Gewebeareale aus
den verschiedenen Lungenlappen untersucht wurden, lassen die an den Lungen der
infizierten Kälber aller vorliegenden Versuche erhobenen histologischen Befunde die
Tendenz erkennen, dass in den kranialen Anteilen der Lunge mehr BALT zu finden ist, als in
den kaudalen. Vermutlich hängt diese Beobachtung mit der Luftzirkulation in der Lunge
zusammen, durch die kraniale Anteile vermehrt mit Antigenen belastet sind, denn nicht nur
bei mit Mycoplasma bovis infizierten Rindern ist diese Verteilung festzustellen. So
beschreiben ANDERSON et al. (1986) in ihrer Untersuchung an gesunden Lungen von
Schlachtrindern verschiedener Altersgruppen ein vermehrtes Vorliegen von BALT in den
kranialen Lungenanteilen.
Die von ANDERSON et al. (1986) beschriebene häufige Lage des BALT an der Bifurkation
von Bronchiolen, die auch andere Autoren bei bisher untersuchten Tierarten beobachten
(SMINIA et al. 1989; GOULD u. ISAACSON 1993), konnte in der vorliegenden Arbeit auch
für mit Mycoplasma bovis infizierte Rinder bestätigt werden. Eine Aussage über die
Präferenz des BALT für Bronchien oder Bronchiolen konnte hingegen in der vorliegenden
Untersuchung nicht gemacht werden, da hierfür eine systematische histologische
Auswertung zahlreicher Schnitte aus definierten Lokalisationen größerer Lungenareale
erforderlich wäre.
ANDERSON et al. (1986) beobachten bei gesunden Schlachtrindern das vermehrte
Vorliegen von lymphoidzelligen Aggregaten gegenüber Lymphfollikeln mit Keimzentrum.
Auch nach der Infektion mit Mycoplasma bovis konnte in der vorliegenden Untersuchung bei
fast allen infizierten Kälbern ein Überwiegen der lymphoidzelligen Aggregate festgestellt
werden. Dennoch lassen die vorliegenden Ergebnisse vermuten, dass es gegenüber
Diskussion
86
gesunden Schlachtrindern nach einer Infektion mit Mycoplasma bovis zu einer Vermehrung
der Anzahl an Lymphfollikeln kommt, da ANDERSON et al. (1986) nur in einem Anteil von
sechs Prozent der BALT-Foci bei vier Monate alten Kälbern Lymphfollikel feststellten. Die
vorliegenden semiquantitativen Untersuchungen ergaben, dass es besonders bei länger
bestehender Infektion (Versuche B und C) zu einer Annäherung der Zahl der Lymphfollikel
an die Zahl der lymphoidzelligen Aggregate kam. Bei Versuch A hingegen war nur bei einem
sekundär mit Mannheimia haemolytica infizierten Tier ein Überwiegen der Lymphfollikel zu
beobachten. Zudem waren in den Versuchen B und C nach längerer Infektionsdauer
insgesamt mehr BALT-Foci feststellbar, als in Versuch A.
In neueren Untersuchungen an Mäusen nach Inhalation von durch Hitzebehandlung
abgetöteten Mikroorganismen der Spezies Pseudomonas aeruginosa (TOYOSHIMA et al.
2000) konnte gezeigt werden, dass die Induktion und Unterhaltung der Proliferation des
BALT nur nach wiederholter Antigenstimulation auftritt. Die in den vorliegenden
Untersuchungen bei den Tieren der Versuche B und C gegenüber denen des Versuches A
festgestellte Zunahme des BALT unterstützt die Vermutung anderer Untersucher (HOWARD
et al. 1987 a; RODRÍGUEZ et al. 2001), dass ein länger andauernder, von Mycoplasma
bovis ausgehender Stimulus in der Lunge von Rindern bzw. Ziegen zur Proliferation des
peribronchiolären lymphatischen Gewebes und zur Keimzentrumbildung im BALT führt.
Als Lymphepithel wird ein über dem BALT liegender Abschnitt des Bronchialepithels
bezeichnet, der sich durch abgeflachte Zellen und eine verminderte Anzahl oder
Abwesenheit von Becherzellen und Zilien sowie eine starke Infiltration mit Lymphozyten
auszeichnet (BIENENSTOCK et al. 1973; SMINIA et al. 1989). ANDERSON et al. (1986)
konnten
bei
der
elektronenmikroskopischen
Untersuchung
gesunder
Lungen
von
Schlachtrindern keine Anhaltspunkte für die Bildung von Lymphepithel finden, bei Kälbern
mit enzootischer Pneumonie hingegen fiel den Autoren entlang der betroffenen Luftwege das
Vorhandensein von Lymphepithel auf.
Die vorliegenden Untersuchungen, bei denen drei Wochen nach der Infektion das
Vorkommen über dem BALT liegender Bereiche mit abgeflachten Epithelzellen und starker
Infiltration von Lymphozyten bei den Tieren der Versuche B und C festgestellt werden
konnte, sprechen für eine im Verlauf der Infektion mit Mycoplasma bovis erfolgende Bildung
von Lymphepithel.
SMINIA et al. (1989) beschreiben eine Subpopulation von Zellen des Lymphepithels beim
Kaninchen und bei der Ratte, die zur Aufnahme löslicher und partikulärer Antigene befähigt
Diskussion
87
ist. Es wäre vorstellbar, dass das in den vorliegenden Untersuchungen drei Wochen nach
der Infektion mit Mycoplasma bovis festgestellte Lymphepithel in die Aufnahme des an der
Oberfläche des bronchialen bzw. bronchiolären Erregerantigens involviert ist.
Der Nachweis von Mycoplasma bovis-Antigen in Makrophagen der infizierten Kälber lässt
vermuten, dass diese Zellen an der Präsentation von Antigen beteiligt sind. Untersuchungen
an verschiedenen Spezies zeigen, dass dendritischen Zellen im Respirationstrakt eine
wichtige Rolle bei der Präsentation von Antigenen und der Initiierung einer T-Zellantwort
zukommt (DUPUIS u. McDONALD 1997; NICOD et al. 2000; REYNOLDS 2000). Über die
mögliche Rolle von dendritischen Zellen bei der Immunantwort Mycoplasma bovis-infizierter
Rinder gibt es bislang keine einschlägigen Untersuchungen.
Die gegenüber Versuch A vermehrte Apoptose von Lymphozyten im BALT der Tiere der
Versuche B und C ist möglicherweise nicht nur auf die Proliferation, sondern auch auf eine
durch Mycoplasma bovis induzierte Apoptose von Lymphozyten zurückzuführen. VANDEN
BUSH und ROSENBUSCH (2002) entdeckten kürzlich in Lymphozytenzellkulturen, dass
Mycoplasma bovis die Apoptose von aus dem peripheren Blut stammenden bovinen
Lymphozyten induziert.
Nur wenige Autoren haben sich bisher mit der Phänotypisierung von Lymphozyten in der
Rinderlunge beschäftigt. Für mit Mycoplasma bovis infizierte Rinder waren bislang nur
immunhistologische Befunde über das Vorkommen Immunglobulin-positiver Zellen verfügbar
(HOWARD et al. 1986, 1987 a).
MATHY et al. (1997) stellen in der gesunden Rinderlunge fest, dass T-Lymphozyten
gegenüber B-Lymphozyten überwiegen. Anhand der vorliegenden semiquantitativen
Ergebnisse zeigt sich, dass auch bei mit Mycoplasma bovis infizierten Rindern deutlich mehr
T- als B-Lymphozyten im Lungengewebe vorhanden sind. Im Gegensatz zur gesunden
Rinderlunge, in der MATHY et al. (1997) die T-Lymphozyten überwiegend im BALT lokalisiert
fanden, sind bereits in der frühen Phase post infectionem (Versuch A) viele der CD3positiven Zellen in den Alveolarsepten zu beobachten. Es kann angenommen werden, dass
es sich dabei um aus den Gefäßen ins Interstitium hinein emigrierte T-Zellen handelt.
Die Verteilung der im BALT liegenden T-Zellen bei den infizierten Kälbern in der Peripherie
des BALT entspricht der bei gesunden Rindern beschriebenen (MATHY et al. 1997). Die
CD79a-positiven B-Zellen hingegen konnten nach Infektion mit Mycoplasma bovis nicht nur
Diskussion
88
im Zentrum des BALT, sondern teilweise auch nur in der Peripherie des BALT beobachtet
werden.
Die Untersuchung der überwiegend im BALT liegenden T-Zell-Subtypen von MATHY et al.
(1997) ergab bei gesunden 12 bis 18 Monate alten Rindern eine größere Anzahl CD8positiver Zellen gegenüber einem nur geringen CD4-positiven Zellanteil. In der vorliegenden
Untersuchung war festzustellen, dass beim Rind drei Wochen nach der Infektion mit
Mycoplasma bovis dieses Verhältnis sich umkehrt und die CD4-positiven Zellen im BALT
eindeutig überwiegen. Zu diesem Ergebnis kommen auch RODRÍGUEZ et al. (2000) bei
einer Untersuchung von mit Mycoplasma bovis infizierten Ziegen. Bei der Ziege führen auch
natürliche Infektionen mit Mycoplasma mycoides subsp. mycoides, Mycoplasma mycoides
subsp. capri, Mycoplasma capricolum subsp. capricolum sowie Mycoplasma agalactiae zu
einer deutlichen Vermehrung der CD4-positiven gegenüber den CD8-positiven Lymphozyten
im BALT (RODRÍGUEZ et al. 2001). JONES et al. (2002) konnten bei der Maus nachweisen,
dass Mycoplasma pulmonis die Vermehrung beider Zelltypen bewirkt, wobei CD4-positive
Zellen stärker expandieren.
Aufgrund der bei den untersuchten Kontrolltieren festgestellten histopathologischen
Veränderungen unklarer Ursache ist ein Vergleich der Verteilung CD4- und CD8-positiver
Lymphozyten zwischen gesunden und mit Mycoplasma bovis infizierten Tieren innerhalb
dieses Versuchsansatzes nur eingeschränkt möglich und die Beurteilung möglicher
quantitativer Veränderungen dieser Lymphozytensubtypen in den Lungen der infizierten
Tiere durch die auf eine Infektion mit Mycoplasma bovis folgende Immunantwort erschwert.
Wünschenswert für zukünftige Untersuchungen wäre es, Versuche mit größeren
Tiergruppen, insbesondere auch einer größeren Anzahl an Kontrolltieren durchzuführen, da
eine allgemeingültige Aussage aufgrund der geringen Tierzahlen in den vorliegenden
Versuchen nicht möglich ist.
Die Vermehrung des BALT infizierter Tiere im Laufe der Infektion deutet auf eine starke
absolute Zunahme CD4-positiver T-Lymphozyten hin. Diese könnten über die Bildung von
Lymphokinen zur Aktivierung von Makrophagen bzw. von B-Lymphozyten führen. Auf
Letzteres deutet die bei den Tieren der Versuche B und C im Vergleich zu den Tieren aus
Versuch A festgestellte erhöhte Anzahl CD79a-positiver B-Lymphozyten und Plasmazellen
hin.
HOWARD et al. (1987 a) untersuchten die Antikörperantwort auf eine Infektion mit
Mycoplasma bovis und stellten fest, dass in der tracheobronchialen Lavageflüssigkeit nach
zwei Wochen eine IgA-Antwort überwiegt, die sich vier Wochen nach experimenteller
Diskussion
89
Infektion zu einer Dominanz von IgG1 verschiebt, wobei IgG2 und IgA weiterhin nachweisbar
blieben. Dieser Isotypenswitch wird wahrscheinlich durch die CD4-positiven Zellen, die nach
M. bovis Infektion vermehrt vorliegen, induziert.
Wie auch von HOWARD et al. (1987 a) nach immunhistologischer Untersuchung
beschrieben, konnte in den vorliegenden Untersuchungen um nekrotische Areale herum eine
Infiltration mit überwiegend B-Lymphozyten und Plasmazellen und nur wenigen TLymphozyten festgestellt werden. HOWARD et al. (1987 a) wiesen nach, dass es sich bei
den Plasmazellen überwiegend um IgG1-, gefolgt von IgG2-produzierenden Zellen handelt.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass bei experimentell mit Mycoplasma bovis
infizierten
Kälbern
variable
Oberflächenproteinantigene
im
Lungengewebe
immunhistologisch darstellbar sind und dass die Persistenz von Erregerantigenen von einer
ausgeprägten Akkumulation lymphozytärer Zellen in der Lunge begleitet wird, wobei CD4positive T-Lymphozyten dominieren. Es kann angenommen werden, dass die im infizierten
Wirt auftretende Antigenvariation bzw. Erregerpersistenz einen wichtigen Faktor darstellt, der
dafür mitverantwortlich sein könnte, dass die Elimination des Erregers aus dem
Respirationstrakt ausbleibt. Um die Interaktionen zwischen Mycoplasma bovis und dem
Immunsystem des Wirtes nicht zuletzt im Hinblick auf die Entwicklung eines wirksamen
Impfstoffes besser verstehen zu können, bedarf es weitergehender Untersuchungen, wobei
unter anderem die nähere Charakterisierung der beteiligten Subpopulationen von THelferzellen bzw. der von ihnen produzierten Zytokine sowie die Rolle der in der Lunge
auftretenden Makrophagen als Zellen der unspezifischen Immunantwort zu berücksichtigen
wären.
Zusammenfassung / Summary
90
5 Zusammenfassung / Summary
Inka Buchenau (2003):
Immunhistologische Untersuchungen zur Expression variabler Oberflächenantigene
von Mycoplasma bovis und zur Immunreaktion in der Lunge von experimentell
infizierten Rindern.
Mycoplasma bovis ist einer der weltweit bedeutendsten Erreger boviner Mykoplasmosen, die
mit erheblichen wirtschaftlichen Verlusten einhergehen. Die wichtigsten Krankheitsbilder, die
von diesem Erreger verursacht werden, sind Pneumonien und Arthritiden bei Kälbern und
Jungrindern sowie Mastitis bei Kühen. Da in vitro gezeigt wurde, dass Mycoplasma bovis
variable Oberflächenproteine (Vsps und pMB67) exprimiert, wird diskutiert, dass eine im
Lungengewebe des Wirtes erfolgende Antigenvariation an der Persistenz des Erregers im
Respirationstrakt beteiligt ist. Ein wirksamer, kommerziell erhältlicher Impfstoff ist bislang
nicht verfügbar und die Kenntnisse über die auf die Infektion folgenden Immunreaktionen im
Wirt sind unzureichend.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das Auftreten und die Verteilung variabler
Oberflächenproteinantigene in vivo mittels monoklonaler Antikörper (Klone 4D7, 1A1, 1E5,
2A8 sowie I2) und immunhistologischer Methoden zu untersuchen sowie die Anzahl und
Verteilung von T-Lymphozyten (CD3, CD4, CD8) und B-Lymphozyten (CD79a) in der Lunge
unter besonderer Berücksichtigung des BALT bei experimentell mit Mycoplasma bovis
infizierten Kälbern zu charakterisieren.
In drei Versuchen (A, B und C) wurden 21 konventionell gehaltene Kälber im Alter von drei
bis fünf Wochen intratracheal mit Mycoplasma bovis inokuliert. Den Tieren des Versuches A
wurde hierbei eine klonale Variante des Mycoplasma bovis Typ-Stammes PG 45 verabreicht,
die Kälber der Versuche B und C wurden mit dem Mycoplasma bovis Stamm 1067 infiziert.
Ein Tier aus Versuch A und jeweils zwei Tiere der Versuche B und C, denen steriles
Kulturmedium intratracheal inokuliert worden war, dienten als negative Kontrolltiere. Die
Tötung der Tiere erfolgte im Versuch A nach zwei, vier, sechs bzw. zehn Tagen, in den
Versuchen B und C drei Wochen nach der Infektion.
Von allen Tieren standen paraffineingebettete Lungengewebeproben, von den Kälbern der
Versuche B und C zusätzlich tiefgefrorene Proben aus sechs definierten Lokalisationen der
Lunge zur Verfügung.
Die histologisch bei den infizierten Kälbern festgestellten pneumonischen Veränderungen
entsprachen im Wesentlichen den bei Mycoplasma bovis Infektionen bereits bekannten
Zusammenfassung / Summary
91
Lungenalterationen. Darüber hinaus wurden bei drei Tieren (Versuche B und C)
obliterierende Bronchiolitiden beobachtet, eine bisher bei Rindern mit respiratorischer
Mycoplasma bovis Infektion nicht beschriebene Veränderung.
Die immunhistologischen Untersuchungsergebnisse mit den monoklonalen Antikörpern 4D7,
1A1 und 1E5 sprechen für eine in vivo auftretende Variabilität der Vsps im Lungengewebe
infizierter Kälber. Mit dem monoklonalen Antikörper I2 konnte die Expression des
Oberflächenproteins pMB67 in vivo nachgewiesen werden.
Das proliferierte BALT war vermehrt in kranialen Bereichen der Lunge zu beobachten. Es lag
häufiger in Form lymphoidzelliger Aggregate als in Form von Lymphfollikeln mit Keimzentrum
vor. Mit zunehmender Infektionsdauer (Versuche B und C) konnte eine Zunahme der BALTFoci und eine vermehrte Lymphfollikelbildung bemerkt werden. Auch die Bildung von
Lymphepithel war in diesem Stadium der Infektion festzustellen. Die bei den Tieren der
Versuche B und C gegenüber denen des Versuches A festgestellte stärkere Zunahme des
BALT unterstüzt die bislang diskutierte Hypothese, dass ein länger andauernder, von
Mycoplasma bovis ausgehender Stimulus in den Lungen von Kälbern zur Proliferation des
peribronchiolären lymphatischen Gewebes und zur Keimzentrumbildung führt.
In den untersuchten Lungen konnten überwiegend CD3-positive Lymphozyten festgestellt
werden, die sowohl in den Alveolarsepten, als auch in der Peripherie des BALT anzutreffen
waren. Bei den T-Zell Subtypen fiel das eindeutige Überwiegen CD4-positiver Zellen
gegenüber CD8-positiven Zellen auf. Letztere lagen hauptsächlich im Parenchym der Lunge
und nur selten im BALT. CD79a-positive Zellen waren überwiegend im Zentrum oder der
Peripherie des BALT anzutreffen, aber auch in der Peripherie nekrotischer Areale des
Lungenparenchyms konnten zahlreiche CD79a-positive B-Lymphozyten und Plasmazellen
beobachtet werden.
Um die Interaktionen zwischen Mycoplasma bovis und dem Immunsystem des Wirtes nicht
zuletzt im Hinblick auf die Entwicklung eines wirksamen Impfstoffes besser verstehen zu
können, bedarf es weitergehender Untersuchungen, wobei unter anderem die nähere
Charakterisierung der beteiligten Subpopulationen von T-Helferzellen bzw. der von ihnen
produzierten Zytokine sowie die Rolle der in der Lunge auftretenden Makrophagen als Zellen
der unspezifischen Immunantwort zu berücksichtigen wären.
Zusammenfassung / Summary
92
Summary
Inka Buchenau (2003):
Immunohistological investigations on the expression of variable surface protein
antigens of Mycoplasma bovis and on the immune response in the lungs of
experimentally infected cattle.
Mycoplasma bovis is one of the most important causative agents of bovine mycoplasmosis
world-wide, being responsible for considerable economic losses. The most important
diseases caused by this pathogen are pneumonia and arthritis of calves and cattle as well as
mastitis in cows. Since the variation of defined surface proteins (Vsps and pMB67) has been
shown in vitro, it is under discussion that antigen variation in the host, i.e. in lung tissue, may
be involved in the persistence of the agent in the respiratory tract. So far an effective,
commercially available vaccine does not exist and the knowledge about the immune
reactions in the host following an infection is insufficient.
The aim of this study was to investigate the occurrence and distribution of variable surface
protein antigens in vivo by means of monoclonal antibodies (clones 4D7, 1A1, 1E5, 2A8 and
I2) and immunohistological methods, and to characterise the numbers and distribution of Tlymphocytes (CD3, CD4, CD8) and B-lymphocytes (CD79a) in the lung, particularly in the
proliferated BALT of calves following experimental infection with Mycoplasma bovis.
In three experiments (A, B and C) 21 conventionally reared calves aged between three and
five weeks were inoculated intratracheally with mycoplasma broth. The animals of
experiment A were given a clonal variant of type strain PG 45, the calves of the experiments
B and C were infected with Mycoplasma bovis strain 1067. One animal of experiment A and
two animals of each of the experiments B and C which were inoculated intratracheally with
sterile mycoplasma broth served as negative control animals. The calves of experiment A
were euthanased two, four, six and ten days after inoculation, the animals of the experiments
B and C after three weeks.
Paraffin embedded tissue samples of all animals as well as frozen tissue samples of the
animals of experiments B and C from six defined areas of the lung were available for
examination.
The pneumonic changes seen at histological examination in all infected calves mainly
corresponded to the lung alterations known to be caused by M. bovis. Furthermore,
Zusammenfassung / Summary
93
obliterative bronchiolitis could be observed in three animals (experiments B and C), an
alteration not described for M. bovis until now.
The immunohistological results of this study with the monoclonal antibodies 4D7, 1A1 and
1E5 suggest that antigen variation of Vsps does occur in vivo in the lung tissue of infected
calves. Using the monoclonal antibody I2, the expression of the variable surface protein
pMB67 was demonstrated in vivo.
Most of the proliferated BALT was found in the cranial areas of the lung. Lymphoid
aggregates outnumbered lymphoid follicles with germinal centres. With increasing duration of
the infection (experiments B and C), an increase in the number of BALT foci and lymphoid
follicles was noticed. At this stage of infection, the formation of lymphoepithelium was stated.
The observation that in animals from experiments B and C the increase of the BALT was
more severe than in animals from experiment A supports the hypothesis that ongoing
stimulation by Mycoplasma bovis in the lungs of infected calves induces the proliferation of
the peribronchial lymphatic tissue and the development of germinal centres.
CD3 positive lymphocytes was the main lymphocyte type in the lung. They were found in the
alveolar walls as well as in the periphery of the BALT. Of the T-cell subsets, CD4 positive
cells clearly outnumbered CD8 positive cells. The latter were seen mainly in the parenchyma
of the lung and only rarely in the BALT. CD79a positive cells were predominantly found in the
centre or the periphery of the BALT but also in larger numbers around necrotic areas of the
lung parenchyma.
To better understand the interactions between Mycoplasma bovis and the hosts immune
system, especially with regard to the development of an effective vaccine, further
investigations are needed for characterizing the subpopulations of T-helper cells, the
cytokines produced by these cells and the possible role of innate immunity associated with
macrophages.
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Genotypic and immunological analysis of a major surface antigen of Ureaplasma
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Anhang
113
7 Anhang
7.1 Immunhistochemische Methoden
7.1.1 Übersicht für die ABC Methode am Paraffinschnitt
1. Deparaffinieren und rehydrieren: Xylol 1 bis 3
je 5 min
Isopropanol
5 min
96% Ethanol
3 min
2. Hemmung der endogenen Peroxidase in 70%igem Ethanol mit 0,5% H2O2
20 min
3. 3x spülen in PBS unter ständigem Rühren
je 5 min
4. Demaskierung der Antigene durch Vorbehandlung
s. Tab. 9
5. 3x spülen in PBS unter ständigem Rühren
je 5 min
umsetzen in Coverplates  (Nr. 7211013, Fa. Shandon, Frankfurt a. M.) in Sequenza Kassetten (Nr.
73300003, Fa. Shandon, Frankfurt a. M.)
6. Blocken elektrostatischer Bindungsstellen durch inaktiviertes Normalserum der Spezies,
aus der der Sekundärantikörper stammt, 1:5 verdünnt mit PBS
7. Inkubation mit dem primären Antikörper
(neg. Ktr.: Balb C bzw. Kaninchenserum)
20 min
bei 4°C über
Nacht
8. 3x spülen in PBS unter ständigem Rühren
je 5 min
9.. Inkubation mit dem sekundären Antikörper
30 min
10. 3x spülen in PBS
je 5 min
11. ABC-Gebrauchslösung
30 min
12. 3x spülen in PBS unter ständigem Rühren
je 5 min
umsetzen in Küvetten
13. 0,05%ige DAB-Lösung mit 0,03% H2O2 unter ständigem Rühren
5 min
14. Spülen in PBS, verbringen in fließendes Leitungswasser
15 min
15. Gegenfärbung in Hämalaun nach Meyer
4 min
Anhang
114
16. Bläuen der Schnitte in fließendem Leitungswasser
10 min
17. Entwässern
70% bis 96% Ethanol
je 3 min
Isopropanol
5 min
Xylol 1 bis 3
je 5 min
18. Eindecken mit xylolhaltigem Eindeckmittel
7.1.2 Übersicht für die ABC Methode am Kryostatschnitt
1. Fixieren in Aceton bei Raumtemperatur
5 min
2. Trocknen lassen bei Raumtemperatur
5 min
3. 3x spülen in PBS unter ständigem Rühren
je 5 min
umsetzen in Coverplates  (Nr. 7211013, Fa. Shandon, Frankfurt a. M.) in Sequenza Kassetten (Nr.
73300003, Fa. Shandon, Frankfurt a. M.)
4. Blocken elektrostatischer Bindungsstellen durch inaktiviertes Normalserum der Spezies,
aus der der Sekundärantikörper stammt, 1:5 verdünnt mit PBS
5. Inkubation mit dem primären Antikörper
(neg. Ktr.: Balb C)
20 min
bei 4°C über
Nacht
6. 3x spülen in PBS unter ständigem Rühren
je 5 min
7. Hemmung der endogenen Peroxidase in 70%igem Ethanol mit 0,5% H2O2
20 min
8. 3x spülen in PBS unter ständigem Rühren
je 5 min
9.. Inkubation mit dem sekundären Antikörper
30 min
10. 3x spülen in PBS unter ständigem Rühren
je 5 min
11. ABC-Gebrauchslösung
30 min
12. 3x spülen in PBS
je 5 min
umsetzen in Küvetten
13. 0,05%ige DAB-Lösung mit 0,03% H2O2
5 min
14. Spülen in PBS, verbringen in fließendes Leitungswasser
15 min
Anhang
115
15. Gegenfärbung in Hämalaun nach Meyer
4 min
16. Bläuen der Schnitte in fließendem Leitungswasser, verbringen in Aq. dest.
10 min
17. Eindecken in wässrigem Eindeckmittel
7.2 Vorbehandlungen für die Immunhistochemie
7.2.1 Demaskierung mit Demaskierungslösung G im Wasserbad
Konzentrat (Fa. BioLogo, Wettenberg, Art. Nr. DE 007) 1:4 mit PBS verdünnen
300 ml auf 60°C im Wasserbad erhitzen
zu demaskierende Schnitte hineinstellen und auf 95°C einstellen
10 min bei 95°C demaskieren
10 min in der Demaskierungslösung abkühlen lassen
7.2.2 Demaskierung mit 0,25%iger Trypsinlösung
In 200 ml vorgewärmtem Aq. dest. 0,5 g Trypsin (Fluka Chemie, Buchs, Schweiz, Art.
Nr.93613) lösen und diese Lösung mit 0,04 g CaCl2 versetzen, auf pH 7,2 einstellen
bei 37° C die Schnitte 60 min demaskieren
7.3 Reagenzien für die Immunhistochemie
7.3.1 Phosphatpuffer (PBS)
40 g NaCl (Fa. Merck, Darmstadt, Nr. 6404) und
7,8 g NaH2PO4*H2O (Fa. Merck, Darmstadt, Nr. 6364)
in 5 Litern Aq. dest. lösen;
mit 1 M Natronlauge auf pH 7,1 einstellen
7.3.2 ABC-Gebrauchslösung
(Vectastain-ABC-Kit Elite, Fa. Vector, Burlingame, USA, PK-6100)
20 µl Lösung A und 20 µl Lösung B in 1 ml PBS gut mischen
30 min vor Gebrauch ansetzen
7.3.3 DAB-Gebrauchslösung
1. Stammlösung:
100 mg DAB (Fa. Buchs, Schweiz) in 50 ml PBS
Lagerung bei –20°C, vor Gebrauch im Dunkeln auftauen lassen
Anhang
2. Gebrauchslösung:
116
50 ml Stammlösung in 150 ml PBS lösen
Lösung filtern und 3 ml 3%iges H2O2 hinzufügen
auf dem Magnetrührer mischen
7.4 Färbungsprotokolle
7.4.1 HE-Färbung am Paraffinschnitt
Entparaffinieren der Schnitte in einer absteigenden Alkoholreihe, beginnend mit Xylol 1 bis 3
je 5 min, Isopropanol 5 min, dann 96%iges und 70%iges Ethanol je 2 bis 3 min, dann Aq.
dest.
15 min in Hämalaun nach P. Mayer
10 min in Leitungswasser bläuen
1 min in Eosin 1%ig (Zugabe von 1 Tropfen Eisessig pro Küvette)
in Aq. dest. spülen
Entwässern der Schnitte in einer aufsteigenden Alkoholreihe, beginnend mit 70%igem, dann
96%igem Ethanol 2 bis 3 min, Isopropanol 5 min, dann Xylol 1 bis 3 je 5 min
Eindecken mit Corbit-Balsam (Fa. Hecht, Kiel)
7.4.2 Toluidinblau-Färbung
Entparaffinieren wie bei HE-Färbung
5 min 0,1%ige Toluidinblaulösung
<1 min Propanol
Entwässern der Schnitte wie bei HE-Färbung
Eindecken in Corbit-Balsam (Fa. Hecht, Kiel)
2 min fließendes Leitungswasser
Entwässern der Schnitte wie bei HE-Färbung
Eindecken in Corbit-Balsam (Fa. Hecht, Kiel)
7.4.3 Elastika van Gieson-Färbung
Entparaffinieren wie bei HE-Färbung
30 min Resorcinfuchsin
in 96%igem Alkohol differenzieren
kurz in Aq. dest. spülen
5 min Eisenhämatoxylin nach Weigert
in HCL-Alkohol differenzieren
Anhang
117
spülen in Aq. dest.
15 min Leitungswasser
5 min Pikrofuchsin (van Giesonlösung)
kurz spülen in Aq. dest.
Entwässern der Schnitte wie bei HE-Färbung
Eindecken in Corbit-Balsam (Fa. Hecht, Kiel)
7.5 Ergebnistabellen
7.5.1 Ergebnisse der Immunhistologie, Versuch B (CD4 / CD8)
Tabelle 11:
arithmetische Mittel der absoluten und relativen Häufigkeit positiver Zellen im BALT
(oberer Wert)
Standardabweichung (unterer Wert)
CD4
Tier Nr.
absolute Häufigkeit
2
10
11
12
13
14*
15*
relative Häufigkeit
CD8
absolute Häufigkeit
2
relative Häufigkeit
[in pos. Zellen/1000µm ]
[in % Lymphozyten]
[in pos. Zellen/1000µm ]
[in % Lymphozyten]
12,4
38,83
1,1
6,30
3,19
9,12
1,72
5,78
6,6
24,27
0,4
2,11
3,46
10,48
0,16
0,87
15,3
40,86
2,1
8,07
6,16
11,39
0,98
2,84
10,4
34,21
1,3
6,77
2,50
6,19
1,30
6,82
2,0
9,74
0,2
0,96
1,84
9,17
0,23
1,29
10,2
32,42
2,0
7,39
3,88
10,75
2,45
8,03
* Kontrolltiere
Anhang
118
7.5.2 Ergebnisse der Immunhistologie, Versuch C (CD4 / CD8)
Tabelle 12:
arithmetische Mittel der absoluten und relativen Häufigkeit positiver Zellen im BALT
(oberer Wert)
Standardabweichung (unterer Wert)
Tier Nr.
CD4
CD8
absolute Häufigkeit
2
16
17
18
19
20*
relative Häufigkeit
absolute Häufigkeit
2
relative Häufigkeit
[in pos. Zellen/1000µm ]
[in % Lymphozyten]
[in pos. Zellen/1000µm ]
[in % Lymphozyten]
13,3
32,77
1,0
4,09
7,01
16,44
1,00
3,19
8,8
28,14
1,76
3,35
11,4
33,42
0,2
0,98
7,26
10,48
0,13
0,73
8,8
27,09
1,2
6,12
7,15
13,23
1,12
6,45
10,1
21,29
0,4
1,35
5,15
3,95
0,04
0,13
21*
* Kontrolltiere
BALT nicht auswertbar
kein BALT
Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation „Immunhistologische Untersuchungen zur
Expression variabler Oberflächenantigene von Mycoplasma bovis und zur Immunreaktion in
der Lunge von experimentell infizierten Rindern“ selbstständig verfasst habe. Bei der
Anfertigung wurde nicht die Hilfe Dritter in Anspruch genommen.
Ich
habe
keine
entgeltliche
Hilfe
von
Vermittlungs-
bzw.
Beratungsdiensten
(Promotionsberater oder andere Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir
unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die im
Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen.
Ich habe die Dissertation an folgendem Institut angefertigt:
Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Abteilung Immunpathologie.
Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen
Zweck zur Beurteilung eingereicht.
Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der
Wahrheit entsprechend gemacht habe.
Danksagung
Frau Prof. Dr. M. Hewicker-Trautwein danke ich für die Initiierung dieses Themas und die
jederzeit gewährte Hilfe und Unterstützung bei der Durchführung und Ausarbeitung dieser
Arbeit. Weiterhin bedanke ich mich für die Bereitstellung des Untersuchungsmaterials.
Herrn K.-P. Kuhlmann möchte ich für die Einarbeitung in die Laborarbeiten, die jederzeit
gewährten Ratschläge und die nette Zusammenarbeit danken.
Herrn Dr. L.H. Thomas (Institute for Animal Health, Compton Laboratory, Compton,
Newbury, England) danke ich für die freundliche Bereitstellung der zusätzlichen negativen
Kontrolltiere.
Frau Dr. B. Baum und Frau Dr. B. Ehinger danke ich für so manchen Ratschlag und das
offene Ohr bei aufkommenden Problemen.
Besonders herzlich möchte ich meinen Eltern danken, die mir sowohl das Studium, als auch
diese Arbeit ermöglicht haben und ebenso herzlich meinem lieben Mann, Thomas, für seine
Geduld, liebevolle „Aufbauhilfe“ und Unterstützung und natürlich seine schnelle Rettung bei
PC-Frust.